JPH01195848A - 腟試料試験および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は正常妊娠および子宮外妊娠；妊娠の終了；およ
び早期（ｐｒｅｔｅｒｍ）陣痛および早期羊膜破裂（ｒ
ｕｐｔｕｒｅ　ｏｆ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）の危険増大の
検出用の方法、試薬およびキットに関するものである。

本発明の各具体例には、腟腔より試料を採取してその試
料中の診断指標（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　１ｎｄｉｃａ
ｔｏｒ）の存在または不存在を判定することが包含され
る。

妊娠初期の３箇月中に妊娠を判定する具体例の一つにお
いては、試料を検定して非制限（ｎｏｎｒｅｓｔｒｉｃ
ｔｅｄ）妊娠指標の存在を判定する。

妊娠初期の２０週間中に妊娠を判定する具体例において
は、胎児性制限（ｒｅｓｔｒｉｓｔｅｄ）抗原の存在を
判定する。

子宮外妊娠の判定法は、妊娠初期の２０週中において妊
娠した患者より試料を採取し、試料中の胎児性制限抗原
の不存在を判定することよりなる。

試料中の胎児性制限抗原の不存在は子宮外妊娠の存在を
示す。

本発明は妊娠による生体排出生成物（ｅｘ　ｖｉｖ。

ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の検出に関するものである。特に子
宮組織中の疑似（５ｕｓｐｅｃｔｅｄ）自発妊娠中絶（
流産）または治療的妊娠中絶を経由して子宮より排出ま
たは取り出された子宮組織中の妊娠による生成物を判定
する。

妊娠２０週後の早期陣痛または早期羊膜破裂の危険増加
の検出に関する具体例は、胎児性制限抗原の存在につい
て試料を評価する。

妊娠の判定に関しては広範な試験法が開発されている。

商業的な初期妊娠判定法には一般に尿および血清の検定
が含まれる。尿中のｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン
）に関する家庭内妊娠試験法には、０ないし７日経過後
の（ｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｍ１ｓｓｅｄ　ｐｅｒｉｏ
ｄ）妊娠の指標として有効な多様な酵素免疫学的検定法
、赤血球凝集反応抑制試験法（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ
ａｔｉｏｎ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）　、および抗体標
識凝集試験法が含まれる。特に子宮外妊娠のような異常
妊娠の判定には、医師による確認が推奨される。

ｈＣＧ　は胎児の栄養芽層（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）
で生産され、胎児血液より胎盤の絨毛間空間（１ｎｔｅ
ｒｖｉ１１ｏｕｓ　５ｐａｃｅ）を通って母親の血液に
入る。母体の血液および尿中のｈＣＧ　　レベルはしば
しば約３週間で検出可能となる。ｈＣＧ　の生産量は栄
養芽層組織の量および母体体液中でのｈＣＧ　の希釈度
により決定されるので、血清または尿ｈＣＧ試験法の感
度は限定されたものである。β−ｈＣＧ特異結合抗体（
ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ）の生成までは、ＬＨ（黄体形成ホルモン）と
の交差反応（ｃｒｏｓｓ−ｒｅｃｔｉｏｎ）も感度レベ
ルの点での制限に関係する。

本件発明者らは、子宮頚管または子宮頚部の近傍より取
り出した試料を“妊娠性抗体”、すなわち胎盤組織内で
生産され、女性が妊娠していない場合には正常には体液
（血漿、血清、または尿）中に存在しないか、または妊
娠中に母親の体液中の量が増加する抗原性の、および非
抗原性の化合物または物質に関して試験することにより
、正常子宮妊娠の情況（５ｔａｔｕｓ）が妊娠周期の初
期に高い信頼性を持って判定し得ることを見いだした。

本件発明者らは、子宮頚管または子宮頚部の近傍より採
取した試料を胎児性制限抗原、すなわち、胎盤組織内で
生産され、いかなる実質的な量においても母親の血液に
入らない化合物または物質の存在について試験すること
により、正常子宮妊娠を妊娠周期の初期に、高度の信頼
性を持って判定し得ること見いだした。この類（ｃｌａ
ｓｓ）の抗原には胎児性フィブロネクチン類が含まれる
。

本件発明者らは、子宮頚管または子宮頚部の近傍より採
取した試料を胎児性制限抗原、すなわち、胎盤組織内で
生産され、いかなる実質的な量においても母親の血液に
入らない化合物または物質の存在について試験すること
により子宮外妊娠を判定し得ること見いだした。この類
の物質には胎児性フィブロネクチンが含まれる。非制限
妊娠性抗原についての血液および尿の試験により妊娠に
関する試験が一陽性であるとされた人よりの試料中にお
いて胎児性制限抗原が実質的に抑制されているならば、
子宮外妊娠を示していることになる。

治療的、または自発的妊娠中絶で取り出された子宮組織
内の妊娠による生体排出生成物の存在の判定は、子宮妊
娠およびその終結を確認するために、また、子宮外妊娠
の存在を除外するために決定的に重要である。母親の血
清または尿中の胎盤随伴性（ａｓｓｏｃ　１ａｔｅｄ）
抗原のレベルが妊娠を示しており、かつ、治療的妊娠中
絶中に採取した子宮組織が妊娠による生成物を含有しな
いならば、子宮外妊娠の可能性が示されている。自発的
妊娠中絶の指標に随伴する子宮排出物（ｄｉｓｃｈａｒ
ｇｅ）中の妊娠による生成物の存在は妊娠中絶を確証す
るものであり、一方、その不存在は妊娠の継続を示すも
のである。腟腔より採取した試料中の胎児性随伴抗原の
存在を判定するための通常の免疫学的検定技術は、これ
らの試料が典型的に母親の血液を含有する故に、妊娠に
よる生成物の存在を示すには信頼性がない。非制限胎児
抗原は通常は母親の血液中に、ならびに胎児に、および
胎盤の組織内に存在する。

早産の切迫の判定は、早産による新生児の生存率を増加
させるために決定的に重要である。羊膜破裂の検出は真
の陣痛と誤った陣痛との弁別に重要である。破裂が小さ
く、破水した羊水の体積が少ないならば、破裂はしばし
ば検出されない。羊膜破裂の検出に受は入れられている
方法は十分に敏感でもなく、特定的でもない項目である
。妊娠の２０週間後における早期陣痛および早期の羊膜
破裂の危険増加を検出するための本発明の具体例は１後
’ｌｉｊ　（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ　ｆｏｒｎｉｘ）　、
子宮頚管、または子宮口より採取した試料の評価を指向
している。

本発明の方法は妊娠の存在および／または情況の判定に
使用する。本件方法は、腟腔より採取した試料中の診断
指標の存在の判定に使用し、（ａ）　　子宮頚管または
子宮頚部の近傍で試料を採取し、その試料中の非制限妊
娠性抗原の存在を判定することよりなる、最初の３箇月
中における妊娠判定方法； （ｂ）　　子宮頚管または子宮頚部の近傍の試料を採取
し、その試料中の胎児性制限抗原の存在を判定すること
よりなる、妊娠初期の２０週間中における正常子宮妊娠
の判定方法； （ｃ）　　妊娠初期の２０週間中における妊娠患者より
子宮頚管または子宮頚部の近傍の試料を採取し、その試
料中の胎児性制限抗原の不存在を判定することよりなる
、卵管妊娠の判定方法； （ｄ）子宮より排出された、または取り出されｔ；試料
を採取し、その試料中の胎児性制限抗原の存在を判定す
ることよりなる、妊娠による生体排出生成物の判定方法
；または （ｅ）　　妊娠２０週より後の患者より後穹、子宮頚管
または子宮頚部の近傍の試料を採取し、その試料中の胎
児性制限抗原の存在を判定することよりなる、早期陣痛
または早期羊膜破裂の危険増加の判定方法 よりなる。

妊娠初期の３箇月において正常妊娠を判定するための本
発明の具体例の一つは、試料を採取し、その試料中の非
制限妊娠性抗原の存在を判定することよりなる。試料中
に存在する場合に妊娠の指標となる妊娠性抗原の例はｈ
ＣＧ、ｈＣＴ、ｈＰＬ。

ＳＰＩ、ＰＡＰＰ−Ａ、ＰＡＰＰ−Ｂ、ＨＳＡＰ。

ＣＡＰ、ＰＰ　５、ＰＡＭＧ、、ＰＡＭ、Ｇ、、β１−
ＰＡＭ、　　α、−ＰＡＭ１ｈＣＬＲＦ、ソマトスクチ
ン、ＭＰＩ、ＰＰ　　１３、ＰＰ２０、タンパク質　Ｂ
等である。妊娠性抗原に関して試験する本発明の具体例
は一般に、試料中の妊娠性抗原を抗妊娠性抗原抗体と、
抗原抗体結合を起こさせるのに十分な時間相互作用させ
、土泥の結合の存在または不存在を判定することよりな
る。

妊娠初期の２０週間において正常妊娠を判定するための
具体例は、試料を採取し、その試料中の胎児性制限抗原
の存在を判定することよりなる。

胎児性制限抗原の一つは胎児性フィブロネクチンである
。胎児性制限抗原は母親の血漿または血清中には有意の
量で存在しないので、この具体例の方法は、試料が母親
の血液で汚染されている場合にも信頼性がある。試料中
の胎児性制限抗原を検定して正常妊娠を試験する具体例
は一般に、試料を抗胎児性制限抗原類抗体と、抗原抗体
結合を起こさせるのに十分な時間相互作用させ、上記の
結合の存在または不存在を判定することよりなる。

妊娠初期の２０週間において子宮外妊娠を判定するため
の具体例は、妊娠している患者より試料を採取し、その
試料中の胎児性制限抗原の存在を判定することよりなる
。試料中の胎児制限抗原を検定して子宮外妊娠を試験す
る具体例は一般、に、試料を抗胎児性制限抗原類抗体と
、抗原抗体結合を起こさせるのに十分な時間相互作用さ
せ、上記の結合の存在または不存在を判定することより
なる。

子宮より取り出された、すなわち、拡張および掻爬（ｄ
ｉｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｒｅｔｔａｇｅ　（Ｄ　
＆　Ｃ）　）中の、または治療的もしくは疑似自発妊娠
中絶中の子宮より引き出したと考えられる組織試料中の
妊娠による生成物の存在を判定するための本発明の具体
例は、試料中の胎児性制限抗原の存在を判定することよ
りなる。試料中の胎児制限抗原を検定して妊娠による生
体排出生成物に関して試験する具体例は一般に、試料を
抗胎児性制限抗原類抗体と、抗原抗体結合を起こさせる
のに十分な時間相互作用させ、上記の結合の存在または
不存在を判定することよりなる。

妊！　２０週間より後の羊膜破裂または゛早産の危険増
大を判定するための具体例は、試料を採取し、その試料
中の胎児性制限抗原の存在を判定することよりなる。試
料中の胎児性制限抗原を検定して早期の陣痛および羊膜
破裂の危険増大を試験する具体例は一般に、試料を抗胎
児性制限抗原類抗体と、抗原抗体結合を起こさせるのに
十分な時間相互作用させ、上記の結合の存在または不存
在を判定することよりなる。

本発明記載の検定に使用する試薬には標識した、または
未標識の抗妊娠性抗原抗体、たとえば抗−（ｈＣＧ）抗
体、抗−（ｈＰＬ）抗体等が含まれる。

本発明記載の検定に使用する他の試薬には抗妊娠性抗原
抗体、たとえば抗−（ｈＣＧ）抗体等が付着している不
溶性担体が含まれる。標識した、または未標識の試薬妊
娠性抗原もまた、本発明記載の試薬である。本発明記載
の検定に使用する試薬にはまた、試薬分析剤（ｒｅａｇ
ｅｎｔ　ａｎａｌｙｔａ）が付着している不溶性担体、
すなわち妊娠性抗原が付着している担体も含まれる。

本発明記載の検定に使用する試薬には標識した、または
未標識の杭分析剤抗体、すなわち抗胎児性制限抗原類抗
体、たとえば抗胎児性フィブロネクチン抗体；抗分析剤
類抗体、すなわち抗胎児性制限抗原類抗体、たとえば抗
フィブロネクチン抗体等が含まれる。本発明記載の検定
に使用する他の試薬には抗分析剤抗体１．すなわち抗胎
児性制限抗原類抗体、たとえば抗胎児性フィブロネクチ
ン抗体；杭分析剤類抗体すなわち抗胎児性制限抗原類抗
体、たとえば抗フィブロネクチン抗体等が付着している
不溶性担体が含まれる。標識した、または＊標識の胎児
性制限抗原もまた、本発明記載の試薬である。本発明記
載の検定に使用する試薬にはまた、反応性分析剤が付着
している不溶性担体、すなわち胎児性制限抗原が付着し
ている不溶性担体も含まれる。

本発明には単独の、または標識抗体との組合わせでの上
記試薬の１種よりなるキットが含まれる。

上記の試薬はキット中で適当な形状、たとえば容器、包
み等のいかなるものに入れた形状でも存在し得る。

妊娠の存在および／または情況を判定するための本発明
記載の方法は後穹、子宮頚管または子宮頚部の、特に子
宮頚管または子宮頚部の近傍の腟腔より採取した試料中
の診断指標、特に非制限妊娠性抗原または胎児性制限抗
原の存在を判定することよりなる。

本発明の個々の具体例は正常子宮妊娠、子宮外妊娠、治
療的または自発妊娠中絶の発生、および早期陣痛または
羊膜破裂の危険増大の判定に使用する。

非制限妊娠性抗原試験 本発明の具体例の一つには妊娠を判定すべき試料中の妊
娠性抗原の検出が含まれる。本件発明者らは、検出可能
な量のこれらの物質が妊娠初期の３箇月において子宮頚
管または子宮頚部の近傍で採取した試料中に存在し、ま
た、妊娠初期のこれらの試料中に検出し得る量で見いだ
されるであろうことを発見した。

本件明細書中において使用する“妊娠性抗原”の語は、
妊娠に対する反応として胎盤組織により、または子宮内
の母体組織により形成され、その形成に続いて本発明に
従って試料採取した物質中に存在する抗原性の、または
非抗原性の化合物または物質を意味するものとして定義
される。妊娠を判定するために検定する妊娠性抗原は非
制限的な、すなわち母親の血漿、血清または尿中に有意
の量で存在するものである。本発明以前にも、母親の血
清、血漿または尿をこれらの物質の存在について試験し
て、妊娠を判定していた。これらの物質、たとえばｈＣ
Ｇ　の生産量が胎盤組織の量により制限されている故に
、着床に続く最初の数日間における生産量は少量であり
、母親の体液により急速に希釈される。子宮頚管または
子宮頚部の近傍で採取した試料中に現れる妊娠性抗原は
母親の体液による大希釈を受けたものではなく、明らか
に子宮腔内の胎盤組織および母体組織により生産され、
放出されたものであり、着床、すなわち桑実胚（受精卵
）の子宮内膜への付着のほとんど直後に検出可能な量で
存在する。本件明細書中で使用する“妊娠性抗原”の語
には抗原性物質、タンパク質、および、その純粋な形状
では抗原性ではないが、抗原が選択的に結合し得る独特
な末端構造（ｅｐｉｔｏｐｅ）を有する他の物質も含ま
れる。

同定（１ｄｅｎｔｉｆｙ）された妊娠性抗原はヒト絨毛
性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト絨毛性チロトロピン
（ｈＣＴ）、ヒト胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）、妊娠特
異性糖タンパク質１または妊娠特異性β−糖タンパク質
（ＳＰＩ）、妊娠随伴性血漿タンパク質Ａ　（ＰＡＰＰ
−Ａ）　、妊娠随伴性血漿タンパク質Ｂ　（ＰＡＰＰ−
Ｂ）　、熱安定性アルカリ７オスフアターゼ（Ｈ３ＡＰ
）（Ｓ、Ｉ　　およびＦ表現型）、シスチンアミノペプ
チダーゼ（ｃＡＰ）、胎盤タンパク質５（ＰＰ５）、胎
盤特異性α１−ミクログロプリン（ＰＡＭＧ、）、胎盤
随伴性ａ、−ミクログロブリン（ＰＡＭＧｚ）、妊娠随
伴性β１−マクログロブリン（β、−ＰＡＭ）　、妊娠
随伴性　α２−マクログロブリン（α、−ＰＡＭ）、ヒ
ト絨毛性黄体形成ホルモン放出因子（ｈＣＬ　ＲＦ）、
ヒト絨毛性チロトロピン放出ホルモン（ｈＣＴＲＦ）　
、ヒト絨毛性成長ホルモン放出抑制ホルモン（ソマトス
タチン）、胎盤タンパク質　ＰＰ　２０およびＰＰ１３
、タンパク質Ｂ１ならびに初期妊娠性因子（ＥＰＦ）で
ある。これらのいずれもが胎盤により生産され、精製さ
れた、十分に特性を調査したタンパク質である。

本件明細書中で使用する“抗体″の語は分類ＩｇＧ、Ｉ
ｇＭ％　ＩｇＢ、ＩｇＡ、ＩｇＤ　およびＩｇＨの抗体
、ならびに抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２分画を含
む抗体の選択的結合分画および抗体の混成（ｂｙｂｒ　
ｉｄ）誘導体を包含するものとして定義される。抗体は
ポリクローンのものであってもモノクローンのものであ
ってもよい。一般に、モノクローン抗体が本発明記載の
検定に使用するのに好ましい。

免疫学的方法はその特異性の故に本発明記載の検定の実
施に最も便利であり、本件明細書中で使用する“免疫学
的検定法”の語は抗原と、その抗原の末端構造と選択的
に結合する第２の物質（すなわち結合相手、通常は抗体
または抗原結合部位を有する抗体分画）との選択的結合
を用いるいかなる方法をも意味するものとして定義され
る。本件明細書中で使用する選択的結合とは、選択的な
、かつ、一般には特異的な、一般には１０％未満の、好
ましくは５％未満の交差反応的非特異性結合を示す結合
成分間の結合を表す語である。

本発明の範囲内にはたとえばサンドウィッチ法、競争法
（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）　、浸漬棒法（ｄｉｐ　５
ｔｉｃｋ）、アグロメレーション法、沈澱法、トランジ
スターブリッジグローブ法、粒子選別法（ｐａｒｔｉｃ
ｌｅ　ｓｏｒｔｉｎｇ）　、光擾乱法（ｌｉｇｈｔ　ｄ
ｉｓｔｕｒｂｉｎｇ）　、光散乱法、および超音波プロ
ーブ免疫検定法を含むがこれらに限定されるものではな
い、この段階を含む全ての免疫学的検定法が包含される
。適当な免疫学的検定法には、たとえば放射性同位体、
酵素または蛍光原性物質、発色原性物質もしくは化学発
光性物質を標識として使用することができる。

検定すべき試料を子宮頚管または子宮頚部の近傍で採取
し、この試料を検定して試料中の妊娠抗原の存在または
量を測定する。この試料は一般に液体および微粒状固体
よりなり、腟粘液もしくは頚管粘液、他の腟もしくは頚
管分泌物、細胞もしくは細胞破片、羊水、または他の胎
児性もしくは母体性物質を含有し得る。試料はダクロン
または他の繊維のチップを有するスワブ、アスピレータ
−１吸引手段、洗浄手段等を用いて採取し、適当な貯蔵
容器に移し、試験室に運ぶ。

試料組成物中では不安定な、敏感なタンパク質分析剤を
保存し得る液体中に試料を分散させることが重要である
。この貯蔵および輸送用の媒体は貯蔵および輸送中にお
けるタンパク質分析剤レベルの低下を防ぐものでなけれ
ばならない。貯蔵および輸送用の適当な保存溶液は０．
０５Ｍ１−リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４；　０．１５　Ｍ
　ＮａＣ１，０，０２％ＮａＮ、、１％　ＢＳＡ、５０
０力リクレイン単位／ｍＱのアプロチニン、１ｍＭ　　
フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）および５
ｍＭＥＤＴＡ　よりなり、１９８８年９月　１５日に受
理された米国特許出願環２４４．９６９号に記載されて
いる。

妊娠性抗原の検出は、子宮頚管または子宮頚部の近傍で
採取した試料中の妊娠性抗原を、妊娠性抗原の末端構造
に選択的に結合する抗体と結合させ、この結合の存在を
判定して達成することができる。

本発明のサンドウィッチ免疫検定法の具体例においては
、試料を抗妊娠性抗原抗体が付着している不溶性担体と
接触させて、試料中の妊娠性抗原の結合と捕捉とを実現
させる。ついで、この不溶性担体を、不溶性担体に付着
している妊娠性抗原と結合する未標識の、または標識し
た抗体と接触させて、捕捉された妊娠性抗原、すケわち
二次（５ｓｃｏｎｄａｒｙ）抗体を標識し、測定する。

たとえば抗−（ｈＣＧ）抗体は不溶性担体に付着させる
ことができ、標識した、または未標識の抗−（ｈｃｃ）
抗体は捕捉したｈＣＧ抗原の標識に使用することができ
る。二次抗体は物理的に検出可能な標識を有することが
でき、これを不溶性担体上で直接に測定することができ
る。これに替えて二次抗体を標識しないこともでき、こ
の二次抗体は、二次抗体と選択的に結合する標識した抗
体または抗体分画を有する不溶性担体と接触させ（すな
わち三次（ｔｅｒｔ　１ａｒｙ）抗体）、未結合の標識
三次抗体を担体より分離し、不溶性担体上の標識の存在
を測定して判定することができる。膜状基質を用いるサ
ンドウィッチ免疫検定法の使用が適当である。

上述のものに替えて、試料を競争免疫検定法により試験
する。試料は標識試薬抗体または抗原と混合し、抗妊娠
性抗原抗体または試薬妊娠性抗原を付着させた不溶性担
体とともに培養することができる。試薬との間に試料分
析剤との結合に関する競争が起きる。この種の免疫学的
検定法を実行する方法および手順は免疫学的検定技術の
熟練者には周知されている。不溶性担体に最後まで結合
している標識または溶液に残留している標識を測定する
。

抗−（ｈＣＧ）ポリクローン抗体およびその製造は米国
特許第３．１７１．７８３．３，２３４，０９６．３，
２３６．７３２および３，３０９．２７５号に記載され
ている。抗−（ｈＣＧ）モノクローン抗体およびその製
造は世界特許Ｗ０８４０４５９８、日本特許出願６２０
４６２６２　（、１９８７年２月２８日）およびヨーロ
ッパ特許比ＩＩ　２１０８６３（１９８７年２月４日）
に記載されている。抗−（β−ｈＣＧ）抗体およびその
製造は米国特許第４．１１６．７７６．４．１２３．５
０９．４，２３４，５６１．４，２５６，６２９．４．
２６８，４３５．４．３１０４５５、および４，３１３
．８７１号に記載されている。

他の公知の妊娠特異的指標およびこれと選択的に結合す
る抗体は文献および特許に広く報告されている。たとえ
ば抗−（ＳＰＩ）抗体およびその製造は日本特許出願５
９１７４７６２および５９２１４７６７に、ならびにエ
ングバル（Ｅ、　Ｅｌｇｖａｌｌ）ら、癌研究（ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　　（１９８２）に記載されている
。α−フェトタンパクおよびその製造はウオチラ（ＩＪ
。

Ｕｏｔｉｌａ）ら１分子免疫学（Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、）　１７　ニア９１　（１９８０）およびウオチ
ラ（Ｍ、　Ｕｏｔｉｌａ）ら、免疫学方法論雑誌（Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、）　４２：　１１（１
９８１）に記載されている。抗−（ＥＰＦ（初期妊娠性
因子））抗体およびその製造は世界特許Ｗ０８６０５４
９８に記載されている。抗−（ｈＰＬ（ヒト胎盤ラクト
ゲン因子））抗体はその製造とともに米国特許筒３，８
９２．８４１号に記載されている。抗体選択結合性タン
パク質Ｂは米国特許筒４．５５４．２５６号に記載され
ている。抗−（ＭＰＩ（膜随伴性胎盤タンパク質））抗
体はヨーロッパ特許用ＩＥ［１２５５１４（１９８４年
１１月２１日）に記載されている。抗−（ＰＰ１３（胎
盤特異性タンパク質））抗体およびその製造は米国特許
筒４．５００．４５１号に記載されている。抗−（ｐｐ
１７）抗体およびその製造は米国特許筒４，４６８，３
４５号に記載されている。抗−（ＰＰ２０）抗体および
その製造は米国特許筒４．５９２，８６３号に記載され
ている。抗−（ＰＬＡＰ　（胎盤アルカリフォスファタ
ーゼ））抗体およびその製造はミラン（Ｊ、　Ｍｉｌｌ
ａｎ）ら、胎盤タンパク質（Ｐｌａｃａｎｔａｌ　Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ）　　（上掲、４３２ページに引用）に記
載されている。ニストロジエン（エストリオール）と結
合する抗体およびその製造はヨーロッパ特許用＠　１７
８．６８３　（１９８６年４月２３日）に記載されてい
る。プロゲステロンと結合する抗体はハンガリア特許出
願Ｔ　３７０２８（１９８５年１１月２８日）に記載さ
れている。

抗妊娠性抗原抗体は妊娠性抗原から、好ましくは高度に
精製した妊娠性抗原から、通常の抗血清技術またはモノ
クローン技術により得ることができる。本発明は、本件
明細書中において妊娠性抗原としてのヒト絨毛性ゴナド
トロピン（ｈＣＧ）の検出に関して記述するが、明瞭性
の目的のためであって、限定のためのものではない。い
かなる妊娠性抗原の検出も本発明の範囲内のものと考え
られる。抗＝（ｈＣＧ）抗体の製造に関しては上に記述
しである。

モノクローンおよびポリクローン抗妊娠性抗原抗体の双
方とも、妊娠性抗原から、好ましくは高度に精製した抗
原から通常の抗血清技術またはモノクローン技術により
直接に誘導することができる。

本発明記載の検定法に有用な主要な抗体はＩｇＧ　およ
び　ＩｇＭ抗体であるが、ＩｇＤ。

ＩｇＥ　　および　ＩｇＡ　抗体も十分な量入手し得る
ならば使用することができる。これらの抗体は、たとえ
ばミシエル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびシルギ（ＳｈｉＩ
ｇｉ）　、細胞免疫学の方法（Ｓｅｌｅｄｔｅｄ　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ）、サンフランシスコニ７リーマン（Ｆｒｅｅｍａ
ｎ）　　（１９８０）　、ゴディング（Ｊ、Ｇ。

ｄｉｎｇ）　＋モノクローン抗体：原理と実際（Ｍｏｎ
ｏｃ　１ｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ｐｒ１
ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）　＝　ニ
ーヨーク：アカデミツクプレス、　１１１−１１４ペー
ジ（１９８３）　、ならびにパリク（Ｐａｒｉｋｈ）ら
、Ｃ＆ＥＮ（１９８５年８月２６日）に記載されている
ような通常の親和性（ａｆＩｉｎｉｔｙ）クロマトグラ
フィー技術を用いて親和性精製する。

本発明記載のキットおよび方法における使用に適した選
択的結合抗体分画は、個々のモノクローン抗体またはポ
リクローン抗体がら通常の酵素的または化学的分画法に
より製造することができる。

適当な方法は、たとえばティーラセン（Ｐ、　Ｔｉｊｓ
ｓｅｎ）　、生化学および分子生物学における実験室技
術：酵素免疫検定法の実際と理論（Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ。

１ｏｇｙ　：　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒ
ｉｅｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎ。

ａｓｓａｙｓ）　、　−１−ユーヨーク：エルゼビア（
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）（１９８５）に記載されている。ポ
リクローン抗妊娠性抗原抗体はウサギ、モルモット、ラ
ットまたはヤギのような動物に、濃縮した妊＊ｔ！：抗
原、たとえばｈＣＧに対する免疫性を与え、免疫性を得
た動物から血清を採取し、たとえば硫酸アンモニウム沈
澱法により血清からイムノグロブリンを分離して得るこ
とができる。

親和性クロマトグラフィーにおける使用に適した吸収剤
には、抗妊娠性抗原抗体が共有結合している架橋アガロ
ースおよび架橋ポリアクリルアミドが含まれる。他のホ
ルモンまたは組織と交差反応する抗体を除去するには、
これらの物質が結合するカラムに抗体血清を通す。つい
で、溶離液の残留抗体を含有する部分をｈＣＧ　のカラ
ムに通し、溶離して親和性精製した抗体を得ることがで
きる。

これらの工程においては、リン酸塩緩衝溶液を加えた食
塩水中でカラムに抗体溶液を適用し、ｐＨ８，０の２．
５　Ｍ　ＮａＳ　ＣＮ　溶液を用いて抗体を溶離するこ
とができる。所望ならば、負圧透析（ｎｅｇａｔｉｖｅ
　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｄｉａｌｙｓｉｓ）または超遠心
により抗体を濃縮することができる。この抗体溶液は４
°Ｃ１またはそれ以下の温度で安定である。所望の分離
と純度とが達成されるまで、カラム分離工程の反復を継
続する。　− モノクローン抗妊娠性抗原抗体は、マウスに妊娠性抗原
に対する免疫性を持たせて混成用の牌臓細胞を得る、ゴ
ーフル（Ｇａｌｆｒｅ）およびミルシュタイン（ｕｉ＋
５ｔｅｉｎ）＋酵素学の方法（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ
、）７３　：　ｌ　（１９８１）の方法により得ること
ができる。

適当な方法はゴディング（Ｊ、　Ｇｏｄｉｎｇ）　＋モ
ノクローン抗体：原理と実際、　５６−９７ページに記
載されている。

サンドウィッチ免疫検定法：試料中の妊娠性抗原を測定
するための本発明記載のサンドウィッチ免疫検定法の具
体例においては、抗妊娠性抗原抗体が付着している不溶
性担体を水性緩衝溶液、たとえばｐＨ６ないし８、好ま
しくは７．２ないし７．６のリン酸塩緩衝溶液（Ｐ　Ｂ
　Ｓ）で希釈した試料と、試料中の妊娠性抗原を不溶性
担体上の抗妊娠性抗原抗体と結合させるのに十分な時間
接触させる。ついで、試料を担体から取り出す。培養時
間はかなりの結合を生じさせるのに十分なものであるべ
きであり、温度に応じて変化する。適当な培養時間は、
１６ないし４０℃の範囲の温度では３０ないし２４０分
であり、好ましい接触時間は２０ないし２６°Ｃの範囲
の温度で少なくとも６０分である。

ついで、洗浄溶液を用いて残留試料溶液を担体より取り
出す。通常の洗浄溶液のいかなるものも使用することが
できる。適当な洗浄溶液は米国特許筒４．５２８．２６
７号に記載されている。この洗浄溶液は、０．０００１
ないし０．０５のリン酸塩モル濃度と６ないし８のｐＨ
とを有し、０．００１ないし０．１重量％の非イオン性
界面活性剤を含有する水性りン酸塩緩衝溶液である。適
当な非イオン性界面活性剤にはポリオキシエチレンエー
テル（ＢＲＩＪ、にとえばラウリル、セチル、オレイル
、ステアリル、およびトリデシルポリオキシエチレンエ
ーテル）；ポリオキシエチレンソルビタン（トゥイーン
（Ｔｗｅｅｎ）　、たとえば−ラウリン酸、−パルミチ
ン酸、−ステアリン酸、−オレイン酸、および三オレイ
ン酸ポリオキシエチレンソルビタール）；ならびに他の
ポリオキシエチレンエーテル（たとえばトリトン（Ｔｒ
ｉｔｏｎ）　）が含まれる。好ましい非イオン性界面活
性剤は、４０個の酸化エチレン単位を有するオクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール（トリトン　Ｘ−４０
５、ローム・アンド・ハース社）で゛ある。

ついで、不溶性担体を、その不溶性担体上に捕捉された
妊娠性抗原と結合する抗体、すなわちサンドウィッチ抗
体と接触させる。サンドウィッチ抗体は標識しであるも
のであっても未標識のものであってもよい。未標識のサ
ンドウィッチ抗体を使用する場合には、サンドウィッチ
抗体と結合し、物理的に検出可能な標識を保持する三次
抗体を、通常の手法でサンドウィッチ抗体の測定に使用
することができる。

本件明細書には多様な標識が記述される。明瞭性の目的
で、しかし限定のためではなく、本件方法の次の各段階
を酵素、好ましくは発色原性または蛍光原性酵素で標識
した抗妊娠性抗原抗体に関して記述する。本件明細書中
においては、°“発色原性酵素”の語は適当な基質と反
応して発色団生成物を生成する酵素を表すものとして定
義される。

本件明細書においては、′蛍光原酵素”の語は適当な基
質と反応して蛍光団生成物を生成する酵素を表すものと
して定義される。

水溶液中で、不溶性担体にサンドウィッチ抗体を付着さ
せる。この溶液は好ましくは、反応剤を保存し、結合反
応を容易にするために、適当な塩および緩衝剤を含有す
る。この溶液はたとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
、リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）、および穏和な界面活性
剤、たとえば上記の洗浄溶液中に使用するポリオキシエ
チレンソルビタンエステルを含有することができる。培
養はサンドウィッチ抗体を、いかなるものにせよ、不溶
性担体に付着している暴露された妊娠性抗原末端構造と
結合させるのに十分な時間継続する。

好ましい培養時間はおよび温度は、不溶化された試薬抗
妊娠性抗原抗体と妊娠性抗原との結合に関して述べたも
のと同様である。ついで、不溶性担体からサンドウィッ
チ抗体溶液を取り出し、担体をたとえば上記の洗浄溶液
で洗浄して、残留している非結合物質があれば、これを
除去する。

サンドウィッチ抗体が未標識のものであれば、酵素標識
抗体またはサンドウィッチ抗体と選択的に結合する他の
結合剤を水溶液中で不溶性担体に適用する。この溶液は
好ましくは、反応剤を保存し、結合反応を容易にするた
めに、たとえば上記のような適当な塩および緩衝剤を含
有する。培養は、標識した抗サンドウ、イッチ抗体抗体
を、いかなるものにせよ、不溶性担体に付着している暴
露されたサンドウィッチ抗体末端構造と結合させるのに
十分な時間継続する。好ましい培養時間はおよび温度は
、不溶化された試薬抗妊娠性抗原抗体と試料妊娠性抗原
との結合に関して述べたものと同様である。ついで、不
溶性担体から標識抗体溶液を取り出し、担体をたとえば
上記の洗浄溶液で洗浄して、残留している非結合物質が
あれば、これを除去する。

サンドウィッチ法の次の段階においては、不溶性担体を
酵素の存在下で反応して溶液中に蛍光体化合物または発
色厚化合物を放出する基質の水溶液と接触させる。適当
な基質とこれを転化させることのできる酵素とは、ｊ；
とえば米国特許第４．１９０．４９６および４，５２８
．２６７号に記載されている。担体を　１０−ないし１
０−”モル濃度の基質を含有する基質水溶液と接触させ
る。ｉｏ−’ないし１０−Ｓの基質モル濃度が好ましい
。基質溶液中の好ましい付加的な試薬および緩衝剤には
、たとえば２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール
緩衝剤、トリス（Ｔｒｉｓ）　、および塩化マグネシウ
ムが含まれる　。

基質溶液を不溶性担体とともに、蛍光体または発色団を
得る反応を起こさせるのに十分な時間培養する。１８な
いし４０’Ｏの温度でにおいては５ないし２４０分の培
養時間を使用し得る。この温度は好ましくは２０ないし
２６℃の範囲であり、培養時間は３０ないし９０分であ
る。

ついで、溶液中の蛍光体または発色団のレベルを測定す
る。基質溶液中の蛍光体レベルまたは発色団レベル測定
用の装置および手順は当該技術で通常使用されるもので
ある。溶液中の蛍光体または発色団のレベルは不溶性担
体上の酵素濃度に依存し、後者はさらに試料中の妊娠性
抗原の量に依存する。妊娠性抗原の濃度は、溶液の蛍光
体または発色団のレベルを、それぞれ、既知濃度の妊娠
性抗原を含有する対照溶液で得た蛍光体または発色団の
レベルと比較することにより測定する。

膜免疫検定：試料中の妊娠性抗原を測定する本発明記載
の膜免疫検定の具体例においては、抗妊娠性抗原抗体が
付着している不溶性担体を水性緩衝溶液、たとえばｐＨ
６ないし８の、好ましくは７．２ないし７．６のリン酸
塩緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で希釈した試料と、試料中の
妊娠性抗体を不溶性担体上の抗妊娠性抗原抗体と結合さ
せるのに十分な時間接触させる。結合に必要な時間は、
流通系においては極めて短い。適当な培養時間は、１６
ないし４０°Ｃの範囲の温度では１秒ないし２０分以内
が可能で、この場合の好ましい接触時間は１分以内であ
り、最適培養時間は１０秒ないし２分である。

ついで、不溶性担体を、この不溶性担体上に捕捉された
妊娠性抗原と結合する抗体、即ちサンドウィッチ抗体と
接触させる。サンドウィッチ抗体は標識したものであっ
ても未標識のものであってもよい。未標識のサンドウィ
ッチ抗体を使用する場合には、サンドウィッチ抗体と結
合し、物理的に検出可能な標識を保持する三次抗体を使
用して、通常の手法でサンドウィッチ抗体を測定するこ
とができる。

本件明細書には種々の標識が記載されている。

明瞭性の目的で、しかし限定のためではなく、本件方法
の次の各段階を酵素、好ましくは蛍光原性または発色原
性酵素により標識された抗妊娠性抗原抗体に関して記述
する。

サンドウィッチ抗体を水溶液中で不溶性担体に適用する
。この溶液は好ましくは、反応剤を保存し、結合反応を
容易にするために、適当な塩および緩衝剤を含有する。

この溶液はたとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、リ
ン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）、および穏和な界面活性剤、
たとえば上記の洗浄溶液中に使用するポリオキシエチレ
ンソルビタンエステルを含有することができる。培養は
、サンドウィッチ抗体を、いかなるものにせよ、不溶性
担体に付着している暴露された妊娠性抗原末端構造と結
合させるのに十分な時間継続する。好ましい培養時間は
および温度は、不溶化された試薬妊娠性抗原抗体と試料
妊娠性抗原との結合に関して述べたものと同様である。

任意に、不溶性担体からサンドウィッチ抗体溶液を取り
出すことができ、担体をたとえば上記の洗浄溶液で洗浄
して、残留している非結合標識物質があれば、これを除
去する。

サンドウィッチ抗体が未標識のものであれば、酵素標識
抗体またはサンドウィッチ抗体と選択的に結合する他の
結合剤を水溶液中で不溶性担体に適用する。この溶液は
好ましくは、反応剤を保存し、結合反応を容易にするた
めに、たとえば上記のような適当な塩および緩衝剤を含
有する。培養は、標識した抗サンドウィッチ抗体抗体を
、いかなるものにせよ、不溶性担体に付着したサンドウ
ィッチ抗体の末端構造と結合させるのに十分な時間継続
する。好ましい培養時間はおよび温度は、不溶化された
試薬抗サンドウィッチ抗体抗体と試料妊娠性抗原との結
合に関して述べたものと同様である。

ついで、不溶性担体から標識抗体溶液を取り出し、担体
をたとえば上記の洗浄溶液で洗浄して、残留している非
結合標識物質があれば、これを除去する。

本発明記載の膜サンドウィッチ法の次の段階においては
、不溶性担体を、酵素の存在下に反応して蛍光原性化合
物または発色原性化合物を溶液中に放出する基質の水溶
液と接触きせる、適当な基質およびこれを転化させ得る
酵素、ならびに付加的化合物および緩衝剤は上に記述し
である。

基質溶液を不溶性担体とともに、蛍光体または発色団を
得る反応が起こるのに十分な時間培養する。１８ないし
４０℃の温度においては１ないし２０分の培養時間を使
用することができる。好ましくは、温度は２０ないし２
６℃の範囲であり、培養時間は２ないし５分である。膜
上の蛍光原または発色原のレベルは反射計または光学密
度計により測定することができる。

競争免疫検定法：標識試薬妊娠性抗原を用いる本発明記
載の競争法の具体例は、試料と標識試薬妊娠性抗原との
混合物を不溶性担体に付着している抗妊娠性抗原抗体と
接触させ、不溶性担体と結合する、または溶液相に残留
する標識の量を測定することよりなる。

標識抗妊娠性抗原抗体を用いる本発明記載の競争法の具
体例は複数の形態が可能である。不溶性担体に結合して
いる抗妊娠性抗原抗体を用いる具体例の一つは、試料と
標識抗妊娠性抗原抗体との混合物を不溶性担体に付着し
ている抗妊娠性抗原抗体と接触させ、不溶性担体と結合
する、または溶液相に残留する標識の量を測定すること
よりなる。不溶性担体に結合している試薬妊娠性抗原を
用いる具体例の他の一つは、試料と標識抗妊娠性抗原抗
体との混合物を不溶性担体に付着している妊娠性抗原と
接触させ、不溶性担体と結合する、または溶液相に残留
する標識の量を測定することよりなる。

これらの方法のいずれにおいても、試料をサンドウィッ
チ免疫検定法の具体例に関して上に記述したものと同様
にして緩衝溶液で希釈し、培養し、標識測定する。不溶
性担体上に、または溶液中に残留する標識の量は試料中
の分析剤の量に依存して変化するものとして、制限試薬
の濃度は試薬間で競争的に結合を起こさせるように選択
する。これらの方法は一般に周知のものであり、工程の
最適化のためにこれらをどのように変更するかは、完全
に免疫学的検定法の熟練者の知識の範囲内にある。

抗妊娠性抗原抗体と試料中の妊娠性抗原との結合はまた
、試料中の妊娠性抗原により抗妊娠性抗原抗体が付着し
た粒子の集積、抗原抗体反応による抗体の沈澱、または
、半導体ブリッジプローブ、たとえば米国特許第４．６
４７．５４４号に記載された光擾乱パターン等を用いる
、抗原抗体反応に起こる物理的もしくは電気的変化の観
測によっても判定することができる。

試料中の非制限妊娠性抗体の存在の判定は妊娠を示す。

本発明の範囲内に包含される非制限妊娠性抗原試駆キッ
トには、試料採取手段と、（ａ）不溶性担体に付着して
いる抗妊娠性抗原抗体；　（ｂ）不溶性担体に付着して
いる抗妊娠性抗原抗体と標識抗妊娠性抗原抗体もしくは
標識試薬妊娠性抗原との組合わせ；または（ｃ）不溶性
担体に付着している試薬妊娠性抗原および標識抗妊娠性
抗原抗体との組合わせが含まれる。

本発明記載のキットはさらに、試料中の妊娠性抗原およ
び胎児性制限抗原の双方を判定するための組合わせ；試
料輸送および貯蔵用の緩衝剤；本発明記載の試薬用のガ
ラスびん（ｖｉａｌ）　、？ｉ包ｈ（ｆｏｉｌ　ｐａｃ
ｋａｇｅ）または他の容器；個別のガラスびんまたは他
の容器に入れた付加的な試薬、たとえば酵素試薬；抗体
抗原結合の存在および広がりを判定するだめの機械的ま
たは光学的手段；ならびにこれらの組合わせをも包含す
ることができる。

試料採取手段たとえば試料採取用スワブならびに輸送お
よび貯蔵用の緩衝剤を含ませることもできる。本件キッ
トの個々の部分は便宜な形状、たとえばガラスびん、箔
包み、または他の容器のいかなるものにも包装すること
ができる。たとえば、箔包み中の不溶性担体構造はガラ
スびん、または他の容器中において他の試薬と組み合わ
されていることができる。

胎児性制限抗原妊娠試験 妊娠試験の具体例は、子宮頚管または子宮頚部の近傍で
採取した試料中の胎児性制限抗原、すなわち特異的に胎
児性の、または胎盤性の中心物質の検出を包含する。本
件発明者らは、検出可能な量のこれらの物質が妊娠初期
の２０週間におけるこの種の試料中に存在することを見
いだした。胎児性制限抗原は母親の血液中には有意の量
で存在しないので、試料中の母親の血液の存在はこの試
験を妨害しない。

本件明細書中で使用する“胎児性制限抗原パの語は、母
親の血清、血漿または尿中には存在しないかまたは母親
の血清、血漿または尿中には有意の量で存在しない特異
的に胎児性の、または胎盤性の誘導物質を意味するもの
として定義される。

抗原性物質と、タンパク質およびその純粋な形状では抗
原性でないが抗体と特異的に、または選択的に結合し得
る独特な末端構造を有する他の物質との双方を含み、こ
の定義に合致するいかなる物質も、この語の意味に包含
されると考えられる。

胎児性制限抗原の例は、マツウラ（Ｈ，Ｍａｔｕｕｒａ
）およびハコモリ（Ｓ、　Ｈａｋｏｍｏｒｉ）　、米国
国立科学アカデミ−報文集（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、）８２　：　６５１７
−６５２１　（１９８５）に記載された　Ｆ　Ｄ　Ｃ−
６モノクロ一ン抗体と特異的に結合する胎児性フィブロ
ネクチンである。

本件明細書中で使用する°“胎児性制限抗原類″の語は
、胎児性制限抗原がその成員である抗原の類またはグル
ープを意味するものとして定義される。たとえば胎児性
フィブロネクチンはヒトフィブロネクチングループまた
は類の胎児性制限成員である。

本件明細書中で使用する“抗体″の語は、ＩｇＧｓ　　
ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、および　ＩｇＥ　の類の抗体
と、選択的結合分画ならびに抗体の　ＦａｂおよびＦ（
ａｂ’）、分画を含む各抗体の混成誘導体を包含するも
のとして定義される。抗体はポリクロ−ンのものであっ
てもモノクローンのものであってもよい。一般には、モ
ノクローン抗体が本発明記載の検定法における使用に好
適である。

免疫学的方法は、その特異性の故に本発明記載の検定法
を行うのに最も便利であり、本件明細書中で使用する“
免疫学的検定法”の語は、抗原と、抗原の末端構造に選
択的に結合する第２の物質（すなわち結合相手、通常は
抗体または抗原結合部位を有する抗体分画）との選択的
結合を用いるいかなる方法をも意味するものとして定義
される。

本件明細書中で使用する選択的結合は選択的な、かつ一
般的には特異的な結合であり、また、一般的には１０％
未満の、好ましくは５％未満の交差反応性非特異的結合
を示す結合成員間の結合を表す。たとえば、反応剤が胎
児性フィブロネクチンである場合には抗胎児性フィブロ
ネクチン抗体は成人フィブロネクチンとは１０５未満の
、好ましくは５％未満の交差反応性を有する。

たとえばサンドウィッチ法、競争法、浸漬棒法、アグロ
メレーシ黛ン法、沈澱法、トランジスターブリッジプロ
ーブ法、粒子選別法、光擾乱法、光散乱法、および超音
波プローブ免疫検定法を含むがこれらに限定されるもの
ではない、この段階を含む全ての免疫学的検定法が本発
明の範囲に包含される。適当な免疫学的検定法には、た
とえば放射性同位体、酵素または蛍光原性物質、発色原
性物質もしくは化学発光性物質を標識として使用するこ
とができる。

検定すべき試料を子宮頚管または子宮頚部の近傍で採取
し、この試料を検定して試料中の胎児性制限抗原の存在
または量を測定する。この試料は一般に液体および微粒
状固体よりなり、腟粘液もしくは頚管粘液、他の腟もし
くは頚管分泌物、細胞もしくは細胞破片、羊水、または
他の胎児性もしくは母体性物質を含有し得る。試料はダ
クロンまたは他の繊維のチップを有するスワブ、アスピ
レータ−１吸引手段、洗浄手段等を用いて採取し、適当
な貯蔵容器に移し、試験室に運ぶ。

試料組成物中では不安定な、敏感なタンパク質分析剤を
保存し得る液体中に試料を分散させることが重要である
。この貯蔵および輸送用の媒体は貯蔵および輸送中にお
けるタンパク質分析剤レベルの低下を防ぐものでなけれ
ばならない。貯蔵および輸送用の適当な保存溶液は０．
０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４；０．１５　Ｍ　Ｎ
ａＣ１，０，０２％ＮａＮ５．１％　ＢＳＡ、５００力
リクレイン単位ｈａＱのアプロチニン、１ｍＭ　フッ化
フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）および５ｍＭＥ
ＤＴＡ　よりなり、１９８８年９月１５日に受理された
米国特許出願第２４４．９６９号に記載されている。

胎児性制限抗原の検出は、試料中の胎児性制限抗原を、
胎児性制限抗原の末端構造に選択的に結合する抗体と結
合させ、この結合の存在または不存在を判定して達成す
ることができる。

胎児性制限抗原のためのサンドウィッチ免疫検定法の一
例においては、試料を抗胎児性制限抗原類抗体が付着し
ている不溶性担体と接触させて、試料中の胎児性制限抗
原の不溶性担体への結合を実現させる。ついで、この不
溶性担体を、不溶性担体に付着している胎児性制限抗原
と結合する二次抗体、未標識の、または標識した抗胎児
性制限抗原類抗体と接触させて、捕捉された胎児性制限
抗原を標識し、測定する。

分析剤胎児性制限抗原を含む物質の類と結合する抗体は
特異的抗胎児性制限抗原類抗体捕捉抗体または特異的抗
胎児性制限抗原類抗体サンドウィッチ抗体と置き換える
ことができる；たとえば抗胎児性フィブロネクチン抗体
は不溶性担体に付着させることができ、標識した、また
は未標識の抗フィブロネクチン抗体は捕捉した抗原の標
識に使用することができる。これに替えて抗フィブロネ
クチン抗体を不溶性担体に付着させ、標識した、または
未標識の抗胎児性フィブロネクチン抗体を捕捉した抗原
の標識に使用することもできる。この二次抗体は不溶性
担体上で直接に測定し得る物理的に検出可能な標識を有
することもできる。これに替えて、二次抗体を標識しな
いこともでき、この二次抗体は、二次抗体と選択的に結
合する標識した抗体または抗体分画を有する不溶性担体
と接触させ（すなわち三次抗体）、未結合の標識三次抗
体を担体より分離し、不溶性担体上の標識の存在を測定
して判定することができる。膜状基質を用いるサンドウ
ィッチ免疫検定法の使用が適当である。

この試料はまた、競争免疫検定法により試験することも
できる。試料を標識試薬抗体または抗原と混合し、抗胎
児性制限抗原類抗体または試薬胎児性制限抗原を付着さ
せた不溶性担体とともに培養する。試薬との間に試料分
析剤との結合に関する競争が起きる。この種の免疫学的
検定法を実行する方法および手順は免疫学的検定技術の
熟練者には周知されている。最後に不溶性担体に結合し
ている標識、または溶液に残留している標識を測定する
。

抗胎児性制限抗体は胎児性制限抗原から、好ましくは高
度に精製した胎児性制限抗原から、通常の抗血清技術ま
たはモノクローン技術により得られる。本発明は、本件
明細書中において胎児性制限抗原としての胎児性フィブ
ロネクチンの検出に関して記述するが、明瞭性の目的の
ためであって、限定のためのものではない。いかなる胎
児性制限抗原の検出も本発明の範囲内のものと考えられ
る。

胎児性フィブロネクチンはエングバル（Ｅｎｇｖａｌｌ
）およびルオスラーティ　（ＲｕｏｓｌａｈＬｉ）　、
国際癌雑誌（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）　２０　
：　ｌ　−５（１９７？）の記載、と同様にして羊水よ
り精製する。抗胎児性フィブロネクチン抗体は胎児性フ
ィブロネクチンから、通常の抗血清技術により、または
モノクローン抗体技術により誘導することができる。

モノクローンおよびポリクローン抗胎児性制限抗原類抗
体の双方、または抗胎児性制限抗原類抗体は胎児性制限
抗原から、好ましくは高度に精製した抗原から通常の抗
血清技術またはモノクローン技術により直接に誘導する
ことができる。

本発明記載の検定法に有用な主要な抗体はＩｇＧ　およ
び　ＩｇＭ抗体であるが、ＩｇＤ。

ＩｇＥ　および　ＩｇＡ抗体も十分な量入手し得るなら
ば使用することができる。これらの抗体は、たとえばミ
シエル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびシルギ（ＳｈｉＩｇｉ
）　、細胞免疫学の方法（Ｓｅｌｅｄｔｅｄ　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
）　、サンフランシスコニフリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ
）　　（１９８０）　、ゴディング（Ｊ。

Ｇｏｄｉｎｇ）　＋モノクローン抗体：原理と実際（Ｍ
ｏｎ。

ｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ｐｒ１ｎｃ
ｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）ニューヨーク
：アカデミツクプレス、　１１１−１１４ページ（１９
８３）　、ならびにバリダ（Ｐａｒ　１ｋｈ）ら。

ＣａＥＮ（１９８５年８月２６日）に記載されているよ
うな通常の親和性クロマトグラフィー技術を用いて親和
性精製する。

本発明記載のキットおよび方法における使用に適した選
択的結合抗体分画は、個々のモノクローン抗体またはポ
リクローン抗体から通常の酵素的または化学的分画法に
より製造することができる。

適当な方法は、たとえばティーラセン（Ｐ、　Ｔｉｊｓ
ｓｅｎ）　、生化学および分子生物学における実験室技
術：酵素免疫検定法の実際と理論（Ｌａｂｏｑａｔｏｒ
ｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ。

１ｏｇｙ　：　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒ
ｉｅｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎ。

ａｓｓａｙｓ）　、ニューヨーク：エルゼビア（Ｅｌｓ
ｅｖｔｅｒ）（１９８５）に記載されている。

ポリクローン抗胎児性制限抗原類抗体はウサギ、モルモ
ット、ラットまたはヤギのような動物に、濃縮した胎児
性制限抗原、たとえば胎児性フィブロネクチンに対する
免疫性を与え、免疫性を得た動物から血清を採取し、た
とえば硫酸アンモニウム沈澱法により血清からイムノグ
ロブリンを分離することにより得られる。

親和性クロマトグラフィーにおける使用に適した吸収剤
には、抗胎児性制限抗原類抗体が共有結合している架橋
アガロースおよび架橋ポリアクリルアミドが含まれる。

成人性フィブロネクチンと交差反応する抗体を除去する
には、成人性フィブロネクチンが結合するカラムに抗体
血清を通す。

ついで、溶離液の残留抗体を含有する部分を胎児性フィ
ブロネクチンのカラムに通し、溶離して親和性精製した
抗体を得ることができる。

これらの工程においては、リン酸塩緩衝溶液を加えた食
塩水中でカラムに抗体溶液を適用し、ｐＨ８，０の２．
５　Ｍ　ＮａＳ　ＣＮ　溶液を用いて抗体を溶離するこ
とかできる。所望ならば、負圧透析または超遠心により
抗体を濃縮することができる。

この抗体溶液は４℃、またはそれ以下の温度で安定であ
る。所望の分離と純度とが達成されるまで、カラム分離
工程の反復を継続する。

胎児性フィブロネクチンの製造には、腫瘍フィブロネク
チンを胎児性フィブロネクチンに替えて、マツウラ（Ｈ
，Ｍａｔｕｕｒａ）およびハコモリ（Ｓ、　Ｈａｋｏｍ
ｏｒｉ）　、米国国立科学アカデミ−報文集（Ｐｒｏｃ
　。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、）　８２
　：　６５１７−６５２１　（１９８５）に記載された
方法に従うことができる。抗胎児性制限抗原類抗体のポ
リクローンおよびモノクローン変種の双方とも周知物質
であり、商業的に入手可能であるか、またはヒブリドー
マ寄託機関（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｄｅｐｏｓｉｔ）よ
り公共的に入手可能である。

たとえば抗フィブロネクチンモノクローン抗体はＡＴＣ
ＣＨＢ　９１（アメリカ形態培養集積所（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ）　、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）　
）のクローン試料より誘導される。この種の抗体の他の
ものは、日本特許出願６００９１２６４　（ダイアログ
（Ｄｉａｌｏｇ）データベース７フイル３５１．　ＷＰ
　Ｉ　　登録番号８５−１６１６１７／２７）および米
国特許第４，３２５．８６７号に記載されている。

サンドウィッチ免疫検定法：試料中の胎児性制限抗原を
測定するための本発明記載のサンドウィッチ法の具体例
においては、抗胎児性制限抗原類抗体が付着している不
溶性担体を水性緩衝溶液、たとえばｐＨ６ないし８、好
ましくは７．２ないし７．６のリン酸塩緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ）で希釈した試料と、試料中の胎児性制限抗原を不溶
性担体上の抗胎児性制限抗原類抗体と結合させるのに十
分な時間接触させ、ついで、試料を担体から取り出す。

培養時間はかなりの結合を生じさせるのに十分なもので
あるべきであり、温度に応じて変化する。

適当な培養時間は、１６ないし４０℃の範囲の温度では
３０ないし２４０分であり、好ましい接触時間は２０な
いし２６６Ｃの範囲の温度で少なくとも６０分である。

ついで、洗浄溶液を用いて残留試料溶液を担体より取り
出す。通常の洗浄溶液のいかなるものも使用することが
できる。適当な洗浄溶液は米国特許第４．５２８．２６
７号に記載されている。この洗浄溶液は、０．０００１
ないし０．０５のリン酸塩モル濃度と６ないし８のｐＨ
とを有し、０．００１ないし０．１重量％の非イオン性
界面活性剤を含有する水性リン酸塩緩衝溶液である。適
当な非イオン性界面活性剤にはポリオキシエチレンエー
テル（ＢＲＩＪ、たとえばラウリル、セチル、オレイル
、ステアリル、およびトリデシルポリオキシ呈チレンエ
ーテル）；ポリオキシエチレンソルビタン（トウイーン
、たとえば−ラウリン酸、−パルミチン酸、−ステアリ
ン酸、−オレイン酸、および三オレイン酸ポリオキシエ
チレンソルビクール）；ならびに他のポリオキシエチレ
ンエーテル（たとえばトリトン）が含まれる。好ましい
非イオン性界面活性剤は、４０　ｍの酸化エチレン単位
を有するオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（
１−ＩＪ　ｌ−ンＸ−４０５、ローム・アンド・ハース
社）である。

ついで、不溶性担体を、その不溶性担体上に捕捉された
胎児性制限抗原と結合する抗体、すなわちサンドウィッ
チ抗体と接触させる。サンドウィッチ抗体は抗胎児性制
限抗原類抗体であってもよく、抗胎児性制限抗原類抗体
であってもよい。サンドウィッチ抗体は標識しであるも
のであっても未標識のものであってもよい。未標識のサ
ンドウィッチ抗体を使用する場合には、サンドウィッチ
抗体と結合し、物理的に検出可能な標識を保持する三次
抗体を、通常の手法でサンドウィッチ抗体の測定に使用
することができる。

本件明細書には多様な標識が記述される。明瞭性の目的
で、しかし限定のためではなく、本件方法の次の各段階
を酵素、好ましくは発色原性または蛍光原性酵素で標識
した抗胎児性制限抗原類抗体に関して記述する。本件明
細書において、′発色原性酵素″の語は適当な基質と反
応して発色団生成物を生成する酵素を表すものとして定
義される。

本件明細書において、“蛍光原性酵素”の語は適当な基
質と反応して蛍光体生成物を生成する酵素を表すものと
して定義される。

水溶液中で、不溶性担体にサンドウィッチ抗体を適用す
る。この溶液は好ましくは、反応剤を保存し、結合反応
を容易にするために、適当な塩および緩衝剤を含有する
。この溶液はｔ；とえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
、リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）、および穏和な界面活性
剤、たとえば上記の洗浄溶液中に使用するポリオキシエ
チレンソルビタンエステルを含有することができる。培
養はサンドウィッチ抗体を、いかなるものにせよ、不溶
性担体に付着している暴露された胎児性制限抗原の末端
構造と結合させるのに十分な時間継続する。好ましい培
養時間はおよび温度は、不溶化された試薬抗胎児性制限
抗原類抗体と試料胎児性制限抗原との結合に関して上に
述べたものと同様である。

ついで、不溶性担体からサンドウィッチ抗体溶液を取り
出し、担体をたとえば上記の洗浄溶液で洗浄して、残留
している非結合物質があれば、これを除去する。

サンドウィッチ抗体が未標識のものであれば、酵素標識
抗体またはサンドウィッチ抗体と選択的に結合する他の
結合剤を水溶液中で不溶性担体に適用する。この溶液は
好ましくは、反応剤を保存し、結合反応を容易にするた
めに、たとえば上記のような適当な塩および緩衝剤を含
有する。培養は、標識した抗サンドウィッチ抗体抗体を
、いかなるものにせよ、不溶性担体に付着している暴露
されたサンドウィッチ抗体末端構造と結合させるのに十
分な時間継続する。好ましい培養時間はおよび温度は、
不溶化された試薬抗胎児性制限抗原類抗体と試料胎児性
制限抗原との結合に関して述べたものと同様である。

ついで、不溶性担体から標識抗体溶液を取り出し、担体
をたとえば上記の洗浄溶液で洗浄して、残留している非
結合物質があれば、これを除去する。

次の段階においては、不溶性担体を酵素の存在下で反応
して溶液中に蛍光体化合物または発色厚化合物を放出す
る基質の水溶液と接触させる。適当な基質とこれを転化
させることのできる酵素とは、たとえば米国特許第４．
１９０，４９６および４．５２８．２６７号に記載され
ている。担体を１ｏ−２ないし１０″″１０モル濃度の
基質を含有する基質水溶液と接触させる。１０−’ない
し１０−６の基質モル濃度が好ましい。基質溶液中の好
ましい付加的な試薬および緩衝剤には、たとえば２−ア
ミノ−２−メチル−１−プロパツール緩衝剤、および塩
化マグネシウムが含まれる。

基質溶液を不溶性担体とともに、蛍光体または発色団を
得る反応を起こさせるのに十分な時間培養する。１８な
いし４０℃の温度でにおいては５ないし２４０分の培養
時間を使用し得る。この温度は好ましくは２０ないし２
６°Ｃの範囲であり、培養時間は３０ないし９０分であ
る。

ついで、溶液中の蛍光体または発色団のレベルを測定す
る。基質溶液中の蛍光体レベルまたは発色団レベル測定
用の装置および手順は当該技術で通常使用されるもので
ある。溶液中の蛍光体または発色団のレベルは不溶性担
体上の酵素濃度に依存し、さらには試料中の胎児性制限
抗原の量に依存する。胎児性制限抗原の濃度は、溶液の
蛍光体または発色団のレベルを、それぞれ、既知濃度の
胎児性制限抗原を含有する対照溶液で得た蛍光体または
発色団のレベルと比較することにより測定する。

本件サンドウィッチ法は、捕捉抗体またはサンドウィッ
チ抗体として胎児性制限抗原類結合性抗体を使用するた
めに変更することができる。これらの具体例においては
、抗胎児性制限抗原類抗体、たとえば抗フィブロネクチ
ン抗体を不溶性担体に付着させ、標識した、または未標
識の抗胎児性制限抗原類抗体をサンドウィッチ抗体とし
て適用する。

これに替えて、抗胎児性制限抗原類抗体を不溶性担体に
付着させ、標識した、または未標識の抗胎児性制限抗原
類抗体を用いて捕捉された抗原をサンドウィッチするこ
ともできる。

膜免疫検定：試料中の胎児性制限抗原を測定する本発明
記載の膜検定法の具体例においては、抗胎児性制限抗原
類抗体が付着している不溶性担体を水性緩衝溶液、たと
えばｐＨ６ないし８の、好ましくは７，２ないし７．６
のリン酸塩緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で希釈しｊ；試料と
、試料中の胎児性制限抗原を不溶性担体上の抗胎児性制
限抗原類抗体と結合させるのに十分な時間接触させる。

結合に必要な時間は、流通系においては極めて短い。

適当な培養時間は、１６ないし４０℃の範囲の温度では
１秒ないし２０分以内が可能で、この場合の好ましい接
触時間は１分以内であり、最適培養時間は１０秒ないし
２分である。

ついで、不溶性担体を、この不溶性担体上に捕捉された
胎児性制限抗原と結合する抗体、すなわちサンドウィッ
チ抗体と接触させる。サンドウィッチ抗体は標識したも
のであっても未標識のものであってもよい。未標識のサ
ンドウィッチ抗体を使用する場合には、サンドウィッチ
抗体と結合し、物理的に検出可能な標識を保持する三次
抗体を使用して、通常の手法でサンドウィッチ抗体を測
定することができる。

本件明細書には種々の標識が記載されている。

明瞭性の目的で、しかし限定のためではなく、本件方法
の次の各段階を酵素、好ましくは蛍光原性または発色原
性酵素により標識された抗胎児性制限抗原類抗体に関し
て記述する。

サンドウィッチ抗体を水溶液中で不溶性担体に適用する
。この溶液は好ましくは、反応剤を保存し、結合反応を
容易にするために、適当な塩および緩衝剤を含有する。

この溶液はたとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、リ
ン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）、および穏和な界面活性剤、
たとえば上記の洗浄溶液中に使用するポリオキシエチレ
ンソルビタンエステルを含有することができる。培養は
、サンドウィッチ抗体を、いかなるものにせよ、不溶性
担体に付着している暴露された胎児性制限抗原末端構造
と結合させるのに十分な時間継続する。

好ましい培養時間はおよび温度は、不溶化された試薬抗
胎児性制限抗原類抗体と試料胎児性制限抗原との結合に
関して述べたものと同様である。

任意に、不溶性担体からサンドウィッチ抗体溶液を取り
出すことができ、担体をたとえば上記の洗浄溶液で洗浄
して、残留している非結合標識物質があれば、これを除
去する。

サンドウィッチ抗体が未標識のものであれば、酵素標識
抗体またはサンドウィッチ抗体と選択的に結合する他の
結合剤を水溶液中で不溶性担体に適用する。この溶液は
好ましくは、反応剤を保存し、結合反応を容易にするた
めに、適当な塩および緩衝剤を含有する。この溶液はた
とえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、リン酸塩緩衝溶
液（ＰＢＳ）、および穏和な界面活性剤、たとえば上記
の洗浄溶液中に使用するポリオキシエチレンソルビタン
エステルを含有することができる。培養は、標識した抗
サンドウィッチ抗原抗体を、いかなるものにせよ、不溶
性担体に付着したサンドウィッチ抗体の末端構造と結合
させるのに十分な時間継続する。好ましい培養時間はお
よび温度は、不溶化された試薬抗胎児性制限抗原類抗体
と試料胎児性制限抗原との結合に関して述べたものと同
様である。　　　　゛ ついで、不溶性担体から標識抗体溶液を取り出し、担体
をたとえば上記の洗浄溶液で洗浄して、残留している非
結合標識物質があれば、これを除去する。

本発明記載の膜サンドウィッチ法の次の段階においては
、不溶性担体を、酵素の存在下に反応して蛍光原性化合
物または発色原性化合物を溶液中に放出する基質の水溶
液と接触させる。適当な基質およびこれを転化させ得る
酵素、ならびに付加的化合物および緩衝剤は上に記述し
である。

基質溶液を不溶性担体とともに、蛍光体または発色団を
得る反応が起こるのに十分な時間培養する。１８ないし
４０°Ｃの温度においては１ないし２０分の培養時間を
使用することができる。好ましくは、温度は２０ないし
２６°０の範囲であり、培養時間は２ないし５分である
。膜上の蛍光原または発色原のレベルは反射計または光
学密度計を用いて測定することができる。

競争免疫検定法：標識試薬胎児性制限抗原を用いる本発
明記載の競争法の具体例は、試料と標識試薬胎児性制限
抗原との混合物を不溶性担体に付着している抗胎児性制
限抗原類抗体と接触させ、不溶性担体と結合する、また
は溶液相に残留する標識の量を測定することよりなる。

標識抗胎児性制限抗原類抗体を用いる本発明記載の競争
法の具体例は複数の形態が可能である。

不溶性担体に結合している抗胎児性制限抗原類抗体を用
いる一つの具体例は、試料と標識抗胎児性制限抗原類抗
体との混合物を不溶性担体に付着している抗胎児性制限
抗原類抗体と接触させ、不溶性担体と結合する、または
溶液相に残留する標識の量を測定することよりなる。不
溶性担体に結合している試薬胎児性制限抗原を用いる他
の一つの具体例は、試料と標識抗胎児性制限抗原類抗体
との混合物を不溶性担体に付着している胎児性制限抗原
と接触させ、不溶性担体と結合する、または溶液相に残
留する標識の量を測定することよりなる。

これらの方法のいずれにおいても、試料をサンドウィッ
チ免疫検定法の具体例に関して上に記述したものと同様
にして緩衝溶液で希釈し、培養し、標識測定する。不溶
性担体上に、または溶液中に残留する標識の量は試料中
の分析剤の量に依存して変化するものとして、制限試薬
の濃度は試薬間で競争的に結合を起こさせるように選択
する。これらの方法は一般に周知のものであり、工程の
最適化のためにこれらをどのように変更するかは、完全
に免疫学的検定技術の熟練者の知識の範囲内にある。

抗胎児性制限抗原類抗体と試料中の胎児性制限抗原との
結合はまた、試料中の胎児性制限抗原により抗胎児性制
限抗原類抗体が付着した粒子の集積、抗体抗原反応によ
る抗体の沈澱、または、半導体ブリッジプローブ、たと
えば米国特許第４．６４７．５４４号に記載された光擾
乱パターン等を用いる、抗体抗原結合に起こる物理的も
しくは電気的変化の観測によっても判定することができ
る。

試料中の胎児性制限抗原の存在の判定は妊娠を示す。

本発明の範囲内に包含される、試料中の胎児性制限抗原
を測定すφための胎児性制限妊娠試験キットには一般に
、（ａ）不溶性担体に付着している抗胎児性制限抗原類
抗体、抗胎児性制限抗原類抗体、もしくは試薬胎児性制
限抗原抗［；　（ｂ）不溶性担体に付着している抗胎児
性制限抗原類抗体と標識抗胎児性制限抗原類抗体、標識
抗胎児性制限抗原類抗体、もしくは標識試薬胎児性制限
抗原との組合わせ；（ｃ）不溶性担体に付着している抗
胎児性制限抗原類抗体と標識抗胎児性制限抗原類抗体と
の組み合わせ；および／または（ｄ）不溶性担体に付着
した試薬胎児性制限抗原と標識抗胎児性制限抗原類抗体
との組合わせが含まれる。

本発明記載のキットはさらに、試料中の妊娠性抗原と胎
児性制限抗原との双方を判定するための組合わせ；試料
輸送および貯蔵用の緩衝剤−本発明記載の試薬用のガラ
スびん、箔包みまたは他の容器；個別のガラスびんまた
は他の容器に入れた付加的な試薬、ｔ；とえば酵素基質
試薬；抗体抗原結合の存在および広がりを判定するため
の機械的または光学的手段；ならびにこれらの組合わせ
をも包含することができる。試料採取手段たとえば試料
採取用スワブならびに輸送および貯蔵用の緩衝剤を含ま
せることもできる。本件キットの個々の部分は便宜な形
状、たとえばガラスびん、箔包み、または他の容器のい
かなるものにも包装することができる。たとえば、箔包
み中の不溶性担体構造はガラスびん、または他の包装中
において他の試薬と組み合わされていることができる。

子宮外妊娠試験 子宮外妊娠を判定する本発明記載の方法には、子宮頚管
および／または子宮頚部の近傍で採取した試料中の胎児
性制限抗原、すなわち特異的に胎児性の、または胎盤性
の中心物質の存在または不存在の検出が含まれる。通常
は、検出可能な量のこれらの物質が正常妊娠初期の２０
週間におけるこの種の試料中に存在する。妊娠初期の２
０週間において妊婦より得たこの種の試料中における胎
児性制限抗原の不存在は子宮外妊娠の存在を示すもので
ある。胎児性制限抗原は母親の血液中には有意の量で存
在しないので、試料中の母親の血液の存在はこの試験を
妨害しない。

１゛胎児性制限抗厚″′、“胎児性制限抗原類″、“抗
体゛′、“免疫学的検定法”、および“選択的結合゛′
の語はいずれも胎児性制限抗原妊娠試験に関連して上に
記述したものと同様に定義される。

検定すべき試料を子宮頚管または子宮頚部の近傍で採取
し、この試料を検定して試料中の胎児性制限抗原の存在
または量を測定する。この試料は一般に液体および微粒
状固体よりなり、腟粘液もしくは頚管粘液、他の腟もし
くは頚管分泌物、細胞もしくは細胞破片、羊水、または
他の胎児性物質もしくは母体性物質を含有し得る。試料
はダクロンまたは他の繊維のチップを有するスワブ、ア
スピレータ−１吸引手段、洗浄手段等を用いて採取し、
適当な貯蔵容器に移し、試験室に運ぶ。

試料組成物中では不安定な、敏感なタンパク質分析剤を
保存し得る液体中に試料を分散させることが重要である
。適当な貯蔵および輸送用の媒体は胎児性制限抗原妊娠
試験に関連して上に記述した。

胎児性制限抗原の検出は、試料中の胎児性制限抗原を、
胎児性制限抗原の末端構造に選択的に結合する抗体と結
合させ、この結合の存在または不存在を判定して達成す
ることができる。

胎児性制限抗原のためのサンドウィッチ免疫検定法の一
つにおいては、試料を抗胎児性制限抗原類抗体が付着し
ている不溶性担体と接触させて、試料中の胎児性制限抗
原の一不溶性担体への結合を実現させる。ついで、この
不溶性担体を、不溶性担体に付着している胎児性制限抗
原と結合する二次抗体、未標識の、または標識した抗胎
児性制限抗原類抗体と接触させて、捕捉された胎児性制
限抗原を標識し、測定する。

分析側胎児性制限抗原を含む物質の類と結合する抗体は
抗胎児性制限抗原類抗体捕捉抗体ｉたは抗胎児性制限抗
原類抗体サンドウィッチ抗体と置き換えることができる
。たとえば抗胎児性フィブロネクチン抗体は不溶性担体
に付着させることができ、標識した、または未標識の抗
フィブロネクチン抗体は捕捉した抗原の標識に使用する
ことができる。

これに替えて抗フィブロネクチン抗体を不溶性担体に付
着させ、標識した、または未標識の抗胎児性ブイプロネ
クチン抗体を捕捉した抗原の標識に使用することもでき
る。この二次抗体は不溶性担体上で直接に測定し得る物
理的に検出可能な標識を有することもできる。これに替
えて、二次抗体を標識しないこともでき、この二次抗体
は、二次抗体と選択的に結合する標識した抗体または抗
体分画を有する不溶性担体と接触させ（すなわち三次抗
体）、未結合の標識三次抗体を担体より分離し、不溶性
担体上の標識の存在を測定して判定することができる。

膜状基質を用いるサンドウィッチ免疫検定法の使用が適
当である。

この試料はまた、競争免疫検定法により試験することも
できる。試料を標識試薬抗体または抗原と混合し、抗胎
児性制限抗原類抗体または試薬胎児性制限抗原を付着さ
せた不溶性担体とともに培養する。試薬の間に試料分析
剤との結合に関する競争が起きる。この種の免疫学的検
定法を実行する方法および手順は免疫学的検定技術の熟
練者には周知されている。不溶性担体に最後まで結合し
ている標識または溶液に残留している標識を測定する。

抗胎児性制限抗体は胎児性制限抗原から、好ましくは高
度に精製した胎児性制限抗原から、通常の抗血清技術ま
たはモノクローン技術により得ることができる。本発明
は、本件明細書中において胎児性制限抗原としての胎児
性フィブロネクチンの検出に関して記述するが、明瞭性
の目的のためであって、限定のためのものではない。い
かなる胎児性制限抗原の検出も本発明の範囲内のものと
考えられる。胎児性フィブロネクチンは、エングバル（
Ｅｎｇｖａｌｌ）およびルオスラーティ（Ｒｕｏｓｌａ
ｈｔｉ）、国際癌雑誌（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ
）　２０：　１−５（１９７７）の記載のようにして、
羊水より精製する。

抗胎児性フィブロネクチン抗体は胎児性フィブロネクチ
ンから通常の抗血清技術により、またはモノクローン技
術により誘導することができる。

モノクローンおよびポリクローン抗胎児性制限抗原類抗
体の双方、または抗胎児性制限抗原類抗体は胎児性制限
抗原から、好ましくは高度に精製した抗原から通常の抗
血清技術またはモノクローン技術により直接に誘導する
ことができる。ここで子宮外妊娠検定法に有用な抗体お
よび抗体分画は、その製造とともに、胎児性制限抗原妊
娠試験に関して上に記述した。

ポリクローンおよびモノクローン抗胎児性制限抗原類抗
体の製造は、胎児性制限抗原妊娠試験に関して上に記述
した。この種の製造方法は、ここで子宮外妊娠試験に使
用する抗体の製造に適している。

胎児性制限抗原妊娠試験に関連して上に記述した抗胎児
性制限抗原類抗体たとえば抗胎児性フィブロネクチン抗
体および抗胎児性制限抗原類抗体たとえば抗フィブロネ
クチン抗体の免疫プロトコル、親和性クロマトグラフィ
ー法、溶離、精製および濃縮は、子宮外妊娠試験に使用
する抗体の製造に使用することができる。

サンドウィッチ免疫検定法：試料中の胎児性制限抗原を
測定するための本発明記載のサンドウィッチ法の具体例
においては、胎児性制限抗原妊娠試験との関連で上に記
述しｊ；ようにして、抗胎児性制限抗原類抗体が付着し
ている不溶性担体を水性緩衝溶液で希釈した試料と接触
させる。試料の希釈、試薬の接触、ならびに培養および
洗浄条件、溶液、時間および温度は、胎児性制限抗原妊
娠試験に関連して上に記述したものと同様である。洗浄
溶液を用いて残留試料溶液を担体より取り出し、胎児性
制限抗原妊娠試験に関連して上に記述した条件下でサン
ドウィッチ抗体と接触させる。ついで、このサンドウィ
ッチ抗体溶液を不溶性担体より取り出し、担体をたとえ
ば上記の洗浄溶液で洗浄して、残留している非結合物質
があれば、これを上記のようにして除去する。

サンドウィッチ抗体が未標識のものであるならば、サン
ドウィッチ抗体と選択的に結合する抗体または他の結合
剤を、上記のようにして、水溶液中で不溶性担体に適用
する。ついで、標識された抗体溶液を不溶性担体より取
り出し、担体をたとえば上記の洗浄溶液で洗浄して、残
留している非結合標識物質があれば、これを除去する。

ついで標識を測定する。上側のように標識が酵素である
場合には、担体を適当な基質水溶液と接触させ、培養し
て蛍光体または発色団を生成させる。ついで、上記の身
うにして溶液中の蛍光体または発色団のレベルを測定す
る。

本件サンドウィッチ法は、胎児性制限抗原妊娠試験と関
連して上に記述したように、捕捉抗体またはサンドウィ
ッチ抗体として胎児性制限抗原類結合性抗体を使用する
ために変更することができる。

膜免疫検定：試料中の胎児性制限抗原を測定する膜検定
法の具体例においては、胎児性制限抗原妊娠試験に関連
して上に記述した条件下で、抗胎児性制限抗原類抗体が
付着している不溶性担体を、希釈した試料と接触させ、
培養する。

ついで不溶性担体を、上記のようにして、この不溶性担
体上に捕捉された胎児性制限抗原と結合する抗体、すな
わちサンドウィッチ抗体と接触させる。このサンドウィ
ッチ抗体を、胎児性制限抗原妊娠試験に関連して上に記
述したようにして、水溶液中で不溶性担体に適用する。

任意にこのサンドウィッチ抗体を取り出し、担体を上記
のようにして洗浄する。

サンドウィッチ抗体が未標識のものであるならば、サン
ドウィッチ抗体と選択的に結合する抗体または他の結合
剤を、上記のようにして水溶液中で不溶性担体に適用す
る。好ましい培養時間および温度は上に記述したような
ものである。

ついで、標識された抗体溶液を不溶性担体より取り出し
、担体をたとえば上記の洗浄溶液で洗浄して、残留して
いる非結合標識物質があれば、これを除去する。上記の
ように標識が酵素である場合には、不溶性担体を酵素の
存在下で反応して蛍光体化合物または発色団化合物を溶
液中に放出する基質の水溶液と接触させる。適当な基質
およびこれを転化させる酵素は、付加的な化合物および
緩衝剤とともに上に記述した。上記のようにして、基質
溶液を不溶性担体とともに、蛍光体または発色団を得る
反応が起こるのに十分な時間培養する。

膜上の蛍光原または発色原のレベルは反射計または光学
密度計を用いて測定することができる。

競争免疫検定法：標識試薬胎児性制限抗原を用いる本発
明記載の競争法の具体例は、試料と標識試薬胎児性制限
抗原との混合物を不溶性担体に付着している抗胎児性制
限抗原類抗体と接触させ、不溶性担体と結合する、また
は溶液相に残留する標識の量を測定することよりなる。

標識抗胎児性制限抗原類抗体を用いる本発明記載の競争
法の具体例は、胎児性制限抗原妊娠試験に関連して上に
記述したように、複数の形態が可能である。これらの方
法のいずれにおいても、試料をサンドウィッチ免疫検定
法の具体例に関連して上に記述したものと同様にして緩
衝溶液で希釈し、培養し、標識測定する。不溶性担体上
に、または溶液中に残留する標識の量は試料中の分析剤
の量に依存して変化するものとして、制限試薬の濃度は
試薬間で競争的に結合を起こさせるように選択する。こ
れらの方法は一般に周知のものであり、工程の最適化の
ためにこれらをどのように変更するかは、完全に免疫学
的検定技術の熟練者の知識の範囲内にある。

抗胎児性制限抗原類抗体と試料中の胎児性制限抗原との
結合はまた、試料中の胎児性制限抗原により抗胎児性制
限抗原類抗体が付着した粒子の集積、抗体抗原反応によ
る抗体の沈澱、または、半導体ブリッジグローブ、たと
えば米国特許筒４．６４７．５４４号に記載された光擾
乱パターン等を用いる、抗体抗原結合に起こる物理的も
しくは電気的変化の観測によっても判定することができ
る。

血清または尿中の妊娠指示性ホルモンの存在を用いて妊
娠を判定するのが望ましいこともあり得る。患者の血液
または尿中の非制限妊娠指示性抗体のレベルを判定する
だめの多様な方法が当業者に公知である。信頼性のある
いかなる方法も使用することができる。血漿、血清およ
び／または尿中のｈＣＧ　を測定する方法は、たとえば
米国特許筒３，１７１，７８３．３，２３４，０９６．
３，２３６，７３２．３．２９８，７８７．３，３０９
，２７５．３，４８５，７５１．３，６５５，８３８．
３．６８９，６３３．３．８６２，３０２．３，８７３
，６８２．３，８７３，６８３．３．８３３，３０４．
３，９９１．１７５．４，００３．９８８．４．Ｏ１４
，６５３，４，０１６，２５０，４，０３３，７２３，
４，０７１，３１４，４，０９４，９６３，４，１２３
，２２４，４，１２３，５０９，４，１３８，２１４，
４，２０８，１８７，４，２１０，７２３，４，２３４
，５６１，４，２５６，６２９，４，２６８，４３５，
４，２７０，９２３，４，３１０，４５５，４，３１３
，８７１，４，３２０，１１１゜４．３４８，２０７．
４，３７１，５１５．４，４１９，４５３．４，４２１
，８９６．４．４９３，７９３．４，５０８，８２９、
および４，６６５．０３４号に記載されている。尿中（
米国特許筒３．１４１．７４０号）、または乳、血清も
しくは血漿中（ハンガリー特許第７３７０２８号、ＷＰ
！　　番号８６−０２３３４４１０４）のプロゲステロ
ン代謝物質；血清または血漿中のヒト胎盤性ラクトゲン
（米国特許筒３．８９２，８４１１４．３７１，５１５
、および４，４９３．７９３号）；尿中のニストロジエ
ンステロイド（米国特許筒３．９５５，９２８号）；血
清、血漿または尿中の黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロ
ラクチン（Ｐ　ＲＬ）および／またはｈＣＧ様物質（米
国特許筒４．０１６，２５０．４，０９４．９６３、お
よび４，３２０．１１１号）；妊娠特異性β−糖タンパ
ク質（米国特許筒４．０６５，４４５および４．１９１
．５３３号）；ＬＨ（米国特許筒４．１３８．２１４お
よび４，２０８．１８７号）；ウシの血清または尿中の
ウシ妊娠性抗原　（ヨーロッパ特許出願１８８．５５Ｌ
　ＷＰ　１　　番号８６−０４２１０８１０６）；新規
な胎盤タンパク質（米国特許筒４．５９２．８６３号）
；ならびに初期妊娠因子Ｗ０８６０５４９８　（ＷＰｌ
　　番号８６−２６４９４０／４０）の測定による妊娠
検出が記載されている。尿に染料を添加することによる
（米国特許筒２．５８７．２２１および３，２２６．１
９６号、ジニトロフェニルヒドラジン；米国特許筒３．
５９５．６２０号、ブロモクレゾールパープルまたはク
ロロフェノールレッド）、ヨー素紙試験による（米国特
許筒３．２４８．１７３号）、他の沈澱剤を添加するこ
とによる（米国特許筒３．２７８．２７０号）、酸と塩
化ナトリウムとの混合物で女性の血液を処理することに
よる（米国特許筒３．８８３，３０４号）妊娠判定法が
記載されている。妊娠は、１９８７年１１月１７日に受
理された米国特許出願一連番号１２１．９０２の示唆に
従う、子宮頚管または子宮頚部の近傍で採取した試料の
検定を用いて判定することができる。上記の方法のいか
なるものも使用することができるが、ｈＣＧ測定のよう
な方法が好ましい。

妊娠初期の２０週間における試料中の妊娠の存在の判定
とこれに伴う胎児性制限抗原の負判定とは、正常子宮妊
娠の不存在を示し、かつ、子宮外妊娠が起きていること
を示す。

本発明の範囲内に包含される、試料中の胎児性制限抗原
を測定する子宮外妊娠キットには一般に、（ａ）不溶性
担体に付着している抗胎児性制限抗原類抗体、抗胎児性
制限抗原類抗体、もしくは試薬胎児性制限抗原；　（ｂ
）不溶性担体に付着している抗胎児性制限抗原類抗体と
標識抗胎児性制限抗原類抗体、標識抗胎児性制限抗原類
抗体、もしくは標識試薬胎児性制限抗原との組合わせ；
　（ｃ）不溶性担体に付着している抗胎児性制限抗原類
抗体と標識抗胎児性制限抗原類抗体との組み合わせ；お
よび／または（ｄ）不溶性担体に付着している試薬胎児
性制限抗原と標識抗胎児性制限抗原類抗体との組合わせ
が含まれる。

子宮外妊娠判定用のキットはさらに、試料中の非制限妊
娠性抗原と胎児性制限抗原との双方を判定するための組
合わせ；試料輸送および貯蔵用の緩衝剤；本発明記載の
試薬用のガラスびん、箔包みまたは他の容器；個別のガ
ラスびんまたは他の包装に入れた付加的な試薬、たとえ
ば酵素基質試薬；抗体抗原結合の存在および広がりを判
定するための機械的または光学的手段；ならびにこれら
の組合わせをも包含する′ことができる。試料採取手段
たとえば試料採取用スワブならびに輸送および貯蔵用の
緩衝剤を含ませることもできる。本件キットの個々の部
分は便宜な形状、たとえばガラスびん、箔包み、または
他の容器のいかなるものにも包装することができる。た
とえば、箔包み中の不溶性担体構造はガラスびん、また
は他の包装中において他の試薬と組み合わされているこ
とができる。

妊娠による生体排出生成物の試験 妊娠による生体排出生成物の存在を判定する本発明の具
体例には、疑似自発妊娠中絶により取り出された試料、
または拡張掻爬もしくは治療的妊娠中絶の過程で採取し
た試料中の胎児性制限抗原、すなわち特異的に胎児性の
、または胎盤性の中心物質の検出が含まれる。胎児性制
限抗原は母親の血液中には有意の量で存在しないので、
試料中の母親の血液の存在はこの試験を妨害しない。

“胎児性制限抗原”、゛°胎児性制限抗原類”、゛抗体
”、“免疫学的検定法”および“選択的結合”の語はい
ずれも胎児性制限抗原妊娠試験に関連して上に記述した
ものと同様に定義される。

子宮より排出された物質を代表すると考えられる、妊娠
による生体排出生成物の存在に関して検定すべき試料を
採取する。この種の物質には治療的妊娠中絶またはＤ＆
Ｃ（拡張掻爬）の過程で採取した組織が可能である。こ
れに替えて、この物質には自発妊娠中絶、すなわち流産
の指標であると考えられている腟放出物も可能である。

この試料は一般に液体および微粒状固体よりなり、組織
物質、腟粘液もしくは頚管粘液、他の腟もしくは頚管分
泌物、細胞もしくは細胞破片、羊水、または他の胎児性
物質もしくは母体性物質を含有し得る。試料はダクロン
または他の繊維のチップを有するスワブ、アスピレータ
−１吸引手段、洗浄手段等を用いて腟腔より採取するこ
とができる。

この試料は拡張掻爬の過程で、もしくは治療的妊娠中絶
中に採取した、または疑似妊娠中絶の場合に女性用保護
パッドを用いて採取した組織を代表し得る。

試料組成物中では不安定な、敏感なタンパク質分析剤を
保存し得る液体中に試料を分散させることが重要である
。適当な貯蔵および輸送用の媒体は胎児性制限抗原妊娠
試験に関連して上に記述したものである。

胎児性制限抗原の検出は、試料中の胎児性制限抗原を、
胎児性制限抗原の末端構造に選択的に結合する抗体と結
合させ、この結合の存在または不存在を判定して達成す
ることができる。

胎児性制限抗原のためのサンドウィッチ検定法の一つに
おいては、試料を抗胎児性制限抗原類抗体が付着してい
る不溶性担体と接触させて、試料中の胎児性制限抗原の
不溶性担体への結合を実現させる。ついで、この不溶性
担体を、不溶性担体に付着している胎児性制限抗原と結
合する二次抗体、未標識の、または標識した抗胎児性制
限抗原類抗体と接触させて、捕捉された胎児性制限抗原
を標識し、測定する。

分析側胎児性制限抗原を含む物質の類と結合する抗体は
抗胎児性制限抗原類抗体捕捉抗体または抗胎児性制限抗
原類抗体サンドウィッチ抗体と置き換えることができる
。たとえば抗胎児性フィブロネクチン抗体は不溶性担体
に付着させることができ、標識した、または未標識の抗
フィブロネクチン抗体は捕捉した抗原の標識に使用する
ことができる。

これに替えて抗フィブロネクチン抗体を不溶性担体に付
着させ、標識した、または未標識の抗胎児性フィブロネ
クチン抗体を捕捉した抗原の標識に使用することもでき
る。この二次抗体は不溶性担体上で直接に測定し得る物
理的に検出可能な標識を有することもできる。こ、れに
替えて、二次抗体を標識しないことも可能であり、この
二次抗体は、二次抗体と選択的に結合する標識した抗体
または抗体分画を有する不溶性担体と接触させ（すなわ
ち三次抗体）、未結合の標識三次抗体を担体より分離し
、不溶性担体上の標識の存在を測定して判定することが
できる。膜状基質を用いるサンドウィッチ免疫検定法の
使用が適当である。

この試料はまた、競争免疫検定法により試験することも
できる。試料を標識試薬抗体または抗原と混合し、抗胎
児性制限抗原類抗体または試薬胎児性制限抗原を付着さ
せた不溶性担体とともに培養する。試薬間に試料分析剤
との結合に関する競争が起きる。この種の免疫学的検定
法を実行する方法および手順は免疫学的検定技術の熟練
者には周知されている。最後に不溶性担体に結合してい
る標識または溶液に残留している標識を測定する。

抗胎児性制限抗体は胎児性制限抗原から、好ましくは高
度に精製した胎児性制限抗原から、通常の抗血清技術ま
たはモノクローン技術により得られる。本発明は、本件
明細書中において胎児性制限抗原としての胎児性フィブ
ロネクチンの検出に関して記述するが、明瞭性の目的の
ためであって、限定のためのものではない。いかなる胎
児性制限抗原の検出も本発明の範囲内のものと考えられ
る。

胎児性フィブロネクチンは工ングバル（Ｅｎｇｖａｌｌ
）およびルオスラーティ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）　、国
際癌雑誌（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）　２０　：
　ｌ　−５（１９７７）の記載のようにして、羊水より
精製する。抗胎児性フィブロネクチン抗体は胎児性フィ
ブロネクチンから通常の抗血清技術により、またはモノ
クローン技術により誘導することができる。

モノクローンおよびポリクローン抗胎児性制限抗原類抗
体の双方、または抗胎児性制限抗原類抗体は胎児性制限
抗原から、好ましくは高度に精製した抗原から通常の抗
血清技術またはモノクローン技術により直接に誘導する
ことができる。とこで妊娠による生体排出生成物の検定
に有用な抗体および抗体分画は、その製造とともに、胎
児性制限抗原妊娠試験に関して上に記述した。

ポリクローンおよびモノクローン抗胎児性制限抗原類抗
体の製造は、胎児性制限抗原妊娠試験に関して上に記述
した。この種の製造方法は、ここで妊娠による生体排出
生成物の検定に使用する抗体の製造に適している。

胎児性制限抗原妊娠試験に関して上に記述した抗胎児性
制限抗原類抗体たとえば抗胎児性フィブロネクチン抗体
および抗胎児性制限抗原類抗体たとえば抗フィブロネク
チン抗体の免疫プロトコル、親和性クロマトグラフィー
法、溶離、精製および濃縮は、ここで妊娠による生体排
出生成物の検定に使用する抗体の製造に使用することが
できる。

サンドウィッチ免疫検定法：試料中の胎児性制限抗原を
測定するための本発明記載のサンドウィッチ法の具体例
においては、胎児性制限抗原妊娠試験との関連で上に記
述したようにして、抗胎児性制限抗原類抗体が付着して
いる不溶性担体を水性緩衝溶液で希釈した試料と接触さ
せる。試料の希釈、試薬の接触、ならびに培養および洗
浄条件、溶液、時間および温度は胎児性制限抗原妊娠試
験に関連して上に記述したものと同様である。洗浄溶液
を用いて残留試料溶液を担体より取り出し、胎児性制限
抗原妊娠試験に関連して上に記述した条件下でサンドウ
ィッチ抗体と接触させる。ついで、このサンドウィッチ
抗体溶液を不溶性担体より取り出し、担体をたとえば上
記の洗浄溶液で洗浄して、残留している非結合物質があ
れば、上記のようにしてこれを除去する。

サンドウィッチ抗体が未標識のものであるならば、サン
ドウィッチ抗体と選択的に結合し、物理的に検出可能な
標識を保持する抗体または他の結合剤を、上記のように
して、水溶液中で不溶性担体に適用する。ついで、標識
された抗体溶液を不溶性担体より取り出し、担体をたと
えば上記の洗浄溶液で洗浄して、残留している非結合標
識物質があれば、これを除去する。ついで標識を測定す
る。上側のように標識が酵素である場合には、担体を適
当な基質水溶液と接触させ、培養して蛍光体または発色
団を生成ささせる。ついで、上記のようにして溶液中の
蛍光体または発色団のレベルを測定する。

本件サンドウィッチ法は、胎児性制限抗原妊娠試験と関
連して上に記述したように、捕捉抗体またはサンドウィ
ッチ抗体として胎児性制限抗原類結合性抗体を使用する
ために変こすることができる。

膜免疫検定：試料中の胎児性制限抗原を測定する膜検定
法の具体例においては、胎児性制限抗原妊娠試験に関連
して上に記述した条件下で、抗胎児性制限抗原類抗体が
付着している不溶性担体を、希釈した試料と接触させ、
−培養する。

ついで不溶性担体を、上記のようにして、この不溶性担
体上に捕捉された胎児性制限抗原と結合する抗体、すな
わちサンドウィッチ抗体と接触させる。このサンドウィ
ッチ抗体を、胎児性制限抗原妊娠試験に関連して上に記
述したようにして、水溶液中で不溶性担体に適用する。

任意にこのサンドウィッチ抗体を取り出し、担体を上記
のようにして洗浄する。

サンドウィッチ抗体が未標識のものであるならば、サン
ドウィッチ抗体と選択的に結合する酵素標識抗体まｌ；
は他の結合剤を、上記のようにして水溶液中で不溶性担
体に適用する。好ましい培養時間および温度は上に述べ
たものと同様である。

ついで、標識された抗体溶液を不溶性担体より取り出し
、担体をたとえば上記の洗浄溶液で洗浄して、残留して
いる非結合標識物質があれば、これを除去する。上記の
ように標識が酵素である場合には、不溶性担体を酵素の
存在下で反応して蛍光原化合物または発色厚化合物を溶
液中に放出する基質の水溶液と接触させる。適当な基質
およびこれを転化させ得る酵素は、付加的な成分および
緩衝剤とともに上に記述した。上記のようにして、基質
溶液を不溶性担体とともに、蛍光体または発色団を得る
反応が起こるのに十分な時間培養する。

膜上の蛍光原または発色原のレベルは反射計または光学
密度計を用いて測定することができる。

競争免疫検定法：標識試薬胎児性制限抗原を用いる本発
明記載の競争法の具体例は、試料と標識試薬胎児性制限
抗原との混合物を不溶性担体に付着している抗胎児性制
限抗原類抗体と接触させ、不溶性担体と結合する、また
は溶液相に残留する標識の量を測定することよりなる。

標識抗胎児性制限抗原類抗体を用いる本発明記載の競争
法の具体例は、胎児性制限抗原妊娠試験に関連して上に
記述したように、複数の形態が可能である。これらの方
法のいずれにおいても、試料をサンドウィッチ免疫検定
法の具体例に関連して上に記述したものと同様にして緩
衝溶液で希釈し、培養し、標識測定する。不溶性担体上
に、または溶液中に残留する標識の量は試料中の分析剤
の量に依存して変化するものとして、制限試薬の濃度は
試薬間で競争的に結合を起こさせるように選択する。こ
れらの方法は一般に周知のものであり、工程の最適化の
ためにこれらをどのように変更するかは、完全に免疫学
的検定技術の熟練者の知識の範囲内にある。

抗胎児性制限抗原類抗体と試料中の胎児性制限抗原との
結合はまた、試料中の胎児性制限抗原により抗胎児性制
限抗原類抗体が付着した粒子の集積、抗体抗原反応によ
る抗体の沈澱、または、半導体ブリッジプローブ、たと
えば米国特許第４．６４７．５４４号に記載された光擾
乱パターン等を用いる、抗体抗原結合に起こる物理的も
しくは電気的変化の観測によっても判定することができ
る。

血清または尿中の妊娠指示性ホルモンの存在を用いて妊
娠を判定するのが望ましいこともあり得る。患者の血液
または尿中の非制限妊娠指示性抗体のレベルを判定する
ための多様な方法が当業者に公知である。たとえば子宮
外妊娠試験に関連して上に記述したもののような、信頼
性のあるいかなる方法も使用することができる。

Ｄ＆Ｃ，治療的妊娠中絶、または疑似自発妊娠中絶（流
産）の過程で得た試料は、胎児性制限抗原の存在に関し
て試験することができる。治療的または自発妊娠中絶を
表すと考えられる試料中の、妊娠の存在の判定と胎児性
制限抗原の負判定との同時判定は、妊娠が発生し、継続
していることを示すものである。治療的または自発妊娠
中絶を表すと考えられる試料中の、妊娠の存在の判定と
胎児性制限抗原の正判定とは、妊娠が発生したが、終結
したことを示すものである。Ｄ＆Ｃより誘導した試料中
の、妊娠指示体の不存在の判定と胎児性制限抗原の負判
定とは、妊娠が発生し、未だ終結していないことを示す
ものである。

本発明の範囲内に包含される、試料中の胎児性制限抗原
を測定するための妊娠による生体排出生成物試験キット
には一般に、（ａ）不溶性担体に付着している抗胎児性
制限抗原類抗体、抗胎児性制限抗原類抗体、もしくは試
薬胎児性制限抗原：（ｂ）不溶性担体に付着−している
抗胎児性制限抗原類抗体と標識抗胎児性制限抗原類抗体
、標識抗胎児性制限抗原類抗体、もしくは標識試薬胎児
性制限抗原との組合わせ；（ｃ）不溶性担体に付着して
いる抗胎児性制限抗原類抗体と標識抗胎児性制限抗原類
抗体との組み合わせ：および／または（ｄ）不溶性担体
に付着している試薬胎児性制限抗原および標識抗胎児性
制限抗原類抗体が含まれる。

妊娠による生体排出生成物測定用のキットはさらに、試
料中の非制限妊娠性抗原と胎児性制限抗原との双方を判
定するための組合わせ；試料輸送および貯蔵用の緩衝剤
；本発明記載の試薬用のガラスびん、箔包みまたは他の
容器；個別のガラスびんまたは他の包装に入れた付加的
な試薬、たとえば酵素基質試薬；抗体抗原結合の存在お
よび広がりを判定するための機械的または光学的手段：
ならびにこれらの組合わせをも包含することができる。

試料採取手段たとえば試料採取用スワブならびに輸送お
よび貯蔵用の緩衝剤を含ませることもできる。本件キッ
トの個々の部分は便宜な形状、たとえばガラスびん、箔
包み、または他の容器のいかなるものにも包装すること
ができる。たとえば、箔包み中の不溶性担体構造はガラ
スびん、または他の包装中において他の試薬と組み合わ
されていることができる。

早期陣痛／羊膜破裂の危険性試験 早産の危険増大を示すための本発明の具体例には、妊！
　２０週以後の試料中の胎児性制限抗原の検出が含まれ
る。本件発明者らは、検出可能な量のこれらの物質が一
般に、妊娠２０週以後の後宮、子宮頚管または子宮頚部
の近傍より得たもののような腟試料中には存在しないこ
とを見いだした。

検出可能な量のこれらの物質が妊娠２０週以後に採取し
たこの種の試料中に存在することは、切迫した早産の危
険増大を示し、かつ／または、羊膜の破裂を示す。胎児
性制限抗原は母親の血液中には有意の量で存在しないの
で、試料中の母親の血液の存在はこの試験を妨害しない
。

“胎児性制限抗原”、“胎児性制限抗原類゛′、“抗体
”、“免疫学的検定法”および“選択的結合”の語はい
ずれも胎児性制限抗原妊娠試験に関連して上に記述した
ものと同様に定義される。

検定すべき試料を後宮、子宮頚管または子宮頚部の近傍
より採取し、この試料を検定して試料中の胎児性制限抗
原の存在または量を測定する。この試料は一般に液体お
よび微粒状固体よりなり、腟粘液もしくは頚管粘液、他
の腟もしくは頚管分泌物、細胞もしくは細胞破片、羊水
、または他の胎児性物質もしくは母体性物質を含有し得
る。試料はダクロンまたは他の繊維のチップを有するス
ワブ、アスピレータ−１吸引手段、洗浄手段等を用いて
採取し、貯蔵用の適当な容器に移し、試験室に運ぶ。

試料組成物中では不安定な、敏感なタンパク質分析剤を
保存し得る液体中に試料を分散させることが重要である
。適当な貯蔵および輸送用の媒体は胎児性制限抗原妊娠
試験に関連して上に記述したものである。

胎児性制限抗原の検出は、試料中の胎児性制限抗原を、
胎児性制限抗原の末端構造に選択的に結合する抗体と結
合させ、この結合の存在または不存在を判定して達成す
ることができる。

胎児性制限抗原のためのサンドウィッチ検定法の一つに
おいては、試料を抗胎児性制限抗原類抗体が付着してい
る不溶性担体と接触させて、試料中の胎児性制限抗原の
不溶性担体への結合を実現させる。ついで、この不溶性
担体を、不溶性担体に付着している胎児性制限抗原と結
合する二次抗体、未標識の、または標識した抗胎児性制
限抗原類抗体と接触させて、捕捉された胎児性制限抗原
を標識し、測定する。

分析剤胎児性制限抗原を含む物質の類と結合する抗体は
抗胎児性制限抗原類抗体捕捉抗体まｔ；は抗胎児性制限
抗原類抗体サンドウィッチ抗体と置き換えることができ
る。たとえば抗胎児性フィブロネクチン抗体は不溶、性
担体に付着させることができ、標識した、または未標識
の抗フィブロネクチン抗体は捕捉した抗原の標識に使用
することができる。

これに替えて抗フィブロネクチン抗体を不溶性担体に付
着させ、標識した、または未標識の抗胎児性フィブロネ
クチン抗体′を捕捉した抗原の標識に使用することもで
きる。この二次抗体は不溶性担体上で直接に測定し得る
物理的に検出可能な標識を有することもできる。これに
替えて、二次抗体を標識しないことも可能であり、この
二次抗体は、二次抗体と選択的に結合する標識した抗体
または抗体分画を有する不溶性担体と接触させ（すなわ
ち三次抗体）、未結合の標識三次抗体を担体より分離し
、不溶性担体上の標識の存在を測定して判定することが
できる。膜状基質を用いるサンドウィッチ免疫検定法の
使用が適当である。

この試料はまた、競争免疫検定法により試験することも
できる。試料を標識試薬抗体または抗原と混合し、抗胎
児性制限抗原類抗体または試薬胎児性制限抗原を付着さ
せた不溶性担体とともに培養する。試薬間に試料分析剤
との結合に関する競争が起きる。この種の免疫学的検定
法を実行する方法および手順は免疫学的検定技術の熟練
者には周知されている。最後に不溶性担体に付着してい
る標識または溶液中に残留している標識を測定する。

抗胎児性制限抗体は胎児性制限抗原から、好ましくは高
度に精製した胎児性制限抗原から、通常の抗血清技術ま
たはモノクローン技術により得られる。本発明は、ここ
で胎児性制限抗原としての胎児性フィブロネクチンの検
出に関して記述するが、明瞭性の目的のためであって、
限定のためのものではない。いかなる胎児性制限抗原の
検出も本発明の範囲内のものと考えられる。胎児性フィ
ブロネクチンはエングバル（Ｅｎｇｖａｌｌ）およびル
オスラーティ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）　、国際癌雑誌（
Ｉｎｔ。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）　２０　：　１−５　（１９７７
）の記載のようにして、羊水より精製する。抗胎児性フ
ィブロネクチン抗体は胎児性フィブロネクチンから通常
の抗血清技術により、まｔ；は七ツクローン抗体技術に
より誘導することができる。

モノクローンおよびポリクローン抗胎児性制限抗原類抗
体の双方、または抗胎児性制限抗原類抗体は胎児性制限
抗原から、好ましくは高度に精製した抗原から通常の抗
血清技術またはモノクローン技術により直接に誘導する
ことができる。ここで検定に有用な抗体および抗体分画
は、その製造とともに、胎児性制限抗原妊娠試験に関し
て上に記述した。

ポリクローンおよびモノクローン抗胎児性制限抗原類抗
体の製造は、胎児性制限抗原妊娠試験に関して上に記述
した。この種の製造方法は、ここで早期陣痛／羊膜破裂
の危険性試験に使用する抗体の製造に適している。

胎児性制限抗原妊娠試験に関して上に記述した抗胎児性
制限抗原類抗体たとえば抗胎児性フィブロネクチン抗体
および抗胎児性制限抗原類抗体たとえば抗フィブロネク
チン抗体の免疫プロトコル、親和性クロマトグラフィー
法、溶離、精製および濃縮は、早期陣痛／羊膜破裂試験
に用いる抗体の製造に使用することができる。

サンドウィッチ免疫検定法：試料中の胎児性制限抗原を
測定するための本発明記載のサンドゥイッチ法の具体例
においては、胎児性制限抗原妊娠試験との関連で上に記
述したようにして、抗胎児性制限抗原類抗体が付着して
いる不溶性担体を水性緩衝溶液で希釈した試料と接触さ
せる。試料の希釈、試薬の接触、ならびに培養および洗
浄条件、溶液、時間および温度は胎児性制限抗原妊娠試
験に関連して上に記述したものと同様である。洗浄溶液
を用いて残留試料溶液を担体より取り出し、胎児性制限
抗原妊娠試験に関連して上に記述した条件下でサンドウ
ィッチ抗体と接触させる。ついで、このサンドウィッチ
抗体溶液を不溶性担体より取り出し、担体をたとえば上
記の洗浄溶液で洗浄して、残留している非結合物質があ
れば、上記のようにしてこれを除去する。

サンドウィッチ抗体が未標識のものであるならば、サン
ドウィッチ抗体と選択的に結合する抗体または他の結合
剤を、上記のようにして、水溶液中で不溶性担体に適用
する。ついで、標識された抗体溶液を不溶性担体より取
り出し、担体をたとえば上記の洗浄溶液で洗浄して、残
留している未結合の標識物質があれば、これを除去する
。ついで標識を測定する。上側のように標識が酵素であ
る場合には、担体を適当な基質水溶液と接触させ、培養
して蛍光体または発色団を生成ささせる。ついで、上記
のようにして溶液中の蛍光体または発色団のレベルを測
定する。

本件サンドウィッチ法は、胎児性制限抗原妊娠試験と関
連して上に記述したように、捕捉抗体またはサンドウィ
ッチ抗体として胎児性制限抗［類結合性抗体を使用する
ために変更することができる。

膜免疫検定法：試料中の胎児性制限抗原を測定する膜検
定法の具体例においては、胎児性制限抗原妊娠試験に関
連して上に記述した条件下で、抗胎児性制限抗原類抗体
が付着している不溶性担体を、希釈した試料と接触させ
、培養する。

ついで不溶性担体を、上記のようにして、この不溶性担
体上に捕捉された胎児性制限抗原と結合する抗体、すな
わちサンドウィッチ抗体と接触させる。このサンドウィ
ッチ抗体を、胎児性制限抗原妊娠試験に関連して上に記
述したようにして、水溶液中で不溶性担体に適用する。

任意にこのサンドウィッチ抗体を取り出し、担体を上記
のようにして洗浄する。

サンドウィッチ抗体が未標識のものであるならば、サン
ドウィッチ抗体と選択的に結合する酵素標識抗体または
他の結合剤を、上記のようにして水溶液中で不溶性担体
に適用する。好ましい培養時間および温度は上に述べた
ものと同様である。

ついで、標識された抗体溶液を不溶性担体より取り出し
、担体をたとえば上記の洗浄溶液で洗浄して、残留して
いる非結合標識物質があれば、これを除去する。上記の
ように標識が酵素である場合には、不溶性担体を酵素の
存在下で反応して蛍光原化合物または発色厚化合物を溶
液中に放出する基質の水溶液と接触させる。適当な基質
およびこれを転化させ得る酵素は、付加的な成分および
緩衝剤とともに上に記述した。上記のようにして、基質
溶液を不溶性担体とともに、蛍光体または発色団を得る
反応が起こるのに十分な時間培養する。

膜上の蛍光原または発色原のレベルは反射計または光学
密度計を用いて測定することができる。

競争免疫検定法：標識試薬胎児性制限抗原を用いる本発
明記載の競争法の具体例は、試料と標識試薬胎児性制限
抗原との混合物を不溶性担体に付着している抗胎児性制
限抗原類抗体と接触させ、不溶性担体と結合する、また
は溶液相に残留する標識の量を測定することよりなる。

標識抗胎児性制限抗原類抗体を用いる本発明記載の競争
法の具体例は、胎児性制限抗原妊娠試験に関連して上に
記述したように、複数の形態が可能である。これらの方
法のいずれにおいても、試料をサンドウィッチ免疫検定
法の具体例に関連して上に記述したものと同様にして緩
衝溶液で希釈し、培養し、標識測定する。不溶性担体上
に、または溶液中に残留する標識の量は試料中の分析剤
の量に依存して変化するものとして、制限試薬の濃度は
試薬間で競争的に結合を起こさせるように選択する。こ
れらの方法は一般に周知のものであり、工程の最適化の
ためにこれらをどのように変更するかは、完全に免疫学
的検定技術の熟練者の知識の範囲内にある。

抗胎児性制限抗原類抗体と試料中の胎児性制限抗原との
結合はまた、試料中の胎児性制限抗原により抗胎児性制
限抗原類抗体が付着した粒子の集積、抗体抗原反応によ
る抗体の沈澱、または、半導体ブリッジプローブ、たと
えば米国特許第４．６４７，５４４号に記載された光擾
乱パターン等を用いる、抗体抗原結合に起こる物理的も
しくは電気的変化の観測によっても判定することができ
る。

妊娠２０週以後の試料中の胎児性制限抗体の存在の判定
は、羊膜が破裂している可能性があることを示し、かつ
／または、早期陣痛の危険性が増大していることを示す
ものである。

本発明の範囲内に包含される、試料中の胎児性制限抗原
を測定するための早期陣痛／羊膜破裂の危険性試験キッ
トには一般に、（ａ）不溶性担体に付着している抗胎児
性制限抗原類抗体、抗胎児性制限抗原類抗体、もしくは
試薬胎児性制限抗原；（ｂ）不溶性担体に付着している
抗胎児性制限抗原類抗体と標識抗胎児性制限抗原類抗体
、標識抗胎児性制限抗原類抗体、もしくは標識試薬胎児
性制限抗原との組合わせ；　（ｃ）不溶性担体に付着し
ている抗胎児性制限抗原類抗体と標識抗胎児性制限抗原
類抗体との組み合わせ；および／または（ｄ）不溶性担
体に付着している試薬胎児性制限抗原および標識抗胎児
性制限抗原類抗体台まれる。

本件キットはさらに、試料中の非制限妊娠性抗原と胎児
性制限抗原との双方を判定するための組合わせ；試料輸
送および貯蔵用の緩衝剤；本発明記載の試薬用のガラス
びん、箔包みまたは他の容器；個別のガラスびんまたは
他の包装に入れた付加的な試薬、たとえば酵素基質試薬
；抗体抗原結合の存在および広がりを判定するための機
械的または光学的手段；ならびにこれらの組合わせをも
包含することができる。試料採取手段たとえば試料採取
用スワブならびに輸送および貯蔵用の緩衝剤を含ませる
こともできる。本件キットの個々の部分は便宜な形状、
たとえばガラスびん、箔包み、または他の容器のいかな
るものにも包装することができる。たとえば、箔包み中
の不溶性担体構造はガラスびん、または他の包装中にお
いて他の試薬と組み合わされていることができる。

不溶性担体試薬 本発明記載の抗原試薬および抗体試薬は、通常の方法に
より不溶性担体に結合させることができる。米国特許第
３，２３４，０９６．３，２３６，７３２．３．３０Ｑ
、２７５．３，８７３，６８３．３，９９１，１７５．
４，００３，９８８．４．０１６，２５０．４，０３３
，７２３．４，０７１，３１４．４，３４８，２０７、
および４，４１９．４５３号に記載された、抗原をたと
えばラテックス粒子および赤血球に結合させるための方
法のような、不溶性担体に抗原を結合させるのに適した
抗原結合方法を使用することができる。抗体を不溶性担
体に結合させる方法は、たとえば米国特許第３．５５１
，５５５．３，５５３，３１０．４．０４８，２９８号
およびＲＥ−２９，４７４に、ならびにティーツソン（
Ｔｉｊｓｓｏｎ）　、酵素免疫検定法の理論と実際（Ｐ
ｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚ
ｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）　＋エルゼビア科
学出版（Ｅｌｓｅｖｉｓｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ）　、　　（１９８５）　２９７−３２８
ページに記載されている。吸着により抗体をポリスチレ
ンに結合させる方法は、たとえば米国特許第３．６４６
．３４６および４，０９２，４０８号に記載されている
。明瞭性の目的のために、しかし限定のためではなく、
結合方法はここでは抗原の不溶性担体への結合に関連し
て記述する。これらの方法は試薬抗体、たとえば抗妊娠
性抗原抗体、抗胎児性制限抗原類抗体、および抗胎児性
制限抗原類抗体の、ならびに試薬抗原、たとえば試薬妊
娠性抗原または試薬胎児性制限抗原の不溶性担体への結
合に適している。

不溶性担体としては多様な物質を使用することができる
。第一に考慮することは表面への抗体の結合であり、ま
た、抗原結合方法または結合反応の存在および広がりの
判定に使用し得る他の反応に関する干渉の不存在である
。天然および合成の有機または無機の重合体はいずれも
不溶性担体として使用することができる。適当な重合体
の例にはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン
、ポリ−（４−メチルブチレン）、ブチルゴム、シリコ
ンゴム系（ｓＮａｓｔｉｃ）重合体、ポリエステル、ポ
リアミド、セルローズおよびセルローズ誘導体（たとえ
ば酢酸セルローズ、ニトロセルローズ等）、アクリレー
ト、メタクリレート、ビニル重合体（たとえばポリ酢酸
ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ７
ツ化ビニル等）、ポリスチレンおよびスチレングラフト
共重合体、レーヨン、ナイロン、ポリ酪酸ビニル、ポリ
ホルムアルデヒド等が含まれる。不溶性担体として使用
し得る他の物質は上記の重合体のラテックス、シリカゲ
ル、ケイ素ウェーファー、ガラス、紙、不溶性タンパク
質、金属、メタロイド、酸化金属、磁性材料、半導性材
料、サーメット（ｃｅｒｍｅＬ）等である。加えて、ゲ
ルを形成する物質、たとえばタンパク質たとえばゼラチ
ン、リボ多糖類、ケイ酸塩、アガロース、ポリアクリル
アミドもしくは幾つかの水相を形成する重合体たとえば
デキストリン、ポリアルキレングリコール（２ないし３
個の炭素原子を有するアルキレン）、または界面活性剤
、たとえば両性化合物たとえばリン脂質、長鎖（１２−
２４個の炭素原子）のアルキルアンモニウム塩等も含ま
れる。

本発明に用いる好ましい診断用担体にはナイロンおよび
ニトロセルローズの膜が含まれる。これに替わる診断用
担体はポリスチレン、スチレン共重合体たとえばスチレ
ン−アクリロニトリル共重合体、またはポリオレフィン
たとえばポリエチレンもしくはポリプロピレンならびに
アクリル酸エステルおよびメタクリル酸′エステルの重
合体および共重合体より製造したものである。試薬抗体
または抗原試薬は吸着、イオン結合、ファンデルワール
ス吸着、静電的結合、もしくは他の非共有結・合により
不溶性担体に結合させることができるか、まｔ；は、共
有結合により不溶性担体に結合することができる。本件
方法に特に有利な担体は複数の井戸状のくぼみ（ｗｅｌ
ｌ）を有するミクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）
板よりなるものである。このくぼみの表面またはその中
に入れたプラスチックカップ挿入物（１ｎｓｅｒｔｓ）
が抗原または抗体の担体を構成し得る。判定に蛍光測定
法の使用が必要であるならば、くぼみに適用する励起光
が周囲のくぼみの内容物に到達しないように、または影
響を与えないように、上記のミクロタイター板またはく
ぼみ挿入物は光に対して不透明であるものが有利である
。

非共有結合の方法は米国特許第４．５２８．２６７号に
記載されている。抗体および抗原を不溶性担体に共有結
合させる方法はチバタ（１，Ｃｈｉｂａｔａ）　。

固定酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）
　、　ハルステッド出版（Ｈａｌｓｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ
　：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　　（１９７８）に、また、
クアトレカサス（Ａ、　Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）　、
生物化学雑誌（Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ、）　２４５
　：　３０５９　（１９７０）に記載されている。上記
の表面はタンパク質で被覆し、たとえば米国特許第４，
２１０．４１８号に記載されている、結合剤としてゲル
タールアルデヒドを使用する方法を用いて、抗体また抗
原と結合させることができる。これに替わる方法におい
ては、上記のくぼみを遊離のインシアネート基を有する
層、たとえばポリエーテルインシアネートの層で被覆し
、これに水溶液の形状の抗体または抗原を適用して必要
な結合を実現させることができる。

さらにその他の方法においては、米国特許第３．７２０
．７６０号に記載されているように、臭化シア°ノゲン
を用いて抗体または抗原をヒドロキシル化物質に結合さ
せることができる。

不溶性担体は、非特異的結合を減少させるために好まし
くは“遮蔽（ｂｌｏｃｋ）”する。適当な遮蔽剤の選択
は不溶性担体の塁により決定される。

たとえばポリスチレン担体に対する適当な遮蔽剤には水
溶性の非免疫動物性タンパク質が含まれる。

適当な水溶性の非免疫動物性タンパク質にはウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）；ヒト、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、お
よびウマの血清アルブミン；カゼインおよび脱脂乳；オ
ボアルブミン：糖タンパク質等が含まれる。

同様の遮蔽剤をナイロンおよびニトロセルローズの担体
にも使用することができる。しかし、ニトロセルローズ
またはナイロンの膜担体に好ましい遮蔽剤は脱脂乳また
はカゼインである。これらの膜担体に最適な遮蔽剤は１
ないし５重量％の脱脂粉乳まｔ；はカゼイン、ならびに
非イオン性界面活性剤たとえばポリオキシエチレンソル
ビタン誘導体およびポリオキシエチレンエーテルを含有
する水溶液である。

標識試薬 本発明記載の標識試薬妊娠性抗原、抗妊娠性抗原抗体、
抗サンドウィッチ抗体試薬抗体は、好ましくは抗体結合
部位を適当に保護しながらタンパク質に標識を付着させ
る通常の方法により製造することができる。

本発明記載の標識試薬胎児性制限抗原、抗胎児性制限抗
原類抗体、抗胎児性制限抗原類抗体および抗サンドウィ
ッチ抗体試薬抗体は、好ましくは抗体結合部位を適当に
保護しながらタンパク質に標識を付着させる通常の方法
により製造することができる。

標識は化学的または物理的結合によりタンパク質試薬に
結合またはカップルさせることができる。

本発明記載の試薬抗原または抗体に結合し得るリガンド
および基には、それに結合している試薬を試験すべき化
合物および材料と判別するのに使用し得る物理的または
化学的特性を有する単体、化合物または生物学的物質が
含まれる。

本件明細書においては、標識法は明瞭性の目的で抗体の
標識との関連で記述されているが、限定のためではなく
、記述された方法は一般に、タンパク質性の化合物また
は材料、たとえばここでの試薬妊娠性抗原または胎児性
制限抗原のいかなるものの標識にも適している。

本発明記載の放射性標識抗体は生体内診断試験に使用す
ることができる。標識した抗体の比放射能は放射性標識
の半減期、同位体純度およびいかにして抗原または抗体
に標識を組み入れたかに依存する。表Ａには数種の通常
使用する同位体、その比放射能および半減期が列記しで
ある。免疫学的検定法試験においては一般に、比放射能
がより高ければ感度もより良好である。。

表　　Ａ 同位体　　純粋同位体の比放射能　　半減期（キューリ
ー１モル） １’ｃ　　　　　６．２５　Ｘ　１０’　　　　５７２
０年”Ｈ２，９１Ｘ　１０’　　　　１２．５年”Ｓ　
　　　　１．５０　Ｘ’　１０’　　　　　８７日１２
Ｍ　　　　　２．１８　Ｘ　ｔｏ’　　　　　６０日”
Ｐ　　　　　３．１６　Ｘ　１０’　　　　１４．３日
日１１　　　　１．６２　Ｘ　１０’　　　　８．１日
表Ａに列記した放射性同位体で抗体を標識する方法は当
該技術で周知されているものである。

たとえばトリチウム標識法は米国特許第４．３２０．４
３８号に記載されている。特に抗体に受は入れられてい
るヨウ素化法、トリチウム標識法おヨヒ３’Ｓ　ｌｉｍ
法１１ゴディング（Ｊ、　Ｇｏｄｉｎｇ）　。

モノクローン抗体：原理と実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　
ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）　、ニューヨーク：アカデ
ミツクプレス（１９８３）　１２４−１２６ページに記
載されており、本件明細書に引用されている。ヨウ素化
抗体に関する他の方法はハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）およ
びグリーンウッド（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）　。

ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　１４４　：　９４５　
（１９６２）に、およびデーピッド（Ｄａｖｉｄ）ら、
生化学（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　、　）襲：　１０１４−１
０２１　（１９７４）に、ならびに米国特許第３．８６
７．５１７および４，３７６．１１０号に記載されてい
る。適当な系、結合方法およびこれに伴う基質反応は、
たとえば米国特許ＲＥ−３１，００６、第３．６５４，
０９０．４，２１４，０４８．４，２８９，７４７．４
，３０２，４３８．４．３１２，９４３．４，３７６．
１１０号に開示されており、本件明細書に引用されてい
る。他の適当な系の例はペスケ（Ｐｅ５ｃｅ）ら、臨床
化学（ｃＩｉｎ、　Ｃｈｅｍ、）　２０：　３５３−３
５９　（１９７４）およびウィズダム（Ｇ、　Ｗｉｓｄ
ｏｍ）臨床化学（ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅｍ−）　２２　：
　１２４３　（１９７６）に記載されている。

標識に使用し得る適当な酵素類および各類の特定の例の
リストを以下に示す。

表　　Ｂ 類　　　　　　酵素例 ヒドロラーゼ類カ ルボヒドラーゼ類　アミラーゼ ヌクレアーゼ類　　　ポリヌクレアーゼアミダーゼ類　
　　　アルギナーゼ プリンデアミナーゼ 類　　　　　　　　アデナーゼ ペプチダーゼ類　　　アミノポリペプチダーゼプロテイ
ナーゼ類　　ペプシン エステラーゼ類　　　リパーゼ 鉄酵素類　　　　　　カタラーゼ 銅酵素類　　　　　　チロシナーゼ 助酵素含有酵素類　　アルコールデヒドロゲナーゼ 酵素還元性チトクロ ーム類　　　　　　コハク酸デヒドロゲナーゼ黄色酵素
類　　　　　シア７オラーゼ ムスターゼ類　　　　グリオキサラーゼデモラーゼ類　
　　　アルドラーゼ オキシダーゼ類　　　グルコースオキシダーゼホースラ
ディッシュペルオ 適当な酵素はホーク（Ｈａｗｋ）ら、実用生理化学（Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）　、ニューヨーク：マグロ−ヒル、　
３０６−３９７ページ（１９５４）に記載されている。

蛍光原および発色原酵素（その存在下に、選択された基
質が蛍光体化合物または発色厚化合物を生成する酵素）
が各部分の標識に有用である。抗体の抗原に結合する能
力を損なうことなく抗体に酵素を選択的に結合させる方
法およびタンパク質性試薬に酵素を結合させる方法は当
該技術で周知されている。

適当な酵素およびこれを抗体に結合させる方法は、たと
えばチバタ（＋、　Ｃｈｉｂａｔａ）、固定酵素（Ｉｍ
ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）　、　ハルステ
ッド出版：ニューヨーク（１９７８）　、クアトレカサ
ス（Ａ、　Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）　、生物化学雑誌
（Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ−）　２４５ｊ　３０５９
　（１９７０）　；ウィルソン（Ｍ、　Ｗｉｌｌｓｏｎ
）ら、。

免疫蛍光法および関連染色技術国際会議（Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｉｍｍ
ｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｓｅｎｃｅ　ａｎｄＲｅｌａＬｅ
ｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　＊ク
ナップ（Ｗ。

Ｋｎａｐｐ）ら編、アムステルダム：エルゼビア（Ｅｌ
ｓｅｖｔｅｒ）、　２１５−２４４ページ（１９７８）
　、サリバン（Ｍ。

Ｓｕｌ　ｌ　１ｖａｎ）ら、臨床生化学年報（Ａｎｎ、
　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉ。

ｃｈｅｗ、）　１６：　２２１−２４０　（１９７９）
　；ニグレン（Ｈ，ＮＹｇｒｅｎ）ら、医学生物学（Ｍ
ａｄ、　Ｂｉｏｌ、）　５７：　１８７−１９１　（１
９７９）　；ガドカリ（Ｄ、　Ｑａｄｋａｒｉ）ら、ウ
ィルス学方法論雑誌（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　Ｍｅｔｈ、
）　１０：　２１５−２２４（１９８５）　；ティーラ
セン（Ｐ、　Ｔｉｊｓｓｅｎ）ら１分析生化学（Ａｎａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｉ、）　１３６　：　４５１−４
５７　（１９８４）：ツルタ（Ｊ、　Ｔｕｒｕｔａ）ら
１組織化学細胞化学雑誌（Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、
　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）　３３　：　７６７−７７７（
１９８５）　；イシカワ（Ｅ、　［ｓｈｉｋａｗａ）　
、免疫検定法雑誌（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）　
４　：　２０９−３２７　（１９８３）　；および米国
特許第４，１９０．４９６号に記載されている。

たとえば、好ましい酵素およびこれに対応する適当な基
質にはホースラデイツシュペルオキシダーゼも含まれ、
これに適した基質には　０−フ二二レンジアミン、ｍ−
７二二レンジアミン、０−ジアニシジン、および４−ク
ロロ−ａ−ナフトールがある。好ましい酵素には　β−
ガラクトシダーゼも含まれ、これに適した基質には４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−
ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトース、ｐ−ニトロフ
ェノール、０−ニトロフェニル−β−Ｄ〜ガラクトース
、および０−二トロフェノールがある。好ましい酵素に
はアルカリホスファターゼも含まれ、これに適した基質
は　リン酸ｐ−ニトロフェニル、リン酸インドキシル、
およびリン酸５−ブロモ−３−クロロインドキシルがあ
る。

抗体を酵素標識する適当な方法の例にはカルボジイミド
、ジアルデヒド、および二官能性結合剤の使用が含まれ
る。アミド基を経由する酵素の結合は、非水溶媒、たと
えばジメチルホルムアミド、ジオキサン、ジメチルスル
ホキシド、テトラヒドロ７ラン等に入れた塩化チオニル
、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドまたは同様の試薬でタン
パク質を処理することにより達成される。これに替わる
結合剤には、たとえば、カルボジイミド類、たとえばｌ
−エチル−（３−（Ｎ、Ｎ’−ジメチルアミノ）−プロ
ピル）−カルボジイミド、■−シクロへキシル−３−（
２−モルホリノエチル）−カルボジイミド、ｐ−トルエ
ンスルホン酸メチル、４−（Ｎ−マレイミドエチル）−
シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシニミジル、およ
び３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン酸スクシニ
ミジルが含まれる。

酵素のカルボヒトラード部分はまた、酸化してアルデヒ
ドとし、イムノグロブリンのりシルアミノ基と反応させ
てシッフ塩基を形成させることもできる。ホウ水素化ナ
トリウムによる還元は酵素と抗体との安定な結合に効果
を有する。ホースラデイツシュペルオキシダーゼと抗体
とは、ウィルソン（Ｍ、　Ｗｉｌｌｓｏｎ）ら、免疫蛍
光法および関連染色技術国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎＩｍｍｕｎｏｆ
ｌｕｏｒｅｓｓｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔａｄ　Ｓ
ｔａｉｎｉｎｇ　Ｔａｃｈｎｉｑｕｅｓ）　、クナップ
（Ｗ、　Ｋｎａｐｐ）ら編、アムステルダム：エルゼビ
ア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）　、　２１５−２４４ページ（
１９７８）の方法により、イムノグロブリンに効果的に
結合させることができる。蛍光体標識抗体および発色体
標識抗体は、当該技術で公知の標準蛍光体部分より製造
することができる。抗体および他のタンパク質が約３１
０　ｎｍまでの波長を有する光を吸収するので、蛍光体
部分は３１０　ｎｍ以上の、好ましくは４０００ｍ以上
の波長でかなりの吸収を有するように選択するべきであ
る。多くの適当な蛍光体および発色体がストライヤー（
５ｔｒｙｅｒ）　、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１
６２　：　５２６　（１９６８）およびブランド（Ｌ、
　Ｂｒａｎｄ）ら、生化学年報（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　４１　：　８４３−８６８　（１
９７２）に記載されている。抗体は、たとえば米国特許
第３．９４０，４７５．４，２８９．７４７および４，
３７６．１１０号に開示されているような通常の方法に
より、蛍光発色体基で標識することができる。

上記の幾つかの望ましい性質を有する蛍光体のグループ
の一つはキサンチン染料であり、これには３．６−シヒ
ドロキシー９−７二二ルキサントヒドロールとレサミン
類とより誘導されたフルオレスカミン類および３．６−
ジアミツー９−７二二ルキサントヒドロールとりッサニ
ムローダミン　Ｂ　とより誘導されたレサミン類が含ま
れる。９−ｏ−カルボキシフェニルキサントヒトロール
のローダミン誘導体村よびフルオレスカミン誘導体は９
−０−力ルポキシフェニル基を有する。反応性結合基、
たとえばアミ７基およびイソチオシアネート基を有する
フルオレスカミン化合物、たとえばフルオレッセインイ
ソチオシアネートおよびフルオレスカミンは容易に入手
し得る。

蛍光体化合物の他の一つのグループは、ａ−または　β
−位にアミノ基を有するナフチルアミン類である。ナフ
チルアミン化合物にはｌ−ジメチルアミノナフチル−５
−スルホン酸塩、ｌ−アニリノ−８−ナフタレンスルホ
ン酸塩および２−ｐ−トルイソニルー６−ナフタレンス
ルホン酸塩が含まれる。他の染料には３−フェニル−７
−インジアナトクマリン；アクリジン類、たとえば９−
インチオシアナドアクリジンおよびアクリジンオレンジ
；Ｎ−［ｐ−（２−ベンゾキシアゾリル）−フェニル］
−マレイミド；ベンゾキシアジオゾール類、たとえば４
−クロロ−７−二トロベンゾー２−オキサ−１，３−ジ
アゾールおよび７−（ｐ−メトキシベンジルアミノ）−
４−二トロペンジルー２−オキサ−１，３−ジアゾ、−
ルースチルベン類、たとえば４−ジメチルアミノ−４゛
−イソチオシアナトスチルベンおよヒ４−ジメチルアミ
ノー４′−マレイミドスチルベン；Ｎ、Ｎ’−ジオクタ
デシクロキサカルボキシアミン−ｐ−トルエンスルホン
酸塩；ピレン類、たとえば８−ヒドロキシ−１，３，６
−ピレントリスルホン酸、ｌ−ピレン酪酸、メロシアニ
ン５４０、ローズベンガル、２．４−ジフェニル−３−
（２Ｈ）−フラノン、ｏ−７タラルデヒド、ならびに他
の容易に入手し得る蛍光体分子が含まれる。これらの染
料は活性官能性基を有するか、まｔ；はこの種の官能性
基を容易に導入し得る。

抗体は、ゴディング（Ｊ、　Ｇｏｄｉｎｇ）　、モノク
ローン抗体：原理と実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　
Ｐｒａｃｔｉｃｅ）　、ニューヨーク：アカデミツクプ
レス（１９８３）　２０８−２４９ページに記載された
方法により、蛍光発色体または発色体で標識することが
できる。蛍光発色体の濃度はゴディング上掲書の２２９
ページの表に従って選択する。たとえば、フルオレッセ
インイソシアネートＣ１−０ｍｇ／ｍｌ）またはローダ
ミンイソシアネー）　（１０，０ｍｇ／ｒｓＱ）のＤＭ
ＳＯ溶液を調製し、所望の体積（タンパク質溶液の全体
積の１−１０％）をタンパク質溶液に、撹拌しなから滴
々添加する。

反応は２時間、光を遮断して行う。生成物を、０．１％
のＮａＮＯｓを含有するセファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ）　Ｇ−２５の　ＰＢＳ　中ゲル上でのゲル濾過に
より精製して未反応の、または加水分解した蛍光発色体
を分離する。抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の不存在は
２８０　ｒｉｍで、また、その可視領域のビ、−り（フ
ルオレッセイン化抗体では４９５　ｎｍ、ローダミン化
抗体では５５０　ｎｍ）で測定する。蛍光発色体対タン
パク質比はゴディング（Ｊ、　Ｇｏｄｉｎｇ）。

モ／クローン抗体：原理と実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　
ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）　、　＝　ニーヨーク：ア
カデミツクプレス（１９８３）　２２４−２２５ページ
の方法により計算する。抱合体は使用まで４℃で、光を
遮断して貯蔵する。抗体溶液濃度がｌ　ｍｇ／ｒａＱ未
満であるならば、溶液にＢＳＡ　を添加して最終濃度を
ｌ　ｍｇ７ａＱとする。

本発明記載の検定法に使用する抗体および試薬抗原はア
ビジンまたはビオチンに共有結合させることができる。

適当な結合方法には二官能性架橋剤による架橋が含まれ
る６適当な二官能性化合物はビータース（Ｋ、　Ｐｅｔ
ｅｒｓ）ら、生物化学年報（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ、）　４６　：　５２３　（１９７７）に記
載されている。イミド酸アルキルは、タンパク質により
与えられた官能基の中でも高度の特異性を示す。

この反応は主としてアミノ基に特異的である。適当な結
合試薬の例にはアミドエステルたとえばマロニミド酸ジ
メチル、アジド類たとえばイムノ基と容易に反応してア
ミド結合を作るタードリルジアジドのアシルアジドが含
まれる。ジハロゲン化アリール（たとえば１．５−ジフ
ルオロ−２，４−ジニトロヘンセン、マたは４．４′−
ジフルオロ−３，３″−ジニトロフェニルスルホン）、
ゲルタールアルデヒド、ｌ−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩、シマレイ
ミド、混合酸無水物、ｍ−マレアミドベンゾイルＮ−ヒ
ドロキシスクシニミドエステル、および他の公知の架橋
剤を使用することができる。

上述の試薬類は基本的に不可逆の結合を与える。

二硫化物またはグリコールのような官能基を有する二官
能性薬剤を使用することもできる。これらは、所望なら
ば架橋反応後に切断し得る結合を与える。この種の薬剤
には３，３′−ジチオビスプロピオニミド酸ジメチル、
プロピオニミド酸スクシニミジル、Ｎ−（３−フルオロ
−４，６−シニトロフエニル）−シスタミン、タードリ
ルジアジド、タードリルジー（グリシルアジド）および
タードリルジー（ｇ−アミノカプロイルアジド）が含ま
れる。

他の場合には、結合は試薬自体の間で直接に形成するこ
とができる。たとえば、抗体は個々の物質の官能基を通
してビオチンと結合することができる。特定の例として
、ビオチンは過ヨウ素酸塩で処理し、抗体と反応させて
、ビオチンとアビジンとの結合を阻害することなく、ま
た抗体の免疫学的活性を遮蔽することなく、シッフ塩基
形状とすることができる。アビジン抱合試薬およびビオ
チン化試薬はベクター研究所（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　Ｃａ１
ｉｆｏｒｎｉａ）より入手し得る。

二官能性架橋剤を用いる公知の技術には以下のものが含
まれる。（ａ）１段階ゲルタールアルデヒド結合、アブ
ラメアス（Ｓ、　Ａｖｒａｍａａｓ）　＊免疫化学（１
＋ｕｍｕｎｏｃｈｅｍ、）　Ｑ　：　４３　（１９６９
）　；　（ｂ　）　２段階ゲルタールアルデヒド結合、
アブラメアス（Ｓ。

Ａｖｒａｍｅａｓ）　＊免疫化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍ、）旦：　１１７５（１９７１）　　：および（ｃ）
シマレイミド結合、カド−（Ｋ、　Ｋａｔｏ）ら、ヨー
ロッパ生化学雑誌（Ｅｕｒｏ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　６２　：　２８５　（１９６
６）。

抗体はナトウィ’／チ（Ｄ、　Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ）ら
、応用放射線学雑誌（Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｒａｄ、）　
３５　：　５５４−５５７（１９８４）およびパラフレ
−（Ｒ，Ｂｕｃｋｌｅｙ）ら、ヨーロッパ生化学協会連
合（Ｆｅｄ、　Ｅｕｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、）　１６６　：　２０２−２０４　（１９８４
年１月）の方法に従って金属核種で標識することもでき
る。この方法においては抗体がキレート剤、たとえば、
金属核種とキレートを形成し得るジエチレントリアミン
五酢酸（ＤＴＰＡ）と結合する。ＤＴＰＡ　の二環状無
水物を乾燥溶媒、ｔ；とえばクロロホルム、エーテルま
たは乾燥ＤＭＳ○　にけん濁させて０．１　ｍｇ／ｍＱ
のけん濁液を調製する。ｌ：ｌのＤＴＰＡ　対イムノグ
ロブリン比を与えるのに十分な量を清浄な乾燥した試験
管にとり、窒素下で蒸発させる。上に使用したｐＨ７，
０−７，５の０．０５　Ｍ炭酸水素塩緩衝剤食塩水中の
抗体溶液（ｔｏ　−２０ｍｇ／ｍＱ＞　　１０−２０ミ
クロリツトルを乾燥ＤＴＰＡに添加し、内容物を０．５
−１．０分間撹拌する。

同一の緩衝溶液を用いて結合タンパク質配合液を０．２
　　ｍＱに希釈し、セファデックス　Ｇ−５０ゲルを有
する５　ｃｍのゲル濾過カラムで、食塩水溶離液を用い
て精製する。結合効率は、ｐＨ６，０の０．５Ｍ酢酸塩
緩衝溶液に入れた“キーレーショングレード”のＩｌｌ
　１　ｎを添加して、精製前に測定する。結合効率を計
算するために抗体に結合したＤＴＰＡ　　を分離するに
は薄層クロマトグラフィーを使用する。ＤＴＰＡ−結合
抗体は、たとえば＋１１１ｎ中！、１１１Ｂｉ＋３およ
び”Ｇａ”のような金属放射性核種との結合が必要とな
るまで、４℃で貯蔵することができる。

本発明はさらに、以下の特定的な、しかし非限定的な実
施例により説明する。これと異なる指示のない限り、温
度は°Ｃで、百分率は重量％で表す。

実施例　ｌ ポリクローン抗胎児性フィブロネクチン抗体胎児性フィ
ブロネクチンを工ングバル（Ｅｎｇｖａｌｌ）およびル
オスラーティ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）　＋国際癌雑誌（
Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）　２０　：　ｌ　−５
（１９７７）の記載のようにして、羊水より精製する。

抗胎児性フィブロネクチン抗体は、たとえばストラー（
Ｓｔｏｌｌａｒ）の文献、酵素学の方法（Ｍａｔｈ。

Ｅｎｚｙｍ、）　７０　：　７０　（１９８０）に記載
されている免疫技術および手順を用いて、ウサギに胎児
性フィブロネクチン抗原に対する免疫性を与えて採取す
る。

この抗血清を、たとえばラング（Ｌａｎｇｅ）ら、臨床
実験免疫学（ｃＩｉｎ、　Ｅｘｐ、　１ｍｍｕｎｏ１．
）　２５：　１９１（、１９７６）およびビセッキー（
Ｐｉｓｅｔｓｋｙ）ら、免疫学方法論雑誌（Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎ、　Ｍｅｔｈ、）　４１　：’　１８７　（１９
８１）に記載されているような、モノクローン抗体に用
いられるものと同様の固相検定法で選別する。

この抗血清の　ＩｇＧ　分画を、胎児性フィブロネクチ
ンが結合している　ＣＮ　　Ｂｒ−セファロース（ｃＮ
　　Ｂｒ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ）　４Ｂ　（ファルマシ
ア精密化学薬品（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）　）を使用する親和性クロマトグラフ
ィーによりさらに精製する。結合に使用する方法は上記
ゲル製造業者の、親和性クロマトグラフ４−　（Ａｆｆ
ｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）　、　７
　フルマシア精密化学薬品、　１５−１８ページに推奨
されているものである。

２ないし３倍体積の緩衝液（０，０１Ｍ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ
。

ｐＨ７，２）を用いてカラムを平衡に達せしめ、ついで
、抗胎児性フィブロネクチン抗体含有溶液をカラムに適
用する。タンパク質がもはやカラムより流出しなくなる
まで、溶離液の吸光度を２８０ｎｍで監視する。ついで
、このカラムをｐＨ２，５の０．１　Ｍグリシン緩衝液
で洗浄して、免疫親和性結合した抗胎児性フィブロネク
チン抗体を脱着させる。ピークのタンパク質分画を集め
、貯蔵し、ｐＨ７，２の０．０１ＭＰＢＳ　に対して４
°Ｃで２４−３６時間、緩衝液をしばしば換えながら透
析する。

より高い純度が望ましいならば、上記の方法により、成
人血漿性フィブロネクチンの結合した親和性カラムに親
和性精製した　ＩｇＧ　　を流して、成人血漿性フィブ
ロネクチンと交差反応するいかなる抗体をも除去するこ
とができる。

実施例　２ モノクローン抗胎児性フィブロネクチン抗体実施例１の
方法により得られた精製胎児性フィブロネクチンを使用
し、マウスに免疫性を与えるための抗原として胎児性フ
ィブロネクチンを用いるゴーフル（Ｇａｌｆｒｅ）およ
びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　、酵素学の方
法（Ｍｅｓｈ、　Ｅｎｚｙｍ、）　７３　：　１（１９
８１）ならびにマツウラ（Ｈ，Ｍａｔｓｕｕｒａ）およ
びハコモリ（Ｓ、　ｌＢｋｏｍｏｒｉ）ら、米国国立科
学アカデミ−報文集（Ｐｒｏｃ、　ＮａＬｌ、Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）８２　：　６５１７−６５２１
　（１９８５）の標準法を使用して、胎児性フィブロネ
クチンに対するマウスのモノクローン抗体を得る。文献
、たとえばラング（Ｌａｎｇｅ）ら、臨床実験免疫学（
ｃＩｉｎ、　Ｉｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈ、）　２５：１９
１　（１９７６）およびピセツキー（Ｐｉｓｅｔｓｋｙ
）ら免疫学方法論雑誌（Ｊ、夏ｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈ、
）　４１　：　１８７（１９８１）に記載されている技
術の変法を用いてこのモノクローン抗体を選別する。

腹水またはヒブリドーマ培養上澄液より、タンパク質−
Ａ　結合セファロース−４Ｂ（ファルマシア精密化学）
を用い、ティーツソン（Ｔｉｊｓｓｏｎ）　＋酵素免疫
検定の実際と理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅ
ｏｒｙｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｎ＋ｍｕｎｏａｓｓａｙ
ｓ）エルゼビア科学出版。

１０５−１０７ページ（１９８５）の方法に従っててマ
ウスのモノクローン抗体を精製する。

実施例　３ 抗体被覆ミクロタイター板 ヤギのＦ（ａｂ’）２抗マウス　ＩｇＧ抗体（タボ（Ｔ
ａｇｏ）　）をｐＨ９，６の０．０５　Ｍ炭酸塩緩衝溶
液でｌＯμｇ／ｒａ（ｔに希釈する。イムロン（Ｉｍｍ
ｕｌｏｎ）ＩＩ　ミクロタイター板（ダイナチック（Ｄ
ｎａｔｅｃｈ）　）の各井戸状くぼみごとに１００μα
ずつを分ける。

このミクロタイター板に蓋をし、室温で４時間、または
４°Ｃで一晩培養する。このミクロタイター板を洗浄緩
衝液（０，０２Ｍ　　トリスＨＣ１，０，０１５ＭＮａ
Ｃｌ、　０．０５　Ｍ　　トウィーン２０）で４回洗浄
する。ついで、各くぼみごとに２００μｍの遮蔽溶液（
０，０１Ｍ　Ｐ　Ｂ　３％　１％Ｂ　Ｓ　Ａ、　０．０
２％Ｎ　ａＮ　ｓｓ　ｐＨ７，４）を加えてミクロタイ
ター板を遮蔽する。米国特許第３．１７１，７８３．３
，２３４，０９６．３．２３６，７３２．３，３０９，
２７５．４，１１６，７７６．４．１２３．５０９．４
．２３４，５６１．４，２５６，６２９．４，２６８，
４３５．４，３１０，４５５、または４，３１３．８７
１号に記載されている方法に従って調製した抗−（ｈＣ
Ｇ）抗体をｐＨ７，４の０．ＯＩＭ　ＰＢＳ−１％　Ｂ
ＳＡ　で１／１０．０００に希釈する。

この溶液１００μαずつを上記の遮蔽したミクロタイタ
ー板の各くぼみに加える。このくぼみに蓋をし、室温で
２時間、または４℃で一晩培養する。

ついで、このミクロタイター板を上記のような洗浄溶液
で４回洗浄する。ここで試料の免疫検定の準備が整った
。

実施例　４ ポリクローン抗体被覆ミクロタイター板実施例１の記載
と同様にして調製し、さらに精製して成人性フィブロネ
クチン交差反応性を除いたウサギの抗胎児性フィブロネ
クチン抗体をｐＨ９，６の０．０５Ｍ炭酸塩緩衝溶液で
１０　ｕｇ／ｖｒＱに希釈する。イムロンＩＩ　ミクロ
タイター板（ダイナチック）の各井戸状くぼみごとに１
００μＱずつを分ける。このミクロタイター板に蓋をし
、室温で４時間、または４℃で一晩培養する。このミク
ロタイター板は使用ごとにくぼみの充填、排出を完全に
行って、洗浄緩衝液（０，０２Ｍ　　トリスＨＣｌ、　
０．０１５　Ｍ　　ＮａＣ１，０，０５Ｍ　　）ウィー
ン２０）で４回洗浄する。ついで、各くぼみごとに２０
０４ｆｆ　ノ遮蔽溶液（０，０１Ｍ　ＰＢＳＳ　１％Ｂ
ＳＡ、　０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ７，４）を加えテミ
クロタイター板を遮蔽し、室温で１時間培養する。つい
で、このくぼみを上記のようにして洗浄緩衝液で４回洗
浄する。ここで、このミクロタイター板は試料の免疫検
定の準備が整った。

実施例　５ モノクローン抗体被覆ミクロタイター板ヤギのＦ（ａｂ
’）、抗マウス　ＩｇＧ　抗体（タボ）’ｋ　ｐＨ９，
６（７）　０．０５　Ｍ炭′酸塩緩衝溶液テｌｏμｇ／
ｍＱに希釈する。イムロン１！ミクロタイター板　・。

（ダイ、ナテック）の各井戸状くぼみごとに１００μａ
を分ける。このミクロタイター板に蓋をし、室温で４時
間、または４°Ｃで一晩培養する。このミクロタイター
板を実施例４に記載したものと同様の洗浄緩衝液で４回
洗浄する。ついで、各くぼみに実施例４に記載したもの
と同様の遮蔽溶液を加えてミクロタイター板を遮蔽する
。実施例２と同様にして調製したマウスのモノクローン
抗胎児性フィブロネクチン腹水をｐＨ’　７．４（７）
　０．０１　Ｍ　ＰＢＳ−１％Ｂ　Ｓ　Ａ　−ｔ’　１
１５０００　＋：：希釈する。この溶液１００μＱずつ
を上記の遮蔽したミクロタイター板の各くぼみに加える
。このくぼみを室温で２時間、または４°Ｃで一晩培養
し、蓋をする。ついで、このミクロタイター板を上記の
洗浄緩衝液で４回洗浄する。ここで試料の免疫検定の準
備が整った。

実施例　６ 酵素標識抗ｈＣＧ抗体 米国特許第３．１７１，７８３．３，２３４，０９６．
３，２３６．７３２または３，３０９．２７５号の方法
に従って抗ｈＣＧ　抗体を調製し、アブラメアス（Ａｖ
ｒａｍｅａｓ）　＋免疫化学（１ｍｎ＋ｕｎｏｃｈｅｍ
、）　６４　：　４３　（１９６９）の１段階ゲルター
ルアルデヒド法に従ってアルカリホスファターゼで抱合
する。

実施例　７ 酵素標識抗フィブロネクチン抗体 米国特許第４．３２５．８６７号の方法に従って調製し
た、またはＡＴＣＣＨＢ　９１（アメリカ形式％式％ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）　）より誘導した抗フィ
ブロネクチン抗体をアブラメアス（Ａｖｒａ＋１ｌａａ
ｓ）　、免疫化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｈａｍ、）　６　：
　４３　（１９６９）の１段階ゲルタールアルデヒド法
に従ってアルカリホスファターゼで抱合する。

実施例　８ 妊娠試験 子宮頚管または子宮腔部の近傍の腟腔より試料を採取し
、検定して非制限妊娠性抗原の存在を判定する。この種
の非制限妊娠性抗原の存在は、患者が妊娠していること
を示す。

この試験には正の対照体と負の対照体とが含まれる。正
の対照体は既知の妊娠性抗原濃度の試料をほぼ検定範囲
（モノクローン基準の検定に関しては２０　ｎｇ／ｖ２
ないし５μｇ／ｍＱ）　ニ入６　Ｊ：つｉ：：　希釈し
たものである。負の対照体は試料希釈剤である。検定標
準は、既知濃度の妊娠性抗原を有する試料を２０　ｎｇ
／ｍＱないし５μｇ７ｍ（ｌの範囲で標準曲線が得られ
るように、試料希釈剤で連続的に希釈したものである。

子宮腔部の近傍で採取した試料を含有する試料採取用ス
ワブを、ｐＨ７，４の０．０５Ｍ１−リス−ＨＣｌ、０
．１５　Ｍ　ＮａＣｌ、　０．０２％ＮａＮ、、１％Ｂ
ＳＡ、５００カリクレイン単位／ｍＱのアプロチニン、
ｌｒＩＩＭ　フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳ
Ｆ）および５ｍＭＥＤＴＡ　よりなる貯蔵溶液０．７５
　ｒｔｒＱに浸す。この貯蔵溶液は、１９８８年９月１
５日に受理された米国特許出願第２４４，９６９号に記
載されている。検定のためにスワブを溶液より取り出し
、この溶液を１３．０００　ｒｐｍで５分間遠心して粒
状物質を除去する。上澄液は、スワブ中にあった可溶性
妊娠性抗原を含有している。

実施例３と同様にして調製したミクロタイター板を検定
に使用する。それぞれ１００μαずつの標準、試料、正
のおよび負の対照体を個別の井戸状くぼみに入れ、室温
で２時間培養する。このミクロタイター板を上記の洗浄
緩衝液で４回洗浄する。実施例６と同様にして調製した
アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗−（ｈＣＧ）抗体１
００μＱを抱合緩衝液（ｐＨ８の０．０２Ｍトリス−Ｈ
Ｃ１，，０，３Ｍ　ＮａＣｌ、　０．０５％トウィーン
２０゜５％Ｂ　Ｓ　Ａ、　０．０２％ＮａＮ５）で１／
１０００に希釈する。各くぼみに１００μＱずつ分け、
室温で２時間培養する。このミクロタイター板を上記の
ようにして４回洗浄する。４　ｍｇ７ｍＱのリン酸　ｐ
−ニトロフェニル（ＰＮＰＰ）を基質として使用する。

これを、０．１２　ｍＭ　のＭｇＣｌ２を有するｐＨ９
，５の０．１８　Ｍ　２−アミノ−２−メチル−１−プ
ロパツール（ＡＭＰ）緩衝液で希釈する。ミクロタイタ
ー板の各くぼみに１００μＱずつを分ける。室温で５分
培養したのち、■−マックス（Ｖ　−Ｍ　Ａ　Ｘ　”）
動的ミクロタイター板読取器（モレキュラー・デイバイ
ス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）　）上、
４０５　ｎｍで、反応速度をミリーＯＤ／分で読み取る
。

反応速度の増大を標準中の妊娠性抗原濃度の増大と相関
させて標準曲線を構成する。未知数は曲線より直接に、
または前もって調整したコンピュータプログラム（モレ
キュラー・デイバイス社）を用いて計算する。試料中の
妊娠性抗原の存在は妊娠を示す。

実施例　９ 択一的妊娠性試験 実施例８の方法を繰り返し、ただ抗−（ｈｃｃ）抗体を
、日本特許出願５９１７４７２６および５９２１４７６
７の記載と同様にして調製した抗−（ＳＰｌ）抗体で置
き換えて、ＳＰｌ妊娠性抗原の検定による妊娠の判定法
を提供する。

実施例８の方法を繰り返し、ｔ；だ抗−（ｈＣＧ）抗体
を、世界特許Ｗ０８６０５４９Ｂの方法により調製した
抗−（ＥＰＦ）（早期妊娠因子）抗体で置き換えて、Ｅ
ＰＦ　の検定による妊娠の判定法を提供する。

実施例８の方法を繰り返し、ただ抗−（ｈＣＧ）抗体を
、米国特許第３，８９２．８４１号の記載と同様にして
調製した抗−（ｈＰＬ）抗体で置き換えて、ｈＰＬ　の
検定による妊娠の判定法を提供する。

実施例８の方法を繰り返し、ただ抗−（ｈＣＧ）抗体を
、米国特許第４　、５５４　、２５６号の記載と同様に
して調製した抗−（タンパク質Ｂ）抗体で置き換えて、
タンパク質Ｂの検定による妊娠の判定法を提供する。

実施例８の方法を繰り返し、ただ抗−（ｈＣＧ）抗体を
、米国特許第４．５００．４５１号の記載と同様にして
調製した抗−（ＰＰ１３）抗体で置き換えて、ＰＰ１３
妊娠性抗原の検定による妊娠の判定法を提供する。

実施例　ｌＯ 択一的妊娠性試験 実施例８の方法を繰り返し、ただ抗−（ｈＣＧ）抗体を
、ウオリタ（Ｍ、　Ｕｏｒｉｔａ）ら９分子免疫学（Ｍ
ｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　１７　：　７９１　（１
９８０）およびウォリタら免疫学方法論雑誌（Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｏｔｈ、）　４２：　１１　（１９
８１）の記載と同様にして調製した抗−（ａ−フェトタ
ンパク質）抗体で置き換えて、ａ−フェトタンパク質妊
娠性抗原の検定による妊娠の判定法を提供する。

実施例８の方法を繰り返し、ただ抗−（ｈＣＧ）抗体を
、ヨーロッパ特許出願１２５５１４　（１９８４年１１
月２１日）の記載と同様の方法により調製した抗−（Ｍ
ＰＩ）抗体で置き換えて、ＭＰＩ　　妊娠性抗原の検定
による妊娠の判定法を提供する。

実施例８の方法を繰り返し、ただ抗−（ｈＣＧ）抗体を
、米国特許第４．４６８．３４５号の記載と同様にして
調製した抗−（ＰＰ１７）抗体で置き換えて、ＰＰ１７
妊娠性抗体の検定による妊娠の判定法を提供する。

実施例８の方法を繰り返し、ただ抗−（ｈＣＧ）抗体を
、米国特許第４．５９２．８６３号の記載と同様にして
調製した抗−（ＰＰ２０）抗体で置き換えて、ＰＰ２０
妊娠性抗体の検定による妊娠の判定法を提供する。

実施例８の方法を繰り返し、ただ抗−（ｈｃｃ）抗体を
、ミラン（Ｊ、　Ｍｉｌｌａｎ）ら、胎盤タンパク質（
Ｐｌａｃｅｎｔａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）　　（４３２
ページ）の記載と同様にして調製した抗−（ＰＬＡＰ）
（胎盤アルカリホスファターゼ）抗体で置き換えて、Ｐ
ＬＡＰ妊娠性抗原の検定による妊娠の判定法を提供する
。

実施例　１１ 妊娠試験 子宮頚管または子宮腔部の近傍の腟腔より試料を採取し
、検定して胎児性制限抗原の存在を判定する。試料中の
この種の胎児性制限抗原の存在は、患者が妊娠している
ことを示す。

この試験には正の対照体と負の対照体とが含まれる。正
の対照体は、既知濃度の胎児性フィブロネクチンを有す
る羊水を、はぼ検定範囲（モノクローン基準の検定に関
しては２０　ｎｇ／＋ｏＱないし５Ｍｇ／＋ａりに入る
ように希釈したものである。負の対照体は試料希釈剤で
ある。検定標準は、既知濃度のフィプロネチンを有する
羊水を２０　ｎｇ／ｍＱないし５μｇ７ｍｍの範囲で標
準曲線が得られるように、試料希釈剤で連続的に希釈し
たものである。

試料希釈剤はｐＨ７，４の０．０５Ｍ）リス−ＨＣｌ、
　０．１５　Ｍ　ＮａＣ１，０，０２％ＮａＮ５．１％
ＢＳＡ、５００カリクレイン単位／ｓＱのアプロチニン
、ｌｎ１Ｍ　フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳ
Ｆ）および５ｍＭＥＤＴＡ　よりなるものである。

子宮腔部の近傍で採取したスワブ試料を収集用ガラスび
ん中の試料希釈剤０−７５　ｒｐｍ中に浸す。

検素のためにスワブを溶液より取り出し、この溶液を１
３．００Ｏｒｐｍで５分間遠心して粒状体を除去する。

上澄液は、スワブ中にあった可溶性妊娠性抗原を全て含
有している。

実施例５と同様にして調製したミクロタイター板を検定
に使用する。それぞれ１００μαずつの標準、試料、正
のおよび負の対照体を個別の井戸状くぼみに入れ、室温
で２時間培養する。このミクロタイター板を実施例４お
よび５の記載と同様の洗浄緩衝液で４回洗浄する。実施
例７と同様にして調製したアルカリホスファターゼ抱合
ヤギ抗−（ヒトフィブロネクチン）　１００μＱを抱合
緩衝液（ｐＨ８の０．０２Ｍ）リス−ＨＣｌ、０．３Ｍ
ＮａＣ１，０，０５％トウィーン２０．５％ＢＳＡ。

０．０２％ＮａＮ５）で１／１０００に希釈する。各く
ぼみに１００μαずつ分け、室温で２時間培養する。

このミクロタイター板を上記のよ、うにして４回洗浄す
る。４　ｍｇ／ｍｆｆのリン酸　ｐ−ニトロフェニル（
Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｐ）を基質として使用する。これを、０．
１２　　ｍＭのＭｇＣ１，を有するｐＨ９，５の０．１
８　Ｍ　２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール（
ＡＭＰ）緩衝液で希釈する。ミクロタイター板の各くぼ
みに１００μαずつを分ける。室温で５分培養したのち
、Ｖ−ｖ７　クス（Ｖ−ＭＡＸ”）　　動的ミクロタイ
ター板読取器（モレキュラー・デイバイス社）上、４０
５　ｎｍで、反応速度をミリーＯＤ／分で読み取る。

反応速度の増大を標準中のフィブロネクチン濃度の増大
と相関させて標準曲線を構成する。未知数は曲線より直
接に、または前もって調整したコンピュータプログラム
（モレキュラー・デイバイス社）を用いて計算する。

試料中に有意の胎児性フィブロネクチンを表す妊娠２０
週以前に得た試料は正常子宮妊娠を示す。

有意の量の胎児性フィブロネクチンが存在しない試料は
正常子宮妊娠が存在しないことを示す。

実施例　１２ 子宮外妊娠試験 妊娠に関して正の試験結果を得ており、かつ、子宮外妊
娠の疑いのある患者の子宮腔部の近傍で収集した試料を
用いて実施例１１の方法を繰り返し　ｔこ　。

試料中に有意の胎児性フィブロネクチンの存在しないこ
とを表す妊娠２０週以前に得た試料は子宮外妊娠の存在
を示す。

実施例　１３ 治療的妊娠中絶の生成物試験 治療的妊娠中絶中に得Ｉ；試料を試験して、胎児性物質
が子宮より取り出されたことを確認する。

この試験には正の対照体と負の対照体とが含まれる。正
の対照体は既知濃度の胎児性フィブロネクチンを有する
羊水を貯蔵溶液でｌ／ｌｏ、１／３０、ｌ／９０、ｌ／
２７０．１／７１０および１／２１３０に希釈したもの
である。貯蔵溶液はｐＨ７，４の０．０５Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ、　０．１５　Ｍ　ＮａＣ＋、　０．０２％　Ｎａ
Ｎ３．１％　ＢＳＡ、５００力リクレイン単位／ｒｔｒ
（ｉｆ）７プロチニン、１ｍＭ　フッ化フェニルメチル
スルホニル（ＰＭＳＦ）および５ｍＭＥＤＴＡ　よりな
るものである。この貯蔵溶液は、１９８８年９月　１５
日に受理された米国特許出願第２４４．９６９号に記載
されている。負の対照体は妊娠初期の３箇月の母胎血漿
を貯蔵溶液で１１５および１／１０に希。釈したもので
ある。貯蔵溶液は負のバックグラウンド対照体として使
用する。

治療的妊娠中絶中に採取した組織または他の物質の試料
を０．７５　ｍＱの試料希釈剤中に分散させる。この試
料溶液を１ｍＱのミクロヒュージ管中で遠心（１３，０
００ｒｐ＋ｙで５分間）して粒状体を除去する。

実施例５と同様にして調製したミクロタイター板を検定
に使用する。それぞれ１００μαずつの標準、試料、正
のおよび負の対照体を個別の井戸状くぼみに入れ、室温
で２時間培養する。このミクロタイター板を実施例４に
記載した洗浄緩衝液で４回洗浄する。実施例６と同様に
して調製したアルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗−（ｈ
ＣＧ）１００μＱを抱合緩衝液（ｐＨ８の０．０２　Ｍ
　　トリス−ＨＣｌ、０．３　Ｍ　ＮａＣ１，０，０５
％トウィーン２０１５％Ｂ　Ｓ　Ａ、　０．０２％Ｎａ
Ｎ５）で１／１０００に希釈する。各くぼみに１００μ
αずつ分け、室温で２時間培養する。このミクロタイタ
ー板を上記のようにして４回洗浄する。４　ｍｇ／ｍ（
ｌのリン酸　ｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰＰ）を基質と
して使用する。これを、０．１２　　ｍＭ　のＭｇＣ１
，を有するｐＨ９，５の０．１８　Ｍ　２−アミノ−２
−メチル−１−プロパツール（ＡＭＰ）緩衝液で希釈す
る。ミクロタイター板の各くぼみに１００μαずつを分
ける。

室温で５分培養したのち、■−マックス（Ｖ−ＭＡ　Ｘ
　ＴＭ）　　動的ミクロタイター板読取器（モレキュラ
ー・デイバイス社、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）上
、４０５ｎｍで、反応速度をミリーＯＤ／分で読み取る
。

反応速度の増大を標準中の胎児性制限抗原濃度の増大と
相関させて、標準曲線を構成する。未知数は曲線より直
接に、または前もって調整したコンピュータプログラム
（モレキュラー・デイバイス社）を用いて計算する。

妊娠による生成物を含有する試料中に有意の量の胎児性
フィブロネクチンが見いだされれば、正常妊娠とその終
結とが確認される。妊娠患者において有意の量の胎児性
フィブロネクチンが存在しないならば、子宮外妊娠の可
能性を示す。

実施例　１４ 自発妊娠中絶試験 正常妊娠の疑似自発妊娠中絶中に得た腟排出物の試料を
用いて実施例１３の方法を繰り返す。自発妊娠中絶（流
産）よりの試料は排出物中の有意レベルの胎児性フィブ
ロネクチンを示す。排出物中に胎児性フィブロネクチン
が有意のレベルで検出されないならば、妊娠が継続して
いることを示す。

実施例　１５ 早期陣痛／羊膜破裂サンドウィッチ免疫検定妊娠２０−
３８週中に得た試料を用いて実施例１３の方法を繰り返
す。試料中の有意量の胎児性フィブロネクチンの存在は
羊膜が破れているであろうことを示し、早期陣痛が起こ
り得ることを示す。

本発明の主なる特徴および態様は以下のとおりである。

１、（ａ）子宮頚管または子宮腔部の近傍で試料を採取
し、その試料中の非制限妊娠性抗原の存在を判定するこ
とよりなる、最初の３箇月中における妊娠判定方法： （ｂ）　　子宮頚管または子宮腔部の近傍で試料を採取
し、その試料中の胎児性制限抗原の存在を判定すること
よりなる、妊娠初期の２０週間中における正常子宮妊娠
の判定方法； （ｃ）　　妊娠初期の２０週間中における妊娠患者より
子宮頚管または子宮腔部の近傍で試料を採取し、その試
料中の胎児性制限抗原の不存在を判定することよりなる
、卵管妊娠の判定方法： （ｄ）　　子宮より排出された、または取り出された試
料を採取し、その試料中の胎児性制限抗原の存在を判定
することよりなる、妊娠による生体排出生成物の判定方
法；または （ｅ）　　妊娠２０週より後の患者より後穹、子宮頚管
または子宮腔部の近傍で試料を採取し、その試料中の胎
児性制限抗原の存在を判定することよりなる、早期陣痛
または早期羊膜破裂の危険増大の判定方法 よりなる腟腔より採取した試料中の診断指標の存在の判
定方法。

２、（ａ）子宮頚管または子宮腔部の近傍より試料を採
取し、 （ｂ）　　その試料中の非制限妊娠性抗原の存在を判定
する ことよりなる上記の第１項記載の初期の３箇月中におけ
る妊娠判定方法。

３、（ａ）子宮頚管または子宮腔部の近傍より試料を採
取し、 （ｂ）その試料中の胎児性制限抗原の存在を判定する ことよりなる上記の第１項記載の妊娠初期の２０週中に
おける正常子宮妊娠判定方法。

４、（ａ）妊娠初期の２０週における妊娠患者より子宮
頚管または子宮腔部の近傍で試料を採取し、 （ｂ）　　その試料中の胎児性制限抗原の不存在を判定
する ことよりなる上記の第１項記載の子宮外妊娠判定方法。

５、（ａ）子宮より放出された、または採取した試料を
得、 （ｂ）　　その試料中の胎児性制限抗原の存在を判定す
る ことよりなる上記の第１項記載の妊娠による生体排出生
成物の判定方法。

６、（ａ）妊娠２０週以後の患者より後穹、子宮頚管ま
たは子宮腔部の近傍で試料を採取し、 （ｂ）　　その試料中の胎児性制限抗原の存在を判定す
る ことよりなる上記の第１項記載の早期陣痛または胎児膜
破裂の危険増大の判定方法。

７、　ａ）試料を抗妊娠性抗原抗体と、抗原−抗体結合
を起こさせるのに十分な時間接触させ ｂ）上記の結合の存在を判定する ことよりなる上記の第１または第２項記載の方法。

８、　ａ）試料を抗妊娠性抗原抗体が付着している不溶
性担体と、抗原−抗体結合を起こさせるのに十分な時間
接触させて試料を担体より取り出し、 ｂ）上記の不溶性担体を抗妊娠性抗原抗体と、抗原−抗
体結合を起こさせるのに十分な時間接触させ、未結合の
抗妊娠性抗原抗体を担体より取り出し Ｃ）上記の不溶性担体上の抗妊娠性抗原抗体の存在を判
定する 各段階よりなる上記の第１１第２または第７項記載の方
法。

９、　ａ）試料を抗胎児性制限抗原類抗体が付着してい
る不溶性担体と、抗原−抗体結合を起こさせるのに十分
な時間接触させて試料を担体より取り出し、 ｂ）上記の不溶性担体を抗胎児性制限抗原類抗体または
抗胎児性制限抗原類抗体と、抗原−抗体結合を起こさせ
るのに十分な時間接触させ、未結合の抗胎児性制限抗原
類抗体を担体より取り出し Ｃ）上記の不溶性担体上の抗胎児性制限抗原類抗体の存
在を判定する 各段階よりなる上記の第１、第３、第４、第５または第
６項記載の方法。

１０、　　ａ）試料を抗胎児性制限抗原類抗体が付着し
ている不溶性担体と、抗原−抗体結合を起こさせるのに
十分な時間接触させて試料を担体より取り出し、 ｂ）上記の不溶性担体を抗胎児性制限抗原類抗体と、抗
原−抗体結合を起こさせるのに十分な時間接触させ、未
結合の抗胎児性制限抗原抗体を担体より取り出し Ｃ）上記の不溶性担体上の抗胎児性制限抗原類抗体の存
在を判定する 各段階よりなる上記の第１１第３、第４、第５または第
６項記載の方法。

１１、上記の妊娠性抗原がｈＣＧ、ｈＣＴ、ｈＰＬ。

ＳＰＩ、ＰＡＰＰ−Ａ、ＰＡＰＰ−ＢＳＨＳＡＰ。

ＰＬＡＰＳＣＡＰ、ＰＰ　５、ＰＡＭＧ、、ＰＡＭＧ２
、β−ＰＡＭ、　　α、−Ｐ　ＡＭ、　　ｈＣＬ　ＲＦ
、　　α−フェトタンパク質、ＥＰＦ、ＭＰ　１．ＰＰ
　　１３、ＰＰ１７、Ｐ　Ｐ　２０、ソマトスタチン、
およびこれらの混合物よりなるグループから選択したも
のであることを特徴とする上記の第１１第２、第７また
は第８項記載の方法。

１２、上記の試料中の判定すべき胎児性制限抗原抗体が
胎児性フィブロネクチンであることを特徴とする上記の
第１、第３、第４、第５、第６、第９または第１Ｏ項記
載の方法。

１３、上記の段階（ｂ）の試薬抗体が物理的に検出可能
な標識を有することを特徴とする上記の第８、第９また
は第１Ｏ項記載の方法。

１４、　　（ａ）不溶性担体ｊこ付着させた抗妊娠性抗
原抗体；　（ｂ）不溶性担体に付着させた抗妊娠性抗原
抗体と標識抗妊娠性抗原抗体、標識抗妊娠性抗原類抗体
、もしくは標識反応性妊娠性抗原との組合わせ；または
（ｃ）不溶性担体に付着させた試薬妊娠性抗原および標
識抗妊娠性抗原抗体を有する試料採取手段の組合わせよ
りなる妊娠性ｒｃ、ｙＫ試験用キット。

１５、　　（ａ）不溶性担体に付着させた抗胎児性制限
抗原類抗体、抗胎児性制限抗原類抗体、もしくは試薬胎
児性制限抗［；　（ｂ）不溶性担体に付着させた抗胎児
性制限抗原類抗体と標識抗胎児性制限抗原類抗体、標識
抗胎児性制限抗原類抗体、もしくは標識試薬胎児性制限
抗原との組合わせ；（ｃ）不溶性担体に付着させた抗胎
児性制限抗原類抗体と標識抗試薬胎児性制限抗原抗体と
の組合わせ；または（ｄ）不溶性担体に付着させた試薬
胎児性制限抗原および標識抗胎児性制限抗原類抗体より
なる、試料中の胎児制限性抗原判定用キット。

１６、上記以外にさらに標識抗サンドウィッチ抗体抗体
をも含有する上記の第１４もしくは第１５項記載のキッ
ト。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）子宮頚管または子宮頚部の近傍で試料を採取
   し、その試料中の非制限妊娠性 抗原の存在を判定することよりなる、最 初の３箇月中における妊娠判定方法； （ｂ）子宮頚管または子宮頚部の近傍で試料を採取し、
   その試料中の胎児性制限抗原の 存在を判定することよりなる、妊娠初期 の２０週間中における正常子宮妊娠の判 定方法； （ｃ）妊娠初期の２０週間中における妊娠患者より子宮
   頚管または子宮頚部の近傍で試 料を採取し、その試料中の胎児性制限抗 原の不存在を判定することよりなる、卵 管妊娠の判定方法； （ｄ）子宮より排出された、または取り出された試料を
   採取し、その試料中の胎児性制 限抗原の存在を判定することよりなる、 妊娠による生体排出生成物の判定方法； または （ｅ）妊娠２０週より後の患者より後穹、子宮頚管また
   は子宮頚部の近傍で試料を採取 し、その試料中の胎児性制限抗原の存在 を判定することよりなる、早期陣痛また は早期羊膜破裂の危険増大の判定方法 よりなる腟腔より採取した試料中の診断指標の存在の判
   定方法。 ２、試料採取手段と、（ａ）不溶性担体に付着している
   抗妊娠性抗原抗体；（ｂ）不溶性担体に付着している抗
   妊娠性抗原抗体と標識抗妊娠性抗原抗体、標識抗妊娠性
   抗原類抗体、もしくは標識反応性妊娠性抗原との組合わ
   せ；または（ｃ）不溶性担体に付着している試薬妊娠性
   抗原および標識抗妊娠性抗原抗体との組合わせよりなる
   妊娠性抗原試験用キット。 ３、（ａ）不溶性担体に付着させた抗胎児性制限抗原抗
   体、抗胎児性制限抗原類抗体、もしくは試薬胎児性制限
   抗原；（ｂ）不溶性担体に付着させた抗胎児性制限抗原
   抗体と標識抗胎児性制限抗原抗体、標識抗胎児性制限抗
   原類抗体、もしくは標識試薬胎児性制限抗原との組合わ
   せ；（ｃ）不溶性担体に付着させた抗胎児性制限抗原類
   抗体と標識抗試薬胎児性制限抗原抗体との組合わせ；ま
   たは（ｄ）不溶性担体に付着させた試薬胎児性制限抗原
   および標識抗胎児性制限抗原抗体よりなる、試料中の胎
   児制限性抗原判定用キット。