DE3853390T2

DE3853390T2 - Verfahren zur Herstellung von phosphodiester-Konjugaten, die bei der Herstellung der immunaktiven Liposomen verwendbar sind.

Info

Publication number: DE3853390T2
Application number: DE3853390T
Authority: DE
Inventors: Say-Jong Law
Original assignee: Ciba Corning Diagnosys Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1987-09-09
Filing date: 1988-09-07
Publication date: 1995-10-05
Anticipated expiration: 2008-09-08
Also published as: JPH087218B2; JPH01107152A; CA1340413C; ES2071618T3; DE3853390D1; EP0307175A2; EP0307175A3; EP0307175B1; ATE120276T1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Phosphodiester-Konjugaten, die zur Herstellung immunaktiver Liposomen geeignet sind. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung bestimmter Phosphodiester-Konjugate aus bestimmten Phospholipiden, Liganden und Analyten als auch die Herstellung immunaktiver Liposomen aus derartigen Konjugaten.
Ein Liposomen-Immunoassay verwendet immunaktive Liposomen (d.h. Liposomen mit einem kovalent gebundenen Antigen, Antikörper oder einem anderen interessierenden Analyten). Die Herstellung der immunaktiven Liposomen umfaßt die Herstellung von Analytderivaten aus Phosphatidylethanolamin (PE) oder anderen Phospholipiden und anschließender Aufnahme spezifischer Mengen dieses Phospholipid-Analyt-Konjugats in die Liposomenoberflächenmembran während der Bildung des Liposomenvesikels.
Die US-Patentschrift Nr. 4 480 041 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung immunaktiver Liposomen unter Verwendung von Phosphotriester-Zwischenprodukten von mit einem Analyten derivatisierten Phospholipiden. Die Synthese der Phosphotriester-Zwischenprodukte und die Umwandlung zum gerichteten Phospholipid-Analyt-Derivat umfaßt ein fünf- oder sechsstufiges Verfahren.
Die US-Patentschrift Nr. 4 193 983 beschreibt die Herstellung eines Konjugats eines carbaxylat-enthaltenden Phenobarbitols und Dipalmitoylphosphatidylethanolamins (DPPE) durch (1) Umsetzen des Phenobarbitols mit Oxalsäure und anschließend (2) Umsetzen des so erhaltenen Reaktionsprodukts mit DPPE zur Herstellung des Konjugats. Diese Patentschrift beschreibt weiterhin die Derivatisierung von Cardiolipin zu einem Cardiolipin-Hemisuccinat durch die Reaktion der Hydroxylgruppe des Glycerinrestes im Cardiolipin mit Succinsäureanhydrid. Dieses Hemisuccinat wird dann durch Oxalylchlorid aktiviert und anschließend mit Fluoresceinamin umgesetzt, um ein Cardiolipin-Succinat-Fluorescein-Konjugat herzustellen.
In O'Connell et al., "A highly Sensitive Immunoassay System Involving Antibody-Coated Tubes and Liposomes-Entrapped Dye", Clin. Chem. 31/9, 1424-1426 (1985) wird die direkte Kopplung von DPPE und 3-Ketodigoxigenin unter Bildung einer Schiffschen Base beschrieben, die dann mit Natriumcyanogenborhydrid reduziert wird, um ein DPPE-Digoxigenin-Konjugat herzustellen.
Haga et al., "Drug Sensor: Liposome Immunosensor for Theophylline", Anal. Biochem. 118, 286-293 (1981) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung eines Theophyllin-Phosphatidylethanolamin-(PE-)Konjugats durch (1) Umsetzen von Theophyllin und Thionylchlorid, um ein Säurechlorid von Theophyllin (ein Theophyllinanalogon mit einer Carboxylatgruppe) herzustellen, und anschließend (2) Umsetzen des Säurechlorids von Theophyllin mit PE, um das Theophyllin-PE-Konjugat herzustellen.
Die EP-A-144 084 offenbart den Einbau eines Phospholipid-Liganden-Komposits in Liposomen und nachfolgender Ankopplung eines immunaktiven Partners an das Liposom über die auf der Oberfläche des Liposoms angeordnete, verbleibende funktionelle Gruppe des Phospholipid-Liganden-Komposits. In ähnlicher Weise wird in der EP-A-276 165 (die einen früheren Prioritätstag beansprucht, jedoch nicht vorveröffentlicht ist) das Phospholipid mit einem Liganden umgesetzt, um ein Liposom zu bilden, worauf die Umsetzung mit einem Analyten erfolgt.
Die WO-86/00142 offenbart einen Immunliposomenassay, worin ein Liganden-Lipid-Komplex zur Stabilisierung einer ansonsten instabilen Liposomenzusammensetzung verwendet wird.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zur Herstellung von Phosphodiester-Ligand-Analyt-Konjugaten bereitzustellen, die zur Herstellung immunaktiver Liposomen geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung nutzt ein Verfahren zur Herstellung eines analyt-funktionalisierten Liposoms, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt
a) Umsetzen eines Polaren Phospholipids der nachfolgenden allgemeinen Formel:
worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxyl, R", OR" oder O R" sind,
worin R" eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigtoder geradkettige Alkyl- oder Alkylengruppe mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen ist, und worin wenigstens einer der Reste R&sub1; und R&sub2; O R" oder OR" ist,
während der andere unabhängig vom ersten Wasserstoff, Hydroxyl, R", OR" oder O R" ist; und
worin R&sub3; eine verzweigt- oder geradkettige Aminoalkylgruppe mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen ist; mit einem Liganden durch direkte Derivatisierung, um einen polaren Phospholipid-Liganden-Verbundstoff herzustellen;
b) Umsetzen des polaren Phospholipid-Liganden-Verbundstoffs, der vorher aktiviert worden sein kann, mit einem Analyten, um das Phosphodiester-Liganden-Analyt-Konjugat herzustellen, wobei der Ligand mit dem R&sub3;-Rest des Phospholipids und mit dem Analyten reaktionsfähig ist;
c) Ausbilden eines analyt-funktionalisierten Liposoms hieraus, das auf seiner Oberfläche mit dem Analyten funktionalisiert ist und einen im Liposom angeordneten Marker aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Bildung eines analyt-funktionalisierten Liposoms zur Verwendung in Immunoassays, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:
a) Herstellen eines Phosphodiester-Ligand-Analyt-Konjugats durch ein derartiges Verfahren;
b) Zugeben eines Markers zur das Konjugat enthaltenden Dispersion; und
c) Ausbilden eines analyt-funktionalisierten Liposoms hieraus, das auf seiner Oberfläche mit dem Analyten funktionalisiert ist und einen Marker aufweist, der im Liposom angeordnet ist.
Das Phosphodiester-Ligand-Analyt-Konjugat kann dann, falls erwünscht, gereinigt werden.
Bevorzugt sind R&sub1; und R&sub2; O R" oder OR"; R&sub3; ist eine geradkettige Aminoalkylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, und R" ist eine gesättigte geradkettige Alkylkette mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen. Bevorzugter sind R&sub1; und R&sub2; O R"; R&sub3; ist
Aminoethyl; und R" ist eine gesättigte geradkettige Alkylgruppe mit 15 Kohlenstoffatomen.
Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare Ligand wirkt als Verbinder oder Spacer zwischen dem Phospholipid und dem Analyten, d.h. der Ligand ist eine bifunktionelle Verbindung, die die Anlagerung an einem Ende des gewünschten Analyten und am anderen Ende des Phospholipids ermöglicht. Die Liganden sind bevorzugt Alkylgruppen mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, verzweigt oder unverzweigt, die wahlweise substituiert sind mit 0 bis 20 Heteroatomen, normalerweise Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel oder Phosphor, und zwei unterschiedlichen funktionellen Gruppen mit Carboxyl-, Amin-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Imidat-, Maleimid-, 2-Pyridylthio-, Halogenid-, Isothiocyanat- oder Anhydridresten, bevorzugt Carboxyl-, Amin-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylresten, bevorzugt an den gegenüberliegenden Enden des Liganden. Das eine Ende des Liganden ist zur Anlagerung an das Phospholipid, bevorzugt über eine Carboxylgruppe, ausgebildet. Der tatsächliche Anlagerungsmechanismus der Liganden an die Phospholipide und Analyten wird von der Natur der reaktiven Komponenten abhängig. Bestimmte Liganden müssen aktiviert werden (derivatisiert, um eine reaktive Gruppe zu bilden, die zur Kopplung an das Phospholipid befähigt ist), bevor der Ligand mit dem Phospholipid umgesetzt wird. Bestimmte Phospholipid-Ligand-verbundstoffe müssen ebenfalls aktiviert werden (Derivatisieren des Liganden des Phospholipid-Ligand-Verbundstoffs, um eine reaktive Gruppe zu bilden, die zur Kopplung an den gewünschten Analyten befähigt ist), bevor der Phospholipid-Ligand-Verbundstoff mit dem Analyten umgesetzt wird. Anhydride, Thionylchlorid, Sulfonsäurederivate, N-Hydroxysuccinamide, Carbodiimide und andere Mittel zur Aktivierung (oder zur Bildung reaktiver Gruppen), die im Stand der Technik bekannt sind, sind zur Herstellung des Liganden zur Reaktion mit dem Phospholipid oder zur Herstellung des Phospholipid-Ligand-Verbundstoffs zur Umsetzung mit dem Analyten verwendbar. Der notwendige Aktivierungs-(oder Derivatisierungs-)Typ wird von der zu verwendenden besonderen Phospholipid-, Ligand- und Analytkombination abhängen.
Verwendbare Liganden umfassen hetero- und homo-bifunktionelle Vernetzungsreagentien und zyklische Säureanhydride. Beispiele für bevorzugte Liganden umfassen Succinimyl-4(p-maleimidophe nyl)-butyrat (SMPB), N-Succinimydyl-3(2-pyridyldithio )propionat; 2-Iminothiolan; Succinsäureanhydrid und ähnliche Verbindungen.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Analyten sind solche Materialien, die zur Kopplung an den Liganden des polaren Phospholipid-Ligand-verbundstoffs befähigt sind. Beispiele für geeignete Analyten umfassen Antigene, zirkulierende Hormone, Antibiotika und andere therapeutische Arzneistoffe und Derivate hiervon. Verwendbare Analyten umfassen Folat, Digoxin, B-12 und Theophyllin. Bevorzugte Analyten sind amino-enthaltende Analyten wie Thyroxin und Triiodthyronin. Bestimmte Analyten, beispielsweise Folat, Digoxin oder B-12, können eine Aktivierung (Derivatisierung) erfordern, um diese Analyten zur Kopplung an das liganden-enthaltende Phospholipid zu befähigen. Der notwendige Derivatisierungstyp wird von der zu verwendenden spezifischen Analyt-Liganden-Kombination abhängen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Phospholipid eine Phosphatidylethanolamin(PE-)Verbindung der nachfolgenden Formel:
Die Reaktion von PE mit einem zyklischen Anhydrid, beispielsweise einem Succinsäureanhydrid, ergibt ein Phosphatidyldiesterderivat (PE-Suc) der nachfolgenden Formel:
Die Carboxylgruppe des PE-Suc-Derivats ist durch Umsetzung mit einem Aktivierungsreagens, beispielsweise Ethylchlorformiat (zur Bildung eines Mischanhydrids), Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid (zur Bildung eines aktiven Esters) oder Oxalylchlorids oder Thionylchlorids (zur Bildung eines Acylchlorids) aktivierbar.
Die Aktivierung des PE-Suc-Derivats durch das Mischanhydridverfahren ist in einem aprotischen Lösungsmittel, bevorzugt Chloroform, durchführbar. Das Aktivierungsmittel kann ein verzweigtkettiges oder geradkettiges Alkylchlorformiat sein, wobei die Alkylgruppe bevorzugt eine Ethylgruppe ist. Die Zugabe einer organischen Base ist erforderlich, um allen entstandenen Chlorwasserstoff zu neutralisieren. Diese Aktivierung wird bevorzugt bei einer Temperatur von etwa -20ºC bis etwa 25ºC, bevorzugter von etwa 0ºC bis etwa 10ºC für einen Zeitraum von etwa 5 Minuten bis etwa 90 Minuten, am bevorzugtesten von etwa 20 Minuten bis etwa 30 Minuten, durchgeführt.
Der Analyt, beispielsweise Thyroxin, wird dann in äquimolaren Mengen oder in molarem Überschuß zur PE-Suc-Derivat-Menge zugegeben, da die Trennung des gewünschten Konjugats (z.B. PE- Suc-T&sub4;) von überschüssigem, nicht umgesetztem Analyt (z.B. T&sub4;) leichter ist als von nicht umgesetztem PE-Suc.
Sofort nach Zugabe des Analyten sollte ein polares, aprotisches Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylformamid (DMF), in einem Volumen im Bereich von der Hälfte bis zum Dreifachen der Ausgangsreaktionsmischung zugegeben werden. Die Ausbeute des erwünschten Konjugats wird durch Zugabe des Lösungsmittels verbessert. Nach Zugabe des Lösungsmittels wird die Reaktion etwa 0,5 Stunden bis etwa 16 Stunden lang bei Raumtemperatur belassen.
PE-Suc ist ebenfalls durch ein aktives Veresterungsverfahren unter Verwendung eines Carbodiimids, beispielsweise von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) in äquimolaren Mengen oder im Überschuß zum PE-Suc-Derivat, aktivierbar. PE-Suc wird zunächst mit DCC in einem aprotischen, polaren oder unpolaren, bevorzugt einem unpolaren, Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform, bei Raumtemperatur oder bevorzugt bei einer niedrigeren Temperatur etwa 5 bis etwa 30 Minuten lang, bevorzugt etwa 10 bis etwa 15 Minunten lang, umgesetzt, um ein Reaktionsaddukt zwischen dem PE-Suc und dem DCC zu bilden. NHS wird dann zu diesem Reaktionsaddukt zugegeben und bei Raumtemperatur über Nacht umgesetzt, um den gewünschten Ester, PE-Suc-NHS der nachfolgenden Formel, zu bilden:
wobei Dicyclohexylharnstoff als Nebenprodukt entsteht. NHS kann zur Reaktionsmischung in fester Form zugegeben werden, worauf sich die Zugabe eines polaren, aprotischen Lösungsmittels wie DMF anschließt. Alternativ hierzu kann NHS zunächst im polaren Lösungsmittel gelöst und dann zur Reaktionsmischung zugegeben werden.
Vor der Zugabe des Analyten (z.B. Thyroxin) werden die aprotischen Lösungsmittel aus der Reaktionsmischung, beispielsweise durch Verdampfung, entfernt. Der Analyt wird dann in äquimola- ren Mengen oder im molaren Überschuß zum PE-Suc-Derivat zur Reaktionsmischung zugegeben. Sofort nach Zugabe des Analyten wird ein polares, protisches Lösungsmittel, bevorzugt Methanol, in Gegenwart einer organischen Base, beispielsweise Triethylamin, im Überschuß zugegeben. Die Reaktion wird dann bei Raumtemperatur über Nacht durchgeführt, um das gewünschte Konjugat, beispielsweise PE-Suc-T&sub4;, zu bilden.
Um das entstandene gewünschte Konjugat aus der Reaktionsmischung abzutrennen, wird ein Reinigungsverfahren, beispielsweise eine präparative Dünnschichtchromatographie (PLC), verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung eines PLC-Verfahrens wird die das gewünschte Konjugat enthaltende Rohreaktionsmischung zunächst in einem Lösungsmittelsystem mit einer ausreichenden Polarität gelöst, um eine gleichmäßige Adsorption des Materials über die Dicke des Silicagels einer präparativen Dünnschichtchromatographieplatte zu erleichtern. Bevorzugt werden zur PLC-Aufreinigung präparative Dünnschichtchromatographieplatten (20 x 20 cm) mit einem vorbeschichteten Silicagel (Teilchen mit einer Porengröße mit 60 Ångström (x 10&supmin;¹&sup0; m), 2 mm Dicke) mit einem Fluoreszenzindikator verwendet. Das verwendete Lösungsmittelsystem sollte gleich oder polarer sein wie ein 20% Methanol/Chloroform-Lösungsmittelsystem, bevorzugt sollte es durch Zugabe von Wasser verstärkbar sein. Ein bevorzugtes Lösungsmittelsystem ist Chloroform/Methanol/Wasser in einem Verhältnis von 73:24:3. Die Rohreaktionsmischung wird auf die Platten in einer Menge von zwischen 125-250 mg/Platte, bevorzugt 150-200 mg/Platte, in einem Volumen von zwischen 1-4 ml/Platte, bevorzugt von zwischen 2-3 ml/Platte1aufgebracht.
Die Reinigung eines bevorzugten Konjugats, PE-Suc-T&sub4;, aus der Rohreaktionsmischung verwendet eine organische Säure, die ein Lösungsmittelsystem, beispielsweise Chloroform/Methanol/Essigsäure (60:20:3), enthält, das PE-Suc-T&sub4; und nicht umgesetztes T&sub4; in zwei verschiedene Banden auf der Platte auftrennt. Die PE- Suc-T&sub4;-Bande wird dann von der Platte abgetrennt und durch Elution in einem polaren Lösungsmittelsystem, beispielsweise Chloroform/Methanol/Wasser (55:40:5), effizient wiedergewonnen.
Häufig wird das so hergestellte PE-Suc-T4 mit nicht umgesetztem PE-Suc kontaminiert sein. Um das PE-Suc-T4 vom PE-Suc abzutrennen, wird ein keine Säure enthaltendes polares Lösungsmittelsystem, beispielsweise Chloroform/Methanol/Wasser (55:40:5), auf einer zweiten PLC-Platte verwendet, auf der die eluierte Bande von der ersten PLC-Platte aufgebracht wird. Das PE-Suc-T&sub4; wird abgetrennt und eluiert. Dieser PLC-Schritt zur Abtrennung von PE-Suc-T&sub4; von nicht umgesetztem PE-Suc wird wiederholt, bis eine PE-Suc-T&sub4;/Chloroformlösung (0,5 mg/ml) eine Absorption bei A300 von 1,05 oder darüber aufweist. Das so hergestellte PE- Suc-T&sub4; ist dann zur Thyroxin-Liposomen-Präparation einsetzbar.
Andere präparative Chromatographieverfahren, die verwendbar sind, um das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte gewünschte Konjugat aus der Rohreaktionsmischung abzutrennen, umfassen Kurzsäulenchromatographieverfahren mit geringem oder mittlerem Druck, Flash-Chromatographie und Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC). Es ist zu erwarten, daß HPLC, obwohl es eine kostspielige Ausrüstung erfordert, ein sehr effizientes und einfaches Verfahren darstellt, wenn einmal optimale Elutionsbedingungen bestimmt wurden.
Liposomen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Konjugate aufnehmen, sind unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren herstellbar. Beispielsweise sind in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, S. 467-508 (1980) verschiedene einsetzbare Verfahren beschrieben.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 1

Herstellung von N-(3-Carboxypropionyl) (1,2-dipalmitoyl-3-racphosphatidyl)ethanolamin (PE-Suc)

Eine Mischung aus (1,2-Dipalmitoyl-3-rac-phosphatidyl)ethanolamin (PE, 440 mg, 0,637 mMol), Succinsäureanhydrid (76 mg, 0,764 mMol), Triethylamin (0,09 ml, 0,637 mMol) in 40 ml DMF:CHCl&sub3; (1:1) wurde gerührt, bei 65ºC 1,5 Std. lang erhitzt und in Vakuum abgedampft. Der ölige Rückstand wurde mit 4 ml 20% Methanol in Chloroform aufgenommen und auf präparative TLC- Silicagelplatten (Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., Katalog Nr. 5717-7) mit einem Beladungsverhältnis von 0,25 g/Platte aufgebracht. Die Platten wurden mit Chloroform/Methanol/Wasser (55:40:5) entwickelt. Eine schwache UV-Bande (Rf = 0,30) wurde abgenommen und mit Chloroform/Methanol/Wasser (54:40:5) eluiert. Das Elutionsmittel wurde verdampft und der Rückstand mit 30 ml Chloroform pulverisiert und filtriert. Das Filtrat wurde abgedampft, um das gewünschte Produkt PE-Suc (470 mg, 93%) zu erhalten.

Beispiel 2

Herstellung von N-[3-(α-Carboxy-3,3',5,5'-tetraiodo-L-thyrony)propionyl] (1,2-dipalmitoyl-3-rac-phosphatidyl)-ethanolamin (PE-Suc-T&sub4;)

(A) Mischanhydridverfahren

Eine Lösung von PE-Suc (402 mg, 0,508 mMol aus Beispiel 1) in 10 ml Chloroform wurde mit Triethylamin (100 ul, 0,70 mMol) behandelt, in einem Eisbad abgekühlt und dann mit Ethylchlorformiat (65 ul, 0,70 mMol) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde 20 Minuten lang gerührt, mit L-Thyroxin (Natriumsalz, 406 mg, 0,508 mMol) und 10 ml Dimethylformamid behandelt. Das Eisbad wurde entfernt. Nach 10-15 Minuten wurde eine vollständige Auflösung erhalten. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, mit 10 ml Xylen zweimal bis zur vollständigen Trockne koverdampft. Das gewünschte PE-Suc-T&sub4; wurde durch wiederholte PLC wie folgt isoliert: Die getrocknete Reaktionsmischung wurde in 10 ml Chloroform/Methanol/Wasser (73:24:3) gelöst, auf präparative TLC-Silicagelplatten (Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., Katalog Nr. 5717-7) mit 200 mg/Platte aufgebracht und mit Chloroform/Methanol/Essigsäure (60:20:3) entwickelt. Das gewünschte Produkt wurde als UV-Hauptabsorptionsbande (Rf = 0,42) identifiziert, die ebenfalls mit einem Molybdänspray (Test auf Organophosphat) ein positives Ergebnis ergab. Die Bande wurde abgenommen und mit 150 ml Chloroform/- Methanol/Wasser (54:40:5) eluiert. Der aus der Verdampfung des Eluats erhaltene Rückstand wurde einer zweiten PLC-Aufreinigung unter Verwendung von Chloroform/Methanol/Wasser (65:25:4) unterzogen, um die Platten zu entwickeln. Die gewünschte Bande wurde identifiziert, abgenommen, eluiert und in gleicher Weise wie bei der ersten PLC verdampft. Der so erhaltene Rückstand wurde mit 30 ml Chloroform pulverisiert und über ein Whatman #1-Filterpapier durch Schwerkraft abfiltriert. Das Filtrat wurde verdampft, um das reine gewünschte Produkt PE-Suc-T&sub4; (202 mg, 25%) zu erhalten.
Berechnete Analyse für C&sub5;&sub6;H&sub8;&sub7;N&sub2;I&sub4;O&sub1;&sub4;P: C, 43,36; H, 5,65; N, 1,81.
Gefunden: C, 43,51; H, 5,90; N, 1,67.

(B) Aktives Veresterunusverfahren

Eine Lösung aus PE-Suc (100 mg, 0,126 mMol, aus Beispiel 1) in 5 ml Chloroform wurde in einem Eisbad abgekühlt, mit DCC (39 mg, 0,19 mMol) in 1 ml Chloroform behandelt. Nach 10 Minuten wurde NHS (22 mg, 0,19 mMol) in 1 ml DMF zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und mit 2 ml xylen zur vollständigen Trockne koverdampft. Zum Rückstand wurden Thyroxin (Natriumsalz, 150 mg, 0,19 mMol) und Triethylamin (90 u1, 0,63 mMol) in 10 ml Methanol zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und zur Trockne eingedampft.
Das gewünschte PE-Suc-T&sub4; (50 mg, 25,6%) wurde durch wiederholte PLC in gleicher Weise wie oben in (A) beschrieben isoliert.

(C) Aktives Veresterungsverfahren

Das gleiche wie in (B) beschriebene Verfahren wurde verwendet, mit der Ausnahme, daß das gewünschte PE-Suc-T&sub4; isoliert und aus der Reaktionsmischung durch Flash-Chromatographie auf einer 100-ml-Glassäule (Aldrich Chemical Col, Inc., Milwaukee, WI, Katalog Nr. Z14, 735-4), gepackt mit einer Silicagelaufschlämmung (40 um, J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, N.J., Katalog Nr. 7024-1), in Chloroform/Methanol/Essigsäure (73:24:3) unter 10-15 psi Stickstoff gereinigt wurde. Die das reine PE- Suc-T&sub4; enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde erneut durch PLC unter Verwendung von Chloroform/Methanol/Wasser (55:40:5) aufgereinigt, um die Platte zu entwickeln. Die Ausbeute an reinem PE- Suc-T&sub4; betrug 16,2%.

Beispiel 3

Herstellung von N-[3-(α-Carboxy-3,3',5-triiodo-L-thyronyl)- propionyl](1,2-dipalmitoyl-3-rac-phosphatidyl)ethanolamin (PE-Suc-T&sub3;)

Eine Lösung aus PE-Suc (360 mg, 0,45 mMol aus Beispiel 1) in 7 ml Chloroform wurde mit Triethylamin (78 ul, 0,54 mMol) behandelt, in einem Eisbad abgekühlt und mit Ethylchlorformiat (54 ul, 0,54 mMol) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde 25 Minuten lang gerührt und mit T&sub3; (293 mg, 0,45 mMol) und 7 ml Dimethylformamid behandelt. Das Eisbad wurde entfernt. Eine vollständige Auflösung wurde nach 10-15 Minuten erhalten. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und mit 10 ml Xylen zur vollständigen Trockne koverdampft.
Das gewünschte PE-Suc-T&sub3; (65 mg, 9,5%) wurde durch PLC in gleicher Weise wie in Beispiel 2A oben beschrieben isoliert.

Beispiel 4

Herstellung immunaktiver T&sub4;-Liposomen unter Verwendung von PE-Suc-T&sub4;

A. Herstellung eines Lipidfilms

Eine Lösung aus PE-Suc-T4 (0,95 mg, OD 300 = 2,0/ul Chloroform, aus Beispiel 2A), L-Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) (125 mg) (Avanti Polar Lipids, Inc., Birmingham, AL), Cholesterin (67,5 mg) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und L-Dipalmitoylphosphatidylglycerin (11,5 mg) (Avanti Polar Lipids, Inc., Birmingham, AL) in 5 ml Chloroform wurde auf einer Kristallisationsschale (Corning Glass Works, Corning, N.Y.) mit einem Durchmesser von 8 cm unter Vakuum von 60-100 mm Hg bei Raumtemperatur 2 Std. lang und dann über Nacht (16 Std.) bei 10-100 milliTorr eingedampft, um eine trockene, dünne homogene Lipidschicht auf dem Boden der Platte (Schale) zu erhalten.

B. Lipidvesikelbildung/Enzymeinkapselung

Die den in A hergestellten Lipidfilm enthaltende Platte wurde auf einem Orbital-Schüttelwasserbad bei 38-39ºC 10-12 Min. lang vorgewärmt. Eine Lösung aus Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (37,5 kU) (Toyobo Biochemicals Co., Osaka, Japan) in 15 ml 2% Glycerin/0,25 mM EDTA, pH 7,3 wurde zum angewärmten Lipidfilm in der Platte zugegeben. Die Platte wurde mit Parafilm verschlossen und bei 150-250 Upm bei 38-39ºC 20 Min. lang geschüttelt, um Lipidvesikel zu bilden.

C. Dialyse

Die in B hergestellten Lipidvesikel wurden in der Platte auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, in ein Dialyserohr unter Verwendung einer Pasteur-Pipette überführt und dann gegen 1 l kalten Tris-Puffer aus 0,1 M Tris/0,5 mM EDTA/0,03 M Nacl/0,01% Natriumazid, pH 7,8 bei 2-8ºC 2 Tage lang dialysiert, wobei nach 24 Std. der Puffer einmal gewechselt wurde.

D. Extrusion/Dimensionierung von Lipidvesikeln

Die dialysierten Lipidvesikel aus C wurden in ein Becherglas überführt und bei 30-32ºC 10 Min. lang in einem Wasserbad erwärmt und dann durch Polycarbonatmembrane mit einem Durchmesser von 25 mm (Nucleopore Corp., Pleasanton, CA) mit den nachfolgenden Porengrößen und bei den entsprechenden Drücken extrudiert:
3,0 um - 18 psi
2,0 um - 20 psi
1,0 um - 24 psi
0,6 um - 30 psi
wobei der Liposomenextruder verwendet wurde.

E. Waschen der dimensionierten Vesikel

Die extrudierten Liposomenvesikel aus D wurden aus dem Extruder entfernt und bei 35000 Upm (BECKMAN L5-75, Typ 65-Rotor) bei 5-10ºC 60 Min. lang zentrifugiert. Der klare Überstand wurde dann entfernt, und das Pellet wurde im in C beschriebenen Tris-Puffer resuspendiert und abzentrifugiert. Dieser Schritt wurde drei weitere Male wiederholt. Das so erhaltene gewaschene Liposomenvesikelpellet wurde in 10 ml Tris-Puffer suspendiert. Die so hergestellten T&sub4;-Liposomen wurden dann in einem Enzym-Membran- Immunoassay (EMIA) verwendet.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines analyt-funktionalisierten Liposoms, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

a) Umsetzen eines polaren Phospholipids der nachfolgenden allgemeinen Formel:

worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxyl, R", OR" oder O R"

sind,

worin R" eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigt- oder geradkettige Alkyl- oder Alkylengruppe mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen ist, und worin wenigstens einer der Reste R&sub1; und R&sub2; O R" oder OR" ist, während der andere unabhängig vom ersten Wasserstoff, Hydroxyl, R", OR" oder O R" ist; und

worin R&sub3; eine verzweigt oder geradkettige Aminoalkylgruppe mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen ist; mit einem Liganden durch direkte Derivatisierung, um einen polaren Phospholipid-Liganden-Verbundstoff herzustellen;

b) Umsetzen des polaren Phospholipid-Liganden-Verbundstoffs, der vorher aktiviert worden sein kann, mit einem Analyten, um das Phosphodiester-Liganden-Analyt-Konjugat herzustellen, wobei der Ligand mit dem R&sub3;-Rest des Phospholipids und mit dem Analyten reaktionsfähig ist;

c) Ausbilden eines analyt-funktionalisierten Liposoms hieraus, das auf seiner Oberfläche mit dem Analyten funktionalisiert ist und einen im Liposom angeordneten Marker aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig O R" oder OR" sind; und

R" ein gesättigtes geradkettiges Alkyl mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen ist; und R&sub3; eine geradkettige Aminoalkylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Ligand ein Alkyl mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, verzweigt- oder geradkettig, wahlweise substituiert mit 0 bis 20 Heteroatomen, und zwei verschiedenen funktionellen Gruppen aufweist; und/oder ein hetero- oder homo-bifunktionelles Vernetzungsmittel oder ein zyklisches Säureanhydrid ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Analyt ein amino-enthaltender Analyt ist; und/oder Thyroxin oder Triiodthyronin ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Phosphodiester-Ligand-Analyt-Konjugat durch präparative Chromatographie gereinigt wird.

6. Verfahren zur Bildung eines analyt-funktionalisierten Liposoms zur Verwendung in Immunoassays, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

a) Herstellen eines Phosphodiester-Ligand-Analyt-Konjugats durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5;

b) Zugeben eines Markers zur das Konjugat enthaltenden Dispersion; und

c) Ausbilden eines analyt-funktionalisierten Liposoms hieraus, das auf seiner Oberfläche mit dem Analyten funktionalisiert ist und einen Marker aufweist, der im Liposom angeordnet ist.