DE3851035T2 - Interleukin-7. - Google Patents

Interleukin-7.

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DE3851035T2
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Raymond G. Seattle Washington 98119 Goodwin
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Diane Y. Seattle Washington 98105 Mochizuki
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Virginia L. Seattle Washington 98102 Price
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Description

    Technischer Bereich
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen die Bereiche der Immunologie und Molekularbiologie und im besonderen einen Polypeptid-Wachstumsfaktor, der die Proliferation und die Differenzierung von Lymphozyten und anderen hämatopoetischen Vorläufern reguliert.
    • Hintergrund der Erfindung
  • B- und T-Lymphozyten sind die primären Effektor-Zellen der Immunantworten. Von beiden Zellklassen wird vermutet, daß sie letztendlich von hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark des Säugers abstammen, über Vorgänger- oder Vorläuferzellen, die unterscheidbare Differenzierungsstadien jeder dieser Klassen repräsentieren.
  • B-Lymphozyten oder B-Zellen sind die Vorläufer der zirkulierenden Antikörpersezernierenden Plasmazellen. Reife B-Zellen, die durch die Expression oberflächengebundener, zur Bindung spezifischer Antigene befähigter Immunglobuline charakterisiert sind, stammen von hämatopoetischen Stammzellen über eine intermediäre, als Prä-B-Zellen bekannte Zellklasse ab. Reife T-Zellen entwickeln sich hauptsächlich im Thymus, vermutlich aus einer bis jetzt noch nicht identifizierten Vorläufer-Zelle, die aus dem Knochenmark in den Thymus während eines frühen Stadiums der T-Zellentwicklung wandert.
  • Während ein beträchtlicher Fortschritt in der Identifizierung löslicher Hormonähnlicher Faktoren gemacht wurde, die die Differenzierung anderer Zellen hämatopoetischen Ursprungs regulieren, z. B. Granulozyten und Makrophagen, ist sehr wenig über regulatorische Faktoren bekannt, die in der B- und T-Zell- Lymphogenese involviert sind. Die pluripotente, lymphoide Stammzelle wurde nicht identifiziert, auch sind nicht alle Faktoren und Bedingungen bestimmt, die für Festlegung und Ausbreitung von B- und T-Zell-Familien erforderlich sind. Die späteren Stadien des B- und T-Zell-Wachstums und der -Differenzierung, die dem Erscheinen von Oberflächen-Immunglobulin und dem Auftreten von B-Zellen aus dem Knochenmark oder T-Zellen aus dem Thymus folgen, sind am besten untersucht worden. Diese Arbeit hat eine Anzahl von Faktoren enthüllt, die auf peripheren B- und T-Zellen aktiv sind, einschließlich IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, Interferon gamma, BSF-2, Neuroleukin und den transformierenden Wachstumsfaktor beta.
  • Ein fragmentarischer Beweis wurde verfügbar hinsichtlich B-Zellen, die für die unmittelbaren Vorläufer von reifen funktionellen peripheren B-Zellen gehalten werden. Diese Prä-B-Zellen wurden definiert als Zellen, die eine cytoplasmatische u- Kette aber keine cytoplasmatische leichte Kette und kein Oberflächen-Immunglobulin besitzen.
  • Paige, Nature302 : 711 (1983) und Paige et al. Eur. J. Immunol. 14 : 979(1984) beschrieben Techniken zur Kultivierung von B-Zell-Vorläufern, die von fötalen Leber-Zellen (14. Tag) aus Maus abstammten. Es wurde beobachtet, daß diese Prä-B- Zellen zu Antikörper-sezernierenden B-Zellen in vitro differenzieren, wenn Kulturen durch eine Schicht fötaler Leberzellen, Knochenmark-adhärente Zellen oder hergerichtete Medien, die Kolonie stimulierende Faktoren beinhalten, unterstützt werden.
  • Giri et al., J. Immunol. 132 : 223 (1984) kultivierten eine aus Knochenmark der Maus abgeleitete Prä-B-Zellinie, 70Z/3, in Anwesenheit teilweise gereinigter IL-1- Präparationen von P388D1 Zellüberständen, die mit Lipopolysaccharid (LPS) induziert wurden. Es wurde beobachtet, daß die Prä-B-Zellen nach Kontakt mit der IL-1-Präparation Oberflächen-Immunglobulin exprimieren. Jyonouchi et al., J Immunol. 135 : 1891(1985) berichteten, daß ein humoraler Faktor oder Faktoren aus dem Serum von NZB Mäusen die Reifung von Vorläufer-B-Zellen beschleunigen konnten. Landreth et al., J. Immunol. 134 : 2305 (1985) zeigten, daß ein Faktor (oder Faktoren) aus dem Urin eines Patienten mit Zyklischer Neutropenie die Bildung von Prä-B-Zellen in Knochenmarks-Kulturen von Mensch und Maus stimuliert.
  • Diese Ergebnisse waren wegen der nicht-homogenen Beschaffenheit der involvierten Zellpopulationen schwierig zu interpretieren. Die pleiotropen Effekte bekannter Lymphokine und deren intrinsische biologische Aktivitäten erschweren die Analyse von Assays, die die Reaktion von heterogenen Zellkulturen auf hergerichtete Zellkultur-Medien, die sich von Serum-enthaltenden Zellkulturen herleiten, beinhaltet.
  • Ein großes Hindernis bei der Untersuchung der Lymphozyten-Entwicklung war die Schwierigkeit, die mit dem Erhalt angereicherter Populationen lebensfähiger lymphoider Vorläufer verbunden war. Das von Whitlock und Witte J. Immunol. Meth. 67 : 353 (1984) entwickelte Lang-Zeit Knochenmarks-Kultur-System lieferte eine Quelle von Prä-B-Zellen zur Untersuchung. In einer Whitlock-Witte-Kultur wird eine adhärente Hilfsschicht, die aus dem Stroma stammende Fibroblasten, Makrophagen und Endothelzellen umfaßt, als Nährschicht eingesetzt, um das Wachstum einer oberen Phase nicht-adhärenter Prä-B-Zellen und früher lympoider Vorläufer zu unterstützen.
  • Whitlock et al., Cell 48 : 1009 (1987) und Hunt et al., Cell 48 : 997 (1987) beschrieben die Klonierung von Zellinien, die von Knochenmarksstroma der Maus abstammten und die imstande waren, das Wachstum von Prä-B-Zellen und anderer Vorläufer reifer B-Zellen in Whitlock-Witte-Kulturen zu unterstützen. Überstände einer solchen Zellinie, mit ALC bezeichnet, wurden auf Aktivität in IL-1-, IL-2-, IL- 3- und IL-4-Assays getestet. Das Fehlen von Aktivität in diesen Assays wies darauf hin, daß diese Faktoren nicht der Ursprung der in ALC-Überständen gefundenen Proliferations-induzierenden Aktivität war. Sowohl Whitlock et al. als auch Hunt et al. zogen in Betracht, daß die von ihnen beobachtete Prä-B-Zell induzierende Aktivität, einem neuen, in Stromazell- Überständen anwesenden Faktor zuzuschreiben sei.
    • =Entwicklung der Erfindung
  • Bei der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde eine Variante des Whitlock-Witte-Kultur-Systems als Quelle unreifer B-Zellen eingesetzt, die die Grundlage für ein schnelles quantitatives Assay zur Aufspürung von zur Stimulierung der Prä-B-Zell-Proliferation befähigter Wachstumsfaktoren darstellte. Ein vermeintlicher, in Stroma-Zellkulturen der Maus beobachteter Faktor, wurde provisorisch als "Lymphopoietin-1" ("LP-1") und später als "Interleukin-7" ("IL-7") bezeichnet. Zur Klonierung von Maus-IL-7 cDNA, die zur Sicherung der cDNA aus Mensch verwendet wurde, wurde eine neue Klonierungstechnik eingesetzt. Um eine Zellinie zu erhalten, die lösliches IL-7 aus Maus in nachweisbaren Mengen exprimiert, wurde eine neuartige Zellinie durch Transformation von aus Whitlock- Witte-Kultur stammenden Stromazellen etabliert. Diese Zellinie, die eine Prä-B-Zell- Wachstums-Aktivität in Serum-freien Medien absondert, lieferte spezifische IL-7 Boten-RNA zur Expressions-Klonierung und Protein zur Reinigung und Sequenzierung. Die Isolierung eines cDNA-Klons aus Maus ermöglichte die Identifizierung von IL-7 codierenden, menschlichen, genomischen und cDNA- Klonen.
  • Einleitende Experimente, die die Verabreichung von gereinigtem, rekombinanten IL-7 an Mäuse einschließen, haben gezeigt, daß, zusätzlich zur Stimulierung der Entwicklung und Proliferation hämatopoetischer Vorläufer von B- und T-Zellen, IL-7 auch zur Induzierung der Proliferation von Megakaryozyten und Granulozyten/Makrophagen-Vorläufern im Knochenmark befähigt ist. In Hinsicht auf potentielle immunologische therapeutische Verwendungen bei der Stimulierung der Proliferation von T-Zell-Vorläufern und Antikörper-sezernierenden B-Zellen, wie auch anderer hämatopoetischer Zelltypen, ist ein erhebliches Interesse an der Entwicklung der Technologie zur Produktion biologisch aktiver IL-7-Moleküle vorhanden. Die Verwendung von rekombinanten Expressionssystemen kann ausreichende Mengen reinen Proteins liefern, um detailierte Untersuchungen der biologischen Aktivität solcher Moleküle zu erlauben und den erwarteten klinischen Bedarf an therapeutischen IL-7-Zusammensetzungen zu decken.
    • Die Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung liefert Säuger-Interleukin-7 (IL-7) Protein, das zuvor als Lymphopoietin-1 ("LP-1") bezeichnet wurde. Diese Moleküle können durch Reinigung von Zellkultur-Überständen oder durch Expression von IL-7 codierenden DNA-Sequenzen hergestellt werden. Solche Sequenzen bestehen bevorzugt im wesentlichen aus einer Nukleotidsequenz mit einem offenem Leseraster, welche in einer rekombinanten Transkriptions-Einheit unter der Kontrolle von Säuger-, mikrobiellen oder viralen Transkriptions- oder Translations-Kontrollelementen exprimiert werden kann. Die vorliegende Erfindung liefert auch rekombinante Expressions-Vektoren, umfassend die DNA-Sequenzen, eukaryotische und prokaryotische Expressions-Systeme, umfassend rekombinante Expressions-Vektoren, Verfahren zum Herstellen von Proteinen durch Reinigung von Säugerzell- Kulturmedien oder durch rekombinante Expression in geeigneten eukaryotischen oder prokaryotischen Systemen, verschiedene therapeutische Zusammensetzungen und Verfahren, umfassend oder einschließend das Verwenden von Proteinen der Erfindung und Antikörper, die mit den Proteinen der Erfindung Immunreaktionen eingehen.
  • Verschiedene bevorzugte Merkmale der Erfindung werden nun beschrieben, mit Verweis auf die begleitenden Zeichnungen in denen:
  • Fig. 1 Restriktionskarten von cDNA-Klonen liefert, die IL-7-Protein aus Mensch und Maus codieren. Die Blöcke zeigen die Positionen der offenen Leseraster an. Die Schraffierung markiert ein Signalpeptid oder Leadersequenz. Die angenäherten Positionen ausgewählter Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen sind gekennzeichnet.
  • Fig. 2 die Nukleotidsequenz eines IL-7 aus Maus (mIL-7) codierenden cDNA-Klones veranschaulicht, der durch direkte Expressionsklonierung unter der Verwendung eines Expressionsvektor aus Säugetier identifiziert wurde. Das Initiationscodon des nativen Proteins voller Länge, das Codon, das die N-terminale Aminosäure der reifen Sequenz spezifiziert und das Terminationscodon sind unterstrichen.
  • Fig. 3 die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der codierenden Region des cDNA-Klones aus Maus der Fig. 2 zeigt. Die reife Proteinsequenz wird codiert von der Nukleotidsequenz, die bei Nukleotid 1 beginnt und bei Nukleotid 387 endet. Die vermutliche Signalpeptid-Sequenz, die als Leadersequenz des nativen Translationsproduktes codiert ist, wird von den Nukleotiden -75 bis -1 codiert. Der N-terminale Glutaminsäurerest des reifen mIL-7 ist unterstrichen.
  • Fig. 4 die Nukleotidsequenz eines IL-7 aus Mensch (hIL-7) codierenden cDNA-Klones veranschaulicht, der bei Kreuz- Hybridisierungs-Studien unter Verwendung einer von mIL-7-cDNA abgeleiteten Sonde isoliert wurde. Das Initiationscodon des nativen Proteins voller Länge, das Codon, das die N-terminale Aminosäure der reifen Sequenz spezifiziert und das Terminationscodon sind unterstrichen.
  • Fig. 5 die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der codierenden Region des hIL-7 cDNA-Klones der Fig. 4 zeigt. Das reife menschliche Protein wird codiert von der Sequenz, die bei Nukleotid 1 beginnt und bei Nukleotid 456 endet. Ein putatives hydrophes Signalpeptid, das als Leadersequenz des nativen Tarnslationsproduktes codiert ist, wird von den Nukleotiden -75 bis -1 codiert. Der N-terminale Asparaginsäurerest des reifen Proteins ist unterstrichen. Ein Plasmid, das die codierende Sequenz von hIL-7 im E. coli Stamm JM107 trägt, wurde bei der American Type Culture Collection am 21. Oktober 1987 hinterlegt und mit der Zugangsnummer ATCC 67546 bezeichnet.
  • Fig. 6 die Antwort von Prä-B-Zellen (Schaubild A) und von Thymozyten (Schaubild B) auf IL-7 zeigt. In dem in Schaubild A dargestellten Experiment wurden Prä-B-Zellen einer Whitlock-Witte-Knochenmark-Kultur (siehe unten) mit einer Dichte von 2,5 · 10&sup5; Zellen pro ml in der Anwesenheit von IL-7 für drei Tage bei 37ºC kultiviert. Zwei Quellen von IL-7 wurden eingesetzt: periodische Verdünnungen der Überstände von COS-7-Zellen, die mit einem das IL-7-Gen (offene Quadrate) enthaltenden Expressionsvektor transfiziert wurden und gereinigtes rekombinantes IL- 7-Protein, mit einer Konzentration von 100 ng/ml (geschlossene Quadrate) beginnend. In dem in Schaubild B dargestellten Experiment wurden Thymozyten mit einer Dichte von 1 · 10&sup7; Zellen pro ml unter den gleichen Bedingungen kultiviert, mit der Ausnahme, daß die Verdünnungen des gereinigten rekombinanten IL-7-Protein bei einer Konzentration von 1 ug/ml gestartet wurden. In allen Experimenten repräsentiert jeder aufgetragene Wert den Durchschnitt von dreifachen Proben.
  • Fig. 7 eine schematische Zeichnung des Hoch-Expressionsplasmids pDC201 darstellt, welches detailierter in Beispiel 7 beschrieben wird.
    • Detailierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung 1. Definitionen
  • "Interleukin-7" und "IL-7" beziehen sich auf ein endogenes sekretorisches Protein aus Säuger, welches befähigt ist, die Proliferation von aus dem Knochenmark stammenden Lymphozyten-Vorgängern oder -Vorläufern zu induzieren, auch die als Prä-B-Zellen bekannten spezialisierten Vorläufer beinhaltend. Alternative Bezeichnungen für dieses Molekül sind "Prä-B-Zell-Wachstumsfaktor" und Lymphopoietin-1". Das vorausgesagte Molekulargewicht des reifen Proteins entsprechend der in Fig. 3 dargestellten Sequenz beträgt 14897 Dalton, ausgenommen jeglicher Glykosylierung. Das vorausgesagte Molekulargewicht des reifen menschlichen Proteins, entsprechend der in Fig. 5 dargestellten Sequenz, beträgt 17387 Dalton, ausgenommen Glykosylierung. Wie in der Beschreibung durchweg verwendet wurde, bedeutet der Ausdruck "reif" ein Protein, das in einer Form exprimiert wird, der eine Leader-Sequenz fehlt, wie es in Transkripten voller Länge eines nativen Gens vorliegen kann.
  • "Im wesentlichen homolog" oder "im wesentlichen identisch", welches sowohl Nukleinsäure- als auch Aminosäure-Sequenzen betreffen kann, bedeutet, daß sich eine spezielle, zu untersuchende Sequenz, beispielsweise eine mutierte Sequenz, von einer Referenz-Sequenz um eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen unterscheidet; der Netto-Effekt davon resultiert nicht in einer ungünstigen funktionellen Verschiedenheit zwischen Referenz- und der zu untersuchenden Sequenz. Für die erfindungsgemäßen Zwecke werden Aminosäuresequenzen mit mehr als 90% Ähnlichkeit, äquivalenter biologischer Aktivität und äquivalenten Expressionscharakteristika als im wesentlichen identisch oder homolog betrachtet und sind im Rahmen der Proteine, die durch den Ausdruck "Interleukin-7" definiert sind, mit einbezogen. Aminosäuresequenzen mit mehr als 40% Ähnlichkeit werden als im wesentlichen ähnlich betrachtet. Bei der Bestimmung von Nukleinsäure-Sequenzen werden alle zu untersuchenden Nukleinsäuren, die befähigt sind, eine im wesentlichen homologe oder ähnliche Aminonosäuresequenz zu codieren, als im wesentlichen homolog oder ähnlich zu einer Referenz-Nukleinsäuresequenz betrachtet. Für die Zwecke der Bestimmung der Homologie oder Ähnlichkeit sollten Verkürzungen oder interne Deletionen der Referenz-Sequenz ignoriert werden. Sequenzen mit einem geringeren Grad der Homologie und vergleichbaren Bioaktivitäten werden als Äquivalente betrachtet. Für die erfindungsgemäßen Zwecke, wird eine "Untereinheit" eines IL-7-Proteins als eine mindestens 20 Aminosäuren auszumachende Aminosäuresequenz erachtet.
  • "Rekombinant", wie es hierin verwendet wird, bedeutet, daß das Protein von einem rekombinanten (z. B. mikrobiellen oder aus Säuger stammenden) Expressionssystem abstammt, welches die Transformation von Zellen einer Spezies mit Techniken beinhaltet, die den Durchschnitts-Fachleuten bekannt sind. "Mikrobiell" bezieht sich auf rekombinante Proteine, die in bakteriellen oder Pilz- (z. B. Hefe) Expressionssystemen hergestellt wurden. Als Produkt definiert "rekombinant mikrobiell" ein Prntein. das frei von nativen endogenen Substanzen und nicht durch assoziierte Glykosylierung begleitet wird. Protein, das in den meisten bakteriellen Kulturen, z. B. E. coli, exprimiert wird, wird frei von Glycan sein; Protein, das in Hefe exprimiert wird, wird ein Glykosylierungsmuster aufweisen, das sich von dem unterscheidet, welches in Säuger exprimiert wird.
  • Isolierte DNA-Sequenz" bezieht sich auf ein DNA-Polymer in der Form eines einzelnen Fragmentes oder als Bestandteil eines größeren DNA-Konstruktes, das von DNA abstammt, die mindestens einmal in einer im wesentlichen gereinigten Form isoliert wurde, d. h. frei von kontaminierenden endogenen Substanzen ist und in einer Menge oder Konzentration vorliegt, die die Identifizierung, Manipulation und Erlangung der Sequenz und deren Teilsequenzen mittels biochemischer Standard- Verfahren erlaubt, z. B. einen Klonierungsvektor verwendend. Derart isolierte Sequenzen werden vorzugsweise in Form eines offenen Leserasters geliefert, nicht unterbrochen durch interne untranslatierte Sequenzen oder Introns, die typischerweise in eukaryotischen Genen vorhanden sind. Sequenzen nicht-translatierter DNA können stromabwärts des offenen Leserasters vorhanden sein, wo sie die Manipulation oder Expression der codierenden Regionen nicht stören. "Nukleotidsequenz" bezieht sich auf ein Heteropolymer von Desoxyribonukleotiden. Im allgemeinen sind DNA- Sequenzen die die durch diese Erfindung vorgeschriebenen Proteine codieren, aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonukleotid- Linkern zusammengesetzt oder aus Serien von Oligonukleotiden, um ein synthetisches Gen zu erhalten, welches in einer rekombinanten Expressions-Einheit exprimiert werden kann. IL-7-DNA kann ebenso aus genomischer DNA jeder anderer Säugerzellen isoliert werden.
  • "Rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Plasmid, umfassend eine transkriptionelle Einheit, umfassend einen Zusammenbau (1) eines genetischen Elementes oder Elemente, die eine regulatorische Aufgabe bei der Genexpression besitzen, z. B. Promotoren oder Enhancer, (2) einer strukturellen oder codierenden Sequenz, die in mRNA transkribiert und in Protein translatiert wird, und (3) geeigneter Transkriptions-Initiations- und Terminations-Sequenzen. Strukturelle Elemente, die für die Verwendung in Hefe- Express ions-Systemen gedacht sind, beinhalten vorzugsweise eine Leader-Sequenz, die eine extrazelluläre Sekretion translatierten Proteins durch eine Wirtszelle gewährleisten. Alternativ kann das Protein einen N-terminalen Methionin-Rest beinhalten, wenn das rekombinante Protein ohne Leader- oder Transport-Sequenz exprimiert wird. Dieser Rest kann anschließend wahlfrei vom exprimierten rekombinanten Protein abgeschnitten werden, um ein Endprodukt zu liefern. Vektoren, die potentiell nützlich bei der Expression biologisch aktiven IL-7-Proteins sind, beinhalten ebenso Viren, z. B. Phagen, oder DNA-Fragmente, die in das Wirtsgenom durch Rekombination integrierbar sind.
  • "Rekombinantes mikrobielles Expressionssystem" bedeutet eine im wesentlichen homogene Monokultur geeigneter Wirts-Mikroorganismen, zum Beispiel Bakterien wie E. coli oder Hefe wie S. cerevisiae, die stabil eine rekombinante Transkriptions- Einheit in die chromosomale DNA integriert haben oder eine rekombinante Transkriptions-Einheit als Komponente eines innewohnenden Plasmids tragen. Im allgemeinen sind Zellen, die das System ausmachen, die Nachkommen eines einzelnen Ur-Transformanten. Rekombinante Expressionssysteme, wie sie hierin definiert sind werden heterologes Protein nach Induktion regulatorischer Elemente exprimieren, die mit den zu exprimierenden DNA-Sequenzen oder synthetischen Genen verbunden sind.
    • 2. Entwicklung von IL-7-Assay und zelluläre Quellen von Faktor
  • Ein in vitro Kultursystem für B-Zell-Vorläufer wurde eingesetzt, um einen Prä-B- Zell-Wachstum regulierenden Faktor zu identifizieren, der in Zellkultur von Knochenmark-Stromazellen aus Maus sezerniert wird. Die beobachtete strikte Wachstums-Abhängigkeit der Prä-B-Zellen von ihren Stroma-Nährschichten in Whitlock-Witte-Kulturen wies darauf hin, daß die Stroma-Zellen eine Prä-B-Zell- Wachstum stimulatorische Aktivität produzierten. Um diese Wachstumsaktivität zu charakterisieren, wurde ein quantitatives Assay entwickelt und eine zelluläre Quelle der Prä-B-Zell-Wachstum fördernden Aktivität gesucht.
  • Einleitende Versuche, ein Bioassay zu entwickeln, nutzten zellfreie Überstände von Lang-Zeit Knochenmark-(Nähr)-Schichten aus Stroma als Quelle der wachstumsfördernden Aktivität. Im allgemeinen waren die Assay-Ergebnisse zweifelhaft, weil ein Stimulations-Index von nur zwei- bis vierfach über Hintergrund beobachtet wurde. Dieses stimmt überein mit den Ergebnissen, die von Whitlock et al., Cell 48 : 1009 (1987) und Hunt et al., Cell 48 : 997 (1987) veröffentlicht wurden. Um dieses Hindernis zu umgehen und eine geeignete zelluläre Quelle von Wachstums- Faktor zu etablieren, wurde eine immortalisierte Zellinie durch Transfektion von Stromazellen aus Lang-Zeit-Knochenmark-Kulturen mit pSV3neo Plasmid erzeugt, welches die SV40 T-Antigen transformierenden Sequenzen beinhaltet. Es wurde gefunden, daß eine resultierende klonale Zellinie, bezeichnet mit IxN/A6, konstitutiv einen Faktor produziert, der befähigt ist, das Wachstum von Vorläufer-B-Zellen zu unterstützen. Anschließend wurde gefunden, daß vergleichbare Spiegel der Prä-B- Zell-Wachstum unterstützenden Aktivität produziert werden konnten, wenn die Zellen unter serumfreien Bedingungen in Anwesenheit von 1 ug/ml LPS angezogen wurden.
  • Um die Empfindlichkeit des Assays zu optimieren, wurde eine stark angereicherte Population von Vorläufer-B-Zellen aus Lang-Zeit-Knochenmark- Kulturen erhalten. Ein weiterer Zellanreicherungs-Schritt, der den Durchtritt über Sephadex G-10 gebraucht wurde verwendet, um eine homogenere Population zu erhalten, die befähigt ist, passende Ergebnisse der biologischen Assays zu erzeugenden. Die Spezifität dieses Assay-Systems wurde mit anderen bestimmten Faktoren getestet. Keiner der getesteten Faktoren, die IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSF, CSF-1, BSF-2, alpha-, beta- und gamma- Interferon, Neuroleukin und denn transformierende Wachstumsfaktor beta beinhalteten, war befähigt, die Stimulation des Thymidin-Einbaus über einen Hintergrund-Spiegel hinaus bei einer Reihe von Faktor-Konzentrationen zu induzieren. Zusätzlich rief mIL-7 keine Antwort in Standard-Bioassays für IL-1, IL-2, IL-3, GM-CSF (FDCP&sub2;-1D), IL-4, IL-5, G-CSF, CSF-1 und Interferon hervor. Zellfreie Überstände von IxN/A6 stimulierten aber die Bildung von Maus-Makrophagen-Typ-Kolonien in Weichagar. Die Fraktionierung von IxN/A6-konditioniertem Medium über DEAE-Sephacel- Chromatographie trennte die Kolonie-stimulierende Aktivität von der Prä-B-Zell- Wachstum unterstützenden Aktivität. Ein bevorzugtes Assay-Protokoll wird unten beschrieben.
    • 3. Assay für die biologische Aktivität von IL-7
  • Um eine Prä-B-Zell-Vorläufer-Population zu etablieren, wurden Knochenmark- Kulturen initiiert und aufrechterhalten wie es bei Whitlock et al., J. Immunol. Meth. 67 : 353 (1983) beschrieben wurde, in RPMI 1640 mit einer ausgewählten Menge von 5% fötalem Rinderserum (FBS) (Irvine Scientific, Santa Clara, CA, USA), 50 uM 2- Mercaptoethanol, 50 U/ml Penicillin, 50 ug/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin.
  • Es wurde gezeigt, daß die nicht-adhärenten Zellen, die von dieser Art Kultur- System erhalten wurden, B-Vorgänger-Zellen, Prä-B-Zellen und einige frühe B-Zellen beinhalten. Siehe Whitlock et al., Cell 32 : 903 (1983). Bezeichnenderweise demonstrierten Dorshkind et al., J. Immunoi. 137 : 3457 (1986), daß Zellen solcher Knochenmark-Kulturen befähigt waren, sowohl B-Zell- als auch T-Zell-Teile in kombinierten immundefizienten Mäusen wiederherzustellen, welches anzeigt, daß ein lymphoides Stammzellen-Element ebenso in diesen Kulturen anwesend ist. Zur Zeit ist das vollständige Repertoire reagierender Zellen noch nicht bestimmt, aber eindeutig beinhaltet diese Population Vorläufer-Zellen der B-Familie. Diese Zellen zeigen ein lymphozytisches Erscheinungsbild mit einem großen Nukleus und einem kleinen Kranz Zytoplasma, was mit dem Phänotyp der Prä-B-Zellen übereinstimmt.
  • Für das Assay werden nicht-adhärente Prä-B-Zellen von den Stroma-Schichten der Whitlock-Witte-Kulturen durch vorsichtiges Pipettieren entfernt, durch Zentrifugation sedimentiert und in 1-2 ml von Iscoves modifiziertes Dulbeccos Medium (IMDM) resuspendiert, das 5% FBS, 50 U/ml Penicillin, 50 ug/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin (Assay Medium) enthält.
  • Die Zellen werden dann auf eine kleine Sephadex G-10-Säule (Warenzeichen von Pharmacia Fine Chemicals, Inc. Uppsala SE für Gelfiltrationsmedien) mit einer Dichte von weniger als 10&sup8; Zellen pro ml Gel gegeben, um jede verdrängte, kontaminierende adhärente oder stromale Zellen zu entfernen und anschließend bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert wie es von Ly et al., J. Immunol. Meth. 5 : 239 (1974) beschrieben wird. Die Prä-B-Zellen werden hierauf von den G-10- Säulen mit Assay-Medium eluiert, gewaschen, und mit einer Dichte von 2,5 · 10&sup5; Zellen/ml in Assay-Medium resuspendiert. Zu untersuchende Proben werden seriell in individuellen Probenvertiefungen einer 96- Probenvertiefungen-Mikrotiter-Platte in einem Endvolumen von 50 ml verdünnt. Fünfzig Mikroliter der Zellsuspension (12500 Zellen/Probenvertiefung) werden in jede Probenvertiefung gegeben und die Platten für 48 Stunden in einem befeuchteten CO&sub2;-Inkubator, der 7,5% CO&sub2;, 5% O&sub2;, Rest N&sub2; enthält, inkubiert. Die Kulturen werden während der letzten vier Stunden der Inkubation mit 2uCi/Probenvertiefung Tritium-markiertem Thymidin ([³H]-TdR; NEN, 60-80 Ci/mmol) in einem Volumen von 25 Mikrolitern radiomarkiert. Die Kulturen werden mit einem automatischen Sammler auf Glasfaser-Filtern geerntet und die eingebaute Radioaktivität durch Flüssigkeits-Scintillation gezählt. Eine Einheit von IL-7 ist definiert als der Betrag von Faktor, der erforderlich ist, um den halbmaximalen Einbau von 3 H-TdR unter den oben beschriebenen Bedingungen des IL-7-Assays zu induzieren. Die Ergebnisse eines typischen Prä-B-Zell-Proliferations- Assays, bei dem rohe und gereinigte Präparationen von rekombinantem IL-7 eingesetzt werden, sind in Fig. 6, Schaubild A, dargestellt.
    • 4. Isolierung von gereinigtem nativen Protein
  • Die Entwicklung von Reinigungsverfahren für IL-7 aus Maus zeigten daß die biologische Aktivität des Faktors in einem weiten Spektrum von Bedingungen stabil ist, die Extreme des p-Wertes (2, 1 bis 9,0) und Lösungen, die die organischen Lösungsmittel Azetonitril und n-Propanol beinhalten, einschließen. Die Auflösung der Aktivität durch SDS-PAGE (Sodium Dodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese) zeigte, daß die IL-7-Aktivität mit einem Protein von Mr 25000 assoziiert ist und in Anwesenheit von SDS und Temperaturen von 70ºC stabil ist. Aber die Reduktion des Proteins durch Kontakt mit 1% 2-Mercaptoethanol zerstörte vollständig dessen biologische Aktivität, was auf die Anwesenheit intramolekularer Disulfidbrücken hinwies. Die präparative SDS-PAGE ergab ein einzelnes Protein mit Mr 25000, was mit der biologischen Aktivität zusammentraf. Außerdem band radiomarkiertes IL-7 spezifisch an Zellen, die auf diesen Faktor antworten, darauf hinweisend, daß IL-7 wie andere Polypeptid-Hormone an spezifische Rezeptoren auf der Zell-Oberfläche bindet. Das Reinigungs-Protokoll ergab eine 10-millionenfache Aufreinigung mit einer End-Ausbeute von 35%. Eine durch Edman-Abspaltung erhaltene N-terminale Sequenz stellte X-X-His-Ile-Lys-Asp-Lys-Glu-X-Lys-Ala-Tyr-Glu-X-Val-Met dar, die sich als einmalig beim Vergleich mit der Daten-Basis veröffentlichter Proteine herausstellte.
  • Das gereinigte IL-7 zeigte eine geschätzte spezifische Aktivität von über 4 · 10&sup6; Einheiten/ug Protein und war bei einer Konzentration von 10¹ pM aktiv, beruhend auf visuellen Schätzungen der Protein-Konzentration, die durch die Intensität silbergefärbter SDS-PAGE bestimmt war. Diese einleitende Schätzung der spezifischen Aktivität im Prä-B-Zell-Proliferations-Assay wurde angesichts genauerer Bestimmungen der Protein-Konzentrationen nach unten korrigiert. Die spezifische Aktivität gereinigten rekombinanten IL-7 im Prä-B-Zell-Proliferations-Assay scheint sich im Bereich von 1-2 · 1&sup5; Einheiten/kg zu bewegen.
    • 5. Isolation von cDNAs
  • Um die codierende Sequenz aus Maus zu sichern, wurde eine IL-7 codierende DNA-Sequenz aus einer cDNA-Genbank isoliert, die durch reverse Transkription polyadenylierter, aus der transformierten Stroma-Zellinie aus Maus IxN/A6 isolierter RNA, hergestellt wurde. Die Genbank wurde durch direkte Expression vereinigter cDNA-Fragmente in Affen-COS-7-Zellen abgesucht, einen Expressionsvektor aus Säuger (pDC201) gebrauchend, der regulatorische, von SV40 und Adenovirus-2 abstammende Sequenzen verwendet. Annähernd 720000 cDNAs wurden in Pools von ungefähr 1000 cDNAs abgesucht, bis ein Überstands-Assay eines transfektanten Pools den zehnfachen Anstieg von Thymidin-Einbau über Hintergrund anzeigte. Eine gefrorene Stammsuspension von Bakterien dieses positiven Pools wurde anschließend verwendet, um Platten von ungefähr 200 Kolonien zu erhalten. Plasmid-DNA der Kolonien jeder dieser Platten wurde vereinigt in COS-7-Zellen transformiert und ein positiver Pool wurde identifiziert. Individuelle Kolonien dieses Pools wurden abgesucht, bis ein einziger Klon durch direkte Synthese eines 25 Kilodalton-Proteins mit meßbarer IL-7-Aktivtät identifiziert wurde. Dieser Klon wurde isoliert und sein inseriertes Fragment sequenziert, um die codierende Sequenz der cDNA aus Maus zu bestimmen, die in Fig. 2 bekannt gemacht wird. Die cDNA beinhaltet eine lange, 548 Basenpaare umfassende untranslatierte Region, die an die Transkriptions- Initiationsstelle angrenzt. Die Start-Position für das reife Protein wurde durch Vergleich mit einer N-terminalen Aminosäure-Sequenz abgeleitet, die von hochgereinigten, aus A6-Zellüberständen stammenden IL-7-Präparationen erhalten wurde. Die codierende Region beinhaltet sechs Cysteinreste und zwei potentielle N- Glykosylierungsstellen.
  • Es wurden Sonden aus der Maus-Sequenz konstruiert und zum Absuchen von humanen genomischen DNA-Banken und humanen cDNA-Banken verwendet die aus Kulturen der humanen Leber-Adenokarzinom-Zellinie SK-HEP- 1 (ATCC HTB-52) abstammten. cDNA-Klone, die mit Oligonukleotid-Sonden, die von humanen genomischen Sequenzen abstammten und mit Sonden hybridisierten , die selektierte 3' und 5' untranslatierte Sequenzen des Maus-Gens umfaßten, wurden anschließend isoliert und sequenziert. Die auf diese Weise isolierte, vollständige cDNA-Sequenz ist in Fig. 4 dargestellt, und die abgeleitete codierende Sequenz ist in Fig. 5 abgebildet.
  • Menschliches IL-7 wird von einem Multi-Exon-Gen codiert. Bei der Isolierung des in Fig. 4 dargestellten cDNA-Klones wurden einige alternative mRNA- Konstrukte beobachtet, die verschiedenen Spleiß-Ereignissen nach der Transkription zugeschrieben werden können. Diese alternativen Konstrukte, die große Homologie- Bereiche mit den hierin beanspruchten cDNAs aufweisen, werden innerhalb des erfindungsgemäßen Anwendungsbereichs in Betracht gezogen.
    • 6. Synthetische DNA-Konstruktionen
  • In seiner Nukleinsäure-Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung Sequenzen, die Säugetier-IL-7e, IL-7-Analogons und Untereinheiten codieren. Beispiele für Säugetier-IL-7e beinhalten IL-7 aus Primaten, IL-7 aus Mensch und IL-7 aus Maus, Kaninchen, Katze Pferd, Rind, Schwein, Schaf, Hirsch und Ziege. IL-7- DNAs werden vorzugsweise in einer Form bereitgestellt, die befähigt ist, in einer rekombinanten Transkriptions-Einheit unter der Kontrolle von Transkriptions- oder Translations-Kontrollelementen aus Säugetieren, Mikroorganismen oder Viren exprimiert zu werden. Zum Beispiel wird eine Sequenz, die in einem Mikroorganismus exprimiert werden soll, keine Introns enthalten. In der bevorzugten Gestalt umfassen die DNA-Sequenzen mindestens eine, aber wahlweise mehr als eine Sequenz-Komponente, die von einer cDNA-Sequenz oder einer Kopie davon abstammt. Solche Sequenzen können verbunden sein mit oder flankiert sein durch DNA-Sequenzen, die durch den Zusammenbau synthetischer Oligonukleotide hergestellt werden. Exemplarische Sequenzen beeinhalten jene, die im wesentlichen homolog zu den in den Fig. 3 und Fig. 5 dargestellten Nukleotidsequenzen sind. Wahlweise können die codierenden Sequenzen Codons beeinhalten, die eine oder mehrere zusätzliche, am N-Terminus gelegene Aminosäuren beeinhalten, z. B. ein N-terminales ATG-Codon, welches ein Methionin bestimmt, das im Leseraster mit der Nukleotid-Sequenz verbunden ist. Wegen der Degenerierung des Codes kann eine erhebliche Variierung in Nukleotid-Sequenzen vorliegen, die die gleiche Aminosäure-Sequenz codieren; eine exemplarische DNA-Ausführungsform ist diejenige, die der Sequenz von Nukleotiden 1-387 in Fig. 3 entspricht. IL-7- Proteine codierende synthetische DNA-Sequenzen die Nukleotid-Sequenzen beinhalten, welche verändert werden, um Restriktionsstellen oder bevorzugte Codon- Verwendung für bakterielle Expression einzuführen, sind im Anwendungsbereich der Erfindung mit eingeschlossen.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch Expressionsvektoren, um brauchbare Mengen von gereinigtem IL-7 zu produzieren das synthetische oder von cDNA abstammende DNA-Fragmente umfassen kann, die Säugetier-IL-7e oder IL-7- Analogons oder Untereinheiten codieren, die einsatzbereit mit regulatorischen Elementen aus Säuger-, Bakterien-, Hefe-, Bakteriophagen- oder viralen Genen verbunden sind. Brauchbare regulatorische Elemente werden detaillierter weiter unten beschrieben. Nach der Transformation oder Transfektion einer geeigneten Zellinie können solche Vektoren induziert werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren.
    • 7. Rekombinante Expressions-Systeme
  • Säuger-IL-7e können in Säugetier- oder Insekten-Zellen, Hefe-, Bakterien- oder anderen Zellen unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors exprimiert werden. Zellfreie Translations-Systeme könnten auch eingesetzt werden, um Säuger-IL-7 zu produzieren, wobei RNAs verwendet werden, die von den erfindungsgemäßen DNA- Konstrukten abstammen. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit Bakterien-, Pilz-, Hefe- und Säugetier-Wirtszellen sind beschrieben durch Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985), deren erhebliche Offenbarung hierdurch in Form der Referenz eingeschlossen ist.
  • Verschiedene Säuger-Zellkultur-Systeme können eingesetzt werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren. Beispiele von Expressions-Systemen aus Säuger schließen die COS-7-Linien von Affen-Nieren-Fibroblasten ein, die von Gluzman, Cell 23 : 175 (1981) beschrieben wurden, und andere Zellinien, die befähigt sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, z. B. die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zellinien. Säuger-Expressionsvektoren können nicht-transkribierte Elemente umfassen, wie einen Replikations-Ursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer und andere 5'- oder 3'-flankierende nicht-transkribierte Sequenzen und 5'- oder 3'- untranslatierte Sequenzen, wie notwendige Ribosomen-Bindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleißdonor- und -akzeptor-Stellen und Terminations- Sequenzen. Vom SV40-viralen Genom stammende DNA-Sequenzen, z. B. SV40- Ursprung, früher Promotor, Enhancer, Spleiß- und Polyadenylierungs-Stellen können verwendet werden, um die anderen genetischen Elemente, die für die Expression einer heterologen DNA-Sequenz erforderlich sind, zu liefern. Zusätzliche Details betreffs der Verwendung von Säuger- Hochexpressions-Vektoren zur Produktion eines rekombinanten Säuger-IL-7 werden in den Beispielen 3 und 8 weiter unten geliefert. Exemplarische Vektoren können konstruiert werden, wie bekanntgemacht wurde bei Okayama und Berg, Mol. Cell. Biol. 3 : 280 (1983), Cosman et al., Nature 312 : 768 (1984), Cosman et al., Mol. Immunol. 23 : 935 (1986) oder Clark et al., U.S. Patent 4675285.
  • Hefesysteme, die bevorzugt Saccharomyces-Arten, wie S. cerevisiae, einsetzen, können auch zur Expression der rekombinanten Proteine dieser Erfindung eingesetzt werden, ebenso wie Hefen anderer Gattungen, z. B. Pichia oder Kluyveromyces.
  • Im allgemeinen werden brauchbare Hefe-Vektoren Replikations-Ursprünge und selektierbare Marker beeinhalten, die die Transformation sowohl von Hefe, als auch von E. coli erlauben, z. B. das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae-TRP1-Gen und einen Promotor, der von einem hoch-exprimierten Hefe- Gen abstammt, um die Transkription einer stromabwärts gelegenen strukturellen Sequenz zu induzieren. Solche Promotoren können von Hefe-Transkriptions-Einheiten abgeleitet werden, die hoch-exprimierte Gene codieren, wie u. a. 3- Phosphoglyceratkinase (PGK), α-Faktor, Saure Phosphatase oder Hitzeschock- Proteine. Die heterologe strukturelle Sequenz wird zusammengebaut im geeigneten Raster mit Translations-Initiations- und -Terminations-Sequenzen und bevorzugt einer Leader-Sequenz, die befähigt ist, die Sekretion translatierten Proteins in das extrazelluläre Medium zu dirigieren. Wahlweise kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein codieren, beinhaltend ein N-terminales Identifizierungs-Peptid (z. B. Asp-Tyr-Lys-(Asp)&sub4;-Lys) oder andere Sequenzen, die gewünschte Qualitäten vermitteln, z. B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten, rekombinanten Produkts.
  • Brauchbare Hefe-Vektoren können zusammengebaut werden durch Verwendung von DNA-Sequenzen von pBR322 für die Selektion und Replikation in E. coli (Ampr- Gen und Replikations-Ursprung) und Hefe-DNA-Sequenzen, die einen Glucosereprimierbaren Alkoholdehydrogenase 2 (ADH2)-Promotor beinhalten. Der ADH2- Promotor wurde beschrieben von Russell et al., J. Biol. Chem. 258 : 2674 (1982) und Beier et al., Nature 300 : 724 (1982). Solche Vektoren können ebenso ein Hefe-TRP1- Gen als selektierbaren Marker und den Hefe 2u-Replikationsursprung beinhalten. Eine Hefe-Leader-Sequenz, z. B. der α-Faktor-Leader, der die Sekretion von heterologen Proteinen aus einem Hefe-Wirt dirigiert, kann zwischen den Promotor und die zu exprimierenden strukturellen Gene inseriert werden. Siehe Kurjan et al., U.S. Patent 4546082; Kurjan et al., Cell 30 : 933 (1982); und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 5330 (1984). Die Ieeader-Sequenz kann verändert werden, um nahe ihres 3'- Endes eine oder mehrere brauchbare Restriktionsstellen zu erhalten, die die Fusion der Leader-Sequenz mit fremden Genen erleichtern.
  • Geeignete Hefe-Transformations- Protokolle sind den Durchschnitts-Fachleuten bekannt; eine exemplarische Technik wird beschrieben von Hinnen et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 : 1929 (1978), worin selektiert wird nach Trp&spplus;-Transformanten in einem selektiven Medium bestehend aus 0,67% Hefe-Stickstoff-Basis, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glucose, 10 ug/ml Adenin und 20 ug/ml Uracil.
  • Wirtsstämme, die transformiert werden durch Vektoren, umfassend den ADH2- Promotor, können zur Expression angezogen werden in einem Vollmedium bestehend aus 1% Hefe-Extrakt, 2% Pepton und 1% Glucose, angereichert mit 80 ug/ml Adenin und 80 ug/ml Uracil. Die Aufhebung der Reprimierung des ADH2-Promotors tritt ein bei Erschöpfung der Medium-Glucose. Die Überstände der Hefe-Rohextrakte werden durch Filtration geerntet und vor der weiteren Reinigung bei 4ºC aufbewahrt. Die Verwendung eines Hefe-Expressions-Systems zur Produktion eines rekombinanten Säuger-IL-7 wird in Beispiel 4 weiter unten beschrieben.
  • Geeignete Expressions-Vektoren für die Verwendung in Bakterien werden konstruiert durch die Inserierung einer strukturellen DNA-Sequenz, die Säuger-IL-7 zusammen mit geeigneten Translations-Initiations- und -Terminations-Signalen codiert in einen betriebsbereiten Leserahmen mit einem funktionellen Promotor. Der Vektor wird einen oder mehrere phänotypische selektierbare Marker und einen Replikations- Ursprung umfassen, um die Amplifikation innerhalb des Wirts zu sichern. Geeignete prokaryotische Wirte für die Transformation schließen ein E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl andere ebenso für diesen Zweck eingesetzt werden können.
  • Expressionsvektoren werden günstigerweise konstruiert durch Spaltung von cDNA-Klonen an Stellen nahe des Codons, welches den N-terminalen Rest des reifen Proteins codiert. Z.B. kann cDNA aus Maus gespalten werden mit NdeI oder ClaI oder menschliche cDNA mit ClaI, um ein Fragment zu erzeugen, das im wesentlichen umfaßt die gesamte codierende Region. Synthetische Oligonukleotide können dann benutzt werden, um jeden deletierten Anteil der codierenden Region wiederherzustellen und um eine verbindende Sequenz für die Ligierung des codierenden Fragments in einem geeigneten Leseraster mit einem Expressions-Vektor zu liefern und wahlweise ein Codon, das ein Initiator-Methionin spezifiziert.
  • Als ein repräsentatives, aber nicht begrenzendes Beispiel können geeignete Expressionsvektoren für den Gebrauch in Bakterien umfassen einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikations-Ursprung, der von kommerziell erhältlichen Plasmiden abstammt, umfassend genetische Elemente des bekannten Klonierungs-Vektors pBR322 (ATCC 37017). Solche kommerziellen Vektoren beeinhalten z. B. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322-"Rückgrat"-Anteile werden kombiniert mit einem geeigneten Promotor und der strukturellen. Zu exprimierenden Sequenz. Ein besonders brauchbares bakterielles Express ions-System setzt den Phagen λ PL-Promotor und den cI857ts thermolabilen Repressor ein. Plasmidvektoren, die bei der American Type Culture Collection erhältlich sind, die Abkömmlinge des λ PL-Promotors beeinhalten, schließen das Plasmid pHUB2 im E. coli-Stamm JMB9 (ATCC 37092) und pPLc28, in E. coli RRI (ATCC 53082) ein. Andere nützliche Promotoren für die Expression in E. coli schließen den T7-RNA- Polymerase-Promotor ein, beschrieben von Studier et al., J. Mol. Biol. 189 : 113 (1986), den lacZ-Promotor, beschrieben von Lauer, J. Mol. Appl. Genet. 1 : 139-147 (1981) und erhältlich unter ATCC 37121 und den tac-Promotor, beschrieben von Maniatis, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p 412) und erhältlich unter ATCC 37138.
  • Nach der Transformation eines geeigneten Wirts-Stammes und Wachstum des Wirts-Stammes bis zu einer geeigneten Zelldichte wird der ausgewählte Promotor dereprimiert mit geeigneten Mitteln (z. B. Temperaturwechsel oder chemische Induktion), und die Zellen werden für eine zusätzliche Zeitspanne kultiviert. Im allgemeinen werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen, und der resultierende Rohextrakt wird für die weitere Reinigung zurückbehalten. Die Zellen werden z. B. in einem 10 Liter- Fermenter herangezogen anwendend Bedingungen für größtmögliche Durchlüftung und kräftiges Schütteln. Bevorzugt wird ein Agens gegen Schaumbildung angewendet (Antifoam A). Die Kulturen werden herangezogen bei 30ºC im Überinduktions- Medium, bekanntgemacht durch Mott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 88 (1985), wahlweise enthaltend Antibiotika, und dereprimiert bei einer Zelldichte von A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,4-0,5 durch Erhöhung der Temperatur auf 42ºC und geerntet nach 2-20, bevorzugt 3-6 Stunden nach der Erhöhung der Temperatur. Die Zellmasse wird eingangs konzentriert durch Filtration oder andere Mittel, dann zentrifugiert bei 10000 · g für 10 Minuten bei 4ºC, gefolgt von schnellem Einfrieren des Zellsediments.
  • Der Gebrauch eines bakteriellen Expressions-Systems zur Produktion eines rekombinanten Säuger-IL-7 wird weiter unten in Beispiel 5 beschrieben.
    • 8. Reinigungsprozeduren
  • Bevorzugt werden gereinigte Säuger IL-7e oder bioäquivalente Homologe durch Kultivierung geeigneter Wirt/Vektor-Systeme präpariert, um die rekombinanten Translationsprodukte der erfindungsgemäßen synthetischen Gene zu exprimieren, die dann aus Kultur-Medien gereinigt werden.
  • Ein alternatives Verfahren zum Produzieren von gereinigtem IL-7 schließt die Reinigung aus Zellkultur-Überstanden ein. In diesem Ansatz wird eine Zellinie verwendet, die brauchbare Mengen des Proteins entwickelt. Überstände einer solchen Zellinie können wahlweise konzentriert werden durch Verwendung eines käuflich erhältlichen Protein-Konzentrations-Filters, z. B. einer Amicon (Warenzeichen von W.R. Grace & Co., Danvers, MA, USA) oder Pellicon (Warenzeichen der Millipore Corp., Bedford, MA, USA) Ultrafiltrations-Einheit. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf ein geeignetes Anionen-Austausch-Harz gegeben werden, z. B. eine Matrix oder ein Substrat, die anhängende Diethylaminoethyl (DEAE)- Gruppen tragen. Die Matrizen können bestehen aus Acrylamid, Agarose, Dextran' Zellulose oder anderen gewöhnlich in der Proteinreinigung angewendeten Sorten. Eine bevorzugte Matrix ist DEAE-Sephacel (Pharmacia). Wenn DEAE-Gruppen beinhaltende Medien angewendet werden, werden die IL-7-enthaltenden Extrakte bei einem schwach basischen pH (z. B. pH 8) und bei Natriumchlorid-Konzentrationen (oder geeigneten Salzen) von ungefähr 100 mM aufgegeben. Viele kontaminierende Protein binden an den Ionenaustauscher, während IL-7 in den ungebundenen Fraktionen wiedererlangt wird.
  • Auf die Anionen-Austausch-Chromatographie folgend, kann ein Kationen- Austausch-Schritt ausgeführt werden. In diesem Schritt werden IL-7 enthaltende Fraktionen unter schwach sauren und Niedrig-Salz- Bedingungen (z. B. pH 5, 100 mM NaCI) auf einen Kationen-Austauscher gegeben. IL-7 wird an den Austauscher gebunden und kann in einer gereinigteren Form mit höheren Salz-Konzentrationen und bei einem schwach basischen pH-Wert eluiert werden. Geeignete Kationen- Austauscher schließen verschiedene unlösliche Matrizen ein, die Sulfopropyl- oder Carboxymethyl-Gruppen beeinhalten. Sulfopropyl-Gruppen werden bevorzugt. Ein geeignetes Material für die IL-7-Reinigung ist SP-Trisacryl (Pharmacia-LKB). Nach der Kationen-Austausch-Chromatographie wurde ein Affinitätsschritt unter Verwendung einer mit einem blauen Farbstoff versehenen Matrix als notwendig befunden. Geeignete Farbstoff-Liganden schließen Blue B ein, das als Konjugat mit Agarose erhältlich ist (Blue B Agarose). Andere Farbstoff-Liganden-Äquivalente können ebenfalls verwendet werden. Schließlich können eine oder mehrere Revertierte-Phasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (RP-HPLC)-Schritte unter Verwendung hydrophober RP-HPLC-Medien, z. B. Silica-Gel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen, zur weiteren Reinigung einer IL-7- Zusammensetzung verwendet werden. Einige oder alle der genannten Reinigungs- Schritte, in verschiedenen Kombinationen, können auch angewendet werden, um ein homogenes, rekombinantes Protein bereitzustellen.
  • In Bakterien-Kulturen produziertes rekombinantes Protein wird gewöhnlich gereinigt durch anfängliche Extraktion aus Zell-Sedimenten, gefolgt von einem oder mehreren Konzentrations-, Aussalzungs-, wäßrigen Ionen-Austausch- oder Größen- Ausschluß-Chromatographie-Schritten. Das Protein kann nach bakterieller Expression renaturiert werden durch Kontakt mit einem katalytischen, reduzierenden Agens bei einer Protein-Konzentration von 10-50 ug/ml in Anwesenheit von 1-6 M Guanidinium-HCl zur Verhinderung der Aggregation. Schließlich kann Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (H PLC) für die endgültigen Reinigungsschritte angewendet werden. Mikrobielle Zellen, angewendet in der Expression des rekombinanten Säuger-IL-7, können durch jede geeignete Methode aufgebrochen werden, einschließlich Gefrier- und Auftau-Zyklen, Beschallung, mechanischer Disruption oder des Gebrauchs Zell-lysierender Wirkstoffe.
  • Fermentierung von Hefe, die Säuger-IL-7 als sezerniertes Protein exprimieren, vereinfachen die Reinigung beträchtlich. Sezerniertes rekombinantes Protein, resultierend aus einer Fermentation im großen Maßstab, kann gereinigt werden durch Methoden, wie beschrieben von Urdal et al., J. Chromatog. 296 : 171(1984). Diese Referenz beschreibt zwei aufeinanderfolgende Reversed-Phase-HPLC-Schritte für die Reinigung rekombinanten Säuger-GM-CSFs auf einer präparativen HPLC-Säule.
  • "Gereinigte wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Säuger-IL-7- Zusammensetzung mit einer spezifischen Aktivität von mindestens ungefähr 10&sup4; Einheiten pro Mikrogramm (ug) Protein in einem Prä-B-Zell-Proliferations-Assay, beschrieben an anderer Stelle in der Patentschrift. Bevorzugt zeigen gereinigte IL-7- Zusammensetzungen spezifische Aktivitäten von mindestens ungefähr 10&sup5;Einheiten/kg.
    • 9. Biologisch aktive Protein-Analoga
  • In ihren verschiedenen Protein-Ausführungsformen liefert die vorliegende Erfindung im wesentlichen homogene rekombinante Säuger-IL-7-Peptide frei von kontaminierenden endogenen Materialien und wahlweise ohne assoziierte native Glykosylierungsmuster. Die nativen Mäuse- und Säuger-IL-7-Moleküle werden aus der Zell-Kultur erhalten als Glykoproteine mit einem apparenten Molekulargewicht bei SDS-PAGE von ungefähr 25 Kilodalton (kD). In Säuger-Expressions-Systemen, z. B. COS-7-Zellen, exprimierte IL-7e können ähnlich oder leicht unterschiedlich in Molekulargewicht und Glykosylierungsmustern zu den nativen Molekülen sein, abhängig vom Expressions-System. Expression von IL-7-DNAs in Bakterien, wie E. coli, liefert nicht-glykosylierte Moleküle mit einem apparenten Molekulargewicht von ungefähr 16 kD bei der SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen.
  • Rekombinante IL-7-Proteine innerhalb des erfindungsgemäßen Bereichs schließen auch Mäuse- und Säuger-IL-7e mit N-terminalem Methionin ein.
  • Zusätzliche erwartete Ausführungsformen sind Säuger-IL-7e, exprimiert als Fusionsproteine mit Polypeptid- Leadern umfassend die Sequenz Asp-Tyr-Lys- (Asp&sub4;)-Lys oder andere geeignete Peptid- oder Protein-Sequenzen, angewendet als Hilfsmittel für die Expression in Mikroorganismen oder die Reinigung von mikrobiell-exprimierten Proteinen.
  • Bioäquivalente und biologisch aktive Homologe oder Analoge der erfindungsgemäßen Proteine schließen verschiedene Muteine ein, z. B. verkürzte Versionen der IL-7e, in denen terminale oder interne, nicht für die biologische Aktivität benötigte Reste oder Sequenzen deletiert sind und auch Alloproteine, wie beschrieben von Koide et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 6237 (1988). Wie hierin verwendet wird, bedeuten die Ausdrücke "bioäquivalent" und "biologisch aktiv", daß ein bestimmtes Protein die biologische Aktivität eines nativen IL-7- Molekül aufweist. Andere hierin betrachtete Muteine sind diejenigen, bei denen ein oder mehrere Cystein-Reste deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt worden sind, z. B. neutrale Aminosäuren, um eine begünstigtere Renaturierung oder Stabilitätsmerkmale zu erlangen. Andere Annäherungen an Mutagenese beinhalten die Modifizierung von angrenzenden dibasischen Aminosäuren, um die Expression in Hefe-Systemen, in denen die KEX2-Protease anwesend ist, zu steigern, oder die Modifizierung von Protein-Sequenzen, um eine oder mehrere N-gekoppelte Glykosylierungsstellen zu eliminieren. Es wurde auch beobachtet, daß Deletion der Reste 121-139 des humanen IL-7-Moleküls, die keine Gegenstücke im Mäuse-IL-7 haben, die biologische Aktivität in Mäuse- oder menschlichen Prä-B-Zell-Assay- Systemen nicht unterdrücken.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet "mutante Aminosäure-Sequenz" ein Polypeptid, das durch eine Nukleotid-Sequenz codiert wird, absichtlich abweichend von der nativen Sequenz hergestellt. "Mutantes Protein" oder "Mutein" bedeutet ein Protein, beinhaltend eine mutierte Aminosäuresequenz. "Native Sequenz" bezieht sich auf eine Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenz, die identisch ist zur Wildtyp- oder nativen Form eines Gens oder Proteins. Die Ausdrücke "KEX2-Protease-Erkennungsstelle" und "N-Glykosylierungsstelle" werden weiter unten definiert. Der Ausdruck "inaktivieren", wie verwendet zur Definition bestimmter erfindungsgemäßer Aspekte, bedeutet, eine ausgewählte KEX2-Protease-Erkennungsstelle zu verändern, um die Spaltung durch die KEX2-Protease von Saccharomyces cerevisiae zu verzögern oder zu verhindern, oder um eine N-Glykosylierungsstelle zu verändern, damit die kovalente Bindung von Oligosaccharid-Einheiten zu bestimmten Aminosäure-Resten verhindert wird.
  • Ortsspezifische Mutagenese-Verfahren können angewendet werden zur Inaktivierung von K1EX2-Protease-Prozessierungsstellen durch Deletion, Addition oder Substitution von Resten zur Veränderung von Arg-Arg-, Arg-Lys- und Lys-Arg- Paaren, um das Vorkommen von diesen benachbarten basischen Resten zu eliminieren. Lys-Lys-Paarungen sind erheblich weniger zugänglich für KEX2- Spaltung und die Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg zu Lys-Lys stellt einen konservativen und bevorzugten Ansatz zur Inaktivierung von KEX2-Stellen dar. Die resultierenden Muteine sind weniger zugänglich für die Spaltung durch KEX2- Protease an Stellen, die verschieden sind von der Hefe-α-Faktor-Leader-Sequenz, an der die Spaltung während der Sekretion beabsichtigt ist.
  • Viele sezernierte Proteine erwerben nach der Translation kovalent gebundene Kohlenhydrat-Einheiten, oft in der Form von Kohlenhydrat-Einheiten, gebunden an Asparagin-Seitenketten durch N-glykosidische Bindungen. Sowohl die Struktur als auch die Anzahl der Kohlenhydrat-Einheiten, die an ein bestimmtes sezerniertes Protein gebunden sind, können stark variabel sein, was in einer großen Spanne von apparenten, einem einzelnen Glykoprotein zuzuweisenden Molekulargewichten resultiert. mIL-7 und hIL-7 sind sezernierte Glykoproteine dieses Typs. Versuche, Glykoproteine in rekombinanten Systemen zu exprimieren, können kompliziert werden durch die diesem variablen Kohlenhydrat-Anteil zuzuweisende Heterogenität. Zum Beispiel können gereinigte Mischungen rekombinanter Glykoproteine, wie humanen oder Mäuse-Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF) aus 0-50 Gew.- % Kohlenhydrat bestehen. Miyajima et al., EMBO Journal 5 : 1193 (1986) beschrieben die Expression eines rekombinanten Mäuse-GM-CSF, in dem die N-Glykosylierungsstellen mutiert worden waren, um die Glykosylierung zu verhindern und die Heterogenität des in Hefe exprimierten Produkts zu reduzieren.
  • Die Anwesenheit variabler Mengen gebundener Kohlenhydrate in rekombinanten, sezernierten Glykoproteinen erschwert die Reinigungs-Verfahren und reduziert dadurch die Ausbeute. Zusätzlich besteht die Möglichkeit, falls das Glykoprotein als therapeutisches Agens eingesetzt werden soll, daß die Empfänger allergische Reaktionen zu den Hefe-Kohlenhydrat-Einheiten entwickeln werden, worauf die Therapie eingestellt werden muß. Aus diesen Gründen können biologisch aktive, homogene Analogons von immun-regulatorischen Glykoproteinen, die reduzierte Kohlenhydrate besitzen, für die therapeutische Verwendung wünschenswert sein.
  • Funktionelle mutante Analogons von Säuger-IL-7en mit inaktivierten Glykosylierungsstellen können produziert werden durch Oligonukleotid-Synthese und Ligierung oder durch ortsspezifische Mutagenese-Techniken, wie weiter unten beschrieben. Diese analogen Proteine können in einer homogenen Form mit reduzierten Kohlehydraten in einer guten Ausbeute mit Hefe-Expressions-Systemen hergestellt werden. N-Glykosylierungsstellen in eukaryotischen Proteinen sind durch das Aminosäure-Triplett Asn-A¹-Z charakterisiert, wobei A¹ jede Aminosäure mit Ausnahme von Pro und Z entweder Ser oder Thr darstellt. In dieser Sequenz liefert Asparagin eine Seitenketten-Aminogruppe für die kovalente Anheftung von Kohlenhydrat. Eine solche Stelle kann eliminiert werden, indem Asn oder der Rest Z durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, oder indem Asn oder Z deletiert wird, oder indem zwischen A¹ und Z eine Nicht-Z-Aminosäure oder zwischen Asn und A¹ eine andere Aminosäure als Asn inseriert wird. Bevorzugt werden konservative Austausche gemacht, d. h. die bevorzugten Ersatz-Aminosäuren sind jene, die physiko-chemische Charakteristika besitzen, ähnelnd der zu ersetzenden Aminosäure. Ähnlich sollte, wenn eine Deletions- oder Insertions-Strategie angewendet wird, der potentielle Effekt der Deletion oder Insertion auf die biologische Aktivität erwogen werden.
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen, besonderen Muteinen können, wenn gewünscht, zahlreiche DNA-Konstruktionen, beinhaltend die ganzen oder einen Teil der Nukleotid-Sequenzen, beschrieben in den Fig. 1-5, in Verbindung mit Oligonukleotid-Kassetten, die zusätzliche nützliche Restriktionsstellen umfassen, hergestellt werden. Mutationen können eingeführt werden an speziellen Loci durch die Synthese von Oligonukleotiden, die eine mutante Sequenz beinhalten, flankiert von Restriktionsstellen, die die Ligierung an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Nach der Ligierung codiert die resultierende rekonstruierte Sequenz ein Mutein, das die gewünschte Aminosäure-Insertion, -Substitution oder -Deletion enthält.
  • Alternativ können Oligonukleotid-gerichtete, ortsspezifische Mutagenese- Verfahren angewendet werden, um ein verändertes Gen zu liefern, das bestimmte Codons verändert hat. Übereinstimmend mit der erforderten Substitution, Deletion oder Insertion. Walder et al., Gene 42 : 133 (1986); Bauer et al., Gene 37 : 73 (1985); Craik, Biotechniques, January 1985, 12-19; Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods (Plenum Press, 1981); und U.S. Patent 4518584 beschreiben geeignete Techniken und sind hierin als Referenz aufgenommen.
  • In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Aminosäure-Sequenz von IL-7 mit einer Hefe-α-Faktor-Leader-Sequenz durch ein N-terminales Fusions- Konstrukt verbunden, umfassend ein Nukleotid, das das Peptid Asp-Tyr-Lys-Asp- Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) codiert. Die letztere Sequenz ist stark antigen und stellt ein Epitop bereit, das reversibel durch einen spezifischen, monoklonalen Antikörper gebunden wird, was eine schnelle Bestimmung und einfache Reinigung des exprimierten, rekombinanten Proteins ermöglicht. Diese Sequenz wird auch spezifisch gespalten durch Rinder-Mucosa-Enterokinase an dem Rest, der direkt auf das Asp- Lys-Paar folgt. Fusionsproteine, die mit diesem Peptid geschützt sind, können auch gegen intrazellulären Abbau in E. coli resistent sein. Eine alternative Konstruktion ist Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Glu-Ile-Gly-Arg-Pro das eine Faktor-X- Erkennungsstelle direkt 3' von der Enterokinase-Stelle liefert.
    • 10. Verabreichung von IL-7
  • In Aspekten bezüglich der Zusammensetzung und der Anwendungs-Verfahren liefert die vorliegende Erfindung therapeutische Zusammensetzungen, umfassend eine wirksame Menge jedes der erfindungsgemäßen Säuger-IL-7-Proteine und ein geeignetes Verdünnungsmittel oder einen Träger und Verfahren zur Stimulierung der B- und/ oder T-Lymphozyten-Entwicklung oder -Proliferation oder zur Modulierung oder Verstärkung der Immun-, lymphopoetischen oder hämatopoetischen Antwort in Säugern, einschließlich Menschen, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge jeder der vorher genannten Zusammensetzungen. Der Gebrauch in Verbindung oder Beimischung mit anderen Lymphokinen, z. B. IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, CSF-1, GM-CSF oder G-CSF, IFN-β, IFN-β oder IFN-τ wird auch erwogen.
  • Zur therapeutischen Anwendung wird ein gereinigtes IL-7 einem Säuger zur Behandlung in einer der Indikation angemessenen Weise verabreicht. Folglich kann z. B. eine Säuger-IL-7-Zusammensetzung verabreicht als Stimulator der Prä-B- oder Prä-T-Zell-Proliferation oder als Modulator der Immun- oder hämatopoetischen Effektor-Zellentwicklung, -Proliferation oder -Funktion als Bolus-Injektion, kontinuierliche Infusion oder durch Dauer-Freisetzung aus Implantaten oder mittels anderer geeigneter Verfahren gegeben werden. Typischerweise wird ein IL-7- Therapeutikum verabreicht in Form einer Zusammensetzung, umfassend das gereinigte Protein in Verbindung mit physiologisch akzeptablen Trägern, Vehikeln oder Verdünnungsmitteln. Neutral gepufferte Salzlösungen oder Salzlösungen, gemischt mit einem konspezifischen Serumalbumin sind exemplarische, geeignete Verdünnungsmittel. Bevorzugterweise wird das Produkt als Lyophilisat formuliert, geeignete Träger-Lösungen (z. B. Saccharose) als Verdünnungsmittel verwendend. Geeignete Dosierungen können in Versuchen ermittelt werden; im allgemeinen kann erwartet werden, daß Dosierungen von 10 ng bis 100 ug/kg/Tag, bevorzugterweise 100 ng bis 1 ug/kg/Tag über 1-20 Tage, eine biologische Wirkung induzieren. Z.B. können Bolus-Injektionen von 1 u/kg in 4-Tage-Intervallen als Stimulator der hämatopoetischen Zellentwicklung gegeben werden.
  • Die folgenden Beispiele illustrieren spezielle, erfindungsgemäße Aspekte, enthaltend die Reinigung von nativem IL-7 der Maus, Klonierung und Expression von Genen, die Maus- und menschliche IL-7-Proteine codieren, Reinigung rekombinanter Maus- und menschliche IL-7-Proteine zur Homogenität. biologische Assays, die die Verwendung von gereinigten IL-7-Proteinen beinhalten, und Verabreichung von gereinigten IL-7-Proteinen an Säuger in einem therapeutischen Modellsystem. In den Beispielen wurden alle Verfahren, die die Verwendung von DNA-Enzymen, z. B. Restriktionsendonukleasen und DNA-Polymerasen beinhalten, den Vorschriften des Herstellers entsprechend durchgeführt. Alle Proben wurden mit ³²P markiert. Andere Standard-Nukleinsäure-Manipulationstechniken sind im wesentlichen ähnlich zu denen, die von Maniatis, siehe oben, und von Ausubel et al., Herausg., Current Protocols in Molecular Biology (Wiley-lnterscience, Media, PA, USA) beschrieben wurden.
    • Beispiel 1: Erzeugung einer Maus-IL-7 produzierenden Zellinie (IxN/A6) durch Transfektion: Reinigung von Maus-IL-7 aus Zellüberständen
  • Adhärente Knochenmark-Stroma-Zellen wurden mit dem Plasmid pSV3neo das SV40-T-Antigen-transformierende Sequenzen enthält, mit der Calciumphosphat- Methode, wie bei Southern et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 : 327 (1982), and Graham et al., Virology 52 : 456 (1973) beschrieben, transfiziert; modifiziert nach Wigler et al., Cell 14 : 725 (1978). Die transfizierten, adhärenten Zellen wurden mit Trypsin:EDTA entfernt und durch limitierende Verdünnung kloniert. Die Überstände der resultiernden Klone wurden auf IL-7-Aktivität getestet und der beste Produzent wurde für weitere Studien angereichert. Diese Zellinie wurde monatlich auf Mycoplasmen mit kommerziell erhältlichen Mycoplasma-Detektions-Kits überprüft.
  • Die von den IxN/A6-Zellen mit IL-7 angereicherten Medien wurden in 1750 cm²-Zellkultur-Rollflaschen (Falcon #3029) in der folgenden Weise hergestellt. Nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurde das Medium durch 1 Liter/Rollflasche von serumfreien RPMI, supplementiert mit 2,3 gm/l Glucose und 1,54 gm/l Natriumhydrogencarbonat und mit 1 ug/ml S. typhimurium LPS als Stimulans, ersetzt. Die Flaschen wurden mit 10% CO&sub2; in Luft begast und für sechs Tage inkubiert. Der Überstand wurde geerntet und 20-fach in einem Amicon DC10- Hohlfaser-Apparat (10000 MW Ausschluß-Größe) konzentriert. Die Rohkonzentrate wurden vor Assay und Reinigung durch Filtration sterilisiert.
  • Ein Liter des konzentrierten, konditionierten Rohmediums wurde mit 1 N NaOH auf pH 8 eingestellt und mit sterilem, destilliertem Wasser auf eine Leitfähigkeit von 1 mSiemens/cm eingestellt (eine Leitfähigkeit von mSiemens/cm entspricht einer NaCl-Konzentration von 100 mM auf einem Radiometer CDM83- Leitfähigkeitsmeßgerät. Das Konzentrat wurde dann auf eine DEAE-Sephacel- (Pharmacia) Säule (5,0 · 15 cm) aufgetragen, die zuvor mit 20 mM Tris-HCl (pH 8), enthaltend 100 mM NaCl äquilibriert worden war. Der Auslauf wurde bei einer OD&sub2;&sub8;&sub0; überwacht und die protein-enthaltende Durchfluß-Fraktion wurde für weitere Reinigung gesammelt.
  • Die nichtbindende Fraktion der DEAE-Säule wurde mit 1 M Zitronensäure (freie Säure) auf pH 5 eingestellt und wurde anschließend direkt auf eine SP- Trisacryl-(Pharmacia-LKB) Säule (3,2 · 12,5 cm) aufgetragen die zuvor mit 10 mM Citrat (pH 5,0), enthaltend 100 mM NaCl equilibriert worden war. Die Säule wurde mit 5 Säulenvolumina des Äquilibrierungspuffers und anschließend mit 5 Säulenvolumina 20 mM Tris-HCl (pH 8) gewaschen. Nachdem der pH des Säulen- Ausflusses pH 8 erreicht hatte und die OD&sub2;&sub8;&sub0; den Nullwert erreicht hatte, wurde die Säule mit 1 l eines linearen Gradienten von 0,0-0,5 M Natriumchlorid in 20 mM Tris- HCL (pH 8) eluiert. Die Elution wurde bei einer Durchflußrate von 50 ml/Std. durchgeführt, wobei 10 ml-Fraktionen gesammelt und auf die Anwesenheit von IL-7 untersucht wurden.
  • Die vereinigten IL-7 enthaltenden Fraktionen zweier getrennter SP-Trisacryl- Elutionen wurden vereinigt und direkt auf eine Blue B-Agarose-(Amicon Corp., Danvers, MA, USA) Säule aufgetragen, die zuvor mit 20 mM Tris-HCL (pH 8), enthaltend 125 mM NaCl äqulibriert worden war. Die Probe wurde mit einer Flußrate 15 ml/Std. aufgetragen. Nachdem mit Equilibrierungspuffer gewaschen wurde bis die OD&sub2;&sub8;&sub0; den Nullwert erreicht hatte, wurde die Säule mit 1 Liter eines linearen Gradienten von 0,125 bis 2 M NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 8) eluiert. Zehn ml- Fraktionen wurden bei einer Flußrate von 25 ml/Std. gesammelt und auf IL-7- Aktivität untersucht.
  • Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (High performance liquid chromatography, HPLC) wurde mit einem Waters Associates (Milford, MA) Flüssigkeits Chromatographen ausgeführt, der ausgestattet war mit zwei Modell-510 Pumpen, einem Modell-720 System-Regler und einem Modell-441- Absorptionsdetektor, wobei im wesentlichen bei 214 nm gemessen wurde wie von Urdal et al., J. Chrom. 296 : 171(1984) beschrieben wurde. Große Probenvolumina wurden auf die Säulen mit einer Minipumpe gepumpt.
  • Die Fraktionen, die IL-7-Aktivität aus dem Blue-B-Agarose-Chromatographie- Schritt besaßen, wurden bei einer Flußrate von 5 ml/min. auf eine 8 mm · 10 cm radiale PAK-Kassette (Waters Associates), die 15-20 u Vydac C-4 Revertierte-Phase- Kieselerde (Separations Group, Hesperia, CA, USA) beinhaltete, aufgetragen. Wasser, das 0, 1% Trifluoressigsäure (TFA, Lösungsmittel A) beinhaltete, wurde durch die Säulen gespült, bis die Absorption bei 214 den Nullwert erreicht hatte. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein linearer Gradient eingesetzt, führend von 0 bis 100% Lösungsmittel B (Acetonitril, beinhaltend 0, 1% TFA) bei einer Rate von 1% Lösungsmittel B/min. und einer Flußrate von 1 ml/min.
  • Aktive Fraktionen nach einer einzigen HPLC wurden gesammelt, mit zwei Volumina 0,9 M Essigsäure und 0,2 M Pyridin ( pH 4,0, Puffer A&sub2;) verdünnt und auf die selbe Säule nach der Re-Equilibrierung im Pyridin-Acetat-Lösungsmittel- System aufgetragen. Ein Gradient von Lösungsmittel B&sub2; (0,9 M Essigsäure, 0,2 M Pyridin, und 60% n-Propanol) wurde anschließend auf die Säule aufgetragen, beginnend von 0 bis 20% Lösungsmittel B&sub2; in 10 Minuten und von 20% B&sub2; bis 84% B&sub2; in 100 Minuten bei einer Flußrate von i ml/min.
  • Fraktionen, die aus dieser zweiten HPLC-Phase heraus Aktivität besitzen, wurden gesammelt, mit zwei Volumina des Lösungsmittels A&sub2; verdünnt, und auf eine 3,9 mm · 30 cm radiale PAK-Säule, die 10 u Vydac C-18 Revertierte-Phase- Kieselerde aufgetragen, die zuvor in 20% Lösungsmittel B&sub2; equilibriert worden war. Ein Gradient von Lösungsmittel B&sub2; von 20% bis 84% wurde verwendet, um Protein von der Säule zu eluieren. Fraktionen, die aus der dritten Phase der HPLC heraus Aktivität aufwiesen, wurden mit zwei Volumina des Lösungsmittels A&sub1; (0, 1% TFA) verdünnt und auf die C-18-Säule aufgetragen, die zuvor mit 20% Lösungsmitte! B&sub1; (Acetonitril, 0, 1% TFA) equilibriert worden war, und es wurde ein Gradient des Lösungsmittels B&sub1; bei einer Wechsel-Rate von 1% pro Minute und einer Flußrate von 1ml/min verwendet, um IL-7 zu eluieren.
  • SDS-PAGE wurde nach Modifizierung des von Laemmli, Nature 227 : 680 (1970) beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Das über vier Phasen der RP-HPLC gereinigte Material wurde bis zur Trockenheit in einem Lyophilisator eingedampft und in einem kleinen Volumen des SDS Probenpuffers ohne 2-Mercaptoethanol zurückgelöst. Die Probe wurde auf einem 12% Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die entsprechende Spur des resultierenden Gels wurde in 1-2mm Sektionen geschnitten, und jede Sektion wurde zerkleinert und durch Diffusion in 0,2% SDS über Nacht eluiert: anschließend wurde die biologische Aktivität in jeder Fraktion bestimmt. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und ein Aliquot nach Elektrophorese mit einem Phastgel-PAGE-System (Pharmacia) auf einem 10-15% Gradienten-Gel analysiert. Die Proteine wurden sichtbar gemacht durch Verwendung eines Silberfärbe-Verfahrens.
  • Tabelle 1, weiter unten, faßt die Ergebnisse der Verfahren zur Reinigung von IL-7 zusammen. Bei pH 8,0 und 100 mM NaCl band die IL-7-Aktivität im konzentrierten Medium der IxN/A6-Zellen nicht an die DEAE-Sephacel-Säule, obwohl 90% des gesamten, im konditionierten Roh-Medium vorliegenden Proteins, inklusive desjenigen, das für Makrophagen Kolonie stimulierende Aktivität verantwortlich ist, an die Säule band. Anschließende Chromatographie-Schritte, einschließlich SP-Trisacryl, Blue b-Agarose und vier getrennte Revertierte-Phase- HPLC-Protokolle resultierten in einer 200000-fachen Anreicherung der IL-7 Aktivität. Tabelle 1: Reinigung von Maus-Interleukin-7 (IL-7) Schritt Einheiten Anreicherung Ausbeute Konzentrat DEAE-Sephacel (ungeb.) SP-Trisacryl Blue B Agarose
  • Die auf diese Weise erfolgte Verarbeitung von 800 Liter angereichertem Roh- Medium ergab vier HPLC-Säulen-Fraktionen, die insgesamt 5·10&sup6; Einheiten der IL- 7-Aktivität beinhalteten. Die Untersuchung dieses Materials mittels SDS-PAGE und Silberfärbung oder ¹²&sup5;I-Markierung zeigte, daß eine Anzahl von Proteinen in diesem Stadium der Anreicherung noch vorhanden war. Das größte Protein in diesem Material wies eine Masse von 18000 auf; es waren aber schwache Banden über und unter dieser Bande feststellbar.
  • Zwei Experimente wurden durchgeführt, um das Protein in dem Gemisch zu identifizieren, das für die IL-7-Aktivität verantwortlich war. Im ersten wurde IL-7 unter nicht-reduzierenden Bedingungen einer SDS-PAGE unterzogen. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel in 1 mm-Banden geschnitten und das Protein jeder Bande in Medium eluiert und auf biologische Aktivität getestet. Die Ergebnisse zeigten, daß IL-7-Bioaktivität mit einem Protein von Mr 25000 assoziiert war und sich von der Gel-Region die eine Proteinbande von Mr 18000 aufwies, unterschied. Keine Aktivität konnte isoliert werden, als die Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt wurde.
  • Im zweiten Experiment wurde ¹²&sup5;I-markiertes IL-7 von Zellen absorbiert, die auf diesen Faktor antworten (IxN/2b). IxN/2b ist eine klonale Zellinie, die von nichtadhärenten Prä-B-Zellen einer Lang-Zeit-Knochenmark-Kultur abstammten. Diese Zellen können in Abwesenheit von Nährzellen angezogen werden und sind strikt abhängig von gereinigtem IL-7 für fortgesetztes Wachstum und Lebensfähigkeit. Die Zellen wurden gewaschen und anschließend mit PBS extrahiert, das 1% Triton X-100 (Polyoxyethylen Ether oberflächenaktives Agens, Rohm & Huss Co., Philadelphia, PA, USA) beinhaltete. Ein Aliquot dieses Materials wurde nach der SDS-PAGE mittels Autoradiographie analysiert. Die Ergebnisse zeigten, daß anscheinend nur ein Protein mit Mr 25000 an die IL-7-ansprechenden Zellen band. Ein Überschuß nichtmarkierten IL-7 inhibierte die Bindung dieses Proteins, und Kontroll-Zellen, die nicht auf IL-7 ansprechen, versagten bei der Bindung des Proteins mit Mr 25000. Die Ergebnisse beider Experimente wiesen darauf hin, daß ein Protein mit Mr 25000 für die IL-7-Aktivität verantwortlich war.
  • Die Resistenz der IL-7-Aktivität bei SDS-PAGE wies darauf hin, daß dieses Verfahren als Endschritt bei der Reinigung dieses Proteins verwendet werden könnte. Die Ergebnisse zeigen, wie in einem Pilot-Experiment herausgefunden wurde, daß die IL-7-Aktivität bei einer Position eluiert wurde, die mit einem Protein mit Mr 25000 zusammenfiel. PAGE-Analyse dieser bioaktiven Fraktion zeigte ein einziges Protein, das durch Silberfarbung nachgewiesen wurde. Protein-Sequenzierung über Edman- Spaltung mit Hilfe eines automatischen Sequenzierers (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) zeigte die folgende N-terminale Aminosäure-Sequenz: X-X-His-Ile- Lys-Asp-Lys-Glu-X-Lys-Ala-Tyr-Glu-X-Val-Met.
  • Die endgültige spezifische Aktivität wurde einleitend auf 4·10&sup6; Einheiten/kg Protein geschätzt, weiches eine Anreicherung vom 10 Millionenfachen des Start- Materials bedeutete. Aus zuvor genannten Gründen, wurde diese Schätzung auf annähernd 2·10&sup5; Einheiten/kg nach unten korrigiert, äquivalent zur spezifischen Aktivität des homogenen, rekombinanten IL-7 aus Maus, das in COS-7-Zellen produziert wurde.
    • Beispiel 2: Isolierung von cDNA. die IL-7 aus Maus codiert, durch direkte Expression aktiven Proteins in COS-7-Zellen.
  • Eine cDNA-Genbank wurde hergestellt mittels reverser Transkription polyadenylierter mRNA, die aus Gesamt-RNA isoliert wurde, welche aus unter IL-7 induzierenden Bedingungen gewachsenen IxN/A6-Zellen extrahiert wurde. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium mit 5% fötalem Rinderserum für 48 Std. in Anwesenheit von 10 ng/ml Phorbol-Myristyl-Acetat (PMA) und 1 ug/ml S. typhimurium LPS kultiviert, um eine maximale IL-7-spezifische mRNA-Produktion zu erreichen. Die Zellen wurden geerntet durch Verwendung von Trypsin-EDTA und cytoplasmatischer RNA, die mittels NP40-Lyse-Verfahren isoliert wurde, das im wesentlichen dem von Pennica et al., Nature 301 : 214 (1983) ähnelt. Poly-A&spplus;-RNA wurde über Oligo-dT-Säulenchromatographie isoliert und doppelsträngige cDNA mittels reverser Transkriptase hergestellt. Die stumpf endende cDNA wurde in eine SmaI-gespaltene, dephosphorylierte pDC201-Vektor-DNA ligiert.
  • Der eukaryotische Hoch-Expressions-Vektor pDC201 (siehe Beispiel 7 und Fig. 7) wurde aus SV40-, Adenovirus2- und pBR322-DNA zusammengebaut, umfassend in der Sequenz: (1) ein SV40-Fragment, das den Replikationsursprung, frühe und späte Promotoren und Enhancer enthält; (2) ein Adenovirus 2-Fragment das den major late Promotor, das erste Exon und einen Teil des ersten Introns des dreiteiligen späten Leaders beinhaltet; (3) eine Synthetische Sequenz, umfassend eine HindIII-Stelle, eine Spleiß-Akzeptor-Stelle, das zweite und dritte Exon des dreigeteilten Leader von Adenovirus 2 und eine multiple Klonierungsstelle, die eine SmaI-Stelle beinhaltet; (4) zusätzliche SV40-Sequenzen, die frühe und späte Polyadenylierungsstellen beinhalten; (5) Adenovirus 2-Sequenzen, die die Virusassozierten RNA-Gene enthalten; und (6) pBR322-Elemente für die Replikation in E. coli.
  • Die resultierende IxN/A6 cDNA-Genbank in pDC201 wurde verwendet, um den E. coli-Stamm DH5α zu transformieren, und Rekombinanten wurden mit 1000 Kolonien pro Platte und einer ausreichenden Menge an Platten ausplattiert, damit annähernd 50000 Kolonien pro Durchsuchungsvorgang zur Verfügung standen. Kolonien wurden von jeder Platte abgeschabt, gesammelt, und aus jedem Pool wurde Plasmid-DNA isoliert. Die gesammelte DNA wurde anschließend verwendet, um eine subkonfluente Schicht von Affen-COS-7 Zellen zu transfizieren, wobei DEAE- Dextran, gefolgt von einer Chloroquin-Behandlung, verwendet wurde, wie beschrieben von Luthman et al., Nucleic Acids Res. 11 : 1259 (1983) und McCutchan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41 : 351 (1968). Anschließend wurden die Zellen für drei Tage in Kultur angezogen, um eine transiente Expression der inserierten Fragmente zu gestatten. Nach drei Tagen wurden die Kultur-Überstände auf IL-7-Aktivität untersucht, wobei der Prä-B-Zell-Proliferations-Assay verwendet wurde, der an einer anderen Stelle in der Beschreibung aufgeführt ist. Nachdem annähernd 720000 Rekombinanten der Genbank auf diese Weise abgesucht worden waren, wurde beobachtet, daß ein transfektanter Pool eine IL-7-Aktivität von zehnfach über Hintergrund im Proliferations-Assay entwickelt hatte.
  • Eine eingefrorene Stammsuspension von Bakterien aus dem positiven Pool wurde anschließend eingesetzt, um Platten mit annähernd 200 Kolonien zu erhalten. Die Platten wurden wie zuvor behandelt, um Plasmid-DNA aus den gesammelten Bakterienkolonien zu erlangen, die DNA wurde in COS-7-Zellen transfiziert, wie oben beschrieben wurde. Nach Identifizierung eines positiven Pools wurde Plasmid- DNA von individuellen Kolonien präpariert und erneut nach COS-7-Transfektion durchmustert. Auf diese Weise wurde ein einziger Klon isoliert, der befähigt war, IL- 7-Expression in COS-7 Zellen zu induzieren. Das inserierte Fragment wurde mit konventionellen Techniken subkloniert und sequenziert. Die Sequenz wird in Fig. 2 bekanntgemacht.
    • Beispiel 3: Isolierung von cDNA. die IL-7 aus Mensch codiert und Expression des aktiven Proteins in COS-7-Zellen
  • Einleitende Versuche IL-7-mRNA aus Mensch auf Northern-Blots mittels nicktranslatierter IL-7-cDNA aus Maus zu entdecken, waren nicht erfolgreich. Aber es war möglich, eine Hybridisierung der Sonde aus Maus mit Southern-Blots menschlicher, genomischer DNA zu erhalten. Folglich wurde die Suche nach IL-7- cDNA aus Mensch durch ein erstes Durchmustern einer kommerziell erhältlichen, menschlichen, genomischen Genbank eingeleitet. Annähernd 400000 menschliche, genomische Klone wurden mit einer nicktranslatierten IL-7-cDNA aus Maus abgesucht, wobei die Techniken von Benton und Davis, Science 169 : 180 (1977) verwendet wurden. Diese Durchmusterung ergab einen einzigen, hybridisierenden Klon, der gereinigt und restriktionskartiert wurde. Southern-Blots dieser klonierten, genomischen DNA zeigten an, daß die Hybridisierung mit der Sonde aus Maus auf ein 1,2 kb-EcoRi-Fragment begrenzt war. Dieses Fragment wurde subkloniert und sequenziert, offenlegend daß es mit der 5'-nicht-codierenden Region des Gens bis zu den ersten 10 Basen der codierenden Region übereinstimmte, worauf die menschliche, genomische DNA-Sequenz von der IL-7-cDNA aus Maus aufgrund der Anwesenheit eines Introns abwich. Die Bestimmung dieser genomischen Sequenz ermöglichte die Synthese von Oligonukleotiden mit Sequenzen, die komplementär zum menschlichen IL-7-RNA-Transkript waren. Zwei solcher Oligonukleotide mit 29 und 31 Basen wurden synthetisiert, mit ³²P unter Verwendung von T4-Polynukleotid-Kinase markiert, und als Sonde bei Northern-Blots von RNA einer Reihe humaner Zellinien verwendet. Es stellte sich heraus daß diese Sonden spezifisch mit zwei mRNA- Größenklassen aus einer menschlichen Leber-Adenokarzinom-Zellinie, SK-HEP-1 (ATCC HTB 52) hybridisierten.
  • Eine cDNA-Genbank wurde über reverse Transkription polyadenylierter mRNA konstruiert, die aus Gesamt-RNA, extrahiert aus SK-HEP-1, isoliert wurde. Die Zellen wurden für 16 Std. kultiviert in RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum in Anwesenheit von 1ug/ml LPS, um hIL-7-mRNA-Synthese hervorzurufen. Polyadenylierte mRNA wurde durch Chromatographie auf Oligc-dT- Zellulose isoliert und unter Verwendung von Standard-Verfahren revers transkribiert, um eine Erststrang-cDNA zu erhalten. Diese cDNA wurde mittels DNA-Polymerase I in Doppelstrang übersetzt, unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen, mit EcoRI-Methylase methyliert, um EcoRI-Schnittstellen in der cDNA zu schützen, und mit EcoRI-Linkern ligiert. Die resultierenden Konstrukte wurden mit EcoRI gespalten, um alle Linker mit Ausnahme je eines an jedem Ende der cDNA zu entfernen und in EcoRI-geschnittene und dephosphorylierte Arme des Bakteriophagen λ gt10 (Huynh et al. DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, ed., IRL Press, pp. 49-78) ligiert. Die ligierte DNA wurde in Phagenpartikel unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits verpackt um eine Genbank von Rekombinanten (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA) zu erzeugen. Rekombinante wurden auf dem E. coli-Stamm C600(hfl&supmin;) plattiert und mittels Standard-Plaque-Hybridisierungstechniken unter moderaten Stringenz-Bedingungen (50ºC, 0,9 M NaCl) unter Verwendung derselben phosphorylierten Oligonukleotide, die mit der mRNA hybridisierten durchmustert. Bei der Durchmusterung von 150000 Plaques wurde ein Klon aus der Genbank isoliert, der mit den Sonden hybridisierte, als die Filter mit IxSSC bei 55ºC gewaschen wurden. Dieser Klon (hIL-7 cDNA #1) wurde plaque-gereinigt, die inserierte DNA wurde gereinigt und in ein EcoRI- gespaltenes Derivat (pGEMBL 18) des Standard-Klonierungsvektors pBR322 subkloniert, enthaltend einen Polylinker mit einer einzigen EcoRI-Restriktionsstelle, eine BamHI-Stelle und zahlreiche andere einmalige Restriktionsstellen. Ein exemplarischer Vektor dieses Typs wurde von Dente et al., Nucleic Acids Research 11 : 1645 (1983) beschrieben.
  • Es wurde gezeigt, daß diese cDNA, nachdem sie sequenziert wurde, eine Länge von 1465 Basenpaaren aufwies und ein offenes Leseraster besitzt, das ein Protein von 133 Aminosäuren codieren kann. Sowohl die DNA- als auch die Aminosäuresequenz dieser menschlichen cDNA zeigten 78% Homologie zu der cDNA aus der Maus. Nachdem aber diese menschliche cDNA in die 5mal-Stelle von pDC201 subkloniert wurde, um ihre Expression in COS-7-Zellen zu ermöglichen, wurde keine IL-7- Aktivität in den Kultur-Überständen nach der Transfektion nachgewiesen.
  • Um weitere humane IL-7-cDNAs zu erhalten, wurden annähernd eine Million λ gt10-Bakteriophagen, die von SK-HEP-1 Poly-A&spplus;-RNA abstammende cDNAs enthielten, unter Verwendung nick-translatierter menschlicher IL-7-cDNA #1, durchmustert. Dieses resultierte in der Isolierung von 5 weiteren cDNAs, die anschließend in die 5mal-Stelle von pDC201 inseriert wurden. Diese Konstrukte wurden hierauf in COS-7-Zellen transfiziert und die Kultur-Überstände auf IL-7- Aktivität untersucht. Eine cDNA, bezeichnet mit hIL-7 #3, zeigte nachweisbare IL-7- Aktivität. Diese cDNA wurde in pGEMBL18 subkloniert und dequenziert. Die cDNA-Sequenz ist in Fig. 4 dargestellt, die codierende Sequenz und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz von hIL-7 sind in Fig. 5 gezeigt.
    • Beispiel 4: Expression von IL-7 aus Maus in einem Hefe-System
  • Um einen Hefe-Expressionsvektor für mIL-7 zu erzeugen, wurde das Hefe- Plasmid pBC10, das ein Derivat und Aquivalent von pYαHuGM (ATCC 53157) ist, wie folgt verändert. pBC10 ist ein Hefe/Bakterien Shuttlevektor, umfassend (1) einen Replikationsursprung und das Ampr-Gen von pBR322, welches die Selektion und Replikation in E. coli ermöglicht: (2) das Trp1-Gen und den Replikationsursprung 2u für die Selektion und Replikation in S. cerevisiae; (3) den Alkoholdehydrogenase 2 (ADH2)-Promotor aus Hefe, gefolgt von der Prä-Pro-α-Faktor-Leader-Sequenz aus Hefe, um Fremdprotein-Expression und Sekretion von der Hefe zu ermöglichen; und (4) eine multiple Klonierungsstelle, die eine SpeI-Stelle beinhaltet. pBC10 wurde vollständig mit Asp718 und SpeI gespalten; das Vektor-Fragment wurde isoliert und mit dem folgenden Oligonukleotid A ligiert, welches ein N-terminales Epitop oder einen Identifizierungs-Leader Asp-Tyr-Lys-(Asp)&sub4;-Lys ("Flagge") liefert, der direkt neben und im Leseraster mit der α-Faktor-Leadersequenz fusioniert ist, gefolgt von einer Faktor-X-Protease-Erkennungsstelle und einer Polylinker-Sequenz, umfassend StuI-, NcoI-, BamHI-, SmaI- und SpeI-Schnittstellen:
  • Das resultierende Konstrukt, bezeichnet mit pIXY166, wurde anschließend mit StuI und SpeI gespalten und der Vektor mit einem ca. 950 bp NdeI-XbaI-Fragment ligiert, welches die Mehrheit der codierenden Region der mIL-7cDNA und den angrenzenden Oligonukleotid-Linker beinhaltet, der die N-terminalen 11 Aminosäuren der reifen Sequenz von mIL-7 zur internen NdeI-Stelle addiert:
  • Dieser Expressionsvektor, bezeichnet mit pIXY 171, wurde gereinigt, und zur Transformation eines diploiden Hefestammes von S. cerevisiae (XV2181) mittels Standard-Verfahren eingesetzt wie jene, die in EPA 0165654 veröffentlicht wurden, zur Selektion auf Tryptophan-Prototrophe. Die resultierenden Transformanten wurden zur Expression eines Flaggen-mIL-7-Fusionsproteins kultiviert. Auf biologische Aktivität zu untersuchende Kulturen wurden in 20-50 ml YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 1% Glucose) bei 37ºC bis zu einer Zelldichte von 1-5·10&sup8; Zellen/ml angezogen. Die Zellen wurden hierauf durch Zentrifugation entfernt und das Medium durch einen 0,45 u Celluloseacetat-Filter gefiltert. Die durch den transformierten Hefestamm produzierten Überstände wurden auf die Reaktion mit einem monoklonalen Antikörper aus Maus untersucht, gefolgt von Ziege-anti-Maus- Antikörper der mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelt war, um die Anwesenheit des Flaggenpeptids nachzuweisen, und wurden auch auf IL-7-Aktivität mit dem Prä-B- Zell-Proliferations-Assay untersucht, der die Expression eines biologisch aktiven Proteins bestätigte.
    • Beispiel 5: Expression eines menschlichen IL-7 in Hefe
  • Für die Expression von hIL-7 wird ein von pIXY120 abgeleiteter Hefe- Expressions-Vektor wie folgt konstruiert. pIXY120 ist identisch zu pYαHuGM (ATCC 53157), mit der Ausnahme, daß es kein cDNA-Fragment enthält und eine Polylinker/multiple Klonierungsstelle mit einer NcoI-Stelle beinhaltet. Dieser Vektor beinhaltet DNA-Sequenzen von folgenden Quellen: (1) Ein großes SphI- (Nukleotid 562) EcoRI-(Nukleotid 4361) Fragment, ausgeschnitten aus dem Plasmid pBR322 (ATCC 37017), beinhaltend den Replikationsursprung und den Marker für die Ampicillin-Resistenz zur Selektion in E. coli; (2) S. cerevisiae-DNA einschließlich des TRP-1-Markers, des 2u-Replikations-Ursprungs, des ADH2-Promotors; und (3) DNA codierend für ein 85 Aminosäuren langes Signalpeptid, das von dem Gen abstammt, das das sezernierte Peptid α-Faktor codiert (Siehe Kurjan et al., U. S. Patent 4546082). Eine Asp718-Restriktionsstelle wurde bei Position 237 des α- Faktor-Signalpeptids eingeführt, um die Fusion zu heterologen Genen zu erleichtern. Das wurde erreicht durch den Austausch des Thymidin-Restes bei Nukleotid 241 gegen einen Cytosin-Rest durch ortsspezifische in vitro-Mutagenese, wie beschrieben von Craik, Biotechniques, Januar 1985, 12-19. Ein synthetisches Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz, das multiple Klonierungs-Stellen enthält, wurde von der Asp718-Stelle bei Aminosäure 79, nahe dem 3'-Ende des α-Faktor-Signalpeptids, bis zu einer SpeI-Stelle in der 2u-Sequenz inseriert:
  • pBC120 unterscheidet sich von pYαHuGM auch durch das Vorhandensein eines 514 bp-Fragmentes, das von dem einzelsträngigen Phagen f1 abstammt und den Replikationsursprung und eine intergenische Region enthält, die an der NruI-Stelle der pBR322-Sequenz eingefügt wurde. Das Vorhandensein eines f1-Replikationsurprungs erlaubt die Erzeugung von einzelsträngigen DNA-Kopien des Vektors nach der Transformation in geeignete Stämme von E. coli und Superinfektion mit dem Bakteriophagen f1, was die DNA-Sequenzierung des Vektors erleichtert und eine Grundlage für in vitro-Mutagenese liefert. Um eine cDNA zu inserieren wird pIXY120 mit Asp718 gespalten, das nahe dem 3'-Ende des α-Faktor-Leaderpeptids spaltet (Nukleotid 237), und z. B. NruI, das im Polylinker spaltet. Das große Vektor- Fragment wird dann gereinigt und mit einem DNA-Fragment, das das zu exprimierende Protein codiert, ligiert.
  • Um einen Sekretionsvektor für die Expression von menschlichem IL-7 zu erzeugen, wird ein hIL-7 codierendes cDNA-Fragment von der ClaI-Stelle (siehe Fig. 1) bis zu einer Ncol-Stelle 3' des offenen Leserasters aus einer cDNA ausgeschnitten, die die vollständige hIL-7-Sequenz enthält. pIXY120 wird mit Asp718 in der Nähe des 3'-Endes des α-Faktor-Leaders und NcoI gespalten. Das Vektor- Fragment wird mit dem ClaI-Ncol-geschnittenen hIL-7 cDNA-Fragment und dem folgenden Oligonukleotid, weiches die letzten fünf Aminosäuren des α-Faktor- Leaders und die ersten 20 Aminosäuren des reifen hIL-7 wiederherstellt, ligiert.
  • Das Oligonukleotid beinhaltet auch einen T→C-Austausch in Nukleotid 12, um eine EcoRV-Restriktionsstelle einzuführen ohne die codierte Aminosäure-Sequenz zu verändern. Der resultierende hIL-7-Expressionsvektor wird als pIXY192 bezeichnet.
  • Um einen intrazellulären Expressionsvektor für die hIL-7-Produktion in S. cerevisiae zu erzeugen, wird pIXY210 mit XhoI (weiches 5' der α-Faktor-Leader- Sequenz spaltet) und NcoI gespalten, um die Leader-codierende DNA-Sequenz zu entfernen. Das Vektor Fragment wird isoliert und an ein EcoRV-NcoI-Fragment ligiert, das hIL-7 von Nukleotid 12 an codiert und von pIXY192 (wie oben beschrieben) abgeleitet ist, und das folgende Oligonukleotid:
  • Dieses Oligonukleotid verbindet reifes hIL-7 mit dem Hefe-ADH2-Promotor und liefert ein Initiator-Methionin-Codon und die ersten drei Aminosäuren des reifen hIL- 7 bis zur EcoRV-Stelle. Der resultierende Vektor wird mit pIXY193 bezeichnet.
  • Die vorangegangenen Expressionsvektoren werden anschließend gereinigt und eingesetzt um einen diploiden Hefestamm von S. cerevisiae (XV2181) mittels Standard-Verfahren zu transformieren, so wie die in EPA 0165654, bekanntgemachten, die auf Tryptophan-Prototrophe selektieren. Die resultierenden Transformanten werden zur Expression eines hIL-7-Proteins entweder intracellulär oder als sezerniertes Protein kultiviert. Auf biologische Aktivität zu untersuchende Kulturen werden in 20-50 ml YPD-Medium (1% Hefe-Extrakt, 2% Pepton, 1% Glucose) bei 37ºC bis zu einer Zelldichte von 1-5 0&sup8; Zellen/ml angezogen. Um Zellen vom Medium zu trennen, werden die Zellen vor dem Assay durch Zentrifugation entfernt und das Medium durch 0,45 u Celluloseacetat gefiltert. Überstände, die von pIXY192-transformierten Hefestämmen produziert werden oder Rohextrakte, die von disrumpierten, mit pIXY193 transformierten Hefezellen präpariert werden, werden untersucht unter Verwendung des Prä-B-Zell- Proliferations-Assay für IL-7-Aktivität, um Expression eines biologisch aktiven Proteins nachzuweisen.
    • Beispiel 6: Expression des IL-7 aus Maus in E. coli
  • Reifes mIL-7 wurde intrazellulär in E. coli exprimiert durch die Platzierung der codierenden Region stromabwärts des Bakteriophagen λ Leftward-Promotor PL. Die durch das Plasmid produzierte mRNA beinhaltet eine Konsensus- Ribosomenbindungsstelle und ATG (Starter-Methionin-Codon). Das Expressionsplasmid wurde konstruiert wie folgt. Erstens wurde das Plasmid pLNbIL2 (ATCC 53202; siehe EPA 215,576) mit XbaI und StuI gespalten und das erhaltene 5,2 kb Vektorfragment wurde gewonnen. Zweitens wurde ein synthetisches Oligonukleotid hergestellt, um die transkriptionelle Einheit des abgeschnittenen N- Gens des Phagen Lambda mit einer Konsensus-Ribosomenbindungsstelle (cRBS) und der codierenden Region von mIL-7 bis zu der NdeI-Stelle zu verbinden (siehe Fig. 1). Dieses Oligonukleotid hatte die folgende Sequenz:
  • Drittens, wurde ein Restriktionsfragment, welches die Mehrheit der mIL-7 codierenden Region beinhaltet, von dem isolierten Klon, wie in Beispiel 2 beschrieben, durch Spaltung mit NdeI und PvuII erlangt. Die vorhergehenden drei Fragmente wurden zusammenligiert, um ein Expressionsplasmid, bezeichnet mit pLNPBGF, zu liefern. Dieses Plasmid wurde verwendet, um E. coli-Stamm K802:pRK248cits (ATCC 33526: ATCC 33766) zu transformieren, der anschließend in Superinduktions-Medium [siehe Mott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 88 (1985)] kultiviert wurde. Die Expression der rekombinanten Transicriptionseinheit wurde durch Temperaturwechsel von 30ºC nach 42ºC induziert, als die Kulturen eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von über 0,5 erreichten, und bei dieser Temperatur für annähernd zwei Std. gehalten. An diesem Punkt wurden die Zellen geerntet und das resultierende Zellpellet in einem Extraktionspuffer, der aus (für Pellet entsprechend einer 1 ml-Kultur) 0,5 ml 7 M Guanidin-HCl, 10 mM Citrat pH 7,0, 5 mM EDTA, 0, 1% β-Mercaptoethanol, und 0,1% Triton-X-100 bestand, gelöst. Der resultierende vollständig denaturierte Zellextrakt wurde hierauf schnell in Gewebe-Kultur-Medium (RPMI 1640), das 1% Rinderserum-Albumin enthielt, verdünnt (1 Teil auf 100). Dieses Verfahren ergab die Expression von 20-50000 Einheiten Aktivität pro ml Zellextrakt.
  • Der Spiegel der mIL-7-Expression wurde annähernd 100-fach gesteigert durch Transfer eines Restriktionsfragmentes von pLNPBGF, das das Protein codiert, in ein Plasmid, das eine verkürzte 5'-nichtcodierende Region beinhaltete. Dieses Expressionsplasmid (bezeichnet mit pPL1ppPBGF) wurde aus Plasmid pPL3 wie folgt konstruiert. pPL3 ist ein Derivat des kommerziell erhältlichen Plasmids pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA), welches einen temperatursensitiven PL Promotor beinhaltet, der zu dem von Gourse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 1069 (1985) im Detail beschriebenen im wesentlichen ähnlich ist. Ähnliche PL Promotor-Sequenzen sind anwesend im Plasmid pHUB2 im E. coli-Stamm JMB9 (ATCC 37092) und in pPLc28 in E. coli RRI (ATCC 53082). pPL3 wurde mit HindIII gespalten, das resultierende linearisierte Plasmid mittels T4-Polymerase mit stumpfen Enden versehen und anschließend mit Asp718 gespalten. Ein synthetisches Oligonuideotid mit der folgenden Sequenz wurde anschließend präpariert:
  • Ein Restriktionsfragment von pLNPBGF das die vollständige codierende Region enthält, wurde durch Spaltung mit XbaI und SspI erhalten. Die vorangehenden Elemente wurden mittels Standard-Verfahren aneinander ligiert und das resultierende Plasmid pPLippPBGF wurde zur Transformation von K802:pRK248cits verwendet. Durch Induktion dieses Stammes, wie oben beschrieben, wurden annähernd 2,5-3,2 Millionen Einheiten einer Prä-B-Zell unterstützenden Aktivität pro ml Kulturmedium in Zellextrakten erzeugt, die wie oben beschrieben hergestellt wurden. Zusätzlich zeigte SDS-PAGE eine dicht färbende Proteinbande in einer Position, die mit dem Molekulargewicht des reifen mIL-7 korrespondiert.
    • Beispiel 7: Expression von rekombinantem IL-7 aus Mensch unter der Verwendung eines hocheffizienten Expressionssystems aus Säuger.
  • Das Expressionsplasmid pDC201 aus Säuger, dargestellt in Fig. 7, wird entworfen, um cDNA-Sequenzen zu exprimieren, die in dessen multipler Klonierungsstelle (MCS) inseriert sind, nach Transfektion in Säugerzellen. Bezug nehmend auf Fig. 7, beinhaltet pDC201 die folgenden Bestandteile: SV40 (schraffierter Kasten) enthält SV40-Sequenzen von den Koordinaten 5171-270 inklusive Replikationsursprung, Enhancer-Sequenzen und frühe und späte Promotoren. Die Transkriptionsorientierung des Fragmentes wird durch einen Pfeil angezeigt. Ad-MLP (offener Kasten) enthält Adenovirus-2-Sequenzen von den Koordinaten 5779-6231, die den Major-Late-Promotor, das erste Exon und einen Teil des Introns zwischen dem ersten und zweiten Exon des dreigeteilten Leaders beinhalten. TPL (punktierter Kasten) enthält eine synthetische DNA-Sequenz, die die Adenovirus-2-Sequenzen 7056-7172, 9634-9693 (beinhaltend die Akzeptor- Spleißstelle des dreigeteilten Leaders, das zweite Exon und Teile des dritten Exons des dreigeteilten Leaders) und eine multiple Klonierungsstelle (MCS) spezifiziert, die Stellen für KpnI, SmaI und BgIII enthält. pA (schraffierter Kasten) besitzt SV40 Sequenzen von 4127-4100 und 2770-2533, die die Polyadenylierungs- und Terminationssignale für die frühe Transkription beinhalten. VA (ausgefüllter Kasten) besitzt Adenovirus-2-Sequenzen von 10226-11555, die die Virus-assoziierten RNA- Gene (VAI und VAII) und eine NheI-Stelle beinhalten, die annähernd 570 Basenpaare stromabwärts des MCS lokalisiert ist. Die stabilen Linien sind von pBR322 abgeleitet und repräsentieren (hinter den pA-Sequenzen startend und im Uhrzeigersinn fortsetzend) die Koordinaten 29-23, 651-185 (an dieser Stelle sind die VA-Sequenzen inseriert) 29-1, 4363-2486 und 1094-375. pDC201 ist ein Derivat von pMLSV, das kürzlich von Cosman et al., Nature 312 : 768 (1984) beschrieben wurde.
  • COS-7-Zellen wurden angezogen und transfiziert, wie von Cosman et al., siehe oben, beschrieben wurde, mit der Plasmid-DNA einer 1,5 ml-Kultur von E. coli DH5α (rec A&supmin;), transformiert mit Sinai-gespaltenen pDC201, umfassend eine inserierte hIL-7-cDNA (siehe Beispiel 3, oben). In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine hIL-7-cDNA gespleißt an eine menschliche IL-2- Rezeptor-(p55, Tac Antigen) Signal-Sequenz, eingesetzt um die Sekretion rekombinanten hIL-7 von transfizierten COS-7-Zellen zu steigern.
  • In dieser Ausführungsform wird das pDC201-Plasmid, das die hIL-7-cDNA- Insertion trägt, mit ClaI und NheI gespalten, und das resultierende ClaI-Nhei- Fragment (beinhaltend den C-terminalen Anteil der menschlichen IL-7 codierenden Sequenz) wird mit dem folgenden Oligonukleotid ligiert, welches die Sequenz, die die ersten 19 Aminosäuren des reifen humanen IL-7 bis einschließlich einer internen ClaI- Stelle codiert, regeneriert:
  • Ein PvuII-XbaI-Fragment einer humanen IL-2-Rezeptor-cDNA wird anschließend von pMLSV-NI/N4-S ausgeschnitten (ATCC 39890; siehe EPA 162,699 und Cosman et al., siehe oben). Dieses Plasmid beinhaltet eine PvuII-Stelle direkt oberhalb der PstI, die in den zitierten Publikationen veröffentlicht werden. Das PvuII-XbaI-Fragment wird isoliert und mittels T4-DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen und mit BamHI-Linkern ligiert. Dieses Fragment wird anschließend in einen BgIII-gespaltenen intermediären Vektor kloniert. Nach der Spaltung mit BamHI wird das resultierende Fragment isoliert und in BgIII-gespaltenen pDC201 kloniert, um pDC201/IL-2R zu erhalten. Um den IL-2-Rezeptor-Leader an das reife hIL-7 zu spleißen, wird pDC201/IL-2R mit SstI gespalten, mit stumpfen Enden versehen, anschließend mit NheI gespalten und das resultierende Vektorfragment mit dem hIL-7-Fragment ligiert, das bereits mit dem vorher beschriebenen Oligonukleotid zusammengebaut worden war. Nach der Transfektion in COS-7-Zellen induziert der resultierende Vektor eine vorübergehende hIL-7-Expression mit hohem Spiegel.
  • Ein alternatives Zell-Expressions-System aus Säuger für humanes IL-7 wird zusammengebaut durch Insertion des vorher beschriebenen IL-2RIIL-7-Konstruktes in einen stabilen, mit einem selektierbaren Marker versehenen Säuger- Expressionsvektor, der anschließend in Baby- Hamster-Nieren (BHK)-Zellen eingeführt wird. Der Expressionsvektor wird wie folgt konstruiert. Ein SmaI-HincII- cDNA-Fragment wird aus dem vorher beschriebenen pDC201/hIL-2R/hIL-7-Plasmid, das wie oben beschrieben zusammengebaut wurde, herausgeschnitten und kloniert in die reparierte (Klenow-Polymerase) BamHI-Stelle eines Säuger-Expressionsvektors umfassend einen SV40-Replikations-Ursprung und virale Enhancer-Sequenzen, die an einen Metallothionein-Promotor aus Maus (MT-1) angefügt sind. Siehe Palmiter et al., U.S. Patent 4579821. Dieser Hybrid-Promotor zeigt einen hohen Spiegel einer stabilen, konstitutiven Expression in einer Vielzahl von Säuger-Zelltypen. pNPVI enthält auch die normale Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)-DNA-Sequenz, die eine Methotrexat-Selektion für Säuger-Zellen mit diesem Plasmid erlaubt. DHFR-Sequenz- Amplifizierungs-Ereignisse können in solchen Zellen selektiert werden durch die Verwendung erhöhter Methotrexat-Konzentrationen. Auf diese Weise amplifiziert man auch im allgemeinen die benachbarten DNA-Sequenzen und erreicht so verstärkte Expression.
  • Selektion und Expression wurden gehandhabt unter Verwendung adhärenter BHKtk-ts 13-Zellen (ATCC CRL 1632), wie von Waechter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 1106 (1982) und Talavera et al., J. Cell Physiol. 92 : 425 (1977) beschrieben. Diese Zellen sind sowohl zur Hoch-Mannose-, als auch zur komplexen Oligisaccharid-Protein-Modifikation befähigt [siehe Hsieh et al., J. Biol. Chem. 258 : 2548 (1983)]. Nach der Linearisierung des Expressions-Plasmids mit SaII wird die DNA in BHK-Zellen mittels Elektroporation bei 300 Volt und 960 Mikrofarad eingeführt. Geeignete Elektroporations-Techniken sind von Ausubel et al., Herausg., s. o., unter 9.3.1., veröffentlicht. Nach 48 Stunden wurde 1 Mikromolar Methotrexat dem Kulturmedium zugefügt und resistente Kolonien werden nach einer zweiwöchigen Zeitspanne selektiert. Repräsentative Klone werden auf Sekretion von hIL-7 in das Kulturmedium untersucht. Klone mit der höchsten Expression werden weiteren Selektions-Prozeduren unter Verwendung von 10, 20 und 50 Mikromolar Methotrexat unterzogen. Resistente Kolonien werden weiter analysiert, um Klone mit hohem Expressions-Spiegel zu identifizieren. Die unter Verwendung dieses Protokolls selektierten BHK-Zellinien sind adhärente Zellen und Schemata für die Produktion im großen Maßstab können konstruiert werden, die entweder Wachstum in Suspension unter Verwendung von Kugeln oder Wachstum in Bioreaktoren unter Verwendung von Hohlfaser-Technologie beinhalten. BHK-Zellen können leicht an das Wachstum als Suspensions-Zellen adaptiert werden.
    • Beispiel 8: Die Verwendung von IL-7 zur Stimulierung der Proliferation von unreifen T-Zellen und Thymozyten
  • Um zu demonstrieren, daß IL-7 die Proliferation verschiedener Linien und Stadien von T-Zellen stimuliert, wurden Thymozyten von fötalen und adulten Mäusen kultiviert in Gegenwart von Roh- und gereinigten Präparationen von rekombinantem Mäuse-IL-7.
  • Der Thymus, der verantwortlich ist für die Entwicklung und/oder die Differenzierung der zellulären Immunantwort, besteht aus einer heterogenen Population von T-Zellen. Die große Mehrheit, ungefähr 80-85% der Zellen, sind phänotypisch einzigartig (CD4&spplus;/CD8&spplus;) und funktionell beschränkt. Reifere Zellen, sowohl funktionell als auch phänotypisch, befinden sich auch im Thymus. Diese Zellen oder Einzel-Positive (CD4&spplus;/CD8&supmin; oder CD4&supmin;/CD8&spplus;) umfassen ungefähr 5- 10% der Thymozyten und sind zur Antwort auf verschiedene immunulogische Stimuli befähigt. Auch befindet sich im Thymus eine Population von CD4&supmin;/CD8&supmin;-Zellen, die als die ersten Zellen in der T-Zell-Ontogenese angesehen werden. Innerhalb der CD4&supmin; /CD8&supmin;-Untergruppe befinden sich Zellen, die befähigt sind, den Thymus von immungeschädigten Patienten wiederzubesiedeln und eine neue Thymozytenpopulation zu erzeugen.
  • Heutzutage weiß man, daß frühe Thymozyten, z. B. L3T4&supmin;/Lyt2&supmin; oder CD4&supmin; /CD8&supmin;-Zellen, den Thymus von bestrahlten Patienten wiederbesiedeln und in die verschiedenen Thymozytensubpopulation (z. B. CD4&spplus;/CD8&supmin;, CD4&supmin;/CD8&spplus; und CD4&spplus;/CD8&spplus;) differenzieren können. Um die Effekte von IL-7 auf die Thymozyten- Proliferation zu bestimmen, wurden verschiedene Thymozyten-Präparationen in Anwesenheit von gereinigtem mIL-7 und [³H]-Thymidin inkubiert und die relativen Spiegel der eingebauten Radioaktivität durch Scintillationszählung gemessen. In der folgenden Serie von Experimenten wurden Kultur-Überstände, enthaltend IL-7, abstammend von einer COS-7-Zellinie, die mit einem Expressionsvektor, enthaltend Maus-IL-7cDNA, transformiert worden war, präpariert wie in Beispiel 3 beschrieben. Diese Überstände wurden direkt verwendet oder bis zu einer einzigen 25 kD-Protein-Spezies gereinigt wie in Beispiel 1 ausgeführt. Nach der Reinigung hatte das rekombinante mIL-7 eine spezifische Aktivität von ungefähr 8 · 10&sup5; Einheiten/mg Protein.
  • In Thymozyten-Proliferations-Assays wurden adulte C3H/HeJ oder C57BL/6J- Thymozyten kultiviert bei einer Dichte von 10&sup6; Zellen/Vertiefung in Costar 96- Vertiefungen-Flachboden-Mikrotiterplatten (Cambridge, MA, USA) in RPMI- 1640- Medium, angereichert mit 10% fötalem Rinderserum, 5 · 10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol, 50 ug/ml Glutamin in einem Endvolumen von 0,2 ml. Rekombinantes Mäuse-IL-2 wurde zu den Kulturen in einer Konzentration von 50 ng/ml zugefugt, während rIL 7 in einer 1 : 50-Verdünnung eines Roh-COS-7-Überstandes, enthaltend ungefähr 1,25 ng/ml mIL-7' zugefügt wurde. [³H]-Thymidin wurde zu den Kultur-Vertiefungen für die letzten sechs Stunden einer 72 Std.-Kultur gegeben. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in Zerfällen/min (cpm) in Tabelle 2 siehe unten, als das arithmetische Mittel von Vierfach-Bestimmungen.
  • Die mitogenen Fähigkeiten von IL-7 auf die ersten T-Zellen, oder thy&spplus; CD4&supmin; /CD8&supmin;-Thymozyten, wurden sowohl alleine als auch in Gegenwart von Con A bestimmt. Zwei Quellen von CD4&supmin;/CD8&supmin;-Thymozyten wurden verwendet. CD4&supmin; /CD8&supmin;-Thymozyten wurden erhalten von adulten Thymi durch negative Selektion unter Verwendung von Antikörper- und Komplement-vermittelter Zytolyse. C57BL/6J-adulte Thymozyten wurden inkubiert bei 4ºC für 45 min mit gleichen Volumina von anti-L3T4- und anti-Lyt2-monoklonalen Antikörpern. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen im Kulturüberstand der Mar 18,5-Zellinie (anti-Ratten-Kappa-Kette-monoklonaler Antikörper) (American Type Tissue Center, Rockville, MD, USA) (1ml/10&sup7; Zelle) für 30 min bei 4ºC resuspendiert. Nach Zentrifugation wurden die Zellen resuspendiert in einer 1 : 10-Verdünnung von Kaninchen-Komplement und für 30 min bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden dann einmal gewaschen und die lebensfähigen Zellen über Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen Dichtegradienten isoliert. Die resultierenden Zellen waren ungefähr 0,1% der ursprünglichen Anzahl. Sie waren zu mehr als 98% lebensfähig und die Analyse der CD4- und CD8-Expression mittels Immunofluoreszenz-Färbung und Durchfluß-Zytometrie zeigte, daß sie zu weniger als 4% CD4&spplus; oder CD8&spplus; waren.
  • CD4&supmin;/CD8&supmin;-Thymozyten wurden auch als Tag 13 fötale Thymozyten erhalten, die zum größten Teil (> 99%) aus CD4&supmin;/CD8&supmin; Thyl&spplus;-Zellen bestehen. Fötale Thymozyten des Tag 13 (Tag 0 ist der erste Tag des Vaginal-Pfropfens) wurden kultiviert bei einer Dichte von 5 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung in Rundbodenplatten nach dem Verfahren von Raulet, Nature 314 : 101 (1985). Wenn diese Zellen mit rekombinantem IL-7 kultiviert wurden, wurde eine proliferative Antwort beobachtet, wie in Tabelle 2 gezeigt. CD4&supmin;/CD8&supmin;-Thymozyten können proliferieren als Antwort auf IL-7 in Abwesenheit jedes anderen Comitogens.
  • Die Zugabe des Pflanzenlectins Concanavalin A (Con A, 2,5 ug/ml) zu den Kulturen vergrößerte deutlich die Antwort von CD4&supmin;/CD8&supmin;-Thymozyten auf IL-2 und IL-7. Adulte CD4&supmin;/CD8&supmin;-Zellen antworteten sehr heftig auf Con A alleine, während die Zugabe von IL-2 zu den Kulturen eine dreifache Verstärkung der Proliferation ergab. Fötale Thymozyten antworteten nicht meßbar auf Con A allein, aber in Gegenwart von IL-2 oder IL-7 wurde eine signifikante Proliferation beobachtet. Diese Daten zeigen daß Zellen des unreifsten intrathymischen Stadiums der T-Zell- Differenzierung zur Proliferation durch IL-7 stimuliert werden können, was die Rolle dieses Cytokines in der T-Zell-Differenzierung und -Reifung anzeigt.
    • Tabelle 2: IL-7 getriebene Proliferation von adulten und fötalen Thymozyten
  • (Mittlere cpm/Kultur-Probenvertiefung · 10&supmin;³ im Thymozyten-Proliferations-Assay) Thymozyten Kultur-Zusätze Kein
  • Die relative Effizienz von IL-7 al T-Zell-Mitogen wurde ebenfalls untersucht, sowohl durch sich selbst als auch in der Anwesenheit eines co-mitogenen Stimulus, PHA, und mit zwei weiteren T-Zell-Wachstumsfaktoren, Interleukin-2 (IL-2) und Interleukin-4 (IL-4) verglichen. Sowohl IL-2 als auch IL-7 stimulierten direkt die Thymozyten-Proliferation; IL-2 war aber annähernd zehnfach aktiver als IL-7 bezogen auf das gleiche Gewicht. Sogar bei Konzentrationen von 1 ug/ml war IL-4 ein schwaches Mitogen für Thymozyten-Kulturen. Aber nach Zugabe des Lectins Phytohämagglutinin (PHA) zu den Kulturen mit einer Endkonzentration von 1% (V/V) wurde ein starker Anstieg der IL-2-, IL-4- und IL-7-abhängigen Proliferation beobachtet.
  • IL-7 wirkt unabhängig von IL-2, IL-4 oder PHA auf die Stimulierung der Thymozyten-Proliferation. Zum Beispiel verstärkte IL-7 (bei ungefähr 1-2 ng pro ml) signifikant bei IL-2-Konzentrationen, die für Thymozyten-Proliferation sättigen (1- 1000 ng pro ml), die proliferative Antwort, was in einem annähernd 50%-igem Anstieg des Einbaus Tritium-markierten Thymidins resultierte. In einem ähnlichen Ansatz wurde ein Anstieg der IL-4-abhängigen Proliferation auch in der Anwesenheit von IL-7 beobachtet. Weiter wurde eine IL-7-getriebene Proliferation von Thymozyten nicht durch monoklonalen anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper bei Konzentrationen gehemmt, die ansonsten zur Hemmung der IL-2-getriebenen Thymozyten-Proliferation fähig sind. Ein monoklonaler anti-mIL-4-Antikörper inhibierte ebenfalls nicht die Fähigkeit von IL-7, die Thymozyten-Proliferation zu induzieren.
  • Die vorher beschriebenen Experimente zeigen, daß IL-7 die Proliferation unreifer T-Zellen stimulieren kann und ebenfalls einen starken Co-Stimulator reifer T- Zellen in Anwesenheit eines Mitogens darstellt.
    • Beispiel 9: Verabreichung von IL-7 an normale Mäuse
  • Eine Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, um die Effekte einer intraperitonealen Verabreichung von mIL-7 an normale C57BL/6J-Mäuse (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) zu bestimmen. IL-7 aus Maus, wie in Beispiel 3 beschrieben, präpariert durch COS-7-Zell-Expression, wurde von Tag 0 bis 4 verabreicht. Zellartiger Aufbau, Funktion und Zelloberfiächen-Antigen-Phänotyp in der Milz, peritonealem Hohlraum, Thymus und Knochenmark wurden an den Tagen 5 und 8 bestimmt, bei Dosen von 40 ng, 200 ng und 1 ug pro Tier und unter Verwendung von 5 Tieren pro Dosierungs-Gruppe.
  • Knochenmark-Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-formende Einheiten (CFU- GM) wurden am Tag 8 in allen Mäusen erhöht, die IL-7 erhalten hatten, wobei die 40 ng-Gruppe den größten Anstieg aufwies, verglichen mit Kontrollmäusen, die nur Träger erhalten hatten. In der gleichen Art wurden auf IL-7 ansprechende Mark- Zellen in den selben Mäusen mit maximalem Effekt in der 40 ng-Gruppe vermehrt. Knochenmark-Megakaryozyten-CFU (CFU-MK) wurden in allen Dosierungsgruppen erhöht, und waren maximal (dreifach über Kontrolle) am Tag 8 in Mäusen, die 200 ng erhalten hatten. In der Milz waren CFU-GM nur in den Mäusen erhöht, die die höchste Dosis IL-7 erhalten hatten.
  • Der zellartige Aufbau im peripheren Blut war 1,5 bis 2,5-fach am Tag 5 in allen Dosierungs-Gruppen vergrößert und verblieb bei annähernd 2,5-fach in der höchsten Dosierungs-Gruppe an Tag 8. Ähnliche Kinetiken wurden für den zellartigen Aufbau des peritonealen Hohlraums beobachtet, die Anstiege erreichten jedoch das 3,5-fache. Knochenmark war an Tag 5 1,5-fach erhöht, unterschied sich jedoch nicht von den Kontrollen an Tag 8. In der Milz wurden 1,5-1,8-fache Anstiege im zellartigen Aufbau an Tag 5 und 8 bei der Hoch-Dosierungs-Gruppe beobachtet. Der zellartige Aufbau des Thymus war unverändert an Tag 5 aber 2-fach vergrößert an Tag 8 in der Hoch-Dosierungs-Gruppe.
    • Beispiel 10: Präparation von Antikörpern, die Immunreaktion mit IL-7 eingehen
  • Präparationen von gereinigtem, nativen oder rekombinanten IL-7, z. B. menschlichem IL-7, werden eingesetzt um polyklonale Antiseren oder bevorzugt monoklonale Antikörper gegen IL-7 zu erzeugen, unter Verwendung konventioneller Techniken, z. B. den in U.S. Patent 4411993 beschriebenen. Solche Antikörper sind wahrscheinlich nützlich zum Nachweis von IL-7 oder zur Neutralisation der biologischen Aktivität von IL-7 in Assays oder in Experimenten, die vielfache Lymphokine beinhalten.
  • Zur Immunisierung von Mäusen wird eine im wesentlichen reine IL-7- Präparation in komplettem Freund's Adjuvans emulgiert und in Mengen zwischen 10- 100 ug subkutan in Balb/c-Mäuse injiziert. 10 bis 12 Tage später wird den immunisierten Tieren eine Boost-Injektion mit zusätzlichem IL-7 gegeben, emulgiert in inkomplettem Freund's Adjuvans, und anschließend werden periodische Boost- Injektionen in wöchentlichem oder zweiwöchentlichem Abstand gegeben. Serumproben werden regelmäßig durch retroorbitale Blutung oder Schwanzspitzen- Exzision für die Untersuchung mittels Dot-Blot-Assays (Antikörper-Sandwich) oder ELISA (Enzym verbundener Immuno-Adsorbierungs-Assay) entnommen. Andere Assay-Verfahren sind auch geeignet. Nach der Bestimmung eines geeigneten Antikörper-Titers bekommen positive Tiere eine intravenöse Injektion des Antigens in Saline. Drei bis vier Tage später werden die Tiere getötet, die Milz-Zellen geerntet und mit der Maus-Myelom-Zellinie NSI fusioniert. Auf diese Weise hergestellte Hybridom-Zellinien werden in vielfache Mikrotiterplatten in HAT-selektivem Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) plattiert, um die Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelom-Hybriden und Milzzell-Hybriden zu inhibieren.
  • Auf diese Weise hergestellte Hybridom-Klone können durch ELISA auf die Reaktivität mit IL-7 untersucht werden, z. B. durch Adaptionen der von Engvall et al. Immunochemistry 8 : 871 (1971) und im U.S. Patent 4703004 beschriebenen Verfahren. Positive Klone werden dann in die Peritoneal-Höhlen syngenetischer Balb/c-Mäuse injiziert, um Aszites zu produzieren die hohe Konzentrationen (> 1mg/ml) von monoklonalem anti-IL-7-Antikörper enthalten. Der resultierende monoklonaler Antikörper kann gereinigt werden durch Ammoniumsulfat-Fällung, gefolgt von Gelausschluß-Chromatographie und/oder Affinitäts-Chromatographie. basierend auf der Bindung des Antikörpers an Staphylococcus aureus-Protein A.

Claims (21)

1. DNA-Sequenz, die ein biologisch aktives Interleukin-7 (IL-7) aus Säugetier oder ein Analogon oder eine Untereinheit davon codiert, umfassend die Sequenz:
(a) die NukIeotidsequenz der Fig. 3 oder 5;
(b) eine Sequenz, die unter gemäßigten Stringenz-Bedingungen mit der Sequenz unter (a) hybridisiert oder mit dieser im wesentlichen homolog ist; oder
(c) eine Sequenz, die als Ergebnis des genetischen Codes von einer Sequenz in (a) oder (b) entartet ist;
worin das Analogon oder die Untereinheit von IL-7 die biologische Aktivität des nativen IL-7 aufweist.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, im wesentlichen aus einem ein Säuger-IL-7 oder ein Analogon oder eine Untereinheit davon codierenden synthetischen Gen bestehend, welches in einer rekombinanten Transkriptions-Einheit exprimiert werden kann die von Säugetier-, mikrobiellen oder viralen Operons abgeleitete, induzierbare regulatorische Elemente umfaßt.
3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 mit 90% oder mehr Ähnlichkeit zu der Nukleotidsequenz, die das in Fig. 3 gezeigte IL-7 aus Maus codien.
4. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 mit 90% oder mehr Ähnlichkeit zu der Nukleotidsequenz, die das in Fig. 5 gezeigte IL-7 aus Mensch codiert.
5. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, die die Nukleotidsequenz umfaßt:
(i) von -75 bis 387 in Fig. 3;
(ii) von 1 bis 387 in Fig. 3;
(iii) von -75 bis 456 in Fig. 5; oder
(iv) von 1 bis 456 in Fig. 5.
6. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, die menschliches IL-7 (mit der N- terminalen Sequenz Asp-Cys-Asp-Ile-Glu-Gly-Lys-Asp-Gly-Lys-Gln-Tyr) oder IL-7 aus Maus (mit der N-terminalen Sequenz Glu-Cys-His-Ile-Lys-Asp-Lys-Glu-Gly Lys- Ala-Tyr) codien.
7. Rekombinanter Expressionsvektor umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
8. Verfahren zum Herstellen eines Säuger-IL-7 oder eines Analogons oder einer Untereinheit davon mit der biologischen Aktivität des nativen IL-7, wobei das Verfahren das Kultivieren einer geeigneten Wirtszelle umfaßt, die einen Vektor nach Anspruch 7 umfaßt, unter Bedingungen, die die Expression von IL-7 oder eines Analogons oder einer Untereinheit davon unterstützen.
9. Gereinigtes Protein, welches IL-7 aus Maus oder Mensch oder ein Analogon oder eine Untereinheit davon mit der biologischen Aktivität von nativem IL-7 darstellt, weiches von DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird oder zu den Aminosäuresequenzen der Fig. 3 oder 5 im wesentlichen homolog ist.
10. Protein nach Anspruch 9 mit einer Aminosäuresequenz, die 90% oder mehr Ähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz des menschlichen IL-7 in den in Fig. 5 gezeigten Positionen 1 bis 152 aufweist.
11. Protein nach Anspruch 9 mit einer Aminosäuresequenz, die 90% oder mehr Ähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz des IL-7 aus Maus in den in Fig. 3 gezeigten Positionen 1 bis 129 aufweist.
12. Protein nach Anspruch 9 oder 10, weiches ein menschliches IL-7-Analogon darstellt, bei dem ein oder mehrere Cystein-Reste durch Nicht-Cysteine ersetzt worden sind.
13. Protein nach Anspruch 9 oder 10, welches ein menschliches IL-7-Analogon darstellt, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren gemäß Positionen 121-139 des reifen menschlichen Proteins deletiert worden sind.
14. Protein-Zusammensetzung, umfassend ein Protein nach einem der Ansprüche 9 bis 13 weiches von einer rekombinanten Zellkultur produziert ist und eine spezifische Aktivität von mindestens 1·10&sup4; IL-7 Einheiten/kg im Prä-B-Zell Proliferations-Assay besitzt.
15. Protein, wie es in einem der Ansprüche 9 bis 11 definiert wurde für die Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin.
16. Verwendung eines Proteins, wie es in einem der Ansprüche 9 bis 11 definiert wurde bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der B- oder T- Lymphozyten-Entwicklung und -Proliferation oder zur Verstärkung der Immunantwort im Säugetier.
17. Verwendung wie in Anspruch 15 beansprucht, worin das Protein menschliches IL-7 und der zu behandelnde Säuger ein Mensch ist.
18. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche für die parenterale Verabreichung beim menschlichen Patienten zur prophylaktischen oder therapeutischen Stimulierung der B- oder T-Lymphozyten-Entwicklung und -Proliferation oder Verstärkung der Immunantwort geeignet ist, umfassend eine wirksame Menge eines menschlichen IL-7-Proteins, wie in Anspruch 9 oder 10 definiert wurde, im Gemisch mit einem geeigneten Lösungsmittel oder einem geeigneten Träger.
19. Antikörper, der mit einem Protein, wie es in einem der Ansprüche 9 bis 11 definiert wurde, eine Immunreaktion eingeht.
20. Antikörper nach Anspruch 19, welcher einen monoklonalen Antikörper darstellt.
21. Zusammensetzung, welche für Diagnose, Assay oder Therapie geeignet ist, umfassend einen monoklonalen Antikörper, der eine Immunreaktion mit einem wie in einem der Ansprüche 9 bis 11 definierten Protein eingeht.
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