DE3787236T2

DE3787236T2 - Landwirtschaftliche Produkte und Methoden.

Info

Publication number: DE3787236T2
Application number: DE87306596T
Authority: DE
Inventors: Peter J Dart; K Prakash Hebbar
Original assignee: Stine Seed Farm Inc
Current assignee: Stine Seed Farm Inc
Priority date: 1986-07-28
Filing date: 1987-07-27
Publication date: 1994-04-28
Anticipated expiration: 2007-07-28
Also published as: ATE93682T1; CA1293701C; ES2044936T3; EP0255774A1; AU610511B2; DE3787236D1; AU7612887A; EP0255774B1

Description

Erfindungsbereich

Die vorliegende Erfindung betrifft biologische Verfahren und Produkte, die in der Landwirtschaft verwendbar sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle von Pilzkrankheiten bei Pflanzen, vorzugsweise jenen Krankheiten, die durch einen Pilz der Gattung Fusarium hervorgerufen werden, betrifft weiters bestimmte biologische, zur Verwendung bei einem solchen Verfahren brauchbare Kontrollmittel und betrifft biologische Mittel, die allgemein in der Landwirtschaft einsetzbar sind.

Grundlagen der Erfindung

Pilze der Gattung Fusarium sind für zahlreiche Krankheiten von Erntepflanzen auf der ganzen Welt verantwortlich. Diese Pilze sind besonders schädlich für Erntegetreide, wie etwa für Mais, Sorghum und Weizen. Beispielsweise können in jeder Gegend der Vereinigten Staaten, in der Mais angebaut wird, in jeder Saison aus praktisch jedem vegetativen oder reproduktiven Teil des Mais eine oder mehrere Arten von Fusarium isoliert werden. Eine besondere Art von Fusarium kann allein oder als Teil eines Komplexes von Fusarium-Arten oder von Pilzen anderer Gattungen vorkommen. Je nach dem Wetter, dem Boden und der speziellen Getreideart kann der Schaden an der Ernte vernachlässigbar bis außerordentlich groß sein. Üblicherweise tritt zum Beispiel bei Pflanzen, die von Fusarium befallen sind, dann eine Schädigung auf, wenn die Pflanze unter Streß gerät. Die durch Fusarium-Pilze hervorgerufenen Krankheiten sind u. a. Samenfäule (seedling blight), Wurzelfäule (root rot), Stengelfäule (stalk rot) und Ährenfäule (ear rot).
Fusarium moniliforme ist die am häufigsten auftretende und wirtschaftlich wichtigste Fusarium-Art, die bei Mais in den Vereinigten Staaten angetroffen wird, und ist die am häufigsten aus Schalengetreide isolierte Fusarium-Art. Samenverluste mit 100%-iger Infektion sind nicht selten. Diese Art ist auch die häufigste Ursache der Ährenfäule und ist an der Samenfäule und der Wurzelfäule beteiligt. Eine der wichtigsten Krankheiten, die in den Vereinigsten Staaten das Maisgetreide befällt, ist die Stengelfäule und F. moniliforme wird als der hauptsächliche Stengelfäule-Pilz in zumindest 10 Staaten angesehen: Florida, Idaho, Iowa, Minnesota, Nebraska, New Jersey, North Carolina, Pennsylvania, South Carolina und Virginia. Von F. roseum ist es auch bekannt, daß er ein Phytotoxin produziert.
Fusarium roseum wird weniger oft in den Maiskörnern angetroffen als F. moniliforme, der in erster Linie in den feuchten Bereichen des Maisgürtels östlich des Mississippi-Flusses und entlang der Atlantischen Küste auftritt. F. roseum ist der Verursacher der Ährenfäule und der Samenfäule und ist einer der wichtigen Verursacher für Stengelfäule in New England, Mid-Atlantic und den Nördlichen Maisgürtelstaaten. F. roseum produziert auch ein Mycotoxin in den Körnern und Stengeln.
Weitere Arten von Fusarium-Pilzen, die bei Maiskrankheiten von geringerer Bedeutung als F. moniliforme und F. roseum sind, sind u. a. F. tricinctum, F. oxysporum und F. soloni. Während diese Arten hauptsächlich als Teile von Krankheitskomplexen von Bedeutung sind, wurde von F. tricinctum berichtet, daß er Nycotoxine in Körnern und Stengeln produziert.
Von den Fusarium-Pilzen wird nicht angenommen, daß sie starke Pathogene sind. Im allgemeinen bilden sie stärkere Symptome und Ernteschäden nur dann, wenn die Pflanzen unter Streß stehen. Das Fortschreiten der Pilze in der Pflanze wird hauptsächlich durch die Art des auftretenden Stresses und das Ausmaß des Zellsterbens in dem Pflanzengewebe bestimmt. Fusarium-Pilze haben viele Getreidearten und Gräser als Wirt und entwickeln sehr wirksame Methoden zum Überleben im Boden oder in Pflanzenrückständen. Wo immer Gräser oder Getreide in den Vereinigten Staaten angebaut werden, ist immer eine Fusarium-Infektion der Samen, Wurzeln, Stengel oder Ähren möglich. Daher ist ein Verfahren zur Kontrolle einer Fusarium-Infektion bei Erntepflanzen äußerst wünschenswert. Vgl. allgemein: Fusarium: Diseases, Biol and Taxonomy (Herausg. P.E. Nelson, T.A Toussoun und R.J. Cook, 1981); Christensen und Wilcoxson (1966) Amer. Phytopathol. Soc. Monogr. Nr. 3, 5. 59; Koehler (1959) Illinois Agric. Exp. Stn. Bull. 639, S. 87, Koehler (1960) Illinois Agric. Exp. Stn. Bull. 658, S. 90.
Andere pflanzenpathogene Pilze, die eine kräftige Wirkung haben, sind u. a. Phythium spp., Phytophthora spp., Sclerotinia spp., Sclerotium spp., Rhizoctonia spp. und Golletotrichum spp . . Phythium spp. sind die Verursacher eines großen Krankheitsspektrums bei vielen Erntepflanzen, inklusive der Unfallkrankheit (damping off), dem Hohlstamm, der Stammfäule, Wurzelfäule und Welkekrankheit. Wichtige Stämme sind u. a. P. ultimum, P. debarynum und P. aphanidermatum. Phytophthora spp. hängen auch mit einer Vielzahl von Pflanzenkrankheiten, wie der Umfallkrankheit, der Blattfäule, mit Petiolen- und Stamminfektionen und Wurzelinfektionen zusammen. Pflanzenpathogene Stämme sind unter anderen Phytophthora porri, P. capsici, P. cryptogea, P. mexicana, P. cinnamomi (Wurzelverfall) und P. infestans (Späte Fäule in Tomaten). Sclerotinia spp., die Verursacher der Weißen Fäule, sind weit verbreitet und haben einen großen Wirtsbereich. Wichtige Pflanzenpathogene sind u. a. Sclerotinia sclerotiorum, S. minor und S. intermedia.
Sclerotium spp. und S. rolfsii stehen besonders im Zusammenhang mit der Stamm-Wurzel-Fäule und mit dem Mehltau (Southern blight). Diese Pathogene befallen viele Erntepflanzen, wie Reis, Erdnuß und Sonnenblume. Rhizoctonia spp. (echte Wurzeltöter) sind mit Wurzelfäule im Zusammenhang. Rhizoctonia sind das Mycelstadium von Basidiomyceten. Die Basidienstufe wird oft mit einer anderen Bezeichnung benannt. Rhizoctonia solani (Basidienstufe: Thanatephoris cucumeris) ist das wichtigste Mitglied dieser Gruppe, die insbesondere Getreide (Weizen und Hafer), Sonnenblume und Baumwolle befällt. Rhizoctonia violacea (Basidienstufe: Helicobasidium purpureum) ist der Verursacher der Violetten Wurzelfäule. Colletotrichum spp. sind mit Anthracnose-Krankheiten bei einer Reihe von Pflanzen im Zusammenhang. Colletotrichum graminicola befällt Getreide und Gräser; C. coccodes befällt Gemüse, inklusive Tomaten und Kartoffel; C. lagenarium befällt insbesondere Gurken und Melonen und C. lindemuthianum befällt die Phaseolus-Bohne.
Es wurden Versuche unternommen, die Pilzinfektionen von Pflanzen durch biologische Mittel unter Kontrolle zu bekommen. Beispielsweise wurde von Koedahl und Mew (1975) in Phytopathology 65 : 296-300 berichtet, daß drei Maishybride mit Bacillus subtilis und Chaetomium globosum überzogen wurden, um die Wirkung auf Sämlinge, Ernteertrag, Stengelfäule und Feldausbeute im Vergleich mit der chemischen Standard-Samenbehandlung, dem Captan, zu bestimmen. Die Stengelfäule und das Brechen treten weniger häufig bei Organismus-beschichteten und Captan-beschichtenen Samen auf im Vergleich zu nichtbeschichteten Samen. Die Kornausbeute war jedoch im allgemeinen bei den Captan-beschichteten Samen höher als bei den Organismus-beschichteten. Es wurde der Schluß gezogen, daß die Organismen nicht so beständig in ihrer Schutzwirkung der Pflanzen waren wie das Captan und daß noch weitere Forschungsarbeit notwendig wäre, bevor die Organismen in der Praxis zur Beschichtung von Maisgetreide verwendet werden können. Hinsichtlich einer weiteren Diskussion der biologischen Kontrolle von Pilzinfektionen bei Pflanzen vgl. allgemein: R J. Cook und K F. Baker: The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens (Amer. Phytopathol. Soc. 1983); K.F. Baker und R.J. Cook: Biological Control of Plant Pathogens (Amer. Phytopathol. Soc. 1982); Burges, H. D. (Herausg.) (1981) Microbial Control of Pests and Plant Diseases 1970-1980, Academic Press, New York, Baker (1968) Ann. Rev. Phytopathol. 6 : 263-294; Chang und Koedahl (1968) Phytopathology 58 : 1395-1401; Kommedahl und Chang, (1966) Phytopathology 56 : 885; Kommedahl et al. (1974) Ann. Proc. Am. Phytopathol. Soc. 1 : 46; Mew und Kommedahl (1972) Plant Dis. Rep. 56.861-863, Mitchell (1973) Soil Biol. Blochem. 5.721-728, Papavizas (1973) Soil Biol. Biochem. 5.709-720.
In Kawamoto und Lorbeer (1976) Plant Dis. Peptr. 60 : 189-191 wird berichtet, daß Zwiebelsämlinge vor der durch einen speziellen Stamm von Fusarium oxysporum verursachten Unfallkrankheit geschützt werden konnten, indem die Zwiebelsämlinge mit dem Stamm 64-22 von Pseudomonas cepacia Burck infiziert wurden. Von diesem Stamm (64-22) von P. cepacia wird berichtet, daß er aus der Wurzel, Wurzel-Stamm-Zone und dem Samenüberzug auf 18 Tage alten Sämlingen aus inokulierten Samen gewonnen wurde. Lebende Zellen von P. cepacia 64-22 sollen Fusarium oxysporum f. sp. cepae inhibiert haben, während tote Zellen und Kulturfiltrate dazu nicht imstande waren. Die Autoren gaben an, daß der Mechanismus, über welchen P. cepacia die jungen Sämlinge schützt, nicht geklärt war. Die Autoren schlossen daraus, daß die berichteten Versuche zumindest die Machbarkeit von biologischen Kontrollmaßnahmen zur Verbesserung der Standfestigkeit von Zwiebelsämlingen belegten, daß jedoch "derzeit noch nicht empfohlen werden konnte, die Zwiebelsamen im kommerziellen Anbau mit P. cepacia zu infizieren . . . .", wahrscheinlich weil manche P. cepacia-Stämme den Ruf haben, für Zwiebel pathogen zu sein.
R.D. Lumsden berichtet in einem Abstract in Phytopathology 72 : 709 (1982), daß ein Stamm von P. cepacia ein Antagonist zu Phythium aphanidermatum ist und Gurkensämlinge vor einer Infektion durch diesen Pilz im Boden schützt. In der US-Patentanmeldung Ser. Nr. 500 043, angemeldet am 1. Juni 1983 von R.D. Lumsden und Myron Sasser (nun US-A-4 588 584), wird der Schutz von Gurken und Erbsen vor einer Phthium-Erkrankung durch Verwendung eines neuen Biotyps von P. cepacia mit der Bezeichnung SDL-POP-S-1 beschrieben. Der Schutz erfolgt durch bakterielle Inokulierung der Samen.
Ein anderer Stamm von Pseudomonas cepacia schützte die China-Aster gegen die von Fusarium oxysporum f. sp. callistephi verursachte Welkekrankheit im Glashaus und bei Felduntersuchungen (T. D. Cavileer und J. L Peterson, Abstract Nr. 522, American Phytopathological Society Annual Meeting, 1985).
Kommedahl und Mew, supra, berichteten auch, daß Captan bei der Samenbehandlung allgemein verwendet wurde, da es verläßlich, leicht aufzubringen und preiswert ist. Es wurde jedoch auch berichtet, daß Captan nicht immer und unter allen Bedingungen für die Samenbehandlung günstig ist. Insbesondere Kommedahl und Mew, supra, berichteten, daß sich unter verlängerten Bedingungen mit niedriger Bodentemperatur und hohem Feuchtigkeitsgehalt des Bodens die biologische Kontrolle im Verhältnis zu Captan bei der Bekämpfung von Wurzelinfektionen als überlegen erwiesen hat. Dies wurde der möglichen Vervielfältigung und dem Wachstum der Organismen von den Samen zu der Wurzeloberfläche hin zugeschrieben. Daher ist es trotz der allgemeinen Wirksamkeit von Captan und den wenig wirtschaftlichen Aussichten für eine biologische Kontrolle durch den Bericht von Kommedahl und Mew, supra, in höchstem Maße wünschenswert, eine Methode der biologischen Kontrolle von Pilzinfektionen bei Erntegetreide, insbesondere bei Mais, zu entwickeln.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur biologischen Kontrolle von Pilzinfektionen in Pflanzen zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, biologische Bekämpfungsmittel für Verfahren zur Kontrolle von Pilzinfektionen in Pflanzen zur Verfügung zu stellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zum Inokulieren von Pflanzen sowie Bakterienstämme zur Verwendung in diesen Verfahren zur Verfügung zu stellen, wodurch Pflanzen vor Pilzinfektionen geschützt werden und dadurch die Pflanzenausbeute gesteigert wird.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, Bakterienstämme zur Verfügung zu stellen, die leicht in den Wurzeln oder der Rhizosphäre von Pflanzen kolonisieren.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, Bakterienstämme zur Verfügung zu stellen, die in Pflanzenblättern kolonisieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, einen Stamm eines Bakteriums zur Verfügung zu stellen, das leicht in einer Pflanze kolonisiert und als Vektor für die Einbringung eines von dem Bakterium gebildeten vorteilhaften Genproduktes in die Pflanze dienen kann.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verfahren und Bakterienstämme zur Verfügung gestellt, die Maispflanzen vor Pilzinfektionen schützen und die Maisausbeute steigern.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden im wesentlichen gereinigte neue Bakterienstämme von Pseudomonas cepacia, Typ Wisconsin, zur Verfügung gestellt. Dieser Typ von P. cepacia unterscheidet sich durch die folgenden Merkmale:
i. Fähigkeit zur Kolonisierung der Blätter und Wurzeln einer Vielzahl von Pflanzen.
ii. Breites Spektrum antifungischer Wirksamkeit.
iii. Fähigkeit zum Schutz der Pflanzen, die er kolonisiert, vor Pilzkrankheiten, insbesondere einer Krankheit, die durch einen Pilz der Gattung Fusarium hervorgerufen wird.
iv. Nicht-Phytopathogenität.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Schutz einer Pflanze vor einer durch einen Pilz hervorgerufenen Krankheit zur Verfügung gestellt, bei welchem die Pflanze mit einem Stamm von Pseudomonas cepacia, Typ Wisconsin, inokuliert wird. Bei noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein bakterienhältiges landwirtschaftliches Inokulum zur Verfügung gestellt, das zum Impfen einer Pflanze zur Einführung eines Bakterienstammes in die Pflanzenrhizosphäre, die Pflanzenwurzeln oder auf die Pflanzenoberfläche geeignet ist, welches enthält:
a. einen geeigneten, nicht phytopathogenen, nicht bakteriostatischen und nicht bakteriziden Träger und
b. einen Bakterienstamm, der die unterscheidenden Merkmale eines Stammes von Pseudomonas cepacia, Typ Wisconsin, aufweist.
Bei einer noch weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Substanzzusammensetzung zur Verfügung, die einen Pflanzensamen und einen Stamm von P. cepacia, Typ Wisconsin, enthält.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung der Größe des Sameninokulums auf die Gewinnung des Rif-resistenten Stammes 526 von P. cepacia aus 10 Tage alten primären Maiswurzeln zeigt. Die Bakterienzählung erfolgt in log&sub1;&sub0; (cfu/5cm der Wurzel). Die Größen des Inokulums reichen von 10 bis 10&sup7; Bakterien/Samen.
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Größe des Inokulums und der Gewinnung des Stammes 526 von P. cepacia aus der Rhizosphäre von 2 Wochen alten Maispflanzen zeigt. Die Bakterienzählungen sind in log&sub1;&sub0; (cfu/g Trockengewicht Wurzel oder Erde) angegeben. Die Größen des Inokulums reichen von 10 bis 10&sup7; Bakterien/Samen.
Fig. 3 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung von Sameninokulantien auf die Infektionsstärke durch F. moniliforme bei 2 Wochen alten Maissprossen zeigt. Stücke der Stammbasis (Mesocotyl) und des Wachstumspunktes (plumule) wurden auf Pilzinvasion untersucht.
Fig. 4 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung von verschiedenen Sameninokulantien auf die Stärke der gesamten Pilzinfektion von 2 Wochen alten Maissprossen zeigt. Stücke der Stammbasis (Mesocotyl) und des Wachstumspunktes (plumule) wurden auf Pilzinvasion untersucht.
Fig. 5 ist eine grafische Darstellung, die die Herabsetzung der Infektion von 2 Wochen alten Maiswurzeln durch sowohl Gesamtfungi (A) als auch F. moniliforme (B) für verschiedene Sameninokulantien zeigt.
Fig. 6 ist eine grafische Darstellung, die die Wurzelkolonisierung und die Herabsetzung der Pilzinfektion (Fusarium moniliforme) durch Sameninokulation von acht Stämmen von P. cepacia, inklusive P. cepacia Wisconsin 526, zeigt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt die Isolierung und Identifikation verschiedener Maiswurzel-kolonisierender Bakterien aus Proben von Wurzelgewebe und Rhizosphären-Erde. Unter diesen Wurzel-kolonisierenden Stämmen wurde eine Reihe nicht-fluoreszierender Pseudomonas-Stämme, die als zur Spezies Pseudomonas cepacia gehörend eingestuft wurden, als gute Koloniebildner der Wurzeln und Rhizosphäre von Mais identifiziert. Es wurde entdeckt, daß sich ein überraschend großer Prozentsatz aller isolierten Wurzel-kolonisierenden Bakterien als Antagonist des pflanzenpathogenen Pilzes Fusarium moniliforme erwies. Eine Vielzahl von Bakterienstämmen, inklusive Mitglieder der Gattung Pseudomonas, Bacillus und Enterobacter, erwies sich als Antagonist von Fusarium. Unter den pilzlichen Antagonisten waren die Wurzel-kolonisierenden Pseudomonas-Arten P. fluorescens und die nicht-fluoreszierende P. cepacia die häufigsten.
Eine andere überraschende Entdeckung der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung einer Gruppe von Maiswurzelisolaten von P. cepacia, die gute Kolonisatoren sowohl der Wurzeln und/oder der Rhizosphäre von Pflanzen als auch von Pflanzenblättern sind. Diese Stämme wurden aus Maiswurzelproben isoliert, haben jedoch unerwarteterweise eine Affinität zur Wurzelkolonisierung verschiedener Pflanzen, inklusive Sorghum, Sojabohne, Raps, Baumwolle, Taaek und Sonnenblume. Überraschender ist noch die Fähigkeit dieser Bakterien, Blätter verschiedener Pflanzen, inklusive Tabak, Streptocarpus und Baumwolle, zu kolonisieren. Zusätzlich dazu erwiesen sich diese Stämme als breites Spektrum pilzlicher Antagonisten mit einer Wirkung gegen Arten von Phytomycetes (Pythium spp. und Phytophthora spp.), Ascomycetes (Sclerotinia spp. und Sclerotium spp.), Basidiomycetes (Rhizoctonia spp.) und Fungi Iniperfecti (Fusarium spp. und Colletotrichum spp.).
Die zellfreien Überstände eines repräsentativen Stammes dieser Gruppe, P. cepacia 526, erwiesen sich als aktiv gegen Fusarium moniliforme, Saccharomyces carlsbergensis und gegen das Bakterium Streptomyces aureofaciens. Die Analyse des Kulturüberstands von P. cepacia 526 deutet auf die Anwesenheit von zumindest drei oder vier antibiotischen Substanzen. Zwei dieser Verbindungen wurden als Pyrrolnitrin und Aminopyrrolnitrin identifiziert, von denen es bekannt ist, daß sie antifungische und Antihefe-Aktivität besitzen und von denen früher berichtet wurde, daß sie von P. multivorans-Stämmen (nun P. cepacia genannt) produziert werden (Elander et al., 1968, Applied Microbiol. 16 : 753-758). Eine dritte und möglicherweise eine vierte antibiotische Komponente, die beide antifungische und Antihefe-Aktivität besitzen, wurde bis jetzt noch nicht identifiziert.
Weiters wurde gefunden, daß Stämme dieses Typs von P. cepacia jene Pflanzen, die sie kolonisieren, vor Pilzinvasion und Pilzinfektion schützen. Insbesondere schaffen diese Stämme von P. cepacia einen ausgezeichneten Schutz des Mais vor dem pathogenen Fusarium moniliforme, wenn sie als Inokulationsmittel auf Maissamen aufgebracht werden.
Diese die Pflanzen wirkungsvoll kolonisierenden Stämme von Pseudomonas wurden als Pseudomonas cepacia identifiziert, indem wohl etablierte Kriterien, die in Palleroni und Holmes (1981) Intl. J. System. Bacteriol. 31 : 479-481, und Palleroni (1984) "Pseudomonadaceae" in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 1, Krieg (Herausg.) Williams und Wilkins, London, S. 141-199, zusammengefaßt sind, angewendet wurden. Unähnlich vielen aus Pflanzen isolierten Stämmen von Pseudonionas cepacia sind die Organismen der vorliegenden Erfindung nicht pathogen für Zwiebel (Gonzales und Vidaver (1979) J. Gen. Microbiol. 110 : 161-170). Um diese Gruppe verwandter Stämme von den bekannten Stämmen von Pseudomonas cepacia zu unterscheiden, wurden die Organismen der vorliegenden Erfindung als Pseudomonas cepacia, Typ Wisconsin, bezeichnet. Dieser Typ von P. cepacia wird von anderen P. cepacia dadurch unterschieden, daß er gemeinsam die Eigenschaften guter Kolonisierung von Pflanzenwurzeln und/oder Rhizosphären und Kolonisierung von Pflanzenblättern, Nicht-Pathogenität für Zwiebel, ein breites Spektrum von Pilzantagonismen und die Fähigkeit zum Schutz von Pflanzen gegen Infektion und Invasion durch diese Pilze, insbesondere durch Pilze der Gattung Fusarium, besitzt.
Die vorliegende Erfindung stellt im wesentlichen gereinigte Kulturen von P. cepacia, Typ Wisconsin, zur Verfügung. Unter "im wesentlichen gereinigt" versteht man eine Kultur, die in erster Linie nur Bakterien des gegenständlichen Bakterienstammes enthält und frei von verunreinigenden Mikroorganismen, insbesondere anderen Stämmen von Bodenbakterien, ist. Diese Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, haben die oben angegebenen unterscheidenden Merkmale inklusive der nützlichen Eigenschaft, daß sie wirksame Kolonisatoren von Pflanzenwurzeln und -blättern sind. Diese Bakterienstämme können dann als Vektoren dienen, die in die Pflanze irgend ein wertvolles Genprodukt des Stammes einbringen. Solche wertvollen Produkte können jene sein, die normalerweise von dem Wildtyp-Bakterium produziert werden, oder sie können das Ergebnis einer genetischen Veränderung des Vektorstammes sein, beispielsweise durch eine einfache Mutation oder die Einführung von Fremdgenen. Die Fusarium-antagonistischen Wildtypenstämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, sind dazu verwendbar, die Pflanzen, die sie kolonisieren, gegen eine durch Fusarium verursachte Krankheit zu schützen. Die gleichzeitig hinterlegte US-Patentanmeldung (Stock et al., Ser. Nr. 891 305) beschreibt die Einführung von Fremdgehen, die für ein insektentoxisches Protein codieren, in Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, und beschreibt weiters die erfolgreiche Verwendung dieser genetisch veränderten Stämme zum Schutz der Pflanzen vor Insektenlarven.
Spezielle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die Stämme von Pseudominas cepacia, Typ Wisconsin, die in Tabelle 1 aufgezählt sind. Die aufgezählten Stämme sind unabhängige Isolate aus verschiedenen Proben von Maiswurzeln von mehreren verschiedenen Feldern mit einem langwährenden Einsatz als Maisanbaugebiet in der Samenversuchsfarm Jacques, in der Nähe von Prescott, Wisconsin (Osthälfte des nordöstlichen Viertels von Abschnitt 2, Township 26 Nord, Bereich 20 West, Pierce County, Wisconsin, USA). Alle diese Stämme haben die unterscheidenden Merkmale von P. cepacia, Typ Wisconsin. Die Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, werden durch zwei Arten von Koloniemorphologie gekennzeichnet: schleimig und glatt, Stämme 406, 531 und 462, und schleimig, runzelig werdend mit vertieftem Zentrum, Stämme 526 und 504. Die repräsentativen Stämme Pseudomonas cepacia 406 und 526 wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, am 19. September 1985 mit den Hinterlegungsnummern ATCC 53266 bzw. ATCC 53267 hinterlegt.

Tabelle 1:

Pseudomonas cepacia, Typ Wisconsin

Stamm¹ Quelle²
406 Stelle a, Jacques Maisparentallinie 1, ursprünglich isoliert auf Nähragar
526 Stelle a, Jacques Maisparentallinie 86, isoliert auf King's B Medium
462 Stelle a, Jacques Maisparentallinie 13, isoliert auf kombiniertem Kohlenstoffmedium
531 Stelle b, hybride Maislinie 7780, isoliert auf King's B Medium
504 Stelle b, hybride Maislinie 7780, isoliert auf kombiniertem Kohlenstoffmedium
¹ Alle unter Verwendung üblicher Kriterien als P. cepacia typisiert. Vgl. Palleroni und Holmes, 1981, und Bergey's Manual of Systematic Bacteriology VI (1984).
² Originales Wurzelmaterial wurde von den Versuchsfeldern von Jacques Seed Company, Prescott, Wisconsin, entnommen. Stelle a ist das Feld der Versuchsstation, auf dem seit 40 Jahren kontinuierlich Mais angebaut wird. Stelle b ist das Demonstrationsfeld in der samenverarbeitungsanstalt in Prescott, Wisconsin. Stelle a und Stelle b sind einige Kilometer voneinander entfernt. Tabelle 2: Inhibierung von Fusarium moniliforme auf Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) und Kings B (KB) Agar durch Rhizosphären-Bakterien (repräsentative Isolate). Identifiziert als Stamm Nr. Ursprung² Inhibierung¹ auf PDA KB Pseudomonas fluorescens Darling Downs Salinus Valley (USA) Wisconsin Pseudomonas putida Pseudomonas cepacia Kempsey (NSW) Pseudomonas paucimobilis Flavobacterium sp/CDC Bacillus sp. Actinomvcetes Enterobacter agglomerans Enterobacter cloacae Acinetobacter sp.
¹ Inhibierung von Fusarium moniliforme, + positiv, (+) schwach, 0 negativ
² Old - Queensland
NSW - New South Wales Tabelle 3: Isolierung von Stämmen von Pseudomonas cepacia, die in vitro Antagonisten gegen F. moniliforme sind, aus Maiswurzeln, gezüchtet in verschiedenen Erden und direkt aus dem Boden. Bodenart oder Ort Stamm Isolationsgeschichte 1a. Prescott, Wisconsin USA Jacques Versuchsfeld schlammiger Lehm Jacques Parentallinie 86, unsteriles Wurzelmazerat auf Kings B Medium² Jacques Parentallinie 1, unsteriles Wurzelmazerat auf kombiniertem Kohlenstoffmedium, 1983² parentallinie 13, unsteriles Wurzelmazerat Medium² b. Prescott, Wisconsin Jacques Hybrid 7780, Jacques Demonstrationsfeld 531¹ 2. Kairi Queensland, Austral. Rotbraun Ton-Lehmerde Cultivar QK487, ähnlicher Phänotyp: geld fluoresz 3. Kempsey, Frederick Town New South Wales, Austral. Schlammiger Lehm Cultivar GH5010, Rhizosphärenerde auf Nähragar, 1983 oberflächensterilisiertes Wurzelmazerat, Stämme ähnl. Phänotyp; mittl. Koloniegröße, weiß, schleimig, 1983 Tabelle 3 (Forts.) Bodenart oder Ort Stamm Isolationsgeschichte (Kempsey) CV GH5010, unsteriles Wurzelmazerat auf Nähragar, 1983 Wurzelwaschung Stämme 29 und 69, ähnlicher Phänotyp: gelb, fluoresz 4. Tulia, Texas Cultivar Tender Treat, Spermosphärenanreicherung
¹ Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin.
² Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, reisoliert aus Bodenproben, aus ursprünglichen Wurzelproben in Prescott, Wisconsin, entnommen. Diese Bodenproben waren drei Jahre unter Kühlung gelagert. Tabelle 4 Inhibition pathogener Pilze durch verschiedene Pseudomonas cepacia Pilzstämme a Bakterienstamm b Inhibitionszonen c a Pilzstämme; F119 Fusarium moniliforme, F120 und F130 Fusarium graminearum, F110 Fusarium oxysporum, F111 und F112 Sclerotinia sclerotiorum, F100 Macrophomina phaseolina, F104 Colletotrichum lindimuthanum, F113 Rhizoctonia solani b P. cepacia Stämme 526, 406, 64, 65, 205, 29 und 790, isoliert aus Mais-Rhizosphäre und Wurzeln; der Rest waren ATCC-Stämme c Gemessen nach der Beschreibung von Beispiel 2 in mm; Assays auf Kartoffel-Dextrose-Agar durchgeführt; ND = nicht bestimmt.
Alle Bakterien, die nach der Beschreibung von Beispiel 1 isoliert wurden, wurden anfänglich wie in Beispiel 2 auf Antagonismus gegen den Pilz Fusarium moniliforme gescreent. Wie in Tabelle 2 gezeigt, entwickelten die Stämme, die als P. fluorescens, P. cepacia, Bacillus sp. , Actinomycetes und Enterobacter agglomerans identifiziert wurden, eine antifungische Aktivität gegen dieses Fusarium. Die gegen Fusarium antagonistischen Stämme von P. cepacia wurde aus vielen untersuchten Proben gewonnen (Tabelle 3). Wurzelisolate von P. cepacia wurden unter Verwendung von in vitro-Plattenversuchen auf Inhibierung einer größeren Gruppe von Pilzen untersucht, wie in Tabelle 4 gezeigt ist. In jedem Fall hatten die Wurzelisolate von P. cepacia eine antifungische Aktivität gegen zumindest einen anderen der untersuchten Pilze. Die Stämme 526 und 406 von P. cepacia, Typ Wisconsin, waren besonders wirksam als Breitspektrum-Pilzantagonisten. Zusätzlich zu Fusarium moniliforme, waren P. cepacia 526 und 406 gegen die pflanzenpathogenen F. graminearum, F. oxysporum, Sclerotina sclerotium, Macrophomina phaseoli, Colletotrichum lindemuthianum und Phizoctonia solani wirksam (Tabelle 4). In weiteren Versuchen zeigten sich P. cepacia 526 und 406 als Antagonisten von Phytophthora cinnamomi, Pythium ultimum, Sclerotium rolfsii und Verticullium dahliae. In Tabelle 4 sind sechs ATCC-Stmme von P. cepacia im Vergleich zu Wurzelisolaten enthalten; nur die Hälfte dieser Stämme zeigte irgend eine antifungische Wirksamkeit. Bei den untersuchten ATCC-Stämmen erwies sich der Pilzantagonismus als nicht zusammenhängend mit der Ursprungsumgebung des Stammes.
Im vorliegenden Fall wurde Pflanzenpathogenität als Pathogenität gegen das Zwiebelgewebe von Zwiebeln definiert, da bekanntermaßen viele Stämme von P. cepacia mit Zwiebeln in Zusammenhang gebracht werden. Die Stämme von P. cepacia wurden durch Inokulieren des Zwiebelgewebes nach der Beschreibung von Beispiel 8 auf Zwiebelpathogenität untersucht. Isolate mit Ergebnissen von 2 oder mehr wurden als pathogene Stämme erachtet. Wie in Tabelle 8 gezeigt, waren manche der P. cepacia-Wurzelisolate (nicht die vom Typ Wisconsin), insbesondere der Stamm 64, gegen Zwiebel pathogen. Die Stämme 526 und 406 von P. cepacia erwiesen sich als nicht signifikant pathogen für Zwiebelgewebe.
Ein Mikroorganismus, der aus einer bestimmten Umgebung isoliert wurde, wird als ein solcher bezeichnet, der diese Umgebung kolonisiert. Daher sind Bakterien, die aus Pflanzenwurzeln isoliert werden, Wurzel-kolonisierende Bakterien. Die Fähigkeit eines Bakteriums, eine bestimmte Umgebung zu kolonisieren, kann auch als die Fähigkeit des Bakteriums aufgefaßt werden, sich in dieser bestimmten Umgebung nach der Einbringung in dieselbe zu vermehren oder dort zu überleben. Somit wird ein Bakterium, das sich nach dem Inokulieren in Blattgewebe einnistet und dort überlebt, als eines bezeichnet, das Blattgewebe kolonisiert. Die relative Fähigkeit von Bakterienstämmen, eine bestimmte Umgebung zu kolonisieren, kann in Versuchen gemessen werden, wie jenen, die in den Beispielen 3, 4 und 7 beschrieben sind. Zu Vergleichszwecken wurden in dieser Anmeldung die untersuchten Isolate, die von Pflanzenwurzeln oder Rhizosphären gewinnbar waren (nach zwei Wochen, Beispiel 3) bei einem Ausmaß von mehr als oder gleich etwa 106 Bakterien/g Wurzel oder Erde als gute Wurzel- oder Rhizosphrren-Kolonisatoren bezeichnet; solche Bakterien, die in Mengen zwischen etwa 10&sup5;-10&sup6; gewonnen werden, sind durchschnittliche Kolonisatoren und jene, die mit Mengen von unter 10&sup5; gewonnen werden, sind schlechte Kolonisatoren. Unter Verwendung dieser Kriterien wurden Wurzelisolate von Stämmen von P. cepacia, inklusive der Stämme 526 und 406 von P. cepacia, Typ Wisconsin, die Fusarium-Antagonisten sind, als gute Wurzel- und/oder Rhizosphären-Kolonisatoren eingestuft.
Es zeigte sich, daß P. cepacia 526 nach einer Sameninokulation die Spitzen-, Mitten- und Basisabschnitte der Wurzeln kolonisierte (Fig. 1). Hohe Mengen von P. cepacia 526 wurden aus unsterilem Wurzelmazerat, aus der Wurzelwaschmasse und Rhizosphärenerde gewonnen, was darauf hinweist, daß eine allgemeine Kolonisierung der gesamten Rhizosphäre stattgefunden hat Zwei Wochen nach der Sameninokulierung wird P. cepacia 526 nicht nur in hoher Anzahl aus den Wurzeln inokulierter Pflanzen gewonnen, sondern erwies sich auch als dominanter (etwa 99%) aerober Heterotroph, der aus inazerierten Wurzeln isolierbar ist.
Eine erfolgreiche Kolonisierung von Maiswurzeln durch P. cepacia 526 kann durch so geringe Sameninokulierungsmengen wie 10 Bakterien/Samen erreicht werden (Fig. 1 und 2). Diese Menge ist wesentlich geringer als die Bakterienmengen, die üblicherweise in solchen Inokula angewendet werden (10&sup7; bis 10&sup8; Bakterien/Samen).
Ein Vergleich der Wurzelkolonisierungsfähigkeit des guten Wurzelkolonisators P. cepacia 526 mit der von sechs AICC-Stämmen von P. cepacia (Ergebnisse in Tabelle 8 und in Fig. 6 aufgelistet) deutet darauf hin, daß alle untersuchten ATCC-Stämme gute bis durchschnittliche Kolonisatoren von Maiswurzeln und/oder Rhizosphären waren. Nach dem Wissen der Anmelderin wird von keinem der untersuchten ATCC-Stämme berichtet, daß er ein Wurzelisolat ist. Die ATCC-Stämme 29424 und 17616 sind in ihrer Kolonisierungsfähigkeit dem Stamm 526 von P. cepacia zumindest äquivalent. Es zeigte sich, daß die Stämme 526 und 406 von P. cepacia, Typ Wisconsin, die Wurzeln einer Vielzahl von Pflanzen kolonisieren (Tabelle 5). Diese Stämme sind gute Kolonisatoren von Mais, Sorghum, Sonnenblume, Alfalfa, Baumwolle, Erbse und Tomate und sind mittelgute Kolonisatoren für Raps und Sojabohne. Die Bestandigkeit dieser Stämme in den Wurzeln ist relativ gut mit Ausnahme von Alfalfa und Tomate, wo die Population von 526 und 406 mit der Zeit deutlich abnimmt. Tabelle 5: Populationen von P. cepacia, Typ Wisconsin (526 und 406), die aus den Wurzeln von Erntepflanzen im Anschluß an eine Sameninokulierung gewonnen wurden. Populationsgröße Log&sub1;&sub0; P. cepacia Zellen/g Wurzeltrockengewichta) Pflanzenart 2 Wochen 2 Monate Mais Sorghum TE Ölsamenraps Sonnenblume Weizen Alfalfa Baumwolle Sojabohne Franz. Bohne Erbse Tomate
a Die Werte stellen Mittelwerte von zwei Bodenarten und zwei Inokulum-Stämmen von P. cepacia (526 und 406) dar. Der anfängliche Inokulumgehalt lag bei etwa 10&sup7;/Samen.
Eine überraschende Erkenntnis der vorliegenden Anmeldung liegt darin, daß der gute Wurzelkolonisator Stamm 526 von P. cepacia, Typ Wisconsin, auch ein Kolonisator für Pflanzenblätter ist. Die Blattkolonisationsfähigkeit wurde nach der Beschreibung von Beispiel 7 erfaßt. P. cepacia 526 erwies sich als Kolonisator für Tabakblätter, Baumwollblätter und Blätter von Streptocarpus-Pflanzen. Die Fähigkeit des Stammes 526 zur Kolonisation von Blättern derart unterschiedlicher Pflanzen legt nahe, daß sich seine Blattkolonisationsfähigkeit auf viele Pflanzen erstreckt.
Der Schutz der Pflanzen vor Pilzinfektion und -invasion wurde hier festgestellt durch die Verwendung von Plattenassays hinsichtlich Pilzinvasion von Pflanzen, die aus mit Testbakterien inokulierten Samen gezüchtet wurden (Beispiel 5, Fig. 3-5 und Tabelle 4). Es zeigte sich, daß die Stämme 526, 406 und 64 von P. cepacia die Maispflanzen vor Invasion und Infektion durch Fusarium moniliforme schützten. Es zeigte sich weiters, daß Sameninokulation mit P. cepacia 526 ebenso wie mit P. cepacia 406 sowohl die Wurzeln als auch die Stengel von Pflanzen vor einer Pilzinvasion schützt. Im Vergleich mit einer Anzahl von P. cepacia-Stämmen erwiesen sich die Stämme von P. cepacia Typ Wisconsin (Fig. 6, Tabelle 7) als bessere Pilzschutzmittel für Pflanzen, wenn sie beispielsweise als Sameninokula aufgebracht wurden. Als besserer Schutz wird hier ein Schutz vor einer Fusarium-Invasion von mehr als 50% bezeichnet, wenn er durch die Verfahren nach Beispiel 5 bestimmt wird.
Eine mögliche Erklärung für die bessere Schutzwirkung für die Pflanzen durch Inokulation mit den Stämmen 526 und 406 ist der Pilzantagonismus in Kombination mit der guten Wurzelkolonisationsfähigkeit dieser Stämme. Jedoch führt die einfache Kombination antifungischer Aktivität mit guter Wurzelkolonisationsfähigkeit nicht in allen Fällen zu einem verbesserten Schutz vor einer Pilzinvasion. Beispielsweise kombiniert der Stamm P. cepacia ATCC 25416 eine gute Kolonisationsfähigkeit für Maiswurzeln mit Fusarium-Antagonismus, liefert jedoch keinen besseren Schutz der Pflanzen. Im Gegensatz dazu ergibt zum Beispiel der Stamm P. cepacia ATCC 17616 einen guten Schutz vor einer Fusarium-Invasion, wenn auch weniger als 526 und 406, obwohl dieser Stamm keine anti-Fusarium-Akktivität aufweist. Es wird angenommen, daß die Kolonisationsfähigkeit bei einem Stamm erforderlich ist, um zum Schutz einer Pflanze, auf welcher er inokuliert ist, vor Pilzinvasion und -infektion befähigt zu sein. Pilzantagonismus ist, zumindest in der Art, wie er in vitro durch Platteninhibitionsassays geprüft wird, für einen Stamm nicht absolut erforderlich, um einer Pflanze Schutz vor Pilzen zu gewähren. Die Fähigkeit eines Bakterienstammes zum Schutz einer Pflanze vor einer Pilzinvasion ist somit eine unabhängige Eigenschaft, die zur Stammkennzeichnung verwendbar ist.
Antifungische Aktivität, Maiswurzelkolonisation, Maisschutz vor Fusarium-Infektion und Zwiebel-Pathogenität von P. cepacia-Wurzelisolaten und P. cepacia ATCC-Stämmen werden in Tabelle 8 und in Fig. 6 verglichen. Der Stamm 526 von P. cepacia, Typ Wisconsin, erwies sich als unterschiedlich von den untersuchten P. cepacia-Stämmen. Er unterscheidet sich von den Stämmen 64-22 durch Nicht-Pathogenität gegenüber Zwiebeln. Der Stamm SDL- POP-S-1 von P. cepacia (der von Lumsford und Sasser, US-Patentanmeldung 500 043, angemeldet am 1. Juni 1983, als Pythium-Antagnist beschrieben wurde) erwies sich als unterschiedlich von den Stämmen 526 und 406 von P. cepacia, Typ Wisconsin. Der Stamm SDL-POP-S-1 produziert ein verbreitbares Pigment, das unter UV-Licht (gelb-grün) fluoresziert und bei den in vitro Plattenassays F. moniliforme nicht inhibiert.
Die Wurzel-kolonisierenden Pilz-antagonistischen Bakterienstämme werden durch Anwendung der Screening-Verfahren der Beispiele 1 und 2 reproduzierbar isoliert. Ein wichtiger, jedoch nicht begrenzender Faktor bei der anfänglichen Isolierung einer großen Zahl von Pilzantagonisten ist vermutlich die Auswehl der Maiswurzel- und Maisfelderde-Proben von solchen Feldern, die für viele Jahre zum Anbau von Mais verwendet worden waren. Beispielsweise wurde auf dem Maisfeld in der Jacques Versuchsstation 40 Jahre lang kontinuierlich Mais angebaut. Die Tatsache, daß die Wurzel-kolonisierenden Pilz-antagonistischen Bakterienstämme leicht von verschiedenen geographischen Plätzen isolierbar sind, legt nahe, daß diese Organismen weit verbreitet sind.
Die Wurzel-kolonisierenden Pilz-Antagonisten von P. cepacia, inklusive der Stämme, die als P. cepacia Typ Wisconsin unterschieden werden, können auch leicht und reproduzierbar aus Wurzel- und/oder Rhizosphären-Bodenproben isoliert werden, indem anfangs eine Verdünnungsaufstrich der Proben auf einem für P. cepacia selektiven Medium erfolgt. Ein solches Medium wurde von Burbage et al. (1982) Phytopatholcgy 72 : 706 beschrieben. Die Wurzel-kolonisierenden Stämme von P. cepacia, die durch dieses anfängliche Aufstreichen ausgewählt wurden, werden dann gemäß Beispiel 2 auf ihre anti- Fusarium-Aktivität gescreent. Prinzipiell könnte für dieses Screenen jeder Pilz verwendet werden. Die entstehenden Selektionen sind Wurzel-kolonisierende Pilz-Antagonisten von P. cepacia. Bevorzugt ist es, wenn Kolonisationsfähigkeit und Schutz vor Pilzen an den entstehenden Isolaten bestätigt werden.
Dieses Selektions/Screening-Verfahren wurde zur neuerlichen Isolierung von Stämmen von P. cepacia Typ Wisconsin aus der Erde des Maisfeldes von Prescott, Wisconsin, das bei der ursprünglichen Isolierung verwendet wurde, herangezogen. Diese Bodenprobe wurde während mehr als drei Jahren unter Kühlung gelagert. Sieben Isolate, die durch biochemische, ernährungsmäßige und andere Kriterien als Stämme von P. cepacia identifiziert wurden, wurden durch selektive Plattierung gewonnen. Alle diese Isolate inhibierten Fusarium moniliforme bei den in vitro Plattenassays und es existiert unter diesen Isolaten zumindest ein Stamm, der die unterscheidenden Merkmale von P. cepacia, Typ Wisconsin, aufweist.
Ein primärer Verwendungszweck der Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Inokulieren einer Pflanze, um dieser einen gewissen Vorteil zu verleihen, wie die Inhibition von solchen Pilzerkrankungen, die durch Fusarium-Pilze hervorgerufen werden. Da die Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung Kolonisatoren der Rhizosphäre und/oder des Wurzelgewebes der Pflanzen darstellen, ist es nur notwendig, daß sie in der Nachbarschaft der Samen oder jungen Pflanzen ausreichend nahe aufgebracht werden, um eine Kolonisation ergeben zu können. Bevorzugt ist es, wenn die Bakterienstämme gemäß der vorliegenden Erfindung in der Nachbarschaft der Samen zum Pflanzungszeitpunkt aufgebracht werden, um eine Wurzelkolonisation zu errichten. Das kann entweder durch direkte oder durch indirekte Inokulierung der Samen zum Zeitpunkt des Pflanzens erfolgen.
Unter direkter Inokulierung versteht man, daß die inokulierenden Bakterien direkt auf die Samen aufgebracht werden, bevor dieselben auf dem Feld ausgesät werden. In der einfachsten Form kann das durch Besprühen der Samen mit oder Eintauchen derselben in eine flüssige Kultur erfolgen, die einen Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung enthält. Dadurch erhält man einen Pflanzensamen, der mit einer das Bakterium enthaltenden Zusammensetzung beschichtet ist. Ein bevorzugtes Verfahren zur direkten Inokulation besteht in der Pelletierung des Samens mit einem Träger, der den gewünschten Stamm von P. cepacia enthält. Im allgemeinen wird das Bakterium auf einen Träger aufgebracht und dann wird ein Pellet geformt, wobei der Träger den Samen umgibt. Es sind dem Fachmann zahlreiche verschiedene Träger bekannt, die umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf Torf, Erde, Calciumcarbonat (viele Formen), Dolomit, Gips (verschiedene Qualitäten), Bentonit (und andere Tonmineralien), Rohphosphat (und andere Phosphorverbindungen), Titandioxid, Humus, Talkum, Alginat und Aktivkohle. Jeder dem Fachmann bekannte, für die Landwirtschaft geeignete Träger ist im Prinzip verwendbar. Oft ist es wünschenswert, in dem Pellet eine Klebesubstanz vorzusehen, um den bakterienhältigen Träger an den Samen zu binden. Die Fachwelt kennt zahlreiche Klebematerialien, von denen manche umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf synthetische Leime, Leime pflanzlichen Ursprungs (wie Gummi arabicum), Gelatine, verschiedene Zucker und Bienenhonig. Im allgemeinen sollte der feste Träger nahe dem neutralen pH-Wert liegen und fein gemahlen sein (d. h. zumindest etwa 90% gehen durch ein 300-mesh-Sieb). Pelletierte Samen, die die erfindungsgemäßen Mikroorganismen enthalten, können direkt auf das Feld ausgesät werden.
Ein typisches Inokulans gemäß der vorliegenden Erfindung wird hergestellt, indem man Gummi arabicum (30% Gew./Vol.) mit dem Bakterienstamm in einem feingemahlenen (durch 300 mesh hindurchgehenden) Torfträger mischt. Diese Mischung wird dann mit den Samen vermengt, beispielsweise in einer Menge von 400 g pro 20 kg Samen oder genügend Samen, um 1 ha zu säen.
Eine Alternative zur direkten Sameninokulierung ist die indirekte Sameninokulierung; d. h. ein landwirtschaftliches Inokulum, das ein Pakterium gemäß der vorliegenden Erfindung in einem geeigneten Träger enthält, wird zum Zeitpunkt des Säens in die Nähe der Samen aufgebracht. Der Träger kann entweder fest oder flüssig sein, wobei dem Fachmann zahlreiche Träger bekannt sind. Das grundlegende Erfordernis ist, daß der Träger weder phytotoxisch, bakteriostatisch noch bakterizid ist. Ein Beispiel eines flüssigen landwirtschaftlichen Inokulums ist einfach ein Stamm von P. cepacia, Typ Wisconsin, in einem flüssigen Wachstumsmedium, das auf die Pflanzreihe aufgesprüht wird, wenn der Samen gepflanzt wird. Feste Träger können viele der Materialien umfassen, von denen angegeben wurde, daß sie zur Pelletierung von Samen geeignet sind. Beispielsweise besteht eine beliebte Methode darin, in Wasser suspendierten Torf als Träger für das Bakterium zu verwenden und diese Mischung auf die Pflanzreihe in der Furche neben und auf den Samen aufzusprühen, wenn diese gepflanzt werden. Ein anderes Beispiel eines festen landwirtschaftlichen Inokulums ist ein Granulat, das Calciumsulfat- Hemihydrat und Carboxymethylcellulose enthält und auf das eine Bakterienbrühe aufgesprüht wird. Ein noch weiteres Beispiel eines festen Inokulums ist granulierter Torf, der mit einem Bakterium inokuliert wurde und in die Samenfurche beim Auspflanzen im Bereich des Samens aufgebracht wird. Andere Beispiele von festen Inokula sind Quarzsand und Marmorchips, die mit einer Torfkultur des Bakteriums überzogen sind. Es ist auch bekannt, Nährstoffe, wie Milchpulver oder Saccharose in das feste Granulat des Inokulums einzuarbeiten.
Die Stämme von P. cepacia Typ Wisconsin gemäß der vorliegenden Erfindung kolonisieren auch Pflanzenblätter und sind daher als Vektoren verwendbar, die vorteilhafte Produkte in die Pflanzenblätter übertragen. Um einen Blatt-kolonisierenden Stamm auf einem Blattgewebe zu etablieren, ist es notwendig, die Blätter mit einer geeigneten landwirtschaftlichen Zusammensetzung, die den gewünschten Stamm enthält, zu inokulieren. Derartige Blatt-Inokulantien können prinzipiell zu jeder Zeit während des Wachstums der Pflanze aufgebracht werden. Eine besonders vorteilhafte Methode zur Inokulierung von Pflanzenblättern ist das Aufsprühen entweder von flüssigen oder teilchenförmigen Inokulierungszusammensetzungen auf die Pflanzenblätter. Zum Aufsprühen geeignete Inokulierungszusammensetzungen umfassen im allgemeinen einen versprühbaren landwirtschaftlichen Träger, wie Wasser, der lebende Zellen des gewünschten Bakterienstammes enthält. Oft ist es wünschenswert, Netzmittel, Imulgiermittel oder Haftmittel einzubauen, um die Anwendbarkeit zu verbessern. Es kann auch wünschenswert sein, Bakteriennährstoffe oder andere Additive zuzusetzen, die die Lebensfähigkeit des Inokulums aufrecht erhalten. Wieder müssen alle Bestandteile einer derartigen Zusammensetzung nicht-toxisch für die Pflanzen und das Bakterieninokulum sein, dürfen weiters das Bakterienwachstum nicht inhibierten (nicht bakteriostatisch sein) und dürfen das Blattwerk der Pflanzen nicht schädigen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird angenommen, daß der durchschnittliche Fachmann mit den grundlegenden Verfahren der landwirschaftlichen Inokulierung vertraut ist. Vgl. z. B. Brockwell in Methods for Evaluating Biological Nitrogen Fixation, S. 417-488 (F. J. Bergersen, Herausg. 1980); Burton in Biological Nitrogen Fixation Technology for Tropical Agriculture, S. 105-114 (Herausg. P. H. Graham und S. Harris, 1980); Roughley in Ibid., S. 115-127; Brockwell in Nitrogen Fixation in Legumes, S. 211-227 (Herausg. J.M. Vincent, 1982); Kremer et al., (1982) Soil Sci. Soc. Ant J. 46 : 539-542; Kremer et al., (1983) Appl. Env. Microbiol. 45 : 1790-1794; Brockwell (1962) Aust. J. Agr. Res. 13 : 638-649; Bergersen et al., (1958) J. Aust. Inst. Agric. Sci. 24 : 158; Hastings et al., (1962) N. Z. J. Agr. 104; 330; Fraser (1966) J. App. Bacteriol. 29 : 587-595; Schiel et al., (1970) Rev. Invest. Agrospec. Ser. 2 7 : 239; Iswaran et al., (1971) Zentralbl. Bakteriol. Parasitenk. Infektionskr., Abt. II, 126 : 43; Iswaran et al., (1971) Zentralbl. Bakteriol. Parasitenk. Infektionskr., Abt II, 126 : 45.
Die folgenden Beispiele sind allein zum Zweck der Erläuterung angegeben und sollen den Rahmen der Erfindung keineswegs beschränken. Da Veränderungen der folgenden Beispiele für den Fachmann auf diesem Gebiet eindeutig sind, wird angenommen, daß diese Erfindung nur durch den Rahmen der angeschlossenen Ansprüche begrenzt wird.

Beispiel 1: Isolierung von Rhizosphären-Bakterien

Dieses Beispiel zeigt die Isolierung von Bakterien aus Rhizosphärenerde und Wurzeln von Maispflanzen.
Maiswurzeln und Maisfelderde wurden von verschiedenen geographischen Orten (Tabelle 3), verschiedenen Stellen innerhalb dieser Orte und verschiedenen Maispflanzen-Kultivaren gesammelt. Innerhalb dieser Orte wurden sowohl alte als auch junge Wurzelproben entnommen. Die Proben der Maiswurzeln und die mitgenommene, lose haftende Rhizosphärenerde wurden einzeln verpackt und in das Genetics Department, Research School of Biological Sciences, Australian National University, Canberra, Australien, gebracht, wo eine Unterteilung der Proben und die Isolationsverfahren vorgenommen wurden.
Die folgenden Probenunterteilungsverfahren wurden durchgeführt:
Rhizopshärenerde - Erde, die lose an den Wurzeln haftet und abgeschüttelt werden kann.
Einfaches Wurzelwaschen - Erde, die durch sorgfältiges Waschen unter rinnendem Leitungswasser entfernt wird.
Ausführliches Wurzelwaschen - Nachdem die Phizosphärenerde abgeschüttelt war, wurden die Wurzeln (2-5 g) in 100 ml sterile Fahraeus Nährlösung mit 20 g 2 mm Glaskugeln eingebracht und 15-20 min bei 250 Upm in einem Orbitalschüttler geschüttelt.
Unsterilisiertes Wurzelmazerat - Wurzeln nach beiden Wurzelwaschbehandlungen wurden in 100 ml steriler Fäbraeus Nährlösung 30-40 sec in einem Mixer mazeriert.
Sterilisiertes Wurzelmazerat - Die Zeit für die Oberflächensterilisation differierte für alte Wurzeln und Wurzeln von 2 Wochen alten Sämlingen:
a. Für alte Wurzeln - Nach den Wurzelwaschbehandlungen wurden die Wurzeln in 3% Wasserstoffperoxid (BDH Analar) 10 min unter konstantem Schütteln bei 250 Upm oberflächensterilisiert und anschließend 3 bis 4 mal mit sterilem Wasser gewaschen. Die Wurzeln wurden dann in 4% Natriumhypochlorit (PDH) übertragen und 30 min unter konstantem Schütteln bei 250 Upm oberflächensterilisiert. Dann wurden die Wurzeln in sterilem Wasser 3 bis 4 mal gewaschen, um das restliche Hypochlorit vor der Mazerierung zu entfernen.
b. Für junge Wurzeln - Gleich wie oben, mit Ausnahme dessen, daß die wurzeln in 3% Wasserstoffperoxid 10 min und anschließend 15 min in 4% Natriumhypochlorit oberflächensterilisert wurden. Die Wirksamkeit der Oberflächensterilisation wird mit einem Rolltest auf einer Nähragarplatte geprüft.
Die Wurzelwaschmaterialien und Wurzelmazerate wurden serienmäßig in 4,5 ml Fähraeus Medium (Vincent (1970), A Manual for the Practical Study of Root Nodule Bacteria, Blackwell) verdünnt und es wurde 0,1 ml auf Nähragar (NA, Difco) (1,5% Agar, pH 6,8-7,0), auf Kings B-Medium (1,5% Agar, pH 7, 2) (King et al., (1954) J. Lab. Clin. Med. 44 : 301-307) und auf ein komplexes Kohlenstoffmedium (Rennie (1981) Can. J. Microbiol. 27 : 8-14) mit Verdünnungen von 10&sup4; bis 10&sup8; aufgestrichen. Die Platten wurden 48 bis 72 Stunden bei 30ºC bis 33ºC inkubiert und die Kolonien ausgezählt. Die meisten aeroben heterotrophen Erdakterien wachsen auf Nähragar, während Kings B-Medium für fluoreszierende Pseudomonaden selektiv ist. Unterschiedliche Bakterienisolate wurden aus diesen Aufstrichen durch Selektieren der Kolonien mit unterschiedlichen Merkmalen der Koloniemorphologie ausgewählt. Die Selektionen wurden durch Aufstreichen auf NA gereinigt und die gereinigten Selektionen wurden in NA-Stabs bei Raumtemperatur und 4ºC gelagert. Es zeigte sich, daß die Bakterienzählungen (NA) in den Wurzelwaschmassen und bei den unsterilen Wurzelmazeratbehandlungen (etwa 10&sup9; cfu/g trockenes Wurzelgewicht) am höchsten waren. Diese Unterproben waren die bevorzugte Quelle für Wurzel-kolonisierende Bakterien.
Die folgenden Medien wurden bei der Isolation und/oder beim Screenen der Bakterienisolate verwendet:

Nähragar

Nährbrühe (Difco) 8 g
Agar 15 g
Wasser (entionisiert) 10000 ml
pH 6,8-7,0

King B Medium (King et al., 1954)

Protease Pepton (Difco) 20 g
Glycerin 8 ml
K&sub2;HPO&sub4;·3H&sub2;O 1,5 mg
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 1,5 g
Gereinigter Agar (Oxoid) 15 g
Wasser (entionisiert) 1000 ml
pH 7,2

Fahraeus Medium (Vincent, 1970, A Manual for the Practical Study of Root- Nodule Bacteria, Blackwell)

mg/l
CaCl&sub2;·2H&sub2;O 100
NgSO&sub4;·7H&sub2;O 120
KH&sub2;HPO&sub4; 100
Na&sub2;HPO&sub4;·12H&sub2;O 150
Eisen(III)citrat 1,5 m
Spurenelementlösung 1 ml
pH 6, 5

Spurenelementlösung (Gibson (1963) Aus. J. Biol. Sci. 16 : 28-42)

g/l
H&sub3;BO&sub3;y 2,86
MnSO&sub4;·4H&sub2;O 2,08
ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 0,22
CuSO&sub4;·5H&sub2;O 0,08
H&sub2;MoO&sub4;·H&sub2;O 0,09

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt das Screenen der Rhizosphären-Isolate von Beispiel 1 hinsichtlich Inhibierung des Wachstums von Fusarium-Pilzen.
Gereinigte Rhizosphären-Isolate wurden auf Platten mit Kings B-Medium und Kartoffel-Dextrose-Agar (Difco) mit einem Zahnstocher als Spots aufgebracht und bei 30ºC bis 33ºC inkubiert, um die Entwicklung der Bakterienisolate zu ermöglichen. Nach 24 Stunden wurden die Platten mit Hilfe eines Parfumsprühers mit einer Sparensuspension von F. moniliforme besprüht. Die Sporensuspension wurde dadurch hergestellt, daß mit F. moniliforme infizierte Nelkenblattstücke in 10 ml sterilem Wasser geschüttelt wurden. Die mit den Sporen inokulierten Platten wurden dann 48 bis 72 Stunden bei 28ºC inkubiert und jene Bakterienisolate, die um sich eine pilzfreie Zone zeigten, wurden als positiv hinsichtlich der Inhibition gegen Fusarium bewertet. Die Inhibition reichte von schwach, wo das Pilzmyzel nicht über den Bakterienfleck wächst, bis zu stark, wo eine 3 bis 6 mm Inhibitionszone rund um den Bakterienfleck besteht.
Der Prozentsatz der Bakterienisolate, die Inhibition von F. moniliforme zeigten, variierte je nach der Erde, aus der sie isoliert worden waren 37% von Darling Dawns Isalaten, 20% von Wisconsin Isolaten, 29% von Kempsey Isolaten und 11% von Kairi Isolaten zeigten Platteninhibition von F. moniliforme.
Unter Verwendung üblicher Kriterien, wie Kolonie-Morphologie, Gram- Färbung und einem Spektrum biochemischer Tests (beispielsweise API-Zone - analytischer Profilindex), wurden die Rhizosphären-Isolate, die Antagonismus gegen Fusarium zeigten, typisiert. Tabelle 2 gibt eine repräsentative Liste von Fusarium-inhibierenden Bakterien, die aus den Maiswurzeln aus verschiedenen Erden isoliert worden waren. Die Inhibition auf den Platten variiert je nach dem verwendeten Medium. Einige wenige Stämme, Pseudomonas fluorescens (916, 611 und 508), Pseudomonas cepacia (516, 406, 64), Bacillus sp. (1023) und Actinomycetes (1032), zeigten Inhibition sowohl auf Kartoffel-Dextrose-Agar als auch auf Kings B-Agar. Das Spektrum der inhibierenden Bakterien variierte in Abhängigkeit von der Art des Bodens. Tabelle 6 gibt eine Aufzählung dieser Typen und ihrer Stärken in einigen der verschiedenen untersuchten Erden. Maiswurzelisolate aus Wisconsin-Böden zeigten große Stärken bei verschiedenen Spezies von Pseudomonas. Die Inhibition ist wahrscheinlich auf die Produktion von inhibitorischen Substanzen durch den Mikroorganismus zurückzuführen. Tabelle 6: Anzahl der Bakterien, die für Fusarium moniliforme antagonistisch sind, aus Wurzeln und Rhizosphäre von Maispflanzen. Stamm identifiziert als Inhibition¹ Zählungen/g Frischgewicht aus Wisconsin Kempsey Darling Downs Pseudomonas putida fluorescens cepaciaFlavcbacterium Bacillus Actinomycetes Acinetobacter EnterobacterND = Nicht bestimmt
¹ Inhibition von Fusarium moniliforme; + positiv, (+) schwach, 0 negativ, (+)/0 manche Isolate schwach, andere negativ.

Beispiel 3: Screening der Rhizosphärenkolonisation

Dieses Beispiel zeigt ein Screening hinsichtlich der Fähigkeit für Wurzel- oder Rhizosphärenkolonisation, das an den in Beispiel 2 identifizierten Fusarium-Antagonisten durchgeführt wurde.
Um die Kolonisation durch Bakterien zu bewerten, war es notwendig, Stämme mit einem selektierbaren Marker zu verwenden. Mutanten mit einer spontanen Rifampicin-Resistenz aus Bakterienisolaten mit Inhibition von Fusarium moniliforme auf Platten wurden mit Konzentrationen von 50 bis 100 ug Rifampicin/ml selektiert. Die spontan Rifampicin-resistenten Mutanten wurden auf Beibehaltung ihrer antifungischen Aktivität geprüft, bevor die Wurzelkolonisationstests durchgeführt wurden.
Für die Kolonisations-Topftests wurden Maissamen mit 4% Natriumhypochlorit 20 bis 30 min oberflächlich sterilisiert und dann 3 bis 4 mal mit sterilem Wasser gewaschen. Die Samen wurden auf halbfestem Fahraeus Medium- (0,5%)-Agar (Vincent 1970) 24 Stunden bei 33ºC vorkeimen gelassen. Die Samen wurden entweder mit Brühe oder mit Torfinokuliert. Für die Brühen-Inokulierung wurden die vorgekeimten Samen in einer Näbrbrühenkultur der späten log-Phase (ca 1 · 10&sup9;/ml) 10 bis 15 min eingeweicht und in 25 cm Töpfen, die mit Erde gefüllt und auf Feldkapazität begossen waren, aufgesät. Für die Torf-Inokulierung wurden die Samen mit einer Aufschlämmung beschichtet, die durch Mischen von 1 g einer Torf-Kultur der antagonistischen Bakterien mit 1,5 g einer Klebelösung (1,1 g Methylcellulose in 60 ml Wasser) hergestellt worden war. Die Samen wurden dann wie oben auf die Töpfe ausgesät.
Rhizosphärenerde, Wurzelwaschmaterial und Wurzelmazerate von 2 Wochen und 2 Monate alten Maispflanzen aus inokulierten Samen wurden auf selektivem Medium (Nähragar plus Rifarnpicin mit 100 ug/ml) aufgestrichen und die Zahlungen erfolgten nach 48 bis 72 Stunden Inkubation. Die Bakterienisolate wurden in Abhängigkeit von ihrer Gewinnung aus Maisrhizosphärenerde und Wurzeln als gute oder schlechte Kolonisatoren eingestuft. Isolate, die mit Gehalten von weniger als etwa 10&sup5;/g Wurzel oder Erde gewonnen werden, werden als schlechte Kolonisatoren bezeichnet, solche mit 10&sup5;-10&sup6; als durchschnittliche Kolonisatoren und solche mit 10&sup7;-10&sup8;/g Wurzel oder Erde als gute Kolonisatoren. Die meisten Bakterienisolate zeigten ziemlich gute Kolonisation nach den ersten zwei Wochen ihres Wachstums, doch die Zahlen nahmen nach 2 Monaten ab. Pseudomonas cepacia 406 und 526 sowie Enterobacter agglomerans 621 zeigten gute Kolonisation, während Enterobacter clcacae 900, Flavobacterium 403 und 1002, Pseudomonas fluorescens A12, 508, 608 und 976, Pseudomonas putida 920 und 963 und Acinetobacter 902 mittlere bis schlechte Kolonisatoren waren. Pseudomonas fluorescens 916, Bacillus und Actinomycetes waren schlechte Kolonisatoren. Die Stämme 406 und 526 von P. cepacia wurden für weitere Studien und zur Kennzeichnung ausgewählt

Beispiel 4: Wurzel und Rhizosphären-Kolonisationsversuche.

Dieses Beispiel demonstriert die Wirksamkeit der Kolonisation in einer kompetitiven Situation für einen der in Beispiel 3 als gute Kolonisatoren eingestuften Stämme, nämlich P. cepacia 526. Die Tests von Beispiel 3 zeigten, daß P. cepacia ein guter Kolonisator auf Mais ist, wenn er in relativ hohen Ausmaßen inokuliert wird. Die folgenden Versuche zeigen die Veränderung der Kolonisationsfähigkeit von P. cepacia 526 als Funktion der Größe des Inokulums. Diese Versuche belegen, wie gut P. cepacia mit natürlichen Erdisolaten um die Wurzelkolonisation konkurriert.
Die Maissamen wurden 5 bis 10 min in Brühekulturen der Rif-resistenten Mutante von P. cepacia getaucht, wobei die Kulturen auf 10&sup7;, 10&sup5;, 10³ und 10¹ Zellen/ml eingestellt waren. Die Samen wurden dann in 700 g rohe, nicht sterile Erde in Kunststoffrohren eingesetzt. Nach 10 Tagen oder 2 Wochen Wachstum wurden die inokulierten Pflanzen geerntet und die Bakterienpopulation der Rhizosphärenerde, die Wurzelwaschmasse und das unsterile Wurzelmazerat wurden durch Aufstreichen auf Rif-haltigem Medium (100 ug Rif/ml) geprüft.
Fig. 1 zeigt die Bakterienzählungen (Rif-resistente Kolonien) von Portionen der primären Wurzeln nach 10 Tagen Sämlingswachstum P. cepacia 526 wurde aus den Wurzelspitzen gewonnen, selbst wenn die Konzentration des anfänglichen Brühen-Inokulums, in das die Samen getaucht worden waren, nur 10 Bakterien/ml betrug. Es bestand keine signifikante Differenz in den Ergebnissen zwischen Inokulum-Konzentrationen von 1 · 10&sup5;, 1 · 10³ und 10 Organismen/ml, doch bei der Behandlung mit einem Inokulum von 1 · 10&sup7;/ml waren die Zählungen etwas höher. Die Basalregion der primären Wurzeln zeigte höhere Zählungen als der Mittelbereich oder die Region der Wurzelspitzen.
Fig. 2 zeigt die Gewinnung von P. cepacia 526 (als Rif-resistente Kolonien) aus Rhizospärenerde, Wurzelwaschmassen und unsterilisierten Wurzelmazeraten von 2 Wochen alten Sämlingen nach der Inokulierung der Maissamen. Ein Inokulumgehalt von 1 · 10&sup7; Bakterien pro ml zeigte schwach höhere Zahlungen als die anderen Behandlungen, zwischen welchen keine signifikanten Unterschiede zu beobachten waren. Die Gewinnung von P. cepacia 526 aus den Wurzelwaschmassen und den unsterilen Wurzelmazeraten wer reichlicher als die aus der Rhizosphärenerde.
Zur Bestimmung des Prozentsatzes von P. cepacia 526 in der Gesamtpopulation wurden Wurzelmazerate auf Nähragar mit und ohne Antibiotika ausgestrichen. Die inokulierenden Stämme machten etwa 99% der gesamten aeroben heterotrophen Population des Wurzelmazerates aus. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Kolonisation festgestellt, wenn das Inokulum auf der Basis einer Brühe oder auf Torfbasis erstellt war. P. cepacia 526 ist ein guter Wurzelkolonisator, selbst wenn er in niedrigen Inokulumkonzentrationen aufgebracht wird.

Beispiel 5: Schutz der Pflanzen gegen Fusarium

Dieses Beispiel demonstriert die Fähigkeit von Bakterienisolaten, die Platten-Antagonismus gegen Fusarium und eine gute Kolonisationsfähigkeit zeigen, zur Unterdrückung von Fusarium-Pilzinfektionen in Pflanzen.
Maissamen wurden unter Verwendung eines Inokulums auf der Basis einer Kulturbrühe oder auf Torabasis nach der Beschreibung von Beispiel 3 inokuliert. Die Samen wurden in eine 60 : 40-Mischung von Erde und Sand in einem Aglar-Rohr (25 mm · 200 mm), das an einem Ende mit einem Gummistopfen verschlossen wer, gesät. Die Erde-Sand-Mischung wurde mit 10 000 cfu (koloniebildende Einheiten, colony forming units) von F. moniliforme pro g Erde durch sorgfältiges Mischen in einem pilzlichen Inokulum infiziert, welches Inokulum wie folgt hergestellt wurde: 100 g Hafer wurden über Nacht in einem konischen Kolben in Wasser eingeweicht. Das Wasser wurde abrinnen gelassen und der Kolben bei 121ºC 15 min an drei aufeinanderfolgenden Tagen autoklaviert. Der Kolben wurde mit einigen wenigen Stücken Agarkultur von F. moniliforme inokuliert und bei 28ºC 2 Wochen unter täglichem Schütteln inkubiert, um die Körner in loser Verteilung zu bewehren. Die Körner wurden später getrocknet und in einer Mühle gemahlen, so daß sie durch ein 1 mm Sieb hindurchgingen.
Die Fähigkeit der Bakterienisolate zum Schützen von Maisstämmen gegen F. moniliforme-Infektionen wurde bestimmt, indem das Ausmaß der Invasion des Pilzes in das Mesocotyl und die Plumule-Pegionen der Pflanzen, die aus inokulierten Samen gezogen worden waren, festgestellt wird. Nach 10 Tagen wurden die Samen und die alten Wurzeln der Pflanze herausgeschnitten und die Regionen von Mesocotyl und Plumule wurden dann mit 4% Hypochlorit während 2 min oberflächlich sterilisiert. Im Anschluß daran folgten 3 bis 4 Waschungen in sterilem Wasser. Unter Verwendung eines sterilen Skalpells wurde die Plumule-Region von der Mesocotyl-Region abgeschnitten und auf ein antibiotisches Wayd-Medium (siehe unten) aufgestrichen, um Fusarium auszuzählen. Die Platten wurden bei 25ºC Tagestepperatur und 20ºC Nachttemperatur mit einer Belichtungsperiode von 12 Stunden und Einsatz von sowohl fluoreszierendem Licht als auch "Schwarzlicht"-Beleuchtung inkubiert. Nach 3 bis 5 Tagen Inkubation wurden die Platten auf die Anwesenheit von kettenbildenden Fusarien, die aus dem Mesocotyl und der Plumule-Region herauswachsen, untersucht und die prozentuelle Herabsetzung der Fusarium-Infektion durch Vergleich mit inukulierten Kontrollen bestimmt.
Die Pilzinvasion der Wurzeln wurde auch durch Aufbringen von Wurzelstücken auf ein Wayd-Agarmedium untersucht. Ganze Wurzeln wurden in 4% Hypochlorit während 2 min nach der oberflächlichen Sterilisation 3 bis 4 mal in sterilem Wasser gewaschen und unter Verwendung eines sterilen Skalpells in 5 cm Stücke geschnitten. Die Basalregionen, Mittelregionen und Wurzelspitzenregionen wurden auf Wayd-Medium aufgebracht.
Das Wayd-(Wasseragar mit Hefe und Dextrose)-Medium enthielt:
Dextrose 10 g
Hefeextrakt 1 g
Agar 20 g
Wasser (entionisiert) 1000 ml pH 7,0
Filter-sterilisierte Antibiotika:
Streptomycinsulfat 1 g
Aureomycin 0,01 g
Die Ergebnisse der Pilzinvasionsversuche an Stamm und Wurzeln (Fig. 3-5) zeigten eine signifikante Herabsetzung der Fusarium moniliforme-Infektion des Mesocotyls, der Plumule und Wurzeln im Anschluß an die Inokulation der Samen mit P. cepacia 526 und 406. Inokulierung mit Bacillus und Pseudomonas SV35 zeigte auch eine Herabsetzung der Infektion, jedoch zu einem geringeren Ausmaß. Es bestand auch eine Herabsetzung der Gesamtpilzzählungen in Mesocotyl und Plumule bei den Behandlungen mit diesen Stämmen (Fig. 4) ebenso wie eine signifikante Herabsetzung in der Gesamtpilzzählung auf Wurzeln bei der Behandlung mit diesen Stämmen (Fig. 5).

Beispiel 6: Wurzelkolonisation und Schutz der Pflanzen gegen Fusarium; Feldversuch.

Dieses Beispiel demonstriert die Reaktion von Feld-gezüchtetem Mais auf die Inokulierung mit einem Fusarium-Antagonist, der in Beispiel 5 als P. cepacia 526 identifiziert worden war.
In zwei Feldtests in der Nähe von Madison, Wisconsin, wurde der Rifresistente Stamm 526 von P. cepacia zur Inokulierung der Samen von 5 Inzucht-Parentallinien von Mais, die in ihrer Aufnahmefähigkeit variierten, und 5 handelsüblichen Maishybriden verwendet. Es wurde eine Brühenkultur verdünnt, um ein flüssiges Inokulum herzustellen, das in die Pflanzfurche über die Samen in einer Menge von 108 Zellen pro 2,5 cm-Reihe gesprüht wurde. Die Maispflanzen wurden 3 Wochen nach dem Auspflanzen geerntet Nichtsterile Wurzelmazerate von geerntetem Mais wurden auf Nähragar mit einem Gehalt von 100 ug/ml Rifampicin ausgestrichen. Der Stamm 526 von P. cepacia hatte das Wurzelsystem der 5 Inzucht-Maissämlinge bis zu einem Ausmaß von 1,7 · 10&sup7; Organismen/g frisches Wurzelgewicht kolonisiert (Mittelwert über alle Kultivare, vgl. Tabelle 7). Das bedeutet, daß 79% der Gesamtpopulation der Bakterien auf den Wurzeln auf dem Nähragar zu wachsen imstande waren. Es bestand ein geringer sichtbarer Unterschied zwischen den Kultivaren in ihrer mikrobiellen Wurzelpopulation.
Eine zweite Ernte des Mais, der aus dem behandelten Samen stammte, wurde 77 Tage nach dem Pflanzen genommen. Der Stamm 526 von P. cepacia war auf den Wurzeln der 5 Inzucht-Maislinien ebenso wie bei den 5 handelsüblichen Hybriden in den Inokulationsbehandlungen immer noch vorhanden, war jedoch bei den nicht inokulierten Vergleichspflanzen nicht mehr vorhanden. Ms das gesamte Wurzelsystem in Unterproben aufgeteilt war, betrugen die Populationsausmaße von P. cepacia 526 immer noch 10&sup5;/g frisches Wurzelgewicht, was 1 bis 3% der gesamten Organismenpopulation betrug, die auf dem Nähragar wuchs. Die Inokulation setzte die Anzahl der durchsetzten Pflanzen von 19 auf 9% herab, wobei ein Mittelwert über 5 Kultivare genommen wurde. Für den Kultivar Co1109 steigerte die Inokulation mit P. cepacia die Trockenmasseproduktion der Pflanzenspitzen um 81%, von 18,6 + 3,1 SD auf 33,6 + 8,7 SD g/Pflanze. Bei einer Ernte nach 4 Monaten war auch das Spitzengewicht des Kultivars A641 durch die Inokulation von 86 g Frischgewicht/Pflanze auf 116 g/Pflanze gestiegen, was einer Zunahme von 35% entspricht. Diese beiden Kultivare neigen zur Durchsetzung. Es zeigte sich nur eine geringe Wirkung der Inokulierung bei den drei anderen Kultivaren dieses Versuchs. Tabelle 7: Gewinnung von Wurzeln von Feld-gezüchtetem Mais mit dem Inokulum-stamm 526 von Pseudomonas cepacia¹ 3 Wochen nach dem Auspflanzen (Organismen/g frisches Wurzelgewicht). Kultivar Gesamtzählung² auf Nähragar Stamm 526 auf Nähragar und Rifampicin
¹ Inokuliert durch Aufbringen einer verdünnten Brühenkultur als Spray auf den Samen in der Furche beim Auspflanzen.
² Die Werte sind Mittelwerte von 4 Replikaten unsteriler Wurzelmazerate, Ernte drei Wochen nach dem Säen.

Beispiel 7: Blattkolonisation durch P. cepacia 526

Die Kolonisationsfähigkeit von P. cepacia 526 wurde an Blättern von Tabakpflanzen in Glashaus-Versuchen untersucht. Die Testinokula waren Kulturen des Testorganismus, die über Nacht in Nährbrühe gezüchtet worden waren. Eine spontane Rifampicin-resistente Mutante von P. cepacia wurde in diesem Versuch verwendet. Eine spontane Streptomycin-resistente Mutante von E. coli HB101 wurde zu Vergleichszwecken ebenfalls verwendet. Die Inokula wurden auf beiden Seiten der Blätter unter Verwendung kleiner Malerbürsten aufgestrichen und die inokulierten Blätter wurden trocknen gelassen. Nach 48 Stunden wurden die Blattproben geerntet, gewogen und es wurde 1 g des Blattmaterials in 10 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung mit einem Gehalt von 0,1% Pepton eingebracht. Die Proben wurden bei Raumtemperatur zwei Stunden geschüttelt, worauf geeignete Verdünnungen auf Nähragar mit und ohne Antibiotika (100 ug/ml Rifampicin oder 25 ug/ml Streptomycin) aufgebracht wurden. Die nicht inokulierten Kontrollblätter wurden zum Vergleich ebenfalls untersucht. Die natürliche Bakteienflora auf der Blattoberfläche (gemessen durch Aufbringen der nicht inokulierten Blattproben auf NA) war in einem Ausmaß von 2,5 · 10³ Zellen/g Blatt anwesend. Auf den mit E. coli HB101 inokulierten Vergleichen überlebt der Vergleichsstamm keine 48 Stunden. Im Gegensatz dazu stellte der Teststamm auf den Blättern, die mit P. cepacia 526 inokuliert waren, 48 Stunden nach der Inokulation 100% der Bakterienpopulation dar.
Die Blattkolonisation wurde auch an Baumwollpflanzen im Feld festgestellt Vier reife Baumwollpflanzen wurden auf beiden Oberflächen mit Brühekultur des Rif-resistenten P. cepacia 526, die etwa 10 cfu/ml enthielt, unter Verwendung eines feinsprühenden Parfumsprühers aufgebracht.
Die Blätter wurden nach 8 Tagen geerntet, mazeriert und Verdünnungen (Fahraeus-Medium) der Wurzelmazerate wurden auf Nähragar (100 ug/ml Rif) und Nähragar ohne Antibiotikum aufgestrichen. Die Zahlungen von P. cepacia 526, die von den Baumwollblättern gewonnen wurden, reichen von etwa 10³ bis 10&sup4; Bakterien/g Trockengewicht der Blätter. Die gesamten Bakterienzählungen auf dem Nähragar reichten von etwa 10&sup7; bis 10&sup8;. P. cepacia 526 stellt nach 8 Tagen einen geringen Prozentsatz der Gesamtpopulation auf Baumwollblättern dar, überlebte jedoch auf der Oberfläche und war gewinnbar. Die Feldtemperaturen reichten von 18ºC (Nacht) bis 30ºC (Tag).
Die Blattkolonisation kann auch durch ähnliche Probennahme- und selektive Plattenversuche erfaßt werden, die andere Methoden der Inokulierung, inklusive des Besprühens der Blätter mit Inokulierungszusammensetzungen der Testorganismen oder durch Inokulieren der Samen und durch Probentnahme von Blättern der aus diesen Samen gewonnen Pflanzen zum Zwecke der Kolonisation bestimmt werden. Es erwies sich, daß P. cepacia 526 die Blätter von Mais, Baumwolle und Streptocarpus-Pflanzen zusätzlich zu Tabak kolonisierte. Tabelle 8: Kennzeichnung und Vergleich von P. cepacia Wurzelisolaten und Kultursammelstämmen REAKTIONEN/ENZYME Reduktion d. Nitrate zu Nitriten Reduktion der Nitrate zu Stickstoff Indolproduktion Ansäuerung mit Glucose Argini-Dihydrolase Urease Hydrolyse (β-Glucosidase) Hydrolyse (Protease) β-Galactosidase Glucose-Assimilation Arabinose-Assimilation Mannose-Assimilation Mannitol-Assimilation REAKTIONEN/ENZYME N-Acetyl-Glucosamin-Assimil. Maltose-Assimilation Gluconat-Assimilation Caprat-Assimilation Adipat-Assimilation Malat-Assimilation Citrat-Assimilation Phenylacetat-Assimilation Cytochromoxidase Motilität Gram-Färbung Pigmentierung Platteninhibition in vitro von² gelb weiß Fusarium moniliforme Sclerotinia sp. Macrophomina sp. REAKTIONEN/Enzyme Pflanzen-Bioassay-% Reduktion² in Sämlingsinfektion Zwiebel-Pathogenitätstest Maiswurzelkolonisation² nach 2 Wochen cfu/Wurzeltrockengew. log&sub1;&sub0; Einheiten
¹ Die Stämme 64-22 und 64-22 NK (Kawamoto und Lorbeer, 1976) wurden ursprünglich als P. cepacia und als Zwiebelpathogene eingestuft; diese Stämme sind als positive Vergleiche für Zwiebelpathogenität entalten
² Die Bewertungsmethode für jede Eigenschaft ist in Beispiel 8 beschrieben

Beispiel 8: Kennzeichnung der Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, und Vergleich mit P. cepacia ATCC-Kulturen.

Verschiedene, biochemisch als P. cepacia charakterisierte Antagonisten von Fusarium wurden aus Proben von nicht sterilisierten Wurzelmazeraten isoliert. Diese Mazerate umfassen mehrere verwandte Stämme, die durch die Stämme 526 und 406 von Wisconsin-Maisproben repräsentiert werden (Tabelle 8), und enthalten die Summe 64 und 65, die aus Australischen Maisproben isoliert wurden. Ein Vergleich zwischen diesen Isolaten und fünf ATCC-Kulturen mit der Bezeichnung P. cepacia wurde durchgeführt. Es waren die folgenden ATCC-Stämme von P. cepacia in dem Vergleich enthalten: ATCC 25416, Spezies-typischer Stamm, Zwiebel-Isolat; ATCC 29424, aus Phthalsäure-Anreicherung; ATCC 17460, vorne Fluß Maraval, Trinidad; ATCC 10856; und ATCC 17616 aus Erde, die mit Anthraniliat angereichert worden wer. Zwei Stämme, die als P. cepacia identifiziert wurden (Kawamoto und Lorbeer (1976) Plant Disease Reporter 60 : 189-191), die Zwiebel-Isolate und bekannte Zwiebel-Pathogene sind, waren auch enthalten, nämlich die Stämme 64-22N5 und 64-22NK. Von diesen Stämmen wurde berichtet, daß sie Zwiebel vor eine Infektion mit Fusarium schützen.
Tabelle 8 faßt die Ergebnisse einer Reihe von biochemischen Vergleichen innerhalb der Stämme von P. cepacia zusammen. Es konnte keine signifikanter Unterschied zwischen diesen Stämmen auf der Basis der in Tabelle 8 enthaltenen biochemischen Versuche festgestellt werden. Das unterstützt die Identifikation dieser enthaltenen Wurzelisolate als Mitglieder der Spezies P. cepacia. Verschiedene andere Assays sind in dem Vergleich enthalten: Pilzinhibition, Zwiebelpathogenität, Maiswurzelkolonisation und Pflanzenschutzassays.
Die Platteninhibition der Pilze Fusarium moniliforme, Sclerotinia spp. und Macrophomia spp. wurde durch Spotting einer frischen Pilzkultur auf Kartoffel-Dexrose-Agar untersucht, der 24 Stunden vorher mit verschiedenen Spots von einer P. cepacia Kultur inokuliert worden war. Nach 8-10 Tagen Inkubation bei 28ºC (wie oben beschrieben) wurde jede pilzfreie Zone rund um Bakterienspets gemessen und bewertet. Die Inhibition wurde anhand einer Skala von 0 bis 5 bewertet, wobei 0 = keine Inhibition, 1 = 1-5 mm Wachstumsinhibition, 2 = 6-10 mm, 3 = 11-15 mm, 4 = 16-20 mm, 5 = mehr als 21 mm.
Zwiebelpathogenität (Cother und Dowling (1985) Austral. Plant Pathol. 14 : 10-12) wurde durch Inokulieren von weißem Zwiebelgewebe mit Kulturen von P. cepacia untersucht. Die äußeren trockenen Schalen von Zwiebeln wurden abgeschalt und die Zwiebeln in 80% Alkohol getaucht und zweimal abgeflammt, um die Oberfläche zu sterilisieren. Querschnitte mit der Dicke 5 mm wurden dann vom Zentrum der Zwiebel geschnitten (3-5 Stücke/Zwiebel) und wurden unter sterilen Bedingungen in eine Petri-Schale eingebracht, wobei mit einem nassen Filterpapier die Feuchtigkeit aufrecht erhalten wurde. Die Platten wurden dann mit einem Film versiegelt und 72 Stunden bei 30ºC inkubiert. Die Zwiebeln wurden nach 24, 48 und 72 Stunden untersucht. Pathogene Reaktionen wurden anhand einer Skala von 0 bis 4 bewertet, wobei 0 = keine Reaktion, 1 = schwach gelbe Verfärbung an der Stelle der Inokulierung, 2 = gelbe Verfärbung, die sich einige mm von der Stelle der Inokulation erstreckt, 3 = fast die Hälfte des Zwiebelgewebes mit dunkelgelber Verfärbung, 4 = gesamtes Gewebe mit brauner Verfärbung.
Um die Fähigkeit von P. cepacia-Stämmen zu Kolonisierung von Maissämlingswurzeln zu testen, wurden die Samen 10 bis 15 min in eine Brühenkultur jedes Stammes eingetaucht, die etwa 10&sup5; Zellen/ml enthielt. Die inokulierten Samen wurden dann in Erdröhrchen gesät (Hawkesbury-Erde, pH 6, 5). Nach 10 bis 14 Tagen Wachstum wurden die Pflanzen geerntet und Verdünnungen des unsterilen Mazerats der ganzen Wurzeln wurden auf antibiotisch selektives Medium aufgestrichen (NA + 100 ug/ml Rifampicin). Das Kolonisationspotential der Stämme wurde verglichen als Rif-resistente TVCC (total viable cell counts, Zellzählungen der gesamten lebenden Zellen)/g Tockengewicht der Wurzel.
Die Unterdrückung einer Infektion durch Fusarium moniliforme durch Stämme von P. cepacia wurde durch Messen der Herabsetzung der Hypocotylinfektion in 10 bis 14 Tage alten Maissämlingen, die aus inokulierten Samen gezogen wurden, bestimmt. Die Maissamen wurden wie für die Kolonisationsassays durch Eintauchen in Brühenkulturen inokuliert. Die inokulierten Samen und nicht inokulierte Vergleiche wurden dann in einer Sand: Erde-Mischung (40 : 60), die mit einer auf Hafersamen mit einem Gehalt von etwa 10&sup4; cfu (koloniebildenden Einheiten)/g Pflanzmischung gezüchteten, gemahlenen Kultur von Fusarium moniliforme infiziert. Die Stamminfektion wurde nach der Beschreibung von Beispiel 5 bestimmt, wobei die ausgeschnittenen oberflächlich sterilisierten Pflanzensamen auf Fusarium-Wachstumsmedium (Wayd- Medium) aufgestrichen wurden. Die Vergleichsversuche beruhten auf der prozentuellen Herabsetzung der Infektion im Vergleich zu nicht inokulierten Kontrollproben. Die Ergebnisse sind grafisch in Fig. 6 dargestellt.
Wie in Tabelle 8 gezeigt, variierte die Platteninhibition der Pilze zwischen den untersuchten Stämmen von P. cepacia. P. cepacia-Maiswurzelisolate 526, 406 und 64 zeigten eine gute Wirkung gegen alle drei untersuchten Pilze. Von den verbleibenden an allen drei Pilzen untersuchten Stämmen hatte nur AAC 14760 eine vergleichbare Aktivität. Die Stämme 64-22 NS und 64-22 NK wurden nicht an allen Pilzen getestet, zeigten jedoch eine gute Wirkung gegen Fusarium P. cepacia ATCC 25416 zeigte auch eine gute Wirkung gegen Fusarium, jedoch nicht gegen andere Pilze. Die Stämme ATCC 10856 und 17616 zeigten keine antifungische Aktivität in diesen Versuchen. Weitere Vergleiche zwischen ATCC-Stämmen und P. cepacia-Wurzelisolaten sind in Tabelle 4 angegeben.
Die Maiswurzelisolate von P. cepacia 526 und 406 scheinen für Zwiebel nicht pathogen zu sein (0 oder 1 der Bewertung, Tabelle 8). Im Gegensatz dazu sind die Isolate 64 und 65 mäßig pathogen für Zwiebel. Wieder ist die Pathogenität der ATCC-Stämme für Zwiebel variabel, wobei die ATCC-Stämme 17460, 10856 und 17616 im wesentlichen nicht pathogen sind, während die ATCC-Stämme 25416 und 29429 mäßige bzw. starke Pathogene sind. Die Stämme 64-22 NK und 64-22 NS, die als Zwiebel-Pathogene bekannt sind, wurden in diesem Assay als starke Zwiebel-Pathogene eingestuft.
Das Kolonisationspotential zeigte einen gewissen Unterschied zwischen den Stämmen von P. cepacia; 526, ATCC 29424, ATCC 17616 und die zwiebelpathogenen Stämme 64-22 NK und NS scheinen bessere Kolonisatoren (Wurzel) zu sein im Vergleich zu den ATCC-Stämmen 17460, 25416 und 10856.
Die Maiswurzelisolate 526 und 406 sind überlegen im Unterdrücken der Hypocotylinfektion durch Fusarium moniliforme. Das Maiswurzelisolat 64 ist deutlich weniger wirksam, während der Stamm 65 keinen Schutz für Maissämlinge in diesem Versuch zeigte. Von den ATCC-Stämmen zeigte nur ein Stamm, ATCC 17616 einen signifikanten Schutz der Maissämlinge gegen Pilzinfektion. Es ist interessant festzuhalten, daß ATCC 17616 keine antifungische Wirksamkeit in den Plattenversuchen zeigte.
Basierend auf den in Tabelle 8 zusammengefaßten Ergebnissen können die beiden Stämme 526 und 406, die Isolate aus Maiswurzeln aus Wisconsin- Böden sind, deutlich von anderen Wurzelisolaten von P. cepacia und von bekannten ATCC-Stämmen von P. cepacia unterschieden werden. Diese Stamme und andere verwandte Isolate, die in Tabelle 1 angegeben sind, werden hier, basierend auf den oben beschriebenen unterscheidenden Merkmalen, als P. cepacia, Typ Wisconsin, bezeichnet.

Beispiel 9: Isolierung von P. cepacia, Typ Wisconsin

Es existieren mehrere Verfahren zur Isolierung von Stämmen von P. ce- Typ Wisconsin, aus Maiswurzelproben oder Maisfelderde.
Maiswurzelproben werden gewaschen, mazeriert und wie in Beispiel 1 hergestellt. Geeignete Verdünnungen eines unsterilen Wurzelmazerats werden auf ein selektives Medium für Pseudomonas cepacia (PC), beispielsweise auf eines, das von Burbage und Sasser (1982) in Phytopathology 72 : 706 beschrieben wurde, aufgestrichen. Selektionen dieser Plattierungen werden durch Aufstreichen auf NA gereinigt. Die gereinigten Maiswurzelisolate von P. cepacia werden dann zur Inhibierung von Fusarium nach der Beschreibung von Beispiel 2 gescreent. Wurzel- und Blattkolonisation durch die entstehenden Fusarium-antagonistischen P. cepacia-Selektionen wird nach der Beschreibung der Beispiele 4 und 7 bestätigt. Es wird bevorzugt, daß die biochemischen Stamm-Merkmale der entstehenden presumptiven Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, bestätigt werden.
Andererseits kann die Identität der presumptiven Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, durch Agglutinierungsversuche bestätigt werden, bei denen Antisera, die gegen die bekannten Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, gezüchtet wurden, verwendet werden. Die Herstellung solcher Antisera ist in Beispiel 10 beschrieben. Eine Probe einer flüssigen Kultur des presumptiven P. cepacia, Typ Wisconsin (etwa 10 ul) wird zu etwa 5 ul einer 1 : 10 Verdünnung des Antiserums auf einem Mikroskop-Objektträger zugesetzt. Die Mischung wird dann bei Raumtemperatur einige Minuten inkubieren gelassen, worauf sie unter dem Mikroskop auf Agglutinierung der Zellen untersucht wir& Proben, bei welchen Zell-Agglutinierung beobachtet wird, sind solche von P. cepacia, Typ Wisconsin.
Die Antisera gegen P. cepacia, Typ Wisconsin (wie jene, die in Beispiel 10 beschrieben sind) können auch in üblichen immunologischen Kolonie- Screenungstests verwendet werden (vgl. z. B. Methods Enzymol. (1979) Bd. 68, Wu (Herausg.), Kapitel 30-32, S. 428-453), um Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, zu isolieren. Bei diesem Screenen werden Maiswurzelisolate gereinigt und auf ein geeignetes Wachstumsmedium (d. h. NA) inokulieft. Die Isolate können rasch und simultan durch Fleck-Inokulierung vieler Isolate auf der gleichen Wachstumsplatte gescreent werden. Die Platten werden inkubiert, um den Bakterienflecken das Wachstum zu erlauben, und die Fleck-Isolate werden auf Nitrocellulose-Filtern, die über festes Wachstumsmedium (d. h. NA) gelegt sind, replica-plattiert. Mehrere Replicas können dann hergestellt und einem Immunoassay unterzogen werden Alternativ können die Isolate direkt auf Nitrocellulose-Filtern Spot-inokuliert werden. Die inokulierten Filter werden zur Entwicklung von Bakterienspots inkubiert. Dann werden die inokulierten Filter mit Antiserum behandelt, anschließend mit ¹²&sup5;I-Protein A versetzt und einer autoradiografischen Feststellung der Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, unterworfen Andere Methoden zur Feststellung der Antiserum-Bindung sind in der Fachwelt wohl bekannt.
Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, werden rasch aus Maiswurzelproben isoliert, indem ein anfängliches Aufbringen der Maiswurzelproben auf selektivem Medium für P. cepacia mit einem anschließenden immunologischen Screening der entstehenden Isolate von presumptivem P. cepacia kombiniert wird.
Die oben beschriebenen Isolationsverfahren können auch auf Proben von Maisfelderde angewendet werden. Die Erdproben können direkt auf ein selektives Medium für P. cepacia aufgestrichen werden oder es kann ein dazwischen liegender Anreicherungsschritt eingefügt werden. Die Anreicherung von Wurzel-kolonisierenden Bodenisolaten kann durch Auspflanzen von oberflächlich sterilisierten Maissamen in der Probe der Maisfelderde erfolgen. Die Maispflanzen (10 bis 14 Tage alt), die aus diesen Samen hervorgehen, werden dann geerntet und unsterile Wurzelmazerate dieser Pflanzen werden einem Screening und den oben beschriebenen Selektionsmethoden zur Isolierung der Stämme von P. cepacia, Typ Wisconsin, unterworfen. Die Wurzel-kolonisierenden Bakterien werden in der Pflanzenwurzel und in der Rhizosphäre angereichert.

Beispiel 10: Herstellung von P. cepacia 526 Antiserum

P. cepacia 526 wurde über Nacht in Nährbrühe gezüchtet, worauf die Zellen durch Zusatz von Glutaraldehyd (2% Vol./Vol.) fixiert werden. Die Zellen werden durch dieses Verfahren getötet, jedoch nicht lysiert. Nach einer 2- bis 5-stündigen Behandlung mit Glutaraldehyd wird die Zellsuspension gegen PBS dialysiert (72 h, 4ºC). Nach der Dialyse wird die Zellsuspension in aliquoten Anteilen und in gefrorenem Zustand aufbewahrt. Die Proben werden als Antigen für die Herstellung von P. capacia 526 Antiserum verwendet.
Es wurde der folgende Injektionsplan für Kaninchen zur Herstellung des Antiserums verwendet:

Claims

1. Verfahren zum Schützen einer Pflanze vor einer durch einen Pilz hervorgerufenen Krankheit, bei welchem Verfahren die Pflanze mit einem Stamm von Pseudomonas cepacia inokuliert wird, der folgende Merkmale aufweist:

Tag 1 Intravenöse Injektion (IV) von 0, 5 ml Antigen-Probe (AG). Subkutane Injektion (SC) von 0, 1 ml AG. Intramuskuläre Injektion (IM) von 0, 5 ml AG und 0, 5 ml unvollständigem Freund-Adjuvans (IF).

Tag 2 IV 1,0 ml AG

Tag 3 IV 1,5 ml AG

Tage 4-6 Pause

Tag 7 IV 1,5 ml AG

Tag 8 IV 2,0 ml AG

Tag 9 IV 2,0 ml AG

Tag 14 Blutabnahme aus dem Ohr zur Titerbestimmung

Tag 16 SC Auffrischung 2,0 ml AG + 2,0 ml IF

Tag 21 Blut aus dem Herzen

Tag 30 SC Auffrischung 2,0 ml AG + 2,0 ml IF

+ 5 Tage Blut aus dem Herzen

+ 2 Tage Sc Auffrischung 2,0 ml AG ohne IF

+ 5 Tage Blut aus dem Herzen

+ 2 Tage Sc Auffrischung 2,0 ml AG + 2,0 ml IF

Die letzten vier Stufen können beliebig lang wiederholt werden, wobei Auffrischungen mit und ohne unvollständigem Freund-Adjuvans abwechseln. Den Kaninchen wurde durch die seitliche Ohrvene Blut zur Titerbestimmung abgenommen, die ihrerseits durch ein Agglutinierungsverfahren auf dem Objektträger erfolgte. Es stellte sich heraus, daß P. cepacia 526 Antiserum eine gewisse Reaktion mit Pseudomonas syringae zeigte. Obwohl P. cepacia leicht von P. syringae durch übliche Kriterien unterschieden werden kann, kann P. cepacia 526 Antiserum erforderlichenfalls vor der Verwendung einer Klärung mit P. cepacia Antigen unterworfen werden. Es werden etwa 10 ul AG zu 5 ul einer 1 : 10-Verdünnung des Serums auf einem Mikroskop-Objektträger zugesetzt. Das Serum wurde für verwendbar erachtet, wenn sich die Zellen mit dem Serum zu Klumpen verbinden. Es wurde immer ein Vergleich mit der Reaktion von Zellen mit pre-immunem Serum durchgeführt. Das gesammelte Serum der immunen Kaninchen wurde filtriert, durch ein 0,45 Mikron Filter sterilisiert und dann bei -80ºC eingefroren.

(a) Nichtpathogenität für Zwiebel,

(b) Fähigkeit zur Kolonisierung der Blätter und/oder Wurzeln und/oder Rhizosphäre dieser Pflanze,

(c) antifungische Wirksamkeit und

(d) Fähigkeit, jene Pflanzen, die er kolonisiert, vor einer Pilzkrankheit zu schützen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem diese Inokulierung das Besprühen dieser Pflanze oder von Teilen derselben mit einem landwirtschaftlichen Inokulum umfaßt, das den genannten Stamm von Pseudomonas cepacia enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem diese Inokulierung das Aufbringen eines diesen Stamm von P. cepacia enthaltenden landwirtschaftlichen Inokulums vor dem Anpflanzen umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem diese Inokulierung das Aufbringen eines diesen Stamm von P. cepacia enthaltenden landwirtschaftlichen Inokulums auf den Boden umfaßt, in welchem die Samen der genannten Pflanze eingepflanzt werden, wobei das landwirtschaftliche Inokulum zur Pflanzzeit in der Nachbarschaft dieser Samen aufgebracht wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem diese Pflanze ausgewählt wird aus jener Gruppe, die aus Mais, Sojabohne, Sorghum, Baumwolle, Tabak, Raps, Sonnenblume, Erbse, Tomate und Alfalfa besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der die Krankheit hervorrufende Pilz ein Pilz der Gattung Fusarium ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem die Pflanze Mais ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem P. cepacia aus der Gruppe der Stämme P. cepacia ATCC 53266 und ATCC 53267 ausgewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der Stamm von P. cepacia eine Mutante oder ein Derivat eines Stammes aus der Gruppe P. cepacia ATCC 53266 und ATCC 53267 ist.

10. Bakterienhaltiges landwirtschaftliches Inokulum, das zur Inokulierung einer Pflanze auf dem Feld geeignet ist und enthält:

(a) einen geeigneten Träger, der nicht phytotoxisch, nicht bakteriostatisch und nicht bakterizid ist und

(b) einen Stamm von Pseudomonas cepacia mit den folgenden unterscheidenden Merkmalen:

(1) Nichtpathogenität für Zwiebel,

(2) Fähigkeit zur Kolonisierung der Blätter und/oder Wurzeln dieser Pflanze,

(3) antifungische Wirksamkeit und

(4) Fähigkeit, jene Pflanzen, die er kolonisiert, vor einer Pilzkrankheit zu schützen.

11. Inokulum nach Anspruch 10, in welchem der Stamm von P. cepacia mit den genannten Eigenschaften aus der Gruppe der Stämme P. cepacia ATCC 53266 und ATCC 53267 sowie Mutanten oder Derivaten derselben ausgewählt ist.

12. Materialzusammensetzung, enthaltend einen Pflanzensamen und einen Stamm von Pseudomonas cepacia mit den folgenden Merkmalen:

(a) Nichtpathogenität für Zwiebel,

(c) antifungische Wirksamkeit und

(d) Fähigkeit, jene Pflanzen, die er kolonisiert, vor einer Pilzkrankheit zu schützen,

welcher Stamm eine Pflanze oder Pflanzenteile, die aus der Keimung dieses Samens stammen, kolonisiert.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, in welcher der Stamm von P. cepacia aus der Gruppe der Stämme P. cepacia ATCC 53266 und ATCC 53267 ausgewählt ist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 12, in welcher der Stamm von P. cepacia eine Mutante oder ein Derivat eines Stammes ist, der aus den Stämmen P. cepacia ATCC 53266 und ATCC 53267 ausgewählt ist.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 12, in welcher der Pflanzensamen ein Samen einer Pflanze ist, die aus der Gruppe Mais, Sorghum, Sojabohne, Baumwolle, Raps, Sonnenblume, Tabak, Erbse, Tomate und Alfalfa ausgewählt ist.

16. Im wesentlichen gereinigte Kultur eines Stammes von Pseudomonas cepacia mit den folgenden Merkmalen:

(a) Nichtpathogenität für Zwiebel,

(b) Fähigkeit zur Kolonisierung der Blätter und/oder Wurzeln und/oder Rhizosphäre der genannten Pflanze,

(c) antifungische Wirksamkeit und

wobei dieser Stamm die Fähigkeit zur Kolonisierung einer Pflanze oder von Pflanzenteilen nach der Inokulierung der Pflanze mit diesem Bakterium besitzt.

17. Kultur nach Anspruch 16, in welcher dieser Stamm von P. cepacia ein Stamm aus der Gruppe der Stämme P. cepacia ATCC 53266 und ATCC 53267 sowie von Mutanten und Derivaten derselben ist.

18. Kultur nach Anspruch 16, in welcher diese Pflanze aus der Gruppe der Pflanzen Mais, Sorghum, Sojabohne, Raps, Tabak, Baumwolle, Sonnenblume, Erbse, Tomate und Alfalfa ausgewählt ist.

19. Verfahren zur Isolierung eines Stammes von Pseudomonas cepacia mit den Eigenschaften Nichtpathogenität für Zwiebel, Fähigkeit zur Kolonisierung der Wurzeln und/oder Blätter und/oder Rhizosphäre der genannten Pflanze, antifungische Wirksamkeit und Fähigkeit, jene Pflanzen, die er kolonisiert, vor einer Pilzkrankheit zu schützen, wobei der genannte Stamm die Wurzeln von Pflanzen kolonisiert, bei welchem Verfahren folgende Schritte vorgesehen sind:

(a) Ernten der Pflanzenwurzeln,

(b) Waschen der Pflanzenwurzeln zur Entfernung der lose an den Oberflächen dieser Wurzeln haftenden Erde,

(c) Mazeration der gewaschenen Pflanzenwurzeln zur Bereitung eines Wurzelmazerats und Verdünnung dieses Wurzelmazerats mit einem geeigneten Medium,

(d) Ausstreichen der Verdünnungen dieses Wurzelmazerats auf einem geeigneten Bakterienwachstumsmedium, so daß die Bakterienkolonien der einzelnen differierenden Bakterienwurzelisolate unterschieden werden können,

(e) Selektion jener Isolate aus den Bakterienwurzelisolaten, die Stämme von Pseudomonas cepacia sind,

(f) Selektion jener Isolate aus den Wurzelisolaten von P. cepacia, die Antagonisten eines Pilzes der Gattung Fusarium sind, Reinigung des ausgewählten Pilzantagonisten aus den P. cepacia - Isolaten und

(g) Bestätigung, daß die ausgewählten gereinigten P. cepacia-Maiswurzelisolate, die Antagonisten für einen Pilz der Gattung Fusarium sind, die genannten Eigenschaften haben.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei welchem die Pflanzenwurzeln Maiswurzeln sind.

21. Verfahren nach Anspruch 19, bei welchem die Ausstreich- und Selektionsschritte umfassen:

(a) das Ausstreichen von Verdünnungen dieses Wurzelmazerats auf einem Wachstumsmedium, das selektiv für das Wachstum der Stämme von P. cepacia ist und

(b) Selektion von Isolaten, die Antagonisten eines Pilzes der Gattung Fusarium sind, aus diesen P. cepacia - Wurzelisolaten.

22. Verfahren nach Anspruch 19, bei welchem zu den genannten Selektionsschritten ein immunologisches Screening der genannten Bakterienwurzelisolate auf Reaktion mit einem Antikörper gehört, der gegen einen Stamm von P. cepacia mit folgenden Merkmalen:

(a) Nichtpathogenität für Zwiebel,

(c) antifungische Wirksamkeit und

gezüchtet wurde, wodurch eine direkte Selektion auf Wurzelisolate, die Stämme von Pseudomonas cepacia mit den genannten Merkmalen sind, erfolgt.