DE3921702A1 - Farbstoffharze, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als adsorbentien fuer die affinitaetschromatographie - Google Patents

Farbstoffharze, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als adsorbentien fuer die affinitaetschromatographie

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Description

Die Erfindung betrifft neue Farbstoffharze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Adsorbentien für die Affinitätschromatographie.
Unter Farbstoffharzen werden auf dem Gebiet der Affinitätschromatographie Kondensationsprodukte aus natürlichen oder synthetischen hochmolekularen Verbindungen (Harzen) und Reaktivfarbstoffen verstanden. Diese Farbstoffharze haben in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung als Adsorbentien für die Affinitätschromatographie erlangt, z. B. für die Auftrennung von Protein-Gemischen in die verschiedenen Proteine oder die Isolierung einzelner Proteine aus Proteingemischen (siehe z. B. Laborpraxis, Nov. 1983, S. 1106 ff).
Die Harze dienen als feste Träger für die als Liganden wirkenden Farbstoffmoleküle. Als feste Träger wurden bislang für die Farbstoffharze vorgeschlagen: Dextrane [siehe J. Chromatogr. 69, 209 (1972) ], ferner Agarose, Sepharose, Polyacrylamide und Aminogruppen aufweisende Ionenaustauscher auf Acrylharz-Basis (siehe DE-OS 24 43 119) und auf Basis von Polystyrol (siehe DE-OS 26 19 451 und 26 19 521).
Die unter Verwendung der hochmolekularen Verbindungen auf Basis von Cellulose-Derivaten wie Dextranen, Agarose oder Sepharose oder aber vernetzten Polyacrylamidgelen hergestellten Farbstoffharze haben den Nachteil zu geringer chemischer, thermischer und mechanischer Stabilität (siehe z. B. die Angaben in Protides of Biological Fluids, 27th Colloquium 1979, Pergamon Press, Oxford and New York, 1979, Seite 809). Die Stabilität dieser Harze reicht für eine Verwendung im Labormaßstab, z. B. in Forschung und Analytik, aus. Für Trennungen im technischen Maßstab, wo von den Harzen in den Trennkolonnen Standzeiten von mehreren Jahren verlangt werden und wo die Harze mehrere hundert Regenerationen aushalten müssen, kommen diese Farbstoffharze nicht in Betracht.
Die in der DE-OS 24 43 119 genannten Farbstoffharze, die als feste Träger Aminogruppen aufweisende Anionenaustauscher auf Acrylharz-Basis enthalten, weisen zwar eine verbesserte chemische und mechanische Stabilität auf. Nachteilig an diesen durch Umsetzung von Reaktivfarbstoffen mit handelsüblichen Anionenaustauschern auf Polyacrylharz-Basis erhaltenen Farbstoffharzen ist jedoch, daß ihre Spezifität, zumindest für bestimmte Trennungen, nur gering ist.
In den DE-OS 26 19 451 und 26 19 521 werden außer Agarose, quervernetztem Dextran, Zellulose und Polyacrylamid aminomethylierte Styrole als polymere Träger für Farbstoffharze vorgeschlagen, z. B. die makroporösen Harze NKZ 2 und NKZ 4, der schwachbasische gelförmige Anionenaustauscher Amberlite IR 45 und der starkbasische makroporöse Anionenaustauscher Lewatit MP 600. Bei diesen Styrolharzen handelt es sich um relativ schwach, mit etwa 5 bis 8 Gew.-% Divinylbenzol vernetzte Anionenaustauscher. Außerdem verleiht die Styrol-Divinylbenzol- Matrix den Farbstoffharzen einen ausgeprägt hydrophoben Charakter. Auch diese, sich von aminomethylierten vernetzten Polystyrolen ableitenden Farbstoffharze haben den Nachteil, daß sie für viele Trennungen eine unzureichende Spezifität aufweisen.
Es wurde nun gefunden, daß man Farbstoffharze hoher chemischer thermischer und mechanischer Stabilität und mit wesentlich verbesserten Trenneigenschaften erhält, wenn man als feste Träger für die Reaktivfarbstoffe statt der üblichen aminogruppenhaltigen Anionenaustauscher auf Acrylharz-Basis makroporöse Perlpolymerisate von gegebenenfalls Epoxy-, OH- und/oder basische -NH-Gruppen aufweisenden Poly-(meth-)acrylsäureestern oder OH- oder basische -NH-Gruppen aufweisenden Poly-(meth-)acrylamiden verwendet.
Die Spezifität der Farbstoffharze wird zwar in hohem Maße von den als Liganden verwendeten Reaktivfarbstoffen bestimmt. Es wurde jedoch gefunden, daß diese durch den Farbstoff-Liganden bestimmte Spezifität erheblich durch die Struktur beeinflußt wird.
Es wurde gefunden, daß die Spezifität der Farbstoffharze merklich erhöht wird, wenn der Farbstoff an eine makroporöse Matrix aus vernetzten perlpolymerisierten Poly- (meth-)acrylsäureestern oder Poly-(meth-)acrylamiden gebunden ist. Diese makroporösen Farbstoffharze zeichnen sich gegenüber den bekannten Farbstoffharzen mit festen Trägern auf Acrylharz- oder Polystyrolharz-Basis durch eine wesentlich verbesserte Trennleistung aus. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen, eine makroporöse Polyacrylharz- Matrix aufweisenden Farbstoffharzen lassen sich noch Gemische von Aminosäuren in einzelne Aminosäuren zerlegen, die mit bekannten Farbstoffharzen nicht mehr trennbar sind.
Die Erfindung betrifft daher Farbstoffharze auf Basis von Kondensationsprodukten von Reaktivfarbstoffen mit festen Trägern auf Acrylharzbasis; die Farbstoffharze sind dadurch gekennzeichnet, daß sie Kondensationsprodukte von Reaktivfarbstoffen mit makroporösen Perlpolymerisaten von gegebenenfalls Epoxy-, OH- und/oder basische -NH-Gruppen aufweisenden Poly-(meth-)acrylsäureestern oder OH- oder basische -NH-Gruppen aufweisenden Poly-(meth-)acrylamiden sind.
Bei der Kondensation der Reaktivfarbstoffe mit den makroporösen Perlpolymerisaten von Epoxy-, OH- und/oder basische -NH-Gruppen aufweisenden Poly-(meth-)acrylsäureestern oder OH- oder basische -NH-Gruppen aufweisenden Poly-(meth-)acrylamiden reagieren die Abgangsgruppen der Reaktivfarbstoffe mit den Epoxiden, OH-, den basischen -NH- und überraschenderweise bei Poly-(meth-) acrylsäurealkylestern, die weder eine OH- noch eine basische -NH-Gruppe aufweisen, auch mit den Alkylester- Gruppen der Perlpolymerisate unter Abspaltung der Abgangsgruppe des Reaktivfarbstoffes und der Ausbildung einer covalenten Bindung zwischen Harz und Reaktivfarbstoff- Rest (Reaktivfarbstoff-Rest=der nach Abspaltung der Abgangsgruppe verbleibende Rest des Reaktivfarbstoffmoleküls, nämlich Chromophor+elektrophile Gruppe).
Die erfindungsgemäßen Farbstoffharze kann man daher auch als makroporöse, durch Reste von Reaktivfarbstoffen substituierte, perlpolymerisierte, gegebenenfalls Epoxy-, OH- und/oder basische -NH-Gruppen aufweisende Poly- (meth-)acrylsäureester oder OH- oder basische -NH-Gruppen aufweisende Poly-(meth-)acrylamide beschreiben. Die basischen -NH-Gruppen können primäre oder sekundäre Aminogruppen sein.
Die erfindungsgemäß als feste Träger für die Reaktionsfarbstoffe zu verwendenden makroporösen Poly-(meth-) acrylamid-Matrices könen gegebenenfalls zusätzlich zu Epoxy-, OH- und/oder basischen -NH-Gruppen noch Carboxylgruppen aufweisen. Diese Carboxylgruppen entstehen bei der Aminolyse der Poly-(meth-)acrylsäureester und -nitrile. Der Gehalt an Carboxylgruppen ist gering und beträgt allgemein nur etwa 0,2 Mol pro Liter Harz.
Die für die besondere Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Farbstoffharze geltend gemachte Makroporosität der Poly- (meth-)acryl-Harze wird dadurch erzeugt, daß man die für die Herstellung der gegebenenfalls Epoxy-, OH- und/oder basische -NH-Gruppen aufweisenden Poly-(meth-)acrylamide erforderlichen monomeren (Meth-)Acrylsäureester oder (Meth-)Acrylnitrile mit 10 bis 88 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 bis 35 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren, einer Polyvinylverbindung in Gegenwart von 30 bis 180 Gew.-%, vorzugsweise 30 bis 150 Gew.-%, besonders bevorzugt 40 bis 120 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren eines Porösmachers, perlpolymerisiert.
Durch die Verwendung der relativ großen Menge Polyvinylverbindung, für die Herstellung der handelsüblichen Anionenaustauscher auf Acrylharz-Basis werden die Polyvinylverbindungen nur in Mengen unter 10 Gew.-% eingesetzt, in Kombination mit den angegebenen Mengen an Porösmachern erhalten die erfindungsgemäß zu verwendenden Perlpolymerisate eine innere Struktur, die ihre besondere Eignung als feste Träger für Farbstoffharze bedingt.
Der Gehalt der erfindungsgemäßen Farbstoffharze an Reaktivfarbstoff beträgt mindestens 0,000001 Mol, vorzugsweise 0,000015 bis 0,15 Mol, besonders bevorzugt 0,00001 bis 0,12 Mol Reaktivfarbstoff je 100 g Farbstoffharz.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Farbstoffharze. Die erfindungsgemäßen Farbstoffharze werden hergestellt, indem man das den Farbstoffharzen zugrundeliegende makroporöse Perlpolymerisat mit der wäßrigen Lösung des gewünschten Reaktivfarbstoffes bei erhöhter Temperatur, z. B. bei Temperaturen von 35 bis 100°C, vorzugsweise 45 bis 80°C, behandelt und dabei in der Farbstofflösung durch Zugabe von Basen, z. B. Alkalihydroxiden oder -carbonaten, einen pH-Wert <7, vorzugsweise einen pH-Wert von 8 bis 12, besonders bevorzugt einen pH-Wert von 9 bis 11, einstellt.
Das makroporöse Perlpolymerisat wird dabei mit einem Überschuß an Farbstoff, bezogen auf die Farbstoffmenge (in Mol), die je Mol (Meth-)Acryl-(Ester oder Amid)- Einheit aufziehen sollen, behandelt.
Das Verhältnis Menge makroporöses Poly-(meth-)acryl-Harz (in Litern) zur Menge an Farbstoff-Lösung (in Litern) sollte, damit sich die Suspension des makroporösen Perlpolymerisats in der Farbstoff-Lösung gut rühren läßt, mindestens 1 : 1, vorzugsweise 1 : 2 bis 1 : 6, betragen.
Die Konzentration des Reaktivfarbstoffes in der Farbstoff- Lösung beträgt vorteilhaft 0,1 bis 300 g/l, vorzugsweise 1 bis 250 g/l, besonders bevorzugt 5 bis 200 g/l. Die vom Harz gebundene Menge an Reaktivfarbstoff wird durch Elementaranalyse bestimmt, z. B. bei Verwendung SO₃H-Gruppen-haltiger Reaktivfarbstoffe durch Bestimmung des Schwefelgehaltes des Harzes.
Die in den erfindungsgemäßen Farbstoffharzen als feste Träger verwendeten makroporösen Perlpolymerisate von gegebenenfalls Epoxy, OH- und/oder basische -NH-Gruppen aufweisenden Poly-(meth-)acrylsäureestern oder OH- oder basische -NH-Gruppen aufweisenden Poly-(meth-)acrylamiden sind wie folgt erhältlich:
Zunächst wird durch radikalische Copolymerisation von (Meth-)Acrylsäureestern, z. B. (Meth-)Acrylsäurealkylestern, wie (Meth-)Acrylsäure-methyl-, -ethyl-, -n- propyl-, -sec.-butyl-, -n-hexyl- oder -glycidylester oder von (Meth-)Acrylnitril mit den angegebenen Mengen an Polyolefinen in Gegenwart der ebenfalls angegebenen Mengen Porösmacher ein Perlpolymerisat mit der gewünschten makroporösen Struktur hergestellt. Diese Copolymerisation wird in an sich bekannter Weise ausgeführt, indem man die den Suspensionsstabilisator enthaltende wäßrige Phase vorlegt und unter Rühren bei Raumtemperatur die organische Phase, bestehend aus Monovinylverbindung, Polyvinylverbindung, Porösmacher und Radikalbildner, zusetzt [siehe z. B. Seide, Malinsky, Dusetz, Heitz in "Advances of Polymer Sciences, Vol. 5, Seiten 113 ff. (1963) ]. Das Polymerisationsgemisch wird 1 Stunde bei Raumtempertur gerührt, dann auf 60°C erwärmt, mehrere Stunden (etwa 10 bis 15 Stunden) bei dieser Temperatur gerührt, auf 80°C erwärmt und noch einmal einige Stunden (5 bis 6 Stunden) auch bei dieser Temperatur gerührt. Die bei der Polymerisation entstandene Suspension wird auf Raumtempratur abgekühlt und der Perlpolymerisat mechanisch abgetrennt und gründlich mit Wasser gewaschen.
Die so erhaltenen makroporösen Poly-(meth-)acrylsäureester- Perlpolymerisate können gegebenenfalls durch Hydrolyse oder Aminolyse funktionalisiert werden. Die makroporösen Poly-(meth-)acrylnitril-Perlpolymerisate werden durch Aminolyse funktionalisiert.
Durch Hydrolyse der Poly-(meth-)acrylsäureglycidylester werden zwei OH-Gruppen aufweisende Poly-(meth-)acrylsäureester, nämlich Poly-(meth-)acrylsäure-2,3-dihydroxypropylester, erhalten. Die Hydrolyse wird allgemein in der Weise ausgeführt, daß man die Perlpolymerisate in wäßriger Lösung entweder sauer, z. B. mit Schwefelsäure oder Salzsäure, oder alkalisch, mit Natronlauge, bei höherer Temperatur (etwa 60 bis 95°C) mehrere Stunden lang rührt.
Durch Aminolyse der Poly-(meth-)acrylsäureglycidylester werden OH- und basische -NH-Gruppen aufweisende Poly- (meht-)acrylsäureester, nämlich Poly-(meth-)acrylsäure- vic-hydroxyamino-propylester, erhalten. Die Aminolyse kann mit Ammoniak, Mono- oder Polyaminen vorgenommen werden. Die Aminolyse wird in der Weise ausgeführt, daß man das Perlpolymerisat in wäßrige Ammoniak- oder Amin- Lösung einträgt und das Gemisch mehrere Stunden bei Temperaturen von 70 bis 220°C rührt.
Für die Aminolyse der Poly-(meth-)acrylnitrile werden vorzugsweise Polyamine vewendet, und es werden basische -NH-Gruppen aufweisende Poly-(meth-)acrylamide erhalten. Die Aminolyse der Poly-(meth-)acrylnitrile wird allgemein in der Weise ausgeführt, daß man das Perlpolymerisat in die wäßrige Lösung des Polyamins einträgt und das Gemisch etwa 15 bis 20 Stunden bei Temperaturen von 70 bis 220°C rührt.
Als bevorzugter Vertreter der für die Aminolyse zu verwendenden Polyamine seien besipielsweise genannt: Alkylendiamine wie Ethylendiamin, Propylendiamin-1,3, N,N- Bis-(2-hydroxyethyl)-propylendiamin-1,3, Hexamethylendiamin und Polyalkylenpolyamine wie Diethylentriamin, N-Methyl-di-(3-aminopropyl)-amin und Triethyltetramin.
Als bevorzugter Vertreter der für die Aminolyse zu verwendenden Monoamine seien vor allem Aminoalkohole wie Aminoethanol, Glukosamin und N-Methylglucamin genannt.
Zum Aufbau der in den erfindungsgemäßen Farbstoffharzen verwendeten makroporösen Poly-(meth-)acrylharze werden als Polyvinylverbindungen vor allem Dinvinylverbindungen, und zwar aromatische Divinylverbindungen wie Divinylbenzol, Divinyltoluol, Divinylnaphthalin und Diallylphthalat, aliphatische Divinylverbindungen wie Hexadien-1,5, 2-Methyl-hexadien-1,5, 2,5-Dimethyl-hexadien-1,5, Heptadien- 1,6, Octadien-1,7, Glykoldivinylether, Diethylenglykol- divinylether, N,N′-Methylendiacrylamid, N,N′-Methylendimethacrylamid, N,N′-Ethylendiacrylamid, Diallylmaleat, Divinylethylenharnstoff und Divinylpropylenharnstoff, Trivinylverbindungen wie Trivinylbenzol und Glycerintrivinylether, verwendet. Vorzugsweise werden Divinylbenzol, Heptadien-1,6 und Octadien-1,7 oder Kombinationen dieser drei Verbindungen eingesetzt.
Als Porösmacher werden die aus der Herstellung makroporöser Ionenaustauscher-Matrices bekannten Porösmacher verwendet. Es sind dies organische Verbindungen, die sich im Monomeren lösen, aber das Polymere ausfällen und gegebenenfalls anquellen (Fällmittel bzw. Quellmittel für das Polymere), z. B. aliphatische Kohlenwassertoffe wie Isododecan, Octan, Decan, Dodecan, Cyclohexan; alkylsubstituierte aromatische Kohlenwasserstoffe wie Toluol; C₄-C₁₄-Alkohole wie Hexanol, Cyclohexanol, Octanol, Decanol und Methylisobutylcarbinol, aliphatische und aromatische Chlorkohlenwasserstoffe wie 1,1,1-Trichlorethan, Ethylenchlorid, Chlorbenzol und o-Dichlorbenzol oder C₁-C₈-Carbonsäureester wie Essigsäureethylester, Essigsäurebutylester und Stearinsäusreamylester.
Die Porösmacher werden nach der Herstellung des Perlpolymerisats durch Verdampfen oder Elution wieder aus diesen entfernt.
Die Umsetzung der Reaktivfarbstoffe mit den erfindungsgemäß zu verwendenden makroporösen Perlpolymerisaten erfordert kerine besonders reaktionsfähigen Reaktivgruppen, sondern verläuft ohne Schwierigkeiten mit beliebigen Reaktivgruppen. Bewährt hat sich die Verwendung von Reaktivfarbstoffen, die als Reaktivgruppe halogenierte, vorzugsweise 6gliedrige N-Heterocyclen, z. B. eine Dichlortriazin- eine Trifluor-chlor-pyrimidin- oder eine 2,3- Dichlorchinoxalin-Gruppe aufweisen.
Aber auch Reaktivfarbstoffen mit nicht heterocyclischen Reaktivgruppen, z. B. der β-Chlorethylsulfonyl-Gruppe, sind erfolgreich verwendbar.
Voraussetzung für die Verwendbarkeit der Reaktivfarbstoffe für die Herstellung der erfindungsgemäßen Farbstoffharze ist lediglich, daß die Farbstoffe wasserlöslich sind, d. h., wasserlöslich machende Gruppen wie Sulfogruppen, Carboxylgruppen oder Phosphonsäuregruppen aufweisen. Vorzugsweise werden Farbstoffe mit Sulfonsäuregruppen verwendet.
Die chromophoren Gruppen der Reaktivfarbstoffe können den verschiedenartigsten Klassen angehören, z. B. der Reihe der metallfreien oder metallhaltigen Mono- oder Polyazofarbstoffe, metallfreien oder metallhaltigen Azaporphinfarbstoffe wie Kupfer-, Kobalt- oder Nickelphthalocyaninfarbstoffe, der Anthrachinon-, Oxazin-, Dioxazin-, Triphenylmethan-, Nitro- oder Azomethin- Farbstoffe oder der Reihe der metallfreien oder metallhaltigen Formazanfarbstoffe.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Farbstoffharze für die Affinitätschromatographie. Für die affinitätschromatographische Trennung eines Proteingemisches wird z. B. eine übliche Chromatographiesäule mit der Suspension eines der erfindungsgemäßen Farbstoffharze in einer Pufferlösung aus Trishydroxyethylaminhydrochlorid/HCl beschickt. Die Lösung des zu trennenden Proteingemisches wird auf die Säule gegeben; anschließend wird die Säule mit Pufferlösung eluiert. Das Eluat wird fraktionsweise aufgefangen und die einzelnen Fraktionen analytisch untersucht.
Beispiel 1
a) 100 ml eines makroporösen, perlförmigen Glycidylmethacrylat- Divinylbenzol-Copolymerisats, das durch Perlpolymerisation von 2,057 g Glycidylmethacrylat, 94,3 g technischem (=63,6%igem) Divinylbenzol in Gegenwart von 450 g Methylisobutylketon erhalten worden war, werden in 500 ml entsalztes Wasser eingetragen und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann gibt man 20 g einer wäßrigen 15gew.-%igen Lösung des Farbstoffes Levafix Brillantblau EBRA zu, rührt 30 Minuten nach, stellt den pH-Wert mit 5gew.-%iger Natronlauge auf 9,0 ein und erwärmt auf 50°C. Die Suspension wird bei pH 9 zwei Stunden bei 50°C, 2 Stunden bei 65°C und 2 Stunden bei 75°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit Wasser gründlich gewaschen. Man erhält 96 ml eines blauen Perlpolymerisats.
Beispiel 2
a) 500 ml des in Beispiel 1 (a) verwendeten makroporösen, perlförmigen Glycidylmethacrylat-Divinylbenzol- Copolymerisats werden in 1250 ml 10gew.- %iger Schwefelsäure eingetragen. Der Ansatz wird auf 80°C erhitzt und weitere 6 Stunden bei 80°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Harz auf einer Nutsche mit entsalztem Wasser ausgewaschen. Nach spektroskopischen Untersuchungen (FTIR) wurde die Epoxidgruppe zu -CH (OH)-CH₂(OH)-Gruppen umgesetzt.
b) 50 ml des nach (a) erhaltenen Harzes werden in 400 ml entsalztes Wasser eingetragen und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der pH-Wert wird mit 20gew.-%iger Natronlauge auf pH 8 eingestellt.
Dann gibt man 100 g Farbstofflösung Levafix Brillantblau PNRL fl., 40gew.-%ig, zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur und pH 8 nach. Anschließend wird der pH-Wert der Suspension mit 20gew.- %iger Natronlauge auf 10 eingestellt, die Suspension auf 45°C erwärmt und weitere 3 Stunden bei pH 10 und 45°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Harz gründlich mit entsalztem Wasser gewaschen. Man erhält 52 ml eines blau gefärbten Perlpolymerisats.
Beispiel 3
a) 1000 ml des in Beispiel 1 (a) verwendeten makroporösen, perlförmigen Glycidylmethacrylat-Divinylbenzol- Copolymerisats werden in 1400 ml einer wäßrigen Lösung, die 20 Gew.-% Hexamethylendiamin enthält, eingetragen. Die Suspension wird im Autoklaven innerhalb von 2 Stunden auf 200°C erhitzt und weitere 20 Stunden lang bei 200°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit Wasser gewaschen. Man erhält 1050 ml Harz mit einem Stickstoffgehalt von 8,15 Gew.-%. Nach spektroskopischen Untersuchungen (FTIR) wurde die Epoxidgruppe im Ausgangsharz zu einem hohen Anteil zu 2-Hydroxy-3- aminohexamethylenaminpropyl-Gruppen umgesetzt.
b) 220 ml des nach (a) erhaltenen Harzes werden in 500 ml entsalztes Wasser eingetragen und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Dann gibt man 150 g einer wäßrigen 15gew.-%igen Lösung des Farbstoffes Levafix Brillantblau EBRA zu, rührt 30 Minuten bei Raumtemperatur, stellt den pH-Wert der Suspension mit 5gew.-%iger Natronlauge auf 10 ein und erwärmt dann auf 45°C. Es wird eine weitere Stunde bei 45°C gerührt, dann auf 71°C erhitzt und weitere 2 Stunden bei 71°C und pH 10 gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit Wasser gewaschen. Man erhält 220 ml eines blau gefärbten Perlpolymerisats mit einem Stickstoffgehalt von 7,88 Gew.-% und einem Schwefelgehalt von 1,10 Gew.-%.
Beispiel 4
a) 1000 ml des in Beispiel 1 (a) verwendeten makroporösen, perlförmigen Glycidylmethacrylat-Divinylbenzol- Copolymerisats werden in 1400 ml einer wäßrigen Lösung, die 25 Gew.-% Diethylentriamin enthält, eingetragen. Die Suspension wird im Autoklaven innerhalb von 2 Stunden auf 200°C erhitzt und weitere 20 Stunden dabei 200°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit Wasser gewaschen. Man erhält 1140 ml Perlpolymerisat mit einem Stickstoffgehalt von 8,03 Gew.-%. Nach spektroskopischen Untersuchungen (FTIR) wurde die Epoxidgruppe in die 3-Diethylentriamino-2-hydroxypropyl- Gruppe überführt.
b) 50 ml des nach (a) erhaltenen Harzes werden in 1000 ml entsalztes Wasser eingetragen und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann gibt man 125 g wäßrige Levafix Brillantblau PN-RL 40gew.-%ige Lösung zu, rührt eine weitere Stunde bei Raumtemperatur und stellt dann den pH-Wert mit 5 Gew.- %iger Natronlauge auf pH 10 ein.
Die Suspension wird anschließend auf 50°C erwärmt, weitere 2 Stunden bei 50°C gerührt, dann auf 70°C erwärmt, weitere 2 Stunden bei 70°C gerührt und anschließend 1 Stunde bei 85°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit entsalztem Wasser gewaschen. Man erhält 350 ml eines blau gefärbten Perlpolymerisats.
Beispiel 5
a) 1000 ml des in Beispiel 1 (a) verwendeten makroporösen, perlförmigen Glycidylmethacrylat-Divinylbenzol- Copolymerisats werden in 1400 ml einer wäßrigen Lösung, die 20 Gew.-% Ehtylendiamin enthält, eingetragen. Die Suspension wird im Autoklaven in 2 Stunden auf 200°C erhitzt und weitere 20 Stunden bei 200°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Perlpolymerisat mit entsalztem Wasser gewaschen. Man erhält 1180 ml Perlpolymerisat. Nach spektroskopischen Untersuchungen (FTIR) enthält das Harz 2-Hydroxy-3-(β-aminoethyl)-amino-propyl- Gruppen.
b) 220 ml des nach (a) erhaltenen Harzes werden in 500 ml entsalztes Wasser eingetragen und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Dann gibt man 40 g einer 25gew.-%igen wäßrigen Levafix-Brillantrot- E-Ba-fl.-Lösung zu und stellt den pH-Wert mit 20 gew.-%iger Natronlauge auf pH 10 ein. Die Suspension wird dann auf 45°C erwärmt, eine weitere Stunde bei 45°C gerührt, auf 60°C erwärmt, eine weitere Stunde bei 60°C gerührt, auf 75°C erhitzt und weitere 2 Stunden bei 75°C und pH 10 gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit entsalztem Wasser ausgewaschen. Man erhält 215 ml rotes Perlpolymerisat.
Beispiel 6
a) 700 ml des in Beispiel 1 (a) verwendeten makroporösen, perlförmigen Glydicylmethacrylat-Divinylbenzol- Copolymerisats werden in 1700 ml einer wäßrigen Lösung, die 17 Gew.-% Hexamethylendiamin enthält, eingetragen. Die Suspension wird im Autoklaven in 2 Stunden auf 200°C erhitzt und weitere 20 Stunden bei 200°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit Wasser ausgewaschen. Man erhält 810 ml Perlpolymerisat mit einem Stickstoffgehalt von 5,72 Gew.-%.
b) 250 ml des nach (a) erhaltenen Harzes werden in 1200 ml entsalztes Wasser eingetragen und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann gibt man 50 g einer 40%igen wäßrigen Levafix-Brillantblau- PN-RL-Lösung zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur nach. Dann wird der pH-Wert mit 20gew.-%iger Natronlauge auf pH 10 eingestellt. Die Suspension wird auf 50°C erhitzt und weitere 2 Stunden bei 50°C gerührt. Anschließend erhitzt man auf 70°C und rührt weitere 2 Stunden bei 70°C und pH 10. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit Wasser gewaschen. Man erhält 245 ml eines blau gefärbten Perlpolymerisates.
Beispiel 7
a) 700 ml des in Beispiel 1 (a) verwendeten makroporösen, perlförmigen Glycidylmethacrylat-Divinylbenzol- Copolymerisats werden in 1700 ml einer wäßrigen Lösung, die 17 Gew.-% Hexamethylendiamin enthält, eingetragen.
Die Suspension wird in 2 Stunden auf 200°C erhitzt und weitere 20 Stunden bei 200°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit Wasser gewaschen. Man erhält 780 ml Perlpolymerisat mit einem Stickstoffgehalt von 5,80 Gew.-%.
b) 250 ml des nach (a) erhaltenen Harzes werden in 1200 ml entsalztes Wasser eingetragen und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann gibt man 200 g einer 40%igen wäßrigen Levafix-Brillantblau-PN-RL- Lösung zu und rührt eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird der pH-Wert mit 20gew.-%iger Natronlauge auf pH 10 eingestellt. Die Suspension wird auf 50°C erwärmt und weitere 2 Stunden bei 50°C mit pH 10 gerührt. Anschließend erhitzt man auf 70°C und rührt weitere 2 Stunden bei 70°C und pH 10. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit entsalztem Wasser gewaschen. Man erhält 245 ml eines blau gefärbten Perlpolymerisats mit einem Schwefelgehalt von 1,25 Gew.-%.
Beispiel 8
a) 500 ml eines makroporösen, perlförmigen Acrylsäuremethylester- Divinylbenzol-Copolymerisats, das durch Perlpolymerisation von 1500 g Acrylsäuremethylester, 151,5 g technischem (=63%igem) Divinylbenzol in Gegenwart von 450 g Methylisobutylketon erhalten worden war, werden in 1400 ml einer wäßrigen Lösung eingetragen, die 28 Gew.-% N-Methylglucamin enthält. Die Suspension wird in 2 Stunden auf 200°C erhitzt und weitere 20 Stunden bei 200°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Perlpolymerisat mit entsalztem Wasser gewaschen. Das Harz besitzt folghende elementaranalytische Zusammensetzung:
C: 70,65 Gew.-%; H: 7,75%; N: 2,50%; O: 17,7%.
b)  100 ml des nach (a) erhaltenen Harzes werden in 500 ml entsalztes Wasser eingetragen und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann gibt man 200 ml einer 10gew.-%igen wäßrigen Levafix-Türkis-Lösung zu, rührt 30 Minuten nach und stellt dann den pH-Wert mit 20gew.-%iger Natronlauge auf 10 ein. Die Suspension wird auf 45°C erhitzt, eine Stunde bei 45°C erhitzt, eine Stunde bei 45°C gerührt, auf 60°C erhitzt, 2 Stunden bei 60°C gerührt, anschließend auf 75°C erhitzt, 2 Stunden bei 60°C gerührt, anschließend auf 75°C erhitzt und eine weitere Stunde bei 75°C und pH 10 gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit entsalztem Wasser gewaschen. Man erhält 265 ml eines türkis gefärbten Perlpolymerisats.
Beispiel 9
a) 500 ml eines makroporösen, perlförmigen Acrylnitril- Divinylbenzol-Copolymerisats, das durch Perlpolymerisation von 204,6 g Acrylnitril, 71,4 g technischem (=63%igem) Divinylbenzol in Gegenwart von 150 g Isododecan erhalten worden war, werden in 1400 ml einer wäßrigen Lösung eingetragen, die 30 Gew.-% Diethylentriamin enthält. Die Suspension wird im Autoklaven in 2 Stunden auf 200°C erhitzt und weitere 20 Stunden bei 200°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Perlpolymerisat mit entsalztem Wasser gewaschen.
b) 250 ml des nach (a) erhaltenen Harzes werden in 1200 ml entsalztes Wasser eingetragen und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann gibt man 20 g einer 40%igen wäßrigen Levafix-Brillantblau-PN-LR- Lösung zu, stellt den pH-Wert mit 5 Gew.-% Natronlauge auf 10 ein und rührt eine Stunde bei Raumtemperatur nach. Anschließend wird die Suspension auf 50°C erhitzt und weitere 2 Stunden bei 50°C gerührt. Die Suspension wird dann auf 70°C erhitzt und eine weitere Stunde bei 70°C und pH 10 gerührt. Anschließend erhitzt man auf 85°C und rührt eine weitere Stunde bei 85°C und pH 10. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit entsalztem Wasser gewaschen. Man erhält 260 ml eines blau gefärbten Perlpolymerisats.
c) 70 ml des nach (a) erhaltenen Harzes werden in 300 ml entsalztes Wasser eingetragen und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann gibt man 100 g einer 25%igen wäßrigen Levafix-Brillantrot-E-Ba-fl.-Lösung zu, stellt den pH-Wert mit 20gew.-%iger Natronlauge auf pH 10 ein und rührt 30 Minuten bei Raumtemperatur. Der Ansatz wrid auf 45°C erhitzt und weitere 2 Stunden bei 45°C erhitzt und weitere 2 Stunden bei 45°C und pH 10 gerührt. Anschließend erwärmt man auf 60°C, rührt eine weitere Stunde bei pH 10 und 60°C, erhitzt dann auf 75°C und rührt eine weitere Stunde bei 75°C und pH 10. Nach dem Abkühlen wird das Perlpolymerisat mit entsalztem Wasser gewaschen. Man erhält 74 ml eines rot gefärbten Perlpolymerisats.
Beispiel 10
a) 100 ml eines makroporösen, perlförmigen Acrylsäuremethylester- Divinylbenzol-Copolymerisats, das durch Perlpolymerisation von 176 g Acrylsäuremethylester, 124 g technischem (=63%igem) Divinylbenzol in Gegenwart von 390 g Methylisobutylketon erhalten worden war, werden in 300 ml einer wäßrigen, 0,1gew.-%igen Levafix-Brillantblau-EBRA-Lösung eingetragen und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird der pH-Wert der Suspension mit 5gew.-%iger Natronlauge auf pH 10 eingestellt. Der Ansatz wird auf 50°C erhitzt und weitere 2 Stunden bei 50°C gerührt, anschließend wird auf 70°C erhitzt und weitere 2 Stunden bei 70°C gerührt. Dann erhitzt man auf 80°C und rührt eine weitere Stunde bei 80°C und pH 10. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit entsalztem Wasser gewaschen. Man erhält 92 ml eines hellblau gefärbten Perlpolymerisats.
Beispiel 11
a) 500 ml des in Beispiel 1 (a) verwendeten makroporösen, perlförmigen Glycidylmethacrylat-Divinylbenzol- Copolymerisats werden in 1400 ml einer Lösung eingetragen, die 28 Gew.-% N-Methylglucamin enthält. Der Ansatz wird in 2 Stunden auf 180°C erhitzt und weitere 10 Stunden bei 180°C gewaschen. Folgende elementaranalytische Zusammensetzung wurde bestimmt:
C: 63,95 Gew.-%; H: 7,8 Gew.-%; N: 1,9 Gew.-%;  O: 24,4 Gew.-%.
b) 100 ml des nach (a) erhaltenen Harzes werden in 500 ml entsalztes Wasser eingetragen und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann gibt man 200 ml einer wäßrigen, 15gew.-%igen Levafix-Brillantblau- EBRA-Lösung zu, rührt 30 Minuten bei Raumtemperatur und stellt den pH-Wert der Suspension mit 20gew.- %iger Natronlauge auf pH 10 ein. Der Ansatz wird auf 50°C erhitzt und weitere 90 Minuten bei 50°C und pH 10 gerührt. Anschließend erhitzt man auf 70°C, rührt weitere 2 Stunden bei 70°C und pH 10, erhitzt auf 85°C und rührt eine weitere Stunde bei 85°C und pH 10. Nach dem Abkühlen wird das Harz mit entsalztem Wasser gewaschen. Man erhält 110 ml blau gefärbtes Perlpolymerisat.
Beispiel 12
In eine Glassäule (Durchmesser 2,5 cm; Länge 50 cm) füllt man 90 ml des nach Beispiel 1 hergestellten Harzes. Verunreinigte Glycerokinase mit einer Aktivität von 20 Einheiten pro mg Protein wurden in einer Konzentration von 10 mg/ml bei pH 8 in 10 mM Kaliumphosphatpuffer gelöst. Die Lösung wurde in 60 Minuten über die Säule gegeben. Das Harz wurde anschließend mit Pufferlösung gewaschen. Das gebundene Enzym wurde dann mit einer Lösung von 10 mM MgCL₂ und 10 mM ATP in wäßriger Kaliumphosphatlösung eluiert. Das eluierte Enzym zeigte eine Aktivität von 140 U/mg und eine Bande auf der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese bei 65 000 Dalton.
Beispiel 13
In eine Glassäule (Durchmesser 2,5 cm; Länge 50 cm) füllt man 100 ml des nach Beispiel 2 (b) hergestellten Harzes. Einzelextrakt, der 30 Einheiten pro mg Protein Carboxylpeptidase G enthält, wurde in 25-mM-Trisacetat- Puffer bei pH 7,5 zu 15 mg/ml gelöst. Die Lösung wird in 60 Minuten über die Säule gegeben, die anschließend mit Trisacetatpufferlösung gewaschen wird. Das Enzym wird mit 1 m KCl-Lösung eluiert. Man findet eine Aktivität von 130 Einheiten pro mg.

Claims (8)

1. Farbstoffharze auf Basis von Kondensationsprodukten von Reaktivfarbstoffen mit synthetischen Trägerharzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie Kondensationsproduke von Reaktivfarbstoffen mit makroporösen Perlpolymerisaten von gegebenenfalls Epoxy-, OH- und/oder NH-Gruppen aufweisenden Poly-(meth-)acrylsäureestern oder NH- oder OH-Gruppen aufweisender Poly-(meth-)acrylamide sind.
2. Farbstoffharze gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Kondensationsprodukte von Reaktivfarbstoffen mit solchen makroporösen Perlpolymerisaten, gegebenenfalls Epoxy-, OH- und/oder NH- Gruppen aufweisender Poly-(meth-)acrylsäureester oder NH- oder OH-Gruppen aufweisender Poly-(meth-) acrylamide sind, die durch Copolymerisation von monomeren (Meth-)Acrylsäureestern oder (Meth-) Acrylnitrilen mit 10 bis 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren, einer Polyvinylverbindung in Gegenwart von 30 bis 180 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomere, eines Porösmachers erhalten wurden.
3. Farbstoffharze gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Kondensationsprodukte von Reaktivfarbstoffen mit solchen makroporösen Perlpolymerisaten, gegebenenfalls Epoxy-, OH- und/oder NH- Gruppen aufweisender Poly-(meth-)acrylsäureester oder NH- oder OH-Gruppen aufweisender Poly-(meth-) acrylamide sind, die durch Copolymerisation von monomeren (Meth-)Acrylsäureestern oder (Meth-) Acrylnitrilen mit 10 bis 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren, einer Polyvinylverbindung in Gegenwart von 30 bis 150 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren, eines Porösmachers erhalten werden.
4. Farbstoffharze gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Kondensationsprodukte von Reaktivfarbstoffen mit solchen makroporösen Perlpolymerisaten, gegebenenfalls Epoxy-, OH- und/oder NH- Gruppen aufweisender Poly-(meth-) acrylsäureester oder NH- oder OH-Gruppen aufweisender Poly-(meth-) acrylamide sind, die durch Copolymerisation von monomeren (Meth-)Acrylsäureestern oder (Meth-) Acrylnitrilen mit 10 bis 35 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomere, einer Polyvinylverbindung in Gegenwart von 40 bis 120 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren, eines Porösmachers erhalten wurden.
5. Farbstoffharze gemäß Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gegebenenfalls Epoxy-, OH- und/oder NH-Gruppen aufweisenden Poly-(meth-)acrylsäureestern um Poly-(meth-) acrylsäurealkylester handelt.
6. Verfahren zur Herstellung von Farbstoffharzen auf Basis von Kondensationsprodukten von Reaktivfarbstoffen mit makroporösen Perlpolymerisaten, gegebenenfalls Epoxy-, OH- und/oder NH-Gruppen aufweisender Poly-(meth-)acrylsäureester oder NH- oder OH-Gruppen aufweisener Poly-(meth-)acrylamide, dadurch gekennzeichnet, daß man die makroporösen Perlpolymerisate mit der wäßrigen Lösung des gewünschten Reaktivfarbstoffes bei erhöhter Temperatur behandelt und dabei in der Farbstofflösung durch Zugabe von Basen einen pH-Wert <7 einstellt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Farbstofflösung einen pH-Wert von 8 bis 12 einstellt.
8. Verwendung von Farbstoffharzen auf Basis von Kondensationsprodukten von Reaktivfarbstoffen mit makroporösen Perlpolymerisaten, gegebenenfalls Epoxy-, OH- und/oder NH-Gruppen aufweisender Poly- (meth-)acrylsäureester oder NH- oder OH-Gruppen aufweisender Poly-(meth-)acrylamide als Adsorbentien für die Affinitätschromatographie.
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