DE4326821A1

DE4326821A1 - Verfahren zur Herstellung von Krebsvakzinen

Info

Publication number: DE4326821A1
Application number: DE4326821A
Authority: DE
Inventors: Max L Prof Dr Birnstiel; Mathew Dr Cotten; Walter Dr Schmidt; Gotthold Dr Schaffner; Ernst Dr Wagner; Kurt Dr Zatloukal
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1993-08-10
Filing date: 1993-08-10
Publication date: 1995-05-18

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Gentherapie, insbesondere auf ihre Anwendung im Rahmen der Krebstherapie.

In den letzten 20 Jahren hat es keinen entscheidenden Durchbruch bei der Behandlung von Krebserkrankungen gegeben, erst der kürzlich entwickelte Ansatz der sog. "Krebsvakzine" hat die Hoffnung auf einen Fortschritt in der Krebstherapie geweckt.

In Krebspatienten hat das Immunsystem einen großen Einfluß auf die Entwicklung des Tumors und auf die Prognose der Krankheit. Im Patienten mit malignem Melanom kann die Immunantwort zu einer vollständigen Rückbildung des Tumors in 0.5% der Patienten führen. In den meisten Patienten wird jedoch eine Immunantwort, die die Tumorentwicklung kontrolliert, jedoch nicht alle Krebszellen ausschalten kann, in frühen Stadien des Tumors beobachtet. In fortgeschrittenen Stadien findet man oft die Situation, daß die Krebszellen der Immunerkennung entkommen oder das Immunsystem spezifisch unterdrückt wird (Hoon et al., 1990). Es wurde vorgeschlagen, nach der chirurgischen Entfernung des Primärtumors dem Patienten Krebsvakzine zu verabreichen. Krebsvakzine enthalten Krebszellen, die genetisch modifiziert sind, oder Krebszellen in Kombination mit immunstimulierenden Adjuvantien, die im Patienten eine krebsspezifische Immunantwort induzieren oder reaktivieren (s. z. B. Hoon et al., 1990; Bystryn et al., 1990 und 1992; Berd et al., 1990; Fearon et al., 1990; Lotze et al., 1992; Pardoll, 1992; Rosenberg et al., 1992, Schirrmacher, 1990).

Die Gene, mit denen Tumorzellen transfiziert werden, um sie stärker immunogen und als Folge davon weniger tumorigen zu machen, fallen in drei Kategorien:

1) Gene, die für Proteine kodieren, die den Tumorzellen fehlen (sog. Fremd- oder Neoantigene): Die dadurch hervorgerufene sog. "Xenogenisierung" kann z. B. durch Expression syngenetischer MHC-I-Antigene in MHC-I- defizienten Tumorzellen, durch Expression von allogenetischen MHC-I- oder MHC-II-Antigenen oder durch Expression von viralen Proteinen wie Hämagglutinin (Itaya et al., 1987; Fearon et al., 1988; Plaksin et al., 1988 und Ostrand-Rosenberg et al., 1990).
2) Zytokingene: Die Expression dieser Gene (z. B. Interleukin-2, CSF = "Colony stimulating factor", Interferone) dient der Aktivierung des Immunsystems, damit dieses die Tumorzellen als fremd erkennt und sie abstößt.
3) Gene, die für sog. "Hilfsproteine" oder "co stimulatorische Moleküle" kodieren: Jüngste Erkenntnisse der Immunologie haben gezeigt, daß eine effiziente Stimulierung von T-Zellen sowohl die Aktivierung des T-Zellrezeptors als auch die Aktivierung eines zweiten Rezeptors auf der T-Zelle durch ein Molekül auf der Oberfläche der Antigen präsentierenden Zelle erfordert (Jenkins und Johnson, 1993). Das Paar B7/CD28 stellt eine solche Einheit co- stimulierender Moleküle dar. Die Expression von B7 auf Melanomzellen stimuliert eine Immunabwehr von normalerweise nicht immunogenen Zellen (Baskar et al., 1993; Chen et al., 1992; Townsend und Allison, 1993, Schwartz, 1992). Das "Hitzestabile Antigen" HSA ("heat stable antigen"), das u. a. von dendritischen Zellen und von Milz-B-Zellen exprimiert wird, zeigt ebenfalls co-stimulierende Aktivität (Liu et al., 1992a und 1992b) und dürfte bei der Förderung des T-Zellwachstums mit B7 zusammenwirken. Eine der Eigenschaften von co- stimulatorischen Molekülen wie B7 dürfte darin bestehen, daß sie den Tumorzellen Eigenschaften von Antigen präsentierenden Zellen verleihen.

Mit der durch die Transfektion der Tumorzellen mit einem Gen aus einer dieser Gruppen bewirkten krebsspezifischen Immunantwort soll erreicht werden, daß nach Entfernung des Tumors Mikrometastasen, die bis heute klinisch nicht nachweisbar sind und chirurgisch nicht entfernt werden können, zerstört werden, um ein späteres Wiederauftreten von Krebs zu verhindern.

Eine Therapie auf Basis von Krebsvakzinen stellt - im Gegensatz zur unspezifischen Stimulation des Immunsystems - eine aktiv-spezifische Immuntherapie mit Impfstoffen aus inaktivierten, möglichst patienteneigenen Tumorzellen oder Teilen davon dar, wodurch das Immunsystem des Patienten gezielt gegen Antigene des individuellen Tumors oder zumindest desselben Tumortyps mobilisiert wird.

Nachdem sich gezeigt hatte, daß eine Inaktivierung der Tumorzellen eine Verminderung der Immunantwort bewirken kann, wurden in jüngster Zeit Krebsvakzine entwickelt, die aus lebensfähigen Tumorzellen bestehen (Rosenberg et. al., 1992). Es ist jedoch aus Sicherheitsgründen ein Impfstoff auf der Grundlage nicht mehr teilungsfähiger Zellen erstrebenswert, die eine begrenzte Lebensdauer haben.

Einer der kritischen Schritte bei der Herstellung von Krebsvakzinen ist der Gentransfer in die Zellen, die das Vakzin bzw. einen Bestandteil davon darstellen.

Die bisher für den Transfer von Genen in die Zelle, u. a. im Rahmen der Anwendung von Krebsvakzinen, am weitesten fortgeschrittene Technik benutzt rekombinante retrovirale Vektoren; eine solche Methode wurde kürzlich von Rosenberg et al., 1992, vorgeschlagen. Die Verwendung von Retroviren ist jedoch problematisch, weil sie, zumindest zu einem geringen Prozentsatz, die Gefahr von Nebenwirkungen, wie Infektion mit dem Virus, in sich birgt. Darüber hinaus können Retroviren nur sich teilende Zellen transduzieren. Außerdem sind diese Vektoren, wie auch die als Alternative zum retroviralen System vorgeschlagenen rekombinanten Adenoviren, Beschränkungen, und zwar hinsichtlich der Größe und Konstruktion der zu transferierenden DNA, unterworfen.

Kürzlich wurde in mehreren Arbeiten der Einsatz von nichtrekombinanten Adenoviren aufgrund der Fähigkeit dieser Viren, den Inhalt von Endosomen freisetzen zu können, für den Gentransfer mit DNA-Komplexen mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose vorgeschlagen. Der Einsatz von Adenoviren bewirkt eine Steigerung der Effizienz des Gentransfers, indem der Abbau der in die Zelle internalisierten DNA-Komplexe in den Lysosomen vermieden wird (Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b). U.a. wurde vorgeschlagen, die Adenoviren durch Bindung an Polylysin zu modifizieren. Die Adenovirus-Polylysin- Konjugate können zusammen mit Konjugaten aus Transferrin-Polylysin mit DNA komplexiert werden, wobei ternäre Transferrin-Polylysin/Adenovirus-Polylysin/DNA- Komplexe entstehen (Wagner et al., 1992). Die Komplexe binden an Transferrin- und Adenovirusrezeptoren auf den Zielzellen. Nach der Endozytose bewirkt das Adenovirus den Aufbruch von Endosomen, das hat die Freisetzung des Materials vom Endosom ins Zytoplasma zur Folge. Die DNA kann daraufhin in den Kern eintreten, wo das Gen exprimiert wird, überwiegend von episomal lokalisierter DNA. Diese Technik hat gegenüber den konventionellen viralen und nichtviralen Gentransfermethoden folgende Vorteile: Da in diesem Zusammenhang das Adenovirus nur als Mittel für die Freisetzung der Transfektionskomplexe aus dem Endosom fungiert, kann das Virus mit Hilfe von genetischen und/oder chemischen, gegebenenfalls in Kombination mit physikalischen Methoden inaktiviert werden, was die Sicherheit gegenüber konventionellen viralen Techniken erhöht (Cotten et al., 1992). Ferner wird das Genkonstrukt an der Außenseite des Virus transportiert; es ist nicht Teil des Virusgenoms. Daher müssen keine viralen Vektoren hergestellt werden, und es gibt beinahe keine Beschränkungen hinsichtlich Größe (wenigstens bis zu 48 kb) und Sequenz der transportierten DNA. Ein weiterer Vorteil liegt in der Breite der Anwendbarkeit hinsichtlich der Zielzellen, weil die Komplexe über Transferrin- und/oder Adenovirusrezeptoren aufgenommen werden können. Statt Transferrin können auch andere Liganden, spezifisch für bestimmte Zellpopulationen, verwendet werden, für Melanomzellen hat sich z. B. LDL als sehr geeignet erwiesen. Es können mit Hilfe dieses Systems hohe Werte für die Genexpression in vielen Zelltypen erhalten werden (10-100fach höher als für retroviral transfizierte Zellen (Lotze et al., 1992; Rosenberg et al., 1992) oder für mittels CaPO₄ Co-Präzipitation erhaltene stabil transfizierte Zellen (Fearon et al., 1990)). Ferner können Vielfachkopien des Genkonstrukts in die Zellen transportiert werden. Es können teilende und nichtteilende Zellen transfiziert werden. Die Expression der in die Zelle transportierten DNA hält über mehrere Monate in konfluenten (wachstumsarretierten) Zellkulturen an (Zatloukal et al., 1992).

Die mit dem Adenovirus dl312 durchgeführten Versuche sind mit Toxizitätsproblemen verbunden; der Replikationsdefekt des Virus, der auf einen Defekt in der E1A-Region zurückzuführen ist, konnte von den transfizierten Zellen teilweise umgangen werden, der Defekt ist also "undicht". Darüberhinaus war die Ausbeute an Virus in den Verpackungszellinien, die verfügbar sind, um die Defekte von Ad5 dl312 zu komplementieren, nicht befriedigend.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Krebsvakzinen auf der Grundlage eines verbesserten Gentransfersystems bereitzustellen.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Krebsvakzinen, die autologe Tumorzellen enthalten. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man Tumorzellen oder Fibroblasten kultiviert und die kultivierten Zellen ex vivo mit einer Zusammensetzung transfiziert, die folgende Komponenten enthält:

ai) ein DNA-Molekül, das eine oder mehrere in der Zelle exprimierbare Sequenzen enthält, die für ein oder mehrere, gleiche oder verschiedene, immunstimulierende Polypeptide kodieren, oder mehrere DNA-Moleküle, enthaltend für verschiedene immunstimulierende Polypeptide kodierende Sequenzen,
aii) gegebenenfalls ein weiteres DNA-Molekül, das frei ist von Sequenzen, die für ein in der zu transfizierenden Zelle funktionell aktives Polypeptid kodiert,
b) ein DNA-bindendes Molekül, gegebenenfalls konjugiert mit einem Internalisierungsfaktor, der an ein Oberflächenmolekül der zu transfizierenden Zellen bindet und in diese internalisiert wird,
c) ein Konjugat zwischen einem DNA-bindenden Molekül und einem Adenovirus, das eine Mutation zumindest in der E4-Region aufweist, oder einem Adenovirus, das neben einem Effekt in der E1A-Region einen oder mehrere weitere genetische Defekte aufweist,

wobei die Komponenten b) und c) mit der in a) definierten DNA einen im wesentlichen elektroneutralen Komplex bilden, daß man die transfizierten Zellen derart inaktiviert, daß sie unter Beibehaltung ihrer Fähigkeit zur Expression der in ai) definierten DNA ihre Fähigkeit zur Teilung verlieren, wobei man im Falle der Transfektion von Fibroblasten diese mit nichttransfizierten sowie inaktivierten Tumorzellen mischt, und daß man die Zellpopulation gegebenenfalls mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und Trägerstoffen mischt.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Krebsvakzine enthalten gegenüber den von Rosenberg et al., 1992, vorgeschlagenen Krebsvakzinen inaktivierte Tumorzellen, die überraschenderweise trotz der Bestrahlung hinsichtlich der von ihnen ausgelösten Immunantwort voll wirksam sind. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß aufgrund der hohen Expressionsraten der immunstimulierenden Gene in den transfizierten Zellen eine durch die Inaktivierung der Zellen bewirkte Verminderung bzw. einen Verlust der Antigenizität zumindest teilweise kompensiert wird.

Als Ausgangsmaterial für Tumorvakzine, die individuell für jeden einzelnen Patienten hergestellt werden, dienen autologe Tumorzellen, gegebenenfalls in Mischung mit Fibroblasten. Die Fibroblasten können ebenfalls autologe Zellen sein, es ist aber auch möglich, Zellen einer Fibroblastenzellinie einzusetzen, wodurch die Notwendigkeit wegfällt, in jedem einzelnen Fall eine individuelle Fibroblastenkultur herstellen zu müssen, was mehrere Wochen erfordert.

Zunächst werden Tumorzellen und/oder Fibroblasten aus Gewebsproben des zu behandelnden Individuums isoliert. Die Methoden dazu sind dem Fachmann bekannt. Primäre Melanomzellen können z. B. am einfachsten aus Lymphknotenmetastasen isoliert werden, indem die Metastasen chirurgisch entfernt und unter sterilen Bedingungen mechanisch und gegebenenfalls zusätzlich enzymatisch dissoziiert werden.

Die Isolierung aus Primärtumoren ist im allgemeinen schwieriger, vor allem im Fall von kleineren Tumoren. Dabei wird beispielsweise so vorgegangen, daß die Tumore chirurgisch entfernt, mechanisch zerkleinert und zusätzlich enzymatisch dissoziiert werden. Bekannte Vorschriften für die Dissoziierung, nach denen vorgegangen werden kann, wenden Collagenase und DNAse an.

Die Isolierung aus anderen Tumoren kann nach demselben Prinzip erfolgen, in Abhängigkeit vom umgebenden Gewebe werden die Methoden zur Isolierung und Dissoziierung variiert. Für Isolierung und Kultur von Tumorzellen können literaturbekannte Methoden angewendet werden, wie sie z. B. dem Fachbuch "Human Cancer in Primary Culture", Hsg. John R.W. Masters, 1991, entnehmbar sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Genkonstrukte statt in Krebszellen in primäre Fibroblasten eingebracht, die dann mit den nichttransfizierten bestrahlten Krebszellen, die Tumorantigene tragen, vermischt werden (Fakhrai et al., 1992). Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, daß Fibroblasten leicht und in großen Mengen vom Patienten erhalten werden können, was vor allem von Bedeutung ist, wenn kleinere Tumore vorliegen und damit eine geringere Zahl von Tumorzellen vorhanden ist, und daß der Gentransfer in autologe primäre Fibroblasten leichter standardisiert werden kann als die Transfektion in primäre Krebszellisolate von verschiedenen Patienten. Ein weiterer Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, daß die Tumorzellen nicht über längere Zeit kultiviert werden müssen, womit ihr antigenes Spektrum, das durch die Kultivierung teilweise verlorengehen kann, erhalten bleibt. Damit wird außerdem der mit der Kultivierung von Tumorzellen verbundene Nachteil vermieden, daß einzelne Populationen, z. B. Fibroblasten, die im Tumorisolat zu einem geringen Anteil enthalten sind, oder Tumorzellklone die Kultur überwachsen.

In den Versuchen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurde die Melanomzellkultur in RPMI 1640 Medium plus FCS durchgeführt. Für die therapeutische Anwendung werden die Zellen für die erfindungsgemäßen Tumorvakzine im Hinblick auf eine möglichst gute Verträglichkeit vorzugsweise in Serum der Blutgruppe AB kultiviert, weiters kann als Medium auch autologes Serum verwendet werden.

Fibroblasten werden nach bekannten Methoden aus Hautbiopsien isoliert und kultiviert.

Nach der Kultur werden die Zellen mit dem Transfektionsmedium, das die Komplexe mit den Komponenten a) bis c) enthält, behandelt. Im allgemeinen wird eine gleichzeitige Verabreichung von Adenoviruskonjugat und dem Komplex zwischen DNA und Internalisierungsfaktor-Konjugat bevorzugt. Um die Genexpression zu verstärken, können die Komplexe auch wiederholt angewendet werden.

Nach der Transfektion werden die Zellen von überschüssigem Medium, das Transfektionskomplexe beinhaltet, befreit, mit frischem Kulturmedium gewaschen und beliebig weiter kultiviert.

Die Inaktivierung der Tumorzellen bzw. der Fibroblasten, die vorzugsweise in gleicher Weise wie die transfizierten Fibroblasten inaktiviert werden, kann mit an sich bekannten Methoden, z. B. physikalischen Methoden, wie Röntgenbestrahlung oder Gammastrahlung, und/oder mittels chemischer Behandlung mit Mitosehemmern, z. B. mit Mitomycin C, erfolgen. Geeignet sind Substanzen, die die DNA-Replikation blockieren oder sog. "Spindelgifte", das sind Substanzen, die die Mitosespindel hemmen.

Im Zuge der durchgeführten Versuche wurde festgestellt, daß eine Röntgenstrahlendosis bis zu 100 Gy die Expression der transfizierten Genkonstrukte nicht vermindert.

Die geeignete Inaktivierungsdosis kann ermittelt werden, indem z. B. bei verschiedenen Strahlendosierungen bzw. Konzentrationen des chemischen Inaktivierungsmittels und/oder Behandlungsdauer einerseits der ³H-Thymidineinbau in die Zellen oder ihre Proliferationsrate und andererseits die Expression des Fremdgens bestimmt wird.

Durch die Bestrahlung der transfizierten Zellen und ihrer damit begrenzten Lebenszeit werden etwaige Langzeitnebenwirkungen verhindert. Es wird eine temporäre, durch die Gendosis festgelegte, zeitlich begrenzte Genexpression erzielt.

Vorzugsweise werden die transfizierten Fibroblasten ebenfalls inaktiviert. Mit dieser Maßnahme wird eine bei der Transfektion und/oder Kultur etwa erworbene Tumorigenität ausgeschaltet.

Die Krebsvakzine, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können unmittelbar nach ihrer Herstellung verabreicht werden.

Die gebrauchsfertigen Krebsvakzine liegen vorzugsweise als Suspension vor, die gegebenenfalls durch Trypsinisierung erhalten wird. Die Zellen befinden sich suspendiert in einem physiologischen Medium (physiologischer Kochsalz- oder Pufferlösung), das gegebenenfalls diejenigen Nährstoffe, insbesondere Aminosäuren, enthält, die die Zellen für die Aufrechterhaltung ihres Metabolismus für die kurze Zeit zwischen Fertigstellung des Vakzins und dessen Verabreichung benötigen.

In dem Verfahren zur Herstellung der Krebsvakzine kann als Zwischenschritt ein Einfrieren der Zellen unter kontrollierten Bedingungen und unter Zusatz von Substanzen, die Gefrierschäden an den Zellen vermeiden ("kryoprotectants"), z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO), eingeschaltet sein. Der Gefrierschritt kann prinzipiell an beliebiger Stelle des Verfahrens vorgesehen sein, z. B. vor der Transfektion der kultivierten Zellen, oder nach der Transfektion, ein Einfrieren ist aber auch als letzter Schritt, also nach der Bestrahlung der Zellen und unmittelbar vor der Verabreichung, möglich. Durch das Einfrieren wird ein Vorrat an für die Transfektion bereiten bzw. bereits transfizierten Zellen verfügbar, der dann in Aliquots die Fertigstellung der Tumorvakzine erleichtert. Zweckmäßig ist ein Gefrierpräparat, das zwischengelagert werden kann und vor der Anwendung nur noch einer Aufbereitung, gegebenenfalls einschließlich Bestrahlung, unterzogen werden muß.

Es ist in jedem Fall erforderlich, vor der Verabreichung der Tumorvakzine die Zellen von Gefrierschutzzusätzen zu reinigen.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in vitro hergestellten Krebsvakzine werden dem Patienten verabreicht, um eine systemische, tumorspezifische Immunantwort auszulösen oder zu reaktivieren.

Die Menge an Tumorzellen pro Immunisierung liegt im Größenordnungsbereich von 10⁵-10⁷ Zellen. Für die Ausführungsform, in der Fibroblasten kultiviert und transfiziert werden, liegt die Zahl an beigemischten Fibroblasten etwa in demselben Bereich, kann jedoch gegebenenfalls bis zu ca. 1/100 der Zellzahl verringert werden.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die in dem Verfahren zur Anwendung kommenden Transfektionskomplexe, bestehend aus DNA, enthaltend eine oder mehrere für ein immunstimulierendes Polypeptid kodierende Sequenzen, einem DNA-bindenden Molekül, das vorzugsweise mit einem Internalisierungsfaktor für Tumorzellen und/oder Fibroblasten konjugiert ist, insbesondere Polylysin, und einem Konjugat aus einem DNA-bindenden Molekül und dem oben definierten Adenovirus, wobei das DNA-bindende Molekül und der DNA-bindende Anteil des Adenovirus- Konjugats an die DNA gebunden sind.

Es wurde festgestellt, daß mit Hilfe der erfindungsgemäßen Komplexe ein effizienter Gentransfer in primäre humane Melanomzellen und primäre humane Fibroblasten möglich ist, daß transfizierte Mausmelanomzellen bis zu 24.000 Einheiten IL-2 pro 1 × 10⁶ Zellen pro 24 h produzierten, was mindestens 30 × mehr ist als die Werte, die mit anderen viralen (Lotze et al., 1992; Rosenberg et al., 1992) oder nichtviralen (Fearon et al., 1990) Gentransfertechniken erhalten wurden, daß eine Bestrahlung von bis zu 100 Gy die Expression der transfizierten Genkonstrukte nicht vermindert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde in einem Mausmodell die Wirkung eines Maus- Melanomvakzins gezeigt, das eine systemische Immunantwort in immunisierten Mäusen induziert und die Tiere nach Verabreichung von tumorigenen Dosen von Melanomzellen vor einer Entwicklung von Tumoren schützt.

Das DNA-Molekül, definiert als Komponente ai), ist ein Plasmid, das eine für ein immunstimulierendes Polypeptid, beispielsweise ein Zytokin, kodierende Sequenz enthält. Unter "immunstimulierend" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch die die Immunantwort verstärkende Eigenschaft der sog. co- stimulierenden Moleküle ("co-stimulatory molecules"), wie B7 (Schwartz, 1992; Townsend und Allison, 1993) oder Adhäsionsmoleküle, z. B. HSAs ("heat stable antigens", Kay et al., 1990) oder ICAM (Springer et al., 1987) verstanden; ferner zählen zu immunstimulierenden Substanzen auch Fremdantigene (sog. "Neo-Antigene"), z. B. virale Antigene. Die für das immunstimulierende Polypeptid kodierende Sequenz steht in Verbindung mit regulatorischen Sequenzen, die eine möglichst hohe Expression des immunmodulatorischen Polypeptids in den Zielzellen ermöglichen. Vorzugsweise werden starke Promotoren wie der CMV-Promotor (Boshart et al., 1985) oder der β-Aktin-Promotor (Gunning et al., 1987) verwendet. Das geeignete Konstrukt kann in Vorversuchen durch Vergleich der Expressionswerte ermittelt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die für Interleukin 2 (IL-2) kodierende Sequenz verwendet.

Es können jedoch auch für andere Zytokine wie IL-4, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF kodierende DNA-Sequenzen eingesetzt werden (Pardoll, 1992). Es können auch Kombinationen von Zytokinsequenzen eingesetzt werden, um die immunstimulierende Wirkung zu verstärken, z. B. IL-2 + IFN-γ, IL-2 + IL-4, IL-2 + TNF-α oder TNF-α + IFN-γ. Vorzugsweise liegen die für zwei verschiedene Zytokine kodierenden Sequenzen auf getrennten Plasmiden vor. Damit kann, wie z. B. in den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten anhand von IL-2 und IFN-γ gezeigt wurde, eine Feinabstufung der Zytokinexpression erhalten werden, indem die Mengenverhältnisse der beiden Plasmide variiert werden.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein DNA-Molekül eingesetzt, das eine oder mehrere für ein co-stimulatorisches Molekül kodierende Sequenz(en) enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das co-stimulatorische Molekül das Hitzestabile Antigen (Heat Stable Antigen HSA). Eine die für HSA kodierende Sequenz enthaltende DNA kann sowohl allein als auch in Kombination mit einer für ein Zytokin, vorzugsweise IL-2, kodierenden DNA eingesetzt werden.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein DNA-Molekül eingesetzt, das eine oder mehrere für ein Neoantigen kodierende Sequenz(en) enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Neoantigen ein Virusprotein oder ein Fragment davon, beispielsweise das Rabies-Glykoprotein. Eine die für das Virusprotein kodierende Sequenz enthaltende DNA kann sowohl allein als auch in Kombination mit einer für ein Zytokin, vorzugsweise IL-2, kodierenden DNA eingesetzt werden.

Hinsichtlich der Größe des DNA-Konstrukts gibt es praktisch keine Limitierung, das zur Anwendung kommende Gentransfersystem hat sich für Konstrukte einer Größe von 48 kb als geeignet erwiesen (Cotten et al., 1992).

Gegebenenfalls liegt die für ein immunstimulierendes Polypeptid kodierende DNA, also die therapeutisch wirksame DNA, in Mischung mit einem in aii) definierten DNA-Molekül vor, das als "Füll-DNA" dient. Die Sequenz dieser DNA ist nicht kritisch, sie muß - neben den Anforderungen an die Reinheit, hinsichtlich derer sie der therapeutisch wirksamen DNA entsprechen muß - lediglich die Bedingung erfüllen, daß sie keine Sequenz enthält, die für ein in der Zelle funktionell aktives Polypeptid kodiert. Die Größe dieser DNA ist ebenfalls nicht kritisch, im allgemeinen ist es zweckmäßig, daß sie im Bereich der Größenordnung des gentherapeutisch wirksamen DNA-Moleküls liegt bzw. kleiner ist als diese.

Diese Füll-DNA kann, ausgehend von einer konstanten DNA-Menge im Hinblick auf ein definiertes Verhältnis der übrigen Komplexpartner, verschieden große Anteile der therapoutisch wirksamen DNA ersetzen. Dies hat den Vorteil, daß man die therapeutische DNA-Dosis und damit die in der Zelle exprimierte Zytokinmenge variieren kann, ohne die anderen Parameter verändern zu müssen, was im Rahmen eines standardisierten Turmorvakzinherstellungsprozesses von großem Interesse ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß die Menge des in der Zelle exprimierten Gens proportional zum Anteil an Füll-DNA abnimmt.

Wenn die Zielzelle Rezeptoren für das Adenovirus aufweist, durch die eine Internalisierung in einem für die effiziente Expression der Fremd-DNA in der Zelle ausreichendem Maß gewährleistet, kann es genügen, als Komponente b) ein nicht mit einem weiteren Internalisierungsfaktor konjugiertes DNA-bindendes Molekül einzusetzen; im allgemeinen handelt es sich dabei um dasselbe Molekül wie das in c) definierte, vorzugsweise wird Polylysin verwendet. Für diese Ausführungsform der Erfindung hat das Adenovirus selbst die Funktion des Internalisierungsfaktors, es ist in diesem Fall nicht erforderlich, die DNA-bindende Substanz mit einem weiteren Internalisierungsfaktor zu konjugieren.

Die DNA ist in der Ausführungsform der Erfindung, in der b) eine nicht-konjugierte DNA-bindende Substanz ist, mit dem Konjugat c) komplexiert; die Komponente b) hat in diesem Fall in erster Linie die Funktion, eine Kompaktierung und damit eine erleichterte Aufnahme der Komplexe in die Zelle zu bewirken (Wagner et al., 1991a).

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die als Komponente b) definierte DNA-bindende Substanz mit einem Internalisierungsfaktor konjugiert. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kommt vor allem dann zur Anwendung, wenn die Zielzelle keine oder nur wenige Rezeptoren für das Adenovirus aufweist, das als Bestandteil des Virus-Konjugats c) zur Anwendung kommt, z. B. wenn ein Virus einer entfernten Spezies eingesetzt wird, das nicht die Fähigkeit aufweist, von sich aus in die zu transfizierenden Zellen einzudringen. In Gegenwart eines weiteren Internalisierungsfaktor-Konjugats profitieren die Virus-Konjugate von der Internalisierungsfähigkeit des Konjugats b), indem sie gemeinsam mit diesem an die Nukleinsäure komplexiert werden und als Bestandteil des so entstandenen Komplexes, im folgenden als "Kombinations-Komplex" oder "ternärer Komplex" bezeichnet, in die Zelle aufgenommen werden. Ohne auf diese Theorie festgelegt sein zu wollen, werden die Kombinations-Komplexe von Zellen entweder durch Bindung an den für den Internalisierungsfaktor spezifischen Oberflächenrezeptor oder durch Bindung an den Virusrezeptor oder durch Bindung an beide Rezeptoren über den Weg der Rezeptor-vermittelten Endozytose aufgenommen. Bei der Freisetzung der Viren aus den Endosomen wird auch die in den Komplexen enthaltene DNA in das Zytoplasma freigesetzt und entkommt dadurch dem lysosomalen Abbau.

Die in b) bevorzugt enthaltenen Konjugate zwischen einem Internalisierungsfaktor und einer DNA-bindenden Substanz sind an sich bekannt.

Unter Internalisierungsfaktor sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Liganden oder Fragmente davon zu verstehen, die nach Bindung an eine Tumorzelle oder einen Fibroblasten über Endozytose, vorzugsweise Rezeptor-vermittelte Endozytose, internalisiert werden, oder Faktoren, deren Bindung/Internalisierung über Fusion mit Zellmembranelementen erfolgt.

Beispiele für Internalisierungsfaktoren sind die Liganden Transferrin (Klausner et al., 1983), Asialoglykoproteine (wie Asialotransferrin, Asialorosomucoid oder Asialofetuin), (Ashwell et al., 1982), Lectine (Goldstein et al., 1980; Sharon, 1987), bzw. Substanzen, die Galaktose enthalten und über den Asialoglykoproteinrezeptor internalisiert werden; mannosylierte Glykoproteine (Stahl et al., 1978), lysosomale Enzyme (Sly et al., 1982), LDL (Goldstein et al., 1982), modifizierter LDL (Goldstein et al., 1979), Lipoproteine, die über Rezeptoren in die Zelle aufgenommen werden (apo B100/LDL); virale Proteine; Antikörper (Mellman et al., 1984; Kuhn et al., 1982; Abrahamson et al., 1981) bzw. Fragmente davon gegen Zelloberflächenantigene, z. B. anti-CD4, anti-CD7, anti- cD3; Zytokine wie Interleukin-1 (Mizel et al., 1987), Interleukin-2 (Smith et al., 1985), TNF (Imamura et al., 1987), Interferone (Anderson et al., 1982); CSF ("Colony-stimulating Factor"), (Walker et al., 1987), Faktoren und Wachstumsfaktoren wie Insulin (Marshall, 1985), EGF ("Epidermal Growth Factor"), (Carpenter, 1984); PDGF ("Platelet-Derived Growth Factor"), (Heldin et al., 1982), TGFα (Massague et al., 1986) und TGFß ("Transforming Growth Factors" α, β), HGF (Hepatocyte Growth Factor (Nakamura et al., 1989), Nervenwachstumsfaktor (Hosang et al., 1987), Insulin- ähnlicher Wachstumsfaktor I ("Insulin-like Growth Factor"), (Schalch et al., 1986), LH, FSH (Ascoli et al., 1978), Wachstumshormon (Hizuka et al., 1981), Prolactin (Posner et al., 1982), Glucagon (Asada-Kubota et al., 1983), Thyroidhormone (Cheng et al., 1980), α-2-Makroglobulin-Protease (Kaplan et al., 1979). Weitere Beispiele sind Immunglobuline oder Fragmente davon als Liganden für den Fc-Rezeptor oder Anti- Immunglobulin-Antikörper, die an sIgs ("Surface Immunoglobulins") binden. Die Liganden können natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein (siehe Trends Pharmacol. Sci., 1989, und die darin zitierten Referenzen).

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind als Internalisierungsfaktor Transferrin und EGF.

Geeignete DNA-bindende Substanzen als Komponente b) (nicht-konjugiert oder als Konjugatbestandteil) bzw. als Bestandteil des Konjugats c) sind z. B. homologe organische Polykationen wie Polylysin, Polyarginin, Polyornithin oder heterologe Polykationen mit zwei oder mehr unterschiedlichen positiv geladenen Aminosäuren, wobei diese Polykationen verschiedene Kettenlänge aufweisen können, weiters nicht-peptidische synthetische Polykationen wie Polyethylenimin. Geeignete DNA-bindende Substanzen sind ferner natürliche DNA-bindende Proteine polykationischen Charakters wie Histone oder Protamine bzw. Analoge oder Fragmente davon, sowie Spermin oder Spermidine.

Die Länge des Polykations ist nicht kritisch, sofern die Komplexe im wesentlichen elektroneutral sind. Wenn die DNA aus 6.000 bp und 12.000 negativen Ladungen besteht, kann die Menge an Polykation pro Mol DNA z. B. sein:
60 Mol Polylysin 200 oder
30 Mol Polylysin 400 oder
120 Mol Polylysin 100, etc.

Der Durchschnittsfachmann kann mittels einfacher Routineversuche andere Kombinationen von Polykationlänge und molarer Menge auswählen.

Bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Polylysin eingesetzt, insbesondere mit einer Kettenlänge von ca. 200 bis 300 Lysinen.

Wenn zur Herstellung der Konjugate c) das DNA-bindende Molekül im Hinblick auf die Kopplung an das Virus modifiziert wird, z. B. wenn Polylysin mit Streptavidin konjugiert wird, um an biotinyliertes Adenovirus gebunden zu werden, kann der Einfachheit halber das derart modifizierte DNA-bindende Molekül als Komponente b) eingesetzt werden. Das bedeutet in der Praxis, daß bei der Herstellung von Polylysin-Streptavidin/Biotin- Adenovirus-Konjugaten ein Überschuß an Polylysin- Streptavidin eingesetzt wird, der die Funktion der Komponente b) übernimmt.

Die Internalisierungsfaktor-Polykation-Konjugate können auf chemischem oder, falls das Polykation ein Polypeptid ist, auf rekombinantem Weg hergestellt werden, bezüglich der Herstellungsmethoden wird auf die Offenbarung der EP 388 758 Bezug genommen.

Die Konjugate können auch nach der von Wagner et al., 1991b, beschriebenen Methode hergestellt werden, indem ein Glykoprotein, z. B. Transferrin, und das DNA- bindende Molekül, insbesondere Polylysin, über eine oder mehrere Kohlenhydratketten des Glykoproteins miteinander verbunden werden.

Bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Komponente c) ein Adenovirus mit einem Defekt in der E4-Region. Derartige Adenoviren wurden von Bridge und Ketner, 1989, beschrieben. Die Funktion der in der komplexen E4-Region kodierten Proteine ist erst teilweise aufgeklärt. Bisher ist bekannt, daß die E4-Region, wie die E1b-Region, für den Übergang zwischen dem frühen und dem späten Genexpressionsprogramm des Virus und für das Abschalten der Wirtsproteinsynthese wesentlich ist, ferner für die Virusreplikation und den Virionzusammenbau. Es gibt 24 E4-mRNAs, bisher wurden sieben offene Leserahmen identifiziert, wobei angenommen wird, daß die Leserahmen 3 und 6 in erster Linie für den E4-Phänotyp verantwortlich sein dürften. Eine sehr wichtige Funktion hat das Genprodukt des offenen Leserahmens ORF 6/7. Dieses Protein bindet wahrscheinlich den zellulären Transkriptionsfaktor E2F, womit er zum hochspezifischen adenoviralen Transkriptionsfaktor wird. Es wurde überraschend festgestellt, daß ein Adenovirus, das einen Defekt in der E4-Region hat, als Bestandteil eines Gentransfersystems auf der Grundlage der Rezeptor-vermittelten Endozytose, bei dem das Adenovirus die Funktion eines die Endosomen aufbrechenden Mittels hat, bei der Anwendung auf Tumorzellen geringe Toxizität bei gleichzeitig hoher Gentransporteffizienz aufweist.

Aus den von Bridge und Ketner beschriebenen Adenoviren wurde die Mutante dl1014, die einen intakten ORF 4 besitzt, in der jedoch ORF 3 und ORF 6 sowie ORF 6/7 defekt sind, aufgrund ihrer Eigenschaft ausgewählt, daß sie in der Synthese viraler Proteine am stärksten beeinträchtigt ist. Da die Funktionen der in E4 kodierten Virusproteine noch nicht zur Gänze aufgeklärt sind, kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht definiert werden, in welchen Leserahmen die Mutationen gesetzt werden müssen, um den gewünschten Effekt zu erzielen. Weitere außer der Mutante dl1014 geeignete Mutanten können empirisch ermittelt werden, indem E4-Mutanten, wie von Bridge und Ketner beschrieben, hergestellt und in standardisierten Transfektions- und Zytotoxizitätsexperimenten, wie sie in den Beispielen beschrieben sind, getestet werden. Für die orientierenden Transfektionstests kann zunächst statt des Zytokingens ein Reportergen verwendet werden. Mutanten, die vergleichbare Genexpressions- und Zytotoxizitätswerte bringen wie dl1014 bzw. dl1014 sogar überlegen sind, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Bestandteile des Transfektionskomplexes geeignet, sofern sie weiters die Anforderung erfüllen, daß die Viren, wie z. B. dl1014 in der Zellinie W162, in einer den E4-Defekt komplementierenden Zellinie zu hohen Titern gezüchtet werden können.

Alternativ zum Adenovirus mit einem E4-Defekt kann auch ein Adenovirus mit einem Defekt in der E1a-Region eingesetzt werden, das zusätzlich zu dem E1a-Defekt einen oder mehrere weitere Gendefekte aufweist, der/die mit chemischen, chemisch/physikalischen oder genetischen Methoden gesetzt wurde(n).

Die mit Hilfe von chemischen oder physikalisch/chemischen Methoden gesetzten Defekte sind keine gezielten Defekte, sondern können über das ganze Virusgenom verstreut sein.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich u. a. eine Adenovirus-Mutante der Bezeichnung dl312 (Jones und Shenk, 1979), die mit 8-Methoxypsoralen/UV inaktiviert worden war, als für die Herstellung von Krebsvakzinen geeignet gezeigt.

Andere geeignete E1a-Mutanten können nach literaturbekannten Methoden hergestellt, zusätzlich mit verschiedenen Inaktivierungsmethoden und/oder -dosen behandelt und, wie für E4-Mutanten beschrieben, ihre Eignung zur Herstellung von Tumorvakzinen als Bestandteil der Transfektionskomplexe getestet werden.

Alternativ zu 8-Methoxypsoralen können andere Psoralenderivate eingesetzt werden, z. B. 4′- Aminomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen, von dem festgestellt wurde, daß es sich für die Inaktivierung von Adenoviren im Hinblick auf deren Anwendung für den Gentransfer eignet. (Psoralenderivate haben die Fähigkeit, in die DNA interkalieren zu können und nach Bestrahlung mit UV von 365 nm kovalente Interstrang- und Intrastrang-Addukte mit der Virus-DNA zu bilden (Hanson, 1992). Diese Addukte inaktivieren die betroffenen Genabschnitte und blockieren dadurch die Genfunktionen, z. B. die Virustranskription und -replikation.) Es wurde festgestellt, daß einer Reduktion der Virusreplikation um mehr als 5 log (bestimmt mittels CPE-Assay) und einer Reduktion der Virusreplikation um mehr als 7 log (bestimmt mittels Plaque-Assay) einer Reduktion der Gentransferverstärkung um nur eine halbe Zehnerpotenz gegenübersteht (Cotten et al., 1992).

Im Hinblick auf die bei der Herstellung von Arzneimitteln generell und bei der Herstellung von Tumorvakzinen im besonderen angestrebte größtmögliche Standardisierbarkeit, die sich auf alle Komponenten bzw. Verfahrensparameter erstreckt, also auch auf die eingesetzten Viren, wird vorteilhafterweise ein Virus eingesetzt, das möglichst nach einer standardisierbaren Methode inaktiviert wurde. Die Anforderung an die Standardisierbarkeit wird vor allem von chemischen Inaktivierungsmethoden erfüllt, die diesbezüglich den chemisch/physikalischen Methoden überlegen sind. Ein Beispiel für eine chemische Inaktivierungsmethode ist die Inaktiverung mit β-Propiolacton (Morgeaux et al., 1993; De Shu et al., 1986; Budowsky und Zalesskaya, 1991). Diese Methode hat den Vorteil, daß aufgrund der Instabilität des Inaktivierungsmittels in wässerigen Lösungen eine Reinigung von nicht-reagiertem Reagens entfällt. Außerdem erfordert diese Inaktivierungsmethode keine UV-Behandlung, was im Hinblick auf Standardisierbarkeit ebenfalls vorteilhaft ist. Es wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß die Behandlung von Adenovirus mit zwei Aliquots 0.3% β-Propiolacton während 4 h bei Raumtemperatur einen Abfall des Virustiters um 5 log hervorruft, was mit der mittels 8-Methoxypsoralen erzielten Inaktivierung vergleichbar ist. Die DNA- Transportaktivität wird bei mittleren Dosen von Propiolacton (0.3%) beibehalten, während die Behandlung mit 1% β-Propiolacton einen beträchtlichen Rückgang dieser Fähigkeit hervorruft. Die Analyse der Genexpression vom inaktivierten Virus zeigte, daß sowohl die Psoralenderivate als auch β-Propiolacton die Virusgenexpression (E1a und E3) im selben Ausmaß blockieren. Der empfindlichere Plaque-Assay erwies jedoch, daß die Psoralenbehandlung das Virus um mehr als 7 log inaktiviert, wobei bei den höchsten Virusdosen keine Plaques beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu rief β-Propiolacton-Inaktivierung nur einen Abfall im Virustiter um 5 log hervor, wobei bei höheren Virusdosen Plaques beobachtbar waren.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird somit ein Virus eingesetzt, das mittels ausschließlich chemischer Methoden inaktiviert ist, vorzugsweise mittels β-Propiolacton.

Die Eignung einer Methode zur Inaktivierung von Viren im Hinblick deren Verwendung für den Gentransfer, insbesondere für die erfindungsgemäßen Tumorvakzine, kann in Vorversuchen, wie sie in den Beispielen für die Inaktivierung von Adenoviren mit 8-Methoxypsoralen/UV, 4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen/UV und β- Propiolacton illustriert sind, ermittelt werden. Dabei wird z. B. die Effizienz der Virusinaktivierung durch Bestimmung des Virustiters und/oder mittels des empfindlicheren Plaque-Assays bestimmt und darüberhinaus die Fähigkeit des Virus zur Verstärkung des Rezeptor-vermittelten Gentransfers anhand eines Reportergens getestet. Um festzustellen, wo am Virusgenom die Inaktivierungsmethode greift, d. h. welche Abschnitte zerstört werden, können mit DNA- Sonden Hybridisierungsversuche durchgeführt werden, mit denen die Viren auf das Vorhandensein der entsprechenden Transkripte untersucht werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden nach diesem Prinzip mehrere Inaktivierungsmethoden daraufhin getestet, ob sie die Virusreplikations- und Transkriptionsfunktionen zu blockieren vermögen. Geeignet ist eine Inaktivierungsmethode dann, wenn sie Adenoviruspartikel liefert, die die für die DNA-Transportfunktion nützliche endosomolytische Aktivität, die eine Funktion des Viruskapsids ist, noch besitzen, während ihnen die Fähigkeit zur Virusgenexpression oder Replikation, welche unerwünschte Veränderungen in der Zelle hervorrufen könnten, fehlt. Es wurde festgestellt, daß die Behandlung von Adenovirus mit 8-Methoxypsoralen oder mit 4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen, jeweils gefolgt von einer 25 minütigen UVA-Bestrahlung, ebenso wie die Behandlung mit 2 × 0.3% β-Propiolacton Viruspartikel liefert, die die Fähigkeit zur Verstärkung des effizienten DNA-Transports beibehalten. Mittels CPE (Zytopathischer Endpunktassay) wurde festgestellt, daß die drei Behandlungsmethoden hinsichtlich der Abnahme des Virustiters vergleichbar sind. Sowohl nach Behandlung mit 8-Methoxypsoralen/UV als auch mit β-Propiolacton war keine Transkription vom Virusgenom nachweisbar. Mittels des empfindlicheren Plaque-Assays wurde jedoch festgestellt, daß β- Propiolacton-behandelte Viren replizieren können, wenn ausreichende Mengen der komplementierenden Zellinie vorhanden sind. Im Gegensatz dazu blockiert die Behandlung des Virus mit beiden Psoralenderivaten die Virusreplikation komplett, so daß mittels dieses Tests keine Plaques nachweisbar waren.

Das Polylysin-gekoppelte Adenovirus wird bevorzugt als Bestandteil eines ternären oder Kombinationskomplexes eingesetzt. Die Kopplung des Virus an Polylysin kann auf verschiedene Arten erfolgen:

Die Kopplung von Virus auf chemischem Weg kann in für die Kopplung von Peptiden an sich bekannter Weise erfolgen, wobei, falls erforderlich, die Einzelkomponenten vor der Kopplungsreaktion mit Linkersubstanzen versehen werden (diese Maßnahme ist dann erforderlich, wenn von vornherein keine für die Kopplung geeignete funktionelle Gruppe, z. B. eine Mercapto- oder Alkoholgruppe, verfügbar ist). Bei den Linkersubstanzen handelt es sich um bifunktionelle Verbindungen, die zunächst mit funktionellen Gruppen der Einzelkomponenten zur Reaktion gebracht werden, worauf die Kopplung der modifizierten Einzelkomponenten durchgeführt wird.

Eine mögliche Art der Kopplung des Virus an Polylysin erfolgt in ähnlicher Weise wie bei der Herstellung von Transferrin-Polylysinkonjugaten (Wagner et al., 1990) nach Modifizierung des defekten Adenovirus mittels eines heterobifunktionellen Reagens. Falls ein Virus geeignete Kohlenhydratketten aufweist, kann es mit der DNA-bindenden Substanz über eine oder mehrere Kohlenhydratketten des Glykoproteins verbunden werden (Wagner et al., 1991b).

Ein weiteres Verfahren zur Herstellung der Virus- Polylysin-Konjugate ist die enzymatische Kopplung des Virus an eine DNA-bindende Substanz, insbesondere ein Polyamin, durch eine Transglutaminase (Zatloukal et al., 1992).

Eine weitere Methode zur Herstellung der Adenovirus- Polylysin-Konjugate besteht darin, das Virus über eine Biotin-Protein-Brücke, vorzugsweise eine Biotin- Streptavidin Brücke, an das Polykation zu koppeln (Wagner et al., 1992).

Gegebenenfalls kann die Bindung an Biotin auch über Avidin erfolgen.

Weiters ist es möglich, die Bindung zwischen Virus und Polylysin herzustellen, indem einerseits das Virus biotinyliert wird und andererseits ein anti-Biotin- Antikörper mit Polylysin konjugiert und die Bindung zwischen Virus und Polylysin über die Biotin/Antikörper-Bindung hergestellt wird, wobei handelsübliche polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen Biotin eingesetzt werden können.

Die Bindung zwischen dem Virus und Polylysin kann auch hergestellt werden, indem Polylysin mit einem Lectin gekoppelt wird, das Affinität zu einem Virus- Oberflächenglykoprotein hat, wobei die Bindung in einem solchen Konjugat über die Bindung zwischen dem Lectin und dem Glykoprotein erfolgt. Weist das Virus von sich aus keine geeigneten Kohlenhydratseitenketten auf, kann es entsprechend modifiziert werden.

Das Virus kann für den Fall, daß es auf seinen Oberflächenproteinen Regionen aufweist, die sauer sind und daher an ein Polykation binden können, auch ionisch an das DNA-bindende Molekül gebunden sein.

Die Reihenfolge der Schritte für die Herstellung der Transfektionskomplexe ist nicht kritisch, es kann zweckmäßig wie folgt vorgegangen werden:

Ausgehend von den DNA-Molekülen wird die DNA-bindende Substanz nach Art und Menge bestimmt, die die Komplexierung der DNA gewährleistet, die erhaltenen Komplexe sind vorzugsweise im wesentlichen elektroneutral. Für die Komplexe, die das Virus- Konjugat und ein Internalisierungsfaktor-Konjugat enthalten, wird der Kationenanteil beider Konjugate hinsichtlich des Aspekts der Elektroneutralität in Betracht gezogen.

Bei der Bestimmung des molaren Verhältnisses der Komponenten a), b) und c) ist zu berücksichtigen, daß Komplexierung der DNA stattfindet und gewährleistet ist, daß der gebildete Komplex an die Zelle gebunden, in die Zelle befördert und daß er aus den Endosomen freigesetzt wird.

Das jeweils gewählte Verhältnis Internalisierungsfaktor-Konjugat/DNA richtet sich vor allem nach der Größe der Polykationmoleküle sowie nach der Anzahl und Verteilung der positiv geladenen Gruppierungen, Kriterien, die auf Größe und Struktur der zu transportierenden DNA abgestimmt werden, wobei auch das Viruskonjugat in Rechnung zu stellen ist.

Vorzugsweise beträgt das molare Verhältnis Internalisierungsfaktor: Polylysin ca. 10 : 1 bis ca. 1 : 10.

Im Falle der Verwendung von nicht-konjugierter DNA- bindender Substanz kann nach Konstruktion und Synthese des Adenovirus-Konjugats und der Bestimmung des für die Effizienz der Transfektion und der Expression optimalen Verhältnisses Konjugat:DNA mit Hilfe von Titrationen die Menge des Konjugat-Anteils bestimmt werden, der durch DNA-bindende Substanz ersetzbar ist.

Bevorzugt wird Polylysin sowohl als Komponente b), vorzugsweise konjugiert mit einem Internalisierungsfaktor, als auch als Bestandteil des Adenvoviruskonjugats c) eingesetzt.

Eine geeignete Methode zur Bestimmung des Verhältnisses der in den Komplexen enthaltenen Komponenten besteht darin, zuerst das in die Zelle zu importierende Genkonstrukt zu definieren und, wie oben beschrieben, ein Virus zu finden, das für die Transfektion geeignet ist. Dann wird das Virus an das Polykation gebunden und mit dem Genkonstrukt komplexiert. Ausgehend von einer konstanten DNA-Menge wird durch Titrationen das optimale Verhältnis zwischen Virus-Konjugat und Internalisierungsfaktor-Konjugat bzw. nicht- konjugierter DNA-bindender Substanz bestimmt.

Die Komplexe können hergestellt werden, indem die Komponenten a), b) und c), die jeweils in Form verdünnter Lösungen vorliegen, gemischt werden.

Das optimale Verhältnis von DNA zu Konjugat und nicht- konjugierter DNA-bindender Substanz wird durch Titrationen, d. h. in einer Reihe von Transfektionsexperimenten mit konstanter DNA-Menge und variabler Menge an Konjugat/Polylysin, bestimmt. Das optimale Verhältnis von Konjugat:Polykation in der Mischung kann mit Hilfe von Routineexperimenten bzw. aus dem Vergleich der optimalen Verhältnisse der in den Titrationsexperimenten eingesetzten Mischungen erhalten werden.

Die Herstellung der DNA-Komplexe kann bei physiologischen Salzkonzentrationen erfolgen. Eine weitere Möglichkeit besteht im Einsatz hoher Salzkonzentrationen (etwa 2 M NaCl) und anschließender Einstellung auf physiologische Bedingungen durch langsames Verdünnen bzw. Dialyse.

Die jeweils am besten geeignete Reihenfolge für die Mischung der Komponenten wird im einzelnen in Vorversuchen bestimmt.

Die Menge an eingesetztem Adenovirus-Konjugat richtet sich nach der im einzelnen vorgenommenen Transfektion. Es ist zweckmäßig, die Mindestmenge an Virus einzusetzen, die erforderlich ist, um die Internalisierung des Komplexes in einen Großteil der Zellen und seine Freisetzung aus den Endosomen zu gewährleisten. Die Menge an Viruskonjugat wird auf den jeweiligen Zelltyp abgestimmt, dabei ist vor allem die Infektiosität des Virus für diesen Zelltyp zu berücksichtigen. Ein weiteres Kriterium ist das jeweilige Internalisierungsfaktor-Konjugat, insbesondere hinsichtlich des Internalisierungsfaktors, für den die Zielzelle eine definierte Anzahl von Rezeptoren aufweist. Außerdem richtet sich die Menge an Viruskonjugat nach der Menge der zu importierenden DNA. Für eine spezielle Anwendung wird in Vorversuchen mit den jeweils für die Transfektion vorgesehenen Zielzellen und dem für die Transfektion vorgesehenen Vektorsystem die optimale Viruskonzentration durch Titrieren ermittelt, wobei zweckmäßigerweise als DNA ein Genkonstrukt eingesetzt wird, das hinsichtlich der Größe mit dem für die konkrete Anwendung vorgesehenen weitgehend übereinstimmt und das zwecks einfacherer Messung der Effizienz des Gentransfers ein Reportergen enthält. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde die Eignung des Luciferasegens als Reportergen für derartige Versuche gezeigt.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die mit den erfindungsgemäßen Komplexen transfizierten Tumorzellen bzw. Fibroblasten. Dieser Typ von Krebsvakzinen, wie er mit Hilfe der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden kann, stellt eine neue Entwicklung auf dem Gebiet der Zytokintherapie dar. Sie hat den Vorteil, daß die schweren Nebenwirkungen systemisch verabreichter Zytokine aufgrund der lokal beschränkten Produktion und Wirkung des Zytokins vermieden werden können. Außer für die Behandlung von Melanomen können auch andere Krebsarten mit Hilfe der erfindungsgemäßen Krebsvakzine behandelt werden, z. B. Darmkrebs, Nierenkrebs, Brustkrebs, etc.

Figurenübersicht

Fig. 1: Gentransport in primäre humane Melanomzellkulturen

Fig. 2: Bestimmung der Liganden, die bei der Aufnahme von Gentransferkomplexen beteiligt sind. Verwendung von nicht-konjugiertem Polylysin

Fig. 3: Effekt der Inaktivierung von Adenoviren durch Psoralen/UV auf die Genexpression in primären humanen Melanomzellen

Fig. 4: Bestimmung der Langzeitzytotoxizität von Adenoviren

Fig. 5: Wirkung der Bestrahlung von Tumorzellen auf die Expression transfizierter Gene

Fig. 6: Einfluß der Plasmidkonzentration auf die Expression des Luciferase-Reportergens

Fig. 7: Einfluß der Plasmidkonzentration auf die Expression von IL-2 und/oder IFN-γ

Fig. 8: Verlust der Tumorigenizität transfizierter Maus-Melanomzellen

Fig. 9: Induktion einer systemischen Immunantwort gegen Melanom in Mäusen durch Immunisierung mit zytokintransfizierten, bestrahlten Tumorzellen

Fig. 10: EGF als Ligand für den Gentransfer in Zellen einer humanen epidermoiden Karzinomzellinie (A: plus 2% FCS, B: ohne FCS)

Fig. 11: IL-2 Expression in Maus-Melanomzellen unter Verwendung verschiedener Vektoren

Fig. 12: IL-2 Expression in Fibroblasten unter Verwendung verschiedener Vektoren

Fig. 13: Stimulierung einer Immunantwort durch Melanomzellen, die auf ihrer Oberfläche HSA exprimieren

Fig. 14: Stimulierung einer Immunantwort durch Melanomzellen, die auf ihrer Oberfläche das Rabies-Glykoprotein exprimieren

Fig. 15: Titration von 8-Methoxypsoralen

Fig. 16: Titration von 4′-Aminomethyl-4,5′,8- trimethylpsoralen

Fig. 17: Titration von β-Propiolacton

Fig. 18: Gentransportaktivität von Adenovirus dl1014 nach Behandlung mit 8-Methoxypsoralen oder nach Behandlung mit niedrigen Konzentrationen von β-Propiolacton

Fig. 19: Plaque-Assays von Adenovirus dl1014, inaktiviert mit 8-Methoxypsoralen, β- Propiolacton oder 4′-Aminomethyl-4,5′,8- trimethylpsoralen

Fig. 20: Plaque-Assays von Adenovirus dl1014, inaktiviert mit 8-Methoxypsoralen oder verschiedenen β-Propiolacton-Behandlungen

Fig. 21: Genexpression vom inaktivierten Virus

In den folgenden Beispielen wurden, sofern nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden verwendet:

a) Plasmid-Konstrukte i) DNA-Plasmid-Konstrukte, enthaltend die für humanes oder Maus-IL-2 kodierende Sequenz

Für die in den Beispielen 6 bis 8 durchgeführten Versuche wurde das von Karasuyama et al., 1989, beschriebene Plasmid BCMGneo-mIL-2 verwendet.

Alternativ wurde ein Plasmid der Bezeichnung pWS2m hergestellt, das das Maus-IL-2-Gen unter Kontrolle des Zytomegalovirus Enhancer/Promotors enthält: Das Plasmid pHβAPr-1 (Gunning et al., 1987) wurde mit BamHI und EcoRI geschnitten. Mittels Agarosegel-Reinigung wurde ein 2.5 kb Fragment isoliert, das das Ampicillin- Restistenzgen und den Replikationsursprung von pBR322 sowie das SV40-Polyadenylsierungssignal enthält. Dieses Fragment wurde mit dem CMV-Promotor/Enhancer ligiert, das als ein 0.7 kb PCR-Fragment vom Vektor pAD-CMVI (beschrieben in der EP-A 393 438) amplifiziert und EcoRI/BamHI verdaut worden war. Das erhaltene Plasmid wurde pWS genannt. Die für Maus-IL-2 kodierende cDNA wurde als PCR-Fragment vom Plasmid BMGneo-mIL-2 (Karasuyama und Melchers, 1988) erhalten. In Richtung des 5′ Endes vom ersten ATG Codon wurde die Sequenz GCCGCC zwecks optimaler Translationsinitiation angehängt. Die 3′-nicht-kodierende Region wurde entfernt. Das PCR-Fragment wurde in den mittels SalI/BamHI-Verdau geöffneten Vektor pWS ligiert.

Für die Anwendung in Humanzellen wird der Vektor pWS2 eingesetzt, der in ähnlicher Weise wie der Vektor pWS2m erhalten wird, mit dem Unterschied, daß als Vorlage für die PCR-Amplifikation statt dem Plasmid BMGneo-mIL-2 das Plasmid pIL2-50A (Taniguchi et al., 1983), der die für humanes IL-2 kodierende cDNA enthält, dient.

Als Alternative zu einem Plasmid mit dem Ampicillin- Resistenzgen wurde ein Plasmid hergestellt, das das Tetracyclin-Resistenzgen, herausgeschnitten aus pBR322, enthält.

Für das Plasmid pCM2 wurde die Maus-IL-2 Sequenz zusammen mit den 5′- und 3′ flankierenden Regionen (Spalt- und Poly(A)-Signale vom Kaninchen-β-Globingen) als SalI/BamHI-Fragment aus BCMGneo-mIL-2 herausgeschnitten und in den Vektor pAD-CMV1 eingesetzt.

ii) DNA-Plasmid-Konstrukt, enthaltend die für Maus-IFN-γ kodierende Sequenz

Es wurde das von Gray und Goeddel, 1983, beschriebene Plasmid pSVEmuIFN-γ verwendet.

iii) DNA-Plasmid-Konstrukt pHSA, enthaltend die für HSA kodierende Sequenz

Das Plasmid pHSA, das die vom CMV-Promotor getriebene HSA-Sequenz enthält, wurde erhalten, indem die HSA-cDNA (Kay et al., 1990) in die BstXI-Stelle des Plasmids pCDM8 (Seed, 1987) kloniert wurde.

iv) DNA-Plasmid-Konstrukt pWS-RABIES, enthaltend die für das Rabies-Glykoprotein kodierende Sequenz

Die für das Rabies-Glykoprotein kodierende Sequenz wurde aus dem Vektor pKSV-10 (Pharmacia), der die Rabies-Glykoprotein cDNA (Anilionis et al., 1982) in die Bgl II-Stelle abwärts vom SV40-Promotor hineinkloniert enthält, als Bgl II-Fragment isoliert. Der Vektor pWS2m wurde mit Bgl II und BamHI geschnitten. Das die murine IL-2 cDNA tragende Fragment wurde über Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und das dem Vektor pWS entsprechende Fragment isoliert und mit dem Rabies-Fragment ligiert. Die richtige Rabies- Orientierung wurde durch Sequenzierung bestätigt. Die Rabies-Glykoprotein-Sequenz ist als SEQ ID NO:1 dargestellt.

v) Reporterplasmid-Konstrukt pCMVL

Das Plasmid pCMV wurde hergestellt, indem das BamHI- Insert des Plasmids pSTCX556 (Severne et al., 1988) entfernt, das Plasmid mit Klenow-Fragment behandelt und das HindIII/SspI sowie Klenow-behandelte Fragment aus dem Plasmid pRSVL (enthaltend das Photinus pyralis Luciferasegen unter der Kontrolle des Rous Sarcoma Virus LTR Enhancer/Promoters (Uchida et al., 1977, De Wet et al., 1987) eingesetzt wurde. Das Reporter- Plasmid wurde pCMVL bezeichnet.

b) Herstellung von Transferrin-Polylysin-Konjugaten

Zur Synthese von Konjugaten aus Transferrin und Polylysin mit einer Kettenlänge von 290 Lysinresten wurde die Wagner et al., 1991b, beschriebene Methode eingesetzt.

c) Herstellung von EGF-Polylysin-Konjugaten

1 mg EGF (Epidermal Growth Factor, Sigma, St. Louis, Cat. No. E-4127) wurde durch Gelfiltration (Sephadex G-10) mit HBS als Elutionspuffer gereinigt. 135 nmol (0.8 mg) Epidermal Growth Factor (EGF) in 1.5 ml HBS wurden mit einer 15 mM ethanolischer Lösung von SPDP (1.2 pmol) behandelt. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurde das modifizierte Protein über eine Sephadex G-10 Säule gelfiltriert, wobei 70 nmol EGF, modifiziert mit 50 nmol Dithiopyridinlinker, erhalten wurde. Das modifizierte Protein wurde mit 3- Mercaptopropionat-modifiziertem Polylysin (50 nmol, durchschnittliche Kettenlänge 290 Lysinmonomere, modifiziert mit 150 nmol Mercaptopropionat-Linker) in insgesamt 1 ml HBS unter Argonatmosphäre reagieren gelassen. Konjugate wurden mittels Gelpermeationschromatographie auf einer Superdex 75 Säule (Pharmacia) isoliert (Puffer: 0.5 M Natriumchlorid). Die Produktfraktion enthielt ein Konjugat, bestehend aus 20 nmol Streptavidin und 25 nmol Polylysin.

d) Herstellung von Streptavidin-Polylysin-Konjugaten

Die Kopplung von Streptavidin mit Polylysin wurde nach der von Wagner et al., 1990, und in der EP-A1 388 758 für die Herstellung von Transferrin-Polylysin- Konjugaten beschriebenen Methode durchgeführt.

79 nmol (4.7 mg) Streptavidin in 1 ml 200 mM HEPES pH 7.9 und 300 mM NaCl wurden mit einer 15 mM ethanolischen Lösung von SPDP (236 nmol) behandelt. Nach 1.5 h bei Raumtemperatur wurde das modifizierte Protein über eine Sephadex G-25 Säule gelfiltriert, wobei 75 nmol Streptavidin, modifiziert mit 196 nmol Dithiopyridinlinker, erhalten wurde. Das modifizierte Protein wurde mit 3-Mercaptopropionat-modifiziertem Polylysin (75 nmol, durchschnittliche Kettenlänge 290 Lysinmonomere, modifiziert mit 190 nmol Mercaptopropionat-Linker) in 2.6 ml 100 mM HEPES pH 7.9, 150 mM NaCl unter Argonatmosphäre reagieren gelassen. Konjugate wurden mittels Kationenaustauschchromatographie auf einer Mono S HR5- Säule (Pharmacia) isoliert. (Gradient: 20-100% Puffer. Puffer A: 50 mM HEPES pH 7.9; Puffer B: Puffer A plus 3 M Natriumchlorid. Die Produktfraktion eluierte bei einer Salzkonzentration zwischen 1.2 M und 1.7 M. Dialyse gegen HBS (20 mM HEPES pH 7.3, 150 mM NaCl) ergab ein Konjugat, bestehend aus 45 nmol Streptavidin und 53 nmol Polylysin.

e) Herstellung von biotinyliertem, inaktiviertem Adenovirus i) Adenovirus dl312-Präparationen

Es wurde der von Jones und Shenk, 1979, beschriebene Adenovirus-Stamm dl312, der eine Deletion in der EIa- Region aufweist, verwendet. Die Vermehrung des Virus wurde in dem E1a-trans-komplementierenden Zellinie 293 durchgeführt, wobei die Herstellung in großem Maßstab durchgeführt wurde, wie von Davidson und Hassell, 1987, beschrieben. Das gereinigte Virus wurde in Lagerpuffer (100 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.1% BSA, 50% Glyzerin) oder in HBS/40% Glyzerin aufgenommen und Aliquots bei -70° C aufbewahrt. Die Bestimmung der Virion-Konzentration wurde mittels UV- spektrophotometrischen Analyse der extrahierten genomischen Virus-DNA durchgeführt (Formel: eine optische Dichteeinheit (OD, A₂₆₀) entspricht 10¹² Viruspartikeln/ml; (Chardonnet und Dales, 1970)).

ii) Adenovirus dl1014-Präparation

Das Adenovirus dl1014, beschrieben von Bridge und Ketner, 1989, wurde in der Zellinie W162, die von der Zellinie Vero (ATCC No. CCL81) abgeleitet ist und deren Herstellung von Weinberg und Ketner, 1983, beschrieben wurde, propagiert. Die Herstellung in größerem Maßstab, Reinigung und Virionkonzentrationsbestimmung wurden durchgeführt, wie für dl312 beschrieben.

iii) Biotinylierung von Adenovirus

2.4 ml einer gelfiltrierten (Sephadex G-25 PD10, Pharmacia) Lösung von Adenovirus dl312 (ca. 10¹¹ Partikel) in 150 mM NaCl / 5 mM HEPES, pH 7.9 / 10% Glycerin, wurde mit 10 µl (10 nmol) einer 1 mM Lösung von NHS-LC-Biotin (Pierce 21335) versetzt. Nach 3 h bei Raumtemperatur wurde der Biotin-modifizierte Virus durch Gelfiltration (wie oben) vom überschüssigen Reagens abgetrennt. Die Lösung wurde durch Zugabe von Glycerin auf eine Glycerinkonzentration von 40% gebracht (Gesamtvolumen 3.2 ml) und bei -25°C gelagert. Die Biotinylierung des Virus konnte in einem qualitativem Nachweis nach Tropfen von verschiedenen Verdünnungen auf Cellulose-Nitrat Membran nachgewiesen werden: nach Trocknen bei 80°C / 2 h im Vakuumtrockenschrank, Blocken mit BSA, Inkubieren mit Streptavidin-konjugierter Alkalischer Phosphatase (BRL), Waschen und 1 h Inkubation mit der Entwicklungslösung NBT/X-Phosphat (Nitroblau- Tetrazolium Salz/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, Toluidin-Salz; Boehringer Mannheim) wurde eine positive Farbreaktion gefunden.

Bei der Biotinylierung von Adenovirus dl1014 wurde von 15 ml Adenoviruspräparation (1.2 × 10¹² Partikel pro ml) ausgegangen, die mit 150 µl, 1 mM NHS-LC-Biotin behandelt wurden. Nach 3 h bei Raumtemperatur wurde gegen 1 l HBS plus 40% Glyzerin bei 4°C über Nacht dialysiert, dann wurde der Puffer durch frischen ersetzt und eine zweite Dialyse durchgeführt. Es wurde eine Viruspräparation mit einem Titer von ca. 1.2 × 10¹² Partikeln pro ml erhalten.

iv) Inaktivierung von biotinyliertem Adenovirus mit 8- Methoxypsoralen

Je 200 µl biotinylierte Viruspräparation wurden in zwei Vertiefungen einer 1.6 cm Gewebskulturplatte gegeben. Zu jeder Probe wurden 2 µl (33 mg/ml) 8-Methoxypsoralen (Sigma, Katalog Nr. M-3501, gelöst in DMSO) gegeben, die Schale auf Eis gestellt und 10 min lang mit einer UV-Lampe (365 nm; UVP TL-33 Lampe) bestrahlt, wobei der Abstand der Probe vom Filter 4 cm betrug. Nach der Bestrahlung wurden die zwei Proben vereinigt und gelfiltriert (G50, Nick-Säule, Pharmacia), wobei die Säule mit 40% Glycerin in HBS vorequilibriert worden war.

Die Inaktivierung von biotinyliertem Adenovirus dl1014 wurde durchgeführt, indem 4 ml Viruspräparation (1 × 10¹² Viruspartikel) mit 40 µl 8-Methoxypsoralen (33 µg/µl, in DMSO) versetzt wurden. Die Proben wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und in 12 × 300 µl Kulturschalen gegeben, auf Eis gestellt und 25 min lang, wie oben beschrieben, UV-bestrahlt. Anschließend wurde eine Gelfiltration (in zwei Portionen) über eine G-25 PD10 Säule, mit HBS/40% Glyzerin, durchgeführt. Es wurden 4.5 ml Viruspräparation mit einem Titer von 9.4 × 10¹¹ Partikel pro ml erhalten.

f) Herstellung von Transfektionskomplexen

Die ternären Komplexe wurden in drei Schritten hergestellt. Im ersten Schritt wurde biotinyliertes Adenovirus in 100 µl HBS mit streptavidinyliertem Polylysin (StreptpL) in 100 µl HBS gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Daraufhin wurden 6 µg Plasmid DNA in 150 µl HBS beigegeben, gut gemischt und weitere 30 min inkubiert. Abschließend wurde Polylysin- modifiziertes humanes Transferrin (TfpL) in 150 µl HBS beigegeben, gründlich gemischt und 30 min inkubiert. (Die Mengen für Adenovirus, StreptpL und TfpL werden jeweils bei den einzelnen Beispielen angegeben.) Das Verhältnis zwischen Plasmid DNA und Polylysin- Konjugaten wurde in Hinblick auf Elektroneutralität in den endgültigen Komplexen berechnet. Für die Transfektion wurden die Komplexe auf die Zellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml Kulturmedium ohne FCS aufgebracht. Nach 4 h Inkubation bei 37°C wurde das Medium entfernt und frisches, Serum enthaltendes Kulturmedium beigegeben.

g) Zellen und Kulturmedien i) Maus-Melanomzellen

Die Maus-Melanomzellinie Cloudman 591 (Klon M3) wurde von ATCC (No. CCL 53.1) erworben. Die Zellen wurden in 6 cm Plastikschalen oder T25 Kulturflaschen, beschichtet mit 0.1% Gelatine, in Ham′s F10 Medium, enthaltend 12.5% Pferdeserum, 2.5% FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika, gezüchtet.

ii) Mausfibroblasten

Primäre Mausfibroblasten wurden wie folgt aus DBA/2 Mäusen isoliert: 4 Wochen alte DBA/2 Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet und in 70% Ethanol getaucht. Die Muskeln wurden unter sterilen Bedingungen von den hinteren Gliedmaßen entfernt und mit PBS gewaschen. Die Proben wurden in Stücke kleiner als 2 mm zerteilt und überschüssiges PBS entfernt. Dann wurden die Gewebsfragmente 3 × mit 5 ml PBS, enthaltend 0.25% Trypsin (aus Schweinepankreas, Sigma, Katalog Nr. T-2904), 0.1% Collagenase (Typ XI, Sigma, Katalog Nr. C-9407), 0.1% BSA (Fraktion V, Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 735 094), gewaschen und 30 min unter Schwenken bei 37°C inkubiert. Daraufhin wurden die Gewebsfragmente 5 min lang absetzen gelassen, und der Überstand, der die freigesetzten Zellen enthielt, wurde mit 5 ml DMEM, enthaltend 20% FCS, vermischt. Das nicht-dissoziierte Material wurde weitere 30 min lang verdaut und der Überstand, wie oben beschrieben, gesammelt. Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis das gesamte Material dissoziiert war. Die vereinigten Überstände wurden 15 min bei 500 × g zentrifugiert, das Zellpellet in DMEM, enthaltend 20% FCS, resuspendiert und die Zellen in Kulturflaschen ausgesät. Nach 30 min wurden die nicht adhäsierten Zellen abgesaugt und frisches Medium zugegeben.

iii) Humane Melanomzellen

Primäre humane Melanomzellen wurden aus chirurgisch entfernten Melanomen isoliert. Die Tumore wurden mechanisch (mit Pinzette und chirurgischem Messer) in Gegenwart von RPMI 1640 Kulturmedium, enthaltend 5% FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika, in kleine Fragmente zerteilt. Dann wurden die Gewebsfragmente vorsichtig mit dem Kolben einer Spritze durch ein Metallsieb gedrückt. Daraufhin wurde das Material mehrere Male durch Zentrifugation und Resuspension gewaschen, und die freigesetzten Zellen wurden in T25 Kulturflaschen ausgesät.

iv) Humanfibroblasten

Nach der chirurgischen Entfernung wurden Hautbiopsien in 4°C DMEM, enthaltend 10% FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika, gegeben. Die Biopsien wurden in einer Gewebekultureinrichtung ausgiebig mit Pinzette und chirurgischem Messer im laminaren Luftstrom in sterilen 6 cm Plastikschalen zerkleinert. Dann wurden 3 ml DMEM, enthaltend 20% FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika beigegeben, und die Kultur in einen 37°C Brutschrank gegeben. Nach 10 Tagen wurde das Medium durch DMEM, enthaltend 10% FCS, ausgetauscht. Dann wurde das Medium weiter 2 × wöchentlich gewechselt. 4 Wochen nach Beginn der Kultur wurden die Zellen, die aus den Gewebsfragmenten herausgewachsen waren, trypsinisiert und für die Transfektion in neue Kulturschalen ausplattiert.

v) KB-Zellen

Die humane epidermoide Karzinomzellinie KB wurde von ATCC (No. CCL 17) erworben. Die Zellen wurden in 6 cm Plastikschalen in MEM, 10% FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika, gezüchtet.

h) Bestimmung der Genexpression i) Luciferase-Assay

Die Herstellung von Zellextrakten, die Standardisierung des Proteingehalts sowie die Bestimmung der Luciferaseaktivität wurden durchgeführt, wie von Zenke et al., 1990, Cotten et al., 1990, bzw. in der EP 388 758 beschrieben.

ii) IL-2 Assay

Die Expression von Interleukin-2 wurde mit Hilfe eines Bioassays bestimmt, wie von Karasuyama und Melchers, 1988, beschrieben. Zusätzlich wurde die IL-2 Produktion unter Verwendung des IL-2 ELISA-Kits von Becton Dickinson (Katalog Nr. 30032) nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt.

iii) IFN-γ-Assay

Die Expression von Maus-IFN-γ wurde unter Verwendung des IFN-γ ELISA "Intertest-γ" (Genzyme, Katalog Nr. 1557-00) durchgeführt.

j) Testung von Komplex-Komponenten

Um die Aussagekraft von Experimenten hinsichtlich Internalisierungsfähigkeit von Liganden oder Effizienz von DNA-Konstrukten zu testen, wurden in Vorversuchen Transfektionsversuche mit verschiedenen Viruspräparationen durchgeführt. Diese Versuche haben gezeigt, daß die diesbezüglich mit dl312 erhaltenen Ergebnisse auf Psoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus dl312 und auf (Psoralen/UV-inaktiviertes) Adenovirus dl1014 übertragen werden können. In einigen Versuchen wurde daher stellvertretend dl312 verwendet.

Beispiel 1 Gentransport in primäre humane Melanomzellkulturen

Primäre humane Melanomzell-Isolate, die von zwei verschiedenen Patienten erhalten worden waren (HMM-1 und HMM-2) wurden nach verschiedenen Zeitintervallen nach Kulturbeginn mit Komplexen transfiziert, die folgende Komponenten enthielten: 1.7 × 10¹⁰ Adenoviruspartikel dl312, 100 ng StreptpL, 6 µg pCMVL- DNA, 7 µg TfpL. 24 h nach der Transfektion wurde die Luciferaseexpression bestimmt. Die Expression wurde auf der Grundlage des Proteingehalts der Zellysate auf 1 × 10⁶ Zellen standardisiert. Das Ergebnis dieser Transfektionsversuche ist in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 2 Bestimmung der Liganden, die bei der Aufnahme von Gentransferkomplexen beteiligt sind

Primäre humane Melanomzell-Isolate der Bezeichnung HMM- 1 wurden mit 1.7 × 10¹⁰ Adenoviruspartikeln dl312, 100 ng StreptpL, 6 µg pCMVL-DNA, 7 µg TfpL, 2 Wochen nach Beginn der Kultur transfiziert. Parallel dazu wurde die Transfektion in Gegenwart eines 50 molaren Überschusses von freiem, eisenbeladenem Transferrin als Konkurrent um die Internalisierung der TfpL-DNA- Adenovirus-Komplexe durchgeführt. Als Alternative wurden Transfektionskomplexe hergestellt, in denen das TfpL durch nicht konjugiertes pL ersetzt wurde (pL). Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 2 dargestellt. Es zeigte sich, daß der Zusatz von freiem Transferrin die Menge der Luciferaseexpression verringert, was darauf hindeutet, daß die Komplexe einerseits, zumindest teilweise, durch Bindung an den Transferrinrezeptor aufgenommen werden. Andererseits deutet jedoch die noch immer beträchtliche Genexpression, die in Gegenwart von freiem Transferrin gesehen wird, darauf hin, daß auch die Bindung an die Adenovirusrezeptoren einen größeren Beitrag leistet.

Beispiel 3

Einfluß der Inaktivierung von Adenovirus dl312 mit Psoralen/UV auf die Langzeit-Toxizität in transfizierten primären Humanmelanomzellen 3 × 10⁵ HMM-1 primäre humane Melanomzellen pro 6 cm Petrischale wurden mit Komplexen transfiziert, die bestanden aus 1.2 × 10¹⁰ Adenoviruspartikeln dl312, 1.200 ng StreptpL, 6 pg pCMVL und 6.6 µg TfpL oder 7.5 × 10⁹ Psoralen/UV/inaktivierten Adenoviruspartikeln dl312 (dl3l2 PI), 600 ng StreptpL, 6 µg pCMVL und 6.6 µg TfpL (die optimale Menge von StreptpL für die verschiedenen Viren war in Vorversuchen mittels Titration ermittelt worden). Nach Tag 1, Tag 3 und Tag 7 nach der Transfektion wurde die Luciferaseexpression pro 3 × 10⁵ Zellen gemessen. Der Effekt der Psoralen/UV-Inaktivierung auf die Genexpression ist in Fig. 3 dargestellt. 7 Tage nach der Transfektion war eine starke Verringerung der Genexpression zu beobachten, die auch mit schweren zytopathischen Veränderungen in dieser Kultur korrelierte. Die Transfektion der Zellen mit Psoralen/UV-inaktiviertem Adenovirus verringerte die zytopathischen Veränderungen signifikant und führte am 7. Tag zu 10fach höheren Expressionswerten als das nichtinaktivierte Virus.

Beispiel 4 Bestimmung der Langzeitzytotoxizität von Adenoviren

Fibroblasten, die aus einem malignen Melanom stammen, wurden mit Kombinationskomplexen, die entweder Adenovirus dl312, Psoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus dl312 oder Adenovirus dl1014 enthielten, transfiziert.

Die Zellen wurden mit Komplexen transfiziert, die folgende Komponenten enthielten: 6 µg pCMVL-DNA, 0.8 µg StreptpL, 6.8 µg TfpL und 20 µl Adenovirus dl312- Präparation (0.25 × 10¹² Viruspartikel pro ml) oder 40 µl Psoralen/UV-inaktivierter Adenovirus dl312- Präparation (0.13 × 10¹² Viruspartikel pro ml) oder 3 µl Adenovirus dl1014-Präparation (4.1 × 10¹² Viruspartikel pro ml). 100 µl Aliquots dieser Mischung bzw., um die in Fig. 4 angegebenen Virus:Zell- Verhältnisse zu erhalten, eine 1 : 3 Serienverdünnung dieser Mischung wurden auf 3 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung einer Zellkulturplatte (24 Vertiefungen pro Platte) in 500 µl RPMI + 2% FCS aufgebracht. Nach 2 h bei 37°C wurde das Medium durch 2 ml RPMI + 10% FCS ersetzt. Nach 8 Tagen wurde das Medium entfernt und die Zellen 5 min lang mit 4% Formaldehyd und 150 mM NaCl fixiert und dann 10 min lang mit 0.1% Kristallviolett in 2% Ethanol gefärbt. Daraufhin wurden die Zellen 2 × mit PBS, 1 × mit Wasser gewaschen und photographiert. Das Ergebnis des Zytotoxizitätstests ist in Fig. 4 gezeigt: Bei einem Standardverhältnis von Virus:Zellen von 10.000:1 ist Adenovirus dl312 zytotoxisch; diese Zytotoxizität wird durch Psoralen/UV-Behandlung des Virus abgeschwächt. Dieselbe Menge Adenovirus dl1014 zeigte keine zytotoxische Wirkung auf die Zellen.

Beispiel 5 Wirkung der Bestrahlung der Tumorzellen auf die Genexpression

3 × 10⁵ primäre humane Melanomzellen der Bezeichnung HMM-5 bzw. der Maus-Melanomzellinie M-3 wurden mit Komplexen behandelt, die 3 × 10⁹ Psoralen/UV- inaktivierte Adenoviruspartikel dl1014, 600 ng StreptpL, 6 µg pCMVL und 6.8 µg TfpL enthielten. 6 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit Dosen im Bereich von 0-100 Gy bestrahlt. 48 h nach der Bestrahlung wurde die Expression des transfizierten Luciferasegens gemessen. Die in Fig. 5 angegebenen Werte stellen die Luciferaseexpression in Lichteinheiten pro µg Protein im Zellysat dar.

Beispiel 6 Einfluß der Plasmidkonzentration auf die Genexpression

3 × 10⁵ M-3 Maus-Melanomzellen wurden mit Komplexen, bestehend aus 8.6 × 10⁹ Psoralen/UV-inaktivierten Adenoviruspartikeln dl1014, 400 ng StreptpL, 6 µg DNA und 5.1 µg TfpL transfiziert. Die Komplexe wurden mit Plasmidkombinationen (pCMVL/pSP = pSP65 Boehringer Mannheim; pSVEmu-INF-γ; IFN-Y/pBCMGneo-mIL-2) bei verschiedenen Mengenverhältnissen der Plasmide transfiziert. Die Mengenverhältnisse der Plasmide sowie die erhaltenen Genexpressionswerte sind Tabelle I sowie Fig. 6 (Luciferaseexpression) und Fig. 7 (IFN-γ/IL-2) entnehmbar.

Beispiel 7 Verlust der Tumorigenizität transfizierter Maus- Melanomzellen

M-3 Maus-Melanomzellen (3 × 10⁵ Zellen pro 6 cm Petrischale) wurden mit 2 × 10⁹ Adenoviruspartikeln dl312, 250 ng StreptpL, 6 µg Plasmid-DNA (enthaltend die Maus-IL-2- oder die Maus-IFN-γ-Sequenz) und 7.5 µg TfpL transfiziert. 4 h nach der Transfektion wurden die Zellen 2 × mit Ham′s F10 Kulturmedium ohne Serum gewaschen. Anschließend wurden je 1 × 10⁵ Zellen subkutan in den Rücken von 6 anästhesierten DBA/2 Mäusen verabreicht. Zur Kontrolle erhielt eine weitere Gruppe von 6 DBA/2 Mäusen 1 × 10⁵ M-3 Zellen, die nicht transfiziert worden waren. Das Tumorwachstum an der Injektionsstelle wurde wöchentlich kontrolliert. Fig. 8 zeigt den Verlauf der Tumorbildung.

Beispiel 8 Induktion einer systemischen Immunantwort gegen Melanom durch Immunisierung mit zytokintransfizierten, bestrahlten Tumorzellen

a) M-3 Melanomzellen (3 × 10⁵ Zellen pro T25 Kulturflasche) wurden mit 3 × 10⁹ Psoralen/UV aktivierten Adenoviruspartikeln dl1014, 6 ng StreptpL, 6 µg IL-2 Plasmid-DNA oder pSP Plasmid-DNA, die kein cDNA Insert enthält und daher nicht zur Expression eines Genproduktes in den transfizierten Zellen führt, und 6.8 µg TfpL transfiziert. 4 h nach der Transfektion wurden die Transfektionskomplexe entfernt und frisches, Serum enthaltendes Medium hinzugefügt. Dann wurden die Zellen 6 h nach der Transfektion mit Röntgenstrahlen einer Dosis von 20 Gy bestrahlt und weitere 18 h kultiviert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und 2 × mit Earl′s gepufferter Salzlösung (EBSS) gewaschen und die Kultur auf eine Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro ml eingestellt. Anästhesierte DBA/2 Mäuse wurden mit 1 × 10⁵ Zellen, die subkutan in den Rücken verabreicht wurden, immunisiert. Parallel dazu wurde eine Gruppe von 6 Mäusen mit nichttransfizierten M-3 Zellen immunisiert, die bestrahlt und weiter behandelt worden waren wie die transfizierten Zellen. Eine Woche nach den ersten Immunisierungen erhielten die Mäuse Boosterimmunisierungen mit Zellzubereitungen, wie sie für die ersten Immunisierungen verwendet worden waren. Nach einer weiteren Woche wurden die Tiere der hochtumorigenen Dosis von 1 × 10⁵ M-3 Zellen ausgesetzt, die an einer Stelle appliziert wurde, die von den früheren Immunisierungsstellen entfernt lag. Zusätzlich wurden 4 Mäuse, die nicht immunisiert worden waren, auf gleiche Art den tumorigenen Zellen ausgesetzt. 8 Wochen nach der Tumorzellimplantation hatten alle (4/4) nicht immunisierten Tiere Tumore entwickelt, während alle Mäuse, die mit den bestrahlten, IL-2 transfizierten M-3 Zellen immunisiert worden waren, frei von Tumoren waren (0 Tumore in 5 Tieren). Die Mäuse, die mit bestrahlten, nicht transfizierten M-3 Zellen und mit bestrahlten M-3 Zellen, die mit einem "leeren" Plasmid (pSP) transfiziert worden waren, waren nur teilweise geschützt (4 von 6 Mäusen entwickelten Tumore). Die Entwicklung der Tumore in den Tieren ist in Tabelle II und in Fig. 9 zusammengefaßt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Immunisierung von Mäusen mit IL-2 transfizierten, bestrahlten Tumorzellen eine systemische Immunantwort induziert, die die Tiere vor weiterer Tumorentwicklung schützt.

b) In einer weiteren Versuchsreihe wurden die Mäuse nach demselben Immunisierungsprotokoll mit bestrahlten M-3 Zellen behandelt, die mit Komplexen transfiziert worden waren, die 3 × 10⁹ Psoralen/UV-inaktivierte Adenoviruspartikel dl1014, 600 ng StreptpL, a) 6 µg IL- 2 Plasmid pBCMGneo-mIL-2 (IL-2 100%), b) 5.4 µg pSP Plasmid und 0.6 µg IL-2 Plasmid (IL-2 10%), c) 5.4 µg IL-2 Plasmid und 0.6 µg IFN-γ Plasmid (IL-2 90% + IFN-γ 10%) oder d) 5.4 µg pSP Plasmid und 0.6 µg IFN-γ Plasmid (IFN-γ 10%), und 4.7 µg TfpL enthielten. Darüberhinaus wurde eine Gruppe von Mäusen mit bestrahlten M-3 Zellen immunisiert, die transfiziert worden waren mit 3.6 × 10⁹ inaktivierten Adenoviruspartikeln dl312, 600 ng StreptpL, 6 µg IL-2 Plasmid und 4.7 µg TfpL (IL-2 100% dl312). Eine Woche nach der Boosterinjektion wurden den immunisierten Tieren und, zur Kontrolle, auch den nichtimmunisierten Tieren 1 × 10⁵ M-3 Zellen implantiert. Die Entwicklung der Tumore ist in Tabelle III zusammengefaßt.

c) Nach demselben Immunisierungsprotokoll wie in den vorangegangenen Versuchen wurden die Mäuse mit bestrahlten M-3 Zellen behandelt, die transfiziert worden waren mit Komplexen, enthaltend 3 × 10⁹ Psoralen/UV-inaktivierte Adenoviruspartikel dl1014, 600 ng StreptpL, a) 6 µg IL-2 Plasmid = 100% IL-2, b) 5.76 µg pSP Plasmid und 0.24 µg IL-2 Plasmid = 4% IL-2, oder c) 6 µg pSP Plasmid und 4.7 µg TfpL. Die Produktion von IL-2 durch die transfizierten, bestrahlten Zellen wurde am Tag der Immunisierung gemessen: M-3 Zellen, die mit 100% IL-2 Plasmid transfiziert worden waren, produzierten 33.000 Einheiten IL-2 pro 1 × 10⁶ Zellen und 24 h, während M-3 Zellen, transfiziert mit 4% IL-2 Plasmid, 396 Einheiten IL-2 pro 1 × 10⁶ Zellen und 24 h produzierten. Eine Woche nach der Boosterinjektion wurden in die immunisierten Tiere und, zur Kontrolle auch in die nicht-immunisierten Tiere 1 × 10⁵ M-3 Zellen implantiert. Um mehr Information über das Ausmaß der Immunantwort zu bekommen, die durch die Immunisierungen bei Verwendung verschiedener Mengen IL-2 Plasmid induziert wird, wurden weiteren Gruppen von Mäusen 3 × 10⁵ M-3 Zellen bzw. 1 × 10⁶ M-3 Zellen implantiert. Um zu zeigen, daß die Immunantwort tumorspezifisch ist, wurden einer Gruppe von Mäusen die mit 100% IL-2 transfizierten, bestrahlten M-3 Zellen immunisiert worden war, 1 × 10⁵ syngenetische Plattenepithelkarzinomzellen KLN 205 (ATCC No. CRL 1453) implantiert. Die Entwicklung der Tumore ist in Tabelle IV gezeigt.

Beispiel 9 Gentransfer in Zellen einer epidermoiden Karzinomzellinie

KB-Zellen wurden in einer Dichte von 400.000 Zellen pro 6 cm Schalen gezüchtet und mit verschiedenen Komplexen transfiziert, die 2.5 × 10⁹ Adenoviruspartikel dl312, 200 ng StreptpL, 6 µg pCMVL-DNA und wahlweise 3.8 µg Polylysin, 3.8 µ EGF-pL (Menge auf Polylysingehalt bezogen), oder 6 µg TfpL enthielten. Die Komplexe (je 500 µl) wurden mit 1.5 ml Medium entweder mit oder ohne 2% FCS gemischt. In Kompetitionsexperimenten wurden noch je 1 µg EGF zu der Mischung aus Komplexen und Medium zugegeben. Die Komplexe mit Medium wurden zu den Zellen zugegeben. Nach 2 h Inkubation bei 37°C wurde das Medium entfernt und frisches, Serum enthaltendes Medium beigegeben.

Ernten der Zellen nach 24 h und Luciferaseassay gab folgendes Ergebnis (Fig. 10A: Experiment mit 2% FCS, Fig. 10B: Experiment ohne FCS): Fig. 10A: Mit EGFpL wurde ein Wert von 20,845.000 Lichteinheiten erhalten; dieser Wert war erheblich höher als mit TfpL (3,970.000) oder Polylysin (pLys 10,550.000). Im Kompetitionsversuch mit freiem EGF wurde im Gegensatz zu den Experimenten mit TfpL (TfpL+EGF 12,350.000 Lichteinheiten) oder Polylysin (pLys+EGF 14,055.000) die erwartete Verringerung des Signals (EGFpL+EGF 14,150.000) gefunden. Dies zeigt, daß der verstärkte Gentransfer Liganden-spezifisch über den EGF-Rezeptor verläuft. Im Experiment ohne FCS (Fig. 10B) war der Effekt von EGFpL noch ausgeprägter (EGFpL 15,150.000, TfpL 2,000.000, pLys 5,100.000, EGFpL+EGF 5,900.000 Lichteinheiten). Die Expressionswerte beziehen sich auf 50% der Zellen.

Analog wurden KB-Zellen mit Komplexen transfiziert, die 5 × 10⁹ Psoralen/UV-inaktivierte Adenoviruspartikel dl1014 enthielten; es wurden vergleichbare Luciferaseexpressionswerte erhalten.

Beispiel 10 IL-2 Expression unter Verwendung verschiedener Vektoren a) M-3 Zellen

3 × 10⁵ M-3 Zellen wurden mit verschiedenen Plasmidkonstrukten, die als Bestandteil ternärer Komplexe vorlagen, transfiziert. 3 µl Adenovirus dl312 Präparation, 0.3 µl (ca. 200 ng) StreptpL, 6 µg TfpL und 6 µg Plasmid-DNA (BCMGneo-mIL-2, pWS2m, BMGneo-mIL-2 oder pCM2) wurden mit HBS auf ein Gesamtvolumen von 500 µl gebracht.

Für die Versuche mit Psoralen/UV-inaktiviertem Adenovirus dl1014 wurden folgende Transfektionskomplexe eingesetzt: 9 µl Viruspräparation, 600 ng StreptpL, 6 µg TfpL, 6 µg BCMGneo-mIL-2.

Nach den in der Fig. 11 angegebenen Zeitabständen wurde die IL-2 Aktivität bestimmt. Für BCMGneo-mIL-2 wurden außerdem nach 48 Stunden 64.000 Einheiten und nach 28 Tagen 7.128 Einheiten erhalten (nicht in der Figur gezeigt). Für pCM2 wurden nach 48 Stunden 3.227 Einheiten und nach 28 Tagen 950 Einheiten erhalten, für BMGneo-mIL-2 nach 24 Stunden 396 Einheiten, nach 48 Stunden 604 Einheiten, nach 7 Tagen 297 Einheiten und nach 14 Tagen 264 Einheiten (nicht in der Fig. gezeigt).

b) Fibroblasten

Primäre humane Fibroblasten wurden wie in a) mit IL-2 Konstrukten transfiziert und die IL-2 Expression an den in der Fig. 12 angegebenen Tagen nach der Transfektion bestimmt. Die Zusammensetzung des Transfektionsmediums war für BCMGneo-mIL-2 dieselbe wie für M-3 Zellen; ein identischer Transfektionskomplex wurde für BMGneo-mIL-2 hergestellt.

Beispiel 11 Melanomzellen, die auf ihrer Oberfläche HSA exprimieren, stimulieren eine Immunantwort mit Schutzwirkung gegen nicht-modifizierte Tumorzellen

M3-Zellen wurden in Ham′s F12-Medium plus 12.5% Pferdeserum, 2.5% FCS auf Gelatine-überzogenen Plastikschalen gezüchtet. 24 h vor der Transfektion wurden die Zellen zu 3 × 10⁵ in eine 25 cm² Kulturflasche plattiert. Die Transfektionskomplexe für diese Zellmenge wurden hergestellt, indem 9 µl biotinyliertes, Psoralen-UV-inaktiviertes Adenovirus dl1014 (1.4 × 10¹² Partikel/ml), 5.2 µg Transferrin-Polylysin, 800 ng Streptavidin- Polylysin und 6 µg der jeweiligen Plasmid-DNA (pSP, pWS2m in Kombination mit pSP, pHSA in Kombination mit pSP bzw. IL-2 in Kombination mit pHSA) in einem Gesamtvolumen von 500 µl vereinigt wurden. Dieses Volumen wurde jeder Kulturflasche in 2 ml Ham′s F12 Medium plus 12.5% Pferdeserum/2.5% FCS zugegeben. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37°C wurden das Medium durch frisches Medium ersetzt und die Zellen bestrahlt (20 Gy). 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert, 2 × mit HBSS (Hank′s Buffered Saline Salts) gewaschen, gezählt und zu 100.000 Zellen in 100 µl HBSS wieder aufgenommen. Diese Zellen bildeten das Vakzin, das innerhalb von 60 min für die Injektion in die Empfängermäuse verwendet wurde.

Die Mäuse wurden injiziert, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben. Es wurden im Abstand von einer Woche zwei getrennte Vakzininjektionen mit je 100.000 Zellen an zwei verschiedenen Stellen des Rückens durchgeführt. Eine Woche nach der zweiten Injektion wurden die Mäuse mit 300.000 nicht- modifizierten, nicht-bestrahlten M3-Zellen in 300 µl HBSS an einer dritten Stelle des Rückens injiziert. Die Entwicklung der Tumore wurde in einwöchigen Abständen kontrolliert.

Fig. 13 zeigt das Ergebnis dieser Versuche (auf der Abszisse ist die Anzahl der Tage angegeben, auf der Ordinate die Tumorgröße in mm³. Die Zahlen neben den Endpunkten bedeuten die Anzahl der Mäuse mit Tumoren im Vergleich zur Gesamtzahl der Mäuse in jeder Gruppe. pSP: 6 µg pSP; 80 IL-2/20 pSP: 4.8 µg pWS2m plus 1.2 µg pSP; 20 HSA/80 pSP: 1.2 µg pHSA plus 4.8 µg pSP; 80 IL-2/20 HSA: 4.8 µg pWS2m plus 1.2 µg pHSA): Die Impfung mit bestrahlten, mit dem Leervektor pSP transfizierten M3-Zellen schützte nicht gegen Tumorwachstum; in 4 von 6 Mäusen wurden beträchtliche Tumormassen gebildet. Die IL-2 produzierenden Zellen bewirken einen nur mäßigen Rückgang der Tumore bei allen Mäusen in der Gruppe (3/3), die Tumore entwickelte. (Dieser Effekt ist darauf zurückzuführen, daß die Versuchsbedingungen im Hinblick auf die Testung der vorteilhaften Wirkung von HSA gewählt wurden, indem Mäuse eingesetzt wurden, denen die dreifache Dosis von Tumorzellen bei einer verringerten Dosis von IL-2-DNA verabreicht wurde.) Im Gegensatz dazu zeigten die Mäuse, die mit HSA exprimierenden M3-Zellen geimpft word 33216 00070 552 001000280000000200012000285913310500040 0002004326821 00004 33097en waren, ein stark unterdrücktes Tumorwachstum. Die Mäuse, die eine Impfung mit sowohl HSA als auch IL.-2 exprimierenden M3-Zellen erhalten hatten, entwickelten mit stark verminderter Häufigkeit Tumore (2 von 6), und die gebildeten Tumore waren klein im Vergleich zu den Kontrolltumoren (Impfung mit pSP-transfizierten Zellen); die durchschnittliche Größe betrug 18 mm³ im Vergleich zu 1149 mm³.

Beispiel 12

Melanomzellen, die auf ihrer Oberfläche das Rabies- Neoantigen exprimieren, stimulieren eine Immunantwort mit Schutzwirkung gegen nicht modifizierte Tumorzellen.

M3-Zellen wurden, wie im Beispiel 11 beschrieben, behandelt und transfiziert. Lediglich die Einwirkungszeit der Transfektionskomplexe, die genauso wie im Beispiel 11 hergestellt wurden (6 µg Plasmid-DNA) auf die Zellen betrug vier anstelle von zwei Stunden. Die Injektionen in die Mäuse wurden ebenfalls analog zu Beispiel 11 durchgeführt, mit dem Unterschied, daß der Abstand zwischen den Injektionen von einer auf zwei Wochen verlängert wurde und das Injektionsvolumen immer 100 µl betrug.

Fig. 14 zeigt das Ergebnis der Versuche, der Aufbau der Graphik ist analog zu Fig. 13 gehalten. Die pSP-Negativkontrolle zeigt das erwartete, beträchtliche Tumorwachstum. Die Positivkontrolle, bei der nur pWS2m (= 100% Il-2) transfiziert wurde, zeigt vollständigen Schutz; die transfizierten Zellen produzierten in den 24 h nach der Transfektion und vor der Injektion 45.000 Il-2 Einheiten/10⁶ Zellen. Bei der Gruppe Mäuse, die nur 50% pWS2m erhalten hatten (mit 50% Leervektor pSP) war ein unvollständiger Schutz zu beobachten. Dieser wurde signifikant verbessert, wenn anstelle des Leervektors das Rabiesexpressionsplasmid pWS-RABIES cotransfiziert wurde. Ein schwaches Tumorwachstum zwischen Woche 2 und 4 ging ab Woche 5 zurück.

Beispiel 13 Vergleich verschiedener Methoden zur Inaktivierung von Adenoviren

Es wurden im Rahmen dieses Beispiels verschiedene Methoden angewendet und hinsichtlich der Reduktion des Virustiters und der Fähigkeit der inaktivierten Viren, den Gentransfer über Rezeptor-vermittelte Endozytose zu verstärken, verglichen. Ferner wurde untersucht, welche Virusgene durch die Inaktivierung ausgeschaltet werden.

a) Testung der Inaktivierung von Adenoviren mit 8-Methoxypsoralen i) Inaktivierung der Viren

Proben von biotinyliertem Adenovirus dl1014 (300 µl) in HBS/40% Glycerin wurden in die 4 Vertiefungen einer Zellkulturschale (NUNC, Katalog Nr. 176740) gegeben. Aliquots von 33 mg/ml 8-Methoxypsoralen in DMSO wurden den Viren beigegeben, so daß die gewünschten Endkonzentrationen erhalten wurden. Die Proben wurden mit geschlossenem Deckel auf Eis gegeben und wie unter e) iv) bei den Methoden beschrieben, 25 min lang UV bestrahlt, wobei die Position der Probenplatte alle 10 min verändert wurde, um Schatten zu vermeiden. Nicht reagiertes Psoralen wurde mittels Gelfiltration entfernt: dazu wurde die Virus/Psoralenprobe (2 ml) auf eine Pharmacia PD-10-Gelfiltrationssäule (vorequilibriert mit 30 ml HBS/40% Glycerin) aufgebracht. Die Probe mit 0.5 ml HBS/40% Glycerin in die Säule gewaschen und das Virus mit HBS/40% Glycerin eluiert, wobei die ersten 400 µl verworfen und die folgenden 4 ml in 0.5 ml Fraktionen gesammelt wurden. Um die Virusfraktionen zu identifizieren, wurde ein Ninhydrinassay durchgeführt, die positiven Fraktionen vereinigt, die Proteinkonzentration gemessen und das Virus in Aliquots bei -70°C tiefgefroren.

ii) Titration von 8-Methoxypsoralen (CPE gegenüber Gentransfer)

Die Titrationen wurden durchgeführt, um die optimale Psoralenkonzentration festzustellen, die bei vollständiger Virusinaktivierung die DNA- Transportkapazität des Virus nicht beeinträchtigt. (Es gibt Berichte, wonach eine schlechte Inaktivierungsleistung erzielt wird, wenn Psoralene in Konzentrationen nahe der Sättigung eingesetzt werden, während wesentlich bessere Leistungen bei niedrigeren Konzentrationen erzielt werden. Dies könnte entweder auf ein Kristallisationsphänomen, welches die Verbindung aus der Lösung entfernt, oder auf einen Filtereffekt zurückgeführt werden, letzteres weil hohe Konzentrationen von nicht-gebundenen Verbindungen die UV-Strahlung absorbieren und somit die Aktivierung von DNA-gebundenem Material durch UV blockieren.)

Der CPE-Assay ("Zytopathischer Endpunktassay" oder "Cytopathic Effect Assay"; Precious und Russell, 1985) zur Bestimmung des Virustiters wurde unter Verwendung von W162-Zellen, die zu 50.000 Zellen/Vertiefung auf Platten mit 24 Vertiefungen ausgebracht wurden, durchgeführt. Die Serienverdünnungen der Proben wurden in DMEM/2% hitzeinaktiviertes Pferdeserum vorgenommen und das verdünnte Virus in 500 µl DMEM/2% hitzeinaktiviertes Pferdeserum auf die Zellen aufgebracht. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37°C wurde das Medium durch frisches DMEM/10% FCS ersetzt. Nach 4 bis 5 Tagen bei 37°C wurden die Zellen mit Formaldehyd fixiert und mit Kristallviolett gefärbt.

Die Eignung der Inaktivierungsmethode im Hinblick auf den Gentransfer wurde anhand des Imports des Luciferasegens in K562-Zellen (ATCC No. CCL 243) getestet. Die Transfektionen mit Hilfe von Kombinationskomplexen wurden durchgeführt, wie in der WO 93/07283 beschrieben, wobei 9 µl Adenovirus dl1014 (1.4 × 10¹² Partikel/ml) bzw. bei Inaktivierung mit β-Propiolacton 13.5 µl (9.3 × 10¹¹ Partikel/ml), 800 ng Streptavidin-Polylysin, 6 µg pCMVL-DNA und 5.2 µg Transferrin-Polylysin in 500 µl HBS verwendet wurden (die Komplexe wurden hergestellt, wie bei den Methoden unter f) beschrieben). Außerdem wurde der relative Titer jeder Viruszubereitung mittels CPE-Assay auf W162-Zellen bestimmt. Das Ergebnis dieser Titrationen ist in Fig. 15 dargestellt: die Ziffern links in der Figur beziehen sich auf den relativen Virustiter (gefüllte Dreiecke), die Ziffern rechts in der Figur beziehen sich auf Luciferaselichteinheiten (offene Quadrate). Auf der Abszisse ist die Konzentration von 8-Methoxypsoralen in mg/ml aufgetragen. Es zeigte sich, daß eine Behandlung des Virus mit 0.11 mg/ml 8-Methoxypsoralen eine Verringerung des Titers hervorruft, die sich von der in Vorversuchen mit einer Konzentration von 0.33 mg/ml verursachten nicht unterscheidet. Die DNA- Transportaktivität wird bei dieser Konzentration beibehalten. Unter den gewählten Bedingungen war eine 8-Methoxypsoralen-Konzentration von 0.033 mg unwirksam. (Die empfindlichere Analyse mittels Plaque-Assay, s. Fig. 19, ergab, daß Konzentrationen von 0.11 und 0.33 mg/ml 8-Methoxypsoralen vergleichbare Abnahmen im Virustiter hervorrufen.)

b) Testung der Inaktivierung von Adenoviren mit 4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen i) Inaktivierung der Viren

Das weniger hydrophobe Psoralenderivat 4′-Aminomethyl- 4,5′,8-trimethylpsoralen ist geladen; es interagiert mit und inaktiviert in der Folge davon einzelsträngige RNA-Viren ebenso wie DNA-Viren und ist zu 5 mg/ml in wäßrigen Lösungen lösbar. Das eingesetzte 4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen wurde von H.R.I. (Katalog Nr. 6) bezogen und zu 5 mg/ml in HBS aufgelöst. Nachdem Aliquots davon den Virusproben beigegeben worden waren, wurden die Inaktivierung des Virus und die Reinigung analog wie für 8-Methoxypsoralen durchgeführt.

ii) Titration von 4′-Aminomethyl-4,5′, 8-trimethylpsoralen (CPE gegenüber Gentransfer)

Die Titrationen wurden durchgeführt, genau wie unter a) ii) für 8-Methoxypsoralen beschrieben. Das Ergebnis dieser Titrationen ist in Fig. 16 dargestellt: die Ziffern links in der Figur beziehen sich auf den relativen Virustiter (gefüllte Dreiecke), die Ziffern rechts in der Figur beziehen sich auf Luciferaselichteinheiten (offene Quadrate). Auf der Abszisse ist die Konzentration von 4′-Aminomethyl- 4,5′,8-trimethylpsoralen in µg/ml aufgetragen. Mit 0.3 und 1 mg/ml 4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen wurden Bedingungen gefunden, die einen Titerabfall von mindestens 5 log hervorrufen, während die Effizienz des DNA-Transfers beibehalten wird. Niedrigere Konzentrationen von 4′-Aminomethyl-4,5′, 8-trimethylpsoralen (<0.1 mg/ml) rufen einen nur mäßigen Abfall des Virustiters hervor. Der Plaque-Assay (s. Fig. 19) zeigte ebenfalls, daß Konzentrationen von ca. 1.0 und 0.3 mg/ml 4′-Aminomethyl-4,5′, 8-trimethylpsoralen Verringerungen des Virustiters hervorrufen, die von den mit 0.11 und 0.33 mg/ml 8-Methoxypsoralen bewirkten nicht unterscheidbar sind. Die Gentransferkapazität des inaktivierten Virus wurde bestimmt, wie unter a) ii) beschrieben. Außerdem wurde der relative Titer jeder Viruszubereitung mittels CPE-Assay auf W162-Zellen bestimmt.

c) Testung der Inaktivierung von Adenoviren mit β-Propiolacton i) Inaktivierung der Viren

Die Virusproben wurden auf 0.3 M HEPES, pH 7.9 eingestellt, bevor die 10fach konzentrierten β-Propiolacton- Lösungen zugegeben wurden. Konzentrierte β-Propiolacton-Lösungen wurden hergestellt, indem β-Propiolacton (Sigma, Katalog Nr. P5648) unmittelbar vor dem Gebrauch mit HBS verdünnt wurde. Es wurden Kontrollversuche durchgeführt, um zu zeigen, daß 0.3 M HEPES, pH 7.9 ausreichend war, um die β-Propiolacton-Behandlung bei 1% abzupuffern. Aliquots von β-Propiolacton wurden bei Raumtemperatur den gepufferten Viruslösungen beigegeben, dann wurden die Virusproben 4 h lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie entweder bei -70°C gelagert oder für die Transfektionsexperimente verwendet wurden.

ii) Titration von β-Propiolacton (CPE gegenüber Gentransfer)

Die Adenoviren wurden 4 h lang bei Raumtemperatur verschiedenen Konzentrationen von β-Propiolacton ausgesetzt. Im übrigen wurden die Versuche durchgeführt, wie für die Psoralenderivate beschrieben. Es zeigte sich (Fig. 17), daß die Behandlung mit 0.3% β-Propiolacton einen Abfall des Virustiters um beinahe 5 log hervorruft, während die DNA- Transportaktivität beibehalten wird. Konzentrationen von 1% und höher bewirken einen noch stärkeren Titerabfall, wobei sich jedoch auch der DNA-Transport verschlechtert. (Die Ziffern links in der Figur beziehen sich auf den relativen Virustiter (gefüllte Dreiecke), die Ziffern rechts in der Figur beziehen sich auf Luciferaselichteinheiten (offene Quadrate). Auf der Abszisse ist die Konzentration von β-Propiolacton in % aufgetragen.)

iii) Gentransferkapazität des Adenovirus nach mehreren β-Propiolacton-Behandlungen bei niedriger Konzentration

Die in ii) beobachtete starke Abnahme der DNA- Transferaktivität mit Konzentrationen zwischen 0.3% und 1% β-Propiolacton ließ vermuten, daß bei der niedrigeren Konzentration eine Modifikation bevorzugt von viralen Nukleinsäuren auftritt, während das Mittel bei den höheren Konzentrationen die Kapsidproteine zu modifizieren und die endosomolytische Aktivität des Virus zu schädigen beginnt. Um die Richtigkeit dieser Vermutung zu prüfen, wurden die Adenoviren mit mehreren Aliquots von niedrigeren (<0.3%) β-Propiolacton- Konzentrationen behandelt, in der Hoffnung, dadurch bevorzugt eine Modifikation der Virus-DNA zu bewirken, ohne das Virusprotein zu schädigen. Dazu wurden Virusproben mit einer Gabe β-Propiolacton zu 0.3%, zwei Gaben β-Propiolacton zu 0.3%, drei Gaben von β-Propiolacton zu 0.2%, vier Gaben von β-Propiolacton zu 0.15% oder mit einer Gabe von β-Propiolacton zu 1% behandelt. Die Gentransferaktivität dieser Viruspräparationen, die in Kombinationskomplexe eingebaut wurden, wie unter F) beschrieben, wurde mit K562-Zellen getestet, wie oben beschrieben. Wie in Fig. 18 gezeigt ist, verursachten außer der 1% Probe alle Behandlungen einen Abfall der Gentransferkapazität von weniger als 1 log. Die Behandlung mit 1% β-Propiolacton verursachte einen Abfall von mehr als 2 log. (Probe 1: nicht-inaktiviertes Virus. Probe 2: Inaktivierung mit 0.11 mg/ml 8-Methoxypsoralen. Probe 3: Inaktivierung mit 0.3% β-Propiolacton. Probe 4: Inaktivierung mit 2 × 0.3% β-Propiolacton. Probe 5: Inaktivierung mit 3 × 0.2% β-Propiolacton. Probe 6: Inaktivierung mit 4 × 0.15% β-Propiolacton. Probe 7: Inaktivierung mit 1% β-Propiolacton. Die Zahlen bei den Balken bedeuten Luciferaselichteinheiten.)

d) Bestimmung der Replikationsfähigkeit inaktivierter Adenoviren mittels Plaque-Assay i) Vergleich der Plaque-Assays von Adenovirus dl1014, inaktiviert mit 8-Methoxypsoralen, β-Propiolacton oder 4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen

Der Plaque-Assay dient einer empfindlicheren Bestimmung der Replikationsfähigkeit des Virus: Adenovirus 5 benötigt das Eindringen von 10 bis 50 Viruspartikeln, um eine infizierte Zelle zu erzeugen. Der im folgenden dargestellte CPE-Assay mißt die Fähigkeit chemisch inaktivierter Viren, eine zytopathische Virusinfektion auszulösen, was aber die Infektion von mindestens 10% der Zielpopulation erfordert, um während der vier Tage, die der Assay dauert, nachgewiesen werden zu können. Dieser Assay erlaubt somit den Nachweis von 50.000 Viruspartikeln. Demgegenüber kann unter optimalen Bedingungen mit Hilfe des Plaque-Assays ein einzelner Plaque nachgewiesen werden, der als Folge des Eindringens von 10 bis 50 Viren entstanden ist; der Test ist also ca. 1.000 × empfindlicher als der CPE- Assay.

Für die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Plaque-Assays wurde die folgende Methode angewendet: W126-Zellen wurden 18 h vor Beginn des Assays zu 500.000 Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen ausplattiert. Dann wurde das Medium entfernt und durch frisches Medium (2% Pferdeserum/DMEM) plus die jeweilige Virusverdünnung ersetzt, wobei das Virus gleichmäßig auf alle Zellen verteilt wurde. Daraufhin wurden die Platten 1.5 h lang bei 37°C inkubiert, wobei die Platte alle 20 min vorsichtig geschwenkt wurde. Inzwischen wurde eine 2X Agaroselösung (2% (2 g/100 ml) SeaPlaque-Agarose niedriger Geliertemperatur (FMC Katalog Nr. 5010), in 5 mM HEPES pH 7.4, vor dem 25 minütigen Autoklavieren pH-eingestellt) auf 70°C erhitzt, um die Agarose zu schmelzen und anschließend bei 37°C equilibriert. Auf ähnliche Weise wurde eine 2X DMEM/10% FCS-Lösung hergestellt (doppelte Konzentration DMEM/doppelte Konzentration Penicillin/Streptomycin/doppelte Konzentration Glutamin/10% FCS (hitzeinaktiviert bei 56°C, 30 min)). Am Ende der 1.5 stündigen Inkubation der Zellen mit dem Virus wurde ein 50 ml Batch einer Überschichtung (25 ml 2X Agarose + 25 ml 2X DMEM/10% FCS in einem 50 ml Falcon-Röhrchen) hergestellt. Die Medium/Virus- Lösung wurde von einer Platte entfernt und je 3.5 ml Überschichtung in jede Vertiefung gegeben. Dann wurden die Platten mindestens 30 min lang ungestört bei Raumtemperatur stehengelassen, um die Agarose zu härten, bevor sie wieder bei 37°C inkubiert wurden. Am sechsten Tag nach der Viruszugabe wurde jede Vertiefung mit weiteren 2-3 ml der Überschichtungslösung überschichtet. Bei dieser Vorgangsweise werden die Plaques normalerweise am siebenten bis zehnten Tag sichtbar. Die Plaques wurden jeweils am vierzehnten bis achtzehnten Tag nach der Infektion gezählt.

Die Testung verschiedener inaktivierter Viruspräparationen mittels Plaque-Assay ergab, daß die β-Propiolacton-Behandlung (2 × 0.3%) einen Abfall im Virustiter um ca. 5 log bewirkt (Fig. 19: Probe 1: nicht-aktiviertes Virus, Probe 2: Inaktivierung mit 0.33 µg/ml 8-Methoxypsoralen, Probe 3: Inaktivierung mit 0.11 µg/ml 8-Methoxypsoralen, Probe 4: Inaktivierung mit 2 × 0.3% β-Propiolacton, Probe 5: Inaktivierung mit 0.28 mg/ml 4′-Aminomethyl-4,5′, 8-trimethylpsoralen, Probe 6: Inaktivierung mit 0,83 mg/ml 4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen. Die Zahlen bei den Balken bedeuten pfu′s/ml). Keine Plaques wurden sowohl bei den 8-Methoxypsoralen-behandelten (0.33 oder 0.11 mg/ml) als auch bei den 4′-Aminomethyl- 4,5′,8-trimethylpsoralen-behandelten (0.28 oder 0.83 mg/ml) Adenoviren beobachtet. Bei einem Verdünnungsfaktor von 6 log zwischen den nicht- inaktivierten dl1014 (mit 1 × 10⁸ pfu/ml) und den Psoralen-inaktivierten Proben zeigt dies, daß in den Psoralen-inaktivierten Proben weniger als 10² Plaque- bildende Einheiten (pfu′s) vorhanden sind. Die wesentliche Beobachtung dabei ist, daß β-Propiolacton- inaktivierte Viren Plaques mit nachweisbarer Häufigkeit bilden. Wenn also auch die β-Propiolacton-Inaktivierung im CPE-Assay der Psoralen-Inaktivierung ebenbürtig erscheint - im Plaque-Assay kommt ein deutlicher Unterschied zwischen den zwei Verbindungstypen zu Tage.

ii) Vergleich der Plaque-Assays von Adenovirus dl1014, inaktiviert mit 8-Methoxypsoralen oder verschiedenen β-Propiolacton-Behandlungen

Die Adenovirus dl1014-Präparationen wurden mit verschiedenen Mehrfachzugaben von β-Propiolacton (s. Fig. 20) inaktiviert, mittels Plaque-Assay analysiert und mit Adenoviren, die mit 0.11 mg/ml 8-Methoxypsoralen inaktiviert worden waren, verglichen. (Probe 1: nicht-aktiviertes Virus, Probe 2: Inaktivierung mit 0.11 µg/ml 8-Methoxypsoralen, Probe 3: Inaktivierung mit 0.3% β-Propiolacton, Probe 4: Inaktivierung mit 2 × 0.3% β-Propiolacton, Probe 5: Inaktivierung mit 3 × 0.2% β-Propiolacton, Probe 6: Inaktivierung mit 4 × 0.15% β-Propiolacton, Probe 7: Inaktivierung mit 1% β-Propiolacton. Die Zahlen bei den Balken bedeuten pfu′s/ml.) Auch dieser Versuch, dargestellt in Fig. 20, ergab keinen Nachweis von Viren in der Psoralen-behandelten Probe. Der Verdünnungsfaktor von 7 log zwischen nicht- inaktiviertem dl1014 von 6.7 × 10⁸ pfu/ml und dem Psoralen-inaktivierten Virus ergibt, daß in der Psoralen-inaktivierten Probe weniger als 6.7 × 10¹ pfu′s vorhanden sein müssen. Im Gegensatz dazu wurden in allen β-Propiolacton-behandelten Proben Plaques nachgewiesen, was einer Inaktivierung von ca. 2 log (0.3% β-Propiolacton) bis 5 log (2 × 0.3% β-Propiolacton) entspricht. Obwohl 1% β-Propiolacton einen starken Abfall in der DNA-Transportaktivität hervorrief (vgl. Fig. 17), bewirkte es nur einen mäßigen Abfall des Virustiters, was für die Annahme spricht, daß die höhere β-Propiolacton-Konzentration die Proteinmodifikation gegenüber der DNA-Modifikation bevorzugt und daher stärker die Fähigkeit des Virus, Endosome aufzubrechen (und somit den Viruseintritt) beeinträchtigt, als die Virusreplikation.

e) Genexpression vom inaktivierten Virus

Es wurden verschiedene Kombinationskomplexe entsprechend der in F) beschriebenen Vorschrift, enthaltend optimale Mengen von Adenovirus dl312, 8-Methoxypsoralen-inaktiviertem dl312, Adenovirus dl1014, 8-Methoxypsoralen-inaktiviertem dl1014 und β-Propiolacton-inaktiviertem dl1014, hergestellt. Die Komplexe enthielten ca. 1 × 10¹⁰ Viruspartikel, 800 ng Streptavidin-Polylysin, 6 µg pCMV-DNA und 5.2 µg Transferrin-Polylysin in einem Endvolumen von 500 µl HBS. Die Komplexe wurden auf K562-Zellen (24 h vorgezüchtet in 50 µM Deferrioxamin/RPMI/10% FCS, ausplattiert zu 250.000 Zellen/ml) zu 2 ml pro Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen aufgebracht. Nach zweistündiger Inkubation wurden die Zellen in frisches Medium ohne Deferrioxamin gewaschen und 48 h später für die Bestimmung der Luciferaseaktivität geerntet oder einer RNA-Analyse auf ausgewählte Adenovirusgene unterworfen, wobei das vereinigte Material drei getrennter Transfektionen verwendet wurde.

Die Messungen der Luciferaseaktivität zeigten, daß alle Transfektionen eine Luciferaseexpression innerhalb einer Größenordnung lieferten.

Die RNA-Northern-Analyse wurde nach der von Paeratakul et al., 1988, beschriebenen Methode durchgeführt: 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen 3 × in HBS gewaschen und Serienverdünnungen entsprechend 30.000, 10.000 oder 3.000 Zellen auf ein Nitrozellulosefilter unter Verwendung eines 96 Proben Dot Blot Geräts (Schleicher & Schuell) aufgebracht. Daraufhin wurden die Zellen mit 1% Glutaraldehyd in HBS 60 min lang bei 4°C fixiert, gefolgt von Proteinase K-Verdau (20 µg/ml) und 30 min in HBS/0.1% SDS bei 37°C. Das Filter wurde dann in Church-Puffer (0.5 M Natriumphosphat, 7% SDS, 1 mM EDTA pH 8) bei 65°C 5 h lang prähybridisiert, gefolgt von der Inkubation (über Nacht bei 65°C) mit den markierten DNA-Sonden in einem Minimalvolumen Church-Puffer. Anschließend wurden die Filter zweimal in 2X SSC/0.1% SDS 30 min lang bei 65°C gewaschen, gefolgt jeweils von 30 min in 0.1X SSC, 0.1% SDS. Das radioaktive Muster wurde durch Phosphorimaging sichtbar gemacht. Die radioaktiv markierten (³²P) Sonden wurden aus PCR-Produkten von Adenovirus dl1014-Sequenzen hergestellt. Eine E1a-Sonde (383 bp) wurde unter Verwendung von PCR-Primern zu Ad5, bp 736-751 (E1a.1) und zu bp 1119-1101 (E1a.2) hergestellt. (Diese Sequenz ist ein Teil der Region, die in dl312 deletiert ist. Sie dient als Kontrolle; das RNA-Signal sollte in den dl312-Proben fehlen, jedoch in den dl1014-Proben enthalten sein, weil letzteres Virus eine Wildtyp E1- Region besitzt.) Eine E3-Sonde (436 bp) wurde vom am stärksten exprimierten E3-Gen, dem 19 K Glykoprotein- Gen (Gooding, 1992) unter Verwendung von Primern, die zu Ad5, bp 28722-28737 (E3.a) und 29157-29142 (E3.b) hergestellt (Die Expression von E3 dürfte eine wichtige Rolle bei der Immunantwort auf transfizierte Zellen spielen, weil mindestens zwei der E3-Gene die Oberflächenexpression von MHC Klasse I-Molekülen und TNF-Rezeptor-Molekülen auf der Oberfläche von infizierten Zellen modulieren.) Im Anschluß an die PCR wurden die Reaktionsprodukte auf niedrigschmelzenden Agarosegelen in TAE-Puffer gereinigt, das gewünschte DNA-Fragment aus dem Gel herausgeschnitten, gewogen und in 1.3 ml Wasser/g Gelfragment aufgenommen. Das in Wasser aufgenommene Gelfragment wurde dann 10 min lang auf 95°C erhitzt und 10 µl der entstandenen Lösung 12 h lang bei Raumtemperatur mittels der Random Primer Methode (Feinberg und Vogelstein, 1984) radioaktiv markiert. Im Anschluß daran wurde die markierte DNA durch Ethanolfällung in Gegenwart von Ammoniumacetat und tRNA gereinigt.

Fig. 21 zeigt das Autoradiogramm: es wurde gefunden, daß bei den dl312-Proben, und zwar sowohl bei den nicht-inaktivierten als auch bei den 8-Methoxypsoralen- inaktivierten, keine E1a-Expression auftrat. Die Expression von E1a ist in den nicht-inaktivierten dl1014-Viren stark, fehlt jedoch komplett sowohl in den 8-Methoxypsoralen-behandelten als auch in den zweimal mit 0.3% β-Propiolacton inaktivierten Viren. E3 ist in nicht-inaktivierten dl312-Adenoviren weniger stark exprimiert, als in dl1014. Dieser Befund ist in Einklang mit der Kenntnis der Funktion von E1a als positiver Modulator der E3-Expression und der Expression anderer früher Gene (Nevins, 1991 und 1992).

In allen Fällen blockierte die Inaktivierung mit 8-Methoxypsoralen bzw. mit β-Propiolacton die RNA- Synthese von diesen Genen vollständig.

Tabelle I

Tabelle IV

Tumorentwicklung in DBA/2 Mäusen

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Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Krebsvakzinen, die autologe Tumorzellen enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man Tumorzellen oder Fibroblasten kultiviert und die kultivierten Zellen ex vivo mit einer Zusammensetzung transfiziert, die folgende Komponenten enthält:

ai) ein DNA-Molekül, das eine oder mehrere in der Zelle exprimierbare Sequenzen enthält, die für ein oder mehrere, gleiche oder verschiedene, immunstimulierende Polypeptide kodieren, oder mehrere DNA-Moleküle, enthaltend für verschiedene immunstimulierende Polypeptide kodierende Sequenzen,
aii) gegebenenfalls ein weiteres DNA-Molekül, das frei ist von Sequenzen, kodierend für ein in der zu transfizierenden Zelle funktionell aktives Polypeptid,
b) ein DNA-bindendes Molekül, gegebenenfalls konjugiert mit einem Internalisierungsfaktor, der an ein Oberflächenmolekül der zu transfizierenden Zellen bindet und in diese internalisiert wird,
c) ein Konjugat zwischen einem DNA-bindenden Molekül und einem Adenovirus, das eine Mutation zumindest in der E4-Region aufweist, oder einem Adenovirus, das neben einem Effekt in der E1A- Region einen oder mehrere weitere genetische Defekte aufweist,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA eine oder mehrere für ein Zytokin kodierende Sequenz(en) enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Plasmid ist, die eine für humanes Interleukin 2 kodierende Sequenz enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Plasmid ist, die eine für humanes IFN-γ kodierende Sequenz enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als in ai) definierte DNA zwei Plasmide eingesetzt werden, von denen eines die für humanes Interleukin 2 und eines die für IFN-γ kodierende Sequenz enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein oder mehrere für ein co-stimulierendes Molekül kodierende Sequenz(en) enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eine für das Heat Stable Antigen kodierende Sequenz enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein oder mehrere für ein Neoantigen kodierende Sequenz(en) enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Neoantigen ein Virusprotein oder ein Fragment davon ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Virusprotein das Rabies-Glykoprotein ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich als in aii) definiertes DNA-Molekül ein Plasmid eingesetzt wird, das frei ist von Sequenzen, kodierend für ein in der zu transfizierenden Zelle funktionell aktives Polypeptid.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente b) Polylysin, vorzugsweise einer Kettenlänge von ca. 200 bis 300 Lysinen, eingesetzt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Polylysin mit humanem Transferrin als Internalisierungsfaktor konjugiert ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Polylysin mit humanem EGF als Internalisierungsfaktor konjugiert ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente c) ein Konjugat eingesetzt wird, das ein Adenovirus mit einem Defekt zumindest in der E4-Region enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als E4-Mutante das Adenovirus der Bezeichnung dl1014 eingesetzt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente c) ein Konjugat eingesetzt wird, das ein Adenovirus mit einem Defekt in der E1a- Region, das zusätzlich mittels Psoralen/UV inaktiviert wurde, enthält.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente c) ein Konjugat eingesetzt wird, das ein Adenovirus enthält, das mittels β-Propiolacton inaktiviert wurde.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die transfizierten Zellen mit Röntgen- oder Gammastrahlen inaktiviert werden.

20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen Melanomzellen sind.

21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Fibroblasten transfiziert und inaktiviert werden.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten autologe Fibroblasten sind.

23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten Zellen einer Fibroblastenzellinie sind.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die transfizierten und inaktivierten Fibroblasten mit autologen inaktivierten Tumorzellen gemischt werden.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen Melanomzellen sind.

26. Krebsvakzine, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25.

27. Komplex zur Anwendung in einem Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er folgende Komponenten enthält:

wobei die Komponenten b) und c) mit der in a) definierten DNA einen im wesentlichen elektroneutralen Komplex bilden.

28. Komplex nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA eine oder mehrere für ein Zytokin kodierende Sequenz(en) enthält.

29. Komplex nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Plasmid ist, die eine für humanes Interleukin 2 kodierende Sequenz enthält.

30. Komplex nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein Plasmid ist, die eine für humanes IFN-γ kodierende Sequenz enthält.

31. Komplex nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA aus zwei Plasmiden besteht, von denen eines die für humanes Interleukin 2 und eines die für IFN-γ kodierende Sequenz enthält.

32. Komplex nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein oder mehrere für ein co-stimulierendes Molekül kodierende Sequenz(en) enthält.

33. Komplex nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eine für das Heat Stable Antigen kodierende Sequenz enthält.

34. Komplex nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die in ai) definierte DNA ein oder mehrere für ein Neoantigen kodierende Sequenz(en) enthält.

35. Komplex nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Neoantigen ein Virusprotein oder ein Fragment davon ist.

36. Komplex nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Virusprotein das Rabies-Glykoprotein ist.

37. Komplex nach einem der Ansprüche 27 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich als in aii) definiertes DNA-Molekül ein Plasmid enthält, das frei ist von Sequenzen, kodierend für ein in der zu transfizierenden Zelle funktionell aktives Polypeptid.

38. Komplex nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß er als Komponente b) Polylysin, vorzugsweise einer Kettenlänge von ca. 200 bis 300 Lysinen, enthält.

39. Komplex nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß das Polylysin mit humanem Transferrin als Internalisierungsfaktor konjugiert ist.

40. Komplex nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß das Polylysin mit humanem EGF als Internalisierungsfaktor konjugiert ist.

41. Komplex nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß er als Komponente c) ein Konjugat enthält, das ein Adenovirus mit einem Defekt zumindest in der E4-Region aufweist.

42. Komplex nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß er als E4-Mutante das Adenovirus der Bezeichnung dl1014 enthält.

43. Komplex nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß er als Komponente c) ein Konjugat enthält, das ein Adenovirus enthält, das mittels β-Propiolacton inaktiviert wurde.

44. Komplex nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß er als Komponente c) ein Konjugat enthält, das ein Adenovirus mit einem Defekt in der E1a-Region, das zusätzlich mittels Psoralen/UV inaktiviert wurde, enthält.

45. Humane Tumorzellen, transformiert mit einem der in einem der Ansprüche 27 bis 44 definierten Komplexe.

46. Humane Fibroblasten, transformiert mit einem der in einem der Ansprüche 27 bis 44 definierten Komplexe.

47. Fibroblasten nach Anspruch 46 in Mischung mit humanen Tumorzellen.