DE3852996T2

DE3852996T2 - Immunoassayverfahren zum Nachweis von Antigenen.

Info

Publication number: DE3852996T2
Application number: DE3852996T
Authority: DE
Inventors: Thomas Michael Houts; Gary Lee Milburn; Judith Rabbie
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1987-12-21
Filing date: 1988-12-20
Publication date: 1995-06-01
Anticipated expiration: 2008-12-21
Also published as: CA1336675C; EP0325045A2; EP0325045B1; US4959303A; JP2892662B2; EP0325045A3; ATE118275T1; JPH02138869A; ES2067480T3; DE3852996D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Antigens in einer biologischen Probe, von der angenommen wird, daß sie das Antigen enthält. Die Erfindung findet insbesondere Anwendung beim Nachweis von gramnegativen Bakterien in einer klinischen Probe.
Zum Nachweis von Antigenen in einer Probe, z.B. einem biologischen Fluid, d.h. Blut, Urin, Zellkulturen, sind zahlreiche Verfahren bekannt. Die Möglichkeit, schnell und genau die Anwesenheit von Antigenen wie gramnegativen Bakterien, d.h. Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci und Neisseria gonorrhoeae, nachzuweisen, ist aufgrund der Vorherrschaft von Krankheiten, die mit solchen Bakterien assoziiert sind, von großer Bedeutung. Viele der Techniken, die zum Nachweis von Antigenen eingesetzt werden, beinhalten Zellkultur-Verfahren. Solche Verfahren sind relativ zeitraubend und kompliziert und die Ergebnisse hängen in großem Umfang vom Geschick des Technikers ab. Viele andere Techniken, z.B. Elektrophorese, erfordern komplizierte und/oder teure Instrumente, die nicht leicht verfügbar sind.
Viele der Nachweisverfahren beinhalten Immunoassays. Einige dieser Verfahren beinhalten den Nachweis von Antikörpern für das interessierende Antigen. Solche indirekte Verfahren neigen dazu ungenau zu sein, da Antikörper häufig im menschlichen Körper verbleiben, nachdem die Krankheit geheilt wurde. Deshalb ist es vorzuziehen, Antigene statt Antikörper nachzuweisen. Immunoassay-Verfahren zum Nachweis von Antigenen beinhalten oft Enzym-Immunoassays, z.B. den Enzym-verknüpften Immunosorbens-Assay, der allgemein als ELISA bezeichnet wird. Solche Assays beinhalten typischerweise, daß das interessierende Antigen nachgewiesen wird, indem eine freiliegende feste Oberfläche oder eine Oberfläche, die vorher mit einem Protein wie z.B. einem Antikörper beschichtet worden ist, beschichtet wird. Nach der Beschichtung der Oberfläche des Trägers mit dem Antigen wird die Oberfläche gewaschen, um ungebundenes Antigen zu entfernen. Danach wird das Antigen auf der Oberfläche mit einem Antikörper für das Antigen in Kontakt gebracht, der markiert ist oder imstande ist, markiert zu werden. Die Oberfläche wird erneut gewaschen und der Antikörper, der an die Oberfläche des Trägers gebunden hat, wird durch den Nachweis der Markierung nachgewiesen.
Die Anzahl an Waschschritten, die im obigen Verfahren erforderlich ist, trägt erheblich zur Zeitdauer und Aufwendigkeit des Verfahrens bei. Es besteht deshalb ein Bedürfnis für ein Verfahren zum Nachweis von Antigenen, insbesondere von Antigenen von gramnegativen Bakterien, das schneller, verläßlicher und kosteneffektiver ist, als die bisher bekannten oder verfügbaren Tests. Es ist gleichermaßen wichtig, daß ein solcher Test weniger Aufwand erfordert als die gegenwärtig verfügbaren Tests.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Ein Verfahren zur Bestimmung von Chlamydia trachomatis- Antigen in einer klinischen Probe ist im U.S.-Patent Nr. 4,497,899 beschrieben. Das beschriebene Verfahren beinhaltet das Lysieren von Chlamydia-Zellen in der Probe, um das Antigen freizusetzen; das Beschichten eines freiliegenden festen Trägers mit dem Zell-Lysat; Trennen des beschichteten Trägers von der Probe; Behandlung des abgetrennten Trägers mit Antikörper, um einen Antigen-Chlamydia-Antikörper-Komplex auf dem Träger zu bilden; Trennen des Komplexes von ungebundenem Antikörper; Behandlung des gebundenen Komplexes mit markiertem Antiglobulin, um einen Antigen-Antikörper-markiertes Antiglobulin-Komplex auf dem Träger zu bilden; Trennen des letzteren Komplexes von ungebundenem markiertem Antiglobulin; und Bestimmung des gebundenen markierten Antiglobulins als Maß für das Antigen in der Probe. Das U.S.-Patent Nr. 4,497,900 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Neisseria gonorrhoeae, das analog zu dem des U.S.-Patents Nr. 4,497,899 ist.
Ein indirektes Verfahren zur Bestimmung eines Antigens in einer flüssigen Probe wird im U.S.-Patent Nr. 4,067,959 beschrieben, welches das Adsorbieren von Antigen desselben immunologischen Typs wie das Probenantigen auf einer festen Trägeroberfläche und das Umsetzen einer bekannten Menge spezifisch markierten Antikörpers in Lösung mit dem Probenantigen und mit dem adsorbierten Antigen umfaßt. Der markierte Antikörper liegt im Überschuß vor, so daß ein Teil des markierten Antikörpers in der Lösung an das Probenantigen gebunden ist und überschüssiger markiert er Antikörper mit dem adsorbierten Antigen auf der Oberfläche immunologisch reagiert. Die Oberfläche wird gewaschen und dann die Menge des reagierten markierten Antikörpers auf der Oberfläche als Maß für das Antigen in der Probe bestimmt.
Ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit einer Chlamydia- Infektion, welches die Erzeugung von Antikörpern gegen das Hauptaußenmembranprotein von Chlamydia trachomatis beinhaltet, ist im U.S.-Patent Nr. 4,427,782 offenbart. Das Verfahren umfaßt, daß eine Probe, von der man annimmt, daß sie eine Chlamydia-Infektion enthält, behandelt wird, um das äußere Zellmembranprotein von Chlamydia zu solubilisieren, die erzeugten Antikörper mit der solubilisierten Probe in Kontakt gebracht und die Reaktion zwischen den Antikörpern und der solubilisierten Probe bestimmt wird. Die europäische Patentanmeldung 0 174 106 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Zellmembranprotein, insbesondere dem Hauptaußenmembranprotein von Chlamydia trachomatis. Die britische Patentanmeldung Nr. 2 047 889A offenbart serologische Tests auf Chlamydia trachomatis-Antikörper durch Mikroimmunfluoreszenz unter Verwendung eines Formaldehyd-stabilisierten Antigens.
Die U.S.-Patente Nr. 4,145,406 und 4,254,082 offenbaren ein Verfahren zur Bestimmung einer spezifisch bindenden Substanz in einer flüssigen Probe, unter Einsatz eines nicht spezifischen Adsorbens und einer markierten Form eines spezifischen Bindungspartners für die zu bestimmende Substanz. Das U.S.- Patent Nr. 4,188,371 offenbart ein Verfahren unter Einsatz immunoradiometrischer Assay-Techniken zum Nachweis von Neisseria-Bakterien in einer Probe. Das Verfahren beinhaltet das Lysieren von Bakterien in der zu testenden Probe; das Inkontaktbringen des Lysats mit radiomarkierten Antiseren; Inkubieren der resultierenden Mischung und dann Inkontaktbringen der Mischung mit einem Antigen in fester Phase oder einem Antigen- Immunoadsorbens; Inkubieren der resultierenden Mischung und dann Überprüfung der Radioaktivität des Überstands.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung betrifft den Nachweis eines Antigens in einer biologischen Probe, von der angenommen wird, daß sie das Antigen enthält. Das Verfahren beinhaltet das Bereitstellen in Kombination von einem festen Träger, der hydrophob oder positiv geladen und im wesentlichen frei von Proteinen ist, Bindungspartnern, die für das Antigen spezifisch sind, Bindungspartnern, die für einen Antikörper spezifisch sind, der für die Antigene spezifisch ist, und Bindungspartnern, die für einen Immunkomplex des Antigens und Antikörpers spezifisch sind, und einem Medium, das ein Antigen aus der Probe und einen Antikörper für das Antigen enthält. Die Kombination wird unter ausreichenden Bedingungen inkubiert, um den Antikörper an den Träger zu binden, wenn er an das Antigen gebunden ist. Die Anwesenheit oder Menge des Antikörpers auf dem Träger oder in dem Medium wird bestimmt und steht im Verhältnis zur Anwesenheit oder Menge des Antigens in der Probe.
Das erfindungsgemäße Verfahren findet insbesondere beim Assay von gramnegativen Bakterien Anwendung. Von besonderem Interesse sind Assays für Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Neisseria gonorrhoeae und Treponema pallidium.

BESCHREIBUNG SPEZIELLER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Antigens in einer biologischen Probe. Das Verfahren beinhaltet die Bereitstellung in Kombination von einem festen Träger, der hydrophob oder positiv geladen ist und im wesentlichen frei von Proteinen ist, Bindungspartnern, die für das Antigen spezifisch sind, Bindungspartnern, die für einen Antikörper spezifisch sind, der für die Antigene spezifisch ist, und Bindungspartnern, die für einen Immunkomplex des Antigens und Antikörpers spezifisch sind, und einem Medium, das Antigen aus der Probe und einen Antikörper für das Antigen enthält.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann die Probe, von der angenommen wird, daß sie das Antigen enthält, in einem wäßrigen Medium mit einem Antikörper für das Antigen kombiniert werden und das Medium mit dem Träger kombiniert werden. Alternativ kann zuerst der Träger und der Antikörper kombiniert und dann die Probe zugegeben werden. In einer weiteren Alternative wird der Träger mit dem Antigen in Kontakt gebracht, gefolgt von Zugabe des Antikörpers. In einer weiteren Alternative kann die Probe vorbehandelt werden, um daraus das Antigen zu extrahieren, und das Antigen kann wie oben angegeben kombiniert werden.
Die Kombination wird dann unter ausreichenden Bedingungen inkubiert, um den Antikörper an den Träger zu binden, wenn er an das Antigen gebunden ist. Danach wird die Menge an Antikörper auf dem Träger oder im Medium bestimmt und steht im Verhältnis zur Anwesenheit oder der Menge von Antigen in der Probe. Die Menge an Antikörper kann auf vielfältige Weise bestimmt werden, einschließlich beispielsweise Trennung des Trägers vom Medium und Inkontaktbringen des abgetrennten Trägers mit einem Nachweismedium, welches einen markierten Rezeptor für den Antikörper für das Antigen einschließt, und Überprüfen des Trägers oder des Mediums auf die Anwesenheit der Markierung.
Das vorliegende Verfahren ist in großem Umfang auf dem Gebiet des Nachweises von Antigenen in biologischen Proben anwendbar. Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das bequemer ist als Bakterienkulturen und immunchemische Standardverfahren. Das vorliegende Verfahren stellt ein Nachweisverfahren zur Verfügung, das schneller ist und weniger Aufwand erfordert als frühere Verfahren, welche vorsehen, daß eine Probe, von der angenommen wird, daß sie ein Antigen enthält, mit einem Träger (entweder freiliegend oder mit einem Einfang-Antikörper vorbeschichtet) in Kontakt gebracht wird, das ungebundene Antigen entfernt wird, ein Antikörper zum gebundenen Antigen zugegeben wird, um einen Immunkomplex zwischen dem Antigen auf dem Träger und dem Antikörper zu bilden, und der Immunkomplex nachgewiesen wird. Die vorliegende Erfindung ergibt einen unerwarteten wirtschaftlichen Vorteil bei den Reagenzien insofern, als sie nur einen kleinen Bruchteil derjenigen Menge an Antikörper für das Antigen erfordert, wie sie bei früheren Verfahren erforderlich ist.
Bevor mit einer Beschreibung der speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, soll eine Anzahl von Ausdrücken definiert werden.
"Antigen" -- die nachzuweisende Verbindung oder Zusammensetzung, das interessierende Material. Das Antigen kann monoepitopisch oder polyepitopisch sein. Das Antigen ist imstande, spezifisch an einen Antikörper zu binden und wird gewöhnlich löslich sein oder kann dazu veranlaßt werden, im Assay-Medium löslich zu sein.
Die Antigene werden normalerweise Poly(aminosäuren) sein, d.h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Glycoproteine, Lipoproteine, ribonukleare Proteine und dgl. Die Antigene werden häufig Bestandteile von Bakterien, Viren, Mitochondrien, Zellkernen, Zellmembranen und dgl. sein.
Die Bakterien schließen gramnegative Bakterien ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, E. coli, Pseudomonas fluorescens, Azotobacter vinelandii, Proteus vulgaris, Hydrogenomanas sp., Aerobacter aerogenes, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Serratia marcescens, Achromobacter fischer, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Sarcina lutea, Micrococcus pyogenes, Lactobacillus casei, Torulopsis utilis und Streptomyces griseus, Shigella, Campylobacter, Salmonella, Legionella und Hemophillus influenza.
Polysaccharide sind eine Kombination von mindestens etwa drei oder vier Monosacchariden, die über glycosidische Bindungen verknüpft sind. Polysaccharide schließen beispielsweise Stärkeglycogen, Cellulose und Dextran ein.
Lipopolysaccharide (LPS) sind Moleküle, die Lipid- und Polysaccharid-Gruppierungen enthalten und in der Außenschicht der Zellmembranen von gramnegativen Bakterien anwesend sind. Die genaue Beschaffenheit einiger der Antigene sind, zusammen mit zahlreichen Beispielen davon, im U.S.-Patent Nr. 4,299,916, Litman et al., insbesondere Spalten 16 bis 23, offenbart.
Meistens werden die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Antigene ein Molekulargewicht (in Dalton) von mindestens etwa 1.000, üblicher mindestens etwa 2.500, häufiger größer als 5.000 aufweisen. Im Bereich der Poly(aminosäuren) werden die Poly(aminosäuren) von Interesse im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5.000 bis 5.000.000, üblicher von etwa 20.000 bis 1.000.000, aufweisen.
Es kann eine große Vielfalt von Proteinen betrachtet werden: die Familie von Proteinen mit ähnlichen Strukturmerkmalen, Proteine mit besonderen biologischen Funktionen, Proteine, die mit speziellen Mikroorganismen in Bezug stehen und spezielle krankheitsverursachende Mikroorganismen, etc.
"Antikörper" -- ein Immunglobulin, das spezifisch an eine spezielle räumliche und polare Organisation eines anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär definiert ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden, z.B. die Immunisierung eines Wirts und die Gewinnung von Seren (polyklonal) oder durch Herstellen kontinuierlicher Hybrid-Zelllinien und Gewinnung des abgesonderten Proteins (monoklonal). Die Antikörper können ein vollständiges Immunglobulin oder ein Fragment davon einschließen, welche Immunglobuline die verschiedenen Klassen und Isotypen, z.B. IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3, IgM, IgG2 und IgG4 einschließen. Fragmente davon können Fab, Fv, F(ab')&sub2; und Fab' einschließen.
"Antikörper für das Antigen" - - ein Antikörper, der spezifisch an das Antigen der vorliegenden Erfindung bindet.
"Bindungspartner für den Antikörper" -- eine Verbindung oder Zusammensetzung, die eine spezielle räumliche oder polare Organisation des Antikörpers, z.B. ein Epitop oder eine determinante Stelle, erkennt oder ein Ligand, der an den Antikörper gebunden ist. Illustrative Bindungspartner schließen in der Natur vorkommende Rezeptoren, z .B. spezifische Immunglobuline, Rheumatoidfaktor-Antikörper, Lectine, Protein A, Komplement- Komponente Clq und Avidin ein.
"Komplex" -- eine Zusammensetzung, die zwischen dem Rezeptor für den Antikörper und einem Antikörper als Ergebnis der Bindungsaffinität des Rezeptors für den Antikörper gebildet wird.
"Immunkomplex" -- ein Komplex, der zwischen einem Antigen und seinem zugehörigen Antikörper als Ergebnis der Bindungsaffinität des Antikörpers für das Antigen gebildet wird.
"Markierung" -- eine Markierung kann jedes Molekül sein, das kovalent oder nicht kovalent an einen Antikörper oder ein anderes Molekül gebunden ist. Die Markierung ist ein Element des signalerzeugenden Systems, welches ein signalerzeugendes Mittel einschließt. Die Markierung kann isotopisch oder nichtisotopisch sein, vorzugsweise nicht-isotopisch. Als Beispiel und nicht als Beschränkung kann die Markierung ein Katalysator, z.B. ein Enzym, ein Coenzym, ein Chromogen, z.B. ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Farbstoff oder ein chemilumineszierendes Mittel, und eine radioaktive Substanz sein.
"Signalerzeugendes Mittel" -- ein Mittel, das imstande ist, mit der Markierung zu wechselwirken, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Solche Mittel schließen beispielsweise elektromagnetische Strahlung, Wärme und chemische Reagenzien ein. Wenn chemische Reagenzien eingesetzt werden, können einige der chemischen Reagenzien als Teil einer Entwicklerlösung eingeschlossen sein. Die chemischen Reagenzien können einschließen Substrate, Coenzyme, Verstärker, zweite Enzyme, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Abfangreagenzien, Metallionen und spezifisch bindende Substanzen, die zur Bindung von signalerzeugenden Substanzen erforderlich sind. Einige der chemischen Reagenzien, z.B. Coenzyme, Substanzen, die mit Enzym-Produkten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren, können an andere Moleküle oder an einen Träger gebunden sein.
"Signalerzeugendes System" -- das signalerzeugende System kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei mindestens eine Komponente eine Markierung ist. Das signalerzeugende System erzeugt ein Signal, das im Verhältnis steht zur Anwesenheit oder der Menge des Antigens in einer Probe. Das signalerzeugende System schließt alle Reagenzien ein, die zur Erzeugung eines meßbaren Signals erforderlich sind. Wenn die Markierung nicht mit dem Antikörper konjugiert ist, ist die Markierung normalerweise an einen Rezeptor für den Antikörper gebunden. Andere Komponenten des signalerzeugenden Systems können einschließen Substrate, Verstärker, Aktivatoren, chemilumineszierende Verbindungen, Cofaktoren, Inhibitoren, Abfangreagenzien, Metallionen und spezifisch bindende Substanzen, die zur Bindung von signalerzeugenden Substanzen erforderlich sind. Andere Komponenten des signalerzeugenden Systems können sein Coenzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und dgl.. Das signalerzeugende System erzeugt ein Signal, das durch externe Mittel nachweisbar ist, vorzugsweise durch Messung elektromagnetischer Strahlung. Meistens wird das signalerzeugende System ein chromophores Substrat und ein Enzym beinhalten, wobei die chromophoren Substrate enzymatisch in Farbstoffe umgewandelt werden, die Licht im ultravioletten oder sichtbaren Bereich absorbieren, Phosphore, Fluoreszenzfarbstoffe oder chemilumineszierende Mittel.
Das signalerzeugende System kann einen Katalysator, gewöhnlich ein Enzym, und ein Substrat einschließen und kann zwei oder mehr Katalysatoren und eine Vielzahl von Substraten einschließen, und kann eine Kombination von Enzymen einschließen, wobei das Substrat des einen Enzyms das Produkt des anderen Enzyms ist. Die Wirkung des signalerzeugenden Systems besteht darin, ein Produkt zu erzeugen, welches ein nachweisbares Signal ergibt, das im Verhältnis zur Menge des Analyten in der Probe steht.
Im U.S.-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 19 bis 23 und U.S.-Patent Nr. 4,318,980, Spalten 10 bis 14, sind eine große Anzahl von Enzymen und Coenzymen aufgeführt, die für ein signalerzeugendes System geeignet sind. Eine Anzahl von Enzymkombinationen sind im U.S.-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 23 bis 28, angegeben, welche Kombinationen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Von besonderem Interesse sind Enzyme, die die Erzeugung von Wasserstoffperoxid und die Verwendung des Wasserstoffperoxids zur Oxidation eines Farbstoff-Vorläufers zu einem Farbstoff beinhalten. Besondere Kombinationen schließen ein Saccharidoxidasen, z.B. Glukose- und Galaktoseoxidase, oder heterocyclische Oxidasen, z.B. Uricase und Xanthinoxidase, gekoppelt mit einem Enzym, welches das Wasserstoffperoxid dazu verwendet, um einen Farbstoff-Vorläufer zu oxidieren, d.h. eine Peroxidase wie Meerrettichperoxidase, Laktoperoxidase oder Mikroperoxidase. Weitere Enzymkombinationen mögen in der Offenbarung der oben angegebenen Patente gefunden werden. Wenn ein einzelnes Enzym als Markierung verwendet wird, können andere Enzyme wie z.B. Hydrolasen, Transferasen und Oxidoreduktasen Verwendung finden, vorzugsweise Hydrolasen wie alkalische Phosphatase und ß-Galaktosidase. Alternativ können Luciferasen wie Glühwürmchen-Luciferase und bakterielle Luciferase verwendet werden.
Illustrative Coenzyme, die Verwendung finden, schließen ein NAD[H]; NADP[H], Pyridoxalphosphat; FAD[H]; FMN[H], etc., üblicherweise Coenzyme, die cyclische Reaktionen beinhalten, siehe insbesondere U.S.-Patent Nr. 4,318,980.
Das Produkt der Enzymreaktion wird gewöhnlich ein Farbstoff oder ein Fluoreszenzfarbstoff sein. Im U.S.-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 30 und 31, sind eine große Anzahl illustrativer Fluoreszenzfarbstoffe aufgeführt.
"Träger" -- ein saugfähiges oder nicht-poröses wasserunlösliches Material. Der Träger wird häufig hydrophob oder positiv geladen sein oder imstande sein, hydrophob oder positiv geladen zu werden, und schließt ein Teilchen, große Festkörper und Filme, gewebte oder als Vlies vorliegende Materialien, die insbesondere Polymere wie Poly(vinylchlorid), Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat) umfassen; Glas und Keramik; und natürliche Fasern, die modifiziert wurden, um hydrophobe oder positiv geladene Eigenschaften zu erhalten, z.B. alkylierte oder acylierte Cellulose, Dextran, Chitin und dgl., oder Oberflächen, die mit Polylysin, Protamin, Dextransulfat, Polyacrylat oder anderen ionischen Polymeren aus irgendeinem der obigen Materialien beschichtet sind. Der Träger wird frei von Proteinen sein, die spezifisch an den Antikörper, das Antigen oder den Immunkomplex binden, und wird häufig frei von jeglichem Protein oder anderen spezifisch bindenden Substanzen sein.
"Hilfsmaterialien" -- In einem erfindungsgemäßen Assay werden häufig verschiedene Hilfsmaterialien verwendet werden. Beispielsweise werden gewöhnlich im Assaymedium Puffer anwesend sein, ebenso wie Stabilisatoren für das Assay-Medium und die Assay-Komponenten. Häufig können über diese Zusätze hinaus weitere Proteine eingeschlossen sein, z.B. Albumine, oder Tenside, insbesondere anionische Tenside und Bindungsverstärker, z.B. Polyalkylenglykole.
Wie oben erwähnt, beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Antigens in einer biologischen Probe, von der angenommen wird, daß sie das Antigen enthält. Das zu bestimmende Antigen kann zuerst solubilisiert werden, indem die Probe, von der angenommen wird, daß sie das Antigen enthält, mit einem Detergens in Kontakt gebracht wird. Die Probe, von der angenommen wird, daß sie ein Antigen enthält, kann gleichzeitig in einer wäßrigen Lösung mit dem Detergens und dem Antikörper für das Antigen in Kontakt gebracht werden. Beispielsweise kann die Probe auf einer Sammelvorrichtung, z.B. einem Bausch, in ein Gefäß, z.B. ein Reagenzglas, eingebracht werden, welches das Detergens und Antikörper für das Antigen enthält. Vorzugsweise kann die Probe mit dem Detergens in Kontakt gebracht werden, bevor sie mit dem Antikörper für das Antigen in Kontakt gebracht wird. Die Probe auf einem Bausch kann in ein Reagenzglas eingebracht werden, welches das Detergens enthält, und dann kann unter oder ohne vorherige(r) Verringerung der Konzentration des Detergens, beispielsweise durch Verdünnung, der Antikörper für das Antigen zugegeben werden.
Das Detergens kann anionisch, kationisch, nicht-ionisch oder amphoter sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind anionische Detergentien bevorzugt und schließen ein, als Beispiel und nicht als Beschränkung, Alkyl-, Alkylether-, Dialkylester-, Alkylaryl-, und α-Olefin-Sulfate, Sulfonsäuren, Sulfonate, Sulfosuccimate und Sulfosuccinsäuren, polymerisierte Alkylnaphthalinsulfonate, Phosphatester, freie Säure von komplexen organischen Phosphatestern, aliphatische hydroxylierte Phosphatester, sulfatierte Fettsäureester, sulfatierte Öle wie Castoröl, Spermöl, Sojabohnenöl, Glycerintrioleat, Klauenfett, Talg und Ölsäure, n-Fettsäure-Acylglutamate wie n-Lauroyl, n-Cocoyl, n-hydrogenierter Talg, n-gemischtes Fettsäureacyl, carboxylierte Polyelektrolyten und disproportionierte Harze. Beispiele von kationischen Detergentien sind quarternäre Alkylammoniumchloride wie Dimethyl- oder Trimethylalkyl oder -dialkyl, z.B. Trimethylsoja, Dimethyl-dehydrogenierter Talg, Trimethylcetyl und Trimethylcoco. Beispiele nicht-ionischer Detergentien sind Triton X 100, Tween 20 und Octylglucosid. Beispiele amphoterer Detergentien sind Fettsäureester von Betain. Besonders bevorzugte Detergentien sind beispielsweise ein Desoxycholat-Salz, z.B. Natriumdesoxycholat und Natriumchenodesoxycholat, ein Alkylsulfat oder Analogon davon, Alkylglucoside und CHAPS (Cholamidopropyldimethylammoniumpropansulfat). Der oben verwendete Begriff Alkyl bedeutet C&sub8; bis C&sub2;&sub0;.
Ein unerwarteter Vorteil beim Einsatz eines Detergens liegt darin, daß Detergentien empirisch ausgewählt werden können, welche verhindern, daß der Antikörper an einen Träger in Abwesenheit des Antigens bindet, während der Antikörper leicht an den Träger bindet, wenn das Antigen anwesend ist. Beispielsweise verhindert Chenodesoxycholat Antikörper für ein Lipopolysaccharid von Chlamydia trachomatis an Polystyrol- Mikrotiterplatten zu binden, wenn das Lipopolysaccharid nicht auch im Assay-Medium anwesend ist.
Die eingesetzten Temperaturen zur Solubilisierung des Antigens liegen gewöhnlich im Bereich von etwa 100 bis 50ºC, üblicher 15º bis 100ºC. Meistens sind relativ kurze Zeiten erforderlich, um ein Antigen zu solubilisieren. Gewöhnlich kann die Solubilisierung eines Antigens mindestens etwa 5 Sekunden und nicht mehr als 1 Stunde beanspruchen, üblicher etwa 30 Sekunden bis etwa 30 Minuten. Die Zeit ist abhängig von der Natur des Antigens und von der Art und Menge des Detergens und der verwendeten Temperatur.
Das Solubilisierungsmedium ist im allgemeinen wäßrig und kann bis zu 40% eines organischen Lösungsmittels enthalten. Der pH- Wert des Solubilisierungsmediums wird gewöhnlich im Bereich von etwa 2 bis 12, üblicher im Bereich von etwa 5 bis 9 liegen. Der pH-Wert wird im allgemeinen so gewählt, um ein hohes Solubilisierungsniveau des Antigens zu erreichen. Um den pH- Wert zu erreichen und während der Solubilisierung aufrecht zu erhalten, können verschiedene Puffer eingesetzt werden. Beispielhafte Puffer schließen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris und Barbital ein. Der speziell eingesetzte Puffer ist nicht kritisch, aber es kann ein Puffer gegenüber anderen bevorzugt sein.
Wie oben festgestellt, wird der Träger, im wesentlichen frei von spezifisch bindenden Proteinen, in Kombination mit einem Medium, das ein Antigen und Antikörper umfaßt, bereitgestellt. In einer Ausführungsform kann eine biologische Probe, von der angenommen wird, daß sie das Antigen enthält, und ein Antikörper für das Antigen in einem wäßrigen Medium kombiniert werden, wodurch voraussichtlich ein Immunkomplex zwischen dem Antigen und dem Antikörper gebildet wird. Das Medium kann mit einem festen Träger in Kontakt gebracht werden. Das Medium kann gegebenenfalls ein Detergens wie oben genannt enthalten. Die Probe wird vorzugsweise vor der Zugabe des Antikörpers mit dem Detergens in Kontakt gebracht. Alternativ können jedoch das Detergens und der Antikörper zur Probe gleichzeitig zugegeben werden oder das Detergens kann nach der Zugabe des Antikörpers zugegeben werden.
In einer weiteren Ausführungsform können Antikörper für das Antigen und der Träger im wesentlichen gleichzeitig kombiniert werden, oder das Antigen oder der Antikörper kann zuerst zum Träger zugegeben werden, unter Bedingungen, unter denen eine Bindung an den Träger nicht eintritt, gefolgt von Zugabe des Antikörpers bzw. des Antigens. Beispielsweise kann der Träger mit einem wäßrigen Medium, das den Antikörper für das Antigen enthält, in Kontakt gebracht werden. Anschließend kann Antigen zum Medium zugegeben werden. Wahrscheinlich bildet sich ein Immunkomplex in situ und bindet an den Träger vor der Bindung des unkomplexierten Antikörpers oder Antigens an den Träger. In einem solchen Fall wird ein Detergens vorzugsweise vor oder im wesentlichen gleichzeitig mit dem Kontakt zwischen dem Träger und dem Antigen und dem Antikörper mit dem Träger kombiniert. Für diesen Zweck kann das Detergens in einem oder beiden der wäßrigen Medien, die den Antikörper oder das Antigen enthalten, eingeschlossen sein.
Nach der Bildung der Kombination des Trägers und des Mediums, welches das Antigen und den Antikörper enthält, wird die Kombination unter ausreichenden Bedingungen inkubiert, um den Antikörper an den Träger zu binden, wenn er an das Antigen gebunden ist. Die Inkubation wird gewöhnlich bei einer Temperatur von etwa 100 bis 50ºC durchgeführt, vorzugsweise 150 bis 40ºC, bei einem pH von etwa 2 bis 12, vorzugsweise 5 bis 9, für einen Zeitraum von etwa 5 Sekunden bis 1 Stunde, vorzugsweise etwa 30 Sekunden bis 30 Minuten. Nach der Inkubation der Kombination wird die Anwesenheit oder Menge des Antikörpers auf dem Träger oder im Medium als Anzeichen für die Anwesenheit des Antigens in der Probe bestimmt. Diese Bestimmung kann auf zahlreichen Wegen ausgeführt werden und es folgen Beispiele, die als Erläuterung und nicht als Beschränkung dienen sollen.
In einer Ausführungsform kann der Antikörper für das Antigen an einen Liganden, gewöhnlich ein organisches Molekül mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500, gebunden sein. Der Träger kann von dem Medium abgetrennt werden, gewaschen werden, um ungebundenes Material zu entfernen, mit einem markierten Rezeptor für das organische Molekül in Kontakt gebracht werden, vorzugsweise gewaschen werden, und dann auf die Anwesenheit einer Markierung überprüft werden. Das Waschmedium wird wäßrig sein und kann Detergentien, Substanzen, die Bindungen verstärken oder inhibieren, z.B. Polyethylenglykol, chaotrope Salze und antichaotrope Salze, Puffer, z.B. Phosphat-gepufferte Salzlösung, Tris oder Borat, enthalten. Das zweite Waschmedium kann zusätzliche Substrate oder andere Elemente eines signalerzeugenden Systems enthalten. Geeignete Liganden schließen beispielsweise ein Biotin, Haptene wie Fluorescein und Vitamin B12, wobei die korrespondierenden Bindungspartner Avidin, Antikörper für das Hapten bzw. intrinsische Faktoren sind. Alternativ kann der Ligand eine chemisch reaktive Gruppe wie Maleimid oder Disulfid sein, oder ein Hydrazid und der Bindungspartner kann eine korrespondierende reaktive Gruppe aufweisen, die spezifisch mit dem Liganden reagiert, z.B. eine Sulfhydrylgruppe oder ein Aldehyd.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Antikörper für das Antigen direkt an eine Markierung, vorzugsweise ein Enzym oder Coenzym, gebunden sein. Nach der Inkubation kann der Träger vom Medium getrennt werden und wird dann vorzugsweise gewaschen. Das Waschmedium kann wieder ein gepuffertes wäßriges Medium sein, das geeignete Elemente eines signalerzeugenden Systems enthält. Auf diese Weise kann die Anwesenheit oder Menge der Markierung auf dem Träger als Anzeichen für die Anwesenheit des Analyten bestimmt werden.
In denjenigen Fällen, in denen der Antikörper für das Antigen nicht an eine Markierung gebunden ist, wird der abgetrennte Träger mit einem markierten Bindungspartner für den Antikörper für das Antigen in Kontakt gebracht, z.B. Protein A, Komplement, Rheumatoidfaktor oder Antikörper für den Antikörper für das Antigen. Die Markierung, die kovalent oder nicht-kovalent mit dem Bindungspartner verbunden sein kann, kann jede Markierung, vorzugsweise ein Enzym oder Coenzym sein. Der Bindungspartner wird gewöhnlich in einem separaten Nachweismedium eingeschlossen sein, aber er kann als Teil einer Waschlösung oder als Teil einer Lösung eingeschlossen sein, die zu dem Träger zugegeben wird, welche alle übrigen Elemente des signalerzeugenden Systems enthält, die nicht an den Träger gebunden sind. Die Anwesenheit der Markierung auf dem Träger kann dann wie oben beschrieben bestimmt werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Antikörper für das Antigen mit einem Rezeptor für einen Liganden markiert, wobei der Ligand eine Markierung wie ein Enzym oder ein Fluorophor sein kann, oder ein Molekül, an das eine Markierung gebunden ist, wobei das Molekül beispielsweise ein Makromolekül oder ein organisches Molekül mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500 sein kann. Nach der Trennung des Trägers von dem Medium wird der Träger mit dem Liganden in Kontakt gebracht und die Markierung wird direkt nachgewiesen oder, wenn nötig, durch Zugabe der zusätzlichen Elemente des signalerzeugenden Systems.
Die Waschlösungen, und die Lösungen, die Elemente des signalerzeugenden Systems enthalten, werden normalerweise aus wäßrigen gepufferten Medien mit mäßigem pH bestehen, im allgemeinen so, daß eine optimale Assay-Empfindlichkeit gegeben ist. Die wäßrigen Medien können nur Wasser sein oder können 0 bis 40 Volumen-% eines Cosolvens einschließen. Der pH-Wert für das Medium wird gewöhnlich im Bereich von etwa 4 bis 11, üblicher im Bereich von etwa 5 bis 10, liegen, und es wird gewöhnlich ein Kompromiß zwischen optimaler Bindung der bindenden Elemente und dem pH-Optimum für andere Reagenzien des Assays, z.B. Elemente des signalerzeugenden Systems, vorliegen.
Es können verschiedene Puffer eingesetzt werden, um den gewünschten pH-Wert zu erreichen und den pH-Wert während der Bestimmung aufrecht zu erhalten. Beispielhafte Puffer schließen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris oder Barbital ein. Der speziell eingesetzte Puffer ist nicht kritisch für diese Erfindung, aber in einem speziellen Assay kann der eine oder andere Puffer bevorzugt sein.
Es werden normalerweise mäßige Temperaturen zur Durchführung des Assays verwendet und gewöhnlich konstante Temperaturen während des Zeitraums der Messung, insbesondere zur Bestimmung von Geschwindigkeiten. Die Temperaturen während der Messung werden im allgemeinen etwa 100 bis 50ºC, üblicher etwa 150 bis 40ºC betragen.
Die Konzentration des nachzuweisenden Antigens wird im allgemeinen von etwa 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;¹&sup5;M, üblicher von etwa 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;¹&sup4; M variieren. Gesichtspunkte, wie die Menge der nichtspezifischen Bindung der Markierung an den Träger, die spezielle Nachweistechnik und die Konzentration des interessierenden Antigens werden normalerweise die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien bestimmen. Während die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien im Assay-Medium im allgemeinen durch die Konzentration des Antigens bestimmt werden, wird die Endkonzentration jedes der Reagenzien normalerweise empirisch bestimmt, um die Empfindlichkeit des Assays zu optimieren.
Nachdem alle Reagenzien entweder gleichzeitig oder nacheinander kombiniert worden sind und jeglicher Komplex, der gebildet wurde, an den Träger gebunden hat, kann das durch das signalerzeugende System mit einer Probe von Interesse erzeugte Signal mit dem Signal verglichen werden, welches durch eine Probe erzeugt wird, von der bekannt ist, daß sie von dem Antigen frei ist, um die Anwesenheit des Antigens in der getesteten Probe sicherzustellen. Ein deutlich höheres Signal, das mit der Testprobe erzeugt wird, bedeutet die Anwesenheit des Antigens.
Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Empfindlichkeit und/oder Spezifität der Assays beibehalten oder erhöht, während die Menge des Antikörpers für das Antigen verringert wird, welche nötig ist, um einen Komplex mit Antigen in einer getesteten Probe zu bilden. Durch die Bildung des Komplexes in einer Lösung wird etwa 100-fach weniger Antikörper eingesetzt, als wenn die Reaktion auf einer festen Phase durchgeführt wird. In einem typischen Sandwich-Assay für ein Antigen wird an einen Träger gebundener Antikörper inkubiert und bildet einen Komplex mit dem Antigen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Immunkomplex, der Antigen und Antikörper für das Antigen umfaßt, vorher gebildet oder in situ in der Lösung gebildet und bindet dann an einen Träger, der kein spezifisch bindendes Protein an seiner Oberfläche aufweist. Der Immunkomplex wird durch Erzeugung eines Signals nachgewiesen, das im Verhältnis zur Anwesenheit von Antigen in der Probe steht. Das Signal wird durch die Anwesenheit einer Markierung im Komplex erzeugt. Der Antikörper enthält entweder eine Markierung oder ist imstande, mit einer Markierung kombiniert zu werden, z.B. durch Bindung an einen Bindungspartner für den Antikörper. Durch die Wahl der Markierung, des Antikörpers und des Trägers und den zur Durchführung des Assays eingesetzten Bedingungen kann ein nachweisbares Signal im Medium und/oder auf dem Träger beobachtet werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung zum Nachweis von Chlamydia wird ein Puffer, der Antikörper für Chlamydia und das Detergens Chenodesoxycholat (CDOC) enthält, zu einer Vertiefung in einer Polystyrol-Mikrotiterplatte zugegeben. Die Probe, von der angenommen wird, daß sie Chlamydia enthält, wird mit CDOC in Kontakt gebracht und zur selben Vertiefung überführt. Die Mischung wird etwa 90 Minuten bei etwa 37ºC inkubiert und dann gewaschen, vorzugsweise mit einer Phosphatpuffer-Lösung. Danach wird die Platte mit einem markierten Bindungspartner für den Antikörper für Chlamydia in Kontakt gebracht. Ein bevorzugter Bindungspartner ist mit einem Enzym, vorzugsweise einer Peroxidase wie Meerrettichperoxidase, markiertes Antiglobulin. Nach 60-minütiger Inkubation bei etwa 37ºC wird der Träger gewaschen und eine Lösung der Substrate Wasserstoffperoxid und Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid zugegeben. Nach der Inkubation für etwa 30 Minuten bei etwa 37ºC kann die Reaktion gegebenenfalls durch Zugabe von Schwefelsäure gestoppt werden. Danach wird die Absorption der Substratlösung bei 450 nm abgelesen und verglichen mit der Absorption, die auf ähnliche Weise mit einer Probe erzeugt wird, von der bekannt ist, daß sie kein Chlamydia-Antigen enthält.
Als Ergebnis der Bindung des Immunkomplexes an den Träger kann ein vereinfachtes Versuchsprotokoll verwendet werden und es wird ein starkes nachweisbares Signal für eine genaue Bestimmung des Antigens in einer Probe erhalten. Durch die vorherige Bildung des Komplexes oder Bildung des Komplexes in situ wird die Menge des im Assay eingesetzten Antikörpers verringert, ohne die Empfindlichkeit des Assays zu beeinträchtigen. Darüber hinaus bietet die Erfindung einen Vorteil gegenüber den Verfahren im Stand der Technik insofern, als die Anzahl der Wasch- und Trennungsschritte verringert wird.

BEISPIELE

Die Erfindung wird weiter durch die folgenden illustrativen Beispiele erläutert.
Bevor mit einer Beschreibung der Beispiele fortgefahren wird, werden die folgenden Begriffe definiert:
cfu - Kolonie-bildende Einheiten
CDOC - Chenodesoxycholat
HRP - Meerrettichperoxidase
PBS - (Phosphat-gepufferte Salzlösung) 0,01 M NaH&sub2;PO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,02% NaN&sub3;
BSA - Rinderserumalbumin
ABTS - 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure)
TMB - Tetramethylbenzidin
DTT - Dithiothreitol
Solubilisierungspuffer (SDB) - 0,05% CDOC, 5mM DTT, DPBS (pH 7,2)
IgG - Immunglobulin G
IgG&sub3; - IgG&sub3;-Isotyp von IgG
FBS - 50% fötales Kalbsserum in 0,01 M Tris, pH 7,5 und 0,2% Tween 20
DPBS - Dulbeccos Phosphat-gepufferte Salzlösung
RαmIgG&sub3; - Kaninchen-Antimaus- IgG&sub3; -Antikörper
FBS - fötales Rinderserum
1H11 - Maus-monoklonaler Antikörper (IgG&sub3;), der für Lipopolysaccharide von Chlamydia-Antigen spezifisch ist; siehe Stephens, R.S.; Tam, M.R.; Kuo, C-C; Nowinski, R.C. "Monoclonal antibodies to Chlamydia trachomatis: Antibodies specificities and antigen characterization." J. Immunol, 128:1083 - 1089 (1982)
Kaninchen-Anti-Chlamydia-Antiseren - Kaninchen-polyklonale Antiseren, die spezifisch gegen Chlamydia-Antigen (solubilisiert und vollständig) gebildet wurden.
Konjugate - affinitätsgereinigter Antikörper für Kaninchen IgG (H- und L-Kette) der Ziege (Ziegen-Anti-Kaninchen IgG), der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiert ist, und mit HRP markierter affinitätsgereinigter Antikörper für Maus IgG (H- und L-Kette) der Ziege (Ziegen-Antimaus-IgG) wurden von Kirkeggard und Perry Laboratories (Maryland) bezogen.

BEISPIEL 1

Eine Probe, von der angenommen wurde, daß sie Chlamydia enthielt, wurde auf einem Bausch gesammelt, und der Bausch und 1,0 ml an 0,10% CDOC wurden etwa 15 Minuten lang kombiniert. Der Bausch wurde entsorgt und die 100 ul Mischung zu einer Polystyrol-Mikrotiterplatte überführt, mit 100 ul 0,1% CDOC, die 0,1 ug Anti-Chlamydia-Antikörper enthielten, gemischt und bei 37ºC inkubiert. Nach 90 Minuten wurde die Platte mit PBS gewaschen. Es wurde Ziegen-Antikaninchen-HRP (3 pMol) in PBS mit 50% FBS zugegeben. Nach 60-minütiger Inkubation bei 37ºC wurde der Träger mit PBS gewaschen, der Tween 20 enthielt. Danach wurde 0,10 ml TMB-Substrat (0,8 mMol/l) zugegeben. Der Träger wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion mit 0,1 ml H&sub2;SO&sub4; (1N) gestoppt und die Reaktion bei 450 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. TABELLE 1 Patientenprobe mit Chlamydia-Antikörper ohne Chlamydia-Antikörper (Konjugat-Kontrolle) 1 (Chlamydia-Antigen enthaltend) 2 (negativ bezüglich Chlamydia-Antigen)

BEISPIEL 2

A) 100 ul des Solubilisierungspuffers (SDB) oder PBS wurden zu einem Polystyrol-Mikrotiterplatten-Träger zugegeben. 10 ul Stamm-Chlamydia-Grundkörper (Lot RR02) und 10 ul 1H11, monoklonaler Anti-Chlamydia LPS (100 ug/ml) in 20 mg/ml BSA in PBS, wurden zum Träger zugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37ºC wurde die Mischung zweimal in PBS gewaschen. RαmIgG&sub3;-HRP (1:1000) in PBS mit 20 mg/ml BSA wurden zum Träger zugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden 0,1 ml ABTS (2 mMol/l) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 414 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
B) Als Vergleich wurde ein konventioneller ELISA-Assay vom Sandwich-Typ durchgeführt, der nicht von der vorliegenden Erfindung umfaßt wird.
Zu einem Polystyrol-Mikrotiterplatten-Träger wurden 100 ul Solubilisierungspuffer oder PBS zugegeben. Dann wurden 10 ul Stamm-Chlamydia-Grundkörper (Lot RR02) (1:500) zum Träger zugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37ºC wurde der Träger zweimal mit PBS gewaschen. Es wurden 10 ul monoklonale Anti-Chlamydia-Antikörper, 1H11 (100 ug/ml) mit 20 mg/ml BSA, zu der Platte zugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37ºC wurde die Platte mit PBS gewaschen. RαmIgG&sub3;-HRP (1:1000) in PBS mit 20 mg/ml BSA wurde zum Träger zugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden 0,1 ml ABTS (2 mMol/l) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 414 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. TABELLE 2 EXTINKTION bei 414 nm Kein Chlamydia-Antigen anwesend Chlamydia-Antigen 1:5000 in PBS Chlamydia-Antigen 1:5000 in SDB Assay-Kontrollen Konjugat-Hintergrund (PBS) Konjugat-Hintergrund (SDB) Substrat-Hintergrund (Antigen in PBS; kein Antikörper; Konjugat anwesend) (Antigen in SDB; kein Antikörper; Konjugat anwesend) (kein Antigen; kein Antikörper; kein Konjugat)

BEISPIEL 3

Eine Probe, von der angenommen wurde, daß sie Chlamydia enthielt, wurde auf einem Bausch gesammelt und in 1 ml eines modifiziertes Natriumtetradecylsulfats (0,1% in 0,1 M Acetatpuffer, pH 4,5, 6 mM DTT, 5 mM EDTA, und 50 mM Glukose) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Mischen wurde der Bausch entfernt und entsorgt und 50 ul der Lösung 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 50 ul einer Lösung inkubiert, die 20 ng/ml Kaninchen-Antikörper für Chlamydia, 0,2 M Tris Puffer, pH 7,5, 0,01% BSA und auf Latexperlen immobilisierte Glukoseoxidase enthielt. Danach wurde die Lösung zu einer Einlaßöffnung in einer Folie zugegeben, die einen Streifen von Glasfaser-Papier bedeckte. Nachdem die Lösung absorbiert worden war, wurden 50 ul FBS zugegeben und in den Streifen einsickern gelassen, gefolgt von der Zugabe von 50 ul Meerrettichperoxidase-Ziegen-Antikaninchen Ig in FBS. Nach 5 Minuten wurden weitere 50 ul PBS zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 1000 ul Citratpuffer (0,1 M pH 5,5) und 50 ul einer Lösung, die ein chromogenes Peroxidase-Substrat, 0,05 M Glukose und 0,1 M Citrat, pH 5,5, enthielt, wobei jede Lösung in den Streifen einsickern gelassen wurde, bevor die Zugabe der nächsten Lösung erfolgte. Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die auf dem Streifen an der Einlaßöffnung gebildete Farbe mit der Farbe verglichen, die in einem ähnlichen Experiment unter Verwendung einer Probe gebildet wurde, die bekanntermaßen frei von Chlamydia-Antigen war, und die Ergebnisse abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. TABELLE 3 Chlamydia-Antigen Farbintensität* anwesend nicht anwesend * geschätzte Skala

BEISPIEL 4

Es wurden fünf endocervikale Bauschproben, die bekanntermaßen für Neisseria gonorrhoeae negativ waren, auf Bäuschen gesammelt und die Proben unter Verwendung von 1 ml 0,1% CDOC, 0,1% Thimerosa , DPBS-pH 7,2, extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt. Ein Teil des Probenpools wurde genommen und mit einer bekannten Menge an N. gonorrhoeae ergänzt. Polyklonaler Kaninchen-Antikörper wurde mit 0,1% CDOC, 0,01% Thimerosal DPBS-pH 7,2 verdünnt und 100 ul der Antikörper-Lösung zu jeder Vertiefung einer Mikrortiterplatte zugegeben. Unmittelbar danach wurden 100 ul der extrahierten Probe (negativ oder ergänzt) zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach 90-minütiger Inkubation bei 37ºC wurde die Mischung entfernt und die Vertiefung mit 0,1% Tween in DPBS gewaschen. Danach wurden 100 ul Ziegen-Antikaninchen-IgG-HRP-Konjugat, geeignet verdünnt mit 50% DPPS/50% FBS, zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach etwa 60-minütiger Inkubation bei 37ºC wurde die Mischung entfernt und die Vertiefung mit 0,1% Tween in DPBS gewaschen und dann 100 ul TMB-Lösung zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 100 ul 1N H&sub2; SO&sub4; zu jeder Vertiefung zugegeben und die Reaktion bei 450 nm abgelesen. Das Experiment wurde mit einem zweiten Antikörper-Lot und einem neuen Satz von Patientenprobenextrakt wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. TABELLE 4 N. gonorrhoea cfu/Vertiefung

BEISPIEL 5

Eine Probe, von der angenommen wurde, daß sie N. gonorrhoeae enthielt, wurde auf einem Bausch gesammelt und in 1 ml eines modifizierten Natriumtetradecylsulfats (0,2% in 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5, 6 mM DTT, 5 mM EDTA) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Mischen wurde der Bausch entfernt und entsorgt und 50 ul der Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 50 ul einer Lösung inkubiert, die 40 ng/ul Kaninchen-Antikörper für N. gonorrhoeae, 2% H&sub2;O&sub2;, 0,2 M Tris Puffer pH 7,5 und auf Latexperlen immobilisierte Glukoseoxidase enthielt. Danach wurde die Lösung einer Einlaßöffnung in einer Folie zugegeben, die einen Streifen von Glasfaser- Papier bedeckte.
Nachdem die Lösung absorbiert worden war, wurden 50 ul FBS zugegeben und in den Streifen einsickern gelassen, gefolgt von Zugabe von 50 ul Meerrettichperoxidase-Ziegen-Antikaninchen Ig in FBS. Nach 5 Minuten wurden weitere 50 ul FBS zugegeben, gefolgt von einer Zugabe von 1000 ul Citratpuffer (0,1 M pH 5,5) und 50 ul einer Lösung, die ein chromogenes Peroxidasesubstrat, 0,05 M Glukose und 0,1 M Citrat, pH 5,5, enthielt, wobei jede Lösung in den Streifen einsickern gelassen wurde, bevor die nächste Lösung zugegeben wurde. Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die auf dem Streifen an der Einlaßöffnung gebildete Farbe mit der Farbe verglichen, die in einem ähnlichen Experiment unter Verwendung einer Probe gebildet worden war, die bekanntermaßen frei von N. gonorrhoeae-Antigen war, und die Ergebnisse verglichen, Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. TABELLE 5 N. Gonorrhoeae-Antigen Farbintensität * vorhanden nicht vorhanden * geschätzte Skala
Die obigen Beispiele zeigen, daß gemäß der oben beschriebenen Erfindung genaue und empfindliche Assays auf Chlamydia und N. gonorrhoeae durchgeführt werden können.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis eines Antigens in einer biologischen Probe, von der angenommen wird, daß sie ein Antigen enthält, welches Verfahren umfaßt -

a) das Bereitstellen in Kombination von einem festen Träger, der hydrophob oder positiv geladen und im wesentlichen frei von Proteinen ist, Bindungspartnern, die spezifisch für das Antigen sind,

Bindungspartnern, die spezifisch für einen Antikörper sind, der spezifisch für die Antigene ist, und Bindungspartnern, die spezifisch für einen Immunkomplex des Antigens und des Antikörpers sind, und einem wäßrigen Medium, welches ein Antigen aus der Probe und einen für das Antigen spezifischen Antikörper umfaßt;

b) das Inkubieren der Kombination unter ausreichenden Bedingungen, um den Antikörper an den Träger zu binden, wenn er an das Antigen gebunden ist; und

c) das Bestimmen des Antikörpers, der an den Träger gebunden ist oder sich in dem Medium befindet, wobei dessen Anwesenheit oder Menge im Verhältnis zur Anwesenheit von Antigen in der Probe steht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Träger von dem Medium vor Schritt c) abgetrennt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Antigen von einem gramnegativen Bakterium stammt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin die Probe mit einem Detergens in Kontakt gebracht wird, um das Antigen vor oder während Schritt a) zu solubilisieren.

5. Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, worin der abgetrennte Träger vor Schritt c) gewaschen wird.

6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Antikörper für das Antigen eine an ihn gebundene Markierung aufweist oder das Medium einen markierten Bindungspartner für den Antikörper einschließt.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, zum Nachweis von gramnegativen Bakterien in einer biologischen Probe, von der angenommen wird, daß sie die Bakterien enthält, welches Verfahren umfaßt -

a) das Bereitstellen in Kombination von einem festen Kunststoffträger, der hydrophob oder positiv geladen und im wesentlichen frei von Proteinen ist,

Bindungspartnern, die für ein Antigen der Bakterien spezifisch sind,

Bindungspartnern, die für einen Antikörper spezifisch sind, der für das Antigen spezifisch ist, und Bindungspartnern, die für einen Immunkomplex des Antigens und des Antikörpers spezifisch sind, und einem wäßrigen Medium, welches eine Mischung des Antigens und eines für das Antigen spezifischen Antikörpers umfaßt;

b) das Inkubieren der Kombination unter ausreichenden Bedingungen, um den Antikörper an den Träger zu binden, wenn er an das Antigen gebunden ist;

c) das Abtrennen des Trägers vom Medium; und

d) das Bestimmen des Antikörpers auf dem Träger, wobei dessen Anwesenheit oder Menge im Verhältnis zur Anwesenheit der gramnegativen Bakterien in der Probe steht.

8. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Antigen ein gramnegatives Bakterium ist, das ausgewählt ist aus Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci und Neisseria gonorrhoeae.

9. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Detergens aus einem Desoxycholat-Salz, einem Alkylsulfat, einemAlkylglucosid und Cholamidopropyldimethylammoniumpropansulfat (CHAPS) ausgewählt ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, zum Nachweis einer Klasse von gramnegativen Bakterien in einer biologischen Probe, welches umfaßt:

a) das Inkontaktbringen von

einem saugfähigen festen Träger, der hydrophob oder positiv geladen und im wesentlichen frei von Proteinen ist,

Bindungspartnern, die für ein Antigen spezifisch sind, das mit den Bakterien aus der Probe assoziiert ist,

Bindungspartnern, die für einen Antikörper spezifisch sind, der für das Antigen spezifisch ist, und Bindungspartnern, die für einen Immunkomplex des Antigens und des Antikörpers spezifisch sind, und einem wäßrigen Medium, das eine biologische Probe, von der angenommen wird, daß sie ein Antigen von den genannten gramnegativen Bakterien enthält, und einen für das Antigen spezifischen Antikörper enthält;

b) das Inkubieren des Trägers mit dem Komplex für eine ausreichende Zeit, um den Komplex an den Träger zu binden; und

c) das Bestimmen des Antikörpers auf dem Träger, wobei dessen Anwesenheit oder Menge im Verhältnis zur Anwesenheit der Bakterien in der Probe steht.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Klasse von gramnegativen Bakterien ausgewählt ist aus Chlamydia trachomatis, Chlamydia Dsittaci, und Neisseria gonorrhoeae.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin die Probe mit einem Detergens in Kontakt gebracht wird, um die Antigene in den Bakterien vor oder während Schritt a) zu solubilisieren.

13. Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, worin das Detergens aus einem Desoxycholat-Salz, einem Alkylsulfat, einem Alkylglucosid und Cholamidopropyldimethylammoniumpropansulfat (CHAPS) ausgewählt ist.

14. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, zum Nachweis eines Antigens, das mit Chlamydia trachomatis assoziiert ist, in einer biologischen Probe, von der angenommen wird, daß sie Chlamydia trachomatis enthält, welches Verfahren umfaßt -

a) das Bereitstellen in Kombination von einem festen Träger, der hydrophob oder positiv geladen und im wesentlichen frei von Proteinen ist, Bindungspartnern, die für das Antigen spezifisch sind,

Bindungspartnern, die für einen Antikörper spezifisch sind, der für das Antigen spezifisch ist, und nicht-ionischen Bindungsmitteln für einen Immunkomplex des Antigens und des Antikörpers, und einem wäßrigen Medium, das eine biologische Probe, von der angenommen wird, daß sie Chlamydia trachomatis enthält, und einen für das Antigen spezifischen Antikörper enthält;

c) das Bestimmen der Menge des Antikörpers auf dem Träger als Maß für das Antigen in der Probe.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin der Träger Kunststoff ist.

16. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, zum Nachweis eines Antigens, das mit Neisseria gonorrhoeae assoziiert ist, in einer biologischen Probe von der angenommen wird, daß sie Neisseria gonorrhoeae enthält, welches Verfahren umfaßt -

Bindungspartnern, die für einen Antikörper spezifisch sind, der für das Antigen spezifisch ist, und nicht-ionischen Bindungsmitteln für einen Immunkomplex des Antigens und des Antikörpers, und einem wäßrigen Medium, das eine biologische Probe, von der angenommen wird, daß sie N. gonorrhoeae enthält, und einen für das Antigen spezifischen Antikörper enthält;