DE3588043T2

DE3588043T2 - Cytokeratin-tumormarkierer und test zu deren nachweis.

Info

Publication number: DE3588043T2
Application number: DE3588043T
Authority: DE
Inventors: Alan Brabon; Robert Cardiff; Paul Rossitto
Original assignee: University of California Berkeley
Current assignee: University of California Berkeley
Priority date: 1984-01-06
Filing date: 1985-01-03
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2005-01-04
Also published as: JP2723203B2; JP2617289B2; EP0167616B1; JPS6447392A; WO1985003132A1; DE3588043D1; JPH08275778A; EP0167616A1; JPH10123138A; CA1336171C; US4775620A; JPS6452800A; EP0167616A4; JP2537539B2; JP2896362B2; ATE125626T1; JPH0681760B2; JPS61501048A

Description

Die Fähigkeit, Krebs durch die Identifizierung von Tumormarkern nachzuweisen und zu diagnostizieren, ist ein Gebiet von breitem Interesse. Tumormarker sind Substanzen, typischerweise Proteine, Glykoproteine, Polysaccharide u.dgl., die von Tumorzellen erzeugt werden und für diese charakteristisch sind. Oft wird ein Tumormarker durch normale, sowie durch Tumorzellen erzeugt. In der Tumorzelle ist die Produktion jedoch in gewisser Weise atypisch. Beispielsweise kann die Produktion der Tumormarker in der Krebszelle deutlich erhöht sein. Alternativ dazu können Proteine oder andere Substanzen, die normalerweise im Inneren oder auf der Oberfläche normaler Zellen vorhanden sind, freigesetzt oder in den Kreislauf abgegeben werden, wenn die Zelle bösartig wird. Durch den Nachweis solcher abgesonderter Substanzen in Serum kann somit Bösartigkeit diagnostiziert werden.
Ein weiteres Problem bei der Krebsdiagnose betrifft die Identifizierung des zellulären Ursprungs sowohl von primären als auch von metastatischen Tumoren. Bei beiden Tumorarten ist es manchmal schwierig, morphologisch unter Tumoren unterschiedlichen zellulären Ursprungs zu unterscheiden, z.B. Tumore epithelialen Ursprungs (Karzinome), Tumore, die im Nichtepithel-Bindegewebe entstehen (Sarkome) und Lymphtumore (Lymphome). Weiters ist es bei Brust-Epithelkrebs oft schwierig, unter Tumoren zu unterscheiden, die in duktalen Epithelgeweben, sekretorischen Epithelgeweben und Myoepithelgeweben entstehen.
Daher ist es wünschenswert, zuvor unerkannte Tumormarker zu identifizieren, insbesondere Tumormarker, die in den Kreislauf abgesondert werden und durch Serumassays identifiziert werden können. Es ist auch wünschenswert, Verfahren und Zusammensetzungen zu entwickeln, die die Bestimmung des zellulären Ursprungs eines bestimmten Tumors ermöglichen.
Nach dem Stand der Technik wurde ein Protein von 52.000 Dalton identifiziert, das durch bestimmte Brustzellinien als Reaktion auf Östradiol-Stimulation freigesetzt wurde.
Siehe Westley und Rochefort (1980) Cell 20: 353-3362 und Veith et al. (1983) Cancer Res. 43: 1861-1868. Es wurde gezeigt, daß monoklonale Antikörper gegen die menschliche MCF-7-Brustkrebs-Zellinie ein Zytosolprotein von 24 kD identifizieren. Ciocca et al. (1982) Cancer Res. 42: 4256-4258. Ein als Gewebe-Polypeptid-Antigen (TPA) bezeichnetes Protein ist mit zytoplasmatischen Zwischenfilamenten von Epithelzellen verwandt. TPA ist laut Berichten sowohl in Serum als auch als Zelloberflächenmarker ein Tumormarker. Siehe Altmannsberger et al. (1981) Virchows Arch. [Cell Pathol.J 37: 277-284, worin Brustkrebszellen mit Antikörpern gegen Präkeratin reagierten; Wagner et al. (1982) Aust. N.Z.J. Surg. 52: 414 3, worin erhöhte Serumwerte von TPA bei einigen Patienten nachgewiesen wurden, die an Magen- und Dickdarmkrebs litten; Mross et al. (1983) Klin. Wochenschr. 61:461468, worin erhöhte Serum-TPA-Werte bei Brustkrebspatienten festgestellt wurden; und Luning und Nilsson (1983) Acta Chemica Scandinavica 37: 731-753, worin über eine partielle Sequenzhomologie zwischen TPA und bestimmten filamentösen Proteinen, einschließlich epidermaler Keratine, berichtet wurde. Sangtec Medical, Bromma, Schweden, verkauft ein Set zum Nachweis von TPA in Serum und Plasma unter dem Handelsnamen Prolifigren RIA-Set. Mariresse et al. (1981) J. Steroid Biochem. 15: 375- 381 berichten über die Gegenwart eines Proteins von etwa 50 kD mit niedriger Umsetzungsrate im Kulturmedium von MCF-7-Zellen. Es wurde über den serologischen Nachweis von Keratin bei einem Krebspatienten berichtet. Madri et al. (1983) Lab. Invest. 48: 98-107.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen, die sich zum Nachweisen und Überwachen von primären und metastatischen Epitheltumoren, insbesondere von Epithel-Brusttumoren, eignen. Das Verfahren beruht auf dem Nachweis löslicher extrazellulärer Zytokeratine (Cytokeratine), die von neoplastischen Epithelzellen in den Kreislauf abgegeben werden. Bei einer Identifizierung besitzen die extrazellulären Zytokeratine ein Molekulargewicht von etwa 40 bis 46 Kilodalton und einen isoelektrischen Punkt von 5,0 bis 5,2. Sie sind mit Proteinen von etwa 40 bis 48 kD verwandt, die auf der Zelloberfläche neoplastischer Epithelzellen vorzufinden sind.
Sowohl die extrazellulären Zytokeratine als auch die Zelloberflächen-Proteine sind ihrerseits mit intrazellulärem Zytokeratin verwandt, doch bei einer anderen Identifizierung des extrazellulären Zytokeratins unterscheidet sich dieses dahingehend sowohl von intrazellulärem Zytokeratin als auch von Zelloberflächen-Zytokeratin, daß es einen blockierten N-Terminus aufweist, in wäßriger Lösung löslich ist und immunologisch mit intrazellulären Zytokeratinen vom Typ 8 oder 18 verwandt ist. Der Nachweis des extrazellulären Zytokeratins kann günstigerweise durch Reaktion mit monoklonalen Antikörpern aus den Hybridom-Zellinien UCD/AB 6.11, UCD/PR 10.11 oder anderen Antikörpern mit ähnlicher Spezifität erfolgen.
Monoklonale Antikörper, die mit Epithel-Zytokeratinen zu reagieren imstande sind, insbesondere UCD/PR 10.11, können verwendet werden, um Epitheltumore (Karzinome) von Nicht-Epitheltumoren, wie z.B. Sarkomen und Lymphomen, zu unterscheiden. Außerdem können Gruppen oder Paletten von Antikörpern dazu dienen, unter primären und metastatischen Brusttumoren duktalen Epithel-, sekretorischen Epithel- und Myoepthitel-Ursprungs zu unterscheiden.
Es werden Verfahren und Zusammensetzungen für den Nachweis, die Identifizierung und die Kontrolle von Epitheltumoren, insbesondere von Brust-Epitheltumoren, bereitgestellt. Es stellte sich heraus, daß sowohl normale als auch neoplastische Epithelzellen durch die Gegenwart eines Proteins von etwa 42 bis 48 kD auf der Zelloberfläche gekennzeichnet sind, welches Protein immunologisch und bezüglich der Zusammensetzung mit intrazellulärem Zytokeratin verwandt ist. Es stellte sich weiters heraus, daß eine kleinere Form des mit Zytokeratin verwandten Proteins (etwa 40 bis 46 kD) sowohl von normalen als auch von neoplastischen Zellen freigesetzt wird, daß aber die Freisetzungsrate aus neoplastischen Zellen deutlich höher ist. Somit kann eine Patientenpopulation durch Assay auf die Gegenwart solcher extrazellulärer Zytokeratine in Serum hinsichtlich Epithelneoplasmen gescreent werden. Der Assay eignet sich besonders für die Überwachung des Fortschritts von Patienten, die einer Behandlung auf Epithelneoplasmen unterzogen werden.
Zwischenfilamente sind eine Hauptkomponente des Zellskeletts in vielen Zellarten. Epithelzellen von Geweben, z.B. der Brustdrüse, enthalten lösliche, aus Keratin bestehende Zwischenfilamente. Diese als Zytokeratine bezeichneten Proteine finden sich sowohl in normalen als auch in neoplastischen Brustzellen und umfassen eine Gruppe von zumindest 19 unterschiedlichen Proteinen, die als Typen 1 bis 19 bezeichnet werden (Moll et al. (1982) Cell 31: 11). Man war bisher der Ansicht, daß solche Zytokeratine intrazelluläre Zellskelett-Proteine wären. Die im später folgenden Experimentellen Teil angeführten Arbeiten zeigen jedoch, daß Proteine, die immunologisch und bezüglich ihrer Zusammensetzung mit solchen intrazellulären Zytokeratinen verwandt sind, auch auf der Zelloberfläche zu finden sind und aus den Zellen abgesondert werden.
Das Zelloberflächen-Zytokeratin und das lösliche extrazelluläre Zytokeratin, die in der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, sind strukturell und immunologisch mit bekannten intrazellulären Zytokeratinen verwandt, mit diesen aber nicht identisch. "Strukturell verwandt" bedeutet, daß zumindest 60%, üblicherweise zumindest 75%, Homologie zwischen den extrazellulären/Zelloberflächen-Zytokeratinen und den intrazellulären Zytokeratinen besteht. "Immunologisch verwandt" bedeutet, daß es zumindest eine gemeinsame epitope Stelle unter den Zytokeratinen gibt, wobei es sich üblicherweise um eine Vielzahl epitoper Stellen, jedoch nicht alle epitopen Stellen, handelt. Beim Beispiel der Brust-Epithelzellen stellt sich heraus, daß zumindest drei Epitope auf dem Zelloberflächen-Zytokeratin vorhanden sind, die mit den intrazellulären Zytokeratinen vom Typ 8, 18 und 19 immunoiogisch kreuzreaktiv sind. Das extrazelluläre Zytokeratin, das aus Brust-Epithelzellen freigesetzt wird, ist mit inatrazellulärem Zytokeratin vom Typ 8 oder 18 am stärksten kreuzreaktiv und in wäßriger Lösung löslich. Weiters stellt sich heraus, daß das extrazelluläre Zytokeratin einen blockierten N-Terminus aufweist.
Der Nachweis des extrazellulären Zytokeratins in einer biologischen Flüssigkeit, wie z.B. Serum, kann mit dem Status eines Epithelkarzinoms in Verbindung gebracht werden. Neoplastische Epithelzellen setzen das Zytokeratin im Vergleich zu normalen Epithelzellen mit erhöhter Rate frei, und die Beobachtung des Serumwerts von Zytokeratin kann mit dem Krankheitszustand korreliert werden. Beispielsweise erwartet man, daß Serumwerte von Zytokeratinen nach der chirurgischen Entfernung eines Tumors oder durch dessen durch andere Therapieformen hervorgerufene Rückbildung abnehmen. Die Serumwerte des Patienten können anschließend kontrolliert werden, um erhöhte Mengen extrazellulärer Zytokeratine festzustellen, die auf eine erhöhte Tumorbelastung entweder primärer oder metastatischer Art schließen lassen würden.
Die vorliegende Erfindung eignet sich auch zum Screenen von Tumorzellen, um den Zellursprung der Tumorzellen zu bestimmen. Die Gegenwart von Zytokeratinen in den Tumorzellen deutet auf den Epithelursprung der Zellen hin. Somit können Epitheltumore durch Reaktion mit Antikörpern, die für die Zell-Zytokeratine spezifisch sind, von Nicht-Epitheltumoren unterschieden werden. Überdies stellte sich heraus, daß bestimmte mit Zytokeratinen reagierende Antikörper unter duktalen Epithel-, sekretorischen Epithel- und Myoepithel-Brustzellen unterscheiden können. Durch Verwendung einer Gruppe oder Palette von Antikörpern, die mit jedem Typ von Epithel- Brustzellen reagieren, mit den beiden anderen Typen von Epithel-Brustzellen jedoch wesentlich schwächer reagieren, kann somit der zelluläre Ursprung eines Brusttumors geeigneterweise durch histochemische Einfärbungsverfahren bestimmt werden. Unter "wesentlich schwächer reagieren" versteht man, daß es möglich ist, positive und negative Proben auf der Grundlage der Reaktivität mit dem Antikörper mittels herkömmlicher Verfahren zu bewerten. Das Wissen um den zellulären Ursprung eines Tumors ist für die Auswahl des richtigen Therapieansatzes von Nutzen.
Geeigneterweise kann die Gegenwart der Zell-Zytokeratine und der löslichen extrazellulären Zytokeratine immunologisch mittels herkömmlicher Immunassays oder histochemischer Färbeverfahren unter Verwendung von mit den Proteinen reagierenden Antikörpern nachgewiesen werden. Solche Antikörper können, wie weiter unten beschrieben, herkömmlich unter Verwendung entweder der Zell-Zytokeratine oder der extrazellulären Zytokeratine oder von Antigen-Fragmenten davon als Immunogen erzeugt werden. Geeigneterweise können vollständige oder lysierte Zellen aus Brusttumorzellen als Immunogen verwendet werden. Alternativ dazu können für die Zytokeratine spezifische Antikörper verwendet werden, um die Zytokeratine aus Serum, primären Tumorzellen oder Tumorzellinien zu isolieren, um gereinigtes Antigen zur Verwendung als Immunogen zu erhalten.
Antikörper können durch Injizieren des erwünschten Immunogens gemäß herkömmlichen Verfahren in eine Vielzahl an Wirbeltieren gebildet werden. Zu den geeigneten Wirbeltieren zählen Mäuse, Ratten, Schafe und Ziegen, insbesondere Mäuse. Üblicherweise wird den Tieren regelmäßig Blut abgenommen, wobei die aufeinanderfolgend abgenommenen Blutmengen verbesserte Titer- und Spezifitätswerte aufweisen. Die Antigene können intramuskulär, intraperitoneal, subkutan od.dgl. injiziert werden. Üblicherweise verwendet man ein Vehikel, wie z.B. das vollständige oder unvollständige Freund'sche Adjuvans. Falls gewünscht können monoklonale Antikörper gebildet werden.
Zur Bildung monoklonaler Antikörper werden Milzzellen aus immunisierten Wirbeltieren immortalisiert. Die Art der Immortalisierung ist nicht entscheidend. Das derzeit gängigste Verfahren ist die Fusion mit einem Myelom-Fusionspartner. Andere Verfahren sind die EBV-Transformation, die Transformation mit bloßer DNA, z.B. Onkogenen, Retroviren usw., oder jedes andere Verfahren, das für eine stabile Aufrechterhaltung der Zellinie und die Produktion monoklonaler Antikörper sorgt. Menschliche monoklonale Antikörper können durch Fusion der Milzzellen mit einem geeigneten menschlichen Fusionspartner, z.B. WI-L2 (beschrieben in EP-A-0.062.409), gebildet werden. Ein Verfahren zur Erzeugung von monoklonalen Mäusex-Mäuse- Antikörpern wird durch Oi und Herzenberg in "Selected Methods in Cellular Immunology", Mishell und Shiigi (Hrsg.), W. H. Freeman and Co., San Francisco (1980) S. 351-371, genau beschrieben. Die Antikörper der Erfindung können jeder beliebigen Immunoglobulin-Klasse angehören, d.h. IgG, einschließlich von IgG1, IgG2a, und IgG2b, IgA, IgD, IgE und IgM, üblicherweise IgG oder IgM.
Besonders nützliche monoklonale Antikörper wurden zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung erzeugt. Antikörper UCD/AB 6.11 reagiert mit intrazellulären, Zelloberflächen- und extrazellulären Formen von Epithel-Zytokeratinen, insbesondere mit Zytokeratin vom Typ 18, das für sekretorische Epithelzellen charakteristisch ist. Antikörper UCD/PR 10.11 reagiert mit intrazellulären und extrazellulären Formen von Zytokeratin, insbesondere mit Zytokeratinen vom Typ 8, die für duktale Epithelzellen charakteristisch sind. UCD/PR 7.01 reagiert mit intrazellulären und extrazellulären Formen eines Antigens, das für Myoepithelzellen charakteristisch ist. Diese drei Antikörper eignen sich besonders zum Screenen neoplastischer Epithelzellen, um zu bestimmen, ob sie duktalen, sekretorischen oder myoepithelialen Urprungs sind.
Antikörper UCD/PR 10.11 eignet sich auch besonders zum Screenen von Tumorzellen, um zu bestimmen, ob sie epithelialen Ursprungs sind. Es stellt sich heraus, daß der UCD/PR10.11-Antikörper eine hohe Affinität für Epithelzellen aufweist und eine sehr spezifische Färbung mit sehr niedrigen Hintergrundwerten liefert.
Sobald Antikörper mit geeigneter Spezifität gebildet wurden, steht eine Vielzahl an immunologischen Assayverfahren zur Verfügung. Zahlreiche kompetitive und nichtkompetitive Proteinbindungsassays wurden in der wissenschaftlichen und der Patentliteratur beschrieben, und eine große Anzahl an solchen Assays ist im Handel erhältlich. Beispiele für Immunassays, die sich zum Nachweis des Serumantigens eignen, finden sich in den folgenden US Patentschriften: 3.791.932; 3.817.837; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074 und 4.098.876.
Es ist üblicherweise erforderlich, die biologische Probe vor der Durchführung des Immunassays in bestimmter Weise vorzubehandeln. Die Probenpräparation variiert je nach der Quelle der biologischen Probe. Feste Tumore und andere Gewebeproben werden durch Lysieren der Zelle präpariert. Serumproben werden typischerweise durch Gerinnung von Gesamtblut und Isolieren des Überstands gemäß wohlbekannter Verfahren präpariert. Andere biologische Flüssigkeiten, z.B. Samen, Speichel und Urin, können auch auf die Gegenwart des extrazellulären Zytokeratins hin untersucht werden.
Auch herkömmliche immunohistochemische Färbeverfahren können zum Nachweis der Zytokeratine in Gewebeproben dienen. Beispielsweise kann die Gewebeprobe in Formal in, B-5 oder anderen herkömmlichen histologischen Konservierungsmitteln fixiert, dehydriert und in Paraffin eingebettet werden; was in den Pathologielabors jedes Krankenhauses ein Routineverfahren darstellt. Aus dem Paraffin können Abschnitte herausgeschnitten und auf Objektträger aus Glas aufgebracht werden. Das zelluläre Antigen kann dann nachgewiesen und lokalisiert werden, indem es entweder einem markierten Antikörper oder einem markierten sekundären Antikörper ausgesetzt wird. Alternativ dazu eignen sich zytologische Präparate. Beispielsweise können Zellen aus der Gewebeprobe auf einem Objektträger fixiert werden - typischerweise durch Aussetzen gegenüber Formal in in einem Puffer bei einem physiologischen pH-Wert und anschließende Suspension in Aceton und Pelletieren auf gelatinbeschichtete Objektträger durch Zentrifugation. Der Zellenoberflächen-Rezeptor kann dann entweder durch Aussetzen gegenüber markiertem Antikörper oder unmarkiertem Antikörper und einem markierten sekundären Antikörper lokalisiert werden. Die Menge des Zelloberflächen-Proteins in der Probe ist direkt proportional zur Menge der gebundenen Markierung.
Ganzkörper-Abbildungsverfahren unter Einsatz von Radioisotopen-Markern können zur Lokalisierung von Epitheltumoren&sub1; insbesondere von metastasierten Brustkarzinomen, verwendet werden. Die Antikörper der Erfindung oder Fragmente davon werden an ein geeignetes Radioisotop gebunden, typischerweise &sup9;&sup9;Tc, ¹²³I, ¹²&sup5;I oder ¹³¹I oder eine Kombination davon, und parenteral verabreicht. Die Bioverteilung der Markierung wird durch Szintigraphie kontrolliert, wobei Anhäufungen der Markierung mit der Gegenwart östrogen-empfindlicher neoplastischer Brust-Epithelzellen in Verbindung gebracht werden können. Ganzkörper-Abbildungsverfahren sind in den US Patentschriften 4.036.945 und 4.311.688 beschrieben.
Die folgenden Versuche dienen der Veranschaulichung und sind nicht einschränkend.

EXPERLMENTELLER TEIL

Es gelten die folgenden Abkürzungen:
BSA - Rinder-Serumalbumin
DCC - Dextran-beschichtete Aktivkohle
ER - Östrogenrezeptor
HMFGM - Menschliche Milchfettkügelchen-Membran
IEF - Isoelektrische Fokussierung
MCA - Monoklonaler Antikörper
PBS - Phosphat-gepufferte Salzlösung (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,3, enthält 0,15 M NaCl)
RIA - Radioimmunassay
SDS-PAGE - Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Zellinien

1. MCF-7-Zellen. Die menschliche MCF-7-Brusttumor-Zellinie wurde zur Immunisierung und zum Screenen auf Antikörper-Produktion verwendet. Es handelt sich dabei um eine gut charakterisierte Zellinie, die aus dem Pleuraerguß eines Patienten mit metastatischem Brustkrebs stammte (Soule et al. (1973) J. Natl. Cancer Res. 51: 1409- 1416). Es wurde gezeigt daß sie sowohl Östrogen- als auch Progesteron-Rezeptoren enthält.
2. HBL-100. HBL-100 ist eine nicht-maligne menschliche Brustepithel-Zellinie, die aus Muttermilchproben entwickelt wurde (Polanowski et al. (1976) In Vitro 12: 328-336). Sie enthält keine Östrogen-Rezeptoren.
3 186-NWT. 186-NWT ist eine menschliche Epithel-Zellinie aus dem Bauchwasser eines Patienten mit metastatischem Brustkrebs. Sie weist keine Brustzellmarker auf und ist ER-negativ.
4. P3x63A98.653. Dies ist eine Mäuse-Myelom-Zellinie, die als Hybridom- Fusionspartner zur MCA-Produktion verwendet wird. Sie erzeugt keinerlei Immunoglobulin oder Immunoglobulin-Untereinheiten (Kearney et al. (1979) J. Immunol. 123: 1548-1555).

Wachstumsmedien

Hybridom-Zellinien wurden in Roswell Park Memorial Institute Tissue Culture Medium (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.) gezüchtet, das mit 10% hitzeinaktiviertem Kalbsserum, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin und 25 ugfml Gentamicin ergänzt wurde. Menschliche Brust-Zeliinien wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Minimal Essential Medium mit entweder 5% Kalbs- oder Pferdeserum, 1 ug/ml Insulin, 25 ug/ml Gentamicin und 100 nM 17β-Östradiol (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) am Leben erhalten.
5. Zellinie AE1 ist eine von Tseng et al. (1982) Cell 30: 361-372 beschriebene Hybridom-Zellinie, die durch Immunisierung mit Zytokeratinen gebildet wurde. Die von der Zellinie erzeugten Antikörper sind spezifisch für alle sauren Zytokeratine und speziell für MCF-7 vom Typ 19.
6. Zellinie βH11 ist eine von Gown und Vogel (1982) J. Cell Bio. 95: 414-424 beschriebene Hybridom-Zellinie, die durch Immunisierung mit Zytokeratin gebildet wurde. Die von der Zellinie erzeugten Antikörper sind spezifisch für Zytokeratin vom Typ 8, 18 und 19 in MCF-7-Zellen.

Gewebeproben

Paraffinblöcke von normalem und malignem menschlichen Brustgewebe stammten von der School of Medicine, Department of Pathology, University of California Medical Center, Sacramento, Kalifornien.

Menschliche Milchfettkügelchen-Membranen

Delapidierte HMFGM wurde durch Extrahieren des Rahmanteils menschlicher Milch mit Chloroform und Ether gebildet (Ceriani et al. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 74: 582-586).

Produktion monoklonaler Antikörper

Eine Standard-Polyethylenglykol-Fusion, ein Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin- Auswahlverfahren nach Oi und Herzenberg (1980) in: Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell und Shiigi, Hrsg. \N. H. Freeman and Co., San Fransisco, CA, S. 351-372. Antikörper-erzeugende Klone wurden mit radioiodiertem Hasen-Anti-Mäuse- IgG durch Festphasen-RIA und Autoradiographie identifiziert, wie von Tsu und Herzenberg (1980) ebda. S. 373-397 beschrieben.
BALB/c-Mäuse wurden mit lebenden, intakten MCF-7-Zellen (2x10&sup6; Zellen) einmal pro Woche drei Wochen lang intraperitoneal hyperimmunisiert. Nach drei Wochen wurden die Mäuse ein viertes Mal mit 2x10&sup6; Zellen drei Tage vor der Fusion intraperitoneal immunisiert. Mäusemilz-Zellen wurden dann mit P3x63Ag8.653-Mäuse-Myelomzellen hybridisiert.
Ganze Leber-MCF-7- und HBL-100-Zellen wurden auch in Festphasen-RIA zum Screenen der ersten und zweiten Stufe verwendet (Brown et al. (1979) J. Immunol. Methods 31: 201-209). Lebende Zellen dienten zur Vermeidung der Selektion nach Fixierungsartefakten. MCF-7 diente als positiver Screen zur Identifizierung von Antikörpern gegen Antigene auf ER-positiven Zellen. HBL-100 diente als negativer Screen zur Identifizierung ER-negativer Antikörper. Aus normaler menschlicher Milch isolierte HMFGM wurde dazu verwendet, nach normalen Brustepithel- Oberflächenkomponenten unter Verwendung eines Standard-Festphasen-RIA zu selektieren (Tsu und Herzenberg (1980), oben).
Die endgültigen Screening-Kriterien beruhten auf der direkten Visualisierung der Antigenverteilung in Paraffin-Objektträgern mittels des Immunoperoxidase-Verfahrens zum Nachweis von Antigenen.
Monoklonale Antikörper der zweiten Generation wurden wie oben erzeugt, außer daß die Mäuse mit Antigen immunisiert wurden, das entweder aus MCF-7-Gewebekultur- Medium (Antikörper der Fusionsserie 10) oder einem Membranextrakt aus 186-NWT- Zellen (Antikörper der Fusionsserie 7) isoliert wurde. Die Antigene wurden unter Verwendung einer Immunaffinitäts-Säule isoliert, die, wie unten beschrieben, mit UCD/AB 6.11-Antikörpern gebildet wurde. Die Screening-Verfahren für die Antikörper der zweiten Generation waren wie folgt. Die Selektion der Antikörper der zweiten Generation beruhte auf der Reaktivität in Festphasen-RIA, Western Blots und Immunperoxidase (Details folgen weiter unten).

Immundiffusion

Die MCA wurden mittels des Doppeldiffusions-Verfahrens nach Ouchterlony und Nilsson (1973) in: Handbook of Experimental Immunology, Weir, Hrsg., Blackwell, London (Kapitel 19), isotypisiert. Überstände jedes Klons und in PBS (0,90/0 NaCl, 10 mM NaPO&sub4;, pH 7,5) 1:100 verdünntes Bauchwasser wurden gegen Antiseren umgesetzt, die für jede Immunoglobulin-Klasse spezifisch waren: IgM, IgG1, IgG2a, IgG3 und Iga. Klassenspezifische Antiseren stammten von Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind.

Festphasen-RIA mit lebenden Zellen

Zellen wurden aus 75 cm²-Gewebekultur-Kolben durch Trypsinisierung geerntet, in 96 Napf-Gewebekultur-Platten mit 50.000 Zellen pro Napf plattiert und 18 bis 24 Stunden lang inkubiert. Alle Inkubationen erfolgten bei 37ºC in 5% CO&sub2;. Das Wachstumsmedium wurde abgesaugt, 150 ul Wachstumsmedien mit 0,08% Natriumazid hinzugefügt und die Zellen 30 min lang inkubiert. Die Zellen wurden mit "Hank's balanced salt solution" gespült, die 50/0 Kalbsserum und 0,08% Natriumazid enthielt (Waschpuffer). Waschpuffer (100 ul) wurde hinzugefügt und die Zellen 30 min lang inkubiert. Die Zellen wurden wiederum mit Waschpuffer gespült und 50 ul Gewebekultur-Flüssigkeit aus einer Hybridomkultur oder verdünntes Bauchwasser hinzugefügt und 1 Stunde lang inkubiert. Die Zellen wurden anschließend zweimal mit Waschpuffer gespült und 50ul (2x10&sup4; cpm) ¹²&sup5;I-Hasen-Anti-Mäuse-IgG hinzugefügt und 1 Stunde lang inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit Waschpuffer gewaschen und die positiven Näpfe durch Autoradiographie visualisiert.

Proteinanalyse

Proteine wurden durch Natriumdodecyisulfat-Polyacrylamid-Platten-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert, wie von Laemmli (1970) Nature 227: 680-685 beschrieben; dabei wurde ein 4%-iges Acrylamid-Stapelgel mit einem 10%-igen Trenn-Gel verwendet, die beide 0,2% SDS enthielten. Proben wurden in 50 ul Probenpuffer aufgebracht (63 mM TRlS, pH 6,8, 10% Glyzerin, 5% 2-Mercaptoethanol, 2,3% SDS) und vier Stunden lang unter konstantem Strom von 20 mA einer Elektrophorese unterzogen. Das Molekulargewicht von Proteinen wurde durch ihre Mobilität im Verhältnis zu Standardproteinen mit bekanntem Molekulargewicht abgeschätzt.
Eine zweidimensionale Elektrophorese erfolgte gemäß O'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250: 4007-4021, außer daß die SDS-PAGE in der zweiten Dimension wie oben beschrieben erfolgte. Es wurden entweder 40 ul immunaffinitäts-gereinigte Gewebekultur-Flüssigkeit (bis zur Trockene eingedampft und erneut in Lysepuffer gelöst) oder 40 ul Zellproteine in Lysepuffer (1 konfluente 100 mm-Petrischale, gelöst in 2 ml Lysepuffer) analysiert.
Die Proteinkonzentration wurde mittels eines Farbstoff-Bindungsassays bestimmt (Bio- Rad Laboratories, Richmond, CA).

Western Blots

Zur Charakterisierung des durch den Antikörper identifizierten Antigens wurde eine Modifikation des Western Blots (beschrieben von Towbin, et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 4350-4354) verwendet, worin die Proteine von SDS-PAGE-Gelen auf Nitrozellulose-Filter übertragen und durch den MCA identifiziert werden. Nach der Übertragung auf die Nitrozellulose-Filter wurden überzählige Protein-Bindungsstellen durch Tränken der Filter in 3% BSA enthaltender PBS blockiert. Das Antigen wurde durch einstündiges Inkubieren der Platte in 30 ml PBS lokalisiert, die 1% BSA und 1- 2x10&sup7; cpm iodierten Antikörper enthielt. Das Filter wurde anschließend gespült, getrocknet und Autoradiographie unterzogen. Mit diesem Verfahren können selbst so geringe Mengen wie 100 pg Protein nachgewiesen werden.

Analyse markierter Proteine

Zellen wurden 10 Tage lang in 5% Kalbsserum gezüchtet, das mit DCC behandelt worden war, um Steroidhormone zu entfernen. Zwei Tage vor dem Testen wurden Zellen trypsinisiert und mit 4x10&sup6; Zellen pro 100 mm Petrischale plattiert. Nach 24 Stunden wurde Östradiol zum Medium hinzugefügt, um Konzentrationen von 0, 1, 10 und 100 nM Östradiol zu erzielen. Das Medium wurde nach 24 Stunden ausgetauscht. Nach 48-stündiger Hormonbehandlung wurden die Zellen zweimal mit "Hank's balanced salt solution" gewaschen. Es wurde serumfreies Medium, das wie oben mit Hormonen versetzt war und 10% der normalen Methionin-Konzentration plus 200 uCi/ml ³&sup5;S-Methionin enthielt, hinzugefügt. Die Zellen und das Medium wurden nach einer 6-12-stündigen Inkubation gewonnen.

Immunperoxidase-Färbung

Das angewandte Immunperoxidase-Färbeverfahren war eine Modifikation des Avidin- Biotin-Immunperoxidase-Verfahrens nach Hsu et al. (1981) J. Histochem. Cytochem. 29: 577-580, beschrieben von Horan-Hand et al. (1983) Cancer Res. 43: 728-735.

Immunaffinitäts-Chromatographie

Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey) wurde mit Bromcyan aktiviert, wie von March et al. (1974) Anal. Biochem. 60: 149-152 beschrieben. Antikörper wurden aus Bauchwasser durch Fällung in 40%-igem Ammoniumsulfat über Nacht bei 4ºC gereinigt. Der Niederschlag wurde in 0,2 M NaPO&sub4;, pH 7,3, gelöst und dagegen dialysiert. Ein Volumsteil aktivierte Sepharose die zu einem kompakten Kuchen filtriert worden war, wurde zu 1,5 Volumsteilen Antikörperlösung hinzugefügt (2 mg Protein/ml). Die Antikörper wurden 16 Stunden lang bei 4ºC unter leichtem Rühren angekoppelt. Die Sepharose wurde wiederum zu einem kompakten Kuchen filtriert, mit drei Volumsteilen Wasser gewaschen und zu 1,5 Volumsteilen 1 M Ethanolamin, pH 9, hinzugefügt, um nicht-umgesetzte Stellen zu blockieren. Diese Reaktion erfolgte 2 Stunden lang bei 27ºC. Die Sepharose wurde dann mit jeweils zehn Volumsteilen Phosphatpuffer (0,1 M NaPO&sub4;, pH 7,3, 1,0 M NaCl), 0,1 M Essigsäure und wiederum Phosphatpuffer (in dieser Reihenfolge) gewaschen. Das Harz wurde bei 4ºC in Phosphatpuffer mit 0,1 % Natriumazid gelagert.
Das Affinitätsharz wurde in 0,2-1,0 ml-Säulen gefüllt, mit dem fünffachen Säulenvolumen 6 M Guanidin-HCl, pH 1,5, abgetrieben und mit zumindest zehn Volumsteilen PBS vor der Verwendung gespült. Die Gewebekultur-Flüssigkeit wurde gesammelt und 2 mM EDTA und Phenylmethylsulfonylfluorid hinzugefügt, um die Proteolyse zu hemmen. Bruchstücke wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 5000 X g und anschließende Filtration durch Glaswolle und 0,22 pm-Filter entfernt. Die Probe wurde vor der Affinitätssäule mit 20-30 ml/h bei 4ºC durch eine 1 ml-Säule mit Sepharose 4B geschickt. Nicht-spezifisch gebundenes Protein wurde mit 10-20 ml 0,5 M Harnstoff in PBS eluiert. Antigen wurde mit dem vierfachen Säulenvolumen 6 M Guanidin-HCl, pH 1,5, eluiert, das Eluat neutralisiert und dialysiert.

Iodierung von Antikörpern

Antikörper wurden nach einem Chloramin T-Verfahren (Mc Conahey et al. (1980) Methods Enzymol. 70: 210-213) bis zu einer spezifischen Aktivität von etwa 2 uCi/ug iodiert. Die Reaktionsprodukte wurden auf einer 1 x 30 cm-Säule aus Sephadex C-25 in PBS mit 1% BSA aufgetrennt und bis zur Verwendung bei -70ºC gelagert.

Ergebnisse

1. Produktion und Charakterisierung monoklonaler Antikörper

Das autoradiografische Bindungsmuster im RIA mit lebenden Zellen war die Grundlage der anfänglichen Selektion von MCA. 87 von 288 Näpfen der anfänglichen Fusion enthielten Hybridkolonien, die Antikörper gegen die MCF-7-Zellinie bildeten. 22 dieser Kolonien wurden zur Expansion und weiteren Charakterisierung ausgewählt. Neun Kolonien wurden durch Grenzverdünnung kloniert. Von diesen wurden zwei mit UCD/AB 6.01 und UCD/AB 6.11 bezeichnete Antikörper zur weiteren Charakterisierung ausgewählt.
Die Spezifität von UCD/AB 6.11 für MCD-7 wurde durch das Western Blot-Verfahren aufgezeigt. UCD/AB 6.11 band sich an zwei SDS-PAGE-Banden in MCD-7-Extrakten, zeigte jedoch keine Bindung an die HBL-100- und NWT-186-HWT-Extrakte oder an HMFGM. Zum Vergleich zeigte ein weiterer Klon (bezeichnet als UCD/AB 6.13) Bindung an alle drei Zellinien, jedoch nicht an die HMFGM.
Der Nachweis zellulärer Antigene in Paraffin-Abschnitten mittels des Avidin-Biotin- Immunperoxidase-Verfahrens sollte sicherstellen, daß die MCA menschliche Brust- Antigene und nicht nur Gewebekultur-Artefakte von MCD-7 banden.
Die Verteilung der durch UCD/AB 6.11 in normalem, dysplastischem und malignem Brustgewebe identifizierten Antigene wurde mit Formal in und B-5-fixiertem Gewebe bestimmt. Die B-5-Fixierung ergab die besseren zytologischen Details.
Mittels Avidin-Biotin-lmmunperoxidase-Färbung stellte sich heraus, daß sich UCD/AB 6.11 an normale, prälaktierende Epithelzellen, aber nicht an normale Myoepithel-, Stroma- oder luminale Sekretionsprodukte bindet. Das durch UCD/AB 6.11 nachgewiesene Antigen wurde vor allem in supranuklearen Granula lokalisiert. Dieses Antigen wies zwischen Kügelchen eine unregelmäßige Verteilung auf, sodaß ein positv färbendes Kügelchen oft neben einem negativ färbenden Kügelchen zu finden war. In vielen Fällen waren benachbarte Zellen innerhalb eines einzelnen Kügelchens abwechselnd positiv und negativ. Paraffinabschnitte von 90% (18/20) der mit Immunperoxidase gefärbten Brustkrebszellen waren hinsichtlich UCD/AB 6.11 positiv. Die meisten bösartigen Zellen in einem bestimmten Gewebeabschnitt wurden gefärbt. Das Färbungsmuster war im allgemeinen diffus und zytoplasmatisch, obwohl auch Granular- und Oberflächenfärbung beobachtet wurde. Die Färbung war in den Tumorzellen viel intensiver als in benachbarten normalen Zellen. Die Färbung war in metastatischen Tumorzellen auch intensiver als in primären Brusttumorzellen. Diese Ergebnisse zeigen, daß eine erhöhte Produktion des Antigens in den metastatischen Brustkrebszellen festzustellen ist.
Einige aber nicht alle Brustdysplasien (fibrozystische Krankheit) wurden mit UCD/AB 6.11 gefärbt.
Monoklonale Antikörper der zweiten Generation, die aus der Immunisierung mit Antigen entstanden, das durch Immunchromatographie mit 6.11-Antikörper aus MCF-7- Gewebekultur-Medium isoliert wurde, wurden als Serie 10 bezeichnet. Die jeweils zur weiteren Charakterisierung und Untersuchung ausgewählten Antikörper waren UCD/PR 10.02, UCD/PR 10.11 und UCD/PR 10.12. UCD/PR 10.02 ist ein Mäuse-lgM, das mit Zytokeratin vom Typ 18 reagiert, jedoch nicht die Bindung von UCD/AB 6.11 oder UCD/PR 10.11 an das Antigen hemmt, das von UCD/AB 6.11 erkannt wird (6.11 Antigen). UCD/PR 10.11 ist ein Mäuse-IgG, das mit dem 6.11 Antigen, sowie mit Zytokeratin vom Typ 8 und - in einem geringeren Ausmaß - mit Zytokeratin vom Typ 18 reagiert. UCD/PR 10.12 ist ein Mäuse-IgM, das mit dem 6.11-Antigen reagiert.
Monoklonale Antikörper der zweiten Generation, die aus der Immunisierung mit Antigen entstanden, das durch Immunchromatographie mit 6.11-Antikörper aus 186- NWT-Zellen isoliert wurde, wurden als Serie 7 bezeichnet. Ein bestimmter, als UCD/PR 7.01 bezeichneter Antikörper stellte sich als für Myoepithelzellen spezifisch heraus.

2. Zelloberflächen-Antigen

Die Iodierung der Zelloberflächen-Proteine lebender Zellen durch Lactoperoxidase und die anschließende Immunfällung dienten dazu, den Zelloberflächen-Standort des durch UCD/AB 6.11 identifizierten Antigens weiters zu charakterisieren. Diese Daten zeigten, daß sich das Antigen auf der Zelloberfläche befindet, wenn die Zellen entweder mit oder ohne Östradiol gezüchtet werden.

3. Reaktivität von Antikörpern mit verschiedenen mit Keratin verwandten Proteinen

Drei Typen intrazellulärer, mit Keratin verwandter Proteine (mit Typen 8, 18 und 19 verwandt) wurden in der MCF-7-Brustkrebs-Zellinie identifiziert. Diese Proteine besaßen Schätzungen zufolge Molekulargewichte von etwa 52, 46 bzw. 40 kD und isoelektrische Punkte im Bereich von 6,1-6,0, 5,8-5,3 bzw. 5,2-5,0. Man ist der Ansicht, daß die beobachteten isoelektrischen Mehrfachformen zumindest teilweise auf variierende Phosphorylierung der Keratine zurückzuführen sind. Immunblots unter Verwendung von monoklonalen Antikeratin-Antikörpern führten zu unterschiedlichen Bindungsmustern für jeden Antikörper gegen jeden Proteintyp. Beispielsweise erkannte der 35 βH11-Antikörper alle drei mit Keratin verwandten MCF-7-Zellproteine, während AEI, UCD/AB 6.01, UCD/AB 6.11 und UCD/PR 10.11 jeweils zwischen den verschiedenen Proteintypen unterschieden. Siehe Tabelle 1. Tabelle 1 Reaktivität* *Beruht auf der Reaktivität in zweidimensionalen Western Blots (siehe oben).

4. Gewebeverteilung der von 6.11 und 10.11 erkannten Epitope

Zur Bestimmung der Gewebeverteilung der von den monoklonalen Antikörpern UCD/AB 6.11 und UCD/PR 10.11 erkannten Epitope und zur Bewertung des Nutzens dieser Antikörper für die Immundiagnose wurden zahlreiche Formal in- oder mit B5 fixierte Paraffingewebe-Abschnitte nach dem Avidin-Biotin-Immunperoxidase-Verfahren gescreent. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 2 angeführt. In histologisch normalen Geweben färbten beide Antikörper einfache Epitheigewebe, einschließlich von Brust-, Schweiß- und Speicheldrüsen, Magen- und Grimmdarmschleimhaut und distale Nierentubuli. Beide Antikörper reagierten nicht mit neuralen und Blutelementen, obwohl UCD/AB 6.11 (aber nicht UCD/PR 10.11) oft schwach mit einer Komponente von glatten Muskeln reagierte. Tabelle 2 Reaktivität (positiv/insgesamt) Gesamtzahl der untersuchten Proben Gefärbtesgewebe I. Brust A. Normal ruhend prälaktierend B. Abnormal Gutartig Fibroadenom Fibrozyste Apokrine Metaplasie Dysplasie Bösartig Adenokarzinom Brustkarzinom-Metastase INSGESAMT II. Nicht-Brust A. Normal Bauch Hauptzellen Parientaizellen Lumenales Epithel Leerdarm Grimmdarm Muskel Skelett Herz Luftröhre (fötal) Bronchus (fötal) Lunge (fötal) Lyrrphknoten M lz (fötal) Adrenal Niere proximale Tubuli distale Tubuli/Kanäle Glomerulus Eileiter Schleimhaut Mesothel Eierstock (fötal) ursprünglich Stroma Leber 3 Organgewebe 1/3 3/3 Gallengang 0/3 3/3 Bauchspeicheldrüse 2 Langerhans-Inseln 0/2 0/2 Drüsenbläschen 2/2 0/2 Gänge 2/2 2/2 Speicheldrüse 1/2 2/2 2 Schilddrüse (fötal) 0/1 0/1 1 Schweißdrüse 4 Sekretorisch 4/4 4/4 Exkretorisch 4/4 0/4 _____ INSGESAMT 40 B. Abnormal Grimmdarmkarzinom 0/2 1/2 Schuppenförmiges Zellkarzinom 1/1 0/1 Gangliones Neuroblastom 0/1 0/1 Seminom 0/1 0/1 i Schilddrusenkarzinom 0/1 Gutartige Prostatahyperplasie Melanom 0/L 0/1 i INSGESAMT

5. Epitopen-Verteilung auf lebenden Zellen

Eine indirekte Immunfluoreszenz auf lebenden, intakten MCF-7-Zellen wurde durchgeführt, um die Oberflächenbindung an Zelloberflächen-Epitope sichtbar zu machen. UCD/AB 6.01 und UCD/AB 6.11 identifizierten punktierte Antigene, die mit Konzentrationen in Bereichen des Kontakts zwischen den Zellen über die gesamte Zeloberfläche verteilt waren. Die Zelloberflächen-Epitope wurden durch leichte Trypsinbehandlung entfernt, zeigten keine Hinweise auf Unregelmäßigkeiten oder Überlagerungen und waren vorhanden, wenn die Zellen entweder in serumhaltigen oder serumfreien Medien gezüchtet wurden. Die von UCD/PR 10.11, 35βH11 und AE1 erkannten Epitope konnten jedoch in analogen, indirekten Immunfluoreszenz- Versuchen nicht nachgewiesen werden.

6. Charakterisierung von sekretiertem 6.11-Antigen

Mit Keratin verwandte Antigene können auch als lösliche Proteine in neoplastischen Brustgewebe-Kulturmedien vorkommen. Es stellte sich heraus, daß Kulturflüssigkeiten aus den menschlichen MCF-7-, T47D- und SK-BR 3-Brustzellinien jeweils keratinähnliche Immunreaktivität enthielten. Vier von fünf untersuchten monoklonalen Antikörpern binden sich an das Antigen aus MCF-7-Kulturüberständen (Tabelle 3), und das Antigen besitzt ein Molekulargewicht im Bereich von 40-46 kD und einen isoelektrischen Punkt von 5,0-5,2. Zusätzliche Versuche zeigten, daß das MCF-7- Gewebekultur-Antigen einen Sedimentationskoeffizienten von 3,6S und eine Tauchdichte von 1,25 g/cm³ aufweist.

Tabelle 3

Antikörper Reaktivität mit MCF-7-Antiaen 6. 11

UCD/AB 6.01 UCD/AB 6.11 UCD/PR 10.11 + AE1 + 35ßh11 +
Dieses extrazel luläre MCF-7-Antigen scheint demnach mit intrazel lulärem Zytokeratin verwandt zu sein. Als erstes erkennen die gegen Nicht-Brust-Keratine gebildeten Antikörper (z.B. 35βH11 und AE1) das Antigen. Zweitens: wenn Hybridome von Mäusen gebildet werden, die mit dem immunaffinitäts-gereinigten MCF-7- Gewebekulturflüssigkeits-Antigen immunisiert wurden, reagieren die resultierenden Antikörper (wie z.B. UCD/PR 10.11) weitgehend mit Nicht-Brust-Keratinen. Drittens kommt die Aminosäure-Zusammensetzung des gereinigten MCF-7-Antigens nahe an jene anderer Keratine heran, insbesondere dahingehend, daß Glycin- und Glutaminsäure-Glutaminreste 25-30% aller Aminosäuren im Protein umfassen. Siehe Tabelle 4. Tabelle 4* Aminosäure Keratin vom Typ 18 (46 kd) Keratin vom Typ 8 (52 kd) MCF-7-Axitigen 6.11 (40-46 kd) * Meßfehler bei allen Werten möglich. ** ("Not Determined") Nicht bestimmt.

7.Serumassay auf extrazelluläres Zytokeratin

UCD/AB 6.11 wurde in einem Radioimmunassay verwendet, um die Gegenwart von extrazellulärem Zytokeratin sowohl in normalem Serum als auch im Serum von Patienten mit Brustkrebs nachzuweisen. Der Assay war eine Modifikation des Zweistellen-Immunradiometrie-Assays (IRMA), der von Miles et al. (1973) in: "Radioimmunoassays and Related Procedures in Medicine", Internationale Atomenergiebehörde, Wien, S. 149-164, Bd. 1, beschrieben wird. Gereinigter monoklonaler Antikörper UCD/AB 6.11 wurde an die Näpfe von Kunststoff- Mikrotiterplatten adsorbiert. Nach der Adsorption wurde das Probenserum in jeden Napf gefüllt. Falls das extrazelluläre Zytokeratin in der Serumprobe vorhanden war, reagierte der an die feste Phase gebundene UCD/AB 6.11, um das Zytokeratin einzufangen. Überschüssiger, gereinigter Hasen-IgG-Antikörper, der für ein unterschiedliches Epitop auf dem Zytokeratin spezifisch ist, wurde dann in die Mikrotiter-Näpfe eingebracht, wo er mit dem gebundenen Zytokeratin (falls vorhanden) reagierte. Überschüssiges ¹²&sup5;I-radiomarkiertes Protein A wurde dann in die Näpfe eingebracht, wo es mit dem Hasen-IgG reagierte. Nach dem Waschen zur Entfernung von ungebundenem, markiertem Protein A wurde die Menge an Radioaktivität in jedem Napf bestimmt. Die Menge an extrazellulärem Zytokeratin war demnach direkt proportional zur Menge der gebundenen Radioaktivität. Absolute Mengen an Zytokeratin wurden anhand einer zuvor erstellten Standardkurve bestimmt.
Wenn normales Serum hinsichtlich der Gegenwart von extrazellulärem Zytokeratin geprüft wurde, reichten die erzielten Werte von 140 bis 3260 CPM, was 0,02 ug/ml bis 0,82 ug/ml entsprach. Bei Brustkrebspatienten betrugen die Werte 340 bis 10.800 CPM, was 0,05 ug/ml bis 33,4 ug/ml entsprach. Bei Festsetzung von 1000 CPM als willkürlicher Cutoff waren zwei von 14 (14%) normalen Serumproben positiv. Bei Brustkrebspatienten waren 30 von 83 (36%) positiv. Somit ist die Gegenwart von extrazellulärem Zytokeratin in Serum bei Patienten deutlich höher, die an Epitheltumoren, wie z.B. Brustkrebs, leiden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden genaue und empfindliche Assays zum Nachweis der Gegenwart eines bestimmten Zellproteins von 42 bis 48 kD und eines verwandten Serumproteins von 40 bis 46 kD in biologischen Proben bereitgestellt. Das Verfahren eignet sich besonders zur Identifizierung jener Brusttumore, die auf Östrogen- Therapie ansprechen. Das Verfahren eignet sich auch zur Identifizierung jener östrogenempfindlichen Brusttumore, die von der Brust ausgehend Metastasen bilden, sowie zum Screenen von Patientenseren hinsichtlich solcher Tumore.
Die Hybridom-Zellinie UCD/AB 6.11 wurde bei der American Type Culture Collection am 8. Dezember 1983 hinterlegt und erhielt die Zugriffsnummer HB 8458. Die Hybridom-Zellinien UCD/AB 6.01 und UCD/PR 10.11 wurden bei der American Type Culture Collection am 3. Januar 1985 hinterlegt und erhielten die Zugriffsnummern HB 8693 bzw. HB 8694.

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung neoplastischer Epithelzellen in einem Patienten, wobei das Verfahren das Nachweisen eines löslichen, extrazellulären Cytokeratins in einer Serumprobe des Patienten umfaßt, wobei das extrazelluläre Cytokeratin einen blockierten N-Terminus aufweist und mit intrazellulären Cytokeratinen vom Typ 8 oder Typ 18 immunologisch verwandt ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das extrazelluläre Cytokeratin mit den UCD/AB 6.11- oder UCD/PR 10.11-Antikörpern aus Hybridom-Zellinien mit den Hinterlegungsnummern ATCC HB 8458 bzw. ATCC HB 8694 reagiert.

3. Verfahren zur Identifizierung neoplastischer Epithelzellen in einem Patienten, wobei das Verfahren das Nachweisen eines löslichen, extrazellulären Cytokeratins in einer Probe umfaßt das mit dem Cytokeratin aus Säugetier-Epithelzellen verwandt ist und ein Molekulargewicht im Bereich von 40 bis 46 kd (bestimmt durch SDS-PAGE) und einen isoelektrischen Punkt von 5,0 bis 5,2 aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das extrazelluläre Cytokeratin mit intrazellulärem Cytokeratin vom Typ 8 oder Typ 18 immunologisch verwandt ist.

5. Verfahren zum Nachweis neoplastischer Epithelzellen in einer menschlichen biologischen Probe, wobei das Verfahren das Nachweisen von löslichem, extrazellulärem Cytokeratin durch Kombinieren der Probe mit Antikörpern, die für eine epitope Stelle spezifisch sind, die entweder durch UCD/AB 6.11-Antikörper aus der Hybridom-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer ATCC HC 8458 oder von UCD/PR 10.11-Antikörpern aus der Hybridom-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8694 erkannt wird, und das Nachweisen der Bildung spezifischer Komplexe aus Antikörper und dem löslichen, extrazellulären Cytokeratin umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Probe Serum ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Probe eine Gewebeprobe ist.

8. Verfahren zum Screenen neoplastischer Epithelzellen zur Bestimmung des Ursprungs solcher Zellen, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

das Aussetzen einer Probe der neoplastischen Epithelzellen einer Gruppe von Antikörpern gegen lösliches, extrazelluläres Cytokeratin das immunologisch mit intrazellulären Cytokeratinen vom Typ 8 oder Typ 18 verwandt ist, worin einzeine Antikörper innerhalb der Gruppe fähig sind, selektiv mit duktalen Epithelzellen. sekretorischen Eplithelialzellen Myoepithelzellen oder Kombinationen davon zu reagieren;

das Bestimmen, durch Nachweisen von Komplexen von Antikörper und löslichem, extrazellulärem Cytokeratin, welcher der Antikörper mit neoplastischen Epithelzellen reagiert; und

das Bestimmen des Ursprungs der neoplastischen Epithelzellen auf der Grundlage des Reaktivitätsmusters der Antikörper.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Gruppe von Antikörpern folgendes umfaßt: einen ersten Antikörper, der mit duktalen Epithelzellen reagiert, doch mit sekretorischen Epithelzellen und Myoepithelzellen deutlich weniger reagiert, einen zweiten Antikörper der mit sekretorischen Epithelzellen reagiert, doch mit duktalen Epithelzellen und Myoepithelzellen deutlich weniger reagiert, und einen dritten Antikörper, der mit Myoepithelzellen reagiert, doch mit duktalen Epithelzellen und sekretorischen Epithelzellen deutlich weniger reagiert.

10. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Epithelzellen Säugetier-Epithelzellen sind.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin der mit duktalen Epithelzellen reagierende Antikörper UCD/PR 10.11 aus der Hybridom-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8694 ist.

12. Verfahren nach Anspruch 9, worin der mit sekretorischen Epithelzellen reagierende Antikörper UCD/AB 6.11 aus der Hybridom-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8458 ist.

13. Set zum Screenen neoplastischer Epithelzellen zur Bestimmung des Ursprungs solcher Zellen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Set folgendes umfaßt:

Antikörper, der mit duktalen Epithelzellen reagiert, doch mit sekretorischen Epithelzellen und Myoepithelzellen deutlich weniger reagiert;

Anitkörper, der mit sekretorischen Epithelzellen reagiert, doch mit duktalen Epithelzellen und Myoepithelzellen deutlich weniger reagiert;

Antikörper, der mit Myoepithelzellen reagiert, doch mit duktalen Epithelzellen und sekretorischen Epithelzellen deutlich weniger reagiert; und

Mittel zum Nachweis der Reaktion der Antikörper mit den neoplastischen Epithelzellen.

14. Set nach Anspruch 13, worin die Epithelzellen Säugetier-Epithelzellen sind.

15. Set nach Anspruch 13, worin der mit duktalen Epithelzellen reagierende Antikörper UCD/PR 10.11 aus der Hybridom-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8694 ist.

16. Set nach Anspruch 13, worin der mit sekretorischen Epithelzellen reagierende Antikörper UCD/AB 6.11 aus der Hybridom-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8458 ist.

17. Hybridom-Zellinie UCD/AB 6.11, American Type Culture Collection- Zugriffsnummer HB 8458.

18. Hybridom-Zellinie UCD/PR 10.11, American Type Culture Collection- Zugriffsnummer HB 8694.

19. Antikörper aus der Hybridom-Zellinie nach Anspruch 18.

20. Antikörper aus der Hybridom-Zellinie nach Anspruch 17.

21. Hybridom-Zellen, die monoklonale Antikörper produzieren, die für ein Epitop spezifisch sind, das auf einem löslichen, extrazellulären Cytokeatin von etwa 40 bis 46 kd (bestimmt durch SDS-PAGE) vorhanden ist, das einen isoelektrischen Punkt von 5,0 bis 5,2 aufweist und von menschlichen Säugetier-Epithelzellen freigesetzt wird, wobei das Epitop von UCD/AB 6.11- oder UCD/PR 10.11-Antikörpern aus Hybridom-Zellinien mit den Hinterlegungszugriffs-Nummern ATCC HB 8458 bzw. ATCC HB 8694 erkannt wird.

22. Antikörper, die von den Hybridom-Zellen nach Anspruch 21 erzeugt werden.

23. Verfahren zur Unterscheidung von Krebsgeschwüren von Tumoren nichtepithelialen Ursprungs, wobei das Verfahren das Kombinieren einer Probe der Tumorzellen mit Antikörper UCD/PR 10.11 aus der Hybridom-Zellinie mit der Hinterlegungszugriffs-Nummer ATCC HB 8694 oder einem anderen Antikörper, der zumindest äquivalente Affinität für die von UCD/PR 10.11 erkannte epitope Stelle aufweist, und das Nachweisen der Bildung spezifischer Komplexe von Antikörper und löslichem, extrazellulärem Cytokeratin umfaßt.

24. Lösliches, extrazelluläres Cytokeratin, das von neoplastischen Epithelzellen freigesetzt wird und mit den Antikörpern UCD/AB 6.11 aus der Hybridom-Zellinie mit der Hinterlegungszugriffs-Nummer ATCC HB 8458 oder UCD/PR 10.11 aus der Hybridom-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8694 reagiert, wobei das Cytokeratin frei von anderen Serumkomponenten ist.

25. Lösliches, extrazelluläres Cytokeratin nach Anspruch 24 mit einem Molekulargewicht im Bereich von 40 bis 46 kd (bestimmt durch SDS-PAGE) und einem isoelektrischen Punkt von 5,0 bis 5,2.

26. Lösliches, extrazelluläres Cytokeratin, das von neoplastischen Säugetier- Epithelzellen freigesetzt wird, wobei das Cytokeratin einen blockierten N-Terminus, ein Molekulargewicht im Bereich von 40 bis 46 kd (bestimmt durch SDS-PAGE) und einen isoelektrischen Punkt von 5,0 bis 5,2 aufweist und frei von anderen Serumproteinen ist.

27. Set zum Nachweis neoplastischer Epithelzellen in einem Patienten durch Analysieren einer biologischen Probe des Patienten, wobei das Set Antikörper umfaßt die für ein lösliches, extrazelluläres Cytokeratin mit einem blockierten N-Terminus spezifisch sind, das mit einem oder beiden intrazellulären Cytokeratinen vom Typ 8 oder Typ 18 immunologisch verwandt ist.

28. Set nach Anspruch 27, worin die Antikörper für eine epitope Stelle spezifisch sind, die entweder von UCD/AB 6.11- oder UCD/PR 10.11-Antikörpern aus Hybridom- Zelllinien mit den Hinterlegungszugriffs-Nummern ATCC HB 8458 bzw. ATCC HB 8694 erkannt wird.

29. Set nach Anspruch 27 oder 28, worin die Antikörper aus den Hybridom-Zellinien UCD/AB 6.11, American Type Culture Collection Zugriffsnummer HB 8458 oder UCD/PR 10.11 American Type Culture Collection Zugriffsnummer HB 8694 stammen.

30. Set zum Nachweis neoplastischer Epithelzellen in einem Patienten durch Analysieren einer biologischen Probe des Patienten, wobei das Set Antikörper gegen ein lösliches, extrazelluläres Cytokeratin umfaßt, das mit dem Cytokeratin aus Säugetier- Epithelzellen verwandt ist und ein Molekulargewicht im Bereich von 40 bis 46 kd (bestimmt durch SDS-PAGE) und einen isoelektrischen Punkt von 5,0 bis 5,2 aufweist.

31. Set nach Anspruch 30, worin das lösliche, extrazelluläre Cytokeratin ein Molekulargewicht von etwa 40 kd (bestimmt durch SDS-Page) aufweist.

32. Set nach Anspruch 30 oder 31' worin die Antikörper für ein lösliches, extrazelluläres Cytokeratin spezifisch sind, das mit einem oder beiden intrazellulären Cytokeratinen vom Typ 8 oder Typ 18 immunolgisch verwandt ist.

33 Set zum Nachweis neoplastischer Epithelzellen in einem Patienten in einer biologischen Probe des Patienten, wobei das Set Antikörper gegen eine epitope Stelle umfaßt die entweder von UCD/AB 6.11- oder UCD/PR 10.11- Antikörper aus Hybridom-Zellinien mit den Hinterlegungszugriffs-Nummern ATCC HB 8458 bzw. ATCC HB 8694 erkannt wird.

34. Diagnostische Zusammensetzung zum Nachweis neoplastischer Epithelzellen in einem Patienten durch Analysieren einer biologischen Probe des Patienten, wobei die diagnostische Zusammensetzung Antikörper umfaßt, die für ein lösliches, extrazelluläres Cytokeratin mit einem blockierten N-Terminus spezifisch sind und mit einem oder beiden der intrazellulären Cytokeratine vom Typ 8 oder Typ 18 immunologisch verwandt sind.

35. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin die biologische Probe eine Serumprobe ist.

36. Set nach Anspruch 27, 30 oder 33, worin die biologische Probe eine Serumprobe ist.

37. Set zur Unterscheidung von Karzinomtumoren von Tumoren nicht-epithelialen Ursprungs, wobei das Set Antikörper UCD/AB 6.11, ATCC HB 8458, oder einen anderen Antikörper mit zumindest äquivalenter Affinität für die epitope Stelle aufweist, die von UCD/AB 6.11 erkannt wird.

38. Set zur Unterscheidung von Karzinomtumoren von Tumoren nicht-epithelialen Ursprungs, wobei das Set den Antikörper UCD/PR 10.11, ATCC HB 8694, oder einen anderen Antikörper mit zumindest äquivalenter Affinität für die epitope Stelle aufweist, die von UCD/PR 10.11 erkannt wird.