DE3853940T2

DE3853940T2 - Vaginale Probe, Test und Reagenzien.

Info

Publication number: DE3853940T2
Application number: DE3853940T
Authority: DE
Inventors: Andrew E Senyei; Nelson N H Teng
Original assignee: Adeza Biomedical Corp
Current assignee: Adeza Biomedical Corp
Priority date: 1987-11-17
Filing date: 1988-11-17
Publication date: 1995-12-14
Anticipated expiration: 2008-11-18
Also published as: ATE123577T1; EP0316919A2; CA1337394C; EP0316919B1; ES2074993T3; JP2612915B2; JPH01195848A; EP0316919A3; DE3853940T4; GR3017075T3; DE3853940D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, Reagenzien und Sets zum Nachweisen von normaler und Extrauterinschwangerschaft; der Beendigung von Schwangerschaft; und dem erhöhten Risiko von vorzeitigen Wehen und Fruchtblasensprung. Jede Ausführungsform der Erfindung erfordert die Entnahme einer Testprobe aus dem Vaginalraum, um das Vorhandensein oder Fehlen eines Diagnoseindikators in der Testprobe zu ermitteln.
Bei einer Ausführungsform, die die Schwangerschaft während des ersten Trimenons der Schwangerschaft bestimmt, wird die Testprobe einem Assay unterzogen, um das Vorhandensein eines nicht beschränkten Schwangerschafts-Indikators zu ermitteln.
Bei einer Ausführungsform zum Ermitteln der Schwangerschaft während der ersten 20 Schwangerschaftswochen wird das Vorhandensein eines fötal beschränkten Antigens ermittelt.
Ein Verfahren zum Bestimmen von Extrauterinschwangerschaft umfaßt das Prüfen einer Testprobe, die einer schwangeren Patientin während der ersten 20 Wochen der Schwangerschaft entnommen wurde, um das Fehlen eines fötal beschränkten Antigens in der Probe zu bestimmen. Das Fehlen von fötal beschränktem Antigen in der Probe weist auf das Vorliegen einer Extrauterinschwangerschaft hin.
Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis von ex vivo-Empfängnisprodukten. Insbesondere werden Empfängnisprodukte im Uterusgewebe ermittelt, die durch einen vermuteten Spontanabort (eine Fehlgeburt) oder einen ärztlich eingeleiteten Abort aus dem Uterus abgegeben oder entfernt worden sind.
Bei einer Ausführungsform zum Nachweis erhöhten Risikos für vorzeitige Wehen und Fruchtblasensprung nach der 20. Schwangerschaftswoche wird eine Testprobe einem Assay auf Vorhandensein eines fötal beschränkten Antigens unterzogen.
Zur Feststellung der Schwangerschaft ist eine große Vielzahl von Tests entwickelt worden. Kommerzielle Tests zum frühen Schwangerschaftsnachweis umfassen im allgemeinen Bestimmungen an Harn oder Serum. Schwangerschaftstests hinsichtlich hCG (menschliches Chorion-gonadotropin) im Harn zur Selbstanwendung umfassen eine Vielzahl von Enzymimmunoassays, Hämagglutinationshemmungs- und Antikörper- Indikator-Agglutinationstests, die eine Schwangerschaft zwischen 0 und 7 Tagen nach dem Ausbleiben der Menstruation wirksam anzeigen. Bestätigung durch einen Arzt wird empfohlen, insbesondere, um anormale Schwangerschaft wie z.B. Extrauterinschwangerschaft zu bestimmen.
hCG wird vom fötalen Trophoblast erzeugt und gelangt vom Blut des Fötus durch den intervillösen Raum in der Plazenta ins Blut der Mutter. hCG-Mengen im Blut und Harn der Mutter sind oft nach etwa 3 Wochen nachweisbar. Die Empfindlichkeit von hCG- Tests an Serum oder Harn ist beschränkt, da die produzierte hCG-Menge durch die Menge an Trophoblastgewebe und durch Verdünnung des hCG in den Körperfluids der Mutter bestimmt wird. Bis zur Entwicklung des spezifisch β-hCG-bindenden Antikörpers beschränkte auch die Kreuzreaktion mit LH (luteinisierendes Hormon) die Ansprechempfindlichkeit.
Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben gefunden, daß das Stadium normaler Uterusschwangerschaften früh im Reifungszyklus und mit hoher Zuverlässigkeit ermittelt werden kann, indem eine aus der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermundes entnommene Probe auf das Vorhandensein von "Schwangerschafts- Antigenin" getestet wird, das sind antigene oder nichtantigene Verbindungen oder Stoffe, die im Plazentagewebe erzeugt werden und die entweder normalerweise nicht in Körperfluids (Plasma, Serum oder Harn) vorhanden sind, wenn eine Frau nicht schwanger ist, oder die in Körperfluids der Mutter während der Schwangerschaft in erhöhten Mengen vorhanden sind.
Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben gefunden, daß normale Uterusschwangerschaften früh im Reifungszyklus und mit hoher Zuverlässigkeit ermittelt werden können, indem eine aus der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermundes entnommene Probe auf das Vorhandensein von fötal beschränkten Antigenen geprüft wird, das sind Verbindungen oder Stoffe, die im Plazentagewebe erzeugt werden und die nicht in wesentlichen Mengen ins Blut der Mutter gelangen. Zu dieser Klasse von Antigenen gehören fötale Fibronectine.
Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben gefunden, daß Extrauterinschwangerschaft festgestellt werden kann, indem eine aus der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermundes entnommene Probe auf das Vorhandensein von fötal beschränkten Antigenen geprüft wird, das sind Verbindungen oder Stoffe, die im Plazentagewebe erzeugt werden und die nicht in wesentlichen Mengen in das Blut der Mutter gelangen. Zu dieser Klasse von Stoffen gehören fötale Fibronectine. Wenn die fötal beschränkten Antigene in einer Probe von einer Person, bei der mit einem Blut- oder Harntest auf nichtbeschränktes Schwangerschaftsantigen eine Schwangerschaft festgestellt wurde, deutlich verringert sind, ist das ein Hinweis auf eine Extrauterinschwangerschaft.
Das Bestimmen des Vorhandenseins von ex vivo-Empfängnisprodukten in Uterusgewebe, das bei ärztlich eingeleitetem Abort oder Spontanabort entfernt wurde, ist von entscheidender Bedeutung bei der Bestätigung des Vorliegens von Uterusschwangerschaft und deren Beendigung, und um das Vorliegen einer Extrauterinschwangerschaft auszuschließen. Wenn die Mengen an fötal assoziierten Antigenen im Serum oder Harn der Mutter auf Schwangerschaft hinweisen und das während eines ärztlich eingeleiteten Aborts entfernte Uterusgewebe keine Empfängnisprodukte enthält, ist das ein Hinweis auf eine mögliche Extrauterinschwangerschaft. Das Vorhandensein von Empfängnisprodukten in Uterusausscheidungen in Verbindung mit Indikatoren für Spontanabort bestätigt den Abort, während deren Fehlen auf eine Fortdauer der Schwangerschaft hinweist. Übliche Immunoassaytechniken zum Nachweisen des Vorhandenseins von fötal assoziierten Antigenen in aus dem Vaginalraum stammenden Testproben geben keinen zuverlässigen Hinweis auf das Vorhandensein von Empfängnisprodukten, da diese Proben typischerweise Blut der Mutter enthalten. Nicht beschränkte fötale Antigene sind üblicherweise sowohl im Blut der Mutter als auch im Fötus- und Plazentagewebe enthalten.
Die Bestimmung drohender Frühgeburten ist entscheidend für die Erhöhung der neonatalen Überlebensrate von Frühgeborenen. Das Feststellen des Fruchblasensprungs ist wichtig, um echte von falschen Wehen zu unterscheiden. Wenn der Sprung klein und die Menge des abgehenden Fruchtwassers gering ist, bleibt der Sprung oft unentdeckt. Anerkannte Verfahren zum Nachweis gesprungener Blasen sind subjektiv, nicht ausreichend empfindlich und nicht spezifisch. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Feststellen eines erhöhten Risikos für vorzeitige Wehen und Fruchtblasensprung nach der 20. Schwangerschaftswoche betrifft einen Assay einer aus der Nähe des hinteren Scheidengewölbes, des Cervicalkanals oder des Muttermundes entnommenen Testprobe.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird eingesetzt, um das Vorliegen und/oder Stadium einer Schwangerschaft zu bestimmen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird verwendet, um das Vorhandensein eines Diagnoseindikators in einer aus dem Vaginalraum stammenden Probe zu ermitteln, und umfaßt:
(a) ein Verfahren zum Nachweis einer Schwangerschaft während des ersten Trimenons, umfassend das Prüfen einer Testprobe, die aus der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermundes entnommen wurde, und das Feststellen des Vorhandenseins eines nicht beschränkten Schwangerschafts-Antigens in der Probe;
(b) ein Verfahren zum Nachweis normaler Uterusschwangerschaft während der ersten 20 Schwangerschaftswochen, umfassend das Prüfen einer Testprobe, die aus der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermundes entnommen wurde, und das Bestimmen des Vorhandenseins eines fötal beschränkten Antigens in der Probe;
(c) ein Verfahren zum Nachweis einer Eileiterschwangerschaft, umfassend das Prüfen einer aus der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermundes einer schwangeren Patientin während der ersten 20 Schwangerschaftswochen erthaltenen Testprobe und das Bestimmen des Fehlens eines fötal beschränkten Antigens in der Probe;
(d) ein Verfahren zum Nachweis von ex vivo-Empfängnisprodukten, umfassend das Prüfen einer aus dem Uterus abgegebenen oder entnommenen Testprobe und das Bestimmen des Vorhandenseins eines fötal beschränkten Antigens in der Probe; oder
(e) ein Verfahren zum Nachweis erhöhten Risikos von vorzeitigen Wehen oder Fruchtblasensprung, umfassend das Prüfen einer aus der Nähe des hinteren Scheidengewölbes, des Cervikalkanals oder des Muttermundes einer Patientin nach der 20. Schwangerschaftswoche entnommenen Testprobe und das Bestimmen des Vorhandenseins eines fötal beschränkten Antigens in der Probe.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Bestimmen normaler Schwangerschaft während des ersten Trimenons der Schwangerschaft umfaßt das Entnehmen einer Testprobe; und das Bestimmen des Vorhandenseins eines nicht beschränkten Schwangerschafts-Antigens in der Probe. Beispiele für Schwangerschafts- Antigene, deren Vorhandensein in der Testprobe auf Schwangerschaft hinweist, sind hCG, hCT, hPL, SP1, PAPP-A, PAPP-B, HSAP, CAP, PP5, PAMG&sub1;, PAMG&sub2;, β&sub1;-PAM, α&sub2;- PAM, hCLRF, Somatostatin, MP1, PP13, PP20, Protein B und ähnliche. Im allgemeinen umfaßt die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, mit der ein Test für ein Schwangerschaftsantigen durchgeführt wird, das Wechselwirken eines Schwangerschaftsantigens in einer Testprobe mit einem Anti(Schwangerschaftsantigen)- Antikörper über eine ausreichende Zeitspanne, um die Ausbildung der Antigen- Antikörper-Bindung zu ermöglichen; und das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens dieser Bindung.
Eine Ausführungsform zum Nachweis einer normalen Schwangerschaft während der ersten 20 Schwangerschaftswochen umfaßt das Entnehmen einer Testprobe; und das Bestimmen des Vorhandenseins eines fötal beschränkten Antigens in der Probe. Ein fötal beschränktes Antigen ist fötales Fibronectin. Da das fötal beschränkte Antigen im Plasma oder Serum der Mutter nicht in signifikanten Mengen vorhanden ist, sind die Verfahren dieser Ausführungsform auch dann zuverlässig, wenn die Testprobe mit Blut der Mutter verunreinigt ist. Im allgemeinen umfaßt die Ausführungsform, bei der durch Bestimmen eines fötal beschränkten Antigens in einer Testprobe auf normale Schwangerschaft geprüft wird, das Wechselwirken der Probe mit einem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen über eine ausreichende Zeitspanne, um die Ausbildung der Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen; und das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens dieser Bindung.
Die Ausführungsform zum Nachweis von Extrauterinschwangerschaft während der ersten 20 Schwangerschaftswochen umfaßt das Prüfen einer einer schwangeren Patientin entnommenen Testprobe; und das Feststellen des Fehlens von fötal beschränktem Antigen in der Probe. Im allgemeinen umfaßt die Ausführungsform, die einen Test bezüglich Extrauterinschwangerschaft durch das Bestimmen eines fötal beschränkten Antigens in einer Testprobe darstellt, das Wechselwirken der Probe mit einem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen über eine ausreichende Zeitspanne, um die Ausbildung der Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen; und das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens dieser Bindung.
Die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Bestimmen des Vorhandenseins von Empfängnisprodukten in einer Testprobe von Gewebe, von dem vermutet wird, daß es aus dem Uterus abgezogen wurde, d.h. während einer Dilatation und Kürettage (D&C) oder während eines ärztlich eingeleiteten oder vermutlich spontanen Aborts aus dem Uterus hergeleitet wurde, umfaßt das Bestimmen des Vorhandenseins eines fötal beschränkten Antigens in der Probe. Im allgemeinen umfaßt die Ausführungsform, die durch Bestimmen eines fötal beschränkten Antigens in einer Testprobe auf ex vivo- Empfängnisprodukte prüft, das Wechselwirken der Probe mit einem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen über eine ausreichende Zeitspanne, um die Ausbildung der Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen; und das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens dieser Bindung.
Die Ausführungsform zum Bestimmen von Fruchtblasensprung oder eines erhöhten Risikos für Frühgeburt nach der 20. Schwangerschaftswoche umfaßt das Entnehmen einer Testprobe; und das Bestimmen des Vorhandenseins eines fötal beschränkten Antigens in der Probe. Im allgemeinen umfaßt die Ausführungsform, die durch Bestimmen eines fötal beschränkten Antigens in einer Testprobe auf das erhöhte Risiko für vorzeitige Wehen und Blasensprung prüft, das Wechselwirken der Probe mit einem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen über eine ausreichende Zeitspanne, um die Ausbildung der Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen; und das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens dieser Bindung.
Reagenzien zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Assays sind markierte und un markierte Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper, wie z.B. Anti-(hCG)- Antikörper, anti-(hPL)-Antikörper und dergleichen. Andere Reagenzien zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Assays sind unlösliche Träger, an denen Anti- (Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper wie z.B. Anti-(hCG)-Antikörper und dergleichen fixiert sind. Markierte oder unmarkierte Reagens-Schwangerschafts-Antigene sind ebenfalls Reagenzien gemäß vorliegender Erfindung. Reagenzien zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Assays umfassen auch unlösliche Träger, an denen Reagensanalyt fixiert ist, d.h. unlösliche Träger, an denen Schwangerschafts-Antigen fixiert ist.
Reagenzien zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Assays sind markierte oder unmarkierte Anti-(Analyt)-Antikörper, d. h. Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, wie z.B. Antikörper gegen fötales Fibronectin; Antikörper gegen die Analytklasse, d.h. Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene, wie z.B. Anti-(Fibronectin)- Antikörper, und dergleichen. Andere Reagenzien zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Assays sind unlösliche Träger, an denen die Anti-(Analyt)-Antikörper fixiert sind; d.h. Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, wie z.B. Antikörper gegen fötales Fibronectin; Antikörper gegen die Analytklasse; d.h. Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene, wie z.B. Anti-(Fibronectin)-Antikörper; und dergleichen. Markierte oder unmarkierte fötal beschränkte Reagensantigene sind ebenfalls Reagenzien gemäß vorliegender Erfindung. Reagenzien zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Assays sind auch unlösliche Träger, an denen Reagensanalyt fixiert ist, d.h. unlösliche Träger, an denen fötal beschränktes Antigen fixiert ist.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Sets, die eines der obigen Reagenzien alleine oder in Kombination mit markierten Antikörpern umfassen. Die Reagenzien können im Set in jeder geeigneten Form vorhanden sein, beispielsweise in Behältern, Packungen und dergleichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Feststellen des Vorliegens und/oder Stadiums einer Schwangerschaft umfaßt das Feststellen des Vorhandenseins eines diagnostischen lndikators, im speziellen eines nicht beschränkten Schwangerschafts-Antigens oder eines fötal beschränkten Antigens, in einer aus der Nähe des hinteren Scheidengewölbes, Cervikalkanals oder Muttermundes und im speziellen am Cervikalkanal oder Muttermund aus dem Vaginalraum entnommenen Testprobe.
Spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden verwendet, um normale Uterusschwangerschaft, Extrauterinschwangerschaft, das Vorliegen eines ärztlich eingeleiteten oder Spontanaborts und das erhöhte Risiko vorzeitiger Wehen oder eines Blasensprungs zu ermitteln.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt den Nachweis eines Schwangerschafts-Antigens in einer Testprobe, um eine Schwangerschaft festzustellen. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben gefunden, daß nachweisbare Mengen dieser Stoffe in Testproben vorhanden sind, die während des ersten Schwangerschafts-Trimenons in der Nähe des Cervikalkanals oder des Muttermundes entnommen wurden und früh in der Schwangerschaft in nachweisbaren Mengen in solchen Proben zu finden sind.
Der Begriff "Schwangerschafts-Antigen", wie hierin verwendet, ist so definiert, daß damit eine antigene oder nicht-antigene Verbindung oder Substanz gemeint ist, die als Reaktion auf Schwangerschaft entweder durch Plazentagewebe oder durch Gewebe im Uterus der Mutter gebildet wird und im Stoff vorhanden ist, der nach einer solchen Bildung gemäß vorliegender Erfindung als Probe entnommen wird. Schwangerschafts- Antigene, auf die ein Assay durchgeführt wird, um Schwangerschaft festzustellen, sind nicht beschränkt, das heißt, sie sind im Plasma, Serum oder Harn der Mutter in signifikanten Mengen vorhanden. Vor der vorliegenden Erfindung wurde Serum, Plasma oder Harn der Mutter auf das Vorhandensein dieser Substanzen geprüft, um Schwangerschaft festzustellen. Da die Menge der produzierten Substanzen wie z.B. hCG durch die Menge an Plazentagewebe beschränkt ist, sind die in den ersten Tagen nach der Einnistung erzeugten Mengen klein und werden rasch durch Körperfluids der Mutter verdünnt. Die in der in der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermundes entnommenen Probe auftretenden Schwangerschafts-Antigene sind keiner starken Verdünnung durch Körperfluids der Mutter unterworfen, werden offensichtlich durch das Plazantagewebe und Gewebe in der Uterushöhle der Mutter erzeugt und freigesetzt und sind beinahe unmittelbar nach Einnisten oder Festsetzen der Morula (des befruchteten Eies) am Uterusendometrium in nachweisbaren Mengen vorhanden. Der Begriff "Schwangerschafts-Antigen", wie hierin verwendet, umfaßt antigene Stoffe, Proteine und andere Substanzen, die in ihrer gereinigten Form nicht antigen sind, die aber einzigartige Epitope aufweisen, an die sich die Antikörper vorzugsweise binden können.
Beispiele für identifizierte Schwangerschafts-Antigene sind menschliches Chorion- gonadotropin (hCG), menschliches Chorion-thyrotropin (hCT), menschliches Plazenta- Laktogen (hPL), schwangerschaftsspezifisches Glykoprotein 1 oder schwangerschaftsspezifisches β&sub1;-Glykoprotein (SP1), schwangerschaftsassoziiertes Plasma Protein A (PAPP-A), schwangerschaftsassoziiertes Plasma Protein B (PAPP-B), wärmestabile alkalische Phosphatase (HSAP) (S, I und F-Phänotypen), Cystinaminopeptidase (CAP), Plazenta-Protein 5 (PP5), plazentaspezifisches α&sub1;- Mikroglobulin (PAMG&sub1;), plazentaspezifisches α&sub2;-Mikroglobulin (PAMG&sub2;), schwangerschaftsassoziiertes β&sub1;-Makroglobulin (β&sub1;-PAM), schwangerschaftsassoziiertes α&sub2;-Makroglobulin (α&sub2;-PAM), menschlicher chorionaler, luteinisierendes Hormon freisetzender Faktor, (hCLRF), menschliches chorionales, Thyrotropin freisetzendes, Hormon (hCTRH), menschliches chorionales, Wachstumshormonfreisetzungs- Hemmhormon (Somatostatin), die Plazentaproteine PP20 und PP13, Protein B und der frühe Schwangerschaftsfaktor (EPF). Bei jedem davon handelt es sich um Proteine, die von der Plazenta erzeugt werden und die gereinigt und gut charakterisiert worden sind.
Der Begriff "Antikörper", wie hierin verwendet, ist so definiert, daß er Antikörper der Klassen IgG, IgM, IgA, IgD und IgE umfaßt, und vorzugsweise bindende Fragmente und Hybridderivate von Antikörpern, einschließlich der Antikörperfragmente Fab und F(ab')&sub2;. Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Im allgemeinen werden zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Assays monoklonale Antikörper bevorzugt.
Immunologische Verfahren sind aufgrund ihrer Spezifität am zweckmäßigsten bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Assays, und der Begriff "Immunoassays" wie hierin verwendet ist so definiert, daß damit jedes Verfahren gemeint ist, bei dem eine bevorzugte Bindung eines Antigens mit einem zweiten Stoff (d.h. einem Bindungspartner, üblicherweise einem Antikörper oder Antikörperfragment mit einer Antigen-Bindungsstelle) verwendet wird, der sich vorzugsweise an ein Epitop des Antigens bindet. Bevorzugte Bindung wie hierin verwendet bezieht sich auf Bindung zwischen Bindungspartnern, die selektiv und im allgemeinen spezifisch ist und die im allgemeinen weniger als 10%, vorzugsweise weniger als 5%, kreuzreaktive nichtspezifische Bindung zeigt.
In den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen alle Immunoassays, die diesen Schritt umfassen, einschließlich aber nicht beschränkt auf beispielsweise Sandwich-, Konkurrenz-, Eintauchstab-, Agglomerations-, Fällungs- Transistorbrückensonden-, Partikelsorting-, Lichtstörungs-, Lichtstreuungs- und Ultraschallsonden-Immunoassays. Bei geeigneten Immunoassays können als Markierungen beispielsweise Radioisotopen, Enzyme oder fluorogene, chromogene oder chemolumineszierende Substanzen verwendet werden.
Eine Testprobe, an der ein Assay vorzunehmen ist, wird in der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermundes entnommen, und die Probe wird einem Assay unterzogen, um das Vorhandensein von oder die Menge an Schwangerschafts-Antigen in der Probe festzustellen. Die Probe umfaßt im allgemeinen Fluid oder teilchenartige Feststoffe und kann Scheiden- oder Cervikalschleim, andere Vaginal- oder Cervikalsekrete, Zellen oder Zellbruchstücke, Fruchtwasser oder andere Stoffe vom Fötus oder der Mutter enthalten. Die Probe wird mit einem Tupfer mit einer Spitze aus Dacron oder einem anderen faserigen Material, einem Aspirator, einer Absaugvorrichtung, einer Spülvorrichtung oder dergleichen entnommen und wird zur Lagerung und zum Transport zum Testlabor einem geeigneten Behälter übertragen.
Es ist wichtig, diese Testprobe in einer Flüssigkeit zu dispergieren, die die empfindlichen Proteinanalyten konserviert, die in der als Probe genommenen Zusammensetzung instabil sind. Das Lager- und Transfermedium sollte das Absinken des Proteinanalytspiegels während der Lagerung und des Transports verhindern. Eine geeignete Konservierungslösung für Lagerung und Transfer besteht aus 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4; 0,15 M NaCl, 0,02% NaN&sub3;, 1% BSA, 500 Kallikrein-Einheiten/ml Aprotinin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 5 mM EDTA und wird in der am 15. September 1988 eingereichten US-A-244,969 beschrieben.
Der Nachweis von Schwangerschafts-Antigenen kann erfolgen, indem das Schwangerschafts-Antigen in einer Testprobe, die in der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermundes entnommen wurde, mit einem Antikörper verbunden wird, der sich vorzugsweise an ein Epitop des Schwangerschafts-Antigens bindet, und das Vorliegen dieser Bindung festgestellt wird.
Bei einer Sandwich-Immunoassay-Variante der vorliegenden Ausführungsform wird die Testprobe mit einem unlöslichen Träger in Kontakt gebracht, an dem Anti- (Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper fixiert ist, um Bindung und Einfangen von Schwangerschafts-Antigen in der Probe zu bewirken. Der unlösliche Träger wird dann mit einem unmarkierten oder markierten Antikörper in Kontakt gebracht, der sich an das Schwangerschafts-Antigen bindet, das am unlöslichen Träger haftet, um das eingefangene Schwangerschafts-Antigen, d.h. einen sekundären Antikörper, zu markieren und zu messen. Beispielsweise kann anti-(hCG)-Antikörper am unlöslichen Träger fixiert werden, und markierter oder unmarkierter anti-(hCG)-Antikörper kann verwendet werden, um das eingefangene hCG-Antigen zu markieren. Der sekundäre Antikörper kann eine physikalisch nachweisbare Markierung aufweisen, die direkt auf dem unlöslichen Träger gemessen werden kann. Alternativ dazu kann der sekundäre Antikörper unmarkiert sein, und der sekundäre Antikörper kann bestimmt werden, indem der unlösliche Träger mit einem markierten Antikörper oder Antikörperfragment in Kontakt gebracht wird, der bzw. das sich selektiv an den sekundären Antikörper bindet (d.h. ein tertiärer Antikörper), ungebundener markierter tertiärer Antikörper vom Träger entfernt wird und das Vorhandensein der Markierung auf dem unlöslichen Träger bestimmt wird. Zur Verwendung eignen sich Sandwich-Immunoassays, bei denen ein Membransubstrat verwendet wird.
Alternativ dazu wird die Probe mit einem Konkurrenz-Immunoassayverfahren geprüft. Die Probe kann mit markiertem Reagens-Antikörper oder Antigen gemischt und mit einem unlöslichen Träger inkubiert werden, an dem ein Anti-(Schwangerschafts- Antigen)-Antikörper oder Reagens-Schwangerschafts-Antigen fixiert ist, wobei die Reagenzien um die Bindung mit dem Probenanalyt konkurrieren. Fachleuten auf dem Gebiet der Immunoassays sind Verfahren und Vorgangsweisen zur Durchführung solcher Immunoassays wohlbekannt. Es wird die Markierung bestimmt, die schlußendlich am unlöslichen Träger haftet oder in der Lösung verbleibt.
Polyklonale Anti-(hCG)-Antikörper und ihre Herstellung werden in den US-PS- 3,171,783, 3,234,096, 3,236,732 und 3,309,275 beschrieben. Monoklonale Anti- (hCG)-Antikörper und ihre Herstellung werden im Weltpatent WO 8404598, der J-PA- 62046262 (28.Feb. 1987) und der EP-A-210863 (4. Feb. 1987) beschrieben. Anti-(β- hCG)-Antikörper und ihre Herstellung werden in den US-Patenten Nr. 4,116,776, 4,123,509, 4,234,561, 4,256,629, 4,268,435, 4,310,455 und 4,313,871 beschrieben.
Anderen bekannten schwangerschaftsspezifischen Indikatoren und Antikörpern, die sich vorzugsweise an diese binden, wird in der Literatur und Patenten breiter Raum gewidmet. Beispielsweise werden Anti-(SPI)-Antikörper und ihre Herstellung in den J- PA-59174762 und 59214767 und in Engvall, E. et al., "Cancer Res." (1982) beschrieben. Antikörper, die α-Fetoprotein binden, und ihre Herstellung werden von Uotila M. et al., "Mol.Immunol." 17:791 (1980) und Uotila, M. et al., "J.Immunol.Meth." 42:11 (1981) beschrieben. Anti-(EPF) (früher Schwangerschaftsfaktor)-Antikörper und ihre Herstellung werden im Weltpatent WO 8605498 beschrieben. Anti-(hPL)(menschlicher laktogener Plazenta-Faktor)-Antikörper werden samt ihrer Herstellung in der US-PS-3,892,841 beschrieben. Antikörper, die vorzugsweise Protein B binden, werden in der US-PS-4,554,256 beschrieben. Anti- (MP1)(membranassoziiertes Plazentaprotein)-Antikörper werden in der EP-A 125 514 (21.Nov. 1984) beschrieben. Anti-(PP13)(plazentaspezifisches Protein)-Antikörper und ihre Herstellung werden in der US-PS-4,500,451 beschrieben. Anti-(PP17)-Antikörper und ihre Herstellung werden in der US-P54,468,345 beschrieben. Anti-(PP20)- Antikörper und ihre Herstellung werden in der US-PS-4,592,863 beschrieben. Anti- (PLAP)(alkalische Plazentaphosphatase)-Antikörper und ihre Herstellung werden von Millan, J. et al., "PLACENTAL PROTElNS (oben, Bezug auf S. 432) beschrieben. Antikörper, die Östrogen (Östriol) binden, und ihre Herstellung werden in der EP-A- 178,683 (23. April 1986) beschrieben. Antikörper, die Progesteron binden, werden in der HU-A-T37028 (28.Nov. 1985) beschrieben.
Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper können durch herkömmliche Antiserum- oder monoklonale Techniken aus Schwangerschafts-Antigenen, vorzugsweise aus hochgereinigten Schwangerschafts-Antigenen, erhalten werden. Die vorliegende Erfindung wird hierin bezogen auf den Nachweis von menschlichem Chorion-gonadotropin (hCG) als Schwangerschafts-Antigen beschrieben, und zwar zum Zweck der Klarheit und nicht als Einschränkung: der Nachweis jedes beliebigen Schwangerschafts-Antigens soll im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen. Die Herstellung von Anti-(hCG)- Antikörpern ist oben beschrieben.
Sowohl monoklonale als auch polyklonale Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper können durch herkömmliche Antiserum- oder monoklonale Techniken direkt aus Schwangerschafts-Antigenen abgeleitet werden, vorzugsweise aus hochgereinigten Antigenen.
Die hauptsächlichen Antikörper, die bei den erfindungsgemäßen Assays nützlich sind, sind IgG- und IgM-Antikörper, obwohl auch die IgD-, IgE- und IgA-Antikörper verwendet werden können, wenn sie in ausreichender Menge verfügbar sind. Die Antikörper werden dann unter Einsatz herkömmlicher Affinitätschromatographie-Techniken affinitätsgereinigt, wie sie z.B. von Mishell und Shilgi in "SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY. San Francisco: Freeman (1980), Goding, J. "MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE". New York: Academic Press S. 111-114 (1983), und Parikh et al., C&EN (26. August 1985) beschrieben werden.
Bevorzugte bindende bzw. Bindungs-Antikörper-Fragmente, die zur Verwendung im Set und Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können durch herkömmliche Enzym- oder chemische Fragmentationsverfahren aus den jeweiligen monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern hergestellt werden. Geeignete Verfahren werden beispielsweise von Tijssen, "P.LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: PRACTICE AND THEORIES OF ENZYME IMMUNOASSAYS". New York; Elsevier (1985) beschrieben.
Polyklonaler Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper kann erhalten werden, indem ein Tier, wie z.B. ein Kaninchen, Meerschweinchen, eine Ratte oder Ziege mit konzentriertem Schwangerschaftsantigen, wie z.B. hCG immunisiert wird, Serum dem immunisierten Tier entnommen wird und die Immunoglobuline, beispielsweise durch Ammoniumsulfatausfällung, vom Serum abgetrennt werden.
Geeignete Absorbentien zur Verwendung bei der Affinitätschromatographie sind vernetzte Agarose und vernetzte Polyacrylamide, an welche der Anti-(Schwangerschafts- Antigen)-Antikörper kovalent gebunden wird. Zum Entfernen von Antikörpern, die mit anderen Hormonen oder Geweben über Kreuz reagieren, wird das Antikörper-Serum durch Säulen geschickt an welche diese Materialien gekoppelt sind. Eine Teilmenge des Eluats, die den verbleibenden Antikörper enthält, kann dann durch eine hCG-Säule geschickt und eluiert werden, um den affinitätsgereinigten Antikörper zu erhalten.
Bei diesen Verfahren kann die Antikörperlösung in einer phosphatgepufferten Salzlösung auf die Säule aufgebracht werden, und die Antikörper können mit einer 2,5 M NaSCN-Lösung, pH 8,0, eluiert werden. Antikörper-Konzentration kann, wenn erwünscht, durch Dialyse mit negativem Druck oder Ultrafiltration erreicht werden. Die Antikörper-Lösung ist bei einer Temperatur von 4ºC oder darunter stabil. Die Wiederholung der Säulentrennverfahren wird fortgesetzt, bis die gewünschte Trennung und Reinheit erreicht ist.
Monoklonaler Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper kann nach dem Verfahren von Galfre and Milstein, "Meth.Enzym." 73:1(1981) erhalten werden, wobei Mäuse mit Schwangerschafts-Antigenen immunisiert werden, um die Milzzellen zur Hybridisierung zu erhalten. Geeignete Verfahren werden von Goding, J. "MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE" New York: Academic Press (1983) S.56- 97) beschrieben.
Sandwich-Immunoassays: Bei einer Sandwich-Immunoassay-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Feststellung von Schwangerschafts-Antigen in einer Testprobe wird ein unlöslicher Träger, an dem Anti-(Schwangerschafts-Antigen)- Antikörper fixiert ist, mit einer Testprobe, die mit einer wässerigen Pufferlösung wie z.B. Phosphatpufferlösung (PBS), pH 6 bis 8, und vorzugsweise von 7,2 bis 7,6 verdünnt ist, über eine ausreichende Zeitspanne in Kontakt gebracht, um das Binden von Schwangerschafts-Antigen in der Testprobe an den Anti-(Schwangerschafts-Antigen)- Antikörper auf dem unlöslichen Träger zu ermöglichen. Die Probe wird dann vom Träger entfernt. Die Inkubationszeit sollte ausreichen, um eine wesentliche Bindung zu ermöglichen, wobei die Zeit temperaturabhängig ist. Geeignete Inkubationszeiten sind von 30 bis 240 Minuten bei Temperaturen innerhalb des Bereichs von 16 bis 40ºC, wobei die bevorzugte Kontaktzeit zumindest 60 Minuten bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 26ºC beträgt.
Die verbleibende Proben lösung wird dann unter Verwendung einer Spüllösung vom Träger entfernt. Es kann jede herkömmliche Spüllösung verwendet werden. Eine geeignete Spüllösung wird in der US-PS-4,528,267 beschrieben. Es handelt sich dabei um eine wässerige Phosphatpufferlösung mit einer Phosphatmolarität von 0,0001 bis 0,05 und einem pH von 6 bis 8, die von 0,001 bis 0,1 Gew.-% nichtionisches Tensid enthält. Geeignete nichtionische Tenside sind Polyoxyethylenether (BRIJ , wie z.B. Lauryl-, Cetyl-, Oleyl-, Stearyl- und Tridecylpolyoxyethylenether); Polyoxyethylensorbitane (TWEEN , wie z.B. Polyoxyethlyensorbitan-Monolaurat, -Monopalmitat, -Monostearat, -Monoleat und -Trioleate); und andere Polyoxyethylenether (beispielsweise TRITON ). Ein bevorzugtes nicht-ionisches Tensid ist Octylphenoxypolyethoxyethanol mit 40 Ethylenoxidein heiten (TRITON X405 , Rohm and Haas Company).
Der unlösliche Träger wird dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der an das eingefangene Schwangerschafts-Antigen auf dem unlöslichen Träger, d.h. dem Sandwich ing-Antikörper, bindet. Der Sandwiching-Antikörper kann markiert oder unmarkiert sein. Für den Fall, daß ein unmarkierter Sandwiching-Antikörper verwendet wird, kann auf herkömmliche Art ein tertiärer Antikörper verwendet werden, der an den Sandwiching-Antikörper bindet und eine physikalisch nachweisbare Markierung trägt, um den Sandwiching-Antikörper zu bestimmen.
Eine Vielzahl von Markierungen wird hierin beschrieben. Zum Zweck der Klarheit und nicht als Einschränkung werden die folgenden Schritte des Verfahrens bezogen auf Anti- (Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper beschrieben, die mit einem Enzym markiert worden sind, vorzugsweise mit einem chromogenen oder fluorogenen Enzym. Der Begriff "chromogenes Enzym" ist hierin so definiert, daß damit ein Enzym gemeint ist, das mit einem geeigneten Substrat ein Chromophorprodukt erzeugt. Der Begriff "fluorogenes Enzym" ist hierin so definiert, daß damit ein Enzym gemeint ist, das mit einem geeigneten Substrat ein Fluorophorprodukt erzeugt.
Der Sandwiching-Antikörper wird in einer wässerigen Lösung auf den unlöslichen Träger aufgebracht. Die Lösung enthält vorzugsweise geeignete Salze und Puffer, um die Reaktanden zu konservieren und die Bindungsreaktion zu erleichtern. Beispielsweise kann die Lösung Rinderserumalbumin (BSA), Phosphatpufferlösung (PBS) und ein mildes Tensid wie z.B. Polyoxyethylensorbitanester enthalten, der bei der oben beschriebenen Spüllösung verwendet wird. Die Inkubation wird ausreichend lange fortgesetzt, um die Bindung des Sandwiching-Antikörpers mit freiliegenden Schwangerschaftsantigen-Epitopen, so es welche gibt, zu ermöglichen, die am unlöslichen Träger fixiert sind. Die bevorzugten Inkubationszeiten und -temperaturen sind für die Bindung von insolubilisiertem Reagens-Anti-(Schwangerschafts-Antigen)- Antikörper an das Schwangerschafts-Antigen dargelegt. Die Sandwiching-Antikörper- Lösung wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche ungebundene Material zu entfernen.
Wenn der Sandwiching-Antikörper unmarkiert ist, wird ein Enzym-markierter Antikörper oder ein anderes Bindungsmittel, das selektiv an den Sandwiching-Antikörper bindet, auf den unlöslichen Träger in einer wässerigen Lösung aufgetragen. Die Lösung enthält vorzugsweise geeignete Salze und Puffer, um die Reaktanden zu konservieren und die Bindungsreaktion zu erleichtern, wie z.B. oben beschrieben. Die Inkubation wird über eine ausreichende Zeitspanne fortgesetzt, um es markiertem Anti-(Sandwiching- Antikörper)-Antikörper zu ermöglichen, sich an freiliegende Sandwiching-Antikörper- Epitope, so vorhanden, zu binden, die am unlöslichen Träger fixiert sind. Die bevorzugten Inkubationszeiten und -temperaturen sind jene, die für die Bindung von insolubilsiertem Reagens- Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper an das Proben- Schwangerschafts-Antigen dargelegt sind. Die markierte Antikörper-Lösung wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jedes restliche ungebundene markierte Material zu entfernen.
In einem nächsten Schritt des Sandwich-Verfahrens wird der unlösliche Träger mit einer wässerigen Lösung aus einem Substrat in Kontakt gebracht, das in Gegenwart des Enzyms umgesetzt wird, sodaß es eine fluoreszierende oder chromogene Verbindung in die Lösung freisetzt. Geeignete Substrate und die Enzyme, mit denen sie umgewandelt werden können, werden beispielsweise in den US-PS-4,190,496 und 4,528,267 beschrieben. Der Träger wird mit einer wässerigen Lösung des Substrats in Kontakt gebracht, die von 10&supmin;² bis 10&supmin;¹&sup0; Molkonzentrationen des Substrats enthält. Molkonzentrationen des Substrats von 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;&sup5; werden vorgezogen. Zu bevorzugten zusätzlichen Reagenzien und Puffern in der Substratlösung gehören beispielsweise 2- Amino-2-methyl-1-propanol-Puffer, TRIS und Magnesiumchlorid.
Die Substratlösung wird mit dem unlöslichen Träger über eine ausreichende Zeitspanne inkubiert, damit die Reaktion die das Fluorophor oder Chromophor ergibt, eintreten kann. Bei Temperaturen von 18 bis 40ºC können Inkubationszeiten von 5 bis 240 Minuten eingesetzt werden. Vorzugsweise liegt die Temperatur im Bereich von 20 bis 26ºC, und die Inkubationszeit beträgt von 30 bis 90 Minuten.
Die fluoreszierende oder Chromophor-Menge in der Lösung wird dann gemessen.Die Ausrüstung und Verfahren zum Bestimmen der Menge an Fluoreszenz- oder Chromophormenge in den Substratlösungen sind die nach dem Stand der Technik verwendeten. Die Menge an Fluoreszenz oder Chromogen in Lösung ist eine Funktion der Enzymkonzentration auf dem unlöslichen Träger, die wiederum eine Funktion der Menge an Schwangerschafts-Antigen in der Testprobe ist. Die Konzentration des Schwangerschafts-Antigens kann ermittelt werden, indem man die Fluoreszenz- oder Chromophormenge der Lösung mit jeweiligen Fluoreszenz- oder Chromophormengen vergleicht, die man mit Kontrollösungen erhält, die bekannte Schwangerschafts-Antigen- Konzentrationen enthalten.
Membranimmunoassays: Bei einer Membran- Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von Schwangerschafts-Antigen in einer Testprobe wird ein unlöslicher Träger, an dem Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper fixiert ist, mit einer mit einer wässerigen Pufferlösung, wie z.B. Phosphatpufferlösung (PBS), pH 6 bis 8, und vorzugsweise von 7,2 bis 7,6, verdünnten Testprobe über eine ausreichende Zeitspanne in Kontakt gebracht, um die Bindung von Schwangerschafts-Antigen in der Probe mit dem Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper auf dem unlöslichen Träger zu ermöglichen. Die zur Bindung erforderliche Zeit ist in einem Durchflußsystem sehr gering. Geeignete Inkubationszeiten können 1 Sekunde bis zu 20 Minuten bei Temperaturen im Bereich von 16 bis 40ºC sein, wobei die bevorzugte Kontaktzeit weniger als 1 Minute und optimalerweise von 10 Sekunden bis 2 Minuten beträgt.
Der unlösliche Träger wird dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der an das eingefangene Schwangerschafts-Antigen auf dem unlöslichen Träger, d.h. den Sandwiching-Antikörper, bindet. Der Sandwiching-Antikörper kann markiert oder unmarkiert sein. Für den Fall, daß ein unmarkierter Sandwiching-Antikörper verwendet wird, kann ein tertiärer Antikörper, der an den Sandwiching-Antikörper bindet und eine physikalisch nachweisbare Markierung trägt, auf herkömmliche Art verwendet werden, um den Sandwiching-Antikörper zu bestimmen.
Eine Vielzahl von Markierungen wird hierin beschrieben. Zum Zweck der Klarheit, nicht jedoch zur Einschränkung, werden die folgenden Schritte des Verfahrens für Anti- (Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper beschrieben, die mit einem Enzym, vorzugsweise einem fluorogenen oder chromogenen Enzym, markiert worden sind.
Der Sandwiching-Antikörper wird auf den unlöslichen Träger in einer wässerigen Lösung aufgetragen. Die Lösung enthält vorzugsweise geeignete Salze und Puffer, um die Reaktanden zu konservieren und die Bindungsreaktion zu erleichtern. Beispielsweise kann die Lösung Rinderserumalbumin (BSA), Phosphatpufferlösung (PBS) und ein mildes Tensid wie z.B. Polyoxyethylensorbitanester enthalten, das in der oben beschriebenen Spüllösung verwendet wird. Die Inkubation wird über eine ausreichende Zeitspanne fortgesetzt, um das Binden des Sandwiching-Antikörpers an freiliegende Schwangerschafts-Antigen-Epitope, so vorhanden, zu ermöglichen, die am unlöslichen Träger fixiert sind. Die bevorzugten Inkubationszeiten und -temperaturen sind jene, die für die Bindung von insolubil isiertem Reagens-Anti-(Schwangerschafts-Antigen)- Antikörper an das Testproben-Schwangerschafts-Antigen dargelegt sind.
Die Sandwiching-Antikörper-Lösung kann wahlweise vom unlöslichen Träger entfernt werden, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche ungebundene markierte Material zu entfernen.
Wenn der Sandwiching-Antikörper unmarkiert ist, wird ein enzymmarkierter Antikörper oder ein anderes Bindungsagens, das selektiv an den Sandwiching-Antikörper bindet, in einer wässerigen Lösung auf den unlöslichen Träger aufgetragen. Die Lösung enthält vorzugsweise geeignete Salze und Puffer, um die Reaktanden zu konservieren und die Bindungsreaktion zu erleichtern, wie z.B. oben beschrieben. Die Inkubation wird über eine ausreichende Zeitspanne fortgesetzt, um die Bindung von markiertem Anti- (Sandwiching-Antikörper)-Antikörper an Sandwiching-Antikörper-Epitope, falls vorhanden, die am unlöslichen Träger fixiert sind, zu ermöglichen. Die bevorzugten Inkubationszeiten und -temperaturen sind jene, die für die Bindung von insolubilisiertem Reagens Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper an das Testproben-Schwangerschaftsantigen dargelegt sind.
Die markierte Antikörper-Lösung wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche, ungebundene markierte Material zu entfernen.
In einem nächsten Schritt des Membran-Sandwich-Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung wird der unlösliche Träger mit einer wässerigen Lösung eines Substrats in Kontakt gebracht, das in Gegenwart des Enzyms umgesetzt wird, um Fluorogen- oder Chromogenverbindung in die Lösung freizusetzen. Geeignete Substrate und die Enzyme, mit denen sie umgewandelt werden können, sowie zusätzliche Komponenten und Puffer sind oben beschrieben worden.
Die Substratlösung wird mit dem unlöslichen Träger über eine ausreichende Zeitspanne inkubiert, damit die Reaktion, die zum Auftreten des Fluorophor oder Chormophor führt, eintreten kann. Bei Temperaturen von 18 bis 40ºC können Inkubationszeiten von 1 bis 20 Minuten eingesetzt werden. Vorzugsweise liegt die Temperatur im Bereich von 20 bis 26ºC, und die Inkubationszeit beträgt von 2 bis 5 Minuten. Die Fluorogen- oder Chromogenmenge auf der Membran kann unter Verwendung eines Reflektometers oder Densitometers gemessen werden.
Konkurrenz-Immunoassays: Konkurrenz- bzw. Kompetitiv-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen markiertes Reagens-Schwangerschafts-Antigen verwendet wird, umfassen das In-Kontakt-Bringen eines Gemisches aus der Testprobe und dem markierten Reagens-Schwangerschafts-Antigen mit einem Anti- (Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper, der an einem unlöslichen Träger fixiert ist, und das Bestimmen der Menge an Markierung, die entweder an den unlöslichen Träger bindet oder in der Lösungsphase verbleibt.
Die Konkurrenz-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen markierte Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper verwendet werden, können mehr als eine Form haben. Eine Ausführungsform, bei der an den unlöslichen Träger gebundener Anti- (Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper verwendet wird, umfaßt das In-Kontakt-Bringen eines Gem isches aus der Testprobe und markierten Anti-(Schwangerschafts-Antigen)- Antikörpern mit einem an einem unlöslichen Träger fixierten Anti-(Schwangerschafts- Antigen)-Antikörper, und das Bestimmen der Markierungsmenge, die entweder an den unlöslichen Träger bindet oder in der Lösungsphase verbleibt. Eine weitere Ausführungsform, bei der an den unlöslichen Träger gebundenes Reagens- Schwangerschafts-Antigen verwendet wird, umfaßt das In-Kontakt-Bringen eines Gemisches aus der Testprobe und markierten Anti-(Schwangerschafts-Antigen)- Antikörpern mit einem an einem unlöslichen Träger fixierten Schwangerschafts-Antigen und das Bestimmen der Markierungsmenge, die entweder an den unlöslichen Träger bindet, oder in der Lösungsphase verbleibt.
Bei jedem dieser Verfahren wird die Testprobe mit Pufferlösung verdünnt, inkubiert und die Markierung wie oben unter Bezugnahme auf die Sandwich-Immunoassay- Ausführungsformen beschrieben bestimmt. Die Konzentration des Beschränkungsreagens ist so gewählt, daß kompetitive Bindung zwischen den Reagenzien ermöglicht wird, wobei die Menge an Markierung, die auf dem unlöslichen Träger oder in der Lösung verbleibt, eine Variable ist, die von der Menge des Analyten in der Probe abhängt. Diese Verfahren sind im allgemeinen wohlbekannt, und Fachleute auf dem Gebiet der Immunoassays wissen, wie sie zu variieren sind, um ein Verfahren zu optimieren.
Die Bindung des Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörpers an das Schwangerschafts- Antigen in der Testprobe kann auch durch Agglomeration von Teilchen, an denen Anti- (Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper durch Schwangerschafts-Antigen in der Probe fixiert ist, Ausfällung von Antikörpern aufgrund von Antikörper-Antigen-Reaktionen oder Beobachtungen von bei der Antikörper-Antigen-Bindung auftretenden physikalischen oder elektrischen Veränderungen festgestellt werden, wobei Halbleiterbrücken-Sonden, Lichtstörungsmuster wie z.B. in der US-PS-4,647,544 beschrieben und dergleichen verwendet werden.
Das Feststellen des Vorhandenseins von nicht beschränktem Schwangerschafts-Antigen in der Testprobe weist auf Schwangerschaft hin.
Testsets für nicht beschränktes Schwangerschafts-Antigen, die in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen, umfassen Kombinationen aus einer Probenahmevorrichtung mit (a) einem an einem unlöslichen Träger fixierten Anti- (Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper; (b) einer Kombination aus an einem unlöslichen Träger fixierten Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper und entweder einem markierten Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper oder einem markierten Reagens- Schwangerschafts-Antigen; oder (c) einem an einem unlöslichen Träger fixierten Reagens-Schwangerschaftsantigen und einem markierten Anti-(Schwangerschafts- Antigen)-Antikörper.
Die erfindungsgemäßen Sets können weiters Kombinationen umfassen, um sowohl ein Schwangerschafts-Antigen, als auch ein fötal beschränktes Antigen in einer Testprobe zu bestimmen; weiters Puffer für den Probentransport und die Probenlagerung; Phiolen, Folienpackungen oder andere Behälter von Reagenzien der vorliegenden Erfindung; andere fakultative Reagenzien, wie z. B. Enzymsubstratreagenzien in getrennten Phiolen oder anderen Packungen; mechanische oder optische Vorrichtungen, um das Vorhandensein und Ausmaß von Antikörper-Antigen-Bindung zu bestimmen; und Kombinationen daraus. Probennahmevorrichtungen wie z.B. Probennahme-Tupfer und Puffer für Transport und Lagerung können ebenfalls enthalten sein. Die einzelnen Teile des Sets können in jeder zweckmäßigen Form, wie z.B. in Phiolen, Folienpackungen oder anderen Behältern,verpackt sein. Beispielsweise können unlösliche Trägeranordnungen in einer Folienpackung mit anderen Reagenzien in Phiolen oder anderen Packungen kombiniert sein.
Eine Ausführungsform zum Schwangerschaftstest umfaßt den Nachweis eines fötal beschränkten Antigens, d.h. eines einzig auf den Fötus oder die Plazenta fokussierten Stoffs, in einer Testprobe, die in der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermundes entnommen wurde. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben gefunden, daß nachweisbare Mengen dieser Stoffe während der ersten 20 Schwangerschaftswochen in einer solchen Probe vorhanden sind. Da die fötal beschränkten Antigene nicht in signifikanten Mengen im Blut der Mutter vorhanden sind, stört das Vorhandensein von Blut der Mutter in der Probe den Test nicht.
Der Begriff "fötal beschränktes Antigen", wie hierin verwendet, ist so definiert, daß damit ein allein aus dem Fötus oder der Plazenta stammender Stoff gemeint ist, der entweder nicht oder nicht in signifikanten Mengen im Serum, Plasma oder Harn der Mutter vorhanden ist. jede Substanz, die dieser Definition entspricht, soll von der Bedeutung des Begriffs umfaßt werden, einschließlich sowohl antigener Stoffe und Proteine als auch anderer Substanzen, die in ihrer gereinigten Form nicht antigen sind, die aber einzigartige Epitope aufweisen, die selektiv an Antikörper binden können, die dafür spezifisch oder selektiv sind. Ein Beispiel für ein fötal beschränktes Antigen ist das fötale Fibronectin, das spezifisch an den monoklonalen FDC-6-Antikörper bindet, wie von H. Matsuura und S. Hakomori, "Proc.Natl.Acad.Sci.USA" 82:6517-6521 (1985) beschrieben.
Der Begriff "Klasse der fötal beschränkten Antigene", wie hierin verwendet, ist so definiert, daß damit eine Klasse oder Gruppe von Antigenen gemeint ist, der das fötal beschränkte Antigen angehört. Beispielsweise ist fötales Fibronectin ein fötal beschränktes Element der Gruppe oder Klasse menschlicher Fibronectine.
Der Begriff "Antikörper", wie hierin verwendet, ist so definiert, daß er Antikörper, die den Klassen IgG, IgM, IgA, IgD und lge angehören und vorzugsweise bindende Fragmente und Hybridderivate von Antikörpern umfaßt, einschließlich der Fab- und F(ab')&sub2;-Fragmente von Antikörpern. Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Im allgemeinen werden zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Assays monoklonale Antikörper bevorzugt.
Wegen ihrer Spezifität sind immunologische Verfahren am zweckmäßigsten für die Durchführung der erfindungsgemäßen Assays, und der Begriff "Immunoassay", wie hierin verwendet, ist so definiert, daß damit jedes Verfahren gemeint ist, bei dem eine bevorzugte Bindung eines Antigens mit einem zweiten Stoff (d.h. einem Bindungspartner, üblicherweise einem Antikörper oder Antikörperfragment mit einer Antigen-Bindungsstelle) eingesetzt wird, der bevorzugt an ein Epitop des Antigens bindet. Bevorzugte Bindung, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Bindung zwischen Bindungspartnern, die selektiv und im allgemeinen spezifisch ist und die im allgemeinen weniger als 10%, vorzugsweise weniger als 5% kreuzreaktive nichtspezifische Bindung zeigt. Wenn beispielsweise der Analyt fötales Fibronectin ist, ist der Antikörper gegen fötales Fibronectin zu weniger als 10% und vorzugsweise weniger als 5% kreuzreaktiv mit Fibronectinen von Erwachsenen.
Im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen alle Immunosassays, die diesen Schritt umfassen, einschließlich aber nicht beschränkt auf beispielsweise Sandwich-, Konkurrenz-, Eintauchstab-, Agglomerations-, Fällungs-, Transistorbrückensonden-, Teilchensorting-, Lichtstörungs-, Lichtstreuungs- und Ultraschallsonden-Immunoassays. Bei geeigneten Immunoassays können als Markierungen beispielsweise Radioisotopen, Enzyme oder fluorogene, chromogene oder chemolumineszierende Substanzen verwendet werden.
Eine Testprobe, die einem Assay zu unterziehen ist, wird in der Nähe des Cervikalkanals oder des Muttermundes entnommen, und die Probe wird einem Assay unterzogen, um das Vorhandensein oder die Menge an fötal beschränktem Antigen in der Probe zu bestimmen. Die Probe umfaßt im allgemeinen Fluid und Feststoffteilchen und kann Scheiden- oder Cervicalschleim, andere Vaginal- oder Cervikalsekrete, Zellen oder Zellbruchstücke, Fruchtwasser oder andere Stoffe vom Fötus oder der Mutter umfassen. Die Probe wird mit einem Tupfer mit einer Spitze aus Dacron oder einer anderigen faserigen Spitze, einem Aspirator, einer Absaugvorrichtung, einer Spülvorrichtung oder dergleichen entnommen und wird zur Lagerung und zum Transport zum Testlabor einem geeigneten Behälter übertragen.
Es ist wichtig, diese Testprobe in einer Flüssigkeit zu dispergieren, die die empfindlichen Proteinanalyten konserviert, die in der als Probe genommenen Zusammensetzung instabil sind. Das Lager- und Transfermedium sollte das Absinken des Proteinanalytspiegels während der Lagerung und des Transports verhindern. Eine geeignete Konservierungslösung für Lagerung und Transfer besteht aus 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4; 0,15 M NaCl, 0,02% NaN&sub3;, 1% BSA, 500 Kallikrein-Einheiten/ml Aprotinin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 5 mM EDTA und wird in der am 15. September 1988 eingereichten US-A-244,969 beschrieben.
Der Nachweis des fötal beschränkten Antigens kann erbracht werden, indem das fötal beschränkte Antigen in einer Testprobe an einen Antikörper gebunden wird, der vorzugsweise an ein Epitop des fötal beschränkten Antigens bindet, und das Vorhandensein oder Fehlen dieser Bindung ermittelt wird.
Bei einem Sandwich-Assay für fötal beschränktes Antigen, wird die Testprobe mit einem unlöslichen Träger in Kontakt gebracht, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen fixiert ist, um die Bindung von fötal beschränktem Antigen in der Probe an den unlöslichen Träger zu bewirken. Der unlösliche Träger wird dann mit einem sekundären Antikörper, einem markierten oder unmarkierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, der an das fötal beschränkte Antigen bindet, das am unlöslichen Träger fixiert ist, in Kontakt gebracht, um das eingefangene fötal beschränkte Antigen zu markieren und zu messen.
Der spezifische Einfang-Antikörper für Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder der spezifische Sandwiching-Antikörper für Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen kann durch einen Antikörper ersetzt werden, der an eine Klasse von Substanzen bindet, die das fötal beschränkte Analyt-Antigen umfaßt. Beispielsweise kann Antikörper gegen fötales Fibronectin am unlöslichen Träger fixiert werden, und markierter oder unmarkierter Anti-(Fibronectin)-Antikörper kann verwendet werden, um das eingefangene Antigen zu markieren. Alternativ dazu kann Anti-(Fibronectin)-Antikörper am unlöslichen Träger fixiert werden, und markierter oder unmarkierter Antikörper gegen fötales Fibronectin wird verwendet, um das eingefangene Antigen zu markieren. Der sekundäre Antikörper kann eine physikalisch nachweisbare Markierung aufweisen, die direkt auf dem unlöslichen Träger gemessen werden kann. Alternativ dazu kann der sekundäre Antikörper unmarkiert sein, und der sekundäre Antikörper kann bestimmt werden, indem der unlösliche Träger mit einem markierten Antikörper oder Antikörperfragment in Kontakt gebracht wird, der/das selektiv an den sekundären Antikörper bindet (d.h. einem tertiären Antikörper), ungebundener markierter tertiärer Antikörper vom Träger entfernt wird und das Vorhandensein der Markierung auf dem unlöslichen Träger bestimmt wird. Sandwich-Immunoassays, bei denen ein Membransubstrat eingesetzt wird, sind zur Verwendung geeignet.
Die Probe kann auch mit einem Konkurrenz-Immunoassayverfahren getestet werden. Die Testprobe wird mit markiertem Reagens-Antikörper oder Antigen vermischt und mit einem unlöslichen Träger inkubiert, an dem ein Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder fötal beschränktes Reagens-Antigen fixiert ist, wobei Konkurrenz zwischen den Reagenzien um Bindung mit dem Probenanalyt auftritt. Fachleuten auf dem Gebiet der Immunoassays sind Verfahren und Vorgangsweisen zur Durchführung solcher Immunoassays wohlbekannt. Die Markierung, die zum Schluß am unlöslichen Träger fixiert ist oder in der Lösung verbleibt, wird bestimmt.
Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen kann durch herkömmliche Antiserum- oder monoklonale Techniken aus fötal beschränkten Antigenen erhalten werden, vorzugsweise aus hochgereinigten fötal beschränkten Antigenen. Die vorliegende Erfindung wird zum Zweck der Klarheit, nicht jedoch als Einschränkung, hierin bezogen auf den Nachweis von fötalem Fibronectin als fötal beschränktes Antigen beschrieben: der Nachweis eines jeden fötal beschränkten Antigens soll im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen. Fötales Fibronectin wird aus Fruchtwasser gereinigt, wie von Engvall und Ruoslahti, "Int.J.Cancer" 20:1-5 (1977) beschrieben. Antikörper gegen fötales Fibronectin kann nach herkömmlichen Antiserumtechniken oder durch Monoklonal-Antikörper-Techniken aus fötalem Fibronectin abgeleitet werden.
Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene können nach herkömmlichen Antiserum- oder Monoklonal-Techniken direkt aus fötal beschränkten Antigenen, vorzugsweise aus hochgereinigten Antigenen, abgeleitet werden.
Die hauptsächlichen, bei den erfindungsgemäßen Assays nützlichen Antikörper sind IgG- und IgM-Antikörper, obwohl auch die IgD-, IgE- und IgA-Antikörper verwendet werden können, wenn sie in ausreichender Menge verfügbar sind. Die Antikörper werden dann unter Einsatz herkömmlicher Affinitäts-Chromatographie-Techniken, wie z.B. den von Mishell und Shilgi in "SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY". San Francisco: Freeman (1980), Goding, J. "MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE", New York: Academic Press, S. 111-114 (1983) und Parikh et al., C&EN (26. August 1985) beschriebenen Affinitätsreinigung unterzogen.
Bevorzugt bindende Antikörperfragmente, die zur Verwendung beim Set und Verfahren gemäß vorliegender Erfindung geeignet sind, können nach herkömmlichen Enzym- oder chemischen Fragmentierungsverfahren aus den jeweiligen monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern hergestellt werden. Geeignete Verfahren werden beispielsweise von Tijssen, P."LABORATORY TECHNlQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: PRACTICE AND THEORIES OF ENZYME IMMUNOASSAYS". New York: Elsevier (1985) beschrieben.
Polyklonaler Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen kann durch Immunisieren eines Tieres, wie z.B. Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte oder Ziege mit konzentriertem fötal beschränktem Antigen, wie z.B. fötalem Fibronectin, Entnehmen von Serum vom immunisierten Tier und Abtrennen der Immunoglobuline vom Serum, beispielsweise durch Ammoniumsulfat-Ausfällung, erhalten werden.
Geeignete Absorbenzien zur Verwendung bei der Affinitätschromatographie sind vernetzte Agarose oder vernetzte Polyacrylamide, an die Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen kovalent gebunden wird. Zum Entfernen von Antikörpern, die mit Erwachsenen-Fibronectinen kreuzreaktiv sind, wird das Antikörper-Serum durch Säulen geschickt an die Erwachsenen-Fibronectine gekoppelt sind. Eine Teilmenge des Eluats, das den verbleibenden Antikörper enthält, kann dann durch eine Säule mit fötalem Fibronectin geschickt und eluiert werden, um den affinitätsgereinigten Antikörper zu erhalten.
Bei diesen Verfahren kann Antikörperlösung auf die Säule in einer phosphatgepufferten Salzlösung aufgebracht werden, und die Antikörper können mit einer 2,5 M NaSCN- Lösung, pH 8,0, eluiert werden. Die Antikörper-Konzentration kann, falls gewünscht, durch Dialyse mit negativem Druck oder Ultrafiltration erreicht werden. Die Antikörperlösung ist bei einer Temperatur von 4ºC oder darunter stabil. Die Säulen- Trennverfahren werden fortgesetzt, bis die gewünschte Trennung und Reinheit erreicht ist.
Zur Herstellung von fötalem Fibronectin können die von H. Matsuura und S. Hakomori, "Proc.Natl.Acad.Sci. USA" 82:6517-6521 (1985) beschriebenen Verfahren nachvollzogen werden, wobei das Tumor-fibronectin durch fötales Fibronectin ersetzt wird. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Varianten von Antikörpern gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene sind im allgemeinen wohlbekannt und entweder im Handel oder bei öffentlich zugänglichen Hybridom-Banken erhältlich. Beispielsweise können monoklonale Anti-(Fibronectin)-Antikörper von Klonproben von ATCC HB 91 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) erhalten werden. Andere derartige Antikörper werden in der J-A-60091264 (DIALOG-Datenbank-Akte 351, WPI- Eintragungsnummer 85-161617/27) und der US-PS-4,325,867 beschrieben.
Sandwich-Immunoassays: Bei einer Sandwich-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe wird ein unlöslicher Träger, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen fixiert ist, mit einer mit einer wässerigen Pufferlösung wie z.B. Phosphatpufferlösung (PBS), pH 6 bis 8 und vorzugsweise 7,2 bis 7,6, verdünnten Testprobe über eine ausreichende Zeitspanne in Kontakt gebracht, um die Bindung von fötal beschränktem Antigen in der Testprobe an den Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen auf dem unlöslichen Träger zu ermöglichen und die Probe dann vom Träger zu entfernen. Die Inkubationszeit sollte ausreichen, um die Ausbildung beträchtlicher Bindung zu ermöglichen, wobei die Zeit temperaturabhängig ist. Geeignete Inkubationszeiten sind von 30 bis 240 Minuten bei Temperaturen innerhalb des Bereichs von 16 bis 40ºC, wobei die bevorzugte Kontaktzeit zumindest 60 Minuten bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 26ºC beträgt.
Die restliche Proben lösung wird dann unter Verwendung einer Spüllösung vom Träger entfernt. Es kann jede herkömmliche Spüllösung verwendet werden. Eine geeignete Spüllösung wird in der US-PS-4,528,267 beschrieben. Es handelt sich dabei um eine wässerige Phosphatpufferlösung mit einer Phosphatmolarität von 0,0001 bis 0,05 und einem pH von 6 bis 8, die von 0,001 bis 0,1 Gew.-% nichtionisches Tensid enthält. Geeignete nichtionische Tenside sind Polyoxyethylenether (BRIJ , wie z.B. Lauryl-, Cetyl-, Oleyl-, Stearyl- und Tridecylpolyoxyethylenether); Polyoxyethylensorbitane (TWEEN , wie z.B. Polyoxyethlyensorbitan-Monolaurat, -Monopalmitat, -Monostearat, -Monoleat und -Trioleate); und andere Polyoxyethylenether (beispielsweise TRLTON ). Ein bevorzugtes nicht-ionisches Tensid ist Octylphenoxypolyethoxyethanol mit 40 Ethylenoxideinheiten (TRITON X405 , Rohm and Haas Company).
Der unlösliche Träger wird dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der an den eingefangenen fötal eingeschränkten Antigen auf dem unlöslichen Träger, d.h. den Sandwiching-Antikörper, bindet. Der Sandwiching-Antikörper kann jeder Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder jeder Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene sein. Der Sandwiching-Antikörper kann markiert oder unmarkiert sein. Für den Fall, daß ein unmarkierter Sandwiching-Antikörper verwendet wird, kann auf herkömmliche Art ein tertiärer Antikörper verwendet werden, der an den Sandwiching-Antikörper bindet und eine physikalisch nachweisbare Markierung trägt, um den Sandwiching-Antikörper zu bestimmen.
Eine Vielzahl von Markierungen wird hierin beschrieben. Zum Zweck der Klarheit und nicht als Einschränkung werden die folgenden Schritte des Verfahrens bezogen auf Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen beschrieben, die mit einem Enzym markiert worden sind, vorzugsweise mit einem chromogenen oder fluorogenen Enzym. Der Begriff "chromogenes Enzym" ist hierin so definiert, daß damit ein Enzym gemeint ist, das mit einem geeigneten Substrat ein Chromophorprodukt erzeugt. Der Begriff "fluorogenes Enzym" ist hierin so definiert, daß damit ein Enzym gemeint ist, das mit einem geeigneten Substrat ein Fluorophorprodukt erzeugt.
Der Sandwiching-Antikörper wird in einer wässerigen Lösung auf den unlöslichen Träger aufgebracht. Die Lösung enthält vorzugsweise geeignete Salze und Puffer, um die Reaktanden zu konservieren und die Bindungsreaktion zu erleichtern. Beispielsweise kann die Lösung Rinderserumalbumin (BSA), Phosphatpufferlösung (PBS) und ein mildes Tensid wie z.B. Polyoxyethylensorbitanester enthalten, der bei der oben beschriebenen Spüllösung verwendet wird. Die Inkubation wird über eine ausreichende Zeitspanne fortgesetzt, um die Bindung des Sandwiching-Antikörpers an freiliegende fötal beschränktes Antigen-Epitope, so es welche gibt, zu ermöglichen, die am unlöslichen Träger fixiert sind. Die bevorzugten Inkubationszeiten und -temperaturen sind jene, die für die Bindung von insolubilisiertem Reagens-Anti-(fötal beschränktes Antigen)- Antikörper an das fötal beschränkte Antigen der Testprobe dargelegt sind.
Die Sandwiching-Antikörper-Lösung wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche ungebundene Material zu entfernen.
Wenn der Sandwiching-Antikörper unmarkiert ist, wird ein Enzym-markierter Antikörper oder ein anderes Bindungsmittel, das selektiv an den Sandwiching-Antikörper bindet, in einer wässerigen Lösung auf den unlöslichen Träger aufgetragen. Die Lösung enthält vorzugsweise geeignete Salze und Puffer, um die Reaktanden zu konservieren und die Bindungsreaktion zu erleichtern, wie z.B. oben beschrieben. Die Inkubation wird über eine ausreichende Zeitspanne fortgesetzt um es markiertem Anti-(Sandwiching- Antikörper)-Antikörper zu ermöglichen, an frei liegende Sandwiching-Antikörper- Epitope, so vorhanden, zu binden, die am unlöslichen Träger fixiert sind. Die bevorzugten Inkubationszeiten und -temperaturen sind jene, die für die Bindung von insolubilisiertem Reagens- Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen an das fötal beschränkte Testproben-Antigen dargelegt sind.
Die markierte Antikörper-Lösung wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches verbleibende ungebundene Material zu entfernen.
In einem nächsten Schritt wird der unlösliche Träger mit einer wässerigen Lösung aus einem Substrat in Kontakt gebracht, das in Gegenwart des Enzyms umgesetzt wird, sodaß es eine fluoreszierende oder Chromogen-Verbindung in die Lösung freisetzt. Geeignete Substrate und die Enzyme, mit denen sie umgewandelt werden können, werden beispielsweise in den US-P54,190,496 und 4,528,267 beschrieben. Der Träger wird mit einer wässerigen Lösung des Substrats in Kontakt gebracht, die von 10&supmin;² bis 10&supmin;¹&sup0; Molkonzentrationen des Substrats enthält. Molkonzentrationen des Substrats von 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;&sup5; werden vorgezogen. Zu bevorzugten zusätzlichen Reagenzien und Puffern in der Substratlösung gehören beispielsweise 2-Amino-2-methyl-1-propanol-Puffer und Magnesiumchlorid.
Die Substratlösung wird mit dem unlöslichen Träger über eine ausreichende Zeitspanne inkubiert, damit die Reaktion, die das Fluorophor oder Chromophor ergibt, auftreten kann. Bei Temperaturen von 18 bis 40ºC können Inkubationszeiten von 5 bis 240 Minuten eingesetzt werden. Vorzugsweise liegt die Temperatur im Bereich von 20 bis 26ºC, und die Inkubationszeit beträgt von 30 bis 90 Minuten.
Die fluoreszierende oder Chromophor-Menge in der Lösung wird dann gemessen. Die Ausrüstung und Verfahren zum Bestimmen der Menge an Fluoreszenz- oder Chromophormenge in den Substratlösungen sind die herkömmlich nach dem Stand der Technik verwendeten. Die Menge an Fluoreszenz oder Chromogen in Lösung ist eine Funktion der Enzymkonzentration auf dem unlöslichen Träger, die wiederum eine Funktion der Menge an fötal beschränktem Antigen in der Testprobe ist. Die Konzentration des fötal beschränkten Antigens kann ermittelt werden, indem man die Fluoreszenz- oder Chromophormenge der Lösung mit jeweiligen Fluoreszenz- oder Chromophormengen vergleicht, die man mit Kontrollösungen erhält, die bekannte Konzentrationen an fötal beschränktem Antigen enthalten.
Das Sandwich-Verfahren kann so modifiziert werden, daß ein Bindungsantikörper für die Klasse fötal beschränkter Antigene entweder als Einfang- oder als Sandwiching- Antikörper verwendet wird. Bei diesen Ausführungsformen wird ein Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene, wie z.B. ein Anti-(Fibronectin)-Antikörper, am unlöslichen Träger fixiert, und ein markierter oder unmarkierter Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen wird als Sandwiching-Antikörper aufgetragen. Alternativ dazu kann der Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen auf dem unlöslichen Träger fixiert werden, und ein markierter oder unmarkierter Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene wird verwendet, um das eingefangene Antigen zu sandwichen.
Membranimmunoassays: Bei einer Membran- Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe wird ein unlöslicher Träger, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen fixiert ist, mit einer mit einer wässerigen Pufferlösung, wie z.B. Phosphatpufferlösung (PBS), pH 6 bis 8, und vorzugsweise von 7,2 bis 7,6, verdünnten Testprobe über eine ausreichende Zeitspanne in Kontakt gebracht, um die Bindung von fötal beschränktem Antigen in der Probe an den Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen auf dem unlöslichen Träger zu ermöglichen. Die zur Bindung erforderliche Zeit ist in einem Durchflußsystem sehr gering. Geeignete Inkubationszeiten können 1 Sekunde bis zu 20 Minuten bei Temperaturen im Bereich von 16 bis 40ºC sein, wobei die bevorzugte Kontaktzeit weniger als 1 Minute und optimalerweise von 10 Sekunden bis 2 Minuten beträgt.
Der unlösliche Träger wird dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der an das eingefangene fötal beschränkte Antigen auf dem unlöslichen Träger, d.h. den Sandwiching-Antikörper, bindet. Der Sandwiching-Antikörper kann markiert oder unmarkiert sein. Für den Fall, daß ein unmarkierter Sandwiching-Antikörper verwendet wird, kann ein tertiärer Antikörper, der an den Sandwiching-Antikörper bindet und eine physikalisch nachweisbare Markierung trägt, auf herkömmliche Art verwendet werden, um den Sandwiching-Antikörper zu bestimmen.
Eine Vielzahl von Markierungen wird hierin beschrieben. Zum Zweck der Klarheit, nicht jedoch zur Einschränkung, werden die folgenden Schritte des Verfahrens für Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen beschrieben, die mit einem Enzym, vorzugsweise einem fluorogenen oder chromogenen Enzym, markiert worden sind.
Der Sandwiching-Antikörper wird auf den unlöslichen Träger in einer wässerigen Lösung aufgetragen. Die Lösung enthält vorzugsweise geeignete Salze und Puffer, um die Reaktanden zu konservieren und die Bindungsreaktion zu erleichtern. Beispielsweise kann die Lösung Rinderserumalbumin (BSA), Phosphatpufferlösung (PBS) und ein mildes Tensid wie z.B. Polyoxyethylensorbitanester enthalten, das in der oben beschriebenen Spüllösung verwendet wird. Die Inkubation wird über eine ausreichende Zeitspanne fortgesetzt, um das Binden des Sandwiching-Antikörpers an freiliegende Epitope von fötal beschränktem Antigen, so vorhanden, zu ermöglichen, die am unlöslichen Träger fixiert sind. Die bevorzugten Inkubationszeiten und -temperaturen sind jene, die für die Bindung von insolubilisiertem Reagens-Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen an das fötal beschränkte Testproben-Antigen dargelegt sind.
Die Sandwiching-Antikörper-Lösung kann wahlweise vom unlöslichen Träger entfernt werden, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche ungebundene markierte Material zu entfernen.
Wenn der Sandwiching-Antikörper unmarkiert ist, wird ein enzymmarkierter Antikörper oder ein anderes Bindungsagens, das selektiv an den Sandwiching-Antikörper bindet, in einer wässerigen Lösung auf den unlöslichen Träger aufgetragen. Die Lösung enthält vorzugsweise geeignete Salze und Puffer, um die Reaktanden zu konservieren und die Bindungsreaktion zu erleichtern. Beispielsweise kann die Lösung Rinderserumalbumin (BSA), Phosphatpufferlösung (PBS) und ein mildes Tensid, wie z.B. Polyoxyethylensorbitanester enthalten, wie in der oben beschriebenen Spüllösung verwendet. Die Inkubation wird über eine ausreichende Zeitspanne fortgesetzt, um die Bindung von markiertem Anti-(Sandwiching-Antikörper)-Antikörper an Sandwiching- Antikörper-Epitope, falls vorhanden, die am unlöslichen Träger fixiert sind, zu ermöglichen. Die bevorzugten Inkubationszeiten und -temperaturen sind jene, die für die Bindung von insolubilisiertem Reagens Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen an das fötal beschränkte Testproben-Antigen dargelegt sind.
Die markierte Antikörper-Lösung wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche, ungebundene markierte Material zu entfernen.
In einem nächsten Schritt des Membran-Sandwich-Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung wird der unlösliche Träger mit einer wässerigen Lösung eines Substrats in Kontakt gebracht, das in Gegenwart eines Enzyms umgesetzt wird, um Fluorogen- oder Chromogenverbindung in die Lösung freizusetzen. Geeignete Substrate und die Enzyme, mit denen sie umgewandelt werden können, sowie zusätzliche Komponenten und Puffer sind oben beschrieben worden.
Die Substratlösung wird mit dem unlöslichen Träger über eine ausreichende Zeitspanne inkubiert, damit die Reaktion, die zum Auftreten des Fluorophor oder Chromophor führt, eintreten kann. Bei Temperaturen von 18 bis 40ºC können Inkubationszeiten von 1 bis 20 Minuten eingesetzt werden. Vorzugsweise liegt die Temperatur im Bereich von 20 bis 26ºC, und die Inkubationszeit beträgt von 2 bis 5 Minuten. Die Fluorogen- oder Chromogenmenge auf der Membran kann unter Verwendung eines Reflektometers oder Densitometers gemessen werden.
Konkurrenz-Immunoassays: Konkurrenz-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen markiertes fötal beschränktes Reagens-Antigen verwendet wird, umfassen das In-Kontakt-Bringen eines Gemisches aus der Testprobe und dem markierten fötal beschränkten Reagens-Antigen mit einem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, der an einem unlöslichen Träger fixiert ist, und das Bestimmen der Menge an Markierung, die entweder an den unlöslichen Träger bindet oder in der Lösungsphase verbleibt.
Die Konkurrenz-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen markierte Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen verwendet werden, können mehr als eine Form haben. Eine Ausführungsform, bei der an den unlöslichen Träger gebundener Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen verwendet wird, umfaßt das In-Kontakt- Bringen eines Gemisches aus der Testprobe und markierten Antikörpern gegen fötal beschränktes Antigen mit einem an einem unlöslichen Träger fixierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, und das Bestimmen der Markierungsmenge, die entweder an den unlöslichen Träger bindet oder in der Lösungsphase verbleibt. Eine weitere Ausführungsform, bei der an den unlöslichen Träger gebundenes fötal beschränktes Reagens-Antigen verwendet wird, umfaßt das In-Kontakt-Bringen eines Gemisches aus der Testprobe und markierten Antikörpern gegen fötal beschränktes Antigen mit einem an einem unlöslichen Träger fixierten Antigen und das Bestimmen der Markierungsmenge, die entweder an den unlöslichen Träger bindet, oder in der Lösungsphase verbleibt.
Bei jedem dieser Verfahren wird die Testprobe mit Pufferlösung verdünnt, inkubiert und die Markierung wie oben unter Bezugnahme auf die Sandwich-Immunoassay- Ausführungsformen beschrieben bestimmt. Die Konzentration des Beschränkungsreagens ist so gewählt, daß kompetitive Bindung zwischen den Reagenzien ermöglicht wird, wobei die Menge an Markierung, die auf dem unlöslichen Träger oder in der Lösung verbleibt, eine Variable ist, die von der Menge des Analyten in der Testprobe abhängt. Diese Verfahren sind im allgemeinen wohlbekannt, und Fachleute auf dem Gebiet der Immunoassays wissen, wie sie zu variieren sind, um ein Verfahren zu optimieren.
Die Bindung des Antikörpers gegen fötal beschränktes Antigen an das fötal beschränkte Antigens in der Testprobe kann auch durch Agglomeration von Teilchen, an denen Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen durch fötal beschränktes Antigen in der Probe fixiert wird, Ausfällung von Antikörpern aufgrund von Antikörper-Antigen- Reaktionen oder Beobachtungen von bei der Antikörper-Antigen-Bindung auftretenden physikalischen oder elektrischen Veränderungen bestimmt werden, wobei Halbleiterbrücken-Sonden, Lichtstörungsmuster wie z.B. in der US-PS-4,647,544 beschrieben und dergleichen verwendet werden.
Das Feststellen des Vorhandenseins von fötal beschränktem Antigen in der Testprobe weist auf Schwangerschaft hin.
Schwangerschafts-Testsets auf fötal beschränktes Antigen zum Ermitteln von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe, die in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen, umfassen im allgemeinen (a) einen Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, einen Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene oder fötal beschränktes Reagens-Antigen, das an einem unlöslichen Träger fixiert ist; (b) eine Kombination aus an einem unlöslichen Träger fixierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen und entweder einem markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, einen markierten Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene oder ein markiertes fötal beschränktes Reagens-Antigen; (c) eine Kombination aus Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene, der an einem unlöslichen Träger fixiert ist, gemeinsam mit einem markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen; und/oder (d) ein fötal beschränktes Reagens-Antigen, das an einem unlöslichen Träger fixiert ist, und einen markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen.
Die erfindungsgemäßen Sets können weiters Kombinationen umfassen, um sowohl ein Schwangerschafts-Antigen, als auch ein fötal beschränktes Antigen in einer Testprobe zu bestimmen; weiters Puffer für den Probentransport und die Probenlagerung; Phiolen, Folienpackungen oder andere Behälter von Reagenzien der vorliegenden Erfindung; andere fakultative Reagenzien, wie z.B. Enzymsubstratreagenzien in getrennten Phiolen oder anderen Packungen; mechanische oder optische Vorrichtungen, um das Vorhandensein und Ausmaß von Antikörper-Antigen-Bindung zu bestimmen; und Kombinationen daraus. Probennahmevorrichtungen wie z.B. Probennahme-Tupfer und Puffer für Transport und Lagerung können ebenfalls enthalten sein. Die einzelnen Teile des Sets können in jeder zweckmäßigen Form, wie z.B. in Phiolen, Folienpackungen oder anderen Behältern,verpackt sein. Beispielsweise können unlösliche Trägeranordnungen in einer Folienpackung mit anderen Reagenzien in Phiolen oder anderen Packungen kombiniert sein.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren, das Extrauterinschwangerschaft nachweist, umfaßt das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens eines fötal beschränkten Antigens, d.h. eines einzig auf den Fötus oder die Plazenta fokussierten Stoffs, in einer Testprobe, die in der Nähe des Cervikalkanals und/oder Muttermundes entnommen wurde. Nachweisbare Mengen dieser Stoffe sind normalerweise während der ersten 20 Wochen bei normaler Schwangerschaft in einer solchen Probe vorhanden. Das Fehlen von fötal beschränktem Antigen in einer solchen Probe von einer schwangeren Frau während der ersten 20 Schwangerschaftswochen weist auf das Vorliegen einer Extrauterinschwangerhaft hin. Da die fötal beschränkten Antigene nicht in signifikanten Mengen im Blut der Mutter vorhanden sind, stört das Vorhandensein von Blut der Mutter in der Probe den Test nicht.
Die Begriffe "fötal beschränktes Antigen", "Klasse der fötal beschränkten Antigene", "Antikörper", "Immunoassay" und "bevorzugte Bindung" sind jeweils wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest mit fötal beschränktem Antigen beschrieben definiert.
Eine Testprobe, die einem Assay zu unterziehen ist, wird in der Nähe des Cervikalkanals und/oder des Muttermundes entnommen, und die Probe wird einem Assay unterzogen, um das Vorhandensein oder die Menge an fötal beschränktem Antigen in der Probe zu ermitteln. Die Probe umfaßt im allgemeinen Fluid und Feststoffteilchen und kann Scheiden- oder Cervicalschleim, andere Vaginal- oder Cervikalsekrete, Zellen oder Zellbruchstücke, Fruchtwasser oder andere Stoffe vom Fötus oder der Mutter enthalten. Die Probe wird mit einem Tupfer mit einer Spitze aus Dacron oder einem anderen Fasermaterial, einem Aspirator, einer Absaugvorrichtung, einer Spülvorrichtung oder dergleichen entnommen und wird zur Lagerung und zum Transport zum Testlabor einem geeigneten Behälter übertragen.
Es ist wichtig, daß die Testprobe in einer Flüssigkeit dispergiert wird, die die empfindlichen Proteinanalyten konserviert, die in der als Probe genommenen Zusammensetzung instabil sind. Ein geeignetes Lagerungs- und Transfermedium ist das oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest mit fötal beschränktem Antigen beschriebene.
Der Nachweis des fötal beschränkten Antigens kann erbracht werden, indem das fötal beschränkte Antigen in einer Testprobe an einen Antikörper gebunden wird, der vorzugsweise an ein Epitop des fötal beschränkten Antigens bindet, und das Vorhandensein oder Fehlen dieser Bindung ermittelt wird.
Bei einem Sandwich-Assay auf fötal beschränktes Antigen wird die Testprobe mit einem unlöslichen Träger in Kontakt gebracht, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen fixiert ist, um die Bindung von fötal beschränktem Antigen in der Probe an den unlöslichen Träger zu bewirken. Der unlösliche Träger wird dann mit einem sekundären Antikörper, einem unmarkierten oder markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen in Kontakt gebracht, der an das fötal beschränkte Antigen bindet, das am unlöslichen Träger fixiert ist, um das eingefangene fötal beschränkte Antigen zu markieren und zu messen.
Der Festhalte-Antikörper für Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder der Sandwiching-Antikörper für Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen kann durch einen Antikörper ersetzt werden, der an eine Klasse von Substanzen bindet, die das fötal beschränkte Analyt-Antigen umfaßt. Beispielsweise kann Antikörper gegen fötales Fibronectin am unlöslichen Träger fixiert werden, und markierter oder unmarkierter Anti-(Fibronectin)-Antikörper kann verwendet werden, um das eingefangene Antigen zu markieren. Alternativ dazu kann Anti-(Fibronectin)-Antikörper am unlöslichen Träger fixiert werden, und markierter oder unmarkierter Antikörper gegen fötales Fibronectin wird verwendet, um das eingefangene Antigen zu markieren. Der sekundäre Antikörper kann eine physikalisch nachweisbare Markierung aufweisen, die direkt auf dem unlöslichen Träger gemessen werden kann. Alternativ dazu kann der sekundäre Antikörper unmarkiert sein, und der sekundäre Antikörper kann bestimmt werden, indem der unlösliche Träger mit einem markierten Antikörper oder Antikörperfragment in Kontakt gebracht wird, der/das selektiv an den sekundären Antikörper bindet (d.h. einem tertiären Antikörper), ungebundener markierter tertiärer Antikörper vom Träger entfernt wird und das Vorhandensein der Markierung auf dem unlöslichen Träger bestimmt wird. Sandwich-Immunoassays, bei denen ein Membransubstrat eingesetzt wird, sind zur Verwendung geeignet.
Die Probe kann auch mit einem Konkurrenz-Immunoassayverfahren geprüft werden. Die Testprobe wird mit markiertem Reagens-Antikörper oder Antigen vermischt und mit einem unlöslichen Träger inkubiert, an dem ein Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder fötal beschränktes Reagens-Antigen fixiert ist, wobei Konkurrenz zwischen den Reagenzien um Bindung an den Probenanalyt auftritt. Fachleuten auf dem Gebiet der Immunoassays sind Verfahren und Vorgangsweisen zur Durchführung solcher Immunoassays wohlbekannt. Die Markierung, die zum Schluß am unlöslichen Träger fixiert ist oder in der Lösung verbleibt, wird bestimmt.
Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen kann durch herkömmliche Antiserum- oder monoklonale Techniken aus fötal beschränkten Antigenen erhalten werden, vorzugsweise aus hochgereinigten fötal beschränkten Antigenen. Die vorliegende Erfindung wird zum Zweck der Klarheit, nicht jedoch als Einschränkung, hierin bezogen auf den Nachweis von fötalem Fibronectin als fötal beschränktes Antigen beschrieben: der Nachweis eines jeden fötal beschränkten Antigens soll im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen. Fötales Fibronectin wird aus Fruchtwasser gereinigt, wie von Engvall und Ruoslahti, "Int.J.Cancer" 20:1-5 (1977) beschrieben. Antikörper gegen fötales Fibronectin kann nach herkömmlichen Antiserumtechniken oder durch Monoklonal-Antikörper-Techniken aus fötalem Fibronectin abgeleitet werden.
Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene können nach herkömmlichen Antiserum- oder Monoklonal-Techniken direkt aus fötal beschränkten Antigenen, vorzugsweise aus hochgereinigten Antigenen, abgeleitet werden. Antikörper und Antikörper-Fragmente, die bei den Assays für Extrauterinschwangerschaft gemäß vorliegender Erfindung nützlich sind, sowie deren Herstellung sind oben bezogen auf den Schwangerschaftstest mit fötal beschränktem Antigen beschrieben worden.
Die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern gegen fötal beschränktes Antigen ist oben für den Schwangerschaftstest mit fötal beschränktem Antigen beschrieben worden, und solche Herstellungsverfahren sind geeignet, um Antikörper zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Extrauterinschwangerschaftstest herzustellen.
Immunisierungsvorschriften, Affinitätschromatographie-Verfahren, Eluierung, Reinigung und Konzentration von Antikörpern gegen fötal beschränktes Antigen, wie z.B. Antikörper gegen fötales Fibronectin, und Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene, wie z.B. Anti-(Fibronectin)-Antikörper, wie oben unter Bezug auf den Schwangerschaftstest mit fötal beschränktem Antigen beschrieben, können verwendet werden, um Antikörper zur Verwendung beim Extrauterinschwangerschaftstest zu erzeugen.
Sandwich-Immunoassays: Bei einer Sandwich-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe wird ein unlöslicher Träger, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen fixiert ist, mit einer Testprobe in Kontakt gebracht, die mit einer wässerigen Pufferlösung verdünnt ist, wie oben bezogen auf den Schwangerschaftstest mit fötal beschränktem Antigen beschrieben. Probenverdünner, Reagenskontakt und Inkubations- und Spülbedingungen, -lösungen, -zeit und -temperatur sind wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben. Restliche Probelösung wird unter Verwendung einer Spüllösung vom Träger entfernt, und mit einem Sandwiching-Antikörper unter den oben in bezug auf den Schwangerschaftstest mit fötal beschränktem Antigen beschriebenen Bedingungen in Kontakt gebracht. Die Sandwiching-Antikörper-Lösung wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche ungebundene Material zu entfernen, wie beschrieben.
Wenn der Sandwiching-Antikörper unmarkiert ist, wird ein Antikörper oder ein anderes Bindungsmittel, das selektiv an den Sandwiching-Antikörper bindet, auf den unlöslichen Träger in einer wässerigen Lösung aufgetragen, wie oben beschrieben. Die Lösung aus markiertem Antikörper wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche ungebundene markierte Material zu entfernen. Die Markierung wird dann bestimmt. Wenn die Markierung ein Enzym ist, wie oben als Beispiel angeführt, wird der Träger mit einer geeigneten wässerigen Substratlösung in Kontakt gebracht und inkubiert, um ein Fluorophor oder Chromophor zu erzeugen. Die Fluoreszenz- oder Chromophormenge in der Lösung wird dann gemessen, wie oben beschrieben.
Das Sandwichverfahren kann so modifiziert werden, daß ein Antikörper, der die Klasse der fötal beschränkten Antigene bindet, entweder als Festhalte oder Sandwiching- Antikörper verwendet wird, wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest mit fötal beschränktem Antigen beschrieben.
Membran Immunoassays: Bei einer Membran-Ausführungsform zur Feststellung von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe wird ein unlöslicher Träger, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen fixiert ist, mit einer verdünnten Testprobe in Kontakt gebracht und inkubiert, wobei die Bedingungen die oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen dargelegten sind.
Der unlösliche Träger wird dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der an das eingefangene fötal beschränkte Antigen auf dem unlöslichen Träger, d.h. den Sandwiching-Antikörper bindet, wie oben beschrieben. Der Sandwiching-Antikörper wird in einer wässerigen Lösung auf den unlöslichen Träger aufgetragen, wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben. Der Sandwiching-Antikörper wird fakultativ entfernt und der Träger gespült, wie oben beschrieben.
Wenn der Sandwiching-Antikörper unmarkiert ist, wird ein enzymmarkierter Antikörper oder anderes Bindungsagens, das selektiv an den Sandwiching-Antikörper bindet, in einer wässerigen Lösung auf den unlöslichen Träger aufgetragen, wie beschrieben. Bevorzugte Inkubationszeiten und -temperaturen sind oben dargelegt.
Die markierte Antikörperlösung wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche, ungebundene markierte Material zu entfernen. Wenn die Markierung ein Enzym ist, wie oben beschrieben, wird der unlösliche Träger dann mit einer wässerigen Lösung eines Substrats in Kontakt gebracht, das in Gegenwart des Enzyms umgesetzt wird, sodaß Fluorogen- oder Chromogenverbindung in die Lösung freigesetzt wird.
Geeignete Substrate und die Enzyme, mit denen sie umgewandelt werden können, sowie zusätzliche Komponenten und Puffer sind oben beschrieben worden. Die Substratlösung wird mit dem unlöslichen Träger über eine ausreichende Zeitspanne inkubiert, damit die Reaktion, die zum Auftreten von Fluorophor oder Chromophor führt, auftreten kann, wie oben beschrieben. Die Fluorogen- oder Chromogenmenge auf der Membran kann unter Verwendung eines Reflektometers oder Densitometers gemessen werden.
Konkurrenz-Immunoassays: Konkurrenz-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen markiertes fötal beschränktes Reagens-Antigen verwendet wird, umfassen das In-Kontakt-Bringen eines Gemisches aus der Testprobe und dem markierten fötal beschränkten Reagens-Antigen mit einem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, der an einem unlöslichen Träger fixiert ist, und das Bestimmen der Menge an Markierung, die entweder an den unlöslichen Träger bindet oder in der Lösungsphase verbleibt.
Die Konkurrenz-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen markierte Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen verwendet werden, können mehr als eine Form haben, wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben. Bei jedem dieser Verfahren wird die Testprobe mit Pufferlösung verdünnt, inkubiert und die Markierung wie oben unter Bezugnahme auf die Sandwich-Immunoassay-Ausführungsformen beschrieben ermittelt. Die Konzentration des Beschränkungsreagens ist so gewählt, daß kompetitive Bindung zwischen den Reagenzien ermöglicht wird, wobei die Menge an Markierung, die auf dem unlöslichen Träger oder in der Lösung verbleibt, eine Variable ist, die von der Menge des Analyten in der Testprobe abhängt. Diese Verfahren sind im allgemeinen wohlbekannt, und Fachleute auf dem Gebiet der Immunoassays wissen, wie sie zu variieren sind, um ein Verfahren zu optimieren.
Die Bindung des Antikörpers gegen fötal beschränktes Antigen an das fötal beschränkte Antigen in der Testprobe kann auch durch Agglomeration von Teilchen, an denen Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen durch fötal beschränktes Antigen in der Probe fixiert ist, Ausfällung von Antikörpern aufgrund von Antikörper-Antigen- Reaktionen oder Beobachtungen von bei der Antikörper-Antigen-Bindung auftretenden physikalischen oder elektrischen Veränderungen ermittelt werden, wobei Halbleiterbrücken-Sonden, Lichtstörungsmuster wie z.B. in der US-PS-4,647,544 beschrieben und dergleichen verwendet werden.
Es kann wünschenswert sein, Schwangerschaft unter Heranziehung des Vorhandenseins von auf Schwangerschaft hinweisenden Hormonen in Serum oder Harn nachzuweisen. Fachleuten auf diesem Gebiet ist eine große Vielzahl von Verfahren zum Bestimmen der Mengen an nichteingeschränkten Antigenen, die auf Schwangerschaft hinweisen, im Blut oder Harn einer Patientin bekannt. Es kann jedes verläßliche Verfahren eingesetzt werden. Verfahren zum Messen von hCG in Plasma, Serum und/oder Urin werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 3,171,783, 3,234,096, 3,236,732, 3,298,787, 3,309,275, 3,485,751, 3,655,838, 3,689,633, 3,862,302, 3,873,682, 3,873,683, 3,833,304, 3,991,175, 4,003,988, 4,014,653, 4,016,250, 4,033,723, 4,071,314, 4,094,963, 4,123,224, 4,123,509, 4,138,214, 4,208,187, 4,210,723, 4,234,561, 4,256,629, 4,268,435, 4,270,923, 4,310,455, 4,313,871, 4,320,111, 4,348,207, 4,371,515, 4,419,453, 4,421,896, 4,493,793, 4,508,829, and 4,665,034 beschrieben. Schwangerschaftsnachweise durch das Messen von Progesteron- Stoffwechselprodukten im Harn (US-PS-3,141,740) oder in Milch, Serum oder Plasma (HU-PS-T37028, WPI Nr. 86-023344/04); menschlichem Plazenta-Laktogen in Serum oder Plasma (US-PS-3,892,841, 4,371,515 und 4,493,793); Östrogensteroiden im Harn (US-PS-3,955,928); luteinisierendem Hormon (LH), Prolaktin (PRL) und/oder hCG- ähnlichen Substanzen in Serum, Plasma oder Harn (US-PS-4,016,250, 4,094,963 und 4,320,111); schwangerschaftsspezifischem β&sub1;-Glykoprotein (US-PS-4,065,445 und 4,191,533); LH (US-PS-4,138,214 und 4,208,187); Rinder-Schwangerschaftsantigen in Rinderserum oder -harn (EP-A-188,551, WPI Nr. 86-042108/06); eines neuen Plazentaproteins (US-PS-4, 592,863); und des frühen Schwangerschaftsfaktors WO 8605498 (WPI Nr. 86-264940/40) sind beschrieben worden. Es sind Verfahren zum Feststellen einer Schwangerschaft beschrieben worden, bei denen Farbstoffe dem Harn zugegeben werden (US-PS-2,587,221 und 3,226,196, Dinitrophenylhydrazin; US-PS- 3,5 95,620, Bromcresol-Purpur oder Chlorphenol-Rot), indem ein Jodpapiertest durchgeführt wird (US-PS-3,248,173), indem andere Ausfällungsmittel zugegeben werden (US-PS-3,278,270), durch Behandlung von weiblichem Blut mit einem Gemisch aus Säuren und Natriumchlorid (US-PS-3,883,304). Nach den Lehren der am 17. November 1987 eingereichten US-PA-121,902 kann Schwangerschaft unter Verwendung eines Assays einer Testprobe bestimmt werden, die in der Nähe des Cervikalkanals oder des Muttermundes entnommen wurde. Es kann jedes beliebige der obigen Verfahren eingesetzt werden, aber Verfahren wie z.B. hCG-Messungen werden bevorzugt.
Das Feststellen des Vorliegens einer Schwangerschaft gemeinsam mit einer negativen Bestimmung von fötal beschränktem Antigen in der Testprobe während der ersten 20 Schwangerschaftswochen weist darauf hin, daß keine normale Uterusschwangerschaft vorliegt, und ist ein Hinweis darauf, daß es zu einer Extrauterinschwangerschaft gekommen ist.
Sets für Tests auf Extrauterinschwangerschaft zum Nachweis von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe, die in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen, umfassen im allgemeinen (a) einen an einem unlöslichen Träger fixierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene oder fötal beschränktes Reagens-Antigen; (b) einer Kombination aus an einem unlöslichen Träger fixierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen und entweder einem markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, einem markierten Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene oder einem markierten fötal beschränkten Reagens-Antigen; (c) einer Kombination aus Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene, der an einem unlöslichen Träger fixiert ist, gemeinsam mit
einem markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen; und/oder (d) ein an einem unlöslichen Träger fixiertes fötal beschränktes Reagens-Antigen und einen markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen.
Die Sets zum Nachweis von Extrauterinschwangerschaft können weiters Kombinationen umfassen, um sowohl ein nicht beschränktes Schwangerschafts-Antigen, als auch ein fötal beschränktes Antigen in einer Testprobe zu bestimmen; weiters Puffer für den Probentransport und die Probenlagerung; Phiolen, Folienpackungen oder andere Behälter von Reagenzien der vorliegenden Erfindung; andere fakultative Reagenzien, wie z.B. Enzymsubstratreagenzien in getrennten Phiolen oder anderen Packungen; mechanische oder optische Vorrichtungen, um das Vorhandensein und Ausmaß von Antikörper-Antigen-Bindung festzustellen; und Kombinationen daraus. Probennahmevorrichtungen wie z.B. Probennahme-Tupfer und Puffer für Transport und Lagerung können ebenfalls enthalten sein. Die einzelnen Teile des Sets können in jeder zweckmäßigen Form, wie z.B. in Phiolen, Folienpackungen oder anderen Behältern,verpackt sein. Beispielsweise können unlösliche Trägeranordnungen in einer Folienpackung mit anderen Reagenzien in Phiolen oder anderen Packungen kombiniert sein.

TEST AUF EX VIVO-EMPFÄNGNISPRODUKTE

Ein erfindungsgemäßes Verfahren, das das Vorhandensein von ex vivo- Empfängnisprodukten nachweist, umfaßt das Bestimmen eines fötal beschränkten Antigens, d.h. eines einzig auf den Fötus oder die Plazenta fokussierten Stoffs, in einer Testprobe, die durch einen vermuteten Spontanabort abgegeben wurde oder während einer Dilatation und Kürettage oder eines ärztlich eingeleiteten Aborts entfernt wurde. Da die fötal beschränkten Antigene nicht in signifikanten Mengen im Blut der Mutter vorhanden sind, stört das Vorhandensein von Blut der Mutter in der Probe den Test nicht.
Die Begriffe "fötal beschränktes Antigen", "Klasse der fötal beschränkten Antigene", "Antikörper", "Immunoassay" und "bevorzugte Bindung" sind jeweils wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben definiert.
Eine Testprobe, die einem Assay zu unterziehen ist, um das Vorhandensein von ex vivo-Empfängnisprodukten zu bestimmen, von denen angenommen wird, daß sie aus dem Uterus abgegebenes Material darstellen, wird entnommen. Derartige Materialien können Gewebe sein, die während eines ärztlich eingeleiteten Aborts oder einer D&C (Dilatation und Kürettage) entfernt wurden. Alternativ dazu kann das Material Scheidenausfluß sein, von dem angenommen wird, daß er ein Indikator für Spontanabort oder Fehlgeburt ist. Die Probe umfaßt im allgemeinen Fluid und Feststoffteilchen und kann Gewebematerial, Scheiden- oder Cervicalsch lei m, andere Vaginal- oder Cervikalsekrete, Zellen oder Zellbruchstücke, Fruchtwasser oder andere Stoffe vom Fötus oder der Mutter enthalten. Die Probe kann mit einem Tupfer mit einer Spitze aus Dacron oder einem anderen Fasermaterial, einem Aspirator, einer Absaugvorrichtung, einer Spülvorrichtung oder dergleichen entnommen werden. Die Probe kann Gewebe darstellen, die während eines Dilatations- und Kürettage-Vorgangs oder eines ärztlich herbeigeführten Aborts entnommen wurden oder kann im Fall eines vermuteten Spontanaborts unter Verwendung einer Damenbinde beschafft werden.
Es ist wichtig, daß die Testprobe in einer Flüssigkeit dispergiert wird, die die empfindlichen Proteinanalyten konserviert, die in der als Probe genommenen Zusammensetzung instabil sind. Ein geeignetes Lagerungs- und Transfermedium ist das oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschriebene.
Der Nachweis des fötal beschränkten Antigens kann erbracht werden, indem das fötal beschränkte Antigen in einer Testprobe an einen Antikörper gebunden wird, der vorzugsweise an ein Epitop des fötal beschränkten Antigens bindet, und das Vorhandensein oder Fehlen dieser Bindung festgestellt wird.
Bei einem Sandwich-Assay auf fötal beschränktes Antigen wird die Testprobe mit einem unlöslichen Träger in Kontakt gebracht, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen fixiert ist, um die Bindung von fötal beschränktem Antigen in der Probe an den unlöslichen Träger zu bewirken. Der unlösliche Träger wird dann mit einem sekundären Antikörper, einem unmarkierten oder markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen in Kontakt gebracht, der an das fötal beschränkte Antigen bindet, das am unlöslichen Träger fixiert ist, um das eingefangene fötal beschränkte Antigen zu markieren und zu messen.
Der Festhalte-Antikörper für Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder der Sandwiching-Antikörper für Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen kann durch einen Antikörper ersetzt werden, der an eine Klasse von Substanzen bindet, die das fötal beschränkte Analyt-Antigen umfaßt. Beispielsweise kann Antikörper gegen fötal es Fibronectin am unlöslichen Träger fixiert werden, und markierter oder unmarkierter Anti-(Fibronectin)-Antikörper kann verwendet werden, um das festgehaltene Antigen zu markieren. Alternativ dazu kann Anti-(Fibronectin)-Antikörper am unlöslichen Träger fixiert werden, und markierter oder unmarkierter Antikörper gegen fötales Fibronectin wird verwendet, um das eingefangene Antigen zu markieren. Der sekundäre Antikörper kann eine physikalisch nachweisbare Markierung aufweisen, die direkt auf dem unlöslichen Träger gemessen werden kann. Alternativ dazu kann der sekundäre Antikörper unmarkiert sein, und der sekundäre Antikörper kann nachgewiesen werden, indem der unlösliche Träger mit einem markierten Antikörper oder Antikörperfragment in Kontakt gebracht wird, der/das selektiv an den sekundären Antikörper bindet (d.h. einem tertiären Antikörper), ungebundener markierter tertiärer Antikörper vom Träger entfernt wird und das Vorhandensein der Markierung auf dem unlöslichen Träger bestimmt wird. Sandwich-Immunoassays, bei denen ein Membransubstrat eingesetzt wird sind zur Verwendung geeignet.
Die Probe kann auch mit einem Konkurrenz-Immunoassayverfahren geprüft werden. Die Testprobe wird mit markiertem Reagens-Antikörper oder Antigen vermischt und mit einem unlöslichen Träger inkubiert, an dem ein Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder fötal beschränktes Reagens-Antigen fixiert ist, wobei Konkurrenz zwischen den Reagenzien um Bindung an den Probenanalyt auftritt. Fachleuten auf dem Gebiet der Immunoassays sind Verfahren und Vorgangsweisen zur Durchführung solcher Immunoassays wohlbekannt. Die Markierung, die zum Schluß am unlöslichen Träger fixiert ist oder in der Lösung verbleibt, wird bestimmt.
Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen kann durch herkömmliche Antiserum- oder monoklonale Techniken aus fötal beschränkten Antigenen erhalten werden, vorzugsweise aus hochgereinigten fötal beschränkten Antigenen. Die vorliegende Erfindung wird zum Zweck der Klarheit, nicht jedoch als Einschränkung, hierin bezogen auf den Nachweis von fötalem Fibronectin als fötal beschränktes Antigen beschrieben: der Nachweis eines jeden fötal beschränkten Antigens soll im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen. Fötales Fibronectin wird aus Fruchtwasser gereinigt, wie von Engvall und Ruoslahti, "Int.J.Cancer" 20:1-5 (1977) beschrieben. Antikörper gegen fötales Fibronectin kann nach herkömmlichen Antiserumtechniken oder durch Monoklonal-Antikörper-Techniken von fötalem Fibronectin abgeleitet werden.
Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene können nach herkömmlichen Antiserum- oder Monoklonal-Techniken direkt aus fötal beschränkten Antigenen, vorzugsweise aus hochgereinigten Antigenen, abgeleitet werden. Antikörper und Antikörper-Fragmente, die bei den Assays auf ex vivo-Empfängnisprodukte gemäß vorliegender Erfindung nützlich sind, sowie deren Herstellung sind oben bezogen auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben worden.
Die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern gegen fötal beschränktes Antigen ist oben für den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben worden, und solche Herstellungsverfahren sind geeignet, um Antikörper zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Test auf ex vivo- Empfängnisprodukte herzustellen.
Immunisierungsvorschriften, Affinitätschromatographie-Verfahren, Eluierung, Reinigung und Konzentration von Antikörpern gegen fötal beschränktes Antigen, wie z.B. Antikörper gegen fötales Fibronectin, und Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene, wie z.B. Anti-(Fibronectin)-Antikörper, wie oben unter Bezug auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben, sind geeignet, um Antikörper zur Verwendung beim Test für ex vivo-Empfängnisprodukte zu erzeugen.
Sandwich-Immunoassays: Bei einer Sandwich-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe wird ein unlöslicher Träger, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen fixiert ist, mit einer Testprobe in Kontakt gebracht, die mit einer wässerigen Pufferlösung verdünnt ist, wie oben bezogen auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben. Probenverdünner, Reagenskontakt und Inkubations- und Spülbedingungen, -lösungen, -zeit und -temperatur sind wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben. Restliche Proben lösung wird vom Träger unter Verwendung einer Spüllösung entfernt, und mit einem Sandwiching-Antikörper unter den oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben in Kontakt gebracht. Die Sandwiching-Antikörper-Lösung wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche ungebundene Material zu entfernen, wie beschrieben.
Wenn der Sandwiching-Antikörper unmarkiert ist, wird ein Antikörper oder ein anderes Bindungsmittel, das selektiv an den Sandwiching-Antikörper bindet, auf den unlöslichen Träger in einer wässerigen Lösung aufgetragen, wie oben beschrieben. Die Lösung aus markiertem Antikörper wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche ungebundene markierte Material zu entfernen. Die Markierung wird dann bestimmt. Wenn die Markierung ein Enzym ist, wie oben als Beispiel angeführt, wird der Träger mit einer geeigneten wässerigen Substratlösung in Kontakt gebracht und inkubiert, um ein Fluorophor oder Chromophor zu erzeugen. Die Fluoreszenz- oder Chromophormenge in der Lösung wird dann gemessen, wie oben beschrieben.
Das Sandwich-Verfahren kann so modifiziert werden, daß ein die Klasse der fötal beschränkten Antigene bindender Antikörper entweder als der Festhalte- oder der Sandwiching-Antikörper verwendet wird, wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben.
Membran-Immunoassays: Bei einer Membran-Ausführungsform zum Nachweis von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe wird ein unlöslicher Träger, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen fixiert ist, mit einer verdünnten Testprobe in Kontakt gebracht und inkubiert, wobei die Bedingungen die oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen dargelegten sind.
Der unlösliche Träger wird dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der an das eingefangene fötal beschränkte Antigen auf dem unlöslichen Träger, d.h. den Sandwiching-Antikörper bindet, wie oben beschrieben. Der Sandwiching-Antikörper wird in einer wässerigen Lösung auf den unlöslichen Träger aufgetragen, wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben. Der Sandwiching-Antikörper wird fakultativ entfernt und der Träger gespült, wie oben beschrieben.
Wenn der Sandwiching-Antikörper unmarkiert ist, wird ein enzymmarkierter Antikörper oder anderes Bindungsagens, das selektiv an den Sandwiching-Antikörper bindet, auf den unlöslichen Träger in einer wässerigen Lösung aufgetragen, wie beschrieben. Bevorzugte Inkubationszeiten und -temperaturen werden oben dargelegt.
Die markierte Antikörperlösung wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliche restliche, ungebundene markierte Material zu entfernen. Wenn die Markierung ein Enzym ist, wie oben beschrieben, wird der unlösliche Träger dann mit einer wässerigen Lösung eines Substrats in Kontakt gebracht, das in Gegenwart des Enzyms umgesetzt wird, sodaß Fluorogen- oder Chromogenverbindung in die Lösung freigesetzt wird. Geeignete Substrate und die Enzyme, mit denen sie umgewandelt werden können, sowie zusätzliche Komponenten und Puffer sind oben beschrieben worden. Die Substratlösung wird mit dem unlöslichen Träger über eine ausreichende Zeitspanne inkubiert, damit die Reaktion zum Auftreten von Fluorophor oder Chromophor führt, wie oben beschrieben. Die Fluorogen- oder Chromogenmenge auf der Membran kann unter Verwendung eines Reflektometers oder Densitometers gemessen werden.
Konkurrenz-Immunoassays: Konkurrenz-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen markiertes fötal beschränktes Reagens-Antigen verwendet wird, umfassen das In-Kontakt-Bringen eines Gemisches aus der Testprobe und dem markierten fötal beschränkten Reagens-Antigen mit einem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, der an einem unlöslichen Träger fixiert ist, und das Bestimmen der Menge an Markierung, die entweder an den unlöslichen Träger bindet oder in der Lösungsphase verbleibt.
Die Konkurrenz-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen markierte Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen verwendet werden, können mehr als eine Form haben, wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben. Bei jedem dieser Verfahren wird die Testprobe mit Pufferlösung verdünnt, inkubiert und die Markierung wie oben unter Bezugnahme auf die Sandwich-Immunoassay-Ausführungsformen beschrieben bestimmt. Die Konzentration des Beschränkungsreagens ist so gewählt, daß kompetitive Bindung zwischen den Reagenzien zugelassen wird, wobei die Menge an Markierung, die auf dem unlöslichen Träger oder in der Lösung verbleibt, eine Variable ist, die von der Menge des Analyten in der Testprobe abhängt. Diese Verfahren sind im allgemeinen wohlbekannt, und Fachleute auf dem Gebiet der Immunoassays wissen, wie sie zu variieren sind, um ein Verfahren zu optimieren.
Die Bindung des Antikörpers gegen fötal beschränktes Antigen an das fötal beschränkte Antigen in der Testprobe kann auch durch Agglomeration von Teilchen, an denen Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen durch fötal beschränktes Antigen in der Probe fixiert ist, Ausfällung von Antikörpern aufgrund von Antikörper-Antigen- Reaktionen oder Beobachtungen von bei der Antikörper-Antigen-Bindung auftretenden physikalischen oder elektrischen Veränderungen ermittelt werden, wobei Halbleiterbrücken-Sonden, Lichtstörungsmuster wie z.B. in der US-PS-4,647,544 beschrieben und dergleichen verwendet werden.
Es kann wünschenswert sein, Schwangerschaft unter Heranziehung des Vorliegens von Schwangerschaft anzeigenden Hormonen in Serum oder Harn nachzuweisen. Fachleuten auf diesem Gebiet ist eine große Vielzahl von Verfahren zum Bestimmen der Mengen an nichteingeschränkten Antigenen, die auf Schwangerschaft hinweisen, im Blut oder Harn einer Patientin bekannt. Es kann jedes verläßliche Verfahren eingesetzt werden, wie z.B. die oben unter Bezugnahme auf den Test für Extrauterinschwangerschaft beschriebenen.
Eine Testprobe, die während einer D&C, eines ärztlich eingeleiteten Aborts oder vermuteten Spontanaborts (Fehlgeburt) erhalten wurde, kann auf das Vorhandensein von fötal beschränktem Antigen geprüft werden. Gleichzeitiger Nachweis des Vorliegens einer Schwangerschaft und negativer Nachweis von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe, von der vermutet wird, daß sie einen ärztlich eingeleiteten oder spontanen Abort repräsentiert, ist ein Hinweis darauf, daß die Schwangerschaft eingetreten ist und immer noch besteht. Der Nachweis des Vorliegens einer Schwangerschaft und positiver Nachweis von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe, von der vermutet wird, daß sie einen ärztlich eingeleiteten oder spontanen Abort repräsentiert, ist ein Hinweis dafür, daß eine Schwangerschaft eingetreten ist, aber nicht mehr vorliegt. Der Nachweis des Fehlens beider Schwangerschaftsindikatoren und der negative Nachweis von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe, die von einer D&C stammt, ist ein Hinweis dafür, daß keine Schwangerschaft eingetreten ist und keine Schwangerschaft beendet wurde.
Testsets für ex vivo-Empfängnisprodukte zum Nachweis von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe, die in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen, umfassen im allgemeinen (a) einen an einem unlöslichen Träger fixierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene oder fötal beschränktes Reagens-Antigen; (b) eine Kombination aus an einem unlöslichen Träger fixierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen und entweder einem markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, einem markierten Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene oder einem markierten fötal beschränkten Reagens-Antigen; (c) eine Kombination aus Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene, der an einem unlöslichen Träger fixiert ist, gemeinsam mit einem markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen; und/oder (d) ein an einem unlöslichen Träger fixiertes fötal beschränktes Reagens-Antigen und einen markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen.
Die Sets zum Nachweis von ex vivo-Empfängnisprodukten können weiters Kombinationen umfassen, um sowohl ein nicht beschränktes Schwangerschafts-Antigen, als auch ein fötal beschränktes Antigen in einer Testprobe zu bestimmen; weiters Puffer für den Probentransport und die Probenlagerung; Phiolen, Folienpackungen oder andere Behälter von Reagenzien der vorliegenden Erfindung; andere fakultative Reagenzien, wie z.B. Enzymsubstratreagenzien in getrennten Phiolen oder anderen Packungen; mechanische oder optische Vorrichtungen, um das Vorhandensein und Ausmaß von Antikörper-Antigen-Bindung zu bestimmen; und Kombinationen daraus. Probennahmevorrichtungen wie z.B. Probennahme-Tupfer und Puffer für Transport und Lagerung können ebenfalls enthalten sein. Die einzelnen Teile des Sets können in jeder zweckmäßigen Form, wie z.B. in Phiolen, Folienpackungen oder anderen Behältern,verpackt sein. Beispielsweise können unlösliche Trägeranordnungen in einer Folienpackung mit anderen Reagenzien in Phiolen oder anderen Packungen kombiniert sein.

TEST FÜR DAS RISIKO VORZEITIGER WEHEN/BLASENSPRUNG

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Anzeigen erhöhten Risikos für Frühgeburt umfaßt den Nachweis eines fötal beschränkten Antigens in einer Testprobe nach der 20. Schwangerschaftswoche. Die Autoren des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben gefunden, daß nachweisbare Mengen dieser Stoffe im allgemeinen nicht in aus der Scheide stammenden Proben vorkommen, wie z.B. den nach der 20. Schwangerschaftwoche aus der Nähe des hinteren Scheidengewölbes, des Zervikalkanals oder Muttermundes entnommenen. In solchen nach der 20. Schwangerschaftswoche entnommenen Proben vorhandene nachweisbare Mengen dieser Stoffe weisen auf ein erhöhtes Risiko für drohende Frühgeburt und/oder das Springen der Fruchtblase hin. Da die fötal beschränkten Antigene nicht in signifikanten Mengen im Blut der Mutter vorhanden sind, stört das Vorhandensein von Blut der Mutter in der Probe den Test nicht.
Die Begriffe "fötal beschränktes Antigen", "Klasse der fötal beschränkten Antigene", "Antikörper", "Immunoassay" und "bevorzugte Bindung" sind jeweils wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben definiert.
Eine Testprobe, die einem Assay zu unterziehen ist, wird aus der Nähe des hinteren Scheidengewölbes' des Cervikalkanals oder des Muttermundes entnommen, und die Probe wird einem Assay unterzogen, um das Vorhandensein von oder die Menge an fötal beschränktem Antigen in der Probe zu ermitteln. Die Probe umfaßt im allgemeinen Fluid und Feststoffteilchen und kann Scheiden- oder Cervicalschleim, andere Vaginal- oder Cervikalsekrete, Zellen oder Zellbruchstücke, Fruchtwasser oder andere Stoffe vom Fötus oder der Mutter enthalten. Die Probe kann mit einem Tupfer mit einer Spitze aus Dacron oder einem anderen Fasermaterial, einem Aspirator, einer Absaugvorrichtung, einer Spülvorrichtung oder dergleichen entnommen werden und wird einem geeigneten Behälter für Lagerung und Transport ins Testlabor übertragen.
Es ist wichtig, daß die Testprobe in einer Flüssigkeit dispergiert wird, die die empfindlichen Proteinanalyten konserviert, die in der als Probe genommenen Zusammensetzung instabil sind. Ein geeignetes Lagerungs- und Transfermedium ist das oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschriebene.
Der Nachweis des fötal beschränkten Antigens kann erbracht werden, indem das fötal beschränkte Antigen in einer Testprobe an einen Antikörper gebunden wird, der vorzugsweise an ein Epitop des fötal beschränkten Antigens bindet, und das Vorhandensein oder Fehlen dieser Bindung festgestellt wird.
Bei einem Sandwich-Assay auf fötal beschränktes Antigen wird die Testprobe mit einem unlöslichen Träger in Kontakt gebracht, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen fixiert ist, um die Bindung von fötal beschränktem Antigen in der Probe am unlöslichen Träger zu bewirken. Der unlösliche Träger wird dann mit einem sekundären Antikörper, einem unmarkierten oder markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen in Kontakt gebracht, der an das fötal beschränkte Antigen bindet, das am unlöslichen Träger fixiert ist, um das eingefangene fötal beschränkte Antigen zu markieren und zu messen.
Der Festhalte-Antikörper für Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder der Sandwiching-Antikörper für Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen kann durch einen Antikörper ersetzt werden, der an eine Klasse von Substanzen bindet, die das fötal beschränkte Analyt-Antigen umfaßt. Beispielsweise kann Antikörper gegen fötal es Fibronectin am unlöslichen Träger fixiert werden, und markierter oder unmarkierter Anti-(Fibronectin)-Antikörper kann verwendet werden, um das eingefangene Antigen zu markieren. Alternativ dazu kann Anti-(Fibronectin)-Antikörper am unlöslichen Träger angebracht werden, und markierter oder unmarkierter Antikörper gegen fötales Fibronectin wird verwendet, um das festgehaltene Antigen zu markieren. Der sekundäre Antikörper kann eine physikalisch nachweisbare Markierung aufweisen, die direkt auf dem unlöslichen Träger gemessen werden kann. Alternativ dazu kann der sekundäre Antikörper unmarkiert sein, und der sekundäre Antikörper kann festgestellt werden, indem der unlösliche Träger mit einem markierten Antikörper oder Antikörperfragment in Kontakt gebracht wird, der/das selektiv an den sekundären Antikörper bindet (d.h. einem tertiären Antikörper), ungebundener markierter tertiärer Antikörper vom Träger entfernt wird und das Vorhandensein der Markierung auf dem unlöslichen Träger nachgewiesen wird. Sandwich-Immunoassays, bei denen ein Membransubstrat eingesetzt wird, sind zur Verwendung geeignet.
Die Probe kann auch mit einem Konkurrenz-Immunoassayverfahren geprüft werden. Die Testprobe wird mit markiertem Reagens-Antikörper oder Antigen vermischt und mit einem unlöslichen Träger inkubiert, an dem ein Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder fötal beschränktes Reagens-Antigen fixiert ist, wobei Konkurrenz zwischen den Reagenzien um Bindung an den Probenanalyt auftritt. Fachleuten auf dem Gebiet der Immunoassays sind Verfahren und Vorgangsweisen zur Durchführung solcher Immunoassays wohlbekannt. Die Markierung, die zum Schluß am unlöslichen Träger fixiert oder in der Lösung verbleibt, wird bestimmt.
Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen kann durch herkömmliche Antiserum- oder monoklonale Techniken aus fötal beschränkten Antigenen erhalten werden, vorzugsweise aus hochgereinigten fötal beschränkten Antigenen. Die vorliegende Erfindung wird zum Zweck der Klarheit, nicht jedoch als Einschränkung, hierin bezogen auf den Nachweis von fötalem Fibronectin als fötal beschränktes Antigen beschrieben: der Nachweis eines jeden fötal beschränkten Antigens soll im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen. Fötales Fibronectin wird aus Fruchtwasser gereinigt, wie von Engvall und Ruoslahti, "Int.J.Cancer" 20:1-5 (1977) beschrieben. Antikörper gegen fötales Fibronectin kann nach herkömmlichen Antiserumtechniken oder durch Monoklonal-Antikörper-Techniken von fötalem Fibronectin abgeleitet werden.
Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene können nach herkömmlichen Antiserum- oder Monoklonal-Techniken direkt aus fötal beschränkten Antigenen, vorzugsweise aus hochgereinigten Antigenen, abgeleitet werden. Antikörper und Antikörper-Fragmente, die bei den Assay gemäß vorliegender Erfindung nützlich sind, sowie deren Herstellung sind oben bezogen auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben worden.
Die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern gegen fötal beschränktes Antigen ist oben für den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben worden, und solche Herstellungsverfahren sind geeignet, um Antikörper zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Test für das Risiko vorzeitiger Wehen/Blasensprung herzustellen.
Immunisierungsvorschriften, Affinitätschromatographie-Verfahren, Eluierung, Reinigung und Konzentration von Antikörpern gegen fötal beschränktes Antigen, wie z.B. Antikörper gegen fötal es Fibronectin, und Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene, wie z.B. Anti-(Fibronectin)-Antikörper, wie oben unter Bezug auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben, sind geeignet, um Antikörper zur Verwendung beim Test für vorzeitige Wehen/Blasensprung zu erzeugen.
Sandwich-Immunoassays: Bei einer Sandwich-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe wird ein unlöslicher Träger, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen fixiert ist, mit einer Testprobe in Kontakt gebracht, die mit einer wässerigen Pufferlösung verdünnt ist, wie oben bezogen auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben. Probenverdünner, Reagenskontakt und Inkubations- und Spülbedingungen, -lösungen, -zeit und -temperatur sind wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben. Restliche Proben lösung wird vom Träger unter Verwendung einer Spüllösung entfernt und unter den oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschriebenen Bedingungen mit einem Sandwiching-Antikörper in Kontakt gebracht. Die Sandwiching-Antikörper-Lösung wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche ungebundene Material zu entfernen, wie beschrieben.
Wenn der Sandwiching-Antikörper unmarkiert ist, wird ein Antikörper oder ein anderes Bindungsmittel, das selektiv an den Sandwiching-Antikörper bindet, auf den unlöslichen Träger in einer wässerigen Lösung aufgetragen, wie oben beschrieben. Die Lösung aus markiertem Antikörper wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche ungebundene markierte Material zu entfernen. Die Markierung wird dann bestimmt. Wenn die Markierung ein Enzym ist, wie oben als Beispiel angeführt, wird der Träger mit einer geeigneten wässerigen Substratlösung in Kontakt gebracht und inkubiert, um ein Fluorophor oder Chromophor zu erzeugen. Die Fluoreszenz- oder Chromophormenge in der Lösung wird dann gemessen, wie oben beschrieben.
Das Sandwich-Verfahren kann so modifiziert werden, daß ein die Klasse der fötal beschränkten Antigene bindender Antikörper entweder als der Festhalte- oder der Sandwiching-Antikörper verwendet wird, wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben.
Membran-Immunoassays: Bei einer Membran-Ausführungsform zum Nachweis von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe wird ein unlöslicherTräger, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen fixiert ist, mit einer verdünnten Testprobe in Kontakt gebracht und inkubiert, wobei die Bedingungen die oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen dargelegten sind.
Der unlösliche Träger wird dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der an das eingefangene fötal beschränkte Antigen auf dem unlöslichen Träger, d.h. den Sandwiching-Antikörper bindet, wie oben beschrieben. Der Sandwiching-Antikörper wird in einer wässerigen Lösung auf den unlöslichen Träger aufgetragen, wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben. Der Sandwiching-Antikörper wird fakultativ entfernt und der Träger gespült, wie oben beschrieben.
Wenn der Sandwiching-Antikörper unmarkiert ist, wird ein enzymmarkierter Antikörper oder anderes Bindungsagens, das selektiv an den Sandwiching-Antikörper bindet, in einer wässerigen Lösung auf den unlöslichen Träger aufgetragen, wie beschrieben. Bevorzugte Inkubationszeiten und -temperaturen sind oben dargelegt.
Die markierte Antikörperlösung wird dann vom unlöslichen Träger entfernt, und der Träger wird mit einer Spüllösung wie z.B. oben beschrieben gespült, um jegliches restliche, ungebundene markierte Material zu entfernen. Wenn die Markierung ein Enzym ist, wie oben beschrieben, wird der unlösliche Träger dann mit einer wässerigen Lösung eines Substrats in Kontakt gebracht, das in Gegenwart des Enzyms umgesetzt wird, sodaß Fluorogen- oder Chromogenverbindung in die Lösung freigesetzt wird. Geeignete Substrate und die Enzyme, mit denen sie umgewandelt werden können, sowie zusätzliche Komponenten und Puffer sind oben beschrieben worden. Die Substratlösung wird mit dem unlöslichen Träger über eine ausreichende Zeitspanne inkubiert, damit die Reaktion, die zum Auftreten von Fluorophor oder Chromophor führt, auftreten kann, wie oben beschrieben. Die Fluorogen- oder Chromogenmenge auf der Membran kann unter Verwendung eines Reflektometers oder Densitometers gemessen werden.
Konkurrenz-Immunoassays: Konkurrenz-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen markiertes fötal beschränktes Reagens-Antigen verwendet wird, umfassen das In-Kontakt-Bringen eines Gemisches aus der Testprobe und dem markierten fötal beschränkten Reagens-Antigen mit einem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, der an einem unlöslichen Träger fixiert ist, und das Bestimmen der Menge an Markierung, die entweder an den unlöslichen Träger bindet oder in der Lösungsphase verbleibt.
Die Konkurrenz-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen markierte Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen verwendet werden, können mehr als eine Form haben, wie oben unter Bezugnahme auf den Schwangerschaftstest auf fötal beschränktes Antigen beschrieben. Bei jedem dieser Verfahren wird die Testprobe mit Pufferlösung verdünnt, inkubiert und die Markierung wie oben unter Bezugnahme auf die Sandwich-Immunoassay-Ausführungsformen beschrieben bestimmt. Die Konzentration des Beschränkungsreagens ist so gewählt, daß kompetitive Bindung zwischen den Reagenzien ermöglicht wird, wobei die Menge an Markierung, die auf dem unlöslichen Träger oder in der Lösung verbleibt, eine Variable ist, die von der Menge des Analyten in der Testprobe abhängt. Diese Verfahren sind im allgemeinen wohlbekannt, und Fachleute auf dem Gebiet der Immunoassays wissen, wie sie zu variieren sind, um ein Verfahren zu optimieren.
Die Bindung des Antikörpers gegen fötal beschränktes Antigen an das fötal beschränkte Antigen in der Testprobe kann auch durch Agglomeration von Teilchen, an denen Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen durch fötal beschränktes Antigen in der Probe fixiert ist, Ausfällung von Antikörpern aufgrund von Antikörper-Antigen- Reaktionen oder Beobachtungen von bei der Antikörper-Antigen-Bindung auftretenden physikalischen oder elektrischen Veränderungen ermittelt werden, wobei Halbleiterbrücken-Sonden, Lichtstörungsmuster wie z.B. in der US-PS-4,647,544 beschrieben und dergleichen verwendet werden.
Der Nachweis des Vorhandenseins von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe nach der 20. Schwangerschaftswoche weist darauf hin, daß die Fruchtblasen gesprungen sein können und/oder ist ein Hinweis auf erhöhtes Risiko für vorzeitige Wehen.
Testsets bezüglich Risiko für vorzeitige Wehen/Blasensprung zum Nachweisen von fötal beschränktem Antigen in einer Testprobe, die in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen, umfassen im allgemeinen (a) einen an einem unlöslichen Träger fixierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene oder fötal beschränktes Reagens-Antigen; (b) eine Kombination aus an einem unlöslichen Träger fixierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen und entweder einem markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, einem markierten Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene oder einem markierten fötal beschränkten Reagens-Antigen; (c) eine Kombination aus Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene, der an einem unlöslichen Träger fixiert ist, gemeinsam mit einem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen; und/oder (d) ein an einem unlöslichen Träger angebrachtes fötal beschränktes Reagens-Antigen und einen markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen.
Die Sets können weiters Kombinationen umfassen, um sowohl ein nicht beschränktes Schwangerschafts-Antigen, als auch ein fötal beschränktes Antigen in einer Testprobe nachzuweisen; weiters Puffer für den Probentransport und die Probenlagerung; Phiolen, Folienpackungen oder andere Behälter für Reagenzien der vorliegenden Erfindung; andere fakultative Reagenzien, wie z.B. Enzymsubstratreagenzien in getrennten Phiolen oder anderen Packungen; mechanische oder optische Vorrichtungen, um das Vorhandensein und Ausmaß von Antikörper-Antigen-Bindung zu bestimmen; und Kombinationen daraus. Probennahmevorrichtungen wie z.B. Probennahme-Tupfer und Puffer für Transport und Lagerung können ebenfalls enthalten sein. Die einzelnen Teile des Sets können in jeder zweckmäßigen Form, wie z.B. in Phiolen, Folienpackungen oder anderen Behältern,verpackt sein. Beispielsweise können unlösliche Trägeranordnungen in einer Folienpackung mit anderen Reagenzien in Phiolen oder anderen Packungen kombiniert sein.

REAGENZIEN MIT UNLÖSLICHEM TRÄGER

Antigen- und Antikörper-Reagenzien gemäß vorliegender Erfindung können nach herkömmlichen Verfahren an unlösliche Träger gebunden werden. Es können beispielsweise Antigen-Bindungsverfahren eingesetzt werden, die zur Bindung von Antigenen an unlösliche Träger geeignet sind, wie beispielsweise die in den US-PS- 4,033,723, 4,071,314, 4,348,207 und 4,419,453 beschriebenen zur Bindung von Antigenen an Latexteilchen und Erythrozyten. Verfahren zum Binden von Antikörpern an unlösliche Träger werden beispielsweise in den US-PS-3,551,555, 3,553,310, 4,048,298 und RE-29,474 und von Tijsson "PRACTICE AND THEORY OF ENZYME IMMUNOASSAYS" Elsevier Science Publishers, (1985) S.297-328 beschrieben. Verfahren zum Binden von Antikörpern an Polystyrol durch Adsorption werden beispielsweise in den US-PS-3,646,346 und 4,092,408 beschrieben. Zum Zweck der Klarheit, und nicht als Einschränkung, werden die Bindungsverfahren hierin unter Bezugnahme auf die Bindung von Antikörpern an unlösliche Träger beschrieben. Diese Verfahren eignen sich zur Bindung von Reagens-Antikörpern, wie z.B. Anti- (Schwangerschafts-Antigen)-Antikörpern, Antikörpern gegen fötal beschränktes Antigen und Antikörpern gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene und zur Bindung von Reagens-Antigenen, wie z. B. Reagens-Schwangerschaftsantigen oder fötal beschränktes Reagens-Antigen an unlösliche Träger.
Eine Vielfalt von Materialien kann als der unlösliche Träger verwendet werden, wobei die primäre Überlegung die Bindung des Antikörpers an der Oberfläche und das Fehlen von negativer Beeinflussung der Antigenbindungsreaktion oder anderer Reaktionen, die verwendet werden können, um das Vorhandensein und Ausmaß der Bindungsreaktion festzustellen, ist. Sowohl natürliche als auch synthetische organische und anorganische Polymere können als unlöslicher Träger verwendet werden. Beispiele für geeignete Polymere sind Polyethylen, Polypropylen, Polybutylen, poly(4-Methylbutylen), Butylkautschuk, Silastic-Polymere, Polyester, Polyamide, Zellulose und Zell ulosederivate (wie z.B. Zelluloseacetat, Nitrozellulose und dergleichen), Acrylate, Methacrylate, Vinylpolymere (wie z.B. Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenchlorid, Polyvinylfluorid und dergleichen), Polystyrol und Styrol-Pfropf- Copolymere, Rayon, Nylon, Polyvinylbutyrat, Polyformaldehyd usw. Andere Materialien, die als der unlösliche Träger verwendet werden können, sind die Latexe der obigen Polymere, Silikagel, Siliziumwafer, Glas, Papier, unlösliches Protein, Metalle, Metalloide, Metalloxide, magnetische Materialien, Halbleitermaterialien, Cermets und dergleichen. Außerdem gehören dazu Substanzen, die Gels bilden, wie z.B. Proteine, wie z.B. Gelatine, Lipopolysaccharide, Silikate, Agarose, Polyacrylamide oder Polymere, die mehrere wässerige Phasen bilden, wie z.B. Dextrane, Polyalkylenglykole (Alkylen mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen) oder Tenside, z.B. amphophile Verbindungen, wie z.B. Phospholipide, Iangkettige (12-24 Kohlenstoffatome) Alkylammoniumsalze und dergleichen.
Ein bevorzugter diagnostischer Träger gemäß vorliegender Erfindung umfaßt eine Nylon- oder Nitrozellulosemembran. Alternative diagnostische Träger bestehen aus Polystyrol, Styrol-Copolymeren, wie z.B. Styrol-Acrylnitril-Copolymeren oder Polyolefinen, wie z.B. Polyethylen oder Polypropylen, und Acrylat- und Methacrylat-Polymeren und Copolymeren. Der Reagens-Antikörper oder die Antigenreagenzien können an den unlöslichen Träger durch Adsorption, Ionenbindung, van der Waals-Adsorption, elektrostatische Bindung oder andere nicht-kovalente Bindung gebunden sein, oder durch kovalente Bindung an den unlöslichen Träger gebunden sein. Ein besonders vorteilhafter Träger für dieses Verfahren umfaßt eine Mikrotiterplatte, die eine Vielzahl von Näpfen aufweist. Die Napfoberfläche oder Kunststoffschalen-Einsätze darin können den Antigen- oder Antikörperträger darstellen. Wenn die Bestimmung die Anwendung von fluorometrischen Messungen erfordert, sind die Mikrotiterplatten- oder Napfeinsätze vorteilhafterweise für Licht undurchlässig, sodaß das auf einen Napf gerichtete Anregungslicht den Inhalt der umgebenden Näpfe nicht erreicht oder beeinflußt.
Verfahren zur nicht-kovalenten Bindung werden in der US-PS-4,528,267 beschrieben. Verfahren zum kovalenten Binden von Antikörpern und Antigenen an unlösliche Träger werden von I. Chibata in "IMMOBILIZED ENZYMES", Halsted Press: New York (1978) und A. Cuatrecasas, "J.Bio.Chem." 245:3059 (1970) beschrieben. Die Oberfläche kann mit einem Protein beschichtet und mit dem Antikörper oder Antigen gekoppelt werden, wobei beispielsweise Verfahren, die in der US-PS-4,210,418 beschrieben sind, eingesetzt werden, bei denen Glutaraldehyd als Kopplungsmittel verwendet wird. Bei einem alternativen Verfahren kann der Napf mit einer Schicht beschichtet werden, die freie Isozyanatgruppen, wie z.B. Polyetherisozyanat, aufweisen, und das Auftragen des Antikörpers oder Antigens in wässeriger Lösung darauf bewirkt die erforderliche Bindung. Bei wieder einem anderen Verfahren kann der Antikörper oder das Antigen mittels Cyanogenbromid mit einem hydroxylierten Material gekoppelt werden, wie in der US-PS-3,720,760 beschrieben.
Die unlöslichen Träger werden vorzugsweise "blockiert", um nichtspezifische Bindung zu verringern. Die Wahl geeigneter Blockierungsmittel wird durch die Art des unlöslichen Trägers bestimmt. Beispielsweise umfassen bei Polystyrolträgern geeignete Blockierungsmittel wasserlösliche nichtimmune Tierproteine. Geeignete wasserlösliche nichtimmune Tierproteine sind Rinderserumalbumin (BSA); Serumalbumine von Mensch, Kaninchen, Ziege, Schaf und Pferd; Casein und Magermilch; Ovalbumin; Glykoproteine; und dergleichen.
Die gleichen Blockierungsmittel können auch für Nylon- und Nitrozelluloseträger verwendet werden. Jedoch ist ein bevorzugtes Blockierungsmittel für Nitrozellulose- oder Nylonmembranträger Magermilch oder Casein. Ein optimales Blockierungsmittel für diese Membranträger ist eine wässerige Lösung, die von 1 bis 5 Gew.-% Trockenmagermilch oder Casein enthält, oder nichtionische Tenside, wie z.B. Polyoxyethylensorbitan-Derivate und Polyoxyethylenether.

MARKIERTE REAGENZIEN

Das markierte Reagens-Schwangerschafts-Antigen, der markierte Anti-(Schwangerschafts- Antigen)-Antikörper, die markierten Anti-(Sandwiching-Antikörper)-Reagens-Antikörper gemäß vorliegender Erfindung können nach herkömmlichen Verfahren zum Fixieren von Markierungen an Proteine hergestellt werden, vorzugsweise mit geeignetem Schutz von Antikörper-Bindungsstellen.
Das markierte fötal beschränkte Reagens-Antigen, der markierte Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, der markierte Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene und die markierten Anti-(Sandwiching-Antikörper)-Reagens-Antikörper gemäß vorliegender Erfindung können nach herkömmlichen Verfahren zum Fixieren von Markierungen an Proteine hergestellt werden, vorzugsweise mit geeignetem Schutz von Antikörper-Bindungsstellen.
Die Markierungen können durch chemische oder.physikalische Bindung an die Protein- Reagenzien gebunden oder daran gekoppelt sein. Liganden und Gruppen, die mit dem/den Reagens-Antigen oder Antikörpern gemäß vorliegender Erfindung konjugiert werden können, umfassen Elemente, Verbindungen oder biologische Materialien, die physikalische oder chemische Eigenschaften aufweisen, die eingesetzt werden können, um die Reagenzien, an die sie gebunden sind, von Verbindungen und Materialien in der Probe, die geprüft wird, zu unterscheiden.
Markierungsverfahren werden zum Zweck der Klarheit und nicht als Einschränkung hierin unter Bezugnahme auf die Markierung von Antikörpern beschrieben, und die beschriebenen Verfahren sind im allgemeinen zum Markieren einer jeden eiweißartigen Verbindung oder Substanz geeignet, wie z.B. der Reagens-Schwangerschafts-Antigene oder fötal beschränkten Antigene gemäß vorliegender Erfindung.
Radiomarkierte Antikörper gemäß vorliegender Erfindung können für in vitro- Diagnosetests verwendet werden. Die spezifische Wirkung eines markierten Antikörpers hängt von der Halbwertszeit, der Isotopen-Reinheit der radioaktiven Markierung und davon ab, wie die Markierung in das Antigen oder den Antikörper eingebaut ist. Tabelle A führt mehrere häufig verwendete Isotope, ihre spezifischen Wirkungen und Halbwertszeiten an. Bei Immunoassay-Tests ist die Empfindlichkeit im allgemeinen umso besser, je höher die spezifische Wirkung ist. Tabelle A Isotop spezifische Aktivität des reinen Isotops (Curie/Mol) Halbwertszeit Jahre Tage
Die Verfahren zum Markieren von Antikörpern mit den in Tabelle A angeführten radioaktiven Isotopen sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt. Tritium- Markierungsverfahren werden beispielsweise in der US-PS-4,302,438 beschrieben. jodierungs-, Tritium-Markierungs- und ³&sup5;S-Markierungs-Verfahren, die speziell für Antikörper ausgelegt sind, werden von Goding J:, "MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE", New York: Academic Press (1983) S. 124-126 und den darin zitierten Verweisen beschrieben. Andere Verfahren zum Jodieren von Antikörpern werden von Hunter und Greenwood, "Nature", 144:945 (1962) und David et al., "Biochem." 13:1014-1021 (1974) und in den US-PS-3,867,517 und 4,376,110 beschrieben. Beispiele für geeignete Systeme, Kopplungsverfahren und Substratreaktionen damit werden beispielsweise in den US-PS-RE-31,006, 3,654,090, 4,214,048, 4,289,747, 4,302,438, 4,312,943, 4,376,110 und den darin zitierten Verweisen geoffenbart. Beispiele für andere geeignete Systeme werden von Pesce et al., "Clin.Chem." 20:353-359 (1974) und Wisdom, G. "Clin.Chem." 22:1243 (1976) beschrieben.
Es folgt eine Liste geeigneter Enzymklassen, die zum Markieren verwendet werden können, und spezifischer Beispiele für jede Klasse: Tabelle B Klasse Enzymbeispiel Hydrolasen Carbohydrasen Nukleasen Amidasen Purin-Desaminasen Peptidasen Proteinasen Esterasen Eisenenzyme Kupferenzyme Coenzyme enthaltende Enzyme Cytochrom reduzierende Enzyme Gelbe Enzyme Mutasen Demolasen Oxidasen Amylasen Polynukleotidase Arginase Adenase Aminopolypeptidase Pepsin Lipasen Catalase Tyrosinasen Alkoholdehydrogenase Bernsteinsäuredehydrogenase Diaphorase Glyoxalase Aldolase Glukoseoxidase Meerrettichperoxidase
Geeignete Enzyme werden in Hawk et al., "PRACTICAL PHYSIOLOGICAL CHEMISTRY", New York: McGraw-Hill, S.306-397 (1954) beschrieben.
Fluorogene und chromogene Enzyme (Enzyme, in deren Gegenwart ein ausgewähltes Substrat ein fluoreszierendes oder chromogenes Produkt erzeugt) sind geeignete Markierungsgruppen. Verfahren zum selektiven Konjugieren von Enzymen an Antikörper, ohne daß die Fähigkeit des Antikörpers beeinträchtigt wird, an Antigen zu binden, und zum Konlugieren von Enzymen an eiweißartige Reagenzien, sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt.
Geeignete Enzyme und Verfahren, um sie an Antikörper zu koppeln, werden beispielsweise von I. Chibata in IMMOBILIZED ENZYMES. Halsted Press: New York (1978); A. Cuatrecasas, J.Bio.Chem. 245:3059 (1970); Wilson, M. et al, INTERNATIONAL CONFERENCE IMMUNOFLUORESCENCE AND RELATED STAINING TECHNIQUES. W. Knapp et al, Hrsg. Amsterdam: Eisevier pp 215-244 (1978); Suilivan, M. et al, Ann.Clin.Biochem. 16:221-240 (1979); Nygren, H. et al, Med.Biol. 57:187-191 (1979); Gadkari, D. et al, J.Virol.Meth. 10:215-224 (1985); Tijssen, P. et al, Anal.Biochem. 135:451-457 (1984); Tsuruta, J. et al, J.Histochem.Cytochem. 33:767-777 (1985); Ishikawa, E., J. Immunoassay. 4:209-327 (1983); und in U.S.PS 4,190,496 beschrieben.
Die bevorzugten Enzyme und geeigneten Substrate, die ihnen entsprechen, umfassen Meerrettichperoxidase, für die die geeigneten Substrate o-Phenylendiamin, m- Phenylendiamin, o-Dianisidin und 4-Chlor-α-naphthol sind. Sie umfassen auch β- Galaktosidase, für die geeignete Substrate beispielsweise 4-Methylumbelliferyl-β-D- galactosid, p-Nitrophenyl-β-D-Galaktose, p-Nitrophenol, o-Nitrophenyl-β-D-Galaktose und o-Nitrophenol sind. Sie umfassen alkalische Phosphatase, für die geeignete Substrate beispielsweise p-Nitrophenylphosphat, Indoxylphosphat und 5-Brom-3- chlorindoxylphosphat sind.
Beispiele für geeignete Verfahren zur Enzymmarkierung des Antikörpers sind die Verwendung von Carbodiimiden, Dialdehyden und bifunktionellen Kopplungsreagenzien. Die Verknüpfung von Enzymen über Amidgruppen kann erreicht werden, indem die Proteine mit Thionylchlorid, N-Hydroxysuccinimid oder ähnlichen Reagenzien in einem wasserfreien Lösungsmittel, wie z.B. Dimethylformamid, Dioxan, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran oder dergleichen behandelt werden. Alternative Kopplungsmittel sind Carbodiimide, wie beispielsweise 1-Ethyl-3-(3-(N,N'- dimethylamino)propyl)-carbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2- morpholinoethyl)carbodiimidmethyl-p-toluolsulfonat, Succinimidyl-4-(N- maleimidoethyl)-cyclohexan-1-carboxylat, und Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)- propionat.
Die Kohlehydratgruppe eines Enzyms kann auch zu einem Aldehyd oxidiert und mit Lysyl-Aminogruppen von Immunoglobulinen umgesetzt werden, um eine Schiffsche Base zu bilden. Die Reduktion mit Natriumborhydrid bewirkt eine stabile Verknüpfung von Enzym und Antikörper. Meerrettichperoxidase mit Antikörper kann nach dem Verfahren von Wilson, M. et al., "INTERNATIONAL CONFERENCE lN IMMUNOFLUORESCENCE AND RELATED STAINING TECHNIQUES", Hrsg. W. Knapp et al.,Amsterdam: Elsevier S. 215-244 (1978) wirksam mit den Immunoglobulinen verknüpft werden.
Fluorophor- und chromophormarkierte Antikörper können aus nach dem Stand der Technik bekannten herkömmlichen fluoreszierenden Gruppen hergestellt werden. Da Antikörper und andere Proteine Licht mit Wellenlängen bis zu etwa 310 nm absorbieren, sollten die fluoreszierenden Gruppen so ausgewählt werden, daß sie beträchtliche Absorption bei Wellenlängen über 310 nm und vorzugsweise über 400 nm aufweisen. Eine Vielzahl geeigneter Fluoreszenzmittel und Chromophore wird von Stryer, Science- 162:526 (1968) und Brand, L. et al., "Ann.Rev.Biochem." 41:843-868 (1972) beschrieben. Die Antikörper können nach herkömmlichen Verfahren, wie beispielsweise den in den US-PS-3,940,475, 4,289,747 und 4,376,110 geoffenbarten mit fluoreszierenden Chromophorgruppen markiert werden.
Eine Gruppe von Fiuoreszenzmitteln, die eine Reihe der oben beschriebenen wünschenswerten Eigenschaften aufweisen, sind die Xanthenfarbstoffe, zu denen die von 3,6-Dihydroxy-9-phenylxanthhydrol und Resaminen abgeleiteten Fluoresceine und die von 3,6-Diamino-9-phenylxanthydrol und Lissanim-Rhodamin B abgeleiteten Rhodamine gehören. Die Rhodamin- und Fluorescein-Derivate von 9-o- Carboxyphenylxanthhydrol weisen eine 9-o-Carboxyphenylgruppe auf. Fluorescein- Verbindungen, die reaktive Kopplungsgruppen wie z.B. Amino- und Isothiocyanatgruppen, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat und Fluorescamin aufweisen, sind problemlos verfügbar.
Eine weitere Gruppe von fluoreszierenden Verbindungen sind die Naphthylamine, die eine Aminogruppe in der α- oder β-Position aufweisen. Zu den Naphthylaminoverbindungen gehören 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino- 8-Naphthalinsulfonat und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalinsulfonat. Andere Farbstoffe sind 3- Phenyl-7-isocyanatkumarin; Acridine, wie z.B. 9-Isothiocyanatacridin und Acridin- Orange; N-[p-(2-benzoxazolyl)phenyl]maleimid; Benzoxadiazole, wie z.B. 4-Chlor-7- nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol und 7-(p-Methoxybenzylamino)4-nitrobenzo-2-oxa-1,3- diazol; Stilbene, wie z.B. 4-Dimethylamino4'-isothiocyanatstilben und 4- Dimethylamino-4'-maleimidstilben; N,N'-Dioctadecyloxacarboxyamin-p-toluolsulfonat; Pyrene, wie z.B. 8-Hydroxy-1,3,6-Pyrentrisulfonsäure, 1-Pyrenbuttersäure, Merocyanin 540, Bengalrosa, 2,4-Diphenyl-3(2H)-furanon, o-Phthalaldehyd sowie andere problemlos verfügbare fluoreszierende Moleküle. Diese Farbstoffe weisen entweder aktive funktionelle Gruppen auf, oder solche funktioneiie Gruppen können leicht eingefügt werden.
Antikörper können nach den von Goding J. "MONOCLONAL ANTIBODIES: PRLNCLPLES AND PRACTICE"; New York: Academic Press (1983), S. 208-249, beschriebenen Verfahren mit Fluorochromen oder Chromophoren markiert werden. Die Fiuorochromkonzentration wird nach der Tabelie von Goding (oben), S. 229, ausgewählt. Beispielsweise wird Fluoresceinisocyanat (1,0 mg/ml) oder Rhodaminisocyanat (10,0 mg/ml) in DMSO hergestellt, und das gewünschte Volumen (1-10% des gesamten Proteinlösungsvolumens) wird der Proteinlösung unter Rühren zugetropft. Die Umsetzung erfolgt, von Licht abgeschirmt, zwei Stunden lang. Das Produkt wird durch Gelfiltration auf SEPHADEX G-25-Gel in PBS gereinigt, das 0,1% NaNO&sub3; enthält, um das nicht umgesetzte oder hydrolysierte Fluorochrom abzutrennen.
Das Absorptionsvermögen des Konjugats wird bei 280 nm und an ihrem Maximum im sichtbaren Bereich (495 nm bei fluoresceiniertem Antikörper und 550 nm bei rhodaminiertem Antikörper) gemessen. Das Verhältnis zwischen Fluorochrom und Protein wird nach dem Verfahren von Goding "MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE", New York: Academic Press (1983) S. 224-225, berechnet. Konjugate werden bis zur Verwendung vor Licht geschützt bei 4ºC gelagert. Wenn die Antikörper-Konzentration in der Lösung weniger als 1 mg/ml beträgt, wird der Lösung BSA bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben.
Die bei den Assays gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Antikörper und Reagens-Antigene können kovalent an Avidin oder Biotin gebunden werden. Geeignete Bindungsverfahren umfassen die Vernetzung durch ein bifunktionelles Vernetzungsmittel. Geeignete bifunktionelle Verbindungen werden von Peters, K. et al, "Ann.Rev.Biochim." 46:523 (1977) beschrieben. Alkylimidate weisen einen hohen Grad an Spezifität unter den ihnen von einem Protein präsentierten funktionellen Gruppen auf. Die Reaktion ist für primäre Aminogruppen spezifisch. Beispiele für geeignete Kopplungsreagenzien sind Amidoester, wie z.B. Dimethylmalonimidat, Azide, wie z.B. das Acylazid von Tartryldiazid, das leicht mit Immunogruppen umzusetzen ist, um Amidbindungen zu erzeugen. Es können Aryldihalide (z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol oder 4,4'-Difluor-3,3'-dinitrophenylsulfon, Glutaraldehyd, 1-Ethyl-3-(3- Dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, Dimaleimid, gemischtes Anhydrid, m- Maleamidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester und andere bekannte Vernetzungsmittel verwendet werden.
Die vorangehenden Reagenzien liefern im wesentlichen irreversible Bindungen. Bifunktionelle Mittel mit funktionellen Gruppen, wie z.B. Disulfid oder Glykol, können verwendet werden. Diese sorgen für Bindungen, die, wenn gewünscht, nach der Vernetzungsreaktion gelöst werden können. Derartige Reagenzien sind Dimethyl-3,3'- dithiobispropionimidat, Succinimidylpropionimidat, N-(3-Fluor-4,6-dinitrophenyl)- cystamin, Tartryldiazid, Tartryldi(glycylazid) und Tartryl-di(epsilon-aminocaproylazid).
In anderen Fällen können die Bindungen direkt zwischen den Reagenzien selbst gebildet werden. Beispielsweise kann Antikörper durch funktionelle Gruppen auf den jeweiligen Materialien an Biotin gebunden werden. Als spezifisches Beispiel kann Biotin mit Perjodat behandelt und mit Antikörper umgesetzt werden, sodaß eine Schiffsche Base gebildet wird, ohne die Bindung zwischen Biotin und Avidin zu hemmen oder die immunologische Aktivität des Antikörpers zu blockieren. Avidinkonjugierte und biotinylierte Reagenzien sind bei Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien erhältlich.
Zu bekannten Techniken, bei denen bifunktionelle Vernetzungsmittel verwendet werden, gehören die folgenden: (a) eine einstufige Glutaraldehydbindung, Avrameas, S. "Immunochem." 6:43 (1969); (b) zweistufige Glutaraldehydbindung, Avrameas, S. "Immunochem." 8:1175 (1971); und (c) Dimaleimidbindung, Kato, K. et al., "Euro.J.Biochem." 62:285 (1966).
Antikörper können nach dem Verfahren von Hnatowich, D. et al., "J.Appl.Rad." 35:554- 557 (1984) und Buckley R. et al., "Fed.Eur.Biochem.Soc." 166:202-204 (Jan. 1984) mit metallischen Radionukliden markiert werden. Bei diesem Verfahren werden die Antikörper mit einem Chelatbildner, wie z.B. Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), konjugiert, das fähig ist, mit dem metallischen Radionuklid ein Chelat zu bilden. Eine Suspension aus 0,1 mg/ml des bizyclischen Anhydrids von DTPA wird in einem trockenen Lösungsmittel, wie z.B. Chloroform, Ether oder trockenem DMSO hergestellt. Ein Aliquot, das ausreicht, um ein Molverhältnis zwischen DTPA und Immunoglobulin von 1:1 zu schaffen, wird in ein sauberes, trockenes Rohr verbracht und unter Stickstoff eingedampft. Eine 10-20 Mikroliter-Teilmenge der verwendeten Antikörperlösung (10- 20 mg/ml) in 0,05 M Bikarbonatpuffer in Salzlösung, pH 7,0-7,5, wird dem trockenen DTPA zugegeben und der Inhalt wird 0,5-1,0 Minute lang gerührt. Das gekoppelte Proteinpräparat wird mit der gleichen Pufferlösung auf 0,2 ml verdünnt und mit SEPHADEX G-50-Gel auf einer 5 cm Gelfiltrationssäule gereinigt, wobei ein Salzlösungs-Eluens verwendet wird. Die Kopplungseffizienz wird vor der Reinigung durch die Zugabe von "Chelatisierungsqualität"-¹¹¹In in 0,5 M Acetatpufferlösung, pH 6,0 ermittelt. Dünnschicht-Chromatographie wird eingesetzt, um den DTPA- gekoppelten Antikörper zur Berechnung der Kopplungseffizienz abzutrennen. Die DTPA-gekoppelten Antikörper können bei 4ºC gelagert werden, bis sie zur Bindung mit metallischen Radionukliden, wie beispielsweise ¹¹¹InIII,²¹²BiIII und &sup6;&sup8;GaIII benötigt werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden spezifischen, aber nicht einschränkenden Beispiele weiter veranschaulicht. Wenn nicht anders angeführt, sind Temperaturen in Grad Celsius und Prozentsätze als Gewichtsprozent angegeben.

BEISPIEL

Polyklonaler Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen

Fötales Fibronectin wird aus Fruchtwasser gereinigt, wie von Engvall und Ruoslahti, "Int.J.Cancer" 20:1-5 (1977) beschrieben.
Die Antikörper gegen fötal es Fibronectin werden in Kaninchen unter Verwendung der in der Literatur, z.B. bei Stollar, "Meth.Enzym." 70:70 (1980) beschriebenen Immunisierungstechniken und -vorschriften gezüchtet, wobei die Kaninchen mit dem fötalen Fibronectin-Antigen immunisiert wurden. Das Antiserum wird in einem Festphasen-Assay ähnlich dem bei monoklonalen Antikörpern verwendeten, z.B. wie von Lange et al., "Clin.Exp.Immunol." 25:191 (1976) und Pisetsky et al., "J.Immun.Meth." 41:187 (1981) beschrieben, gescreent.
Die IgG-Fraktion der Antiseren wird durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals), an die fötales Fibronectin gekoppelt war weiter gereinigt. Das zum Koppeln verwendete Verfahren ist das vom Gel-Hersteller in AFFINITY CHROMATOGRAPHY, Pharmacia Fine Chemicals, S.15-18 empfohlene.
Die Säule wird mit 2 bis 3 Volumina Puffer (0,01 M PBS, pH 7,2) äquilibriert, und die Antikörper gegen fötales Fibronectin enthaltende Lösung wird dann auf die Säule aufgebracht. Das Absorptionsvermögen des Eluats wird bei 280 nm überwacht, bis kein Protein mehr aus der Säule austritt. Die Säule wird dann mit 0,1 M Glycinpuffer, pH 2,5 gewaschen, um den durch Immunoaffinität gebundenen Antikörper gegen fötales Fibronectin zu desorbieren. Die Proteinpeakfraktionen werden gesammelt, vereinigt und gegen 0,01 M PBS, pH 7,2 24-36 Stunden lang bei 4ºC mit mehreren Pufferwechseln dialysiert.
Wenn eine höhere Reinheit erwünscht ist, kann das affinitätsgereinigte IgG nach dem oben beschriebenen Verfahren durch eine Affinitätssäule geschickt werden, an die Fibronectin aus Erwachsenenplasma gebunden ist, um jegliche Antikörper zu entfernen, die mit den Fibronectinen in Erwachsenenplasma über Kreuz reagieren würden.

Beispiel 2

Monoklonaler Antikörper gegen fötales Fibronectin

Unter Verwendung des nach dem Verfahren von Beispiel 1 erhaltenen gereinigten fötalen Fibronectins werden monoklonale Maus-Antikörper gegen das fötale Fibronectin unter Einsatz der Standardverfahren von Galfre und Milstein, "Meth.Enzym." 73:1 (1981) und Matsuura, H. und Hakomori, S. et al., "Proc.Natl.Acad.Sci.USA" 82:6517- 6521 (1985) erhalten, wobei fötales Fibronectin als Antigen zum Immunisieren der Mäuse verwendet wird. Die monoklonalen Antikörper werden unter Verwendung einer Abwandlung der in der Literatur, z.B. von Lange et al., "Clin.Exp.Immunol." 25:191 (1976) und Pisetsky et al., "J.Immun.Meth." 41:187 (1981) beschriebenen Techniken gescreent.
Monoklonaler Maus-Antikörper wird unter Einsatz von an Protein A gekoppelter Sepharose-4B (Pharmacia Fine Chemicals) nach dem Verfahren von Tijsson, "PRACTICE AND THEORY OF ENZYME IMMUNOASSAYS", Elsevier Science Publishers, S.105-107 (1985) aus Aszitesfluid oder Hybridomakultur-Überständen gereinigt.

BEISPIEL 3

Antikörper-beschichtete Mikrotiterplatte

Ziegen-F(ab')&sub2;-anti-(Maus IgG)-Antikörper (Tago) wird in 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,6, auf 10 ug/ml verdünnt. 100 ul werden in jeden Napf einer IMMULON II- Mikrotiterplatte (Dynatech) abgegeben. Die Platte wird abgedeckt und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur oder bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Platte wird viermal mit Waschpuffer (0,02 M Tris-HCl, 0,015 M NaCl, 0,05% TWEEN -20) gewaschen. Die Platte wird dann blockiert, indem in jeden Napf 200 ul Blockierungslösung (0,01 M PBS, 1 % BSA, 0,02% NaN&sub3;, pH 7,4) abgegeben werden. Nach den in den US-PS- 4,256,629, 4,268,435, 4,310,455 oder 4,313,871 beschriebenen Verfahren hergestellte Anti-(hCG)-Antikörper werden mit 0,01 M PBS-1% BSA, pH 7,4, auf 1/10 000 verdünnt. 100 ul der Lösung werden in jeden Napf der blockierten Mikrotiterplatte abgegeben. Die Näpfe werden abgedeckt und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang oder bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Platte wird dann viermal mit Waschpuffer wie oben beschrieben gewaschen und ist dann für das Immunoassay von Proben bereit.

BEISPIEL 4

Mit polyklonalem Antikörper beschichtete Mikrotiterplatte

Kaninchen-anti-(fötales-Fibronectin), das hergestellt und weiter gereinigt wurde, um Kreuzreaktivität mit Erwachsenen-Fibronectin zu beseitigen, wie in Beispiel 1 beschrieben, wird in 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,6 auf 10 ug/ml verdünnt. 100 ul werden in jeden Napf einer IMMULON II-Mikrotiterplatte (Dynatech) abgegeben. Die Platte wird abgedeckt und bei Raumtemperatur 4 Stunden lang oder bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Platte wird viermal mit Waschpuffer (0,02 M Tris-HCl, 0,015 M NaCl, 0,05% TWEEN -20) gewaschen, wobei die Näpfe bei jeder Verwendung vollständig gefüllt und entleert wurden. Die Platte wird dann blockiert, indem in jeden Napf 200 ul einer Blockierungslösung (0,01 M PBS, 1% BSA, 0,02% NaN&sub3;, pH 7,4) abgegeben wurden und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Näpfe werden dann viermal mit Waschpuffer gewaschen, wie oben beschrieben. Die Platte ist nun zum Immunoassay von Proben bereit.

BEISPIEL 5

Mit monoklonalem Antikörper beschichtete Mikrotiterplatte

Ziegen-F(ab')&sub2;-anti-(Maus-IgG)-Antikörper (Tago) wurde in 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,6, auf 10 ug/ml verdünnt. 100 ul wurden in jeden Napf einer IMMULON II- Mikrotiterplatte (Dynatech) abgegeben. Die Platte wurde abgedeckt und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur oder bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Platte wurde viermal mit Waschpuffer gewaschen, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Platte wurde dann blockiert, indem in jeden Napf die Blockierungslösung wie in Beispiel 4 beschrieben abgegeben wurde. Wie in Beispiel 2 hergestelltes monoklonales Maus-anti-(fötales Fibronectin)-Aszites wurde mit 0,01 M PBS-1% BSA, pH 7,4, auf 1/5000 verdünnt. 100 ul der Lösung wurden in jeden Napf der blockierten Mikrotiterplatte abgegeben. Die Näpfe wurden abgedeckt, zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Platte wurde dann viermal mit Waschpuffer gewaschen, wie oben beschrieben, und war dann für das Immunoassay der Proben bereit.

BEISPIEL 6

Enzymmarkierter Anti-(hCG)-Antikörper

Anti-(hCG)-Antikörper wird nach den Verfahren der US-PS-3,171,783, 3,234,096, 3,236,732 oder 3,309,275 hergestellt und gemäß dem einstufigen Glutaraldehydverfahren von Avrameas, "Immunochem." 6:43 (1969) folgend mit alkalischer Phosphatase konjugiert.

BEISPIEL 7

Enzymmarkierter Anti-(Fibronectin)-Antikörper

Nach den Verfahren der US-PS-4,325,867 hergestellter oder von ATCC HB 91 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) abgeleiteter Anti-(Fibronectin)- Antikörper wird gemäß dem einstufigen Glutaraldehydverfahren von Avrameas, "Immunochem." 6:43 (1 969) mit alkalischer Phosphatase konjugiert.

BEISPIEL 8

Schwangerschaftstest

Eine Probe wird in der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermundes aus dem Vaginalraum entnommen und einem Assay unterzogen, um das Vorhandensein eines nicht beschränkten Schwangerschaftsantigens nachzuweisen. Das Vorhandensein eines solchen nicht beschränkten Schwangerschaftsantigens weist darauf hin, daß die Patientin schwanger ist.
Im Test sind positive und negative Kontrollen enthalten. Die positive Kontrolle ist eine Testprobe mit bekannter Schwangerschaftsantigen-Konzentration, die entsprechend verdünnt ist, um in den Assaybereich zu fallen (20 ng/ml bis 5 ug/ml bei einem Assay auf Monoklonalbasis). Die negative Kontrolle ist ein Probenverdünner. Der Assay- Standard ist eine Probe mit bekannter Schwangerschaftsantigen-Konzentration, das in Probenverdünner reihenverdünnt ist, um eine Standardkurve im Bereich von 20 ng bis 5 ug/ml bereitzustellen.
Probennahme-Tupfer, die die in der Nähe des Muttermundes genommene Testprobe enthalten, werden in 0,75 ml einer Speicherlösung eingetaucht, die aus 0,05 M Tris- HCl, pH 7,4; 0,15 M NaCl, 0,02% NaN&sub3;, 1% BSA, 500 Kallikrein-Einheiten/ml Aprotinin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 5 mM EDTA besteht. Die Tupfer werden für das Assay aus der Lösung entfernt, und die Lösung wird mit 13 000 UpM 5 Minuten lang zentrifugiert, um Teilchenmaterie zu entfernen. Der Überstand enthält die löslichen Schwangerschafts-Antigene, die sich in den Tupfern befanden.
Eine wie in Beispiel 3 hergestellte Mikrotiterplatte wird für das Assay verwendet. 100 ul einer jeden Standard-, Proben-, positiven und negativen Kontrolle werden in getrennte Näpfe gegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wird viermal mit oben beschriebenem Waschpuffer gewaschen.100 ul wie in Beispiel 6 hergestelltes, mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziegen-anti-(hCG) wird mit Konjugatpuffer (0,02 M Tris-HCl, pH 8, 0,3 M NaCl, 0,05% TWEEN 20, 5% BSA, 0,02% NaN&sub3;) auf 1/1000 verdünnt. 100 ul werden in jeden Napf abgegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wird viermal gewaschen, wie zuvor beschrieben. 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (PNPP) wird als Substrat verwendet. Dieses wird in 0,18 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol (AMP)-Puffer, pH 9,5 mit 0,12 mM MgCl&sub2; verdünnt. 100 ul werden in jeden Napf der Mikrotiterplatte abgegeben. Nach 5- minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Reaktionsrate in milli-OD/Min. bei 405 nm auf einem kinetischen V-MAX -Mikrotiterplatten leser (Molecular Devices) abgelesen.
Eine Standardkurve wird konstruiert, indem eine steigende Reaktionsrate mit steigender Schwangerschafts-Antigen-Konzentration in den Standards in Korrelation gesetzt wird. Unbekannte werden direkt aus der Kurve oder unter Verwendung eines vorgegebenen Computerprogramms (Molecular Devices) berechnet. Das Vorhandensein von Schwangerschafts-Antigen in der Testprobe weist auf Schwangerschaft hin.

BEISPIEL 9

Alternative Schwangerschaftstests

Durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 8, wobei jedoch Anti-(hCG)- Antikörper durch anti-(SPI)-Antikörper ersetzt wurden, die wie in den J-PA-59174762 und 59214767 beschrieben hergestellt wurden, ermöglicht den Nachweis von Schwangerschaft durch Bestimmen eines SP1-Schwangerschaftsantigens.
Durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 8, wobei jedoch Anti-(hCG)- Antikörper durch Anti-(EPF)(früher Schwangerschaftsfaktor)-Antikörper ersetzt werden, die nach den Verfahren des Weltpatentes WO 8605498 hergestellt wurden, läßt sich Schwangerschaft durch das Bestimmen von EPF nachweisen.
Durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 8, wobei jedoch Anti-(hCG)- Antikörper durch Anti-(hPL)-Antikörper ersetzt werden, die wie in der US-PS-3,892,841 hergestellt wurden, läßt sich Schwangerschaft durch das Bestimmen von hPL nachweisen.
Durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 8, wobei jedoch Anti-(hCG)- Antikörper durch Anti-(Protein B)-Antikörper ersetzt werden, die wie in der US-PS- 4,5 54,256 beschrieben hergestellt wurden, läßt sich Schwangerschaft durch Bestimmen von Protein B nachweisen.
Durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 8, wobei jedoch Anti-(hCG)- Antikörper durch Anti-(PP13)-Antikörper ersetzt werden, die wie in der US-PS-4,500,451 beschrieben hergestellt wurden, läßt sich Schwangerschaft durch Bestimmen von PP13- Schwangerschafts-Antigen nachweisen.

BEISPIEL 10

Alternative Schwangerschaftstests

Durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 8, wobei jedoch Anti-(hCG)- Antikörper durch Anti-(α-Fötoprotein)-Antikörper ersetzt werden, die wie in Uotila, M. et al., "Mol.Immunol." 17:791 (1980) und Uotila, M. et al., "J.Immunol.Meth." 42:11 (1981) beschrieben hergestellt wurden, läßt sich Schwangerschaft durch Bestimmen von α-Fötoprotein nachweisen.
Durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 8, wobei jedoch Anti-(hCG)- Antikörper durch Anti-(MPI)-Antikörper ersetzt werden, die wie in der EP-A-125514 (21. Nov. 1984) beschrieben hergestellt wurden, läßt sich Schwangerschaft durch Bestimmen von MP1 Schwangerschafts-Antigen nachweisen.
Durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 8, wobei jedoch Anti-(hCG)- Antikörper durch Anti-(PP17)-Antikörper ersetzt werden, die wie in der US-PS-4,468,345 beschrieben hergestellt wurden, läßt sich Schwangerschaft durch Bestimmen von PP17- Schwangerschafts-Antigen nachweisen.
Durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 8, wobei jedoch Anti-(hCG)- Antikörper durch Anti-(PP20)-Antikörper ersetzt werden, die wie in der US-PS-4,592,863 beschrieben hergestellt wurden, läßt sich Schwangerschaft durch Bestimmen von PP20- Schwangerschafts-Antigen nachweisen.
Durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 8, wobei jedoch Anti-(hCG)- Antikörper durch Anti-(PLAP)(Piazenta-alkalische Phosphatase)-Antikörper ersetzt werden, die wie in Millan, J. et al., "PLACENTAL PROTElNS" (S.432) beschrieben hergestellt wurden, läßt sich Schwangerschaft durch Bestimmen von PLAP- Schwangerschafts-Antigen nachweisen.

BEISPIEL 11

Schwangerschaftstest

Eine Probe wird in der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermundes aus dem Vaginalraum entnommen und einem Assay unterzogen, um das Vorhandensein eines fötal beschränkten Antigens nachzuweisen. Das Vorhandensein eines solchen fötal beschränkten Antigens in der Probe weist darauf hin, daß die Patientin schwanger ist.
Im Test waren positive und negative Kontrollen enthalten. Die positive Kontrolle war ein Fruchtwasser mit bekannter Konzentration an fötalem Fibronektin, die entsprechend verdünnt war, um in den Assaybereich (20 ng/ml bis 5 ug/ml für ein Assay auf Monoklonalbasis) zu fallen. Die negative Kontrolle war Probenverdünner. Der Assaystandard war Fruchtwasser mit bekannter Fibronectin-Konzentration, das in einem Probenverdünner reihenverdünnt wurde, um eine Standardkurve im Bereich von 20 ng bis 5 ug/ml zu liefern.
Der Probenverdünner bestand aus 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4; 0,15 M NaCl, 0,02% NaN&sub3;, 1% BSA, 500 Kallikrein-Einheiten/ml Aprotinin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 5 mM EDTA.
In der Nähe des Muttermundes entnommene Tupferproben wurden in 0,75 ml Probenverdünner in einer Sammelphiole eingetaucht. Die Tupfer wurden für das Assay aus der Lösung entfernt, und die Lösung wurde bei 13 000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert, um Teilchenstoffe zu entfernen. Der Überstand enthielt alles im Tupfer befindliche fötale Fibronectin.
Für das Assay wird eine wie in Beispiel 5 vorbereitete Mikrotiterplatte verwendet. 100 ul einer jeden Standard-, Proben-, positiven und negativen Kontrolle wurden in getrennte Näpfe gegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde viermal mit Waschpuffer gewaschen, wie in den Beispielen 4 und 5 beschrieben. 100 ul mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziegen-anti-(menschliches Fibronektin), das wie in Beispiel 7 hergestellt war, wurde in Konjugatpuffer (0,02 M Tris-HCl, pH 8, 0,3 M NaCl, 0,05% TWEEN 20, 5% BSA, 0,02% NaN&sub3;) auf 1/1000 verdünnt. 100 ul wurden in jeden Napf abgegeben und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang inkubiert. Die Platte wurde viermal gewaschen, wie zuvor beschrieben. 4 mg/ml p- Nitrophenylphosphat (PNPP) wurde als Substrat verwendet. Dieses wurde in 0,18 M 2- Amino-2-methyl-1-propanol (AMP)-Puffer, pH 9,5, mit 0,12 mM MgCl&sub2; verdünnt. loopl wurden in jeden Napf der Mikrotiterplatte abgegeben. Nach 5minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsrate in milli-OD/Min. bei 405 nm auf einem kinetischen V-MAX -Mikrotiterplattenleser (Molecular Devices) abgelesen.
Eine Standardkurve wurde konstruiert, indem steigende Reaktionsrate mit steigender Fibronectin-Konzentration in den Standards in Korrelation gesetzt wurde. Unbekannte wurden direkt aus der Kurve oder unter Verwendung eines vorgegebenen Computerproramms (Molecular Devices) berechnet.
Vor der 20. Schwangerschaftswoche erhaltene Proben, die signifikante Mengen an fötalem Fibronectin in der Testprobe zeigen, weisen auf normale Uterusschwangerschaft hin. Proben, in denen keine signifikanten Mengen an fötalem Fibronectin vorhanden sind, weisen darauf hin, daß keine normale Uterusschwangerschaft vorliegt.

BEISPIEL 12

Extrauterinschwangerschaftstest

Das Verfahren von Beispiel 11 wird mit Proben wiederholt, die in der Nähe des Muttermundes einer Patientin mit positivem Schwangerschaftstest entnommen wurden, bei der der Verdacht auf eine Extrauterinschwangerschaft besteht.
Vor der 20. Schwangerschaftswoche entnommene Proben, die keine signifikante Menge an fötalem Fibronectin in der Testprobe zeigen, weisen auf das Vorliegen einer Extrauterinschwangerschaft hin.

BEISPIEL 13

Test auf das Produkt eines ärztlich eingeleiteten Aborts

Während eines ärztlich eingeleiteten Aborts entnommene Proben werden geprüft, um zu verifizieren, daß fötale Stoffe aus dem Uterus entfernt worden sind.
Im Test sind positive und negative Kontrollen enthalten. Die positive Kontrolle, Fruchtwasser mit einer bekannten Konzentration an fötalem Fibronectin, wird in Aufbewahrungslösung auf 1/10, 1/30, 1/90, 1/270, 1/710 und 1/2130 verdünnt. Die Aufbewahrungslösung besteht aus 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4; 0,15 M NaCl, 0,02% NaN&sub3;, 1% BSA, 500 Kallikrein-Einheiten/ml Aprotinin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 5 mM EDTA. Diese Aufbewahrungslösung wird in der am 15. September 1988 eingereichten US-PA-244,969 beschrieben. Die negative Kontrolle ist Plasma der Mutter aus dem ersten Trimenon, das in Aufbewahrungslösung auf 1/5 und 1/10 verdünnt ist. Die Aufbewahrungslösung wird als die negative Hintergrundkontrolle verwendet.
Eine während eines ärztlich eingeleiteten Aborts entnommene Probe aus Gewebe oder anderem Material wird in 0,75 ml Aufbewahrungslösung dispergiert. Die Probenlösungen werden in 1 ml-Microfuge-Röhrchen zentrifugiert (13 000 UpM für 5 Minuten), um Teilchenmaterie zu entfernen.
Eine wie in Beispiel 5 hergestellte Mikrotiterplatte wird für das Assay verwendet. 100 ul einer jeden Standard-, Proben-, positiven und negativen Kontrolle werden in getrennte Näpfe gegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wird viermal mit in Beispiel 4 beschriebenem Waschpuffer gewaschen. 100 ul mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziegen-anti-(hCG), das wie in Beispiel 6 hergestellt wurde, wird in Konjugatpuffer (0,02 M Tris-HCl, pH 8, 0,3 M NaCl, 0,05 Wo TWEEN 20, 5% BSA, 0,02 Wo NaN&sub3;) auf 1/1000 verdünnt. 100 ul werden in jeden Napf abgegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wird viermal gewaschen, wie zuvor beschrieben. 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (PNPP) wird als Substrat verwendet. Dieses wird in 0,18 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol(AMP)-Puffer, pH 9,5 mit 0,12 mM MgCl&sub2; verdünnt. 100 ul werden in jeden Napf der Mikrotiterplatte abgegeben. Nach 5minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Reaktionsrate in milli-OD/Min. bei 405 nm auf einem kinetischen V-MAX -Mikrotiterplattenleser (Molecular Devices Corp., Palo Alto, CA) abgelesen.
Eine Standardkurve wird konstruiert, indem eine steigende Reaktionsrate mit steigender Konzentration an fötal beschränktem Antigen in den Standards in Korrelation gesetzt wird. Unbekannte werden direkt aus der Kurve oder unter Verwendung eines vorgegebenen Computerprogramms (Molecular Devices) berechnet.
In Proben, die Empfängnisprodukte enthalten, sind signifikante Mengen an fötalem Fibronectin zu finden, was das Vorliegen einer normalen Schwangerschaft und deren Beendigung bestätigt. Wenn eine schwangere Patientin keine signifikanten Mengen an fötalem Fibronectin aufweist, weist dies auf die Möglichkeit einer Extrauterinschwangerschaft hin.

BEISPIEL 14

Spontanabort-Test

Das Verfahren von Beispiel 13 wird mit Proben von Vaginalsekret wiederholt, die während eines vermuteten Spontanaborts einer normalen Schwangerschaft erhalten wurden. Proben von einem Spontanabort (Fehlgeburt) zeigen signifikante Mengen an fötalem Fibronectin im Sekret. Wenn fötales Fibronectin nicht in signifikanten Mengen im Sekret festgestellt wird, weist das auf eine fortgesetzte Schwangerschaft hin.

BEISPIEL 15

Sandwich-Immunoassay auf vorzeitige Wehen/Blasensprung

Das Verfahren von Beispiel 13 wird mit einer Testprobe wiederholt, die während der 20.-38. Schwangerschaftswoche entnommen wurde. Das Vorhandensein sign ifikanter Mengen an fötalem Fibronectin in der Probe weist darauf hin, daß die Fruchtblase möglicherweise gesprungen ist und vorzeitige Wehen wahrscheinlich sind.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von und/oder des Stadiums einer Schwangerschaft, umfassend das Nachweisen der Gegenwart (a) einer Verbindung oder eines Stoffes, die/der entweder von Plazentagewebe oder von Gewebe im Uterus der Mutter als Reaktion auf Schwangerschaft gebildet wird und die/der entweder normalerweise nicht in Plasma, Serum oder Harn vorkommt, wenn eine Frau nicht schwanger ist, oder die/der während der Schwangerschaft in erhöhten Mengen im Plasma, Serum oder Harn der Mutter vorhanden ist, (eines "nicht beschränkten Schwangerschafts-Antigens"), oder (b) eines von Fötus oder Plazenta stammenden Stoffs, der entweder nicht oder nicht in signifikanten Mengen im Serum, Plasma oder Harn der Mutter vorkommt, (eines "fötal beschränkten Antigens"), in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe aus dem Vaginalraum in der Nähe des hinteren Scheidengewölbes, dem Cervikalkanal oder dem Muttermund, stammt.

2. Verfahren zum Nachweis von Schwangerschaft im ersten Trimenon, umfassend das Nachweisen der Gegenwart (a) einer Verbindung oder eines Stoffes, die/der entweder von Plazentagewebe oder von Gewebe im Uterus der Mutter als Reaktion auf Schwangerschaft gebildet wird und die/der entweder normalerweise nicht in Plasma, Serum oder Harn vorkommt, wenn eine Frau nicht schwanger ist, oder die/der während der Schwangerschaft in erhöhten Mengen im Plasma, Serum oder Harn der Mutter vorhanden ist, (eines "nicht beschränkten Schwangerschafts-Antigens"), in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe aus der Nähe des Cervikalkanals oder Muttermunds stammt.

3. Verfahren zum Nachweis von normaler Intrauteringravidität in den ersten 20 Wochen der Schwangerschaft, umfassend das Nachweisen des Gegenwart eines vom Fötus oder der Plazenta stammenden Stoffs, der entweder nicht oder nicht in signifikanten Mengen im Serum, Plasma oder Harn der Mutter vorkommt, (eines "fötal beschränkten Antigens"), in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe aus der Nähe des Cervikalkanals oder des Muttermunds stammt.

4. Verfahren zum Nachweis von Eileiterschwangerschaft, umfassend das Nachweisen der Abwesenheit eines vom Fötus oder der Plazenta stammenden Stoffs, der entweder nicht oder nicht in signifikanten Mengen im Serum, Plasma oder Harn der Mutter vorkommt, (eines "fötal beschränkten Antigens"), in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe aus der Nähe des Cervikalkanals oder des Muttermunds einer schwangeren Patientin während der ersten 20 Wochen der Schwangerschaft stammt.

5. Verfahren zum Nachweis von ex vivo-Empfängnisprodukten, umfassend das Nachweisen der Gegenwart eines vom Fötus oder der Plazenta stammenden Stoffs, der entweder nicht oder nicht in signifikanten Mengen im Serum, Plasma oder Harn der Mutter vorkommt, (eines "fötal beschränkten Antigens"), in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe vom Uterus abgegeben oder daraus entnommen wird.

6. Verfahren zum Nachweis erhöhten Risikos von vorzeitigen Wehen oder Fruchtblasensprung, umfassend das Nachweisen der Gegenwart eines vom Fötus oder der Plazenta stammenden Stoffs, der entweder nicht oder nicht in signifikanten Mengen im Serum, Plasma oder Harn der Mutter vorkommt, (eines "fötal beschränkten Antigens"), in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe aus der Nähe des hinteren Scheidengewölbes, dem Cervikalkanal oder dem Muttermund einer Patientin während der ersten 20 Wochen der Schwangerschaft stammt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend

(a) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Anti-(Schwangerschafts- Antigen)-Antikörper über eine ausreichende Zeitspanne, um die Ausbildung der Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen; und

(b) das Nachweisen der Gegenwart dieser Bindung.

8. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 7, umfassend die Schritte:

(a) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem unlöslichen Träger, an dem Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper angebracht wurde, über eine ausreichende Zeitspanne, um die Ausbildung der Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen, und das Entfernen der Probe vom Träger;

(b) das In-Kontakt-Bringen des unlöslichen Trägers mit einem Anti- (Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper über eine ausreichende Zeitspanne, um die Ausbildung der Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen, und das Entfernen von ungebundenem Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper vom Träger; und

(c) das Nachweisen der Gegenwart von Anti-(Schwangerschafts-Antigen)- Antikörper auf dem unlöslichen Träger.

9. Verfahren nach Anspruch 1, 3, 4, 5 oder 6, umfassend die Schritte:

(a) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem unlöslichen Träger, an dem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen angebracht wurde, über eine ausreichende Zeitspanne, um die Ausbildung der Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen, und das Entfernen der Probe vom Träger;

(b) das In-Kontakt-Bringen des unlöslichen Trägers mit einem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen oder gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene über eine ausreichende Zeitspanne, um die Ausbildung der Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen, und das Entfernen von ungebundenem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen vom Träger; und

(c) das Nachweisen der Gegenwart von Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen auf dem unlöslichen Träger.

10. Verfahren nach Anspruch 1, 3, 4, 5 oder 6, umfassend die Schritte:

(a) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem unlöslichen Träger, an dem Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene angebracht wurde, über eine ausreichende Zeitspanne, um die Ausbildung der Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen, und das Entfernen der Probe vom Träger;

(b) das In-Kontakt-Bringen des unlöslichen Trägers mit einem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen über eine ausreichende Zeitspanne, um die Ausbildung der Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen, und das Entfernen von ungebundenem Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen vom Träger; und

11. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 7 oder 8, worin das Schwangerschafts-Antigen aus der aus hCG, hCT, hPL, SP1, PAPP-A, PAPP-B, HSAP, PLAP, CAP, PPS, PAMG&sub1;, PAMG&sub2;, β&sub1;-PAM, α&sub2;-PAM, hCLRF, α-Fetoprotein, EPF, MP1, PP13, PP17, PP20, Somatostatin und Gemischen davon bestehenden Gruppe ausgewählt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, 3, 4, 5, 6, 9 oder 10, worin das in der Probe nachgewiesene fötal beschränkte Antigen fötales Fibronectin ist.

13. Verfahren nach Anspruch 8, 9 oder 10, worin der reagierende Antikörper aus Schritt (b) eine physikalisch nachweisbare Markierung aufweist.

14. Schwangerschafts-Antigen-Test-Set, umfassend Kombinationen einer Probennahm-Vorrichtung zum Ziehen einer Testprobe aus der Nähe des Cervikalkanals oder des Muttermunds mit (a) einem an einem unlöslichen Träger angebrachten Anti- (Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper; (b) einer Kombination von einem an einem unlöslichen Träger angebrachten Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper und entweder einem markierten Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper, einem markierten Antikörper gegen die Klasse der Schwangerschafts-Antigene oder einem markierten reagierenden Schwangerschafts-Antigen; oder (c) einem an einem unlöslichen Träger angebrachten reagierenden Schwangerschafts-Antigen und einem markierten Anti-(Schwangerschafts-Antigen)-Antikörper; wobei ein "Schwangerschafts- Antigen" eine Verbindung oder ein Stoff ist, die/der entweder von Plazentagewebe oder von Gewebe im Uterus der Mutter als Reaktion auf Schwangerschaft gebildet wird und die/der entweder normalerweise nicht in Plasma, Serum oder Harn vorkommt, wenn eine Frau nicht schwanger ist, oder die/der während der Schwangerschaft in erhöhten Mengen im Plasma, Serum oder Harn der Mutter vorhanden ist.

15. Set zum Nachweis eines fötal beschränkten Antigens in einer Testprobe, umfassend Kombinationen einer Probennahme-Vorrichtung zum Ziehen einer Testprobe aus der Nähe des Cervikalkanals oder des Muttermunds und (a) einen Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen und einen Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene oder ein reagierendes fötal beschränktes Antigen, an einem unlöslichen Träger angebracht; (b) eine Kombination von einem an einem unlöslichen Träger angebrachten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen und entweder einem markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen, einem markierten Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene oder einem markierten reagierenden fötal beschränkten Antigen; (c) eine Kombination von an einem unlöslichen Träger angebrachtem Antikörper gegen die Klasse fötal beschränkter Antigene und einem markierten Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen; oder (d) ein an einem unlöslichen Träger angebrachtes reagierendes fötal beschränktes Antigen und ein markierter Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen; wobei ein "fötal beschränktes Antigen" ein entweder vom Fötus oder der Plazenta stammender Stoff ist, der entweder nicht oder nicht in signifikanten Mengen im Serum, Plasma oder Harn der Mutter vorkommt.

16. Set nach Anspruch 14 oder 15, das weiters einen Anti-(Sandwiching-Antikörper)- Antikörper umfaßt.

17. Set, umfassend einen Antikörper gegen fötal beschränktes Antigen und eine Probennahme-Vorrichtung zum Ziehen einer Testprobe aus der Nähe des Cervikalkanals oder des Muttermunds, wobei ein "fötal beschränktes Antigen" ein entweder vom Fötus oder der Plazenta stammender Stoff ist, der entweder nicht oder nicht in signifikanten Mengen im Serum, Plasma oder Harn der Mutter vorkommt.