DE3782191T2

DE3782191T2 - Difluorketoverbindungen.

Info

Publication number: DE3782191T2
Application number: DE19873782191
Authority: DE
Inventors: Mark Morris Stein; Amy Diane Trainor
Original assignee: ICI Americas Inc
Current assignee: Zeneca Inc
Priority date: 1986-06-05
Filing date: 1987-05-19
Publication date: 1993-02-25
Anticipated expiration: 2007-05-20
Also published as: EP0249349A1; GB8711748D0; EP0249349B1; AU609041B2; DE3782191D1; AU7382587A; ES2052560T3

Description

Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf gewisse Difluoroketo-Verbindungen, die Inhibitoren von Humanleukozytenelastase (HLE) sind und die auch als Forschungswerkzeuge in pharmakologischen und verwandten Studien und bei der Behandlung von degenerativen Gewebeerkrankungen, wie z. B. Pulmonaremphysen, Atherosklerose, rheumatoide Arthritis und Osteoarthritis bei Warmblütern, brauchbar sind. Die Erfindung betrifft auch Zwischenprodukte, die bei der Synthese dieser Peptid-Derivate brauchbar sind, verfahren zur Herstellung derselben, pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Peptid-Derivate enthalten, und Verfahren zu ihrer Anwendung. Auf Prolin basierende Peptidaldehyde sind in der europäischen Patentanmeldung 84 302 621.2 beschrieben. Fluoroketon-Inhibitoren von hydrolytischen Enzymen sind in einem Aufsatz von Gelb, M. H. et al., Biochemystry (1985) 24, 1813-1817 für Nonserin-Proteasen beschrieben. Imperiali, B. et al., Tetra. Letters (1986) 27, Nr. 2, 135-138 beschreiben ausgewählte Fluoromethylketone. Thaisrivongs, S. et al., J. Med. Chem. (1985) 28, Nr. 11, 1553-1555 beschreiben ausgewählte Fluoroketone als Renin-Inhibitoren. Die europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 130 679 betrifft gewisse irreversible Inhibitoren einer Reihe von Cystein- und Serin-Proteasen. Die europäische Patenanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 204 571 beschreibt gewisse strukturell verwandte Difluoroketon-Inhibitoren für Humanleukozytenelastase.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft Difluoroketo-Verbindungen der allgemeinen Formel Ib
worin R¹ für (1-3C)Alkyl steht, R³ für Benzyl steht, RA für eine Gruppe der Formel -CO.X.RB steht, worin X.RB für Methyl steht oder X für die Gruppe -NH- steht und RB ausgewählt ist aus -CH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;CH&sub2;CH&sub3;, -CH&sub2;CH&sub2;(2-Pyridyl), -CH&sub2;CH&sub2;OH, -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;OH, -CH&sub2;CH(OH)(Phenyl), -CH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;H und -CH&sub2;CH&sub2;CONHS(O)&sub2;(4-Chlorophenyl), und A für Oxycarbonyl steht; oder pharmazeutisch zulässige Salze davon.
Eine spezielle Alkyl-Gruppe R¹ ist Isopropyl.
Beispiele für Salze der Verbindungen der Formel Ib sind pharmazeutisch zulässige Basen- oder Säureadditionssalze, wie z. B. solche, die mit einer Mineralsäure, z. B. Salzsäure, oder einer organischen Säure, z. B. Zitronen-, Malein-, Fumar- oder Essigsäure, gebildet sind. Basenadditionssalze sind z. B. solche, die mit Alkalimetallhydroxiden, wie z. B. Natriumhydroxid, Alkalimetallcarbonaten und -bicarbonaten, Erdalkalimetallhydroxiden und organischen Aminen gebildet sind. Solche Salze können dadurch hergestellt werden, daß man das Peptid-Derivat in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel auflöst, eine wäßrige Lösung der Base zugibt und das Salz aus der wäßrigen Lösung gewinnt.
Die bevorzugte erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen die S-Konfiguration (d. h. diejenige der natürlich vorkommenden L-Aminosäuren) am chiralen Zentrum, das in der weiter unten stehenden Formel IIIb mit * identifiziert ist. Die weiter unten beschriebenen Syntheseverfahren liefern Isomere mit der S-Konfiguration am chiralen Zentrum, das durch das Symbol # identifiziert ist, oder isomere Gemische als Folge der R- und S-Konfigurationen am chiralen Zentrum, das durch das Symbol # identifiziert ist. Es wird im allgemeinen bevorzugt, daß die Verbindungen die S-Konfiguration an dem durch das Symbol # identifizierten Zentrum aufweisen.
Wie es Fachleuten auf diesem Gebiet allgemein bekannt ist, ist die Aktivität der einzelnen Isomere nicht immer gleich, und es wird deshalb bevorzugt, das aktivere Isomer zu verwenden. Die vorliegende Erfindung umfaßt Verbindungen, die aus der S- und/oder R-Konfiguration an dem mit # gekennzeichneten chiralen Zentrum resultieren.
RB kann ein chirales Zentrum aufweisen. Die vorliegende Erfindung umfaßt Verbindungen der Formel Ib, worin das chirale Zentrum in RB die S- oder R-Konfiguration aufweist.
Es ist allgemein bekannt, daß die Difluoroketon-Derivate als Solvate, insbesondere Hydrate, Formel IVb, existieren können. Auch diese fallen unter die vorliegende Erfindung.
Es wird bevorzugt, die Difluoroketo-Verbindungen der vorliegenden Erfindung aus im Handel verfügbaren alpha-Aminosäuren herzustellen, d. h. aus solchen, in denen die NH&sub2;-Gruppe sich an dem Kohlenstoffatom befindet, das der Gruppe -COOH benachbart ist.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine pharmazeutisch wirksame Menge mindestens eines Peptid-Derivates der Formel Ib sowie ein pharmazeutisch zulässiges Verdünnungs- oder Trägermittel enthalten.
Die Difluoroketo-Verbindungen der Formel Ib können wie folgt hergestellt werden:

Methode A

Eine Verbindung der Formel Ib kann hergestellt werden aus dem entsprechenden Alkohol der Formel Vb
(siehe Formel Vb nach den Beispielen)
durch ein oxidatives Verfahren.
Bei brauchbaren Verfahren werden Oxalylchlorid, DMSO und ein tertiäres Amin (siehe Marx, H., et al., J. Org. Chem., (1984) 49, 788-793, wobei die besten Resultate mit 10-20 Equivalenten Oxidationsmittel erhalten werden) oder Essigsäureanhydrid und DMSO oder Chromtrioxid/Pyridinan Komplex in Methylenchlorid oder Dess-Martin-Periodinan [1,1,1-Triacetoxy-2,1-benzoxiodol-3-(3- H)-on] (Verfahren von Dess, D. B. et al., J. Org. Chem., (1983) 48, 4155-56) verwendet.
Die Alkohole der Formel Vb können wie folgt erhalten werden:
(i) Wenn RA die Formel II mit X = NH aufweist, dann kann ein Aldehyd der Formel VIb
(siehe Formel VIb nach den Beispielen)
mit 2-Bromo-2,2-difluoroessigsäure-ethylester (erhältlich von SCM, Specialty Chemicals) und Zn in auf Rückfluß gehaltenem THF umgesetzt werden (siehe Hallinan, E. A. et al., Tetrahedron Letters, (1984) 25 (22), 2301-2302), wobei eine Verbindung der Formel VIIb
(siehe Formel VIIb nach den Beispielen)
erhalten wird, die ihrerseits mit einem Amin der Formel Vd
(siehe Formel Vd nach den Beispielen)
in Ethanol umgesetzt werden kann, wobei der entsprechende Alkohol der Formel VIIIb
(siehe Formel VIIIb nach den Beispielen)
erhalten wird.
Verbindungen der Formel VIIIb sind ausgewählte Verbindungen der Formel Vb, worin RA die Formel II mit X = NH aufweist.
Die Aldehyde der Formel VIb können hergestellt werden durch Oxidation des entsprechenden Alkohols der Formel XIVb
(siehe Formel XIVb nach den Beispielen)
(geeignete Oxidationsbedingungen sind beispielsweise von H. Marx et al., J. Org. Chem., (1984) 49, 788-793 beschrieben) oder durch Hydrolyse oder Transacetalisierung des entsprechenden Acetals der Formel XVb.
(siehe Formel XVb nach den Beispielen)
Die Herstellung solcher Verbindungen ist beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung 84 302 621.2 beschrieben.
Verbindungen der Formel XIVb können hergestellt werden durch Umsetzung eines Aminoalkohols der Formel XVI
(siehe Formel XVI nach den Beispielen)
mit einer entsprechenden freien Säure der Formel XVIIb
(siehe Formel XVIIb nach den Beispielen)
durch Standard-Peptid-Kupplungsverfahren, wobei Verfahren verwendet werden, die Fachleuten allgemein bekannt sind, wie z. B. diejenigen, die von M. Bodanszky, Priciples of Pentide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin, (1984), und in The Pentides: Analysis, Synthesis and Biology (Herausgeber E. Gross und J. Meinhofer), Bände 1-5 (Academic Press, New York) 1979-1983, beschrieben wurden. Eine Verbindung der Formel XVIIb kann hergestellt werden durch Standard-Peptid-Kupplungs- und Schutzgruppenabspaltungsverfahren, wie sie oben beschrieben wurden. Die Aminoalkohole der Formel XVI (sofern sie nicht im Handel verfügbar sind), können hergestellt werden aus den entsprechenden alpha-Aminosäuren der Formel H&sub2;NCHR¹COOH durch Reaktion mit einem Reduktionsmittel, wie z. B. Diboran. Siehe US-PS 3 935 280 (Lane).
In ähnlicher Weise kann eine Verbindung der Formel XVb hergestellt werden, durch Umsetzung eines Aminoacetals der Formel XVIIIa
(siehe Formel XVIIIa nach den Beispielen)
mit einer entsprechenden Säure der Formel XVIIb oder aber durch Standard-Peptid-Kupplungsverfahren. Die Aminoacetale der Formel XVIIIa können so hergestellt werden, wie es in den Beispielen 1a-1d beschrieben ist.
Ein Acetal der Formel XVb kann, wenn es zweckmäßig ist, hergestellt werden durch eine sauer katalysierte Acetalisierung einer Verbindung der Formel VIb (z. B. mit Triethylorthoformiat in mit p-Toluolsulfonsäure angesäuertem absoluten Ethanol bei Raumtemperatur).
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel VIIIb aus einer Verbindung der Formel VIIb erfolgt dadurch, daß man eine Verbindung der Formel VIIb mit ungefähr 1,25 Equivalenten 1 N NaOH in CH&sub3;OH umsetzt, wobei Verbindungen der Formel IXb
(siehe Formel IXb nach den Beispielen)
erhalten werden, worauf sich eine Umsetzung der Verbindung der Formel IXb mit der Verbindung einer Formel Vb unter Verwendung von HOBT, WSCDI und THF anschließt.
Amine der Formel Vd sind im allgemeinen im Handel verfügbar und können hergestellt werden durch Standardtechniken der organischen Chemie und durch Analogie mit der Synthese von bekannten strukturell ähnlichen Verbindungen.
(ii) Wenn der gesamte Ausdruck XRB für CH&sub3; steht, dann kann eine Verbindung der Formel Vb hergestellt werden durch Umsetzung einer entsprechenden Verbindung der Formel VIIb mit einem Grignard-Reagenz der Form CH&sub3;MgBr.

Methoden B und C

Eine Verbindung der Formel Ib, worin RA die Formel II mit X = NH aufweist, kann aus dem entsprechenden Ester, wie z. B. aus dem Ethylester der Formel XXVIb
(siehe Formel XXVIb nach den Beispielen)
hergestellt werden durch Umsetzung des Esters mit einem entsprechenden Amin der Formel Vd in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Ethanol, wobei die entsprechende Verbindung der Formel Ib erhalten wird, oder alternativ aus der entsprechenden Säure der Formel XXVIIb
(siehe Formel XXVIIb nach den Beispielen)
durch Kuppeln der Säure mit einem Amin der Formel Vd (wobei ähnliche Bedingungen verwendet werden, wie sie oben für die Umwandlung von IXb und VIIIb beschrieben wurden), um die entsprechende Verbindung der Formel Ib herzustellen. Ein Ausgangs-Ester der Formel XXVIb kann beispielsweise erhalten werden durch Oxidation des entsprechenden Alkohols der Formel VIIb, wobei eine der oben bei Methode A beschriebenen Oxidationsmethoden verwendet wird. Eine Ausgangssäure der Formel XXVIIb kann beispielsweise erhalten werden durch Hydrolyse des entsprechenden Esters der Formel XXVIb, wobei ein ähnliches Verfahren verwendet wird, wie es oben für die Hydrolyse einer Verbindung der Formel VIIb zu einer Verbindung der Formel IXb beschrieben wurde.

Methode D

Eine Verbindung der Formel Ib, worin RB eine Carboxy-Gruppe enthält, kann hergestellt werden durch Zersetzung der Ester- Gruppe einer entsprechenden Verbindung der Formel Ib, worin RB eine Ester-Gruppe enthält.
Es wird darauf hingewiesen, daß die Zersetzung unter Verwendung der verschiedensten in der organischen Chemie allgemein bekannten Verfahren durchgeführt werden kann. So kann sie beispielsweise ausgeführt werden durch übliche Hydrolyse unter sauren oder basischen Bedingungen, wobei nötigenfalls Nachstellungen gemacht werden, um jegliche hydrolytische Entfernung anderer funktioneller Gruppen im Molekül gering zu halten.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Zersetzung eines Esters der Formel Ib besteht darin, daß man den Ester mit einer geeigneten Base, wie z. B. mit einem Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxid oder -carbonat (wie z. B. Lithiumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid, Calciumhydroxid oder Kaliumcarbonat) in einem geeigneten wäßrigen Lösungsmittel oder Verdünnungsmittel, wie z. B. Wasser, das gegebenenfalls ein mit Wasser mischbares organisches Colösungsmittel, z. B. Methanol, enthält, umsetzt, und zwar zweckmäßigerweise bei oder in der Nähe von Raumtemperatur. Nenn ein solches Verfahren verwendet wird, dann wird die resultierende Carbonsäure der Formel Ib, worin RB eine Carboxy-Gruppe enthält, zunächst als entsprechendes Salz der bei der Hydrolyse verwendeten Base erhalten, und dieses kann dann als solches isoliert oder durch ein herkömmliches Ansäuerungsverfahren in die freie Säure umgewandelt werden.

Methode E

Eine Verbindung der Formel Ib, worin RB eine Acylsulfonamid- Gruppe der Sulfonamidocarbonyl-Type enthält, kann hergestellt werden durch Umsetzung der entsprechenden Verbindung der Formel Ib, worin RB eine Carboxy-Gruppe enthält, mit einem geeigneten Sulfonamid in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels, wie z. B. mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid oder mit einem Hydrochlorid- oder Hydrobromid-Salz davon, gegebenenfalls zusammen mit einer organischen Base, wie z. B. 4-(Dimethylamino)pyridin, und in Gegenwart eines geeigneten Lösungs- oder Verdünnungsmittels, wie z. B. Dichloromethan, bei einer Temperatur im Bereich von beispielsweise 10 bis 50ºC, aber vorzugsweise bei oder in der Nähe von Raumtemperatur.
Wie es Fachleuten auf diesem Gebiete bekannt ist, kann es erwünscht sein, eine Verbindung der Formel Ib in eine andere Verbindung der Formel Ib umzuwandeln, wobei ein in der Technik an sich bekanntes Standardverfahren verwendet wird.
Es kann auch erwünscht sein, gegebenenfalls eine Schutzgruppe während allen oder einem Teil ,der oben beschriebenen Verfahren zu verwenden. Die Schutzgruppe kann dann entfernt werden, wenn die endgültige Verbindung hergestellt wird. (Siehe Greene, T. W., Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, New York (1981)).
Wenn ein pharmazeutisch zulässiges Salz gewünscht wird, dann kann dieses unter Verwendung an sich bekannter Standardverfahren erhalten werden, beispielsweise durch weitere Umsetzung einer geeigneten sauren Verbindung der Formel Ib mit einer geeigneten Base, die ein physiologisch zulässiges Kation liefert, oder durch weitere Umsetzung einer ausreichend basischen Verbindung der Formel Ib mit einer geeigneten Säure, die ein physiologisch zulässiges Anion liefert.

Inhibierungsmessungen

Das Vermögen von erfindungsgemäßen Verbindungen, als ein Elastaseinhibitoren zu wirken, kann zunächst dadurch bestimmt werden, daß man das Vermögen einer erfindungsgemäßen Verbindung ermittelt, die Wirkung von Humanleukozytenelastase (HLE) auf einem niedermolekularen Peptid-Substrat zu inhibieren. Die Wirkungsstärke eines Inhibitors wird dadurch ermittelt, daß man eine kinetische Bestimmung der Dissoziationskonstante, Ki, des Komplexes vornimmt, der durch die Wechselwirkung des Inhibitors mit HLE gebildet wird. Das verwendete Substrat war das Anilid Methoxysuccinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-valin-p- nitroanilid, das von K. Nakajima et al., J. Biol. Chem., (1979) 254, 4027-4032, und von T. Teshima et al., J. Biol. Chem., (1982) 257, 9, 5085-5091, beschrieben wurde. Das in diesen Studien verwendete HLE-Enzym kann von Elastin Products in St. Louis, Missouri, erhalten werden oder kann gemäß B. R. Viscarello et al., Prenerative Biochemystry, (1983) 13, 57-67, wie folgt gereinigt werden, wobei alle Arbeiten in einem kalten Raum mit 4ºC durchgeführt werden.
Salzextraktions-DNase-Behandlung: Das Ausgangsmaterial, 193 g eitriges Sputum, wurde mit 200 ml kaltem destillierten Wasser homogenisiert und bei 30 000 g während 20 min. bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde mit einer hohen Salzkonzentration extrahiert und mit DNase durch das Verfahren von D. Y. Twumasi et al., J. Biol. Chem., 252, 1917-1926, behandelt. Chromatographie auf Elastin-Agarose: Die Ausfällung der DNase-Digerierung wurde in zwei 40 ml- Portionen von 50 mM Tris, 1,0 M NaCl, pH 8 aufgenommen. Die Suspension wurde zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wurde direkt auf eine Kolonne von löslicher Elastin-Sepharose 4B (2,5·20 cm) aufgegeben. Die Kolonne wurde mit Gleichgewichtseinstellungspuffer (50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8,0) gewaschen, bis die optische Dichte bei 280 nm (OD&sub2;&sub8;&sub0;) des Eluats zur Basislinie zurückgekehrt war. Weiteres verunreinigendes Protein wurde mit zwei Kolonnenvolumina 50 mM Acetat, 1,0 NaCl, pH 5,0 eluiert. Elastase und Cathepsin G (HLC-G) wurden abschließend mit 50 mM Acetat, 1,0 M NaCl, 20 % DMOS, pH 5,0 eluiert. Die Kolonne wurde mit 6 ml/min entwickelt, wobei 10 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt, gegen zwei 6 l-Chargen 50 mM Acetat, 0,1 M NaCl, pH 5,5 dialysiert und auf einer Amicon ®-Ultrafiltrationseinheit (YM-10 Membrane) konzentriert. CM-Chromatographie: Die konzentrierte aktive Fraktion wurde auf eine Kolonne von CM- Sephadex® C-50 (2,2·10 cm) aufgegeben, die vorher mit 50 mM Acetat, 0,1 M NaCl, pH 5,5 ins Gleichgewicht eingestellt worden war, worauf die Kolonne mit Tris-Puffer gewaschen wurde, um verunreinigendes Protein zu entfernen. Die Elution wurde mit 50 mM Acetat, 0,2 M NaCl, pH 5,5 fortgesetzt und ergab eine Versetzung einer Aktivitätsspitze gegen Bz-L-Phe-L-Val- L-Arg-pNa. HLE wurde als nächstes mit dem Acetat-Puffer, der 0,45 M NaCl enthielt, eluiert, während die Elution mit HLC-G die Anwesenheit von 1,0 M NaCl im Puffer erforderte, wie es von R. Martodam et al., Preparative Biochemistry, (1979) 9, 15-31, beschrieben ist. Diese Kolonne wurde mit 30 ml/h entwickelt, wobei 5,5 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Aus dem so gereinigten HLE wurde eine Standardbildungsgeschwindigkeit von p-Nitroanilin bei 25ºC spektralphotometrisch im sichtbaren Spektrum bei 410 nm gemessen, wobei eine automatische Datenaufnahme von einem Cary 210 Spektralphotometer erfolgte, der von Varian Associates erhalten worden war. Die Reaktionen wurden durch Injektion von 10 ul der HLE-Lösung in eine 3 ml-Cuvette initiiert, die 2,89 ml Puffer (10 millimolar Natriumphosphat, 500 millimolar NaCl, pH 7,6), 50 ul Substratlösung in DMSO und 50 ul DMSO enthielt. Zu Beginn wurden stetige Reaktionsgeschwindigkeiten der p-Nitroanilin-Bildungen mit Hilfe einer Anpassung der experimentiellen Daten an eine lineare Abhängigkeit der Zeit durch lineare letzte Quadrate berechnet. Diese Geschwindigkeit, die ohne die Anwesenheit eines Inhibitors bestimmt wurde, wurde als Standard bei der Berechnung der Inhibitor-Ki-Werte verwendet.
Als allgemeine Regel wurde gefunden, daß die Peptid-Derivate der vorliegenden Erfindung "langsambindende" Inhibitoren von HLE waren und deshalb spezielle Analysenmethoden zur genauen Bestimmung der Ki-Werte für deren Inhibierung von HLE erforderten (siehe Williams, J. N. und Morrison, J. F., Meth. Enz. (1979) 63, 437 für eine Beschreibung dieser Methoden). In einem typischen Experiment wurden 2,89 ml Puffer (10 millimolar Natriumphosphat, 500 millimolar Natriumchlorid, pH 5,6), 50 ul Inhibitorlösung in DMSO und 50 ul Substratlösung in DMSO in eine 3 ml-Cuvette eingebracht. Die Cuvette wurde zugestopselt, mehrere Male umgedreht, um ihren Inhalt zu mischen, und im Spektralphotometer auf 25ºC gehalten. Nach einer Zeit von 5 min, während der die Reaktion ins thermische Gleichgewicht einstellen gelassen wurde, wurden 10 ul Grundenzymlösung in die Cuvette eingebracht, um die Reaktion zu initiieren. Duplikat- oder Triplikatversuche wurden mit der Inhibitorkonzentration Null und mindestens drei Inhibitorkonzentrationen von nicht Null gefahren. Die Ki-Werte wurden durch das oben angegebene Verfahren von Williams und Morrison berechnet. Die Ki-Werte für ausgewählte Verbindungen waren kleiner als 10&supmin;&sup7;.

Tiermodelle

Bei den Tiermodellen auf Emphysem erfolgte eine intratracheale (i.t.) Verabreichung einer elastolytischen Protease, um eine langsame, fortschreitende destruktive Läsion der Lunge zu verursachen. Diese Läsionen werden normalerweise einige Wochen bis einige Monate nach der ersten Verabreichung bestimmt. Jedoch induzieren diese Proteasen eine Läsion, die schon in den ersten wenigen Stunden offenkundig ist. Die frühe Läsion ist zunächst hämorrhagisch, schreitet am Ende der ersten 24 h zu einer entzündlichen Läsion fort und löst sich in der ersten Woche nach der Verabreichung auf. Um diese frühe Läsion auszunutzen, wurde das folgende Modell verwendet.
Hamster wurden zunächst leicht mit Methohexital-Natium (Brevital® von Eli Lilly) anästhetisiert. Mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 wurde dann entweder alleine oder mit einem Gehalt von 400 ug Humanleukozytenelastase (HLE) direkt in die Trachea verabreicht. 24 h später wurden die Tiere getötet, und die Lungen wurden entfernt und sorgfältig von äußerem Gewebe befreit. Im Anschluß an die Bestimmung des nassen Lungengewichts wurden die Lungen mit PBS gewaschen, und die gesamten auswaschbaren roten und weißen Zellen wurden gewonnen und bestimmt. Die Werte für die nassen Lungengewichte, die gesamten auswaschbaren roten Zellen und die gesamten auswaschbaren weißen Zellen wurden in einer dosisabhängigen Weise im Anschluß an die Verabfolgung von HLE bestimmt. Verbindungen, die wirksame Elastaseinhibitoren sind, können die durch das Enzym induzierten Läsion verhindern oder verringern, was ein niedrigeres nasses Lungengewicht und verringerte Werte für gesamte auswaschbare Zellen, sowohl rote als auch weiße, relativ zur Verabreichung von HLE alleine zur Folge hat. Verbindungen können dadurch eingestuft werden, daß sie entweder mit oder verschiedene Zeiten vor der Verabreichung von HLE verabreicht werden, um ihren Nutzen bei der Verhinderung einer HLE- Lesion zu bestimmen. Erfindungsgemäße Verbindungen erzeugten beträchtliche Verringerungen beim nassen Lungengewicht und bei den gesamten auswaschbaren Zellen relativ zu HLE allein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigten eine Aktivität bei mindestens einem der oben unter "Inhibierungsmessungen" oder "Tiermodelle" beschriebenen Tests. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß nicht immer eine direkte Korrelation zwischen den Aktivitäten der Verbindungen, die bei der Inhibierungsmessung als Ki-Werte gemessen wurden, und den verringerten Werten der gesamten auswaschbaren Zellen und der nassen Lungengewichte relativ zur Verabreichung von HLE alleine, wie sie beim Tiermodelltest erhalten wurden, bestand. Es wird vermutet, daß der Tiermodelltest besser die Aktivität von solchen Verbindungen bei der Behandlung von Emphysem vorhersagen läßt.

Pharmakokinetik

Männliche syrische Hamster (80 bis 120 g) werden intravenös mit der Testverbindung injiziert. Vor der Injektion und verschiedene Zeiten hernach werden sie leicht mit Äther anästhetisiert, und Blutproben von jeweils 0,2 ml werden durch eine Kardialpunktur gezogen. Das Blut wird in 2 ml-Zentrifugenröhrchen ausgedrückt und während 1 h gerinnen gelassen. Die Probe wird dann zentrifugiert, und das Serum wird entfernt.
Die Wirkstoffwerte werden dadurch bestimmt, daß zunächst endogene Elastaseinhibitoren inaktiviert werden, und zwar durch 5 min dauernde Inkubation von 50 ul Serum mit einem gleichen Volumen Puffer, der 5 mg/ml Rinderpankreastrypsin enthält. Das mit Trypsin inaktivierte Serum (10 ul) wird dann in eine 0,52 ml fassende Cuvette eingebracht, die einen Puffer enthält, der bezüglich HLE 20 nM gemacht worden war. Nach einer weiteren 30 min dauernden Inkubation wird die Reaktion durch die Zugabe von Substrat (350 ul) (MeOSuc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Val-pNA, 1,6 nM) gestartet, und die Reaktion wird spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 410 nM überwacht. Für Vergleichszwecke wird die Serumbeständigkeit der Testverbindungen in der folgenden Weise bestimmt:
Die prozentuale Inhibierung von Serumproben wurde wie folgt errechnet:
prozentuale Inhibierung = Vo - Vi/Vo·100
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können an Warmblüter, die ihrer bedürfen, insbesondere Menschen, zur Behandlung von Pulmonaremphysem, Atherosklerose, rheumatoide Arthritis und Osteoarthritis, insbesondere bei Emphysem, verabreicht werden. Die Verabreichung kann oral, parenteral, einschließlich subcutan als Depot mit Hilfe einer osmotischen Pumpe oder über ein pulverförmiges oder flüssiges Aerosol erfolgen. Hierzu können die erfindungsgemäßen Verbindungen in der üblichen Weise in eine orale oder parenterale Dosierungsform gebracht werden, indem ungefähr 10 bis 250 mg je Einheitsdosierung der Verbindung mit einem üblichen Träger, Exzipiens, Binder, Schutzmittel, Stabilisator, Geschmacksmittel oder dergleichen gemischt werden, wie es in der pharmazeutischen Praxis üblich und wie es beispielsweise in der US-PS 3 755 340 beschrieben ist. Bei einer parenteralen Verabreichung werden 1 bis 10 ml eines intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Injektionsmittels verabfolgt, das ungefähr 0,02 bis 10 mg/kg Körpergewicht einer erfindungsgemäßen Verbindung enthält, und zwar drei- oder viermal täglich. Das Injektionsmittel könnte eine erfindungsgemäße Verbindung in einer wäßrigen isotonischen sterilen Lösung oder Suspension gegebenenfalls zusammen mit einem Schutzmittel, wie z. B. Phenol, oder einem Solubilisierungsmittel, wie z. B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), enthalten. Bei einem Pulveraerosol könnte eine erfindungsgemäße Verbindung in der gleichen Weise wie Cromlyn-Natrium mit Hilfe einer Spinhalter®-Turboinhalationsvorrichtung verabreicht werden, die von Fisons Corp. in Bedford, Massachusetts, erhältlich ist, und zwar mit einer Rate von 0,1 bis 50 mg/Kapsel, wobei 1 bis 8 Kapseln täglich bei einem durchschnittlichen Menschen verabreicht werden. Jede in einem Spinhaler® enthaltene Kapsel enthält die erforderliche Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei der Rest der 20 mg-Kapsel ein pharmazeutisch zulässiger Träger ist, z. B. Lactose. In einem flüssigen Aerosol werden die erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer Rate von 100 bis 1000 ug je Ausstoß eines Standardvolumens Treibmittel verabreicht. Das flüssige Aerosol wird mit einer Rate von 1 bis 8 Ausstößen je Tag verabreicht, wobei die Dosierungen sich entsprechend der Schwere des zu behandelnden Zustands, dem Gewicht des Patienten und der Teilchengrößenverteilung des Aerosols ändern, da kleinere Teilchen eine größere Lungeneindringung ergeben. Treibmittel, wie z. B. ein fluorierter Kohlenwasserstoff oder Isobutan, Behälter, Ventile und Betätigungsvorrichtungen für flüssige Aerosole sind von L. Lachmann et al. in "The Theory and Practise of Industrial Pharmacy", Lea und Febiger, Philadelphia (1976) beschrieben.
In den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung werden die folgenden Abkürzungen verwendet: at (Atmosphären) mit 1,013·10&supmin;&sup5; Pascal = 1 at; Kp (Siedepunkt); ºC (Grad Celsius); g (Gramm); h (Stunde); mg (Milligramm); min (Minute); ml (Milliliter); mmol (Millimol); Fp (Schmelzpunkt); N (normal); nm (Nanometer); nM (Nanomolar); Rf (relative Mobilität in TLC); TLC (Dünnschichtchromatographie); DCC (Dicyclohexylcarbodiimid); DMF (Dimethylformamid); DMSO (Dimethylsulfoxid); Et&sub2;O (Diethylether); EtOAc (Ethylacetat); HOAc (Essigsäure); WSCDI (wasserlösliches Carbodiimid; 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid); Bz (Benzoyl); HOBT (1-Hydroxybenzotriazol); MeOH (Methylalkohol); Pd/C (Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator); pNA (Paranitroanilid); DMAP (4-Dimethylaminopyridin); ø (Phenylgruppe); NMM (N-Methylmorpholin); THF (Tetrahydrofuran); CBZ (Benzyloxycarbonyl); t-BOC (tert-Butyloxycarbonyl); tR (HPLC-Retensionszeit in min); HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie); TEA (Triethylamin); TFA (Trifluoroessigsäure); Ac&sub2;O (Essigsäureanhydride); RT (Raumtemperatur); e.g. (zum Beispiel); supra (oben); DAST (Diethylaminoschwefeltrifluorid); VS (gegen); Dibal (Diisobutylaluminiumhydrid); Zorbax® ODS Analysenkolonne (4,6 mm·25 cm) auch als "C&sub1;&sub8;-Kolonne" bezeichnet; und Phenomenex Zorbax C&sub8; (25 cm·4,6 mm) auch als "C&sub8;-Kolonne" bezeichnet. Weiterhin werden C, H, N usw. (die üblichen Symbole für die Elemente) verwendet. Außerdem werden übliche Abkürzungen für Aminosäuren verwendet, z. B. Prolin (Pro), Valin (Val) usw. Es wird darauf hingewiesen, daß allgemeine Ausdrücke, wie z. B. (1-3C)Alkyl, sowohl gerade als auch als verzweigte Alkylradikale bezeichnen, daß aber Bezugnahmen auf einzelne Alkylradikale, wie z. B. "Propyl", das gerade ("normale") Radikal bezeichnen, wobei verzweigte Isomere, wie z. B. "Isopropyl", besonders bezeichnet werden. ¹H NMR-Daten sind als delta-Werte angegeben, wobei Tetramethylsilan als innerer Standard verwendet wurde. Sofern nötig, wurden Mehrfachversuche von ausgewählten Verfahren durchgeführt, um zusätzliches Produkt zu erhalten.
Die Blitzchromatographie wurde auf Merck Kieselgel (Artikel 9385) ausgeführt, und die Kolonnenchromatographie erfolgte auf Merck Kieselgel 60 (Artikel 7734) [diese Materialien wurden von E. Merck, Darmstadt, W.-Deutschland erhalten]. Blitz- und Kolonnenchromatographien erfolgten auf saurem Kieselgel (J. T. Baker Chemical Co., niederer pH, Nummer 7290-R). Die Dünnschichtchromatographie (TLC) erfolgte auf Analtech 0,25 mm- Silicagel-GHLF-Platten (Artikel 21521), welche von Analtech, Newark, De, USA, erhältlich sind.
Bei diesen Verbindungen wurde keine offenkundige Toxizität festgestellt.

Beispiel 1

2-[[[4-[(3-Ethoxy-3-oxypropyl)amino]-3,3-difluoro-1-(1-methylethyl)-2,4-dioxobutyl]amino]carbonyl]-1-pyrrolidin-carbonsäure-phenylmethyl-ester

(Formel Ib, RA = Formel II, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = ø CH&sub2;OCO-, X = NRC, RB = CH&sub2;CH&sub2;COOCH&sub2;CH&sub3;, RC = H)

a. N-Benzyloxycarbonyl-L-valinol (Formel XIVa, R³A = ø CH&sub2;OCO-, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;)

Benzylchloroformiat (91,0 g, 0,532 mol, 95 % Reinheit) wurde tropfenweise während eines Zeitraums von 1 h zu einer vorgekühlten (0ºC) Lösung von L-Valinol (50,0 g, 0,484 mol) und Triethylamine (60,0 g, 0,6 mol) in CHCl&sub3;(1500 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 0ºC gerührt und dann während 2 h auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum konzentriert. EtOAc (1500 ml) wurde zum erhaltenen Rückstand zugegeben, und die organische Lösung wurde mit wäßriger 1 N NaOH und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Base wurde über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde durch Blitzchromatographie auf einer Silicagelkolonne (6 cm·30 cm) gereinigt, wobei ein Stufengradient von Et&sub2;O:Hexan (1:5) bis zu reinem Et&sub2;O verwendet wurde. Dabei wurde das Produkt (91,4 g) als weißer wachsartiger Feststoff erhalten; TLC, Rf = 0,23, Silicalgel, Hexan:Et&sub2;O (50:50).

b. N-Benzyloxycarbonyl-L-valinal (Formel VIa, R³A = ø CH&sub2;OCO-, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;)

Eine Lösung von DMSO (107,2 g, 1,372 mol) in CH&sub2;Cl&sub2;(150 ml) wurde tropfenweise während 0,5 h zu einer vorgekühlten (-60ºC) und gerührten Lösung von Oxalylchlorid (87,1 g, 0,686 mol) in CH&sub2;Cl&sub2;(800 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben. Die Temperatur des Gemisches stieg auf -45ºC. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf -30ºC erwärmt. Eine Lösung des Produkts von Beispiel 1a (81,5 g, 0,343 mol) in CH&sub2;Cl&sub2;(300 ml) wurde tropenweise während 45 min bei -30ºC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 50 min bei -25 ºC gerührt und auf -40ºC abgekühlt, und eine Lösung von Diisopropylethylamin (177,4 g, 1,372 mol) in CH&sub2;Cl&sub2;(250 ml) wurde tropfenweise während 45 min bei -40ºC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h gerührt, währenddessen es sich auf Raumtemperatur erwärmte. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2;(1500 ml) verdünnt, und die organische Base wurde mit wäßriger 1 N HCl gewaschen und dann unter Vakuum konzentriert, wobei das Produkt (98 g) als grünes Öl erhalten wurde, das unmittelbar darauffolgend ohne weitere Reinigung verwendet wurde; TLC, Rf= 0,48, Silicagel, Hexan:Et&sub2;O (50:50).

c. N-Benzyloxycarbonyl-L-valinal-diethylacetal (Formel XVa, R³A = ø CH&sub2;OCO-, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;)

Triethyl-orthoformiat (700 g, 4,723 mol), absolutes EtOH (800 ml) und p-Toluolsulfonsäure-monohydrat (5,0 g, 0,026 mol) wurden zum Produkt von Beispiel 1b (81 g, 0,343 mol) zugegeben. Das Gemisch wurde 10 min bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Vakuum konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde in Et&sub2;O aufgelöst und mit gesättigter wäßriger NaHCO&sub3; gewaschen. Die organische Base wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert, wobei ein rohes Produkt erhalten wurde. Dieses Produkt wurde durch Blitzchromatographie mit Silicagel unter Verwendung eines Stufengradienten von Hexan über Gemische von CH&sub2;Cl&sub2;:Hexan bis EtOAc:CH&sub2;Cl&sub2;(30:70) gereinigt, wobei das Produkt als blaßgelbes Öl erhalten wurde; TLC, Rf= 0,21, Silicagel, CH&sub2;Cl&sub2;:Petrolether (50:50)

d. L-Valinal-diethylacetal (Formel XVIIIa, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;)

Ein Gemisch aus dem Produkt von Beispiel 1c (147,8 g, 0,478 mol) und 10% Pd/C (10 g) in EtOAc (1500 ml) wurde unter H&sub2; (1 at) gerührt, bis 2500 ml H&sub2; verbraucht waren. Während dieser Zeit wurde zweimal die Reaktion unterbrochen, wobei 10% Pd/C (10 g) zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann durch ein Kissen aus Diamoteenerde filtriert. 10% Pd/C (10 g) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde gerührt bis 10,92 l H&sub2; verbraucht waren. Das Reaktionsgemisch wurde durch Diatomeenerde filtriert, und das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei das Produkt (78,8 g) als blaßgelbes Öl erhalten wurde; [alpha]D²&sup5;=+7,8.

e. (Formel XVb, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = ø CH&sub2;OCO-)

WSCDI (24,04 g, 125,4 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung von CBZ-L-Prolin (28,4 g, 114,1 mmol), HOBT (30,00 g, 228,2 mmol), dem Produkt von Beispiel 1d (20 g, 114,1 mmol) und trockenem THF (400 ml) bei 0ºC unter N&sub2; zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 1 h bei 0ºC gerührt. Das Kühlbad wurde weggenommen, und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das THF wurde unter Vakuum entfernt, wobei das rohe Produkt erhalten wurde. Das rohe Produkt wurde in Ethylacetat aufgelöst und die Ethylacetat-Lösung wurde aufeinanderfolgend mit 1 N HCl, gesättigter NaHCO&sub3; und Kochsalzlösung gewaschen. Die Ethylacetat-Lösung wurde dann getrocknet (MgSO&sub4;) und filtriert, und das Filtrat wurde unter Vakuum gerührt, wobei nach Reinigung durch Blitzchromatographie (CHCl&sub3;:MeOH (98:2)) das Produkt (35,03 g, 77%) als gelbes Öl erhalten wurde; TLC, Rf= 0,7, CHCl&sub3;:MeOH (95:5).

f. (Formel VIb, R¹= CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = ø CH&sub2;OCO-)

Eine Lösung des Produkts von Beispiel 1e (24,0 g, 60 mmol), p-Toluolsulfonsäure (2,4 g, 12,6 mmol) und Aceton (1600 ml) wurde bei Raumtemperatur 5 h gerührt. Das Aceton wurde unter Vakuum entfernt, wobei ein öliger Rückstand zurückblieb. Der Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst, und die Lösung wurde mit gesättigter NaHCO&sub3; und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und filtriert, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wobei das Produkt (17,67 g, 91%) als hell bernsteinfarbenes Öl erhalten wurde; TLC, Rf = 0,46, CHCI&sub3;:CH&sub3;OH (95:5).

g. (Formel VIIb, R¹= CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = ø CH&sub2;OCO-)

Ein Gemisch aus dem Produkt von Beispiel 1f (2,50 g, 7,75 mmol), 2-Bromo-2,2-difluoroessigsäure-ethylester (1,57 g, 7,75 mmol), aktiviertem Zink (0,505 g, 7,75 mmol) und trockenem THF (125 ml) wurde unter Stickstoff 1 h auf mäßigen Rückfluß erhitzt. Das Gemisch wurde dann bis kurz unter Rückflußtemperatur abkühlen gelassen, und weiterer 2-Bromo-2,2-difluoroessigsäure-ethylester (1,57 g, 7,75 mmol) und aktiviertes Zink (0,505 g, 7,75 mmol) wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde wieder auf mäßigen Rückfluß erhitzt und 3 h auf Rückfluß gehalten. Das Gemisch wurde abgekühlt und Ethylacetat (400 ml) wurde zugegeben. Die Ethylacetat- Lösung wurde mit 1 N KHSO&sub4;-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und filtriert, und das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei ein rohes Produkt (3,7 g) erhalten wurde. Das Produkt wurde durch Blitzchromatographie (EtOAc:Hexan (1:1)) gereinigt, wobei 1,53 g (45% Ausbeute) des gewünschten Produkts als hellgelber wachsartiger Feststoff erhalten wurden; TLC, Rf = 0,45, Petrolether:EtOAc (33:66).

h. (Formel IXb, R¹= CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = ø CH&sub2; OCO-)

1 N Natriumhydroxid-Lösung (2,75 ml, 2,75 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung des Produkts von Beispiel 1g (1,0 g, 2,19 mmol) und Methanol (15 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser (75 ml) behandelt, und die erhaltene Lösung wurde mit EtOAc extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde mit 1 N HCl angesäuert (pH 2). Das saure wäßrige Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert, und die Ethylacetat-Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und filtriert, und das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei das Produkt (0,883 g, 94,1% Ausbeute) als weißer Schaum erhalten wurde; TLC, Rf = 0,1, CHCl&sub3;:MeOH:HOAc (95:5:0,5).

i. (Formel VIIIb, R¹= CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = ø CH&sub2;OCO-, RB = CH&sub2;CH&sub2;COOCH&sub2;CH&sub3;, RC = H)

WSCDI (0,251 g, 1,27 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung des Produkts von Beispiel 1h (0,5 g, 1,16 mmol), beta-Alanin-ethylester-hydrochlorid (0,179 g, 1,16 mmol), HOBT (0,158 g, 1,16 mmol), N-Methylmorpholin (0,117 g, 1,16 mmol) und trockenem THF (20 ml) bei Raumtemperatur unter N&sub2; zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde unter Vakuum konzentriert, und der erhaltene Rückstand wurde in Ethylacetat aufgelöst. Die Ethylacetat-Lösung wurde mit 1 N HCl, gesättigter NaHCO&sub3; und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und filtriert, und das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei das Produkt (61,6%) erhalten wurde; TLC, Silicagel, Rf = 0,4, MeOH:CHCl&sub3;(5:95).

j. (Formel Ib, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = ø CH&sub2;OCO-, X = NRC, RB = CH&sub2;CH&sub2;COOCH&sub2;CH&sub3;, RC = H)

Zu einer Lösung des Produkts von Beispiel 1i (0,5 g, 0,95 mmol) und trockenem CH&sub2;Cl&sub2;(25 ml) wurde Dess-Martin-Periodinan (2,01 g, 4,74 mmol) zugegeben. Trifluoroessigsäure (0,54 g, 4,74 mmol) wurde hinzugegeben, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht unter N&sub2; gerührt. Ethylacetat (75 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde mit gesättigter Na&sub2;S&sub2;O&sub3;, gesättigter NaHCO&sub3; und Kochsalzlösung extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und unter Vakuum konzentriert, wobei das Produkt (42%) als Öl erhalten wurde; TLC, Silicagel, Rf = 0,7, MeOH:CHCl&sub3; (5:95); ¹H NMR (DMSO-d&sub6;): 0.79(m,6), 1.17(t,J = 7,5 Hs,3), 1.80(m,3), 2. 14(m,2), 2.5(m,2), 3.38(m,4), 4.05(q,J = 7,5 Hz,2), 4.36(m,1), 4.7(m,1), 4.9(m,2), 7.32(m,5), 8.35(m, 1), 9.15(m, 1).

Beispiel 2

2-[[[3,3-Difluoro-1-(1-methylethyl)-2,4-dioxo-4-[[2-(2-pyridinyl)ethyl]amino]butyl]amino]carbonyl]-1-pyrrolidin-carbonsäure-phenylmethyl-ester

(Formel Ib, RA = Formel II, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = ø CH&sub2;OCO-, X = NRC, RB= CH&sub2;CH&sub2;(2-Pyridyl), RC = H)

a. (Formel XXVIb, R¹= CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = ø CH&sub2;OCO-)

Eine Lösung des Produkts von Beispiel 1g (1,3 g, 2,85 mmol) und CH&sub2;Cl&sub2;(5,0 ml) wurde zu einem gerührten Gemisch von Dess-Martin-Periodinan (4,83 g, 11,39 mmol) und CH&sub2;Cl&sub2;(35 ml) zugegeben. Trifluoroessigsäure (0,89 ml) wurde zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter N&sub2; bei Raumtemperatur gerührt. Ethylacetat (200 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde mit gesättigter Na&sub2;S&sub2;O&sub3;, gesättigter NaHCO&sub3; und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und unter Vakuum konzentriert, wobei nach Reinigung durch Blitzchromatographie (MeOH:CHCl&sub3; (1:99)) das Produkt (0,53 g) erhalten wurde; TLC, Rf= 0,65, MeOH:CHCl&sub3; (2:98).

b. (Formel Ib, RA = Formel II, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = ø CH&sub2; OCO-, X = NRC, RB= CH&sub2;CH&sub2;(2-Pyridyl), RC = H)

Eine Lösung des Produkts, das durch das Verfahren von Beispiel 2a (0,460 g, 1,01 mmol) hergestellt worden war, 2-(2- Pyridyl)ethylamin (0,12 ml, 1,01 mmol) und Ethanol (1,5 ml) wurde bei Raumtemperatur unter N&sub2; während 1 h gerührt. Das Ethanol wurde unter Vakuum entfernt, wobei ein Rückstand erhalten wurde, der durch Blitzchromatographie (MeOH:CHCl&sub3; (3:97)) gereinigt wurde. Dabei wurde das Produkt (0,135 g, 20%) erhalten; TLC, Rf = 0,68, MeOH:CHCl&sub3;(5:95); ¹H NMR (DMSO-d&sub6;): 0.78(m,6), 1.80(m,3), 2.16(m,2), 2.92(t,J = 7.5 Hz,2), 3.40(m,4), 4.4(m, 1), 4.8(m,1), 4.95(m,2), 7.30(m,7), 7.6(m,1), 8.3(m,2), 9. 2(m,1).

Beispiel 3

2-[[[3,3-Difluoro-4-[(2-hydroxyethyl)amino]-1-(1-methylethyl)2,4-dioxobutyl]amino]carbonyl]-1-pyrrolidin-carbonsäure-phenylmethyl-ester

(Formel Ib, RA = Formel II, R¹= CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = ø CH&sub2;OCO-, X = NRC, RB = CH&sub2;CH&sub2;COOCH&sub2;CH&sub3;, RC = H)
Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 2b wurde das durch das Verfahren von Beispiel 2a hergestellte Produkt mit 2-Ethanolamin reagieren gelassen, wobei nach Reinigung durch Blitzchromatographie (MeOH:CHCl&sub3;(2:98)) das Titelprodukt (83%) erhalten wurde: TLC, Rf = 0,3, MeOH:CHCl&sub3; (2:98).
Analyse berechnet für
C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub9;N&sub3;O&sub6;F&sub2;·0,5H&sub2;O: C, 55,22; H, 6,31; N, 8,78
gefunden: C, 55,03; H, 6,13; N, 8,63

Beispiel 4

2-[[[3,3-Difluoro-4[(2-hydroxyprooyl)amino]-1-(1-methylethyl)- 2,4-dioxobutyl]amino]carbonyl]-1-pyrrolidin-carbonsäure-phenylmethyl-ester

(Formel Ib, RA = Formel II, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = øCH&sub2;OCO-, X = NRC, RB = (CH&sub2;)&sub3;OH, RC = H)
Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 2b wurde das durch das Verfahren von Beispiel 2a hergestellte Produkt mit 3-Propanolamin reagieren gelassen, wobei nach Reinigung durch Blitzchromatographie (MeOH:CHCl&sub3;(3:97)) das Titelprodukt (65%) erhalten wurde; ¹NMR (DMSO-d&sub6;): 0,8 (m,6), 1,6(m,2), 1,8(m,3), 2,2(m,2), 3,2(m,2), 3,4(m,4), 4,36(m,1), 4,8(m,1), 5,0(m,2), 7,3(m,5), 8,34(m,1), 9,05(m,1).

Beispiel 5

2-[[[3,3-Difluoro-4-[(2-hydroxy-2-phenylethyl)amino]-1-(1-methylethyl)-2,4-dioxobutyl]amino]carbonyl]-1-pyrrolidin-carbonsäure-phenylmethyl-ester

(Formel Ib, RA = Formel II, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = øCH&sub2;OCO-, X = NRC, RB = CH&sub2;CH(OH)ø, RC = H)
Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 2b wurde das durch das Verfahren von Beispiel 2a hergestellte Produkt mit 2-Phenyl-2-ethanolamin reagieren gelassen, wobei nach Reinigung durch Blitzchromatographie (MeOH:CHCl&sub3; (2:98)) das Produkt (42%) erhalten wurde: TLC, Rf = 0,73, (MeOH:CHCl&sub3; (5:95)).
Analyse berechnet für
C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub3;F&sub2;N&sub3;O&sub6;·0,5H&sub2;O: C, 61,64; H, 6,09; N, 7,70
gefunden: C, 61,26; H, 6,14; N, 7,60

Beispiel 6

2-[[[3,3-Difluoro-1-(1-methylethyl)-2,4-dioxopentyl]amino]carbonyl]-1-pyrrolidin-carbonsäure-phenylmethyl-ester

(Formel Ib, RA = Formel II, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = øCH&sub2;OCO-, XRB = CH&sub3;)

a. (Formel XIIb, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = CH&sub2;OCO-)

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (0,24 g, 1,23 mmol) wurde zu einer Suspension des Produkts von Beispiel 1h (0,48 g, 1,12 mmol), O,N-Dimethylhydroxylamin-hydrochlorid (0,11 g, 1,12 mmol), 1-Hydrobenzotriazol (0,3 g, 2,24 mmol) und N-Methylmorpholin (0,11 g, 1,12 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in EtOAc aufgenommen, mit gesättigter wäßriger NaHCO&sub3;, 1 N wäßriger HCl und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na&sub2; SO&sub4;) und filtriert, und das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei das Produkt (0,42 g) erhalten wurde; TLC, Silicagel, Rf= 0,38, MeOH:CHCl&sub3; (5:95).

b. (Formel Xb, R¹= CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = øCH&sub2;OCO-, RB = CH&sub3;)

Methylmagnesium-bromid (2,9 M in Et&sub2;O (1,0 ml, 2,9 mmol)) wurde zu einer gekühlten (0ºC) Lösung des Produkts von Beispiel 6a (0,355 g, 0,75 mmol) in THF (5 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 0ºC gerührt, und 1 N wäßrige HCl wurde zugegeben. Das Gemisch wurde mit EtOAc extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und unter Vakuum konzentriert, wobei das Produkt (0,31 g) erhalten wurde; TLC, Silicagel, Rf = 0,50, MeOH:CHCl&sub3; (5:95).

c. (Formel Ib, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = øCH&sub2;OCO-, X = CH&sub2;, RB= H)

Eine Lösung des Produkts von Beispiel 6b (0,3 g, 0,7 mmol) Dess-Martin-Periodinan (0,59 g, 1,4 mmol) und TFA (0,055 ml, 0.7 mmol) in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt. EtOAc wurde zugegeben, und das Gemisch wurde mit gesättigtem wäßrigen Na&sub2;S&sub2;O&sub3;, gesättigtem wäßrigen NaHCO&sub3; und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na&sub2; 50&sub4;), filtriert und konzentriert, wobei ein rohes Produkt erhalten wurde. Das Produkt wurde durch Blitzchromatographie unter Verwendung von EtOAc:Hexan (2:3) als Eluiermittel gereinigt, wobei das Produkt (0,21 g) erhalten wurde; TLC, Silicagel, Rf = 0,36, EtOAc:Hexan (50:50).

Beispiel 7

2-[[[4-2-Carboxyethyl)amino]-3,3-difluoro-1-(1-methylethyl)- 2,4-dioxobutyl]amino]carbonyl]-1-pyrrolidin-carbonsäure-phenylmethyl-ester

(Formel Ib, RA = Formel II, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = øCH&sub2;OCO-, X - NRC, RB= CH&sub2;CH&sub2;COOH, RC = H)
1 N NaOH (0,4 ml, 0,4 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung des Produkts von Beispiel 1j (0,17 g, 0,32 mmol), Methanol (2,0 ml) und Wasser (1,5 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Wasser (25 ml) wurde zugegeben, und das wäßrige Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde mit 1 N NaOH-Lösung angesäuert (pH 2). Dieses saure Gemisch wurde (zweimal) mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat-Lösung wurde mit 1 N HCl-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und filtriert, und das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei die Titelverbindung (0,128 g, 81%) als trockener weißer Schaum erhalten wurde; TLC, Silicagel, Rf = 0,48, CHCl&sub3;:CH&sub3; OH:HOAc (95:5:0,5).
Analyse berechnet für
C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub9;F&sub2;N&sub3;O&sub1;·½H&sub2;O: C, 54,54; H, 5,97; N, 8,30
gefunden: C, 54,62; H, 5,84; N, 7,89

Beispiel 8

2-[[[4-[[3-(4-Chlorophenyl)sulfonylamino-3-oxopropyl]amino]- 3,3-difluoro-1-(1-methylethyl)-2,4-dioxybutyl]amino]carbonyl]- 1-pyrrolidin-carbonsäure-phenylmethyl-ester

(Formel Ib, RA = Formel II, R¹= CH(CH&sub3;)&sub2;, R³A = øCH&sub2;OCO-, X = NRC, RB = CH&sub2;CH&sub2;CONHS(O)&sub2;(4-Clø), RC = H)
Zu einer gerührten Lösung von 4-Chlorobenzolsulfonamid (0,01926 g, 0,10 mmol) in trockenem CH&sub2;Cl&sub2;(2 ml) wurde bei Raumtemperatur unter N&sub2; DMAP (0,01343 g, 011 mmol) zugegeben, worauf sich der Zusatz von WSCDI (0,021108 g, 0,11 mmol) und des gemäß Beispiel 7 hergestellten Materials (0,050 g, 0,10 mmol) anschloß. Nachdem das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur über Nacht gerührt worden war, wurde weiteres CH&sub2;Cl&sub2;(20 ml) zugegeben, und die Lösung wurde mit 1 N HCl und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und unter Vakuum konzentriert, wobei 60 mg rohes Produkt erhalten wurden, das durch Blitzchromatographie auf saurem Silicagel unter Elution mit CHCl&sub3;:MeOH (99:1) gereinigt wurde. Dabei wurde das Titelprodukt (0,029 g, 43%) als weißes Pulver erhalten; TLC, Silicagel, Rf = 0,46, CHCl&sub3;:MeOH:HOAc (98:2:0,1); HPLC, tR = 10,08 min, H&sub2;O:CH&sub3;CN:THF:TFA (55:35:15:0,1), 2 ml/min, Phenomenex® Zorbax® C-8-Analysenkolonne, 4,6 mm·35 cm; ¹H NMR (DMSO-d&sub6;: 0.77(m,6), 1.79(m,3), 2,17(m,2), 4.3(m,1), 4.6-5.06(m,3), 7.31(m,5), 7.68(d,J = (.675 Hz,2), 7.9(d,J = 8.65 Hz,2), 8. 35(m,1), 9.31(m,1), 12.29(m,1).

Beispiel 10

2-[[[3,3-Difluoro-1-(1-methylethyl)-4-[methyl(2-phenylethyl)amino]-2,4-dioxobutyl]amino]carbonyl]-1-pyrrolidin-carbonsäure-phenylmethyl-ester

(Formel Ib, R³A = øCH&sub2;OCO-, R¹= -CH(CH&sub3;)&sub2;, RA = -COXRB, X = NRC, RC = CH&sub3;, RB= -(CH&sub2;)&sub2;ø)

a. (Formel VIIIb, R³A = øCH&sub2;OCO-, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, RB = -(CH&sub2;)&sub2;ø, RC = CH&sub3;,

Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1i, aber ohne N-Methylmorpholin, wurde ein durch das Verfahren von Beispiel 1 h hergestelltes Produkt mit N-Methyl-2-phenetylamin reagieren gelassen, wobei ohne weitere Reinigung ein Produkt (68%) erhalten wurde; TLC, Rf= 0,44, Silicagel, MeOH:CHCl&sub3; (5:95).

b. (Formel Ib, R³A = øCH&sub2;OCO-, R¹= -CH(CH&sub3;)&sub2;, RA = -COXRB, X = NRC, RC = CH&sub3;, RB = -(CH&sub2;)&sub2;ø)

Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1j, wobei jedoch zunächst mit gesättigtem NaHCO&sub3;, das 23 Equivalente Na&sub2;S&sub2;O&sub3; enthielt, und dann mit gesättigter NaHCO&sub3; extrahiert wurde, wurde das Produkt von Beispiel 10a oxidiert, wobei nach Reinigung durch Blitzchromatographie (CHCl&sub3;) das Titelprodukt (37%) erhalten wurde; HPLC, tR = 26,46 min, CH&sub3;CN:H&sub2;O (50:50), 2 ml/min, Zorbax ODS analytisch.
Analyse berechnet für
C&sub2;&sub9;H&sub3;&sub5;F&sub2;N&sub3;O&sub5;·H&sub2;O: C, 62,01; H, 6,64; N, 7,48
gefunden: C, 62,26; H, 6,39; N, 7,56

Beispiel 11

2-[[[4-[(3-Carboxypropyl)amino]-3,3-difluoro-1-(1-methylethyl)2,4-dioxobutyl]amino]carbonyl]-1-pyrrolidin-carbonsäure-phenylmethyl-ester

(Formel Ib, R³A = øCH&sub2;OCO-, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, RA = -COXRBX = NRC, RB = -(CH&sub2;)&sub3;COOH, RC = H)

a. (Formel VIIIb, R³A = øCH&sub2;OCO-, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, RB = -(CH&sub2;)&sub3;COOCH&sub3;ø, RC = H)

Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1i, wurde ein durch das Verfahren von Beispiel 1h hergestelltes Produkt mit γ-Aminobuttersäure-methylester-hydrochlorid reagieren gelassen, wobei ohne weitere Reinigung ein Produkt (93%) erhalten wurde; TLC, Rf = 0,51, Silicagel, MeOH:CHCl&sub3; (5:95).

b. (Formel Ib, R³A = øCH&sub2;OCO-, R¹= CH(CH&sub3;)&sub2;, RA = -COXRB, X = NRC, RB = -(CH&sub2;)&sub3;COOCH&sub3;, RC = H)

Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 10b wurde das Produkt von Beispiel 11a oxidiert, wobei nach Reinigung durch Blitzchromatographie (MeOH:CHCl&sub3; (3:97)) ein Produkt (83%) erhalten wurde; TLC, Rf = 0,66, Silicagel, MeOH:CHCl&sub3; (5:95).

c. (Formel Ib, R¹ = CH(CH&sub3;)&sub2;, RA = -COXRB, X = NRC, RB = -(CH&sub2;)&sub3;COOH&sub3;, RC = H)

Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1h, aber mit H&sub2;O:MeOH in-einem 1:4-Verhältnis wurde das Produkt von Beispiel 11b hydrolisiert, wobei nach Reinigung durch Blitzchromatographie auf saurem Silicagel (MeOH:CHCl&sub3;(5:95)) das Titelprodukt (77%) erhalten wurde; HPLC, tR = 21,22 min, 2 ml/min, H&sub2;O;CH&sub3;CN;THF;TFA (55:35:15:0,1), C&sub8;-Kolonne.
Analyse berechnet für
C&sub2;&sub9;H&sub3;&sub1;F&sub2;N&sub3;O&sub7;·0,5H&sub2;O: C, 55,37; H, 6,17; N, 7,81
gefunden: C, 55,32; H, 6,03; N, 7,81

Claims

1. Verbindung der Formel Ib,

worin R¹ für (1-3C)Alkyl steht, R³ für Benzyl steht, RA für eine Gruppe der Formel -CO.X.RB steht, worin X.RB für Methyl steht oder X für die Gruppe -NH- steht und RB ausgewählt ist aus -CH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;CH&sub2;CH&sub3;, -CH&sub2;CH&sub2;(2-Pyridyl), -CH&sub2;CH&sub2;OH, -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;OH, -CH&sub2;CH(OH)(Phenyl), -CH&sub2;CH&sub2; CO&sub2;H und -CH&sub2;CH&sub2;CONHS(O)&sub2;(4-Chlorophenyl), und A für Oxycarbonyl steht; oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹ für Isopropyl steht.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin ein chirales Zentrum bei R¹ die S-Konfiguration aufweist.

4. Salz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches ausgewählt ist aus Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und organischen Amin-Salzen und aus Salzen mit Säuren, die pharmazeutisch zulässige Säureadditionssalze bilden.