CH651579A5

CH651579A5 - Verfahren zum selektiven zerstoeren einer permeablen membran.

Info

Publication number: CH651579A5
Application number: CH1574/82A
Authority: CH
Inventors: Franklin Lim
Original assignee: Damon Biotech Inc
Priority date: 1981-03-13
Filing date: 1982-03-12
Publication date: 1985-09-30
Also published as: GB2094750A; JPS6152737B2; SE454181B; IT8220139A0; NO158284B; BE892477A; NO158284C; CA1184518A; SE8201557L; JPS57197031A; FR2501528A1; IT1150681B; DE3209045A1; DK112382A; FR2501528B1; GB2094750B; DE3209045C2; NO820795L

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum selektiven Zerstören einer permeablen Membran, die eine Matrix aus a) mindestens einem ersten Polymer mit mehreren kationischen Gruppen und b) einem zweiten Polymer mit mehreren anionischen Gruppen und einer ersten Ladungsdichte aufweist, wobei das erste Polymer und das zweite Polymer durch Salzbrücken zwischen den anionischen und kationischen Gruppen verbunden sind, sowie die Anwendung dieses Verfahrens zum Zerstören einer permeablen Membran, die eine Mikrokapsel begrenzt, die eine lebende Zelle enthält.

Die US-Patentanmeldung Nr. 24 600, die am 28. März 1979 von F. Lim eingereicht wurde, offenbart ein Mikro-einkapselungsverfahren, das angewandt werden kann, um im wesentlichen jedes beliebige feste oder flüssige Material innerhalb von semipermeablen oder praktisch nicht permeablen Kapselmembranen einzukapseln. Ein hervorragender Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass die Bedingungen, unter denen die Kapselmembranen gebildet werden, keine toxischen oder denaturierenden Reagentien, extremen Temperaturen oder anderen Bedingungen, die lebende Zellen schädigen, umfassen. Das erfindungemässe Verfahren ist entsprechend gut geeignet für die Herstellung von mikroeingekapselten lebenden Materialien, die lebensfähig und in gesundem Zustand bleiben. Weil das Verfahren einen gewissen Grad der Steuerung der Permeabilität der Membran erlaubt, ist es nun möglich, Zellkulturen von prokaryotischem, eukaryotischem oder anderem Ursprung derart in Mikrokapseln einzukapseln, dass die Zellen der Kultur vor verunreinigenden Bakterien, hochmolekularen Immunoglobulinen und anderen potentiell schädlichen Faktoren geschützt sind und innerhalb eines Mikromilieus eingeschlossen bleiben, das sich gut für ihre fortgesetzte Lebensfähigkeit und fortlaufenden Stoffwechselfunktionen eignet. Wenn die Mikrokapseln in einem herkömmlichen Kulturmedium suspendiert werden, das genügt, um das Wachstum der betreffenden lebenden Zellen zu unterhalten, steht es den in Mikrokapseln eingekapselten Zellen frei, Substanzen aufzunehmen, die für den Stoffwechsel erforderlich sind und die durch die Membran diffundieren, und ihre Stoffwechselprodukte durch die Kapselmembran in das umgebende Medium auszuscheiden.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum selektiven Zerstören permeabler Membranen, die z.B. während des Mikroeinkapselungsverfahrens, das in der oben erwähnten US-Patentanmeldung dargelegt ist, synthetisiert werden, ohne dass irgendeine nachweisbare Schädigung des eingekapselten Kernmaterials eintritt. Das erfin-dungsgemässe Verfahren wird angewandt auf Membranen, die eine wasserunlösliche Matrix aufweisen, die aus mindestens zwei wasserlöslichen Komponenten gebildet ist: mindestens einem ersten Polymer, das mehrere kationische Gruppen aufweist (polykationisches Polymer, z.B. Polyäthy-lenamin); und einem zweiten Polymer mit mehreren anionischen Gruppen (polyanionisches Polymer, z.B. Natrium-alginatgummi). Die beiden Komponenten sind durch Salz5

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brücken zwischen den anionischen und kationischen Gruppen verbunden, um die Matrix zu bilden.

Das erfindungsgemässe Verfahren umfasst die folgenden Stufen: Man setzt Membranen des oben angegebenen Typs einer Lösung von Kationen, vorzugsweise einatomigen oder sehr niedermolekularen mehrwertigen Kationen, und mindestens einem zerstörenden Polymeren mit mehreren anionischen Gruppen aus. Vorzugsweise werden diese Lösungen miteinander gemischt. Die Ladungsdichte des zerstörenden Polymeren muss genügen, um die Salzbrücken zu zerstören, und sollte vorzugsweise gleich sein wie oder grösser als die Ladungsdichte des polyanionischen Polymeren der Membran. Man bringt die Lösung mit der Membran in Berührung, um die Kationen, z.B. Calcium oder Aluminium, mit dem polykationischen Polymeren um die anionischen Gruppen auf dem polyanionischen Polymeren konkurrieren zu lassen. Gleichzeitig konkurriert das zerstörende Polymer mit dem polyanionischen Polymeren um die kationischen Gruppen auf dem polykationischen Polymer. Dies führt zu einer «Erweichung» oder Öffnung» der Membranen. Um die Zerstörung zu Ende zu führen, werden die Kapseln, vorzugsweise nach einer Waschoperation, einem Sequestriermittel ausgesetzt, um mit dem polyanionischen Polymeren asoziierte Kationen zu sequestrieren. Die bevorzugten Sequestriermittel sind chelatbildende Mittel, wie Citrationen oder Äthylendiamintetraessigsäure-ionen. Wenn die Membranen, wie bei einer wichtigen Anwendung, lebensfähige Zellen einkapseln, wird es bevorzugt, das Sequestiermittel mit einer isotonischen Kochsalzlösung zu mischen.

Das zur Zeit bevorzugte Kation ist Calcium. Beispiele von zerstörenden Polymeren mit mehreren anionischen Gruppen, die in der gemischten Lösung verwendet werden, sind u.a. Polysulfonsäure oder (vorzugsweise) deren Salze, die entweder natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein können. Hervorragende Ergebnisse wurden bei Verwendung von Heparin, einem natürlichen Polymer, das mehrere Sulfonatgruppen enthält, erhalten. Polymere, die Poly-phosphorsäure- oder Polyacrylsäure-Salzgruppen enthalten, können ebenfalls verwendet werden. Das zur Zeit bevorzugte Sequestriermittel ist Natriumeitrat.

Die Erfindung ermöglicht auch die Freisetzung von lebensfähigen Zellen, die innerhalb eines Milieus schützend eingekapselt sind. Somit steht eine Art Verpackung zur Verfügung, die lebende Zellkulturen von beliebigem Ursprung in einem sterilen, stabilisierenden Milieu hält, in dem sie den normalen Stoffwechsel und sogar eine Mitose erfahren können und aus dem sie anschliessend freigesetzt werden können.

Die Erfindung ermöglicht somit innerhalb permeabler Membranen eingekapselte lebende Zellen durch selektive Zerstörung der Membranen freizusetzen. Weiter ermöglicht die Erfindung das selektive Zerstören von Membranen, und zwar ohne Schädigung von angrenzendem lebendem Gewebe, sowie das Freisetzen von eingekapselten feinzerteilten Materialien, Flüssigkeiten und Lösungen.

Das erfindungsgemässe Verfahren zum selektiven Zerstören von Membranen wird auf Membranen angewandt, die aus einer Matrix aus durch Salzbrücken verbundenen polykationischen Polymeren und polyanionischen Polymeren besteht. Gewöhnlich haben die Membranen eine sphä-roide Form, die ein Inneres, das eine eingekapselte Substanz enthält, begrenzen. Das Verfahren kann aber auch auf Membranen dieses Typs angewandt werden, die keine sphäroide Form haben.

Obgleich im wesentlichen jedes beliebige Material (das mit wässrigen Milieus verträglich ist) in flüssiger oder fester Form eingekapselt und anschliessend mittels des erfindungs-

gemässen Verfahrens freigesetzt werden kann, wird als wichtigste Anwendungsmöglichkeit zur Zeit das Vermögen angesehen, eingekapselte lebende Systeme, wie Zellkulturen, freizusetzen. Die Beschreibung wird in erster Linie auf eine Diskussion der Einkapselung und Freisetzung von Zellen gerichtet. Für den Fachmann ist es ohne Schwierigkeiten möglich, das Verfahren im Zusammenhang mit der Einkapselung von weniger empfindlichen Materialien abzuwandeln.

Das einzukapselnde Gewebe oder die einzukapselnden Zellen können in einem wässrigen Medium suspendiert werden, das für die Erhaltung und die Aufrechterhaltung des fortlaufenden Stoffwechselprozesses des betreffenden speziellen Zelltyps geeignet ist. Für diesen Zweck geeignete Medien sind dem Fachmann gut bekannt und können häufig im Handel erhalten werden. Der durchschnittliche Durchmesser der Zellmasse oder des einzukapselnden anderen Materials kann in grossem Umfang zwischen einigen Mikrometern und einem Millimeter oder mehr variieren. Lan-gerhans-Inseln aus Säugetieren haben zum Beispiel im typischen Falle einen Durchmesser von 50 bis 200 p.m. Gewebebruchstücke und einzelne Zellen, die Fibroblasten, Leukozyten, Lymphoblastoide, pankreatische ß- oder a-oder 5-Zellen, Langerhans-Inseln, Hepatozyten oder Zellen anderer Gewebe können nach Wunsch eingekapselt werden. Auch Mikroorganismen können eingekapselt werden, einschliesslich solcher, die durch rekombinierende DNS oder auf andere Weise genetisch modifiziert worden sind.

Die fortlaufende Lebensfähigkeit derartiger lebender Materialien hängt unter anderem von der Zugänglichkeit der erforderlichen Nährstoffe, von der Sauerstoffübertragung, von dem Fehlen von toxischen Substanzen in dem Medium und dem pH-Wert des Mediums ab. Bisher was es nicht möglich, ein derartiges lebendes Material in einem physiologisch verträglichen Milieu zu halten, während man es gleichzeitig einkapselte. Das Problem lag darin, dass die für die Membranbildung erforderlichen Bedingungen für das Gewebe tödlich oder schädlich waren; vor der Erfindung der oben genannten US-Patentanmeldung war kein Verfahren der Membranbildung bekannt, das es dem Gewebe ermöglichte, in gesundem Zustand zu überleben.

Es wurde nun gefunden, dass die oben erwähnten wasserlöslichen Polymere, die mit lebendem Gewebe physiologisch verträglich sind und unter Bildung einer formbeständigen, zusammenhängenden Masse wasserunlöslich gemacht werden können, zur Bildung einer «zeitweiligen» Kapsel oder Schutzsperrschicht um einzelne Zellen, Gruppen von Zellen oder Gewebe herum verwendet werden können. Eine solche Substanz kann, im typischen Falle in einer Konzentration in der Grössenordnung von 1 bis 2 Gew.-%, zu dem Kulturmedium des Gewebes zugesetzt werden. Die Lösung kann dann in Tröpfchen übergeführt werden, die das Gewebe zusammen mit seinem Erhaltungs- oder Wachstumsmedium enthalten, und kann sofort, mindestens in einer Oberflächenschicht, wasserunlöslich gemacht und geliert werden. Danach können die formbeständigen zeitweiligen Kapseln mit einer weniger zeitweiligen Membran versehen werden, die anschliessend erfindungsgemäss selektiv zerstört werden kann, um das eingekapselte Gewebe ohne Schädigung freizusetzen. Wenn es das zur Bildung der zeitweiligen Kapseln verwendete Material erlaubt, kann das Innere der Kapsel nach Bildung der permanenten Membran wieder verflüssigt werden. Dies erfolgt z.B. durch Wiederherstellung der Bedingungen in dem Medium, unter denen das Material löslich ist.

Das für die Bildung der zeitweiligen Kapseln verwendete Material kann ein beliebiges nicht toxisches, wasserlösliches Material sein, das durch eine Änderung des umgeben5

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den ionischen Milieus oder der Konzentration in eine formbeständige Masse übergeführt werden kann. Das Material weist ebenfalls mehrere, leicht ionisierbare anionische Gruppen, z.B. Carboxylgruppen, auf, die durch Salzbildungsbildung mit Polymeren, die mehrere kationische Gruppen enthalten, zu reagieren vermögen. Wie unten erläutert wird, ermöglicht ein Material dieses Typs die Abscheidung einer permanenten Membran mit einer vorgegebenen Permeabilität (einschliesslich einer solchen Permeabilität, dass die Membran für Molekulargewichte in der Grössenordnung von mehreren 100 000 Dalton nicht porös ist).

Das zur Zeit bevorzugte polyanionische Material für die Bildung der zeitweiligen Kapsel sind saure, wasserlösliche, natürliche oder synthetische Polysaccharidgummis. Viele derartige Materialien sind im Handel erhältlich. Sie werden im typischen Falle aus pflanzlichem Material extrahiert und werden häufig als Additive für verschiedene Nahrungsmittel verwendet. Natriumalginat ist das zur Zeit bevorzugte anionische Polymer. Alginate mit Molekulargewichten im Bereich von mehr als 150 000 Dalton können zwar verwendet werden, aber wegen ihrer molekularen Abmessungen vermögen sie gewöhnlich nicht durch die am Ende gebildeten Kapselmembranen hindurchzutreten. Um Kapseln . ohne eingeschlossenes flüssiges Alginat herzustellen, können Alginate mit niedrigerem Molekulargewicht, z.B. 40 000 bis 80 000 Dalton, verwendet werden. Das Alginat kann dann durch Diffusion durch eine Membran mit ausreichender Porosität leichter aus dem Inneren der Kapseln entfernt werden. Andere verwendbare polyanionische Gummis sind saure Fraktionen von Guargummi, Carrageenan, Pektin, Tragantgummi oder Xanthangummi.

Diese Materialien enthalten durch Glycosidbindungen verknüpfte Saccharidketten. Ihre freien Säuregruppen liegen häufig in der Alkalimetallsalzform, z.B. in der Natriumform, vor. Wenn ein mehrwertiges Ion, wie Calcium, Strontium oder Aluminium, gegen das Alkalimetallion ausgetauscht wird, werden die flüssigen, wasserlöslichen Poly-saccharidmoleküle unter Bildung.von wasserunlöslichen formbeständigen Gelen «vernetzt», die durch Entfernung der Ionen durch Ionenaustausch und mittels eines Sequestriermittels wieder löslich gemacht werden können. Obgleich im wesentlichen beliebige mehrwertige Ionen, die mit dem sauren Gummi ein Salz zu bilden vermögen, brauchbar sind, werden vorzugsweise physiologisch verträgliche Ionen, z.B. Calcium, verwendet. Dies trägt dazu bei, das Gewebe im lebenden Zustand zu halten. Andere mehrwertige Kationen können für weniger empfindliches Material verwendet werden. Magnesiumionen bewirken keine Gelierung von Natriumalginat.

Eine Lösung mit typischer Zusammensetzung umfasst gleiche Volumen einer Zellsuspension in ihrem Medium und einer 1- oder 2% igen Lösung von Gummi in physiologischer Kochsalzlösung. Bei Verwendung von Natriumalginat wurde eine 1,2- bis l,6%ige Lösung mit Erfolg verwendet.

In der nächsten Stufe des Einkapselungsprozesses kann die Gummilösung, die das Gewebe enthält, zu Tröpfchen mit einer gewünschten Grösse, die genügt, um die einzukapselnden Zellen zu umhüllen, verformt werden. Danach können die Tröpfchen sofort geliert werden, um formbeständige sphärische oder sphäroide Massen zu bilden. Die Tropfenbildung kann in bekannter Weise ausgeführt werden.

Man verfährt z.B. folgendermassen:

Ein Röhrchen, das eine wässrige Lösung von mehrwertigen Kationen, z.B. 1,5% ige Calciumchloridlösung, enthält, wird mit einem Stopfen versehen, der einen Tropfenbildungsapparat enthält. Der Apparat umfasst ein Gehäuse mit einer oberen Luftaufnahmedüse und einen langgestreckten hohlen Körper, der durch Reibungskräfte in dem

Stopfen befestigt ist. Eine 10 ml-Spritze, die mit einer Fortschaltpumpe versehen ist, wird oben auf das Gehäuse montiert, wobei zum Beispiel eine mit Teflon beschichtete Nadel mit 0,25 mm Innendurchmesser in Längsrichtung durch das Gehäuse hindurchreicht. Das Innere des Gehäuses ist so konstruiert, dass die Spitze der Nadel einen konstanten laminaren Luftstrom, der als Luftmesser wirkt, ausgesetzt ist. Beim Gebrauch ist die Spritze mit einer Lösung, die das einzukapselnde Material enthält, gefüllt und wird die Fortschaltpumpe betätigt, um in Inkrementen Tröpfchen aus der Spitze der Nadel zu pressen. Jeder Tropfen wird durch den Luftstrom «abgeschnitten» und fällt ungefähr 2,5 cm in die Calciumchloridlösung hinab, wo er durch Absorption von Calciumionen sofort geliert wird. Der Abstand zwischen der Spitze der Nadel und der Oberfläche der Calciumchloridlösung ist in diesem Falle genügend gross, um es zu ermöglichen, dass die Natriumalginat/Zell-Suspension die physikalisch günstigste Form, nämlich eine Kugelform (maximales Volumen für minimale Oberfläche) annimt. Die Luft innerhalb des Röhrchens tritt durch eine Öffnung im Stopfen aus. Dies führt zur «Vernetzung» des Gels und zur Bildung einer hochviskosen, formbeständigen schützenden zeitweiligen Kapsel, die das suspendierte Gewebe und sein Medium enthält. Die Kapseln sammeln sich in der Lösung als getrennte Phase an und werden durch Absaugen abgetrennt.

In der nächsten Stufe des Einkapselungsprozesses kann durch Vernetzung von Oberflächenschichten eine Membran um die Oberfläche der zeitweiligen Kapseln herum abgeschieden werden. Dies erfolgt, wenn man die zeitweiligen Kapseln, die Polyanionen enthalten, einer wässrigen Lösung eines Polymeren aussetzt, das kationische Gruppen enthält, die mit den anionischen funktionellen Gruppen in dem polyanionischen Polymer reaktionsfähig sind. Polymere, die reaktionsfähige kationische Gruppen, wie freie Amin-gruppen oder Kombinationen von Amin- und Imingruppen, enthalten, werden bevorzugt. In dieser Situation wird der Polysaccharidgummi durch Wechselwirkung (Salzbindungsbildung) zwischen den Carboxylgruppen und den Amin- bzw. Imingruppen des polykationischen Polymeren vernetzt. Vorteilhafterweise kann die Permeabilität innerhalb gewisser Grenzen gesteuert werden, indem man das Molekulargewicht des verwendeten vernetzenden Polymeren auswählt und die Einwirkungszeit und die Konzentration des Polymeren in der Lösung variiert. Eine Lösung von Polymer mit niedrigem Molekulargewicht dringt innerhalb eines gegebenen Zeitraums weiter in die zeitweiligen Kapseln ein als ein hochmolekulares Polymer. Der Grad des Eindringens des vernetzenden Polymeren wurde mit der resultierenden Permeabilität ins Verhältnis gesetzt. Im allgemeinen ist die Porengrösse umso grösser, je höher das Molekulargewicht und je geringer die Eindringung ist. Längere Einwirkungszeiten und konzentriertere Polymerlösungen neigen dazu, die Obergrenze der Permeabilität der Membran herabzusetzen. Jedoch ist das durchschnittliche Molekulargewicht des Polymeren der wichtigste Faktor. Allgemein können Polymere mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 100 000 Dalton oder mehr verwendet werden, und zwar in Abhängigkeit von der Reaktionsdauer, der Konzentration der Polymerlösung und dem gewünschten Grad der Permeabilität. Eine erfolgreiche Kombination von Reaktionsbedingungen bei Verwendung von Polylysin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von ca. 35 000 Dalton umfasste die Reaktion während 3 Minuten unter Rühren einer physiologischen Kochsalzlösung, die 0,0167% Polylysin enthielt. Dies führt zu Membranen mit einer Obergrenze der Permeabilität von ca. 100 000 Dalton. Im allgemeinen bilden höhermolekulare Materialien Membranen,

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die sich im Vergleich zu niedrigermolekularen Materialien schwerer zerstören lassen. Die Ladungsdichte des vernetzenden polykationischen Polymeren beeinflusst auch die Poren-grösse und die Leichtigkeit der Zerstörung der Membran. Im allgemeinen bilden Materialien mit höherer Ladungsdichte weniger poröse Membranen, die sich schwerer zer-v stören lassen. Die optimalen Reaktionsbedingungen, die fur die Steuerung der Permeabilität in einem gegebenen System geeignet sind, können im Hinblick auf die vorstehenden Richtlinien leicht empirisch festgelegt werden.

Beispiele von geeigneten vernetzenden Polymeren sind Proteine und Polypeptide, die entweder natürlich oder synthetisch sein können und freie Aminogruppen oder Kombinationen von Amino- und Iminogruppen aufweisen, Poly-äthylenamine, Polyäthylenimine und Polyvinylamine. Polylysin, sowohl in der D- als auch in der L-Form, wurde mit Erfolg verwendet. Auch Proteine, wie Polyarginin, Polyci-trullin oder Polyornithin, sind verwendbar. Polymere mit einer positiven Ladungsdichte im höheren Bereich (z.B. Po-lyvinylamin) haften stark an den anionischen Gruppen der polyanionischen Moleküle und lassen sich schwerer zerstören.

An diesem Punkt des Einkapselungsverfahrens können Kapseln gesammelt werden, die eine «permanente» semipermeable Membran aufweisen, die eine gelierte Lösung von Gummi, mit dem Zelltyp verträgliches Kulturmedium und die Zellen umgibt. Wenn man lediglich bezweckt, die Zellen in einem schützenden Medium zu konservieren, brauchen keine weiteren Schritte unternommen zu werden.

Wenn aber die Massenübertragung innerhalb der Kapseln und durch die Membranen hindurch begünstigt werden soll, wird das Gel vorzugsweise wieder zu seiner wasserlöslichen Form verflüssigt. Dies kann geschehen, indem man die Bedingungen, unter denen das Gummi flüssig ist, wiederherstellt, z.B. indem man das Calcium oder die anderen mehrwertigen Kationen aus dem Gel entfernt. Das Medium in der Kapsel kann einfach wieder löslich gemacht werden, indem man die Kapseln in mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung eintaucht, die Alkalimetallionen und Wasserstoffionen enthält. Die einwertigen Ionen tauschen sich gegen die Calciumionen oder anderen mehrwertigen Ionen innerhalb des Gummis aus, wenn die Kapseln unter Rühren in die Lösung eingetaucht werden. Natriumcitratlösungen können für den gleichen Zweck verwendet werden und dienen dazu, die mehrwertigen Ionen zu sequestrieren. Gummimoleküle mit einem Molekulargewicht unterhalb der Obergrenze der Permeabilität der Membranen können anschliessend durch Diffusion aus dem Inneren der Kapseln entfernt werden.

Schliesslich kann es erwünscht sein, die Kapseln so zu behandeln, dass freie Aminogruppen oder dergleichen, die andernfalls den Kapseln eine Neigung zum Verklumpen verleihen könnten, zu verknüpfen. Dies kann beispielsweise erfolgen, indem man die Kapseln in eine verdünnte Lösung von Natriumalginat eintaucht.

Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, dass keine scharfen Reagentien, extremen Temperaturen oder anderen Bedingungen, die für die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen schädlich sind, in dem Membranbildungspro-zess angewandt zu werden brauchen. Somit können sogar empfindliche Zellen, wie Hepatozyten, Leukozyten, Fibroblasten, Lymphoblasten und Zellen aus verschiedenen endokrinen Geweben von Menschen oder Säugetieren, ohne Schwierigkeiten eingekapselt werden. Natürlich können auch Zellen von mikrobiellem Ursprung, wie Hefen, Schimmelpilze und Bakterien, die besser dafür ausgerüstet sind, in feindlichen Milieus zu überleben, sowie inerte Reagentien,

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Feststoffe oder biologisch aktive Materialien ohne Schädigung eingekapselt werden.

Eingekapselte Zellen des oben beschriebenen Typs können zur Aufbewahrung oder Züchtung in Erhaltungsmedien oder Wachstumsmedien suspendiert werden und bleiben frei von bakteriellen Infektionen. Wenn Zellen, die in vitro eine Mitose erfahren, in einem Züchtungsmedium suspendiert sind, erfahren sie auch eine Mitose in den Kapseln. Der normale in vitro-Stoffwechsel läuft weiter ab, sofern die für die Stoffwechselprozesse erforderlichen Faktoren ein so niedriges Molekulargewicht haben, dass sie die Kapselmembran durchdringen können, oder wenn sie zusammen mit den Zellen eingekapselt werden. Stoffwechselprodukte der Zellen durchdringen die Membran und sammeln sich in dem Medium an, wenn sie ein Molekulargewicht unterhalb der oberen Grenze der Permeabilität haben. Die Zellen können in eingekapselter Form nach Wunsch aufbewahrt, transportiert oder gezüchtet werden und können ohne Schädigung mittels des nachstehend beschriebenen Verfahrens zum selektiven Zerstören der Membranen aus ihrem schützenden Milieu freigesetzt werden.

Erfindungsgemäss wird das eingekapselte Material mittels eines zweistufigen Verfahrens unter Verwendung im Handel erhältlicher Reagentien mit Eigenschaften, die die eingekapselten Zellen nicht in nachteiliger Weise beeinflussen, freigesetzt.

Man verfährt z.B. folgendermassen:

Zuerst werden die Kapseln von ihrem Suspendiermedium abgetrennt, gründlich gewaschen, um alle etwaigen Verunreinigungen zu entfernen, und dann unter Rühren in getrennten Lösungen oder vorzugsweise in einer gemischten Lösung von Kationen, wie Calciumionen oder anderen einatomigen oder niedermolekularen mehrwertigen Kationen, und einem zerstörenden Polymer mit mehreren anionischen Resten, wie Polysulfonsäuregruppen, dispergiert. Polymere, die Polyphosphorsäure- oder Polyacrylsäurereste enthalten, können ebenfalls verwendet werden. Heparin, ein natürliches, sulfoniertes Polysaccharid, wird zum Zerstören der Zellen enthaltenden Membranen bevorzugt. Die Ladungsdichte des zerstörenden Polymeren muss genügen, um die Salzbrücken zu zerstören. Somit kann die anionische Ladungsdichte gleich wie oder vorzugsweise grösser als die Ladungsdichte des inneren polyanionischen Polymeren (z.B. des Gummis) sein, das ursprünglich für die Bildung der Membranen verwendet wurde. Das Molekulargewicht des zerstörenden Polymeren sollte mindestens vergleichbar mit und vorzugsweise grösser als das Molekulargewicht des inneren polykationischen Polymeren sein, das bei der Bildung der Membran verwendet wurde. Innerhalb der Suspension konkurrieren die Calciumionen mit dem inneren polykationischen Polymeren, das die Membran bildet, um anionische Gruppen auf dem polyanionischen Polymeren. Gleichzeitig konkurriert das zerstörende Polymer, das in der Lösung gelöst ist, mit dem polyanionischen Gummi in der Membran um kationische Gruppen auf dem polykationischen Polymer. Dies führt zu einem in Wasser dispergier-baren oder vorzugsweise wasserlöslichen Komplex von zum Beispiel Polylysin und dem polyanionischen Polymeren und zur Assoziierung der Kationen mit den Gelmolekülen.

Durch diese Operation wird die Membran geeignet für die anschliessende Einwirkung eines Sequestriermittels, das den Zerstörungsprozess zu Ende führt, indem es 2- oder 3-wertige Ionen aus dem Gel sequestriert. Im typischen Falle können Rückstände der Kapselmembran, die in dem Medium verbleiben, falls vorhanden, leicht von den Zellen getrennt werden.

Die zur Zeit bevorzugte Lösung für die erste Stufe des selektiven Zerstörungsprozesses umfasst l,l%iges (Gew./

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Vol.) Calciumchlorid und 500 bis 1500 Einheiten Heparin pro ml Lösung. Ein Volumen von Mikrokapseln, das genügt, um zwischen ca. 20 und 30% des Gesamtvolumens der Suspension zu bilden, wird zu dieser Lösung zugesetzt. Calciumchlorid und Heparin werden bevorzugt, wenn Membranen von Zellen enthaltenden Kapseln zerstört werden, da beide Reagentien mit den meisten Zellen physiologisch verträglich sind und die Möglichkeit der Zellschädigung minimieren. Gemische von Aluminiumsalzen und Salzen anderer mehrwertiger Kationen (aber keine Magnesiumionen) können ebenfalls zusammen mit dem Polysulfonsäure- oder anderen Säuresalz des oben erläuterten Typs verwendet werden.

Im allgemeinen können die Konzentrationen der Ionen und des anionischen Polymeren in der in dieser Stufe verwendeten Lösung innerhalb weiter Grenzen schwanken. Die optimalen Konzentrationen können leicht empirisch festgestellt werden. Die niedrigste wirksame Konzentration für einen speziellen Ansatz von eingekapselten Zellen wird bevorzugt.

Das zur Zeit bevorzugte Sequestriermittel zur Ausführung der selektiven Zerstörung ist Natriumeitrat, obgleich auch andere Alkalimetallcitrate und Alkalimetallsalze der Äthylendiamintetraessigsäure verwendet werden können. Wenn Natriumeitrat verwendet wird, liegt die optimale Konzentration in der Grössenordnung von 55 mMol pro Liter. Wenn die Kapselmembranen, die zerstört werden, lebensfähiges Gewebe enthalten, wird das Citrat vorzugsweise in isotonischer Kochsalzlösung gelöst, um die Zellschädigung zu minimieren.

Die Beispiele 5 bis 8 erläutern die Erfindimg. Die Beispiele 1 bis 4 beziehen sich auf die durch die Erfindung nicht beanspruchte Kapselbildung und die Beispiele 5 bis 8 auf die erfindungsgemässe Zerstörung der Membranen.

Beispiel 1 Einkapselung von Pankreasgewebe

Langerhans-Inseln werden aus Rattenpankreas erhalten und in einer Konzentration von annäherungsweise 103 Inseln pro Milliliter zu einem kompletten Gewebekulturmedium (CMRL-1969, Connaught Laboratories, Toronto, Canada) gegeben. Die Gewebekultur enthält alle Nährstoffe, die für die fortgesetzte Lebensfähigkeit der Inseln erforderlich sind, sowie die Amiriosäuren, die von den Zellen zur Herstellung von Hormonen verwendet werden. 0,4 ml einer Inselsuspension, die annäherungsweise 103 Inseln pro Milliliter enthält, werden dann zu 0,5 ml einer l,2%igen Lösung von Natriumalginat (Sigma Chemical Company) in physiologischer Kochsalzlösung hinzugefügt.

Dann wird eine 1,5% ige Calciumchloridlösung verwendet, um Tröpfchen mit einem Durchmesser in der Grössenordnung von 300 bis 400 [im zu gelieren. Nachdem die überstehende Lösung durch Absaugen entfernt worden ist, werden die gelierten Tröpfchen in ein Becherglas übergeführt, das 15 ml einer Lösung enthält, die 1 Teil einer 2%igen 2-(Cyclohexylamino)-äthansulfonsäure-Pufferlösung in 0,6 %iger Kochsalzlösung (isotonisch, pH = 8,2), verdünnt mit 20 Teilen 1 %igem Calciumchlorid, enthält. Nach 3mi-nütigem Eintauchen werden die Kapseln zweimal mit 1 %-igem Calciumchlorid gewaschen.

Die Kapseln werden dann in 32 ml einer Lösung von 1 Teil 1 %igem Polylysin (durchschnittliches Molekulargewicht 35 000 Atommasseneinheiten) in 80 Teilen physiologischer Kochsalzlösung übergeführt. Nach 3 Minuten wird die Polylysinlösung dekantiert. Die Kapseln werden mit l%igem Calciumchlorid gewaschen und gegebenenfalls nochmals 3 Minuten lang in einer Lösung von Polyäthylen-

imin (Molekulargewicht 40 000 bis 60 000) suspendiert, die durch Verdünnung einer 3,3%igen Polyäthylenimin-Vorratslösung in Morpholinopropansulfonsäurepuffer (0,2 molar, pH = 6) mit so viel l%igem Calciumchlorid, dass 5 sich eine Endpolymerkonzentration von 0,12% ergibt, hergestellt wurde. Die resultierenden Kapseln mit «permanenten» semipermeablen Membranen werden dann zweimal mit l%igem Calciumchlorid und zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und mit 10 ml 0,12%iger io Alginsäurelösung gemischt.

Die Kapseln klumpen nicht zusammen, und bei vielen kann man feststellen, dass sie Langerhans-Inseln enthalten. Das Gel an der Innenseite der Kapseln wird wieder verflüssigt, indem man die Kapseln 5 Minuten lang in ein Geis misch aus Kochsalzlösung und Citratpuffer (pH = 7,4) eintaucht. Schliesslich werden die Kapseln im CMLR-69-Me-dium eingetaucht.

Unter dem Mikroskop stellt man fest, dass die Kapseln eine dünne Membran aufweisen, die eine Insel einschliesst, 20 in der einzelne Zellen sichtbar sind. Moleküle mit einem Molekulargewicht bis ca. 100 000 können die Membranen durchqueren. Dies ermöglicht es, dass Sauerstoff, Aminosäuren, Nährstoffe und Plasmakomponenten, die in Kulturmedien verwendet werden (z.B. die niedermolekularen Kom-25 ponenten von fötalem Kälberserum), die Insel erreichen und dass Insulin ausgeschieden wird.

Beispiel 2 Einkapselung von Hepatozyten

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Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei aber 0,5 ml einer Leberzellensuspension, die ca. 105 Zellen pro ml enthält, anstelle der 0,4 ml Inselsuspension verwendet werden. Die fortlaufende Lebensfähigkeit der Le-35 berzellen wurde durch die Farbstoffausschlussmethode (Trypanblau-Ausschluss) und durch ihre beobachtete Fähigkeit, kontinuierlich Harnstoff zu erzeugen, bewiesen. Es ist bekannt, dass Lebergewebe in vitro Toxine aus seiner Umgebung aufnehmen kann. Dementsprechend werden 40 Toxine, deren Molekulargewicht so niedrig ist, dass sie durch die semipermeablen Membranen hindurchtreten,

durch die Zellen entgiftet.

Beispiel 3

45 Einkapselung von Aktivkohle

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei aber feinteilige Aktivkohle direkt in der Natriumalginatlö-sung suspendiert wird, die halbe ml Gewebesuspension so weggelassen wird und Polylysin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 35 000 als Vernetzer verwendet wird. Solange die Kohlepartikel kleiner sind als der kleinste Innendurchmesser der Kapillare, die zur Erzeugung der Tröpfchen verwendet wird, wird Aktivkohle mit 55 hoher spezifischer Oberfläche, die von einer semipermeablen Membran umgeben ist, erhalten. Diese Membranen verhindern wirksam das Entweichen von Aktivkohlestückchen oder -staub, können aber trotzdem verwendet werden, um Materialien mit jedem beliebigen vorgegebenen Mole-60 kulargewichtbereich aus durch die Kapseln geleiteter Flüssigkeit zu absorbieren.

Beispiel 4

Einkapselung von menschlichen Fibroblasten

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Menschliche Fibroblasten, die erhalten wurden durch Behandlung von menschlichem Vorhautgewebe mit Trypsin und Äthylendiamintetraessigsäure während 5 Minuten bei

37°C in bekannter Weise, werden in einem kompletten Wachstumsmedium (CMLR-1969, Connaught Laboratories), ergänzt mit 40 Vol.-% gereinigtem fötalem Kälberserum, 0,8% Natriumalginat (Sigma) und 200 mg /ml gereinigtem Kälberhautkollagen, suspendiert. Die Zelldichte der Suspension beträgt ca. 1,5 X 107 Zellen pro ml. Zeitweilige Algi-natkapseln werden wie oben angegeben gebildet. In Oberflächenschichten der Kapseln werden semipermeable Membranen abgeschieden, indem man die Kapseln in einer 0,005% igen (Gew./Vol.) wässrigen Lösung von Poly-L-Ly-sin (Molekulargewicht 43 000 Dalton) 3 Minuten lang suspendiert.

Die resultierenden Kapseln werden in CMLR-1969, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt ist, suspendiert. Die vorstehenden Stufen werden alle bei 37°C ausgeführt. Nach Bebrütung bei der gleichen Temperatur findet man bei Untersuchung der Kapseln unter dem Mikroskop, dass sie Fi-brolasten enthalten, die innerhalb der Mikrokapseln eine Mitose erfahren haben und eine dreidimensionale fibroblastische Morphologie zeigen.

Beispiel 5

Mikrokapseln aus einem der Beispiele 1 bis 4 können folgendermassen behandelt werden, um die Kapselmembranen ohne Schädigung des eingekapselten Kernmaterials selektiv zu zerstören.

Man lässt Portionen von 10 ml der Mikrokapselsuspen-sionen, die ca. 500 bis 5000 Kapseln pro ml enthalten,

sich absetzen und saugt das Suspensionsmedium ab. Die Kapseln werden zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschenen Kapseln werden dann mit einem aliquoten Teil von 3,0 ml Kochsalzlösung gemischt, die Heparin in verschiedenen Konzentrationen, die weiter unten angegeben werden, und 1,1% (Gew. /Vol.) Calciumchlorid enthalten. Nach der Ausführung dieser Stufe zeigen Kapseln, in denen Alginat eingeschlossen ist, einen gelierten, formbeständigen inneren Kern. Die Suspension wird 10 Minuten lang bei 37°C gerührt, wonach man die Kapseln sich absetzen lässt, die überstehende Flüssigkeit absaugt und die Kapseln zweimal mit 3,0 ml 0,15-molarem Natriumchlorid wäscht. Nach dem Absaugen der zweiten Waschlösung werden die Kapseln mit 2,0 ml einer gemischten Lösung gemischt, die gleiche Volumen 110-mmolares Na-triumcitrat und 0,15-molares Natriumchlorid enthalten (pH = 7,4).

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Kapselmembranen, die mit 1000 Einheiten Heparin pro ml behandelt und in der Natriumchlorid-Natriumcitrat-Lösung 1 Minute lang verwirbelt worden waren, waren vollständig zerfallen. Das gleiche Ergebnis wird mit Kapseln erzielt, die mit 2 000 Einheiten Heparin pro ml 2 Minuten lang behandelt und dann 15 bis 30 Sekunden lang mit der Hand verwirbelt worden sind. Niedrigere Heparin-konzentrationen werden bevorzugt, da die Möglichkeit der Zellschädigung abnimmt.

Nach der Auflösung der Membranen können alle etwa vorhandenen Membranbruchstücke durch Absaugen und Waschen entfernt werden. Nachdem die freigesetzten Zellen wieder in Kulturmedium suspendiert worden sind, können sie mittels der Tryptanblau-Ausschlussmethode getestet werden, wobei man feststellt, dass sie in einem gesunden, lebensfähigen Zustand vorliegen, wobei verhältnismässig wenige Zellen Farbstoffaufnahme zeigen.

Beispiel 6

Gemäss Beispiel 3 hergestellte Kapseln werden nach dem Waschen 6 Minuten lang unter Rühren mit 3,0 ml einer Lösung, die 1000 Einheiten Heparin pro ml und 1,0% Aluminiumchlorid enthält, behandelt. Nach dem Absaugen der überstehenden Flüssigkeit wird das Kernmaterial freigesetzt, indem man die Kapseln 30 bis 90 Sekunden lang mit einer 0,1-molaren Lösung von Natriumeitrat verwirbelt.

Beispiel 7

Die Verfahrensweise von Beispiel 6 wird wiederholt, wobei aber 0,10-molares Äthylendiamintetraessigsäure-natrium-salz mit einem pH-Wert von 7,0 anstelle des Natriumeitrats verwendet wird, wobei eine schnelle Zerstörung der Kapselmembranen resultiert.

Beispiel 8

Gemäss Beispiel 3 hergestellte Kapseln werdennach dem Waschen mit 3,0 ml einer wässrigen Lösung behandelt, die 10 mg Polyvinylsulfat (Molekulargewicht annähernd 50 000 Dalton) pro ml und 1 % Calciumchlorid enthält. Die Nachbehandlung mit 0,10-molarem Natriumeitrat führt zu einer praktisch vollständigen Auflösung der Kapseln.

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Claims

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1. Verfahren zum selektiven Zerstören einer permeablen Membran, die eine Matrix aus mindestens einem ersten Polymer mit mehreren kationischen Gruppen und einem zweiten Polymer mit mehreren anionischen Gruppen und einer ersten Ladungsdichte aufweist, wobei das erste Polymer und das zweite Polymer durch Salzbrücken zwischen den anionischen und kationischen Gruppen verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass man

A. die Membran einer Lösung von Kationen und mindestens einem zerstörenden Polymer mit mehreren anioni-schen Gruppen aussetzt, wobei das zerstörende Polymer eine Ladungsdichte hat, die genügt, um die Salzbrücken zu zerstören;

B. die Kationen mit dem ersten Polymer um die anionischen Gruppen auf den zweiten Polymer konkurrieren lässt und das zerstörende Polymer mit dem zweiten Polymer um die kationischen Gruppen auf dem ersten Polymer konkurrieren lässt; und

C. mit dem zweiten Polymer assoziierte Kationen nach der Stufe B sequestriert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Sequestrierungsstufe (C) ausführt, indem man die Membranen einer Lösung aussetzt, die ein chelatbil-dendes Mittel, das vorzugsweise aus Citrationen und Äthy-lendiamintetraessigsäureionen gewählt ist, enthält.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Polymer mehrere Aminogruppen enthält.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Polymer ein saurer wasserlöslicher Gummi, vorzugsweise ein Alginat, ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als zerstörendes Polymer Heparin und als Kationen Calciumionen verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Polymer ein solches ausgewählt aus der Gruppe a) Proteine, die mehrere Aminosäureeinheiten mit freien Aminogruppen aufweisen;

b) Proteine, die mehrere Aminosäureeinheiten mit freien Iminogruppen aufweisen;

c) Polypeptide, die mehrere Aminosäureeinheiten mit freien Aminogruppen aufweisen;

d) Polypeptide, die mehrere Aminosäureeinheiten mit freien Iminogruppen aufweisen;

e) Polyvinylamine;

f) Polyäthylenimine;

g) Polyäthylenamine; und h) Gemische davon;

ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das zerstörende Polymer wählt aus a) Polysulfonsäuren;

b) Polyphosphorsäuren;

c) Salzen davon, vorzugsweise Polysulfonsäuresalzen;

und d) Gemischen davon.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Ladungsdichte des zerstörenden Polymers mit mehreren anionischen Gruppen grösser ist als die erste Ladungsdichte.

9. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Zerstören einer permeablen Membran, die eine Mikrokapsel begrenzt, die eine lebende Zelle enthält.

10. Anwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Polymer ein Protein und das zweite Polymer ein wasserlöslicher Gummi, insbesondere ein Na-triumalginat, ist und dass man als Kationen Calciumionen und als zerstörendes Polymer mit mehreren anionischen Gruppen Heparin verwendet, wobei man die Sequestrierungsstufe vorzugsweise mit einer Lösung von Citrat in einer mit der Zelle physiologisch verträglichen Lösung ausführt.