DE3855970T2

DE3855970T2 - Verwendung von Amylin oder CGRP zur Behandlung des Diabetes mellitus

Info

Publication number: DE3855970T2
Application number: DE3855970T
Authority: DE
Inventors: Garth James Smith Cooper
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1987-08-26
Filing date: 1988-08-26
Publication date: 1998-01-29
Anticipated expiration: 2008-08-27
Also published as: SG93776A1; NO883828D0; US5124314A; ES2106721T3; JPH0196137A; FI883936A0; DK473888D0; AU2157588A; EP0309100B1; JP2828250B2; EP0309100A3; FI883936A7; GB8720115D0; NO883828L; US5641744A; DE3855970D1; EP0787741A1; EP0309100A2; GR3024705T3; DK473888A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, Fragmente davon und die Herstellung von Zusammensetzungen daraus.
Typ-I-Diabetes mellitus ist eine Erkrankung, die eine große Zahl von Menschen betrifft und aus der Zerstörung von B- Zellen innerhalb der Langerhans-Inseln in dem Pankreas resultiert. Die gegenwärtige Therapie von Typ-I-Diabetes erfolgt durch parenterale Verabreichung von Ersatzgaben von Insulin. Es wird angestrebt, die Diabetes-Bekämpfung so vorzunehmen, daß die Glucose-Konzentrationen des Blutes nahezu auf normal zurückgeführt werden können, um die Langzeitkomplikationen des Diabetes zu vermeiden. Eine solche Therapie ist daher insofern schwer zu überwachen, daß es oftmals nicht leicht ist, die Komplikation durch Hypoglykämie zu vermeiden, die zur Morbidität, zu hypoglykämischem Koma und in weniger häufigen Fällen zu langfristiger Hirnschädigung oder Tod führen kann. Es war seit langem bekannt, daß die Hypoglykämie aus Gründen, die nicht vollständig verstanden werden, eine sehr häufige und beeinträchtigende Nebenwirkung der Insulintherapie ist.
Typ-II-Diabetes mellitus ist etwa um das 8- bis 10- facher häufiger als Typ-I-Diabetes und kann in westlichen Ländern bis zu 4 % der erwachsenen Bevölkerung befallen. Er zeichnet sich aus durch einen (1) Mangel, jedoch nicht durch das absolute Fehlen, der Insulinsekretion, der zur Hyperglykämie führt, sowie normalerweise auch (2) unterschiedliche Resistenzgrade der wirkungen des Insulins. In dieser Form des Diabetes werden im Gegensatz zum Typ I B-Zellen in den Inselzellen in einer normalen oder lediglich geringfügig verringerten Zahl zurückgehalten. Das Inselzellen-Amyloid wird in den meisten Zellen ebenfalls gefunden (Klark A., Cooper G.J.S., et al., Lancet, 2. August 1987).
Die EP-A-0 289 287 mit Prioritätszeitpunkt vom 27. April 1987 und entsprechend verfügbar als Bestandteil das Standes der Technik im Sinne der vorliegenden Patentschrift und unter Artikel 54 (3) sowie 54 (4) EPÜ, beschreibt ein neuartiges Peptid, das identischist oder weitgehend homolog mit der Aminosäuresequenz:
oder einem aktiven Subfragment davon. (Cooper et al., "Purification and Characterization of a Peptide from Amyloid-Rich Pancreases of Type 2 Diabetic Patients", Proc. Natl.Acad. Sci., USA, Bd. 84 (1987)).
Dieses kann alternativ unter Verwendung der klassischen Dreibuchstabensymbole von Aminosäure-Resten folgendermaßen geschrieben werden:
Dieses neuartige Peptid, vorübergehend bezeichnet als "diabetes associated peptide" oder "DAP" und jetzt umbenannt in "Amylin", wurde von den Amyloid-enthaltenden Pankreasen von Menschen mit Typ-II-Diabetes isoliert und charakterisiert. Es wurde festgestellt, daß Amylin gefunden werden kann, das über einen klinischen Nutzen verfügt, wie beispielsweise Aktivität als Appetitzügler und vielleicht auch vasodilatorische Aktivität, die entweder eine allgemeine Aktivität sein könnte oder spezifisch für Pankreas oder Inselzellen-Blutströmung.
Von dem in der primären Struktur dem Amylin ähnlichen tumorassozuerten Peptid ist gesagt worden, daß es teilweise von einem Human-Insulinom sequenziert und der N- terminale Abschnitt eines ähnlichen Peptids unvollständig von dem Pankreas einer Katze mit Diabetes sequenziert wurde (P. Westermark et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, Bd. 84, S. 3881 ... 3885, Juni 1987, Medical Sciences). Dieses Peptid ist als Insulinom oder Inselzellamyloidpolypeptid (IAPP) bezeichnet worden, doch soll wenig Zweifel darüber bestehen, daß die Human- und Katzen-Inselzellamyloide hinsichtlich ihrer chemischen Beschaffenheit im wesentlichen ähnlich sind. Immunhistochemische Methoden unter Verwendung einer Peroxidase-Methode legen nahe, daß IAPP lokal von Inselzell-B-Zellen freigesetzt wird. Obgleich die Rolle des IAPP in der Inselzelle als unbekannt angegeben wird, wird behauptet, daß seine Bewahrung und teilweise Identität mit CGRP mit Nachdruck auf eine bedeutende regulatorische Funktion hinweist.
Amylin enthält 37 Aminosäure-Reste und ist strukturell ähnlich dem "calcitonin gene related peptid" CGRP und hat zu 46 % eine Identität mit Human-CGRP-2. In der folgenden Tabelle wird die primäre Struktur von 1) Amylin mit der von 2) Human-CGRP-2, 3) Human-CGRP-1 und 4) Ratten-CGRP-1 verglichen. Identität von Aminosäure zwischen Peptiden wird in den Kästchen angegeben. Gepunktete Kästchen zeigen Bereiche einer verschobenen Homologie.
Es ist bekannt, daß CGRP signifikante Einflüsse auf Blutdruck und Katecholamin-Konzentrationen im Blut ausübt, wenn es an Ratten verabreicht wird.
In einem Beitrag in "Lancet" van 2. August 1987 berichten A. Clark, G.J.S. Cooper et al., daß Inselzellenamyloid in 22 Versuchsobjekten mit Amyolid-enthaltenden Typ-II-Diabetes Imunitätsreaktionsvermögen mit Antiseren auf CGRP zeigte. Dieses wurde durch Vorabsorption der Antiseren mit Amylin inhibiert, was nahelegt, daß Amylin ein Hauptproteinbestandteil des Inselzellenamyloids ist. Cooper et al. (siehe oben) (1987), bestätigten, daß Amylin eine Hauptkomponente des Inselzellenamyloids ist. Darüberhinaus wurde in Inselzellen sowohl von Versuchsobjekten mit Diabetes als auch von solchen ohne Diabetes CGRP/Amylin-Immunreaktionsvermögen festgestellt, und es zeigen vorläufige Untersuchungen deren Anwesenheit in B-Zellen. (Cooper et al., Lancet, 1987, 2:964). Diese Kennzeichnung legt gemeinsam mit dem Auffinden eines ähnlichen Peptids in Insulinoma nahe, daß Amylin gemeinsam mit Insulin abgeschieden werden kann.
Die vorliegende Erfindung gewährt ein pharmazeutisches Produkt, umfassend:
(a) einen Amylin-Agonisten und
(b) ein Insulin,
als ein kombiniertes Präparat für die separate oder gemeinsame Verwendung zur therapeutischen Behandlung.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Amylin-Agonisten in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Subjekts auf Diabetes mellitus gewährt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Überwachung der Therapie auf Diabetes mellitus oder Hypoglykämie, umfassend die Schritte:
(a) Bestimmen der Menge eines Amylin-Agonisten, die in der Probe eines biologischen Fluids von einem Patienten vorliegt, der sich dieser Therapie unterzieht; und
(b) Bewerten des Bedarfs des Patienten für eine Verabreichung eines Amylin-Agonisten.
- Ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Bewerten des Bedarfs für die Verabreichung eines Amylin- Agonisten in der Behandlung von Diabetes mellitus oder Hypoglykämie, umfassend die Schritte:
(a) Bestimmen der Menge von Amylin in der Probe eines biologischen Fluids von einem Patienten; und
(b) Bewerten des Bedarfs dieses Patienten für eine Verabreichung eines Amylin-Agonisten.
Spezielle Merkmale der Erfindung sind in den Ansprüchen der vorliegenden Patentschrift ausgeführt.
Die vorliegende Erfindung ergibt sich aus dem Gedanken, daß Amylin oder desamidiertes Amylin oder CGRP oder ein funktionelles Peptidfragment von Amylin oder desamidierten Amylin oder CGRP oder eine konservative Variante des Amylins oder desamidierten Amylins oder CGRP oder Fragments in der Behandlung von Diabetes mellitus oder Hypoglykämie von Nutzen sein wird. Dieser Gedanke war unerwartet. Obgleich bekannt war, daß sowohl Amylin als auch CGRP in gewisser Weise mit Diabetes mellitus im Zusammenhang stehen, ist bisher nicht vorgeschlagen worden, daß eines von beiden in der Behandlung der Krankheit verwendbar sein könnte. Die Arbeit, auf der die vorliegende Erfindung beruht, hat sich mit Amylin befaßt. Die Erfindung erstreckt sich auf CGRP auf der Grundlage, daß dieses Peptid eine in der Regel ähnliche Konstitution und Eigenschaften wie Amylin hat und daher erwartet werden kann, daß es die gleiche überraschende therapeutische Wirkung zeigt.
Amylin kann in seiner Carboxy-terminierten Form desamidiertes Amylin sein oder alternativ in seiner carboxyterminal amidierten Form Amylin. Die Struktur der amidierten Form kann folgendermaßen dargestellt werden:
R-NH-(C&sub6;H&sub4;OH)-CONH&sub2;
worin R der Rest des Peptids bis zur Peptid-Bindung des Carboxy-terminalen Tyrosin-Rests ist. Gegenwärtig bekannte Formen von CGRP schließen eine C-terminale Amid-Gruppe ein, die für deren biologische Aktivität signifikant ist.
Unter einem funktionellen Peptidfragment von Amylin oder desamidierten Amylin-CGRP wird ein Peptidfragment einer Länge von mindestens 5 Aminosäure-Resten verstanden, das in vivo eine therapeutische Funktion des vollständigen Amylins oder desamidierten Amylins oder CGRP-Peptids ausführt. Unter einer konservativen Variante wird ein Peptid verstanden, welches weitgehend, wenn auch nicht vollständig, mit Amylin oder desamidierten Amylins oder CGRP oder dem Fragment davon homolog ist, welches jedoch funktionell damit äquivalent ist. (siehe M.O. Dayhoff, "A Model of Evolutionary Change in Proteins" in "Atlas of Protein Sequence and Structure", Bd. 6, Ergänzung 3, National Biomedical Research Foundation, 1978, S.345... 352).
Nach einem bevorzugten Aspekt der Erfindung umfaßt eine Zusammensetzung zur Verwendung in der Behandlung von Diabetes mellitus oder Hypoglykämie: (a) Insulin und (b) Amylin oder desamidiertes Amylin oder CGRP oder ein funktionelles Peptidfragment von Amylin oder desamidiertem Amylin oder CGRP oder eine konservative Variante des Amylins oder desamidierten Amylins oder CGRP oder Fragments. Der hierin verwendete Begriff "Insulin" soll Insulin natürlicher Herkunft und synthetischer Herkunft aber auch funktionelle Peptidfragmente von Insulin und konservative Varianten von Insulin oder Fragmenten davon abdecken, wie sie beispielsweise bei der konventionellen Behandlung von Diabetes mellitus verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Produkte lassen sich ohne weiteres in Form von Lösungen bereitstellen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind. In vielen Fällen wird es bequem sein, Insulin und Amylin oder desamidiertes Amylin oder CGRP (oder Fragmente oder Varianten) in einer einzelnen Lösung zur gemeinsamen Verabreichung bereitzustellen. In anderen Fällen kann es vorteilhafter sein, Insulin und Amylin oder desamidiertes Amylin oder CGRP (oder Fragmente oder Varianten) separat zu verabreichen. Eine geeignete Verabreichungsform läßt sich am besten individuell vom Arzt des jeweiligen Patienten festlegen. Im allgemeinen wird es zu bevorzugen sein, das Rezept so aufzubauen, daß das Molverhältnis von Insulin zu Amylin oder desamidierten Amylin oder CGRP (oder Fragmente oder Varianten davon) bei Verwendung zur Behandlung 100:1 ... 0,1:1 beträgt. Eine vorläufige Untersuchung hat gezeigt, daß wie bei Insulin-Immunreaktionsvermögen, Amylin-Immunreaktionsvermögen und somit Amylin bei den Langerhans-Inseln in Typ-I-Diabetes fehlt. Es wurde daher vorgeschlagen, daß Typ-I-Diabetessyndrom aus einem Mangel an nicht einem (d.h. Insulin nach früherer Meinung), sondern zwei (Insulin und Amylin oder desamidiertes Amylin oder CGRP) Hormonen resultiert. Wie bereits ausgeführt, ist das Hauptproblem bei der Insulin-Behandlung von Diabetes die
- Hypoglykämie. Es ist wahrscheinlich, daß die gemeinsame Verabreichung von Insulin und Amylin oder desamidiertem Amylin oder CGRP diese Nebenwirkung verhindern kann. Dieses kann die folgenden Möglichkeiten bieten:
- Genauere Diabetes-Kontrolle mit vermindertem Risiko von Hypoglykämie. Dieses gilt für die Behandlung von Typ-I- Diabetes mellitus und auch für Typ-II-Diabetes mellitus (in der Phase des Versagens der sekundären Inselzellen).
- Die Verwendung von Amylin oder desamidierten Amylin oder CGRP für die Therapie von rekurrierender Hypoglykämie, die die Insulintherapie von Typ-I-Diabetes mellitus (oder Typ-II-Diabetes mellitus) kompliziert.
- Die Therapie von labilem Diabetes (Typ-I-Diabetes mellitus mit erhöhtem Risiko von Hypoglykämie).
- Die Therapie der nichtbehandelbaren Hypoglykämie, die den Verlauf der Erkrankung komplizieren kann, die durch Insulin-sekretierende Tumore erzeugt wird, wie beispielsweise Insulinoma.
Obgleich sich die vorliegende Erfindung mit Ergebnissen und nicht mit Theorien befaßt, könnte die folgende Erklärung des möglichen Wirkungsmodus von Amylin (oder CGRP) von Interesse sein.
1. Amylin oder desamidiertes Amylin wird in der Langerhans-Zellen zumeist in den B-Zellen produziert, d.h. die selben Zellen, die das Insulin erzeugen. Typ-I-Diabetes ist die Folge der Zerstörung von B-Zellen in den Langerhans Zellen. Da diese Zellen Amylin oder desamidiertes Amylin enthalten, ist es sehr wahrscheinlich, daß Typ-I-Diabetes im Zusammenhang mit einem Mangel an Amylin oder desamidierten Amylin sowie Insulin steht. Zweifellos ist kein Amylin oder desamidiertes Amylin in den Langerhans-Zellen in dieser Erkrankung zu finden.
2. Amylin und CGRP haben gezeigt, daß sie die Geschwindigkeit der Glucose-induzierten Insulinsekretion von Insel- B-Zellen in einer Reihe von Modellsystemen modulieren. (Ahren B., Martensson H., Nobin A.: "Effects of calcitonin generated peptide (CGRP) on islet hormone secretion in the pig.); Diabetologia, 1987, 30: 354...359; Pettersson M., Ahren B., Böttcher G., Sundler M.: "Calcitonin Gene-Related Peptide: Occurrence in Pancreatic Islets in the Mouse and the Rat and Inhibition of Insulin Secretion in the Mouse"; Endocrinology 1986: 110: 865...869).
3. In insolierten Soleus-Muskeln reduziert Amylin die Geschwindigkeit der Glykogen-Synthese sowohl in den Basalals auch in den Insulin-stimulierten Moden (siehe nachfolgendes Beispiel).
Wenn man 2. und 3. zusammennimmt, übt Amylin (oder CGRP) einen starken modulierenden Einfluß auf die Insulin-induzierte Speicherung von Glucose als Glykogen aus. Da dieses ohne weiteres der Mechanismus sein kann, durch den bei Typ- II-Diabetes Insulinresistenz hervorgerufen wird, kann es auch gut sein, daß Hypersekretion von Amylin oder desamidierten Amylin (oder CGRP) ein Faktor in der Genese der Insulinresistenz ist, die bei dieser Erkrankung in Erscheinung tritt.
Die Wirkungsmechanismen von Amylin (oder CGRP), wie vorstehend erkennbar, modulieren und reduzieren die hypoglykämischen Wirkungen von Insulin, indem sie sowohl die Insulinfreisetzung in bezug auf einen vorgegebenen Glucosestimulus reduzieren, als auch (was im Fall von Typ-I-Diabetes wichtiger ist) indem sie den Anteil der Speicherung von Glucose als Glykogen reduzieren. Somit kann Amylin (oder CGRP) "Insulinresistenz" induzieren und die hypoglykämischen Wirkungen von Insulin dämmen.
Die Wirksamkeit eines Amylin-Präparats bei der Behandlung von Diabetes mellitus hängt von der Fähigkeit des Amylins ab, Zugang zum Kreislauf zu erhalten. In dieser Hinsicht werden Amylin-Präparate benötigt, die löslich sind. Es wurde demonstriert, daß bestimmte Prozesse zur Anwendung gelangen können, um Amylin zu solubilisieren, wenn es in Amyloidmassen vorliegt, wobei diese Methoden auch beim Solubilisieren von Amylin aus anderen Quellen anwendbar sind, siehe Cooper et al., "Proc. Natl. Acad. Sci., 84:8628...8632, (1987). Diese umfassen: (1) Auflösung von Amylin in Guanidinium- Lösungen, speziell Guanidinium-hydrochlorid, pH 7,5, gepuffert in 0,2 molarem Natriummonohydrogenphosphat/Natriumdihydrogenphosphat; (2) Auflösung von Amylin in Trifluoressigsäurelacetonitril-Lösungen, speziell 1,0 % Trifluoressigsäure/67 % Acetonitril; (3) Auflösung von Amylin in Ameisensäure- Lösung, speziell 70 % Ameisensäure; sowie (4) die Anwendung von Ultraschall zum Auflösen von Amylin.
Experimentelle Arbeiten zeigen ebenfalls, daß eine Lyophilisierung Amylin löslicher machen kann, was möglicherweise durch Veränderung seines physikalischen Zustandes erfolgt.
Ein Vergleich der Aktivität von Amylin, das durch chemische Synthese dargestellt wurde, mit dem von natürlichen Quellen zeigt, daß die Aktivität von Amylin aus diesen unterschiedlichen Quellen quantitativ unterschiedlich sein kann. Es ist wahrscheinlich, daß eine etwaige Differenz in der Aktivität durch einen Mangel während der chemischen Synthese hervorgerufen wird, das Molekül in der natürlichen Konformation vollständig wieder herzustellen, wie es für die vollständige biologische Aktivität erforderlich ist. Es wird angenommen, daß dieses zum Teil durch ein Versagen zum vollständigen Wiederherstellen der Disulfid-Bindung in dem auf chemischen Wege synthetisch dargestellten Material hervorgerufen wird. Daher ist es nützlich zu beachten, daß die Aktivität von Amylin aus unterschiedlichen Quellen, d.h. aus dem natürlichen Zustand extrahiertes und auf chemischen Wege synthetisch dargestelltes, zum Teil aufgrund des unterschiedlichen Grades der Wiederherstellung der natürlichen sekundären und tertiären Struktur des Moleküls verschieden sein kann.
Die Wiederherstellung des Moleküls in verdünnter wäßriger Lösung bei pH 8 erzeugte ein gewisses Maß an biologischer Aktivität. Angesichts der geringen Löslichkeit des synthetischen Materials in Lösung bei pH 8 in Wasser kann jedoch eine verbesserte Wiederherstellung des synthetischen Amylins durch rückfaltendes Material erhalten werden, das aus den Syntheseverfahren resultiert, und zwar in wäßriger, denaturierender Lösung, z.B. Guanidinium- oder Harnstoff-Lösungen, speziell 6,0 molar Guanidiniumchlorid oder 8,0 molar Harnstoff bei vorgegebenem pH-Wert, speziell bei einem mäßigen alkalischen pH-Wert zwischen etwa 7,5 und etwa 9,0. Alternativ kann eine Lösung für die aufeinanderfolgende Wiederherstellung in einem nichtwäßrigen, denaturierenden Lösemittel wirksam sein, wie beispielsweise Dimethylformamid. Unter diesen Umständen wird erwartet, daß die Wiederherstellung der Disulfid-Bindung durch mäßige Oxidation, wie sie beispielsweise durch Lösungen von Kaliumhexacyanoferrat(III) oder Exponierung an atmosphärischen Sauerstoff erzeugt wird, eine optimale Wiederherstellung der Disulfid- Bindung bewirkt.
Für die therapeutische Anwendung ist es nützlich, über Amylin-Präparate unterschiedlicher Wirkungsdauer zu verfügen, wie sie beispielsweise bei Insulin verwendet werden (siehe Larner, J.: "Insulin and Oral Hypoglycaemic Drugs: Glucagon"; (In Gilman, et al., Herausg. The Pharmacologic Basis of Therapeutics, 7. Ausg., Maamillan, 1985, S. 1501...02)). Für therapeutische Amylin- Präparate sind in dieser Hinsicht Methoden einzusetzen, wie sie ähnlich bei Insulin angewendet werden. Alle diese Präparate können entweder allein oder in Verbindung mit geeigneten Kombinationen von Insulin für die Behandlung von Diabetes mellitus, Hypoglykämie und andere Erkrankungen verwendet werden. Diese Behandlungsverfahren und Präparate schließen ein: (1) Reaktion von Amylin mit Zink und Protamin nach der Methode von Hagedorn, et al., "Protamine Insulinate", JAMA 106:177...180, (1936), zur Erzeugung eines Amylin-Präparats, wobei das Einsetzen und die Dauer der Wirkung davon im Vergleich zu dem nichtkomplexierten Amylin verzögert ist; (2) eine Suspension von Protamin-Amylin, hergestellt wie vorstehend in einem geeigneten wäßrigen Puffer für die parenterale Verabreichung; (3) kristallines Amylin, hergestellt durch Kristallisation von Amylin in Gegenwart eines Zinksalzes, speziell Zinkchlorid in einem geeigneten Puffermedium und speziell einem solchem mit neutralem pH-Wert (Larner, siehe oben); (4) eine Suspension von kristallinem Zinkamylin in einem geeigneten wäßrigen Puffer, hergestellt wie vorstehend und geeignet für die parenterale Verabreichung; (5) eine modifizierte Prptamin- Zink-Suspension von Amylin, d.h. kristallin, wo die Konzentrationen von Amylin, Zink und Protamin so gewählt werden können, daß das Einsetzen und die Dauer der Wirkung zwischen denen der löslichen und Protamin-Formen von Amylin liegt; (6) das Material von (5) wie vorstehend zubereitet in einem geeigneten wäßrigen Puffer, verwendbar für die parenterale Verabreichung; (7) ein Präparat aus kristallinem Zinkamylin, resuspendiert in einer Lösung von Natriumchlorid/Natriumacetat, pH 7,2 ... 7,5 und geeignet für die parenterale Verabreichung; (8) amorphes Insulin, ausgefällt bei hohem pH-Wert und geeignet für die parenterale Verabreichung; sowie (9) eine Mischung von kristallinem und amorphem Amylin, geeignet für die parenterale Verabreichung. Jedes dieser Präparate ist für die parenterale Verabreichung auf subkutanem Weg geeignet.
Die Stabilität von Amylin-Präparaten kann bei neutralem pH-Wert erhöht werden. Neutrale Amylin-Präparate können mit anderen neutralen Amylin-Präparaten oder mit entsprechenden Präparaten von Insulin gemischt werden und ergeben eine erhöhte klinische Nutzbarkeit (siehe Larner wie oben).
Um Amylin aus den zahlreichen unterschiedlichen Quellen bis zu einem Grad zu reinigen, der für die Humantherapie verwendbar ist, wurden zahlreiche Methoden verwendet. Es ist nachgewiesen worden, daß Amylin aus den Pankreas-Organen des Menschen in einem hochreinen Zustand durch eine Kombination von Aufkonzentration unter Verwendung einer Zentrifuge, der Gelfiltrationschromatographie und der Umkehrphasenchromatographie, speziell HPLC, isoliert werden kann. Bei einer Reinigung von Amylin, beispielsweise in einem größeren Umfang, können andere Formen der Chromatographie als die HPLC verwendbar und geeignet sein, wie beispielsweise "Schnelle-Protein-Flüssigkeitschromatographie" (FPLC). Die Verwendung anderer Formen der Chromatographie ist ebenfalls möglich, wie beispielsweise die Ionenaustauschchromatographie, Molekularsiebchromatographie oder Aussalzungschromatographie.
Die Therapie des Typ-I-Diabetes mellitus mit Transplantaten von Inselzellengewebe oder ganzen Pankreas-Geweben oder mit Inselzellen-Implantaten kann zu bedeutenden Behandlungen werden. Da einige der therapeutischen Wirkungen dieser Therapie aus der Wiederherstellung der Fähigkeit zur Erzeugung und Sekretion von Amylin resultieren, wird die Beobachtung der Amylin-Konzentrationen erforderlich sein, um den Ablauf dieser Therapie zu verfolgen. In ähnlicher Weise kann es erforderlich sein, die Amylin-Konzentrationen im Blut, Serum oder Plasma zur Bewertung der Behandlung der Hypoglykämie, des Typ-I-Diabetes mellitus und verschiedener Amylin-Mangel zustände zu überwachen.

Beispiel

Dieser Versuch wurde ausgeführt, um vorstehend (3) zu demonstrieren, daß Amylin die Geschwindigkeit der Glykogensynthese sowohl in basalen als auch in Insulin-stimulierten Moden reduziert.
Nach einem Hungemlassen über Nacht wurden Ratten getötet und ihr Soleus-Muskel extrahiert und in einem Puffer bei einem physiologischen pH-Wert inkubiert. Es wurden ¹&sup4;C- markierte Glucose und kalte (nichtmarkierte) Glucose zugesetzt und die Rate des Einbaus von Glucose in Glykogen durch Extraktion von Glykogen und Zählen der Intervalle bis zu 6 Stunden gemessen. Die Versuche wurden in Gegenwart von 1, 10, 100 und 1.000 Mikroeinheiten Insulin pro Milliliter ausgeführt. Die Hälfte der Versuche wurde in Gegenwart von 120 Nanomol pro Liter Amylin ausgeführt.
Die Ergebnisse sind in der beigefügten Figur 1 ausgeführt, die eine graphische Darstellung der Geschwindigkeit der Glykogensynthese in Abhängigkeit von der Insulin- Konzentration ist. Die offenen Kreise stellen die Versuchsergebnisse dar, die bei Abwesenheit bei Amylin erhalten wurden; die vollen Kreise stellen die Versuchsergebnisse dar, die in Gegenwart von 15 Mikromol pro Liter Amylin erhalten wurden. Jeder Punkt bei 1 und 100 Mikroeinheiten pro Milliliter Insulin ist der Mittelwert von 11 wiederholten Versuchen, wobei jeder Punkt bei 10 und 1.000 Mikroeinheiten pro Milliliter Insulin der Mittelwert von 5 wiederholten Versuchen ist.
Bei allen physidlogischen Konzentrationen von Insulin (von 1 bis 100 Mikroeinheiten pro ml) wird die Glykogensynthese in Gegenwart von Amylin verlangsamt. Die Unterschiede sind statistisch signifikant (nach dem "Mann Whitney-U-Test" ist p kleiner als 0,05 bei 1 bzw. 100 Mikroeinheiten pro ml).
Es kann festgestellt werden, daß die Inhibition der Glykogensynthese durch Amylin bei geringen Insulin-Konzentrationen und wahrscheinlich sogar bei einer Insulin- Konzentration von Null fortbesteht. Es hat den Anschein, daß Amylin über seinen eigenen Wirkungsmechanismus verfügt, der im Widerspruch zu dem von Insulin steht, wahrscheinlich jedoch nicht durch direkten Antagonismus vermittelt wird. Bestätigend wurde festgestellt, daß Amylin nicht in der Lage ist, Insulin von seinem Rezeptor an roten Blutkörperchen signifikant zu verdrängen.

Claims

1. Pharmazeutisches Produkt, umfassend:

(a) einen Amylin-Agonisten und

(b) ein Insulin,

als ein kombiniertes Präparat für die separate oder gemeinsame Verrendung zur therapeutischen Behandlung.

2. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 1, zur Verwendung in der Behandlung von Diabetes mellitus oder Hypoglykämie dient.

3. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der Amylin-Agonist Amylin ist.

4. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der Amylin-Agonist CGRP ist.

5. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der Amylin-Agonist ein funktionelles Peptidfragment von Amylin ist.

6. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der Amylin-Agonist ein funktionelles Peptidfragment von CGRP ist.

7. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der Amylin-Agonist eine konservative Variante von Amylin ist.

8. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der Amylin-Agonist eine konservative Variante von CGRP ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der Amylin- Agonist eine konservative Variante eines funktionellen Peptidfragments nach Anspruch 4 oder Anspruch 5 ist.

10. Pharmazeutisches Produkt nach einem der vorgenannte Ansprüche, bei welchem das Insulin funktionelles Peptidfragment von Insulin ist.

11. Pharmazeutisches Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei welchem das Insulin eine konservative Variante von Insulin oder ein funktionelles Peptidfragment von Insulin ist.

12. Pharmazeutisches Produkt nach einem der vorgenannte Ansprüche, bei welchem der Amylin-Agonist lyophilisiert ist.

13. Pharmazeutisches Produkt nach einem der vorgenannte Ansprüche, bei welchem der Amylin-Agonist in einem für die Verabreichung mit verzögerter Freisetzung geeigneten Konstituens bereitgestellt wird.

14. Pharmazeutisches Produkt nach einem der vorgenannte Ansprüche, bei welchem das Produkt für die parenterale Verabreichung geeignet ist.

15. Pharmazeutisches Produkt nach einem der vorgenannte Ansprüche, umfassend eine Suspension des Amylin-Agonisten.

16. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 15, bei welchem die Suspension mit einem Zinksalz in einem pharmazeutisch zulässigen Puffer zubereitet wird.

17. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 16, bei welchem das Zinksalz Zinkchlorid ist.

18. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 16 oder 17, umfassend eine Resuspension eines kristallisierten Präparates aus dem Amylin-Agonisten und ein Zinksalz, wobei das Resuspendieren in einer Lösung von Natriumacetat/Natriumchlorid ausgeführt wird.

19. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 18, bei welchem die Lösung einen pH-Wert von 7,2 ... 7, 5 hat.

20. Pharmazeutisches Produkt nach einem der vorgenannte Ansprüche, bei welchem der Amylin-Agonist ein Human-Amylin- Agonist ist.

21. Pharmazeutisches Produkt nach einem der vorgenannte Ansprüche, bei welchem das Molverhältnis des Insulins zu dem Amylin-Agonisten 100:1 ... 0,1:1 beträgt.

22. Verwendung eines Amylin-Agonisten in einem Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Patienten auf Diabetes mellitus.

23. Verwendung eines Amylin-Agonisten in einem Verfahren für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Patienten auf Hypoglykämie.

24. Verwendung nach Anspruch 22 oder 23, wobei in der Herstellung des Arzneimittels ein Insulin verwendet wird.

25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Insulin für die parenterale Verabreichung zubereitet wird.

26. Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Insulin für die Verabreichung mit verzögerter Freisetzung zubereitet wird.

27. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei das Insulin und der Amylin-Agonist für die Verwendung in der Behandlung von Diabetes mellitus oder Hypoglykämie separat zubereitet werden.

28. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei der Amylin-Agonist Amylin ist.

29. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei der Amylin-Agonist CGRP ist.

30. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei der Amylin-Agonist ein funktionelles Peptidfragment von Amylin ist.

31. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei der Amylin-Agonist ein funktionelles Peptidfragment von CGRP ist.

32. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei der Amylin-Agonist eine konservative Variante von Amylin ist.

33. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei der Amylin-Agonist eine konservative Variante von CGRP ist.

34. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei der Amylin-Agonist eine konservative Variante eines funktionelles Peptidfragment von Amylin oder CGRP ist.

35. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 34, wobei der Amylin-Agonist für die parenterale Verabreichung zubereitet wird.

36. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 35, wobei der Amylin-Agonist für die Verabreichung mit verzögerter Freisetzung zubereitet wird.

37. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 36, wobei Molverhältnis des Insulins zu dem Amylin-Agonisten 100:1 0,1:1 beträgt.

38. Verfahren zur Überwachung der Therapie von Diabetes mellitus oder Hypoglykämie, umfassend die Schritte:

(a) Bestimmen der Menge eines Amylin-Agonisten, die in der Probe eines biologischen Fluids von einem Patienten vorliegt, der sich dieser Therapie unterzieht; und

(b) Bewerten des Bedarfs des Patienten für eine Verabreichung eines Amylin-Agonisten.

39. Verfahren zum Evaluieren der Notwendigkeit zur Verabreichung eines Amylin-Agonisten in der Behandlung von Diabetes mellitus oder Hypoglykämie, umfassend die Schritte:

(a) Bestimmen der Menge von Amylin in der Probe eines biologischen Fluids von einem Patienten; und (b) Bewerten des Bedarfs dieses Patienten für eine Verabreichung eines Amylin-Agonisten.

40. Verfahren nach Anspruch 38, ferner umfassend den Schritt der Bewertung des Bedarfs dieses Patienten für eine Verabreichung von Insulin.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 bis 40, bei welchem der Amylin-Agonist Amylin umfaßt.

42. Verfahren nach Anspruch 41, bei welchem das Amylin Human-Amylin umfaßt.

43. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 44, bei welchem die Probe des biologischen Fluids ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Blut, Serum und Plasma.