DE3780480T2

DE3780480T2 - Test fuer menschlichen brustkrebs.

Info

Publication number: DE3780480T2
Application number: DE8787301040T
Authority: DE
Inventors: Joseph P Brown; Arthur E Frankel; Diane Horn; Peter S Linsley; Vincent W Ochs; David B Ring
Original assignee: Oncogen LP; Cetus Oncology Corp
Current assignee: Oncogen LP; Cetus Oncology Corp
Priority date: 1986-02-05
Filing date: 1987-02-05
Publication date: 1993-02-18
Anticipated expiration: 2007-02-06
Also published as: JP2739110B2; ES2033823T3; JPS62259064A; EP0232179A2; EP0232179B1; CA1279006C; AU593476B2; AU6828387A; EP0232179A3; ATE78601T1; DE3780480D1; US4803169A; GR3005971T3

Description

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Krebsdiagnose und -überwachung. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Brustkrebsdiagnose oder zur Überwachung des Brustkrebsstadiums in Brustkrebspatienten durch Bestimmung der Menge von bestimmten Antigenen in Körperflüssigkeiten wie Serum mit einem quantitativen Immuntest.
Der Verlauf bösartiger Erkrankungen kann in einigen Fällen durch Messung der Serumwerte geeigneter Tumorkennzeichen überwacht werden. Zahlreiche Immuntests sind zum Nachweis von im Blut vorhandenen Tumorantigenen entwickelt worden, und von diesen können die nützlichsten in zwei allgemeinen Gruppen klassifiziert werden. Eine Gruppe beruht auf aktiv sekretierten Protein- oder Glycoproteinantigenen, wie alpha-Fetoprotein und Prostataspezifisches Antigen, und die zweite auf stark glykosilierten Antigenen von hohem Molekulargewicht, wie carcinoembryonales Antigen oder die Mucin-ähnlichen Antigene, die von einer Vielzahl von Tumorarten über unbekannte Mechanismen freigesetzt werden.
Einige Krebsarten, wie Brustkrebsarten, - die eine der umfangreichsten Klassen bösartiger Frauenkrankheiten darstellen - sind unter Verwendung bestehender serologischer Tests nicht leicht zu überwachen. Einige potentielle Serummarker für Brustkrebs werden in der Literatur beschrieben. Ceriani et al., PNAS 79 (1982), 5420-5424, beschreiben Brustepithelantigene, die anscheinend im Serum von Patienten mit disseminiertem Brustkrebs erhöht vorliegen. Burchell, J. et al., Int. J. Cancer 34 (1984), 763-768 haben monoclonale Antikörper beschrieben, die Mucinähnliche, im Patientenserum erhöht vorliegende Antigene von hohem Molekulargewicht nachweisen. Hayes, D.F., J. Clin. Invest. 75 (1985), 1671-1678, beschreiben ebenfalls einen monoclonalen Antikörper, der ein im Plasma von Brustkrebspatienten in erhöhten Mengen vorliegendes Brustepithelantigen von hohem Molekulargewicht erkennt. Vergleiche ebenfalls Papsidero, L.D. et al., Cancer Res. 44 (1984), 4653-4657; Taylor Papadimitriou, J. et al., Int. J. Cancer 28 (1981), 17-28 und US-A 4,522,918. In Ermangelung von Strukturangaben über die von diesen Antikörpern erkannten Epitope erweist sich die Ermittlung der Beziehung zwischen ihnen oder den in der Erfindung verwendeten Antikörpern als unmöglich. Auf jeden Fall ist keiner der zuvor beschriebenen Antikörper als Grundlage für einen weithin akzeptierten klinischen Test verwendet worden.
EP-A 0 148 166 beschreibt einen Test zum Nachweis eines Antigens im Blut, bei dem das Blut zunächst zur Absonderung des Antigens von den übrigen Blutproteinen behandelt und das abgesonderte Antigen anschließend durch eine Reaktion mit für das Antigen spezifischen Antikörpern nachgewiesen wird. Der Nachweis von Brustkrebsantigenen mit verfügbaren gegen Brustkrebs gerichteten monoclonalen Antikörpern wird als eine Ausführungsform des Tests beschrieben.
EP-A 0 160 446 beschreibt die Isolierung eines Antigens mit der Bezeichnung AF-1 aus ZR-75-1B Brustkrebszellen. AF-1 ist dadurch gekennzeichnet, daß es Determinanten aufweist, deren Konzentration zwischen gutartigen Zellen und Tumorzellen nicht variiert und eine weitere Determinante, deren Konzentration zwischen diesen Zelltypen beträchtlich schwankt. Es werden gegen AF-1- Determinanten gerichtete monoclonale Antikörper und ebenfalls Antigentests unter Verwendung von Kombinationen der zwei monoclonalen Antikörper beschrieben.
EP-A 0 153 114 beschreibt eine Reihe von gegen Brustkrebs gerichteten monoclonalen Antikörpern. Diese Antikörper wurden aufgrund ihrer Fähigkeit, menschliche Brustkrebszellen selektiv zu binden, und ihrer Wirksamkeit als Immunotoxine gegen Brustkrebs nach der Konjugation an eine Ricin A-Kette identifiziert. Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten monoclonalen Antikörper sind in dieser Reihe enthalten. EP-A 0 153 114 stellt fest, daß die Antikörper in Immuntests zum Nachweis oder zur Überwachung von Brustkrebs verwendet werden können. Die dort erwähnten spezifischen Tests sind eher zellulärer als serologischer Natur. EP-A 0 153 114 deutet nicht darauf hin, daß eines der von den Antikörpern erkannten Antigene ein im Blut vorhandener Brustkrebsmarker sein könnte. Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß zwei der in EP-A 0 153 114 beschriebenen Antikörper dasselbe Antigen oder assoziierte Antigene erkennen, das/die in Seren von Brustkrebspatienten erhöht ist/sind.
Ein Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Brustkrebs in einem menschlichen Patienten, umfassend:
(a) Bestimmung der Menge eines Antigens, welches das von dem monoclonalen Antikörper erkannte Antigen ist, der vom aus HB-8491 erhältlichen Hybridom hergestellt wird, oder welches das von dem monoclonalen Antikörper erkannte Antigen ist, der vom aus HB-8489 erhältlichen Hybridom hergestellt wird, in einer Körperflüssigkeit dieses Patienten durch einen quantitativen Immuntest unter Verwendung eines gegen dieses Antigen gerichteten monoclonalen Antikörpers; und
(b) Vergleich der in (a) bestimmten Menge mit der Menge dieses Antigens, das in der entsprechenden Körperflüssigkeit von normalen Menschen vorliegt, um zu ermitteln, ob die in (a) bestimmte Menge relativ zu der in der entsprechenden Körperflüssigkeit von normalen Menschen vorliegenden Menge erhöht ist, wobei eine wesentliche Erhöhung ein Anzeichen für Brustkrebs ist.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwachung des Brustkrebsstadiums in einem menschlichen Patienten, umfassend:
(a) Bestimmung der Menge eines Antigens, welches das von dem monoclonalen Antikörper erkannte Antigen ist, der vom aus HB-8491 erhältlichen Hybridom hergestellt wird, oder welches das von dem monoclonalen Antikörper erkannte Antigen ist, der vom aus HB-8489 erhältlichen Hybridom hergestellt wird, in vom Patienten regelmäßig über ein bestimmtes Zeitintervall erhaltenen Proben an Körperflüssigkeit durch einen quantitativen Immuntest unter Verwendung eines gegen dieses Antigen in den jeweiligen Proben gerichteten monoclonalen Antikörpers; und
(b) Vergleich der Mengen, wobei ein Anstieg in der Menge ein Anzeichen für vermehrte Tumorlast und eine Abnahme in der Menge ein Anzeichen für verminderte Tumorlast ist.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des klinischen Stadiums von Brustkrebs in einem menschlichen Patienten, umfassend:
(a) Bestimmung der Menge eines Antigens, welches das von dem monoclonalen Antikörper erkannte Antigen ist, der vom aus HB-8491 erhältlichen Hybridom hergestellt wird, oder welches das von dem monoclonalen Antikörper erkannte Antigen ist, der vom aus HB-8489 erhältlichen Hybridom hergestellt wird, in einer Körperflüssigkeit dieses Patienten durch einen quantitativen Immuntest unter Verwendung eines gegen dieses Antigen gerichteten monoclonalen Antikörpers; und
(b) Vergleich der in Schritt (a) bestimmten Menge mit vorher bestimmten Mengen dieses Antigens, die in der entsprechenden Körperflüssigkeit von menschlichen Brustkrebspatienten in den verschiedenen Stadien der Krankheit vorkommen.
Die Figuren 1 und 2 sind graphische Darstellungen der Ergebnisse der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Tests.
Wie hier verwendet bedeutet der Begriff "monoclonaler Antikörper" eine Antikörperzusammensetzung, die eine homogene Antikörperpopulation aufweist. Es ist keine Begrenzung im Hinblick auf die Art oder Quelle des Antikörpers oder seine Herstellungsweise beabsichtigt. Der Begriff soll Antigen bindende Fragmente (z.B. Fab, F(ab')2, Fv) ebenso enthalten, wie das vollständige Immunglobulin.
Wie hier im Hinblick auf die als Beispiel dienenden, gegen menschlichen Brustkrebs gerichteten monoclonalen Maus- Antikörper verwendet, bedeutet der Begriff "funktionell äquivalent" einen monoclonalen Antikörper, der dasselbe Epitop wie der als Beispiel dienende Antikörper bindet, wie mit Bindungshemmungsuntersuchungen festgestellt wurde.
Wie hier zur Beschreibung eines menschlichen Individuums oder von Individuen verwendet, bedeutet der Begriff "normal", daß das Individuum oder die Individuen keinen nachweisbaren Krebs aufweisen.
Die im Test verwendete Körperflüssigkeit wird üblicherweise Serum sein. Weitere Blutfraktionen (z.B. Plasma) oder Körperflüssigkeiten wie Brustflüssigkeit und austretende Flüssigkeiten (z.B. Urin oder Auswurf) können für den Nachweis einer metastatischen Krankheit nützlich sein.
Während in der Erfindung theoretisch monoclonale Antikörper von jeder nicht menschlichen Säugerart verwendet werden könnten, werden die Antikörper in der Praxis auf Grund der Verfügbarkeit von Mäuse- und Rattenzellinien zur Verwendung bei der Herstellung von monoclonale Antikörper erzeugenden Hybridzellinien (Hybridome) üblicherweise von Ratten oder Mäusen stammen. Diese Hybridome werden unter Verwendung der üblichen somatischen Zellhybridisierungstechnik von Köhler, G. und Milstein, C., Nature 256 (1975), 495-497 aus Zellen, üblicherweise Milzzellen, die gegen das spezifische Brustkrebsantigen gerichtete Antikörper erzeugen, und einer unsterblichen Tumorzellinie hergestellt.
Die bei der Hybridisierung verwendeten, Antikörper herstellenden Fusionspartner werden durch Immunisierung von Wirten, z.B. Mäusen, mit lebenden menschlichen Brustkrebszellen oder Membranextrakten davon erzeugt. Die Tiere werden intraperitoneal mit einer immunogenen Menge der Zellen oder einem Extrakt geimpft und anschließend mit ähnlichen Mengen des Immunogens nachgeimpft. Einige Tage nach der letzten Nachimpfung werden die Milzen der immunisierten Tiere gesammelt, und es wird daraus eine Zellsuspension zur Verwendung bei der Fusion hergestellt. Verfügbare Maus-Myelomlinien wie die vom Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, können als Tumor-Fusionspartner bei der Hybridisierung verwendet werden. Grundsätzlich beinhaltet die Technik die Fusion der Tumorzellen und Splenocyten unter Verwendung eines Fusionsmittels wie Polyethylenglycol. Nach der Fusion werden die Zellen vom Fusionsmedium abgetrennt und zur Eliminierung der nicht hybridisierten parentalen Zellen in einem selektiven Nährmedium, wie HAT-Medium gezüchtet. Die Hybridome werden vermehrt, falls erwünscht, und die Überstände werden mit üblichen Immuntestverfahren auf Aktivität gegen menschlichen Brustkrebs untersucht. Die hier als anti-W1 und anti-W9 ausgewiesenen Antikörper wurden hergestellt, anfänglich auf Selektivität hin ausgewählt und unter Verwendung der in US-A 4,753,894 beschriebenen Verfahren charakterisiert. Diese besonderen Antikörper wurden in der in dieser Patentanmeldung beschriebenen Gruppe von Brustkrebs-selektiven Antikörpern identifiziert, indem sie in einem Test zur Messung der Bindungshemmung monoclonaler Antikörper an immobilisierte Zielzellen (Brustkrebszellen) durch Tumor-Serumpools relativ zu normalen Serumpools untersucht wurden. Auf diese Weise wurden diejenigen Antikörper in der Gruppe identifiziert, die erhöhte Antigene im Serum von Brustkrebspatienten erkennen.
Unter Verwendung von anti-W1 und anti-W9 wurde(n) das(die) von ihnen erkannte(n) Antigen(e) affinitätschromatographisch in reiner Form aus dem Serum gewonnen und durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western-Blotting charakterisiert. Das(Die) von den Antikörpern erkannte(n) Antigen(e) wurde(n) zusammen aus dem Serum aufgereinigt und zeigte(n) nach einer Bestimmung durch eine SDS-PAGE ein scheinbares Molekulargewicht von 260000 bis 340000. Die Reinigungseigenschaften der Antigene zeigen, daß sie dasselbe Antigen, oder nahe verwandte oder assoziierte Moleküle sein können.
Die Menge an W1- und W9-Antigen in einer Serumprobe kann unter Verwendung von in der Technik verfügbaren kompetitiven oder nicht kompetitiven, direkten oder indirekten Testanordnungen bestimmt werden. Radio- Immuntests, Enzymtests und Fluoreszenstests sind am weitesten verbreitet. Diese Bestimmung kann in Abhängigkeit vom jeweiligen Patienten zum Nachweis von Brustkrebs, zur Beurteilung des Krankheitsstadiums oder zur Überwachung des Krankheitsverlaufs verwendet werden. Mit den bis heute untersuchten Testanordnungen wurden das Stadium II und höhere Krebsstadien besser nachgewiesen als das Krebsstadium I. Bei der Verwendung zum Nachweis von Brustkrebs wird die Menge mit der in den Seren normaler Patienten üblicherweise auftretenden Antigenmenge verglichen. In dieser Hinsicht wird die Menge in normalen Patienten üblicherweise weniger als etwa 50 Testeinheiten pro ml betragen (nach Bestimmung mit dem in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Doppeldeterminantentest (DDIA)), wohingegen in Krebspatienten die Menge mehr als etwa 50 Testeinheiten pro ml beträgt. Die Menge wird, wenn sie zur Beurteilung des Krankheitsstadiums herangezogen wird, mit den für die verschiedenen Krankheitsstadien typischen Mengen verglichen. In dieser Hinsicht betragen die für die Stadien typischen Mengen: Stadium I bis III, weniger als etwa 100 Testeinheiten pro ml, und Stadium IV, mehr als etwa 100 Testeinheiten pro ml. Serumproben werden, wenn sie zur Überwachung des Krankheitsverlaufs herangezogen werden, dem Patienten regelmäßig (die Länge des Zeitraums wird vom Patienten, von der Krankengeschichte des Patienten und der Behandlung abhängen) entnommen und die Antigenmengen miteinander verglichen. Eine Erhöhung der Menge zeigt ein Anwachsen der Tumorlast an; eine Abnahme zeigt eine abnehmende Tumorlast an.
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben und veranschaulichen die Erfindung weiter.

Beispiele

Monoclonale Antikörper

Die im US-A 4,753,894 beschriebene Antikörpergruppe wurde zur Beurteilung herangezogen. Die Antikörper der Gruppe, die Antigene auf normaler Leber und Milz erkennen, wurden nicht ausgewertet, da normale Serumwerte von Antigenen, die auf diesen Organen vorhandenen sind, erwartungsgemäß hoch sein würden. Es wurden Antikörper zur Beurteilung ausgewählt, die Antigene erkannten, die auf einem hohen Prozentsatz von Brusttumoren vorhandenen sind. Dreizehn Antikörper der Liste wurden zur Beurteilung in indirekten und direkten, kompetitiven, radiometrischen Zellbindungstests ausgewählt. Diese Antikörper, ihre Bezeichnung mit der laufenden Nr. 690750, Isotyp und erkanntes Antigen sind nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt. Zweckmäßigerweise wird den erkannten Antigenen dieselbe laufende Bezeichnung wie den Antikörpern zugewiesen. Daher bezieht sich das W1-Antigen, um ein Beispiel zu nennen, auf das Molekül, das von dem monoclonalen Antikörper W1 erkannt und gebunden wird. Tabelle 1 Bezeichnung Aktuell Vorher Isotyp Antigen HMW = Hohes Molekulargewicht; ND = Nicht bestimmt. Die Molekulargewichte beziehen sich auf die Größe der in Brusttumorzellinien identifizierten Antigene.

Zellbindungstests

Zellen

MCF7-Zellen wurden von Dr. Marc Lipmann, NIH, erhalten und in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), enthaltend 10 % fötales Kälberserum (FCS) und 0,6 ug/ml Insulin, gehalten. Calu-1-Zellen wurden von der ATCC erhalten und in DMEM, enthaltend 10 % FCS, gehalten. Für die meisten Experimente wurden von Calu-1 durch wiederholte Selektion auf einem FACS hergeleitete Zellinien verwendet. Diese Linien binden erhöhte Mengen von W1-, W5- und W9- Antikörpern und tragen die Bezeichnung W1S4, W5S4, W9S4 und W5C16. W5C16 stellte eine von W5S4 abstammende clonale Linie dar. Diese abgeleiteten Zellinien banden mehr als fünfmal mehr ¹²&sup5;I-markierte W1- und W5-Antikörper als die parentalen Calu-1-Zellen und mehr als fünfzigmal mehr ¹²&sup5;I-W9- Antikörper.

Seren

Die Zellen wurden durch Trypsinbehandlung geerntet, bei einer Dichte von 3-18 x 10&sup4; Zellen/cm² in Plastikgefäßen mit vielen Vertiefungen (48 oder 96 Vertiefungen) ausgesäht und vor Testbeginn 18 Std. lang bei 37ºC gehalten. Die einzelligen Schichten wurden gewaschen, vor der Antikörperzugabe in situ mit 0,5 % Paraformaldehyd immobilisiert und, wie beschrieben von Marquardt, H. und Todaro, G.T., J. Biol. Chem. 257 (1982), 5220-5225, mit Bindungspuffer blockiert.
Es wurde Personen Blut entnommen, und man ließ es 10 bis 90 Min. lang bei 23ºC gerinnen. Die Proben wurden anschließend vor der Zentrifugation (16000 x g) in einer klinischen Zentrifuge 0,5-5 Std. lang bei 4ºC-6ºC gelagert. Das Serum wurde vom geronnenen Material getrennt, in Aliquots aufgeteilt und bei -70ºC eingefroren.
Für den indirekten Test wurde das vereinigte Serum von 5 normalen Personen (NHS) und 5 Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs (BHS) verwendet.
Für den direkten Test wurden Seren von insgesamt 149 Personen gesammelt. Bei 34 von ihnen wurde eine Brustkrebserkrankung diagnostiziert. Das klinische Krankheitsstadium bei diesen Personen zum Zeitpunkt der Serumentnahme wurde wie folgt bezeichnet: Stadium I, Primärtumor festgestellt, aber keine Beteiligung der Lymphknoten; Stadium II und III, Tumorzellen enthaltende Lymphknoten waren vorhanden; Stadium IV, Metastasen waren vorhanden. Die Seren von zweiundachtzig Personen, die andere Krebsarten als Brustkrebs aufwiesen, wurden untersucht; etwa einundzwanzig von ihnen wiesen kolorektale Krebsarten auf; fünfzig, Prostatakrebs; zehn, Lungenkrebs; fünf, Blasenkrebs; vier, Eierstockkrebs; und die übrigen wiesen weitere Krebsarten auf. Die Seren von sieben normalen Freiwilligen und sechsundzwanzig Patienten, die wegen nicht bösartiger Krankheiten im Krankenhaus behandelt wurden, wurden als Kontrollen verwendet.

Direktes Bindungstestverfahren

¹²&sup5;I-markierte W1-, W5- oder W9-Antikörper (die spezifischen Aktivitäten betrugen etwa 1 x 10&sup9; cpm/nmol) wurden in bestimmten Konzentrationen in Gegenwart oder in Abwesenheit von konkurrierenden Lösungen zu den einzelligen, mit Formalin immobilisierten Zellschichten der Calu-1-Zellen zugesetzt. Die Bindungsreaktion konnte 1 Std. lang bei 23ºC vonstatten gehen, die einzelligen Schichten wurden mit Bindungspuffer gewaschen, in 0,5 N NaOH solubilisiert und in einem Gammazähler gezählt. Die nichtspezifische Antikörperbindung wurde in Gegenwart eines fünfzigfachen Überschusses von nicht markiertem Antikörper gemessen und betrug im allgemeinen weniger als 10 % der Gesamtbindung.

Indirektes Bindungstestverfahren

Einzelne, immobilisierte Zellschichten wurden gleichzeitig mit nicht markierten monoclonalen Antikörpern in einer Konzentration von 0,5 ug/ml in Bindungspuffer und mit den NHS- oder BHS-Seren für einen Zeitraum von 1 Std. bei 23ºC inkubiert. Die einzelligen Schichten wurden anschließend gewaschen und mit ¹²&sup5;I-markiertem Ziegen-anti- Maus-Immunglobulin (spezifische Aktivität 1-2 x 10&sup9; cpm/nmol) eine weitere Stunde lang bei 23ºC inkubiert. Die einzelligen Schichten wurden schließlich zweimal mit Bindungspuffer gewaschen, in NaOH solubilisiert und die zellgebundene Radioaktivität unter Verwendung eines Gammazählers bestimmt.

Ergebnisse:

Indirekter Bindungstest

Die 13 in Tabelle 1 aufgeführten, gegen Brustkrebstumore gerichteten Antikörper wurden in drei Experimenten unter Verwendung von verschiedenen Serumpools bei jedem Experiment getestet. Über die Ergebnisse wird nachstehend in Tabelle 2 berichtet. MCF-7-Zellen wurden im Experiment mit der Bezeichnung Experiment II verwendet. Monoclonale Antikörper wurden in den Experimenten I und III zu einer Konzentration von 0,5 ug/ml und im Experiment II zu einer Konzentration von 0,4 ug/ml zugesetzt. Das ¹²&sup5;I- Ziegen-anti-Maus-Ig wurde in Experiment I zu einer Konzentration von 0,5 ug/ml und in den Experimenten II und III zu einer Konzentration von 1 ug/ml zugesetzt. Die Werte für gebundene Antikörper sind für nichtspezifische ¹²&sup5;I- Antikörperbindung (gebundener Antikörper in Abwesenheit von monoclonalem Antikörper) korrigiert worden. Die Korrekturen betrugen 130 pg, 100 pg und 180 pg bei den Experimenten I, II bzw. III. Tabelle 2 Hemmung der Antikörperbindung durch normale und Tumorenserumpools Experiment I Antikörper gebundener¹ ¹²&sup5;I-Antikörper % Differenz² Experiment II Antikörper gebundener ¹²&sup5;I-Antikörper¹ % Differenz² Experiment III 1. Pro 10&sup5; Zellen gebundene Picogramm ¹²&sup5;I-Antikörper. 2. (in NHS gebundenes ¹²&sup5;I - in BCS gebundenes ¹²&sup5;I)/in NHS gebundenes ¹²&sup5;I.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde die Bindung der Antikörper W1 und W9 an jede Zellinie in einem wesentlich größeren Ausmaß (≤ 50 %) durch Seren von Tumorpatienten als durch Seren von normalen Personen gehemmt. Die Bindung des Antikörpers W5 wurde manchmal durch Tumorseren, abhängig vom jeweils verwendeten Serumpool, wesentlich gehemmt. Die Bindung der gesamten übrigen getesteten Antikörper wurde durch Seren von Tumorpatienten nicht in einem signifikant größeren Ausmaß (≥ 25 %) reproduzierbar gehemmt.
Um zu ermitteln, ob die von den Antikörpern W1, W5 und W9 erkannten Epitope miteinander in Beziehung stehend wurden die Fähigkeiten jedes Antikörpers, mit der Bindung der übrigen Antikörper zu konkurrieren, miteinander verglichen. Jeder Antikörper wurde mit ¹²&sup5;I radioaktiv markiert, und festgelegte Konzentrationen der markierten Antikörper wurden einzeln in Gegenwart von steigenden Mengen nicht markierter Antikörper zu den Zielzellen zugesetzt. Die Bindung jedes radioaktiv markierten Antikörpers wurde durch Zusatz des entsprechenden nicht markierten Antikörpers in einer dosierungsabhängigen Weise gehemmt, ein Hinweis darauf, daß die gemessene Bindung spezifisch war. Nicht markierter W9-Antikörper zeigte selbst bei einem fünfzigfachen Überschuß von nicht markierten zu markierten Antikörpern keine Hemmung der ¹²&sup5;I-W1-Bindung. Niedrigere Konzentrationen nicht markierter W9 ergaben sogar eine leicht, aber reproduzierbar, erhöhte W1-Bindung. Nicht markierter W1-Antikörper konkurrierte umgekehrt bei hohen Konzentrationen nicht um die Bindung von ¹²&sup5;I-W9, sondern stimulierte bei niedrigen Konzentrationen sogar die Bindung. Es wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß W1 und W9 auf Grund der untereinander fehlenden Bindungskonkurrenz unterschiedliche Epitope erkennen.
Das von W5 erkannte Epitop weist ein komplexeres Verhalten auf. W5 konkurriert nicht um die Bindung von W1 oder W9, aber im umgekehrten Experiment zeigen sowohl W1 als auch W9 die Fähigkeit, um die Bindung von W5 zu konkurrieren. Diese Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß die Bindung des sperrigen W5-Antikörpers (IgM-Isotyp) durch die Bindung der übrigen Antikörper gehemmt werden kann, daß er vermutlich aber ein unterschiedliches Epitop bindet. Diese Schlußfolgerung wird weiter durch die Erkenntnis gestützt, daß der W5-Antikörper einen bedeutend geringeren Anteil immunhistologisch getesteter Brusttumore bindet. Alles in allem erkennen die Antikörper W1, W5 und W9 anscheinend unterschiedliche Epitope.

Direkter Test

Die Seren sowohl der normalen Freiwilligen als auch der Brustkrebspatienten hemmten in diesem Test auf eine dosierungsabhängige Weise die Bindung der mit ¹²&sup5;I markierten Antikörper W1, W5 und W9 an die Zielzellen. Seren von Brustkrebspatienten lieferten im allgemeinen vergleichbare Inhibierungsniveaus bei bedeutend höheren Verdünnungen als die normalen Seren. Diese Ergebnisse bestätigten die Resultate des indirekten Inhibierungstests und zeigten, daß sämtliche drei Antikörper das/die in erhöhten Mengen im Serum von Brustkrebspatienten vorkommende(n) Antigen(e) erkennen - wobei der Anteil an fortgeschrittenen Krebspatienten erhöhte Antigenmengen, die für W1 und W9 größer waren als für W5, aufwies. Sowohl das Ausmaß der Antigenerhöhung als auch der Prozentsatz der erhöhte Antigenmengen zeigenden Seren waren für W5 niedriger als für die übrigen zwei Antikörper, was darauf hinwies, daß die Brauchbarkeit des zuerst erwähnten für Serumtests weniger wahrscheinlich war.
Für den genauen Nachweis der Patientenzahl mit erhöhten W1- und W9-Mengen wurden Serumproben von insgesamt 147 Personen unter Verwendung des direkten Inhibitionstests auf die Mengen dieser Antigene untersucht. 34 dieser Proben stammten von Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs, 82 von Patienten mit anderen Tumoren als Brusttumoren, 8 von normalen Personen und 23 von Krankenhauspatienten mit einer nicht bösartigen Krankheit. Zur Absicherung gegen eine experimentelle Voreingenommenheit bei den Bestimmungen wurden die Proben auf eine zufällige, doppelt blinde Weise untersucht. Die Proben wurden bei einer einzigen Serumkonzentration getestet (Endserumkonzentration von 6,25 % für W1 und von 12,5 % für W9) und der beobachtete Grad der Bindungshemmung wurde durch einen Vergleich mit einer für ein Bezugsserum bestimmten Inhibierungskurve in willkürliche Einheiten des angezeigten Antigens umgewandelt. Die für die W1- und W9-Bestimmungen verwendeten Serumkonzentrationen wurden so ausgewählt, daß der mittlere, beobachtete Bereich der Inhibierungswerte etwa mit dem Mittelpunkt der Bezugskurve zusammenfiel; deswegen sind die Werte an den äußeren Enden der bestimmten Werte weniger genau. Die bestimmten Werte werden in den Figuren 1 und 2 graphisch dargestellt. Eine Zusammenstellung der Zahl von Personen mit verschiedenen Tumorarten, die erhöhte W1- oder W9- Antigenmengen aufwiesen, wird nachstehend in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Zusammenstellung von Personen² mit erhöhten Antigenmengen Diagnose A. Bösartige Krankheit Brust Kolorectal Prostata Lunge Blase Eierstock Andere B. Nichtbösartige Krankheit Krankheit c. Normale 1. Die in Klammern gesetzten Zahlen zeigen die getestete Personenzahl an. 2. Grenzwerte von 50 Einheiten/Test und 2 Einheiten/Test wurden für W1 bzw. W9 verwendet.
Wie in Figur 1 gezeigt, wurden bei einem bedeutsamen Anteil der Personen mit Brustkrebs über die normalen Werte erhöhte, zirkulierende Mengen von sowohl W1- als auch W9- Antigenen festgestellt. Im W1-Test betrug der höchste beobachtete Wert bei einem Patienten ohne Tumor etwa 50 Einheiten: Dreiundfünfzig Prozent (18/34) der Personen mit Brustkrebs und siebzehn Prozent (15/82) der Personen mit anderen bösartigen Krankheiten wiesen zirkulierende, oberhalb dieses Wertes liegende W1-Antigenmengen auf.
Für W9 ergab sich ein größerer überlappender Bereich zwischen den im Serum von Tumorpatienten und normalen Patienten festgestellten Werten. In diesem Fall ergaben die meisten Seren von Patienten ohne bösartige Krankheiten und normalen Kontrollpersonen Werte, die sich um eine Einheit pro Test häuften. Zwölf Prozent (4/34) der Personen mit nicht bösartigen Krankheiten wiesen W9-Antigenmengen auf, die signifikant erhöht über der Hauptmenge der Werte (> 2 Einheiten) lagen. Vierundsiebzig Prozent (25/34) der Brusttumorpatienten und etwa neunundzwanzig Prozent (24/82) der Patienten mit Tumoren, die keine Brusttumore waren, zeigten gegenüber dem normalen Häufungsbereich erhöhte W9- Antigenmengen im Serum. Keine erkennbaren Zusammenhänge wurden zwischen den Serummengen der W1- und W9-Antigene und dem Alter, Geschlecht, den Mengen der Östrogen- oder Progesteronrezeptoren oder dem Therapieverordnung festgestellt.
In Figur 2 werden die festgestellten Werte der W1- und W9-Antigenmengen im Serum von normalen Personen und solchen mit Brustkrebs und nicht bösartigen Krankheiten verglichen. Die Daten in dieser Figur werden ebenfalls entsprechend den klinischen Krankheitsstadien zur Zeit der Serumentnahme ausgewiesen. Mehrere Punkte gehen aus dieser Datendarstellung klar hervor. Zunächst stehen die für W1 und W9 bestimmten Werte im allgemeinen miteinander in Beziehung; es besteht ein lineares Verhältnis zwischen den bei denselben Patienten ermittelten W1- und W9-Werten. Die Extremwerte tendieren zu einer weniger guten Übereinstimmung miteinander, aber dies kann sehr wohl das Ergebnis von Ungenauigkeiten bei der Bestimmung dieser Werte sein. Es ist ebenfalls klar ersichtlich, daß die vier Patienten ohne Krebs mit erhöhten W9-Mengen keine entsprechend erhöhten W1- Mengen aufwiesen, wodurch sie sich von den meisten Brustkrebspatienten unterschieden. Schließlich standen sowohl die W1- als auch die W9-Mengen im allgemeinen mit dem klinischen Krankheitsstadium in Beziehung, wobei Patienten, die nachweisbare Metastasen (Stadium IV) aufwiesen, mit der Tendenz die höchsten W1- und W9-Werte zu besitzen, aufwarteten; sechsundachtzig Prozent (18/21) der Patienten im Stadium IV wiesen W1- und W9-Werte auf, die eindeutig außerhalb des normalen Bereichs (> 50 Einheiten bei W1 und > 2 Einheiten bei W9) lagen.
Bei Patienten, die andere Tumorarten als Brusttumore aufweisen, bestehen einige deutliche Unterschiede in der Zahl von Personen, die erhöhte W1- und W9-Antigenmengen aufweisen (Tabelle 3). In sämtlichen Fällen waren die Zahlen derselben, für W9 positiven Serumproben gleich oder größer als die für das W1-Antigen positiven Zahlen. Diese Ergebnisse zeigen, daß erhöhte W1- und W9-Antigenmengen in Seren der Mehrheit von Brustkrebspatienten gefunden wurden. Das/Die von diesen Antikörpern erkannte(n) Antigen(e) wird/werden im nachfolgenden Abschnitt charakterisiert.

Charakterisierung der Antigene

Die Charakterisierung der im Gesamtserum vorhandenen W1- und W9-Antigene war auf Grund der niedrigen Antigenkonzentrationen und großen Proteinmengen, die im Serum vorhanden waren, schwierig. Zur Kennzeichnung der von den W1- und W9-Antikörpern erkannten Antigene wurde das W1- Antigen partiell durch Immun-Affinitätschromatographie gereinigt. Kurz gesagt, das Serum wurde 60 Minuten lang durch Zentrifugation bei 147000 x g geklärt und mit an W1 konjugierter Sepharose 4B (5 mg Antikörper/ml Harz) in einem Volumenverhältnis von 4:1 (Serum : Harz) gemischt. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC im Kreise bewegt, in eine mit einem Stopfen aus Glaswolle versehenen Einwegspritze gegossen und gewaschen. Die Elution des gebundenen Antigens wurde durch Zusatz von 75 mM Triethylamin erreicht. Der Säulendurchfluß enthielt kein nachweisbares W1-Antigen, während etwa 77 % der Anfangsmenge des Antigens (wie aus der zur 50%igen Inhibition der ¹²&sup5;I-W1-Bindung erforderlichen Menge geschlossen wurde) aus der gewaschenen Säule durch Elution bei einem alkalischen pH-Wert gewonnen wurde. Das Eluat enthielt etwa 0,57 % des ursprünglichen Proteins in der Probe, was eine 130fache Antigen-Gesamtreinigung anzeigte. Wenn eine immun-affinitätsgereinigte W1- Antigenpräparation SDS-PAGE und Western-Blotting unterzogen wurde, wurden zwei immunreaktive Bestandteile von etwa Mr = 260000-340000 Dalton beobachtet.
Dieselbe Serumprobe wurde auf das W9-Antigen getestet. Der Durchfluß der W1-Affinitätssäule enthielt weniger als 12 % der ursprünglichen Aktivität von W9, was darauf hinwies, daß die Entfernung des W1-Antigens ebenfalls zu einer Entfernung des W9-Antigens führte. Die W9-Aktivität wurde aus der Säule mit einer Ausbeute von 50 % eluiert; dies entspricht einer etwa 88fachen Gesamtreinigung für das W9-Antigen. Wenn gereinigtes W9-Antigen SDS-PAGE und Western-Blotting unterzogen wurde, wurden immunreaktive Bestandteile beobachtet, die zusammen mit den vom W1-Antigen erkannten wandern. Diese Daten weisen darauf hin, daß W1- und W9-Antigene gemeinsam aus dem Serum gereinigt werden und höchst wahrscheinlich eng verwandte oder assoziierte Moleküle darstellen.
Die in den Figuren 1 und 2 gezeigten Ergebnisse wurden im allgemeinen unter Verwendung eines Doppel- Determinantentests (DDIA) mit dem W1-Antikörper bestätigt. Seren von 78 Brustkrebspatienten und 75 normalen Patienten wurden getestet. Das im DDIA verwendete Verfahren lief wie folgt ab.
Plastikgefäße mit 96 Vertiefungen (Immulon II) wurden eine Std. lang mit einer Lösung von W1-Antikörpern beschichtet (0,5 ug Antikörper in einem Volumen von 0,05 ml 0,05 M Tris, pH 8,0). Die Platten wurden anschließend eine weitere Std. lang mit 1 % Gelatine in demselben Puffer blockiert. Ein Volumen von 0,05 ml Serum (verdünnt 1:200 in einer Lösung von 5 % (Gew./Vol.), 0,1 % (Gew./Vol.) NaN&sub3; in 0,05 M Tris, pH 8,0) wurde zu jeder Testvertiefung zugesetzt und die Platte wurde etwa 16 Std. lang inkubiert. Die Vertiefungen wurden anschließend 30 Min. lang mit ¹²&sup5;I- markiertem W1-Antikörper inkubiert (15 ng in einem Volumen von 0,05 ml) und dreimal mit PBS gewaschen. Der gebundene ¹²&sup5;I-W1-Antikörper wurde mit 0,5 M NaOH solubilisiert, und die Radioaktivität wurde mit einem Gammazähler gemessen. Die für die einzelnen Seren bestimmten Werte wurden durch Vergleich mit einer Eichkurve, die unter Verwendung von verschiedenen Verdünnungen eines Referenzserums von einem Brustkrebspatienten erhalten wurde, in Einheiten umgewandelt. Sämtliche Inkubationen wurden bei 23ºC vorgenommen.
Proben der Hybridome, die die vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper W1 und W9 herstellen, wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776, U.S.A., hinterlegt. Die Hinterlegungsdaten und -nummern für diese Hinterlegungen sind nachstehend aufgeführt. Hybridom-/Antikörperbezeichnung Frühere Aktuelle Hinterlegungsdatum Hinterlegungs Nr.
Diese Hinterlegungen wurden nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages vorgenommen und werden in Übereinstimmung damit gehalten.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Brustkrebs in einem menschlichen Patienten, umfassend:

(a) Bestimmung der Menge eines Antigens, welches das von dem monoclonalen Antikörper erkannte Antigen ist, der vom aus HB-8491 erhältlichen Hybridom hergestellt wird, oder welches das von dem monoclonalen Antikörper erkannte Antigen ist, der vom aus HB-8489 erhältlichen Hybridom hergestellt wird, in einer Körperflüssigkeit des Patienten durch einen quantitativen Immuntest unter Verwendung eines gegen das Antigen gerichteten monoclonalen Antikörpers; und

(b) Vergleich der in (a) bestimmten Menge mit der Menge des Antigens, das in der entsprechenden Körperflüssigkeit von normalen Menschen vorliegt, um zu ermitteln, ob die in (a) bestimmte Menge relativ zu der in der entsprechenden Körperflüssigkeit von normalen Menschen vorliegenden Menge erhöht ist, wobei eine wesentliche Erhöhung ein Anzeichen für Brustkrebs ist.

2. Verfahren zur Überwachung des Brustkrebsstadiums in einem menschlichen Patienten, umfassend:

(a) Bestimmung der Menge eines Antigens, welches das das von dem monoclonalen Antikörper erkannte Antigen ist, der vom aus HB-8491 erhältlichen Hybridom hergestellt wird, oder welches das von dem monoclonalen Antikörper erkannte Antigen ist, der vom aus HB-8489 erhältlichen Hybridom hergestellt wird, in vom Patienten regelmäßig über ein bestimmtes Zeitintervall erhaltenen Proben von einer Körperflüssigkeit durch einen quantitativen Immuntest unter Verwendung eines gegen das Antigen in den jeweiligen Proben gerichteten monoclonalen Antikörpers; und

(b) Vergleich der Mengen, wobei ein Anstieg der Menge ein Anzeichen für vermehrte Tumorlast und eine Abnahme der Menge ein Anzeichen für verminderte Tumorlast ist.

3. Verfahren zur Bestimmung des klinischen Stadiums von Brustkrebs in einem menschlichen Patienten, umfassend:

(b) Vergleich der in Schritt (a) bestimmten Menge mit vorher bestimmten Mengen des Antigens, die in der entsprechendem Körperflüssigkeit von menschlichen Brustkrebspatienten in den verschiedenen Stadien der Krankheit vorkommen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Körperflüssigkeit Serum ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der monoclonale Antikörper derjenige ist, der von dem aus HB-8491 oder HB-8489 erhältlichen Hybridom hergestellt wird.