-
Vitronectin ist ein Glycoprotein in der Körperflüssigkeit
und im Gewebe von Tieren. Sein Molekulargewicht beträgt
60.000-80.000. Vitronectin wird auch als Serum-Spreading-
Factor, 5-Protein oder Epibolin bezeichnet (Masao Hayashi;
Kagaku to Seibutsu, Bd. 24, Seiten 303-313, 1986).
-
Diese Erfindung betrifft ein einfaches und effizientes
Verfahren zur Herstellung von Vitronectin. Genauer gesagt
betrifft diese Erfindung ein Verfahren für die Herstellung
von Vitronectin, in dem Vitronectin in biologischen
Materialien an immobilisierte Glycosaminoglycane gebunden
wird.
-
Bislang waren die folgenden drei Verfahren, die
inenschliches Plasma/Serum als Ausgangsmaterialien verwenden, als
Herstellungsverfahren für Vitronectin bekannt.
-
Verfahren 1. Vier verschiedene Säulen werden kombiniert.
Es handelt sich um Glaskugel-, Concanavalin A-Sepharose-,
DEAE-Agarose- und Heparin-Sepharose-Säulen. Vitronectin
wird aus menschlichem Plasma/Serum mit ca. 8% Ausbeute
hergestellt (Barnes und Silnutzer; J. Biol. Chein. Bd. 258,
Seiten 12548-12552, 1983).
-
Verfahren 2. Zwei Säulen mit monoclonalem
Anti-menschliches-Vitronectin-Antikörper und Heparin-Sepharose werden
kombiniert. Die Ausbeute beträgt etwa 10-20% (Hayman et
al.; Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Bd. 80, Seiten 4003-4007,
1983).
-
Verfahren 3. Dieses Verfahren besteht aus 5 Prozessen.
Nach 2 Fraktionierungsprozessen, d.h. der Absorption durch
Bariumcitrat und Fraktionierung durch Polyethylenglycol
4000, werden 3 Säulen, und zwar mit DEAE-Cellulose, Blue
Sepharose, und Anti-Albumin-Sepharose kombiniert.
Vitronectin wird mit etwa 7% Ausbeute erhalten (Dahlbäck und
Podack; Biochemistry Bd. 24, Seiten 2368-2374, 1985).
-
Diese Verfahren bringen die folgenden Probleme mit sich.
Verfahren 1 ist ein Komplex von 4 verschiedenen Prozessen,
die zeitraubend (üblicherweise etwa 1 Monat) und
hinsichtlich der Ausbeute (ca. 8%) ineffizient sind. Verfahren 2
beinhaltet die Anwendung monoclonaler Antikörper.
Demzufolge kann das Verfahren nur auf Materialien menschlicher
Herkunft angewendet werden. Es ist zu eingeschränkt und
teuer. Verfahren 3 ist ein Komplex von 5 verschiedenen
Stufen, es ist zeitaufwendig (üblicherweise etwa 2 Wochen)
und hinsichtlich der Ausbeute (ca. 7%) ineffizient. Jede
dieser Methoden ist daher unbefriedigend und für die
industrielle Anwendung nicht gut genug.
-
Die Aufgabe der Erfindung umfaßt die Herstellung von
Vitronectin aus biologischen Materialien auf einfache,
kostengünstige und effiziente Weise. Sie umfaßt weiterhin
die Herstellung von Vitronectin nicht nur aus menschlichem
Plasma, sondern auch aus biologischen Materialien anderer
Tierarten. Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung
Vitronectin aus verschiedenen Arten von Materialien, wie
Körperflüssigkeit, Gewebe und dgl., herzustellen.
-
Diese Aufgaben können gelöst werden durch ein Verfahren
zur Gewinnung von gereinigtem Vitronectin aus einem
biologischen Material, in dem Vitronectin vorhanden ist, im
wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß man immobilisiertes
Glycosaminoglycan mit dem biologischen Material in
Gegenwart
von Harnstoff in Kontakt bringt, wodurch die
Konformation des Vitronectins, das in dem biologischen Material
vorhanden ist, so verändert wird, daß die
Bindungsaktivität des Vitronectins an Glycosaminoglycan selektiv erhöht
wird, wodruch Vitronectin selektiv an das immobilisierte
Glycosaminoglycan bindet, und daß man das gebundene
Vitronectin gewinnt.
-
Der Erfinder hat Vitronectin bereits lange Zeit
biochemisch und zellbiologisch untersucht. Er hat gefunden, daß
durch Harnstoff Vitronectin seine Konformation so ändert,
daß seine Bindungsaktivität an Heparin, eines der
Glycosaminoglycane, steigt (Hayashi et al.; J. Biochem. Bd. 98,
Seiten 1135-1138, 1985). Dieser Befund führte den Erfinder
zu der Erfindung.
-
Figur 1 zeigt ein Elutionsprofil der
Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie. Die Präparation wurde nach dem
Verfahren in Beispiel 1 erhalten. Die gestrichelte Linie
zeigt die Proteinkonzentrationen an, die durch
Absorptionsmessung bei 280 nm bestimmt wurden. Die durchgezogene
Linie gibt die durch Enzym-gekoppelten Immunoassay (ELISA)
bestimmte Menge an Vitronectin an. Die Elutionsfraktionen
zwischen 535 ml und 560 ml stellen gereinigtes Vitronectin
dar.
-
Figur 2 zeigt die Reinheit des Vitronectins von Beispiel
1, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Es
gibt zwei Banden (durch Pfeile bezeichnet) zwischen den
Molekulargewichten 60.000 und 80.000. Diese 2 Banden
entsprechen Vitronectin. Eine Verunreinigung mit anderen
Proteinen wurde nicht gefunden.
-
Figur 3 zeigt die physiologische Aktivität des nach dem
Verfahren in Beispiel 1 hergestellten gereinigten
Vitronectins.
Die Aktivität wurde als
Zellausbreitungsaktivität (cell-spreading activity) an BHK-Zellen (baby
hamster kidney, Babyhamsterniere) bestimmt. Die
Vitronectinpräparation fördert die Ausbreitung von BHK-Zellen mit
etwa 1/50 der Proteinkonzentration, die für Fibronectin
bekannt ist.
-
Jegliche biologische Materialien, die eine kleine Menge an
Vitronectin enthalten, können als biologische Materialien
für die Erfindung verwendet werden. Solche biologischen
Materialien umfassen Körperflüssigkeit, einschließlich
Tierblut, Plasma, Serum und Urin, Gewebe, Organe, Viscera,
Gewebekulturzellen und Gewebekulturmedium. Menschliches
Plasma und Serum sind die besten Materialien, aber
Materialien von anderen Tierarten können ebenfalls verwendet
werden. Als Proteindenaturierungsmittel wird Harnstoff
verwendet. Als immobilisierte Glycosaminoglycane können
Heparin-Sepharos -, Heparan-Sulfat-Sepharose -,
Chondroitin-Schwefelsäure-Sepharose - und
Dermatan-Sulfat-Sepharose -Träger verwendet werden. Die obige Sepharose kann
durch Agarose oder andere Träger ersetzt werden. Heparin-
Sepharose -Träger ist am wünschenswertesten.
-
Die Erfindung wird nun im Detail beschrieben. Harnstoff
wird so zu beispielsweise Säugetierplasma oder -serum
gegeben, daß die Endkonzentration von Harnstoff 4-8 M wird.
Das Plasma/Serum wird mit dem Glycosaminoglycan-bindenden
Träger, wie Heparin-Sepharose -Träger, gemischt.
Vitronectin im Plasma oder Serum wird spezifisch an den
Glycosaminoglycan-bindenden Träger gebunden. Substanzen, die nicht
gebunden wurden, werden ausgewaschen. Dann wird das
gebundene Vitronectin von den immobilisierten
Glycosaminoglycanen eluiert.
-
Die Erfindung wird als ein Verfahren zur Herstellung von
Vitronectin charakterisiert, welches nur aus dem einen
Prozess der Anwendung immobilisierter Glycosaminoglycane
besteht. Wie oben erwähnt, beschrieben Barnes et al. (J.
Biol. Chem. Bd. 258, Seiten 12548-12552, 1983) und Hayman
et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA Bd. 80, Seiten 4003-
4007, 1983) Verfahren, die die Verwendung von
Heparin-Sepharose umfaßten. Bei ihren Verfahren stellte die
Verbindung von Heparin-Sepharose jedoch nur den letzten und
unterstützenden Prozess dar, der den Reinigungsgrad auf das
1,5- bis 2-fache desjenigen der vorhergehenden Stufe
erhöht. Im Gegensatz dazu steigt die Reinheit des
Vitronectins bis auf das etwa 400-fache lediglich durch die
Verwendung von Heparin-Sepharose ohne andere Säulen. Dies
charakterisiert die Erfindung. Der genaue Mechanismus der
spezifischen Wechselwirkung zwischen Vitronectin und
Glycosaminoglycanen, die in der Erfindung gezeigt wurde, ist
unbekannt. Basierend auf den vom Erfinder berichteten
Resultaten (Hayashi et al.; J. Biochem. Bd. 98, Seiten 1135-
1138, 1985: Akama et al.; J. Biochem. Bd. 100, Seiten
1343-1351, 1986) wird auf den folgenden Mechanismus
geschlossen. Auf der Polypeptidkette von Vitronectin
befindet sich ein Ort, der an Glycosaminoglycane bindet. Unter
normalen Bedingungen ist dieser Ort im Inneren der
Polypeptidkette verborgen, sodaß seine Bindungsaktivität
niedrig ist. Die Behandlung von Vitronectin mit 4-8 M
Harnstoff entfaltet den Polypeptidkettenkomplex, so daß die
verborgene Bindungsstelle frei wird, um an
Glycosaminoglycane zu binden. Zusätzlich verlieren andere
Heparin-bindende Proteine in Materialien, wie Plasma, in Gegenwart
von Harnstoff ihre Heparin-bindende Aktivität. Die Zugabe
von Harnstoff ist daher für die spezifische Bindung von
Vitronectin an Glycosaminoglycane wirksam. Normalerweise
wird Heparin aufgrund seiner hohen Aktivität und seines
niedrigen Preises als Glycosaminoglycan verwendet.
-
Die Erfindung, die ein Verfahren zur Herstellung von
Vitronectin betrifft, hat die Vorteile:
-
Das Verfahren besteht aus nur einem Herstellungsprozess.
-
Es benötigt nur kurze Zeit (normalerweise 1-3 Tage).
-
Die Ausbeute ist hoch (15-40%).
-
Die Kosten sind niedrig.
-
Darüberhinaus sind die Ausgangsmaterialien nicht auf
menschliches Plasma oder Serum beschränkt. D.h. das
erfindungsgemäße Verfahren kann ungeachtet der Tierart auch auf
biologische Materialien angewendet werden, die Vitronectin
enthalten. Weiterhin kann das Verfahren auch auf jede Art
von biologischen Materialien angewendet werden, die
Vitronectin enthalten, wie Körperflüssigkeit, Gewebe und
Fragmente davon. Kurz gesagt hat die Erfindung bezüglich
der bekannten Verfahren große Vorteile bei der Einsparung
von Ausrüstung, Zeit und Ausgaben für die industrielle
Anwendung. Außerdem hat die Erfindung Vorteile hinsichtlich
der Bandbreite von Ausgangsmaterialien. Indem man
Zellkulturplatten mit Vitronectin, dem Produkt der Erfindung,
beschichtet, können die Adhäsion und Ausbreitung
verschiedener Zellarten und Bakterien kontrolliert werden. Denselben
Effekt erreicht man, indem man dem Zellkulturmedium
Vitronectin zusetzt. Vitronectin kann auch als
Zelladhäsionsmittel für künstliche Blutgefäße, künstliche Haut,
Kontaktlinsen, künstliche Viscera, Biosensoren, Biochips,
elektronische Vorrichtungen mit biologischen Funktionen
und dgl. verwendet werden. Kurz gesagt kann Vitronectin im
Prinzip als Adhäsionsmittel verwendet werden, das Zellen
und Viren mit jeglichen Materialarten verbindet. Was den
medizinischen Bedarf betrifft, kann Vitronectin für die
Diagnose und Behandlung verschiedener Arten von
Krankheiten, wie Krebs, Blutkrankheiten, Collagen-Krankheiten
verwendet werden, von denen angenommen wird, daß
Veränderungen
von Vitronectin beteiligt sind. Vitronectin kann
ebenfalls für Augenlotionen, Antiinfektionsmittel,
entzündungshemmende Mittel, Mittel zur Gewebsreparatur, etc.
verwendet werden. Weiterhin kann Vitronectin für
Zahnpasten, Kosmetika, usw. verwendet werden.
-
Es folgen einige Beispiele, in denen die Erfindung in die
Praxis umgesetzt wird. Die Erfindung ist jedoch nicht auf
diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
-
Ethanol wird so zu 100 ml menschlichem Plasma bei 4ºC
gegeben, daß die Endkonzentration an Ethanol 10% wird.
Fibrinogen etc. werden durch Zentrifugieren (10.000 UpM, 10
Minuten) bei 4ºC entfernt. Die folgenden Schritte werden
bei Raumtemperatur durchgeführt. Harnstoff wird bis zu
einer Endkonzentration von 8 M Harnstoff zu der
resultierenden Flüssigkeitsfraktion gegeben. Nach 2 Stunden wird das
Gemisch auf eine Heparin-Sepharose -Säule mit 5 ml
Säulenbettvolumen appliziert. Die Säule wird mit 10
Säulenvolumina 8 M Harnstoff, 5 mM EDTA, 10 mM Phosphatpuffer (pH
7,7) gewaschen. Die Säule wird erneut mit 15
Säulenvolumina 8 M Harnstoff, 5 mM EDTA, 10 mM Phosphatpuffer,
enthaltend 0,13 M NaCl, gewaschen. Dann wird die Säule mit 10
Säulenvolumina 8 M Harnstoff, 5 mM EDTA, 10 mM
Phosphatpuffer, enthaltend 0,13 M NaCl, und 1 mM Dithiothreit
gewaschen. Anschließend wird Vitronectin mit 10
Säulenvolumina 8 M Harnstoff, 5 mM EDTA, 10 mM Phosphatpuffer,
enthaltend 0,3 M NaCl, 1 mM Dithiothreit, von der Säule
eluiert. Figur 1 zeigt ein Beispiel des Elutionsprofils. Das
Ausgangsmaterial war menschliches Plasma. Die
Vitronectinmenge wird durch Enzymimmunoassay gemessen, bei dem
Kaninchen-Anti-menschliches-Vitronectin-Antikörper eingesetzt
werden. In Figur 2 ist das Ergebnis der SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese dargestellt, das die Reinheit des
erhaltenen Vitronectins zeigt. Es traten nur 2 Banden mit
Molekulargewichten von ca. 60.000-80.000 auf; dies legt nahe,
daß die Vitronectinpräparation hohe Reinheit aufwies.
Figur 3 zeigt, daß das erhaltene Vitronectin die Adhäsion
und Ausbreitung von BHK-Zellen (Gewebekulturzellen der
Hamsterniere) auf Zellkulturplatten fördert. Dieser Effekt
des Vitronectins wird bereits bei der Proteinkonzentration
0,1 ug/ml beobachtet.
Beispiel 2
-
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wie folgt modifiziert.
Menschliches Serum wurde anstelle von menschlichem Plasma
verwendet. Ethanol wurde nicht zugegeben. 10 mM MgCl&sub2;, 1
mM CaCl&sub2;, 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) wurden anstelle
von 5 mM EDTA, 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,7) verwendet.
Beispiel 3
-
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wie folgt modifiziert.
Die Waschstufe mit 8 M Harnstoff, 5 mM EDTA, 10 mM
Phosphatpuffer, enthaltend 0,13 M NaCl, 1 mM Dithiothreit,
wurde ausgelassen. Für die Elution wurde 0,21 M NaCl, 8 M
Harnstoff, 5 mM EDTA, 10 mM Phosphatpuffer verwendet.
Beispiel 4
-
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde modifiziert; anstelle
von 8 M wurde 4 M Harnstoff verwendet.
Beispiel 5
-
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde modifiziert; anstelle
von 8 M wurde 6 M Harnstoff verwendet.
Beispiel 6
-
Die Präparation wurde auf eine Heparin-Sepharose -Säule
wie in Beispiel 1 appliziert, und die nächsten Stufen des
Verfahrens aus Beispiel 1 wurden wie folgt modifiziert.
Die Säule wurde mit 20 Säulenvolumina 0,1 M NaCl, 8 M
Harnstoff, 5 mM EDTA, 25 mM Phosphatpuffer (pH 8,0)
gewaschen. Vitronectin wurde von der Säule mit 0,5 M NaCl, 8 M
Harnstoff, 5 mM EDTA, 25 mM Phosphatpuffer eluiert.
Beispiel 7
-
Das Verfahren von Beispiel 6 wurde modifiziert;. der pH des
Phosphatpuffers betrug 7,0.
Beispiel 8
-
Das Verfahren von Beispiel 6 wurde modifiziert; der pH des
Phosphatpuffers betrug 6,0.
Beispiel 9
-
Das Verfahren von Beispiel 7 wurde modifiziert; anstelle
von 8 M wurde 6 M Harnstoff verwendet.
Beispiel 10
-
Das Verfahren von Beispiel 9 wurde wie folgt modifiziert.
Statt die Präparation in Anwesenheit von 6 M Harnstoff 2
Stunden bei Raumtemperatur zu belassen, wurde die
Präparation in Gegenwart von 6 M Harnstoff 5 Minuten lang zum
Sieden erhitzt.
Beispiel 11
-
Das Verfahren von Beispiel 7 wurde modifiziert. In
Beispiel 7 wurde Ethanol so zu der Präparation bei 4ºC
gegeben, daß die Endkonzentration an Ethanol 10% wurde.
Stattdessen wurde 20 mM CaCl&sub2; zugegeben, und das Gemisch wurde
2 Stunden lang bei Raumtemperatur belassen.
Beispiel 12
-
Das Verfahren von Beispiel 7 wurde modifiziert. In
Beispiel 7 wurde Ethanol so zu der Präparation bei 4ºC
gegeben, daß die Endkonzentration an Ethanol 10% wurde. Diese
Stufe wurde ausgelassen.
Beispiel 13
-
Das Verfahren von Beispiel 12 wurde modifiziert. 1 mM
Dithiothreit wurde zu allen Lösungsarten zugegeben.
-
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1: Reinheit, Ausbeute und Menge an erhaltenem
Vitronectin
Reinheit(-fach)
Ausbeute (%)
Menge (mg)
Beispiel
*: wurde nicht berechnet.