DE3853552T2 - Lichtempfindliche Kalzium-Chelatoren. - Google Patents
Lichtempfindliche Kalzium-Chelatoren.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft lichtempfindliche (photolabile) Calcium²&spplus;-Chelatoren, deren Affinität zu Calcium durch Belichtung gesenkt wird.
- Obwohl Ca²&spplus; ein gut etablierter intrazellulärer Botenstoff ist, gibt es immer noch viele unbeantwortete Fragen bezüglich der Kinetik und der räumlichen Lokalisierung seiner Wirkungen. Als Mittel zur Lieferung von Daten, die zur Beantwortung einiger dieser Fragen benötigt werden, werden nun Chelatoren, deren Affinität zu Calcium durch Belichtung verringert wird, beispielsweise diejenigen, die in dem US-Patent Nr. 4,689,432 offenbart wurden, zur Induzierung von Schwankungen der Konzentrationen an freiem Calcium verwendet, die ähnlich denen sind, die in vivo auftreten. Siehe hierzu auch die Publikation von Gurney und Lester (1987).
- Obwohl die photolabilen Chelator-Verbindungen, die in dem US-Patent Nr. 4,689,432 offenbart sind, nützlich zur Untersuchung einiger Prowsse sind, die Calcium einschließen, ist unglücklicherweise die Calcium²&spplus;-Affinität einiger dieser Verbindungen nicht stark genug zur Untersuchung anderer Prozesse. Beispielsweise tragen bei Chelatoren wie nitr-2, einer Verbindung, die in dem US-Patent Nr. 4,689,432 offenbart ist, bei Werten an freiem Calcium²&spplus; im Zytosol, wie sie typisch sind für ruhende Zellen, nur etwa die Hälfte oder weniger der unphotolysierten Chelator-Moleküle Calcium²&spplus;-Ionen. Offensichtlich ist es so, daß umso weniger Calcium²&spplus;-Ionen durch Photolyse freigesetzt werden können, je weniger Calcium²&spplus;-Ionen über den Chelator gebunden werden. Darüberhinaus puffern die Moleküle, die einer Photolyse während des Einstrählens von Licht entkommen, den Anstieg an freiem Calcium ab, der durch die Moleküle erzeugt wird, die photolysieren.
- Die vorliegende Erfindung offenbart eine neue Klasse photolabiler (lichtempfindlicher) Calcium-Chelatorverbindungen. Anders als die Calcium-Chelatoren, die in der Druckschrift US-4,689,432 offenbart sind, in der die beiden Hälften des Chelators über eine einfache 1,2-Ethandiyl-Einheit (-CH&sub2;CH&sub2;-Einheit) verbunden sind, modifizieren die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die stereochemische Konformation dieser Bindung, indem raumgreifende Substituenten addiert sind oder die Bindung in einen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring eingebaut ist. Derartige stereochemische Modifikationen können die Ca²&spplus;-Affinität um das 75-fache senken oder um das 4-fache erhöhen, verglichen mit deijenigen der Verbindungen des Standes der Technik. Diese neuen Verbindungen geben Ca²&spplus; auch schneller nach der Photolyse frei als dies Verbindungen des Standes der Technik wie beispielsweise nitr-2 tun. Diese Unterschiede machen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung besonders nützlich zur Untersuchung der Wirkungen von Ca²&spplus; auf solche Phänomene wie den Ionenkanal-Durchlaß und die Muskelkontraktion.
- Figur 1, die einen Teil -1 und einen Teil -2 aufweist, ist ein Fließschema, das die Synthese von Chelatoren gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. In dem Fließschema sind Reagenzien, die gekauft oder mittels bekannter Standardverfähren hergestellt wurden, durch arabische Zahlen in Klammern identifiziert. Neu synthetisierte Verbindungen sind mit römischen Zählen und kleinen Buchstaben wie beispielsweise a, b, c usw. identifiziert. 1m Rähmen dieser Notation bedeutet a, daß die Verbindung eine cis-Cyclopentandiyl-Bindung enthält; bedeutet b, daß die Verbindung eine trans-Cyclopentandiyl- Bindung enthält; bedeutet c, daß die Verbindung eine cis-Cyclohexandiyl-Bindung enthält; bedeutet d, daß die Verbindung eine trans-Cyclohexandiyl-Bindung enthält; bedeutet e, daß die Verbindung eine cis-2,3-Butandiyl-Bindung enthält; bedeutet f, daß die Verbindung eine trans-2,3-Butandiyl-Bindung enthält; und bedeutet g, daß die Verbindung eine cis-3,4-Tetrahydrofurandiyl-Bindung enthält.
- Figur 2 ist ein Fließbild, das die chemischen Formeln von Vorstufen-Modellen (Va-g) eines Chelatortyps gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt. Das Fließbild zeigt auch die Formel einer bekannten Verbindung mit der nachfolgend gezeigten "Stamm-"Bindung:
- Die in der vorliegenden Beschreibung offenbarten neuen photolabilen Ca²&spplus;-Chelatoren sind namensmäßig mit Bindestrichen bezeichnet, um die Zahl 1 von dem Buchstaben 1 zu unterscheiden, z.B. nitr-7.
- Entsprechend der Benennung in der vorliegenden Beschreibung bedeutet "nitr-7" cis-1-(2- Bis(carboxymethyl-)amino-5-(1-hydroxy-1(2-nitro-4,5-methylendioxyphenyl-)methyl-)phenoxy-)2-(2-bis(carboxymethyl-)amino-5-methylphenoxy-)cyclopentan. In dem Fließschema gemäß Figur 1 ist die Verbindung nitr-7 als Verbindung VIIa gezeigt.
- In der vorliegenden Beschreibung bedeutet "TMS-Triflat" oder "TMS-OTf" Trimethylsilyltrifluormethansulfonat.
- Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet "MOPS" 3-(N-Morpholino-)propansulfonsäure.
- Im Rähmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet "EGTA" Ethylenglykolbis(betaaminoethylether-)N,N,N',N'-tetraessigsäure.
- Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet "BAPTA" 1,2-Bis(2-aminophenoxy-)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure. Die chemische Struktur von BAPTA ist:
- Im Rähmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet "quin-1" 2-[[2-[Bis(carboxymethyl-)amino-]5-methylphenoxy-]methyl-]8-[bis(carboxymethyl-)amino-]chinolin.
- Im Rähmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet "quin-2" 2-[[2-[Bis(carboxymethyl-)amino-]5-methylphenoxy-]methyl-]6-methoxy-8-[bis(carboxymethyl-)amino-]chinolin. Die chemische Struktur für quin-2 ist:
- Im Rähmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet "BAPTA-ähnlich" substituierte Derivate von BAPTA, bei denen die essentiellen charakteristischen Eigenschaften der beiden Bis(carboxymethyl-)amino-substituierten Phenylringe erhalten sind, wobei diese Ringe in den ortho-Positionen zu den Aminen über eine vier Atome aufweisende Brücke verbunden sind, wobei das jedem Phenylring benachbarte Atom ein N- oder O-Atom ist und die beiden zentralen Atome jeweils C-Atome sind. Durch diese Definition soll ausgedrückt werden, daß der Begriff "BAPTA-ähnlich" Verbindungen wie quin-1 und quin-2 einschließt.
- Im Rähmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Begriff "pharmazeutisch annehmbare Ester" solche in einfacher Weise hydrolysierbaren Ester, die in der pharmazeutischen Industrie bekannt sind und verwendet werden, insbesondere alpha-Acyloxyalkyl-ester.
- Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Begriff "pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Salze" Carbonsäuresalze, in denen das Gegenion oder die Ionen alle Na, K, NR&sub4;&spplus; (worin R = H, C&sub1;- bis C&sub4;-Alkyl oder eine Mischung daraus ist), Cholin, N- Methylglucamin, Ca oder Mg oder irgendeine Kombination dieser Gegenionen sind, oder irgendeine Kombination von sauren Salzen oder von diesen Gegenionen zusammen mit freien Säuregruppen.
- Im Rähmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet "microM" micromolar.
- Die in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Temperaturen sind in Grad Celcius angegeben.
- 1. A.M. Gurney und H.A. Lester, (1987) "Light-Flash Physiology with Synthetic Photosensitive Compounds", Physiol. Rev. 67(2): 583-617.
- 2. A.M. Gurney, R.Y. Tsien und H.A. Lester, (1987) "Activation of a potassium current by rapid photochemically generated step increases of intracellular calcium in rat sympathetic neurons", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:3496-3500.
- 3. J. March, (1977) Advanced Organic Chemistry, Second Edition, McGraw Hill auf den Seiten 498-499.
- 4. A.E. Martell und R.M. Smith, (1974) Critical Stability Constants, Band 1, Plenum Press, NY.
- 5. R. Noyori, S. Murata und M. Suzuki, (1981) Tetrahedron 37:3899-3910.
- 6. R.Y. Tsien, (1980) Biochemistry 19:2396-2404.
- 1. Tsien et al., US-Patent Nr. 4,689,432, erteilt 25. August 1987.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt eine neue Klasse von Verbindungen, die bei Belichtung ihrer Affinität zu Calcium ändern. Die Verbindungen enthalten ein lichtempfindliches (photolabiles) Nitrobenzylderivat, das an eine Tetracarboxylat-Stammverbindung gebunden ist, die die octa-koordinierenden chelatisierenden Gruppen aufweist, die für EGTA oder BAPTA kennzeichnend sind. Jedoch modifizieren im Unterschied zu EGTA oder BAPTA- ähnlichen Verbindungen, in denen die beiden Hälften des Chelators über eine einfache 1,2-Ethandiyl-Einheit (-CH&sub2;CH&sub2;-Einheit) verknüpft sind, die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die stereochemische Konformation dieser Bindung durch Addition raumgreifender Substituenten oder die Einbeziehung der Bindung in einen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring. Solche stereochemischen Modifikationen können die Ca²&spplus;Affinität um das 75-fache senken oder um das 4-fache erhöhen, verglichen mit Verbindungen des Standes der Technik. Die neue Klasse von Calcium-Chelatoren, die in der vorliegenden Beschreibung offenbart werden, unterscheiden sich auch von Verbindungen des Standes der Technik im Hinblick auf die Zeit, die sie zur Freisetzung von Calcium in Reaktion auf Belichtung mit einem Lichtblitz benötigen. Dies macht die Verbindungen der vorliegenden Erfindung besonders nützlich zur Untersuchung physiologischer Prozesse wie beispielsweise des Ionenkanal-Durchlasses und der Muskelkontraktion. Die neuen Chelatoren sind - in Verbindung mit Chelatoren des Standes der Technik - auch nützlich zur Untersuchung verschiedener physiologischer Prozesse durch Vergleichen der Wirkungen, die durch unterschiedliche Chelatoren induziert werden. Vergleiche hierzu allgemein Gurney et al. (1987) und Gurney und Lester (1987).
- In einer ersten Ausführungsform umfassen die neuen Verbindungen einen BAPTA-ähnlichen Chelator, in dem die beiden Hälften des Chelators über eine Bindung verknüpft sind, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus
- (a) einer einfachen 1,2-Ethandiyl-Einheit (-CH&sub2;CH&sub2;-Einheit) mit daran addierten raumgreifenden Substituenten wie beispielsweise -CH&sub3;, -C&sub2;H&sub5; oder -CH&sub2;OH;
- (b) einer 1,2-Ethandiyl-Einheit, die in einen carbocyclischen Ring eingebaut ist; und
- (c) einer 1,2-Ethandiyl-Einheit, die in einen heterocyclischen Ring eingebaut ist;
- worin der Chelator an ein einzelnes 2-Nitrobenzyl-Derivat gekoppelt ist, das seinerseits eine photochemische Vorstufe eines 2-Nitrosobenzophenons ist. In dieser Form umfassen die neuen Verbindungen eine chemische Verbindung mit der allgemeinen Formel:
- und deren pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Salze und Ester, worin
- - A für -NO&sub2; oder -H steht;
- - R¹ gewählt ist aus -H (außer wenn R² auch H ist), -CH&sub3; oder einem anderen Alkylrest, -OH, -NHR&sup6;, -F, -Cl und -Br;
- - R² gewählt ist aus -H (außer wenn R¹ ebenfalls H ist), -CH&sub3;, -F, -Cl, -Br und C&sub1;- bis C&sub4;-Alkoxy, mit der Maßgabe, daß R² -H ist, wenn R¹ ein Alkylrest außer -CH&sub3;, -OH oder -NHR&sup6; ist;
- - R³, R&sup4; und R&sup5; unabhängig voneinander für -H, -OH, -NR&sup6;R&sup7; oder -Alkoxy stehen oder
- - R³ und R&sup4; zusammen -OCH&sub2;O- oder -OCH&sub2;CH&sub2;O- sind und R&sup5; -H, -OH, -NR&sup6;R&sup7; oder -Alkoxy ist oder
- - R&sup4; und R&sup5; zusammen -OCH&sub2;O- oder -OCH&sub2;CH&sub2;O- sind und R³ -H, -OH, -NR&sup6;R&sup7; oder -Alkoxy ist;
- - X gewählt ist aus -OH, -Alkoxy, -Cl, -Br, -NR&sup6;R&sup7;, -OCOCH&sub3;, -OCOCF&sub3;, -OCOCH&sub2;NH&sub2;, -OPO&sub3;H und -OSO&sub2;CH&sub3;;
- - R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander -H, -Methyl oder -Ethyl sind;
- - R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander -H, -CH&sub3;, -C&sub2;H&sub5; oder -CH&sub2;OH sind, mit der Ausnahme, daß nicht beide Reste gleichzeitig -H sein können, oder R&sup8; und R&sup9; zusammen (CH&sub2;)m-Y-(CH&sub2;)n- sind, worin m und n unabhängig voneinander 1 oder 2 sind und Y gewählt ist aus -CH&sub2;-, -O-, -NR&sup6;-, -S- und -S-S-; und
- - W für -H, -OH oder -NHR&sup6; steht.
- In einer zweiten Ausführungsform umfassen die neuen Verbindungen einen BAPTA- ähnlichen Chelator, in dem die beiden Hälften des Chelators über eine Bindung verknüpft sind, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus
- (a) einer einfachen 1,2-Ethandiyl-Einheit (-CH&sub2;CH&sub2;-Einheit) mit daran addierten raumgreifenden Substituenten wie beispielsweise -CH&sub3;, -C&sub2;H&sub5; oder -CH&sub2;OH;
- (b) einer 1,2-Ethandiyl-Einheit, die in einen carbocyclischen Ring eingebaut ist; und
- (c) einer 1,2-Ethandiyl-Einheit, die in einen heterocyclischen Ring eingebaut ist;
- worin der Chelator an zwei 2-Nitrobenzyl-Derivate gekoppelt ist, die selbst photochemische Vorstufen der verwandten 2-Nitrosobenzophenone sind. In dieser Form umfassen die neuen Verbindungen eine chemische Verbindung mit der allgemeinen Formel:
- und die pharmazeutisch annehmbaren nicht-toxischen Salze und Ester davon, worin
- - A für -NO&sub2; oder -H steht;
- - R' gewählt ist aus -H, -CH&sub3; oder anderen Alkylresten, -OH, -NHR&sup6;, -F, -Cl und -Br;
- - R³, R&sup4; und R&sup5; unabhängig voneinander für -H, -OH, -NR&sup6;R&sup7; oder -Alkoxy stehen oder
- - R³ und R&sup4; zusammen für -OCH&sub2;O- oder -OCH&sub2;CH&sub2;O- stehen und R&sup5; für -H, -OH, -NR&sup6;R&sup7; oder -Alkoxy steht oder
- - R&sup4; und R&sup5; zusammen für -OCH&sub2;O- oder -OCH&sub2;CH&sub2;O- stehen und R³ für -H, -OH, -NR&sup6;R&sup7; oder -Alkoxy steht;
- - X gewählt ist aus -OH, -Alkoxy, -Cl, -Br, -NR&sup6;R&sup7;, -OCOCH&sub3;, -OCOCF&sub3;, -OCOCH&sub2;NH&sub2;, -OPO&sub3;H und -OSO&sub2;CH&sub3;;
- - R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander für -H, -Methyl oder -Ethyl stehen;
- - R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander für -H oder -CH&sub3; oder -C&sub2;H&sub5; oder -CH&sub2;OH stehen, mit der Ausnahme, daß nicht beide Reste gleichzeitig für -H stehen können, oder
- - R&sup8; und R&sup9; zusammen -(CH&sub2;)m-Y-(CH&sub2;)n- sind, worin m und n unabhängig voneinander 1 oder 2 sind und Y gewählt ist aus -CH&sub2;-, -O-, -NR&sup6;-, -S- und -S-S-; und
- - W für -H, -OH oder -NHR&sup6; steht.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt eine neue Klasse lichtempfindlicher, Calcium chelatisierender Verbindungen, deren Affinität zu Calcium sinkt, wenn sie Licht ausgesetzt werden.
- Allgemeine Formeln für diese photolabilen Verbindungen sind oben angegeben. Verbindungen des offenbarten und in den Ansprüchen beanspruchten Typs bestehen aus einem Calcium²&spplus; chelatisierenden Teil, der zwei 2-Bis(carboxymethyl-)aminophenoxy-Gruppen enthält, die über einen 1,2-Propandiyl-Rest oder einen 2,3-Butandiyl-Rest oder einen 1,2- Cycloalkandiyl-Rest oder über zwei benachbarte Kohlenstoffatome in einem heterocyclischen Ring, beispielsweise in einem 3,4-Tetrahydrofurandiyl-Ring, verbunden sind, und einem Nitroaryl-Teil, der mit dem chelatisierenden Teil über eine substituierte Methylenbrücke verknüpft ist.
- Die Synthese der neuen photolabilen Verbindungen, wie sie in den Ansprüchen beansprucht werden, wird anhand der detaillierten Synthese von nitr-7 veranschaulicht (siehe Figur 1). Fachleute in diesem Bereich der Technik erkennen, daß andere neue Formen dieser photolabilen Ca²&spplus;-Chelatoren dadurch hergestellt werden können, daß man verwandte Syntheseverfähren und Ausgangsverbindungen heranzieht.
- Die vollständigen Beschreibungen der Reaktionsbedingungen werden nachfolgend angegeben. Sowohl in Figur 1 als auch in der nachfolgenden Diskussion werden Zahlen (sowohl römische als auch arabische) und kleine Buchstaben manchmal als abgekürztes Mittel zur Identifizierung der verschiedenen chemischen Verbindungen verwendet. Reagenzien, die verwendet werden, jedoch nicht synthetisiert werden, sind in dem Fließbild von Figur 1 mit in Klammer gesetzten arabischen Zahlen bezeichnet. In dem folgenden, der Synthese gewidmeten Abschnitt sind diese Reagenzien mit eingeklammerten arabischen Zählen identifiziert.
- Die Herstellungswege der Calcium chelatisierenden Verbindungen, die zur Verwendung als Zwischenstufen im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, wurden bereits beschrieben (siehe Tsien, 1980). Zusätzlich zu den in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Verbindungen realisieren Fachleute in diesem Bereich der Technik, daß es durch Anwendung von Standardverfähren möglich ist, Derivate der Verbindungen herzustellen, die verschiedene Gruppen R¹, R² und W enthalten (siehe allgemeine Formeln im obigen Abschnitt "Beschreibung der Erfindung"). Solche Derivate werden als vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt angesehen.
- Der Nitrophenyl-Teil der neuen Verbindungen kommt von einem geeigneten 2-Nitrobenzaldehyd oder 2,6-Dinitrobenzaldehyd. Bei bevorzugten Syntheseverfahren wird der Aldehyd direkt zur Herstellung der Verbindungen verwendet.
- Die verschiedenen Substituenten R und W ermöglichen es, daß eine Anzahl verwandter Verbindungen hergestellt werden kann. Wenn W für -OH, -Alkoxy oder -NHR&sup6; steht, kann das Heteroatom elektronische und sterische Effekte unter Modifikation der Stabilität des photoaktiven Übergangszustandes bewirken. R¹ und R² können verändert werden, um den Kd-Wert des Chelator-Teils des Moleküls zu modifizieren und die elektrophile aromatische Substitution des Nitrobenzaldehyd-Derivats zu steuern, so daß eine oder zwei photolabile Gruppen in das Endmolekül eingebaut werden. Die Substituenten R³ bis R&sup5; beeinflussen die Elektronendichte des Nitrophenyl-Rings und können daher die Wellenlänge beeinflussen, die zur Aktivierung der Photoreaktion nötig ist.
- Der Schlüsselschritt bei der Herstellung von Verbindungen des in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen und beanspruchten Typs ist die Kondensation eines 2-Nitrobenzaldehyds mit einem aromatischen, BAPTA-ähnlichen Chelator. Die offensichtlichen, Lehrbüchern entnehmbaren Verfahrensweisen zur Synthese von Benzhydrolen waren entweder nicht erfolgreich oder ungeeignet wegen der vielen anderen Substituenten an dem gewünschten Molekül. Beispielsweise ist es bekannt, daß die klassischen Verfahrensweisen zur Kondensation aromatischer Ringe mit Aldehyden oder Ketonen ("Hydroxyalkylierung"; siehe: March (1977)) nicht auf der Benzhydrol-Stufe anhalten, sondern bis zu Triarylmethanen durchlaufen. Außerdem desaktivieren auch herkömmliche Lewis-Säuren, wie sie zur Aktivierung des Aldehyds erforderlich sind, die BAPTA-ännlichen Substrate wegen deren funktioneller Amino-Gruppe. Daher wurde die selektive Lewis-Säure Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (siehe Noyori et al., 1982) zur Durchführung der erforderlichen elektrophilen aromatischen Substitution verwendet. Das Verfahren kann praktisch in der Weise durchgeführt werden, daß man ein Äquivalent einer Arylverbindung und ein gehindertes tertiäres Amin miteinander mischt und danach TMS-Triflat zusetzt und am Ende einen 2-Nitroarylaldehyd oder dessen Dialkylacetal zusetzt.
- Bei der Herstellung von Verbindungen gemäß der Erfindung, die nur eine photolabile Nitrobenzylgruppe enthalten, wird dann, wenn R² ein anderer Rest als Wasserstoff ist, die 5-Position des Rings blockiert, und eine Nitrobenzylierung kann nur an der gewünschten 5-Position des 4-W-Phenylrings oder des äquivalenten Chinolins oder Benzopyrans ablaufen. Wenn R² Wasserstoff ist, desaktiviert die Gegenwart von Halogen an R¹ den Ring für eine elektrophile Substitution, und eine Nitrobenzylierung erfolgt hauptsächlich in der gewünschten Position. Produkte des ersten Typs, in denen R² = H und R¹ = H oder Alkyl ist, können nur hergestellt werden durch gesteuerte Nitrobenzylierung und Abtrennung des gewünschten Produkts. Eine Herstellung derartiger Verbindungen wird also nicht empfohlen.
- Zur Herstellung von Verbindungen, die zwei Nitrobenzylgruppen enthalten, muß R² Wasserstoff sein und kann R¹ Wasserstoff, Alkyl oder ein Substituent sein, der für den Substituenten W geeignet ist. In diesem Fall erfolgt die gewünschte Nitrobenzylierung in der 5-Position beider Phenylringe oder in der 5-Position sowohl des R¹-R²-Phenylrestes als auch des Chinolins.
- Es ist bekannt, daß die Kation-Affinitäten von BAPTA-Derivaten durch geeignete Elektronen gebende oder Elektronen abziehende Substituenten an den Benzolringen erhöht oder erniedrigt werden können (siehe allgemein: Tsien, 1980). Beispielsweise verstärkte die Substitution zweier Wasserstoffatome in para-Stellung zu den beiden Stickstoffatomen von BAPTA durch zwei Methylgruppen die Bindung zu Ca²&spplus; um 0,4 logarithmische Einheiten, und eine ähnliche zweifache Substitution durch Bromatome schwächte die Bindung zu Ca²&spplus; um 1,2 logarithmische Einheiten (siehe allgemein Tsien, 1980). Es wurde gefunden, daß eine einfache Substitution einen halb so großen Effekt auf die Calciumaffinität ergibt (experimentelle Daten nicht gezeigt). Fachleute in diesem technischen Bereich realisieren, daß die Wirkung anderer Substituenten auf die Kation-Affinitäten der vorliegenden Verbindung quantitativ durch eine lineare freie Energie-Beziehung des Hammett-Typs voraussagbar sein sollte.
- Es ist auch bekannt, daß die größte Änderung im Hinblick auf die charakteristischen chelatisierenden Eigenschaften innerhalb eines Bereichs von 2 log [Ca²&spplus;]-Einheiten des Kd-Werts eines speziellen Chelators erfolgt (siehe Tsien, 1980). Im Ergebnis wäre es hilfreich, Chelatoren verfügbar zu haben, die einen Bereich von Kd-Werten aufweisen. Diesbezüglich können R¹ und R² variiert werden, um den Kd-Wert nach oben oder nach unten einzustellen. Wie erwartet, schwächt die Nitrobenzyl-Komponente des Moleküls die Ca²&spplus;-Bindung um 0 bis 0,3 logarithmische Einheiten (vergleiche Kd = 160 nM mit BAPTA Kd = 100 nM (siehe Tsien, 1980)).
- Die in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen und in den Ansprüchen beanspruchten photolabilen Verbindungen können auch unter Verwendung eines alpha-Alkyloxyalkylbromids verestert werden. Derartige Ester sind hydrophob genug, um bereitwillig Zellmembranen zu durchqueren. Sobald sie jedoch einmal in der Zelle sind, werden sie durch im Zytosol vorhandene Esterasen gespalten und bilden die freien Säuren zurück.
- Verfährensweisen zur Synthese der neuen photolabilen Ca²&spplus;-Chelatoren, wie sie in der vorliegenden Beschreibung offenbart sind, werden im nachfolgenden Abschnitt "Synthese der Verbindungen" aufgezeigt.
- Die meisten Reagenzien und Lösungsmittel, die bei den Synthesen verwendet wurden, lagen in ACS- oder HPLC-Qualitätsstufe vor und wurden so verwendet, wie sie von den Firmen Aldrich, Mallinkradt, Fisher oder J.T. Baker erhalten wurden, solange nichts anderes angegeben ist. Trockenes Dimethylformamid (DMF) wurde von der Firma Aldrich erhalten (Gold Label), über 4Å-Molekularsieb aufbewährt und wie erhalten verwendet. Dimethoxyethan wurde über Natrium-Blei-Legierung getrocknet. CH&sub2;Cl&sub2; und CHCl&sub3; wurden wiederholt von P&sub2;O&sub5; abdestilliert. Tetrahydrofuran (THF) wurde wiederholt von CaH&sub2; abdestilliert. Zum Test der verschiedenen Reaktionsprodukte wurden kernmagnetische Resonanzspektren auf einem Varian-EM-390-Spektrometer (90 MHz) in CDCl&sub3; aufgenommen, soweit nichts anderes angegeben ist. Die erhaltenen Peaks sind nachfolgend folgendermaßen angegeben: NMR (Lösungsmittel, Arbeitsfrequenz): chemische Verschiebung (in ppm) gegenüber Tetramethylsilan, Multiplizität (s = Singlett; d = Dublett; t = Triplett; q = Quartett; m = Multiplett; br. = breit), Spin-Spin-Kopplungskonstante (soweit zutreffend), integrierte Protonenzahl. Manchmal sind einige benachbarte Peaks zu nahe beieinander, als daß ihre Integrale getrennt werden können. In diesem Fall wird nur das Gesamtintegral für einen Cluster angegeben.
- UV-Absorptionsspektren wurden auf einem Cary 210-Spektrophotometer oder auf einem Perkin Elmer Lambda Array 3840-Spektrophotometer bei 22 ± 2 ºC aufgenommen.
- Die Schmelzpunkte sind unkorrigiert, und Elementaranalysen wurden durchgeführt vom mikroanalytischen Laboratorium im Department of Chemistry an der University of California, Berkeley. Die Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
- Dünnschichtchromatographie-Experimente (TLC) wurden an vorbeschichteten Silicagel- Platten (60F-254; Firma E. Merck) oder Umkehrphasen-Platten (RP-18 F-254s; Firma E. Merck) durchgeführt. Zur Säulenchromatographie wurde Silicagel 60 (Korngröße 230 bis 400 mesh; Firma E. Merck) verwendet. Da alle 2-Nitrobenzaldehyd- und 2-Nitrobenzylalkohol-Derivate gegenüber Licht nahe dem ultravioletten Bereich empfindlich sind, wurden alle Vorgänge unter einer orangefarbenen Sicherheitslampe durchgeführt.
- Fachleute in diesem Bereich der Technik realisieren, daß bei Ausgehen von Estern wie beispielsweise (VI) oder Säuren (VII), in denen X für -OH steht (siehe allgemeine Formel im Abschnitt "Kurze Beschreibung der Erfindung"), analoge Verbindungen, die Gruppen mit den Bedeutungen X = -OCOCH&sub3;, -OCOCF&sub3;, -O-Glycyl, -OPO&sub3;H und -OSO&sub2;CH&sub3; enthalten, in einfacher Weise durch Acylierung, Phosphorylierung oder Methansulfonylierung unter Standardbedingungen hergestellt werden könnten. Bei Ausgehen von Estern, in denen X für -OH steht, könnten auch analoge Verbindungen mit X = Cl oder Br unter Verwendung von SOCl&sub2; oder PCl&sub3; oder PBr&sub3; oder anderen Standardmitteln zur Umwandlung von Alkoholen in Halogenide hergestellt werden. Ester mit X = NR&sup6;R&sup7; könnten aus Estern mit X = Br oder X = OSO&sub2;CH&sub3; durch nucleophile Substitution unter Standardbedingungen hergestellt werden.
- trans-2'-(5-Methyl-2-nitrophenoxy-)cyclopentanol wurde wie folgt hergestellt:
- Cyclopentenoxid [Reagenz 2] (8,73 ml; 0, 1 Mol), 5-Methyl-2-nitrophenol (15,3 g; 0,1 Mol) [Reagenz 1] und Kalium-5-methyl-2-nitrophenoxid (1,91 g; 0,01 Mol) wurden in trockenem DMF (5 ml) gelöst und am Rückfluß 20 h unter Argon erwärmt. Die abgekühlte Reaktionsmischung wurde mit einer wäßrigen NaOH-Lösung (100 ml; 1 M) verdünnt und mit Toluol extrahiert (drei 50 ml-Portionen). Die vereinigten Extrakte wurden mit H&sub2;O (3 x 50 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Das Toluol wurde durch Verdampfen entfernt und das Produkt [Verbindung Ib] wurde gewonnen, was 17,0 g (72 %) eines orangefarbenen Öls ergab, das beim Abkühlen kristallisierte.
- Schmelzpunkt: 42 bis 44 ºC.
- ¹H-Daten (δ): 1,9 (br m, 6H, Cyclopentenyl-CH&sub2;-); 2,40 (s, 3H, CH&sub3;); 4,40 (br m, 1H -CH-OH); 4,65 (m, 1H, -CH-OAr); 6,80 (d, 1H, J=8Hz, H-64); 6,93 (s, 1H, H-6); 7,67 (d, 1H, J=8Hz, H-3).
- Verbindung Id wurde nach derselben Verfährensweise synthetisiert wie Verbindung Ib, jedoch wurde Cyclohexenoxid [Reagenz 3] anstelle von Cyclopentenoxid verwendet. Eine Umkristallisation aus Hexan ergab gelbe Kristalle; Ausbeute: 56 %.
- Schmelzpunkt 55 bis 57 ºC.
- ¹H-Daten (δ): 1,50, 1,78, 2,1 (br. m, 8H, Cyclohexyl); 2,40 (s, 3H, CH&sub3;); 3,30 (s, br., 1H, OH); 3,73 (m, 1H, -CH-OH); 4,05 (m, 1H, -CH-OAr); 6,78 (d, 1H, J=8Hz, H-4); 6,90 (s, 1H, H-6); 7,67 (d, 1H, J=8Hz, H-3).
- Verbindung Ie wurde nach derselben Verfahrensweise synthetisiert wie Verbindung Ib. Jedoch wurde trans-2,3-Epoxybutan [Reagenz 4] anstelle von Cyclopentenoxid verwendet. Das resultierende Öl (16 % Ausbeute Ie) wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
- ¹H-Daten (δ): 1,20, 1,30, (2d, 6H, J=5Hz, Butyl-CH&sub3;); 2,40 (s, 3H, Ar-CH&sub3;); 2,72 (s, 1H, -OH); 4,00, 4,53 (2m, 2H, J=3Hz, -CH-); 6,85 (d, 2H, J=8Hz, H-4); 6,95 (s, 1H, H-6); 7,80 (d, 2H, J=8Hz, H-3).
- 2'-(5-Methyl-2-nitrophenoxy-)cyclopentanon wurde wie folgt hergestellt:
- Verbindung Ib (8,3 g; 35 mMol) gelöst in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) wurde in einer Portion einer gerührten Suspension Pyridiniumchlorchromat [Reagenz 5] (11,3 g; 55 mMol) in CH&sub2;Cl&sub2; (70 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 16 h lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Et&sub2;O (350 ml) verdünnt, und es wurde von dem dunklen Teer abdekantiert, der mit Et&sub2;O (3 x 50 ml) gewaschen wurde. Die vereinigten Extrakte wurden durch Celite filtriert, und das Filtrat wurde zur Trockene unter Erhalt eines Öls eingedampft, das kristallisierte. Ein Umkristallisieren aus MeOH ergab die Verbindung IIa in Form gelber Kristalle (6,60 g; 80 %).
- Schmelzpunkt: 65 bis 66 ºC.
- ¹H-Daten (δ): 2,10 (m, 6H, -(CH&sub2;)&sub3;-); 2,33 (s, 3H, CH&sub3;); 4,63 (t, 1H, CH); 6,80 (d, 1H, J=8Hz, H-4); 7,02 (s, 1H, H-6); 7,70 (d, 2H, J=8Hz, H-3).
- Eine Oxidation des Cyclohexanol-Derivats Id erforderte einen sechsfachen Überschuß an Pyridiniumchlorchromat und eine Reaktionszeit von 5 Tagen. Es ergab sich Verbindung IIc (88 % Ausbeute) in Form eines gelben Feststoffs. Dieser wurde aus Isopropylether umkristallisiert.
- Schmelzpunkt 125 bis 128 ºC.
- ¹H-Daten (δ): 1,6 - 2,6 (m, 8H, -(CH&sub2;)&sub4;-); 2,33 (s, 3H, CH&sub3;); 4,63 (t, 1H, CH); 6,80 (d, 1H, J=8Hz, H-4); 7,02 (s, 1H, H-6); 7,73 (d, 2H, J=8Hz, H-3).
- Verbindung IIa (5,86 g; 25 mMol), gelöst in trockenem THF (25 ml) bei -10 ºC wurde tropfenweise unter Rühren einer Lösung aus Lithiumtrisiamylborhydrid [Reagenz 6] (30 mMol) in THF (30 ml) bei -78 ºC unter N&sub2;-Atmosphäre zugesetzt. Nach 2 h ließ man die rote Reaktionsmischung sich auf Raumtemperatur erwärmen (1 h). Sie wurde dann mit H&sub2;O (4 ml) und EtOH (15 ml) abgeschreckt, mit wäßriger KOH (6 ml; 10 M) alkalisch gestellt und durch vorsichtige Zugabe von 30 %iger wäßriger H&sub2;O&sub2;-Lösung (15 ml) unter Kühlen oxidiert. Nach Sättigen mit K&sub2;CO&sub3; wurde die wäßrige Schicht abgetrennt und mit Et&sub2;O : THF (1:1; 2 x 10 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO&sub4;), zur Trockene eingedampft, und das Produkt wurde im Rahmen einer Kugelrohrdestillation (bulb-to-bulb) bei 180 bis 200 ºC bei einem Druck von 0,1 mm Hg destilliert. Man erhielt die Verbindung Ia in Form eines orangefarbenen Öls (4,55 g; 77 %).
- ¹H-Daten (δ): 1,9 (br. m, 6H, -(CH&sub2;)&sub3;-); 2,40 (s, 3H, CH&sub3;); 3,05 (br. s, 1H, OH); 4,20, 4,66 (2m, 2H, CH); 6,82 (d, 1H, J=8Hz, H-4); 6,90 (s, 1H, H-6); 7,76 (d, 1H, J=8hz, H-3).
- Dünnschichtchromatographie (TLC) in einem System, das die cis- und trans-Isomere Ia bzw. Ib trennte, zeigte die vollständige Umwandlung in das cis-Isomer an.
- In Analogie zur der oben beschriebenen Herstellung der Verbindung Ia wurde die Verbindung IIc zur Verbindung Ic reduziert, einem dunkel-orangefarbenen Öl (54 % Ausbeute) nach Chromatographie an SiO&sub2; in Ethylacetat-Hexan.
- ¹H-Daten (δ): 1,68 (br. m, 8H, -(CH&sub2;)&sub4;-); 2,40 (s, 3H, CH&sub3;); 2,70 (br. d, 1H, OH); 3,83 (br. m, 1H, CH-); 4,53 (m, 1H, CH-OAr); 6,80 (d, 1H, J=8Hz, H-4); 6,90 (s, 1H, H-6); 7,76 (d, 1H, J=8Hz, H-3).
- cis-3'-(2-Nitrophenoxy-)tetrahydrofuran-4-ol (Verbindung XIIh) wurde wie folgt hergestellt:
- NaH (42 mg einer 57 %igen Suspension in Öl; 1 mMol) wurde portionsweise unter Rühren einer Lösung aus cis-Tetrahydrofuran-3,4-diol [Reagenz 8] (0,21 g; 2 mMol) und 2-Fluornitrobenzol [Reagenz 7] (105 ul; 1 mMol) in trockenem DMF (1 ml) zugesetzt. 30 min nach dem Zeitpunkt des Abschlusses der Zugabe wurde die Reaktionsmischung mit H&sub2;O (15 ml) verdünnt und auf Eis wenigstens 30 min lang gekühlt. Der feste Niederschlag des diarylierten Nebenprodukts wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde mit Toluol extrahiert (3 x 5 ml). Die vereinigten Extrakte wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zur Trockene eingedampft. So erhielt man das Produkt Ig in Form eines gelben Öls, das bei Triturieren mit Isopropylether kristallisierte; Ausbeute: 111 mg.
- Schmelzpunkt: 59 bis 61 ºC.
- Die Dünnschichtchromatographie (TLC) (5 % MeOH-CHCl&sub3;) zeigte weniger als 5 % disubstituiertes Nebenprodukt. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet. ¹H-Daten (δ): 3,13 (d, 1H, OH); 3,4 - 4,2 (m, 4H, -CH&sub2;OCH&sub2;-); 4,45, 5,80 (2m, 2H, CH); 6,90 - 8,0 (m, 4H, aromatisches H).
- In ähnlicher Weise wie bei der Herstellung der Verbindung Ig ergab die Zugabe von NaH (4 mMol) zu einer Lösung von (R, R)-(-)-2,3-Butandiol [Reagenz 9] (5 mMol) und 2- Fluornitrobenzol [Reagenz 7] (4 mMol) in trockenem N-Methylpyrrolidinon (2,5 ml), Abfangen mit H&sub2;O nach 30 min und Extraktion mit Ethylacetat eine Mischung des monosubstituierten und des disubstituierten Produkts. Diese wurden auf SiO&sub2; durch Elution mit Ethylacetat-Hexan unter Erhalt eines gelben Öls (Verbindung If; 45 %) bzw. eines weißen Feststoffs (14 %) getrennt.
- cis-1-(5'-Methyl-2'-nitrophenoxy-)2-(2"-nitrophenoxy-)cyclopentan wurde wie folgt hergestellt:
- NaH (1,05 g einer 57 %igen öligen Suspension; 25 mMol) wurde portionsweise unter Rühren und Kühlen einer Lösung von Verbindung Ia (4,27 g; 18 mMol) und 2-Fluornitrobenzol [Reagenz 7] (2,11 ml; 20 mMol) in trockenem 1,2-Dimethoxyethan (25 ml) zugesetzt. Nach Stehen bei Raumtemperatur für die Zeit von 1 h wurde die Reaktionsmischung mit H&sub2;O (100 ml) verdünnt und mit CHCl&sub3; (3 x 50 ml) extrahiert. Die Extrakte wurden getrocknet und zur Trockene eingedampft. So erhielt man das Rohprodukt IIIa in Form eines Öls, das beim Abschrecken kristallisierte. Ein Umkristallisieren aus Aceton- Methanol ergab gelbe Kristalle; Schmelzpunkt 109 bis 111 ºC; Ausbeute: 4,8 g (74 %).
- ¹H-Daten (δ): 1,7 - 2,2 (m, 6H, -CH&sub2;)&sub3;-); 2,35 (s, 3H, CH&sub3;); 4,87 (m, 2H, CH); 6,7 - 7,8 (m, 7H, aromatisches H).
- Die Verbindungen IIIb, IIIc, IIId und IIIe wurden aus den entsprechenden Alkoholen durch dieselbe Verfährensweise synthetisiert, wie sie zur Synthese der Verbindung Ia verwendet worden war. Die Ausbeute, die physikalischen und die spektralen Eigenschaften waren die folgenden:
- - IIIb: orangefarbenes Öl; Kugelkopfdestillation; 230 ºC bei 0,25 mm Hg (63 %).
- ¹H-NMR-Daten (δ): 1,6 - 2,1 (m, 6H, -(CH&sub2;)&sub3;-); 2,40 (s, 3H, CH&sub3;); 4,75 (m, 2H, CH); 6,8 - 7,8 (m, 7H, aromatisches H).
- - IIIc: braunes Öl (SiO&sub2;-Chromatographie; Ethylacetat-Hexan); Ausbeute: 74 %.
- ¹H-Daten (δ): 1,3 - 2,2 (m, 8H, -(CH&sub2;)&sub4;-); 2,37 (s, 3H, CH&sub3;); 4,70 (br. d, 2H, CH); 6,8 - 7,8 (m, 7H, aromatisches H).
- - IIId: gelbe Kristalle; Schmelzpunkt: 86 bis 90 ºC (60 %).
- ¹H-Daten (δ): 1,3 - 2,2 (m, 8H, -(CH&sub2;)&sub4;-); 2,40 (s, 3H, CH&sub3;); 4,63 (m, 2H, CH); 6,8 - 7,8 (m, 7H, aromatisches H).
- - IIIe: blaßgelber Feststoff; Schmelzpunkt: 86 ºC (64 %); gereinigt durch SiO&sub2;- Chromatographie.
- ¹H-Daten (δ): 1,47 (d, 6H, J = 6,5 Hz, CH&sub3;); 2,42 (s, 3H, Ar-CH&sub3;); 4,75 (q, d 2H, J = 6,5, 3 Hz, CH); 6,8 - 8,0 (m, 7H, aromatisches H).
- Wie bei der Synthese der Verbindungen IIIb, c, d und e wurden die Verbindungen IIIf und IIIg in ähnlicher Weise aus den Alkoholen If bzw. Ig hergestellt. Es wurde jedoch 3- Fluor-4-nitrotoluol [Reagenz 10] anstelle von 2-Fluornitrobenzol eingesetzt.
- Verbindung IIIf war ein orangefarbenes Öl, das durch SiO&sub2;-Chromatographie abgetrennt wurde (Ethylacetat-Hexan); Ausbeute: 45 %.
- ¹H-NMR-Daten (δ): 1,33 (d, 6H, J = 6,5 Hz, CH&sub3;); 2,40 (s, 3H, Ar-CH&sub3;); 4,75 (m, 1H, CH); 6,7 - 7,8 (m, 7H, aromatisches H).
- Verbindung IIIg wurde in Form eines blaßgelben Niederschlags beim Abschrecken der Reaktionsmischung und bei anschließender Umkristallisation aus Ethanol erhalten; Ausbeute 63 %; Schmelzpunkt: 145 bis 148 ºC.
- ¹H-Daten (δ): 2,37 (s, 3H, CH&sub3;); 4,21 (m, 4H, -CH&sub2;OCH&sub2;-); 5,07 (m, 2H, CH); 6,8 - 7,8 (m, 7H, aromatisches H).
- cis-1-(2'-Amino-5'-methylphenoxy-)2-(2"-aminophenoxy-)cyclopentan wurde wie folgt hergestellt:
- Verbindung IIIa (2,0 g; 5,58 mMol) wurde katalytisch bei Raumtemperatur und unter Druck mit 200 mg 5 % Pd/C in Ethylacetat : 95 %iger wäßriger EtOH (2:1) hydriert. Die Wasserstoffaufnahme war nach einer Stunde vollständig, und nach einer weiteren Stunde wurde die Reaktionsmischung filtriert und zur Trockene eingedampft. Man erhielt das Produkt IVa in Form eines blaß-braunen Öls, das in der folgenden Reaktion ohne weitere Reinigung eingesetzt wurde.
- ¹H-Daten (δ): 1,6 - 2,2 (br. m, 6H, -(CH&sub2;)&sub3;-); 2,18 (s, 3H, CH&sub3;); 3,67 (br. s, 4H, NH&sub2;); 4,63 (m, 2H, CH); 6,4 - 6,8 (m, 7H, aromatisches H).
- In ähnlicher Weise wie bei der Herstellung der Verbindung IVa wurden die Nitroether IIIb - g über einem Pd/C-Katalysator in Ethylacetat oder Ethanol hydriert. Die Aminprodukte IVb - g waren üblicherweise Öle, die bei Kontakt mit Luft dunkler wurden, die erwarteten NMR-Spektren ergaben und ohne weitere Reinigung verwendet wurden.
- Das gesamte Amin Va, das von der Reduktion der Verbindung IVa resultierte (es wurde angenommen, daß dies 5,58 mMol waren), 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin (7,29 g; 34 mMol) Nal (0,45 g; 3 mMol) und Methylbromacetat [Reagenz 11] (3,22 ml; 34 mMol) wurden in trockenem CH&sub3;CN (75 ml) unter N&sub2;-Atmosphäre für die Zeit von 16 h am Rückfluß erwärmt. Die abgekühlte Reaktionsmischung wurde mit Toluol (150 ml) verdünnt, filtriert, mit Phosphatpuffer (pH = 2) gewaschen, bis die Waschflüssigkeiten einen pH-Wert von 2 hatten, und mit H&sub2;O gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und zur Trockene eingedampft. So wurde ein Öl erhalten, das an SiO&sub2; unter Elution mit Ethylacetat-Hexan chromatographiert wurde. So wurde Verbindung Va als farblöses Öl erhalten (2,77 g; 85 %).
- ¹H-Daten (δ): 2,0 (br. m, 6H, -(CH&sub2;)&sub3;-); 2,15 (s, 3H, Ar-CH&sub3;); 3,61 (s, 12H, - OCH&sub3;); 4,13, 4,18 (2s, 8H, -CH&sub2;-); 4,77 (m, 2H, CH); 6,5 - 6,8 (m, 7H, aromatisches 15 H).
- In ähnlicher Weise wurden die Amine IVb - g mit Ethylbromacetat oder Methylbromacetat alkyliert. Nach Chromatographie an SiO&sub2; ergaben sich die erwarteten Produkte Vb - g in Form von Ölen, von denen eines (Verbindung Ve) kristallisierte (Umkristallisation aus Isopropylether: Schmelzpunkt 67 bis 69 ºC). Ausbeuten: 30 bis 80 %.
- Die ¹H-Spektren waren wie erwartet. Die Verschiebungen (ppm) der Ethanbrücken-Protonen waren wie folgt
- Vd: 4,50; Vc: 4,65; Vf: 4,77; Ve: 4,51; Vb: 4,80; Vg: 5,13.
- nitr-7-Tetramethylester wurde wie folgt hergestellt:
- TMSOTf (0,5 ml; 2,54 mMol) wurde tropfenweise einer Lösung von Verbindung Va (293 mg; 0,5 mMol) 6-Nitropiperonal [Reagenz 12] (127 mg; 0,65 mMol) und 2,6-Ditert-butylpyridin (0,67 ml; 3 mMol) in trockenem CHCl&sub3; (3 ml) bei Raumtemperatur unter einer N&sub2;-Atmosphäre zugesetzt (es ist wichtig, daß das CHCl&sub3; sorgfältig getrocknet ist; daher wird eine frische Destillation über P&sub2;O&sub5; empfohlen).
- Nach Stehenlassen über Nacht wurde die Reaktionslösung mit CHCl&sub3; (10 ml) verdünnt und in gesättigte wäßrige NaHCO&sub3;-Lösung (50 ml) gegossen. Die Schichten wurden abgetrennt, und die wäßrige Schicht wurde mit CHCl&sub3; (2 x 15 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit H&sub2;O gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und zur Trockene eingedampft. Man erhielt den rohen TMS-Ether in Form eines gelben Öls. Dies wurde in CHCl&sub3; (25 ml) gelöst, und Tetrabutylammoniumfluorid-Trihydrat (475 mg; 1,5 mMol) wurde in einer Portion zugesetzt. Nach 15 min bei Raumtemperatur wurde die Lösung zur Trockene eingedampft, in Ethylacetat : Toluol (1:9; Volumen/Volumen; 100 ml) gelöst, mit H&sub2;O (3 x 20 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und eingedampft. Man erhielt das Rohprodukt in Form eines orangefarbenen Öls. Abtrennung durch Chromatographie an SiO&sub2; unter Elution mit Ethylacetat-Hexan ergab die Verbindung VIa in Form eines gelben, glasartigen Schaums; Ausbeute: 53 %; Schmelzpunkt 44 bis 49 ºC.
- ¹H-Daten (δ): 2,0 (br. m, 6H, -(CH&sub2;)&sub3;-); 2,18, 2,23 (2s, 3H, Ar-CH&sub3;); 3,58, 3,60, 3,62, 3,64 (4s, 12H, -OCH&sub3;); 3,99, 4,02, 4,15 (3s, 8H, NCH&sub2;-); 4,83 (br. m, 2H, Cyclopentan -CH-O); 6,03 (s, 2H, -OCH&sub2;O-); 6,30 (d, 1H, -Ar&sub2;CH-); 6,60 - 6,93 (m, aromatisches H); 7,11 (s, 1H, Piperonyl-H-2); 7,28 (s, 1H, -OH); 7,37, 7,41 (2s, 1H, Piperonyl-H-5).
- Die Ester Va - g und VIa wurden in Dioxan : Methanol (1:1) gelöst und durch Zugabe eines Überschusses einer 1 M wäßrigen KOH-Lösung verseift, wobei man aufwärmte, sofern dies erforderlich war, um den Lösevorgang zu unterstützen. Die Reaktion war innerhalb weniger Stunden oder nach Stehen über Nacht abgeschlossen. Üblicherweise wurden die Chelatoren in diesen verdünnten Verseifungsmischungen eingefroren aufbewährt. Die freien Säuren konnten durch Ansäuern und Gewinnen des Niederschlags isoliert werden.
- Spezielle Eigenschaften einiger der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in dem folgenden Beispiel aufgezeigt. Das Beispiel dient nur der Veranschaulichung der Erfindung; es ist nicht beabsichtigt, daß es den Umfang der Ansprüche in irgendeiner Weise beschränkt.
- Dieses Beispiel veranschaulicht, daß in Übereinstimmung mit der Lehre der vorliegenden Erfindung Fachleute in diesem technischen Bereich nunmehr Änderungen der Ca²&spplus;- Affinität und der Ca²&spplus;:Mg²&spplus;-Selektivität voraussagen können, die von Änderungen der Stereochemie der Bindung zwischen den beiden aromatischen Ringen der Chelatoren resultieren.
- Wie Tabelle I zeigt, können sich drastische Änderungen der Ca²&spplus;-Affinität und der Ca²&spplus;:Mg²&spplus;-Selektivität aus anscheinend kleineren Änderungen der Stereochemie der Bindung zwischen den beiden aromatischen Ringen der Chelatoren ergeben. Beispielsweise hat in der Cyclopentandiyl-Reihe das cis-Isomer (Va) eine 300-fach höhere Afflnität für Ca²&spplus; als das trans-Isomer (Vb). Im Gegensatz dazu hat in der Cyclohexandiyl-Reihe das cis-Isomer (Vc) eine etwa 1,8-fach niedrigere Affinität zu Ca²&spplus; und eine 1,7-fach höhere Affinität zu Mg²&spplus; als das trans-Isomer; beide sind jedoch schlechter als die unsubstituierte Chelator-Ausgangsverbindung.
- Die Größe und selbst die Richtung dieser stereochemischen Effekte war von Chelatoren des Standes der Technik nicht voraussagbar. Beispielsweise ist in Verbindungen des Standes der Technik, die Ethylendiamin-N,N'-tetraessigsäure (EDTA) analog sind, in denen die zentrale 1,2-Ethandiyl-Bindung substituiert ist oder durch Ringe ersetzt ist, das cis-Cyclopentandiyl-Analoge unbekannt, weist das trans-Cyclopentandiyl-Analoge eine 3,7-fach höhere Affinität zu Ca²&spplus; auf als die Stammverbindung, und weist das cis-Cyclohexandiyl-Analoge eine 17-fach schlechtere Affinität zu Ca²&spplus; auf als die Stammverbindung, während das trans-Cyclohexandiyl-Analoge 324-fach so stark ist wie die Stammverbindung (Ergebnisse von Martell und Smith (1974)). Dieses Muster der Reaktion auf eine Substitution ist vollständig verschieden von den Ergebnissen der vorliegenden Erfindung in Tabelle I.
- Die Zahlenangaben aus Tabelle I können erklärt und zur Voraussage der Affinitäten anderer Verbindungen dadurch verwendet werden, daß man raumfüllende Molekülmodelle der Chelatoren baut. Stärkere Affinitäten zu Ca²&spplus; sind mit Konformationen verbunden, in denen die Entfernung zwischen den Ether-Sauerstoffatomen minimiert ist und in denen die einsamen Elektronenpaare der beiden Amino-Stickstoffe und der beiden Ether-Sauerstoffe alle in einen zentralen Hohlraum zeigen. Strukturen wie beispielsweise die der Verbindungen (Va), (Vg) und (VIIa), die zur Bildung solcher vorteilhafter Konformationen neigen, ergeben die höchsten Affinitäten zu Ca²&spplus;, während flexible Strukturen wie beispielsweise die Stammverbindung und die Verbindung (Vf) mittlere Affinitäten ergeben. Strukturen, bei denen derartige Konformationen ausgeschlossen sind, geben die niedrigsten Affinitäten (Vb, Vc, Vd). Daher können durch Aufbau physikalischer oder mit dem Computer generierter Molekülmodelle und Beachtung der obigen Regeln im Hinblick auf sterische Beziehungen der Ether-Sauerstoffatome und der Amino-Stickstoffatome die Kation- Affinitäten vorausgesagt werden.
- Die Wirkungen einer Addition von Substituenten an die Benzolringe in meta- oder para- Stellung zu den Aminogruppen sind ebenfalls recht gut voraussagbar, zwar nicht auf der Grundlage der Stereochemie, jedoch statt dessen über lineare freie Energie-Beziehungen. Elektronendonator-Gruppen beziehungsweise Elektronenladung abziehende Gruppen erhöhen bzw. erniedrigen die Kation-Affinitäten in einer semiquantitativ voraussagbaren Weise ohne signifikante sterische Effekte. So sind die Ca²&spplus;-Affinitäten der Nitrobenzhydrole VII, die einen Nitrobenzyl-Substituenten enthalten, um das 2- bis 2,5-fache niedriger als diejenigen ihrer Vorstufen V, und die Wirkung der Photoisomerisierung zu Verbindung VIII reduziert die Affinitäten weiter um das 40- bis 60-fache. Speziell die Verbindung nitr-7 (VIIa) hat eine Dissoziationskonstante für Ca²&spplus; von 53 nM bei 22 ºC und einer Ionenstärke von 0,1 M. Die Zurückweisung von Mg²&spplus; ist ausgezeichnet (> 10&sup5;), und die Dissoziationskonstante für Mg²&spplus; ist 5,7 mM. Bei Photolyse zu dem Nitrosobenzophenon VIII erhöht sich die Dissoziationskonstante für Ca²&spplus; auf 3 uM. Die Freisetzung von Ca²&spplus; erfolgt recht schnell und geschieht mit einer exponentiellen Zeitkonstante von 1,8 ms nach einem Lichtblitz einer Dauer im Submikrosekunden-Bereich.
- Die Addition von Nitrobenzyl-Substituenten an beide Benzolringe (siehe Abschnitt "Kurze Beschreibung der Erfindung") reduziert die Ca²&spplus;-Affinitäten um das 4- bis 6-fache, verglichen mit den Vorstufen V, und eine Photolyse beider Nitrobenzyl-Substituenten reduziert dann die Affinitäten weiter um das 1.600- bis 3.600-fache. Tabelle I Chelator V Nach Verseifung Notation in Figur 2 Notation der Bindung in der Formel Konformation der Bindung (Stammverbindung) siehe Figur 2
- Es kann also ersehen werden, daß die vorliegende Erfindung eine neue Klasse photolabiler (lichtempfindlicher) Ca²&spplus;-Chelatoren offenbart, die Ca²&spplus; in physiologisch inaktiver Form speichern, bis sie mit ultraviolettem Licht bestrählt werden. Daraufhin besteht eine Neigung zur Freisetzung des Ca²&spplus;. Dieses freigesetzte Ca²&spplus; wird dann frei und aktiviert physiologische Prozesse. Da die neue Klasse der in der vorliegenden Beschreibung offenbarten Chelatoren die Fähigkeit zur Verwendung von Licht zur Steuerung der Freisetzung von Ca²&spplus; auf den Bereich innerhalb der Zellen ausdehnen, sind sie extrem nützlich für Forscher im biologischen Bereich, die versuchen, die vielen Zellfunktionen zu untersuchen, von denen heute angenommen wird, daß Calcium sie steuert. Derartige Funktionen schließen den Ionenkanal-Durchlaß und die Muskelkontraktion ein.
Claims (9)
1. Chemische Verbindung mit der allgemeinen Formel:
und die pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Salze und Ester davon, worin
- A für -NO&sub2; oder -H steht;
- R¹ gewählt ist aus -H (außer dann, wenn R² auch -H ist), -CH&sub3; oder ein anderer
Alkylsubstituent, -OH, -NHR&sup6;, -F, -Cl und -Br;
- R² gewählt ist aus -H (außer dann, wenn R¹ auch für -H steht), -CH&sub3;, -F, -Cl, -Br
und C&sub1;- bis C&sub4;-Alkoxy, mit der Maßgabe, daß R² für -H steht, wenn R¹ für -Alkyl
außer -CH&sub3;, -OH oder -NHR&sup6; steht;
- R³, R&sup4; und R&sup5; unabhängig voneinander für -H, -OH, -NR&sup6;R&sup7; oder -Alkoxy stehen
oder R³ und R&sup4; zusammen für -OCH&sub2;O- oder -OCH&sub2;CH&sub2;O- stehen und R&sup5; für -H,
-OH, -NR&sup6;R&sup7; oder -Alkoxy steht oder R&sup4; und R&sup5; zusammen für -OCH&sub2;O- oder
-OCH&sub2;CH&sub2;O- stehen und R³ für -H, -OH, -NR&sup6;R&sup7; oder -Alkoxy steht;
- X gewählt ist aus -OH, -Alkoxy, -Cl, -Br, -NR&sup6;R&sup7;, -OCOCH&sub3;, -OCOCF&sub3;,
-OCOCH&sub2;NH&sub2;, -OPO&sub3;H und -OSO&sub2;CH&sub3;;
- R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander für -H, -Methyl oder -Ethyl stehen; und
- R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander für -H, -CH&sub3;, -C&sub2;H&sub5; oder -CH&sub2;OH stehen, mit
der Ausnahme, daß nicht beide Reste gleichzeitig -H sein können, oder R&sup8; und R&sup9;
zusammen für -(CH&sub2;)m-Y-(CH&sub2;)n- stehen, worin m und n unabhängig voneinander
1 oder 2 sind und Y gewählt ist aus -CH&sub2;-, -O-, -NR&sup6;-, -S- und -S-S-; und
- W für -H, -OH oder -NHR&sup6; steht.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Tetraessigsäureester alpha-Acyloxyalkylester
sind.
3. Verbindung nach Anspruch 2, worin die alpha-Acyloxyalkylester Acetoxymethylester
sind.
4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin R² für Methyl steht.
5. Chemische Verbindung mit der allgemeinen Formel:
und deren pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Salze und Ester, worin
- A für -NO&sub2; oder -H steht;
- R¹ gewählt ist aus -H, -CH&sub3; oder einem anderen Alkylrest, -OH, -NHR&sup6;, -F, -Cl
und -Br;
- R³, R&sup4; und R&sup5; unabhängig voneinander für -H, -OH, -NR&sup6;R&sup7; oder -Alkoxy stehen
oder R³ und R&sup4; zusammen für -OCH&sub2;O- oder -OCH&sub2;CH&sub2;O- stehen und R&sup5; für -H,
-OH, -NR&sup6;R&sup7; oder -Alkoxy steht oder R&sup4; und R&sup5; zusammen für -OCH&sub2;O- oder
-OCH&sub2;CH&sub2;O- stehen und R³ für -H, -OH, -NR&sup6;R&sup7; oder -Alkoxy steht;
- X gewählt ist aus -OH, -Alkoxy, -Cl, -Br, -NR&sup6;R&sup7;, -OCOCH&sub3;, -OCOCF&sub3;,
-OCOCH&sub2;NH&sub2;, -OPO&sub3;H und -OSO&sub2;CH&sub3;;
- R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander für -H, -Methyl oder -Ethyl stehen; und
- R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander für -H, -CH&sub3;, -C&sub2;H&sub5; oder -CH&sub2;OH stehen, mit
der Ausnahme, daß nicht beide Reste gleichzeitig -H sein können, oder R&sup8; und R&sup9;
zusammen für -(CH&sub2;)m-Y-(CH&sub2;)n- stehen, worin m und n unabhängig voneinander
1 oder 2 sind und Y gewählt ist aus -CH&sub2;-, -O-, -NR&sup6;-, -S- und -S-S-; und
- W für -H, -OH oder -NHR&sup6; steht.
6. Verbindung nach Anspruch 5, worin die Tetraessigsäureester alpha-Acyloxyalkylester
sind.
7. Verbindung nach Anspruch 6, worin die alpha-Acyloxyalkylester Acetoxymethylester
sind.
8. Die Verbindung
cis-1-(2-Bis(carboxymethyl-)amino-5-(1-hydroxy-1-(2-nitro-5,6-methylendioxyphenyl-)methyl-)phenoxy-)2-(2-bis(carboxymethyl-)amino-5-methylphenoxy-)cyclopentan.
9. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Untersuchung
physiologischer Prozesse, die Calcium einschließen.
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