DE68928043T2

DE68928043T2 - Interleukin-4-Rezeptoren

Info

Publication number: DE68928043T2
Application number: DE68928043T
Authority: DE
Inventors: Patricia Beckmann; David J Cosman; Rejean Idzerda; Carl J March; Bruce Mosley; Linda Park
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1988-10-31
Filing date: 1989-10-31
Publication date: 1997-09-11
Anticipated expiration: 2009-11-01
Also published as: IL91705A; FI106044B; DK175583B1; JP2744821B2; ES2103706T3; US5767065A; WO1990005183A1; DK78491A; US6548655B1; US6391581B1; US7317090B2; GR3024271T3; US5856296A; AU643427B2; NZ231189A; US20050118176A1; EP0367566B1; DE68928043D1; JPH02215385A; AU4411389A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen Cytokinrezeptoren und insbesondere Interleukin-4-Rezeptoren.
Interleukin-4 (IL-4, auch bekannt als B-Zellstimulierender Faktor oder BSF-1), wurde ursprünglich dadurch charakterisiert, daß er fähig war, die Proliferation von B-Zellen in Reaktion auf geringe Konzentrationen von Antikörpern, die gegen Oberflächenimmunoglobulin gerichtet waren, zu stimulieren. In neuerer Zeit wurde gezeigt, daß IL-4 ein weitaus größeres Spektrum von biologischen Aktivitäten aufweist, einschließlich der Wachstums-Co-Stimulierung von T-Zellen, Mastzellen, Granulocyten, Megakaryocyten und Erythrocyten. Zusätzlich stimuliert IL-4 die Proliferation von verschiedenen IL-2 und IL-3 abhängigen Zellinien, induziert die Expression von Klasse II Haupt-Histokompatibilitäts-Komplexmolekülen auf ruhende B-Zellen und verstärkt die Sekretion von IgE und IgG1-Isotypen durch stimulierte B-Zellen. Sowohl murines als auch menschliches IL-4 wurden definitiv durch rekombinante DNA-Technologie und durch Reinigung zur, Homogenität des natürlichen murinen Proteins charakterisiert (Yokota et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5894, 1986; Noma et al, Nature 319:640, 1986; und Grabstein et al., J. Exp. Med. 163:1405, 1986).
Die biologischen Aktivitäten von IL-4 werden durch spezifische Zelloberflächenrezeptoren für IL-4 übertragen, die auf primären Zellen und in vitro-Zellinien mit Säugerursprung exprimiert werden. IL-4 bindet einen Rezeptor, der dann ein biologisches Signal auf verschiedene Immuneffektorzellen überträgt. Gereinigte IL-4 Rezeptor (IL-4R) Zusammensetzungen können daher nützlich sein in diagnostischen Assays auf IL-4 oder IL-4 Rezeptor und um Antikörper gegen IL-4 Rezeptor zur Verwendung in der Diagnose oder Therapie zu erzeugen. Zusätzlich können gereinigte IL-4 Rezeptorzusammensetzungen direkt in der Therapie verwendet werden, um IL-4 zu binden oder zu reinigen, vorausgesetzt ein Mittel zur Regulierung der biologischen Aktivitäten dieses Cytokins ist vorhanden.
Obwohl IL-4 ausführlich charakterisiert wurde, ist nur ein geringer Fortschritt bei der Charakterisierung seines Rezeptors gemacht worden. Verschiedene Studien, die die Existenz des IL-4 Rezeptors auf einer Vielzahl von Zelltypen dokumentieren, sind veröffentlicht worden; jedoch war die strukturelle Charakterisierung auf Schätzungen des Molekulargewichts des Proteins beschränkt, wie bestimmt durch SDS-PAGE Analyse von kovalenten Komplexen, die durch chemische Kreuzverbindung zwischen dem Rezeptor und radioaktiv markierten IL-4 Molekülen gebildet wurden. Ohara et al (Nature 325:537,, 1987) und Park et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1669, 1987) stellten als erste die Gegenwart eines IL-4 Rezeptors fest unter Verwendung von radioaktiv jodierten rekombinanten murinem IL- 4 um einen Hochaffinitätsrezeptor zu binden, der in geringer Anzahl auf B- und T-Lymphocyten exprimiert wurde und einer Vielzahl von Zellen hämatopoetischer Abstammung. Durch Affinitätskreuzverbindung von ¹²&sup5;J-IL-4 an IL-4R identifizierten Ohara et, al. und Park et al. Rezeptorproteine, die anscheinend je ein Molekulargewicht von 60.006 bzw. 75.000 Daltons aufwiesen. Es ist möglich, daß die geringere Rezeptorgröße, die in murinen Zellen beobachtet wurde, ein proteolytisch gespaltenes Fragment des nativen Rezeptors darstellt. Darauffolgende Experimente von Park et al. (J. Exp. Med. 166.476, 1987) unter Verwendung von hefeabstammendem, rekombinantem, menschlichen IL-4, das mit ¹²&sup5;J radioaktiv markiert war, zeigten, daß menschlicher IL-4 Rezeptor nicht nur auf Zellinien von B-, T- und hämatopoetischen Zellinien vorhanden war, sondern auch auf menschlichen Fibroblasten mit epithelialem und endothelialem Ursprung gefunden werden. IL-4 Rezeptoren wurden seitdem auf anderen Zellinien nachgewiesen, einschließlich CBA/N Milz B-Zellen (Nakajima et al., J. Immunol. 139:1987). Burkitt-Lymphom Jijoye-Zellen (Cabrillat et al., Biochem. & Biophys, Res. Commun. 149:995, 1987), einer großen Vielzahl von hämatopoetischen und nichthämatopoetischen Zellen (Löwenthal et al., J. Immunol, 140:456, 1988) und Mäuse- Lyt-2&supmin;/L3T4&supmin;Thymocyten. In letzter Zeit haben Park et al. (UCLA Symposium, J. Cell Biol., Suppl. 12A, 1988) berichtet, daß in Gegenwart von ausreichenden Proteaseinhibitoren ¹²&sup5;J- IL-4 bindende Plasmamembranrezeptoren von 138 bis 145 kDa auf verschiedenen murinen Zellinien identifiziert werden konnten. Beträchtliche Kontroversen bleiben daher bestehen im Hinblick auf die tatsächliche Größe und Struktur von IL-4 Rezeptoren.
Weitere Untersuchungen der Struktur und der biologischen Kennzeichen von IL-4 Rezeptoren und der Rolle, die IL-4 Rezeptoren bei den Reaktionen verschiedener Zellpopulationen auf IL-4 oder andere Cytokinstimulationen spielen, oder der effektiven Verfahren unter Verwendung von IL-4 Rezeptoren zur Therapie, Diagnose oder im Assay sind nicht möglich gewesen aufgrund der Schwierigkeit, ausreichende Quantitäten von gereinigtem IL-4 Rezeptor zu erhalten. Bis jetzt waren keine Zellinien bekannt, die hohe Levels von IL-4 Rezeptoren konstitutiv und kontinuierlich exprimierten und in Zellinien, die nachweisbare Mengen IL-4 Rezeptor exprimierten, war die Menge der Expression im allgemeinen auf weniger als ungefähr 2000 Rezeptoren pro Zelle begrenzt. Dadurch wurden die Bemühungen, IL-4 Rezeptormoleküle zur Verwendung durch in biochemischer Analyse zu reinigen oder Säugergene, die IL-4 Rezeptor kodieren, zu klonieren und exprimieren durch einen Mangel an gereinigtem Rezeptor und einer geeigneten Quelle für Rezeptor mRNA behindert.
Die vorliegende Erfindung stellt DNA-Sequenzen zur Verfügung, die für Polypeptide kodieren, die fähig sind, Säuger-Interleukin-4 zu binden, wie beschrieben in den Ansprüchen 1 bis 9 (ausgenommen die Ansprüche für Spanien, wo Verfahren in den Ansprüchen 1 bis 9 beschrieben sind, die den Schritt der Isolierung solcher DNA-Sequenzen enthalten). Die vorliegende Erfindung stellt außerdem rekombinante Expressionsvektoren zur Verfügung, die die oben definierten DNA-Sequenzen enthalten, Wirtszellen, die mit den rekombinanten Expressionsvektoren transfiziert sind, rekombinante IL-4R Moleküle, die unter Verwendung der rekombinanten Expressionsvektoren erzeugt wurden und Verfahren für die Herstellung der rekombinanten IL-4R Moleküle unter Verwendung der Expressionsvektoren.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein gereinigtes Polypeptid zur Verfügung, das fähig ist, Säuger-Interleukin-4 Protein zu binden, wie beschrieben in den Ansprüche 13 bis 23 (ausgenommen der Ansprüche für Spanien und Griechenland, wo Verfahren für die Herstellung eines solchen Polypeptids in den Ansprüchen 11 bis 23 beschrieben sind). Das gesamte murine IL-4R Molekül ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 130.000 bis ungefähr 140.000 Mr durch SDS-PAGE. Die offensichtliche Bindungsaffinität (Ka) für COS- Zellen, die mit den murinen IL-4 Rezeptorklonen 16 und 18 aus der CTLL 19.4 Bibliothek transfiziert sind, liegt bei 1 bis 8 x 10&sup9; M&supmin;¹. Die Ka für COS-Zellen, die mit den murinen IL-4 Rezeptorklonen 7B9-2 und 7B9-4 der murinen 7B9 Bibliothek transfiziert sind, liegt bei 2 x 10&sup9; bis 1 x 10¹&sup0; M&supmin;¹. Das reife murine IL-4 Rezeptormolekül hat eine N-terminale Aminosäuresequenz wie folgt: I K V L G E P T C F S D Y I R T S T C E W.
Es wird angenommen, daß das menschliche Il-4R Molekül ein Molekulargewicht von zwischen ungefähr 110.000 und 150.000 Mr aufweist und eine N-terminale Aminosäuresequenz, vorhergesagt von der cDNA-Sequenz und durch Analogie zu den biochemisch bestimmten N-terminalen Sequenzen des reifen murinen Proteins, wie folgt: M K V L Q E P T C V S D Y M S I S T C E W.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Zusammensetzungen für die Verwendung in Therapie, Diagnose, Assay von IL-4 Rezeptor oder zur Anzucht von Antikörpern gegen IL-4 Rezeptoren zur Verfügung, die effektive Mengen von löslichen Rezeptorproteinen enthalten, hergestellt gemäß den vorstehenden Verfahren. Solche lösliche rekombinante Rezeptormoleküle umfassen verkürzte Proteine, bei denen die Regionen des Rezeptormoleküls, die nicht für die IL-4 Bindung notwendig sind, deletiert wurden. Diese und andere Aspekte gemäß der vorliegenden Erfindung werden sich nach Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beiliegenden Zeichnungen ergeben. Die Erfindung wird nun durch Beispiele mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, wobei:
Fig. 1 Restriktionskarten von cDNA-Klonen zeigt, die die kodierenden Regionen (bezeichnet durch einen Balken) der murinen und menschlichen IL-4R cDNAs enthalten. Die Restriktionsstellen EcoR1, PvuII, Hinc II und Sst I sind durch die Buchstaben R, P, H bzw. S gekennzeichnet.
Fig. 2A bis 2C zeigen die cDNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der kodierenden Region eines murinen IL-4 Rezeptors, wie abgeleitet vom Klon 7B9-2 der 7B9-Bibliothek. Das N-terminale Isoleucin des reifen Proteins ist als Aminosäurezahl 1 bezeichnet. Die kodierende Region des gesamten membrangebundenen Proteins des Klones 7B9-2 ist definiert durch die Aminosäuren 1-785. Das ATC-Kodon, das den Isoleucinrest spezifiziert, der den reifen N-Terminus konstituiert, ist an Position 1 der Proteinsequenz unterstrichen; die putative transmembrane Region bei den Aminosäuren 209-232 ist ebenfalls unterstrichen. Die Sequenzen der kodierenden Regionen der Klone 7B9-4 und Klone CTLL-18 und CTLL-16 der CTLL 19.4 Bibliothek sind identisch zu der von 7B9- 2 mit der folgenden Ausnahme. Die kodierende Region von CTLL-16 kodiert für einen membrangebundenen IL- 4 Bindungsrezeptor, definiert durch die Aminosäuren -25 bis 233 (einschließlich der putativen 25 Aminosäuresignalpeptidsequenz), wird jedoch gefolgt von einem TAG-Stopcodon (nicht dargestellt) was den offenen Leserahmen beendet. Die Nukleinsäuresequenz läßt die Gegenwart einer Spaltungsdonorstelle an dieser Stellung vermuten (angezeigt durch einen Pfeil in Fig. 1) und einer Spaltungsakzeptorstelle nahe dem 3'-Ende (dargestellt durch einen zweiten Pfeil), was vermuten läßt, daß CTLL-16 von einem nicht gesplicten mRNA-Zwischenprodukt abstammt. Die Klone 7B9-4 und CTLL-18 kodieren die Aminosäuren 23 bis 199 bzw. -25 bis 199. Nach der Aminosäure 199 führt ein 114-Basenpaar-Einschub (identisch in beiden Klonen und dargestellt durch einen offenen Kasten in Fig. 1) sechs neue Aminosäuren ein, gefolgt von einem Stopcodon. Diese Form des Rezeptors ist löslich.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung des Säuger-Hochexpressionsplasmids pCAV/NOT, das detallierter in Beispiel 8 beschrieben ist.
Fig. 4A bis 4C stellen die Kodierungsssequenz einer menschlichen IL-4 Rezeptor-cDNA dar von Klon T22-8, der aus einer cDNA-Bibliothek erhalten wurde, die abgeleitet ist von der T-Zellinie T22. Das vorhergesagte N-terminale Methionin des reifen Proteins und die transmembrane Region sind unterstrichen.
Fig. 5A bis 5B sind ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäure- Sequenzen der menschlichen (obere Zeile) und murinen (untere Zeile) IL-4 Rezeptor cDNA-Klonen.

Definitionen

Wie hierin verwendet, bezeichnen die Ausdrücke "IL-4 Rezeptor" und "IL-4R" Proteine mit Aminosäure-Sequenzen, die im wesentlichen den Aminosäure-Sequenzen des nativen Säuger-Interleukin-4 Rezeptors ähneln, wie offenbart in Fig. 2 und 4 und die, wie unten definiert, dadurch biologisch aktiv sind, daß sie fähig sind, Interleukin-4 (IL-4) Moleküle zu binden oder ein biologisches Signal zu übertragen, das durch die Bindung eines IL-4 Moleküls an eine Zelle, ausgelöst wird oder mit Anti-IL-4R Antikörpern kreuz zu reagieren, die gegen IL-4R aus natürlichen (das heißt nicht-rekombinanten) Quellen erzeugt wurden. Von dem nativen murinen IL-4 Rezeptormolekül wird angenommen, das es ein anscheinendes Molekulargewicht, durch SDS-PAGE von ungefähr 140 Kilodaltons (kDa) aufweist. Die Bezeichnungen "IL-4-Rezeptor" oder "IL-4R" umfassen analoge oder Untereinheiten von nativen Proteinen, die mindestens 20 Aminosäuren aufweisen und die mindestens einige biologische Aktivität in übereinstimmung mit IL-4R aufweisen, sind aber nicht auf diese begrenzt. Wie in der ganzen Beschreibung verwendet, bedeutet die Bezeichnung "reif" ein Protein, das in einer Form exprimiert wird, der die Führungssequenz fehlt, wie sie z. B. in Gesamttranskripten eines nativen Gens vorhanden sein kann. Verschiedene bioäquivalente Protein-, und Aminosäureanaloge sind im Detail unten beschrieben.
Die Bezeichnung "im wesentlichen ähnlich" bedeutet, wenn sie verwendet wird, um entweder Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen zu definieren, das eine bestimmte gemeinte Sequenz, z. B. eine mutierte Sequenz, von der Referenz-Sequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen abweicht, wobei es der gewünschte Effekt ist, die biologische Aktivität des IL-4R Proteins zu erhalten. Alternativ sind Nukleinsäure-Untereinheiten und Analoge "im wesentlichen ähnlich" zu den hier spezifisch offenbarten DNA-Sequenzen, wenn: (a) die DNA-Sequenz von der kodierenden Region eines nativen Säuger-IL-4R-Gens abstammt; (b) die DNA-Sequenz fähig ist zu einer Hybridisierung mit DNA-Sequenzen von (a) unter moderat stringenten Bedingungen und die bioligisch aktive IL-4R Moleküle kodieren; oder DNA-Sequenzen, die als Ergebnis des genetischen Codes degeneriert sind zu den DNA-Sequenzen, wie definiert in (a) oder (b) und die für biologisch aktive IL-4R- Moleküle kodieren. Im wesentlichen ähnliche analoge Proteine können mehr als ungefähr 30 Prozent ähnlich zu der korrespondierenden Sequenz des nativen IL-4R sein. Sequenzen mit geringerem Grad an Ähnlichkeit, aber vergleichbarer biologischer Aktivität werden als Äquivalente angesehen. Bevorzugter sind die analogen Proteine mit mehr als 80 Prozent Ähnlichkeit zu der korrespondierenden Sequenz des nativen IL-4R, in welchem Fall sie als "im wesentlichen identisch" definiert werden. Bei der Definition von Nukleinsäure-Sequenzen werden alle betrachteten Nukleinsäure-Sequenzen, die fähig sind, im wesentlichen ähnliche Aminosäure-Sequenzen zu kodieren, als im wesentlichen ähnlich zu einer Referenz-Nukleinsäure-Sequenz angesehen. Die Prozentzahl der Übereinstimmung kann z. B. durch einen Vergleich der Sequenzinformation unter Verwendung des GAP-Computerprogramms, Version 6.0, erhältlich von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) bestimmt werden. Das GAP-Programm verwendet das Anordnungsverfahren (alignment method) von Needleman und Wunsch (J. Mol., Biol., 48:433,1970) wie verändert von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981). Zusammengefaßt definiert das GAP-Programm die Ähnlichkeit als Zahl von angeordneten Symbolen (das heißt, Nucleotide oder Aminosäuren), die ähnlich sind, dividiert durch die Gesamtanzahl der Symbole in der kürzeren der zwei Sequenzen. Die bevorzugten Unterlassungsparameter für das GAP-Programm umfassen: (1) eine Einstoff-Vergleichsmatrix (enthaltend einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nichtidentitäten) für Nucleotide und eine gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, wie beschrieben von Schwartz und Dayhoff, ed., Atlas of Protein Sequence and Structur, National Biomedical Research Foundation, Seiten 353-358, 1979; (2) einen Abzug (penalty) von 3.0 für jede Freistelle und einen zusätzlichen 0,10-Abzug für jedes Symbol in jeder Freistelle; und (3) keinen Abzug für Endfreistellen.
"Rekombinant", wie hier verwendet, bedeutet, daß ein Protein aus rekombinanten (das heißt mikrobiellen oder Säuger) Exressionssystemen abstammt. "Mikrobiell" bezieht sich auf rekombinante Proteine, die in bakteriellen oder Pilz- (das heißt Hefe) Expressionssystemen hergestellt wurden. Als Produkt, definiert "rekombinant mikrobiell" ein Protein, das in einem mikrobiellen Expressionssystem erzeugt wurde, das im wesentlichen frei von nativen endogenen Substanzen ist. Protein, das in den meisten Bakterienkulturen exprimiert wurde, z. B. in E. coli, wird frei Glycan sein. Protein, das in Hefe exprimiert wurde, kann ein Glykosilierungsmuster aufweisen, das sich von dem unterscheidet, das in Säugerzellen exprimiert wird.
"Biologisch aktiv", wie in der ganzen Beschreibung verwendet als Kennzeichen von IL-4 Rezeptoren, bedeutet, daß ein bestimmtes Molekül eine ausreichende Aminosäure-Sequenz-Ähnlichkeit mit den Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung, wie hier offenbart, aufweist, um fähig zu sein, nachweisbare Quantitäten von IL-4 zu binden, einen IL-4 Stimulus auf eine Zelle zu übertragen, z. B. als Komponente eines Hybrid-Rezeptorkonstrukts oder mit Anti-IL-4R-Antikörpern kreuz zu reagieren, die gegen IL-4R aus einer natürlichen (d. h. nicht rekombinanten) Quelle erzeugt wurden. Vorzugsweise sind biologisch aktive IL-4 Rezeptoren im Umfang der vorliegenden Erfindung fähig, mehr als 0,1 Nanomol IL-4 pro Nanomol-Rezeptor zu binden und besonders bevorzugt mehr als 0,5 Nanomol IL-4 pro Nanomol-Rezeptor in Standardbindungsassays (siehe unten).
"DNA-Sequenz" bezeichnet ein DNA-Molekül in Form eines getrennten Fragments oder als Komponente eines größeren DNA- Konstrukts, das von DNA abstammt, die mindestens einmal in im wesentlichen reiner Form isoliert wurde, d. h. das frei von kontaminierenden endogenen Materialien ist und in einer Quantität oder Konzentration vorliegt, die seine Identifikation, Manipulation und Wiedergewinnung der Sequenz und ihrer Nucleotid-Sequenzbestandteile durch standardbiochemische Verfahren, z. B. unter Verwendung eines Klonierungsvektors, ermöglicht. Solche Sequenzen werden vorzugsweise in Form eines offenen Leserrahmens zur Verfügung gestellt, der nicht von internen, nichttranslatierten Sequenzen oder Introns unterbrochen ist, die typischerweise in eukaryontischen Genen vorhanden sind. Genomische DNA, die die relevanten Sequenzen enthält, könnte ebenfalls verwendet werden. Sequenzen von nicht translatierter DNA können 5' oder 3' vom offenen Leserahmen vorhanden sein, wenn sie nicht mit der Manipulation oder Expression der kodierenden Regionen interferieren. Die Sequenzen sind vorzugsweise mindestens 60 Basen lang.
"Nucleotid-Sequenz" bezeichnet ein Heteropolymer von Deoxyribonudeotiden. DNA-Sequenzen, die für die Proteine, die durch diese Erfindung zur Verfügung gestellt werden, kodieren, können aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonudeodidlinkern oder aus einer Serie von Oligonudeotiden zusammengestellt werden, um ein synthetisches Gen zur Verfügung zu stellen, das fähig ist, in einer rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert zu werden.
"Rekombinanter Expressionsvektor" bezeichnet ein replikationsfähiges DNA-Konstrukt, das entweder zur Vervielfachung oder zur Expression von DNA verwendet wird, die für IL-4R kodiert und die eine transkriptionale Einheit enthält, die eine Zusammenstellung von (1) einem genetischen Element oder Elementen enthält, die eine regulatorische Rolle bei der Genexpression spielen, z. B. Promotoren oder Enhancern, (2) eine Struktur- oder kodierende Sequenz, die in mRNA transkribiert und in Protein translatiert wird und (3) geeignete Transkriptions- und Translations-Initiations- und Terminations-Sequenzen. Strukturelemente, die zur Verwendung in Hefeexpressionssystemen gedacht sind, enthalten vorzugsweise eine Leadersequenz, die eine extrazelluläre Sekretion von translatierten Proteinen durch eine Wirtszelle ermöglicht. Alternativ kann es einen N-terminalen Methioninrest enthalten, wenn das rekombinante Protein ohne eine Leader- oder Transport-Sequenz exprimiert wird. Dieser Rest kann ggfs. anschließend von dem exprimierten rekombinanten Protein abgespalten werden, um ein Endprodukt zur Verfügung zu stellen.
"Rekombinantes mikrobielles Expressionssystem" bedeutet eine im wesentlichen homogene Monokultur von geeigneten Wirtsmikroorganismen, z. B. Bakterien, wie z. B. E. coli oder Hefe, wie z. B. S. cerevisiae, die stabil integriert eine rekombinante, transkriptionale Einheit in die chromosonale DNA aufweisen oder die rekombinante Transkriptionseinheit als Bestandteil eines residenten Plasmids tragen. Im allgemeinen sind die Zellen, die das System bilden, die Nachfolger eines einzigen Vorläufertransformanten. Die rekombinanten Expressionssysteme, wie hier definiert, werden heterologe Proteine nach Induktion der regulatorischen Elemente, die mit der DNA- Sequenz oder dem zu exprimierenden, synthetischen Gen verbunden sind, exprimieren.

Proteine und Analoge

Die vorliegende Erfindung stellt im wesentlichen homogene rekombinante Säuger-IL-4R Polypeptide zur Verfügung, die im wesentlichen frei sind von kontaminierenden, endogenen Materialien und ggfs. ohne assoziierte Glycosylierung mit nativem Muster. Die nativen murinen und menschlichen IL-4 Rezeptormoleküle werden aus Zellysaten als Glycoproteine mit einem anscheinenden Molekulargewicht, durch SDS-PAGE, von ungefähr 130 bis 145 Kilodaltons (kDa) gewonnen. Säuger IL-4R gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt, als Beispiele, Primaten-, menschliches, murines, Kaninchen-, Katzen-, Rinder-, Schafe-, Pferde- und Schweine-IL-4R. Derivate von IL-4R innerhalb des Umfangs der Erfindung umfassen außerdem verschiedene strukturelle Formen des primären Proteins, die die biologische Aktivität erhalten haben. Aufgrund der Gegenwart von ionisierbaren Amino- und Carboxylgruppen, kann ein IL-4R Protein z. B. in Form von sauren oder basischen Salzen vorliegen oder in neutraler Form. Individuelle Aminosäurereste können auch durch Oxidation oder Reduktion modifiziert sein.
Die primäre Aminosäurestruktur kann durch die Bildung von kovalenten oder aggregativen Konjugaten mit anderen chemischen Bestandteilen, wie z. B. Gylcosylgruppen, Lipiden, Phosphat, Acetylgruppen und ähnlichem modifiziert sein oder indem Aminosäuresequenz-Mutanten erzeugt werden. Kovalente Derivate werden durch Verbindung von bestimmten funktionellen Gruppen mit IL-4R Aminosäureseitenketten oder an den N- oder C-Termini hergestellt. Andere Derivate von IL-4R innerhalb des Umfangs der Erfindung umfassen kovalente oder aggregative Konjugate von IL-4R oder seinen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, z. B. durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Zum Beispiel kann das konjugierte Peptid eine Signal (oder Leader) Poypeptidsequenz am N-terminalen Bereich des Proteins sein, die cotranslational oder posttranslational die Übertragung des Proteins von seinem Syntheseort zum Funktionsort innerhalb und außerhalb der Zellmembran oder Wand (z. B. der Hefe α-Faktorleader) steuert. IL-4R Proteinfusionen können Peptide enthalten, die hinzugefügt wurden, um die Reinigung oder Identifizierung von IL-4R (z. B. Poly-His) zu erleichtern. Die Aminosäure-Sequenz des IL-4 Rezeptors kann auch mit dem Peptid Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988) verbunden sein. Die letztere Sequenz ist hoch antigen und stellt ein Epitop zur Verfügung, das reversibel durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden ist, was einen schnellen Test und eine einfache Reinigung von exprimiertem rekombinanten Protein ermöglicht. Diese Sequenz wird außerdem spezifisch durch Rinderschleimhaut-Enterokinase an dem Rest gespalten, der unmittelbar der Asp-Lys-Paarung folgt. Fusionsproteine, die mit diesem Peptid versehen sind, können auch gegen einen intrazellulären Abbau in E. coli resistent sein.
IL-4R Derivate können ebenfalls als Immonogene verwendet werden, als Reagenzien in auf Rezeptor basierenden Immunassays oder als Bindungsmittel für ein Affinitätsreinigungsverfahren von IL-4 oder anderen bindenden Liganden. IL-4R Derivate können auch durch kreuzbindende Mittel, wie z. B. M-Maleimidbenzoylsuccinimid-Ester und N-Hydroxysuccinimid an den Cystein- und Lysinresten erhalten werden. IL-4R Proteine können auch über reaktive Seitengruppen mit verschiedenen unlöslichen Substraten, wie z. B. Cyan-Bromid-aktivierte, Bisoxiran-aktivierte, Carbonyldiimidazol-aktivierte oder Tosyl-aktivierte Agarosestrukturen kovalent gebunden sein oder durch Adsorption an Polyolefinoberflächen (mit oder ohne Glutaraldehydkreuzverbindung). Wenn es einmal an ein Substrat gebunden ist, kann IL-4 verwendet werden, um selektiv (für die Zwecke eines Assays oder einer Reinigung) Anti-IL-4R-Antikörper oder IL-4 zu binden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem IL-4R mit oder ohne assozuerte Glycosylierung mit nativem Muster. IL-4R, das in Hefe- oder Säugerexpressionssystemen, z. B. COS-7 Zellen, exprimiert wird, kann entweder ähnlich im Molekulargewicht und im Glycosylierungsmuster zu den nativen Molekülen sein oder sich signifikant davon unterscheiden, abhängig von dem Expressionsssystem. Die Expression von IL-4R DNAs in Bakterien, wie z. B. E. coli. stellt nichtglycosylierte Moleküle zur Verfügung. Funktionale mutante Analoge von Säuger-IL-4R, die inaktivierte N-Glycosylierungsstellen aufweisen, können durch Oligonucleotidsynthese unter Ligation oder durch ortsspezifische Mutagenese-Techniken erzeugt werden. Diese analogen Proteine können in einer homogenen Form mit reduzierten Kohlenhydraten mit gutem Ertrag unter Verwendung von Hefeexpressionssystemen erzeugt werden. N-Glycosylierungsstellen in eukaryotischen Proteinen sind durch das Aminosäuretriplet Asn-A&sub1;-Z charakterisiert, wobei A&sub1; jede Aminosäure außer Pro sein kann und Z Ser oder Thr ist. In dieser Sequenz stellt Asparagin eine Seitenkettenaminogruppe für die kovalente Bindung von Kohlenhydraten zur Verfügung. Eine solche Stelle kann eliminiert werden, indem eine andere Aminosäure für Asn oder für den Rest Z substituiert wird, Asn oder Z deletiert werden oder eine Nicht Z-Aminosäure zwischen A&sub1; und Z inseriert wird oder eine andere Aminosäure als Asn zwischen Asn und A&sub1;.
IL-4R Derivate können auch durch Mutationen von Il-4R oder seinen Untereinheiten erhalten werden. Ein IL-4R Mutant, wie hier bezeichnet, ist ein Polypeptid, das homolog mit IL-4R ist, das aber eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von dem nativen IL-4R aufgrund von Deletion, Insertion oder Substitution unterscheidet. Wie die meisten Säugergene, sind die Säuger-IL-4 Rezeptoren vermutlich durch Multi-Exon-Gene kodiert. Alternative mRNA-Konstrukte, die durch unterschiedliche mRNA-Splicingereignisse, die der Transkription folgen, entstehen und die große Regionen von Identität oder Ähnlichkeit mit hier beanspruchten cDNAs aufweisen, werden als innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung betrachtet.
Bioäquivalente Analoge von IL-4R Proteinen können z. B. hergestellt werden, indem verschiedene Substitutionen von Resten oder Sequenzen erzeugt werden oder terminale oder interne Reste oder Sequenzen, die nicht für die biologische Aktivität benötigt werden, deletiert werden. Es können z. B. Cysteinreste deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um die Bildung von unrichtigen intramolekularen Disulfidbrükken bei der Renaturierung zu verhindern. Andere Mutageneseansätze beinhalten die Modifikation von benachbarten dibasischen Aminosäureresten, um die Expression des Hefesystems zu verstärken, in denen eine KEX2-Protease Aktivität vorhanden ist. Im allgemeinen sollten Substitutionen konservativ durchgeführt werden; das heißt, die besonders bevorzugten Ersatzaminosäuren sind diejenigen, die physiko-chemische Charakteristiken aufweisen, die denjenigen des zu ersetzenden Restes entsprechen. Dementsprechend sollte der potentielle Effekt der Deletion oder Insertion auf die biologische Aktivität berücksichtigt werden, wenn eine Deletions- oder Insertionsstrategie verwendet wird.
Untereinheiten von IL-4 können konstruiert werden, indem terminale oder interne Reste oder Sequenzen deletiert werden. Besonders bevorzugte Untereinheiten umfassen diejenigen, in denen die transmembrane Region und die intrazelluläre Domäne von IL-4R deletiert oder mit hydrophilen Resten substituiert sind, um die Sekretion des Rezeptors in das Zellkulturmedium zu erleichtern. Das resultierende Protein ist ein lösliches IL-4R Molekül, das seine Fähigkeit, IL-4 zu binden, erhalten kann. Besondere Beispiele von löslichem IL-4R umfassen Polypeptide, die eine wesentliche Identität zu der Sequenz der Aminosäurereste 1-208 in Fig. 2A und der Reste 1-207 in Fig. 4A aufweisen.
Mutationen in Nucleotid-Sequenzen, die für die Expression von analogem IL-4R konstruiert wurden, müssen natürlich die Leserahmenphase der kodierenden Sequenzen erhalten und werden vorzugsweise keine komplementären Regionen erzeugen, die hybridisieren könnten, um sekundäre mRNA-Strukturen zu erzeugen, wie z. B. Schlaufen oder Haarnadelschleifen, die die Translation der Rezeptor mRNA negativ beeinflussen könnten. Obwohl eine Mutationsstelle vorbestimmt sein kann, ist es nicht notwendig, daß die Natur der Mutation per se vorbestimmt ist. Um auf optimale Charakteristiken von Mutanten an einer gegebenen Stelle zu selektieren, kann z. B. eine Zufallsmutagenese am Zielcodon durchgeführt werden und die exprimierten IL-4 Mutanten auf die gewünschte Aktivität abgesucht werden.
Nicht alle Mutationen der Nucleotid-Sequenz, die für IL-4R kodiert, werden im Endprodukt exprimiert werden, z. B. können Nucleotidsubstitutionen hergestellt werden, um die Expression zu verstärken, primär um sekundäre Strukturschlaufen in der transkribierten mRNA zu verhindern (siehe EPA 75,444A, hier durch Referenz mit einbezogen) oder um Codons zur Verfügung zu stellen, die einfacher durch den selektierten Wirt translatiert werden, z. B. die wohl bekannten E. coli Vorzugscodons für die E. coli Expression.
Mutationen können an bestimmten Loci eingeführt werden, indem Oligonudeotide synthetisiert werden, die eine Mutations-Sequenz enthalten, flankiert von Restriktionsstellen, die eine Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Nachfolgend auf die Ligation kodiert die erhaltene, rekonstruierte Sequenz für ein Analog mit der gewünschten Aminosäure- Insertion, Substitution oder Deletion.
Alternativ können Oligonucleotidgerichtete, ortsspezifische Mutageneseverfahren angewendet werden, um ein verändertes Gen mit bestimmten Codons zur Verfügung zu stellen, das gemäß der benötigten Substitution, Deletion oder Insertion verändert ist. Beispielhafte Verfahren für die Herstellung der Veränderungen, die oben genannt sind, sind durch Walder et al. offenbart (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (Bio Techniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles ant Methods, Plenum Press, 1981); und U.S. Patent Nr. 4,518,584 und 4,737,462, die hier durch Bezugnahme mit einbezogen sind.

Expression von rekombinantem IL-4R

Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Expressionsvektoren zur Verfügung, die synthetische oder von cDNA abstammende DNA-Fragmente enthalten, die für Säuger-IL-4R oder bioäquivalente Analoge kodieren, die operabel mit geeigneten transkriptionalen oder translationalen, regulatorischen Elementen verbunden sind, die vom Säuger, Mikroben, Viren oder Insektengenen abstammen. Solche regulatorischen Elemente umfassen einen transkriptionalen Promotor, unter Umständen eine Operatorsequenz, um die Transkription zu steuern, eine Sequenz, die für geeignete mRNA ribosomale Bindestellen kodiert, und Sequenzen, die die Termination der Transkription und Translation steuern, wie im Detail unten beschrieben.
Die Fähigkeit, sich in einer Wirtszelle zu replizieren, die in der Regel durch einen Replikationsursprung ermöglicht wird, und ein Selektionsgen, um eine Erkennung von Transformanten zu vereinfachen, können außerdem inkorporiert werden. Die DNA-Regionen sind operabel verbunden, wenn sie funktionell miteinander verwandt sind. Die DNA für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) ist z. B. mit der DNA für ein Polypeptid operabel verbunden, wenn es als Vorläufer exprimiert wird, der an der Sekretion des vorliegenden Peptids teilnimmt; ein Promotor ist mit einer kodierenden Sequenz operabel verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz steuert; oder eine ribosomale Bindungsstelle ist mit einer Kodierungsequenz operabel verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß sie eine Translation ermöglicht. Im allgemeinen bedeutet operabel verbunden aneinandergrenzend und im Fall von sekretorischen Leadern aneinandergrenzend und im Leserahmen.
DNA-Sequenzen, die für Säuger IL-4 Rezeptoren kodieren, die in einem Mikroorganismus exprimiert werden sollen, werden vorzugsweise keine Introns enthalten, die zu früh die Transkription der DNA in mRNA beenden könnten; jedoch kann eine vorzeitige Beendigung der Transkription wünschenswert sein, z. B., wo dies zu Mutanten führen würde, die vorteilhafte c- terminale Verkürzungen aufweisen, z. B. eine Deletion einer transmembranen Region, um einen löslichen Rezeptor zu ergeben, der nicht mit der Zellmembran verbunden ist. Aufgrund der Degeneration des Codes kann eine bemerkenswerte Variation bei den Nucleotidsequenzen auftreten, die für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren; beispielhafte DNA-Ausführungsformen sind diejenigen, die mit den Nucleotidsequenzen, wie dargestellt in den Figuren, korrespondieren. Andere Ausführungsformen umfassen Sequenzen, die fähig sind zur Hybridisierung mit den Sequenzen der Figuren unter moderat stringenten Bedingungen (50ºC, 2 X SSC) und andere Sequenzen, die mit den oben beschriebenen hybridisieren oder degenerieren, die für biologisch aktive IL-4 Rezeptorpolypeptide kodieren.
Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit IL-4R Vektoren transformiert oder transfiziert wurden, die hergestellt wurden unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren. Transformierte Wirtszellen exprimieren in der Regel IL-4R, aber Wirtszellen, die für die Zwecke einer Klonierung oder Vervielfachung von IL-4R DNA transformiert wurden, müssen nicht unbedingt IL-4R exprimieren. Exprimiertes IL-4R wird in der Zellmembran deponiert oder in den Kulturüberstand sekretiert, abhängig von der gewählten IL-4R DNA. Geeignete Wirtszellen für die Expression von Säuger-IL-4R umfassen Prokaryoten, Hefen oder höhere eukaryotische Zellen unter der Steuerung von geeigneten Promotoren. Prokaryoten umfassen grammnegative oder grammpositive Organismen, z. B. E. coli oder Bazillen. Höhere eukaryotische Zellen umfassen etablierte Zellinien mit Säugerursprung wie unten beschrieben. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um Säuger IL-4R zu erzeugen unter Verwendung von RNAs, die von DNA-Konstrukten gemäß der vorliegenden Erfindung abstammen. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit bakteriellen, Pilz-, Hefe- und zellulären Säugerwirten sind beschrieben von Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985), wobei dessen relevante Offenbarung hier durch Bezugnahme miteingeschlossen ist.
Prokaryontische Expressionswirte können für die Expression von IL-4Rs verwendet werden, die keine extensive proteolytische und Disulfidverarbeitung benötigen. Prokaryontische Expressionsvektoren umfassen im allgemeinen einen oder mehrere phänotypische selektierbare Marker, z. B. ein Gen, das für Proteine kodiert, die eine Antibiotikaresistenz vermitteln oder einen autotrophen Bedarf darstellen und einen Replikationsursprung, der durch den Wirt erkannt wird, um eine Vervielfachung innerhalb des Wirts sicherzustellen. Geeignete prokaryontische Wirte für die Transformation umfassen E. coli, Bacillus subtilis. Salmonella typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl andere ebenfalls als Objekt der Wahl angewendet werden können.
Geeignete Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung können einen selektierbaren Marker enthalten und einen bakteriellen Replikationsursprung, abgeleitet von kommerziell erhältlichen Plasmiden, die genetische Elemente des wohlbekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) enthalten. Solche kommerziellen Vektoren umfassen z. B. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison WI, USA). Diese pBR322 "Rückgrad"-Bereiche sind mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktur- Sequenz kombiniert. E. coli wird typischerweise unter Verwendung von Derivaten von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das von einer E. coli Art abstammt (Bolivar et al., Gene 2:95, 1977). pBR322 enthält Gene für eine Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt daher ein einfaches Mittel für die, Identifizierung transformierter Zellen zur Verfügung.
Promotoren, die im allgemeinen in rekombinanten, mikrobiellen Expressionsvektoren verwendet werden, umfassen das β-Lactamase- (Penicillinase) und Lactose-Promotorsystem (Chang et al., Nature 275:615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), das Tryptophan-(trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; und EPA 36, 776) und den Tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 412, 1982). Ein besonders wirkungsvolles, bakterielles Expressionssystem verwendet den Phagen λPL-Promotor und den c1857ts thermolabilen Repressor. Plasmidvektoren, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind, die Derivate des λPL-Promotors inkorporieren, umfassen das Plasmid pHUB2, resident im E. coli Stamm JMB9 (ATCC 37092) und pPLc28, resident in E. coli RR1 (ATCC 53082).
Rekombinante IL-4R Proteine können auch in Hefewirtszellen exprimiert werden, vorzugsweise aus der Gattung Saccharomyces, wie z. B. S. cerevisiae. Hefen anderer Gattungen, wie z. B. Pichia oder Kluyveromyces können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren werden im allgemeinen einen Replikationsursprung von dem 2µ-Hefeplasmid enthalten oder eine sich autonom replizierende Sequenz (ARS), einen Promotor, eine DNA, die für IL-4R kodiert, Sequenzen für Polyadenylierung und Transkriptionsbeendigung und ein Selektionsgen. Vorzugsweise werden Hefevektoren einen Replikationsursprung enthalten und einen selektierbaren Marker, der die Transformation von sowohl der Hefe als auch E. coli erlaubt, z. B. das Ampicillinrestistenzgen vom E. coli und S. cerevisiae trp 1 Gen, das einen Selektionsmarker für einen mutanten Stamm von Hefe zur Verfügung stellt, der nicht auf Tryptophan wachsen kann und einem Promotor, der von einem hochexprimierten Hefegen abstammt, um die Transkription einer Struktursequenz stromabwärts zu induzieren. Die Gegenwart der trp 1-Lesion in dem Hefewirtszellengenom stellt dann eine wirksame Umgebung für den Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan zur Verfügung.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biel. Chem. 255:2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung in der Hefeexpression sind weiter beschrieben in Hitzeman, EPA 73,657.
Bevorzugte Hefevektoren können unter Verwendung von DNA-Sequenzen von pBR322 für die Selektion und Replikation in E. coli (Ampr-Gen und Replikationsursprung) und Hefe-DNA-Sequenzen, einschließlich des Glucose-repressiblen ADH2-Promotors und einem α-Faktor-Sekretionsleaders zusammengestellt werden. Der ADH2-Promotor wurde von Russel et al. beschrieben (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) und Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Der Hefe-α-Faktorleader, der die Sekretion von heterologen Proteinen steuert, kann zwischen dem Promotor und dem zu exprimierenden Strukturgen inseriert werden. Siehe z. B. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984. Die Leadersequenz kann so modifiziert sein, daß sie nahe ihrem 3'-Ende ein oder mehrere geeignete Restriktionsstellen enthält, um eine Fusion der Leadersequenz mit fremden Genen zu vereinfachen.
Geeignete Hefetransformationsprotokolle sind dem Fachmann bekannt; eine beispielhafte Technik wurde von Hinnen et al. beschrieben, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978; wobei auf Trp&spplus;-Transformanten in einem selektivem Medium selektiert wird, das aus 0,67% Hefestickstoffbasis, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glukose, 10µg/ml Adenin und 20 µg/ml Uracil besteht.
Wirtsstämme, die mit Vektoren transfomiert sind, die den ADH2-Promotor enthalten, können zur Expression in einem reichen Medium angezüchtet werden, das aus 1% Hefeextrakt besteht, 2% Pepton und 1% Glukose, supplementiert mit 80 µg/ml Adenin und 80 µg/ml Uracil. Die Derepression des ADH2-Promotors tritt nach Verbrauch der Glukose im Medium auf. Rohe Hefeüberstände werden durch Filtration geerntet und bei 4º Celsius vor der weiteren Reinigung gehalten.
Verschiedene Säuger oder Insektenzellkultursysteme können verwendet werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren.
Die Baculovirus-Systeme für die Herstellung von heterologen Proteinen in Insektenzellen werden von Luckow und Summers beschrieben, Bio/Technology 6:47 (1988). Beispiele für geeignete Säugerwirtszellinien umfassen die COS-7 Linien von Affen-Nierenzellen, beschrieben von Gluzman (Cell 23:175, 1981) und andere Zellinien, die geeignet sind zur Expression von geeigneten Vektoren umfassen z. B. L-Zellen, C127, 3T3, Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO), HeLa und BHK Zellinien. Säugerexpressionsvektoren können nichttranskribierte Elemente enthalten, wie z. B. einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und einen Enhancer, der mit dem zu exprimierenden Gen verbunden ist und andere 5' oder 3' flankierende, nichttranskribierte Sequenzen und 5' oder 3' nichttranslatierte Sequenzen, sowie notwendige Ribosomen-Bindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spaltungsdonor- und Akzeptorstellen und transkriptionale Beendigungssequenzen.
Die transkriptionalen und translationalen Steuersequenzen in Expressionsvektoren, die bei der Transformation von Vertebraten-Zellen verwendet werden, können durch virale Quellen zur Verfügung gestellt werden. Zum Beispiel leiten sich allgemein verwendete Promotoren und Enhancer von Polyoma, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und menschlichem Cytomegalievirus ab. DNA-Sequenzen, die aus dem viralen SV40 Genom abstammen, z. B. der SV40 Ursprung, der früher und späte Promotor, Enhancer, Spaltungsstelle und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um andere genetische Elemente zur Verfügung zu stellen, die für die Expression einer heterologen DNA-Sequenz benötigt werden. Die frühen und späten Promotoren sind insbesondere brauchbar, da beide einfach aus dem Virus als Fragment erhältlich sind, das außerdem den viralen SV40 Replikationsursprung enthält (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250-bp-Sequenz, die sich von der HindIII-Stelle zu der Bgl I-Stelle erstreckt, die im viralen Replikationsursprung lokalisiert ist, ist mit eingeschlossen. Weiterhin können genomische Säuger-IL-4R-Promotor-, Steuer- und/oder Signal-Sequenzen verwendet werden, vorausgesetzt, diese Steuersequenzen sind mit der gewählten Wirtszelle kompatibel. Zusätzliche Details, die die Verwendung ein von Säugerhochexpressionsvektoren betreffen, um einen rekombinanten Säuger-IL-4 Rezeptor zu erzeugen, sind in Beispiel 8 unten zur Verfügung gestellt. Beispielhafte Vektoren können so konstruiert werden, wie offenbart von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983).
Ein geeignetes System für eine stabile Expression auf hohem Niveau von Säugerrezeptor cDNAs in C127 murinen 0Brustepithelialzellen können im wesentlichen so konstruiert werden, wie beschrieben von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986).
Ein besonders bevorzugter eukaryontischer Vektor für die Expression von IL-4R DNA ist unten in Beispiel 2 offenbart. Dieser Vektor, bezeichnet als pCAV/NOT, wurde aus dem Säuger Hochexpressionsvektor pD201 abgeleitet und enthält regulaterische Sequenzen von SV40, Adenovirus-2 und menschlichem Cytomegalievirus. pCAV/NOT, der ein menschliches IL-7 Rezeptor-Insert trägt, wurde bei der American Type Culture Collection, (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer 68014 hinterlegt.
Gereinigte Säuger-IL-4 Rezeptoren oder Analoge werden durch Kultivierung von geeigneten Wirts/Vektorsystemen präpariert, um die rekombinanten Translationsprodukte der DNA gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, die dann aus den Kulturmedien oder den Zellextrakten gereinigt werden.
Zum Beispiel können Überstände von Systemen, die rekombinantes Protein in Kulturmedien sekretieren, zunächst unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters ankonzentriert werden, z. B. einer Amicon- oder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationseinheit. Dem Konzentrationsschritt folgend kann das Konzentrat einer geeigneten Reinigungsmatrix zugeführt werden. Eine geeignete Affinitätsmatrix kann z. B. ein IL-4 oder Lectin oder Antikörpermolekül enthalten, das an einen geeigneten Träger gebunden ist. Alternativ kann ein Anionen-Austauschharz verwendet werden, z. B. eine Matrix oder ein Substrat, das daran hängende Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen aufweist. Die Matrizes können Acrylamide, Agarose, Dextran, Cellulose oder andere Arten sein, die in der Regel bei der Proteinreinigung verwendet werden. Alternativ kann ein Kationenaustauschschritt verwendet werden. Geeignete Kationenaustauscher umfassen verschiedene unlösliche Matrizes, einschließlich Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt.
Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographieschritte (RP-HPLC) verwendet werden, wobei hydrophobe RP-HPLC-Medien verwendet werden, z. B. Silicagel mit daranhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen, können verwendet werden,um eine IL-4R Zusammensetzung zu reinigen. Einige oder alle der vorstehenden Reingungsschritte können in verschiedenen Kombinationen ebenfalls verwendet werden, um ein homogenes rekombinantes Protein zur Verfügung zu stellen.
Rekombinantes Protein, das in bakterieller Kultur erzeugt wurde, wird in der Regel durch anfängliche Extraktion aus den Zellpellets isoliert, gefolgt von einer oder mehreren Konzentrationen, Aussalzung, wäßrigem Ionenaustausch- oder Größenausschluß-Chromatographieschritten. Schließlich kann eine Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) für die letzten Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle Zellen, die bei der Expression von rekombinantem Säuger-IL-4R verwendet werden, können durch jedes geeignete Verfahren zerstört werden, einschließlich Einfrier- und Auftauzyklen, Ultraschall, mechanische Zerstörung oder die Verwendung von Zell-Lysemitteln.
Die Fermentation von Hefe, das Säuger-IL-4R als sekretiertes Protein exprimiert, vereinfacht die Reingung deutlich. Sekretiertes, rekombinantes Protein, das aus einer groß angelegten Fermentation resultiert, kann durch Verfahren gereinigt werden, analog zu den von Urdal et al. offenbarten (J. Chromatog, 296:171, 1984). Diese Referenz beschreibt zwei sequentielle Umkehrphasen-HPLC-Schritte zur Reinigung von rekombinantem, menschlichen IL-2 auf einer präparativen HPLC-Säule.
Menschliches IL-4R, das in einer rekombinanten Kultur synthetisiert wird, ist durch die Gegenwart von nicht menschlichen Zellbestandteilen, einschließlich Proteinen, charakterisiert in Mengen und von einem Charakter, der von den Reinigungsschritten abhängt, die durchgeführt wurden, um das menschliche IL-4R aus der Kultur zu gewinnen. Diese Bestandteile werden in der Regel einen Hefe-, prokaryontischen oder nicht- menschlichen, höher-eukaryontischen Ursprung haben und sind vorzugsweise in ungefährlichen, kontaminierenden Mengen vorhanden, in einer Menge von weniger als ungefähr 1 Gew.-%. Weiterhin ermöglicht die rekombinante Zellkultur die Produktion von IL-4, das frei ist von Proteinen, die in der Regel mit IL-4R assoziiert sind, wenn es in der Natur in der Ursprungsart gefunden wird, z B. in Zellen, Zellexudaten oder Körperflüssigkeiten.
IL-4R Zusammensetzungen werden für die Verabreichung durch Mischung von IL-4R mit dem gewünschten Grad an Reinheit mit physiologisch akzeptablen Trägern hergestellt. Solche Träger sind für den Empfänger in den Dosierungen und angewendeten Konzentrationen nicht toxisch. In der Regel beinhaltet die Herstellung solcher Zusammensetzungen die Kombination des IL- 4R mit Puffern, Antioxidantien, wie z. B. Ascorbinsäure, niedrig molekularen (weniger als ungefähr 10 Reste) Polypeptiden, Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten, einschließlich Glukose, Saccharose oder Dextrinen, Chelatbildnern, wie z. B. EDTA, Glutathion und anderen Stabilisatoren und Hilfsstoffen. IL-4R Zusammensetzungen können verwendet werden, um die Funktion von B-Zellen zu regulieren, z. B. inhibiert lösliches IL-4R (sIL-4R) die Proliferation von B-Zellkulturen, induziert von IL-4 in der Gegenwart von Anti-Ig. sIL-4R inhibiert ebenfalls die IL-4 induzierte IgG1-Sekretion durch LPS-aktivierte B-Zellen, wie bestimmt durch Isotypen-spezifischen ELISA und inhibiert IL-4-induzierte Ia-Expressionen auf murinen B-Zellen, wie bestimmt durch EPICS-Analyse. sIL-4R inhibiert ebenfalls IL-4-induzierte IgE-Synthese und kann dementsprechend verwendet werden, um IgE-induzierte Sofort-Hypersensitivitätsreaktionen zu behandeln, wie z. B. allergische Rhinitis (gewöhnlicher Heuschnupfen), Bronchialasthma, atopische Dermatitis und gastreintestinale Nahrungsmittelallergie.
IL-4R Zusammensetzungen können ebenfalls verwendet werden, um die Funktion von T-Zellen zu regulieren. Zum Beispiel inhibiert IL-4R die IL-4 induzierte Proliferation von T-Zellinien, wie z. B. der CTLL-T-Zellinie. sIL-4R inhibiert außerdem die funktionale Aktivität, die durch endogen erzeugtes IL-4 vermittelt wird. sIL-4R inhibiert z. B. die Erzeugung von alloreaktiven, cytolytischen T-Lymphocyten (CTL) in sekundärer, gemischter Leukocytenkultur, wenn dies in einer Kultur gleichzeitig mit einem monoklonalen Antikörper gegen IL-2, wie z. B. S4B6 vorhanden ist. Neutralisierende Mittel für sowohl IL-2 als auch IL-4 werden verwendet, um endogenes 11-2 oder IL-4 zu inhibieren, die beide die CTL-Erzeugung regulieren und in solchen Kulturen erzeugt werden.
In therapeutischen Anwendungen wird eine therapeutisch effektive Menge einer IL-4 Rezeptor Zusammensetzung einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, zusammen mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht.
Die folgenden Beispiele werden im Zuge der Illustration und nicht als Begrenzung dargestellt.

Beispiele

Beispiel 1

Bindungsassays für IL-4 Reseptor

A. Radioaktive Markierung von IL-4. Rekombinantes murines und menschliches IL-4 wurde in Hefe exprimiert und zu Homogenität gereinigt, wie beschrieben von Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5267 (1987) bzw. Park et al., J. Exp. Med. 166:476 (1987). Das gereinigte Protein wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Enzymträger (Enzymobead) Iodierungsmittels (BioRad) radioaktiv markiert. Bei diesem Verfahren werden 2,5 µg rIL-4 in 50µl 0,2 molarem Natriumphospaht, pH 7.2, mit 50 µl Enzymobeadreagenz, 2 MCi Natriumiodid in 20 µl 0,05 molarem Natriumphosphat, pH 7,0 und 10 µl 2,5 % b-D-Glukose kombiniert. Nach 10 Minuten bei 25ºC wurden Natriumazid (10 µl, 50 mM) und Natriummetabisulfit (10 µl, 5 mg/ml) hinzugefügt und die Inkubation wurde für 5 Minuten bei 25ºC fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde durch Gelfiltrationen auf einem 2 ml Bettvolumen von Sephadex G-25 (Sigma) fraktioniert, equilibriert in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, das 2,5 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, 0,2 % (w/v) Natriumazid und 20 mM Hepes pH 7,4 (Bindungsmedium). Der schließliche Pool von ¹²&sup5;I- IL-4 wurde zu einer Arbeitslagerlösung von 2 x 10&supmin;&sup8; M in Bindungsmedium verdünnt und für bis zu einem Monat bei 4ºC ohne erkennbaren Verlust an Rezeptorbindungsaktivität gelagert. Die spezifische Aktivität liegt routinemäßig im Bereich von 1-2 x 10¹&sup6; cpm/mMol IL-4.
B. Bindung an adhärente Zellen. Bindungsassays mit Zellen, die in Suspensionskultur (das heißt CTLL- und CTLL-19.4) angezüchtet waren, wurden durch ein Phathalat-Öltrennungsverfahren durchgeführt (Dower et al. J. Immunol, 132:751, 1984), im wesentlichen wie beschrieben von Park et al., J. Biol. Chem. 261:4177, 1986 und Park et al., supra. Bindungsassays wurden außerdem an COS-Zellen durchgeführt, die mit einem Säugerexpressionsvektor transfiziert waren, der cDNA enthielt, die für ein IL-4 Rezeptormolekül kodierte. Für die Scatchardanalyse der Bindung an adhärente Zellen wurden COS- Zellen mit Plasmid-DNA durch ein Verfahren von Luthman et al., Nucl. Acids. Res. 11:1295, 1983 und McCutchan et al. J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1968 durchgeführt. Acht Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und auf sechs Lochplatten ausgesät (Costar, Cambridge, MA) bei einer Dichte von 1 x 10&sup4; COS-IL-4-Rezeptor-Transfektanden/wohl gemischt mit 5 x 10&sup5; COS-kontrolltransfizierten Zellen als Träger. Zwei Tage später wurden die Monolayer auf ¹²&sup5;I-IL-4 Bindung untersucht bei 4ºC, im wesentlichen durch das Verfahren beschrieben durch Park et al., J. Exp. Med. 166:476, 1987. Eine nichtspezifische Bindung von ¹²&sup5;I-IL-4 wurde in Gegenwart von einem 200-fachen oder größeren molaren überschuß von nicht markierten IL-4 gemessen. Natriumazid (0,2%) wurde allen Bindungsassays hinzugefügt, um eine Internalisierung von ¹²&sup5;I-IL-4 durch Zellen bei 37ºC zu verhindern.
Für die Analyse der Inhibition der Bindung durch lösliches IL-4R wurden überstände von COS-Zellen,mit rekombinanten IL- 4R Konstrukten transfiziert und drei Tage nach Transfektion geerntet. Serielle zweifache Verdünnungen von konditionierten Medien wurden mit 3 x 10&supmin;¹&sup0; M ¹²&sup5;I-IL-4 präinkubiert (mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 1 x 10¹&sup6; cpm/mMol) für eine Stunde bei 37ºC vor der Zugabe von 2 x 106 CTLL-Zellen. Die Inkubation wurde für 30 Minuten bei 37ºC fortgeführt, vor der Trennung von freien und zellgebundenem murinen ¹²&sup5;I-IL-4.
C. Festphasenbindungsassays. Die Fähigkeit des IL-4 Rezeptors, stabil an Nitrozellulose von Waschextrakten von CTLL 19.4 Zellen zu adsorbieren und dabei jedoch die IL-4 Bindungsaktivität zu erhalten, stellte ein Mittel zur überwachung der Reinigung zur Verfügung. Ein ml Aliquots der Zellextrakte (siehe Beispiel 3), IL-4 Affinitätssäulenfraktionen (siehe Beispiel 4) oder andere Proben wurden auf trokkenen BA85/21 nitrozellulose Membranen plaziert (Schleicher und Schuell, Keene, NH) und man ließ sie trocknen. Die Membrane werden in Gewebekulturschalten für 30 Minuten in Tris (0,05 M) gepufferter Salzlösung (0,15 M) pH 7,5 mit 3% w/v BSA inkubiert, um nicht spezifische Bindungsstellen zu blokkieren. Die Membran wird dann mit 4 x 10&supmin;¹¹ M ¹²&sup5;I-IL-4 in PBS und 3 % BSA mit oder ohne einem 200-fachen molaren überschuß von nicht markiertem IL-4 bedeckt und für 2 Stunden bei 4ºC unter Schütteln inkubiert. Am Ende dieser Zeit werden die Membranen 3 mal in PBS gewaschen, getrocknet und auf Kodak X- Omat AR-Folie für 18 Stunden bei -70ºC plaziert.

Beispiel 2

Selektion von CTLL-Zellen mit hoch IL-4 Rezeptor-Expression durch Fluoreszenz-aktivierte Zellauslese (FACS)

Die bevorzugte Zellinie für den Erhalt einer hohen IL-4 Rezeptor Selektion ist CTLL, eine murine IL-2-abhängige cytotoxische T-Zellinie (ATCC TIB 214). Um höhere Niveaus von IL- 4 Rezeptorexpression zu erhalten, wurden CTLL-Zellen (Elternzellen) unter Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellauslese ausgewählt und fluoreszein-konjungiertes, rekombinantes murines IL-4 (rmIL-4), wobei das überschüssige Kohlenhydrat, das am rmIL-4 durch die Hefewirtszelle angebunden wird, zum Vorteil durch eine Verkupplung des Fluoreszeinhydrazids an periodierte, oxidierte Zuckerbestandteile verwendet wird. Das fluoreszein-konjungierte IL-4 wurde durch eine Kombination von Aliquots von hyperglycosylierten rmIL-4 hergestellt (300µg in 300 µl 0,1 M Citrat-Phosphatpuffer, pH 5,5) mit 30 µl 10 mM Natrium m-Periodate (Sigma), frisch hergestellt in 0,1 M Citrat-Phosphat, pH 5,5, und die Mischung wurde bei 4ºC für 30 Minuten im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde mit 30 µl mit 0,1 M Glycerol unterdrückt und für 18 Stunden bei 4ºC gegen 0,1 M Citrat-Phosphat, pH 5,5, dialysiert. Auf die Dialyse folgend wurde ein 1/10 des Volumens von 100 mM 5-(((2-(Carbohydrazino)methyl)thio)acetyl)aminofluorescein (Molecular Probes, Eugene OR), gelöst in DMSO, der Probe hinzugefügt und bei 25ºC für 30 Minuten inkubiert. Das IL-4 Fluoreszein wurde dann erschöpfend bei 4ºC gegen PBS, pH 7,4, dialysiert und die Proteinkonzentration durch Aminosäureanalyse bestimmt. Das Endprodukt wurde bei 4ºC, folgend auf die Zugabe von 1% (w/v) BSA und Sterilfiltration gelagert.
Um auszulesen, wurden CTLL-Zellen (5 x 10&sup6;) 30 Minuten bei 37ºC in 150 µl PBS und 1% BSA inkubiert, das 1 x 10&supmin;&sup9; M IL-4 Fluoreszein unter sterilen Bedingungen enthielt. Die Mischung wurde dann auf 4ºC abgekühlt, einmal in einem großen Volumen von PBS und 1% BSA gewaschen und unter Verwendung von EPICS C flow Cytometer (Coulter Instruments) ausgelesen. Die Zellen, die das höchste Fluoreszenzsignal (Top 1%) zeigten, wurden in ihrer Masse gesammelt und die Population in flüssiger Zellkultur vermehrt. Alternativ wurden für eine Einzelzellklonierung die Zellen, die eine Fluoreszenzsignal im Top 1,0% zeigten, in 96 Vertiefungs-Gewebekulturtiterplatten mit einer Zelle pro Vertiefung ausgelesen.
Der Fortschritt wurde überwacht, indem Bindungsassays mit ¹²&sup5;I-IL-4 durchgeführt wurden, folgend auf jede Runde von FACS-Selektion. Nicht ausgelesene CTLL-Zellen (CTLL Eltern) zeigten typischerweise 1.000 bis 2.000 IL-4 Rezeptoren pro Zelle. CTLL-Zellen wurden 19 Runden einer FACS-Selektion unterzogen. Die endgültigen ausgewählten CTLL-Zellen (CTLL-19) zeigten 5 x 10&sup5; bis 1 x 10&sup6; IL-4 Rezeptoren pro Zelle. An diesem Punkt wurde die CTLL-19 Population einer EPICS C unterstützten Einzelzellklonierung unterzogen und individuelle Klonierungspopulationen wurden vermehrt und auf ¹²&sup5;I-IL-4 Bindungen getestet. Ein einzelner Klon, bezeichnet als CTLL- 19.4, zeigte 1 x 10&sup6; IL-4 Rezeptoren pro Zelle und wurde für die Reinigung und Klonierungsstudien ausgewählt. Während die kalkulierten anscheinenden Ka-Werte denen für die zwei Linien entsprachen, exprimiert CTLL 19.4 ungefähr 400-fach mehr Rezeptoren auf seiner Oberfläche als das CTLL-Elternteil.

Beispiel 3

Waschextraktion von CTLL-Zellen

CTLL-19.4-Zellen wurden in RPMI 1640 gehalten, das 10% fötales Rinderserum enthielt, 50 U/ml Penicillin, 50 µg/ml Streptomycin und 10 ng/ml von rekombinantem, menschlichen IL-2. Die Zellen wurden auf 5 x 10&sup5; Zellen pro ml in Rollflaschen angezogen, durch Zentrifugation geerntet, zweimal in serumfreien DMEM gewaschen und bei 2.000 g für 10 Minuten sedimentiert, um ein festes Pellet (ungefähr 2 x10&sup8; Zellen pro ml) zu ergeben. Dem Pellet wurde ein entsprechendes Volumen PBS hinzugefügt, das 1% Triton 100 enthielt und ein Cocktail von Proteaseinhibitoren (2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10µM Pepstatin, 10 µM Leupeptin, 2mM o-Phenanthrolin und 2 mM EGTA). Die Zellen wurden mit dem Extraktionspuffer durch starkes Vortexen gemischt und die Mischung wurde auf Eis für 20 Minuten inkubiert, woraufhin die Mischung bei 12.000 g für 20 Minuten bei 8ºC zentrifugiert wurde, um Zellkerne und anderen Abfall zu entfernen. Der überstand wurde entweder sofört verwendet oder bei -70ºC bis zur Verwendung gelagert.

Beispiel 4

IL-4 Rezeptor Reinigung durch IL-4 Affinitätschromatographie

Um ausreichende Mengen murines IL-4R zu erhalten, um seine N- terminale Sequenz bestimmen zu können oder menschliches IL-4R weiter zu charakterisieren, wurde das Protein, das von der Waschextraktion der Zellen erhalten wurde, weiter durch Affinitätschromatographie gereinigt. Rekombinantes, murines oder menschliches IL-4 wurde mit Affigel -10 (BioRad) gemäß den Vorschlägen des Herstellers verbunden. Zum Beispiel wurde einer Lösung von IL-4 (3,4 mg/ml in 0,4 ml 0,1 M Hepes pH 7,4) 1,0 ml gewaschenes Affigel -10 hinzugefügt. Die Lösung wurde über Nacht bei 4ºC bewegt und ein Aliquot des Überstandes wurde auf Protein durch ein Biorad-Proteinassay nach den Instruktionen des Herstellers unter Verwendung von BSA als Standard getestet. Mehr als 95 % des Proteins hatten sich mit dem Gel verbunden, was andeutet, daß die Säule eine Endladung von 1,3 mg IL-4 pro ml Gel hatte. Glycin-Ethylester wurde zu einer endgültigen Konzentration von 0,05 M hinzugefügt, um jedwede Stellen auf dem Gel zu blockieren, die noch nicht reagiert hatten. Das Gel wurde extensiv mit PBS-1% Triton gewaschen, gefolgt von 0,1 Glycin-HCl, pH 3. Eine 0,8 x 4,0 cm-Säule wurde mit IL-4 gekoppeltem Affigel präpariert, hergestellt wie beschrieben (4,0 ml Bettvolumen), und mit PBS gewaschen, das 1% Triton X-100 enthielt, zur Reinigung von murinem IL-4. Alternativ wurden 50 µl Aliquots einer 20%igen Suspension von IL-4 gekoppelten Affigel mit ³&sup5;S- Cystein/Methionin markierten Zellextrakten für Affinitätsreinigung und Gelelektrophorese in geringem Umfang inkubiert.
Aliquots (25 ml) von waschextrahiertem IL-4 Rezeptor, der CTLL-19.4 Zellen trug, wurden langsam auf die murine 11-4 Affinitätssäule bei 4ºC (Flußrate 3,0 ml/Stunde) aufgegeben. Die Säule wurde dann sequentiell mit PBS gewaschen, das 1% Triton X-100 enthielt, RIPA-Puffer (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 1% NP-40, 1% Deoxycholat und 0,1% SDS), mit PBS, das 0,1% Triton X-100 enthielt und 10 mM ATP und PBS mit 1% Triton X-100, um alles kontaminierende Material außer dem mIL-4R zu entfernen. Die Säule wurde dann mit pH 3,0 Glyzin HCl-Puffer eluiert, der 0,1% Triton X-100 enthielt, um das IL-4R zu entfernen und anschließend mit PBS gewaschen, das 0,1% Triton X-100 enthielt. Ein-ml-Fraktionen wurden für die Elution gesammelt, und 2 ml Fraktionen wurden während der Waschung gesammelt. Unmittelbar im Anschluß an die Elution wurden die Proben mit 80 µl 1 M Hepes, pH 7,4 neutralisiert. Die Gegenwart von Rezeptor in den Fraktionen wurde durch den Festphasenbindungsassays, wie oben beschrieben, detektiert, unter Verwendung von ¹²&sup5;I-markiertem IL-4. Die Aliquots wurden aus jeder Fraktion zur Analyse durch SDS-PAGE entfernt und der Rest wurde bei -70ºC bis zur Verwendung eingefroren. Für die SDS-PAGE wurden 40 µl jeder Säulenfraktion zu 40 µl 2 x SDS Proben-Puffer (0,125 M Tris HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20 % Glycerol, 10 % 2-Mercaptonethanol) hinzugefügt. Die Proben wurden in einem Wasserbad mit kochendem Wasser für 3 Minuten gehalten und 80 µl Aliquotes wurden auf Probenvertiefungen eines 10% Polyacrylamid-Gels aufgebracht, das entsprechend dem Verfahren von Laemmli (Nature 227:680, 1970) aufgebaut und durchgeführt wurde. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit Silber gefärbt, wie vorher beschrieben von Urdal et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6481, 1984).
Die Reinigung durch das vorstehende Verfahren ermöglichte die Identifizierung durch Silberfärbung der Polyacrylamidgele von zwei mIL-4R-Proteinenbanden mit einem Durchschnitt von 45 bis 55 kDa und 30 - 40 kDa, die in den Fraktionen vorhanden waren, die IL-4 Bindungsaktivität zeigten. Experimente, bei denen die Zelloberflächenproteine von CTLL 19.4 Zellen radiakiv markiert wurden und der ¹²&sup5;I-markierte Rezeptor durch Affinitätschromatographie gereinigt wurde, legten nahe, daß diese beiden Proteine auf der Zelloberfläche exprimiert wurden. Das Verhältnis der niedrig-molekularen zu hochmolekularen Banden nahm zu nach Lagerung der Fraktionen bei 4ºC, was nahelegte, daß eine Vorläufer-Erzeugnisbeziehung vorlag, möglicherweise abhängig von einem langsamen proteolytischen Abbau. Das mIL- 4-Rezeptor Protein, das durch den vorstehenden Prozeß gereinigt wurde, war weiterhin fähig, IL-4 zu binden, sowohl eine Lösung als auch adsorbiert an die Nitrozellulose.

Beispiel 5

Sequenzierung von IL-4 Rezeptor-Protein

CTLL 19.4 mIL-4 Rezeptor enthaltende Fraktionen aus der mIL-4 Affinitätssäulenreinigung wurden für eine aminoterminale Proteinsequenzanalyse durch Fraktionierung auf einem SDS-PAGE Gel vorbereitet und dann auf eine PVDF-Membran übertragen. Bevor man die Proteinfraktionen auf Polyacrylamidgelen laufen ließ, war es zunächst notwendig, restliches Waschmittel aus dem Affinitätsreinigungsverfahren zu entfernen. Die Fraktionen, die Proteine enthielten, die an die mIL-4 Affinitätssäule aus den drei Präparationen gebunden waren, wurden aufgetaut und individuell in einem Speed-Vac unter Vakuum zu einem Endvolumen von 1 ml konzentriert. Die konzentrierten Fraktionen wurden dann auf pH 2 durch Zugabe von 50% (v/v) TFA eingestellt und auf eine Brownlees RP-300 Umkehrphasen HPLC-Säule (2,1 x 30 mm), equilibriert mit 0,1 % (viv) TFA in Wasser, bei einer Flußrate von 200 µl/min auf einem Hewlett Packard Modell 1090M HPLC injiziert. Die Säule wurde mit 0,1% TFA in Wasser für 20 Minuten nach der Injektion gewaschen. Die HPLC-Säule, die das gebundene Protein enthielt, wurde dann mit einem Gradienten wie folgt entwickelt:
1 ml Fraktionen wurden alle fünf Minuten gesammelt und auf die Gegenwart von Protein durch SDS-PAGE, gefolgt von Silberfärbung, analysiert.
Jede Fraktion aus dem HPLC-Lauf wurde in den trockenen Zustand in einer Speed-Vac evaporiert und dann in Laemmli-Reduktionsprobenpuffer resuspendiert, hergestellt, wie beschrieben von Laemmli, U. K. Nature 227:680, 1970. Die Proben wurden auf ein 5-20%-Gradienten Laemmli SDS Gel aufgetragen und bei 45 mA gelaufen, bis die Farbstoffront den Boden des Gels erreichte. Das Gel wurde dann auf PVDF-Papier übertragen und wie beschrieben von Matsudaira, J. Biol. Chem. 262:10035, 1987, gefärbt. Die Färbebanden wurden in den Fraktionen von jeder der drei Präparationen bei ungefähr 30.000 bis 40.000 Mr deutlich identifiziert.
Die Banden des vorherigen PVDF-Blottings wurden ausgeschnitten und einem automatisierten Edman Abbau auf einem Applied Biosystems Model 477A Proteinsequenzer unterzogen, im wesentlichen wie beschrieben von March et al (Nature 315:641, 1985), außer daß die PTH-Aminosäuren automatisch injiziert und on-line mit einem Applied Biosystems Model 120A HPLC unter Verwendung eines Gradienten und eines Detektionssystems, das vom Hersteller zur Verfügung gestellt wurde, analysiert wurden. Die folgenden Amino-terminalen Sequenzen wurden aus den Ergßbnissen der Sequenzierung bestimmt: NH&sub2;-Ile-Lys-Val- Leu-Gly-Glu-Pro-Thr-Cys/Asn-Phe-Ser-Asp-Tyr-Ile. Die Banden aus der zweiten Präparation, verwendet für die amino-terminale Sequenzierung, wurden mit CNBR behandelt unter Verwendung des situ-Verfahrens, beschrieben von March et al. (Nature 315:641,1985), um das Protein nach den internen Methioninresten zu spalten. Sequnzierung der erhaltenen Spaltungsprodukte ergab die folgenden Daten, die anzeigen, daß das CNBR das Protein nach zwei internen Methioninresten spaltete:
Wenn verglichen mit den Proteinsequenzen, die aus den Klonen 16 und 18 abgeleitet sind (siehe Fig. 2), stimmten die Sequenzen wie folgt überein: Sequenz
Identische Übereinstimmungen wurden für alle Positionen der Sequenz 1 außer Asn(2) gefunden und Sequenz 2, außer Arg an den Positionen 8, 10 und 12, Ser in der Position 13 und Leu in der Position 16. Die obigen Sequenzen korrespondieren mit dem Aminosäureresten 137-154 und 169-187 der Fig. 2.
Zusätzlich entsprach die Amino-terminale Sequenz einer Sequenz, wie abgeleitet aus dem Klon mit Position 9 definiert als Cys.
Die obengenannten Daten unterstützen den Schluß, daß die Klone 16 und 18 aus der Information für das Gen für den IL-4 Rezeptor abgeleitet sind.

Beispiel 6

Synthese von einer Hybried substrahierten cDNA-Sonde

Um eine Bibliothek auf Klone, die für den murinen IL-4 Rezeptor kodieren, abzusuchen, wurde eine hoch angereicherte IL-4 Rezeptor cDNA-Sonde unter Verwendung der Substrakions-Hybridisierungsstrategie erhalten. Polyadenylierte (polyA&spplus;) mRNA wurde aus zwei ähnlichen Zellinien isoliert, der Elternzellinie CTLL (die ungefähr 2.000 Rezeptoren pro Zelle exprimiert) und der ausgelesenen Zellinie CTLL 19.4 (die 1 x 10&sup6; Rezeptoren pro Zelle exprimiert). Der mRNA-Gehalt dieser zwei Zellinien sollte identisch sein mit Ausnahme des relativen Gehalts von IL-4 Rezeptor mRNA. Dann wurde eine radioaktiv markierte Einzelstrang-cDNA Präparation aus der mRNA der ausgelesenen Zellinie CTLL 19.4 durch reverse Transkription von polyadenyliertem mRNA von CTLL 19.4 Zellen durch ein Verfahren durchgeführt, das ähnlich demjenigen ist, wie beschrieben von Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). Kurz wurde die polyA&spplus; mRNA, wie beschrieben von March et al. (Nature 315:641- 647, 1985) gereinigt, und in cDNA durch reverse Transcriptase unter Verwendung von oligo dT als Primer kopiert. Um ein hohes Level von ³²P-Markierung der cDNA zu erhalten, wurden 100 µCi (s.a. = 3.000 Ci/mMol) in einer 50 µl-Reaktion mit nichtradioaktivem dCTP bei 10µM verwendet. Nach der reversen Transkription bei 42ºC für 2 Stunden wurde EDTA zu 20 mM hinzugefügt und die RNA wurde durch Zugabe von NaOH auf 0,2 M hydrolysiert und die cDNA Mischung wurde bei 68ºC für 20 Minuten inkubiert. Die einzelsträngige cDNA wurde mit einer Phenol/Chloroform (50/50) Mischung extrahiert, die vorher mit 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA equilibriert worden war. Die wäßrige Phase wurde in ein sauberes Röhrchen übertragen und durch Zugabe von NaOH, 0,5 M, alkalisch gemacht. Die cDNA wurde durch Chromatographie auf einer 6 ml-Sephadex G50 Säule in 30mM NaOH und 1 mM EDTA größen-fraktioniert, um niedrig-molekulare Kontaminanten zu entfernen.
Die resultierende größen-fraktionierte cDNA aus den ausgelesenen CTLL 19.4-Zellen wurde dann mit einem Überschuß an mRNA aus den nicht-ausgelesenen Eltern-CTLL-Zellen durch Ethanol- Präcipitation der cDNA von CTLL-19.4-Zellen mit 30µg polyA&spplus; mRNA aus nicht-ausgelesenen CTLL-Zellen hybridisiert, mit einer Resuspendierung in 16 µl 0,25 M NaPO&sub4;, pH 6,8, 0,2% SDS, 2 mM EDTA und einer Inkubation für 20 Stunden bei 68ºC. Die cDNA der ausgelesenen CTLL-19.4-Zellen, die komplementär zu den mRNAs der unausgelesenen CTLL-Zellen sind, bilden doppelsträngige cDNA-mRNA-Hybride, die dann von der einzelsträngigen cDNA getrennt werden können, basierend. auf ihren unterschiedlichen Bindungsaffinitäten auf Hydroxyapatit. Die Mischung wurde mit 30 Volumen 0,02 M NaPO&sub4;, pH 6,8 verdünnt; an Hydroxyapatit bei Raumtemperatur gebunden, und einzelsträngige cDNA wurde von dem Harz mit 0,12 M NaPO&sub4;, pH 6,8, bei 60ºC, wie beschrieben von Sims et al., Nature 312:541, 1984, eluiert. Der Phosphatpuffer wurde dann durch Zentrifugation über 2 ml-Sephadex G50 Spin-Säulen in Wasser entfernt. Dieses Hybrid-Substraktionsverfahren entfernt einen Großteil von allgemeinen Sequenzen zwischen CTLL-19.4 und unausgelesenen CTLL-Zellen und läßt einen einzelsträngigen cDNA-Pool übrig, der auf radioaktiv markierte IL-4-Rezeptor cDNA angereichert ist, die als Sonde für eine cDNA-Bibliothek (wie unten beschrieben) verwendet werden kann.

Beispiel 7

Synthese einer cDNA-Bibliothek und Plaquescreening

Eine cDNA-Bibliothek wurde aus polyadenylierter mRNA, isoliert von CTLL-19.4-Zellen, unter Verwendung von Standardverfahren konstruiert (Gubler et al., Gene 25:263, 1983; Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Vol., 1, 1987). Nach reverser Transkription unter Verwendung von oligo dT als Primer wurde die einzelsträngige cDNA mit DNA-Polymerase 1 doppelsträngig gemacht, durch T4 DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen, mit EcoRI Methylase methyliert, um EcoRI-Spaltungsstellen innerhalb der cDNA zu schützen und an EcoRI-Linker ligiert. Die resultierenden Konstrukte wurden mit EcoRI verdaut, um alle außer einer Kopie der Linker an jedem Ende der cDNA zu entfernen und an eine äquimolare Konzentration von EcoR1 geschnittenen, dephosphorylierten λZAP -Armen ligiert und die resultierende Ligationsmischung wurde in vitro (Gigapack ) verpackt gemäß den Anweisungen des Herstellers. Andere geeignete Verfahren und Reagenzien für die Erzeugung von cDNA-Bibliotheken in λ-Phagenvektoren sind beschrieben von Huynh et al., DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1984); Meissner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4171 (1987) und Ausubel et al., supra. λZAP ist ein Phagen-λ-Klonierungsvektor ähnlich dem λgt11 (U.S. Patent 4,788,135), der Plasmidsequenzen von pUC19 enthält (Norrander et al., Gene 26:101, 1987), eine Polylinkerstelle, lokalisiert in einem lacZ-Genfragment und einen f1-Phagen Replikationsursprung, der die Wiedergewinnung von ssDNA ermöglicht, wenn Wirtsbakterien mit f1-Helferphagen superinfiziert werden. Die DNA wird in Form eines Plasmids ausgeschnitten, das die vorstehenden Elemente enthält, bezeichnet als Bluescript . Gigapack ist ein ultraschallbehandelter E. coli-Extrakt, der verwendet wird, um λ-Phagen DNA zu verpacken. λZAP , Bluescript und Gigapack sind registrierte Marken von Stratagene, San Diego, CA, USA.
Die radioaktiv markierte Hybrid-substrahierte cDNA aus Beispiel 6 wurde dann als Sonde verwendet, um die cDNA-Bibliothek durchzutesten. Die vervielfachte Bibliothek wurde auf 884-Zellen mit einer Dichte von 25.000 Plaques auf jede von 20 von 150 mm Platten plattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Alle Manipulationen von λZAP und die Exzision des Bluescript Plasmids waren diejenigen, wie beschrieben von Short et al., (Nucl. Acids Res. 16:7583, 1988) und der Stratagene Produkt Literatur. Duplikatplaque-Liftfilter wurden mit Hybrid-substrahierten cDNA-Sonden aus Beispiel 6 in Hybridisierungspuffer inkubiert, der 50% Formamide enthielt, 5 x SSC, 5 x Denhardt's Reagenz und 10% Dextransulfat bei 42ºC für 48 Stunden, wie beschrieben von Wahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3683, 1979. Die Filter wurden dann bei 68ºC in 0,2 x SSC gewaschen. Sechzehn positive Plaques wurden für die weitere Analyse gereinigt.
Die Bluescript Plasmide, die die cDNA-Inserte enthielten, wurden yon dem Phagen, wie vom Hersteller beschrieben, ausgeschnitten und in E. coli transformiert: Die Plasmid-DNA wurde von individuellen Kolonien isoliert, mit EcoR1 verdaut, um die cDNA-Inserte freizusetzen und auf 1%igem Standard Agarosegel elektrophoretisch untersucht. Vier Duplikatgele wurden auf Nylonfilter geblottet, um identische Southernblots für die Analyse mit verschiedenen Sonden zu erzeugen, die (1) radioaktiv markierte cDNA aus unausgelesenen CTLL-Zellen war, (2) radioaktiv markierte cDNA von CTLL-19.4 ausgelesenen Zellen, (3) Hybrid-substrahierte cDNA von CTLL-19.4 ausgelesenen Zellen und (4) Hybrid-substrahierte cDNA von CTLL-19.4 ausgelesenen Zellen nach einer zweiten Hybridisierungsrunde zu polyA&spplus; mRNA von einer IL-4 Rezeptor negativen murinen Zellinie (LBRM 33 1A5B6). Diese Sonden wurden ansteigend auf cDNA-Kopien von mRNA angereichert, die spezifisch war für die ausgelesene Zellinie CTLL-19.4. Von den 16 positiven Plaques, die aus der Bibliothek isoliert wurden, zeigten vier Klone (11A, 14, 16 und 18) einen parallelen Anstieg in der Signalstärke mit Anreicherung der Sonde.
Eine Restriktionskartierung (dargestellt in Fig. 1) und DNA- Sequenzierung der isolierten CTLL-Klone zeigte die Existenz von mindestens zwei unterschiedlichen mRNA-Populationen an. Beide mRNA-Arten weisen homologe offene Leserahmen über einen Großteil der kodierenden Region auf, unterscheiden sich jedoch am 3'-Ende, und kodierten so für homologe Proteine mit unterschiedlichen COOH-terminalen Sequenzen. Die DNA-Sequenz von der Innenseite des offenen Leserahmens beider Klone kodiert für eine Proteinsequenz, die identisch zu der Proteinsequenz ist, wie abgeleitet von der Sequenzierung des gereinigten IL-4 Rezeptors, im Detail beschrieben im Beispiel 5. Die Klone 6 und 18 wurden als Prototypen für diese zwei voneinander verschiedenen Informationsarten für das Gen verwendet. Der Klon 16 enthält einen offenen Leserahmen, der für ein 258-Aminosäurepolypeptid kodiert, das die Aminosäure -25 bis 233 der Fig. 2A einschließt. Der Klon 18 kodiert für ein 230-Aminosäurepolypeptid, dessen N-terminale 224 Aminosäuren identisch mit dem N-Terminus des Klones 16 sind, sich aber am 3'-Ende mit den Nucleotiden CCAAGTAATGAAAATCTG unterscheiden, die für die C-terminalen 6 Aminosäuren kodieren, Pro-Ser-Asn- Glu-Asn-Leu, gefolgt von einem Stop-Codon TGA. Beide Klone wurden in einem Säugerexpressionssystem, wie beschrieben in Beispiel 8, exprimiert.

Beispiel 8

Expression von IL-4R in Säugerzellen

A. Expression in COS-7-Zellen. Ein eukaryontischer Expressionsvektor pCAV/NOT, dargestellt in Fig. 3, wurde von dem Säuger-Hochexpressionsvektor pDC201, beschrieben von Sims et al., Science 241:585, 1988), abgeleitet. pDC201 ist ein Derivat von pMLSV, vorher beschrieben von Cosman et al., Nature 312:768, 1984. pCAV/NOT ist so aufgebaut, daß er cDNA-Sequenzen exprimiert, die an seiner multiplen Klonierungsstelle (MCS) inseriert sind, wenn er in Säugerzellen transfiziert wird und enthält die folgenden Bestandteile: SV 40 (schräggestrichelter Kasten) enthält SV 40-Sequenzen von den Koordinaten 5171-270 einschließlich dem Replikationsurprung, Enhancer-Sequenzen und frühe und späte Promotoren. Das Fragment ist so orientiert, daß die Transkriptionsrichtung vom frühen Promotor als Pfeil dargestellt ist. CMV enthält die Promotor- und Enhancerregionen des menschlichen Cytomegalievirus (Nucleotide -671 bis +7 von der Sequenz, wie veröffentlicht von Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985). Der dreiteilige Leader (gepunkteter Kasten) enthält das erste Exon und einen Teil des Introns zwischen den ersten und zweiten Exons des Adenovirus-2-dreiteiligen-Leaders, das zweite Exon und einen Teil des dritten Exons des dreiteiligen Leaders und eine multiple Klonierungsstelle (MCS), die die Stellen für Xho I, Kpn I, Sma I, Not I und Bgl II enthält. pA (gestrichelter Kasten) enthält SV 40-Sequenzen von 4127-4100 und 2770-2533, die die Polyadenylierungs- und Stopsignale für die frühe Transkription enthalten. In Uhrzeigerrichtung von pA liegen Adenovirus-2-Sequenzen 10532-11156, die die VAI und VAII-Gene enthalten (bezeichnet durch einen schwarzen Streifen), gefolgt von den pBR322-Sequenzen (durchgezogene Linie) von 4363-2486 und 1094 bis 375, die das Ampicillin-Restistenz-Gen und den Replikationsursprung enthalten. Der resultierende Expressionsvektor wurde als pCAV/NOT bezeichnet.
Insertionen in den Klonen 16 und 18 wurden beide aus dem Bluescript Plasmid durch Verdauung mit Asp718 und NotI freigesetzt. Das 3,5 kb Insert des Klones 16 wurde dann direkt in den Expressionsvektor pCAV/NOT ligiert, der ebenfalls an der Asp 718 und NOtI-Stelle in der Polylinkerregion geschnitten war. Das Insert vom Klon 18 wurde mit der T4 Polymerase mit glatten Enden versehen gefolgt von einer Ligation in den Vektor pCAV/NOT, geschnitten mit SmaI und dephosphoryliert.
Plasmid DNA von beiden IL-4 Rezeptorexpressions-Plasmiden wurde verwendet, um eine subkonfluente Schicht von Affen COS- 7-Zellen zu transfizieren, unter Verwendung von DEAE-Dextran, gefolgt von Chloroquinbehandlung, beschrieben von Luthman et al. (Nucl. Acids. Res. 11:1295, 1983) und McCutchan et al. (J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1968). Die Zellen wurden dann in Kultur für drei Tage angezüchtet, um eine transiente Expression der inserierten Sequenzen zu ermöglichen. Nach drei Tagen wurden die Zellkulturüberstände und die Zellmonolayer getestet (wie beschrieben in Beispiel 1) und die Bindung von IL-4 wurde bestätigt.
B. Expression in CHO-Zellen. IL-4R wurde auch in der Säuger- CHO-Zellinie exprimiert, indem zunächst ein Asp 718/NOTI Restriktionsfragment des Klons 18 in den pCAV/NOT-Vektor, wie beschrieben in Beispiel 8, ligiert wurde. Der pCAV/NOT-Vektor, der das Insert von Klon 18 enthielt, wurde dann unter Verwendung eines Standard-Kalzium-Phosphatverfahrens in CHO- Zellen mit dem Dihydrofolatreduktase (DHFR) cDNA-selektierbaren Marker unter Steuerung des SV40 frühen Promotors cotransfiziert. Die DHFR-Sequenz ermöglicht eine Methotrexat- Selektion auf Säugerzellen, die das Plasmid enthalten. Die DHFR-Sequenz-Amplifizierungsereignisse in diesen Zellen werden unter Verwendung von erhöhten Methotrexat-Konzentrationen selektiert. Auf diese Weise werden die benachbarten DNA-Sequenzen ebenfalls amplifiziert, und so wird eine verstärkte Expression erhalten. Massenzellkulturen der Transfektanden sekretierten aktives lösliches IL-4R mit ungefähr 100ng/ml.
C: Expression in HeLa-Zellen. IL-4R wurde in der menschlichen Hela-EBNA-Zellinie 653-6 exprimiert, die konstitutiv EBV nukleares Antigen-1 exprimiert, angetrieben von dem CMV Sofort- Enhancer/Promotor. Der verwendete Expressionsvektor war pHAV- EO-NEO, beschrieben von Dower et al., J. Immunol, 142:4314, 1989), einem Derivat von pDC201, das den EBV-Replikationsursprung enthält und eine Expression auf hohem Niveau in der 653-6-Zellinie ermöglicht. pHAV-EO-NEO ist abgeleitet von pDC201 durch Ersetzung des Hauptadenovirus-späten Promotors durch synthetische Sequenzen von HIV-1, die sich von -148 bis +78 in Bezug auf die Cap-Struktur-Stelle der viralen mRNA erstrecken und das HIV-1 tat-Gen unter Kontrolle des SV 40 frühen Promotors umfassen. Es enthält außerdem ein BGlII-SmaI- Fragment, das das Neomycin-Gen von PSV2NEO (Southern & Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1:332, 1982) enthält, inseriert in BGlII und HpaI-Stellen und eine Subklonierung stromabwärts von der SalI-Klonierungsstelle. Der resultierende Vektor ermöglicht die Selektion von transfizierten Zellen durch Neomycinresistenz.
Ein 760 bp IL-4R-Fragment wurde aus dem Bluescript Plasmid durch Verdauung mit EcoN1 und SstI Restriktionsenzymen freigesetzt. Dieses Fragment des Klons 18 korrespondiert mit den Nucleotiden 1-672 der Fig. 2A, mit dem Zusatz einer 5'terminalen Nucleotidsequenz von GTGCAGGCACCTTTTGTGTCCCCA, einem TGA-Stopkodon, das dem Nucleotid 672 von Fig. 2A folgt, und einer 3'terminalen Nucleotid-Sequenz von CTGAGTGACCTTGGGGGCTGCGGTGGTGAGGAGAGCT. Dieses Fragment wurde dann mit glatten Enden versehen unter Verwendung von T4-Polymerase und in die SalI-Stelle von pHAV-EO-NEO subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde dann in die 653-6-Zellinie durch ein modifiziertes Polybren-Transfektionsverfahren, wie beschrieben von Dower et al., transfiziert (J. Immunol, 142:4314, 1989) mit der Ausnahme, daß die Zellen 2 Tage nach der Transfektion trypsinisiert wurden und in einem Verhältnis von 1:8 in den Medien aufgeteilt wurden, die G418 (Gibco Co.) bei einer Konzentration von 1 mg/ml enthielten. Die Kulturmedien wurden zweimal wöchentlich gewechselt, bis sich Neomycin-resistente Kolonien etabliert hatten. Die Kolonien wurden dann entweder individuell unter Verwendung von Klonierungsringen abgeimpft oder zusammengeführt, um mehrere verschiedene Zellinien zu erzeugen. Diese Zellinien wurden unter Arzneimittelselektion bei einer G418-Konzentration von 250 µg/ml gehalten. Wenn die Zellen den konfluenten Zustand erreichten, wurden die Überstände genommen und in dem Inhibitionsassay von Beispiel 1B getestet. Die Zellinien erzeugten 100 ng/ml bis 600 ng/ml lösliches IL-4R Protein.

Beispiel 9

Expression von IL-4R in Hefezellen

Für die Expression von mIL-4R wurde ein Hefeexpressionsvektor, abstammend von pIXY120 wie folgt konstruiert. pIXY120 ist identisch mit pYαHuGM (ATCC 53157), außer daß es kein cDNA Insert enthält und eine Polylinker/multiple Klonierungsstelle mit einer NcoI-Stelle umfaßt. Dieser Vektor enthält DNA-Sequenzen aus den folgenden Quellen: (1) ein großes SphI (Nucleotid 562) bis EcoRI (Nucleotid 4361) Fragment, das ausgeschnitten ist aus dem Plasmid pBR322 (ATCC 37017) einschließlich dem Replikationsursprung und dem Ampicillinresistenz-Marker für die Selektion in E.coli, (2) S. cerevisiae DNA einschließlich den TRP-1 Marker, 2µ Replikationsursprung, ADH2-Promotor; und (3) DNA, die für ein 85 Aminosäuresignalpeptid kodiert, abgeleitet von dem Gen, das für den sekretierten Peptid-α-Faktor kodiert (siehe Kurjan et al., U.S. Patent 4,546,082). Eine Asp 718-Restriktionsstelle wurde an Position 237 in das α-Faktor-Signal-Peptid eingefügt, um die Fusion an heterologe Gene zu erleichtern. Dies wurde erreicht, indem der Thymidinrest am Nucleotid 241 mit einem Cytosinrest durch Oligonucleotid-gerichtete in vitro Mutagenese, wie beschrieben von Craik, BioTechniques, Januar 1985, Seiten 12-19, getauscht wurde. Ein synthetisches Oligonucleotid, das multiple Klonierungsstellen enthielt, und die folgende Sequenz aufwies, wurde von der Asp 718-Stelle an Aminosäure 79 nahe dem 3'-Ende des α-Faktor-Signalpeptids zu einer SpeI-Stelle in der 2µ-Sequenz inseriert:
pBC 120 variiert von dem pYαHuGM außerdem durch die Gegenwart eines 514 bp DNA-Fragments, abgeleitet von dem einzelsträngigen Phagen f1, das den Replikationsursprung und eine intergene Region enthält, die an der NruI-Stelle in die pBR322-Sequenz inseriert wurde. Die Gegenwart eines f1-Replikationsursprungs ermöglicht die Erzeugung von einzelsträngigen DNA- Kopien des Vektors, wenn diese in geeignete Stämme von E. coli transformiert wurden und mit dem Bacteriophagen f1 superinfiziert wurden, was die DNA-Sequenzierung des Vektors vereinfacht und eine Basis für eine in vitro Mutagenese darstellt. Um eine cDNA zu inserieren, wird pIXY120 mit Asp 718 vertaut, das nahe dem 3'-Ende des α-Faktor Leaderpeptids (Nucleotid 237) spaltet und z. B. BamHI, das in den Polylinker spaltet. Das große Vektorfragment wird dann gereinigt und mit einem DNA-Fragment ligiert, das für das zu exprimierende Protein kodiert.
Um einen Sekretionsvektor für die Expression von mIL-4R zu erzeugen, wurde ein cDNA-Fragment, das mIL-4R kodiert, von dem Bluescript Plasmid von Beispiel 8 durch Verdauung mit PpumI und BglII ausgeschnitten, um ein 831 bp-Fragment von der PpumI-Stelle (siehe Fig.) an eine Bg1II-Stelle freizusetzen, die am 3'-Ende von dem offenen Leserahmen lokalisiert war, der die mIL-4R-Sequenz minus den ersten zwei 5'-Codons, die Ile und Lys kodieren, enthielt. pIXY120wurde mit Asp 718 nahe dem 3'-Ende des α-Faktorsleaders und BamHI verdaut. Das Vektorfragment wurde an das Ppum VBglII hIL-4R cDNA-Fragment ligiert und das folgende Fragment durch Verkleben von einem Paar von synthetischen Oligonudeotiden erzeugt, um die letzten 6 Aminosäuren des α-Faktorleaders und die ersten zwei Aminosäuren des reifen mIL-4R wiederzuerzeugen.

α-factor processing

Das Oligonucleotid enthielt außerdem einen Wechsel von der Nucleotidsequenz TGG ATA zu CTA GAT, was eine XbaI Restriktionsstelle einführt, ohne daß die kodierte Aminosäuresequnez geändert wird.
Der vorstehende Expressionsvektor wurde dann gereinigt und angewendet, um einen diploiden Hefestamm von S. cerevisiae (XV2181) durch Standardverfahren zu transformieren, wie z. B. diejenigen, wie offenbart in EPA 165,654, für die Selektion auf Tryptophan-Prototrophe. Die resultierenden Transformanden wurden auf die Expression eines sekretierten mIL-4R Proteins kultiviert. Die auf biologische Aktivität zu untersuchenden Kulturen wurden in 20-50 ml YPD Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 1% Glukose) bei 37ºC auf eine Zelldichte von 1-5 x 10&sup8; Zellen/ml angezüchtet. Um die Zellen von dem Medium zu trennen, wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt und das Medium durch einen 0,45 M-Zellulose-Acetatfilter vor dem Test gefiltert. Die durch den transformierten Hefestamm überzeugten Überstände oder Rohextrakte, die aus zerstörten Hefezellen präpariert wurden, transformierten das Plasmid und wurden daraufhin untersucht, um die Expression von biologisch aktivem Protein sicherzustellen.

Beispiel 10

Isolation von gesamten und verkürzten Formen von murinen IL-4 Rezeptor cDNAs aus nicht-ausgelesenen 7B9-Zellen

Polyadenylierte RNA wurde aus 7B9-Zellen isoliert, einem Antigen-abhängigen Helfer T-Zellen-Klon, abstammend von C57BL/6 Mäusen, und verwendet um eine cDNA-Bibliothek in λZAP herzustellen (Stratagene, San Diego), wie beschrieben in Beispiel 7. Die λZAP-Bibliothek wurde einmal vervielfacht und eine Gesamtzahl von 300.000 Plaques wurde, wie beschrieben in Beispiel 7, untersucht mit der Ausnahme, daß die Sonde ein zufällig sensibilisiertes ³²P-markiertes 700 bp EcoRI-Fragment war, isoliert vom CTLL-19.4-Klon 16. Dreizehn Klone wurden isoliert und durch Restriktionsanalyse charakterisiert.
Die Nucleinsäuresequenzanalyse des Klons 7B9-2 offenbarte, daß er einen polyadenylierten Schwanz enthielt, ein putatives Polyadenylierungssignal und einen offenen Leserahmen von 810 Aminosäuren (gezeigt in Fig. 2), dessen erste 258 identisch mit denjenigen sind, wie kodiert von CTLL-19.4-Klon 16, einschließlich der 25 Aminosäuren-langen, putativen Signalpeptidsequenz. Die 7B9-2 cDNA wurde in den eukaryontischen Expressionsvektor pCAV/NOT subkloniert und das resultierende Plasmid wurde in COS-7 Zellen, wie beschrieben in Beispiel 8, transfiziert. Die COS-7 Transfektanden wurden, wie dargestellt im Beispiel 12, analysiert.
Eine zweite cDNA-Form, ähnlich dem Klon 18, in der CTLL-19.4- Bibliothek, wurde von der 7B9-Bibliothek isoliert und einer Sequenzanalyse unterzogen. Diese cDNA, Klon 7B9-4, ist 376 bp kürzer als der Klon 7B9-2 am 5'-Ende, und ihm fehlen die ersten 47 Aminosäuren, die von 7B9-2 kodiert werden, aber er kodiert die restlichen N-terminalen Aminosäuren 23-199 (in Fig. 2). An Position 200 weist der Klon 7B9-4 (wie Klon 18 von CTLL 19.4) ein 114 bp Insert auf, das die Aminosäuresequenz zu Pro Ser Asn Glu Asn Leu umwandelt, gefolgt von einem Stop-Codon. Die 114 bp Inserte, die sowohl im Klon 7B9- 4 als auch CTLL-19.4 Klon 18 gefunden werden, stimmen in ihrer Nucleinsäuresequenz überein. Die Tatsache, daß diese cDNA-Form, die eine sekretierte Form vom Il-4 Rezeptor erzeugt, wenn sie in COS-7 Zellen exprimiert wird, aus zwei unterschiedlichen Zellinien isoliert wurde, legt nahe, daß sie weder ein Klonierungsartefakt ist, noch eine mutante Form, die eigentümlich für die ausgelesenen CTLL-Zellen ist.

Beispiel 11

Isolierung von menschlichen IL-4 Rezeptor cDNAs aus PBL und T22-Bibliotheken durch Kreuz-Art-Hybridisierung

Polyadenylierte RNA wurde aus zusammengeführten, menschlichen, peripheren Blutlymphozyten (PBL) isoliert, die durch eine Standard-Ficoll-Reinigung erhalten wurden, und sie wurden in IL-2 für sechs Tage kultiviert, gefolgt von einer Stimulierung von PMA und Con-A für acht Stunden. Eine oligo-dT- sensibilisierte cDNA-Bibliothek wurde in λgt10 unter Verwendung der Verfahren, wie beschrieben in Beispiel 7, konstruiert. Eine Sonde wurde erzeugt durch Synthese eines unmarkierten RNA-Transkripts des 7B9-4 cDNA Inserts unter Verwendung von T7 RNA Polymerase, gefolgt von ³²P-markierter cDNA- Synthese mit reverser Transkriptase unter Verwendung von zufälligen Primern (Beohringer-Mannheim). Diese murine, einzelsträngige cDNA-Sonde wurde verwendet, um 50.000 Plaques der menschlichen cDNA-Bibliothek in 50% Formamid/0,4 M NaCl bei 42ºC durchzusuchen, gefolgt von einer Waschung in 2 x SSC bei 55ºC. Drei positive Plaques wurden gereinigt und die EcoRI Inserte in den Bluescript Plasmidvektor subkioniert. Eine Nucleinsäuresequenzierung eines Bereiches des Klons PBL-1, einer 3,4 kb cDNA, zeigte an, daß der Klon ungefähr 67% homolog mit der korrespondierenden Sequenz des murinen IL-4 Rezeptors war. Jedoch wurde ein Insert von 68 bp, das ein Stop- Codon enthielt und keine Homologie zu den murinen IL-4 Rezeptor Klonen aufweist, 45 Aminosäuren stromabwärts von dem vorhergesagten N-Terminus des reifen Proteins gefunden, was bedeuten könnte, daß der Klon PBL-1 für eine nichtfunktionale, verkürzte Form des Rezeptors kodiert. Neun zusätzliche menschliche PBL-Klone wurden durch Überprüfung derselben Bibliotheke erhalten (unter stringenten Bedingungen) mit einer ³²P-markierten zufallssensibilisierten Sonde, die aus dem Klon PBLL (dem 3,4 kb EoR1 cDNA Insert) bestand. Zwei dieser Klone, PBL-11 und PBL-5, überspannten die 5' Region, die das 68 bp-Insert in PBL-1 enthält, aber ihnen fehlt das 68 bp- Insert und sie erstrecken sich nicht vollständig in 3'-Richtung, was aus ihrer Größe abzulesen ist, was eine funktionale Analyse durch Säugerexpression verhindert. Um ein Konstrukt zu erhalten, das in COS-7-Zellen exprimierbar ist, wurde das 5-Not I-HincII-Fragment der Klone PBL-11 von PBL-5 separat mit dem 3'HincII-BamHI-Ende von Klon PBL-1 ligiert und in den pCAV/NOT Expressionsvektor subkloniert, der mit NotI und BglII, wie beschrieben in Beispiel 8, geschnitten war. Diese chimären, menschlichen IL-4R cDNAS, die PBL-11/PBL-1 und PBL- 5/PBL-1 DNA-Sequenzen enthielten, wurden als Klone A5 bzw. B4 bezeichnet, wie weiter beschrieben in Beispiel 12. Diese Konstrukte wurden in COS-7-Zellen transfiziert und auf IL-4 Bindungen in einem Plattenbindungsassay untersucht, wie im wesentlichen beschrieben von Sims et al. (Science 241:585, 1988). Beide zusammengesetzten Konstrukte kodierten Protein, das IL-4-Bindungsaktivität zeigte. Die Nucleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des zusammengesetzten A5- Konstrukts entsprach der Sequenzinformation, wie dargestellt in den Fig. 4A-4C, mit der Ausnahme, daß ein GTC-Codon die Aminosäure Val an Position 50, anstatt Ile, kodiert. Keine anderen Klone, die sequenziert wurden, enthielten diesen Wechsel. Das Konsensus-Codon der Klone PBL-1, PBL-5 und T22-8 ist jedoch ATC und kodiert für Ile&sup5;&sup0;, wie dargestellt in Fig. 4A. Die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz des zusammengesetzten B4-Konstrukts zeigt auch, daß die 25 Aminosäuren-lange Leadersequenz von PBL-11 durch die Sequenz Met-Gln-Lys-Asp-Ala-Arg-Arg-Glu-Gly-Asn ersetzt ist.
Konstrukte, die eine lösliche Form des menschlichen IL-4 Rezeptors exprimieren, wurden herstellt durch Exzision eines 5'-terminalen 0,8 kb Sma I-Dra III Fragments von PBL-5 und dem korrespondierenden 0,8 kb Asp718-Dra III Fragment von PBL 11, wobei die Dra III Überhänge mit T4-Polymerase mit glatten Enden versehen wurden. Die PBL-5 und PBL-11 Fragmente wurden separat in CAV/NOT subkloniert, das Sma I bzw. Asp 718 plus Sma I geschnitten war; diese werden als lösliches hIL-4R-5 bzw. lösliches hIL-4R-11 bezeichnet. Bei beiden Konstrukten folgen dem finalen IL-4 Rezeptor-Aminosäure-Thr¹&sup9;&sup4; Codon die vektorkodierenden Aminosäuren GlyGlnArgProLeuGlnIleTyrAlaIle vor dem Ende.
Eine zweite Bibliothek wurde aus einem CD4+/CD8-menschlichen T-Zell Klon, T22, (Acres et al., J. Immunol. 138:2132, 1987) hergestellt und durchsucht (unter Verwendung von Duplikat- Filtern) mit zwei verschiedenen Sonden, die wie oben beschrieben synthetisiert wurden. Die erste Sonde wurde aus einem 220 bp Pvu II-Fragment vom 5'-Ende des Klons PBL-1 erhalten und die zweite Probe wurde aus einem 300 bp Pvu II- Ecor I Fragment vom 3'-Ende des Klons PBL-1 erhalten. Fünf zusätzliche cDNA Klone wurden unter Verwendung dieser zwei Sonden identifiziert. Zwei dieser Klone umspannen die 5'-Region, die das 68 pb-Insert enthält, aber keine enthält das Insert. Der dritte dieser Klone T22-8, wies ungefähr 3,6 kb in der Größe auf und war in einem offenen Leserahmen von 825 Aminosäuren enthalten, einschließlich einer 2,5 Aminosäuren- Leadersequenz, einer 207 Aminosäure-reifen externen Domäne, einer 24 Aminosäure-transmembranen Region und einer 569 Aminosäuren-Cytoplasmadomäne. Die Sequenz des Klons T22-8 ist in den Fig. 4A-4C dargestellt. Die Fig. 5A-5B vergleichen die vorhergesagte menschliche IL-4R Aminosäuresequenz mit der vorhergesagten murinen IL-4R Sequenz, und zeigen eine ungefähre 53%ige Sequenzidentität zwischen den beiden Proteinen.
Ein drittes lösliches menschliches IL-4R Rezeptorkonstrukt wurde wie folgt hergestellt. Der cDNA-Klon T22-8 wurde an der Draill-Stelle in dem Thr¹&sup9;&sup4; Codon gespalten und mit synthetischen Oligonudeotiden repariert, um Thr¹&sup9;&sup4; und Lys¹&sup9;&sup5; Codons zu regenerieren, gefolgt von einem Stop-Codon und einer NotI- Restriktionsstelle. Ein 0,68 kb StyI-NotI-Restriktionsfragment dieses Klons wurde dann an der Styl-Stelle mit glatten Enden versehen und in SmaI-NotI subkloniert, verdaut mit pCA/V/NOT Vektor. Dieser cDNA Expressionsvektor wurde als hIL-4R-8 bezeichnet.

Beispiel 12

Analyse und Reinigung von IL-4 Rezeptor in COS-Transfektanden

Gleichgewichtsbindungsstudien wurden für COS-Zellen durchgeführt, die mit murinen IL-4 Rezeptorklonen 16 und 18 aus der CTLL-19.4-Bibliothek transfiziert waren. In allen Fällen ergab die Analyse der Daten in dem Scatchard Koordinatensystem (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949) eine gerade Linie, was andeutet, daß eine einzige Klasse von Hochaffinitätsrezeptoren für murines IL-4 vorlag. Für COS pCAV-16 Zellen betrug der berechnete anscheinende Ka 3,6 x10&sup9; M&supmin;¹ mit 5,9 x 10&sup5; spezifischen Bindungsstellen pro Zelle. Ein ähnlicher anscheinender Ka wurde für COS pCAV-18-Zellen bei 1,5 x10&sup9; M&supmin;¹ kalkuliert, aber die Rezeptorzahl, die an der Zelloberfläche exprimiert wurde, betrug 4,2 x 10&sup4;. Gleichgewichtsbindungsstudien, die an COS-Zellen durchgeführt wurden, die mit IL-4R DNA-Klonen transfiziert waren, isoliert aus der 7B9-Zellbibliothek, zeigten außerdem eine Hochaffinitätsbindung des Rezeptors an IL-4. Insbesondere zeigten Studien, die COS-Zellen verwendeten, die mit pCAV-7B9-2 transfiziert waren, das der gesamte murine IL-4 Rezeptor ¹²&sup5;I-IL-4 mit einem anscheinenden Ka von ungefähr 1,4 x 10¹&sup0; M&supmin;¹ mit 4,5 x 10&sup4; spezifischen Bindungsstellen pro Zelle band. Der anscheinende Ka von CAV-7B9-4-IL-4R wurde auf ungefähr 1,7 x 10&sup9; M&supmin;¹ kalkuliert. Obwohl absolute Werte für Ka und Bindungsstellen pro Zelle zwischen den Transfektionen variierten, waren die Bindungsaffinitäten im allgemeinen ähnlich ((1 x 19&sup9; - 1 x 10¹&sup0; M)&supmin;¹ und paßten gut zu den vorher veröffentlichten Affinitätskonstanten für die IL-4 Bindung.
Die Inhibition von ¹²&sup5;I-mIL-4, das an CTLL-Zellen bindet durch konditionierte Medien von COS-Zellen, die mit dem Plasmid pCAV, pCAV-18 oder pCAV-7B9-4 transfiziert waren, wurden verwendet, um zu bestimmen, ob diese cDNAs für funktionale, lösliche Rezeptormoleküle kodierten. Ungefähr 1,5 µl von mit COS pCAV-18 konditionierten Medien in einem abschließenden Assayvolumen von 150 µl ergab eine ungefähr 50%ige Inhibition von ¹²&sup5;I-IL-4 Bindung an den IL-4 Rezeptor auf CTLL-Zellen. ¹²&sup5;-I-IL-4 Rezeptor kompetitierende Aktivität wird nicht in Kontroll pCAV detektiert, die mit COS-Überständen transfiziert sind. Von der quantitativen Analyse der Verdünnung von pCAV-18 Überständen, die benötigt wurden, um die ¹²&sup5;I-IL-4 Bindung um 50% zu inhibieren, wird geschätzt, daß ungefähr 60-100 ng/ml des löslichen IL-4 Rezeptors durch die in COS- Zellen sekretiert waren, wenn sie drei Tage nach Transfektion geerntet wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von Überständen von COS-Zellen erzielt, die mit pCAV-7B9-4 transfiziert waren.
Konditioniertes Medium von COS-Zellen, die mit pCAV-18 oder pCAV-7B9-4 (siehe Beispiel 8) transfiziert waren und in DMEM gezüchtet wurden, das 3% FBS enthielt, wurden drei Tage nach Transfektion geerntet. Die Überstände wurden bei 3.000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert und bis zu ihrer Verwendung eingefroren. Zweihundert ml der konditionierten Medien wurden auf eine Säule geladen, die 4 ml muIL-4 Affigel enthielt, hergestellt, wie oben beschrieben. Die Säule wurde extensiv mit PBS gewaschen und der IL-4 Rezeptor eluierte mit 0,1 M Glycin, 0,15 M NaCl bei pH 3.0. Unmittelbar auf die Elution folgend, wurden die Proben mit 80 µl 1 M Hepes, pH 7,4, neutralisiert. Die Proben wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Bindung von ¹²&sup5;I-muIL-4 an CTLL-Zellen, wie dargestellt in Beispiel 1B, zu inhibieren. Zusätzlich wurden Proben auf ihre Reinheit durch Analyse auf SDS-PAGE und Silberfärbung, wie vorher beschrieben, getestet. Alternative Verfahren für die Untersuchung der funktionalen löslichen Rezeptoraktivität oder der IL-4 Bindungsinhibition umfassen Festphasenbindeassays, wie beschrieben in Beispiel 1C oder andere ähnliche zellfreie Assays, die entweder radioaktiv jodiertes oder colorimetrisch entwickelte IL-4 Bindungen verwenden, wie z. B. RIA oder ELISA. Das durch SDS-PAGE analysierte Protein unter reduzierenden Bedingungen hat ein Molekulargewicht von ungefähr 37.500 und erscheint ungefähr 90% rein durch Färbeanalyse von Gelen.
Gereinigtes, rekombinantes, lösliches murines IL-4 Rezeptorprotein kann auch auf seine Fähigkeit getestet werden, IL-4 induzierte ³H-Thymidin-Incorporation in CTLL-Zellen zu inhibieren. Folgend auf solche Verfahren wurde für den löslichen IL-4 Rezeptor gefunden, das er die IL-4 stimulierte Proliferation blockiert, aber nicht die IL-2 getriebene mitogene Reaktion beeinflußt.
Schätzungen über das Molekulargewicht wurden an mIL-4 Rezeptorklonen durchgeführt, die in COS-Zellen transfiziert waren. Unter Verwendung von M2 monoklonalem Antikörper, der gegen murine CTLL-19.4-Zellen (siehe Beispiel 13) präpariert wurde, wurde IL-4 Rezeptor von COS-Zellen immunopräcipitiert, die mit CAV-16, CAV-7B9-2 und CAV-7B9-4 transfiziert waren und mit ³&sup5;S-Cystein und ³&sup5;S-Methionin markiert waren. Zellassoziierter Rezeptor von CAV-7B9-4 zeigte ein heterogenes Molekulargewicht im Bereich von 32-39 kDa. Sekretierter CAV-7B9-4 Rezeptor weist ein Molekulargewicht zwischen 36 und 41 kDa auf. Zellassoziierter Rezeptor von CAV-16 transfizierten COS- Zellen liegt bei ungefähr 40 bis 41 kDa. Dies ist signifikant geringer als bei den Molekulargewichtschätzungen von Kreuzverbindungsstudien, beschrieben von Park et al., J. Exp. Med. 166:476, 1987; JC Cell. Biol. Suppl. 12A, 1988. Die Immunopräcipitation von COS CAV-7B9-2 zell-assoziertem Rezeptor zeigte ein Molekulargewicht von 130-140 kDa, ähnlich den Schätzungen von Park et al., J. Cell. Biol. Suppl., 12A, 1988, wobei geschätzt wird, daß dies der gesamte IL-4 Rezeptor ist. Ähnliche Schätzungen des Molekulargewichts von zellassoziierten CAV-16 und CAV-7B9-2 IL-4 Rezeptor basieren ebenfalls auf einer Krezverbindung von ¹²&sup5;IL-4 an COS-Zellen, die mit diesen cDNAs transfiziert sind. Die Heterogenität des Molekulargewichts der individuellen Klone kann teilweise der Glykosylierung zugeschrieben werden. Diese Daten, zusammen mit der DNA-Sequenzanalyse, legen nahe, daß die 7B9-2 cDNA für den gesamten Zelloberflächen IL-4 Rezeptor kodiert, während sowohl 7B9-4 als auch der Klon 18 die löslichen Formen des murinen IL-4 Rezeptors repräsentieren.
Rezeptor-Charakterisierungsstudien wurden ebenfalls an COS- Zellen durchgeführt, die mit hIL-4R tarnfiziert waren, die Expressionsplasmide enthielten. Die beiden chimären, humanen IL-4R Moleküle A5 und B4 (definiert in Beispiel 11) wurden in COS-Zellen transfiziert und Gleichgewichtsbindungsstudien wurden unternommen. Die COS-Affenzelle selbst weist Rezeptoren auf, die fähig sind, hIL-4 zu binden; daher präsentieren die Bindungskalkulationen, die an COS-Zellen durchgeführt wurden, die mit hIL-4R cDNAs transfiziert waren und diese überexprimieren, Hintergrundbindungen von endogenen Affen-IL- 4R-Molekülen, die von der Totalbindung abzuziehen sind. COS- Zellen, die mit hIL-4R A5 transfiziert waren, hatten 5,3 x 10&sup4; hIL-4 Bindungsstellen, mit einem kalkulierten Ka von 3,48 x 10&sup9; M&supmin;¹. Ähnlich exprimierte hIL-4R B4 in COS-Zellen gebundenes ¹²&sup5;I-hIL-4 mit einer Affinität von 3,94 x 10&sup9; M&supmin;¹ und zeigte 3,2 x Rezeptoren pro Zelle.
Schätzungen des Molekulargewichts von menschlichem IL-4R, das in COS-Zellen exprimiert wurde, wurden ebenfalls durchgeführt. Die COS-Zellen, die mit den Klonen A5 oder B4 in pCAV/NOT transfiziert waren, wurden mit ³&sup5;S-Cystein/Methionin markiert und lysiert. Humanes IL-4R wurde aus den erhaltenen Lysaten mit hIL-4 gekoppeltem Affigel (wie beschrieben in Beispiel 4) Affinitäts-gereinigt. Das aus diesem Affinitätsträger eluierte hIL-4R A5 und B4 wanderte bei ungefähr 140.000 Daltons auf SDS-PAGE, was mit den vorherigen Schätzungen des hIL-4R Molekulargewichts durch Kreuzverbindung übereinstimmte (Park et al., J. Exp. Med. 166:476, 1987), wie auch mit den Schätzungen der Gesamtlänge von mIL-4R, wie hier präsentiert.
Da bis jetzt keine menschliche IL-4R cDNA natürlich auftretend gefunden wurde, wie es auch der Fall war für den murinen Rezeptor (Klone 18 und 7B9-4), wurde eine verkürzte Form, wie beschrieben in Beispiel 11, konstruiert. Der Expression in COS-Zellen folgend, wurden Überstände drei Tage nach Transfektion mit löslichem hIL-4R-11 und löslichem hIL-4R-5 geerntet und auf Inhibition von ¹²&sup5;I-hIL-4 Bindung an die menschliche T-Zellinie Raji getestet. Überstände von zwei der löslichen hIL-4R-11 und einer der löslichen hIL-4R-5 transfizierten Platten enthielten 29 bis 149 ng/ml IL-4R kompetitierende Aktivität in dem Medium. Zusätzlich konnte das verkürzte Protein in ³&sup5;S-Methionin/Cystein-markierten COS-Zell- Transfektanden durch Affinitätsreinigung auf hIL-4 gekoppeltem Affigel als ungefähr ein 44kDa-Protein durch SDS-PAGE detektiert werden. Überstände von COS-Zellen, die mit hIL-4R- 8 (kodierend für lösliches, verkürztes IL-4R) transfiziert waren, inhibierten, wenn sie 25-fach ankonzentriert wurden, menschliche IL-4 Bindung an Raji-Zellen, und enthielt ungefähr 16 ng/ml einer kompetitierenden Aktivität.

Beispiel 13

Präparation von monoklonalen Antikördern gegen IL-4R

Präparationen von gereinigtem, rekombinantem IL-4 Rezeptor, z. B. menschlichem oder murinem IL-4 Rezeptor, transfiziert in COS-Zellen, die hohe Mengen von IL-4 Rezeptor exprimierten oder CTLL-19.4-Zellen, werden verwendet, um monoklonale Antikörper gegen IL-4 Rezeptor unter Verwendung von konventionellen Verfahren zu erzeugen, wie z. B. denjenigen, wie offenbart in US-Patent 4,411,993. Solche Antikörper sind vermutlich nützlich bei einer Wechselwirkung mit der IL-4 Bindung an IL-4 Rezeptoren, zum Beispiel, um toxische oder andere ungewünschte Effekte von IL-4 zu entschärfen.
Um Ratten zu immunisieren, wurden IL-4 Rezeptor-tragende CTLL-19.4-Zellen als Immonogen verwendet, emulgiert in vollständigem Freund's Adjuvans und injiziert in Mengen zwischen 10-100 µl subcutan in Lewis-Ratten. Drei Wochen später wurden die immunisierten Tiere zusätzlichem Immunogen ausgesetzt, emulgiert in komplettem Freund's Adjuvans und danach wurden sie alle drei Wochen diesem ausgesetzt. Eine Serumprobe wird periodisch durch retro-orbitales Bluten oder Abschneiden der Schwanzspitze genommen, um durch Dot-blot-Assay testen zu können, durch ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) oder Inhibition der Bindung von ¹²&sup5;I-IL-4 an Extrakte von CTLL- Zellen (wie beschrieben in Beispiel 1). Andere Assay-Verfahren sind ebenfalls geeignet. Folgend auf die Detektion eines geeigneten Antikörpertiters wird positiven Tieren eine endgültige, intravenöse Injektion von antigenen Salzlösungen gegeben. Drei oder vier Tage später werden die Tiere geopfert, die Splenocyten geerntet und mit der Maus-Myelomzellinie AG8653 fusioniert. Hybridomzellinien, die durch dieses Verfahren erzeugt werden, werden in multiplen Mikrotiterplatten in einem HAT selektivem Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) plattiert, um die Proliferation von nichtfusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu inhibieren.
So erzeugte Hybridonklone werden auf ihre Reaktivität mit IL- 4 Rezeptor überprüft. Ein anfängliches Screening von Hybridom-Überständen verwendete einen Antikörperfang und eine Bindung von teilweise gereinigtem ¹²&sup5;-I-mIL-4 Rezeptor. Zwei von über 400 untersuchten Hybridomen waren in diesem Verfahren positiv. Diese beiden monoklonalen Antikörper, M1 und M2, wurden durch einen modifizierten Antikörperfang überprüft, um blockierenden Antikörper zu detektieren. Nur M1 war fähig, die ¹²&sup5;-I-rmIL-4 Bindung an intakte CTLL-Zellen zu inhibieren. Beide Antikörper waren fähig, natives mIL-4R Protein aus CTTL-Zellen oder COS-7-Zellen, transfiziert mit IL-4R Klonen, markiert mit ³&sup5;5-Cystein/Methionin immun zu präcipitieren. M1 und M2 wurden dann in die Peritonealhöhlungen von nackten Mäusen injiziert, um Ascites zu erzeugen, die hohe Konzentrationen (> 1 mg/ml) von Anti-IL-4R monoklonalem Antikörper enthielten. Der erhaltene monoklonare Antikörper wurde durch Ammoniumsulfatpräcipitation gereinigt, gefolgt von einer Gel- Ausschlußchromatographie und/oder Affinitätschromatographie, basierend auf der Bindung des Antikörpers an Protein G.

Beispiel 14

Verwendung von löslichem IL-4R, um die Immunantwort in vivo zu unterdrücken

Es wurden Experimente durchgeführt, um die Wirkung von löslichem IL-4R auf die allogene Wirte host-versus-graft (HVG) Antwort in vivo zu bestimmen unter Verwendung von einem Popliteallymphknotenassay. Bei diesem Modell werden Mäusen in den Fußballen bestrahlte, allogene Milzzellen injiziert. Bestrahlte, syngene Zellen werden dann in die kontralateralen Ballen injiziert. Eine alloreaktive Antwort tritt in dem Ballen auf, der allogene Zellen enthält, in einem Ausmaß, das durch die relative Zunahme in Größe und Gewicht des poplitealen Lymphknotens gemessen werden kann, der die Stelle der antigenen Niederlegung aufbraucht.
Am Tag 0 wurden in den Fußballen von drei BALB/C-Mäusen bestrahlte, allogene Milzzellen von c57BL/6-Mäusen injiziert, und in den gegenüberliegenden Fußballen wurden bestrahlte, syngene Milzzellen injiziert. An den Tagen -1,0 und +1 wurden drei Mäusen (intravenös an den Tagen -1 und 0 und subkutan am Tag +1) 100 ng von gereinigtem, löslichen IL-4R (sIL-4R) in Phosphat-gepufferter Salzlösung injiziert, drei Mäusen intravenös 1 µg sIL-4R injiziert, drei Mäusen wurden 2µg sIL-4R injiziert und drei Mäusen wurde MSA (Kontrolle) injiziert.
Der durchschnittliche Unterschied im Gewicht der Lymphknoten von den Stellen der allogenen und syngenen Milzzellen betrug ungefähr 2,5 mg für die mit MSA behandelten Mäuse, 1 mg für die mit 100 mg sIL-4R behandelten Mäuse und 0,5 mg für 1 µg sIL-4R behandelten Mäuse. Kein nachweisbarer Unterschied im Gewicht der Lymphknoten war für die Mäuse nachweisbar, die mit 2 µg sIL-4R behandelt wurden. So unterdrückte IL-4R deutlich (p < 0,5 in allen Gruppen, unter Verwendung eines zweiseitigen T-Tests), die in vivo lymphproliferative Anwort in einer Dosis-abhängigen Weise im Vergleich mit Kontrollmäusen.

Claims

1. Isolierte DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das fähig ist, Säuger IL-4 zu binden, wobei die DNA-Sequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(a) cDNA-Klonen, die eine Nucleotid-Sequenz enthalten, ausgewählt aus der Sequenz, dargestellt als

Nucleotide -75 bis 2355 der Fig. 2A-2C,

Nucleotide 1 bis 2355 der Fig. 2A-2C,

Nucleotide -75 bis 2400 der Fig. 4A-4C und

Nucleotide 1 bis 2400 der Fig. 4A-4C;

(b) DNA-Sequenzen, die fähig sind, mit einer cDNA von (a) unter moderat stringenten Bedingungen zu hybridisieren und die für ein Polypeptid kodieren, das fähig ist, Säuger IL-4 zu binden; und

(c) DNA-Sequenzen, die als Ergebnis des genetischen Codes zu einer DNA-Sequenz degeneriert sind, wie definiert in (a) oder (b), und die für ein Polypeptid kodieren, das fähig ist, Säuger IL-4 zu binden.

2. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz eine Nucleotid-Sequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Nucleotiden -75 bis 2355 der Fig. 2A-2C, den Nucleotiden 1 bis 2355 der Fig. 2A- 2C, den Nucleotiden -75 bis 2400 der Fig. 4A-4C und den Nucleotiden 1 bis 2400 der Fig. 4A-4C.

3. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz eine Nucleotid-Sequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Nucleotiden -75 bis 621 der Fig. 4A, und den Nucleotiden 1 bis 621 der Fig. 4A.

4. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, die für eine Aminosäure- Sequenz kodiert, die eine mehr als 80%ige Ähnlichkeit zu einer Aminosäure-Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus den Resten -25 bis 800, 1 bis 800, -25 bis 207 oder 1 bis 207, wie dargestellt in den Fig. 4A-4C.

5. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 4, die für einen löslichen Rezeptor kodiert, der fähig ist, menschliches IL-4 zu binden und eine Aminosäure-Sequenz enthält, die im wesentlichen aus den Aminosäureresten -25 bis 207 oder 1 bis 207 besteht, wie dargestellt in Fig. 4A.

6. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, die für eine Aminosäure- Sequenz kodiert, die im wesentlichen aus den Aminosäureresten -25 bis 800 oder 1 bis 800 besteht, wie dargestellt in den Fig. 4A-4C.

7. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, die für ein IL-4 Rezeptorpolypeptid kodiert, das eine Aminosäure-Sequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Sequenz der Aminosäurereste 1 bis 800, wie dargestellt in den Fig. 4A-4C, 1 bis 207, wie dargestellt in Fig. 4A, 1 bis 785, wie dargestellt in den Fig. 2A-2C, 1 bis 208, wie dargestellt in Fig. 2A oder Analogen davon mit einer biologischen Aktivität eines Säuger IL-4 Rezeptors.

8. Isolierte DNA-Sequenz, die:

a) ein Fragment der Nucleotid-Sequenz, dargestellt als Nucleotide 1 bis 2355 der Fig. 2A-2C, ist; und

b) ein Fragment der Nucleotid-Sequenz, dargestellt als Nucleotide 1 bis 2400 der Fig. 4A-4C ist;

wobei das Fragment für eine Polypeptid kodiert, das eine biologische Aktivität eines Säuger IL-4 Rezeptors aufweist.

9. Isolierte DNA-Sequenz, die

ein DNA-Fragment ist, das mindestens ungefähr 60 aufeinanderfolgende Nucleotide der Sequenz enthält, dargestellt als Nucleotide 1 bis 2355 der Fig. 2A-2C; oder

b) ein DNA-Fragment ist, das mindestens ungefähr 60 aufeinanderfolgende Nucleotide der Sequenz enthält, dargestellt als Nucleotide 1 bis 2400 der Fig. 4A-4C.

10. Rekombinanter Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 enthält.

11. Verfahren für die Herstellung eines Polypeptids, das fähig ist, Säuger IL-4 zu binden, das den Schritt der Kultivierung einer geeigneten Wirtszelle enthält, die einen Vektor gemäß Anspruch 10 enthält unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids unterstützen.

12. Verfahren für die Herstellung eines Polypeptids, das fähig ist, menschliches IL-4 zu binden, das den Schritt der Kultivierung einer geeigneten Wirtszelle enthält, die einen Vektor gemäß Anspruch 10 enthält unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids unterstützen.

13. Gereinigtes Polypeptid, das fähig ist zur Bindung von Säuger IL-4, wobei das Polypeptid durch eine DNA gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 kodiert wird.

14. Polypeptid gemäß Anspruch 13, das im wesentlichen aus murinem IL-4 Rezeptor oder menschlichem IL-4 Rezeptor besteht.

15. Polypeptid gemäß Anspruch 13, das eine Aminosäure-Sequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Sequenz der Aminosäurereste 1 bis 800, wie dargestellt in Fig. 4A- 4C, 1 bis 207, wie dargestellt in Fig. 4A, 1 bis 785, wie dargestellt in den Fig. 2A-2C, 1 bis 208, wie dargestellt in Fig. 2A oder das ein Fragment oder ein Analog davon ist mit einer biologischen Aktivität des Säuger IL-4 Rezeptors.

16. Polypeptid gemäß Anspruch 14, das ein menschlicher IL-4 Rezeptor in Form eines Glycoproteins mit einem Molekulargewicht von zwischen ungefähr 110.000 und 150.000 Mr durch SDS-PAGE ist und einer Bindungsaff inität (Ka) für menschliches IL-4 von 1-8x10&sup9;M&supmin;¹.

17. Polypeptid gemäß Anspruch 14, das eine N-terminale Aminosäure-Sequenz Met-Lys-Val-Leu-Gln-Glu-Pro-Thr-Cys- Val-Ser-Asp-Tyr-Met-Ser-Ile-Ser-Thr-Cys-Glu-Trp aufweist.

18. Polypeptid gemäß Anspruch 13, wobei die transmembrane Region und die Cytoplasmadomäne des nativen Rezeptors deletiert wurden.

19. Polypeptid gemäß Anspruch 15, wobei das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz enthält, die eine mehr als 80%ige Ähnlichkeit mit einer Sequenz aufweist, die aus den Resten 1 bis 800, wie dargestellt in den Fig. 4A-4C und den Resten 1 bis 207, wie dargestellt in Fig. 4A ausgewählt ist.

20. Polypeptid gemäß Anspruch 19, das eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die im wesentlichen aus den Resten 1 bis 207, wie dargestellt in Fig. 4A, besteht.

21. Polypeptid gemäß Anspruch 19, das fähig ist zur Bindung von menschlichem IL-4, wobei das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz umfaßt, die im wesentlichen aus den Resten 1 bis 800, wie dargestellt in den Fig. 4A-4C, besteht.

22. Gereinigtes Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) einem Fragment des Polypeptids mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 785 der Fig. 2A-2C; und

b) einem Fragment des Polypeptids mit der Aminosäure-Sequenz 1 bis 800 der Fig. 4A-4C;

wobei das Fragment eine biologische Aktivität des IL-4 Rezeptors aufweist.

23. Gereinigtes Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) einem Polypeptid, das mindestens ungefähr 20 aufeinanderfolgende Reste der Sequenz aufweist, dargestellt als Aminosäuren 1 bis 785 der Fig. 2A- 2C; und

b) einem Polypeptid, das mindestens ungefähr 20 aufeinanderfolgende Reste der Sequenz enthält, dargestellt als Aminosäuren 1 bis 800 der Fig. 4A- 4C.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung für die Regulierung der Immunantworten in einem Säugetier, die eine wirksame Menge eines Polypeptids gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 13 bis 23 enthält und ein geeignetes Verdünnungsmittel oder einen Träger enthält.

25. Zusammensetzung gemäß Anspruch 24, mit einer spezifischen Bindungsaktivität von mindestens ungefähr 0,01 Nanomol IL-4/Nanomol des Polypeptids.

26. Zusammensetzung gemäß Anspruch 24, wobei das Polypeptid menschliches IL-4 bindet und in Form eines Glycoproteins mit einer Bindungsaffinität (Ka) für menschliches IL-4 von ungefähr 1-8 x 10&sup9; M&supmin;¹ vorliegt und die N-terminale Aminosäure-Sequenz Met-Lys-Val-Leu-Gln-Glu-Pro- Thr-Cys-Val-Ser-Asp-Tyr-Met-Ser-Ile-Ser-Thr-Cys-Glu-Trp aufweist.

27. Zusammensetzung gemäß Anspruch 24, wobei das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz enthält, die im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 207, wie dargestellt in Fig. 4A, besteht.

28. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 13 bis 23 in einem Bindungsassay für die Detektion von IL-4 oder IL-4-Rezeptormolekülen oder deren Interaktionen.

29. Polypeptid gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 13 bis 23 zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin.

30. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 13 bis 23 für die Herstellung eines Medikaments für die Regulierung der Immunantworten in einem Säuger.

31. Verwendung gemäß Anspruch 30, wobei das Polypeptid und der zu behandelnde Säuger menschlich sind.

32. Antikörper, die immunreaktiv mit einem Polypeptid gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 13 bis 23 sind.

33. Antikörper gemäß Anspruch 32, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

34. Antikörper gemäß Anspruch 33, worin der monoklonale Antikörper immunreaktiv mit einem menschlichen IL-4 Rezeptorpolypeptid ist.

35. Verwendung eines Antikörpers gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 32 bis 34 für die Herstellung eines Medikaments zum Ausgleich von toxischen oder anderen ungewünschten Wirkungen von IL-4.

36. Wirtszelle, die mit einem Vektor gemäß Anspruch 10 transfiziert ist.

37. RNA, die im wesentlichen komplementär zu der DNA gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 ist.

38. Fusionsprotein, das eine Polypeptid-Sequenz enthält, gekoppelt an ein Polypeptid gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 13 bis 23.

39. Fusionsprotein gemäß Anspruch 38, zur Verwendung in Human- oder Veterinärmedizin.

40. Verwendung eines Fusionsproteins gemäß Anspruch 38 für die Herstellung eines Medikaments für die Regulierung einer Immunantwort in einem Säuger.

41. Verwendung eines Fusionsproteins gemäß Anspruch 40, wobei das Fusionsprotein eine Polypeptid-Sequenz enthält, die fähig ist, humanes IL-4 zu binden, wobei der Säuger menschlich ist.