DE3854577T2

DE3854577T2 - Methode zum screening von zellen oder anderen geformten körpern zur spezifizierung von populationen, die ausgewählte charakteristische eigenschaften exprimieren.

Info

Publication number: DE3854577T2
Application number: DE3854577T
Authority: DE
Inventors: Wallace Coulter; Kenneth Kortright; Ronald Paul; Carlos Rodriguez; Thomas Russell
Original assignee: Coulter Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1987-03-13
Filing date: 1988-03-11
Publication date: 1996-04-18
Anticipated expiration: 2008-03-12
Also published as: EP0381669A4; KR890700830A; JPH02502573A; CA1311404C; EP0381669B1; ES2011652A6; DE3854577D1; AU618736B2; EP0381669A1; CN88101211A; ATE129074T1; CN1021374C; JP2716985B2; AU1681088A; KR970007078B1; WO1988007199A1

Description

Diese Erfindung betrifft allgemein Methoden bzw. Verfahren zur Verwendung eines automatischen Analysators zum Screening biologischer Zellen oder geformter Körper für die Spezifizierung von Populationen, welche gewählte charakteristische Eigenschaften exprimieren, für Forschungszwecke, diagnostische, medizinische oder industrielle Zwecke ausdrücken. Die Verfahren, die die Erfindung verkörpern, ermöglichen insbesondere vielteilige Klassifikationen u.a. von Zellen und geformten Körpern, ein fünktionelles Phänotypisieren von Zellen und geformten Körpern, ein Typisieren von leukämischen Zellen, Lymphomazellen und starken Tumorzellen, unter Verwendung einer einzigartigen Kombination einer elektronischen Technologie und der Spezifität gewählter biologischer Moleküle, wie z.B. Antikörper, für ein solches Screening und selektive Spezifizierung der Zellen und geformten Körper.

Hintergrund des Standes der Technik

Die Automation der vollständigen Routineanalyse von Blutzellen (CBC) des menschlichen peripheren Blutes mittels eines automatisierten Blutzellenzählgerätes wurde vom COUL- TER COUNTER Model A von Coulter Electronics Inc., Hialeh, Florida, erfolgreich geschafft. Das elektronische Prinzip des Teilchenabtastsystems dieses Gerätes ist im U.S.Patent Nummer 2,656,508, ausgegeben am 20. Oktober 1953 für Wallace H. Coulter, geoffenbart. Die Verwendung optischer Abtastmittel oder Laser, welche problembehaftet und teuer sein können, werden durch eine Teilchenanalysierinstrumentierung vermieden, die lediglich auf diesem elektronischen Abtastprinzip von Coulter betrieben wird.
Dieses Coulter-Abtastpriiizip wurde zu einer ausgeklügelten Instrumentierung entwickelt und expandiert, wie z.B. die Gerätetypen COULTER COUNTER Model S, welche CBC-Parameter, absolute Zellenzählungen, Plättchenzählung und Morphologie, die Morphologie der roten Blutzellen (RBC), die Interpretierung normaler und abnormaler Blutproben mit speziellen Computerprogrammen, ermöglichten.
Das elektronische Teilchenabtastprinzip von Coulter wendet eine Öffnungsabtastschaltung an, welche eine Gleichstrom-(DC)-Öffnungszuführ verwendet. Solche Teilchensensoren sind in der Struktur einfach, extrem robust und zuverlassig, wie durch die praktisch universelle Akzeptanz des automatischen Analysiergerates COULTER COUNTER in den klinischen Laboratorien der Vereinigten Staaten und im Rest der Welt bescheinigt wird. Eine Verbesserung dieser Öffnungsabtast Grundschaltung wurde im U.S. Patent Nr. 3,502,974, ausgegeben im Jahr 1970 für Wallace Coulter und Walter Hogg, geoffenbart. Zusätzlich zur Gleichstromöffnungsstandardzuführ wurde ein Hochfrequenzöffnungsstrom angelegt, welcher das Abtasten eines zusatzlichen Parameters für Klassifizierungszwecke ermoglichte. Der Hochfrequenzöffnungsstrom produzierte ein Signal, welches die Funktion der inneren Leitfähigkeit der Blutzelle sowie ihres Volumens ist. Das Signal, welches gleichzeitig von der Gleichstromöffnungsschaltung produziert wird, ist ein herkömmliches Signal mit DC-Amplitude, welches primär eine Anzeige des Zellenvolumens bietet. Die Radiofrequenzamplitude wird durch die Gleichstromimpulsamplitude getellt, wobei eine Hochgeschwindigkeitsteilerschaltung angewendet wird, um einen Quotienten zu erhalten, der eine Funktion des Zellenvolumens und des inneren Widerstandes ist, was üblicherweise als "Opazität" bezeichnet wird. Dieses Prinzip wird ferner im U.S. Patent Nr. 3,502,973 beschrieben, welches auch für Wallace Coulter und Walter Hogg im Jahr 1970 ausgegeben wurde. Dieser Parameter besitzt eine Anwendbarkeit in Klassifizierungssystemen für Zellen. Es konnte entweder eine einzelne Öffnung oder ein Paar getrennter Öffnungen für diesen Zweck verwendet werden.
Die Klassifizierung verschiedener Populationen wird erreicht, indem die Daten der Signalpaare, wie sie erzeugt werden, zusammengestellt werden; eines, ein Maß des Teilchenvolumens, und das andere ein Maß des inneren Zellenwiderstandes oder der Opazität. Eine zweckmäßige Form für die Darstellung dieser Daten ist die zweidimensionale Auftragung, welche als Scatterplots oder Scattergramme bezeichnet wird. Solche Auftragungen bzw. Plots sind in Flow Cytometry and Sorting, Seite 371; herausgegeben von Melamed Melaney und Medelsohn, 1979, John Wiley & Sons, NY, NY, gut beschrieben.
Fig. 5A ist ein Beispiel eines Datenplots einer Probe von Normalblut. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne Zelle. Die Höhe über der Basislinie repräsentiert das relative Volumen der Zelle. Der Abstand des Punktes rechts der vertikalen Basislinie repräsentiert die relative Opazität. Ein Plot von normalen weißen Blutzellen (WBC) (wobei die roten Blutzellen entfernt sind) zeigt drei Punktanhäufüngen, welche drei bestimmte Populationen repräsentieren, welche eine Folge ihrer intrinsischen Unterschiede in Größe und ihrer Innenzusammensetzung sind. Falls erwünscht, können diese Populationen mit einer geeigneten Schaltung spezifiziert werden, um ihre jeweiligen Anzahlen zu erhalten. Die Zellen werden auf Basis dieser inhärenten Unterschiede klassifiziert.
Erste Anwendungen des elektronischen Teilchenabtastprinzips von Coulter bestanden darin, rote Blutzellen auszuzählen, und dann komplexere Bestimmungen anderer Parameter von roten Blutzellen. Indem rote Blutzellen aus dem peripheren Vollblut entfernt wurden, konnte eine Analyse der Populationen der weißen Blutzellen vorgenommen werden, solange die Entfernung der roten Blutzellen die Eigenschaften der übrigbleibenden Populationen weißer Blutzellen, die man messen wollte, nicht signifikant beeinträchtigte. Reagentien zur Lyse roter Blutzellen wurden für diesen Zweck entwickelt, welche, obgleich sie brauchbar waren und verbreitet angewendet wurden, nicht in jeder Hinsicht für nachfolgende Bestimmungen von weißen Blutzellen zufriedenstellend waren.
Frühere Methoden zur Durchflußanalyse von Leukozyten unter Verwendung eines DC- Volumens allein oder Lichtstreuung mit verschiedenen Winkeln haben drei Anhäufüngen von Leukozyten gezeigt, welche Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten entsprachen, welche die neutrophilen, basophilen und eosinophilen Populationen umfaßten. Eine grobe, aber nützliche Abschätzung der Konzentration an Eosinophilen kann bei einigen Proben vorgenommen werden. Die fünfte Hauptpopulation ist für diese Methode relativ zu klein. Die Eosinophilen wurden auch als eine eigene Anhäufüng beobachtet, und zwar unter Verwendung spezieller Fluoreszenztechniken.
Diese Fluoreszenztechniken wurden in Geräten zur Durchflußzytometrie angewendet, wie z.B. das Durchflußzytometer EPICS , welches von der Coulter Corporation erhältlich ist. Solche Geräte wendeten das Prinzip der Zellenbewegung in einer säulenartigen Strömung an, die von einer Mantelströmung gebunden wurde, daß sich Zellen in einer einzigen Reihe anordneten und einzeln durch einen Laserstrahl gingen. Signale aus der Lichtstreuung und/oder Fluoreszenz von den Zellen wurden dann zum Klassifizieren der Zellenpopulationen verwendet. Das Färben von Zellen mit absorptiven oder fluoreszierenden Farbstoffen machte Klassifizierungen zusätzlicher Zellenpopulationen möglich. Die Entwicklung der Instrumentierung und der Fluorochrome für eine automatisierte Multiparameteranalyse wird ferner von R.C. Leif, et al. in Clinical Chemistry, Band 23, Seiten 1492-98 (1977), beschrieben. Diese Entwicklungen weiteten die Zahl gleichzeitiger Populationsklassifizierungen von Leukozyten auf vier aus, nämlich aif Lymphozyten, Monozyten, Eosinophile und "Granulozyten" (Neutrophlle und Basophile).
Ein jüngeres analytisches Hämatologieinstrument hat Lichtstreuungstechniken zusammen mit dem Perioxidaseenzymfarben (absorptiver Farbstoff) von Zellen benützt, um ein fünfteiliges Leukozytendifferential zu produzieren. Außerdem haben Farbstoffe in Kombination mit spezifischen, reagierenden biologischen Molekülen, wie z.B. monoclonalen Antikörpern, die Anzahl von Leukozytenklassifikationen erhöht, die möglich sind, um funktionelle Sub-Teilungen zu umfassen.
Die GB-A-2,173,004 offenbart ein Gerät zum Zählen biologischer Mikroteilchen. Im Gerät werden die Mikroteilchen an markierte Antikörper gekoppelt, um Komplexe zu bilden. Eine Meßeinheit für die Teilchengröße des Typus von Coulter oder des Typus mit gestreutem Licht wird verwendet, um die Große der Teilcher im Blut, einschließlich jener der Komplexe, zu messen. Wenn die gemessene Große jener eines Komplexes entspricht, erzeugt eine Verarbeitungseinheit ein Ausgangssignal und zahlt die Anzahl dieser Signale. Die Anzahl von Ausgangssignalen entspricht der Anzahl von Komplexen und daher der Anzahl von Mikroteilchen, die innerhalb der Komplexe gebunden sind.
Die WO-A-8402777 offenbart ein System für die differentielle Bestimmung von drei Populationen von Leukozyten. Das System verwendet in Kombination ein osmotisch ausgeglichenes Blutverdunnungsmittel und ein lysierendes Reagens, um das Volumen von mindestens einer der drei Populationen von Leukozyten zu modifizieren, wodurch eine volumetrische Differentialanalyse ermoglicht wird. Die Daten werden unter Verwendung eines Coulter Counter- Standard-Gerätes in Verbindung mit einem Coulter Channelyzer und einem X-Y-Plotter präsentiert.
Die US-A-4,499,052 offenbart ein Verfahren zum Unterscheiden multipler Subpopulationen von Blutteilchen von einer Probe, welche eine Vielzahl von Teilchen umfaßt, und ein Gerät zum Durchführen dieser Methode. Die Teilchen im Blut werden mit mindestens zwei unterscheidenden, quantifizierbaren Markierungsmitteln in einer Vielzahl verschiedener vorgewählter Verhältnisse dieser Mittel markiert. Die differenziell markierten Teilchen werden mit den Zellen vermischt, von denen angenommen wird, daß sie für diese spezifische Rezeptoren besitzen. Dann wird jede Zelle analysiert, um das Verhältnis von irgendwelchen zwei Markierungsmitteln, die mit der Zelle verbunden sind, zu bestimmen, und falls dieses Verhältnis mit einem der vorgewählten Verhältnisse der Markierungsmittel in Beziehung steht, kann die Zelle in eine Subpopulationskategorie klassifiziert werden. Vorzugsweise werden Antikörperproteine mit zwei Fluorochromen, die voneinander verschiedene Emisionsspektren besitzen, markiert. Energie wird an die Zelle geführt, um die Fluorochrome anzuregen, und das Verhältnis der Fluoreszenzemissionen wird bestimmt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, welches die Anwendung elektronischer Abtastöffnungsprinzipien, die Spezifität selektiver biologischer Moleküle zum Identifizieren und/oder Spezifizieren definierter Populationen von Zellen oder geformten Körpern und die mikroskopische Teilchentechnologie kombiniert. Ein automatisches Analysiergerät kann zusammen mit einem speziellen lysierenden Reagens und/oder Antikörpern, die an mikroskopische Mikrokugeln oder Träger mit variierender Zusammensetzung gekoppelt sind, verwendet werden.
Ein gezieltes Anbringen mikroskopischer Teilchen ermöglicht die Modifikation des (der) Parameter(s), der (die) für den ursprünglichen Ort von mindestens einer der Populationen verantwortlich ist (sind). Die gesamte Zugabe mikroskopischer Teilchen zu ausgewählten Zielpopulationen, wo diese Zugabe das gemessene Volumen und/oder die Opatität beeinträchtigt, führt zu einer Verschiebung der Lage der Punkte, die eine Population repräsentieren bzw. darstellen.
Es werden Antikörper mit bekannter Spezifität beim Beschichten von mikroskopischen Teilchen verwendet. Dieses Beschichten gibt dem Teilchen die Kapazität, gezielt an gewissen Zellen zu haften, welche das Antigen exprimieren, für welches der Antikörper spezifisch ist. Diese beschichteten oder gekennzeichneten Zellen sind eine Kombination von Teilchen und Zellen, welche sich wie ein neues Gebilde verhalten. Ihre Parameter sind Opazität, Volumen, oder es können sowohl Opazität als auch Volumen angesehen werden, daß sie die Summe der Wirkungen von sowohl der Zelle als auch der Teilchen auf die erhaltenen Signale darstellen. Falls die Charakteristiken der Komponenten verschieden sind, wird sich das neue Gebilde auf eine neue Position bewegen, und zwar in Entsprechung mit der Nettowirkung. Der neue Ort sollte im Gegensatz zur früheren Position der Zelle allein eine Klassifizierung eines solchen neuen Gebildes oder einer Gruppe neuer Gebilde ermöglichen. Falls die Teilchen, die an die Zellen angebracht sind, magnetisch sind, können die neuen Gebilde natürlich gemäß üblicher Praxis durch die Verwendung eines Magneten gefaßt werden. Bei schneller Mischung treten unerwartete Ergebnisse auf; einschließlich einer vollständigen Fassung der Population, ohne daß die Eigenschaften der Zelle, die studiert wird, beeinträchtigt werden.
Es können lediglich drei verschiedene Populationen von Zellen leicht identifiziert und aus einer Blutprobe spezifiziert werden, indem ihre inhärenten und einzigartigen Eigenschaften des DC-Volumens- und des Opazitätsparameters, die oben angegeben sind, verwendet werden. Zusätzliche Schrifte, wie z.B. verbesserte lysierende Systeme, müssen getan werden, um den Nachweis und die Spezifizierung von mehreren Populationen zu ermöglichen. Natürlich stellen diese zusätzlichen Populationen Subpopulationen der drei Grundpopulationen dar, die als Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten bezeichnet werden. Die Schritte, die gemäß dieser Erfindung vorgenommen werden, zeigen, wie Subpopulationen dieser drei Gründpopulationen erhalten werden.
Indem solche einfachen Öffnungsabtasttechniken in Kombination mit zwei oder mehreren biologischen Teilchen angewendet werden, kann man eine einzigartige und neue Position der Punktanhäufüng, die eine vorgegebene Population repräsentiert, herstellen. Diese gezielte Bewegung von Populationen auf dem Punkteplot oder Scattergramm ist reproduzierbar und kann ausgenutzt werden, um eine Population zu klassifizieren, die von dem drei Grundpopulationen verschieden ist.
Die ursprüngliche und inhärente Kombination von DC-Volumen- und Opazitätsabtasttechniken kann durch Anbringung mikroskopischer Teilchen an gewählte einzelne Zellen modifiziert werden. Die Selektrivität wird den Teilchen durch die Natur oder die Spezifltät u.a. der biologischen Moleküle, Antikörper, die als die Beschichtung ihrer Oberflächen verwendet werden, verliehen. Eine Population von Zellen alleine, die keine Teilchen an ihrer Oberfläche besitzen, kann eine Punkteplotposition einnehmen, die von anderen Populationen oder Subpopulationen nicht verschieden ist und daher von einer anderen nicht unterscheidbar ist. Die Zugabe von Teilchen, die eine gezielte Attraktion für eine spezifische Population von Zellen besitzen, welche man identifizieren, spezifizieren und studieren will, ist bei Anwendung dieser Methode möglich. Die gezielte Zugabe einer ausreichenden Masse selektiver Teilchen einer bestimmten, interessierenden Population führt zu der Verschiebung des Punkteplotortes dieser Population, und zwar als ein Ergebnis der neuen und einzigartigen Kombination von Masse, Volumen und Opazität.
Die Trennung spezifischer Zellenpopulationen wird erzielt, ohne daß die Eigenschaften der verbleibenden Zellenpopulationen wesentlich beeinträchtigt werden. Die Entfernung von Erytrozyten oder roten Blutzellen (RBC) aus Vollblut gemäß dieser Erfindung erlaubt die Messung von T4- und/oder T8-Lymphozyten, die auf andere Weise mit heutzutage erhältlichen, chemischen RBC-Lysierungsreagentien nicht möglich ist. Die Verhältnisse der Anzahl von T4- zu T8-Zellen wurden verwendet, um Immunmangelzustände anzuzeigen, die mit schweren viralen Infektionen, einschließlich unter anderem des AIDS-Virus, konsistent sind. Die Anwesenheit spezifischer Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen kann verwendet werden, um eine Population in Subklassen zu klassifizieren, deren Spezifizierung den Nachweis des Ausbruchs einer Krankheit gestattet. In der vorherrschenden Form von Leukämie gibt es zum Beispiel einen scharfen Anstieg der Lymphozyten im periphären Blut. Falls die Subpopulation von Lymphozyten, welche sich rasch vermehrt, den T11-Rezeptor trägt, besteht für den Patienten das Risiko von Immunabnormalitäten. Falls ferner die Subpopulation von positiven T11-Lymphozyten den T4-Rezeptor trägt, wird der Patient als jener klassifiziert, der in Japan üblich ist. Falls außerdem die expandierenden T4-Rezeptor-Subpopulationen 2H4-positiv sind, wird der Patient nicht nur eine Neigung zu multiplen Infektionen sondern auch zu akuter Leukämie zeigen, genauso wie für T11 und T4 die 2H4-positive Zelle der Induktor für die Unterdrückung ist und die Fählgkeit des Patienten, Antikörper zu bilden, fünktionell inhibiert. Der Patient ist multiplen Infektionen ausgesetzt, und muß daher sowohl auf Leukämie als auch auf Immunmangel behandelt werden. K. Takatsuki et al., GANN Monograph über Cancer Research 28:13-22; C.Morimoto et al., Coulter Japan Symposium, 1984; C. Morimoto, et al., Immunology 134 (3):1508-1515, 1985; C. Morimoto, et al., New England Journal of Medicine 3 16(2):67-71, 1987. Die Erfindung betrifft auch Analysen von Suspensionen geformter Körper, wie z.B. u.a. Bakterien und Viren.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, welches die elektronische Teilchenabtasttechnik mit der Spezifität selektiver biologischer Moleküle kombiniert, um einen wesentlichen Fortschrift auf dem Gebiet automatisierter Analysatoren für klinische Laborverwendung und für industrielle Anwendungen zu ermöglichen. Der Nachweis multipler Leukozytenpopulationen und ihrer Beziehung zueinander im menschlichen peripheren Blut ist in der medizischen Forschung und in der Diagnose von Krankheiten von Menschen wichtig. Solche Daten sind als ein Screening-Werkzeug zum Identifizieren und Klassifizieren von Krankheiten, wie z.B. Leukämie, brauchbar. Abnormale Situationen, die durch Ausführung der Erfindung identifiziert werden, stellen eine diagnostisch relevante Information in den Gebieten, die studiert werden, zur Verfügung, die nicht nur auf den Nachweis von Leukozytenpopulationen beschränkt sind, wie aus der Beschreibung und aus den Zeichnungen klar werden wird.
Eines der wertvollsten Merkmale dieser Erfindung besteht darin, das einfache, robuste Coulter-Abtasten anzuwenden. Es ist stabil und erfordert nicht die Komplexität und den Preis optischer Systeme. Die Schaltung, die für die Zugabe des RF-Generators und den Detektor erförderlich ist, ist ökonomisch, kompakt und zuverlässig. Eine einzelne Öffnung ist alles, was erforderlich ist, aber die Hinzufügung einer zweiten oder sogar einer dritten Öffnung kann eine höhere Probendurchsatzrate auf ökonomische Weise ermöglichen.

Kurzfassung der Erfindung

Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Erhalten eines vielteiligen WBC-(weiße Blutzelle)-Populationsdifferentials von einer Vollblutprobe mit mindestens einer roten Blutzellenpopulation und WBC-Populationen darin die Schritte:
Verschieben des charakteristischen Beitrags der Neutrophilenpopulation zum elektronischen Abtasten hinsichtlich der anderen WBC-Populationen, indem die Probe mit Mikrokugeln vermischt wird, auf welchen ein neutrophilspezifischer, monoklonaler Antikörper gebunden ist; und
elektronisches Abtasten und Zählen mindestens der WBC-Populationen von Monozyten, Lymphozyten, Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen, wobei ein niedrig- und ein hochfrequentes Signal verwendet werden, wodurch mindestens ein fünffteiliges WBC-Differential erhalten wird.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Erhalten eines vielteiligen WBC-Populationsdifferentials von einer Vollblutprobe mit mindestens einer roten Blutzellenpopulation und WBC-Populationen darin die Schritte:
(i) elektronisches Abtasten und Zählen von mindestens der WBC-Populationen von Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten, wobei ein niedrig- und ein hochfrequentes Signal verwendet werden;
(ii) Entfernen oder Verschieben des Neutrophilpopulationsbeitrags von den WBC- Populationen, indem die Probe mit Mikrokugeln, wie in Anspruch 1 definiert, vermischt wird;
(iii) elektronisches Abtasten und Zählen von mindestens der verbleibenden WBC- Populationen von Monozyten, Lymphozyten, Eosinophilen und Basophilen; und
(iv) Vergleichen der zwei Zählungen, um eine Zählung der WBC-Population von Neutrophilen und dadurch mindestens ein fünfteiliges WBC-Differential zu erhalten.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Analysieren einer WBC-Population in einer Vollblutprobe, welche eine rote Blutzellenpopulation und WBC-Populationen umfaßt, von welchen eine gewählte WBC-Population mindestens zwei Untergruppen besitzt, die Schritte:
Entfernen oder Verschieben von mindestens eines WBC-Populationsuntergruppenbeitrags von der gewählten WBC-Population, indem die Probe mit Mikrokugehi vermischt wird, auf welche ein monoklonaler Antikörper gebunden ist, der für mindestens eine Untergruppe spezifisch ist; und
elektronisches Abtasten und Analysieren der auf diese Weise subtrahierten Untergruppe und WBC-Population unter Verwendung eines niedrig- und eines hochfrequenten Signals, um mindestens eine charakteristische Eigenschaft der gewählten WBC-Population zu bestimmen.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Bestimmen einer WBC-Population oder einer Populationsuntergruppe in einer Vollblutprobe die Schritte:
Verschieben von mindestens eines charakteristischen Beitrags einer WBC-Population oder Untergruppe zum elektronischen Abtasten hinsichtlich einer anderen WBC-Population oder Untergruppenpopulation, indem die Probe mit Mikrokugeln vermischt wird, auf welche ein monoklonaler Antikörper gebunden ist, der für mindestens eine WBC-Population oder Untergruppe spezifisch ist; und
elektronisches Abtasten und direktes Zählen der verschobenen Population, wobei ein nieder- und ein hochfrequentes Signal verwendet werden, um den Beitrag zur Probe der verschobenen Population oder Untergruppe zu erhalten.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Analysieren einer WBC-Population oder Populationsuntergruppe in einer Vollblutprobe, umfassend WBC-Populationen mit mindestens einer WBC-Populationsuntergruppe, die Schritte:
elektronisches Abtasten und Zählen der WBC-Populationen und ihrer Untergruppen, wobei ein nieder- und ein hochfrequentes Signal verwendet werden, um ein erste Zählung zu erhalten;
Entfernen oder Verschieben von mindestens einer der WBC-Populationen oder einer Untergruppe davon, indem die Probe mit Mikrokugeln, wie im vierten Aspekt der Erfindung definiert, vermischt wird;
elektronisches Abtasten und Zählen der verbleibenden und/oder verschobenen WBC- Populationen unter Anwendung eines nieder- und eines hochfrequenten Signals, um eine zweite Zählung zu erhalten; und
Vergleichen der ersten und der zweiten Zählung, um eine oder beide der verbleibenden WBC-Populationen und der entfernten oder verschobenen WBC-Population oder Untergruppenpopulation zu erhalten oder abzuleiten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung werden nun beispielhaft mit Bezug auf die Zeichnungen, die dieser Beschriebung beigefügt sind, beschrieben, in welchen Zeichnungen:
Fig. 1 ein schematischer Blockdiagramm eines Zellenpopulationsanalysators, der ein Verfahren der Erfindung verkörpert, ist;
Fig. 2 ein schematisches Blockdiagramm eines zweiten Analysators, der ein Verfahren der Erfindung verkörpert; ist,
Fig. 3 ein spezifischer Analysator ist, der ein Verfahren der Erfindung verkörpert und den Fig. 1 und 2 entspricht;
Fig. 4 ein schematisches Blockdiagramm eines weiteren Analysators ist, der ein Verfahren der Erfindung verkörpert;
Fig. 5A und 5B ein Scattergramm eines Satzes von Ergebnissen sind, welche ein Prototyp-Analysatorsystem ähnlich jenem benützt, welches mit Bezug auf die Fig. 2 und 3 dargestellt ist;
Fig. 6 ein schematisches Blockdiagramm eines weiteren Analysators ist, der ein Verfahren der Erfindung verkörpert;
Fig. 7 ein schematisches Blockdiagramm eines weiteren Analysators ist, der ein Verfahren der Erfindung verkörpert;
Fig. 8A und 8B, 9A und 9B, 10A und 10B und 11A und 11B ein Scattergramm eines Satzes von Ergebnissen sind, wobei ein Prototyp-Analysator ähniich jenem verwendet wird, der mit Bezug auf die Fig. 6 und 7 veranschaulicht ist;
Fig. 12 ein schematisches Blockdiagramm eines weiteren Analysators ist, der ein Verfahren der Erfindung verkörpert; und
Fig. 13 ein Scattergramm eines Satzes von Ergebnissen ist, wobei ein Prototyp-Analysator ähnlich jenem verwendet wird, der im Hinblick auf die Fig. 12 veranschaulicht ist.

Ausführungsarten der Erfindung

Bezugnehmend auf Fig. 1 wird eine erste Ausführungsform eines Verfahrens zur Analyse von Zellenpopulationen dieser Erfindung und ein Gerät, welches dieses Verfahren verkörpert, allgemein mit der Bezugsziffer 10 gezeichnet. Der Analysator 10 weist eine biologische Probe 12 auf; welche mindestens eine erste Gruppe von lebensfahigen biologischen Zellen (nicht gezeigt) enthält, wie z.B. in oder von einer Vollblutprobe. Die Zellen der biologischen Probe 12 sollen an einer biologischen Reaktion in einer quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung oder Analyse beteiligt sein. Die Probe 12 kann einen Puffer enthalten, in welchen die Zellen gegeben werden.
Die Probe 12 wird über eine Leitung 14 mit mindestens einem Reaktanten 16 über eine Leitung 18 vereinigt. Die roten Blutzellen (RBC) werden dann aus dem Gemisch von einer fünktionell bezeichneten RBC-Entfernungsstation 20 entfernt. Die RBCs können mit der Station 20 aus dem Gemisch auf mehrere Arten entfernt werden. Die RBCs können im Reaktanten 16 mit einem Lysierungsmitel lysiert werden. Ein solches bevorzugtes Lysierungsmittel und Löschungsmittel, welche damit benützt werden können, sind im U.S.-Patent mit der Seriennummer 025,303 und dem Titel METHOD AND REAGENT SYSTEM FOR ISOLATION IDENTIFICATION AND/OR ANALYSIS OF LEUKOCYTES FROM WHOLE BLOOD SAMPLES, geoffenbart, weiches gleichzeitig angemeldet wurde und welches durch Bezugnahme hier aufgenommen wird. Der Reaktant 16 kann eine Vielzahl von magnetischen Mikrokugeln sein oder enthalten, mit einem Antikörper, der für die RBCs, die an die Mikrokugeln gebunden sind (nicht gezeigt), spezifisch ist. In diesem Beispiel ist der besondere, für rote Blutzellen spezifische Antikörper, der verwendet wird, in der Anmeldung mit der Seriennummer 799,489, eingereicht am 19. November 1985, und dem Titel MONOCLONAL ANTIBODY FOR RECOVERY OF LEUKOCYTES IN HUMAN PERIPHERAL BLOOD AND METHOD OF RECOVERY EMPLOYING SAID MONOCLONAL ANTIBODY, geoffenbärt, welche hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Der Reaktant 16 kann zusätzlich oder anstelle des Probenpuffers einen Puffer enthalten. Der Reaktant 16 kann ferner eine Kombination des bevorzugten RBC-Lysierungsmittels und der spezifischen RBC-Mikrokugeln sein.
Sind einmal die RBCs im wesentlichen aus dem Gemisch entfernt, wird ein Teil des Gemisches über eine Leitung 24 in einen Analysator 22 für weiße Blutzellen (WBC) geleitet. Der WBC-Analysator 22 zählt zumindest die Anzahl der WBCs im Gemisch. Der WBC-Analysator 22 kann auch ein oder mehrere Volums- oder Opazitätsparameter der WBCs messen. Die Ergebnisse aus dem Analysator 22 werden über eine Leitung 28 einem Komparator 26 zugeführt.
Ein zweiter Teil des an RBC verarmten Gemisches wird über die Leitung 32 einer Station 30 zur Subtraktion der WBC-Untergruppe zugeführt. Die WBCs können auf verschiedene Weise vom Gemisch subtrahiert werden. Mikrokugeln mit einem daran gebundenen monoklonalen Antikörper, der auf eine der WBC-Untergruppen spezifisch ist, können dem Gemisch zugegeben werden. Nicht-magnetische Mikrokugeln können an die WBCs gebunden werden, um die erhaltenen Opazitäts- oder Volumsparameter der Zellen zu ändern oder zu verschieben. Magnetische Mikrokugeln können auch an WBCs gebunden werden, welche dann mit einem magnetischen Feld aus dem Gemisch entfernt werden können.
Das Gemisch mit der entfernten WBC-Untergruppenpopulation oder mit einem oder mehreren geänderten Parametern wird dann über eine Leitung 36 einem WBC-Untergruppenanalysator 34 zugeführt. Der Analysator 34 kann mit dem Analysator 22 identisch sein. Die Ergebnisse des Analysators 34 werden dann über eine Leitung 38 dem Komparator 26 zugeführt. Dann vergleicht der Komparator 26 die WBC-Ergebnisse aus dem Analysator 22 mit den modifizierten Ergebnisse aus dem Analysator 34, um mindestens eine charakteristische Eigenschaft bzw. Charakteristik der gewählten weißen Blutzellenpopulation, wie z.B. die Anzähl von Zellen in einem bestimmten Bereich, zu bestimmen.
Bezugnehmend auf Fig. 2 wird eine zweite Ausführungsform des Zellenpopulationsanalysierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung und des Gerätes, welches dieses Verfahren verkörpert, allgemein mit der Bezugsziffer 40 bezeichnet. Der Analysator 40 enthält eine biologische Probe 42, welche wiederum mindestens eine erste Gruppe von lebensfahigen biologischen Zellen (nicht gezeigt), wie z.B in oder von einer Vollblutprobe, enthält. Die Zellen der biologischen Probe 42 sollen in einer biologischen Reaktion an einer quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung oder Analyse beteiligt sein. Die Probe 42 kann wiederum einen Puffer enthalten, in welchen die Zellen gegeben werden.
Die Probe 42 wird über eine Leitung 44 mit mindestens einem Reaktanten 46 über eine Leitung 48 vereinigt. Im Analysator 40 werden die RBCs aus dem Gemisch entfernt, und gleichzeitig wird mindestens ein Charakteristikum von mindestens einer WBC-Untergrüppe geändert oder verschoben, und zwar mit einer fünktionell bezeichneten Station 50 zur Entfernung von RBCs oder zum Verschieben von WBCs. Wie oben angegeben, können die RBCs auf mehrere Weise von der Station aus dem Gemisch entfernt werden, wie früher mit Bezug auf die Station 20 ausgeführt wurde. Gleichzeitig werden im gleichen Gemischteil die WBCs an im allgemeinen nicht-magnetische Mikrokugeln gebunden, um die erhaltenen Opazitäts- und/oder Volumsparameter der Zellen zu verändern oder zu verschieben.
Dann wird das Gemisch mit den entfernten RBCs und der verschobenen WBC-Untergruppenpopulation über eine Leitung 54 einem Analysator 52 zuführt. Der Analysator 52 kann im wesentlichen mit dem Analysator 22 identisch sein. Der Analysator 40 sieht auf diese Weise eine schnelle, direkte Analyse von mindestens einer charakteristischen einer gewählten WBC- Population oder Vollblutuntergruppe vor.
Eine spezifische Ausführungsform eines Analysatorgerätes, welches ein Verfahren der Erfindung verkörpert und welches die Analysierverfahren des ersten und des zweiten Analysators 10 und 40 verwirklicht, wird in der Fig. 3 allgemein mit der Bezugsziffer 56 bezeichnet.
Im Gerät 56 ist nur eine Ausführung dargestellt, welche beinahe gemäß den Prinzipen der Erfindung unendlich abgewandelt werden kann. Ferner ist das Gerät 56 mit allgemeinen fünktionellen Details gezeigt, und die spezifischen Ausführungsformen können strukturell auf manigfaltige bekannte Weisen ausgeführt werden.
Das Instrument 56 weist einen Aspirator-Pumpmechanismus 58 auf, welcher verwendet wird, um die interessierende biologische Probe, zum Beispiel die Probe 12 oder 42, in das Gerät 56 zu ziehen. Der Aspirator 58 ist über eine Leitung 60 an ein Probenventil 62 gekoppelt, welche an eine Probensonde 63 gekoppelt sein kann. Eine Lysiermittelpumpe 64 kann das Lysierungsmittel enthalten, wie z.B. einen Teil des Reaktanten 18 oder 46, und ist ebenso über eine Leitung 66 an das Ventil 62 gekoppelt. Das Ventil 62 und die Pumpe 48 können die biologische Probe 12 oder 42 zusammen mit dem Lysierungsmittel über die Pumpe 64, falls vorgesehen, aufziehen.
Das Reaktionsgemisch oder die biologische Probe selbst wird dann über eine Abgabeleitung 68 in einen Mischapparat 70 abgegeben. Der Mischer 70 weist eine Mischkammer 72 auf, in welche die Probe oder der Reaktant eingespeist wird. An diesem Punkt wird sich der Betrieb des Analysators 10 vom Analysator 40 unterscheiden und daher getrennt beschrieben.
Im Fall des Analysators 10 wird, falls die RBCs vom Lysierungsmittel aus der Pumpe 64 lysiert worden sind, dann, wenn die Reaktion beendet ist, ein Quenchmittel oder ein Fixierungsmittel über eine Leitung 76 aus einer Station 74 zugeführt. Die Reaktion ist beendet. Die Reaktion kann gefördert werden, indem das Lysierungsmittel und die Probe in der Kammer 72 gemischt werden, wie fünktionell bei 78 gezeigt ist.
Spezifische Details eines geeigneten Mischapparates 70, welcher hier verwendet werden kann, sind im U.S.-Patent mit der Seriennummer 025,337 und dem Titel METHOD AND APPARATUS FOR RAPID MIXING OF SMALL VOLUMES FOR ENHANCING BIOLOGICAL REACTIONS, welche gleichzeitig eingereicht wurde und durch Bezugnahme hier aufgenommen wird, geoffenbart. Durch Verwendung des Mischers 70 werden die Reaktionen in großem Ausmaß beschleunigt, ohne daß die interessierenden Eigenschaften der Zellen signifikant beeinträchtigt werden, wie es zum Beispiel durch Anheben der Reaktionstemperatur auftreten kann. Ferner sind die Reaktionen im allgemeinen in wesentlich weniger als eine Minute beendet, und zwar in der Regel in der Größenordnung von 15 Sekunden oder weniger. Dies gestattet eine schnelle Analyse des automatischen, hochvolumigen Analysatorinstruments 56.
Der gequenchte Reaktant, bei dem die RBCs durch das Lysierungsmittel (wie von der Station 20) entfernt sind, wird dann über eine Leitung 80 einer Haltekammer 82 zugeführt, welche in diesem Fall einen zweiten Teil des Gemisches hält. Ein erster Teil des Gemisches wird von der Kammer 82 über eine Leitung 84 einem WBC-Analysator 86 (d.h. Analysator 22) zugeführt. Der Analysator 86 kann einer von vielen physikalischen Typen sein, und zwar gemäß den Zähl- und Klassifizierungstechnlken, die von Wallace H. Coulter im U.S.-Patent Nr. 2,656,508 beschrieben und in einer Reihe kommerzieller Blutzellenzählgeräte des Anmelders Coulter Electronics, Inc. verkörpert sind.
Der Analysator 86 weist im allgemeinen einen Durchflußsensor oder eine Abtastkammer 88 auf Die Kammer 88 weist einen Transducer 90 auf, welcher eine durchgehende Öffnung 92 besitzt. Die Kammer 88 weist einen ersten Teil 99 auf, welcher eine erste Elektrode 96 besitzt, die mit dem darin befindlichen Fluid in Kontakt ist.
Der Kammerteil 94 und die Elektrode 96 stehen über die Öffnung 92 mit einem zweiten Kammerteil 98 in Verbindung, der eine zweite Elektrode 100 darin aufweist.
Die Elektroden 96 und 100 sind über reaktive Leitungen 102 und 104 mit einer RF/DC- Quellen- und Abtastschaltung 106 verbunden. Die Schaltung 106 koppelt sowohl einen DC oder niederfrequenten Strom oder Signal und ein hochfrequentes Signal zwischen den Elektroden 96 und 100.
Das niederfrequente Signal wird benützt, um die Amplitude eines Signalimpulses abzutasten, der von einer Zelle verursacht wird, die die Öffnung 92 passiert. Das hochfrequente Signal wird verwendet, um die elektrische Opazität der gleichen Zelle, die die Öffnung 92 passiert, zu erhalten.
Die Messung der elektrischen Opazität von Zellen wurde seit diesem Patent von Wallace H. Coulter und Walter R. Hogg im U.S.-Patent 3,502,974 und einigen Patenten und Publikationen des Anmelders, Coulter Electronics, Inc., beschrieben. Eine spezifische Schaltung, welche hier verwendet werden kann, ist im U.S.-Patent mit der Seriennummer 921,654 und dem Titel PARTICLE ANALYZER FOR MEASURING TIIE RESISTANCE AND RE- ACTANCE OF A PARTICLE, eingereicht am 21. Oktober 1986, welches hier durch Bezugnahme aufgenommen ist, geoffenbart.
Die Signale, die von der Schaltung 106 von den abgetasteten Zellen erzeugt werden, werden über ein DC-Signalleitung 108 und eine RF-Signalleitung 110 an einen Komparator 112 (wie der Komparator 26) gekoppelt. Der Komparator 112 kann das Signal, welches aus dem ersten Teil erzeugt wird, d.h. jener, bei welchem die WBC-Untergruppe nicht subtrahiert ist, für einen Vergleich mit den Ergebnissen aus dem zweiten Teil, der beschrieben wird, halten.
Der Analysator 86 kann eine Mantelströmung aufweisen, um die Zellen im Sensor 88 zu fokussieren, und dies auf eine gut bekannte Art. Die Mantelströmung kann von einem Fluidsystem 114 vorgesehen werden, das an den Sensor 88 mit einem Leitungspaar 116 und 118 auf eine bekannte Weise gekoppelt ist. Das Probenreaktionsgemisch kann über ein Einbringungsrohr 120 dem Sensor 88 zugeführt werden, und kann vom Sensor 88 über ein Ausgangsrohr 122 in einen Abfallbehälter 124 übergeführt werden.
Während der erste Teil des Gemisches im Analysator 86 analysiert wurde, wird der zweite Teil in der Kammer 82 gehalten, während der Mischer 72 gereinigt oder über eine Spülleitung 126 gespült und durch eine Abfalleitung 128 abgesaugt wird. Sobald die Kammer 72 gereinigt ist, wird der zweite Teil über eine Leitung 130 in die Kammer 72 zurückgeführt. Wie bei der Station 30 wird die WBC-Untergruppe nun subtrahiert, indem die WBC-Mikrokugeln aus einer Station 132 über eine Leitung 134, ein Ventil 136 und eine Kammerleitung 138 zugegeben werden.
Die WBC-Mikrokugeln werden durch den Mischmechanismus 78 mit dem zweiten Teil gemischt. Falls die WBC-Mikrokugeln nicht-magnetisch sind, wird das Reaktionsgemisch mit den gebundenen WBC-Mikrokugeln über die Leitung 80, die Kammer 82 und die Leitung 84 in den Analysator 86 (d.h. der Analysator 34) zugeführt, worin der zweite Teil ährilich dem ersten Teil analysiert wird, und dann werden die Ergebnisse im Komparator 112 (d.h. dem Komparator 26) verglichen. Mindestens einer der WBC-Untergruppenzellenparameter ist im zweiten Teil geändert, wie z.B. die Zellenopazität durch die an Mikrokugeln gebundene WBC-Untergruppe, wobei geänderte Ergebnisse geliefert werden, welche dann analysiert werden können.
Falls die WBC-Mikrokugeln magnetisch sind, wird dann die daran gebundene WBC- Untergrüppe mittels eines Magnetfeldes während und/oder nach dem Mischvorgang mit einem Magnetfeld oder einem Magneten 140 entfernt. Das Feld kann mit elektromagnetischen Mitteln oder mit dem Magneten 140 vorgesehen werden, welcher hinsichtlich der Kammer 72 physisch bewegt wird, um die magnetisch gebundene WBC-Untergruppe zu fassen bzw. einzufangen. Dann wird der zweite Teil ohne die gebundene WBC-Untergruppe über die Leitung 80, die Kammer 82 und die Leitung 84 dem Analysator 86 zugeführt, und zwar auf eine Weise, die oben beschrieben ist, um die Analyse zu erhalten (ähnlich dem Analysator 34).
Das Gerät 56 wird dann vorbereitet, um die nächste Probe für die nächste Analyse aufzunehmen. Die Sonde 63 kann mit einem Sondenspülmechanismus 142 gereinigt werden, und die Leitungen und die Kammern 72 und 82 können auf eine herkömmliche Weise gespült werden. Jede Analyse des nachfolgenden Probengemisches wird auf schnelle und automatische Weise erhalten. Die Zeitspanne zwischen den Analysen aufeinanderfolgender Probengemische kann in der Größenordnung von Minuten oder weniger sein.
Beim Betreiben des Analysatorgerätes 56 wird, ähnlich dem Analysator 40, das Reaktionsgemisch mit dem RBC-Lysierungsmittel/Reaktanten 46 und der Probe 42 in der Kammer 72 zusammen mit nicht-magnetischen WBC-Mikrokugeln aus der Station 132 gemischt, welche an eine der WBC-Untergruppen binden. Das Quenchmittel 74 wird dem reaktiven Gemisch zugegeben, welches dann über die Leitung 80, der Kammer 82 und der Leitung 84 dem WBC- Analysator 86 zur Analyse zugegeben wird (d.h. wie dem Analysator 52).
Alternativ zur Ausnützung des Lysierungsmittels in entweder dem Analysator 10 oder 40 kann die Probe 12 oder 42 über das Ventil 62 dem Mischer 70 ohne jegliches Lysierungsmittel zugegeben werden. In diesem Fall können die RBCs magnetisch unter Verwendung der Mikrokugeln mit dem daran gebundenen RBC-spezifischen Antikörper von einer RBC-Mikrokugelstation 144 entfernt und dem Ventil 136 über eine Leitung 146 und dann der Kammer 70 über die Leitung 138 zugeführt werden. Wird kein Lysierungsmittel verwendet, werden die gebundenen RBCs mit dem Magneten 140 nach dem Mischen auf eine Weise magnetisch entfernt, die iin wesentlichen mit den magnetisch gebundenen WBCS, wie oben beschrieben, identisch ist.
Ferner kann in einem zweiten Fall, um die Geschwindigkeit der Reaktion zu steigern, ein Reaktionsgemisch der Probe mit sowohl dem RBC-Lysierungsmittel als auch den magnetischen RBC-Perlen benützt werden. Das Reaktionsgemisch wird gemischt, das Lysierungsmittel wird gequencht und die gebundenen RBCs werden magnetisch entfernt, und dann werden die WBCS analysiert, wie oben beschrieben ist.
Bezugnehmend nun auf Fig. 4 ist eine andere Ausführungsform eines Zellenpopulationsanalysierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung und eines Gerätes, welches das Verfahren verkörpert, allgemein mit der Bezugsziffer 148 bezeichnet. Der Analysator 148 weist eine biologische Probe 150 auf, welche wiederum mindestens eine erste Gruppe von lebensfahigen biologischen Zellen, wie z.B. in oder von einer Vollblutprobe, enthält. Die Probe 150 kann wiederum einen Puffer aufweisen, in welchen die Zellen gegeben werden.
Die Probe 150 wird über eine Leitung 152 mit mindestens einem Reaktanten 154 über eine Leitung 156 vereinigt. Dann werden die RBCs, wie oben beschrieben, von einer funktionell bezeichneten RBC-Entfernungsstation 158 entfernt. Das Reaktionsgemisch mit den entfernten RBCs wird über eine Leitung 160 in einen WBC-Analysator 162 geführt. Die Ergebnisse aus dem Analysator 162 werden über eine Leitung 166 einem Komparator 164 zugeführt, wobei ein dreiteiliges WBC-Differential mit Ergebnissen für Monozyten (M), Lymphozyten (L) und Granulozyten (G) zur Verfügung gestellt wird.
Dann wird das Gemisch einer fünktionell bezeichneten Station 168 zur Entfernung der Neutrophilen (N) über eine Leitung 170 zugeführt. Die Ns können aus dem Gemisch durch Verschieben oder Verändern eines Parameters, wie z.B. der Opazität, oder durch magnetische Entfernung, beide wie oben beschrieben, entfernt werden. In diesem Beispiel ist der besondere N-spezifische Antikörper, der verwendet wird, im U.S.-Patent mit der Seriennummer 938,864 und dem Titel MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC TO NEUTROPHILS, eingereicht am 8. Dezember 1986, geoffenbart.
Das Gemisch mit den entfernten oder verschobenen Ns wird dann über eine Leitung 174 einem weiteren WBC-Analysator 172 zugeführt. Die Ergebnisse des Analysators 172 werden über eine Leitung 176 dem Komparator 164 zugeführt. Die Ergebnisse des Analysators 172 werden benützt, um ein vierteiliges WBC-Differential mit erneut Ergebnissen für Ms und Ls zu erhalten, aber jetzt werden zusätzlich, da die Ns verschoben oder entfernt sind, Ergebnisse für Eosinophile (E) und Basophile (B) erhalten. Die zwei analytischen Ergebnisse aus den Analysatoren 162 und 172 können dann vom Komparator 164 verglichen werden, um ein fünfteiliges WBC-Differential zu bilden. Spezifisch führt ein Subtrahieren der Anzahl Bs und Es von der Anzahl Grs zur Anzahl der entfernten Ns.
Bezugnehmend auf die Fig. 5A und 5B werden nun zwei Sätze von Scattergrammergebnissen veranschaulicht, die aus einer Vollblutprobe erhalten werden, wobei ein Prototypanalysierungsverfahren ähnlich jenem des Analysators 148 angewendet wird. Die biologische Probe 150 war eine Vollblutprobe von 20 Mikroliter, welche mit 40 Mikroliter magnetischer Mikrokugeln mit daran gebundenem RBC-spezifischen Antikörper, vereinigt mit 140 Mikroliter Pufferlösung, vereinigt wurde, um den Reaktanten 154 zu bilden. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Sekunden gemischt und 10 Sekunden in der Station 158 in ein magnetisches Feld gegeben. Das Gemisch mit den entfernten RBCs wurde vom Analysator 162 analysiert, wie im Scattergramm der Fig. 5A veranschaulicht ist, was folgende Zählungen ergab: 45,6 Ls (1), 5,6 Ms (2) und 48,7 Grs (3).
Dann wird das Gemisch in der Station 168 mit 10 Mikroliter magnetischer Mikrokugeln mit N-spezifischem Antikörper, der an sie gebunden ist, vereinigt. Das Gemisch wird 30 Sekunden gemischt und dann 10 Sekunden in ein magnetisches Feld gegeben. Das Gemisch mit den dann entfernten Ns wurde dem Analysator 176 zugeführt, was zum Scattergramm von Fig. 5B führte und die Zählungen 81,0 Ls (1), 0,6 Ms (2), 11,0 Es (3) und 1,8 Bs (4) ergab. Dann liefert der Komparator 164 das fünfteilige WBC-Differential der Zählungen 45,6 Ls, 5,6 Ms, 41,6 Ns, 6,0 Es und 1,2 Bs. Dies entspricht einem mikroskopischen, fünfteiligen WBC-Standarddifferential, welches Wright'sche Färbung auf der Probe auf einem Objektträger anwendet und die Zählungen 44,0 Ls, 3,4 Ms, 45,0 Ns, 6,1 Es und 0,4 Bs ergibt.
Fig. 6 veranschaulicht eine weitere Ausführungsform eines Zellenpopulationsanalysierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung und eines Gerates, welches dieses Verfahren verkorpert, allgemein bezeichnet mit der Bezugsziffer 178. Der Analysator 178 weist eine biologische Probe 180 auf, welche wiederum mindestens eine erste Gruppe von lebensfahigen biologischen Zellen enthalt, und aucn einen Puffer aufweisen kann.
Die Probe 180 wird uber eine Leitung 182 mit einem Reaktanten 184 über eine Leitung 186 vereinigt. Funktionell veranschaulicht, wird ein erster Teil des Gemisches uber eine Leitung 188 einer fünktionell bezeichneten RBC- und N-entfernenden Station 190 zugeführt. Die RBCs und Ns werden entfernt oder verschoben, wie oben beschrieben, und der erste Teil wird über eine Leitung 192 einem WBC-Analysator 194 zugeführt.
Dies stellt ein Ergebnis aus dem Analysator 194 zur Verfügung, welches über eine Leitung 196 einem Komparator 198 zugeführt wird. Das Ergebnis enthält das oben erwähnte vierteilige Differential, welches Ms, Ls, Es und Bs aufweist.
Zur gleichen Zeit wird ein zweiter Teil des Gemisches der Probe 180 und dem Reaktanten 184 über eine Leitung 200 an eine fünktionell bezeichnete RBC-Entfernungsstation 202 geführt. Das Gemisch mit den entfernten RBCs wird über eine Leitung 204 einem weiteren WBC-Analysator 206 zugeführt. Die Ergebnisse des Analysators 206 werden über eine Leitung 208 dem Komparator 198 zugeführt. Die Ergebnisse des Analysators 206 enthalten direkt das oben erwähnte dreiteilige WBC-Differential, welches die Ms, Ls und Grs enthält. Die Ergebnisse der Analysatoren 194 und 206 werden dann vom Komparator 198 verglichen, um das fünfteilige WBC-Differential zur Verfügung zu stellen.
Noch ein weiteres Analysegerät, welches das Verfahren und den Apparat des Analysators 178 aufweist, wird allgemein mit der Bezugsziffer 210 in der Fig. 7 bezeichnet. Auch hier wurde lediglich eine spezifische Geräteausführung veranschaulicht, aber ähnlich dem Analysegerät 56 kann das Analysegerät 210 in zahlreichen Konfigurationen ausgeführt werden.
Das Gerät 210 weist einen Aspiratorspülmechanismus 212 auf, der über eine Leitung 216 an ein Probenventil 214 gekoppelt ist. Das Ventil 214 kann eine Probensonde 216 aufweisen, um die interessierende biologische Probe, wie z.B. die Probe 180, autzuziehen. Eine Pumpe 220 zur Abgabe von Verdünnungsmittel ist über eine Leitung 222 an das Ventil 214 gekoppelt, um ein Verdünnungsmittel für die Probe vorzusehen, wie z.B. eine Vollblutprobe, falls erwünscht. Ein erster Teil des Gemisches wird dann über eine Leitung 224 und eine Leitung 226 einem ersten Mischapparat 228 zugeführt. Zu diesem Zeitpunkt wird ein zweiter Teil des Gemisches über die Leitung 224 und eine Leitung 230 einem zweiten Mischapparat 232 zugeführt.
Der Mischer 228 (vergleichbar mit der Station 190) ist praktisch identisch mit dem Mischer 232 (vergleichbar mit der Station 202) und wird zuerst beschrieben. Der Mischer 228 weist eine Mischkammer 234 auf, in welche der erste Gemischteil eingespeist wird. Der Mischer 228 besitzt alle der oben beschriebenen verschiedenen Optionen und kann eine Lysierungsmittel-Eingangsleitung 236 für die RBC-Lyse, falls erwünscht, aufweisen.
Falls die Lyse angewendet wird, und zwar nach dem Mischen, wie fünktionell bei 238 veranschaulicht ist, wird das Quenchmittel über eine Quenchmittelleitung 240 zugegeben. Zur gleichen Zeit werden die Ns durch die Zugabe der geeigneten magnetischen oder nicht-magnetischen Mikrokugeln mit dem daran gebundenen N-spezifischen Antikörper von einer Mikrokugelquelle 220, die der Kammer 234 über eine Leitung 244 zugeführt werden, entfernt. Falls magnetische Mikrokugeln für die Ns oder für die RBCs verwendet werden, wird ein Magnet 246 oder ein magnetisches Feld angewendet, um die magnetisch gebundenen Zellen zu entfernen.
Das gemischte und gequenchte (wenn notwendig) Gemisch wird dann über eine Leitung 248 durch ein Ventil 250 und eine Leitung 252 einem WBC-Analysator 254 (d.h. Analysator 194) zugeführt. Der Analysator 254 ist der gleiche wie der Analysator 86 und wird auch nicht so detailliert beschrieben. Auch der Analysator 254 weist eine Abtastkammer 256 mit einer Öffnung 258 auf, durch welche das Gemisch und die Zellen durchgehen. Ein fluides Mantelströmungssystem 260 kann an die Kammer 256 gekoppelt sein. Die Signale, die von den Zellen erzeugt werden, werden von einer RF/DC-Quellen- und Abtastschaltung 262 detektiert, deren Ausgänge einem Komparator 264 zugeführt werden, wie oben beschrieben ist.
Gleichzeitig wird der zweite Gemischteil einer Mischkammer 266 zugeführt. Im zweiten Teil sind lediglich die RBCs entfernt (d.h. ähnlich der Station 202), und die RBCs können durch das RBC-Lysierungsmittel entfernt werden, welches über eine Leitung 268 in die Kammer 266 eingespeist wird. Das Lysierungsmittel wird mit der Probe gemischt, und dann wird ein Quenchmittel über eine Quenchmittelleitung 270 zugegeben. Alternativ können die RBCs mit magnetischen Mikrokugeln, welche den RBC-spezifischen Antikörper daran gebunden haben, aus einer Mikrokugelquelle 272 entfernt und über eine Leitung 274 in die Kammer 266 eingespeist werden. Die Mikrokugeln werden gemischt, und zwar fünktionell bei 276, und dann werden die magnetsich gebundenen RBC-Mikrokugeln mit einem Magneten 278 entfernt.
Das RBC-entfernte Gemisch wird dann über eine Leitung 280 dem Ventil 250 und über die Leitung 252 dem Analysator 254 zugeführt, um die oben erwähnten Ergebnisse zu erhalten. Die Mischer 228 und 232 weisen jeweils geeignete Spülleitungen 282 und 284 und Abfalleitungen 286 und 288 und eine Sondenspülung 290 zur Reinigung des Gerätes 210 vor dem Aufziehen der nächsten Probe oder Proben zur Analyse auf.
Die Fig. 8A und 8B veranschaulichen Scattergrammergebnisse, die aus einer Vollblutprobe erhalten werden, wobei ein Analyseverfahren ähnlich jenem des Analysators 178 angewendet wird. In diesem Beispiel bilden 20 Mikroliter Vollblut die Probe 180, während 40 Mikroliter magnetischer Mikrokugeln mit dem daran gebundenen RBC-spezifischen Antikörper, kombiniert mit 140 Mikroliter Pufferlösung, den Reaktanten 184 bildet. Ein Teil des Gemisches wird 20 Sekunden in der Station 202 gemischt und dann 10 Sekunden in ein magnetisches Feld gegeben. Das Gemisch, aus welchen RBCs entfernt wurden, wird dann im Analysator 206 analysiert, was zum Scattergramm von Fig. 8A führt, welches eine Zählung von 29,4 Ls (1), 8,1 Ms (2) und 62,4 Grs (3) liefert.
Zur gleichen Zeit wird ein anderer Teil des gleichen Gemisches mit 10 Mikroliter magnetischer Mikrokugeln mit dem daran gebundenen N-spezifischen Antikörper vereinigt, um die RBCs und die Ns in der Station 190 zu entfernen. Das Gemisch wird 30 Sekunden lang gemischt und dann für 10 Sekunden in ein Magnetfeld gegeben. Das Gemisch mit den entfernten Ns und RBCs wird dann vom Analysator 194 analysiert, was zum Scattergramm der Fig. 8B führt, was eine Zählung von 73,5 Ls (1), 21,7 Ms (2), 3,4 Es (3) und 1,4 Bs (4) liefert. Die zwei Zählungen werden im Komparator 198 verglichen, was zu einer fünfteiligen WBC-Differentialzählung von 29,4 Ls, 8,0 Ms, 60,8 Ns, 1,2 Es und 0,6 Bs führt. Neuerlich wurde ein Mikroskopvergleich vorgenommen, was zu den Zählungen 29,4 Ls, 5,0 Ms, 65,0 Ns, 1,0 Es und weniger als 1,0 Bs führte.
Die Fig. 9A und 9B zeigen Scattergrammergebnisse eines fünfteiligen WBC-Differentialbeispiels ähnlich jenem der Fig. 8A und 88. Eine zwanzig Mikroliter Probe von Voliblut wurde mit den gleichen Schritten, die oben mit Bezug auf die Fig. 8A und 8B beschrieben werden, analysiert, was zum Scattergramm der Fig. 9A führt, welches eine Zählung von 35,4 Ls (1), 14,6 Ms (2) und 50,0 Grs (3) liefert. Das Scattergramm von Fig. 9B liefert eine Zählung von 66,4 Ls (1), 25,0 Ms (2), 6,6 Es (3) und 2,0 Bs (4). Das erhaltene fünfteilige WBC- Differential führt zu den Zählungen von 35,4 Ls, 14,6 Ms, 45,5 Ns, 3,5 Es und 1,1 Bs und wurde mit einer Mikroskopzählung von 36 Ls, 11 Ms, 49 Ns, 3 Es und 1 B verglichen.
Die Fig. 10A und 10B zeigen Scattergrammergebnisse eines fünfteiligen WBC-Differentials, welches neuerlich ähnlich jenem der Fig. 8A, 8B und 9A, 9B ist, in diesem Beispiel wurde jedoch ein Lysierungsmittel verwendet. In diesem Beispiel wurden 20 Mikroliter Vollblut mit 80 Mikroliter Puffer und 240 Mikroliter des bevorzugten RBC-Lysierungsmittels vereinigt. Das Gemisch wird 6 Sekunden lang gemischt, und dann wird ein Quenchmittel zugegeben. Die Zeitspanne ist signifikant, weil das Lysierungsmittel, wenn es für eine Zeitspanne von länger als etwa 10 Sekunden ungequencht bleibt, die signifikanten Eigenschaften der WBCs zu beeinträchtigten beginnt. Das Gemisch mit den entfernten RBCs wird analysiert, um das Scattergranim der Fig. 10A zur Verfügung zu stellen, was zu den Zahlungen von 25,7 Ls (1), 9,6 Ms (2) und 65,0 Grs (3) führt.
Ein zweiter Teil des Gemisches, welches eine zweite Probe Vollblut von 20 Mikroliter enthält, wird mit 120 Mikroliter Puffer und 10 Mikroliter magnetischer Mikrokugein mit daran gebundenem, N-spezifischem Antikörper vereinigt, und 30 Sekunden gemischt, und dann für 10 Sekunden in ein Magnetfeld gegeben. Das bevorzugte RBC-Lysierungsmittel wird dann dem Gemisch, welchem N entfernt wurde, zugegeben, und dann 6 Sekunden gemischt, bevor es gequencht wird. Das erhaltende Scattergramm Fig. 10B ergibt Prozentsatzzählungen von 74,6 Ls (1), 21,6 Ms (2), 2,9 Es (3) und 0,8 Bs (4). Das erhaltende füiifteilige WBC-Differential führt zu Prozentsatzzahlungen von 25,6 Ls, 9,6 Ms, 63,5 Es, 1,06 Es und weniger als 0,3 Bs. Auch hier führte ein Mikroskopvergleich zu Zahlungen von 29,4 Ls, 5,0 Ms, 65,0 Ns, 1,0 Es und weniger als 1 Bs.
Ein weiteres Beispiel von Scattergramm Ergebnissen eines fünfteiligen WBC Differentials ahnlich jenem der Fig. 10A und 10B ist in den Fig. 11A und 11B veranschaulicht. Eine Probe Vollblut hatte zwei Proben gleichzeitig analysiert, und zwar in den gleichen Schritten, wie sie mit Bezug auf die Fig. 10A und 10B beschrieben sind. Das Scattergramm von Fig. 11A liefert eine Zahlung von 31,9 Ls (1), 17,6 Ms (2) und 50,4 Grs (3). Das Scattergramm von Fig. 11B liefert eine Zählung von 67,1 Ls (1), 24,1 Ms (2) 7,6 Es (3) und 1,2 Bs (4). Das erhaltene, fünfteilige WBC-Differential führt zu Zählungen von 31,9 Ls, 11,4 Ms, 46,0 Ns, 3,6 Es und 0,7 Bs, verglichen mit einer Mikroskopzählung von 36 Ls, 11 Ms, 49 Ns, 3 Es und 1B.
Eine noch andere Ausführungsform eines Zellenpopulationsanalysierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung und eines Apparates, welcher dieses Verfahren verkörpert, ist allgemein mit der Bezugsziffer 292 in der Fig. 12 bezeichnet. Der Analysator 292 weist eine biologische Probe 294 auf, wobei wiederum mindestens eine erste Gruppe von lebensfähigen biologischen Zellen und ein Puffer, falls erwünscht, enthalten sind.
Die Probe 294 wird über eine Leitung 296 mit mindestens einem Reaktanten 298 über eine Leitung 300 vereinigt. Im Analysator 292 werden die RBCs entfernt, und werden die Ns nacheinander oder gleichzeitig in einer fünktionell bezeichneten Station 302 verschoben. Die RBS-Entfernungsfünktion ist mit 304 bezeichnet, und der N-Bewegungs- oder -Verschiebungsteil ist mit 306 bezeichnet, um anzuzeigen, daß die Funktionen gleichzeitig oder nacheinander ausgeführt werden können. Die RBSC können magnetisch oder mit einem Lysierungsmittel oder mit einer Kombination aus den beiden, wie vorher beschrieben, entfernt werden. Die Ns werden entfernt oder verschoben, indem Mikrokugeln dem Gemisch zugegeben werden, welche einen N-spezifischen Antikörper an sie gebunden aufweisen.
Sobald die RBCs entfernt sind und die Ns bewegt oder verschoben sind, wird das erhaltene Gemisch über eine Leitung 308 einem Analysator 310 zugeführt. In diesem Fall werden die Ns ausreichend von den Mustern der Es und Bs verschoben, daß ein fünfteiliges WBC-Differential aus Ms, Ls, Es, Bs und Ns direkt erhalten wird. Die Funktionen des Analysators 292 können entweder auf den Geräten 56 und 210 oder geringfügigen Variationen davon ausgeführt werden.
Die Scattergrammergebnisse eines Beispiels eines direkten fünfteiligen WBC-Differentials gemäß dem Analysator 292 ist in der Fig. 13 dargestellt. In diesem Beispiel ist die biologische Probe 294 20 Mikroliter einer Vollblutprobe und ist der Reaktant 298 10 Mikroliter nichtmagnetische Mikrokugeln mit den daran gebundenem, N-spezifischen Antikörper, vereinigt mit 100 Mikroliter Puffer und gemischt in der Unterstation 306 während 30 Sekunden. Das bevorzugte RBC-Lysierungsmittel, und zwar 240 Mikroliter davon, wird dem Gemisch zugegeben, welches 6 Sekunden in der Unterstation 304 gemischt wird, wonach das Quenchmittel zugegeben wird. Das Gemisch mit entfernten RBCs und verschobenen Ns wird dann vom Analysator 310 analysiert, was zum Scattergramm von Fig. 13 führt, was eine direkte Zählung von 29,6 Ls, 13,6 Ms, 52,2 Ns, 3,4 Es und 1,06 Bs liefert, verglichen mit einer Mikroskopbestimmung von 35 Ls, 5 Ms, 56 Ns, 4 Es und keine Bs. In diesem besonderen Beispiel wurde die Vollblutprobe auch auf einem Zählgerät für allgemeine Zellen von Coulter Electronics, Inc., analysiert, was 29 Ls, 11,1 Ms und 59,9 Grs (Ns, Es und Bs) ergab.
Viele Modifikationen und Abwandlungen der vorliegenden Erfindung sind im Lichte der obigen Lehren moglich. Die Proben 12, 42, 150, 180 und 294 können Vollblut, menschliche Körperflüssigkeiten, welche Zellen enthalten, oder andere Flüssigkeiten, welche geformte Körper, wie z.B. Bakterien, Viren und Pilze, enthalten, sein. Die Volumina an Mikrokugeln, die angegeben sind, sind in Mikrokugelgewicht pro Volumen Verdünnungsmittel angegeben. Es sollte klar sein, daß innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche die Erfindung auch anders, als spezifisch beschrieben wurde, ausgeführt werden kann.

Claims

1. Verfahren zum Erhalten eines vielteiligen WBC-(weiße Blutzelle)-Populationsdifferentials von einer Vollblutprobe mit mindestens einer roten Blutzellenpopulation und WBC-Populationen darin, welches Verfahren die Schritte umfaßt:

Verschieben des charakteristischen Beitrags der Neutrophilenpopulation zum elektronischen Abtasten hinsichtlich der anderen WBC-Populationen, indem die Probe mit Mikrokugeln vermischt wird, auf welchen ein neutrophilspezifischer, monoklonaler Antikörper gebunden ist; und

elektronisches Abtasten und Zählen mindestens der WBC-Populationen von Monozyten, Lymphozyten, Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen, wobei ein niedrig- und ein hochfrequentes Signal verwendet werden, wodurch mindestens ein fünffteiliges WBC-Differential erhalten wird.

2. Verfahren zum Erhalten eines vielteiligen WBC-(weiße Blutzelle)-Populaüonsdifferentials von einer Vollblutprobe mit mindestens einer roten Blutzellenpopulation und WBC-Populationen darin, welches Verfahren die Schritte umfaßt:

(i) elektronisches Abtasten und Zählen von mindestens der WBC-Populationen von Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten, wobei ein niedrig- und ein hochfrequentes Signal verwendet werden;

(ii) Entfernen oder Verschieben des Neutrophilpopulationsbeitrags von den WBC- Populationen, indem die Probe mit Mikrokugeln, wie in Anspruch 1 definiert, vermischt wird;

(iii) elektronisches Abtasten und Zählen von mindestens der verbleibenden WBC- Populationen von Monozyten, Lymphozyten, Eosinophilen und Basophilen; und

(iv) Vergleichen der zwei Zählungen, um eine Zählung der WBC-Population von Neutrophilen und dadurch mindestens ein fünfteiliges WBC-Differential zu erhalten.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt (i) mit einem ersten Teil der Probe ausgeführt wird, und wobei die Schritte (ii) und (iii) mit einem zweiten Teil der Probe ausgeführt werden.

4. Verfahren zum Analysieren einer WBC-(weiße Blutzelle)-Population in einer Vollblutprobe, welche eine rote Blutzellenpopulation und WBC-Populationen umfaßt, von welchen eine gewählte WBC-Population mindestens zwei Untergruppen besitzt, welches Verfahren die Schritte umfaßt:

Entfernen oder Verschieben von mindestens eines WBC-Populationsuntergruppenbeitrags von der gewählten WBC-Population, indem die Probe mit Mikrokugeln vermischt wird, auf welchen ein monoklonaler Antikörper gebunden ist, der für mindestens eine Untergruppe spezifisch ist; und

elektronisches Abtasten und Analysieren der auf diese Weise subtrahierten Untergruppe und WBC-Population unter Verwendung eines niedrig- und eines hochfrequenten Signals, um mindestens eine charakteristische Eigenschaft der gewählten WBC-Population zu bestimmen.

5. Verfahren zum Bestimmen einer WBC-(weiße Blutzelle)-Population oder einer Populationsuntergruppe in einer Vollblutprobe, weiches Verfahren die Schritte umfaßt:

Verschieben von mindestens eines charakteristischen Beitrags einer WBC-Population oder Untergruppe zum elektronischen Abtasten hinsichtlich einer anderen WBC-Population oder Untergruppenpopulation, indem die Probe mit Mikrokugein vermischt wird, auf welchen ein monoklonaler Antikörper gebunden ist, der für mindestens eine WBC-Population oder Untergruppe spezifisch ist; und

elektronisches Abtasten und direktes Zählen der verschobenen Population, wobei ein nieder- und ein hochfrequentes Signal verwendet werden, um den Beitrag zur Probe der verschobenen Population oder Untergruppe zu erhalten.

6. Verfahren zum Analysieren einer WBC-(weiße Blutzelle)-Population oder Populationsuntergruppe in einer Vollblutprobe, umfassend WBC-Populationen mit mindestens einer WBC- Populationsuntergruppe, welches Verfahren die Schritte umfaßt:

elektronisches Abtasten und Zählen der WBC-Populationen und ihrer Untergruppen, wobei ein nieder- und ein hochfrequentes Signal verwendet werden, um ein erste Zählung zu erhalten;

Entfernen oder Verschieben von mindestens einer der WBC-Populationen oder einer Untergruppe davon, indem die Probe mit Mikrokugeln, wie in Anspruch 5 definiert, vermischt wird;

elektronisches Abtasten und Zählen der verbleibenden und/oder verschobenen WBC- Populationen unter Anwendung eines nieder- und eines hochfrequenten Signals, um eine zweite Zählung zu erhalten; und

Vergleichen der ersten und der zweiten Zählung, um eine oder beide der verbleibenden WBC-Populationen und der entfernten oder verschobenen WBC-Population oder Untergruppenpopulation zu erhalten oder abzuleiten.

7. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, welches den zusätzlichen früheren Schritt einer Entfernung der roten Blutzellenpopulation von der Probe oder ihrer Teile umfaßt, ohne die relevanten Qualitäten und/oder Quantitäten der WBC-Populationen nachteilig zu beeinflussen.

8. Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei nach dem Volumen und der Opazität von Teilen abgetastet und gezählt oder analysiert wird.