DD251208A5 - Immunologisches verfahren zur erkennung maligner zellen mit metadatischer zellaktivitaet - Google Patents

Immunologisches verfahren zur erkennung maligner zellen mit metadatischer zellaktivitaet Download PDF

Info

Publication number
DD251208A5
DD251208A5 DD84263171A DD26317184A DD251208A5 DD 251208 A5 DD251208 A5 DD 251208A5 DD 84263171 A DD84263171 A DD 84263171A DD 26317184 A DD26317184 A DD 26317184A DD 251208 A5 DD251208 A5 DD 251208A5
Authority
DD
German Democratic Republic
Prior art keywords
type
antibody
antigen
collagenase
cells
Prior art date
Application number
DD84263171A
Other languages
English (en)
Inventor
Karl Tryggvason
Lance A Liotto
Original Assignee
Kk
����k�������@�Kk��
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kk, ����k�������@�Kk�� filed Critical Kk
Publication of DD251208A5 publication Critical patent/DD251208A5/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
    • G01N2474/20—Immunohistochemistry assay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y10S436/813—Cancer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft immunologische Verfahren zur Bestimmung metastatischer Zellaktivitaet. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren, mit denen maligne Tumorzellen in biologischen Proben, wie Koerperfluessigkeiten, Gewebeextrakten, Gewebeschnitten, Organ- und Zellkulturen, Kulturmedien usw. bestimmt werden koennen. Das erfindungsgemaesse Verfahren besteht aus den folgenden Schritten:a) Inkubieren von Gewebeschnitten oder Zellen mit einem ersten Antikoerper, die fuer das Typ-IV-Kollagenase-Enzymantigen spezifisch ist;b)Bindenlassen des ersten Antikoerpers an das Enzymantigen;c)Zugabe eines zweiten markierten Antikoerpers zu dem ersten Antikoerper und Binden des zweiten markierten Antikoerpers an den ersten Antikoerper, wodurch die Anwesenheit des Typ-IV-Kollagenase-Enzymantigens in der Probe angezeigt wird.Weiterhin betrifft die Erfindung Enzymzubereitungen, die gereinigte Basal-abbauende Metallproteinasen, das Substrat, von dem das Typ-IV-Kollagen herruehrt, enthalten und eine Molmasse von annaehernd 70 000 aufweisen sowie Antikoerperzubereitungen, die polyklonale Antikoerper und monoklonale Antikoerper des Typ-IV-Kollagenase-Enzymantigens enthalten.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Nachweisverfahren metastatischer Zellaktivität durch immunologische Bestimmung des Typ IV-Kollagenase-Antigens mit Hilfe von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern für dieses Enzymantigen. Darüber hinaus werden Zusammensetzungen beschrieben, die markierte oder nichtmarkierte Enzymantigene sowie markierte oder nichtmarkierte polyklonale und monoklonale Antikörper für dieses Enzymantigen enthalten.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Eines der Hauptkennzeichen maligner Zellen ist Invasion und Bildung der Metastase. Dementsprechend sind Verfahren zur Früherkennung und Bekämpfung invasiver Prozesse von signifikanter klinischer Bedeutung. Die Bildung der Metastase ist eine komplexe Folge von Ereignissen, wobei sich maligne Zellen vom Primärtumor ablösen, das umliegende Gewebe befallen, in die Lymph- oder Kreislaufkanäle eindringen, die Gefäßwände an einer entfernten Stelle angreifen und durchdringen, das Gewebe befallen und schließlich wuchern, um damit den metastatischen Herd zu bilden.
Die befallenen Tumorzellen müssen während des Disseminationsprozesses die Basalmembranen an verschiedenen Stellen durchdringen. Basalmembranen sind extrazelluläre Zonen, die eine feste kontinuierliche Schicht darstellen, die Epithel-, Endothel- und Parenchymzellen vom interstitiellen Bindegewebe trennt. Diese Strukturen bestehen aus Kollagen (Typ IV) und nichtkollagenen Komponenten wie Laminin, Proteoglycan, Entactin und Fibronectin. Basalmembranen weisen starke Barrieren fürTumorzellen auf und ihr Abbau ist im metastatischen Prozeß ein wesentlicher Schritt. Man glaubt, diesen Prozeß nun mittels
proteolytischer Enzyme fördern zu können. Erhöhte Spiegel von Proteasen wie Plasminogenaktivatoren, Cathepsin B und D und Proteoglycan-abbauender Enzyme sind sowohl in Tumorgewebeextrakten als auch in Medien kultivierter Tumorzellen beobachtet worden, und diese Enzyme sind als günstige Faktoren für die Messung des invasiven Zellpotentials angesehen worden. Allerdings hat sich die Korrelation zwischen der Freisetzung der Enzyme und der Invasionsfähigkeit maligner Zellen nicht bestätigt. Tatsächlich werden durch manche Zellinien Plasminogenaktivatoren mit nichtinvasiven Eigenschaften produziert. Da weiterhin die oben genannten Proteasen das Typ IV-Kollagen nicht abbauen, liegen für die Tumorzellen keine ausreichenden Mittel vor, die Basalmembranen zu durchqueren.
Von den Anmeldern wurde festgestellt, daß Tumorzellen eine neutrale Protease freisetzen, die spezifisch Typ IV-Kollagen abbaut, und es wurden Verfahren zur Reinigung dieses Enzyms bis zur Homogenität aus einem metastasierten Mäusetumor (Liotta et al., I. Natl. Cancer Inst. 58,1427-1431,1977; Liotta et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 76,2268-2272,1978; SaIo et al., The Journal of Biological Chemistry 258, S.3058-3063,1983) und ebenso aus kultivierten menschlichen Tumorzellen entwickelt. Es wurde gefunden, daß die Aktivität dieses Enzyms, das hier als Typ IV-Kollagenase bezeichnet wird, mit dem metastatischen Potential der Tumorzellen korreliert (Liotta et al.. Nature 284 67-68,1980).
Da gezeigt werden konnte, daß das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen für den Nachweis maligner Zellen mit metastatischer Natur dienen kann, kann das Enzym von großem diagnostischem Wert sein. Allerdings kann die Aktivitätsmessung der Typ IV-Kollagenase nicht in biologischen Flüssigkeiten wie Körperflüssigkeiten, Gewebeextrakten oder Gewebeabschnitten wegen der großen Menge an Proteaseinhibitoren in derartigen Proben durchgeführt werden.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Bestimmung maligner Tumorzellen mit metastatischer Zellaktivität mittels immunologischer Bestimmung des Typ IV-Kollagenase-Enzymantigens in biologischen Proben, wie Körperflüssigkeiten, Gewebeextrakten, Gewebeschnitten, Organ- und Zellkulturen, Kulturmedien usw.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Zusammensetzungen zu entwickeln, die sowohl markiertes als auch nichtmarkiertes, hoch gereinigtes Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen sowie markierte oder nichtmarkierte, polyklonale oder monoklonal Antikörper für das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen enthalten.
Erfindungsgemäß werden Enzymzubereitungen zur Verfügung gestellt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie gereinigte Basal-abbauende Metallproteinasen, das Substrat, von dem das Typ IV-Kollagen herrührt, enthalten und eine Molmasse von annähernd 70000 aufweisen. Sie sind erfindungsgemäß mit geeigneten Markem markiert und ggf. an geeignete feste Träger gebunden.
Weiterhin werden erfindungsgemäß Antikörperzubereitungen zur Verfügung gestellt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie polyklonale Antikörper des Typ IV-Kollagenase-Enzymantigens enthalten. Erfindungsgemäß enthalten sie weiterhin monoklonale Antikörper des Typ IV-Kollagenase-Enzymantigens. Sie sind mit geeigneten Markern markiert und ggf. an geeignete feste Träger gebunden. Derartige Enzymzubereitungen und Antikörperzubereitungen werden angewandt in immunologischen Verfahren zur Erkennung maligner Zellen mit metastatischer Zellaktivität. Sie sind dadurch gekennzeichnet, daß die Typ IV-Kollagenase-Enzymantigene aus biologischen Proben bestimmt werden, insbesondere durch konkurrierende Immunoassay.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht aus den folgenden Schritten:
a) Inkubieren von Gewebeschnitten oder Zellen mit einem ersten Antikörper, der für das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen spezifisch ist;
b) Bindenlassen des ersten Antikörpers an das Enzymantigen;
c) Zugabe eines zweiten markierten Antikörpers zu dem ersten Antikörper und Binden des zweiten markierten Antikörpers an den ersten Antikörper, wodurch die Anwesenheit des Typ IV-Kollagenase-Enzymantigens in der Probe angezeigt wird.
Insbesondere besteht es aus den folgenden Schritten:
a) Inkubieren von markiertem Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen mit einem ersten Antikörper, der für das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen spezifisch ist, in Gegenwart der zu untersuchenden Probe;
b) Stattfindenlassen der Reaktion, wobei das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen der Probe mit dem markierten Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen für den Antikörper konkurriert;
c) Abtrennen des Antigen-Antikörper-Komplexes;
d) Bestimmen der Menge an markiertem Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen in dem Komplex oder im Überstehenden. In einer besonders vorteilhaften Ausbildung besteht das erfindungsgemäße Verfahren aus den folgenden Schritten:
a) Inkubieren von Antikörpern der Typ IV-Kollagenase mit der Probe;
b) Bindenlassen des Typ IV-Kollagenase-Enzymantigens in der Probe mit dem Antikörper;
c) Zugabe eines zweiten Antikörpers, der an einer anderen Stelle des Typ IV-Kollagenase-Enzymantigens anbindet;
d) Messung der Menge an markiertem Antikörper, der nicht in der Lage ist, das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen zu binden. Verfahren zur Reinigung und Bestimmung des Typ IV-Kollagenaseantigens aus Zeilen, die in der Lage sind, Basalmembranen zu durchdringen, insbesondere aus malignen Tumorzellen, sind unbedingte Voraussetzung für die Realisierung der vorliegenden Erfindung. Von den Anmeldern wurde die Typ IV-Kollagenase entdeckt, und es wurden Methoden zur Reinigung und Bestimmung dieses Antigens entwickelt (Liotta et al., I. Natl. Cancer Inst., 58,1427-1431,1977; Liotta et al, Proc. Natl. Acad. Sei., 76,2268-2272,1978; SaIo et al, The Journal of Biological Chemistry, 258, S. 3058-3063,1983; Saloetal.,1. Biol.Chem. 1983). Zur Aktivitätsmessung der Typ IV-Kollagenase wir radioaktiv markiertes Typ IV-Prokollagen als ein Substrat eingesetzt, wobei dieses Substrat nach einem Verfahren hergestellt wird, das von den Erfindern entwickelt worden ist (Tryggvason et al., Biochemistry, 19,1284-1289,1980). Dieser Aktivitätstest ist erforderlich, um den Grad der Reinigung während der einzelnen Schritte des Reinigungsverfahrens zu bestimmen. Mittels dieses Verfahrens kann die Enzymaktivität in serumfreien Organ- oder Zellkulturmedien bestimmt werden.
Das Typ IV-Kollagenaseenzym kann man aus serumfreien Organkulturmedien malignen Tumorgewebes oder den Medien kultivierter Tumorzellen erhalten. Die Gewebestücken oder-zellen werden üblicherweise fünf Tage in vitro kultiviert und die Medien täglich gesammelt. Das Mediumprotein, das Typ IV-Kollagenaseantigen enthält, wird mit Ammoniumsulfat gefällt und anschließend über verschiedene chromatografische Säulen geführt, wie dies in den erläuternden Beispielen unten beschrieben ist.
Das gereinigte Typ IV-Kollagenaseantigen hat eine Molmasse von etwa 70000 und bei Untersuchungen mittels Gel-Elektrophorese ist feststellbar, daß es aus zwei Polypeptidketten mit einer Molmasse von 62000 und 68000 besteht. Das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen benötigt proteolytische Aktivierung für die maximale Aktivität und hat ein pH-Optimum von 7,4. Das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen ist ein metallabhängiges Enzym und benötigt Kalzium für seine Aktivität. Das Enzymantigen ist spezifisch und baut interstitielles Kollagen der Typen I, Il oder III, andere Basalmembrankomponenten oder Kasein nicht ab.
Die Isolierung und Reinigung des Typ IV-Kollagenase-Enzymantigens ermöglichtes, spezifische Antikörper für dieses Enzymantigen zu entwickeln. Die Herstellung dieser Antikörper ermöglicht den Einsatz empfindlicher immunologischer Verfahren zur Auffindung metastatischer Zellaktivität durch qualitative oder quantitative Bestimmung des Typ IV-Kollagenaseantigens in biologischen Proben, wie Körperflüssigkeiten, Gewebeextrakten, Gewebeschnitten, Zeil- oder Organkulturen, Kulturmedien usw.
Die Herstellung von Antiseren, polyklonalen und auch monoklonalen Antikörpern kann über bereits bekannte Verfahren erfolgen. Für die Herstellung von Antiseren wird das gereinigte Typ IV-Kollagenaseantigen den Versuchstieren, wie Kaninchen oder Guineaschweinen verschiedene Male subkutan injiziert, und nach einer gewissen Zeit wird den Tieren (bzw. dem Tier) das Serum abgezogen. Das Vorhandensein der spezifischen Antikörper im Antiserum wird dann mittels bestimmter Techniken getestet, z. B. mittels Enzym-gebundenem Immunosorbenttest (ELISA), Western Immunoblotting-Technik und immunologischer Färbeverfahren, die den Fachleuten bekannt sind.
Antiseren sind zu dem Murin-Typ-IV-Kollagenaseantigen durch Verfahren hergestellt worden, die von den Anmeldern entwickelt worden sind. Diese Antiseren reagieren mit Mäuseantigen, wie gezeigt durch Immunoblotting, ELISA und Immunofluoreszenztechniken.
Für die Herstellung von konventionellem Antiserum muß das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen ein hochreines und homogenes Protein sein. Es ist extrem schwierig, ausreichende Mengen an absolut reinem, menschlichem Typ IV-Kollenaseantigen zu erhalten, um konventionelle Antiseren in Kaninchen und Guineaschweinen zu produzieren. Um dieses Problem zu lösen, wurde von uns das Verfahren von Köhler und Milstein (Nature, 256,496,1975) benutzt, um monoklonal Antikörper herzustellen. Ein Vorteil mit diesem Verfahren besteht darin, daß das Antigen nicht absolut rein sein muß, da die spezifische Antikörper produzierenden Zeilklone (Hybriden) unter in vitro Bedingungen selektiert werden können.
Entsprechend den oben dargelegten Verfahren wurden BALB/C-Mäuse zweimal subkutan mit 100μg hoch gereinigter Typ IV-Kollagenase immunisiert, die aus Kulturmedien menschlicher Fibrosarcomzellen isoliert worden war. Nach sechs Wochen wurden die Antiseren mittels des ELISA-Verfahrens getestet. Bei zufriedenstellenden Ergebnissen wurden die Mäuse ein weiteres Mal intravenös mit einer geeigneten Menge Typ IV-Kollagensaeantigen immunisiert. Milzzellen aus zwei immunisierten Mäusen und Mäuse-Myelomzellen (NS-1) wurden dann hybridisiert und nach konventionellen Techniken in Mikrotiterplatten kultiviert. Von 453 Probelöchern waren 46 positiv für Antikörper, wie mittels des ELISA-Verfahrens festgestellt werden konnte. Mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens wurden 10 geeignete Hybridlinien gefunden. Diese 10 Hybridlinien waren stark positiv für maligne menschliche Fibrosarcom- und Mammakarcinomzellen aber nur schwach reaktionsfähig mit menschlichen Hautfibroblasten. Drei dieser 10 Hybridzellinien, die die höchsten Titer aufwiesen, wurden für das in vitro Klonieren durch Verdünnungstechnik und für die Produktion monoklonaler Antikörper ausgewählt.
Die polyklonalen und monoklonalen Antikörper für das Typ IV-Kollagenaseantigen — hergestellt, isoliert und gereinigt wie oben beschrieben — können mit geeigneten radioaktiven, enzymatischen oder fluoreszierenden Markern mittels üblicher Verfahren, die den Fachleuten bekannt sein sollten, markiert werden.
Die genannten polyklonalen und monoklonalen Antikörper und das Typ IV-Kollagenaseantigen, markiert oder auch nichtmarkiert, könnten an geeignete feste Träger gebunden und in immunologischen Verfahren eingesetzt werden, die einen Teil dieser Erfindung bilden.
Entsprechend den Verfahren zur Bestimmung maligner Zellen mit metastatischer Zellaktivität wird das Vorhandensein von Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen in biologischen Proben, wie Körperflüssigkeiten, Gewebeextrakten und -schnitten usw. über bekannte immunologische Methoden bestimmt, mit Hilfe von markierten oder nichtmarkierten, gebundenen oder nichtgebundenen Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen-Zusammensetzungen sowie auch mittels markierter oder nichtmarkierter, gebundener oder nichtgebundener polyklonaler oder monoklonaler Antikörperzusammensetzungen.
Bei den immunologischen Verfahren wurde Kaninchenserum verwendet, um das Vorhandensein von Typ IV-Kollagenaseantigen festzustellen. Wie über die Western Blottingtechnik gezeigt werden konnte, färbt das Antiserum zwei Proteine im 62 K und 68 K-Bereich an, was mit dem gereinigten Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen übereinstimmt. Weiterhin wurde das Antiserum für die immunolcgische Färbung von menschlichem Mammakarcinom und normalem Mammagewebe eingesetEt. Kryoschnitte der Gewebe wurden zuerst mit dem Antiserium inkubiert und anschließend mit FITC-gekoppeltem Anti-Kaninchen IgG. Die Ergebnisse zeigten, daß von 10 normalen Gewebeproben nicht eine eine positive Fluoreszenz ergab, das heißt, sie enthielten kein Typ IV-Kollagenaseantigen. Andererseits zeigten 25 von 25 Mammakarzinom-Gewebeproben intensive Fluoreszenz im Grenzbereich des Tumors. Dementsprechend können die in dieser Erfindung beschriebenen immunologischen Verfahren die Anwesenheit maligner Tumorzellen in Geweben anzeigen, und da die Färbung in erster Linie an derTumorgrenze erkennbar ist, ist es klar, daß das Typ IV-Kollagenaseantigen sich in invasiven Zellen anreichert.
Für die immunologische Färbung kultivierter Zellen wurden Antikörper zu menschlichen Typ IV-Kollagenase-Enzymantigenen eingesetzt, die von Mäusehybridklonen produziert worden waren. Die untersuchten Zellen waren menschliches Fibrosarcom (HT-1080), Mammacarzinomzellen (MCF-7) und normale menschliche Hautfibroblasten. Die Zellen wurden auf Mikrotiterplatten kultiviert und mit den Antikörpern inkubiert. Anschließend wurden die Platten gewaschen und mit biotinyliertem Pferde-Antimaus IgG/lgM inkubiert und gewaschen. Danach wurde Avidin-Biotin-Peroxidasereagens hinzugegeben, um die an die Zellen gebundenen Maus-Immunoglobulin-Antimaus-Immunoglobulinkomplexe zu färben. Die Ergebnisse zeigten, daß die malignen HT-1080-und MCF-7-Zellen gefärbt wurden, während die normalen Hautfibroblasten nicht gefärbt wurden. Darausist
zu entnehmen, daß monoklonale Antikörper für menschliche Typ IV-Kollagenase dazu zu verwenden sind, maligne Zellen, die das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen enthalten, von normalen Zellen zu unterscheiden, die dieses Enzymantigen nicht enthalten.
Ausführungsbeispiel
Die Erfindung wird nachstehend durch Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1 Isolierung von Typ IV-Kollagenaseantigen
Zur Herstellung von Mäuse-Typ IV-Kollagenase ließ man zuerst metastatische PMT-Tumore in C57B1/6I-Mäusen wachsen. Nach etwa zwei Wochen des Wachstums wurden die Tumore ausgeschnitten, zerkleinert und in einem serumfreien RPMI-1640-Medium als Organkulturen 5 Tage inkubiert. Das Medium wurde täglich gesammelt und das darin enthaltene Protein mit Ammoniumsulfat (25-60%ige Sättigung) ausgefällt. Der Niederschlag wurde in Enzympuffer (0,05 M Tris-HCI, pH 7,4,0,2 M NaCI, 10 mM CaCI2) gelöst und durch eine Concanavalin-A/Agarose-Säule gegeben, an die die meiste Enzymaktivität gebunden wurde. Die gebundene Aktivität wurde mit 1 M a-Methylmannosid eluiert und über eine Typ IV-Kollagen/Agarose-Säule gegeben. Das an die Säule gebundene Kollagen wurde aus dem EHS-Basalmembranmatrix bildenden Tumor extrahiert und gereinigt. Es enthielt intakte Typ IV-Kollagenketten (185 K und 175K). Um den Abbau von Kollagen-Agarose durch das Enzym zu vermeiden, enthielten die Puffer kein CaCI2, während des Kolonnendurchlaufs. Die Enzymaktivität wurde mittels des Enzympuffers, der 1 M NaCI oder 50% Ethylenglykol enthielt, aus der Säule eluiert. Die Endreinigung des Enzyms erfolgt über ein Molekularsieb, z. B. Bio-Gel A 0,5 m, wo es mit einer scheinbaren Molmasse von etwa 160000 wandert. Das auf diese Weise gereinigte Enzym enthält zwei Polypeptidketten mit Molmassen von 68 K und 62 K.
Die menschliche Typ IV-Kollagenaseaktivität wurde in der gleichen Weise bereitet wie das Murinenzym aus dem serumfreien Medium kultivierter menschlicher Fibrosarcomzellen (HT-1080). Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eaglemedium (DMEM) kultiviert, das 10% fötale Konfluenzin Kalbserum in Schüttelflaschen enthielt, wonach das Medium in das gleiche serumfreie Medium abgeändert wurde. Das Medium wurde täglich über 5 Tage gesammelt.
Beispiel 2 Herstellung von Antiserum zur Maus-Typ IV-Kollagenase
Das Antigen (100 bis 200^g) wurde subkutan in gleichen Volumina an Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und kompletten Freunds-Adjuvans injiziert und dann noch einmal nach 4 Wochen mit unkompletten Freunds-Adjuvans. Anschließend wurden zweimal Auffrischungs-Injektionen mit dreiwöchigen Abständen gegeben. Drei Wochen nach der letzten Auffrischung wurde Blut abgenommen und das Serum auf Spezifität und Titer mittels ELISA, Western Blotting und Immunofärbetechniken geprüft.
Beispiel 3 Herstellung und Bestimmung der monoklonalen Antikörper
BALB/c-Mäuse wurden mit 100μg teilweise gereinigtem HT-1080-Enzym in kompletten Freunds-Adjuvans immunisiert und zweimal mit 50/ng Antigen in dreiwöchigen Abständen reimmunisiert. Die Titer der Antiseren wurden 3 Wochen nach der letzten Injektion geprüft und erschienen zufriedenstellend (Verdünnung < 1:500), gemäß Bestimmung über ELISA wurde den Tieren 50//.g Antigen intravenös gegeben. Vier Tage später wurde die Hybridisierung nach Köhler und Milstein (Nature, 256,496,1975) durchgeführt. Immunisierte Milzzellen aus zwei Mäusen wurden mit NS-1 oder entsprechenden Myelomzellen vereinigt und die vereinigten Zellen auf 96er Mikrotiterplatten bei etwa 2 χ 105 Zellen pro Loch aufgebracht, wobei Maus-Peritoneumzellen (Makrophagen) als Nährzellen (6 χ 103) eingesetzt wurden. Die Zellen wurden in einem selektiven HAT-Medium (DMEM mit 10~4MHypoxanthin,10~7MAminopeptin, 1,6 χ 105M und 20% FCS enthaltend)für3 bis4Wochen kultiviert. In diesem Medium ist allein Hybridzellenwachstum möglich. Die Zellen wurden auf Antikörperproduktion mittels ELISA getestet und üblicherweise sind etwa 10% der Löcher positiv. Die Spezifität der Antikörper wurde ebenfalls über Western Blottingtechnik und immunologische Färbung untersucht.
Die ELISA-Methode wurde unter Verwendung von Mikrotiterplatten mit 96 Löchern durchgeführt. In jedes Loch wurde etwa 50 bis 100ng Antigen eingebracht und getrocknet. Freie Bindungsstellen wurden durch Inkubieren über 30 Minuten mit 50μ.11 % FCS blockiert, und die Löcher wurden mit PBS gewaschen. Hybrid-Überstehendes wurde dann als Antiserum in die Löcher (50μ.Ι) gegeben und inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden 50μΙ biotinylierte Pferde-Antimaus-lgG-Lösung, die 1 % FCS enthielt, zugegeben und 30 Minuten inkubiert, gefolgt von Waschen mit PBS. Danach wurde ein Avidin-Biotin-Peroxidasereagenz hinzugegeben und inkubiert. Im Anschluß daran wurde Peroxidasesubstrat (0,01 % o-Dianisidin, 0,01 % H2O2 in PBS) hinzugesetzt und die gebildete Braunfärbung in einem Titertek-Multiscan-Spektrophotofneter gemessen.
Die Western Blotting Technik kann dazu eingesetzt werden, die Antikörper besser zu bestimmen, da sie genau ausweist, mit welchen Polypeptidketten der Antikörper reagiert. Das Antigen oder eine das Antigen enthaltende Proteinmischung wurde zuerst auf einer 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese abgetrennt, wonach anschließend die Proteine horizontal auf einem Nitrozellulosepapier unter Einsatz eines Stromes von 0,1 A über Nacht geblotted wurden. Das Papier wurde dann mit einer Heparin-Toluidin-Färbelösung angefärbt. Die proteinhaltigen Nitrozellulosestreifen wurden anschließend herausgeschnitten und die Färbung mit einer Lösung (50% Ethanol, 8% Essigsäure, 42% Wasser) entfernt. Mit dem gleichen Verfahren wie es bei der ELISA-Methode verwendet wird, erfolgte dann das Immunofärben der Streifen. Positive Antikörper ergeben eine Braunfärbung nur des Antigens, jedoch ist festzustellen, daß, wenn der Antikörper gegen die tertiäre Struktur des Antigens gerichtet ist, man ein negatives Ergebnis erhalten kann, da die Proteine während der Gelelektrophorese denaturiert worden sind.
Beispiel 4 Immunofärben der Typ IV-Kollagenase
Käninchenserum für gereinigte Maus-Typ IV-Kollagenase wurde eingesetzt, um die Lokalisierung des Enzyms in normalem Mammagewebe und malignem menschlichem Mammakrebsgewebezu untersuchen. Kryoschnitte (5μ,ητι dick) von 10 normalen Mammagewebeproben und 25 Mammakrebsgewebeproben wurden mit 1 % FCS vorinkubiert und dann mit PBS gewaschen. Dänach wurde das Antiserum, Verdünnung 1:50, mit den Proben 2 Stunden bei 2O0C inkubiert und anschließend mit PBS gewaschen. Die Schnitte wurden dann mit FITC-gekoppeltem Ziegen-Antikaninchenserum über Nacht bei 4°C inkubiert und mit PBScjgewaschen. Im Anschluß daran wurde die Fluoreszenz untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß keines der normalen Gewebe angefärbt wurde, während sämtliche 25 Krebsgewebe eine deutliche Fluoreszenz ergaben. Die Färbung war im Rändbereich des invasiven Tumors am intensivsten und zwischen 10 und 80% der Tumorzellen waren positiv. Mönoklonale Antikörper gegen menschliche HT-1080 Sarcomzellen-Typ IV-Kollagenase wurden dazu verwendet, kultivierte HT-T080 Zellen, menschliche Mammakarcinomzellen (MCF-7) und menschliche Hautfibroblasten zu färben. Die Zellen wurden auf Deckgläsern biszurSubkonfluenzund mit Methanol bei -20°Cfür 10 Minuten fixiert. Die Zellen wurden dann mit 1% FCS vorinkubiert und mit PBS gewaschen. Danach wurden sie mit den Mausantikörpern 2 Stunden bei 2O0C inkubiert und gewaschen. Im Anschluß daran wurden dieZellen 30 Minuten mit biotinyliertem Pferde-Antimaus-lgG inkubiert, gewaschen und mit Avidin-Bibtin-Peroxidasereagenz inkubiert. Schließlich wurden die Zellen mit dem Peroxidasesubstrat inkubiert. Die Antikörper gaben eine klare Färbung der malignen HT-1080-und MCF-7-Zellen, während die Fibroblasten negativ waren. Beide Beispiele zum Immunofärben zeigen, daß die Antikörper der Typ IV-Kollagenase maligne Tumorzellen mit invasiven Eigenschaften ermitteln können.
Während die vorliegende Erfindung im Hinblick auf bestimmte erläuternde Beispiele beschrieben worden ist, sind für die Fachleute verschiedene Modifikationen und Varianten denkbar, die innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung liegen.

Claims (6)

1. Immunologische Verfahren zur Erkennung maligner Zeilen mit metastatischer Zellaktivität, gekennzeichnet dadurch, daß die Typ IV-Kollagenase-Enzymantigene aus biologischen Proben bestimmt werden.
2. Immunologische Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Typ IV-Kollagenase-Enzymantigene durch konkurrierende Immunoassay bestimmt werden.
3. Immunologische Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß sie aus folgenden Schritten bestehen:
a) Inkubieren von Gewebeschnitten oder Zellen mit einem ersten Antikörper, der für das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen spezifisch ist;
b) Bindenlassen des ersten Antikörpers an das Enzymantigen;
c) Zugabe eines zweiten markierten Antikörpers zu dem ersten Antikörper und Binden des zweiten markierten Antikörpers an den ersten Antikörper, wodurch die Anwesenheit des Typ IV-Kollagenase-Enzymantigens in der Probe angezeigt wird.
4. Immunologische Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß sie aus folgenden Schritten bestehen:
a) Inkubieren von markiertem Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen mit einem ersten Antikörper, der für das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen spezifisch ist, in Gegenwart der zu untersuchenden Probe;
b) Stattfindenlassen der Reaktion, wobei das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen für den Antikörper konkurriert;
c) Abtrennen des Antigen-Antikörper-Komplexes;
d) Bestimmen der Menge an markiertem Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen in dem Komplex oder im Überstehenden.
5. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß sie aus folgenden Schritten bestehen:
a) Inkubieren von Antikörpern der Typ IV-Kollagenase mit der Probe;
b) Bindenlassen des Typ IV-Kollagenase-Enzymantigens in der Probe mit dem Antikörper;
c) Zugabe eines zweiten Antikörpers, der an einer anderen Stelle des Typs IV-Kollagenase-Enzymantigens anbindet;
d) Messung der Menge an markiertem Antikörper, der nicht in der Lage ist, das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen zu binden.
6. Immunologische Verfahren nach den Punkten 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen ein Molekulargewicht von ca. 70000 hat.
DD84263171A 1983-05-19 1984-05-18 Immunologisches verfahren zur erkennung maligner zellen mit metadatischer zellaktivitaet DD251208A5 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/496,230 US4677058A (en) 1983-05-19 1983-05-19 Detecting malignant cells with monoclonal antibodies specific to type IV collagenase enzyme

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DD251208A5 true DD251208A5 (de) 1987-11-04

Family

ID=23971775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DD84263171A DD251208A5 (de) 1983-05-19 1984-05-18 Immunologisches verfahren zur erkennung maligner zellen mit metadatischer zellaktivitaet

Country Status (26)

Country Link
US (1) US4677058A (de)
JP (1) JPS602187A (de)
AU (1) AU2808784A (de)
BE (1) BE899663A (de)
CA (1) CA1230052A (de)
CH (1) CH668838A5 (de)
DD (1) DD251208A5 (de)
DE (1) DE3418625A1 (de)
DK (1) DK243184A (de)
ES (1) ES8605904A1 (de)
FI (1) FI841897L (de)
FR (1) FR2546302B1 (de)
GB (1) GB2142030B (de)
HU (1) HU195004B (de)
IL (1) IL71802A0 (de)
IT (1) IT1175842B (de)
LU (1) LU85366A1 (de)
NL (1) NL8401616A (de)
NO (1) NO841993L (de)
NZ (1) NZ208108A (de)
PL (1) PL247745A1 (de)
PT (1) PT78610B (de)
RO (1) RO92427A (de)
SE (1) SE8402703L (de)
YU (1) YU86984A (de)
ZA (1) ZA843539B (de)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6294172B1 (en) 1983-08-12 2001-09-25 Dade Behring Marburg Gmbh Monoclonal antibodies with specificity for membrane-associated antigens
US4859581A (en) * 1986-03-10 1989-08-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Endoglycosidase assay
GB2209526B (en) * 1987-09-04 1992-06-03 Univ Washington Dna clone of human type iv collagenase
US4923818A (en) * 1987-09-04 1990-05-08 Washington University DNA clone of human type IV collagenase
US4876332A (en) * 1987-10-08 1989-10-24 Regents Of The Univeristy Of Minnesota Polypeptides with type IV collagen activity
US5280106A (en) * 1988-05-20 1994-01-18 Liotta Lance A Matrix metalloproteinase peptides: role in diagnosis and therapy
US5030555A (en) * 1988-09-12 1991-07-09 University Of Florida Membrane-strip reagent serodiagnostic apparatus and method
DE3909799A1 (de) * 1989-03-24 1990-09-27 Behringwerke Ag Monoklonale antikoerper (mak) gegen tumorassoziierte antigene, ihre herstellung und verwendung
US4992537A (en) * 1989-05-15 1991-02-12 Washington University cDNA encoding 92-kDA type IV collagenase
WO1991005793A1 (en) * 1989-10-18 1991-05-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce Production and use of human nm23 protein and antibodies therefor
JPH0734014B2 (ja) * 1990-01-26 1995-04-12 アメリカ合衆国 コラーゲナーゼを定量的に測定するための方法
WO1992020820A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Vanderbilt University Method to determine metastatic potential of tumor cells
US5324634A (en) * 1992-03-31 1994-06-28 The Research Foundation Of State University Of New York Diagnostic tests measuring gelatinase/inhibitor complexes for detection of aggressive and metastatic cancer
JP2673929B2 (ja) * 1993-04-12 1997-11-05 富士薬品工業株式会社 ヒト間質型コラゲナーゼと阻害剤との複合体の免疫学的定量法および臨床診断への応用
DE602005024418D1 (de) * 2004-08-26 2010-12-09 Life Technologies Corp Elektrobenetzende abgabevorrichtungen und dazugehörige verfahren

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE343949B (de) * 1966-06-02 1972-03-20 Pharmacia Ab
DE2363854C3 (de) * 1973-12-21 1980-01-03 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Substrat zur Proteinasebestimmung sowie dessen Herstellung
US4201763A (en) * 1975-10-09 1980-05-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Solid phase immunofluorescent assay method
NO169947C (no) * 1981-10-27 1992-08-26 Hybritech Inc Fremgangsmaate for fremstilling av et monoklonalt antistoff til et tumorassosiert antigen
US4424278A (en) * 1981-11-16 1984-01-03 Research Corporation Cancer detection procedure using an acyl carrier protein
US4443367A (en) * 1982-04-08 1984-04-17 Monsanto Company Peptide and peptolide substrates for mammalian collagenase

Also Published As

Publication number Publication date
FR2546302A1 (fr) 1984-11-23
DE3418625A1 (de) 1984-11-22
NO841993L (no) 1984-11-20
DK243184D0 (da) 1984-05-17
SE8402703D0 (sv) 1984-05-18
PT78610A (en) 1984-06-01
IL71802A0 (en) 1984-09-30
FR2546302B1 (fr) 1988-03-04
LU85366A1 (fr) 1984-11-19
GB2142030B (en) 1987-02-04
RO92427A (ro) 1987-09-30
PL247745A1 (en) 1985-08-27
ZA843539B (en) 1985-07-31
FI841897A7 (fi) 1984-11-20
GB2142030A (en) 1985-01-09
SE8402703L (sv) 1984-11-20
CH668838A5 (de) 1989-01-31
IT8420998A0 (it) 1984-05-18
GB8411959D0 (en) 1984-06-13
CA1230052A (en) 1987-12-08
YU86984A (en) 1991-01-28
NZ208108A (en) 1988-04-29
ES532597A0 (es) 1986-04-01
ES8605904A1 (es) 1986-04-01
DK243184A (da) 1984-11-20
IT8420998A1 (it) 1985-11-18
FI841897L (fi) 1984-11-20
JPS602187A (ja) 1985-01-08
FI841897A0 (fi) 1984-05-11
IT1175842B (it) 1987-07-15
NL8401616A (nl) 1984-12-17
HU195004B (en) 1988-03-28
AU2808784A (en) 1984-11-22
HUT34261A (en) 1985-02-28
PT78610B (en) 1986-07-15
BE899663A (fr) 1984-08-31
US4677058A (en) 1987-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE68912403T2 (de) Monoklonaler Antikörper, spezifisch für eine in transformierten Zellen exprimierte Fibronectin-Sequenz, Hybridoma, das diesen Antikörper erzeugt und Verwendung dieses monoklonalen Antikörpers zur Diagnose von Tumoren.
DE69117292T3 (de) Bestimmung von freiem und komplexiertem prostata-spezifischem antigen
EP0260610A2 (de) Monoklonale Antikörper gegen humanen Tumonekrosefaktor (TNF) und deren Verwendung
CH668838A5 (de) Verfahren zum ermitteln von malignen tumorzellen mit metastatischer zellaktivitaet.
DE60017019T2 (de) Antikörper gegen Spaltprodukte von Vimentin
DE69132122T2 (de) Reinigung von cytokeratinfragmenten
EP0541645B1 (de) Verfahren zur reinigung von cytokeratin 20 und dessen verwendung zur erzeugung von antikörpern
DE3789781T2 (de) Antigene, Antikörper und Verfahren zur Identifizierung humaner metastatischer Tumoren und Zellinien zur Herstellung dieser Antikörper.
DE68921374T2 (de) Monoklonaler Antikörper gegen menschliche Mangan-Superoxiddismutase, Verfahren zu dessen Herstellung, Testreagens, Kit und Testmethode unter Verwendung desselben, Verfahren zur Diagnose von menschlichem Eierstockkrebs und von Herzinfarkt.
DE3689868T2 (de) Monoklonale Antikörper gegen menschliches Plasma-Prekallikrein und Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung.
DE3485965T2 (de) Monoklonaler antikoerper mit spezifitaet gegen nur einen typ eines isozyms der schweren kette des menschlichen herzmyosins.
EP0955361A1 (de) Monoklonale Antikörper gegen tumorassoziierte Antigene, Verfahren zu ihrer Herstelung sowie ihre Verwendung
EP0339443A2 (de) Monoklonaler Antikörper zur selektiven immunologischen Bestimmung von intaktem Prokollagen Peptid (Typ III) und Prokollagen (Typ III) in Körperflüssigkeiten
DE3743402C2 (de) Verfahren zur Krebsdiagnose beim Menschen
EP0195331B1 (de) Monoklonale Antikörper gegen atriale, natriurethische Peptide
DE3686766T2 (de) Monoklonaler antikoerper gegen glutathion s-transferase und dessen verwendung zur diagnose von krebs.
DE69800080T2 (de) Antikörper gegen das Prorenin Profragment, reninaktive Substanz die diese enthält und Prorenintest die diese verwendet
DE68922846T2 (de) Enzymimmuntest für menschliches typiv-collagen gemäss dem sandwichverfahren.
DE69005297T2 (de) Metastasenzugehörige kollagenolytische metalloproteinase.
EP0696597A2 (de) Monoklonale Antikörper zur selektiven immunologischen Bestimmung von hochmolekularen, intakten Lamininformen in Körperflüssigkeiten
DE68926245T2 (de) Nachweis der basismembrankomponenten, diagnose von krebs und sonstigen krankheiten
DE69900283T2 (de) Reninaktive Substanz enthaltend humanes Prorenin und Antikörper gegen das Prorenin Profragment
EP1541676B1 (de) Gegen das Prothrombin-Fragment F1+2 gerichtete Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung
DE68924984T2 (de) Adhäsionsrezeptor für laminin und dessen verwendung.
DE69528527T2 (de) Diagnostische verfahren und zusammensetzungen, die bezug nehmen auf proteoglykan-proteine des knorpelobbaus