DE4337597C2

DE4337597C2 - DNA-Sequenzen für Ammoniumtransporter, Plasmide, Bakterien, Hefen, Pflanzenzellen und Pflanzen enthaltend den Transporter

Info

Publication number: DE4337597C2
Application number: DE4337597A
Authority: DE
Inventors: Wolf-Bernd Frommer; Olaf Ninnemann
Original assignee: Aventis CropScience GmbH
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1993-10-28
Filing date: 1993-10-28
Publication date: 2002-07-18
Anticipated expiration: 2013-10-29
Also published as: DE69432988T2; JPH09504171A; US20030204867A1; DE69432988D1; CA2175211A1; EP0730652B1; AU8060094A; WO1995011978A1; ATE246249T1; US20010003848A1; IL111372A0; AU694457B2; EP0730652A1; DE4337597A1; US6620610B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die die Kodierregion von Ammoniumtransportern enthalten, deren Einführung in ein pflanzliches Genom eine Veränderung der Aufnahme und Weiterleitung von Stickstoffverbindungen in transgenen Pflanzen hervorruft, sowie Plasmide, Bakterien, Hefen, Pflanzenzellen und Pflanzen enthaltend diese DNA-Sequenzen.

Die Versorgung einer wachsenden Pflanze mit Stickstoffverbindungen ist ein limitierender Faktor der Biomasseproduktion und damit begrenzend für den Ertrag landwirtschaftlicher Produktion. Aus diesem Grund werden bei landwirtschaftlicher Biomasseproduktion Stickstoffverbindungen, häufig in Form von mineralischen Düngern, zugeführt. Eine nur teilweise Aufnahme der angebotenen Stickstoffverbindungen durch die Pflanze macht es einerseits nötig, daß die unter hohem Energieaufwand produzierten Stickstoffdünger im Überschuß aufgewendet werden; andererseits führt eine nur teilweise Aufnahme dazu, daß die angebotenen Stickstoffverbindungen in das Grundwasser ausgewaschen werden, was erhebliche ökologische Probleme hervorrufen kann.

Es besteht daher ein großes Interesse an Pflanzen, die befähigt sind, größere Mengen Stickstoff aufzunehmen sowie an der Bereitstellung von Möglichkeiten zur Veränderung der Stickstoffaufnahme in Pflanzen.

Für viele Pflanzenspezies liegen Hinweise vor, daß die Aufnahme von Stickstoff im wesentlichen in Form von Nitratsalzen erfolgt. In stark sauren Böden oder in Böden, die infolge intensiver Bewirtschaftung stark tanninhaltig sind, ist die Nitratbildung (Nitrifizierung) jedoch stark eingeschränkt, und die Aufnahme von Stickstoff in Form von Ammonium wird zum wichtigen Mechanismus der Aufnahme von Stickstoffverbindungen (Raven & Smith, 1976, New Phytol 76: 415-431). Pflanzen, die an saure Böden gut angepaßt sind, scheinen z. T. die Aufnahme von Ammonium gegenüber der Nitrataufnahme zu bevorzugen und sind außerdem in der Lage, Ammoniumionen-Konzentrationen zu tolerieren, die für andere Pflanzen toxisch sind. Zu diesen Pflanzen gehören beispielsweise Zuckerrohr, Betula verucosa oder Lolium rigidum (Foy et al., 1978, Ann Rev Plant Physiol 29: 511-566). Die Toxizität des Ammoniums ergibt sich als Folge einer Verschiebung der Ionenbalance: die Aufnahme des positiv geladenen Ammoniumions führt zu einer Ansäuerung des Cytoplasmas, sofern nicht Kationen im Gegentausch sekretiert werden. Bei einer Aufnahme von Ammonium durch ein Transportsystem, dessen Aufnahmemechanismus auf einem Ammoniumionen-Protonen-Antiport beruht, ergibt sich das Problem der Ionenimbalance nicht.

Es besteht daher auch ein großes Interesse an Transportsystemen, die nach dem Mechanismus eines Ammoniumionen-Protonen-Antiports arbeiten, bzw. an Systemen, die durch Techniken des "protein engineering" in Ammoniumionen- Protonen-Antiporter umgewandelt werden könnten.

Transportsysteme, mit deren Hilfe Pflanzen Ammonium aufnehmen bzw. mit deren Hilfe sich Pflanzen vor einem durch Membrandiffusion verursachten Ammoniumionen-Verlust schützen (Retrieval Systeme), sind nicht bekannt.

Unter Ammonium ist auch Methylamin zu verstehen, das dem Ammonium analog ist.

Bei dem Pilz Aspergillus nidulans ist ein aktives Aufnahmesystem für Ammonium untersucht worden (z. B. Arst et al., 1973, Mol Gen Genet 121: 239-245), ebenso bei Penicillum chrysogenum (Hackette et al., J Biol Chem 245: 4241-4250). Bei diesen Studien wurde Methylamin als Ammoniumanaloges eingesetzt. Für Aspergillus nidulans konnten so fünf genetische Loci ermittelt werden, die am Transport von Methylamin beteiligt sind (Pateman et al., 1973, J Bacteriol 114: 943-950). Bei biochemischen Untersuchungen des Methylammoniumtransportes in Penicillum chrysogenum bzw. in Saccharomyces cerevisisae zeigte sich, daß der Transport temperatur- und pH-Wert-abhängig ist, wobei ein pH Optimum von 6.0 bis 6.5 besteht, und die Transporteffizienz bis zu einer Temperatur von 35°C stetig zunimmt (Roon et al., 1975, J Bacteriol 122: 502-509). Der Methylamin- bzw. Ammoniumtransport in Saccharomyces cerevisiae ist von der Zufuhr leicht verwertbarer chemischer Energie, z. B. in Form von Glukose, abhängig. Das Transportsystem besteht aus mindestens drei unabhängigen Transportern, die sich in Transportkapazität und Affinität zum Substrat unterscheiden: neben einem hochaffinen Transporter mit geringer Kapazität (Km Wert = 250 µM, Maximalgeschwindigkeit Vmax = 20 nmol/min pro mg Zellen (Trockengewicht)) kommen ein niedrig affines System mit hoher Kapazität (Km = 2 mM, Vmax = 50 nmol/min pro mg Zellen) und ein niedrig affines mit mittlerer Kapazität (Km = 20 mM, Vmax = 33 nmol/min pro mg Zellen) vor (Dubois & Grenson, 1979, Mol Gen Genet 175: 67-76). Bei Anwesenheit von Glutamin oder Asparagin im umgebenden Medium wird die Ammoniumaufnahme um 60 bis 70% reduziert, während andere Amine kaum einen Einfluß haben (Roon et al., 1975, J Bacteriol 122: 502-509).

Über die molekulare Natur des Ammoniumtransporters bei den genannten oder anderen Pilzen und sonstigen Organismen, wie beispielsweise den Bakterien, ist nichts bekannt. Ebenso ist über Systeme, mit deren Hilfe sich Pilze oder Bakterien vor einem durch Membrandiffusion verursachten Ammoniumionen-Verlust schützen (Retrieval Systeme) auf molekularer Ebene nichts bekannt. Ferner sind Gene, die Ammoniumtransporter kodieren, nicht bekannt.

Verschiedene Evidenzen deuten darauf hin, daß der Ammoniumtransport in Saccharomyces cerevisiae von zumindest zwei funktionell verschiedenen Transportsystemen bewerkstelligt wird (Dubois & Grenson, 1979, Mol Gen Genet 175: 67-76):

1. Kinetische Analysen der Methylamin-Aufnahme durch Saccharomyces zeigen einen abrupten Übergang zwischen apparent linearen Abschnitten, wobei beide Funktionen durch Ammonium inhibierbar sind.
2. Beide Funktionen können durch Mutation separat ausgeschlossen werden. Die entstandenen Mutationen mep-1 bzw. mep-2 sind genetisch unabhängig.
3. Die Mutanten mep-1 bzw. mep-2 können jeweils in Medien mit Ammonium als einziger Stickstoffquelle wachsen, während eine Doppelmutante mep-1/mep-2 kaum noch Wachstum unter diesen Bedingungen zeigt (Daten entnommen aus Dubois & Grenson, 1979).

Eine Aufklärung der Ammonium-Transportvorgänge bei Pflanzen, die zu ähnlich detaillierten Informationen wie für Hefe führt, liegt nicht vor und ist wegen der Schwierigkeit der molekularbiologischen Analyse von Mutationen auf einem entsprechenden Weg kaum durchführbar.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, DNA-Sequenzen von Ammonium transportern zur Verfügung zu stellen, die in transgenen Pflanzen eine Veränderung der Aufnahme und Weiterleitung von Stickstoffverbindungen hervorrufen.

Aufgabe der Erfindung ist weiterhin, DNA-Konstrukte, wie Plasmide bereitzustellen, mit denen der Ammoniumtransport in transgenen Pflanzen verändert werden kann, indem die entsprechenden Konstrukte (Plasmide) in das pflanzliche Genom eingeführt werden und infolge ihrer Transkription zur Bildung neuer Ammonium- Transportermoleküle in der transgenen Pflanze bzw. zur Unterdrückung der Bildung der pflanzeneigenen Ammonium-Transportermoleküle führen.

Es wurden nun überraschend DNA-Sequenzen gefunden, die die Kodierregion eines pflanzlichen Ammoniumtransporters enthalten, wobei die in der Nukleotidabfolge enthaltende Information bei Integration in ein pflanzliches Genom

a) unter Kontrolle eines Promotors in sense Orientierung, die Expression einer translatierbaren mRNA ermöglicht, was zur Synthese eines Ammonium transporters in transgenen Pflanzen führt oder
b) unter Kontrolle eines Promotors in anti-sense Orientierung, die Expression einer nicht-translatierbaren mRNA ermöglicht, was die Synthese eines endogenen Ammoniumtransporters in transgenen Pflanzen verhindert.

In analoger Weise können Ammoniumtransporter auch zur Veränderung tierischer und menschlicher Zellen verwendet werden.

Die Identifikation der Kodierregion des Ammoniumtransporters wird über ein Verfahren durchgeführt, bei dem die Isolation von pflanzlichen DNA-Sequenzen, die Transporter Moleküle kodieren, mittels Komplementation von spezifischen Mutationen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae erfolgen soll.

Hierzu müssen zunächst geeignete Hefe-Mutanten verfügbar sein, die nicht in der Lage sind, diejenige Substanz aufzunehmen, für die aus einer pflanzlichen Genbank die Kodierregion eines Transporter-Moleküls isoliert werden soll. Eine Mutante, die nicht in der Lage ist, in Medien mit Ammonium als einziger Stickstoffquelle zu wachsen, ist beispielsweise die von Dubois & Grenson (179, Mol Gen Genet 175: 67-76) beschriebene Doppelmutante mep-1/mep-2 (Stamm 26972c).

Eine geeignete Hefemutante, wie beispielsweise die mep-1/mep-2 Doppelmutante, wird mit für die Verwendung in Hefe geeigneten Expressions-Plasmiden, die als Insertion cDNA Fragmente aus einer pflanzlichen cDNA Bibliothek tragen, transformiert. Durch Selektion von Transformanden, die infolge der Expression pflanzlicher cDNA-Sequenzen in der Lage sind, auf Ammonium als einziger Stickstoffquelle zu wachsen, sollen pflanzliche Ammoniumtransporter identifiziert werden.

Ob es möglich ist, unter Verwendung eines derartigen Komplementations- Verfahrens DNA-Sequenzen, die pflanzliche Ammoniumtransporter kodieren, zu identifizieren, hängt von verschiedenen Faktoren ab. Zum einen müssen die für die Verwendung in Hefe geeigneten Expressions-Plasmide cDNA-Fragmente enthalten, die pflanzliche Ammoniumtransporter kodieren, d. h. die der cDNA Synthese zugrundeliegende mRNA muß aus Geweben stammen, die Ammoniumtransporter exprimieren. Da über pflanzliche Ammoniumtransporter nichts bekannt ist, sind Gewebe, die Ammoniumtransporter kodieren, jedoch ebenfalls nicht bekannt.

Eine weitere Voraussetzung für den Erfolg der Komplementationsstrategie ist, daß ein in Pflanzen existierendes Ammoniumtransportsystem in Hefe funktional exprimiert werden kann, da nur in diesem Fall eine Komplementation der durch die Mutation ausgelösten Defizienz möglich ist. Da über pflanzliche Ammonium transporter nichts bekannt ist, ist ebenfalls nicht bekannt, ob eine funktionale Expression in Hefe möglich ist.

Ferner wurde nun überraschend gefunden, daß bei Expression einer cDNA- Bibliothek beispielsweise aus Blattgewebe von Arabidopsis thaliana mittels für die Verwendung in Hefe geeigneter Expressions-Plasmide, die den Promotor der Phosphoglyceratkinase aus Hefe enthalten, die Komplementation der Doppelmutation mep-1/mep-2 möglich ist, wenn die Expressions-Plasmide bestimmte pflanzliche cDNA-Fragmente enthalten. Diese cDNA-Fragmente kodieren pflanzliche Ammoniumtransporter.

Die Identifikation von pflanzlichen Ammoniumtransportern wird hier am Beispiel von Arabidopsis thaliana beschrieben, ist aber nicht auf diese Pflanzenspezies beschränkt.

Ein cDNA-Fragment, das einen pflanzlichen Ammoniumtransporter kodiert, kann beispielsweise die folgende Sequenz aufweisen (Seq. ID No: 1):

Die mit Hilfe der transformierten Hefestämme identifizierten erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen, wie z. B. die Sequenz Seq. ID No. 1, können in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für Expression in eukaryontischen Zellen kombiniert werden (s. Ausführungsbeispiel 4). Derartige Steuerelemente sind einerseits Transkriptions-Promotoren und andererseits Transkriptions-Terminatoren. Mit den Plasmiden können eukaryontische Zellen transformiert werden, mit dem Ziel der Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese eines Ammonium transporters in den Zellen ermöglicht (sense Orientierung) oder mit dem Ziel der Expression einer nicht-translatierbaren mRNA, die die Synthese eines endogenen Ammoniumtransporters verhindert (anti-sense Orientierung).

Diese Plasmide sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Bevorzugte Plasmide sind die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) hinterlegten Plasmide p35S-MEP-a und p355-a-MEP-a.

Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Hefen, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthalten.

Die zur Identifikation eines pflanzlichen Methylamin- bzw. Ammoniumtransporters verwendeten Hefestämme können für Studien der Eigenschaften des Transporters sowie seiner Substrate genutzt werden. Die in Plasmiden vorliegenden DNA- Sequenzen eines pflanzlichen Ammoniumtransporters können entsprechend der Ergebnisse dieser Studien einer Mutagenese oder einer Sequenzveränderung durch Rekombination unterzogen werden, um Eigenschaften des Transporters zu verändern. Durch Veränderung der Spezifität des Transport-Systems ist der Transport neuer Verbindungen möglich, der interessante Anwendungsmöglichkeiten erschließt (s. unten). Darüberhinaus kann durch geeignete Veränderung des Transporters der Transportmechanismus verändert werden. Hierbei ist insbesondere, aber nicht ausschließlich, an eine Veränderung zu denken, die die Kotransporteigenschaften des Transporters verändert, beispielsweise dahingehend, daß es durch die Veränderung zu einem Ammoniumionen-Protonen-Antiport kommt, der eine Toxizität aufgenommener Ammoniumionen für Pflanzen infolge Ansäuerung des Cytoplasmas verhindert. Hierbei kann der erfindungsgemäße Hefestamm, der die cDNA Sequenz eines pflanzlichen Ammoniumtransporters in einem Expressionsplasmid enthält, für ein Mutations-Selektions-System genutzt werden.

Durch Expression einer RNA entsprechend der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen von pflanzlichen Ammoniumtransportern in transgenen Pflanzen wird eine Veränderung des pflanzlichen Stickstoffmetabolismus möglich, deren wirtschaftliche Bedeutung offensichtlich ist: Stickstoff ist der hauptsächlich das Wachstum begrenzende Nährstoff. Die. Lebensfähigkeit von Keimlingen sowie die Keimungsfähigkeit von Samen ist direkt abhängig vom Stickstoffgehalt der Speichergewebe. Die Bildung von hochwertigen, stark proteinhaltigen Nahrungsmitteln ist von einer ausreichenden Stickstoffzufuhr abhängig.

Die Veränderung der Stickstoffaufnahme, beispielsweise im Sinne eines Hinzufügens eines neuen Aufnahmesystems für Stickstoffverbindungen wie Ammonium, kann daher zu einer Ertragssteigerung von transgenen Nutzpflanzen, insbesondere unter Stickstofflimitation führen. Auf diesem Wege können transgene Pflanzen erzeugt werden, die hohe Erträge unter "low input" Bedingungen erwirtschaften.

Die Möglichkeit der Unterdrückung der Ammoniumaufnahme in die transgene Pflanze kann jedoch unter bestimmten Bedingungen ebenfalls erwünscht sein. Beispielsweise ist an den Anbau von nicht für das Wachstum auf sauren Böden angepaßten transgenen Pflanzen zu denken. Infolge der Unterdrückung der Nitrifizierung können auf solchen Böden Ammoniumionen-Konzentrationen vorliegen, die für bestimmte Pflanzen toxisch sind, weil das von den Pflanzen aufgenommene Ammonium in der Zelle nicht mehr vollständig umgewandelt werden kann und dann als Zellgift wirkt. Die Unterdrückung der Ammoniumaufnahme durch Unterdrückung der Biosynthese des Ammoniumtransporters kann daher transgene Pflanzen derart verändern, daß ein Anbau auf sauren Böden möglich wird.

Transgene Nutzpflanzen sind z. B. Tabak, Kartoffel, Zuckerrübe, Sojabohne, Erbse, Bohne und Mais.

Die genetische Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen wird nach gängigen Verfahren durchgeführt (s. u. a. Gasser, C. S., Fraley, R. T., 1989, Science 244: 1293- 1299; Potrykus, 1991, Ann Rev Plant Mol Biol Plant Physiol 42: 205-225). Zur Expression der kodierenden Sequenzen in Pflanzen müssen diese mit transkriptionell regulatorischen Elementen verknüpft werden. Solche Elemente, Promotoren genannt, sind vielfältig beschrieben (s. z. B. EP 375 091). Ferner müssen die Kodierregionen mit einem Transkriptionsterminationssignal versehen werden, damit sie korrekt transkribiert werden können. Derartige Elemente sind ebenfalls beschrieben (vgl. Gielen et al., 1989, EMBO J 8: 23-29). Der transkriptionelle Startbereich kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar. Die DNA-Sequenz der Transkriptionsstart- und -termina tionsregionen kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für Escherichia coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR 322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184 usw. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri- Plasmid T-DNA, als Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vektor System, Offset-drukkerij Kanters B. V. Ablasserdam, (1985), Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4: 277-287 beschrieben worden. Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen neben der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Fusion von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elektroporation sowie ballistische Methoden und Virusinfektion. Aus den transformierten Pflanzenzellen können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Pflanzenzellen, die die erfindungsge mäßen DNA-Sequenzen enthalten.

Bei der Injektion und Elektroporation sind an sich keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Die Einführung von DNA-Sequenzen eines pflanzlichen Ammoniumtransporters zur Veränderung der Aufnahme von Stickstoffverbindungen wird in der vorliegenden Erfindung am Beispiel von Arabidopsis thaliana und Tabak beschrieben. Die Anwendung ist aber nicht auf diese Spezies beschränkt.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für eine Expression in prokaryontischen Zellen kombiniert werden. Die Bildung einer von Bakterien translatierbaren RNA Sequenz eines eukaryontischen Ammoniumtransporters führt trotz der erheblichen Unterschiede in den Membranstrukturen von Pro- und Eukaryonten überraschend dazu, daß Prokaryonten nun einen funktionalen eukaryontischen Ammonium transporter mit dessen Substratspezifität exprimieren. Dies ermöglicht die Produktion von Bakterienstämmen, die wie die zur Identifikation des Ammonium transporters verwendeten Hefestämme für Studien der Eigenschaften des Transporters sowie seiner Substrate genutzt werden können, wobei weitere Anwendungsmöglichkeiten erschlossen werden können.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Bakterien, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthalten.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen mit Hilfe von Standardverfahren der Mikrobiologie erlauben. Dadurch ist eine besonders einfache Veränderung der Spezifität des Ammonium transporters möglich. Veränderte Ammoniumtransporter können beispielsweise verwendet werden zur Transformation von landwirtschaftlich genutzten transgenen Pflanzen, wobei ebenso an den Transport von Pestiziden wie auch von Substraten für Stoffwechselreaktionen der Pflanze zu denken ist. Mit Hilfe von Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten und mit einer anderen DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.

Die Erfindung betrifft somit auch Derivate oder Teile von Plasmiden, auf denen die erfindungsgemäßen DNA-Segenzen lokalisiert sind.

Ferner können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen dazu genutzt werden, nach Standardverfahren aus dem Genom von Pflanzen verschiedener Spezies, aus dem Genom von Pilzen und aus dem Genom von Bakterien ähnliche Sequenzen zu isolieren, die ebenfalls Ammoniumtransporter kodieren. Mit diesen Sequenzen können Konstruktionen zur Transformation von Pflanzenzellen hergestellt werden, die Transportvorgänge in den transgenen Pflanzen verändern.

Um verwandte DNA-Sequenzen zu bestimmen, muß man zunächst Genbanken anlegen, die für den Gehalt von Genen einer Pflanzenart oder für die Expression von Genen in einer Pflanzenart repräsentativ sind. Erstere sind genomische, letztere sind cDNA-Banken. Aus diesen können mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen als Sonde verwandte Sequenzen isoliert werden. Hat man die dazugehörigen Gene identifiziert und isoliert, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz kodierten Proteine möglich. Auf diesem Weg gewonnene DNA-Sequenzen von Ammoniumtransportern sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können wie oben beschrieben eingesetzt werden.

Die Verwendung der DNA-Sequenzen wie oben beschrieben ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Hinterlegungen

Am 26.10.1993 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide hinterlegt (Hinterlegungsnummern):

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt das Plasmid p35S-MEP-a, bei dem es sich um ein Derivat des Plasmids pBIN19 (Bevan, M., 1984, Nucl Acids Res 12: 8711-8721) handelt.
Dabei bedeuten:
A = Fragment aus dem Genom des Blumenkohl Mosaik Virus, das den 35S Promotor (nf 6909-7437) trägt. Das Promotorfragment wurde als EcoRI/KpnI Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl Acids Res 14: 5857-5868) präpariert.
B = NotI/NotI-Fragment der cDNA mit der Kodierregion des Ammonium transporters von Arabidopsis thaliana in sense-Orientierung zum Fragment A. Der in Fragment B eingezeichnete Pfeil gibt die Leserichtung der cDNA an.
C = Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J 3: 835-846), Nukleotide 11749 bis 11939, welches als PvuII/HindIII-Fragment aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., 1983, Nature 303: 209-213) isoliert und nach Addition eines SphI-Linkers an die PvuII Schnittstelle zwischen die SphI- und die HindIII-Schnittstelle des Polylinkers von pBIN19 kloniert wurde.

Fig. 2 zeigt das Plasmid p35S-a-MEP-a, bei dem es sich um Derivate des Plasmids pBIN19 (Bevan, M., 1984, Nucl Acids Res 12: 8711-8721) handelt.
Dabei bedeuten:
A = Fragment aus dem Genom des Blumenkohl Mosaik Virus, das den 35S Promotor (nt 6909-7437) trägt. Das Promotorfragment wurde als EcoRI/KpnI Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl Acids Res 14: 5857-5868) präpariert.
B = NotI/NotI-Fragment der cDNA mit der Kodierregion des Ammonium transporters von Arabidopsis thaliana in antisense Orientierung zum Fragment A. Der in Fragment B eingezeichnete Pfeil gibt die Leserichtung der cDNA an.
C = Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J 3: 835-846), Nukleotide 11749 bis 11939, welches als PvuII/HindIII-Fragment aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., 1983, Nature 303: 209-213) isoliert und nach Addition eines SphI-Linkers an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SphI- und die HindIII-Schnittstelle des Polylinkers von pBIN19 kloniert wurde.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern den Gegenstand der Erfindung ohne ihn einzuschränken, wobei die Klonierung und Identifikation, sowie die Funktion eines pflanzlichen Ammoniumtransporters und seine Verwendung zur genetischen Veränderung von Pflanzen mit dem Ziel der Veränderung der Aufnahme und Weiterleitung von Stickstoffverbindungen beschrieben wird. Analog zu den dargestellten Beispielen können auch andere Pflanzen, insbesondere landwirtschaftliche Nutzpflanzen wie Kartoffel, Zuckerrübe, Mais etc. verändert werden.

In den Ausführungsbeispielen 1 bis 4 werden die folgenden Standardverfahren und Spezialtechniken verwendet.

1. Klonierungsverfahren

Zur Klonierung in E. coli wurde ein Derivat des Vektors pACYC, das den polylinker aus pBluescript enthält, verwendet.

Für die Transformation von Hefen wurde der Vektor pFL61 verwendet (Minet & Lacroute, 1990, Curr Genet 18: 287-291).

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR, einem Derivat von pBIN19 (Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711- 8721), kloniert (s. Ausführungsbeispiel 4).

2. Bakterien- und Hefestämme

Für den pACYC-Vektor sowie für pBinAR-Konstrukte wurde der E. coli-Stamm DH5α verwendet.

Als Ausgangsstamm für die Expression der cDNA-Bibliothek in Hefe wurde der Hefestamm 26972c (Dubois & Grenson, 1979, Mol Gen Gnete 175: 67-76) mit den Mutationen mep-1/mep-2 und ura3 verwendet.

Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanze wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res 12: 8711-8720) durchgeführt.

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA in die Agrobakterien erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res 16: 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979, Nucl Acids Res 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.

4. Pflanzentransformation Tabak

10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens wurden sedimentiert und im gleichen Volumen antibiotikumfreien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben aus Sterilkultur (ca. 1 cm²), deren Mittelrippe entfernt wurde, in der Bakteriensuspension gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen, die MS-Medium (nach Murashige und Skoog, 1962, Physiologia Plantarum 15: 473-497) mit 2% Saccharose und 0,8% Bacto-Agar enthalten, dicht ausgelegt. Nach zweitägiger Inkubation bei 25°C im Dunkeln wurden sie auf MS-Medium übertragen, das 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin, 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l, Naphtylessigsäure(NAA) und 0,8% Agar enthielt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 250 mg/l Claforan und 50 mg/l Kanamycin überführt.

Arabidopsis thaliana

Kotyledonen einer sieben Tage alten, aus Samen angezogenen Sterilkultur von Arabidopsis thaliana wurden auf Cl Medium mit einer Schicht von Tabak- Suspensionskultur (als "feeder layer") zwei Tage lang vorinkubiert und dann 5 Minuten in einer Suspension mit Agrobacterium tumefaciens (Herstellung der Suspension s. Tabak-Transformation) und anschließend für zwei Tage auf Cl- Medium mit "feeder layer" im Schwachlicht inkubiert. Nach dieser Kokultivierung mit Agrobakterien wurden die Explantate auf SIM I Medium ausgelegt, das wöchentlich erneuert wurde. Nach Bildung von Kallus wurden die Explantate auf SIM II Medium umgesetzt und weiterhin unter Selektion mit Kanamycin kultiviert. Kleine Sprosse wurden vom Kallusmaterial abgetrennt und auf RI Medium umgesetzt. Nach der Abreifung der Samen konnten diese analysiert werden.

Die einzelnen Medien setzen sich wie folgt zusammen:

Ausführungsbeispiel 1 Klonierung der cDNA eines pflanzlichen Methylamin- bzw. Ammoniumtransporters

Zur Komplementation der Ammoniumtransport-Doppelmutation des Hefestamms 26972c (Dubois & Grenson, 1979, Mol Gen Genet 175: 67-76) wurde eine cDNA von jungen Keimlingen von Arabidopsis thaliana (Zwei-Blatt-Stadium) im Hefe- Expressionsvektor pFL61 (Minet & Lacroute, 1990, Curr Genet 18: 287-291) verwendet, die von Minet zur Verfügung gestellt wurde (Minet et al., 1992, Plant J 2: 417-422). Etwa 1 µg des Vektors mit der cDNA-Insertion wurden in den Hefestamm 26972c nach der Methode von Dohmen et al. (1991, Yeast 7: 691-692) tranformiert. Hefetransformanden, die auf Minimalmedium mit 1 mM NH₄Cl als einziger Stickstoffquelle wachsen konnten, wurden propagiert. Aus den Linien wurde Plasmid-DNA nach Standardverfahren präpariert. Diese DNA wurde erneut in den Stamm 26972c transformiert. Auf diesem Weg wurde ein Plasmid pFL61-MEP-a erhalten, das die mep-1/mep-2 Doppelmutation komplementieren kann. Dieses Plasmid hat eine Insertion der Größe 1,75 kbp.

Der durch Transformation von 26972c mit dem Plasmid pFL61-MEP-a erhaltene Hefestamm 26972c::pFL61-MEP-a kann für Aufnahmestudien mit Methylamin oder Ammonium verwendet werden (s. Ausführungsbeispiel 3). Durch gentechnische Veränderung der Kodierregion des Ammoniumtransportergens MEP-a nach Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A loboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) kann dessen Spezifität bzw. die Charakteristik des Transportmechanismus verändert werden. Der Stamm 26972c::pFL61-MEP-a eignet sich direkt für die Untersuchung von Inhibitoren oder Promotoren des Ammoniumtransports mit Hilfe des erfindungsgemäßen Ammoniumtransportsystems (vgl. Ausführungsbeispiel 3). Die cDNA Insertion des Plasmids pFL61-MEP-a kann zur Identifikation ähnlicher DNA-Sequenzen aus Pflanzen anderer Spezies oder aus anderen Organismen wie Bakterien oder animalischen Systemen verwendet werden. Hierzu sind Hybridisierungstechniken verwendbar. Ebenso kann mit Hilfe der cDNA Sequenz nach Standardverfahren ein Konstrukt zur Expression des Genprodukts als Fusionsprotein in Bakterien hergestellt werden. Mit Hilfe des Fusionsproteins können Antikörper hergestellt werden, die der Identifikation ähnlicher Proteine in anderen Organismen dienen.

Ausführungsbeispiel 2

Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pFL61-MEP-a

Aus der entsprechend Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen Hefe-Linie 26972c::pFL61- MEP-a wurde das Plasmid pFL61-MEP-a isoliert und dessen cDNA-Insertion als NotI Fragment präpariert. Das Fragment wurde in einen modifizierten pACYC Vektor (Chang & Cohen, 1978, J Bacteriol 134. 1141-1156) kloniert, der zwischen einer HincII (nt 3211) und einer aufgefüllten HindIII (nt 1523) Schnittstelle den polylinker aus pBluescript als BssHII Fragment enthält. Durch die Modifikation geht die Tetracyclinresistenz verloren. Das cDNA Fragment wurde in den so erhaltenen Vektor pACH-H als NotI Fragment in die NotI Schnittstelle kloniert. Mit Hilfe synthetischer Oligonukleotide wurde die Insertion nach der Methode von Sanger et al. (1977, Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467) sequenziert. Die Sequenz ist in Seq-ID No 1 wiedergegeben.

Ausführungsbeispiel 3 Aufnahmestudien mit ¹⁴C-markiertem Methylamin an der Hefe-Linie 26972c:: pFL61-MEP-a

Die Hefe-Linien 26972c::pFL61, 26972c::pFL61-MEP-a und deren Ausgangslinie Σ1278b (Dubois & Grenson, 1979, Mol Gen Genet 175: 67-76, MEP-1/MEP-2 ura3) wurden in Flüssigmedium mit 1,7 g Yeast Nitogen Base ohne Ammonium und ohne Aminosäuren (Difco), 20 g Agarose, 1% Glukose (w : v), 0,5 mg/l Prolin angezogen, bis die Kulturen die logarithmische Phase erreicht hatten. Nach Zentrifugation von jeweils 25 ml der Kultur wurden die Zellen mit 10 mM Phosphat ph7 bzw. pH4 gewaschen und in 1,5 ml 10 mM Phosphatpuffer aufgenommen. Zehn Minuten vor Beginn der Transportmessungen wurde auf eine Endkonzentration von 10 mM Glukose eingestellt. 100 µl der Suspension wurden einer Lösung von 10 mM Phosphat pH 4 bzw. 7, 100 µM unmarkierten Methylamins, und 5 µCi 14C-markierten Methylamins(0.1 mCi/1,9 µmol) zugesetzt (jeweils Endkonzentrationen). Die Aufnahme des markierten Methylamins wurde nach 10, 60, 120 und 180 sek gemessen. Hierzu wurden dem Ansatz jeweils 50 µl entnommen und in einem Volumen von 1 ml H₂O + 3 mM unmarkierten Methylamins auf Glasfaserfilter aufgezogen. Nach Waschen mit 10 ml H₂O + 3 mM unmarkierten Methylamins wurde die Menge aufgenommenen 14C-Methylamins durch Scintillation gemesssen (Tabelle 1a bzw. 1b). Die Aufnahme des markierten Methylamins wurde derjenigen bei Koinkubation mit 0,5 mM NH₄Cl (Tabelle II) bzw. 0,5 mM KCl (Tabelle III), sowie derjenigen bei Koinkubation mit den Entkopplern Dinitrophenol (DNP) und Carbonyl cyanid-m-chlorphenylhydrazon (CCCP) verglichen (Tabelle IV). Die Werte jeweils eines typischen Experiments sind in den Tabelle I bis IV aufgeführt:

Tabelle I

Aufnahme von 14C-Methylamin in Hefestämme nach Inkubation mit 10 mM Glukose bei unterschiedlichen pH Werten (zu jedem Zeitpunkt werden für die MEP-a Transformande und die Nullkontrolle (Plasmid pFL61 ohne cDNA Insertion) Werte aus zwei unabhängigen Meßreihen angegeben). Meßwerte in cpm (counts per minute)

pH = 4

pH = 7

Tabelle II

Aufnahme von 14C-Methylamin in Hefestämme nach Inkubation mit 10 mM Glukose in Gegenwart von 0,5 mM NH4Cl. Meßwerte in cpm. Der pH Wert beträgt 7.

Tabelle III

Aufnahme von 14C-Methylamin in Hefestämme nach Inkubation mit 10 mM Glukose in Gegenwart von 0,5 mM KCl, wenn nicht anders vermerkt. Meßwerte in cpm. Der pH Wert beträgt 7.

Tabelle IV

Aufnahme von 140-Methylamin in Hefestämme nach Inkubation mit 10 mM Glukose in Gegenwart von 0,1 mM Dinitrophenol (DNP) oder 10 µM Carbonylcyanid-m- chlorophenylhydrazon (CCCP) wie vermerkt. Meßwerte in cpm. Der pH Wert beträgt 7.

Ausführungsbeispiel 4 Transformation von Pflanzen mit einer Konstruktion zur Überexpression der Kodierregion des Aminosäuretransporters

Aus dem Plasmid pFL61-MEP-a, das als Insertion die cDNA für den Methylamin- bzw. Ammoniumtransporter von Arabidopsis thaliana enthält, wurde die Insertion als NotI Fragment isoliert und nach Auffüllen überhängender Enden in die SmaI Schnittstelle von pBinAR kloniert. Die cDNA trägt in der Plasmidkarte (Fig. 1) die Bezeichnung "B". Je nachdem, ob B in sense Orientierung zum 35S Promotor von pBinAR eingeführt wurde oder nicht, trägt das entandene Plasmid die Bezeichnung p35S-MEP-a bzw. p35S-a-MEP-a. Das Plasmid pBinAR ist ein Derivat von pBIN19 (Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711-8720). Zwischen dessn EcoRI und KpnI Schnittstelle wurde ein Fragment aus dem Genom des Blumenkohl Mosaik Virus, das den 35S Promotor (nt 6909-7437) trägt, eingefügt. Das Promotorfragment wurde als EcoRI/KpnI Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl Acids Res 14: 5857-5868) präpariert. In der Plasmidkarte trägt das Promotorfragment die Bezeichnung "A". Zwischen der SphI und der HindIII Schnittstelle von pBinAR ist außerdem das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J 3: 835-846) eingefügt. Hierzu war ein PvuII/HindIII Fragment (nt 11749-11939) aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera-Estrella et al., 1983, Nature 303: 209-2139) an der PvuII Schnittstelle mit einem SphI linker versehen worden. Das Polyadenylierungssignal trägt in der Plasmidkarte die Bezeichnung "C".

Nach Transformation von Agrobakterien mit den Plasmiden p35S-MEP-a und p35S- a-MEP-a wurden diese zur Infektion von Blattsegmenten von Tabak und Arabidopsis thaliana eingesetzt.

Zehn unabhängig erhaltene Transformanden für beide Konstrukte, in denen die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten chimären Gens mit Hilfe von Southern blot Analysen nachgewiesen worden war, wurden bezüglich der Veränderungen im Stickstoffhaushalt untersucht.

Claims

1. DNA-Sequenzen, die die Kodierregion eines pflanzlichen Ammonium transporters enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Nukleotid abfolge enthaltende Information bei Integration in ein pflanzliches Genom, unter Kontrolle eines Promotors in sense Orientierung, die Expression einer translatierbaren mRNA ermöglicht, was zur Synthese eines Ammonium transporters in transgenen Pflanzen führt.

2. DNA-Sequenzen, die die Kodierregion eines pflanzlichen Ammonium transporters enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Nukleotid abfolge enthaltende Information bei Integration in ein pflanzliches Genom, unter Kontrolle eines Promotors in anti-sense Orientierung, die Expression einer nicht-translatierbaren mRNA ermöglicht, was die Synthese eines endogen Ammoniumtransporters in transgenen Pflanzen verhindert.

3. DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kodierregion folgende Nukleotidabfolge (Seq-ID No 1) enthält:

4. Plasmide, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1-3.

5. Plasmid p35S-MEP-a (DSM 8651).

6. Plasmid p35S-a-MEP-a (DSM 8652).

7. Verwendung der Plasmide gemäß den Ansprüchen 4-6 oder Derivate oder Teile davon zur Transformation pro- und eukaryontischer Zellen.

8. Transgene Pflanzen, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1-3.

9. Hefen, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1-3.

10. Bakterien, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1-3.

11. Pflanzenzellen, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1-3.

12. Verwendung von Pflanzenzellen gemäß Anspruch 11 zur Regenerierung ganzer Pflanzen.

13. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1-3 zur Herstellung von Derivaten mit veränderter Spezifität des Ammonium transporters.

14. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1-3 zur Isolierung ähnlicher Sequenzen aus dem Genom von Bakterien, Pilzen und transgenen Pflanzen.

15. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 und 3, in Kombination mit einem Transkriptions-Promotor in sense Orientierung, zur Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese eines Ammonium transporters in pro- und eukaryontischen Zellen ermöglicht.

16. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 2 und 3, in Kombination mit einem Transkriptions-Promotor in anti-sense Orientierung, zur Expression einer nicht-translatierbaren mRNA, die die Synthese eines endo genen Ammoniumtransporters in pro- und eukaryontischen Zellen verhindert.

17. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1-3 zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit verändertem Stickstoffmetabolismus.

18. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 und 3 zur Herstellung von transgenen Nutzpflanzen mit gesteigertem Ertrag.

19. Verswendung der DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 2 und 3 zur Herstellung von Nutzpflanzen für "Low Input" Bewirtschaftung.

20. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 2 und 3 zur Herstellung von transgenen Nutzpflanzen, die auch auf sauren Böden wachsen.

21. Verwendung gemäß Anspruch 18 zur Herstellung von transgenem Tabak, Kartoffel, Rübe und Mais.

22. Verwendung gemäß Anspruch 19 zur Herstellung von transgenem Tabak, Kartoffel, Rübe und Mais.