PL209701B1

PL209701B1 - Sposób wytwarzania ß-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego i sposób wytwarzania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino- α-metylowego

Info

Publication number: PL209701B1
Application number: PL377835A
Authority: PL
Inventors: Kenzo Yokozeki; Ayako Ohno; Seiichi Hara; Isao Abe
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2003-01-24
Filing date: 2004-01-23
Publication date: 2011-10-31
Also published as: US8389240B2; US20100279343A1; US20120301918A1; US8034584B2; US20090191600A1; EP2180061B1; EP2166109A1; EP2180061A1; PL377835A1; US7361458B2; US8361748B2; BRPI0406855B1; EP2157188B1; US20050124035A1; US20120295304A1; US20120003692A1; EP2157188A1; CA2512442C; EP2180060A1; EP2180059A1

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego (nazywanego również a-L-(e-o-podstawioną aspartylem)-L-fenyloalaniną (α-ARP) i sposobu wytwarzania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-a-metylowego (nazywanego również estrem metylowym a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny (α-APM).

Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania β-estru a-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego, który jest ważnym półproduktem do wytwarzania estru a-L-aspartylo-L-fenyloalanino-a-metylowego (nazwa produktu: aspartam), jako słodzik oraz sposobu wytwarzania estru a-L-aspartylo-L-fenyloalanino-a-metylowego wykorzystującego sposób wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego.

Znane metody wytwarzania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-a-metylowego (dalej w skrócie: „α-APM”) obejmują metodę syntezy chemicznej i metodę syntezy enzymatycznej. Znana jest metoda kondensacji N-zablokowanego bezwodnika kwasu L-asparaginowego z estrem metylowym L-fenyloalaniny w celu syntetyzowania N-zablokowanego APM i usuwania grupy N-blokującej w celu otrzymania APM, a odnośnie metody syntezy enzymatycznej, znana jest metoda kondensacji N-zablokowanego kwasu L-asparaginowego z estrem metylowym L-fenyloalaniny w celu syntetyzowania N-zablokowanego APM i usuwania grupy N-blokującej w celu otrzymania APM. W obu metodach, jednakże, konieczne są etapy wprowadzania grupy blokującej i usuwania grupy blokującej, a procesy te są bardzo kłopotliwe. Z drugiej strony, badano metodę wytwarzania APM, w której nie stosuje się żadnej grupy N-blokującej (patrz publikacja japońskiego opisu patentowego numer H02-015196 Gazette). Jednakże, metoda ta nie jest odpowiednia do produkcji przemysłowej z powodu bardzo niskiej wydajności produktu. A zatem, potrzebny jest rozwój metod przemysłowego wytwarzania aspartamu przy niskich kosztach.

Celem wynalazku jest sposób wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego, który jest półproduktem estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-a-metylowego, prostej i niedrogiej, a o wysokiej wydajności, bez przechodzenia przez złożoną syntezę. Ponadto, celem wynalazku jest sposób wytwarzania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-a-metylowego, łatwej, niedrogiej i o wysokiej wydajności.

W wyniku przeprowadzenia rozległych badań biorąc pod uwagę opisane cele, twórcy wynalazku stwierdzili, że nowy enzym lub substancja zawierająca enzym jest zdolna do selektywnego wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego z α,β-diestru kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny i zrealizowali wynalazek.

Sposób wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego, obejmujący otrzymywanie β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego z α,β-diestru kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny w obecności enzymu według wynalazku charakteryzuje się tym, że enzym wiąże selektywnie L-fenyloalaninę z miejscem a-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, a enzym stanowi białko wytwarzane przez mikroorganizm, przy czym białko jest wybrane spośród (A) do (X):

(A) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 616 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji, (B) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 616 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem a-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (C) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 21 do 619 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji, (D) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 21 do 619 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (E) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 625 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji, (F) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminoPL 209 701 B1 kwasowych o numerze 23 do 625 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (G) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 645 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji, (H) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 645 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (I) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 26 do 620 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji, (J) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 26 do 620 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (K) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 18 do 644 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji, (L) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 18 do 644 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (M) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji, (N) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (O) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji, (P) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, dełecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (Q) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji, (R) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (S) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji, (T) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (U) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji, (V) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (W) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji, (X) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Korzystnie, enzym pochodzi z hodowli mikroorganizmu lub komórki mikroorganizmu wyizolowanej z hodowli.

PL 209 701 B1

Mikroorganizm jest wybrany z grupy składającej się z: Aeromonas, Azotobacter, Alcaligenes, Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Empedobacter, Flavobacterium, Microbacterium, Propionibacterium, Brevibacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Sphingobacterium, Streptomyces, Xanthomonas, Williopsis, Candida, Geotrichum, Pichia, Saccharomyces, Torulaspora, Cellulophaga, Weeksella, Pedobacter, Persicobacter, Flexithrix, Chitinophaga, Cyclobacterium, Runella, Thermonema, Psychroserpens, Gelidibacter, Dyadobacter, Flammeovirga, Spirosoma, Flectobacillus, Tenacibaculum, Rhodotermus, Zobellia, Muricauda, Salegentibacter, Taxeobacter, Cytophaga, Marinilabilia, Lewinella, Saprospira i Haliscomenobacter.

Mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja opisanego białka (A) lub (B):

(A) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 616 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji, (B) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 616 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Korzystnie, mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (C) lub (D):

(C) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 21 do

619 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji, (D) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 21 do 619 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Korzystnie, mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (E) lub (F):

(E) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 625 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji, (F) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 625 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Korzystnie, mikroorganizmem jest też stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (G) lub (H):

(G) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 645 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji, (H) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 645 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Korzystnie, mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (I) lub (J):

(I) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 26 do

620 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji, (J) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 26 do 620 sekwencji aminokwasowe j opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Korzystnie, mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (K) lub (L):

PL 209 701 B1 (K) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 18 do 644 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji, (L) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 18 do 644 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Korzystnie, mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (M) lub (N):

(M) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji, (N) białka o sekwencji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Korzystnie, mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (O) lub (P):

(O) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji, (P) białka o sekwencji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β -diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Korzystnie, mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (Q) lub (R):

(Q) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji, (R) białka o sekwencji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Korzystnie, mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (S) lub (T):

(S) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji, (T) białka o sekwencji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Korzystnie, mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (U) lub (V):

(U) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji, (V) białka o sekwencji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Korzystnie, mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (W) lub (X):

(W) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji, (X) białka o sekwencji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

Stransformowanym mikroorganizmem jest Escherichia coli.

Sposób wytwarzania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego według wynalazku obejmuje etap syntetyzowania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego sposobem wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego określonym według wynalazku i etap, w którym prowadzi się reakcję przekształcania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego w ester α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-α-metylowy.

PL 209 701 B1

Dzięki sposobowi według wynałazku β-ester α-L-aspartylo-L-fenylalaniny można wytwarzać łatwo i z wysoką wydajnością, ze zmniejszeniem stosowania skomplikowanych metod syntetycznych, takich jak wprowadzanie/eliminacja grup blokujących.

Również ester α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-a-metylowy można wytwarzać łatwo, z wysoką wydajnością i niedrogo.

Krótki opis rysunku

Fig. 1 jest diagramem przedstawiającym ilości enzymów, które występują we frakcji cytoplazmy (Cy) i we frakcji periplazmy (Pe).

Wynalazek opisano kolejno:

<1> Sposób wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego

1. Sposób wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego

2. Mikroorganizmy stosowane w wynalazku

3. Enzymy stosowane w wynalazku <2> Sposób wytwarzania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-a-metylowego <1> Sposób wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego

1. Sposób wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego

W sposobie wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego według wynalazku (nazywanego również „sposobem wytwarzania peptydu według wynalazku”), umożliwia się reakcję L-fenyloalaniny i α,β-diestru kwasu L-asparaginowego w obecności enzymu posiadającego ustaloną aktywność tworzenia peptydu.

β-ester α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowy tworzy się z α,β-diestru kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny wykorzystując enzym lub substancję zawierającą enzym, zdolny do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe. Enzym lub substancja zawierająca enzym, zdolny do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego odnosi się do enzymu lub substancji zawierającej enzym, wykazujący zdolność do lub aktywność katalizowania reakcji, w której L-fenyloalanina, zasadniczo, nie jest zdolna do przeprowadzania ataku nukleofilowego na miejsce β α,β-diestru kwasu L-asparaginowego, ale jest zdolna do przeprowadzania ataku nukleofilowego tylko na miejsce α tego estru. Jednakże, jak przedstawiono w przykładach, można również otrzymać enzym lub substancję zawierającą enzym, który posiada zdolność do katalizowania reakcji, w której zasadniczo L-fenyloalanina nie jest zdolna do przeprowadzania ataku na miejsce α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego, ale jest zdolna do przeprowadzania ataku nukleofilowego tylko na miejsce β tego estru, przeciwnie do powyżej przedstawionej zdolności i wytwarza α-ester β-L-aspartylo-L-fenyloalaninowy (nazywany również β-L-(α-o-podstawioną aspartylem)-L-fenyloalaniną (β-ARP) z α,β-diestru kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny.

Wzór reakcji, w której L-fenyloalanina przeprowadza atak nukleofilowy na miejsce α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego z utworzeniem β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego (α-ARP) przedstawiono we wzorze (I-α) (w którym „Me” odpowiada grupie metylowej), przytaczając przypadek, kiedy jako α,β-diester kwasu L-asparaginowego stosuje się ester α,β-d i metylowy kwasu L-asparaginowego. Jak przedstawiono we wzorze (I-α), w sposobie wytwarzania peptydu według wynałazku, grupa aminowa L-fenyloalaniny reaguje z miejscem a estru metylowego kwasu L-asparaginowego tworząc wiązanie peptydowe.

Z drugiej strony, wzrór (I-β) wskazuje reakcję, w której miejsce β estru metylowego estru α,β-dimetylowego kwasu L-asparaginowego przechodzi atak nukleofilowy z utworzeniem estru β-L-aspartylo-L-fenyloalanino-α-metylowego (nazywanego również β-L-(α-o-metyloaspartylo)-L-fenyloalaniną (β-AMP)). Wiązanie peptydowe w β-AMP tworzy się miejscu β estru metylowego estru α,β-dimetylowego kwasu L-asparaginowego.

Enzym lub substancja zawierająca enzym stosowany w wynalazku przyśpiesza zasadniczo tylko reakcję jak przedstawiono we wzorze (I-α), ale zasadniczo nie powoduje reakcji jak przedstawiono we wzorze (I-β). α-APM można wytwarzać z α-AMP przez prosty etap reakcji (wzór (II)), ale α-APM nie można bezpośrednio wytwarzać z β-AMP.

Sposób według wynalazku jest maksymalnie wydajny jako sposób wytwarzania półproduktu α-APM i jest użyteczny w produkcji przemysłowej.

PL 209 701 B1

Sposób umożliwiający działanie enzymu lub substancji zawierającej enzym na α,β-diester kwasu L-asparaginowego można przeprowadzać przez mieszanie enzymu lub substancji zawierającej enzym z α,β-diestrem kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniną. Bardziej szczegółowo, można zastosować sposób, w którym enzym lub substancję zawierającą enzym dodaje się do roztworu zawierającego diester kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaninę w celu uzyskania reakcji. Kiedy jako substancję zawierającą enzym stosuje się mikroorganizm, który wytwarza enzym, można albo przeprowadzić reakcję, albo zastosować sposób, który obejmuje hodowanie mikroorganizmu produkującego enzym do wytwarzania i akumulację enzymu w mikroorganizmie lub płynie hodowlanym, w którym hodowano mikroorganizm oraz dodawanie α,β-diestru kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny do hodowli płynnej, bądź można stosować podobny sposób. Tak wytworzony β-ester α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowy odzyskuje się zgodnie z konwencjonalną metodą i, jeśli jest to konieczne, można go oczyszczać.

„Substancją zawierającą enzym” może być dowolna substancja tak długo, jak zawiera ona enzym, a specyficzne sposoby otrzymywania jej obejmują hodowlę mikroorganizmu, który wytwarza enzym, oddzielenie komórek mikroorganizmów z hodowli i traktowanie produktu komórek mikroorganizmu. Hodowla mikroorganizmu oznacza substancję otrzymaną przez hodowanie mikroorganizmu, a w szczególności oznacza mieszaninę komórek mikroorganizmu, podłoże stosowane do hodowania mikroorganizmu oraz substancję wytworzoną przez hodowany mikroorganizm i tak dalej. Ponadto, komórkę mikroorganizmu można przemywać do stosowania jako przemytą komórkę mikroorganizmu. Ponadto, traktowany produkt komórki mikroorganizmu obejmuje produkty otrzymane przez poddawanie komórki mikroorganizmu miażdżeniu, lizie lub liofilizacji, a nie oczyszczony enzym odzyskany przez traktowanie komórki mikroorganizmu oraz oczyszczony enzym, otrzymany przez dalsze oczyszczanie. Jako enzym poddawany oczyszczaniu można stosować częściowo oczyszczony enzym otrzymany różnymi metodami oczyszczania i tak dalej. Można stosować immobilizowane enzymy, które zimmobilizowano metodą wiązania kowalencyjnego, metodą adsorpcji, metodą uwięziania lub podobnie. Ponadto, w przypadku niektórych stosowanych mikroorganizmów, część komórek mikroorganizmów może przechodzić lizę podczas hodowli i, w takim przypadku, supernatant płynu hodowlanego można wykorzystywać również jako substancję zawierającą enzym.

Jako mikroorganizm, który zawiera enzym, można stosować szczep dziki lub szczep z rekombinowanym genem, w którym zachodzi ekspresja enzymu. Taki mikroorganizm nie ogranicza się do enzymu komórki mikroorganizmu, ale można stosować produkty traktowanych komórek mikroorganizmu, takie jak komórka mikroorganizmu traktowana acetonem i liofilizowana komórka mikroorganizmu. Można też stosować immobilizowane komórki mikroorganizmów, otrzymane przez immobilizację traktowanego produktu komórek mikroorganizmu z wykorzystaniem metody wiązania kowalencyjnego, metody adsorpcji i metody uwięzienia lub podobnych, immobilizowany traktowany produkt komórek mikroorganizmów.

Stosowanie szczepu dzikiego, który jest zdolny do wytwarzania enzymu wytwarzającego peptyd, wykazującego aktywność tworzenia β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego jest korzystne pod tym względem, że wytwarzanie peptydu można przeprowadzać łatwiej bez przechodzenia przez etap wytwarzania szczepu ze zrekombinowanym genem. Z drugiej strony, szczep ze zrekombinowanym genem, który stransformowano tak, aby zachodziła w nim ekspresja enzymu tworzącego peptyd, wykazującego aktywność tworzenia β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego można modyfikować tak, że enzym tworzący peptyd jest wytwarzany w większej ilości. A zatem, możliwe jest syntetyzowanie β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego i w większej ilości, i szybciej. Hodując mikroorganizm szczepu dzikiego lub szczepu ze zrekombinowanym genem w podłożu w celu akumulacji enzymu tworzącego peptyd w podłożu i/lub mikroorganizmie i mieszając zgromadzony produkt z α,β-diestrem kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniną można wytwarzać β-ester α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowy.

Należy zauważyć, że kiedy stosuje się wyhodowane produkty, wyhodowane komórki mikroorganizmów, przemywane komórki mikroorganizmów i produkty traktowanych komórek mikroorganizmów otrzymane przez poddawanie komórek mikroorganizmów miażdżeniu lub lizie, często zdarza się przypadek, że istnieje enzym, który rozkłada utworzony β-ester α-L-aspartylo-L-fenylalaninowy, bez zaangażowania w tworzenie β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego. W takim przypadku, korzystne jest w niektórych przypadkach dodawanie inhibitora metaloproteazy, takiego jak kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Dodawana ilość pozostaje w zakresie od 0,1 mM do 300 mM, korzystnie od 1 mM do 100 mM.

PL 209 701 B1

Ilość stosowanego enzymu lub substancji zawierającej enzym może być wystarczająca, jeśli jest ilością, przy której widoczny jest skutek docelowy (ilość skuteczna). Chociaż specjalista w tej dziedzinie może z łatwością określić tą skuteczną ilość na podstawie prostych, wstępnych doświadczeń, stosowana ilość wynosi, na przykład, około 0,01 do około 100 jednostek („U”) w przypadku stosowania enzymu i około 0,1 do około 500 g/litr w przypadku stosowania przemytych komórek mikroorganizmów. Należy zauważyć, że 1 U definiuje się jako ilość enzymu, która umożliwia wytwarzanie 1 mikromola ^mol) estru L-a-aspartylo-L-fenyloalanino-e-metylowego ze 100 mM estru α,β-dimetylowego kwasu L-asparaginowego i 200 mM L-fenyloalaniny w temperaturze 25°C i w ciągu jednej minuty. α,β-diester kwasu L-asparaginowego do stosowania w reakcji może być dowolnym estrem, który kondensuje się z L-fenyloalaniną z utworzeniem β-estru a-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego. Przykłady α,β-diestru kwasu L-asparaginowego obejmują ester α,β-dimetylowy kwasu L-asparaginowego i ester α,β-dietylowy kwasu L-asparaginowego. Jeśli umożliwia się reakcję estru α,β-dimetylowego kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny powstaje ester a-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowy (α-AMP), a jeśli poddaje się reakcji ester α,β-dietylowy kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaninę powstaje ester α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-e-etylowy (nazywany również a-L-(e-o-etyloaspartylo)-L-fenyloalaniną (a-AEP)).

Jeśli stężenia α,β-diestru kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny, służących jako materiały wyjściowe wynoszą od 1 mM do 10 mM, a korzystnie od 0,05 M do 2 M, mogą mieć miejsce przypadki, w których korzystne będzie dodanie jednego z substratów w ilości równomolarnej lub większej w odniesieniu do drugiego substratu i jeśli to konieczne selekcja. Ponadto, w przypadkach, kiedy wysokie stężenia substratów hamują reakcję, można je doprowadzać do stężeń, które nie powodują hamowania i stopniowo dodawać w czasie reakcji.

Temperaturą reakcji, która umożliwia wytwarzanie β-estru a-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego jest temperatura od 0 do 60°C, a korzystnie od 5 do 40°C. Ponadto, pH reakcji, które umożliwia wytwarzanie β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego wynosi od 6,5 do 10,5, a korzystnie od 7,0 do 10,0.

2. Mikroorganizmy stosowane w wynalazku

Jako mikroorganizmy w wynalazku można stosować bez szczególnych ograniczeń te mikroorganizmy, które wykazują zdolność do wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego z α,βdiestru kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny. Mikroorganizmy, które wykazują zdolność do wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego z α,β-diestru kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny obejmują, na przykład, mikroorganizmy należące do rodzajów Aeromonas, Azotobacter,

Alcaligenes, Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Empedobacter, Flavobacterium, Microbacterium, Propionibacterium, Brevibacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Sphingobacterium, Streptomyces, Xanthomonas, Williopsis, Candida, Geotrichum, Pichia, Saccharomyces, Torulaspora, Cellulophaga, Weeksella, Pedobacter, Persicobacter, Flexithrix, Chitinophaga, Cyclobacterium, Runella, Thermonema, Psychroserpens, Gelidibacter, Dyadobacter, Flammeovirga, Spirosoma, Flectobacillus, Tenacibaculum, Rhodotermus, Zobellia, Muricauda, Salegentibacter, Taxeobacter, Cytophaga, Marinilabilia, Lewinella, Saprospira oraz Haliscomenobacter.

Szczególnie, następujące mikroorganizmy mogą stanowić przykład:

Aeromonas hydrophila ATCC 13136

Azotobacter vinelandii IFO 3741

Alcaligenes faecalis FERM P-8460

Brevibacterium minutiferuna FERM BP-8277

Corynebacterium flavescens ATCC 10340

Escherichia coli FERM BP-8276

Empedobacter brevis ATCC 14234

Flavobacterium resinovorum ATCC 14231

Microbacterium arborescens ATCC 4348

Propionibacterium shermanii FERM BP-8100

Brevibacillus parabrevis ATCC 8185

Paenibacillus alvei IFO 14175

Pseudomonas fragi IFO 3458

Serratia grimesii ATCC 14460

Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13270

Sphingobacterium sp. FERM BP-8124

Streptomyces griseolus NRRL B-1305 (Streptomyces lavendulae)

PL 209 701 B1

Xanthomonas maltophilia FERM BP-5568

Williopsis saturnus IFO 0895

Candida magnoliae IFO 0705

Geotrichum fragrance CBS 152.25 (Geotrichum amycelium)

Geotrichum amycelium IFO 0905

Pichia ciferrii IFO 0905

Saccharomyces unisporus IFO 0724

Torulaspora delbrueckii IFO 0422

Cellulophaga lytica NBRC 14961

Weeksella virosa NBRC 16016

Pedobacter heparinus NBRC 12017

Persicobacter diffluens NBRC 15940

Flexithrix dorotheae NBRC 15987

Chitinophaga pinensis NBRC 15968

Cyclobacterium marinum ATCC 25205

Runella slithyformis ATCC 29530

Thermonema lapsum ATCC 43542

Psychroserpens burtonensis ATCC 700359

Gelidibacter algens ATCC 700364

Dyadobacter fermentans ATCC 700827

Flammeovirga aprica NBRC 15941

Spirosoma linguale DSMZ 74

Flectobacillus major DSMZ 103

Tenacibaculum maritimum ATCC 43398

Rhodotermus marinus DSMZ 4252

Zobellia galactanivorans DSMZ 12802

Muricauda ruestringensis DSMZ 13258

Salegentibacter salegens DSMZ 5424

Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116

Cytophaga hutchinsonil NBRC 15051

Marinilabilia salmonicolor NBRC 15948

Lewinella cohaerens ATCC 23123

Saprospira grandis ATCC 23119

Haliscomenobacter hydrossis ATCC 27775

Spośród wymienionych szczepów mikroorganizmów, mikroorganizmy opisane numerami FERM zdeponowano w National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia) i można do nich dotrzeć przez odniesienie do numeru.

Mikroorganizmy opisane numerami ATCC zdeponowano w American Type Culture Collection (P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) i można do nich dotrzeć przez odniesienie do numeru.

Mikroorganizmy opisane numerami IFO zdeponowano w Institute of Fermentation, Osaka (2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japonia), i można do nich dotrzeć przez odniesienie do numeru.

Mikroorganizmy opisane numerami NBRC zdeponowano w NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation (5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia) i można do nich dotrzeć przez odniesienie do numeru.

Mikroorganizmy opisane numerami DSMZ zdeponowano w Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures) (Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy) i można do nich dotrzeć przez odniesienie do numeru.

Mikroorganizmy opisane numerami FERM są zdeponowane w National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japonia).

Alcaligenes faecalis FERM P-8460 jest mikroorganizmem, który zdeponowano 30 września 1985 i nadano mu numer depozytu FERM P-8460.

PL 209 701 B1

Propionibacterium shermanii FERM P-9737 jest mikroorganizmem, który pierwotnie zdeponowano 4 grudnia 1987 i kontrolę tego organizmu przeniesiono do depozytu międzynarodowego na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego 1 lipca 2002 i nadano mu numer depozytu FERM BP-8100.

Xanthomonas maltophilia FERM BP-5568 jest mikroorganizmem, który pierwotnie zdeponowano 14 czerwca 1995 i kontrolę tego organizmu przeniesiono następnie do depozytu międzynarodowego na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego 14 czerwca 1996.

Brevibacterium minutiferuna FERM BP-8277 zdeponowano międzynarodowo na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego 20 stycznia 2002.

Escherichia coli FERM BP-8276 zdeponowano w międzynarodowej instytucji depozytowej 20 stycznia 2002.

Empedobacter brevis szczep ATCC 14234 (szczep FERM P-18545, szczep FERM BP-8113) zdeponowano w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia) 1 października 2001 i nadano mu numer depozytu FERM P-18545. Kontrolę tego organizmu przeniesiono następnie do depozytu na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego w International Patent Organism Depositary niezależnej korporacji administracyjnej, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology 8 lipca 2002 i nadano mu numer depozytu FERM BP-8113 (wskazanie mikroorganizmu: Empedobacter brevis szczep AJ 13933).

Sphingobacterium sp. szczep AJ 110003 zdeponowano w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (adres instytucji depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia) 22 lipca 2002 i nadano mu numer depozytu FERM BP-8124. Należy zauważyć, że szczep AJ 110003 (FERM BP-8124) zidentyfikowano jako uprzednio wymieniony Sphingobacterium sp. na podstawie eksperymentu identyfikującego opisanego powyżej. Szczep FERM BP-8124 jest pałeczką gram-ujemną (0,7 do 0,8 x 1,5 do 2,0 μηι), która nie tworzy przetrwalników i jest nieruchliwa. Jej kolonie są okrągłe z całkowicie gładkimi brzegami, zawierają małe uwypuklenia i mają połyskującą, jasnożółtą barwę. Organizm rośnie w temperaturze 30°C i jest katalazo-dodatni, oksydazo-dodatni i ujemny w teście OF (glukoza), i zidentyfikowano go jako bakterię należącą do rodzaju Sphingobacterium w oparciu o te właściwości. Ponadto, ze względu na właściwości, że jest on ujemny pod wzgłędem redukcji azotanów, ujemny pod względem wytwarzania indolu, ujemny pod względem wytwarzania kwasu z glukozy, ujemny pod względem dihydrolazy argininowej, ureazo-dodatni, dodatni pod względem hydrolizy eskuliny, ujemny pod względem hydrolizy żelatyny, β-galaktozydazo-dodatni, dodatni pod względem asymilacji glukozy, ujemny pod względem asymilacji L-arabinozy, dodatni pod względem asymilacji D-mannozy, ujemny pod względem asymilacji D-mannitolu, dodatni pod względem asymilacji N-acetylo-D-glukozoaminy, dodatni pod względem asymilacji maltozy, ujemny pod względem asymilacji glukonianu potasowego, ujemny pod względem asymilacji kwasu n-kaprynowego, ujemny pod względem asymilacji kwasu adypinowego, ujemny pod względem asymilacji kwasu d1-jabłkowego, ujemny pod względem asymilacji cytrynianu sodowego, ujemny pod względem asymilacji octanu fenylu i dodatni pod względem oksydazy cytochromowej, określono, że posiada on właściwości podobne do właściwości Sphingobacterium multivorum lub Sphingobacterium spiritivorum. Ponadto, chociaż wyniki analizowania analiz dotyczących homologii sekwencji genu 16S rRNA wskazują wyższy stopień homologii z Sphingobacterium multivorum (98,8%), nie było szczepu, z którym występowałoby całkowite dopasowanie szczepu bakteryjnego. Zgodnie z tym, ten szczep bakteryjny zidentyfikowano jako Sphingobacterium sp.

Jako te mikroorganizmy można użyć albo szczepy typu dzikiego, albo szczepy zmutowane, albo szczepy indukowane przez fuzję komórkową lub za pomocą technik genetycznych, takich jak inżynieria genetyczna.

W celu uzyskania komórek mikroorganizmów takich mikroorganizmów, mikroorganizmy można hodować i namnażać w odpowiednim podłożu. Nie ma żadnych szczególnych ograniczeń dotyczących podłoża stosowanego do tego celu, tak długo jak umożliwia ono wzrost mikroorganizmów. To podłoże może być zwykłym podłożem zawierającym zwykłe źródła węgla, źródła azotu, źródła fosforu, źródła siarki, jony nieorganiczne i organiczne źródła odżywcze, w zależności od potrzeb. Na przykład, można stosować dowolne źródła węgla, tak długo jak mikroorganizmy mogą je wykorzystywać. Szczególne przykłady źródła węgla, które można stosować obejmują cukry, takie jak glukoza, fruktoza, maltoza i amyloza, alkohole, takie jak sorbitol, etanol i glicerol, kwasy organiczne, takie jak kwas fumarowy, kwas cytrynowy, kwas octowy i kwas propionowy oraz ich sole, węglowodory, takie jak parafina, jak również ich mieszaniny.

PL 209 701 B1

Przykłady źródeł azotu, które można stosować obejmują sole amonowe kwasów nieorganicznych, takie jak siarczan amonowy i chlorek amonowy, sole amonowe kwasów organicznych, takie jak fumaran amonowy i cytrynian amonowy, azotany, takie jak azotan sodowy i azotan potasowy, organiczne związki azotu, takie jak peptony, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny i namok kukurydziany, jak również ich mieszaniny.

Źródła odżywcze stosowane w zwykłych podłożach, takie jak sole nieorganiczne, sole metali śladowych i witaminy można również odpowiednio mieszać i stosować.

Nie ma żadnych szczególnych ograniczeń dotyczących warunków hodowli i hodowlę można prowadzić, na przykład, w ciągu około 12 do około 48 godzin, właściwie kontrolując pH i temperaturę, odpowiednio, pH w zakresie od 5 do 8, a temperaturę w zakresie od 15 do 40°C, w warunkach tlenowych.

3. Enzymy stosowane w wynalazku

W sposobie wytwarzania peptydu według wynalazku stosuje się enzym, który ma zdolność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem a estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe.

W sposobie wytwarzania peptydu według wynalazku, enzym nie jest ograniczony przez swoje pochodzenie i sposób otrzymywania, tak długo jak posiada on taką aktywność. Dalej wyjaśniono oczyszczanie enzymów stosowanych w wynalazku i wykorzytywanie technik inżynierii genetycznej.

(3-1) Mikroorganizmy posiadające enzym, który można stosować w sposobie wytwarzania według wynalazku

Jako mikroorganizmy, które wytwarzają enzym według wynalazku, można stosować wszystkie mikroorganizmy, które wykazują zdolność do wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego z α,β-diestru kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny. Mikroorganizmy obejmują bakterie i podobne, które należą do rodzajów wybranych z grupy składającej się z:

Aeromonas, Azotobacter, Alcaligenes, Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Empedobacter, Flavobacterium, Microbacterium, Propionibacterlum, Brevibacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Serratla, Stenotrophomonas, Sphingobacterium, Streptomyces, Kanthomonas, Williopsis, Candida, Geotrichum, Pichia, Saccharomyces, Torulaspora, Cellulophaga, Weeksella, Pedobacter, Persicobacter, Flexithrix, Chitinophaga, Cyclobacterium, Runella, Thermonema, Psychroserpens, Gelidibacter, Dyadobacter, Flammeovirga, Spirosoma, Flectobacillus, Tenacibaculum, Rhodotermus,

Zobellia, Muricauda, Salegentibacter, Taxeobacter, Cytophaga, Marinilabilia, Lewinella, Saprospira oraz Haliscomenobacter.

Bardziej szczegółowo, mikroorganizmy obejmują:

Empedobacter brevis ATCC 14234 (szczep FERM P-18545, szczep FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002)),

Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 (instytucja depozytariusza: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 22 lipca 2002),

Pedobacter heparinus IFO 12017 (instytucja depozytariusza: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japonia),

Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (instytucja depozytariusza: Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres: Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany),

Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres: P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) oraz

Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres: P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) i tak dalej.

Empedobacter brevis szczep ATCC 14234 (szczep FERM P-18545, szczep FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002)) oraz

Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 (instytucja depozytariusza: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo

PL 209 701 B1

Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 22 lipca 2002),

Pedobacter heparinus szczep IFO 12017 (instytucja depozytariusza: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japonia),

Taxeobacter gelupurpurascens szczep DSMZ 11116 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy),

Cyclobacterium marinum szczep ATCC 25205 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) oraz

Psycloserpens burtonensis szczep ATCC 700359 (instytucja depozytariusza: American Type Culture Collection, adres; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) i podobne są mikroorganizmami wybranymi przez twórców wynalazku w wyniku poszukiwań mikroorganizmów wytwarzających enzym, które wytwarzają β-ester α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowy z α,β-diestru kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny z wysoką wydajnością.

(3-2) Oczyszczanie enzymu

Jak wspomniano, enzym tworzący peptyd stosowany w wynalazku można oczyszczać z bakterii, na przykład rodzaju Empedobacter. Sposób izolowania i oczyszczania enzymu tworzącego peptyd z Empedobacter brevis wyjaśniono jako przykład oczyszczania enzymu.

Najpierw, przygotowuje się ekstrakt z komórek mikroorganizmów Empedobacter brevis, na przykład szczepu FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002) przez niszczenie komórek sposobem fizycznym, takim jak miażdżenie ultradźwiękami lub sposobem enzymatycznym z wykorzystaniem enzymu rozpuszczającego ścianę komórkową i usuwaniem nierozpuszczalnej frakcji za pomocą rozdzielenia przez wirowanie i tak dalej. Enzym wytwarzający peptyd można następnie oczyszczać przez frakcjonowanie ekstraktu komórkowego, otrzymanego w powyższy sposób, przez połączenie zwykłych metod oczyszczania białek, takich jak chromatografia anionowymienna, chromatografia kationowymienna lub chromatografia przez filtrację żelową.

Na przykład, nośnikiem do stosowania w chromatografii anionowymiennej jest Q-Sepharose HP (produkowana przez Amersham). Enzym odzyskuje się z niezadsorbowanej frakcji w warunkach pH 8,5, kiedy umożliwia się przechodzenie ekstraktu komórkowego zawierającego enzym przez kolumnę upakowaną nośnikiem.

Na przykład, nośnikiem do stosowania w chromatografii kationowymiennej jest MonoS HR (produkowany przez Amersham). Po zadsorbowaniu enzymu na kołumnie przez umożliwienie przechodzenia ekstraktu komórkowego zawierającego enzym przez kolumnę upakowaną nośnikiem a następnie płukaniu kolumny, enzym eluuje się roztworem buforu posiadającego wysokie stężenie soli. W tym czasie, stężenie soli może być stopniowo podwyższane lub można zastosować gradient stężeń.

Na przykład, w przypadku stosowania MonoS HR, enzym zadsorbowany na kolumnie eluuje się NaCl w stężeniu od około 0,2 do około 0,5 M.

Enzym oczyszczony można następnie równomiernie oczyszczać stosując chromatografię przez filtrację żelową i tak dalej. Przykładem nośnika do stosowania w chromatografii przez filtrację żelową jest Sephadex 200 pg (produkowany przez Amersham).

W procedurze oczyszczania, frakcję zawierającą enzym można weryfikować przez oznaczanie aktywności tworzenia peptydu każdej frakcji, zgodnie z metodą wskazaną w opisanych później przykładach. Wewnętrzną sekwencję aminokwasową enzymu oczyszczonego przedstawiono w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2 Listy Sekwencji.

(3-3) Izolacja DNA, wytwarzanie transformanta i oczyszczanie enzymu wytwarzającego peptyd (3-3-1) Izolacja DNA

Twórcom wynalazku najpierw udało się wyizolować jeden rodzaj DNA enzymu wytwarzającego peptyd, który można stosować w sposobie wytwarzania peptydu według wynalazku ze szczepu Empedobacter brevis FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002).

DNA posiadający sekwencję zasad składającą się z zasad o numerach od 61 do 1908 sekwencji zasad SEQ ID NO: 5, który jest DNA według wynalazku, wyiolowano ze szczepu Empedobacter brevis FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: National Institute of Advanced Industrial Science

PL 209 701 B1 and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002). DNA posiadający sekwencję zasad składającą się z zasad o numerach od 61 do 1908 jest częścią sekwencji kodującej (CDS).

W sekwencji zasad składającej się z zasad o numerach od 61 do 1908 zawarty jest region sekwencji sygnałowej i region dojrzałego białka. Region sekwencji sygnałowej jest regionem, który składa się z zasad o numerach od 61 do 126, podczas gdy region dojrzałego białka składa się z zasad o numerach od 127 do 1908. Opisano zarówno gen dla białka enzymu wytwarzającego peptyd, który zawiera sekwencję sygnałową, jak i gen dla białka enzymu wytwarzającego peptyd w postaci dojrzałego białka. Sekwencja sygnałowa zawarta w sekwencji opisanej w SEQ ID NO: 5 jest rodzajem sekwencji liderowej. Uważa się, że główną funkcją peptydu liderowego kodowanego przez sekwencję liderową jest wydzielanie z wnętrza błony komórkowej na zewnątrz błony komórkowej. Uważa się, że białko kodowane przez zasady o numerach od 127 do 1908, mianowicie miejsca dla estru z wyłączeniem sekwencji liderowej, jest dojrzałym białkiem i wykazuje wysoki stopień aktywności tworzenia peptydu.

DNA składający się z sekwencji zasad, która składa się z zasad o numerach od 61 do 1917 opisanych w SEQ ID NO: 11, który jest również DNA według wynalazku, wyizolowano ze szczepu Sphingobacterium sp. FERM BP-8124 (instytucja depozytariusza: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002). DNA posiadający sekwencję zasad składającą się z zasad o numerach od 61 do 1917 jest częścią sekwencji kodującej (CDS). W sekwencji zasad składającej się z zasad o numerach od 61 do 1917 zawarty jest region sekwencji sygnałowej i region dojrzałego białka. Region sekwencji sygnałowej jest regionem, który składa się z zasad o numerach od 61 do 120, podczas gdy region dojrzałego białka składa się z zasad o numerach od 121 do 1917. Wynalazek ujawnia zarówno gen dla białka enzymu wytwarzającego peptyd, który zawiera sekwencję sygnałową, jak i gen dla białka enzymu wytwarzającego peptyd w postaci dojrzałego białka. Sekwencja sygnałowa zawarta w sekwencji opisanej w SEQ ID NO: 11 jest rodzajem sekwencji liderowej. Uważa się, że główną funkcją peptydu liderowego kodowanego przez sekwencję liderową jest wydzielanie z wnętrza błony komórkowej na zewnątrz błony komórkowej. Uważa się, że białko kodowane przez zasady o numerach od 121 do 1917, mianowicie część z wyłączeniem peptydu liderowego, jest dojrzałym białkiem i wykazuje wysoki stopień aktywności tworzenia peptydu.

DNA składający się z sekwencji zasad, która składa się z zasad o numerach 61 do 1935 opisany w SEQ ID NO: 17, który jest również DNA według wynalazku, wyizolowano ze szczepu Pedobacter heparinus IFO 12017 (instytucja depozytariusza: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japonia). DNA posiadający sekwencję zasad składającą się z zasad o numerach od 61 do 1935, opisanych w SEQ ID NO: 17, jest częścią sekwencji kodującej (CDS). W sekwencji zasad składającej się z zasad o numerach od 61 do 1935 zawarty jest region sekwencji sygnałowej i region dojrzałego białka. Region sekwencji sygnałowej jest regionem, który składa się z zasad o numerach od 61 do 126, podczas gdy region dojrzałego białka składa się z zasad o numerach od 127 do 1935. Mianowicie, wynalazek zapewnia zarówno gen dla białka enzymu wytwarzającego peptyd, który zawiera sekwencję sygnałową, jak i gen dla białka enzymu wytwarzającego peptyd w postaci dojrzałego białka. Sekwencja sygnałowa zawarta w sekwencji opisanej w SEQ ID NO: 17 jest rodzajem sekwencji liderowej. Uważa się, że główną funkcją peptydu liderowego kodowanego przez sekwencję liderową jest wydzielanie z wnętrza błony komórkowej na zewnątrz błony komórkowej. Uważa się, że białko kodowane przez zasady o numerach od 127 do 1935, mianowicie część z wyłączeniem peptydu liderowego, jest dojrzałym białkiem i wykazuje wysoki stopień aktywności tworzenia peptydu.

DNA składający się z sekwencji zasad, która składa się z zasad o numerach od 61 do 1995 opisany w SEQ ID NO: 22, który jest również DNA według wynalazku, wyizolowano z Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy). DNA składający się z sekwencji, która składa się z zasad o numerach od 61 do 1995, opisanych w SEQ ID NO: 22, jest częścią sekwencji kodującej (CDS). W sekwencji zasad składającej się z zasad o numerach od 61 do 1995 zawarty jest region sekwencji sygnałowej i region dojrzałego białka. Region sekwencji sygnałowej jest regionem,

PL 209 701 B1 który składa się z zasad o numerach od 61 do 126, podczas gdy region dojrzałego białka składa się z zasad o numerach od 127 do 1995. Wnalazek ujawnia zarówno gen dla białka enzymu wytwarzającego peptyd, który zawiera sekwencję sygnałową, jak i gen dla białka enzymu wytwarzającego peptyd w postaci dojrzałego białka. Sekwencja sygnałowa zawarta w sekwencji opisanej w SEQ ID NO: 22 jest rodzajem sekwencji liderowej. Uważa się, że główną funkcją peptydu liderowego kodowanego przez sekwencję liderową jest wydzielanie z wnętrza błony komórkowej na zewnątrz błony komórkowej. Uważa się, że białko kodowane przez zasady o numerach od 127 do 1995, mianowicie część z wyłączeniem peptydu liderowego, jest dojrzałym białkiem i wykazuje wysoki stopień aktywności tworzenia peptydu.

DNA składający się z sekwencji zasad, która składa się z zasad o numerach od 29 do 1888 opisanych w SEQ ID NO: 24, który jest również DNA według wynalazku, wyizolowano z Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA). DNA składający się z sekwencji, która składa się z zasad o numerach od 29 do 1888, opisanych w SEQ ID NO: 24, jest częścią sekwencji kodującej (CDS). W sekwencji zasad składającej się z zasad o numerach od 29 do 1888 zawarty jest region sekwencji sygnałowej i region dojrzałego białka. Region sekwencji sygnałowej jest regionem, który składa się z zasad o numerach od 29 do 103, podczas gdy region dojrzałego białka składa się z zasad o numerach od 104 do 1888. Wynalazek ujawnia zarówno gen dla białka enzymu wytwarzającego peptyd, który zawiera sekwencję sygnałową, jak i gen dla białka enzymu wytwarzającego peptyd w postaci dojrzałego białka. Sekwencja sygnałowa zawarta w sekwencji opisanej w SEQ ID NO: 24 jest rodzajem sekwencji liderowej. Uważa się, że główną funkcją peptydu liderowego kodowanego przez sekwencję liderową jest wydzielanie z wnętrza błony komórkowej na zewnątrz błony komórkowej. Uważa się, że białko kodowane przez zasady o numerach od 104 do 1888, mianowicie część z wyłączeniem peptydu liderowego, jest dojrzałym białkiem i wykazuje wysoki stopień aktywności tworzenia peptydu.

DNA składający się z sekwencji zasad, która składa się z zasad o numerach od 61 do 1992, opisanych w SEQ ID NO: 26, który jest również DNA według wynalazku, wyizolowano z Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (instytucja depozytariusza: American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA). DNA składający się z sekwencji, która składa się z zasad o numerach od 61 do 1992, opisanych w SEQ ID NO: 26, jest częścią sekwencji kodującej (CDS). W sekwencji zasad składającej się z zasad o numerach od 61 do 1992 zawarty jest region sekwencji sygnałowej i region dojrzałego białka. Region sekwencji sygnałowej jest regionem, który składa się z zasad o numerach od 61 do 111, podczas gdy region dojrzałego białka składa się z zasad o numerach od 112 do 1992. Wynalazek ujawnia zarówno gen dla białka enzymu wytwarzającego peptyd, który zawiera sekwencję sygnałową, jak i gen dla białka enzymu wytwarzającego peptyd w postaci dojrzałego białka. Sekwencja sygnałowa zawarta w sekwencji opisanej w SEQ ID NO: 26 jest rodzajem sekwencji liderowej. Uważa się, że główną funkcją peptydu liderowego kodowanego przez sekwencję liderową jest wydzielanie z wnętrza błony komórkowej na zewnątrz błony komórkowej. Uważa się, że białko kodowane przez zasady o numerach od 112 do 1992, mianowicie część z wyłączeniem peptydu liderowego, jest dojrzałym białkiem i wykazuje wysoki stopień aktywności tworzenia peptydu.

Ponadto, różne techniki rekombinacji genów wskazane poniżej można stosować zgodnie z opisem w Molecular Cloning, wyd. 2, Cold Spring Harbor Press (1989) oraz innych publikacjach.

DNA kodujący enzym, który można stosować w wynalazku, można uzyskiwać przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR, patrz White, T. J. i in., Trends Genet., 5, 185 (1989)) lub hybrydyzację z chromosomalnym DNA lub biblioteką DNA Empedobacter brevis, Sphingobacterium sp., Pedobacter heparinus, Taxeobacter gelupurpurascens, Cyclobacterium marinum lub Psychroserpens burtonensis. Startery stosowane w PCR można projektować w oparciu o wewnętrzną sekwencję aminokwasową określoną na podstawie oczyszczonego enzymu tworzącego peptyd, jak wyjaśniono w części (3). Ponadto, ponieważ sekwencje zasad genów enzymu wytwarzającego peptyd (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 26) zidentyfikowane startery lub sondy hybrydyzacyjne można projektować na podstawie tych sekwencji zasad i gen można izolować stosując sondy. Jeśli jako startery w PCR stosuje się startery posiadające, odpowiednio, sekwencje odpowiadające nie ulegającemu translacji regionowi 5' i nie ulegającemu translacji regionowi 3', można zamplifikować pełnej długości region kodujący enzymu. Biorąc jako przykład przypadek amplifikacji regionu zawierającego zarówno sekwencję liderową, jak i region kodujący dojrzałe białko, jak opisano w SEQ ID NO: 5, specyficzne przykłady starterów obejmują starter posiadający sekwencję

PL 209 701 B1 zasad regionu przed zasadą o numerze 61 w SEQ ID NO: 5 dla startera ze strony 5' i starter posiadający sekwencję komplementarną do sekwencji zasad regionu za zasadą numer 1908 dla startera ze strony 3'.

Startery można syntetyzować, na przykład zgodnie ze zwykłymi metodami z wykorzystaniem metody z zastosowaniem fosforynoamidów (Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859), stosując Model 380B DNA Synthesizer produkowany przez Applied Biosystems. Reakcję PCR można przeprowadzać, na przykład, stosując Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer) i Takara LA PCR In Vitro Cloning Kit (Takara Shuzo), zgodnie z metodą określoną przez producenta.

DNA kodujący enzym, który można stosować w sposobie wytwarzania peptydu według wynalazku, niezależnie od tego czy DNA zawiera sekwencję liderową czy nie, obejmuje DNA, który jest zasadniczo identyczny z DNA składającym się z CDS opisanej w SEQ ID NO: 5 Listy Sekwencji. Mianowicie, DNA zasadniczo identyczny z DNA według wynalazku można otrzymać przez izolację DNA, który hybrydyzuje z DNA, składającym się z sekwencji zasad komplementarnej do CDS opisanej w SEQ ID NO: 5 Listy Sekwencji lub z sondą przygotowaną na podstawie sekwencji zasad w ostrych warunkach i koduje białko wykazujące aktywność wytwarzania peptydu, z DNA kodującego zmutowany enzym lub komórek, które posiadają taki DNA.

DNA kodujący enzym, który można stosować w sposobie wytwarzania peptydu według wynalazku, niezależnie od tego czy DNA zawiera sekwencję liderową czy nie, obejmuje DNA, który jest zasadniczo identyczny z DNA składającym się z CDS opisanej w SEQ ID NO: 11 Listy Sekwencji. Mianowicie, DNA zasadniczo identyczny z DNA według wynalazku można otrzymać przez izolację DNA, który hybrydyzuje z DNA, składającym się z sekwencji zasad komplementarnej do CDS opisanej w SEQ ID NO: 11 Listy Sekwencji lub z sondą przygotowaną na podstawie sekwencji zasad w surowych warunkach i koduje białko wykazujące aktywność wytwarzania peptydu, z DNA kodującego zmutowany enzym lub komórek, które posiadają taki DNA.

DNA kodujący enzym, który można stosować w sposobie wytwarzania peptydu według wynalazku, niezależnie od tego czy DNA zawiera sekwencję liderową czy nie, obejmuje DNA, który jest zasadniczo identyczny z DNA składającym się z CDS opisanej w SEQ ID NO: 17 Listy Sekwencji. Mianowicie, DNA zasadniczo identyczny z DNA według wynalazku można otrzymać przez izolację DNA, który hybrydyzuje z DNA, składającym się z sekwencji zasad komplementarnej do CDS opisanej w SEQ ID NO: 17 Listy Sekwencji lub z sondą przygotowaną na podstawie sekwencji zasad w surowych warunkach i koduje białko wykazujące aktywność wytwarzania peptydu, z DNA kodującego zmutowany enzym lub komórek, które posiadają taki DNA.

DNA kodujący enzym, który można stosować w sposobie wytwarzania peptydu według wynalazku, niezależnie od tego czy DNA zawiera sekwencję liderową czy nie, obejmuje DNA, który jest zasadniczo identyczny z DNA składającym się z CDS opisanej w SEQ ID NO: 22 Listy Sekwencji. Mianowicie, DNA zasadniczo identyczny z DNA według wynalazku można otrzymać przez izolację DNA, który hybrydyzuje z DNA, składającym się z sekwencji zasad komplementarnej do CDS opisanej w SEQ ID NO: 22 Listy Sekwencji lub z sondą przygotowaną na podstawie sekwencji zasad w surowych warunkach i koduje białko wykazujące aktywność wytwarzania peptydu, z DNA kodującego zmutowany enzym lub komórek, które posiadają taki DNA.

DNA kodujący enzym, który można stosować w sposobie wytwarzania peptydu według wynalazku, niezależnie od tego czy DNA zawiera sekwencję liderową czy nie, obejmuje DNA, który jest zasadniczo identyczny z DNA składającym się z CDS opisanej w SEQ ID NO: 24 Listy Sekwencji. Mianowicie, DNA zasadniczo identyczny z DNA według wynalazku można otrzymać przez izolację DNA, który hybrydyzuje z DNA, składającym się z sekwencji zasad komplementarnej do CDS opisanej w SEQ ID NO: 24 Listy Sekwencji lub z sondą przygotowaną na podstawie sekwencji zasad w surowych warunkach i koduje białko wykazujące aktywność wytwarzania peptydu, z DNA kodującego zmutowany enzym lub komórek, które posiadają taki DNA.

DNA kodujący enzym, który można stosować w sposobie wytwarzania peptydu według wynalazku, niezależnie od tego czy DNA zawiera sekwencję liderową czy nie, obejmuje DNA, który jest zasadniczo identyczny z DNA składającym się z CDS opisanej w SEQ ID NO: 26 Listy Sekwencji. Mianowicie, DNA zasadniczo identyczny z DNA według wynalazku można otrzymać przez izolację DNA, który hybrydyzuje z DNA, składającym się z sekwencji zasad komplementarnej do CDS opisanej w SEQ ID NO: 26 Listy Sekwencji lub z sondą przygotowaną na podstawie sekwencji zasad w surowych warunkach i koduje białko wykazujące aktywność wytwarzania peptydu, z DNA kodującego zmutowany enzym lub komórek, które posiadają taki DNA.

PL 209 701 B1

Sondę można wytwarzać, na przykład zgodnie z ustalonymi metodami opierającymi się na, na przykład sekwencji zasad opisanej w SEQ ID NO: 5 Listy Sekwencji. Ponadto, sposób izolowania docelowego DNA przez zastosowanie sondy do znajdowania DNA, który hybrydyzuje z sondą można również przeprowadzać zgodnie z ustalonymi metodami. Na przykład, sondę DNA można wytwarzać przez amplifikację sekwencji zasad wklonowanej do plazmidu lub wektora fagowego, rozszczepianie sekwencji zasad pożądanej do stosowania jako sonda za pomocą enzymów restrykcyjnych, a następnie ekstrahowanie pożądanej sekwencji zasad. Część, która ma być odszczepiona, można dopasowywać w zależności od docelowego DNA.

Termin „w ostrych warunkach” odnosi się do warunków, w których tworzy się tak zwana specyficzna hybryda, a nie tworzy się niespecyficzna hybryda. Trudno jest precyzyjnie wyrazić te warunki w wartościach liczbowych. Na przykład, wspomnieć można warunki, w których DNA posiadające wysokie homologie, na przykład, 50% lub więcej, korzystnie 80% lub więcej, korzystniej 90% lub więcej, hybrydyzują ze sobą, a DNA posiadające niższe homologie niż te, nie hybrydyzują ze sobą lub zwykłe warunki dla płukania w hybrydyzacji Southern, w której hybrydyzację przeprowadza się w temperaturze 60°C w stężeniu soli odpowiadającemu 1 x SSC i 0,1% SDS, korzystnie 0,1 x SSC i 0,1% SDS. Chociaż geny, które hybrydyzują w takich warunkach, obejmują te geny, w których kodony stop występują w pewnych położeniach wzdłuż ich sekwencji lub które utraciły aktywność w wyniku mutacji w centrum aktywnym, można je łatwo usunąć przez ich ligację z komercjalnie dostępnym wektorem ekspresyjnym, prowadzenie ich ekspresji w odpowiednim gospodarzu i oznaczanie aktywności enzymatycznej produktu ekspresji z zastosowaniem metody opisanej później.

Jednakże, w przypadku sekwencji, która hybrydyzuje w surowych warunkach jak opisano, korzystne jest, aby białko kodowane przez tę sekwencję zasad zachowywało około połowy lub więcej, korzystnie 80% lub więcej, a korzystniej 90% lub więcej, aktywności enzymatycznej białka posiadającego sekwencję aminokwasową kodowaną przez oryginalną sekwencję zasad, służącą jako baza utrzymywana w warunkach temperatury 50°C i pH 8. Na przykład, kiedy wyjaśnia się dla przypadku, na przykład, sekwencji zasad, która hybrydyzuje w surowych warunkach z DNA, który posiada sekwencję zasad komplementarną do sekwencji zasad składającej się z zasad o numerach od 127 do 1908 sekwencji zasad opisanej w SEQ ID NO: 5, korzystne jest, aby białko kodowane przez tę sekwencję zasad zachowywało około połowę lub więcej, korzystnie 80% lub więcej, a korzystniej 90% lub więcej, aktywności enzymatycznej białka posiadającego sekwencję aminokwasową, która składa się z reszt aminokwasowych o numerach od 23 do 616 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 w warunkach temperatury 50°C i pH 8.

Sekwencję aminokwasową kodowaną przez CDS opisaną w SEQ ID NO: 5 Listy Sekwencji przedstawiono w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji. Sekwencję aminokwasową kodowaną przez CDS opisaną w SEQ ID NO: 11 Listy Sekwencji przedstawiono w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji. Sekwencję aminokwasową kodowaną przez CDS opisaną w SEQ ID NO: 17 Listy Sekwencji przedstawiono w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji. Sekwencję aminokwasową kodowaną przez CDS opisaną w SEQ ID NO: 22 Listy Sekwencji przedstawiono w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji. Sekwencję aminokwasową kodowaną przez CDS opisaną w SEQ ID NO: 24 Listy Sekwencji przedstawiono w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji. Sekwencję aminokwasową kodowaną przez CDS opisaną w SEQ ID NO: 26 Listy Sekwencji przedstawiono w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji.

Całkowita sekwencja aminokwasową opisana w SEQ ID NO: 6 zawiera peptyd liderowy i region dojrzałego białka, przy czym reszty aminokwasowe o numerach od 1 do 22 stanowią peptyd liderowy, a reszty aminokwasowe o numerach od 23 do 616 stanowią region dojrzałego białka.

Całkowita sekwencja aminokwasową opisana w SEQ ID NO: 11 zawiera peptyd liderowy i region dojrzałego białka, przy czym reszty aminokwasowe o numerach od 1 do 20 stanowią peptyd liderowy, a reszty aminokwasowe o numerach od 21 do 619 stanowią region dojrzałego białka.

Całkowita sekwencja aminokwasową opisana w SEQ ID NO: 18 zawiera peptyd liderowy i region dojrzałego białka, przy czym reszty aminokwasowe o numerach od 1 do 22 stanowią peptyd liderowy, a reszty aminokwasowe o numerach od 23 do 625 stanowią region dojrzałego białka.

Całkowita sekwencja aminokwasową opisana w SEQ ID NO: 23 zawiera peptyd liderowy i region dojrzałego białka, przy czym reszty aminokwasowe o numerach od 1 do 22 stanowią peptyd liderowy, a reszty aminokwasowe o numerach od 23 do 645 stanowią region dojrzałego białka.

Całkowita sekwencja aminokwasowa opisana w SEQ ID NO: 25 zawiera peptyd łiderowy i region dojrzałego białka, przy czym reszty aminokwasowe o numerach od 1 do 25 stanowią peptyd liderowy, a reszty aminokwasowe o numerach od 26 do 620 stanowią region dojrzałego białka.

PL 209 701 B1

Całkowita sekwencja aminokwasowa opisana w SEQ ID NO: 27 zawiera peptyd liderowy i region dojrzałego białka, przy czym reszty aminokwasowe o numerach od 1 do 17 stanowią peptyd łiderowy, a reszty aminokwasowe o numerach od 18 do 644 stanowią region dojrzałego białka.

Białko kodowane przez DNA według wynalazku jest białkiem, w którym dojrzałe białko posiada aktywność tworzenia peptydu i DNA, które koduje białko zasadniczo identyczne z białkiem posiadającym sekwencję aminokwasowa opisaną w SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 lub SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji, niezależnie od tego czy zawiera peptyd łiderowy czy nie, również wchodzi w zakres DNA według wynalazku. (Należy zauważyć, że sekwencję zasad wyszczególniono na podstawie sekwencji aminokwasowych zgodnie z kodami uniwersalnych kodonów).

Wynalazek dotyczy DNA, który koduje białka wskazane w od (A) do (X) poniżej:

(A) białko posiadające sekwencję aminokwasowa składającą się z reszt aminokwasowych numer 23 do 616 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji, (B) białko posiadające sekwencję aminokwasowa obejmującą podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych numer 23 do 616 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem a estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe, (C) białko posiadające sekwencję aminokwasową składającą się z reszt aminokwasowych numer 21 do 619 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji, (D) białko posiadające sekwencję aminokwasową obejmującą podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych numer 21 do 619 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe, (E) białko posiadające sekwencję aminokwasową składającą się z reszt aminokwasowych numer 23 do 625 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji, (F) białko posiadające sekwencję aminokwasową obejmującą podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych numer 23 do 625 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe, (G) białko posiadające sekwencję aminokwasową składającą się z reszt aminokwasowych numer 23 do 645 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji, (H) białko posiadające sekwencję aminokwasową obejmującą podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych numer 23 do 645 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe, (i) białko posiadające sekwencję aminokwasową składającą się z reszt aminokwasowych numer 26 do 620 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji, (J) białko posiadające sekwencję aminokwasową obejmującą podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych numer 26 do 620 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe, (K) białko posiadające sekwencję aminokwasową składającą się z reszt aminokwasowych numer 18 do 644 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji, (L) białko posiadające sekwencję aminokwasową obejmującą podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych numer 18 do 644 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe, (M) białko posiadające sekwencję aminokwasową opisaną w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji, (N) białko zawierające region dojrzałego białka, posiadający sekwencję aminokwasową obejmującą podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sePL 209 701 B1 kwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 5 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe, (O) białko posiadające sekwencję aminokwasową opisaną w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji, (P) białko zawierające region dojrzałego białka, posiadający sekwencję aminokwasową obejmującą podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem a estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe, | (Q) białko posiadające sekwencję aminokwasową opisaną w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji, (R) białko zawierające region dojrzałego białka, posiadający sekwencję aminokwasową obejmującą podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe, (S) białko posiadające sekwencję aminokwasową opisaną w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji, (T) białko zawierające region dojrzałego białka, posiadający sekwencję aminokwasową obejmującą podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe, (U) białko posiadające sekwencję aminokwasową opisaną w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji, (V) białko zawierające region dojrzałego białka, posiadający sekwencję aminokwasową obejmującą podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe, (W) białko posiadające sekwencję aminokwasową opisaną w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji, (X) białko zawierające region dojrzałego białka, posiadający sekwencję aminokwasową obejmującą podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji i wykazujące aktywność selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego przez wiązanie peptydowe.

Chociaż znaczenie terminu „wiele z” różni się w zależności od położenia i rodzaju reszt aminokwasowych w trójwymiarowej strukturze białka, pozostaje on w zakresie, który znacząco nie uszkadza trójwymiarowej struktury i aktywności reszt aminokwasowych białka i w szczególności wynosi od 2 do 50, korzystnie od 2 do 30, a korzystniej od 2 do 10. Jednakże, w przypadku sekwencji aminokwasowych obejmujących podstawienia, delecję, insercję, addycję i/lub inwersje jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej białek (B), (D), (F), (H), (J), (L), (N), (P), (R), (T), (V) lub (X), korzystne jest, aby białka zachowywały około połowy lub więcej, korzystniej 80% lub więcej, a nawet korzystniej 90% lub więcej aktywności enzymatycznej białek, kiedy nie zawierają one żadnej mutacji, w warunkach temperatury 50°C i pH 8. Na przykład, w przypadku sekwencji aminokwasowej (B), obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji, korzystne jest, aby białko to zachowało około połowy lub więcej, korzystniej 80% lub więcej, a nawet korzystniej 90% lub więcej aktywności enzymatycznej białka o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji, w warunkach temperatury 50°C i pH 8.

Mutację sekwencji aminokwasowej, podobną do tej wskazanej we wcześniej wspomnianym (B) i tak dalej otrzymuje się modyfikując sekwencję zasad tak, że aminokwas specyficznego dla estru miejsca w genie enzymu ulega podstawieniu, delecji, insercji lub dodaniu, na przykład, przez mutagenezę specyficzną wobec miejsca estru. Ponadto, zmodyfikowany DNA można również uzyskiwać stosując sposoby mutagenezy znane w nauce. Sposoby mutagenezy odnoszą się, na przykład, do sposobu, w którym DNA kodujący enzym traktuje się in vitro hydroksyloamina i tym podobnymi, jak również do sposobu, w którym bakterie z rodzaju Escherichia, które posiadają DNA kodujący enzym traktuje się mutagenem stosowanym zwykle w nienaturalnej mutagenezie, takim jak promieniowanie ultrafioletowe, N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (NTG) lub kwas azotawy.

PL 209 701 B1

Ponadto, naturalnie występujące mutacje, takie jak różnice przypisywane gatunkom lub szczepom mikroorganizmów również uwzględnia się w podstawieniach, delecjach, insercjach, addycjach i/lub inwersjach zasad opisanych powyżej. Dzięki ekspresji DNA, posiadającego taką mutację, w odpowiednich komórkach i badanie aktywności enzymatycznej produktu ekspresji, można otrzymać DNA, który koduje białko zasadniczo identyczne z białkiem opisanym w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 6, 12, 18, 23, 25 lub 27 Listy Sekwencji.

(3-3-2) Przygotowywanie transformantów i wytwarzanie enzymów wytwarzających peptyd

Enzymy wytwarzające peptyd, które można stosować w sposobie wytwarzania peptydu według wynalazku można wytwarzać przez wprowadzenia DNA, jak wyjaśniono w (3-3-1), do odpowiedniego gospodarza i prowadzić ekspresję DNA w tym gospodarzu.

Odnośnie gospodarzy do ekspresji białka określonego przez DNA, przykłady gospodarzy, których można stosować obejmują różne komórki prokariotyczne, obejmujące bakterie z rodzaju Escherichia, takie jak Escherichia coli, bakterie z rodzaju Empedobacter, bakterie z rodzaju Sphingobacterium, bakterie z rodzaju Flavobacterium oraz Bacillus subtilis, jak również różne komórki eukariotyczne, obejmujące Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis i Aspergillus oryzae.

Rekombinowany DNA, stosowany do wprowadzania DNA do gospodarza, można przygotować przez wstawienie DNA, który ma być wprowadzony do wektora odpowiadającego rodzajowi gospodarza, w którym DNA będzie poddawany ekspresji, w takiej postaci, że białko kodowane przez ten DNA może ułegać ekspresji. W przypadku, kiedy promotor unikalny dla genu enzymu wytwarzającego peptyd Empedobacter brevis i tak dalej działa w komórkach gospodarza, promotor można stosować jako promotor dla ekspresji DNA według wynalazku. Ponadto, inny promotor, który działa w komórkach gospodarza można zligować z DNA według wynalazku i DNA może ulegać ekspresji pod kontrolą promotora, jeśli jest to konieczne.

Przykłady metod transformacji do wprowadzania rekombinowanego DNA do komórek gospodarza obejmują metodę D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)) lub metodę, w której przenikalność DNA podwyższa się przez traktowanie receptorów komórek mikroorganizmów chlorkiem wapniowym (Mandel, H. i Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).

W przypadku masowej produkcji białka z zastosowaniem technologii rekombinowanego DNA, koniugacja białka w transformancie, który wytwarza białko tworząc ciałka inkluzyjne białka jest również korzystnym sposobem przeprowadzania wynalazku. Zalety tej metody ekspresji i wytwarzania obejmują ochronę białka docelowego przed trawieniem przez proteazy obecne w komórkach mikroorganizmu oraz proste i łatwe oczyszczanie białka decelowego przez niszczenie komórek mikroorganizmów, a następnie rozdział przez wirowanie i tak dalej.

Ciałko inkluzyjne białka tak otrzymanego poddaje się solubilizacji substancją denaturującą białko i białko przekształca się w białko właściwie ufałdowane, fizjologicznie aktywne stosując procedurę regeneracji aktywności, na którą składa się głównie usuwanie czynnika denaturującego. Istnieją tego liczne przykłady, obejmujące regenerację aktywności ludzkiej interleukiny-2 (JPS61-257931).

W celu otrzymania aktywnego białka z ciałek inkluzyjnych, wymagana jest seria procedur obejmujących solubilizację i regenerację aktywności, a procedura ta jest bardziej złożona niż w przypadku wytwarzania aktywnego białka bezpośrednio. Jednakże, w przypadku wytwarzania białka, które posiada szkodliwy wpływ na wzrost mikroorganizmów w dużych objętościach w obrębie komórek mikroorganizmów, efekt ten można zahamować przez akumulację białka w postaci ciałek inkluzyjnych nieaktywnego białka w obrębie komórek mikroorganizmów.

Przykłady metod produkcji masowej białka docelowego w postaci ciałek inkluzyjnych obejmują metodę, w której białko docelowe ulega ekspresji niezależnie pod kontrolą silnego promotora oraz metodę, w której białko docelowe ulega ekspresji w postaci białka tworzącego fuzję z białkiem, o którym wiadomo, że ulega ekspresji w dużej objętości.

Wynalazek wyjaśniono bardziej szczegółowo dalej, biorąc jako przykład sposób wytwarzania stransformowanej Escherichia coli i stosowania tego stransformowanego mikroorganizmu do wytwarzania enzymu wytwarzającego peptyd. Ponadto, w przypadku wytwarzania enzymu wytwarzającego peptyd w mikroorganizmie takim jak Escherichia coli, można wprowadzać DNA, który koduje białko prekursorowe, zawierające sekwencję liderową lub można wprowadzać DNA, który składa się tyłko z regionu dojrzałego białka, który nie zawiera sekwencji liderowej i DNA można odpowiednio sełekcjonować pod kątem sekwencji kodującej białko, w zależności od warunków wytwarzania, postaci, warunków stosowania i tak dałej enzymu, który ma być produkowany.

PL 209 701 B1

Promotory zwykle używane do wytwarzania heterogennych białek w Escherichia coli można stosować jako promotory do ekspresji DNA kodującego enzym tworzący peptyd. Przykłady takich promotorów obejmują promotor T7, promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR faga lambda, promotor PL i inne silne promotory. Ponadto, przykłady wektorów, które można stosować obejmują pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW11S, pMW219 i pMW218. Oprócz tego, można również stosować wektory DNA fagowych. Ponadto, można stosować wektory ekspresyjne, które zawierają promotory i są zdolne do ekspresji sekwencji wstawionego DNA.

W celu wytwarzania enzymu tworzącego peptyd w postaci ciałka inkluzyjnego fuzji białkowej, gen, który koduje inne białko i korzystnie peptyd hydrofilowy liguje się przed lub za genem enzymu tworzącego peptyd w celu uzyskania genu fuzji białkowej. Gen, który koduje inne białko i może być dowolnym genem, który podwyższa ilość zakumulowanej fuzji białkowej i wzmacnia rozpuszczalność fuzji białkowej po etapach denaturacji i regeneracji. Przykłady kandydatów na takie geny, obejmują gen 10 T7, gen β-galaktozydazy, gen reduktazy dehydrofolianowej, gen γ-interferonu, gen interleukiny-2 i gen prochymozyny.

Kiedy geny te liguje się z genami, które kodują enzymy tworzące peptyd, geny liguje się tak, aby otwarte ramki odczytu kodonów były zgodne. Rekomenduje się, aby geny ligować przy właściwym miejscu dla enzymów restrykcyjnych estru lub wykorzystywać syntetyczny DNA o właściwej sekwencji.

Ponadto, w celu podwyższenia wytwarzanej ilości enzymu wytwarzającego peptyd, korzystne jest w niektórych przypadkach aby terminator, który jest sekwencją terminującą transkrypcję był zligowany za genem fuzji białkowej. Terminator obejmuje, na przykład, terminator T7, terminator faga fd, terminator T4, terminator genu oporności na tetracyklinę oraz terminator genu trpA Escherichia coli.

Jako wektory do wprowadzania genu, który koduje enzym wytwarzający peptyd lub fuzję białkową pomiędzy enzymem wytwarzającym peptyd i innym białkiem w Escherichia coli korzystne są tak zwane wektory typu wielokopiowego, których przykłady obejmują plazmid posiadający replikator pochodzący z ColE1, na przykład plazmid oparty na pUC i plazmid oparty na pBR322, bądź ich pochodne. „Pochodne” odnoszą się do tych plazmidów, które są poddawane modyfikacji przez podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję zasad. Należy zauważyć, że modyfikacja obejmuje modyfikacje przez mutagenezę za pomocą mutagenu lub promieniowania UV lub modyfikacje będące wynikiem mutacji spontanicznych.

Dla przeszukiwania transformantów, korzystne jest, aby wektory posiadały markery, takie jak gen oporności na ampicylinę. Jako takie plazmidy są komercjalnie dostępne wektory ekspresyjne posiadające silne promotory (wektor oparty na pUC (produkowany przez Takara Shuzo, Co., Ltd.), wektor oparty na pRROK (produkowany przez Clonetech Laboratories, Inc.), pKK233-2 (produkowany przez Clonetech Laboratories, Inc.) i tak dalej. Rekombinowany DNA otrzymuje się przez ligaćję fragmentu DNA z wektorem DNA. W tym przypadku, promotor, gen kodujący hydrolazę amidową L-aminokwasów lub fuzję białkową składającą hydrolazy amidowej L-aminokwasów i innego białka oraz w zależności od przypadku, w tym porządku liguje się terminator.

Kiedy transformowana jest Escherichia coli z zastosowaniem rekombinowanego DNA i otrzymane w wyniku Escherichia coli hoduje się, enzym wytwarzający peptyd lub fuzja białkowa składająca się z enzymu wytwarzającego peptyd i innego białka, ulegają ekspresji i wytwarzaniu. Chociaż jako gospodarza do transformacji można stosować szczep, który zwykle stosuje się do ekspresji heterogennego genu, korzystny jest, na przykład, szczep Escherichia coli JM109. Metody przeprowadzania transformacji i metody przeszukiwania transformantów opisano w Molecular Cloning, wyd. 2, Cold Spring Harbor Press (1989) i w innych publikacjach.

W przypadku ekspresji enzymu wytwarzającego peptyd w postaci fuzji białkowej, enzym wytwarzający enzym można rozszczepiać stosując proteazę restrykcyjną, która wykorzystuje jako sekwencje rozpoznawania sekwencje nieobecne w enzymie wytwarzającym peptyd, takie jak czynnik krzepnięcia krwi Xa lub kallikreina.

Podłoże stosowane zwykle do hodowli Escherichia coli, takie jak podłoże M9 z hydrolizatem kazeiny lub podłoże LB, można stosować jako podłoże produkcyjne. Ponadto, warunki hodowli i warunki indukcji wytwarzania wybiera się odpowiednio, zgodnie z zastosowanym markerem wektora, promotorem, rodzajem mikroorganizmu będącego gospodarzem i tak dalej. Metodę można stosować do odzyskiwania enzymu wytwarzającego peptyd lub fuzji białkowej, składającej się z enzymu wytwarzającego peptyd i innego białka. Jeśli enzym wytwarzający peptyd lub jego fuzja białkowa ulega solubilizacji w komórkach mikroorganizmów, to po odzyskaniu komórek mikroorganizmów, komórki miażdży się

PL 209 701 B1 lub lizuje tak, aby można je było stosować jako płynny nieoczyszczony enzym. Ponadto, enzym wytwarzający peptyd lub jego fuzję białkową można oczyszczać przed stosowaniem, stosując zwykłe techniki, takie jak precypitacja, filtracja lub chromatografia kolumnowa, jeśli jest to konieczne. W tym przypadku, można również zastosować metodę oczyszczania, która wykorzystuje przeciwciało skierowane przeciw enzymowi wytwarzającemu peptyd lub jego fuzji białkowej.

W przypadku, kiedy tworzą się ciałka inkluzyjne białka, ciałka inkluzyjne solubilizuje się czynnikiem denaturującym. Można je solubilizować razem z białkiem komórek mikroorganizmu. Jednakże, zważywszy na poniższą procedurę oczyszczania, ciałka inkluzyjne korzystnie zabiera się i następnie solubilizuje. Do odzyskiwania ciałek inkluzyjnych z komórek mikroorganizmów można stosować konwencjonalnie znane metody. Na przykład, ciałka inkluzyjne można odzyskiwać miażdżąc komórki mikroorganizmów, a następnie rozdzielać przez wirowanie. Przykłady czynników denaturujących zdolnych do solubilizacji ciałek inkluzyjnych obejmują chlorowodorek guanidyny (na przykład 6 M, pH 5 do 8) i mocznik (na przykład 8 M).

Białko wykazujące aktywność regeneruje się przez usuwanie tych czynników deneturujących przez dializę. Jako roztwór dializacyjny do stosowania w dializie można stosować roztwór buforu Tris-HCl lub roztwór buforu fosforanowego, a stężenie może wynosić, na przykład, od 20 mM do 0,5 M, podczas gdy pH może wynosić, na przykład od 5 do 8.

Stężenie białka podczas etapu regeneracji utrzymuje się korzystnie na poziomie około 500 μg/ml lub mniej. Temperatura dializy wynosi korzystnie 5°C lub mniej, aby hamować samosieciowanie regenerowanego enzymu wytwarzającego peptyd. Ponadto, oprócz dializy, do usuwania czynników deneturujących można stosować rozcieńczanie lub ultrafiltrację i oczekuje się, że aktywność będzie zregenerowana niezależnie od tego jaki zastosowano czynnik denaturujący.

<2> Sposób wytwarzania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-α-metylowego

Sposób wytwarzania α-APM według wynalazku obejmuje pierwszy etap syntetyzowania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego zgodnie z „<1> Sposób wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego” i drugi etap, przekształcania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego w ester α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-α-metylowy.

Korzystne warunki w pierwszym etapie są takie jak opisano „<1> Sposób wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego”. Ponadto, drugi etap można przeprowadzać zgodnie ze znaną metodą i odnieść się można do metody oraz korzystnych warunków opisanych na przykład, w publikacji JP H4-41155, itd. Dzięki sposobowi wytwarzania α-APM według wynalazku, α-APM, który jest ważny jako słodzik i podobne, można intensywnie wytwarzać z wysoką wydajnością.

Przykłady

Oprócz potwierdzenia przez wybarwianie ninhydryną chromatogramów cienkowarstwowych (jakościowo), wykonywano oznaczenia ilościowe przez wysokosprawną chromatografię cieczową w celu oznaczenia produktów.

Kolumna: InertsiL ODS-2 (produkowana przez GL Science, Inc.), eluat: wodny roztwór fosforanu zawierający 5,0 mM 1-oktanosulfonian sodowy (pH 2,1) : metanol = 100:15 do 50, szybkość przepływu: 1,0 ml/min, detekcja: 210 nanometrów (nm).

P r z y k ł a d 1. Mikroorganizmy, które wytwarzają ester α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowy mililitrów („mL” lub „ml”) podłoża (pH 7,0), zawierającego 20 gramów („g”) glicerolu, 5 g siarczanu aminowego, 1 g diwodorofosforanu potasowego, 3 g wodorofosforanu dipotasowego, 0,5 g siarczanu magnezowego, 10 g ekstraktu drożdżowego i 10 g peptonu w 1 litrze (L), które przeniesiono do kolby Sakaguchi o pojemności 500 mL i sterylizowano w temperaturze 115°C w ciągu 15 minut (podłoże 1) stosowano do hodowli bakterii i promieniowców przedstawionych w tablicy 1-1. Przygotowano podłoże agarowe na skosy (pH 7,0) zawierające 5 g/litr glukozy, 10 g/litr ekstraktu drożdżowego, 10 g/litr peptonu, 5 g/litr NaCl i 20 g/litr agaru w podłożu 1 i mikroorganizmu przedstawione w tablicy 1 hodowano na tych skosach agarowych w temperaturze 30°C w ciągu 24 godzin. Następnie, oczko ezy mikroorganizmów hodowano w podłożu 1 w temperaturze 30°C w ciągu 24 godzin, a następnie w hodowli wytrząsanej w temperaturze 30°C i przy 120 obrotach/minutę w ciągu 17 godzin. Po zakończeniu hodowli, komórki mikroorganizmów oddzielono od hodowli płynnej przez wirowanie i zawieszono w 0,1 M buforze boranowym (pH 9,0), zawierającym 10 mM EDTA do 100 g/litr jako mokrą masę komórek mikroorganizmów.

Dla hodowli drożdży przedstawionych w tablicy 1-1 stosowano 50 mL podłoża (pH 6,0), zawierającego 10 g glukozy, 10 g glicerolu, 5 g siarczanu amonowego, 1 g diwodorofosforanu potasowego,

PL 209 701 B1 g wodorofosforanu dipotasowego, 0,5 g siarczanu magnezowego, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g ekstraktu słodowego i 10 g peptonu w 1 litrze przeniesionego do kolby Sakaguchi o pojemności 500 mL i sterylizowanego w temperaturze 115°C w ciągu 15 minut (podłoże 2). Przygotowano podłoże agarowe do skosów (pH 6,0), zawierające 5 g/litr glukozy, 5 g/litr ekstraktu drożdżowego, 5 g/litr ekstraktu słodowego, 10 g/litr peptonu, 5 g/litr NaCl i 20 g/litr agaru w podłożu 2 i drożdże przedstawione w tablicy 1 hodowano na skosach agarowych w temperaturze 30°C w ciągu 24 godzin. Następnie, oczko ezy drożdży hodowano z wytrząsaniem w temperaturze 30°C w ciągu 24 godzin w podłożu 2 w temperaturze 25°C i przy 120 obrotach/minutę w ciągu 17 godzin. Po zakończeniu hodowli, komórki mikroorganizmów oddzielono od hodowli płynnej przez wirowanie i zawieszono w 0,1 M buforze boranowym (pH 9,0), zawierającym 10 mM EDTA do 100 g/litr jako mokrą masę komórek mikroorganizmów.

Mikroorganizmy przedstawione w tablicy 1-2 wyhodowano w następujący sposób. Stałe podłoże agarowe (pH 7,2, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 1 g tryptonu, 1 g ekstraktu drożdżowego i 15 g agaru w 1 litrze sztucznej wody morskiej SP Daigo stosowano do hodowli Cellulophaga lytica NBRC 14961 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres: 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia) lub Flexithrix dorotheae NBRC 15987 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres instytucji depozytariusza; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia). Komórki mikroorganizmu Cellulophaga lytica NBRC 14961 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres instytucji depozytariusza; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia) lub Flexithrix dorotheae NBRC 15987 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres instytucji depozytariusza; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chibaken, Japonia), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin.

Podłoże agarowe z krwią baranią (Nissui Plate, Nissui Pharmaceutical) stosowano do hodowli Weeksella virosa NBRC 16016 (Instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres instytucji depozytariusza; 5-8 KazusaKamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia). Komórki mikroorganizmu Weeksella virosa NBRC 16016 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres instytucji depozytariusza; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,0, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 10 g peptonu, 2 g ekstraktu drożdżowego, 1 g MgSO4 · 7H2O i 15 g agaru w 1 litrze wody destylowanej stosowano do hodowli Pedobacter heparinus NBRC 12017 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres instytucji depozytariusza; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia). Komórki mikroorganizmu Pedobacter heparinus NBRC 12017 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres: 5-8 Kazusa-Kamaashi 2Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono hodowlę w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,0, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 0,5 g KNO3, 0,1 g glicerofosforanu potasowego, 1 g trishydroksymetyloaminometanu, 5 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 15 g agaru i 1 ml roztworu pierwiastków śladowych w 1 litrze sztucznej wody morskiej SP Daigo stosowano do hodowli Persicobacter diffluens NBRC 15940 ((instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres: 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia), Należy zauważyć, że roztwór pierwiastków śladowych zawierał 2,85 g H3BO4, 1,8 g MnCl2 · 4H2O, 1,36 g FeSO4 · 7H2O, 26, 9 mg CuCl2 · 2H2O, 20, 8 mg ZnCl2, 40,4 mg CoCl2 · 6H2O, 25, 2 mg Na2MoO4 · 2H2O, oraz 1,77 g winianu sodowego). Komórki mikroorganizmu Persicobacter diffluens NBRC 15940 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres: 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia), dla których pro24

PL 209 701 B1 wadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,0, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 3 g Bakcokasitone, 1 g ekstraktu drożdżowego, 1,36 g CaCl2 · 2H2O i 15 g agaru w 1 litrze wody destylowanej stosowano do hodowli Chitinophaga pinensis NBRC 15968 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres: 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia). Komórki mikroorganizmu Chitinophaga pinensis NBRC 15968 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres instytucji depozytariusza; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,0, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 5 g peptonu, 1 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g FeSO4 · 7H2O i 15 g agaru w 1 litrze sztucznej wody morskiej SP Daigo stosowano do hodowli Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA). Komórki mikroorganizmu Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,0, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 1 g peptonu, 1 g ekstraktu drożdżowego, 1 g glukozy i 15 g agaru w 1 litrze wody destylowanej stosowano do hodowli Runella slithyformis ATCC 29530 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA). Komórki mikroorganizmu Runella slithyformis ATCC 29530 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 8,2, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 0,2 g kwasu nitrylotrioctowego, 2 ml 0,03% roztworu FeCl3, 0,12 g CaSO4 · 2H2O, 0,2 g MgSO4 · 7H2O, 0,016 g NaCl, 0,21 g KNO3, 1,4 g NaNO3, 0,22 g Na2HPO4, 2 ml roztworu pierwiastków śladowych i 15 g agaru w 1 litrze wody destylowanej stosowano do hodowli Thermonema lapsum ATCC 43542 ((instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA); należy zauważyć, że roztwór pierwiastków śladowych zawierał 0,5 ml H2SO4, 2,2 g MnSO4, 0,5 g ZnSO4, 0,5 g H3BO3, 0,016 g CuSO4, 0,025 g Na2MoO4 i 0,046 g CoCI2). Komórki mikroorganizmu Thermonema lapsum ATCC 43542 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 60°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin.

Podłoże Marine Agar 2216 (produkowane przez Difco) stosowano do hodowli Gelidlbacter algens ATCC 700364 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), Lewinella cohaerens ATCC 23123 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) lub Salegentibacter salegens DSMZ 5424 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy). W przypadku Gelidibacter algens ATCC 700364 (nstytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) lub Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), stosowano komórki mikroorganizmów Gelidibacter algens ATCC 700364 lub Psychroserpens burtonensis ATCC 700359

PL 209 701 B1 (nstytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 10°C w ciągu 72, a następnie hodowlę główną w temperaturze 10°C w ciągu 72 godzin. W przypadku Lewinella cohaerens ATCC 23123 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), komórki mikroorganizmu Lewinella cohaerens ATCC 23123 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin. W przypadku Salegentibacter salegens DSMZ 5424 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy), komórki mikroorganizmu Salegentibacter salegens DSMZ 5424 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,0, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 0,8 g NH4CI, 0,25 g KH2PO4, 0,4 g K2HPO4, 0,505 g KNO3, 15 mg CaCl2 · 2H2O, 20 mg MgCl2 · 6H2O, 7 mg FeSO4 · 7H2O, 5 mg Na2SO4, 5 mg MnCl2 · 4H2O, 0,5 mg H3BO3, 0,5 mg ZnCl2, 0,5 mg CoCl2 · 6H2O, 0,5 mg NiSO4 · 6H2O, 0,3 mg CuCl2 · 2H2O, 10 mg Na2MoO4 · 2H2O, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g peptonu, 0,5 g hydrolizatu kazeiny, 0,5 g dekstrozy, 0,5 g skrobi rozpuszczalnej,

O, 5 g pirogronianu sodowego i 15 g agaru w 1 litrze wody destylowanej stosowano do hodowli Dyadobacter fermentans ATCC 700827 (instytucja depozytariusza: American Type Culture Collection, adres:

P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA). Stosowano komórki mikroorganizmu Dyadojbacter fermentans ATCC 700827 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin, a następnie hodowlę główną w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,2, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 2 g tryptonu, 0,5 g ekstraktu mięsnego, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g octanu sodowego i 15 g agaru w 1 litrze sztucznej wody morskiej SP Daigo stosowano do hodowli Flammeovirga aprica NBRC 15941 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres instytucji depozytariusza; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia). Komórki mikroorganizmu Flammeovirga aprica NBRC 15941 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres instytucji depozytariusza; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,0, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 1 g glukozy, 1 g peptonu, 1 g ekstraktu drożdżowego i 15 g agaru w 1 litrze wody destylowanej stosowano do hodowli Spirosoma linguale DSMZ 74 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy) lub Flectobacillus major DSMZ 103 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy). Komórki mikroorganizmu Spirosoma linguale DSMZ 74 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy) lub Flectobacillus major DSMZ 103 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin.

PL 209 701 B1

Stałe podłoże agarowe (pH 7,0, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 0,5 g tryptonu, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g ekstraktu mięsnego, 0,2 g octanu sodowego i 15 g agaru w 300 ml wody destylowanej i 700 ml sztucznej wody morskiej SP Daigo stosowano do hodowli Tenacibaculum maritimum ATCC 43398 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA). Stosowano komórki mikroorganizmu Tenacibaculum maritimum ATCC 43398 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin, a następnie hodowlę główną w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,2, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 2,5 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g tryptonu, 100 mg kwasu nitrylotrioctowego, 40 mg CaSO4 · 2H2O, 200 mg MgCl2 · 6H2O, 0,5 ml 0,01 M cytrynianu Fe, 0,5 ml roztworu pierwiastków śladowych, 100 ml buforu fosforanowego, 900 ml wody destylowanej i 28 g agaru w 1 litrze stosowano do hodowli Rhodothermus marinus DSMZ 4252 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy). Należy zauważyć, że roztwór pierwiastków śladowych zawierał 12,8 g kwasu nitrylotrioctowego, 1 g FeCl2 · 4H2O, 0,5 g MnCl2 · 4H2O, 0,3 g CoCl2 · 2H2O, 50 mg CuCl2 · 2H2O, 50 mg Na2MoO4 · 2H2O, 20 mg H3BO3 i 20 mg NiCl2 · 6H2O). Komórki mikroorganizmu Rhodothermus marinus DSMZ 4252 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 60°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 60°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (1,5% agar, pH 7,6, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające BACTO MARINE BROTH (DIFCO 2216) stosowano do hodowli Zobellia galactanivorans DSMZ 12802 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy). Podłoże to stosowano dla komórek mikroorganizmu Zobellia galactanivorans DSMZ 12802 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,2, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 1,5 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g peptonu, 2 g heksadekanu, 17,7 g NaCl, 0,48 g KCl, 3,4 g MgCl2 · 6H2O, 4,46 g MgSO4 · 7H2O, 0,98 g CaCl2 i 15 g agaru w 1 litrze wody destylowanej stosowano do hodowli Muricauda ruestringenesis DSMZ 13258 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy). Komórki mikroorganizmu Muricauda ruestringenesis DSMZ 13258 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,2, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 3 g Casitone, 1 g ekstraktu drożdżowego, 1,36 g CaCl2 · 2H2O i 15 g agaru w 1 litrze wody destylowanej stosowano do hodowli Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy). Komórki mikroorganizmu Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (instytucja depozytariusza; the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin.

PL 209 701 B1

Stałe podłoże agarowe (pH 7,2, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 3 g Casitone, 1 g ekstraktu drożdżowego, 1,36 g CaCl2 · 2H2O, 5 g celobiozy i 15 g agaru w 1 litrze wody destylowanej stosowano do hodowli Cytophaga hutchinsonii NBRC 15051 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres instytucji depozytariusza; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia). Komórki mikroorganizmu Cytophaga hutchinsonii NBRC 15051 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resorce Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres instytucji depozytariusza; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,2, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 10 g peptonu, 2 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g MgSO4 · 7H2O i 15 g agaru w 250 ml wody destylowanej i 750 ml sztucznej wody morskiej SP Daigo stosowano do hodowli Marinilabilia salmonicolor NBRC 15948 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres instytucji depozytariusza; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia). Komórki mikroorganizmu Marinilabilia salmonicolor NBRC 15948 (instytucja depozytariusza; NITE Biological Resource Center of the National Institute of Technology and Evaluation, adres: 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japonia), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,0, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 0,5 g KNO3, 0,1 g oligoglicerofosforanu sodowego, 1 g trishydroksymetyloaminometanu, 2 g tryptonu, 2 g ekstraktu drożdżowego, 15 g agaru i 1 ml roztworu pierwiastów śladowych w 1 litrze sztucznej wody morskiej SP Daigo stosowano do hodowli Saprospira grandis ATCC 23119 ((instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres: P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA). Należy zauważyć, że roztwór pierwiastków śladowych zawierał 2,85g H3BO4, 1,8 g MnCl2 · 4H2O, 1,36 g FeSO4 · 7H2O, 26, 9 mg CuCl2 · 2H2O, 20, 8 mg ZnCl2, 40,4 mg CoCl2 · 6H2O, 25,2 mg Na2MoO4 · 2H2O i 1,77 g winianu sodowego). Komórki mikroorganizmu Saprospira grandis ATCC 23119 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres: P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin.

Stałe podłoże agarowe (pH 7,5, sterylizowane w temperaturze 120°C w ciągu 15 minut), zawierające 27 mg KH2PO4, 40 mg K2HPO4, 40 mg Na2HPO4 · 2H2O, 50 mg CaCl2 · 2H2O, 75 mg MgSO4 · 7H2O, 5 mg FeCl3 · 6H2O, 3 mg MnSO4 · H2O, 1,31 g kwasu glutaminowego, 2,5 mg Trypticase Soy Broth bez glukozy, 0,4 mg tiaminy, 0,01 mg witaminy B12, 2 g glukozy oraz 1 ml roztworu pierwiastków śladowych w 1 litrze wody destylowanej stosowano do hodowli Haliscomenobacter hydrossis ATCC 27775 ((instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres: P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA). Należy zauważyć, że roztwór pierwiastków śladowych zawierał 0,1 g ZnSO4 · 7H2O, 0,03 g MnCl2 · 4H2O, 0,3 g H3BO3, 0,2 g CoCl2 · 6H2O, 0,01 g CuCl2 · 2H2O, 0,02 g NiCl2 · 6H2O i 0,03 g Na2MoO4 · H2O). Komórki mikroorganizmu Haliscomenobacter hydrossis ATCC 27775 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), dla których prowadzono hodowlę zarodową na tym podłożu w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin, stosowano na tym samym podłożu, po czym prowadzono główną hodowlę w temperaturze 25°C w ciągu 48 godzin. Wszystkie otrzymane w ten sposób komórki mikroorganizmów zbierano w podłoża agarowego i zawieszano w 0,1 M buforze boranowym (pH 9,0), zawierającym 10 mM EDTA do 100 g/litr jako mokrą masę komórek mikroorganizmów. Do 0,1 mL każdej z zawiesin tych komórek mikroorganizmów 0,1 mL 100 mM buforu boranowego (pH 9,0), zawierającego 10 mM EDTA, 100 mM chlorowodorek estru α,β-dimetylowego kwasu L-asparaginowego i 200 mM L-fenyloalaniny do uzyskania całkowitej ilości 0,2 mL. Następnie, reakcję przeprowadzano w temperaturze 20°C w ciągu 3 godzin, kiedy stosowano mikroorganizmy przedstawione w tablicy 1-1 lub w ciągu 1 godziny, kiedy stosowano mikroorganizmy przedstawione w tablicy 1-2. Ilość (mM) wytworzonego estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego (α-AMP) przedstawiono w tablicach 1-1 i 1-2. Należy zauważyć, że we wszystkich przypadkach gdzie stosowano mikroorganizmy nie wykryto β-AMP.

PL 209 701 B1

T a b l i c a 1-1

Mikroorganizm	α-AMP (mM)
Aeromonas hydrophila ATCC 13136	1,55
Azotobacter vinelandii IFO 3741	0,15
Alcaligenes faecalis FERM P-8460	0,37
Brevibacterium minutiferuna FERM BP-8277	0,10
Corynebacterium flavescens ATCC 10340	0,26
Escherichia coli FERM BP-8276	3,68
Empedobacter brevis ATCC 142 34	6,31
Flavobacterium resinovorum ATCC 14231	0,62
Microbacterium arborescens ATCC 4 34 8	0,08
Propionibacterium shermanii BERM BP-8100	3,41
Brevibacillus parabrevis ATCC 8185	0,08
Paenibacillus alvei IFO 14175	0,09
Pseudomonas fragi IFO 34 58	0,84
Serratia grimesii ATCC 14460	0,47
Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13270	0,18
Sphingobacterium sp. FERM BP-8124	5,97
Streptomyces lavendulae NRRL B-1305	0,89
Xanthomonas maltophilia FERM BP-5568	0,40
Williopsis saturnus IFO 0895	0,05
Candida magnoliae IFO 0705	0,26
Geotrichum amycelium CBS 152.25	0,19
Geotrichum amycelium IFO 0905	0,06
Saccharoinyces unisporus IFO 0724	0,07
Torulaspora delbrueckii IFO 0422	0,04
Pichia ciferrii IFO 0905	0,06

T a b l i c a 1-2

Mikroorganizm	α-AMP (mM)	Mikroorganizm	α-AMP (mM)
1	2	3	4
Cellulophaga lytica NBRC 14961	ślad	Spirosoma linguale DSMZ 74	0,15
Neeksella virosa NBRC 16016	ślad	Flectobacillus major DSMZ 103	0,68
Pedobacter heparinus NBRC 12017	0,07	Tenacibaculum maritimum ATCC 43398	ślad
Persicobacter diffluens NBRC 15940	ślad	Rhodotermus marinus DSMZ 4252	0,06
Flexithrix dorotheae NBRC 15987	2,47	Zobellia galactanivorans DSMZ 12802	0,42
Chitinophaga pinensis NBRC 15968	0,08	Muricauda ruestringensis DSMZ 13258	0,51
Cyclobacterium marinum ATCC 25205	0,91	Salegentibacter salegens DSMZ 5424	ślad
Runella slithyformis ATCC 29530	0,07	Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116	0,02
Thermonema lapsum ATCC 43542	ślad	Cytophaga hutchinsonii NBRC 15051	ślad

PL 209 701 B1 cd tablicy 1-2

1	2	3	4
Psychroserpens burtonensis ATCC 700359	0,09	Marinilabilia salmonicolor NBRC 15948	0,02
Gelidibacter agens ATCC 700364	0,07	Lewinella cohaerens ATCC 23123	0,33
Dyadobacter fermentans ATCC 700827	0,04	Saprospira grandis ATCC 23119	0,03
Flammeovirga aprica NBRC 15941	0,08	Haliscomenobacter hydrossis ATCC 27775	ślad

Odniesienie do przykładu 1

Mikroorganizm, który wytwarza ester β-L-aspartylo-L-fenyloalanino-α-metylowy Mikroorganizmy przedstawione w tablicy 2 hodowano podobnie jak w procedurze dla bakterii z tablicy 1 przykładu 1. Po zakończeniu hodowli, komórki mikroorganizmów oddzielano od tych brzeczek hodowlanych przez wirowanie i zawieszano w 0,1 M buforze boranowym (pH 9,0), zawierającym 10 mM EDTA do 100 g/litr jako mokrą masę komórek mikroorganizmów. Do 0,1 mL każdej z zawiesin tych komórek mikroorganizmów 0,1 mL 100 mM buforu boranowego (pH 9,0), zawierającego 10 mM EDTA, 100 mM chlorowodorek estru α,β-dimetylowego kwasu L-asparaginowego i 200 mM L-fenyloalaniny do uzyskania całkowitej ilości 0,2 ml, a następnie przeprowadzano reakcję w temperaturze 30°C w ciągu 2 godzin.

Ilość (mM) wytworzonego estru β-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego(P-AMP) przedstawiono w tablicy 2. Należy zauważyć, że u żadnego z mikroorganizmów nie wykryto α-AMP.

T a b l i c a 2

Mikroorganizm	β-AMP (mM)
Hafnia alvei ATCC 9760	0,30
Klebsiella pneumoniae ATCC 8308	0,26

P r z y k ł a d 2. Oczyszczanie enzymu z Empedobacter brevis mL podłoża (pH 6,2), zawierającego 5 gramów (g) glukozy, 5 g siarczanu amonowego, 1 g fosforanu monopotasowego, 3 g fosforanu dipotasowego, 0,5 g siarczanu magnezowego, 10 g ekstraktu drożdżowego i 10 g peptonu w 1 litrze (L) przeniesiono do kolby Sakaguchi o pojemności 500 mL i sterylizowano w temperaturze 115°C w ciągu 15 minut. Podłoże to inokulowano następnie 2 mililitrami (ml lub mL) szczepu Empedobacter brevis FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: niezależna korporacja administracyjna, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres instytucji depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002), który hodowano w temperaturze 30°C w ciągu 16 godzin w tym samym podłożu, a następnie przez hodowlę z wytrząsaniem w temperaturze 30°C i przy 120 obrotach/minutę w ciągu 16 godzin.

Następnie, procedurę po rozdziale przez wirowanie przeprowadzano albo na lodzie, albo w temperaturze 4°C. Otrzymaną brzeczkę hodowlaną wirowano w celu zebrania komórek mikroorganizmów. Po przemyciu 16 g komórek mikroorganizmów 50 mM buforem Tris-HCl (pH 8,0), zawieszono je w 40 mililitrach (ml lub mL) tego samego buforu i poddawano procedurze miażdżenia ultradźwiękami w ciągu 45 minut przy 195 watach. Ten płyn uzyskany po miażdżeniu ultradźwiękami następnie wirowano (10000 rpm, 30 minut) i usuwano fragmenty zmiażdżonych komórek i otrzymano płynny supernatant po miażdżeniu ultradźwiękami. Ten płynny supernatant po miażdżeniu ultradźwiękami dializowano przez noc wobec 50 mM buforu Tris-HCl (pH 8,0), a następnie usuwano nierozpuszczalną frakcję przez ultrawirowanie (50000 rpm, 30 minut) w celu otrzymania rozpuszczalnej frakcji w postaci płynnego supernatantu. Otrzymaną rozpuszczalną frakcję nakładano na kolumnę Q-Sepharose HP (produkowaną przez Amersham) wstępnie równoważoną buforem Tris-HCl (pH 8,0) i zbierano aktywną frakcję z frakcji, która nie uległa adsorbcji. Tę aktywną frakcję dializowano przez noc wobec 50 mM buforu octanowego (pH 4,5), a następnie usuwano nierozpuszczalną frakcję przez rodzielanie przez wirowanie (10000 rpm, 30 minut) w celu uzyskania dializowanej frakcji w postaci płynnego supernatantu. Tę dializowaną frakcję nakładano następnie na kolumnę Mono S (produkowaną przez Amersham) wstępnie równoważoną 50 mM buforem octanowym (pH 4,5) w celu elucji enzymu przy liniowym gradiencie stężeń tego samego buforu, zawierającego od 0 do 1 M NaCl. Frakcję, która miała naj30

PL 209 701 B1 mniejszy poziom zanieczyszczeń białkowych spośród frakcji aktywnych nakładano na kolumnę Superdex 200 pg (produkowaną przez Amersham) wstępnie równoważoną 50 mM buforem octanowym (pH 4,5), zawierającym 1 M NaCl, i przeprowadzano filtrację żelową, umożliwiając przepływ przez kolumnę tego samego buforu (pH 4,5), zawierającego 1 M NaCl w celu uzyskania roztworu frakcji aktywnej.

W wyniku przeprowadzania tych procedur, potwierdzono w oparciu o doświadczalne wyniki elektroforezy, że enzym wytwarzający peptyd stosowany w wynalazku był jednolicie oczyszczony. Stopień odzyskania enzymu w wyżej podanym procesie oczyszczania wynosił 12,2%, a stopień oczyszczenia wynosił 707 razy.

P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego z zastosowaniem frakcji enzymu z Empedobacter brevis mikrolitrów (μΓ) frakcji enzymu z Mono S (około 20 U/ml) otrzymanej w przykładzie 2 dodawano do 190 μl buforu boranowego (pH 9,0), zawierającego 105,3 mM chlorowodorku estru α,β-dimetylowego kwasu L-asparaginowego, 210,5 mM L-fenyloalaniny i 10,51 mM EDTA i reakcję przeprowadzano w temperaturze 20°C. Wytwarzanie estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego (α-AMP) przedstawiono w tablicy 3. Należy zauważyć, że potwierdzono prawie całkowity brak tworzenia estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego w szarży, do której nie dodano enzymu.

Dalej, 10 μl frakcji enzymu z Mono S (około 20 U/ml) otrzymanej w przykładzie 2 dodawano do 190 μl buforu boranowego (pH 9,0), zawierającego po 105,3 mM chlorowodorku estru a-metylowego kwasu L-asparaginowego i chlorowodorku estru β-metylowego kwasu L-asparaginowego, 210,5 mM L-fenyloalaniny i 10,51 mM EDTA i reakcję prowadzono w temperaturze 20°C.

W wyniku, nie obserwowano tworzenia się odpowiadających peptydów.

T a b l i c a 3

Czas reakcji (minuty)	Wytworzony a-AMP (mM)
30	23,0
60	42,1
120	61,7

P r z y k ł a d 4. Oczyszczanie enzymu z Sphlngobacterium sp.

Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 (instytucja depozytariusza: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002) hodowano tak samo jak w przykładzie 2, stosując podłoże z przykładu 2. Następnie, procedurę po rozdziale przez wirowanie przeprowadzano albo na lodzie, albo w temperaturze 4°C. Otrzymaną brzeczkę hodowlaną wirowano (10000 rpm, 15 minut) w celu zebrania komórek mikroorganizmów. Po przemyciu 2 g komórek mikroorganizmów 20 mM buforem Tris-HCl (pH 7,6), zawieszano je w 8 ml tego samego buforu i poddawano procedurze miażdżenia ultradźwiękami w ciągu 45 minut przy 195 W. Ten płyn uzyskany po miażdżeniu ultradźwiękami następnie wirowano (10000 rpm, 30 minut) w celu usunięcia fragmentów zmiażdżonych komórek i otrzymania płynnego supernatantu po miażdżeniu ultradźwiękami. Ten płynny supernatant po miażdżeniu ultradźwiękami dializowano przez noc wobec 20 mM buforu Tris-HCl (pH 7,6), a następnie usuwano nierozpuszczalną frakcję przez ultrawirowanie (50000 rpm, 30 minut) w celu otrzymania rozpuszczalnej frakcji w postaci płynnego supernatantu. Otrzymaną rozpuszczalną frakcję nakładano na kolumnę Q-Sepharose HP (produkowaną przez Amersham) wstępnie równoważoną buforem Tris-HCl (pH 7,6) i zbierano aktywną frakcję z frakcji, która nie uległa adsorbcji. Tę aktywną frakcję dializowano przez noc wobec 20 mM buforu octanowego (pH 5,0), a następnie usuwano nierozpuszczalną frakcję rodzielanie przez wirowanie (10000 rpm, 30 minut) w celu uzyskania dializowanej frakcji w postaci płynnego supernatantu. Tę dializowaną frakcję nakładano następnie na kolumnę SP-Sepharose HP (produkowaną przez Amersham) wstępnie równoważoną 20 mM buforem octanowym (pH 5,0) w celu uzyskania aktywnej frakcji, w której enzym eluowano przy liniowym gradiencie stężeń tego samego buforu, zawierającego od 0 do 1 M NaCl.

P r z y k ł a d 5. Wytwarzanie estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego i estru a-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-etylowego z zastosowaniem frakcji enzymu Sphingobacterium sp.

W przypadku wytwarzania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego (a-AMP), 15 l zatężonego roztworu frakcji z SP-Sepharose HP (około 15 U/ml) otrzymanej w przykładzie 4 dodawano

PL 209 701 B1 do 185 μl buforu boranowego (pH 9,0), zawierającego 108,1 mM chlorowodorku estru α,β-dimetylowego kwasu L-asparaginowego, 216,2 mM L-fenyloalaniny oraz 10,8 mM EDTA i reakcję prowadzono w temperaturze 20°C. Podobnie, w przypadku wytwarzania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-etylowego (α-AEP), 10 μl zatężonego roztworu frakcji z SP-Sepharose HP (około 15 U/ml) otrzymanej w przykładzie 4 dodawano do 190 μl buforu boranowego (pH 9,0), zawierającego 52,6 mM chlorowodorku estru α,β-dietylowego kwasu L-asparaginowego, 105,2 mM L-fenyloalaniny oraz 10,8 mM EDTA i reakcję prowadzono w temperaturze 20°C. Przebieg tworzenia AMP lub AEP przedstawiono w tablicy 4. Należy zauważyć, że potwierdzono prawie całkowity brak tworzenia AMP lub AEP w szarży, do której nie dodano enzymu. W przypadku tworzenia AEP, opisano wartości liczbowe otrzymane z zastosowaniem standardowego produktu AMP.

T a b l i c a 4

Czas reakcji (minuty)	Wytworzony α-AMP (mM)	Wytworzony α-AEP (mM)
30	25,8	7,5
60	40,7	13,3
120	56,0	20,6
180	61,8	-

P r z y k ł a d 6. Izolacja genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Empedobacter brevis

Dalej wyjaśniono izolację genu enzymu wytwarzającego peptyd. Empedobacter brevis szczep FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres instytucji depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002) stosowano jako mikroorganizm. W izolacji genu stosowano Escherichia coli JM-109 jako gospodarza, podczas gdy pUC118 stosowano jako wektor.

(1) Wytwarzanie starterów do PCR w oparciu o określoną wewnętrzną sekwencję aminokwasową

Mieszaninę starterów posiadających sekwencje zasad wskazane w, odpowiednio, SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4, utworzono w oparciu o sekwencje aminokwasowe (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 1 i 2) określone zgodnie z metodą degradacji Edmana z produktu trawienia endopeptydazą lizylową enzymu wytwarzającego peptyd, pochodzącego z Empedobacter brevis szczep FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: niezależna korporacja administracyjna, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002).

(2) Uzyskiwanie komórek mikroorganizmów

Empedobacter brevis szczep FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: niezależna korporacja administracyjna, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres instytucji depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002) hodowano w temperaturze 30°C w ciągu 24 godzin na podłożu agarowym CM2G (zawierającym glukozę w stężeniu 50 g/l, ekstrakt drożdżowy w stężeniu 10 g/l, pepton w stężeniu 10 g/l, chlorek sodu w stężeniu 5 g/l i agar w stężeniu 20 g/l, pH 7,0). Jednym oczkiem ezy otrzymanych komórek mikroorganizmu inokulowano kolbę Sakaguchi o pojemności 500 ml, zawierającą 50 ml płynnego podłoża CM2G (wyżej podane podłoże z wyłączeniem agaru), a następnie hodowano z wytrząsaniem w temperaturze 30°C.

(3) Uzyskiwanie chromosomalnego DNA z komórek mikroorganizmów ml brzeczki hodowlanej wirowano (12000 rpm, 4°C, 15 minut) w celu zebranie komórek mikroorganizmów. Następnie, otrzymywano chromosomalny DNA z komórek mikroorganizmów stosując QIAGEN Genomic-Tip System (Qiagen), w oparciu o procedurę opisaną w instrukcji.

(4) Uzyskiwanie fragmentu DNA zawierającego część genu enzymu wytwarzającego peptyd przez PCR

Fragment DNA zawierający część genu wytwarzającego peptyd, pochodzącego z Empedohacter brevis szczep FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: niezależna korporacja administracyjna,

PL 209 701 B1

National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres instytucji depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002) uzyskiwano metodą PCR stosując LA-Taq (produkowany przez Takara Shuzo). Następnie, przeprowadzano reakcję PCR na chromosomalnym DNA uzyskanym z Empedohacter brevis szczep FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: niezależna korporacja administracyjna, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002) stosując startery posiadające sekwencje zasad sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 3 i 4.

Reakcję PCR przeprowadzano stosując Takara PCR Thermal Cycler - PERSONAL (Takara Shuzo) w ciągu 30 cykli w następujących warunkach:

94°C 30 sekund

52°C 1 minuta

72°C 1 minuta

Po zakończeniu reakcji, 3 μl płynu reakcyjnego nakładano na 0,8% agarozowy żel elektroforetyczny. W wyniku, potwierdzono, że fragment DNA o wielkości około 1,5 kilozasad (kb) uległ amplifikacji.

(5) Klonowanie genu wytwarzającego peptyd z bibliteki genów

W celu uzyskania pełnej długości genu enzymu wytwarzającego peptyd, przeprowadzano hybrydyzację Southern z zastosowaniem jako sondy fragmentu DNA zampilifikowanego w PCR. Procedurę hybrydyzacji Southern wyjaśniono w Molecular Cloning, wyd. 2, Cold Spring Harbor Press (1989).

Fragment DNA o wielkości w przybliżeniu 1,5 kb, zamplifikowany w procedurze PCR wyizolowano przez elektroforezę w 0,8% agarozie. Następnie wycinano docelowy prążek i oczyszczano go. Ten fragment DNA znakowano sondą digoksynigenową stosując DIG High Prime (produkowany przez Boehringer-Mannheim), opierając się na procedurze opisanej w instrukcji wykorzystującej DIG High Prime (produkowany przez Boehringer-Mannheim).

Po całkowitym trawieniu chromosomalnego DNA Empedobacter brevis, uzyskanego w etapie (3) przykładu 6, przez poddawanie reakcji w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin z enzymem restrykcyjnym Hindlll, uzyskany produkt poddawano elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym. Chromosomalny DNA po elektroforezie przeniesiono z żelu agarozowego przez blotting na dodatnio naładowany filtr membranowy Nylon (produkowany przez Roche Diagnostics), a następnie poddawano deneturacji alkalicznej, neutralizacji i immobilizacji. Hybrydyzację przeprowadzano stosując EASY HYB (produkowany przez Boehringer-Mannheim). Po wstępnej hybrydyzacji filtra w temperaturze 50°C w ciągu 1 godziny, dodawano sondę wyznakowaną digoksynigenem, przygotowaną jak opisano powyżej, i hybrydyzację prowadzono w temperaturze 50°C w ciągu 16 godzin. Następnie, filtr płukano w ciągu 20 minut w temperaturze pokojowej, stosując 2 x SSC, zawierający 0,1% SDS. Ponadto, filtr dodatkowo płukano dwa razy w temperaturze 65°C w ciągu 15 minut, stosując 0,1 x SSC, zawierający 0,1% SDS.

Wykrywanie prążków, które hybrydyzują z sondą przeprowadza się stosując DIG Nucleotide Detection Kit (produkowany przez Boehringer-Mannheim), w oparciu o opisaną w instrukcji procedurę wykorzystującą DIG Nucleotide Detection Kit (produkowany przez Boehringer-Mannheim). W wyniku tego, można wykryć, że zachodzi hybrydyzacja z sondą prążka o wielkości odpowiadającej w przybliżeniu 4 kb.

Następnie, 5 μg chromosomalnego DNA przygotowanego w etapie (3) przykładu 6 całkowicie trawiono Hindlll. DNA o wielkości w przybliżeniou 4 kb rozdzielano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym, a następnie oczyszczano DNA stosując Gene Clean II Kit (produkowany przez Funakoshi) i rozpuszczano DNA w 10 μl TE. 4 μl tego produktu mieszano następnie z pUC118 Hindlll/BAP (produkowany przez Takara Shuzo) i reakcję ligacji przeprowadzano, stosując DNA Ligation Kit Ver. 2 (produkowany przez Takara Shuzo). 5 μl mieszaniny reakcji ligacji i 100 μl kompetentnych komórek Escherichia coli JM109 (produkowanych przez Toyobo) mieszano w celu transformacji Escherichia coli. Następnie, nakładano to na odpowiednie podłoże stałe w celu stworzenia biblioteki chromosomalnego DNA.

W celu uzyskania całego pełnej długości genu enzymu wytwarzającego peptyd, bibliotekę chromosomalnego DNA przeszukiwano przez hybrydyzację kolonijną z zastosowaniem powyżej wspomnianej sondy. Procedurę hybrydyzacji kolonijnej wyjaśniono w Molecular Cloning, wyd. 2, Cold Spring Harbor Press (1989).

PL 209 701 B1

Kolonie biblioteki chromosomalnego DNA przeniesiono na filtr membranowy Nylon (membrana nylonowa do hybrydyzacji kolonijnej i łysinkowej, produkowany przez Roche Diagnostics), a następnie poddawano deneturacji alkalicznej, neutralizacji i immobilizacji. Hybrydyzację przeprowadzano stosując EASY HYB (produkowany przez Boehringer-Mannheim). Po wstępnej hybrydyzacji filtra w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny, dodawano sondę wyznakowaną digoksynigenem i hybrydyzację prowadzono w temperaturze 50°C w ciągu 16 godzin. Następnie, filtr płukano w ciągu 20 minut w temperaturze pokojowej, stosując 2 x SSC, zawierający 0,1% SDS. Ponadto, filtr dodatkowo płukano dwa razy w temperaturze 65°C w ciągu 15 minut, stosując 0,1 x SSC, zawierający 0,1% SDS.

Wykrywanie kolonii, które hybrydyzują z wyznakowaną sondą przeprowadzano stosując DIG Nucleotide Detection Kit (produkowany przez Boehringer-Mannheim), w oparciu o wyjaśnienia opisane w jego instrukcji dotyczące stosowania DIG Nucleotide Detection Kit (produkowany przez Boehringer-Mannheim). W wyniku, potwierdzono, że szczepy dwóch kolonii hybrydyzują z wyznakowaną sondą.

(6) Sekwencja zasad genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Empedobacter brevis

Wypreparowano plazmidy, które posiadała Escherichia coli JM109, z uprzednio wymienionych dwóch szczepów komórek mikroorganizmów, co do których potwierdzono, że hybrydyzowały z wyznakowaną sondą, wykorzystując Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (produkowany przez Promega) i określono sekwencję zasad części, gdzie występowała hybrydyzacja z sondą i w pobliżu. Reakcję sekwencjonowania przeprowadzano stosując CEQ DTCS-Quick Start Kit (produkowany przez Beckman-Coulter), w oparciu o procedurę opisaną w jego instrukcji. Ponadto przeprowadzano elektroforezę stosując CEQ 2000-XL (produkowany przez Beckman-Coulter).

W wyniku, potwierdzono, że istnieją otwarte ramki odczytu, które kodują białko zawierające wewnętrzne sekwencje aminokwasowe enzymu wytwarzającego peptyd (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 1 i 2), w ten sposób potwierdzając, że otwarta ramka odczytu była genem kodującym enzym wytwarzający peptyd. Sekwencję zasad pełnej długości genów enzymu wytwarzającego peptyd, wraz z odpowiadającymi sekwencjami aminokwasowymi przedstawiono w SEQ ID NO: 5 Listy Sekwencji. W wyniku analizy dotyczącej homologii uzyskanych otwartych ramek odczytu za pomocą programu BLASTP, odkryto homologię pomiędzy dwoma enzymami; wykazano homologię 34% wykazaną na poziomie sekwencji aminokwasowej z hydrolazą estru α-aminokwasu z Acetobacter pasteurianus (patrz Appl. Environ. Microbiol., 68 (1), 211-218 (2002) i homologię 26% wykazaną na poziomie sekwencji aminokwasowej acylazą glutarylo-7ACA z Brevibacillus laterosporum (patrz J. Bacteriol., 173 (24), 7848-7855 (1991).

(7) Ekspresja genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Empedobacter brevis w Escherichia coli

Zamplifikowano region genu docelowego na regionie promotora operonu trp na chromosomalnym DNA Escherichia coli W3110 przez przeprowadzenie PCR, z zastosowaniem jako starterów oligonukleotydów wskazanych w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 7 i 8 i otrzymane fragmenty DNA zligowano z wektorem pGEM-Teasy (produkowanych przez Promega). Następnie E. coli JM109 stransformowano tym roztworem ligacyjnym i spośród szczepów opornych na ampicylinę wyselekcjonowano te szczepy posiadające plazmid docelowy, w których kierunek wstawionego promotora trp jest przeciwny do orientacji z promotora lac. Następnie, fragment DNA zawierający promotor trp, otrzymany przez traktowanie tego plazmidu Eco0109l/EcoRI zligowano z produktem trawienia Eco0109I/EcoRI pUG19 (produkowanego przez Takara). Następnie, Escherichia coli JM109 transformowano tym roztworem ligacyjnym i spośród szczepów opornych na ampicylinę selekcjonowano szczepy posiadające plazmid docelowy. Następnie, fragment DNA otrzymany przez traktowanie tego plazmidu Hindlll/PvuII zligowano z fragmentem DNA, zawierającym terminator rrnB otrzymany przez traktowanie pKK223-3 (produkowanego przez Amersham Pharmacia) Hindlll/HincII. E. coli Jiyil09 transformowano następnie tym roztworem ligacyjnym, spośród szczepów opornych na ampicylinę selekcjonowano szczepy posiadające plazmid docelowy i plazmid oznaczono jako pTrpT.

Docelowy gen zamplifikowano przez PCR, stosując chromosomalny DNA Empedobacter brevis szczep FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: niezależna korporacja administracyjna, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002) jako matrycę i oligonukleotydy wskazane w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 9 i 10, jako startery. Ten fragment DNA traktowano następnie Ndel/Pstl i otrzymany fragment DNA zligowano z produktem traktowania Ndel/Pstl pTrpT. Escherichia coli JM109

PL 209 701 B1 transformowano następnie tym roztworem ligacyjnym, spośród szczepów opornych na ampicylinę selekcjonowano szczepy posiadające plazmid docelowy i plazmid oznaczono jako pTrpT_Gtg2.

Prowadzono hodowlę zarodową Escherichia coli JM109 zawierającej pTrpT_Gtg2 w temperaturze 30°C w ciągu 24 godzin w podłożu LB, zawierającym 100 mg/l ampicyliny. 1 ml otrzymanej brzeczki hodowlanej szczepiono kolbę Sakaguchi o pojemności 500 ml, zawierającą 50 ml podłoża (D glukoza w stężeniu 2 g/l, ekstrakt drożdżowy w stężeniu 10 g/l, hydrolizat kazeiny w stężeniu 10 g/l, siarczan amonowy w stężeniu 5 g/l, diwodorofosforan potasowy w stężeniu 3 g/l, wodorofosforan dipotasowy w stężeniu 1 g/l, heptawodzian siarczanu magnezowego w stężeniu 0,5 g/l i ampicylina w stężeniu 100 mg/l), a następnie hodowano w temperaturze 25°C w ciągu 24 godzin. Brzeczka hodowlana wykazywała aktywność tworzenia estru α-L-aspartylo-fenyloalanino-e-metylowego wynoszącą 0,11 U na 1 ml brzeczki hodowlanej i potwierdzono, że sklonowany gen ulegał ekspresji w E. coli. Ponadto, nie wykryto żadnej aktywności dla transformantów, do których wprowadzono tylko pTrpT, jako kontrolę.

Przewidywanie sekwencji sygnałowej

Kiedy analizowano sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 6, opisaną w Liście Sekwencji, za pomocą programu Signal P v 1.1 (patrz Protein Engineering, tom 12, numer 1, strona 3-9, 1999), przewidziano, że aminokwasy o numerach od 1 do 22 działają jako sekwencja sygnałowa, która ulega sekrecji do periplazmy, podczas gdy gdy ocenia się, że dojrzałe białko znajduje się za aminokwasem numer 23.

Potwierdzenie sekrecji

Prowadzono hodowlę zarodową Escherichia coli JM109, posiadającej pTrpT_Gtg2, w temperaturze 30°C w ciągu 24 godzin w podłożu LB, zawierającym 100 mg/l ampicyliny. 1 ml otrzymanej brzeczki hodowlanej szczepiono kolbę Sakaguchi o pojemności 500 ml, zawierającą 50 ml podłoża (glukoza w stężeniu 2 g/l, ekstrakt drożdżowy w stężeniu 10 g/l, hydrolizat kazeiny w stężeniu 10 g/l, siarczan amonowy w stężeniu 5 g/l, diwodorofosforan potasowy w stężeniu 3 g/l, wodorofosforan dipotasowy w stężeniu 1 g/l, heptawodzian siarczanu magnezowego w stężeniu 0,5 g/l i ampicylina w stężeniu 100 mg/l), a następnie prowadzono hodowlę ostateczną w temperaturze 25°C w ciągu 24 godzin w celu otrzymania wyhodowanych komórek mikroorganizmów.

Wyhodowane komórki mikroorganizmów rozdzielano na frakcje periplazmatyczną i cytoplazmatyczną metodą szoku ciśnienia osmotycznego, stosując roztwór sacharozy w stężeniu 20 gram/decylitr (g/dl). Komórki mikroorganizmów zanurzane w roztworze sacharozy o stężeniu 20 g/dl, zanurzano w wodnym roztworze MgSO4 o stężeniu 5 mM. Odwirowany supernatant nazwano frakcją periplazmatyczną („Pe”). Ponadto, odwirowany osad ponownie zawieszano i poddawano miażdżeniu ultradźwiękami. Uzyskany produkt nazwano frakcją cytoplazmatyczną („Cy”). Aktywność dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, co do której wiadomo, że występuje w cytoplazmie, stosowano jako wskaźnik do weryfikacji, czy oddzielono cytplazmę. Pomiar ten przeprowadzano przez dodawanie odpowiedniej ilości enzymu do roztworu reakcyjnego, w temperaturze 30°C, zawierającego 1 mM glukozo-6-fosforanu, 0,4 mM NADP, 10 mM MgSO4 oraz 50 mM Tris-Cl (pH 8), a następnie pomiar absorbancji przy 340 nm w celu zmierzenia wytwarzania NADPH.

Ilości enzymów frakcji periplazmatycznej i frakcji cytoplazmatycznej, gdy wartość aktywności oddzielnie przygotowanych ekstraktów wolnokomórkowych ustalono na 100%, przedstawiono na fig. 1. To, że aktywność dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej nie miesza się do frakcji periplazmatycznej, wskazuje, że frakcja periplazmatyczna nie miesza się z frakcją cytoplazmatyczną. Około powstałej aktywności estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-e-metylowego (α-AMP) stwierdzono we frakcji periplazmatycznej i potwierdzono, że enzym tworzący Ala-Gln ulega sekrecji do periplazmy, jak przewidywano na podstawie sekwencji aminokwasowej z wykorzystaniem programu Signal P v 1.1.

P r z y k ł a d 7. Izolacja genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Sphingobacterium sp.

Dalej, w opisie opisuje się izolację genu enzymu wytwarzającego peptyd. Stosowanym mikroorganizmem był Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 (instytucja depozytariusza: niezależna korporacja administracyjna, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres instytucji depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002). Dla izolacji genu Escherichia coli DH5α stosowano jako gospodarza, pUCllS wstosowano jako wektor.

PL 209 701 B1 (1) Uzyskiwanie komórek mikroorganizmów

Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 (instytucja depozytariusza: niezależna korporacja administracyjna, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002) hodowano w ciągu 24 godzin w temperaturze 25°C na podłożu agarowym CM2G (zawierającym glukozę w stężeniu 50 g/l, ekstrakt drożdżowy w stężeniu 10 g/l, pepton w stężeniu 10 g/l, chlorek sodu w stężeniu 5 g/l i agar w stężeniu 20 g/l, pH 7,0). Jednym oczkiem ezy otrzymanych komórek mikroorganizmu inokulowano kolbę Sakaguchi o pojemności 500 ml, zawierającą 50 ml płynnego podłoża CM2G (wyżej podane podłoże z wyłączeniem agaru), a następnie hodowano z wytrząsaniem w temperaturze 25°C.

(2) Uzyskiwanie chromosomalnego DNA z komórek mikroorganizmów ml brzeczki hodowlanej wirowano (12000 rpm, 4°C, 15 minut) w celu zebranie komórek mikroorganizmów. Następnie, otrzymywano chromosomalny DNA z komórek mikroorganizmów stosując QIAGEN Genomic-Tip System (Qiagen), w oparciu o procedurę opisaną w instrukcji.

(3) Uzyskiwanie fragmentu DNA sondy PCR

Fragment DNA zawierający część genu wytwarzającego peptyd, pochodzącego z Empedobacter brevis szczep FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: niezależna korporacja administracyjna, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Ghuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002) uzyskiwano metodą PCR stosując LA-Taq (produkowany przez Takara Shuzo). Następnie, przeprowadzano reakcję PCR na chromosomalnym DNA uzyskanym z Empedobacter brevis szczep FERM BP-8113 (instytucja depozytariusza: niezależna korporacja administracyjna, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Ghuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego transferu depozytu: 8 lipca 2002), stosując startery posiadające sekwencje zasad sekwencji SEQ ID NO: 3 i 4.

94°C 30 sekund

52°C 1 minuta

72°C 1 minuta

Po zakończeniu reakcji, 3 μl płynu reakcyjnego nakładano na 0,8% agarozowy żel elektroforetyczny. W wyniku potwierdzono, że fragment DNA o wielkości około 1,5 kb uległ amplifikacji.

(4) Klonowanie genu wytwarzającego peptyd z biblioteki genów

W celu uzyskania pełnej długości genu enzymu wytwarzającego peptyd, przeprowadzano hybrydyzację Southern z zastosowaniem jako sondy fragmentu DNA zamplifikowanego w powyżej opisanej procedurze PCR. Proceduę hybrydyzacji Southern wyjaśniono w Molecular Cloning, wyd. 2, Cold Spring Harbor Press (1989).

Fragment DNA o wielkości w przybliżeniu 1,5 kb, zamplifikowany w procedurze PCR wyizolowano przez elektroforezę w 0,8% agarozie. Następnie, wycinano docelowy prążek i oczyszczano go. Ten fragment DNA znakowano sondą digoksynigenową stosując DIG High Prime (produkowany przez Boehringer-Mannheim), opierając się na procedurze opisanej w dołączonej instrukcji.

Po umożliwieniu reakcji chromosomalnego DNA Sphingobacterium sp., uzyskanego w etapie (2) przykładu 7, z enzymem restrykcyjnym SacI w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin w celu całkowitego strawienia DNA, uzyskany produkt poddawano elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym. Chromosomalny DNA po elektroforezie przeniesiono z żelu agarozowego przez blotting na dodatnio naładowany filtr membranowy Nylon (produkowany przez Roche Diagnostics), a następnie poddawano deneturacji alkalicznej, neutralizacji i immobilizacji. Hybrydyzację przeprowadzano stosując EASY HYB (produkowany przez Boehringer-Mannheim). Po wstępnej hybrydyzacji filtra w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny, dodawano sondę wyznakowaną digoksynigenem, przygotowaną jak opisano powyżej, i hybrydyzację prowadzono w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. Następnie, filtr płukano dwa razy w temperaturze 60°C, stosując 1 x SSC, zawierający 0,1% SDS.

Wykrywanie prążków, które hybrydyzują z sondą przeprowadza się stosując DIG Nucleotide Detection Kit (produkowany przez Boehringer-Mannheim), w oparciu o opisaną w instrukcji procedurę.

PL 209 701 B1

W wyniku, można z powodzeniem w wykryć, że zachodzi hybrydyzacja z sondą prążka o wielkości odpowiadającej w przybliżeniu 3 kb.

μg chromosomalnego DNA przygotowanego w etapie (2) przykładu 7 całkowicie trawiono Sacl. DNA o wielkości w przybliżeniou 3 kb rozdzielano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym, a następnie oczyszczano DNA stosując Gene Clean II Kit (produkowany przez Funakoshi) i rozpuszczano DNA w 10 μl TE. Mieszano 4 μl otrzymanego roztworu i pUC118, traktowanego fosfatazą alkaliczną (E. coli C75) w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut i w temperaturze 50°C w ciągu 30 minut, po reakcji z SacI w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin do całkowitego strawienia, i reakcję ligacji przeprowadzano, stosując DNA Ligation Kit Ver. 2 (produkowany przez Takara Shuzo). 5 μl płynnego produktu reakcji ligacji i 100 μl kompetentnych komórek Escherichia coli DH5α (produkowanych przez Takara Shuzo) mieszano w celu transformacji Escherichia coli. Następnie nakładano to na odpowiednie podłoże stałe w celu stworzenia biblioteki chromosomalnego DNA.

Kolonie biblioteki chromosomalnego DNA przeniesiono na filtr membranowy Nylon (membrana nylonowa do hybrydyzacji kolonijnej i łysinkowej, produkowany przez Roche Diagnostics), a następnie poddawano deneturacji alkalicznej, neutralizacji i immobilizacji. Hybrydyzację przeprowadzano stosując EASY HYB (produkowany przez Boehringer-Mannheim).

Po wstępnej hybrydyzacji filtra w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny, dodawano uprzednio wspomnianą sondę wyznakowaną digoksynigenem i hybrydyzację prowadzono w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. Następnie, filtr płukano dwa razy w temperaturze 60°C, stosując 1 x SSC, zawierający 0,1% SDS.

Wykrywanie kolonii, które hybrydyzują z wyznakowaną sondą przeprowadzano stosując DIG Nucleotide Detection Kit (produkowany przez Boehringer-Mannheim), w oparciu o wyjaśnienia opisane w jego instrukcji. W wyniku, potwierdzono, że sześć szczepów kolonii hybrydyzowało z wyznakowaną sondą.

(5) Sekwencja zasad genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Sphingobacterium sp.

Wypreparowano plazmidy, które posiadała Escherichia coli DH5α, z sześciu szczepów komórek mikroorganizmów, co do których potwierdzono, że hybrydyzowały z wyznakowaną sondą, wykorzystując Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (produkowany przez Promega) w celu określenia sekwencji zasad części, gdzie występowała hybrydyzacja z sondą i w pobliżu. Reakcję sekwencjonowania przeprowadzano stosując CEQ DTCS-Quick Start Kit (produkowany przez Beckman-Coulter), w oparciu o procedurę opisaną w jego instrukcji. Ponadto przeprowadzano elektroforezę stosując CEQ 2000-XL (produkowany przez Beckman-Coulter).

W wyniku dowiedziono, że istnieją otwarte ramki odczytu, które kodują enzym wytwarzający peptyd. Sekwencję zasad pełnej długości genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Sphingobacterium sp., wraz z odpowiadającymi sekwencjami aminokwasowymi przedstawiono w SEQ ID NO: 11. Enzym wytwarzający peptyd pochodzący z Sphingobacterium sp. wykazywał homologię 63,5% na poziomie sekwencji aminokwasowej z enzymem wytwarzającym peptyd pochodzącym z Empedobacter brevis (jak określono stosując program BLASTP).

(6) Ekspresja genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Sphingobacterium sp. w Escherichia coli

Zamplifikowano region genu docelowego przez PCR z zastosowaniem chromosomalnego DNA Sphingobacterium sp. FERM BP-8124 (instytucja depozytariusza: niezależna korporacja administracyjna, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adres: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, data międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002) jako matrycy i oligonukleotydów przedstawionych w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 13 i 14, jako starterów.

Ten fragment DNA traktowano Ndel/Xbal i uzyskany fragment DNA oraz produkt traktowania Ndel/Xbal pTrpT zligowano. Escherichia coli JM109 transformowano następnie tym roztworem ligacyjnym, i szczepy posiadające plazmid docelowy selekcjonowano spośród szczepów opornych na ampicylinę. Plazmid oznaczono jako pTrpT_Sm_aet. Escherichia coli JM109, posiadającą pTrpT_Sm_aet, hodowano w temperaturze 25°C w ciągu 20 godzin przez inokulację jednym oczkiem ezy zwykłych

PL 209 701 B1 probówek testowych, zwierających 3 ml podłoża (glukoza w stężeniu 2 g/l, ekstrakt drożdżowy w stężeniu 10 g/l, hydrolizat kazeiny w stężeniu 10 g/l, siarczan amonowy w stężeniu 5 g/l, diwodorofosforan potasowy w stężeniu 3 g/l, wodorofosforan dipotasowy w stężeniu 1 g/l, heptawodzian siarczanu magnezowego w stężeniu 0,5 g/l i ampicylina w stężeniu 100 mg/l). Potwierdzono, że sklonowany gen wykazujący aktywność wytwarzania α-AMP na poziomie 0,53 U na ml brzeczki hodowlanej ulegał ekspresji w Escherichia coli. Ponadto, nie wykryto żadnej aktywności dla transformantów, do których wprowadzono tylko pTrpT, jako kontrolę.

Przewidywanie sekwencji sygnałowej

Kiedy analizowano sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 12, opisaną w Liście Sekwencji, za pomocą programu Signal P v 1.1 (Protein Engineering, tom 12, numer 1, strona 3-9, 1999), przewidziano, że aminokwasy o numerach od 1 do 20 działają jako sekwencja sygnałowa, która ulega sekrecji do periplazmy, podczas gdy gdy ocenia się, że dojrzałe białko znajduje się za aminokwasem numer 21.

Potwierdzenie sekwencji sygnałowej

Jednym oczkiem ezy Escherichia coli JM109, zawierającej pTrpT_Sm_aet, zainokulowano zwykłe probówki testowe, zawierającej 50 ml podłoża (glukoza w stężeniu 2 g/l, ekstrakt drożdżowy w stężeniu 10 g/l, hydrolizat kazeiny w stężeniu 10 g/l, siarczan amonowy w stężeniu 5 g/l, diwodorofosforan potasowy w stężeniu 3 g/l, wodorofosforan dipotasowy w stężeniu 1 g/l, heptawodzian siarczanu magnezowego w stężeniu 0,5 g/l i ampicylina w stężeniu 100 mg/l) i prowadzono główną hodowlę w temperaturze 25°C w ciągu 20 godzin.

Dalej, w opisie procedury po rozdziale przez wirowanie przeprowadzano albo w lodzie, albo w temperaturze 4°C. Po zakończeniu hodowli, komórki mikroorganizmów oddzielano od brzeczki hodowlanej przez wirowanie, płukano 100 mM buforem fosforanowym (pH 7), a następnie zawieszano w tym samym buforze. Komórki mikroorganizmów poddawano następnie miażdżeniu ultradźwiękami w ciągu 20 minutes przy 195 W, płyn po miażdżeniu ultradźwiękami wirowano (12000 rpm, 30 minut) w celu usunięcia fragmentów zmiażdżonych komórek i otrzymania rozpuszczalnej frakcji. Otrzymaną rozpuszczalną frakcję nakładano na kolumnę CHT-II (produkowaną przez Biorad) wstępnie równoważoną 100 mM buforem fosforanowym (pH 7) i enzym eluowano przy liniowym gradiencie stężeń, stosując 500 mM bufor fosforanowy.

Roztwór otrzymany przez mieszanie frakcji aktywnej z 5-krotnymi objętościami 2 M siarczanu amonowego i 100 mM buforu fosforanowego nakładano na kolumnę Resource-PHE (produkowaną przez Amersham) wstępnie równoważoną 2 M siarczanem amonowym i 100 mM buforem fosforanowym, i enzym eluowano przy liniowym gradiencie stężeń, stosując od 2 do 0 M siarczan amonowy w celu uzyskania roztworu aktywnej frakcji. W wyniku tych procedur potwierdzono, że enzym wytwarzający peptyd został jednolicie elektroferotycznie oczyszczony.

Kiedy określano sekwencję aminokwasową uprzednio wspomnianego enzymu wytwarzającego peptyd stosując metodę degradacji Edmana, uzyskano sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 15 i potwierdzono, że dojrzałe białko znajduje się za aminokwasem numer 21, jak przewidywano stosując program Signal P v 1.1.

P r z y k ł a d 8. Izolacja genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Pedobacter heparinus IFO 12017

Dalej, w opisie opisuje się izolację genu enzymu wytwarzającego peptyd. Stosowanym mikroorganizmem jest Pedobacter heparinus IFO 12017 (instytucja depozytariusza; the Institute of Fermentation, Osaka, adres instytucji depozytariusza; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japonia). Dla izolacji genu, Escherichia coli JM109, stosowano jako gospodarza, a pUC118 stosowano jako wektor.

(1) Uzyskiwanie komórek mikroorganizmów

Pedobacter heparinus IFO 12017 (instytucja depozytariusza: The Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japonia) hodowano w ciągu 24 godzin w temperaturze 25°C na podłożu agarowym CM2G (zawierającym glukozę w stężeniu 50 g/l, ekstrakt drożdżowy w stężeniu 10 g/l, pepton w stężeniu 10 g/l, chlorek sodu w stężeniu 5 g/l i agar w stężeniu 20 g/l, pH 7,0). Jednym oczkiem ezy otrzymanych komórek mikroorganizmu inokulowano kolbę Sakaguchi o pojemności 500 ml, zawierającą 50 ml płynnego podłoża CM2G (wyżej podane podłoże z wyłączeniem agaru), a następnie hodowano z wytrząsaniem w temperaturze 25°C.

PL 209 701 B1 (2) Uzyskiwanie chromosomalnego DNA z komórek mikroorganizmów ml brzeczki hodowlanej wirowano (12000 rpm, 4°C, 15 minut) w celu zebranie komórek mikroorganizmów. Następnie, otrzymywano chromosomalny DNA z komórek mikroorganizmów stosując QIAGEN Genomic-Tip System (Qiagen), w oparciu o procedurę opisaną w instrukcji.

(3) Uzyskiwanie fragmentu DNA sondy PCR

Fragment DNA zawierający część genu wytwarzającego peptyd, pochodzącego z Pedobacter heparinus IFO 12017 (instytucja depozytariusza: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanboncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japonia) uzyskiwano metodą PCR stosując LA-Taq (produkowany przez Takara Shuzo). Następnie, przeprowadzano reakcję PCR na chromosomalnym DNA uzyskanym z Pedobacter heparinus IFO 12017 (instytucja depozytariusza: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japonia) stosując startery posiadające sekwencję zasad sekwencji o SEQ ID NO: 15 i 16. Zamplifikowany przez procedurę PCR fragment DNA o wielkości w przybliżeniu 1 kb DNA wyizolowano przez elektroforezę w 0,8% agarozie. Następnie, wycięto docelowy prążek i oczyszczano. Fragment DNA wyznakowano sondą digoksynigenową, stosując DIG High Prime (manufactured by Boehringer-Mannheim), w oparciu o procedurę opisaną w jego instrukcji.

(4) Klonowanie genu wytwarzającego peptyd z biblioteki genów

W celu uzyskania pełnej długości genu enzymu wytwarzającego peptyd, przeprowadzano hybrydyzację Southern z zastosowaniem jako sondy fragmentu DNA zamplifikowanego w powyżej opisanej procedurze PCR. Proceduę hybrydyzacji Southern wyjaśniono w Molecular Gloning, wyd. 2, Cold Spring Harbor Press (1989).

Po umożliwieniu reakcji chromosomalnego DNA Pedobacter heparinus IFO 12017 (instytucja depozytariusza: The Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osakashi, Japonia), z enzymem restrykcyjnym Hindlll w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin w celu całkowitego strawienia DNA, uzyskany produkt poddawano elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym. Chromosomalny DNA po elektroforezie przeniesiono z żelu agarozowego przez blotting na dodatnio naładowany filtr membranowy Nylon (produkowany przez Roche Diagnostics), a następnie poddawano deneturacji alkalicznej, neutralizacji i immobilizacji. Hybrydyzację przeprowadzano stosując EASY HYB (produkowany przez Boehringer-Mannheim). Po wstępnej hybrydyzacji filtra w temperaturze 50°C w ciągu 1 godziny, dodawano sondę wyznakowaną digoksynigenem, przygotowaną jak opisano powyżej i hybrydyzację prowadzono w temperaturze 50°C w ciągu 16 godzin. Następnie, filtr płukano dwa razy w temperaturze 60°C, stosując 1 x SSC, zawierający 0,1% SDS.

Wykrywanie prążków, które hybrydyzują z sondą przeprowadza się stosując DIG Nucleotide Detection Kit (produkowany przez Boehringer-Mannheim), w oparciu o opisaną w instrukcji procedurę. W wyniku, można z powodzeniem w wykryć, że zachodzi hybrydyzacja z sondą prążka o wielkości odpowiadającej w przybliżeniu 5 kb.

μg chromosomalnego DNA Pedobacter heparinus IFO 12017 całkowicie trawiono Hindlll. DNA o wielkości w przybliżeniou 5 kb rozdzielano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym, a następnie oczyszczano DNA stosując Gene Clean II Kit (produkowany przez Funakoshi) i rozpuszczano DNA w 10 μl TE. Mieszano 4 μl otrzymanego roztworu i pUC118 Hindlll/BAP i reakcję ligacji przeprowadzano, stosując DNA Ligation Kit Ver. 2 (produkowany przez Takara Shuzo). 5 μl płynnego produktu reakcji ligacji i 100 μl kompetentnych komórek Escherichia coli JM109 (produkowanych przez Takara Shuzo) mieszano w celu transformacji Escherichia coli. Następnie, nakładano to na odpowiednie podłoże stałe w celu stworzenia biblioteki chromosomalnego DNA.

Kolonie biblioteki chromosomalnego DNA przeniesiono na filtr membranowy Nylon (membrana nylonowa do hybrydyzacji kolonijnej i łysinkowej, produkowana przez Roche Diagnostics), a następnie poddawano deneturacji alkalicznej, neutralizacji i immobilizacji. Hybrydyzację przeprowadzano stosując EASY HYB (produkowany przez Boehringer-Mannheim). Po wstępnej hybrydyzacji filtra w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny, dodawano uprzednio wspomnianą sondę wyznakowaną digoksynigenem i hybrydyzację prowadzono w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. Następnie, filtr płukano dwa razy w temperaturze 60°C, stosując 1 x SSC, zawierający 0,1% SDS.

Wykrywanie kolonii, które hybrydyzują z wyznakowaną sondą przeprowadzano stosując DIG Nucleotide Detection Kit (produkowany przez Boehringer-Mannheim), w oparciu o wyjaśnienia opisaPL 209 701 B1 ne w jego instrukcji. W wyniku, zaobserwowano jeden szczep, którego kolonia hybrydyzowała z wyznakowaną sondą.

(5) Sekwencja zasad genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Pedobacter heparinus IFO 12017

Wypreparowano plazmidy, które posiadała Escherichia coli JM109, ze szczepu, co do którego potwierdzono, że hybrydyzował z wyznakowaną sondą i określoną sekwencję zasad części, gdzie występowała hybrydyzacja z sondą i w pobliżu. Reakcję sekwencjonowania przeprowadzano stosując CEQ DTCS-Quick Start Kit (produkowany przez Beckman-Coulter), w oparciu o procedurę opisaną w jego instrukcji. Ponadto przeprowadzano elektroforezę stosując CEQ 2000-XL (produkowany przez Beckman-Coulter).

W wyniku dowiedziono, że istnieje otwarta ramka odczytu, która koduje enzym wytwarzający peptyd. Sekwencję zasad pełnej długości genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Pedobacter heparinus IFO 12017 (instytucja depozytariusza: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japonia), wraz z odpowiadającymi sekwencjami aminokwasowymi przedstawiono w SEQ ID NO: 17.

P r z y k ł a d 9. Ekspresja genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Pedobacter heparinus IFO 12017 w Escherichia coli

Zamplifikowano region genu docelowego przez PCK z zastosowaniem chromosomalnego DNA Pedobacter heparinus IFO 12017 (instytucja depozytariusza: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japonia) jako matrycy i oligonukleotydów przedstawionych w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 19 i 20, jako starterów. Ten fragment DNA traktowano Ndel/Hindlll i zligowano uzyskany fragment DNA oraz produkt traktowania Ndel/Hindlll pTrpT. Escherichia coli JM109 transformowano następnie tym roztworem ligacyjnym, i szczepy posiadające plazmid docelowy selekcjonowano spośród szczepów opornych na ampicylinę. Plazmid oznaczono jako pTrpT_Ph_aet.

Jednym oczkiem ezy Escherichia coli JM109, posiadającej pTrpT_Ph_aet, zainokulowano zwykłe probówki testowe, zawierające 3 ml podłoża (glukoza w stężeniu 2 g/l, ekstrakt drożdżowy w stężeniu 10 g/l, hydrolizat kazeiny w stężeniu 10 g/l, siarczan amonowy w stężeniu 5 g/l, diwodorofosforan potasowy w stężeniu 3 g/l, wodorofosforan dipotasowy w stężeniu 1 g/l, heptawodzian siarczanu magnezowego w stężeniu 0,5 g/l i ampicylina w stężeniu 100 mg/l) i główną hodowlę prowadzono w temperaturze 25°C w ciągu 20 godzin. Potwierdzono, że brzeczka hodowlana wykazywała aktywność wytwarzania α-AMP na poziomie 0,01 U na ml brzeczki hodowlanej tak, że potwierdzono, iż sklonowany gen ulegał ekspresji w Escherichia coli. Ponadto, nie wykryto żadnej aktywności dla transformantów, do których wprowadzono tylko pTrpT, jako kontrolę.

P r z y k ł a d 10. Izolacja genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116

Dalej, w opisie opisuje się izolację genu enzymu wytwarzającego peptyd. Stosowanym mikroorganizmem jest Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures); adres instutucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy). Dla izolacji genu, Escherichia coli JM109 stosowano jako gospodarza, a pUC118 stosowano jako wektor.

(1) Uzyskiwanie komórek mikroorganizmów

Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy) hodowano w ciągu 24 godzin w temperaturze 25°C na podłożu agarowym CM2G (zawierającym glukozę w stężeniu 50 g/l, ekstrakt drożdżowy w stężeniu 10 g/l, pepton w stężeniu 10 g/l, chlorek sodu w stężeniu 5 g/l i agar w stężeniu 20 g/l, pH 7,0). Jednym oczkiem ezy otrzymanych komórek mikroorganizmu inokulowano kolbę Sakaguchi o pojemności 500 ml, zawierającą 50 ml płynnego podłoża CM2G (wyżej podane podłoże z wyłączeniem agaru), a następnie hodowano z wytrząsaniem w temperaturze 25°C.

(2) Uzyskiwanie chromosomalnego DNA z komórek mikroorganizmów ml brzeczki hodowlanej wirowano (12 000 rpm, 4°C, 15 minut) w celu zebranie komórek mikroorganizmów. Następnie, otrzymywano chromosomalny DNA z komórek mikroorganizmów stosując QIAGEN Genomic-Tip System (Qiagen), w oparciu o procedurę opisaną w instrukcji.

PL 209 701 B1 (3) Uzyskiwanie fragmentu DNA sondy PCR

Fragment DNA zawierający część genu wytwarzającego peptyd, pochodzącego z Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instutucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy) uzyskiwano metodą PCR stosując LA-Taq (produkowany przez Takara Shuzo). Następnie, przeprowadzano reakcję PCR na chromosomalnym DNA uzyskanym z Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres: Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy) stosując startery posiadające sekwencję zasad SEQ ID NO: 21 i 16. Zamplifikowany przez procedurę PCR fragment DNA o wielkości w przybliżeniu 1 kb DNA wyizolowano przez elektroforezę w 0,8% agarozie. Następnie wycięto docelowy prążek i oczyszczano. Fragment DNA wyznakowano sondą digoksynigenową, stosując DIG High Prime (manufactured by Boehringer-Mannheim), w oparciu o procedurę opisaną w jego instrukcji.

(4) Klonowanie genu wytwarzającego peptyd z bibliteki genów

Po umożliwieniu reakcji chromosomalnego DNA Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres Instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy), z enzymem restrykcyjnym Pstl w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin w celu całkowitego strawienia DNA, uzyskany produkt poddawano elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym. Chromosomalny DNA po elektroforezie przeniesiono z żelu agarozowego przez blotting na dodatnio naładowany filtr membranowy Nylon (produkowany przez Roche Diagnostics), a następnie poddawano deneturacji alkalicznej, neutralizacji i immobilizacji. Hybrydyzację przeprowadzano stosując EASY HYB (produkowany przez Boehringer-Mannheim). Po wstępnej hybrydyzacji filtra w temperaturze 50°C w ciągu 1 godziny, dodawano sondę wyznakowaną digoksynigenem, przygotowaną jak opisano powyżej, i hybrydyzację prowadzono w temperaturze 50°C w ciągu 16 godzin. Następnie, filtr płukano dwa razy w temperaturze 60°C, stosując 1 x SSC, zawierający 0,1% SDS.

Wykrywanie prążków, które hybrydyzują z sondą przeprowadza się stosując DIG Nucleotide Detection Kit (produkowany przez Boehringer-Mannheim), w oparciu o opisaną w instrukcji procedurę. W wyniku, wykryto, że zachodzi hybrydyzacja z sondą prążka o wielkości odpowiadającej w przybliżeniu 5 kb.

μg chromosomalnego DNA Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (instytucja depozytariusza; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microbes and Cell Cultures, adres instytucji depozytariusza; Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Niemcy) całkowicie trawiono Pstl. DNA o wielkości w przybliżeniou 5 kb rozdzielano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym, a następnie oczyszczano DNA stosując Gene Clean II Kit (produkowany przez Funakoshi) i rozpuszczano DNA w 10 μl TE. Mieszano 4 μl otrzymanego roztworu i pUCllS Pstl/BAP (produkowanego przez Takara Shuzo) i reakcję ligacji przeprowadzano, stosując DNA Ligation Kit Ver. 2 (produkowany przez Takara Shuzo). 5 μl płynnego produktu reakcji ligacji i 100 μl kompetentnych komórek Escherichia coli JM109 (produkowanych przez Takara Shuzo) mieszano w celu transformacji Escherichia coli. Następnie, nakładano to na odpowiednie podłoże stałe w celu stworzenia biblioteki chromosomalnego DNA.

Kolonie biblioteki chromosomalnego DNA przeniesiono na filtr membranowy Nylon (membrana nylonowa do hybrydyzacji kolonijnej i łysinkowej, produkowany przez Roche Diagnostics), a następnie poddawano deneturacji alkalicznej, neutralizacji i immobilizacji. Hybrydyzację przeprowadzano stosując EASY HYB (produkowany przez Boehringer-Mannheim). Po wstępnej hybrydyzacji filtra w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny, dodawano uprzednio wspomnianą sondę wyznakowaną digoksynigenem i hybrydyzację prowadzono w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. Następnie, filtr płukano dwa razy w temperaturze 60°C, stosując 1 x SSC, zawierający 0,1% SDS.

PL 209 701 B1

Wykrywanie kolonii, które hybrydyzują z wyznakowaną sondą przeprowadzano stosując DIG Nucleotide Detection Kit (produkowany przez Boehringer-Mannheim), w oparciu o wyjaśnienia opisane w jego instrukcji. W wyniku, zaobserwowano jeden szczep, którego kolonia hybrydyzowała z wyznakowaną sondą.

(5) Sekwencja zasad genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116

W wyniku dowiedziono, że istnieje otwarta ramka odczytu, która koduje enzym wytwarzający peptyd. Sekwencję zasad pełnej długości genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116, wraz z odpowiadającą sekwencją aminokwasową przedstawiono w SEQ ID NO: 22.

P r z y k ł a d 11. Izolowanie genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Cyclobacterium marinum ATCC 25205

Dalej, w opisie opisuje się izolację genu enzymu wytwarzającego peptyd. Stosowanym mikroorganizmem jest Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA). Dla izolacji genu, Escherichia coli JM109, stosowano jako gospodarza, a pUCllS stosowano jako wektor.

(1) Uzyskiwanie komórek mikroorganizmów

Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) hodowano w ciągu 24 godzin w temperaturze 25°C na podłożu agarowym CM2G (zawierającym glukozę w stężeniu 50 g/l, ekstrakt drożdżowy w stężeniu 10 g/l, pepton w stężeniu 10 g/l, chlorek sodu w stężeniu 5 g/l i agar w stężeniu 20 g/l, pH 7,0). Jednym oczkiem ezy otrzymanych komórek mikroorganizmu inokulowano kolbę Sakaguchi o pojemności 500 ml, zawierającą 50 ml płynnego podłoża CM2G (wyżej podane podłoże z wyłączeniem agaru), a następnie hodowano z wytrząsaniem w temperaturze 25°C.

(3) Uzyskiwanie fragmentu DNA sondy PCR

Fragment DNA zawierający część genu wytwarzającego peptyd, pochodzącego z Cyclobacterium marinum ATCC 25205 uzyskiwano metodą PCR stosując LA-Taq (produkowany przez Takara Shuzo). Następnie, przeprowadzano reakcję PCR na chromosomalnym DNA uzyskanym z Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) stosując startery posiadające sekwencję zasad sekwencji SEQ ID NO: 15 i 16. Zamplifikowany przez procedurę PCR fragment DNA o wielkości w przybliżeniu 1 kb DNA wyizolowano przez elektroforezę w 0,8% agarozie. Następnie, wycięto docelowy prążek i oczyszczano. Fragment DNA wyznakowano sondą digoksynigenową, stosując DIG High Prime (manufactured by Boehringer-Mannheim), w oparciu o procedurę opisaną w jego instrukcji.

(4) Klonowanie genu wytwarzającego peptyd z biblioteki genów

Po umożliwieniu reakcji chromosomalnego DNA Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), z enzymem restrykcyjnym Pstl lub Hindi w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin w celu całkowitego strawienia DNA, uzyskany produkt poddawano elektroforezie

PL 209 701 B1 w 0,8% żelu agarozowym. Chromosomalny DNA po elektroforezie przeniesiono z żelu agarozowego przez blotting na dodatnio naładowany filtr membranowy Nylon (produkowany przez Roche Diagnostics), a następnie poddawano deneturacji alkalicznej, neutralizacji i immobilizacji. Hybrydyzację przeprowadzano stosując EASY HYB (produkowany przez Boehringer-Mannheim). Po wstępnej hybrydyzacji filtra w temperaturze 50°C w ciągu 1 godziny, dodawano sondę wyznakowaną digoksynigenem, przygotowaną jak opisano powyżej, i hybrydyzację prowadzono w temperaturze 50°C w ciągu 16 godzin. Następnie, filtr płukano dwa razy w temperaturze 60°C, stosując 1 x SSC, zawierający 0,1% SDS.

Wykrywanie prążków, które hybrydyzują z sondą przeprowadza się stosując DIG Nucleotide Detection Kit (produkowany przez Boehringer-Mannheim), w oparciu o opisaną w instrukcji procedurę. W wyniku, wykryto, że zachodzi hybrydyzacja z sondą prążka o wielkości odpowiadającej w przybliżeniu 7 kb dla produktu trawionego Pst-I i 2 kb dla produktu trawionego HincII.

μg chromosomalnego DNA Cyclobacterium marinum ATCG 25205 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) całkowicie trawiono Pstl lub HincII. DNA o wielkości w przybliżeniou 7 kb lub 2 kb rozdzielano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym. DNA oczyszczano stosując Gene Clean II Kit (produkowany przez Funakoshi) i rozpuszczano DNA w 10 μl TE. Mieszano 4 μl otrzymanego roztworu i pUC118 Pstl/BAP (produkowanego przez Takara Shuzo) lub pUC118 HincII/BAP (produkowanego przez Takara Shuzo) i reakcję ligacji przeprowadzano, stosując DNA Ligation Kit Ver. 2 (produkowany przez Takara Shuzo). 5 μl płynnego produktu reakcji ligacji i 100 μl kompetentnych komórek Escherichia coli JM109 (produkowanych przez Takara Shuzo) mieszano w celu transformacji Escherichia coli. Następnie, nakładano to na odpowiednie podłoże stałe w celu stworzenia biblioteki chromosomalnego DNA.

W celu uzyskania całego pełnej długości genu enzymu wytwarzającego peptyd, bibliotekę chromosomalnego DNA przeszukiwano przez hybrydyzację kolonijną z zastosowaniem sondy. Procedurę hybrydyzacji kolonijnej wyjaśniono w Molecular Cloning, wyd. 2, Cold Spring Harbor Press (1989).

(5) Sekwencja zasad genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Cyclobacterium marinum ATCG 25205

W wyniku dowiedziono, że istnieje otwarta ramka odczytu, która koduje enzym wytwarzający peptyd. Sekwencję zasad pełnej długości genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) wraz z odpowiadającą sekwencją aminokwasową przedstawiono w SEQ ID NO: 24.

P r z y k ł a d 12. Izolowanie genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Psychroserpens burtonensis ATCC 700359

Dalej, w opisie opisuje się izolację genu wytwrazającego enzym. Stosowanym mikroorganizmem jest Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA). Dla izolacji genu, Escherichia coli JM109, stosowano jako gospodarza, a pUCllS stosowano jako wektor.

PL 209 701 B1 (1) Uzyskiwanie komórek mikroorganizmów

Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) hodowano w ciągu 24 godzin w temperaturze 25°C na podłożu agarowym CM2G (zawierającym glukozę w stężeniu 50 g/l, ekstrakt drożdżowy w stężeniu 10 g/l, pepton w stężeniu 10 g/l, chlorek sodu w stężeniu 5 g/l i agar w stężeniu 20 g/l, pH 7,0). Jednym oczkiem ezy otrzymanych komórek mikroorganizmu inokulowano kolbę Sakaguchi o pojemności 500 ml, zawierającą 50 ml płynnego podłoża CM2G (wyżej podane podłoże z wyłączeniem agaru), a następnie hodowano z wytrząsaniem w temperaturze 10°C.

(3) Uzyskiwanie fragmentu DNA sondy PCR

Fragment DNA zawierający część genu wytwarzającego peptyd, pochodzącego z Psychroserpens burtonensis ATGG 700359 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) uzyskiwano metodą PCR stosując LA-Taq (produkowany przez Takara Shuzo). Następnie, przeprowadzano reakcję PCR na chromosomalnym DNA uzyskanym z Psychroserpens burtonensis ATGG 700359 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres instytucji depozytariusza; P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA) stosując startery posiadające sekwencję zasad SEQ ID NO: 15 i 16. Zamplifikowany przez procedurę PCR fragment DNA o wielkości w przybliżeniu 1 kb DNA wyizolowano przez elektroforezę w 0,8% agarozie. Następnie, wycięto docelowy prążek i oczyszczano. Fragment DNA wyznakowano sondą digoksynigenową, stosując DIG High Prime (manufactured by Boehringer-Mannheim), w oparciu o procedurę opisaną w jego instrukcji.

(4) Klonowanie genu wytwarzającego peptyd z bibliteki genów

Po umożliwieniu reakcji chromosomalnego DNA Psychroserpens burtonensis ATCC 700359, z enzymem restrykcyjnym EcoRI w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin w celu całkowitego strawienia DNA, uzyskany produkt poddawano elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym. Chromosomalny DNA po elektroforezie przeniesiono z żelu agarozowego przez blotting na dodatnio naładowany filtr membranowy Nylon (produkowany przez Roche Diagnostics) a następnie poddawano deneturacji alkalicznej, neutralizacji i immobilizacji. Hybrydyzację przeprowadzano stosując EASY HYB (produkowany przez Boehringer-Mannheim). Po wstępnej hybrydyzacji filtra w temperaturze 50°C w ciągu 1 godziny, dodawano sondę wyznakowaną digoksynigenem, przygotowaną jak opisano powyżej i hybrydyzację prowadzono w temperaturze 50°C w ciągu 16 godzin. Następnie, filtr płukano dwa razy w temperaturze 60°C, stosując 1 x SSC, zawierający 0,1% SDS.

Wykrywanie prążków, które hybrydyzują z sondą przeprowadza się stosując DIG Nucleotide Detection Kit (produkowany przez Boehringer-Mannheim), w oparciu o opisaną w instrukcji procedurę. W wyniku, wykryto, że zachodzi hybrydyzacja z sondą prążka o wielkości odpowiadającej w przybliżeniu 7 kb.

μg chromosomalnego DNA Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 całkowicie trawiono EcoRI. DNA o wielkości w przybliżeniu 7 kb rozdzielano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym, a następnie oczyszczano DNA stosując Gene Clean II Kit (produkowany przez Funakoshi) i rozpuszczano DNA w 10 μl TE. Mieszano 4 μl otrzymanego roztworu i pUCllS EcoRI/BAP (produkowanego przez Takara Shuzo) i reakcję ligacji przeprowadzano, stosując DNA Ligation Kit Ver. 2 (produkowany przez Takara Shuzo). 5 μl płynnego produktu reakcji ligacji i 100 μl kompetentnych komórek Escherichia coli JM109 (produkowanych przez Takara Shuzo) mieszano w celu transformacji Escherichia coli. Następnie nakładano to na odpowiednie podłoże stałe w celu stworzenia biblioteki chromosomalnego DNA. EcoRI.

W celu uzyskania całego pełnej długości genu enzymu wytwarzającego peptyd, bibliotekę chromosomalnego DNA przeszukiwano przez hybrydyzację kolonijną z zastosowaniem powyżej

PL 209 701 B1 wspomnianej sondy. Procedurę hybrydyzacji kolonijnej wyjaśniono w Molecular Cloning, wyd. 2, Cold Spring Harbor Press (1989).

(5) Sekwencja zasad genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Psychroserpens burtonensis ATGG 700359

Wypreparowano plazmidy, które ma Escherichia coli JM109, ze szczepu, co do którego potwierdzono, że hybrydyzował z wyznakowaną sondą i określoną sekwencję części zasad, gdzie występowała hybrydyzacja z sondą i w pobliżu. Reakcję sekwencjonowania przeprowadzano stosując CEQ DTCS-Quick Start Kit (produkowany przez Beckman-Coulter), w oparciu o procedurę z jego instrukcji. Ponadto, przeprowadzano elektroforezę stosując CEQ 2000-XL (produkowany przez Beckman-Goulter).

W wyniku dowiedziono, że istnieje otwarta ramka odczytu, która koduje enzym wytwarzający peptyd. Sekwencję zasad pełnej długości genu enzymu wytwarzającego peptyd pochodzącego z Psychroserpens burtonensis ATGG 700359 (instytucja depozytariusza; American Type Culture Collection, adres: P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110, USA), wraz z odpowiadającą sekwencją aminokwasową przedstawiano w SEQ ID NO: 26.

Lista Sekwencji:

SEQ ID NO: 3: Syntetyczny starter 1

SEQ ID NO: 4 : Syntetyczny starter 2

SEQ ID NO: 5: Gen kodujący enzym wytwarzający peptyd

SEQ ID NO: 7: Syntetyczny starter do przygotowywania pTrpT

SEQ ID NO: 8: Syntetyczny starter do przygotowywania pTrpT

SEQ ID NO: 9: Syntetyczny starter do przygotowywania pTrpT_Gtg2

SEQ ID NO: 10: Syntetyczny starter do przygotowywania pTrpTGtg2

SEQ ID NO: 11: Gen kodujący enzym wytwarzający peptyd

SEQ ID NO: 13: Syntetyczny starter do przygotowywania pTrpT_Sm_aet

SEQ ID NO: 14: Syntetyczny starter do przygotowywania pTrpT_Sm_aet

SEQ ID NO: 15: Mieszanka startera 1 dla Aet

SEQ ID NO: 16: Mieszanka startera 2 dla Aet

SEQ ID NO: 19: Starter 1 do konstruowania wektorów ekspresyjnych aet pochodzących z Pedobacter SEQ ID NO: 20: Starter 2 do konstruowania wektorów ekspresyjnych aet pochodzących z Pedobacter SEQ ID NO: 21: Mieszanka startera 3 dla Aet

PL 209 701 B1

Lista Sekwencji <110> AJINOMOTO CO. , LTD.

<120> Sposób wytwarzania β-estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego i sposób wytwarzania estru a-L-aspartylo-L-fenyloalanino-a-metylowego <130> PAMA-15899 <150> JP2003-016764 <151> 2003-01-24 <150> JP2003-201819 <151> 2003-07-25 <150> US60/491 546 <151> 2003-08-01 <160> 27 <170> Patentln wersja 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> białko <213> Empedobacter brevis <220>

<223> Wynalazca: YOKOZEKI, Kenzo Wynalazca: OHNO, Ayako Wynalazca: HARA, Seiichi Wynalazca: ABE, Isao <400> 1

Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gin Pro Lys 1 5

PL 209 701 B1 <210> 2 <211> 9 <212> białko <213> Empedobacter brevis <400> 2

Thr Asn Val Thr Tyr Thr Met Pro Asp 1 5 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: zsyntetyzowany starter 1 <400> 3 ttyacngcna thtaycarcc 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: zsyntetyzowany starter 2 <400> 4 tcnggcatng trtangtnac rtt 23 <210> 5 <211> 2024 <212> DNA <213> Empedobacter brevis <22υ>

<221> sekwencja kodująca <222> (61).. (1908) <223> gen kodujący enzym wytwarzający peptyd

PL 209 701 B1 <400> 5 atttcttaat aaaaactgaa atcttaatac atttatacta tcgtaaaatt tattgaacac 60

gtg aaa aaa tta

aca Thr 5

tta aaa gta

act eta ctt aca ctt

ttg Leu

ttg Leu 15

gga Gly

108

Val 1

Lys

Lys Leu

Leu

Lys

Val

Thr

Leu 10

Leu

Thr

Leu

agt

aca

gtt

gga

ttt

gcg

caa

gat

gca

aaa

gca

gat

tet

get

tat

gtg

156

Ser

Thr

Val

Gly

Phe

Ala

Gin

Asp

Ala

Lys

Ala

Asp

Ser

Ala

Tyr

Val

20

25

30

cgc

gac

aat

tac

gaa

aaa

ata

gaa

caa

gta

att

ceg

atg

cgc

gat

ggt

204

Arg Asp

Asn

Tyr

Glu

Lys

Ile

Glu

Gin

Val

Ile

Pro

Met

Arg

Asp

Gly

35

40

45

aca

aag

tta

ttt

aca

get

att

tat

cag

cca

aaa

gat

aaa

aca

aaa

caa

252

Thr

Lys

Leu

Phe

Thr

Ala

Ile

Tyr

Gin

Pro

Lys

Asp

Lys

Thr

Lys

Gin

50

55

60

tat

ccc

gtt

ttg

tta

aat

cgt

acg

cct

tat

aca

gtt

gcg

cct

tat

ggt

300

Tyr

Pro

Val

Leu

Asn

Arg

Thr

Pro

Tyr

Thr

Val

Ala

Pro

Tyr

Gly

65

70

75

80

gta

aat

gaa

tac

aag

aaa

teg

tta

gga

aa t

ttt

cct

aca

gaa

atg

cgc

348

Val

Asn

Glu

Tyr

Lys

Ser

Leu

Gly

Asn

Phe

Pro

Thr

Glu

Met

Arg

85

90

95

gaa

ggt

ttt

att

ttt

gtt

tac

caa

gat

gtg

aga

gga

aaa

tgg

atg

agc

396

Glu

Gly

Phe

Ile

Phe

Val

Tyr

Gin

Asp

Val

Arg

Gly

Lys

Trp

Met

Ser

100

105

110

gaa

ggc

gaa

ttt

gaa

gat

gtt

ega

cct

ata

aat

cct

tea

aaa

agt

aaa

444

Glu

Gly

Glu

Phe

Glu

Asp

Val

Arg

Pro

Ile

Asn

Pro

Ser

Lys

Ser

Lys

115

120

125

aag

gca

att

gac

gaa

agc

aca

gat

aca

ttt

gat

acg

eta

gaa

tgg

ctt

492

Lys

Ala

Ile

Asp

Glu

Ser

Thr

Asp

Thr

Phe

Asp

Thr

Leu

Glu

Trp

Leu

130

135

140

get

aaa

aac

ttg

aag

aat

tac

acg

aaa

get

gga

att

tat

gga

att

540

Ala

Lys

Asn

Leu

Lys

Asn

Tyr

Thr

Lys

Ala

Gly

Ile

Tyr

Gly

Ile

145

150

155

160

PL 209 701 B1

588

tcg

tat

cct

ggt

ttt

tat

tcg

aca

atg

agt

ttg

gtt

aat

tcg

cat cca

Ser

Tyr

Pro

Gly

Phe

Tyr

Ser

Thr

Met

Ser

Leu

Val

Asn

Ser

His Pro

165

170

175

act

eta

aaa

gcc

gtt

tcg

cca

caa

gcg

CCC

gtt

acc

aat

tgg

ttt

tta

Thr

Leu

Lys

Ala

Val

Ser

Pro

Gin

Ala

Pro

Val

Thr

Asn

Trp

Phe

Leu

180

185

190

636

ggt

gac

gat

ttt

cat

aat

gga

gtt

tta

ttc

ttg

aat

gat

tet

ttc

Gly

Asp

Phe

His

Asn

Gly

Val

Leu

Phe

Leu

Asn

Asp

Ser

Phe

195

200

205

684

tea

ttt

atg

act

ttt

ggt

gta

aaa

Cgt

ccg

caa

cca

att

acg

cca

Ser

Phe

Met

Thr

Phe

Gly

Val

Lys

Arg

Pro

Gin

Pro

Ile

Thr

Pro

210

215

220

732

gat

aaa

ggt

ccg

aaa

Cgt

ttt

gaa

tat

cca

ata

aaa

gat

aat

tat

aga

Asp

Lys

Gly

Pro

Lys

Arg

Phe

Glu

Tyr

Pro

Ile

Lys

Asp

Asn

Tyr

Arg

225

230

235

240

780

ttt

tat

gca

agt

ggc

tet

gta

aaa

gag

ttg

aaa

gat

aaa

tat

ttg

caa

Phe

Tyr

Ala

Ser

Gly

Ser

Val

Lys

Glu

Leu

Lys

Asp

Lys

Tyr

Leu

Gin

245

250

255

828

gat

aat

atc

aag

ttt

tac

aat

gat

tta

ttt

gcg

cat

cca gat

tac

gat

Asp

Asn

Ile

Lys

Phe

Tyr

Asn

Asp

Leu

Phe

Ala

His

Pro Asp

Tyr

Asp

260

265

270

876

caa

ttt

tgg

caa

gat

cgt

aat

gtt

tta

cca

cat

tta

act

aac

gtg

caa

Gin

Phe

Trp

Gin

Asp

Arg

Asn

Val

Leu

Pro

His

Leu

Thr

Asn

Val

Gin

275

280

285

924

cct

get

gta

atg

acg

gtt

gga

ggt

ttt

gat

gca

gaa

gat

gtc

tac

Pro

Ala

Val

Met

Thr

Val

Gly

Phe

Asp

Ala

Glu

Asp

Val

Tyr

290

295

300

972

ggc

get

ttc

gaa

acg

tat

aaa

gca

att

gag

aaa

caa

aat

ccg

aaa

gca

Gly

Ala

Phe

Glu

Thr

Tyr

Lys

Ala

Ile

Glu

Lys

Gin

Asn

Pro

Lys

Ala

305

310

315

320

1020

PL 209 701 B1

aca aat att atg gtt gcc gga cct tgg ttt cat

ggt ggt tgg

gtt Val 335

cgt Arg

1068

Thr

Asn

Ile

Met Val Ala Gly Pro Trp Phe His

Gly Gly

Trp

325

330

agc

aac

gga

agt

act

ttt

gga

gat

atg

caa

ttt

gca

tcg

aat

aca

agt

1116

Ser

Asn

Gly

Ser

Thr

Phe

Gly

Asp

Met

Gin

Phe

Ala

Ser

Asn

Thr

Ser

340

345

350

gag

cat

tat

cag

caa

gaa

ata

gaa

ttg

cct

ttt

aat

tat

tac

tta

1164

Glu

His

Tyr

Gin

Glu

Ile

Glu

Leu

Pro

Phe

Asn

Tyr

Leu

355

360

365

aaa

gat

aaa

ggt

aat

ttt

aaa

cca

acc

gaa

gct

aca

att

ttt

att

acg

1212

Lys

Asp

Lys

Gly

Asn

Phe

Lys

Pro

Thr

Glu

Ala

Thr

Ile

Phe

Ile

Thr

370

375

380

gga

tct

aac

gaa

tgg

aaa

caa

ttt

gat

gct

tgg

cca

aaa

aat

gta

1260

Gly

Ser

Asn

Glu

Trp

Lys

Gin

Phe

Asp

Ala

Trp

Pro

Lys

Asn

Val

385

390

395

400

aca

caa

aaa

att

tat

ttg

caa

aat

ggt

aaa

ata

gct

ttt

aat

1308

Thr

Gin

Lys

Ile

Tyr

Leu

Gin

Asn

Gly

Lys

Ile

Ala

Phe

Asn

405

410

415

aaa

acc

aat

aca

act

ttt

gac

gaa

tat

gtt

gca

gat

cca

aat

1356

Lys

Thr

Asn

Thr

Phe

Asp

Glu

Tyr

Val

Ala

Asp

Pro

Asn

420

425

430

tct

cca

gtt

cct

tat

tca

gga

gtt

tta

gaa

act

cgt

tca

aga

gaa

1404

Ser

Pro

Val

Pro

Tyr

Ser

Gly

Val

Leu

Glu

Thr

Arg

Ser

Arg

Glu

435

440

445

tat

atg

gtc

gat

caa

cgc

ttt

gct

tct

act

cgt

cct

gat

gtt

atg

1452

Tyr

Met

Val

Asp

Gin

Arg

Phe

Ala

Ser

Thr

Arg

Pro

Asp

Val

Met

450

455

460

gtg

tat

caa

tct

gat

att

ttg

aca

gaa

gat

att

acg

ctt

gct

ggt

cct

1500

Val

Tyr

Gin

Ser

Asp

Ile

Leu

Thr

Glu

Asp

Ile

Thr

Leu

Ala

Gly

Pro

465

470

475

480

PL 209 701 B1

gtt	atc	aat	cat	tta	gtg	gtt	tct
Val	Ile	Asn	His	Leu 485	Val	Val	Ser
gtt	gta	aaa	ttg	att	gat	gtt	tat
Val	Val	Lys	Leu 500	Ile	Asp	Val	Tyr
aac	aaa	tta	atg	gct	gga	tat	caa
Asn	Lys	Leu 515	Met	Ala	Gly	Tyr	Gin 520
cgc	gga	aaa	tat	aga	aat	agt	ttc
Arg	Gly 530	Lys	Tyr	Arg	Asn	Ser 535	Phe
aat	aaa	gaa	aca	aat	gta	acg	tac
Asn 545	Lys	Glu	Thr	Asn	Val 550	Thr	Tyr
ttt	aag	aaa	gga	cat	cgc	att	atg
Phe	Lys	Lys	Gly	His 565	Arg	Ile	Met
cct	tta	gca	gat	cgc	aat	ccg	caa
Pro	Leu	Ala	Asp 580	Arg	Asn	Pro	Gin
act	tct	aaa	gat	tat	tta	aaa	caa
Thr	Ser	Lys 595	Asp	Tyr	Leu	Lys	Gin 600
tat	atc	gaa	att	ccg	gta	ttg	aaa
Tyr	Ile 610	Glu	Ile	Pro	Val	Leu 615	Lys

act acg gga aca gac gct gat tat
Thr Thr Gly Thr Asp	Ala	Asp 495	Tyr
	490
cct	gaa	aac	acg	cca	aaa	ttt	aat
Pro	Glu	Asn	Thr	Pro	Lys	Phe	Asn
505					510
aat	ttg	att	cgt	gca	gaa	att	atg
Asn	Leu	Ile	Arg	Ala	Glu	Ile	Met
				525
tct	aac	ccc	gaa	gct	atg	gtt	ccg
Ser	Asn	Pro	Glu	Ala	Met	Val	Pro
			540
acg	atg	cca	gat	gtt	gga	cat	aca
Thr	Met	Pro	Asp	Val	Gly	His	Thr
		555					560
att	caa	gtt	cag	aac	agt	tgg	ttt
Ile	Gin	Val	Gin	Asn	Ser	Trp	Phe
	570					575
caa	ttt	atg	aat	gtt	tac	gaa	gca
Gin	Phe	Met	Asn	Val	Tyr	Glu	Ala
585					590
acg	caa	ega	att	tat	cat	act	tct
Thr	Gin	Arg	Ile	Tyr	His	Thr	Ser
				605

taacaaaaaa atccagctaa ttagctggat 1938 tttttttata atgttacttt tcctattttt ttai.cgggcg aaaccgtaca agtatg cctttatttc caactaaaat tacatatttt 1998

2024 <210> 6

PL 209 701 B1 <211> 616 <212> biał ko <213> Empedobacter brevis <400> 6

Val Lys Lys Leu Thr Leu Lys Val Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly 15 10 15

Ser Thr Val Gly Phe Ala Gin Asp Ala Lys Ala Asp Ser Ala Tyr Val 20 25 30

Arg Asp Asn Tyr Glu Lys Ile Glu Gin Val Ile Pro Met Arg Asp Gly 35 40 45

Thr Lys Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gin Pro Lys Asp Lys Thr Lys Gin 50 55 60

Tyr Pro Val Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ala Pro Tyr Gly

70 75 80

Val Asn Glu Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Thr Glu Met Arg

90 95

Glu Gly Phe Ile Phe Val Tyr Gin Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser 100 105 110

Glu Gly Glu Phe Glu Asp Val Arg Pro Ile Asn Pro Ser Lys Ser Lys 115 120 125

Lys Ala Ile Asp Glu Ser Thr Asp Thr Phe Asp Thr Leu Glu Trp Leu 130 135 140

Ala Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Gly Ile Tyr Gly Ile

145 150 155 160

Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ser Thr Met Ser Leu Val Asn Ser His Pro

165 170 175

Thr Leu Lys Ala Val Ser Pro Gin Ala Pro Val Thr Asn Trp Phe Leu 180 185 190

PL 209 701 B1

Lys Thr Asn Thr Thr Thr Thr Phe Asp Glu Tyr Val Ala Asp Pro Asn 420 425 430

Ser Pro Val Pro Tyr Ser Gly Gly Val Leu Glu Thr Arg Ser Arg Glu 435 440 445

Tyr Met Val Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ser Thr Arg Pro Asp Val Met 450 455 460

Val Tyr Gin Ser Asp Ile Leu Thr Clu Asp Ile Thr Leu Ala Gly Pro

465 470 475 480

Val Ile Asn His Leu Val Val Ser Thr Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr

485 490 495

Vai Val Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Glu Asn Thr Pro Lys Phe Asn 500 505 510

Asn Lys Leu Met Ala Gly Tyr Gin Asn Leu Ile Arg Ala Glu Ile MeL 515 520 525

Arg Gly Lys Tyr Arg Asn Ser Phe Ser Asn Pro Glu Ala Met Val Pro 530 535 540

Asn Lys Glu Thr Asn Val Thr Tyr Thr Met Pro Asp Val Gly His Thr

545 550 555 560

Phe Lys Lys Gly His Arg Ile Met Ile Gin Val Gin Asn Ser Trp Phe

565 570 575

Pro Leu Ala Asp Arg Asn Pro Gin Gin Phe Met Asn Val Tyr Glu Ala 580 585 590

Thr Ser Lys Asp Tyr Leu Lys Gin Thr Gin Arg Ile Tyr His Thr Ser 595 600 605

Tyr Ile Glu Ile Pro Val Leu Lys 610 615 <210> 7 <211> 40

PL 209 701 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: zsyntetyzowany starter do przygotowywania pTrpT <400> 7 gtatcacgag gccctagctg tggtgtcatg gtcggtgatc 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: zsyntetyzowany starter do przygotowywania pTrpT <400> 8 ttcggggatt ccatatgata ccctttttac gtgaacttgc 40 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: zsyntetyzowany starter do przygotowywania pTrpT_Gtg2 <400> 9 gggaattcca tatgaaaaaa ttaacattaa aagtaact 38 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: zsyntetyzowany starter do przygotowywania pTrpT_Gtg2 <400> 10 gggggctgca gtacttgtac ggtttcgccc gataaa 36

PL 209 701 B1 <210> 11 <211> 1935 <212> DNA <213> Sphingobacterium sp.

<220>

<221> sekwencja kodują ca <222> (61).. (1917) <223> gen enzymu wytwarzają cego peptyd <400> 11 gaaaccaagt gtaaaattat aatttacacc aaagaatgta ctgaacaaat aattatctga 60

atg

aaa

aat

aca

att

tcg

tgc

eta

act

tta

gcg

ctt

tta

agc

gca

agc

Met

Lys

Asn

Thr

Ile

Ser

Cys

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Ser

Ala

Ser

1

5

10

15

108

cag

tta

cat

gct

caa

aca

gct

gcc

gac

tcg

gct

tat

gtt

aga

gat

cat

Gin

Leu

His

Ala

Gin

Thr

Ala

Asp

Ser

Ala

Tyr

Val

Arg

Asp

His

20

25

30

156

tat

gaa

aag

acc

gaa

gta

gca

att

CCC

atg

ega

gat

ggg

aaa

tta

Tyr

Glu

Lys

Thr

Glu

Val

Ala

Ile

Pro

Met

Arg

Asp

Gly

Lys

Leu

35

40

45

204

ttt

act

gcg

atc

tac

agt

cca

aaa

gac

aaa

tcc

aag

aaa

tat

cca

gtt

Phe

Thr

Ala

Ile

Tyr

Ser

Pro

Lys

Asp

Lys

Ser

Lys

Tyr

Pro

Val

50

55

60

252

ttg

ctc

aat

aga

acg

ccc

tac

acg

gtt

tca

cct

tat

ggg

cag

aac

gaa

Leu

Asn

Arg

Thr

Pro

Tyr

Thr

Val

Ser

Pro

Tyr

Gly

Gin

Asn

Glu

65

70

75

80

300

tat

aaa

agc

ttg

gga

aac

ttt

CCC

caa

atg

cgt

gaa

ggc

tat

Tyr

Lys

Ser

Leu

Gly

Asn

Phe

Pro

Gin

Met

Arg

Glu

Gly

Tyr

85

90

95

348

att

ttc

gtt

tac

cag

gat

gtc

cgt

ggc

aag

tgg

atg

agc

gaa

ggt

gat

Ile

Phe

Val

Tyr

Gin

Asp

Val

Arg

Gly

Lys

Trp

Met

Ser

Glu

Gly

Asp

100

105

110

396

PL 209 701 B1

ttt Phe

gaa gat ata

cgt ccg acc acg tac agc aaa gat aaa aaa gca atc

444

Glu

Asp 115

Ile

Arg

Pro

Thr

Thr Tyr 120

Ser Lys

Asp

Lys 125

Lys

Ala

Ile

gat

gaa

agt

acg

gat

acc

tat

gat

gcg

ctt

gaa

tgg

tta

cag

aaa

aat

492

Asp

Glu

Ser

Thr

Asp

Thr

Tyr

Asp

Ala

Leu

Glu

Trp

Leu

Gin

Lys

Asn

130

135

140

ctc

aaa

aac

tat

aat

ggc

aaa

gcc

ggg

ctc

tat

ggg

att

tcc

tat

cca

540

Leu

Lys

Asn

Tyr

Asn

Gly

Lys

Ala

Gly

Leu

Tyr

Gly

Ile

Ser

Tyr

Pro

145

150

155

160

ggc

ttc

tat

tct

acc

gtc

gga

ttg

gtc

aaa

aca

cac

ccg

agc

ttg

aag

588

Gly

Phe

Tyr

Ser

Thr

Val

Gly

Leu

Val

Lys

Thr

His

Pro

Ser

Leu

Lys

165

170

175

gca

gtc

tcc

cca

cag

gct

ccc

gta

aca

gac

tgg

tat

atc

ggc

gac

636

Ala

Val

Ser

Pro

Gin

Ala

Pro

Val

Thr

Asp

Trp

Tyr

Ile

Gly

Asp

180

185

190

ttc

cac

cat

aat

ggc

gta

ttg

ttt

ctt

cag

gat

gca

ttt

aca

ttc

atg

684

Phe

His

Asn

Gly

Val

Leu

Phe

Leu

Gin

Asp

Ala

Phe

Thr

Phe

Met

195

200

205

tca

acc

ttt

ggt

gtc

cct

cgt

cca

aaa

ccc

att

aca

ccg

gat

caa

ttt

732

Ser

Thr

Phe

Gly

Val

Pro

Arg

Pro

Lys

Pro

Ile

Thr

Pro

Asp

Gin

Phe

210

215

220

aag

ggc

aaa

att

cag

atc

aaa

gaa

gcc

gat

aaa

tat

aac

ttt

gca

780

Lys

Gly

Lys

Ile

Gin

Ile

Lys

Glu

Ala

Asp

Lys

Tyr

Asn

Phe

Ala

225

230

235

240

gaa

gca

gga

aca

gcg

cgg

gaa

ctc

aaa

gaa

aag

tat

ttt

ggt

gac

tcc

828

Glu

Ala

Gly

Thr

Ala

Arg

Glu

Leu

Lys

Glu

Lys

Tyr

Phe

Gly

Asp

Ser

245

250

255

gta

caa

ttt

tgg

aat

gac

ctg

ttt

aag

cat

ccc

gac

tat

gat

ttt

876

Val

Gin

Phe

Trp

Asn

Asp

Leu

Phe

Lys

His

Pro

Asp

Tyr

Asp

Phe

260

265

270

PL 209 701 B1

924

tgg

aaa

tcg

cgt

gtg

atc

acg

aat

tct

tta

cag

gag

gta

aaa

cca

get

Trp

Lys

Ser

Arg

Val

Ile

Thr

Asn

Ser

Leu

Gin

Glu

Val

Lys

Pro

Ala

275

280

285

gtg

atg

gtg

gtt

ggt

ttc

ttt

gac

gcg

gaa

gat

get

tat

gga aca

Val

Met

Val

Gly

Phe

Asp

Ala

Glu

Asp

Ala

Tyr

Gly Thr

290

295

300

972

ttt

aag

acc

tac

caa

tcg

att

gag

gat

aaa

age

aaa

aac

tcg

Phe

Lys

Thr

Tyr

Gin

Ser

Ile

Glu

Asp

Lys

Ser

Lys

Asn

Ser

305

310

315

320

1020

att

tta

gtc

gcg

gga

cct

tgg

tat

cat

ggc

ggt

tgg

gtt

cgt

gca

gaa

Ile

Leu

Val

Ala

Gly

Pro

Trp

Tyr

His

Gly

Trp

Val

Arg

Ala

Glu

325

330

335

1068

gga

aac

tat

tta

ggt.

gat

atc

caa

ttt

gag

aaa

acc

agt

att

act

Gly

Asn

Tyr

Leu

Gly

Asp

Ile

Gin

Phe

Glu

Lys

Thr

Ser

Ile

Thr

340

345

350

1116

tat

cag

gaa

caa

ttt

gaa

caa

cca

L t L

ttc

aaa

tat

tac

eta

aaa

gat

Tyr

Gin

Glu

Gin

Phe

Glu

Gin

Pro

Phe

Lys

Tyr

Leu

Lys

Asp

355

360

365

1164

gaa

gga

aac

ttc

gee

cct

tcc

gaa

get

aac

att

ttt

gtt

tca

ggc

age

Glu

Gly

Asn

Phe

Ala

Pro

Ser

Glu

Ala

Asn

Ile

Phe

Val

Ser

Gly

Ser

370

375

380

1212

aac

gaa

tgg

aaa

cat

ttc

gaa

cag

tgg

cca

aaa

aat

gta

gag

aca

Asn

Glu

Trp

Lys

His

Phe

Glu

Gin

Trp

Pro

Lys

Asn

Val

Glu

Thr

385

390

395

400

1260

aaa

eta

tac

ttc

caa

cct

cag

ggg

aaa

ctt

gga

ttt

gac

aaa

gtt

Lys

Leu

Tyr

Phe

Gin

Pro

Gin

Gly

Lys

Leu

Gly

Phe

Asp

Lys

Val

405

410

415

1308

caa

cgt

aca

gat

tcc

tgg

gat

gaa

tat

gta

aca

gac

cct

aat

aaa

cct

Gin

Arg

Thr

Asp

Ser

Trp

Asp

Glu

Tyr

Val

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys

Pro

420

425

430

1356

PL 209 701 B1 gtt ccg cat caa ggt ggg gta att caa aac ega aca cgg gag tat atg 1404

Val Pro His Gin Gly Gly Val Ile Gin Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met

435 440 445 gta gat gat caa cgt ttc gcg gct agt cgc cct gat gtc atg gtt tat 1452

Val Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Met Val Tyr

450 455 460 caa acg gaa ccg ttg acg gag gac ctg acg ata gta ggc cca atc aaa 1500

Gin Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr ile Val Gly Pro Ile Lys

465 470 475 480 aac ttt ctc aaa gtt tct tca aca gga aca gac gcg gac tat gtt gtc 1548

Asn Phe Leu Lys Val Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Val Val

485 490 495 aaa ctg att gac gtt tat ccg aat gat gca gca agt tat caa gga aaa 1596

Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gin Gly Lys

500 505 510 aca atg gct gga tat caa atg atg gta cgt ggt gag atc atg gcg ggg 1644

Thr Met Ala Gly Tyr Gin Met Met Val Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly

515 520 525 aaa tac ega aat ggt ttc gat aaa gcg cag gcc ttg act cca ggt atg 1692

Lys Tyr Arg Asn Cly Phe Asp Lys Ala Gin Ala Leu Thr Pro Gly Met

530 535 540 gtc gaa aag gtg aat ttt gaa atg cca gac gtt gcg cat acc ttc aaa 1740

Val Glu Lys Val Asn Phe Glu Met Pro Asp Val Ala His Thr Phe Lys

545 550 555 560 aaa gga cat cgc att atg gtt cag gta caa aac tca tgg ttt ccg ctg 1788

Lys Gly His Arg Ile Met Val Gin Val Gin Asn Ser Trp Phe Pro Leu

565 570 575 gca gaa ega aat cca cag gtg ttt tta gca cct tat aca gct acc aaa 1836

Ala Glu Arg Asn Pro Gin Val Phe Leu Ala Pro Tyr Thr Ala Thr Lys

580 585 590

PL 209 701 B1

gct	gat	ttc	cgc	aaa	gct	acc	caa	cgt
Ala	Asp	Phe	Arg	Lys	Ala	Thr	Gin	Arg
		595					600

gcc	aca	tac	atc	gaa	ttt	tct	gtc	ctc
Ala	Thr	Tyr	Ile	Glu	Phe	Ser	Val	Leu
	610					615

att ttt cac gat gtg aac aat 1884

Ile Phe His Asp Val Asn Asn

605 aaa gat tagcaggtaa attcgaaa 1935 Lys Asp <210> 12 <211> 619 <212> białko

<21:

3> Sphini

goba<

?ter:

ium i

sp.

<401

3> ll

Met

Lys

Asn

Thr

Ile

Ser

Cys

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Ser

Ala

Ser

1

5

10

15

Gin

Leu

His

Ala

Gin

Thr

Ala

Asp

Ser

Ala

Tyr

Val

Arg

Asp

His

20

25

30

Tyr

Glu

Lys

Thr

Glu

Val

Ala

Ile

Pro

Met

Arg

Asp

Gly

Lys

Leu

35

40

45

Phe

Thr

Ala

Ile

Tyr

Ser

Pro

Lys

Asp

Lys

Ser

Lys

Tyr

Pro

Val

50

55

60

Leu

Asn

Arg

Thr

Pro

Tyr

Thr

Val

Ser

Pro

Tyr

Gl y

Gin

Asn

Glu

65

70

75

80

Tyr

Lys

Ser

Leu

Gly

Asn

Phe

Pro

Gin

Met

Arg

Glu

Gly

Tyr

85

90

95

Ile

Phe

Val

Tyr

Gin

Asp

Val

Arg

Gly

Lys

Trp

Met

Ser

Glu

Gly

Asp

100

105

110

Phe

Glu

Asp

Ile

Arg

Pro

Thr

Tyr

Ser

Lys

Asp

Lys

Ala

Ile

115

120

125

Asp

Gl u

Ser

Thr

Asp

Thr

Tyr

Asp

Ala

Leu

Glu

Trp

Leu

Gin

Lys

Asn

130

135

140

PL 209 701 B1

Glu Gly Asn Phe Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Phe Val Ser Gly Ser 370 375 380

Asn Glu Trp Lys His Phe Glu Gin Trp Pro Pro Lys Asn Val Glu Thr

385 390 395 400

Lys Lys Leu Tyr Phe Gin Pro Gin Gly Lys Leu Gly Phe Asp Lys Val

405 410 415

Gin Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Val Thr Asp Pro Asn Lys Pro 420 425 430

Val Pro His Gin Gly Gly Val Ile Gin Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met 435 440 445

Val Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Met Val Tyr 450 455 460

Gin Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr Ile Val Gly Pro Ile Lys

465 470 475 480

Asn Phe Leu Lys Val Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Val Val

485 490 495

Lys Leu Ile Asp Va1 Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gin Gly Lys 500 505 510

Thr Met Ala Gly Tyr Gin Met Met Val Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly 515 520 525

Lys Tyr Arg Asn Gly Phe Asp Lys Ala Gin Ala Leu Thr Pro Gly Met 530 535 540

Val Glu Lys Val Asn Phe Glu Met Pro Asp Val Ala His Thr Phe Lys

545 550 555 560

Lys Gly His Arg Ile Met Val Gin Val Gin Asn Ser Trp Phe Pro Leu

565 570 575

Ala Glu Arg Asn Pro Gin Val Phe Leu Ala Pro Tyr Thr Ala Thr Lys 580 585 590

PL 209 701 B1

Ala Asp Phe Arg Lys Ala Thr Gin Arg Ile Phe His Asp Val Asn Asn 595 600 605

Ala Thr Tyr Ile Glu Phe Ser Val Leu Lys Asp 610 615 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: zsyntetyzowany starter do przygotowywania pTrpT_Sm_aet <400> 13 gggaattcca tatgaaaaat acaatttcgt 30 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: zsyntetyzowany starter do przygotowywania pTrpT_Sm_aet <400> 14 gctctagact aatctttgag gacagaaaa 29 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> sztuczny <220>

<223> mieszanka startera 1 dla Aet <400> 15 gaygayttyc aycayaa 17 <210> 16 <211> 20 <212> DNA

PL 209 701 B1 <213> sztuczny <220>

<223> mieszanka startera 2 dla Aet

<220>
<221>	cecha	zmienna
<222>	(9)..	(9)
<223>	dowol	na zasad

<400> 16 tgrtcrtcna ccatrtaytc 20 <210> 17 <211> 1974 <212> DNA <213> Pedobacter heparinus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (61)..(1935) <223>

<400> 17 aaacctatcc cgtattcagc aatcaattcc atatatttat ccttaaaaaa accttcctct 60

atg act cct ttc

aaa tcg

ttc tcc ttc

att ttt ctc ttt att ttt acc

Met Thr 1

Pro

Phe

Lys 5

Ser

Phe

Ser Phe

Ile 10

Phe

Leu

Phe

Ile

Phe 15

Thr

agt

ctt

tct

gct

tct

gca

caa

cag

tcc

gac

tct

gct

tat

ata

cgt

cag

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Ala

Gin

Cln

Ser

Asp

Ser

Ala

Tyr

Ile

Arg

Gin

20

25

30

aac

tat

acc

aaa

ata

gaa

agg

ctg

atc

cct

atg

cgg

gat

ggc

att

aag

Asn

Tyr

Thr

Lys

Ile

Glu

Arg

Leu

Ile

Pro

Met

Arg

Asp

Gly

Ile

Lys

35

40

45

eta

ttt

aca

gcc

att

tac

atc

ccc

aaa

gac

aaa

agc

aag

tat

cct

Leu

Phe

Thr

Ala

Ile

Tyr

Ile

Pro

Lys

Asp

Lys

Ser

Lys

Tyr

Pro

50

55

60

PL 209 701 B1

ttt Phe 65

atg ctc Met Leu

aac cgt

act cct Thr Pro 70

tat acc gtt

tcg cct tat ggc

gaa Glu

aac Asn 80

300

Asn

Arg

Tyr

Thr

Val

Ser 75

Pro

Tyr

Gly

aat

tat

aaa

aca

agc

ctt

ggc

ccc

tct

ccg

ctc

ttt

ata

aaa

gaa

ggc

348

Asn

Tyr

Lys

Thr

Ser

Leu

Gly

Pro

Ser

Pro

Leu

Phe

Tle

Lys

Glu

Gly

85

90

95

ttt

atc

ttt

gtt

tat

cag

gat

gta

agg

ggc

aaa

tgg

atg

agt

gag

gga

396

Phe

Ile

Phe

Val

Tyr

Gin

Asp

Val

Arg

Gly

Lys

Trp

Met

Ser

Glu

Gly

100

105

110

aaa

ttt

gaa

gac

gta

agg

ccg

caa

ata

gcc

agc

aag

aaa

cgc

aaa

acg

444

Lys

Phe

Glu

Asp

Val

Arg

Pro

Gin

Ile

Ala

Ser

Lys

Arg

Lys

Thr

115

120

125

gat

att

gat

gaa

agc

tcc

gat

act

tat

gat

acg

atc

gac

tgg

ctg

atc

492

Asp

Ile

Asp

Glu

Ser

Asp

Thr

Tyr

Asp

Thr

He

Asp

Trp

Leu

Ile

130

135

140

agg

aac

att

cct

gga

aac

cgt

aaa

acc

ggt

att

tac

ggt

atc

tca

540

Arg

Asn

Ile

Pro

Gly

Asn

Arg

Lys

Thr

Gly

Ile

Tyr

Gly

Ile

Ser

145

150

155

160

tac

cca

ggc

ttt

tat

gct

act

gct

gcc

eta

cca

gat

gcg

cat

cca

tct

588

Tyr

Pro

Gly

Phe

Tyr

Ala

Thr

Ala

Leu

Pro

Asp

Ala

His

Pro

Ser

165

170

175

tta

aag

gca

gta

tcg

ccc

cag

gct

ccg

gtt

acc

gac

tgg

ttt

ata

ggc

636

Leu

Lys

Ala

Val

Ser

Pro

Gin

Ala

Pro

Val

Thr

Asp

Trp

Phe

Ile

Gly

180

185

190

gat

ttt

cat

cac

aat

ggc

acc

ttg

ttc

ctt

gca

gat

atc

ttt

agc

684

Asp

Phe

His

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Ala

Asp

Ile

Phe

Ser

195

200

205

ttc

tat

acc

ttc

ggg

gta

ccg

ega

cct

caa

cca

att

acg

ccc

gac

732

Phe

Tyr

Thr

Phe

Gly

Val

Pro

Arg

Pro

Gin

Pro

Ile

Thr

Pro

Asp

210 215 220

PL 209 701 B1

aaa cgt cca aaa ccc

ttt gat ttc ccg gtt aaa gac aac tac cgt ttt

780

Lys Arg Pro 225

Lys

Pro

Phe 230

Asp

Phe

Pro

Val

Lys Asp Asn Tyr Arg Phe

235

240

ttt

ctt

gaa

ctg

ggc

ccc

tta

aaa

aac

atc

acc

aaa

tat

ggc

828

Phe

Leu

Glu

Leu

Gly

Pro

Leu

Lys

Asn

Ile

Thr

Lys

Tyr

Gly

245

250

255

gat

acc

ata

ega

ttc

tgg

aat

gat

atc

aat

gcg

cat

acc

aat

tat

gat

876

Asp

Thr

Ile

Arg

Phe

Trp

Asn

Asp

Ile

Asn

Ala

His

Thr

Asn

Tyr

Asp

260

265

270

gcc ttc tgg aaa gcc cgt aac att acg ccg cat tta att ggt gta aaa

924

Ala Phe Trp Lys Ala Arg Asn Ile Thr Pro His Leu Ile

Gly

Val

Lys

275

280

285

cct

gca

gtt

ttg

gta

gtt

ggc

ttc

ttt

gat

gca

gaa

gac

ctt

tac

972

Pro

Ala

Val

Leu

Val

Gly

Phe

Asp

Ala

Glu

Asp

Leu

Tyr

290

295

300

ggt

acg

ctt

aaa

acc

tat

cag

gcc

atc

gaa

aaa

caa

aa i

cca

tcc

tca

1020

Gly

Thr

Leu

Lys

Thr

Tyr

Gin

Ala

Ile

Glu

Lys

Gin

Asn

Pro

Ser

305

310

315

320

aaa

aac

ctc

gtt

atg

ggc

ccc

tgg

tac

cat

ggt

ggc

tgg

gca

aga

1068

Lys

Asn

Leu

Val

Met

Gly

Pro

Trp

Tyr

His

Gly

Trp

Ala

Arg

325

330

335

agt

acg

gga

agc

agt

ttc

ggg

gat

att

aat

ttc

gga

cag

cca

acc

agt

1116

Ser

Thr

Gly

Ser

Phe

Gly

Asp

Ile

Asn

Phe

Gly

Gin

Pro

Thr

Ser

340

345

350

act

tca

tac

cag

caa

aat

gtt

gag

ttc

cct

ttc

ttt

atg

caa

tac

ctc

1164

Thr

Ser

Tyr

Gin

Asn

Val

Glu

Phe

Pro

Phe

Met

Gin

Tyr

Leu

355

360

365

aaa

gag

gca

ccg

gat

gca

aaa

att

gca

gag

gca

acc

att

ttt

atc

act

1212

Lys

Glu

Ala

Pro

Asp

Ala

Lys

Ile

Ala

Glu

Ala

Thr

Ile

Phe

Ile

Thr

370

375

380

PL 209 701 B1

ggc agc aat gaa tgg aag aaa ttt agc tcc tgg cca cct cag gat aca

1260

Gly 385

Ser

Asn

Glu

Trp Lys 390

Lys

Phe

Ser

Trp 395

Pro Pro

Gin

Asp

Thr 400

gaa

aga

aca

tta

tac

ctg

cag

ccc

aat

ggc

aaa

ctg

agc

ttt

gag

1308

Glu

Arg

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Pro

Asn

Gly

Lys

Leu

Ser

Phe

Glu

405

410

415

aag

gta

cag

cgg

acc

gac

agc

tgg

gat

gaa

tat

gta

agt

gat

ccc

aat

1356

Lys

Val

Gin

Arg

Thr

Asp

Ser

Trp

Asp

Glu

Tyr

Val

Ser

Asp

Pro

Asn

420

425

430

tca

cct

gtc

cct

tat

cag

gat

ggc

ata

caa

acc

agc

aga

acc

cgg

gaa

1404

Ser

Pro

Val

Pro

Tyr

Gin

Asp

Gly

Ile

Gin

Thr

Ser

Arg

Thr

Arg

Glu

435

440

445

tat

atg

atc

gat

gac

cag

cgt

ttt

gcc

tcg

cgc

aga

ccg

gat

gta

agg

1452

Tyr

Met

Ile

Asp

Gin

Arg

Phe

Ala

Ser

Arg

Pro

Asp

Val

Arg

450

455

460

gta

ttc

caa

aca

gag

ccc

ctc

agt

tcc

gac

ctt

aca

ctt

acc

ggc

ccg

1500

Val

Phe

Gin

Thr

Glu

Pro

Leu

Ser

Asp

Leu

Thr

Leu

Thr

Gly

Pro

465

470

475

480

gta

ttg

gcc

aaa

ctg

gtg

gta

tca

acc

aca

ggt

acg

gat

gca

gat

tat

1548

Val

Leu

Ala

Lys

Leu

Val

Ser

Thr

Gly

Thr

Asp

Ala

Asp

Tyr

485

490

495

gtg

gta

aaa

ctg

ata

gat

gta

tat

ccg

gaa

gat

aca

cca

aat

cct

gta

1596

Val

Lys

Leu

Ile

Asp

Val

Tyr

Pro

Glu

Asp

Thr

Pro

Asn

Pro

Val

500

505

510

cct

aac

cct

aaa

aac

ctg

atc

atg

ggt

tac

cag

atg

ctg

gta

cgc

1644

Pro

Asn

Pro

Lys

Asn

Leu

Ile

Met

Gly

Gly Tyr

Gin

Met

Leu

Val

Arg

515

520

525

ggc

gag

atc

atg

cgt

gga

aaa

tac

cgt

aat

agc

ttt

gaa

aaa

ccc

gag

1692

Gly

Glu

Ile

Met

Arg

Gly

Lys

Tyr

Arg

Asn

Ser

Phe

Glu

Lys

Pro

Glu

530

535

540

PL 209 701 B1

cct Pro 545

ttt gtt cct

gga aca Gly Thr 550

att Ile

aca Thr

aaa gta

aac Asn 555

tat gcc ctt ccg gat

1740

Phe Val

Pro

Lys

Val

Tyr

Ala Leu

Pro

Asp 560

gta

gcc

cat

acc

ttt

aaa

ggc

cac

cgc

atc

atg

atc

cag

gtc

cag

1788

Val

Ala

His

Thr

Phe

Lys

Gly

His

Arg

Ile

Met

Ile

Gin

Val

Gin

565

570

575

aat

tea

tgg

ttt

ccc

ctg

gcc

gac

cgg

aat

cca

cag

ttt

atg

gac

1836

Asn

Ser

Trp

Phe

Pro

Leu

Ala

Asp

Arg

Asn

Pro

Gin

Phe

Met

Asp

580

585

590

att

tac

cag

gcc

gaa

cct

ggc

gat

ttc

aga

aaa

get

acg

cat

agg

atc

1884

Ile

Tyr

Gin

Ala

Glu

Pro

Gly

Asp

Phe

Arg

Lys

Ala

Thr

His

Arg

Ile

595

600

605

tle

cac

gat

gta

cac

aat

gca

tet

gca

att

acg

gta

aac

gta

ctg

aaa

1932

Phe

His

Asp

Val

His

Asn

Ala

Ser

Ala

Ile

Thr

Val

Asn

Val

Leu

Lys

610 615 620 cct taaaacggat gaaaccagta tattgtgcca tccttactt 1974

Pro

625 <210> 18 <211> 625 <212> białko <213> Pedobacter heparinus <400> 18

Met Thr Pro Phe Lys Ser Phe Ser Phe Ile Phe Leu Phe Ile Phe Thr 15 10 15

Ser Leu Ser Ala Ser Ala Gin Gin Ser Asp Ser Ala Tyr Ile Arg Gin 20 25 30

Asn Tyr Thr Lys Ile Glu Arg Leu Ile Pro Met Arg Asp Gly Ile Lys 35 40 45

PL 209 701 B1

Val Val Lys Leu Ile Asp Val 500

Tyr

Pro Glu Asp Thr Pro Asn Pro Val

505

510

Pro

Asn

Pro

Lys

Asn

Leu

Ile

Met

Gly

Tyr

Gin

Met

Leu

Vai

Arg

515

520

525

Gly

Glu

Ile

Met

Arg

Gly

Lys

Tyr

Arg

Asn

Ser

Phe

Glu

Lys

Pro

Glu

530

535

540

Pro

Phe

Val

Pro

Gly

Thr

Ile

Thr

Lys

Val

Asn

Tyr

Ala

Leu

Pro

Asp

545

550

555

560

Val

Ala

His

Thr

Phe

Lys

Gly

His

Arg

Tle

Met

Ile

Gin

Val

Gin

565

570

575

Asn

Ser

Trp

Phe

Pro

Leu

Ala

Asp

Arg

Asn

Pro

Gin

Pho

Met

Asp

580

585

590

Ile

Tyr

Gin

Ala

Glu

Pro

Gly

Asp

Phe

Arg

Lys

Ala

Thr

His

Arg

Ile

595

600

605

Phe

His

Asp

Val

His

Asn

Ala

Ser

Ala

Ile

Thr

Val

Asn

Val

Leu

Lys

610

615

620

Pro

625 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> sztuczny <220>

<223> starter 1 do konstruowania wektora ekspresyjnego dla act pochodzą cego z Pedobacter <400> 19 gggaattcca tatgactcct ttcaaatcgt tctccttc 38 <210> 20 <211> 30

PL 209 701 B1 <212> DNA <213> sztuczny <220>

<223> starter 1 do konstruowania wektora ekspresyjnego dla aet pochodzą cego z Pedobacter <400> 20 cccaagcttt taaggtttca gtacgtttac 30

<210>	21
<211>	17
<212>	DNA
<213>	sztuczny

<220>

<223> mieszanka startera 3 dla Aet <220>

<221> cecha zmienna <222> (9)..(9) <223> dowolna zasada <400> 21 athttygtnt aycarga 17 <210> 22 <21i> 2018 <212> DNA <213> Taxeobacter gelupurpurascens <220/ <221> sekwencja kodująca <222> (61)..(1995) <223>

<400> 22 ctgaatgtct gctgacgaat tggaactaca ttaggctcgt tcttcaccta cccttccact 60

PL 209 701 B1

108

atg

ccc tac

tct

ttc

ccg

aaa

gtt

gcc

ctg

agt

ggc

eta

ctg

gtg

Met

Pro Tyr

Ser

Phe

Pro

Lys

Val

Ala

Leu

Ser

Gly

Leu

Val

1

5

10

15

gcc

ggt

tta

tcc

ggt

gcc

cac

gcc

caa

act

cct

gtt

acc

tat

ccg

ctg

Ala

Gly

Leu

Ser

Gly

Ala

His

Ala

Gin

Thr

Pro

Val

Thr

Tyr

Pro

Leu

20

25

30

156

gct

tct

gag

gct

gaa

aaa

gcg

cag

ctg

gcg

gtg

gta

eta

gcc

gat

acg

Ala

Ser

Glu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gin

Leu

Ala

Val

Leu

Ala

Asp

Thr

35

40

45

204

gct

tac

atc

aag

gag

cgc

tat

acc

aaa

aca

gaa

tat

cag

att

ccg

atg

Ala

Tyr

Ile

Lys

Glu

Arg

Tyr

Thr

Lys

Thr

Glu

Tyr

Gin

Ile

Pro

Met

50

55

60

252

cgc

gat

ggg

gtg

aag

ttg

tac

acc

att

gtg

tac

gcg

ccc

aac gat

gcc

Arg

Asp

Gly

Val

Lys

Leu

Tyr

Thr

Ile

Val

Tyr

Ala

Pro

Asn Asp

Ala

65

70

75

80

300

aac aag

gta

aag

tac

cct

att

ctg

ctc

aac

cgt

acc

cct

tac

gct att

Asn Lys

Val

Lys

Tyr

Pro

Ile

Leu

Asn

Arg

Thr

Pro

Tyr

Ala Ile

85

90

95

348

ggc

CCC

tac

ggc

CCC

ggc

aaa

tac

aag

ctc

aac

ctg

ggc

ccc

agc

Gly

Pro

Tyr

Gly

Pro

Gly

Lys

Tyr

Lys

Leu

Asn

Leu

Gly

Pro

Ser

100

105

110

396

acg

atg

cat

gag

gga

Lac

atc

ttc

gcc

tac

cag

gat

gtg

cgt

ggg

Thr

Met

His

Glu

Gly

Tyr

Ile

Phe

Ala

Tyr

Gin

Asp

Val

Arg

Gly

115

120

125

444

ega

tat

atg

tcg

gaa

gga

gag

ttt

gtg

gat

gtg

cgc

CCC

gaa

aag

gac

Arg

Tyr

Met

Ser

Glu

Gly

Glu

Phe

Val

Asp

Val

Arg

Pro

Glu

Lys

Asp

130

135

140

492

atg cac

aaa ggc

aag

aac

gac

atc

gat

gaa

ggc

acc

gac

acc

tac

gat

Met His

Lys Gly

Lys

Asn

Asp

Ile

Asp

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Tyr

Asp

145

150

155

160

540

PL 209 701 B1

acc att gag tgg ctt ctg

aag cac ggg ccc aag aat aac ggc cgc gta

588

Thr

Ile

Glu

Trp

Leu 165

Leu

Lys

His

Gly

Pro 170

Lys

Asn

Gly

Arg 175

Val

ggc

cag

tgg

ggc

atc

tcc

tac

ccc

ggc

tac

tat

acc

get

act

ggc

eta

636

Gly

Gin

Trp

Gly

Ile

Ser

Tyr

Pro

Gly

Tyr Tyr

Thr

Ala

Thr

Gly

Leu

180

185

190

ctg

agc

cgc

cac

aag

gcc

eta

aag

gca

tcc

tea

ccg

cag

gcc

cct

att

684

Leu

Ser

Arg

Hi s

Lys

Ala

Leu

Lys

Ala

Ser

Pro

Gin

Ala

Pro

Ile

195

200

205

gcc

gac

tgg

ttc

tgg

gac

gat

ttt

cac

aac

ggc

gcg

ttc

ctg

732

Ala

Asp Trp

Phe

Trp

Asp

Phe

His

Asn

Gly

Ala

Phe

Leu

210

215

220

ccg

cac

get

ttc

aac

ttc

ctg

gcc

tcc

ttt

ggg

ctg

gcc

cgc

ccc

cag

780

Pro

Hi s

Ala

Phe

Asn

Phe

Leu

Ala

Ser

Phe

Gly

Leu

Ala

Arg

Pro

Gin

225

230

235

240

ccc

acg

cct

acc

ggc

aac

ccc

ggc

ttc

aag

cac

ggc

acc

ccc

gat

ggc

828

Pro

Thr

Pro

Thr

Gly

Asn

Pro

Gly

Phe

Lys

His

Gly

Thr

Pro

Asp

Gly

245

250

255

tac

gat

ttt

ttc

ctg

aag

atg

ggt

ccg

ctg

aaa

aac

get

gat

gcc

aac

876

Tyr

Asp

Phe

Leu

Lys

Met

Gly

Pro

Leu

Lys

Asn

Ala

Asp

Ala

Asn

260

265

270

tac

aaa

ggc

aaa

gtg

gcc

ttc

tgg

aac

gaa

atg

gcc

agc

cac

ccc

924

Tyr Tyr

Lys

Gly

Lys

Val

Ala

Phe

Trp

Asn

Glu

Met

Ala

Ser

His

Pro

275

280

285

aac

tac

gac

gaa

ttc

tgg

cag

gcc

cgt

aac

eta

cgc

ccc

cac

ctc

aag

972

Asn

Tyr

Asp

Glu

Phe

Trp

Gin

Ala

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

His

Leu

Lys

290

295

300

aac

ctc

aac

aaa

ggc

acc

gcg

gtg

ctc

acg

gtt

ggt

ggc

ttc

aat

gat

1020

Asn

Leu

Asn

Lys

Gly

Thr

Ala

Val

Leu

Thr

Val

Gly

Phe

Asn

Asp

305

310

315

320

PL 209 701 B1

gcc Ala

gag gac

ctg Leu

ttt ggc

gcc ctg aaa acc tac gaa age atc gag aag

1068

Glu

Asp

Phe 325

Gly

Ala Leu Lys Thr 330

Tyr

Glu

Ser

Ile

Glu 335

Lys

caa

aac

ccc

ggc

atg

cgc

aac

ggc

ctc

gtg

atg

ggg

ccg

tgg

gta

cac

1116

Gin

Asn

Pro

Gly

Met

Arg

Asn

Gly

Leu

Val

Met

Gly

Pro

Trp

Val

His

340

345

350

ggt

ggc

tgg

gcc

cgc

ggc

act

ggc

gaa

atg

gta

ggc

aat

gtg

gcc

tac

1164

G1 y

Gly

Trp

Ala

Arg

Gly

Thr

Gly

Glu

Met

Val

Gly

Asn

Val

Ala

Tyr

355

360

365

ggc

gag

tcg

ccg

tcg

ttg

tat

tac

cag

aag

cag

att

gaa

gcg

ccg

ttc

1212

Gly

Glu

Ser

Pro

Ser

Leu

Tyr

Gin

Lys

Gin

Ile

Glu

Ala

Pro

Phe

370

375

380

ttc

aaa

tca

tat

ctg

aag

gat

ggc

aaa

cct

gcc

get

acc

ccc

gag

get

1260

Phe

Lys

Ser

Tyr

Leu

Lys

Asp

Gly

Lys

Pro

Ala

Thr

Pro

Glu

Ala

385

390

395

400

acc

atc

ttt

gaa

age

ggc

acc

aac

cgc

tgg

cgc

age

ttc

gaa

acc

tgg

1308

Thr

Ile

Phe

Glu

Ser

Gly

Thr

Asn

Arg

Trp Arg

Ser

Phe

Glu

Thr

Trp

405

410

415

ccg

ccc

aaa

gaa

gcc

aaa

gag

cgc

act

ttg

tac

ttt

cag

tcg

gcc

ggg

1356

Pro

Lys

Glu

Ala

Lys

Glu

Arg

Thr

Leu

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Gly

420

425

430

aaa

atc

ggc

ttc

gag

aag

cct

gcc

agt

ggc

eta

gag

tac

gac

cag

ttc

1404

Lys

Ile

Gly

Phe

Glu

Lys

Pro

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Tyr

Asp

Gin

Phe

435

440

445

ctc

age

gac

ccg

get

cac

cca

gtg

cct

ttc

acc

gaa

get

acg

get

acg

1452

Leu

Ser

Asp

Pro

Ala

His

Pro

Val

Pro

Phe

Thr

Glu

Ala

Thr

Ala

Thr

450

455

460

ggc

atg

acc

cgc

gag

tac

atg

acc

gac

cag

cgc

ttc

gcc

age

cgc

Gly

Met

Thr

Arg

Glu

Tyr

Met

Thr

Asp

Gin

Arg

Phe

Ala

Ser

Arg

465

470

475

480

1500

PL 209 701 B1

PL 209 701 B1 acg ttg cgc gtt ctg taggccactc taaacaggct cgg 2018

Thr Leu Arg Val Leu

645

<210>	23
<211>	645
<212>	bial ko
<213>	Taxeobacter gelupurpurascens
<400>	23

Met Pro Tyr Ser Phe Pro Lys Val Ala Ala Leu Ser Gly Leu Leu Val 15 10 15

Ala Gly Leu Ser Gly Ala His Ala Gin Thr Pro Val Thr Tyr Pro Leu 20 25 30

Ala Ser Glu Ala Glu Lys Ala Gin Leu Ala Val Val Leu Ala Asp Thr 35 40 45

Ala Tyr Ile Lys Glu Arg Tyr Thr Lys Thr Glu Tyr Gin Ile Pro Met 50 55 60

Arg Asp Gly Val Lys Leu Tyr Thr Ile Val Tyr Ala Pro Asn Asp Ala

70 75 80

Asn Lys Val Lys Tyr Pro Ile Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Ala Ile

90 95

Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Lys Tyr Lys Leu Asn Leu Gly Pro Ser Ser 100 105 110

Thr Met Met His Glu Gly Tyr Ile Phe Ala Tyr Gin Asp Val Arg Gly 115 120 125

Arg Tyr Met Ser Glu Gly Glu Phe Val Asp Val Arg Pro Glu Lys Asp 130 135 140

Met His Lys Gly Lys Asn Asp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Thr Tyr Asp 145 150 155 160

PL 209 701 B1

Thr Ile Glu Trp Leu Leu Lys His Gly Pro Lys Asn Asn Gly Arg Val 165 170 175

Gly Gin Trp Gly Ile Ser Tyr Pro Gly Tyr Tyr Thr Ala Thr Gly Leu 180 185 190

Leu Ser Arg His Lys Ala Leu Lys Ala Ser Ser Pro Gin Ala Pro Ile 195 200 205

Ala Asp Trp Phe Trp Asp Asp Phe His His Asn Gly Ala Phe Phe Leu 210 215 220

Pro His Ala Phe Asn Phe Leu Ala Ser Phe Gly Leu Ala Arg Pro Gin

225 230 235 240

Pro Thr Pro Thr Gly Asn Pro Gly Phe Lys His Gly Thr Pro Asp Gly

245 250 255

Tyr Asp Phe Phe Leu Lys Met Gly Pro Leu Lys Asn Ala Asp Ala Asn 260 265 270

Tyr Tyr Lys Gly Lys Val Ala Phe Trp Asn Glu Met Ala Ser His Pro 275 280 285

Asn Tyr Asp Glu Phe Trp Gin Ala Arg Asn Leu Arg Pro His Leu Lys 290 295 300

Asn Leu Asn Lys Gly Thr Ala Val Leu Thr Val Gly Gly Phe Asn Asp

305 310 315 320

Ala Glu Asp Leu Phe Gly Ala Leu Lys Thr Tyr Glu Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Gin Asn Pro Gly Met Arg Asn Gly Leu Val Met Gly Pro Trp Val His 340 345 350

Gly Gly Trp Ala Arg Gly Thr Gly Glu Met Val Gly Asn Val Ala Tyr 355 360 365

Gly Glu Ser Pro Ser Leu Tyr Tyr Gin Lys Gin Ile Glu Ala Pro Phe 370 375 380

PL 209 701 B1

Gin Thr Phe Val Pro Asn Ile Phe Glu Ala Asp Glu Lys Asp Phe Gin 610 615 620

Ala Ala Thr His Arg Leu Tyr His Ser Pro Ala His Ser Ser Gin Leu 625 630 635 640

Thr Leu Arg Val Leu 645 <210> 24 <211> 1931 <212> DNA <213> Cyclobacterium marinum <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (29)..(1888) <223>

<400> 24 cccaaagcat taacaaaata atttagtc atg aaa cac tgt tac aaa ctt ctg 52

Met Lys His Cys Tyr Lys Leu Leu 1 5

gtc Val

ttt tac aca

tta ttt ttg atg

acc aca aac

tgg gct tta tca caa

100

Phe Tyr 10

Thr

Leu Phe

Leu 15

Met

Thr

Asn

Trp 20

Ala

Leu

Ser

Gin

gcc

att

aat

gga

tat

gat

aag

gca

gcc

tat

gac

att

cct

atg

ega

gat

148

Ala

Ile

Asn

Gly

Tyr

Asp

Lys

Ala

Tyr

Asp

Ile

Pro

Met

Arg

Asp

25

30

35

40

gga

gtt

cac

ctt

cac

acc

atc

gtc

tat

agc.

ccc

aaa

gat

tta

tcg

cag

196

Gly

Val

His

Leu

His

Thr

Ile

Val

Tyr

Ser

Pro

Lys

Asp

Leu

Ser

Gin

45

50

55

ccc

tat

cct

ata

ttg

atg

caa

agg

aca

cct

tac

agc

gcc

ggc

cct

tat

244

Pro

Tyr

Pro

Ile

Leu

Met

Gin

Arg

Thr

Pro

Tyr

Ser

Ala

Gly

Pro

Tyr

60

65

70

PL 209 701 B1

292

ggt

cct

gga

aat

atg

aaa

aat

aag

ctt

ggc

cct

tct

cag

ttt

tta

atg

Gly

Pro

Gly

Asn

Met

Lys

Asn

Lys

Leu

Gly

Pro

Ser

Gin

Phe

Leu

Met

75

80

85

aac gat

ggc

tat

ata

ttt

gtt

tac

cag

gat

gta

aga

ggg

cgg

tgg

atg

Asn Asp

Gly

Tyr

Ile

Phe

Val

Tyr

Gin

Asp

Val

Arg

Gly

Arg

Trp

Met

90

95

100

340

tcg

gaa

gga

tcc

tat

gac

aac

atg

cgc

cct

acc

eta

tcc

aaa

tca

gaa

Ser

Glu

Gly

Ser

Tyr

Asp

Asn

Met

Arg

Pro

Thr

Leu

Ser

Lys

Ser

Glu

105

110

115

120

388

aga

aat

tcc

aac

caa

ata

gac

gaa

agc

aca

gac

acc

tat

gat

acc ata

Arg

Asn

Ser

Asn

Gin

Ile

Asp

Glu

Ser

Thr

Asp

Thr

Tyr

Asp

Thr Ile

125

130

135

436

gaa

tgg

ttg

ctc

gcc

aat

atc

aaa aat

cac

aat

gaa

aaa

gta

ggc

eta

Glu

Trp

Leu

Al a

Asn

Ile

Lys Asn

His

Asn

Glu

Lys

Val

Gly

Leu

140

145

150

484

tgg

gga

atc

agc

tat

CCC

gga

ttt

tat

agt

gct

gca

gcc

ctt

cct ttt

Trp

Gly

Ile

Ser

Tyr

Pro

Gly

Phe

Tyr

Ser

Ala

Leu

Pro Phe

155

160

165

532

gcc

cat

cca

aac

Ctg

aaa

gcc

gtt

tcc

cct

caa

gca

ccc

ata

ggg

gat

Ala

His

Pro

Asn

Leu

Lys

Ala

Val

Ser

Pro

Gin

Ala

Pro

Ile

Gly

Asp

170

175

180

580

ttt

tac

ttt

gat

ttt

cat

aac

ggt

gct

tac

tta

agt

tat

Phe

Tyr

Phe

Asp

Phe

His

Asn

Gly

Ala

Tyr

Leu

Ser

Tyr

185

190

195

200

628

tgg

ttg

gcc

act

tct

gtt

ttc

ggc

tac

caa

aaa

gac

ggc

cct

aca

cag

Trp

Leu

Ala

Thr

Ser

Val

Phe

Gly

Tyr

Gin

Lys

Asp

Gly

Pro

Thr

Gin

205

210

215

676

gaa

gca

tgg

tat

ggc

atg

gtg

aat

ccg

gaa

aca

aat

gac

ggc

tat

cag

Glu

Ala

Trp

Tyr

Gly

Met

Val

Asn

Pro

Glu

Thr

Asn

Asp

Gly

Tyr

Gin

220

225

230

724

PL 209 701 B1

772

ttt

atg

gat

atg

ggg

cca

tta

aaa

aat

gcc

gat

aaa

tgg

tat

ggt

Phe

Met

Asp

Met

Gly

Pro

Leu

Lys

Asn

Ala

Asp

Lys

Trp

Tyr

Gly

235

240

245

gaa

gac

aat

ttt

ttc

tgg

caa

ctt

aaa

aac

aat

cct

gat

tac

aac

Glu

Asp

Asn

Phe

Trp

Gin

Leu

Lys

Asn

Pro

Asp

Tyr

Asn

250

255

260

820

get

ttc

tgg

caa

aag

aga

agt

att

cct

cac

tta

aaa

gaa

gtg

aag

Ala

Phe

Trp

Gin

Lys

Arg

Ser

Ile

Pro

His

Leu

Lys

Glu

Val

Lys

265

270

275

280

868

cct

gca

gtt

tta

acc

gtt

ggg

ggc tgg

ttt

gat

gca

gaa

gat

ctc

tat

Pro

Ala

Val

Leu

Thr

Val

Gly

Gly Trp

Phe

Asp

Ala

Glu

Asp

Leu

Tyr

285

290

295

916

gga

cca

ctt

aca

att

tat

aaa

acc

att

gaa

aaa

aat

cct

gag

acc

Gly

Pro

Leu

Thr

Ile

Tyr

Lys

Thr

Ile

Glu

Lys

Asn

Pro

Glu

Thr

300

305

310

964

tac

aat

acc

att

gtc

atg

ggc

cct

tgg

tcc

cac gga

gat

tgg

tea

agg

Tyr

Asn

Thr

Ile

Val

Met

Gly

Pro

Trp

Ser

His Gly

Asp

Trp

Ser

Arg

315

320

325

1012

gaa

cct

gga

tea

cag

gtc

att

tea

aat

att

tat

ttt

ggt

gat

tet atc

Glu

Pro

Gly

Ser

Gin

Val

Ile

Ser

Asn

Ile

Tyr

Phe

Gly

Asp

Ser Ile

330

335

340

1060

tcc

aca

tgg

tat

caa

aaa

aat

ata

gaa

Cgt

gtt

ttt

ttc

aat

cat

ttt

Ser

Thr

Trp

Tyr

Gin

Lys

Asn

Ile

Glu

Arg

Val

Phe

Asn

His

Phe

345

350

355

360

1108

eta

aaa

gaa

tcc

gaa

aat

agc

aat

cct

gcc

ctt

cct

gaa

gcc

tac

atg

Leu

Lys

Glu

Ser

Glu

Asn

Ser

Asn

Pro

Ala

Leu

Pro

Glu

Ala

Tyr

Met

365

370

375

1156

ttt

gat

acc

gga

aaa

cat

aaa

tgg

gaa

aaa

ttt

gac

gat

tgg

cct

Phe

Asp

Thr

Gly

Lys

His

Lys

Trp

Glu

Lys

Phe

Asp

Trp

Pro

380

385

390

1204

PL 209 701 B1

1252

aaa

gaa

agc

caa

tgg

aaa

agc

ttt

tac

ttt

caa

gag

aaa

gga

gag

tta

Lys

Glu

Ser

Gin

Trp

Lys

Ser

Phe

Tyr

Phe

Gin

Glu

Lys

Gly

Glu

Leu

395

400

405

act

gag

gta

aca

cct

gag

gga

aat

agg

ttt

act

acc

tat

gtc

tca

gac

Thr

Glu

Val

Thr

Pro

Glu

Gly

Asn

Arg

Phe

Thr

Tyr

Val

Ser

Asp

410

415

420

1300

ccc

tct

aat

cct

gtc

ccc

tat

agt

caa

gat

att

aaa

eta

aac

ttc

act

Pro

Ser

Asn

Pro

Val

Pro

Tyr

Ser

Gin

Asp

Ile

Lys

Leu

Asn

Phe

Thr

425

430

435

440

1348

ccg

aga

aaa

tac

atg

gcc

gat

gac

cag

ega

ttt

gca

gcc

aga aga

ccg

Pro

Arg

Lys

Tyr

Met

Ala

Asp

Gin

Arg

Phe

Ala

Arg Arg

Pro

445

450

455

1396

gac

gta

ctg

acc

ttt

acg

agc

gaa

gta

tta

agt

caa

gac

atg

acg

ctt

Asp

Val

Leu

Thr

Phe

Thr

Ser

Glu

Val

Leu

Ser

Gin

Asp

Met

Thr

Leu

460

465

470

1444

gcg

ggg

gaa

gtc

atg

gca

aac

tta

aaa

gtt

gcc

act

tca

caa

act

gat

Ala

Gly

Glu

Val

Met

Ala

Asn

Leu

Lys

Val

Ala

Thr

Ser

Gin

Thr

Asp

475

480

485

1492

gct

gat

tgg

gta

gtt

aaa

atc

gat

a t a

ttt

ccc

gga

gat

cag

cca

Ala

Asp

Trp

Val

Lys

Ile

Asp

Ile

Phe

Pro

Gly

Asp

Gin

Pro

490

495

500

1540

aat

cat

gcc

tat

gtt

tta

gat

ggg

gtg

gac

atg

ggc

aat

tac

cac

eta

Asn

His

Ala

Tyr

Val

Leu

Asp

Gly

Val

Asp

Met

Gly

Asn

Tyr

His

Leu

505

510

515

520

1588

atg

gtt

cgt

tca

gag

gta

att

aga ggg

agg

tat aga

gaa

agt

ttt

gag

Met

Val

Arg

Ser

Glu

Val

Ile

Arg Gly

Arg

Tyr Arg

Glu

Ser

Phe

Glu

525

530

535

1636

ttt

cct

aaa

ccc

ttt

gtt

cct

gat caa

atc

act

gct

gtt

gat

ttc

agg

Phe

Pro

Lys

Pro

Phe

Val

Pro

Asp Gin

Ile

Thr

Ala

Val

Asp

Phe

Arg

540

545

550

1684

PL 209 701 B1

tta caa gat ctt Leu Gin Asp Leu	ttc cat act ttc aaa aag ggg cat aaa att caa	ata Ile	1732
Phe His	Thr Phe 560	Lys	Lys	Gly His	Lys 565	Ile	Gin
	555
caa	ata caa agt	act tgg	ttt ccc	eta	att	gat ega	aat	ccc	caa	aaa	1780
Gin	Ile Gin Ser	Thr Trp	Phe Pro	Leu	Ile	Asp Arg	Asn	Pro	Gin	Lys
	570		575			580
tat	gta caa aac	ata ttt	gaa gct	gag	gaa	gcc gat	ttt	gtc	aaa	gcc	1828
Tyr	Val Gin Asn	Ile Phe	Glu Ala	Glu	Glu	Ala Asp	Phe	Val	Lys	Ala
585		590				595				600
acc	cat agg gtt	ttt cat	aca gaa	aag	ttt	gcc agc	aaa	att	gaa	gta	1876
Thr	His Arg Val	Phe His	Thr Glu	Lys	Phe	Ala Ser	Lys	Ile	Glu	Val
		605			610				615
atg	gtt ctt cct	tagaattaga atggtttaaa atlactattt gtagcagaag	ata	1931
Met	Val Leu Pro
	620
<210> 25
<211> 620
<212> biał ko
<213> Cyclobacterium marinum
<400> 25
Met	Lys His Cys	Tyr Lys	Leu Leu	Val	Phe	Tyr Thr	Leu	Phe	Leu	Met
1		5			10				15
Thr	Thr Asn Trp	Ala Leu	Ser Gin	Ala	Ile	Asn Gly	Tyr	Asp	Lys	Ala
	20			25				30
Ala	Tyr Asp Ile	Pro Met	Arg Asp	Gly	Val	His Leu	His	Thr	Ile	Val
	35		40				45
Tyr	Ser Pro Lys	Asp Leu	Ser Gin	Pro	Tyr	Pro Ile	Leu	Met	Gin	Arg
	50		55			60
Thr	Pro Tyr Ser	Ala Gly	Pro Tyr	Gly	Pro	Gly Asn	Met	Lys	Asn	Lys
65		70				75				80

PL 209 701 B1

Gly Arg Tyr Arg Glu Ser Phe Glu Phe Pro Lys Pro Phe Val Pro Asp 530 535 540

Gin Ile Thr Ala Val Asp Phe Arg Leu Gin Asp Leu Phe His Thr Phe

545 550 555 560

Lys Lys Gly His Lys Ile Gin Ile Gin Ile Gin Ser Thr Trp Phe Pro

565 570 575

Leu Ile Asp Arg Asn Pro Gin Lys Tyr Val Gin Asn Ile Phe Glu Ala 580 585 590

Glu Glu Ala Asp Phe Val Lys Ala Thr His Arg Val Phe His Thr Glu 595 600 605

Lys Phe Ala Ser Lys Ile Glu Val Met Val Leu Pro 610 615 620 <210> 26 <211> 2036 <212> DNA <213> Psycloserpens burtonensis <220>

<221> sekwencja kodują ca <222> (61)..(1992) <223>

<400> 26 catattcgta aaatagctat aagtttttgt aaatttagtc aatcaaaatt ttaaatgtaa 60

atg

aag

act

ctt

ttt

aaa

ttg

ctc

eta

ttt

gta

ttt

gtt

eta

acg

Met

Lys

Thr

Leu

Phe

Lys

Leu

Phe

Val

Phe

Val

Leu

Thr

1

5

10

15

tct

tgt

aat

aag

gcc

aac

aaa

gac

gct

act

gaa

att

gtg

aaa

acc

gaa

Ser

Cys

Asn

Lys

Ala

Asn

Lys

Asp

Ala

Thr

Glu

Ile

Val

Lys

Thr

Glu

20

25

30

gta

gaa

gat

act

tac

gtt

aaa

gat

aat

tat

aac

aaa caa

gag

gtg

act

Val

Glu

Asp

Thr

Tyr

Val

Lys

Asp

Asn

Tyr

Asn

Lys Gin

Glu

Val

Thr

35

40

45

PL 209 701 B1

252

att

gaa

atg

cgc

gat

ggt

ata

aaa

ctt

cac

acg

acc

att

tat

tca

cca

Ile

Glu

Met

Arg

Asp

Gly

Ile

Lys

Leu

His

Thr

Ile

Tyr

Ser

Pro

50

55

60

aaa

gat

gaa

agt

cag

acc

tat

cct

att

tta

atg

aga

aca

cca

tat

Lys

Asp

Glu

Ser

Cln

Thr

Tyr

Pro

Ile

Leu

Met

Arg

Thr

Pro

Tyr

65

70

75

80

300

agt

tct

caa

cct

tat

ggt gac

aat

gag

ttt

aag

acg

aaa

att

ggt

cct

Ser

Gin

Pro

Tyr

Gly Asp

Asn

Glu

Phe

Lys

Thr

Lys

Ile

Gly

Pro

85

90

95

348

aat

gtt

cat

tta

atg

aaa

gaa

ggg

aat

att

gtt

gtg

tat

caa

gat

gta

Asn

Val

His

Leu

Met

Lys

Glu

Gly

Asn

Ile

Val

Tyr

Gin

Asp

Val

100

105

110

396

ega

ggt

cgt

tgg

atg

agt

gaa

ggt

gtc

tat

gat

aat

atg

cgt

gct

tat

Arg

Gly

Arg

Trp

Met

Ser

Glu

Gly

Val

Tyr

Asp

Asn

Met

Arg

Ala

Tyr

115

120

125

444

atc

cca

aat

aaa

aca

gag

gat

tct

caa

att

gat

gag

gca

tca

gac

act

Ile

Pro

Asn

Lys

Thr

Glu

Asp

Ser

Gin

Ile

Asp

Glu

Ala

Ser

Asp

Thr

130

135

140

492

tat

gac

acg

att

gac

tgg

ctg

gta

aat

aac

gta

gaa

aat

aac

ggg

Tyr

Asp

Thr

Ile

Asp

Trp

Leu

Val

Asn

Val

Glu

Asn

Gly

145

150

155

160

540

aat

gtt

ggt

act

tgg

gga

att

tca

tat

cct

ggt

ttt

tat

gct

aca

tat

Asn

Val

Gly

Thr

Trp

Gly

Ile

Ser

Tyr

Pro

Gly

Phe

Tyr

Ala

Thr

Tyr

165

170

175

588

tct

act

ata

gac

gca

cac

cca

gct

tta

aaa

gca

Leg

cct

caa gcg

Ser

Thr

Ile

Asp

Al a

His

Pro

Ala

Leu

Lys

Ala

Ser

Pro

Gin Ala

180

185

190

636

tgt

att

gga

gat

ttc

ttt

gac

gat

ttt

cat

aat

ggt

gct ttt

Cys

Ile

Gly

Asp

Phe

Asp

Phe

His

Asn

Gly

Ala Phe

195

200

205

684

PL 209 701 B1

tta tta Leu Leu

agt tat ttt aga

gca gtg tct tta ttt ggt acg aca aaa gat

732

Ser Tyr

Phe Arg

Ala Val Ser 215

Leu Phe

Gly 220

Thr

Lys

Asp

210

aaa

cct

aca

gat

tct

gct

tgg

tat

aag

ttt

cca

gaa

atg

aaa

aca

caa

780

Lys

Pro

Thr

Asp

Ser

Ala

Trp

Tyr

Lys

Phe

Pro

Glu

Met

Lys

Thr

Gin

225

230

235

240

gat

caa

tat

caa

ttt

ctt

gat

gct

gga

cct

tta

agt

aat

ttg

aac

828

Asp

Gin

Tyr

Gin

Phe

Leu

Asp

Ala

Gly

Pro

Leu

Ser

Asn

Leu

Asn

245

250

255

aag

tat

ttc

caa

tat

gac

aca

cca

gac

aca

tct

gta

tcc

aag

tct

876

Lys

Tyr

Phe

Gin

Tyr

Asp

Thr

Pro

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Lys

Ser

260

265

270

gat

agg

ata

gat

gtg

ttt

tgg

aaa

gaa

att

gta

gag

cat

cca

aac

924

Asp

Arg

Ile

Asp Asp

Val

Phe

Trp

Lys

Glu

Ile

Val

Glu

His

Pro

Asn

275

280

285

tac

gat

acg

ata

tgg

aaa

tct

aaa

ggt

tta

att

caa

aac

eta

aaa

gat

972

Tyr

Asp

Thr

Ile

Trp

Lys

Ser

Lys

Gly

Leu

Ile

Gin

Asn

Leu

Lys

Asp

290

295

300

att

aag

cca

agt

gta

gcg

aca

atg

att

gtg

gga

ggg

tta

ttt

gat

gcc

1020

Ile

Lys

Pro

Ser

Val

Ala

Thr

Met

Ile

Val

Gly

Leu

Phe

Asp

Ala

305

310

315

320

gaa

gat

tta

tat

ggg

cca

ttt

gaa

act

tat

aaa

acg

ata

gaa

aaa

cat

1068

Glu

Asp

Leu

Tyr

Gly

Pro

Phe

Glu

Thr

Tyr

Lys

Thr

Ile

Glu

Lys

Hi s

325

330

335

aat

cct

gat

aat

tat

aat

att

atg

gtt

ttt

ggg

cct

tgg

gat

cat

ggt

1116

Asn

Pro

Asp

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Val

Phe

Gly

Pro

Trp

Asp

His

Gly

340

345

350

cgt

tgg

gct

agg

agt

gac

gtt

aaa

aat

tat

gtt

gga

aat

tat

ttc

1164

Arg

Trp

Ala

Arg

Ser

Asp

Val

Lys

Asn

Tyr

Val

Gly

Asn

Tyr

Phe

355 360 365

PL 209 701 B1

1212

gga

gat

tet

ata

tet

eta

aaa

ttt

caa

cgt

gat

gtt

gaa

acg

aag

ttt

Gly

Asp

Ser

Ile

Ser

Leu

Lys

Phe

Gin

Arg

Asp

Val

Glu

Thr

Lys

Phe

370

375

380

ttt

aat

cat

ttt

tta

aaa

gga

aaa

ggc

gac

aag

aac

tea

ggg

tta

cca

Phe

Asn

His

Phe

Leu

Lys

Gly

Lys

Gly

Asp

Lys

Asn

Ser

Gly

Leu

Pro

385

390

395

400

1260

gaa

gca

tat

gta

ttt

gat

tet

ggt

aaa

aag

gaa

tgg

agt

agc

ttt

gac

Glu

Ala

Tyr

Val

Phe

Asp

Ser

Gly

Lys

Glu

Trp

Ser

Phe

Asp

405

410

415

1308

agc

tgg

cct

cca

aag

caa

gca

gaa

aaa

caa

gcc

atg

tat

ctt

aat

gcc

Ser

Trp

Pro

Lys

Gin

Ala

Glu

Lys

Gin

Ala

Met

Tyr

Leu

Asn

Ala

420

425

430

1356

aac

caa

gag

eta

tea

gat

tea

aaa

gga

aat

act

agt

gag

aca

ttt

Asn

Gin

Glu

Leu

Ser

Asp

Ser

Lys

Gly

Asn

Thr

Ser

Glu

Thr

Phe

435

440

445

1404

gtt

agt

gat

tta

aaa

cgc

cct

gta

cct

tat

tcc

gaa

gat

att

aaa

aca

Val

Ser

Asp

Leu

Lys

Arg

Pro

Val

Pro

Tyr

Ser

Glu

Asp

Tle

Lys

Thr

450

455

460

1452

gtt

ttc

aca

cca

ega

aaa

tac

atg

aca

gac

gat

cag

cgt

ttt

gca

Val

Phe

Thr

Pro

Arg

Lys

Tyr

Met

Thr

Asp

Gin

Arg

Phe

Ala

465

470

475

480

1500

ega

cgt

cct

gat

gtt

ctt

ata

ttt

gag

acc

gat

att

ctt

gag

gaa

gat

Arg

Pro

Asp

Val

Leu

Tle

Phe

Glu

Thr

Asp

Ile

Leu

Glu

Asp

485

490

495

1548

ata

acc

tta

get

ggt

gat

att

tta

gcg

cag

ctt

aat

gtg

tea

act

aca

Ile

Thr

Leu

Ala

Gly

Asp

Ile

Leu

Ala

Gin

Leu

Asn

Val

Ser

Thr

500

505

510

1596

ggg

aca

gat

gca

gat

tgg

att

gtc

aaa

ata

gta

gat

gtt

cat

cca gca

Gly

Thr

Asp

Ala

Asp

Trp

Ile

Yal

Lys

Ile

Yal

Asp

Val

His

Pro Ala

515

520

525

1644

PL 209 701 B1

gat gct Asp Ala 530

gag gag caa Glu Glu Gin

aaa gaa ggt atg caa gac cat tta tca atg agt

1692

Lys

Glu 535

Gly

Met

Gin Asp

His 540

Leu

Ser

Met

Ser

aat

tat

cat

ttg

atg

gtg

agg

agt

gaa

gtg

atg

cgc

ggt

cgt

ttt

aga

1740

Asn

Tyr

His

Leu

Met

Val

Arg

Ser

Glu

Val

Met

Arg

Gly

Arg

Phe

Arg

545

550

555

560

aat

agt

ttt

gaa

aac

cca

gag

cca

ttt

gtg

cca

aac

caa

cca

aca

gat

1788

Asn

Ser

Phe

Glu

Asn

Pro

Glu

Pro

Phe

Val

Pro

Asn

Gin

Pro

Thr

Asp

565

570

575

gtc

aat

atc

aag

tta

caa

gat

gta

cat

aca

ttt

aaa

ggt

cac

1836

Val

Asn

Ile

Lys

Leu

Gin

Asp

Val

His

Thr

Phe

Lys

Gly

His

580

585

590

aaa

tta

caa

gtg

caa

gtt

cag

agt

acg

tgg

ttt

cca

ctt

att

gat

ttg

1884

Lys

Leu

Gin

Val

Gin

Val

Gin

Ser

Thr

Trp

Phe

Pro

Leu

Ile

Asp

Leu

595

600

605

aac

ccg

caa

aca

ttt

gtg

cct

aat

att

tat

aaa

gca

aaa

gaa

agc

gat

1932

Asn

Pro

Gin

Thr

Phe

Val

Pro

Asn

Ile

Tyr

Lys

Ala

Lys

Glu

Ser

Asp

610 615 620

ttt

aaa

acc

caa

aca

cat

tcg

gtt

ttt

aac

gat

LcL

aaa

att

gag

ttt

Phe

Lys

Thr

Gin

Thr

His

Ser

Val

Phe

Asn

Asp

Ser

Lys

Ile

Glu

Phe

625

630

635

640

acg gtt ttg aaa taagagtaga tgactaaatt tgccaaggta gatttagtct tttt 2036 Thr Vai Leu Lys

<210>	27
<211>	644
<212>	biał ko
<213>	Psycloserpens burtonensis

<400> 27

Met Lys Thr Leu Phe Lys Leu Leu Leu Leu Phe Val Phe Val Leu Thr 15 10 15

PL 209 701 B1

Ser Cys Asn Lys Ala Asn Lys Asp Ala Thr Glu Ile Val Lys Thr Glu 20 25 30

Val Glu Asp Thr Tyr Val Lys Asp Asn Tyr Asn Lys Gin Glu Val Thr 35 40 45

Ile Glu Met Arg Asp Gly Tle Lys Leu His Thr Thr Ile Tyr Ser Pro 50 55 60

Lys Asp Glu Ser Gin Thr Tyr Pro Ile Leu Met Met Arg Thr Pro Tyr

70 75 80

Ser Ser Gin Pro Tyr Gly Asp Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile Gly Pro

90 95

Asn Val His Leu Met Lys Glu Gly Asn Ile Val Val Tyr Gin Asp Val 100 105 110

Arg Gly Arg Trp Met Ser Glu Gly Val Tyr Asp Asn Met Arg Ala Tyr 115 120 125

Ile Pro Asn Lys Thr Glu Asp Ser Gin Ile Asp Glu Ala Ser Asp Thr 130 135 140

Tyr Asp Thr Ile Asp Trp Leu Val Asn Asn Val Glu Asn Asn Asn Gly

145 150 155 160

Asn Val Gly Thr Trp Gly Ile Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Tyr

165 170 175

Ser Thr Ile Asp Ala His Pro Ala Leu Lys Ala Ala Ser Pro Gin Ala 180 185 190

Cys Ile Gly Asp Phe Phe Phe Asp Asp Phe His His Asn Gly Ala Phe 195 200 205

Leu Leu Ser Tyr Phe Arg Ala Val Ser Leu Phe Gly Thr Thr Lys Asp 210 215 220

Lys Pro Thr Asp Ser Ala Trp Tyr Lys Phe Pro Glu Met Lys Thr Gin 225 230 235 240

PL 209 701 B1

Val Phe Thr Pro Arg Lys Tyr Met Thr Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ala

465 470 475 480

Arg Arg Pro Asp Val Leu Ile Phe Glu Thr Asp Ile Leu Glu Glu Asp

485 490 495

Ile Thr Leu Ala Gly Asp Ile Leu Ala Gin Leu Asn Val Ser Thr Thr 500 505 510

Gly Thr Asp Ala Asp Trp Ile Val Lys Ile Val Asp Val His Pro Ala 515 520 525

Asp Ala Glu Glu Gin Lys Glu Gly Met Gin Asp His Leu Ser Met Ser 530 535 540

Asn Tyr His Leu Met Val Arg Ser Glu Val Met Arg Gly Arg Phe Arg

545 550 555 560

Asn Ser Phe Glu Asn Pro Glu Pro Phe Val Pro Asn Gin Pro Thr Asp

565 570 575

Val Asn Ile Lys Leu Gin Asp Val His His Thr Phe Lys Lys Gly His 580 585 590

Lys Leu Gin Val Gin Val Gin Ser Thr Trp Phe Pro Leu Ile Asp Leu 595 600 605

Asn Pro Gin Thr Phe Val Pro Asn Ile Tyr Lys Ala Lys Glu Ser Asp 610 615 620

Phe Lys Thr Gin Thr His Ser Val Phe Asn Asp Ser Lys Ile Glu Phe

Claims

1. Sposób wytwarzania β-estru a-L-aspartylo-L-fenylo-alaninowego, obejmujący otrzymywanie β-estru a-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego z a,e-diestru kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny w obecności enzymu, znamienny tym, że enzym selektywnie wiąże L-fenyloalaninę z miejscem a-estru a,e-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, a enzym stanowi białko wytwarzane przez mikroorganizm, przy czym białko jest wybrane spośród (A) do (X):

(A) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 616 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji, (B) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 616 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem a-estru a,e-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (C) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 21 do

619 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji, (D) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 21 do 619 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem a-estru a,e-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (E) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 625 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji, (F) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 625 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem a-estru a,e-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (G) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 645 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji, (H) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 645 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem a-estru a,e-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (I) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 26 do

620 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji, (J) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 26 do 620 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem a-estru a,e-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (K) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 18 do 644 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji, (L) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 18 do 644 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem a-estru a,e-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (M) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji, (N) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem a-estru a,e-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (O) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji,

PL 209 701 B1 (P) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, dełecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy

Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (Q) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji, (R) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (S) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji, (T) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (U) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji, (V) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe, (W) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji, (X) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że enzym pochodzi z hodowli mikroorganizmu lub komórki mikroorganizmu wyizolowanej z hodowli.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizm stanowi mikroorganizm z rodzaju wybranego z grupy składającej się z Aeromonas, Azotobacter, Alcaligenes, Brevibacterium,

Corynebacterium, Escherichia, Empedobacter, Flavobacterium, Microbacterium, Propionibacterium, Brevibacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Sphingobacterium, Streptomyces, Xanthomonas, Williopsis, Candida, Geotrichum, Pichia, Saccharomyces, Torulaspora, Cellulophaga, Weeksella, Pedobacter, Persicobacter, Flexithrix, Chitinophaga, Cyclobacterium, Runella, Thermonema, Psychroserpens, Gelidibacter, Dyadobacter, Flammeovirga, Spirosoma, Flectobacillus,

Tenacibaculum, Rhodotermus, Zobellia, Muricauda, Salegentibacter, Taxeobacter, Cytophaga, Marinilabilia, Lewinella, Saprospira i Haliscomenobacter.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (A) lub (B):

(A) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 616 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji, (B) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 616 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (C) lub (D):

(C) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 21 do 619 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji, (D) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 21 do 619 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (E) lub (F):

PL 209 701 B1 (E) bia łka o sekwecji aminokwasowej składają cej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 625 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji, (F) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 23 do 625 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy

Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (G) lub (H):

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (I) lub (J):

(I) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 26 do 620 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji, (J) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 26 do 620 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (K) lub (L):

(K) białka o sekwecji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 18 do 644 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji, (L) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych o numerze 18 do 644 sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (M) lub (N):

(M) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji, (N) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 6 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (O) lub (P):

(O) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji, (P) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, dełecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 12 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (Q) lub (R):

(Q) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji, (R) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 18 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

PL 209 701 B1

13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (S) lub (T):

(S) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji, (T) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 23 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (U) lub (V):

(U) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji, (V) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 25 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe,

15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmem jest stransformowany mikroorganizm, w którym zachodzi ekspresja białka (W) lub (X):

(W) białka o sekwecji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji, (X) białka o sekwecji aminokwasowej obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję i/lub inwersję jednego lub 2-50 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej opisanej w SEQ ID NO: 27 Listy Sekwencji i wykazującego aktywność do selektywnego wiązania L-fenyloalaniny z miejscem α-estru α,β-diestru kwasu L-asparaginowego poprzez wiązanie peptydowe.

16. Sposób według zastrz. 3 albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, znamienny tym, że stransformowanym mikroorganizmem jest Escherichia coli.

17. Sposób wytwarzania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-α-metylowego, znamienny tym, że obejmuje etap syntetyzowania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego sposobem wytwarzania β estru α-L-aspartylo-L-fenyloalaninowego określonym w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, albo 16 i etap, w którym prowadzi się reakcję przekształcania estru α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-β-metylowego w ester α-L-aspartylo-L-fenyloalanino-α-metylowy.