HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(1) Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein
multizelluläres Gelluloseteilchen mit einer neuartigen Struktur
und auf ein Verfahren zu dessen Herstellung. Die vorliegende
Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein multi-zelluläres
Celluloseteilchen mit einer Struktur, die zur Verwendung als
Träger für einen Katalysator, ein Enzym oder ein
Arzneimittel, als Ausgangsmaterial für einen
Ionenaustauscher-Bestandteil oder ein adsorbierendes Material oder als
Mikroträger zur Zellkultivierung geeignet ist, und auf ein
Verfahren zur Herstellung dieses multi-zellulären
Celluloseteilchens.
(2) Beschreibung des Standes der Technik
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Feine Celluloseteilchen werden als
Packungsmaterialien für die Gelpermeationschromatographie (GPC) weithin
verwendet. Da in die Teilchen leicht verschiedene
funktionelle Gruppen eingeführt werden können, besitzen sie
darüberhinaus einen weiten Anwendungsbereich als
Ionenaustauscher-Bestandteile und Affinitätschromatographie-Grundstoffe.
Neuere Entwicklungen in der Biochemie und Gentechnologie
verursachten, daß sich der Bedarf an diesen Teilchen auf dem
Gebiet der Trennung und Reinigung von Spurenproteinen des
lebenden Organismus stark vergrößerte. Poröse Teilchen
gehören zu derzeitigen kommerziell erhältlichen
Celluloseteilchen, und in den meisten dieser porösen Teilchen wird zur
Einstellung des Ausschluß-Molekulargewichts in der GPC oder
zur Einstellung der Teilchendichte eine Porenstruktur mit
einer sehr feinen Porengröße hergestellt, wobei der
Porendurchmesser höchstens etwa 1 µm ist.
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Beispielsweise wird gemäß dem in U.S.-A-3 597 350
offenbarten Verfahren Cellulose in einer Konzentration von
1 bis 12% in einer wäßrigen Kupferammoniumlösung oder
dergleichen aufgelöst, die Celiuloselösung wird in Benzol,
das einen Emulgator enthält, dispergiert, und die Dispersion
wird in ein Regenerierbad geschüttet, wobei
Cellulosemikrokugeln erhalten werden. Es wird angegeben, daß die gemäß
diesem Verfahren erhaltenen Celluloseteilchen eine
Cellulosedichte von 2 bis 25% (Gewicht/Volumen) und einen
Porendurchmesser von 2 bis 2000 nm besitzen. Um den
Porendurchmesser zu vergrößern, muß die Cellulosedichte verringert
werden, was zu einer Abnahme der mechanischen Festigkeit der
Teilchen führt. Deshalb können poröse Teilchen mit einem
Porendurchmesser von wenigstens 2 µm, die für den
gewöhnlichen Gebrauch fest genug sind, praktisch nicht
erhalten werden.
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Gemäß dem in U.S.-A-4 055 510 offenbarten Verfahren
wird eine Suspension aus Viskose in einem mit Wasser nicht
mischbaren Dispersionsmedium zur Bewirkung einer Erstarrung
bei einer Temperatur von 30 bis 100 ºC unter ständigem Rühren
erhitzt, und die gebildeten Teilchen werden durch eine Säure
zersetzt, wobei kugelförmige Celluloseteilchen erhalten
werden. Die gemäß diesem Verfahren erhaltenen Teilchen sind
jedoch hart und gelatinös, und der Porendurchmesser liegt
immer noch im Submikrometerbereich.
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Ebenso führt das Verfahren gemäß EP-A-0 047 064 zu
porösen, kugelförmigen Celluloseteilchen mit einem relativ
kleinen eingezeichneten Durchmesser, die als
Gelfiltrationsmaterial zum Entsalzen von Proteinlösungen verwendet werden
sollen. In diesem Verfahren werden die Teilchen hergestellt,
indem eine Lösung eines organischen Celluloseesters in einem
Chlorkohlenwasserstofflösungsmittel in einem wäßrigen Medium
unter Tropfenbildung suspendiert wird, das Lösungsmittel
unter Bildung von kugelförmigen Teilchen des organischen
Celluloseesters abgedampft wird und die Teilchen verseift
werden. In dem Verfahren wird vor der Suspension der Lösung
in dem wäßrigen Medium eine Säure oder Alkalie mit der Lösung
des organischen Celluloseesters gemischt, um die Porosität
der erhaltenen Teilchen mit hoher Reproduzierbarkeit zu
regeln.
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Ein Celluloseschwamm ist bekannt als eine
Cellulosestruktur mit einem großen Porendurchmesser, worin der
Porendurchmesser größer als einige hundert um ist und Löcher von
der Größe einiger mm geöffnet sind.
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Ein teilchenförmiger Celluloseschwamm mit einem
kleinen Porendurchmesser ist nicht bekannt. Zur Herstellung
eines Celluloseschwamms wird gewöhnlich ein Verfahren
übernommen, bei dem im voraus eine große Menge eines
kristallinen, fein verteilten Natriumsulfatdecahydrats in Viskose
eingeführt wird, die Viskose in eine Form gegossen und durch
Erhitzen verfestigt wird und die Kristalle des Glaubersalzes
anschließend unter Bildung einer porösen Struktur durch
Wasser entfernt werden (siehe zum Beispiel die japanische
Patentveröffentlichung Nr. 18-1580). Eine poröse Struktur
wird gewöhnlich gemäß einem Verfahren gebildet, in dem ein
porenbildendes Material, das nachher entfernt werden kann,
wie Glaubersalz, vorher in ein Lösungsmittel eingeführt wird.
Falls es beabsichtigt wird, durch Kombination dieses
Verfahrens mit dem oben erwähnten Verfahren zur Herstellung
kugelförmiger Teilchen ein multi-zelluläres Celluloseteilchen
mit einem großen Porendurchmesser zu erhalten, ist, da eine
große Menge eines porenbildenden Materials mit einer
kontrollierten Teilchengröße in der Lösung enthalten ist, die
Fließfähigkeit der Lösung vermindert, und es ist sehr
schwierig, feine Flüssigkeitstropfen mit einer einheitlichen
Größe zu bilden.
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Darüberhinaus wird im Fall eines teilchenförmigen
porenbildenden Materials zu dem Zeitpunkt, an dem das
porenbildende Material eingeführt wird, die Löslichkeit der
Cellulose manchmal verringert, und somit findet eine
teilweise Ausfällung statt. Da in der Celluloselösung ein großer
tberschuß des porenbildenden Materials enthalten sein muß, um
den Hohlraumanteil im Innern des Teilchens zu erhöhen oder um
eine kontinuierliche Lochstruktur zu bilden, ist bei dem
porösen Teilchen, das nach Entfernen des porenbildenden
Materials übrigbleibt, außerdem die mechanische Festigkeit
unvermeidlich drastisch verringert. Bei dem Celluloseschwamm
wird durch vorheriges Einführen einer Faser wie Flachs als
Verstärkungsmittel in Viskose eine gewisse Festigkeit
erreicht. Gemäß diesem Verfahren ist es aufgrund der
Verstrickung der Faser in der Celluloselösung unmöglich,
einheitliche feine Tropfen der Lösung zu bilden.
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Wie aus der vorangehenden Beschreibung ersichtlich
ist, ist es sehr schwierig, durch direkte Verwendung des
Verfahrens zur Herstellung eines Celluloseschwamms Teilchen
zu bilden.
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Zusammengefaßt, ein poröses Celluloseteilchen mit
vielen Zellen, die einen maximalen eingezeichneten
Kugeldurchmesser von wenigstens etwa 2 µm besitzen, in welchem
diese Zellen eine kontinuierliche Lochstruktur bilden, wurde
bis jetzt nicht entwickelt.
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Um einen geformten Artikel mit hohem Wassergehalt aus
einem Gel eines von Cellulose verschiedenen wasserlöslichen
Polymers zu erhalten (dieses Produkt ist ebenfalls als
"poröser Artikel" bekannt, jedoch beruht die Porosität, auf
die man sich in diesem Fall bezieht, auf dem Konzept sehr
kleiner Zwischenräume im Netzwerk der Moleküle des Gels und
ist von dem Konzept der Zellen der vorliegenden Erfindung
völlig verschieden), wird eine Lösung des Polymers in einen
Formrahmen gegossen oder zu einem Beschichtungsfilm geformt,
die Lösung wird gefroren, und die gefrorene Lösung wird ohne
aufzutauen im Vakuum getrocknet. Es wurde bereits
vorgeschlagen, einen gelartigen geformten Artikel durch Verwenden
der herkömmlichen Technik des Fixierens einer Gelstruktur der
Lösung durch die Gefrier-Vakuumtrocknungs-Methode (ein
Verfahren, das Polyvinylalkohol verwendet, ist in der
japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 57-130543 und
der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 57-
15982 6 offenbart, und ein Verfahren, das löslich gemachtes
Collagen verwendet, ist in der japanischen ungeprüften
Patentveröffentlichung Nr. 56-23,896 offenbart) herzustellen.
Diese Technik weist jedoch ein anderes Ziel und Vorgehen auf
als die der vorliegenden Erfindung.
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Als eine Anwendungsform des multi-zellulären
Celluloseteilchens kann eine Form erwähnt werden, in welcher das
Teilchen als Träger in einer Säule gepackt ist. Wenn die
Poren des Teilchens klein sind, braucht eine Ausgangslösung
in diesem Fall lange, um durch das Teilchen hindurchzulaufen,
und demzufolge wird, um den Durchsatz in der Säule zu
verbessern, der Flüssigkeitsdruck erhöht, wobei die Größe des
Teilchens erniedrigt wird. Wenn diese Technik übernommen
wird, wird jedoch der Fließwiderstand erhöht und das Teilchen
wird deformiert. Dadurch ist diese Technik eingeschränkt. Ein
multi-zelluläres Teilchen mit einem großen Porendurchmesser
und einem geringen Fließwiderstand ist insbesondere als
Träger für die Trennung und Reinigung eines aus einem lebenden
Organismus stammenden Proteins mit hohem Molekulargewicht
geeignet, und dementsprechend ist die Entwicklung eines
multizellulären Celluloseteilchens mit einem großen
Porendurchmesser erwünscht.
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Bei einem Mikroträger, der für die Massenkultivierung
von adhärenten Zellen verwendet wird, wurde bereits ein
Verfahren angewandt, in welchem die Konzentration der
kultivierten Zellen durch Anhaften der Zellen an der
Oberfläche des Teilchens auf 106 Zellen/ml erhöht wurde. Wenn ein
multi-zelluläres Teilchen einen so großen Porendurchmesser
hat, daß Zellen in das Innere des Teilchens eintreten können
und daran haften können, kann durch Halten der Zellen im
Innern des Teilchens das Problem, daß Zellen, verursacht
durch das gegenseitige Anstoßen der Mikroträgerteilchen, von
der Oberfläche abfallen, gelöst werden, und ein Mikroträger,
in dem die Konzentration der kultivierten Zellen durch eine
erhebliche Zunahme der effektiven Haftoberfläche weiter
verbessert ist, kann zur Verfügung gestellt werden.
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Poröse Celluloseteilchen mit einem Porendurchmesser
von weniger als 2 µm werden hauptsächlich gemäß der
herkömmlichen Technik hergestellt, Celluloseteilchen, die
gleichmäßig
geöffnete Zellen mit einem Durchmesser von wenigstens
2 um aufweisen, können gemäß dieser herkömmlichen Technik
nicht hergestellt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Deshalb ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung,
ein multi-zelluläres Celluloseteilchen mit einem großen
Porendurchmesser zur Verfügung zu stellen, in welchem Zellen
mit einem Durchmesser von mehr als 2 µm relativ gleichmäßig
verteilt sind.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein
multizelluläres Celluloseteilchen mit zahlreichen voneinander
durch Zellmembranen getrennten Zellen zur Verfügung gestellt,
wobei die Zellen einen maximalen eingezeichneten
Kugeldurchmesser von mehr als 2 µm haben und wobei die Zellen eine
kontinuierliche Lochstruktur haben, in der die Zellen
miteinander durch Öffnungen in den zwei benachbarte Zellen
trennenden Membranen in Verbindung stehen, wobei der Anteil
von Zellen mit einem eingezeichneten Kugeldurchmesser von
mehr als 2 µm mindestens 60 Volum-%, bezogen auf die
Gesamtheit der Zellen, beträgt.
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Dieses multi-zelluläre Celluloseteilchen wird durch
ein Verfahren hergestellt, welches darin besteht, daß Tropfen
einer Celluloselösung gebildet werden, die Tropfen auf eine
Temperatur unterhalb der Verfestigungstemperatur der Lösung
gekühlt werden, um die Tropfen zu gefrieren, und das
Lösungsmittel durch Extraktion entfernt wird oder das
Lösungsvermögen des Lösungsmittels beseitigt wird.
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Ferner wird das multi-zelluläre Celluloseteilchen
durch ein Verfahren hergestellt, welches darin besteht, daß
Tropfen einer Cellulosederivatlösung gebildet werden, die
Tropfen auf eine Temperatur unterhalb der
Verfestigungstemperatur der Lösung gekühlt werden, um die Tropfen zu
gefrieren, und das Lösungsmittel durch Extraktion entfernt wird
oder das Lösungsvermögen des Lösungsmittels beseitigt wird
und die Cellulose gleichzeitig oder nachfolgend regeneriert
wird.
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Das Prinzip der vorliegenden Erfindung liegt darin,
als porenbildende Methode eine Art Phasentrennungsphänomen
auszunützen, in welchem durch Gefrieren und Verfestigen einer
Celluloselösung oder Cellulosederivatlösung viele feine
Kristalle des Lösungsmittels oder des Bestandteils davon (im
folgenden als "das Lösungsmittel" bezeichnet) gebildet werden
und die gelöste Cellulose oder das gelöste Cellulosederivat
in den Zwischenräumen zwischen den feinen Kristallen des
Lösungsmittels konzentriert und abgetrennt wird. Mit anderen
Worten, da das Lösungsmittel zur Zeit des Gefrierens in Form
feiner Kristalle ausgefällt wird, wird die Cellulose in der
Lösung in kleinen Zwischenräumen zwischen den feinen Teilchen
in einer hohen Konzentration konzentriert, und durch die
Abtrennung des Lösungsmittels in diesem konzentrierten
Zustand wird die Cellulose in Form einer Membran regeneriert
oder ausgefällt. Dementsprechend ist es möglich, ein
neuartiges multi-zelluläres Celluloseteilchen mit einem
maximalen eingezeichneten Kugeldurchmesser von wenigstens
etwa 2 µm zu erhalten, in welchem der Anteil von Zellen mit
einem maximalen eingezeichneten Kugeldurchmesser von
wenigstens 2 µm mindestens 60 Volum-%, bezogen auf die
Gesamtheit der Zellen, beträgt.
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Der Ausdruck "maximaler eingezeichneter
Kugeldurchmesser" bezeichnet den Durchmesser der Kugel, die unter den
in die Zelle eingezeichneten Kugeln die größte ist. In der
vorliegenden Erfindung wird die Größe der Zellen anhand des
maximalen eingezeichneten Kugeldurchmessers ausgedrückt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
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Figur 1 ist eine Lichtmikroskopaufnahme eines
Schnittes des in Beispiel 1 erhaltenen multi-zellulären
Celluloseteilchens der vorliegenden Erfindung, welche Zellen
des Teilchens zeigt;
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Fig. 2 ist ein Diagramm der Häufigkeitsverteilung von
maximalen eingezeichneten Kugeldurchmessern der Zellen in dem
in Beispiel 1 erhaltenen multi-zellulären Celluloseteilchen
der vorliegenden Erfindung;
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Fig. 3 bis 6 sind Rasterelektronenmikroskop(SEM)-
Aufnahmen, die die Struktur des in Beispiel 1 erhaltenen
multi-zellulären Celluloseteilchens der vorliegenden
Erfindung zeigen;
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Fig. 7 ist ein Diagramm, das eine Ausführungsform des
Verfahrens der vorliegenden Erfindung erläutert;
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Fig. 8 und 9 sind SEM-Aufnahmen, die ein Beispiel des
multi-zellulären Celluloseteilchens der vorliegenden
Erfindung zeigen, in welchem Zellen gerichtet geöffnet sind;
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Fig. 10 zeigt Graphen, die die Einflüsse der Lösungs-
Gefriertemperatur und der Cellulosekonzentration auf den
durchschnittlichen maximalen eingezeichneten Kugeldurchmesser
im Querschnitt der multi-zellulären Celluloseteilchen zeigen;
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Fig. 11 zeigt Graphen, die die Einflüsse der Lösungs-
Gefriertemperatur und der Cellulosekonzentration auf den
durchschnittlichen maximalen eingezeichneten Kugeldurchmesser
auf dem Oberflächenanteil der multi-zellulären
Celluloseteilchen zeigen;
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Fig. 12 zeigt Graphen, die die Einflüsse der Lösungs-
Gefriertemperatur und der Cellulosekonzentration auf die
Oberfläche der offenen Zellen der multi-zellulären
Celluloseteilchen zeigen;
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Fig. 13 ist eine SEM-Aufnahme des in Beispiel 5
erhaltenen multi-zellulären Celluloseteilchens der vorliegenden
Erfindung; und
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Fig. 14 und 15 sind SEM-Aufnahmen, die ein
Anwendungsbeispiel zeigen, in welchem das multi-zelluläre
Celluloseteilchen der vorliegenden Erfindung mit Collagen
behandelt wurde und man die Zellen in der multi-zellulären
Struktur des Teilchens aneinanderhaften und wachsen ließ.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung wird ein multi-zelluläres Celluloseteilchen
zur Verfügung gestellt, das eine Struktur besitzt, in der
sich kontinuierliche Löcher aus miteinander in Verbindung
stehenden Zellen radial von der Oberfläche in das Innere
erstrecken.
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In dem multi-zellulären Celluloseteilchen der
vorliegenden Erfindung beträgt der maximale eingezeichnete
Kugeldurchmesser mindestens 2 µm, und die Zellen mit einem
maximalen eingezeichneten Kugeldurchmesser von mindestens 2 µm
besetzen mindestens 60% des gesamten Zellvolumens.
Vorzugsweise beträgt der kürzeste Abstand zwischen Membranen
größtenteils mindestens 5 µm, insbesondere mindestens 10 µm.
Falls der kürzeste Abstand zwischen Membranen kürzer als 2 µm
ist, wird in dem multi-zellulären Celluloseteilchen keine
freie Bewegung einer Flüssigkeit erhalten, und der Einsatz
des Teilchens ist beschränkt. Die obere Grenze des
Zelldurchmessers ist nicht kritisch, sondern wird gemäß der
beabsichtigten Verwendung und Festigkeit des Teilchens frei gewählt.
In vielen Fällen beträgt die obere Grenze des
Zelldurchmessers mehrere hundert µm, insbesondere 200 µm.
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Die Dicke und Struktur der Zellmeiabranen sind nicht
besonders kritisch, solange in den betreffenden Membranen
Öffnungen zum Verbinden von Zellen miteinander gebildet
werden. Vorzugsweise ist die Größe der Öffnungen, verglichen
mit dem maximalen eingezeichneten Kugeldurchmesser der
Zellen, nicht zu klein. Namentlich beträgt die Größe der
Öffnungen vorzugsweise mindestens ungefähr 1/30 des maximalen
eingezeichneten Kugeldurchmessers der Zellen. Falls die Größe
der Öffnungen zu groß ist, wird die Festigkeit der
Teilchenstruktur zu gering, und während der Verwendung findet oft ein
Zerbrechen statt. Deshalb ist die Größe der Öffnungen
vorzugsweise kleiner als ungefähr 3/4, insbesondere 2/3, des
maximalen eingezeichneten Kugeldurchmessers der Zellen.
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In den Membranen werden manchmal zusätzlich zu den
oben erwähnten Öffnungen mit einer verhältnismäßig großen
Größe feine Löcher beobachtet. Die Gegenwart solcher feiner
Löcher wird bevorzugt, solange das Erreichen des Ziels der
vorliegenden Erfindung dadurch nicht behindert wird.
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Das multi-zelluläre Teilchen der vorliegenden
Erfindung, das heißt die das Teilchen bildende Membran, besteht im
wesentlichen aus Cellulose. Das Ausgangsmaterial der
Cellulose kann irgendeines aus Pulpe, Linters, Altpapier, von
Bakterien hergestellter Cellulose und regenerierter Cellulose
sein, und das Ausgangsmaterial ist nicht besonders kritisch.
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Die das Teilchen bildende Cellulose wird durch
Auflösen des oben beschriebenen Ausgangsmaterials durch das im
folgenden beschriebene Verfahren und Wiederausfällen oder
Regenerieren der Cellulose hergestellt, wobei der
durchschnittliche Polymerisationsgrad nicht besonders kritisch
ist. Im allgemeinen beträgt der durchschnittliche
Polymerisationsgrad vorzugsweise 100 bis 1.000, jedoch ist eine
Cellulose mit einem höheren Polymerisationsgrad (d.h.
Cellulose, die durch Gebrauch eines Bakteriums hergestellt wird)
stärker zu bevorzugen, solange das Erreichen des
beabsichtigten Ziels der vorliegenden Erfindung dadurch nicht behindert
wird.
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Die Gegenwart einer kleinen Menge Hemicellulose oder
hydrolysierter oder oxidierter Cellulose in der Cellulose,
die das Teilchen bildet, ist erlaubt, solange das Erreichen
des Ziels der vorliegenden Erfindung dadurch nicht behindert
wird.
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Die Form oder Größe des Teilchens der vorliegenden
Erfindung ist nicht besonders kritisch und wird gewöhnlich
aus einer Kugelform, einer länglichen Sphäroidform und einer
flachen Sphäroidform ausgewählt. In speziellen Fällen ist zur
Erhöhung des Packungseffekts eine Säulenform, eine
zylindrische Form oder eine sattelartige Form gestattet. Die Größe
wird gemäß der beabsichtigten Verwendung nach Wunsch
ausausgewählt. Der Durchmesser (der Durchmesser im Fall eines
Kugelteilchens oder der Durchmesser der eingezeichneten Kugel
im Fall eines anders geformten Teilchens) beträgt gewöhnlich
5 bis 500 µm, in einem extremen Fall kann der Durchmesser
jedoch 5 mm oder größer sein. Es ist leicht verständlich, daß
das Teilchen die Form einer Faser oder eines Films besitzen
kann.
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Da in die Celluloselösung oder
Cellulosederivatlösung kein porenbildendes Material oder anderes
Fremdmaterial eingeführt werden muß, können in dem Verfahren der
vorliegenden Erfindung leicht feine gleichförmige
Flüssigkeitstropfen gebildet werden, und die Teilchengröße kann
beliebig kontrolliert werden. Der maximale eingezeichnete
Kugeldurchmesser und die Form der Zellen werden im
allgemeinen gemäß der Größe und Form der Kristalle bestimmt, die
gebildet werden, wenn das Lösungsmittel in der Lösung
gefroren und verfestigt wird. Die Form und der maximale
eingezeichnete Kugeldurchmesser können dementsprechend durch
Andern der Art der Celluloselösung oder
Cellulosederivatlösung und der Gefrier-Verfestigungsbedingungen wie der
Temperatur eingestellt werden.
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Als Celluloselösung, die in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden kann, können beispielsweise Lösungen
erwähnt werden, die durch Auflösen von Cellulose in wäßrigen
Lösungen von Metallkomplexen wie Kupferammonium, Kupfer(II)-
ethylendiamin (CED), Cadoxen, Eisennatriumtartrat (EWNN),
Nickelethylendiamin (Nioxen), Nickel-Ammoniak (Nioxam),
Kobaltethylendiamin (Cooxen) und Zinkethylendiamin (Zincoxen)
gebildet werden, Lösungen, die durch Auflösen von Cellulose
in Lösungsmitteln vom Dimethylacetamid/Lithiumchlorid-Typ
gebildet werden, Lösungen, die durch Auflösen von Cellulose
in Aminen wie N-Methylmorpholinoxid, Triethylaminoxid und
Cyclohexyldimethylamin gebildet werden, Lösungen, die durch
Auflösen von Cellulose in kombinierten Lösungsmitteln aus
Ammoniak und einem Salz wie Ammoniumthiocyanat, Natriumiodid,
Natriumnitrat, Natriumthiocyanat oder Ammoniumiodid gebildet
werden, und Lösungen, die durch Auflösen von Cellulose in
wäßrigen Lösungen von Alkalien wie Ätznatron,
Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Cäsiumhydroxid gebildet werden,
wie in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr.
60-42438 offenbart ist. Die Lösungen, die in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können, sind natürlich nicht auf
diejenigen, die oben beispielhaft dargelegt wurden,
beschränkt.
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Als Cellulosederivatlösungen, die in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können, kann beispielsweise eine
Lösung erwähnt werden, die durch Umsetzen von Cellulose mit
Paraformaldehyd in Dimethylsulfoxid gebildet wird, wobei eine
teilweise methylolierte Cellulose in Lösungsform erhalten
wird, eine Lösung, die durch Umsetzen von Cellulose mit
Distickstofftetroxid in Dimethylformamid gebildet wird, wobei
Cellulosenitritester in Lösungsform erhalten wird, eine
Lösung, die durch Umsetzen von Cellulose mit einem Amin und
Schwefeldioxid in Dimethylsulfoxid (DMSO) gebildet wird,
wobei die resultierende modifizierte Cellulose in Lösungsform
erhalten wird, eine Cellulose-Natriumxanthogenat-Lösung und
eine Lösung von Celluloseacetat in Aceton.
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Die Form und Größe des multi-zellulären
Celluloseteilchens kann durch die Art der Celluloselösung oder
Cellulosederivatlösung, der Cellulosekonzentration und der
Viskosität der Lösung kontrolliert werden, und darüberhinaus kann
die Form und Teilchengröße gemäß dem Verfahren der Bildung
von Tropfen der Lösung kontrolliert werden. Als Verfahren der
Bildung von Tropfen der Lösung kann ein Sprühdüsenverfahren,
in welchem die Lösung in einer Gasatmosphäre versprüht wird,
ein Verfahren, in welchem die Lösung in eine Flüssigkeit
extrudiert wird, und ein Emulsionsdispergierverfahren erwähnt
werden, obwohl die Verfahren, die verwendet werden können,
nicht auf diese Verfahren beschränkt sind.
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Es ist zu beachten, daß ebenso ein Verfahren erwähnt
werden kann, in welchem die Lösung aus einer Düse oder einem
Spritzmundstück wie beim gewöhnlichen Spinn- oder
Folienbildungsverfahren extrudiert wird und die resultierende Faser
oder Folie in einem geeigneten nachfolgenden Schritt in die
Teilchenform geschnitten und zerteilt wird.
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Das Gefrieren wird durch Einführen der Tropfen in ein
auf eine beliebige Temperatur eingestelltes Medium erreicht.
In einer Flüssigkeit oder einem Gas, die mit der
Celluloselösung oder Cellulosederivatlösung nicht reagieren und nicht
mischbar sind, werden die Tropfen in Form wirklicher Kugeln
gefroren. In einer mit der Lösung mischbaren Flüssigkeit
werden die Tropfen in unregelmäßiger Form gefroren, und in einer
Flüssigkeit oder einem Gas, die mit der Lösung reagieren,
können die Tropfen in einem Zustand gefroren werden, bei dem
nur der Oberflächenanteil modifiziert ist. Wenn die Tropfen
beispielsweise in einer Flüssigkeit oder einem Gas gefroren
werden, die mit der Celluloselösung oder der
Cellulosederivatlösung mischbar sind, wobei die Flüssigkeit oder das
Gas nur den Oberflächenanteil der Teilchen durchdringt, bevor
die Temperatur auf die Gefriertemperatur erniedrigt wird,
wird die Cellulose in Form eines die Oberfläche bedeckenden
Films ausgefällt, mit dem Ergebnis, daß ein Teilchen mit
vielen Zellen erhalten wird, in dem nur die
Oberflächenschicht mit einem Film bedeckt ist und die Zellen nicht oder
nur teilweise zu der Oberfläche hin geöffnet sind.
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Wenn in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung das
Gefrieren ausgeführt wird, ist die Gefriertemperatur nicht
besonders kritisch, solange die Gefriertemperatur niedriger
ist als die Temperatur, bei welcher das Lösungsmittel
gefroren wird. Trotzdem ist die Gefriertemperatur für das Wachstum
der Lösungsmittel-Kristalle und für die Festlegung der
Zellgröße in den Teilchen der vorliegenden Erfindung von
Bedeutung, und deshalb wird die Gefriertemperatur
geeigneterweise gemäß der Art des Lösungsmittels und der
beabsichtigten Zellgröße ausgewählt. Falls durch Verwendung von
flüssigem Stickstoff eine zu niedrige Gefriertemperatur
ausgewählt wird, werden zur Zeit des Gefrierens keine Kristalle
gebildet. Die Celluloselösung wird gefroren, während die
Lösungsstruktur im wesentlichen beibehalten wird, und es wird
eine Gelstruktur ähnlich der bei dem gewöhnlichen Naß
fällungsverfahren erhaltenen Gelstruktur gebildet, und gute
Ergebnisse können nicht erhalten werden. Es ist zu beachten,
daß, falls die Gefriertemperatur auf einen Wert eingestellt
wird, der um 30 bis 40 ºC niedriger ist als die
Gefriertemperatur des Lösungsmittels, ein Teilchen erhalten werden
kann, in welchem nur der Oberflächenanteil eine Gelstruktur
hat und das Innere eine multi-zelluläre Struktur besitzt, und
die Oberfläche teilweise mit einem Gelfilm bedeckt ist,
während einige Öffnungen, die mit dem Inneren des Teilchens
in Verbindung stehen, verbleiben. Ein multi-zelluläres
Teilchen mit einer solchen Struktur besitzt einen besonders
hohen Druckverformungswiderstand. Im allgemeinen wird das
Gefrieren nicht bei einer Temperatur ausgeführt, die um mehr
als 40 ºC niedriger ist als die Gefriertemperatur des
Lösungsmittels, und um den maximalen eingezeichneten
Kugeldurchmesser zu erhöhen, wird das Gefrieren üblicherweise bei
einer Temperatur ausgeführt, die um 0 bis 20 ºC niedriger ist
als die Gefriertemperatur des Lösungsmittels.
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In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die
gefrorene Celluloselösung oder Cellulosederivatlösung einer
Entfernung des Lösungsmittels durch Extraktion oder einer
Verminderung des Lösungsvermögens des Lösungsmittels (alles
einbegriffen nachstehend "Lösungsmittelentfernung" genannt)
unterworfen, wobei ein verfestigtes multi-zelluläres
Celluloseteilchen erhalten wird. Kurz gesagt, das bei der
Naßformung einer Celluloselösung oder Cellulosederivatlösung
üblicherweise verwendete Fällungsverfahren, wie
Verdünnungsfällung, Sedimentation, Lösungsmittelextraktion oder saure
oder alkalische Neutralisation, kann direkt übernommen
werden. Da eine Salzlösung wie eine Lösung, die 10% Na&sub2;SO&sub4;,
50% Ethylenglykol und 40% H&sub2;O enthält, selbst bei -20 ºC
nicht gefroren wird, kann, um das Lösungsvermögen des
Lösungsmittels zu verringern, außerdem ein Phänomen
ausgenutzt werden, in welchem in Eis umgewandeltes Wasser in
gefrorenen Tropfen einer bestimmten Celluloselösung
allmählich durch die Salzlösung ersetzt wird.
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Die Bedingungen der Lösungsmittelentfernung sind
nicht besonders kritisch, und es reicht aus, wenn das
gefrorene Teilchen schnell in ein beliebiges Fällungsbad oder
Regenerierbad geschüttet wird. Vorzugsweise wird das
Fällungsbad oder Regenerierbad auf einer Temperatur gehalten, die
niedriger ist als die Gefriertemperatur des Lösungsmittels.
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Es ist zu beachten, daß, wenn ein Cellulosederivat
verwendet wird, der Regenerierschritt unerläßlich ist, und
diese Regeneration wird gleichzeitig mit der
Lösungsmittelentfernung oder nachfolgend (das heißt, nach der
Lösungsmittelentfernung) ausgeführt. Die Regenerierung kann gemäß
herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden.
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Das multi-zelluläre Teilchen, das bereits der
Lösungsmittelentfernung oder der Lösungsmittelentfernung und
der Regenerierung unterworfen wurde, wird dann mit Wasser
oder einem Detergens oder Waschmittel gewaschen, und, falls
notwendig, wird das Teilchen getrocknet und
dampfsterilisiert, bevor das Teilchen verwendet wird. Die Wasch- und
Trockenbedingungen sind nicht besonders kritisch, und
angemessene Bedingungen können gemäß der beabsichtigten
Verwendung beliebig gewählt werden.
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Da das multi-zelluläre Celluloseteilchen der
vorliegenden Erfindung kontinuierliche Zellen mit einem
maximalen eingezeichneten Kugeldurchmesser von mindestens etwa
2 µm besitzt, hat das Teilchen eine Struktur, die einen
leichten Austritt und Eintritt einer Flüssigkeit oder eines
Festkörpers erlaubt. Die Trennwand, die die Zellen des
multizellulären Teilchens begrenzt, besteht prinzipiell aus
Cellulose, welche eine natürliche Substanz ist, und deshalb
besitzt das Teilchen eine gute Affinität für Wasser, ist
biologisch ungefährlich und ist insofern vorteilhaft als die
Beständigkeit gegenüber organischen Lösungsmitteln und die
Hitzebeständigkeit gut sind. Mittels dieser Vorzüge ist das
Teilchen wertvoll zur Verwendung als Füllmaterial in der
Affinitätschromatographie, als Träger für ein stabilisiertes
Enzym oder, direkt oder nach teilweiser chemischer
Modifizierung, als Mikroträger zur Zellkultivierung.
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Wenn das Teilchen als Träger in der Chromatographie
verwendet wird, wird sogar für eine viskose Flüssigkeit die
Eigenschaft eines guten Flüssigkeitsdurchlasses erhalten. Da
selbst Zellen mit einem großen Volumen, wie tierische Zellen,
durch die zu der Oberfläche hin geöffneten Löcher in das
Innere eindringen können, kann das Teilchen darüberhinaus als
ein Mikroträger verwendet werden, der Zellen im Inneren des
Teilchens festhält, was von dem herkömmlichen Mikroträger des
Oberflächenadhäsions-Typs verschieden ist. Darüberhinaus kann
das Teilchen durch Ausnützen der reaktiven Hydroxylgruppen
der Cellulose leicht in ein Derivat umgewandelt werden, und
die Eigenschaft der Enzymfixierung, ein
Ionenaustausch-Vermögen oder ein Chelatbildungsvermögen kann verliehen werden.
Deshalb kann das Teilchen für verschiedene Anwendungen
verwendet werden.
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Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist dadurch
gekennzeichnet, daß, da das Lösungsmittel im Gefrierschritt
in Form feiner Kristalle ausgefällt wird, die Cellulose in
der Lösung in kleinen Zwischenräumen zwischen den feinen
Kristallen in einer hohen Konzentration konzentriert ist. Da
die Cellulose durch Abtrennung des Lösungsmittels in diesem
konzentrierten Zustand in der Film-Form ausgefällt oder
regeneriert wird, kann eine feste Filmstruktur erhalten
werden, und selbst wenn kein Verstärkungsmittel enthalten
ist, kann ein multi-zelluläres Teilchen mit einer
mechanischen Festigkeit erhalten werden, die hoch genug ist, um
industriellen Anwendungen standzuhalten Da keine
Fremdsubstanz als porenbildendes Material eingeführt wird, ist
ferner die Reinheit des Produktes sehr hoch.
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Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf die
folgenden Beispiele beschrieben. In den Beispielen wird die
Viskosität der Celluloselösung oder Cellulosederivatlösung
mit einem kommerziell erhältlichen Rotationsviskosimeter bei
einer Temperatur von 23 ºC bei einer Rotordrehung von 20 Upm
gemessen.
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Die relative Kupferammoniumviskosität (ηrel) von
Cellulose wird gemäß dem Verfahren des JIS P-8101 gemessen,
und der durchschnittliche Polymerisationsgrad ( ) wurde aus
der Cuprammoniumviskosität gemäß der folgenden Formel
bestimmt [I.E.C., 42, 502 (1950)]:
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= 520 (ηrel - 1) (wenn < 300), oder
= 2160 [log(µηrel + 1) - 0,267] (wenn ≥ 300)
-
Der Durchmesser des Teilchens wurde im
nicht-getrockneten Zustand durch ein Lichtmikroskop bei geeigneter
Vergrößerung gemessen. Im Fall eines feinen Teilchens mit
einem Durchmesser von weniger als 50 µm wurde ebenso ein
Meßverfahren angewandt, bei welchem ein gewaschenes, aber
nicht getrocknetes Teilchens durch flüssigen Stickstoff
schnell abgekühlt und dann unter einem Vakuum von 0,13 mbar
(0, 1 Torr) gefriergetrocknet (Gefriertrocknungsbehandlung)
und das Teilchen durch ein Rasterelektronenmikroskop (SEM)
beobachtet wurde. Der Lochöffnungsdurchmesser und der Anteil
der Öffnungsfläche der Teilchenoberfläche wurden bestimmt,
indem die gefriergetrocknete Probe mit Gold besputtert und
die Oberfläche mit SEM bei geeigneten Vergrößerungen
beobachtet wurde. Der maximal eingezeichnete Kugeldurchmesser wurde
bestimmt, indem die Gefrierbehandlung mit flüssigem
Stickstoff auf dieselbe Weise wie oben beschrieben
durchgeführt, die Probe bei derselben Temperatur gespalten, die
Trocknungsbehandlung unter Vakuum und nachfolgende
Behandlungen ausgeführt und der Schnitt des Teilchens mit SEM
beobachtet wurde. Es ist zu beachten, daß, wenn das Teilchen
oder die Zelle nicht wirklich kugelförmig waren, der kleinste
Durchmesser als Durchmesser der Teilchens oder der Zelle
definiert wurde.
Beispiel 1
-
Dissolving Sulfite Pulp AL-T (Koniferen-Zellstoff,
hergestellt durch das Verfahren mit schwefliger Säure),
geliefert von Alaska Pulp Co., wurde säurehydrolysiert, so
daß der durchschnittliche Polymerisationsgrad 450 betrug, und
der hydrolysierte Zellstoff wurde in einer 8%igen wäßrigen
Natriumhydroxidlösung bei -6 ºC aufgelöst, um eine
Celluloselösung mit einer Konzentration von 3% zu erzeugen.
Die Lösung wurde unter Verwendung einer Sprühdüse in Form
zerstäubter feiner Teilchen bei -16 ºC in Hexan gesprüht,
wobei eine gefrorene Lösung mit einer feinverteilten Form in
Hexan erhalten wurde. Nach 30 Minuten wurde die gefrorene
Substanz aus dem Hexan enthaltenden Gefäß genommen und in
eine 50%ige wäßrige Schwefelsäurelösung von -20 ºC
geschüttet. Dieser Zustand wurde 5 Stunden lang bei -20 ºC
aufrechterhalten, und die gebildeten Teilchen wurden mit
Wasser gewaschen. Wenn mit einem Lichtmikroskop ungefähr
50 Teilchen beobachtet wurden, wurde gefunden, daß der
Teilcnendurchmesser 50 bis 300 µm betrug. Anschließend wurden aus
diesen Teilchen willkürlich 6 Teilchen ausgewählt und einem
Substitutions-Waschen mit einer 50%igen wäßrigen Lösung einer
wasserlöslichen Einbettflüssigkeit vom Methacrylharz-Typ,
Quetol 523M , geliefert von Nisshin-EM Co., unterworfen, und
die Substitution wurde zweimal mit einer 100%igen
Quetol-Lösung wiederholt. Die abschließende Substitution wurde mit
einer Flüssigkeit ausgeführt, die durch Hinzufügen von 0,05 g
elnes Polymerisations-Starters, QCU-1 , zu 100 ml Quetol
gebildet wurde, und das Einbettungs-Härten wurde unter vorher
festgelegten Härtungsbedingungen (60 ºC und 12 Stunden)
ausgeführt. Nach dem Härten wurde ein Trockenschnitt der
eingebetteten Probe entlang der Mittellinie der Teilchen mit
einem Glasschneider durchgeführt, wobei ein Schnittstück mit
einer Dicke von 1 µm erhalten wurde, und das Schnittstück
wurde unter Verwendung eines Lichtmikroskops betrachtet. Es
wurde gefunden, daß die Zellen in allen Teilchen einheitlich
verteilt waren (siehe Fig. 1). Wenn aus Aufnahmen der
Schnittstücke der sechs Teilchen alle maximalen
eingezeichneten Kreisdurchmesser gemessen wurden und die
Häufigkeitsverteilung bestimmt wurde (siehe Fig. 2), wurde gefunden, daß
die maximalen eingezeichneten Kreisdurchmesser im Bereich von
3 bis 22 µm verteilt waren. Es wird angenommen, daß die auf
diese Weise gemessenen Werte der maximalen eingezeichneten
Kreisdurchmesser annähernd dieselben sind wie die oben in
dieser Beschreibung definierten maximalen eingezeichneten
Kugeldurchmesser. Die Beobachtung mit SEM zeigte, daß jedes
Teilchen ein aus einem Aggregat der oben erwähnten Zellen
bestehendes kugelförmiges Teilchen ist (siehe Fig. 3). Die
Beobachtung bei starken Vergrößerungen offenbarte, daß eine
kontinuierliche Struktur gebildet wurde, in der Membranen,
die die Zellen voneinander trennen, teilweise geöffnet waren
(siehe Fig. 4 und 5).
-
Anschließend wurden Teilchen auf dieselbe Weise wie oben
beschrieben hergestellt, außer daß die Temperatur des Hexans
auf -20 ºC geändert wurde, und die Teilchen wurden auf
ähnliche Weise mit SEM beobachtet. Es wurde bestätigt, daß
die Teilchen teilweise mit einem Film bedeckt waren, wie in
Fig. 6 gezeigt.
Beispiel 2
-
Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 50 bis etwa
300 µm wurden auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 1
beschrieben, hergestellt, außer daß zu dem in Beispiel 1 verwendeten
Hexan 2 Gew.-% Ethanol hinzugefügt wurden und die Temperatur
auf -15 ºC geändert wurde. Nach Neutralisieren und Waschen
mit Wasser wurden die Teilchen gefroren und bei der
Temperatur von flüssigem Stickstoff gespalten, und die Beobachtung
wurde mit SEM auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 1
beschrieben, ausgeführt. Es wurde gefunden, daß die Teilchen
eine doppelte Struktur hatten, in der die Oberfläche mit
einem Film bedeckt war und das Innere offene Zellen mit einem
maximalen eingezeichneten Kugeldurchmesser von 10 bis 20 µm
aufwies.
Beispiel 3
-
Ein Silikonöl (KF96, geliefert von Sinetsu Silicone Co.)
und 50%ige Schwefelsäure wurden in ein 3-Liter-Becherglas
gefüllt, wie in Fig. 7 gezeigt, und die Füllung wurde auf -16
ºC abgekühlt (Die Bezugszahlen 1 und 2 in Fig. 7 zeigen das
Silikonöl bzw. die 50%ige Schwefelsäure). Eine
Celluloselösung mit einer Cellulosekonzentration von 6%, die aus
demselben Ausgangsmaterial, wie es in Beispiel 1 verwendet
wurde, hergestellt wurde, wurde unter Verwendung einer
Spritze 3 auf die Füllung getropft. Während die Tropfen 4 der
Celluloselösung langsam in das Silikonöl fielen, wurden die
Tropfen zu Kugeln geformt und zu weißen Tropfen gefroren. Die
gefrorenen Tropfen 5 blieben eine Zeitlang an der Grenzfläche
zwischen dem Silikonöl und der Schwefelsäure, und dann
begannen die gefrorenen Tropfen wieder zu fallen und gelangten
auf den Boden des Becherglases.
-
Wenn die Tropfen, die den Boden des Becherglases erreicht
hatten, mit Hexan und Wasser gewaschen wurden, wurden
Celluloseteilchen mit einem Durchmesser von etwa 5 mm erhalten.
Die erhaltenen weißen kugelförmigen Teilchen hatten insofern
eine Schwammfunktion als durch Ausüben von Druck auf die
Teilchen durch Zusammendrücken der Teilchen mit einem Finger
die Teilchen deformiert wurden und Wasser, das im Inneren
enthalten war, freigegeben wurde. Wenn der Druck entfernt
wurde, wurde die ursprüngliche Gestalt sofort
wiederhergestellt. Es wurde gefunden, daß die Teilchen eine
widerstandsfähige Struktur besaßen, die durch Deformation, die
durch Anwendung einer äußeren Kraft verursacht wurde, schwer
zu zerstören war.
-
Wenn die Teilchen gefriergeschnitten und
gefriergetrocknet wurden und die Schnitte beobachtet wurden, wurde
gefunden, daß Eiskristalle von der Oberfläche zum Zentrum hin
wuchsen und alle Zellen zum Zentrum des Teilchens hin
geöffnet waren (siehe Fig. 8). Figur 9 ist eine vergrößerte
SEM-Aufnahme des Schnittes, aus welcher zu erkennen ist, daß
die Zellen in einer gerichteten Weise geöffnet waren. In
Fig. 9 liegt das Zentrum des Teilchens auf der rechten Seite.
-
Weiterhin ist zu sehen, daß in dem im gegenwärtigen
Beispiel erhaltenen Teilchen die Membran zwischen den Zellen
eine feine multizelluläre Struktur aufweist, wie in Fig. 9
gezeigt.
Beispiel 4
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Drei Celluloselösungen mit Cellulosekonzentrationen von
2 Gew.-%, 4 Gew.-% bzw. 6 Gew.-% wurden gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt, und die
Einflüsse der Cellulosekonzentration und der
Gefriertemperaturbedingung auf die Zellgröße wurden untersucht. Ein 3-Liter-
Becherglas, gefüllt mit 50%iger Schwefelsäure und Hexan,
wurde als Gefriertank verwendet, und die
Flüssigkeitstemperatur wurde im Bereich von -15 ºC bis -50 ºC in Schritten von
5 ºC geregelt Die Celluloselösung wurde aus einer 5 cm über
dem Flüssigkeitsspiegel gelegenen Sprühdüse unter Verwendung
von Stickstoffgas versprüht, und feine Celluloseteilchen
wurden aus dem unteren Teil des Becherglases entnommen. Die
Teilchen wurden mit Wasser gewaschen, und nur Teilchen mit
einem Durchmesser von 100 bis 150 µm wurden unter Verwendung
von Sieben mit Öffnungen von etwa 0,138 mm und 0,100 mm (110-
mesh- und 145-mesh-Siebe) gewonnen. Die maximalen
eingezeichneten Kugeldurchmesser von Zellen auf der
Teilchenoberfläche und Zellen im Schnitt wurden mit SEM
gemessen. Es wurde gefunden, daß der maximale eingezeichnete
Kugeldurchmesser von Zellen allmählich abnahm, wenn die
Celllosekonzentration erhöht wurde. Es wurde ebenso gefunden,
daß der maximale eingezeichnete Kugeldurchmesser stark von
der Gefriertemperatur abhing und die größten Zellen bei -15
ºC gebildet wurden. Die Zellgröße war mit abnehmender
Gefriertenperatur verringert, die Größe der vom Querschnitt
aus gesehen im mittleren Teil des Teilchens gelegenen Zellen
besaßen jedoch einen konstanten Wert von 8 bis 15 µm, mit
Abweichungen gemäß der Konzentration der Lösung, bei
Temperaturen von weniger als -25 ºC (siehe Fig. 10).
-
Im Oberflächenanteil war die Zellgröße mit abnehmender
Gefriertemperatur verringert (siehe Fig. 11), und ebenso war
der offene Zelloberflächenbereich der Oberfläche verringert
und die Struktur wurde allmählich zu einer mit einem Film
bedeckten Struktur verändert (Fig. 12) Dementsprechend
konnte ein schwammartiges Teilchen, bei welchem die
Oberfläche mit einem Film bedeckt war, nur erhalten werden, indem
die Gefriertemperatur auf einen niedrigen Wert eingestellt
wurde
Beispiel 5
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Viskose mit einer Viskosität von 2,53 Pa s (2.530 cps)
bei 23 ºC, einer Cellulosekonzentration von 7,4%, einer NaOH-
Konzentration von 5% und einem γ-Wert von 36, die unter
Verwendung eines durch das Verfahren mit schwefliger Säure
hergestellten Koniferen-Zellstoffs als Ausgangsmaterial
hergestellt wurde, wurde mit einer Spritze auf dieselbe
Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, in ein
3-Liter-Becherglas, das mit einem Silikonöl und 50%iger Schwefelsäure
gefüllt und auf -16 ºC abgekühlt war, getropft. Wenn die
F1üssigkeitstropfen gefroren würden, wurden die Tropfen opak
und cremefarbig. Die gefrorenen Tropfen blieben eine Zeitlang
an der Grenzfläche zwischen dem Silikonöl und der
Schwefelsäure und erzeugten Blasen, und dann begannen die Tropfen zu
fallen und gelangten auf den Boden des Becherglases.
-
Die Teilchen, die auf dem Boden des Becherglases
angelangt waren, wurden mit Wasser von Raumtemperatur gewaschen,
und anschließend wurden die Teilchen gemäß dem oben erwähnten
Verfahren gefriergeschnitten und gefriergetrocknet und mit
SEM beobachtet. Es wurde gefunden, daß auf dem
Oberflächenanteil des Teilchens mit einem Durchmesser von etwa 5 mm
Zellen mit einem maximalen eingezeichneten Kugeldurchmesser
von 2 bis 8 µm geöffnet waren (siehe Fig. 13) und im Inneren
Zellen mit einem maximalen eingezeichneten Kugeldurchmesser
von 10 bis 15 um geöffnet waren.
Beispiel 6
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Eine Cellulose-Kupferammonium-Lösung mit einer Viskosität
von 10 Pa s (10.000 cps) bei 23 ºC, einer
Cellulosekonzentration von 6%, einer Kupferkonzentration von 3,6% und einer
Ammoniak-Konzentration von 7,0%, die aus Fein-Linters als
Ausgangsmaterial hergestellt wurde, wurde mit einer Spritze
auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, in ein
3-Liter-Becherglas, das mit einem Silikonöl und 50%iger
Schwefelsäure gefüllt und auf -19 ºC gekühlt war, getropft.
Wenn die Flüssigkeitstropfen gefroren wurden, wurden die
Tropfen opak, wobei sie eine himmelblaue Farbe hatten. Die
gefrorenen Tropfen blieben eine Zeitlang an der Grenzfläche
zwischen dem Silikonöl und der Schwefelsäure, und dann
begannen die Tropfen wieder zu fallen und gelangten auf den
Boden des Becherglases
-
Die Teilchen, die auf dem Boden des Becherglases
angelangt waren, wurden mit Wasser von Raumtemperatur gewaschen
und gemäß dem oben erwähnten Verfahren gefriergeschnitten und
gefriergetrocknet, wobei kugelförmige Teilchen mit einen
Durchmesser von etwa 8 mm erhalten wurden. Wenn die Teilchen
mit SEM beobachtet wurden, wurde gefunden, daß ein
beträchtlicher Anteil der Oberfläche mit einem Film bedeckt war, der
Anteil der von offenen Poren besetzten Fläche 30% betrug und
der maximale eingezeichnete Kugeldurchmesser 10 bis 20 um
betrug. Im Innern des Teilchens betrug der maximale
eingezeichnete Kugeldurchmesser der Zellen 20 bis 60 µm.
Beispiel 7
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Dieses Beispiel erläutert eine Anwendung des
multi-zellulären Teilchens der vorliegenden Erfindung.
-
Eine sterilisierte Lösung von Collagen I, Cellmatrix I-A
(geliefert von Nitta Gelatin K.K.), wurde 5mal mit einer
sterilisierten wäßrigen Salzsäureiösung mit einem pH-Wert von
3 verdünnt, um 10 ml einer Lösung von Collagen I mit einer
Konzentration von 0,6 mg/ml herzustellen, und die Lösung
wurde bei 4 ºC gehalten.
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Aus Teilchen, die bei einer Cellulosekonzentration von 4%
und einer Gefriertemperatur von -15 ºC auf dieselbe Weise,
wie in Beispiel 4 beschrieben, hergestellt worden waren,
wurden unter Verwendung von Sieben mit Öffnungen von ungefähr
0,34 mm und 0,84 mm (46-mesh- und 20-mesh-Siebe) nur Teilchen
mit einem Durchmesser von 840 bis 1.000 µm gewonnen. Die
Teilchen im nicht-getrockneten Zustand wurden in einer Menge
von 0,1 g, berechnet als Trockengewicht der Cellulose,
gewonnen und zusammen mit 100 ml destilliertem Wasser in einer
druckbeständigen Glasflasche bei 130 ºC 2 Stunden lang einer
Autoklaven-Sterilisationsbehandlung unterzogen, und die
Teilchen wurden auf 4ºC gehalten. Anschließend wurden 10 ml
der oben erwähnten Lösung von Collagen I hinzugefügt, und das
Gemisch wurde unter Eiskühlung gerührt. Die
Flüssigkeitstemperatur wurde über einen Zeitraum von 1 Stunde unter
Rühren auf 25ºC erhöht, und das Gemisch wurde mit
sterilisiertem Wasser gewaschen. Getrennt wurden 5 ml Ham F-12
Medium (geliefert von Dainippon Seiyaku K.K.), zu welchen 5%
fötales Rinderserum (geliefert von Dainippon Seiyaku K.K.)
hinzugefügt wurden, in eine Schale mit 60 mm Durchmesser
gefüllt. Die mit Wasser gewaschenen Teilchen wurden zu dem
Medium hinzugefügt, so daß die Teilchen in einer Schicht auf
der Bodenfläche der Schale gepackt waren. Anschließend wurden
Zellen des Stammes CHO-K1 (geliefert von Dainippon Seiyaku
K.K.), die von Eierstöcken des Chinesischen Hamsters
stammten, hinzugefügt, und die Inkubation wurde bei 37ºC 7 Tage
lang in 5%igem Kohlendioxid ausgeführt. Danach wurden die
Teilchen in 2%igen Glutaraldehyd gegeben und 3 Stunden lang
bei 4ºC stehen gelassen, und die Teilchen wurden zweimal mit
einer Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen und bei 4ºC
1,5 Stunden lang mit 2%iger Osmiumsäure behandelt.
-
Dann wurden die Teilchen 10 Minuten lang mit einer
20%igen wäßrigen Ethanollösung bei 4ºC , 10 Minuten lang mit
einer 50%igen wäßrigen Ethanollösung bei 4ºC und 10 Minuten
lang mit einer 70%igen wäßrigen Ethanoliösung bei 4ºC
behandelt, und die Alkoholsubstitution wurde dann mit 80%igem
Ethanol, 90%igem Ethanol und 100%igem Ethanol bei
Raumtemperatur ausgeführt. Anschließend wurden die Teilchen
30 Minuten lang in Isoamylacetat getaucht und unter
Verwendung von Kohlendioxid einer Trocknungsbehandlung am
kritischen Punkt unterzogen, wobei eine trockene Probe
erhalten wurde. Wenn die Probe der
Gold-Vakuumsabscheidungsbehandlung unterworfen und mit SEM beobachtet wurde, wurde
bestätigt, daß CHO-K1 in Zellen der Teilchen anhaftete und
wuchs (siehe Fig. 14 und 15).
Beispiel 8
-
Aus Teilchen, bei denen etwa 60% ihrer Oberfläche mit
einem Film bedeckt war, die aus einer Celluloselösung mit
einem Polymerisationsgrad von 400 und einer
Cellulosekonzentration von 4% durch Gefrieren bei -40 ºC auf dieselbe Weise,
wie in Beispiel 4 beschrieben, hergestellt worden waren,
wurden nur Teilchen mit einem Durchmesser von 100 bis 150 µm
gewonnen, und die Teilchen wurden 2 m hoch in eine Glassäule
mit einem Innendurchmesser von 2 cm gepackt, und
destilliertes Wasser wurde bei einer Temperatur von 23 ºC
mit einer Rate von 100 ml/min 30 Minuten lang durchgelassen.
Die Teilchen im unteren Teil wurden wiedergewonnen und gemäß
der oben beschriebenen Verfahren mit einem Lichtmikroskop und
SEM beobachtet. Es wurde bestätigt, daß die Teilchen eine
Kugelform behielten, und Bersten oder Zerbrechen wurde nicht
beobachtet.