JPH09504171A

JPH09504171A - アンモニウム輸送体、該輸送体を含有するプラスミド、細菌、酵母、植物細胞および植物

Info

Publication number: JPH09504171A
Application number: JP7512404A
Authority: JP
Inventors: フロメール，ボルフ―ベルント; ニンネマン，オラフ
Original assignee: インスティテュートフェアゲンビオローギシュフォルシュンクベルリンゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1993-10-28
Filing date: 1994-10-24
Publication date: 1997-04-28
Also published as: DE69432988T2; US20030204867A1; DE69432988D1; CA2175211A1; EP0730652B1; DE4337597C2; AU8060094A; WO1995011978A1; ATE246249T1; US20010003848A1; IL111372A0; AU694457B2; EP0730652A1; DE4337597A1; US6620610B2

Abstract

(57)【要約】適当なベクターに導入後に植物ゲノムに導入され、トランスジェニック植物に新しいアンモニウム輸送体の生成を可能にするかまたは内因性のアンモニウム輸送体の生成を妨げるmRNAの生成に導く、DNA 配列が記載されている。さらに、組換えDNA の構成成分としてのアンモニウム輸送体の配列を含有する、プラスミド、細菌、酵母株、植物細胞およびトランスジェニック植物、並びにアンモニウム輸送体をコードするDNA の同定方法および単離方法も記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】アンモニウム輸送体、該輸送体を含有するプラスミド、細菌、酵母、植物細胞および植物この発明はアンモニウム輸送体のコード領域を含有するDNA 配列に関し、その植物ゲノムへの導入は、トランスジェニック植物における窒素化合物の取り込み（uptake）と輸送を変更するものであり、そしてさらにこの発明は、これらのDN A 配列を含有するプラスミド、細菌、酵母、植物細胞および植物、並びにアンモニウム輸送体をコードするDNA 配列の同定と単離方法に関する。成長する植物に窒素化合物を供給することは、バイオマス生産における限定因子であって、したがって、それは農業生産の収量の限界である。この理由で、窒素化合物は、よく無機肥料の形で、農業バイオマス生産に加えられる。植物が加えられた窒素化合物のほんの一部しか取り込まないことは一方では高エネルギーを入力して生産された窒素肥料を過剰に用いることを必要とし、他方では、それはほんの一部の取り込みをもたらし、そのため窒素化合物が地下水の中に洗い流され、それが相当な環境問題へと導びき得る。従って、植物における窒素の取り込みを変更する可能性の提供と同様に、大量の窒素を取り込める植物に重大な関心がよせられている。硝酸塩の形で窒素を取り込むことが重要であるという情報が多くの植物について提供されている。しかしながら、強酸性の土壌または、集約耕作に従う土壌または強タンニン含有量を有する土壌においては硝酸塩の生成（硝化）が、強度に減少し、窒素のアンモニウムの形での取り込みは、窒素化合物の取り込みのためのもつとも重要なメカニズムとなっている（Ravan & Smith「New Phytol」76： 415〜431(1 976)）。酸性土壌によく適応している植物は、ある程度硝酸塩取り込みよりもアンモニウムを好むようにみえ、他の植物に対しては毒であるだろうアンモニウムイオン濃度に耐えることができる。これらの植物の例は、砂糖きび、ベチュラベルコサ（Betula Verucosa)またはロリウムリジダム（Lolium rigidum）である(Foy他「Ann Rev Plant Physio l 」29： 511〜566(1978))。アンモニウムの毒性はイオンバランスの排除の結果として生じる。すなわち、陽電気を荷電したアンモニウムイオンの取り込みは、もし、カチオンが向流交換（counter exchange）において全然分泌されないなら、細胞質の酸性化を導く。取り込みメカニズムがアンモニウムイオンプロトンの対向輸送（antiport）に基づく輸送システムによるアンモニウムの取り込みにおいてはイオン不均衡は問題ではない。したがって、アンモニウムイオンプロトン対向輸送のメカニズムによって働く輸送システムおよび／またはタンパク質工学技術によって、アンモニウムイオンプロトン対向輸送に変換され得るであろうシステムに多大な関心がよせられている。非常な努力にもかかわらず、現在まで、膜拡散によりもたらされるアンモニウムイオンの損失に対して植物を防御する、輸送システム（回復システム）を分離することは可能ではなかった。アンモニウムに類似しているメチルアミンもまた、アンモニウムという用語によると理解される。能動取り込みシステムは、真菌アスペルギルスニドラン(Aspergillus nidul ans)(たとえばArst他「Mol Gen Genet 」121：239〜245(1973))並びにペニシリウムクリソゲナム（Penicillum chrysogenum）（Hackette 他「J Biol chem 」245：4241〜4250）で研究されていた。これらの研究において、メチルアミンはアンモニウム類似物として用いられた。アスペルギルスニドランについて、メチルアミンの輸送に貢献する５つの遺伝子座が確立されている。ペニシリウムクリソゲナムおよびサッカロミセス・セレビシサエ(Saccharomyces cerevisisae)におけるメチルアンモニウム輸送に関する生化学実験において、輸送は温度およびpHに依存しており、最適pHは 6.0から6.5 で、輸送効率は35℃の温度まで一貫して上昇することが示されてきている（Roon他「J Bacteriol 」 122：502〜509(1975)）。サッカロミセス・セレビシサエにおけるメチルァミンおよび／またはアンモニウム輸送は容易に利用できる、たとえばグルコース中の、化学エネルギーの供給に依存する。輸送システムは、輸送容量および基質に対する親和性の異なる、少くとも三つの独立した輸送体からなる。すなわち、低容量で高親和性の輸送体（Km価＝ 250 μＭ、最大速度Ｖ_max＝20ｎモル／分、細胞のmg当り（乾燥重量））のほかに高容量で低親和性のシステム（Km＝２mM，Ｖ_max＝50ｎモル／分、細胞のmg当り）および中容量で低親和性のシステム（Km＝２mM，Ｖ_max＝50ｎモル／分、細胞のm g当り）がある（Dubois & Grenson「Mol Gen Genet 」175：67〜76（1979））。周囲の培地にグルタミンまたはアスパラギンが存在すると、アンモニウムの取り込みは60〜70％に減ずるか、他のアミンはほとんど何の影響もない（Roon他「J Bacteriol 」 122：502〜509(1975)）。上述のまたは他の真菌およびたとえば細菌のような他の微生物のアンモニウム輸送体の分子の性質については何も知られていない。同じく、膜拡散によるアンモニウムイオンの損失に対して真菌または細胞を防御するシステム（回復システム）について何も知られていない。さらに、アンモニウム輸送体をコードしている遺伝子も知られていない。種々の証拠は、サッカロミセス・セレビシアエにおけるアンモニウムの輸送は少くとも二つの機能的に異なる輸送システムによって達成されることを示唆している（Dubois & Grenson「Mol Gen Genet 」175：67〜76（1979））。すなわち１．サッカロミセスによるメチルアミンの取り込みの速度論的分析法は、見かけ上の直線部分の間の急激な変化を示し、それにより両機能共アンモニウムによって阻害され得る。２．両機能共、変異によって別々に中断され得る。結果として生じる変異体 mep −１および mep−２は一般に独立している。３．変異体 mep−１および mep−２は各々、唯一の窒素源としてのアンモニウムのある培地で増殖するのに、二重の変異体 mep−１/mep−２は、これらの条件ではほとんど増殖を示さない（Dubois & Crenson（1979年）から得たデータ）。たとえば酵母対してのような、同様な詳細な情報を導く、植物におけるアンモニウムの輸送プロセスの解明は入手できないし、変異体の分子生物学的分析の難しさ故に、相当する方法ではほとんど可能でない。この発明の目的は、トランスジェニック植物の窒素化合物の取り込みと輸送における変化をもたらす、アンモニウム輸送体の DNA−配列のコードを提供することである。この発明の目的は、さらに、プラスミドのような、DNA−構成物を提供することであり、それにより、トランスジェニック植物のアンモニウムの輸送は、相当する構成物（プラスミド）の植物ゲノムの導入によって変更されることができ、ゲノムは転写により新しいアンモニウム輸送体分子のトランスジェニック植物中での生成およびまたは植物自身のアンモニウム輸送体分子の生成の抑制を導く。いまや驚くべきことに植物のアンモニウム輸送体をコードする領域を含有する DNA 配列が見い出され、それでヌクレオチド配列に含有されている情報が、植物ゲノムに組み込まれたとき、ａ）プロモーターの制御のもとにセンス方向で翻訳可能なmRNAの発現を可能とし、mRNAはトランスジェニック植物におけるアンモニウム輸送体の合成をもたらす、またはｂ）プロモーターの制御のもとにアンチセンス方向において、翻訳不能なmRNAの発現を可能とし、mRNAはトランスジェニック植物における内因性のアンモニウム輸送体の合成を妨げる。したがって、この発明の他の面は、植物のアンモニウム輸送体のコード領域を含有するDNA 配列である。同様な方法で、アンモニウム輸送体は動物細胞を修飾するためにも用い得る。植物のアンモニウム輸送体をコードするDNA 配列の同定は、DNA 配列が同定および単離され、酵母サッカロミセス・セレビシエにおける特異的変異、特にその相当する株が、唯一の窒素源としてアンモニウムを含む培地においてはもはや増殖できないという結果を有する変異を補完することができる方法によって行なうことができる。このような株は植物cDNA−ライブラリーで形質転換することができ、唯一の窒素源としてアンモニウムを含む培地で増殖できる形質転換体を選択することができる。この発明の更なる面はアンモニウム輸送体をコードする植物からDNA を同定および単離する方法であって、次の工程を含む。ａ）唯一の窒素源としてアンモニウムを含有する培地では増殖できない酵母株の、適当な発現ベクターを用いるcDNA−ライブラリーによる形質転換、ｂ）植物のcDNA−配列の発現後には、唯一の窒素源としてアンモニウムを含有する培地で成長できる形質転換体の選択と増殖、およびｃ）選択された形質転換体からの植物cDNA挿入断片を保持する発現ベクターの単離。工程ａ）における酵母株は、好ましくはアンモニウム取り込みのための輸送システムにおける変異のために、培地からアンモニウムを取り込めないものである。Dubois & Greuson（「Mol．Genet」175：67〜76）に記載された二重の変異体 mep−１/mep−２（株26972c）が好ましく、この二重の変異によりアンモニウムの二つの取り込みシステムが下記の変異で阻止される。この発明のさらなる面は、上述の方法を用いて得ることができ、そしてアンモニウム輸送体の生物活性をもつタンパク質をコードする、植物からのDNA 配列である。このような補完法を用いて、植物アンモニウム輸送体をコードするDNA 配列を同定できるかどうかは種々の因子に依存する。まず、酵母に使用するのに適する発現プラスミドは、植物アンモニウム輸送体をコードするcDNAフラグメントを含有しなければならず、このことは、cDNA合成のための基礎となるmRNAはアンモニウム輸送体を発現する、組織に由来しなければならないことを意味する。植物アンモニウム輸送体について何も知られていないので、アンモニウム輸送体をコードする組織もまた知られていない。更に補完法の成功のための必要条件は、植物に存在するアンモニウム輸送システムが機能的に酵母に発現できることである。というのは変異による解放された欠損の補完が可能なのはこの場合だけだからだ。植物のアンモニウム輸送体について何も知られていないので、酵母における機能的な発現が可能かどうかも、また知られていない。更に驚くべきことに、酵母からのホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーターを含有する酵母において使用するために適する発現プラスミドによる、たとえばアラビドプシスサリアナ（Arabidopsis thaliana）の葉の組織からのcDNAライブラリーの発現によって、この発現プラスミドが特定の植物cDNA断片を含有すれば、二重の変異の補完が可能であることが発見された。これらのcD NAフラグメントは植物アンモニウム輸送体をコードしている。植物アンモニウム輸送体の同定はこの明細書に、アラビドプシスサリアナを例として記載されるけれども、この植物の種に限定されない。植物アンモニウム輸送体をコードする、たとえば次の配列を含有するcDNA。（配列番号１）形質転換された酵母株を用いて同定された。たとえば配列番号１のようなこの発明のDNA 配列は、プラスミドに導入され、それにより、真核細胞における発現のための調節要素と結合され得る（例４参照）。これらの調節要素は一方では転写プロモーターであり、他方では転写ターミネーターである。細胞におけるアンモニウム輸送体の合成を可能とさせる翻訳可能なmRNAの発現を目的として（センス方向）または細胞における内因性のアンモニウム輸送体の合成を妨げる翻訳不可能なRNA の発現を目的として（アンチセンス方向）、真核細胞をプラスミドで形質転換することができる。これらのプラスミドもまたこの発明の態様である。好ましいプラスミドは、プラスミドp35S−MEP −ａおよびp35S−ａ−MEP −ａであり、それらはドイッチェサムルングフォンミクロオルガニズメン(DSM )に寄託されている。その上さらなるこの発明の態様は、この発明のDNA 配列を含む酵母である。植物のメチルアミンまたはアンモニウム輸送体の同定のために用いられた酵母株は、輸送体およびその基質の性質の研究のために用いられ得る。プラスミドに存在する植物アンモニウム輸送体のDNA 配列は、これらの研究の結果にしたがって輸送体の性質を変化させるために変異誘発または組換えによる配列修飾にかけることができる。輸送システムの特異性を変化させることによって、新しい化合物の輸送が可能であり、それは興味ある応用を開く（下記参照）。それに加えて、輸送体の適当な変化によって、輸送メカニズムを変更し得る。特に、しかし排他的ではないが、たとえば、細胞質の酸性化の結果として植物に取り込まれたアンモニウムイオンの毒性を防止する、アンモニウムイオン−プロトン−対向輸送に起因する効果により、輸送体の共輸送特性を変更する変化を期待できる。このように、発現プラスミド中に植物アンモニウム輸送体のDNA 配列を含む、この発明の酵母株を変異選択系に使用することができる。トランスジェニック植物におけるこの発明の植物アンモニウム輸送体のDNA 配列に相当するRNA の発現によって、植物窒素代謝の変化を得ることが可能であり、その経済的な重要性は明らかである。窒素は主に成長を制限する原因となる栄養物である。種子の発芽能力と同様に実生の植物の生存能力は、直接的に貯蔵組織の窒素含有量に依存する。高タンパク質含有量の高価値食糧材料の生成は十分な窒素供給に依存する。したがってたとえば、アンモニウムのような窒素化合物の新しい取り込みシステムの追加によって、窒素取り込みの変化は、特に窒素制限のもとでトランスジェニック作物の収量の増加をもたらすことができる。このように、トランスジェニック植物は、低投入量条件のもとで高収量で栽培され得る。しかしながら、トランスジェニック植物におけるアンモニウムの取り込みを抑制する可能性も、また、特定の条件のもとでは望ましい。たとえば、成長に適さない酸性土壌でのトランスジェニック植物の栽培が期待される。硝化を抑制する結果として、そのような土壌におけるアンモニウムイオン濃度は、特定の植物にとっては毒である濃度で存在するだろう。というのは、植物から取り込まれた細胞中のアンモニウムは、もはや十分に代謝され得ず、細胞毒として作用するからだ。従って、アンモニウム輸送体の生合成を抑制することによる、アンモニウムの取り込みの抑制は、酸性土壌での栽培を可能にするという点で、トランスジェニック植物を変更し得る。この発明のさらなる態様は、この発明の配列が組換えDNA 分子の成分として導入され、この組換えDNA 分子がゲノムに安定に取り込まれたトランスジェニック植物であって、これらの配列の存在に基づいて、その細胞において、追加のアンモニウム輸送体の合成を達成し、それによって、これらの細胞が形質転換されていない植物と比較して大量のアンモニウムを取り込めるかまたは内因性のアンモニウム輸送体の合成の阻害を達成し、それによってこれらの細胞が形質転換されていない細胞に比してアンモニウムの減少した取り込みを示すかのいずれかである、トランスジェニック植物である。たとえば、トランスジェニック作物は、タバコ、じゃがいも、テンサイ、大豆、エンドウ、豆(beans)またはトウモロコシである。双子葉植物および単子葉植物の遺伝的修飾は、広く知られた方法により行うことができる（たとえば、Gasser．C．S.，Fraley R．T.，「Science 」244：1293〜1299（1989）、Portrykus「Ann Rev Plant Mol Biol Blant Phys iol」42：205〜225(1991)）。植物における発現のために、コード配列は、転写調節要素と連結されねばならない。プロモーターと呼ばれるこのような要素は既知である（EP375091）。さらに、コード領域は、それによってそれらが正確に転写され得る転写終止シグナルを供給されねばならない。このような要素もまた記載されている（Gielen 他「EMBO J」８：23〜29（1989））。転写開始領域は、宿主植物に対して外来性および／または異種性であってもよく、また生来的および／または同種性であってもよい。所望なら、終止領域はお互に交換できる。転写開始および転写終止領域のDNA 配列は合成的に調製できるか、天然から得ることができるかまたは合成および天然のDNA 成分の混合物から得ることができる。高等植物に外来遺伝子を導入するために、大腸菌の複製シグナルおよび形質転換された細胞の選択を許容する標識を含む多くのクローニングベクターが利用できる。そのようなベクターの例はpBR322，pUC −シリーズ、M13mp−シリーズ、pACYC 184 等である。植物に所望の遺伝子を導入する方法に依存して、他のDNA 配列も適当であり得る。Ti またはRi−プラスミドが、たとえば植物細胞の形質転換に用いられたとすれば、 TiおよびRi−プラスミドＴ−DNA の少くとも右の境界、しかしながらよく右および左の境界が、導入される遺伝子に、フランキング領域として付着する。植物細胞の形質転換のためのＴ−DNA の使用は徹底的に研究されてきており、EP 12051 6，Hoekama「In： The Binary Plant Vector System」Chapter V（Offsetdrukke riy Kanters B．V．Alblasserdam,1985年）、Fralery 他「Crit．Rev．Plont Sc i．」４：１〜46およびAn他「EMBO J. 」４： 277〜287 によく記載されている。一旦導入されたDNA がゲノムに組み込まれたら、通例、そこで安定であって、また最初に形質転換された細胞の子孫の中にもとどまる。それは、通常選択標識を含み、選択標識は、形質転換された植物細胞に、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ヒグロマイシンまたはホスフィノトリシン(phosphinotricin)等のような殺生物剤または抗生物質に対する耐性を誘導する。だから、個々の使用された標識は、導入されたDNA のない細胞から、形質転換された細胞の選択を可能とすべきである。アグロバクテリア（agrobacteria）を用いる形質転換のほかに、植物宿主細胞にDNA を導入する多くの他の技術が利用できる。これらの技術は、プロトプラストの融合、DNA のマイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション、並びにバリスチック(ballistic)法およびウイルス感染を含む。形質転換された植物材料から、全植物体を選択のために抗生物質または殺生物剤を含有する適当な培地の中で再生することができる。結果として生じた植物を、次いで導入された DNA の存在について試験することができる。この発明のさらなる態様は、この発明のDNA 配列が組換えDNA 分子の成分として導入され、この組換えDNA 分子が安定にゲノムに組み込まれた、これらの配列の存在に基づいて、その細胞において、追加の植物アンモニウム輸送体の合成を達成し、それによってこれらの細胞が形質転換されていない植物に比して大量のアンモニウムを取り込めるか、または内因性のアンモニウム輸送体の合成の阻害を達成し、それによってこれらの細胞が形質転換されていない細胞に比してアンモニウムの減少した取り込みを示すかのいずれかである形質転換された植物細胞である。注入およびエレクトロポレーションにおいてプラスミドに何らの特別の要求も寄せられていない。たとえば pUC−誘導体のような単純なプラスミドを用い得る。しかしながら、このような形質転換された細胞から全植物体が再生されるには選択標識遺伝子の存在が必要である。形質転換された細胞は、通常の方法で植物の中で増殖する（またMc Cormick他「Plant Cell Reports」５：81 〜84（1986）参照）。これらの植物は通常に成長し、同じ形質転換した遺伝子または異なった遺伝子を有する植物と交配させることができる。生じたハイブリッド個体は、対応する表現型を有している。窒素化合物の取り込みを変えるための植物アンモニウム輸送体DNA の導入は、例として、アラビドプシスサリアナおよびタバコを用いて、この明細書に記載される。しかしながら、この植物の種を用いることに限定されない。この発明のDNA 配列は、プラスミドにもまた導入することができ、それによって原核細胞において発現を進める要素と結合させることができる。真核アンモニウム輸送体の翻訳可能RNA 配列の細菌からの生成は、原核生物と真核生物の膜構造がかなり異なるにもかかわらず、さらに驚くべきことに、原核生物がいまやその基質特異性を有する機能的真核生物アンモニウム輸送体を発現できることを意味する。このことはアンモニウム輸送体の同定に用いる酵母株についてと同様に、輸送体の性質およびその基質の研究に用いることができる細菌株の生産を可能にし、このことが興味ある応用を開く。この発明は、この発明のプラスミドを含有する細菌にも関する。この発明のDNA 配列も、また、通常の微生物学的方法を用いてDNＡ配列の組換えによって変異または配列修飾を許容するプラスミドに導入することもできる。このような方法で、アンモニウム輸送体の特異性を修飾することができる。修飾されたアンモニウム輸送体は、たとえば農業用のトランスジェニック植物の形質転換に用いることができ、それによって植物への殺虫剤の輸送およびまた植物成長調節剤の輸送の両方を期待することができる。通常の方法（Sambrook他「Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第２版」Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA（1989）参照）によって、塩基の交換を行うことができ、天然あるいは合成の配列を加えることができる。DN A フラグメントを相互に融合させるために、アダプターまたはリンカーをフラグメントに加えることができる。さらに、適当な制限切断部位を調製するか、過剰のDNA または制限切断部位を除去する操作を行うことができる。挿入、削除、または転移もしくはトランスバージョンのような置換が実行されるべき場合には、試験管内変異誘発、プライマーの修復、制限酵素処理または連結反応を用いることができる。分析方法として、一般に配列分析、制限分析および他の生化学分子生物学的方法を用い得る。各操作の後、用いられたDNA 配列を切断することおよび他のDNA 配列と融合することができる。各プラスミド配列は同じまたは異なるプラスミドにクローン化することができる。この発明は、また、この発明のDNA 配列が局在しているプラスミドの誘導体または部分にも関する。この発明のDNA 配列およびプラスミドの誘導体または部分も、また原核および真核細胞の形質転換に用いることができる。さらに、この発明のDNA 配列は、通常の方法を用いて、アンモニウム輸送体分子をコードする種々の種の植物のゲノムから相同的な配列を単離するためにも用いることができる。これらの配列で植物細胞の形質転換のための構成物を製造することができ、それはトランスジェニック植物の輸送方法を変更する。「相同性」または「相同の配列」なる用語は、60％から80％の、好ましくは80 ％から95％の、特に95％から 100％の配列一致性であると理解されるべきである。関連するDNA 配列を特定するために、植物の種の遺伝子の内容または植物の種の遺伝子の発現を代表する、遺伝子ライブラリーをまず準備すべきである。前者はゲノムライブラリーであり、後者はcDNAライブラリーである。これらから、プローブとしてこの発明のDNA 配列を用いて関連する配列を単離できる。一旦、関連する遺伝子が同定され、単離されると、配列の決定およびこの配列からコードされるタンパク質の性質の分析は可能である。このようにして得られたアンモニウム輸送体のDNA 配列もまたこの発明の一部であり、上述のように使用することができるだろう。上述したDNA の使用もまたこの発明の一部である。この発明のさらなる態様は、この発明のDNA 配列とハイブリダイズし、そして、アンモニウム輸送体の生物学活性を有するタンパク質をコードする植物からの DNA 配列である。「ハイブリダイゼーション」なる用語は、この点に関して、適当なハイブリダイゼーション条件、好ましくは、たとえばSambrook他によって記載されたような（「Molecular Cloning，A Laboratory Manual 第２版」Cold S pring Harbor Laboratory Press．Coldspring Harbour，N．Y．（1989））、ストリンジェント条件のもとでのハイブリダイゼーションである。アンモニウム輸送体の重要な生物学活性は、生物の膜を経てアンモニウムまたはそれらの類似物を輸送する能力である。この活性は、アンモニウムまたはそれらの類似物の、たとえば、この発明の例３に記載するような特定のアンモニウム輸送体を発現する細胞による取り込みにより測定することができる。寄託次のプラスミドを、1993年10月26日に、ドイツ国のブラウンシュバイヒにある、ドイッチェサムルングフォンミクロオルガニズメン(DSM)に寄託した（寄託番号）。プラスミド p35S−MEP −ａ（DSM8651）プラスミド p35S−ａ−MEP −ａ（DSM8652）図面の説明図１はプラスミドp35S−MEP −ａを示し、それはプラスミドpBlN19（Bevan．M .，「Nucl Acids Res」12：8711〜8721（1984））の誘導体である。それは、下記のものを含む。Ａ＝35Ｓプロモーター（nt 6909〜7437）を担持するカリフラワーモザイクウイルスのゲノムからのフラグメント。このプロモーターフラグメントはプラスミドpDH51（Pietrzak 他「Nucl．Acid Res．」14：5857〜5868）からEcoRＩ/KpnＩフラグメントとして調製された。Ｂ＝フラグメントＡに対しセンス方向のアラビドプシスサリアナのアンモニウム輸送体のコード領域を有するcDNAの NotＩ/NotＩフラグメント。フラグメントＢの矢印はcDNAの読とり方向を示す。Ｃ＝プラスミドpTiACH5(Gielen 他「EMBO J」３： 835〜846)のＴ−DNA の遺伝子３のポリアデニル化シグナル、ヌクレオチド 11749から 11939、これはプラスミドpAGV40(Herrera-Estrella他「Nature」303，209〜213)から PvuII／HindI IIフラグメントとして単離され、そして PvuII切断部位に SphＩリンカーを付加した後、pBlN19からのポリリンカーの SphＩおよびHindIII切断部位の間にクローン化された。図２は、pBlN19プラスミド（Bevan．M.，「Nucl Acids Res」12： 8711〜8721（1984））の誘導体である、プラスミドp35S−ａ−MEP−ａを示す。それは下記のものを含む。Ａ＝35Ｓプロモーター（nt 6909〜7437）を担持するカリフラワーモザイクウイルスのゲノムからのフラグメント。このプロモーターフラグメントはプラスミドpDH51（Pietrzac 他「Nucl．Acid Res．」14：5857〜5868）からのEcoRＩ /KpnＩフラグメントとして調製された。Ｂ＝フラグメントＡに対し、アンチセンス方向のアラビドプシスサリアナのアンモニウム輸送体のコード領域を有するcDNAの NotＩ/NotＩフラグメント。フラグメントＢの矢印はcDNAの読とり方向を示す。Ｃ＝プラスミドpTiACH5(Gielen 他「EMBO J」３： 835〜846)のＴ−DNA の遺伝子３のポリアデニル化シグナル、ヌクレオチド 11749から 11939。これは、プラスミドpAGV40から PvuII／HindIIIフラグメントとして単離され、そして PvuI I切断部位に SphＩリンカーを付加した後、pBlN19からのポリリンカーの SphＩおよびHindIII切断部位の間にクローン化された。次の例はこの発明を説明するものであるが、この発明を制限するものではなく、植物アンモニウム輸送体の機能と同様にクローン化と同定および窒素化合物の取り込みおよび輸送を変化させる目的での植物の遺伝子修飾のためのその使用を記載する。例と同様な方法で、他の植物、特にじゃがいも、テンサイ、トウモロコシ等のような収穫植物を修飾することができる。例１から４では、次の標準的な方法と特殊な技術が用いられた。１．クローン化方法大腸菌でのクローン化のために、pBluescript SKからのポリリンカーを含有するpACYC ベクターの誘導体が用いられた。酵母の形質転換のためにpFL61 ベクター(Minet & Lacroute「Curr Gene」18： 287〜291)が用いられた。植物の形質転換のために、遺伝子構成物がpBlN19（Bevan「Nucl Acids Res」1 2：8711〜8721（1984））の誘導体である、バイナリーベクターpBinARの中にクローン化された（例４参照）。２．細菌および酵母株 pAcYC ベクターおよびpBinAR構成体のために、大腸菌株 DH5αが用いられた。酵母のcDNAライブラリーの生産のための出発株として、変異 mep−１/mep−２および ura３を伴う酵母株26972c（Dubois & Grenson「Mol Gen Gnete」175：67 〜76（1979））が用いられた。じゃがいも植物のプラスミドの形質転換が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404株（Bevan「Nucl．Acids Res 」1 2：8711〜8720（1984））を用いて行なわれた。３．アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換による直接形質転換によって行なわれた（「Nucleic Acids Res 」16：9877（19 88））。形質転換されたアグロバクテリアのプラスミドDNA はBirnbormおよびDo lyの方法（「Nucl Acids Res」７：1513〜1523（1979））に従って単離され、適当な制限酵素切断後、ゲル電気泳動により分析された。４．植物の形質転換タバコ 10mlのアグロバクテリウム・ツメファシエンスの選択下で増殖させた一夜培養物を沈降させ、同容積の抗生物質のない培地に再懸濁した。無菌のペトリ皿中で、無菌の植物の中央の葉脈が除去された葉のディスク（約１cm²）を、この細菌の懸濁液中に液浸した。次いで葉のディスクを、２％のショ糖および 0.8％のバクト寒天を有するMS培地（Murashige 他「Physiologi a Plantarum 」15， 473〜493(1962)）を含有するペトリ皿にぎっしりと詰まった配置状態で置いた。25℃暗所での２日のインキュベーション後、500mg／ｌのクラホラン（Claforan）、50ｍ／ｌのカナマイシン、１mg／ｌのベンジルアミノプリン(BAP)、0.2mg／ｌのナフチル酢酸(NAA)および 0.8％のバクト寒天を含有するMS培地に移した。増殖中の苗条（shoots）を、250mg／ｌのクラホランおよび50mg／ｌのカナマイシンを有するホルモンを含まないMS培地に移した。アラビドプシスサリアナ種子から成長させたアラビドプシス・サリアナの７日目の無菌の培養物からの子葉を、タバコの懸濁培養物の層（支持細胞層として）と共にCl−培地上で２日間、次いで、アグロバクテリウムツメファシエンスの懸濁液（懸濁液の調製についてはタバコの形質転換の項を参照）中で５分間プレインキュベートし、次いで、低光条件で支持細胞層と共にCl−培地上で２日間インキュベートした。このアグロバクテリアとの共培養の後、外植片をSlMl−培地上に置床し、このSlMl− 培地は１週に１回新しいものと取り替えた。カルスの生成後、外植片を SlMll− 培地に移植し、次いで、カナマイシン選択下に栽培した。カルス材料から小さな苗条を分離し、Rl−培地に移植した。種子の分離後、これらを分析できるであろう。個々の培地は次のとおりであった。例１植物のメチルアミンまたはアンモニウム輸送体のクローニング酵母株26972c（Dubois & Grenson「Mol Gen Genet 」175：67〜76（1979））のアンモニウム輸送体二重変異の補完のために、Minet（Minet他「Plant J 」２： 417〜422(1992)）によって利用可能にされている、酵母発現ベクターpFL61（ Minet & Lacroute「Curr Genet」18： 287〜291(1990)）中のアラビドプシスサリアナ（２枚葉段階）からの若い生殖細胞系(germ line)のcDNAを用いた。約１μｇのcDNA−挿入断片を有するベクターがDohmen他の方法（「Yeast」７： 69 1〜692(1991)）によって酵母株26972cに形質転換された。唯一の窒素源として１ mMのNH₄Cl を含む最小培地で増殖できるであろう酵母の形質転換体を繁殖させた。該系から、通常の方法によってプラスミド−DNA が製造された。このDNA を直ちに2697 2c株に形質転換した。このようにして、mep−１/mep−２二重変異を補完できるプラスミド pFL61− Mep−ａが得られた。このプラスミドは1.75kbp のサイズの挿入を有している。 26972cのプラスミド pFL61− MEP−ａによる形質転換によって得られる酵母菌株26972c:: pFL61− MEP−ａはメチルアミンまたはアンモニウムの取り込みの研究に用い得る（例３参照）。通常の方法（Sambrook他「Molecular cloning：A．laboratorymanual 第２版」Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA（1989））によるアンモニウム輸送体遺伝子 MEP−ａのコード領域の遺伝的修飾によってその輸送メカニズムの特異性または特色を変更することができる。株26972c:: pFL61− MEP−ａは、この発明のアンモニウム輸送系（例３を参照のこと）を用いて、アンモニウム輸送のインヒビターまたはプロモーターを直接的に試験するのに適している。プラスミド pFL61− MEP−ａのcDNA挿入は、他の種の植物または他の生物体、たとえば菌や動物系からの同様なDNA 配列の同定に用いることができる。このためには、ハイブリダイゼーション技術を用いることができる。同様にcDNA配列を用いて、遺伝子生成物の融合タンパク質としての、細菌中の発現のための構成物を通常の方法によって調製できる。融合タンパク質を用いて、他の生物体中の同様なタンパク質を同定する抗体を製造できる。例２プラスミド pFL61− MEP−ａのcDNA挿入断片の配列分析例１から得られた酵母系26972c:: pFL61− MEP−ａから、プラスミド pFL61− MEP−ａを単離し、そのcDNA挿入物を NotＩフラグメントとして調製した。該フラグメントは、修飾されたpACYC ベクター中でクローン化され（Chang & Cohen 「Bacteriol 」134：1141 〜1156（1978））、このベクターは、HindII(nt 3211)および埋められた（fille d）HindIII(nt 1523)切断位置の間に、BssHIIフラグメントとしてpBluescript からのポリリンカーを含有していた。この修飾により、テトラサイクリン耐性が失なわれる。該cDNAフラグメントは、このようにして得られたベクターpACH−Ｈ中のNotＩ切断位置に、NotＩフラグメントとしてクローン化された。合成オリゴヌクレオチドを用いて、Sanger他の方法（「Proc Natl Acad Sci USA」74：5463 〜5467（1977））によって挿入断片の配列決定を行った。該配列は、配列番号１に示されている。例３酵母系26972c:: pFL61− MEP−ａへの¹⁴Ｃ−標識メチルアミンの取り込みの研究酵母系26972c:: pFL61，26972c:: pFL61− MEP−ａおよびそれらの出発系S127 8b（Dubois & Grenson「Mol Gen Genet 」175：67〜76（1979）），MEP−１/MEP −２ ura３）を 1.7ｇのアンモニウムおよびアミノ酸を含まないイースト・ニトロゲン・ベース（Difco）、20ｇのアガロース、１％のグルコース（ｗ／ｖ）、0 .5mg／ｌのプロリンを添加した液体培地で、培養物が対数の期に達するまで増殖させた。各25mlの培養液を遠心分離した後、細胞を10mMのpH７のリン酸塩または pH４のリン酸塩で洗浄し、 1.5mlの10mMのリン酸塩緩衝液中に取り込んだ。輸送の測定をはじめる10分前に、10mMのグルコース最終濃度にされた。 100μmlの該懸濁液を、pH４または７の10mMのリン酸塩、 100μＭの標識していないメチルアミンおよび５μCi ¹⁴Ｃ−標識メチルアミン（0.1mCi／1.9 μmol）（最終濃度）の溶液に加えた。メチルアミンの取り込みを10，60，120 および 180秒後に測定した。このために、50μｌまでの出発物質およびガラス繊維フィルター上に吸着された１mlの容積の H₂O＋３mMの標識していないメチルアミンを用いた。10mlの H₂O＋３mMの標識していないメチルアミンで洗浄した後、取り込まれた¹⁴ Ｃ−標識メチルアミンの量をシンチレーションにより測定した（表1aおよび1b ）。標識されたメチルアミンの取り込みは、0.5mMのNH₄Cl（表II）および 0.5mMの KCl（表III）の共インキュベーションの場合、並びに脱共役剤であるジニトロフェノール(DNP)およびシアン化カルボニルｍ−クロロフェニルヒドラゾン（CCCP ）との共インキュベーションの場合（表IV）と比較された。典型的な実験の値は表１から表IVに示されている。例４アンモニューム輸送体のコード領域の過剰発現(over-expression)の構成物による植物の形質転換アラビドプシス・サリアナからのメチルアミンまたはアンモニウム輸送体のcD NAを挿入断片として含有するプラスミド pFL61− MEP−ａから、挿入断片を Not Ｉフラグメントとして単離し、pBinARの SmaＩ切断位置の突き出ている末端をフィルインした後クローン化した。cDNAはプラスミドマップで“Ｂ”の名称を有している（図１）。pBinARの35Ｓプロモーターに対してＢがセンス方向で導入されているかいないかに依存して、生じたプラスミドはp35S− MEP−ａまたはp35S−ａ− MEP−ａの名称を有している。プラスミドpBinARはpBlN19（Bevan「Nucl Acids Res」12 ：8711〜8720（1984））の誘導体である。そのEcoRＩおよび KpnＩ切断位置の間に、35Ｓプロモーター（nt 6909〜7437）を有するカリフラワーモザイクウイルスのゲノムからのフラグメントを導入した。プロモーターフラグメントをプラスミドpDH51（Pietrzak 他「Nucl Acids Res」14：5857〜5868）EcoRＩ/KpnＩフラグメントとして調製した。プラスミドマップにおいて、プロモーターフラグメントは“Ａ”の名称を有している。pBinARの SphＩおよびHindIII切断位置の間に、プラスミドpTiACH5(Gielen 他「EMBO J」３： 835〜846)のＴ−DNAの遺伝子３のポリアデニル化シグナルが挿入される。プラスミドpAGV40（Herrera-Estr ella他「Nature」303：209〜2139（1983））からの PvuII／HindIIIフラグメントもまた SphＩリンカーで PvuII切断位置に供給された。ポリアデニル化シグナルはプラスミドマップにおいて“Ｃ”の名称を有している。プラスミドp35S− MEP−ａおよびp35S−ａ− MEP−ａによるアグロバクテリアの形質転換後、これらはタバコおよびアラビドプシスサリアナの葉の部分の感染のために用いられた。サザンブロット分析を用いて完全な、非転位キメラ遺伝子の存在が示された、両構成物の10個の独立して得られた形質転換体を窒素含量の変化について試験した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月３０日【補正内容】請求の範囲１．ヌクレオチド配列に含有されている情報が、植物のゲノムに合体された時にセンス方向のプロモーターの調節のもとに、トランスジェニック植物のアンモニウム輸送体の合成に導く翻訳可能なmRNAの発現を可能とするものであることを特徴とする、請求項４に記載の方法によって得ることができる植物のアンモニウム輸送体のコード領域を含有する単離されたDNA 配列。２．ヌクレオチド配列に含有されている情報が、植物のゲノムに合体された時に、アンチセンス方向のプロモーターの調節のもとに、トランスジェニック植物の内因性のアンモニウム輸送体の合成を妨げる翻訳不可能なmRNAの発現を可能とするものであることを特徴とする、請求項４に記載の方法によって得ることができる植物のアンモニウム輸送体のコード領域を含有する単離されたDNA 配列。３．下記のヌクレオチド配列（配列番号１）：を含有することを特徴とする請求項１または２に記載のDNA 配列。４．アンモニウム輸送体をコードする植物からのDNA 配列の同定および単離方法において、ａ）適当な発現ベクターを用いる植物cDNAライブラリーによる、唯一の窒素源としてアンモニウムを含有する培地では増殖できない酵母株の形質転換、ｂ）植物cDNA−配列の発現後には、唯一の窒素源としてアンモニウムを含有する培地で増殖できる形質転換体の選択および繁殖、並びにｃ）選択された形質転換体からの植物cDNAを担持する発現ベクターの単離、の工程を含むことを特徴とする方法。５．請求項４に記載の方法によって得ることができる、アンモニウム輸送体の生物活性を有するタンパク質をコードする植物からのDNA 配列。６．請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA 配列を含んでなるプラスミド。７．プラスミドp35S− MEP−ａ (DSM8651)。８．プラスミドp35S−ａ− MEP−ａ (DSM8652)。９．アンモニウム輸送体を発現する請求項６〜８項のいずれか１項に記載のプラスミド、それらの誘導体またはそれらの部分の原核細胞および真核細胞の形質転換のための使用。 10．請求項４に記載の方法によって単離されたDNA 配列が組換えDNA 分子の構成成分として導入され、アンモニウム輸送体をコードする該DNA 分子が安定にゲノムに取り込まれ、これらの配列の存在に基づいてその細胞において、追加の植物アンモニウム輸送体の合成を達成し、それによってこれらの細胞が形質転換されていない植物と比較して大量のアンモニウムを取り込めるか、または内因性のアンモニウム輸送体の合成の阻害を達成し、それによってこれらの細胞が形質転換されていない細胞と比較して減少したアンモニウムの取り込みを示すかのいずれかである、トランスジェニック植物。 11．請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA 配列を含有する酵母。 12．請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA 配列を含有する細菌。 13．請求項４に記載の方法によって単離されたDNA 配列が組換えDNA 分子の構成成分として導入され、アンモニウム輸送体をコードする該DNA 分子が安定にゲノムに取り込まれ、これらの配列の存在に基づいて、その細胞において、追加の植物アンモニウム輸送体の合成を達成し、それによってこれらの細胞が形質転換されていない植物と比較して大量のアンモニウムを取り込めるか、または内因性のアンモニウム輸送体の合成の阻害を達成し、それによってこれらの細胞が形質転換されていない細胞と比較して減少したアンモニウムの取り込みを示すかのいずれかである、植物細胞。 14．全植物体の再生のための請求項13に記載の植物細胞の使用。 15．化合物の輸送のためにアンモニウム輸送体の特異性を変化させた誘導体の調製のための請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。 16．細菌、真菌およびトランスジェニック植物のゲノムからのアンモニウム輸送体の機能を有する相同の配列の単離のための請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。 17．原核細胞および真核細胞においてアンモニウム輸送体の合成を可能にする、翻訳可能なmRNAの発現のための、センス方向の転写プロモーターと共同して用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。 18．原核細胞および真核細胞の内因性のアンモニウム輸送体の合成を妨げる翻訳不可能なmRNAの発現のための、アンチセンス方向の転写プロモーターと共同して用いる、請求項２，３または４に記載のDNA 配列の使用。 19．変更された窒素代謝を有するトランスジェニック植物の調製のための請求項１〜３または５のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。 20．増加した収量を有するタバコ、じゃがいも、テンサイおよびトウモロコシのようなトランスジェニック収穫植物の調製のための請求項１，３または５のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。 21．低インプット状態でのタバコ、じゃがいも、テンサイおよびトウモロコシのようなトランスジェニック収穫植物の調製のための請求項２，３または５のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。 22．酸性土壌においてもまた成長する、トランスジェニック収穫植物の調製のための請求項２，３または５のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．ヌクレオチド配列に含有されている情報が、植物のゲノムに合体された時にセンス方向のプロモーターの調節のもとに、トランスジェニック植物のアンモニウム輸送体の合成に導く翻訳可能なmRNAの発現を可能とするものであることを特徴とする、植物のアンモニウム輸送体のコード領域を含有するDNA 配列。２．ヌクレオチド配列に含有されている情報が、植物のゲノムに合体された時に、アンチセンス方向のプロモーターの調節のもとに、トランスジェニック植物の内因性のアンモニウム輸送体の合成を妨げる翻訳不可能なmRNAの発現を可能とするものであることを特徴とする、植物のアンモニウム輸送体のコード領域を含有するDNA 配列。３．下記のヌクレオチド配列（配列番号１）：を含有することを特徴とする請求項１または２に記載のDNA 配列。４．アンモニウム輸送体をコードする植物からのDNA 配列の同定および単離方法において、ａ）適当な発現ベクターを用いる植物cDNAライブラリーによる、唯一の窒素源としてアンモニウムを含有する培地では増殖できない酵母株の形質転換、ｂ）植物cDNA−配列の発現後には、唯一の窒素源としてアンモニウムを含有する培地で増殖できる形質転換体の選択および繁殖、並びにｃ）選択された形質転換体からの植物cDNAを担持する発現ベクターの単離、の工程を含むことを特徴とする方法。５．請求項４に記載の方法によって得ることができる、アンモニウム輸送体の生物活性を有するタンパク質をコードする植物からのDNA 配列。６．請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA 配列を含んでなるプラスミド。７．プラスミドp35S− MEP−ａ (DSM8651)。８．プラスミドp35S−ａ− MEP−ａ (DSM8652)。９．請求項６〜８項のいずれか１項に記載のプラスミド、それらの誘導体またはそれらの部分の原核細胞および真核細胞の形質転換のための使用。 10．本発明のDNA 配列が組換えDNA 分子の構成成分として導入され、この組換えDNA 分子が安定にゲノムに取り込まれ、これらの配列の存在に基づいてその細胞において、追加の植物アンモニウム輸送体の合成を達成し、それによってこれらの細胞が形質転換されていない植物と比較して大量のアンモニウムを取り込めるか、または内因性のアンモニウム輸送体の合成の阻害を達成し、それによってこれらの細胞が形質転換されていない細胞と比較して減少したアンモニウムの取り込みを示すかのいずれかである、トランスジェニック植物。 11．請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA 配列を含有する酵母。 12．請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA 配列を含有する細菌。 13．本発明のDNA 配列が組換えDNA 分子の構成成分として導入され、この組換えDNA 分子が安定にゲノムに取り込まれ、これらの配列の存在に基づいて、その細胞において、追加の植物アンモニウム輸送体の合成を達成し、それによってこれらの細胞が形質転換されていない植物と比較して大量のアンモニウムを取り込めるか、または内因性のアンモニウム輸送体の合成の阻害を達成し、それによってこれらの細胞が形質転換されていない細胞と比較して減少したアンモニウムの取り込みを示すかのいずれかである、植物細胞。 14．全植物体の再生のための請求項13に記載の植物細胞の使用。 15．アンモニウム輸送体の特異性を変化させた誘導体の調製のための請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。 16．細菌、真菌およびトランスジェニック植物のゲノムからの相同の配列の単離のための請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。 17．原核細胞および真核細胞においてアンモニウム輸送体の合成を可能にする、翻訳可能なmRNAの発現のための、センス方向の転写プロモーターと共同して用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。 18．原核細胞および真核細胞の内因性のアンモニウム輸送体の合成を妨げる翻訳不可能なmRNAの発現のための、アンチセンス方向の転写プロモーターと共同して用いる、請求項２，３または４に記載のDNA 配列の使用。 19．変更された窒素代謝を有するトランスジェニック植物の調製のための請求項１〜３または５のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。 20．増加した収量を有するタバコ、じゃがいも、テンサイおよびトウモロコシのようなトランスジェニック収穫植物の調製のための請求項１，３または５のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。 21．低インプット状態でのタバコ、じゃがいも、テンサイおよびトウモロコシのようなトランスジェニック収穫植物の調製のための請求項２，３または５のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。 22．酸性土壌においてもまた成長する、トランスジェニック収穫植物の調製のための請求項２，３または５のいずれか１項に記載のDNA 配列の使用。