DE60005646T2 - Synthese von markierten oligonucleotiden auf festphasenträgern - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Nukleinsäurechemie und insbesondere Verfahren und Zusammensetzungen zum Markieren von Oligonukleotiden auf Festträgern. Marker-Reagenzien umfassen Hybridisierungs-stabilisierende Gruppen, Fluoreszenzfarbstoffe, Fluoreszenzlöscher, Energie-Transfer-Farbstoffgruppen, chemilumineszierende Farbstoffe, Metalloporphyrine, Aminosäuren, Proteine, Peptide, Enzyme und Affinitätsliganden.
  • REFERENZEN
  • Andrus, A. "Chemical methods for 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers" (1995) in PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, Seiten 39–54.
  • Andrus, A., McCollum, C. und Zon, G. "Automated system for polynucleotide synthesis and purification", US-PS 5,047,524 , erteilt am 10. September 1991.
  • Andrus, A., McCollum, C. und Zon, G. "Automated system for polynucleotide synthesis and purification", US-PS 5,262,530 , erteilt am 16. November 1993.
  • Beaucage, S. und Iyer, R. "Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach", Tetrahedron 48: 2223–2311 (1992).
  • Bergot, B., Chakerian, V., Connell, C., Eadie, J., Fung, S., Hershey, N., Lee, L., Menchen, S. und Woo, S. "Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination", US-PS 5,366,860 , erteilt am 22. November 1994.
  • Blackburn, G. und Gait, M. Hrsg. "DNA and RNA structure" in Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 2. Auflage, (1996) Oxford University Press, Seiten 15– 81.
  • Bronstein, I. und Voyta, J., "Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes", US-PS 4,931,223, erteilt am 5. Juni 1990.
  • Bronstein, K., Fortin, J., Stanley, P., Stewart, G. und Kricka, L. "Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays", Anal. Biochemistry 219: 169–81 (1994).
  • Cardullo, R., Agrawal, S., Flores, C., Zamecnik, P. und Wolf, D. "Detection of nucleic acid hybridization by non-radiative fluorescence resonance energy transfer", Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8790–8794 (1988).
  • Caruthers, M. und Beaucage, S. "Phosphoramidite compounds and processes", US-PS 4,415,732 , erteilt am 15. November 1983.
  • Caruthers, M. und Matteucci, M. "Process for preparing polynucleotides", US-PS 4,458,066 , erteilt am 3. Juli 1984.
  • Clegg, R. "Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids", Meth. Enzymol. 211: 353–388 (1992).
  • Dib, C., Faure, S., Fizames, C., Samson, D., Drouot, N., Vignal, A., Millasseau, P., Marc, S., Hazan, J., Seboun, E., Lathrop, M., Gyapay, G., Morissette, J., Weissenbach, J. "A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites", Nature 380: 6570: 152–4 (1996).
  • Dueholm, K., Egholm, M., Behrens, C., Christensen, L., Hansen, H., Vulpius, T., Petersen, K., Berg, R., Nielsen, P. und Buchardt, O. "Synthesis of peptide nucleic acid monomers containing the four natural nucleobases: thymine, cytosine, adenine, and guanine and their oligomerization", J. Org. Chem. 59: 5767–73 (1994).
  • Egholm, M., Buchardt, O., Christensen, L., Behrens, C., Freier, S., Driver, D., Berg, R. und Kim, S. "PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen bonding rules", Nature 365: 566–68 (1993).
  • Englisch, U. und Gauss, D. "Chemically modified oligonucleotides as probes and inhibitors", Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30: 613–29 (1991).
  • Flanagan, W., Wagner, R., Grant, D., Lin, K. und Matteucci, M. "Cellular penetration and antisense activity by a phenoxazine-substituted heptanucleotide", Nature Biotech. 17: 48–52 (1999).
  • Fodor, S., Pirrung, M., Read, J., und Stryer, L. "Array of oligonucleotides on a solid substrate", US-PS 5,445,934 , erteilt am 29. August 1995.
  • Gong, B. und Yan, Y. "New DNA minor-groove binding molecules with high sequenceselectivities and binding affinities", Biochem. and Biophys. Res. Comm. 240: 557–60 (1997).
  • Grossman, P., Bloch, W., Brinson, E., Chang, C., Eggerding, F., Fung, S., Iovannisci, D., Woo, S. und Winn-Dean, E. "High-density multiplex detection of nucleic acid sequences: oligonucleotide ligation assay and sequence-coded separation", Nucl. Acids Res. 22: 4527–4534 (1994).
  • Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, Seiten 40–55, 643–671.
  • J., J., Kheterpal, I., Scherer, J., Ruan, C., Fuller, C., Glazer, A. und Mathies, R. "Design and Synthesis of fluorescence energy transfer dye-labeled primers and their application for DNA sequencing and analysis", Analytical Biochemistry 231: 131–140 (1995).
  • Keller, G. und Manak, M. in DNA Probes Second Edition (1993), Stockton Press, New York, Seiten 121–23.
  • Kricka, L. in Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992), Academic Press, San Diego, Seiten 3–28.
  • Kubista, M. und Svanvik, N. "Probe for analysis of nucleic acids", WO 97/45539, Int. Veröffentlichungsdatum 4. Dezember 1997.
  • Kutyavin, I., Lukhtanov, E., Gamper, H. und Meyer, R. "Covalently linked oligonucleotide minor groove binder conjugates", WO 96/32496, Int. Veröffentlichungsdatum 17. Oktober 1996.
  • Lee, L., Spurgeon, S., Rosenblum, B. "Energy transfer dyes with enhanced fluorescence", US-PS 5,800,996 , erteilt am 1. September 1998.
  • Lee, L., Spurgeon, S., Heiner, C., Benson, S., Rosenblum, B., Menchen, S., Graham, R., Constantinescu, A., Upadhya, K. und Cassel, M. "New energy transfer dyes for DNA sequencing", Nucl. Acids Res. 25: 2816–22 (1997).
  • Livak, K., Flood, S., Marmaro, J., Giusti, W. und Deetz, K. "Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization", PCR Methods and Applications 4: 357–362 (1995).
  • Livak, K., Flood, S. und Marmaro, J. "Method for Detecting Nucleic Acid Amplification Using Self-Quenching Fluorescence Probe", US-PS 5,538,848 , erteilt am 23. Juli 1996.
  • Livak, K., Flood, S., Marmaro, J. und Mullah, K. "Self-quenching fluorescence probe", US-PS 5,723,591 , erteilt am 3. März 1998.
  • Lukhtanov, E., Kutyavin, I., Gamper, H. und Meyer, R. "Oligodeoxyribonucleotides with conjugated dihydropyrroloindole oligopeptides: Preparation and hybridization properties", Bioconjugate Chem. 6: 418–26 (1995).
  • Menchen, S., Lee, L., Connell, C., Hershey, N., Chakerian, V., Woo, S. und Fung, S. "4,7-Dichlorofluorescein dyes as molecular probes", US-PS 5,188,934 , erteilt am 23. February 1993.
  • Meyer, R. "Incorporation of modified bases in oligonucleotides" in Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Hrsg. S. Agrawal (1994) Humana Press, Totowa, N. J., Seiten 73–92.
  • Mullah, B. und Andrus, A. "Automated synthesis of double dye-labeled oligonucleotides using tetramethylrhodamine (TAMRA) solid supports", Tetrahedron Letters 38: 5751–5754 (1997).
  • Mullah, B. und Andrus, A. "Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labeled polynucleotides", US-PS 5,736,626 , erteilt am 7. April 1998.
  • Mullah, B., Livak, K., Andrus, A. und Kenney, P. "Efficient synthesis of double dyelabeled oligodeoxyribonucleotide probes and their application in a real time PCR assay", Nucl. Acids Res. 26: 1026–1031 (1998).
  • Nelson, P., Kent, M. und Muthini, S. "Oligonucleotide labeling methods 3. Direct labeling of oligonucleotides employing a novel, non-nucleosidic, 2-aminobutyl-1,3-propanediol backbone", Nucl. Acids Res. 20: 6253–59 (1992).
  • Nelson, P. "Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis", US-PS 5,141,813 , erteilt am 25. August 1992.
  • Nielsen, P., Egholm, M., Berg, R. und Buchardt, O. "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymidine-substituted polyamide", Science 254: 1497–1500 (1991).
  • Stanton, T., Schindele, D., Renzoni, G., Pepich, B., Anderson, N., Clagett, J. und Opheim, K. "Preparation and use of monomeric phthalocyanine reagents" WO 88/04777, Int. Veröffentlichungsdatum 30. Juni 1988.
  • Theisen, P., McCollum, C. und Andrus, A. "Fluorescent dye phosphoramidite labelling of oligonucleotides", in Nucleic Acid Symposium Series No. 27, Oxford University Press, Oxford, Seiten 99–100 (1992).
  • Tyagi, S. und Kramer, F. "Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon hybridization", Nature Biotechnology, 14: 303–08 (1996).
  • Van der Laan, A., Brill, R., Kuimelis, R., Kuyl-Yeheskiely, E., van Boom, J., Andrus, A. und Vinayak, R. "A convenient automated solid-phase synthesis of PNA-(5')-DNA-(3')-PNA chimera", Tetrahedron Lett. 38: 2249–52 (1997).
  • Vinayak, R., van der Laan, A., Brill, R., Otteson, K., Andrus, A., Kuyl-Yeheskiely, E. und van Boom, J. "Automated chemical synthesis of PNA-DNA chimera on a nucleic synthesizer", Nucleosides & Nucleotides 16: 1653–56 (1997).
  • Wagner, T. und Pfleiderer, W. "An inverse approach in oligodeoxyribonucleotide synthesis", Nucleosides & Nucleotides 16: 1657–60 (1997).
  • Woo, S., Menchen, S. und Fung, S. "Rhodamine phosphoramidite compounds", US-PS 5,231,191 , erteilt am 27. Juli 1993.
  • Woo, S. und Fung, S. "Solid support reagents for the synthesis of 3'-nitrogen containing polynucleotides", US-PS 5,552,471 , erteilt am 3. September 1996.
  • HINTERGRUND
  • Nicht-isotopisch markierte Oligonukleotide sind wesentliche Komponenten in vielen wichtigen Anwendungen in der Molekularbiologie wie PCR-Amplifikation, DNA-Sequenzierung, Antisense-transkriptionelle und -translationelle Kontrolle der Genexpression, genetische Analyse und DNA-Sonde-basierende diagnostische Untersuchung (Keller, 1993; Kricka, 1992). Fluoreszenz-Detektion von mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Oligonukleotiden ist die Grundlage für Nukleinsäuresequenz-Detektions-Assays wie TagmanTM (Livak, 1996), Molekulare Leuchtsignale ("Molecular Beacons"; Tyagi, 1996), genetische Kopplungskartierung (Dib, 1996) und Oligonukleotid-Ligations-Assay (Grossman, 1994).
  • Zwei allgemeine Verfahren zum Markieren von synthetischen Oligonukleotiden wurden entwickelt. In einem ersten Verfahren, das hierin als das "Zwei-Schritt-Lösungs-Markierungsverfahren" bezeichnet wird, wird eine nukleophile Funktionalität, z. B. ein primäres aliphatisches Amin, an einer zu markierenden Anknüpfungsstelle an einem Oligonukleotid, z. B. am 5'-Terminus, eingebracht. Nach Abschluss der automatischen Festphasensynthese wird das Oligonukleotid von dem Träger abgespalten und alle Schutzgruppen werden entfernt. Das Nukleophil-Oligonukleotid wird mit einem Überschuss an einem Markierungsmittel mit einer elektrophilen Gruppe, z. B. einem Isothiocyanat, oder einem aktivierten Ester, z. B. N-Hydroxysuccinimid (NHS), unter homogenen Lösungsbedingungen umgesetzt (Hermanson, 1996; Andrus, 1995).
  • In einem zweiten alternativen Verfahren, das hierin als das "direkte Markierungsverfahren" bezeichnet wird, wird eine Markierung direkt in das Oligonukleotid während oder vor der Synthese eingebracht (Mullah, 1998; Nelson, 1992). Das direkte Markierungsverfahren wird bevorzugt, da es (i) keinen Nach-Synthese-Reaktionsschritt benötigt, wodurch die Synthese von markierten Polynukleotiden vereinfacht wird, und (ii) die Probleme vermeidet, die mit der niedrigen Umsetzungsausbeute (unter 60%) verbunden sind, die typischerweise mit dem Zwei-Schritt-Lösungs-Markierungsverfahren anzutreffen sind, nämlich: (a) Aufreinigung des markierten Oligonukleotids von einem Überschuss an Markierung; (b) Aufreinigung des markierten Oligonukleotids von nicht-markiertem Oligonukleotid; (c) hohe Kosten aufgrund der niedrigen Produktausbeute und aufwendiger analytischer und Aufreinigungsverfahren und (d) irreversibles Cappen der nukleophilen Funktionalität während der Synthese.
  • Bestimmte Fluoreszenzfarbstoffe und andere Markierungen wurden zu Phosphoramidit-Reagenzien für ein 5'-Markieren funktionalisiert (Theisen, 1992). Zum Beispiel beschreibt die US-PS 5,583,236 Fluorescein-markierte Phosphoramidite. Jedoch sind einige Markierungen, z. B. Digoxigenin, Rhodamin-Farbstoffe und Cyanin-Farbstoffe, zu instabil, um die harschen Bedingungen und Reagenzien zu überstehen, die bei der Reagenzherstellung und Oligonukleotidsynthese, -abspaltung und -entschützung verwendet werden. Folglich müssen, wann immer solche Markierungen in derzeitigen Festphasen-Syntheseprotokollen verwendet werden, sie unter Verwendung des weniger bevorzugten Zwei-Schritt-Lösungs-Markierungsverfahrens angebunden werden.
  • Somit ist es wünschenswert, Verfahren und Reagenzien bereitzustellen, um Oligonukleotide und Analoga direkt auf einem Festträger, an dem sie synthetisiert werden, unter Bedingungen zu markieren, die schnell, wirtschaftlich und mit chemisch-labilen Funktionalitäten kompatibel sind.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Die Erfindung betrifft neue Verfahren und Zusammensetzungen für die Synthese von markierten Oligonukleotiden auf Festträgern.
  • In einem ersten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren für eine Synthese von markierten Oligonukleotiden auf einem markierten Festträger mit der Struktur
    Figure 00060001
    worin S ein Festträger ist, A ein spaltbarer Linker ist, X eine Gruppe mit drei oder mehreren Bindungsstellen ist, L eine Markierung ist, Y ein Nukleophil, d. h. O, NH, NR oder S, ist und Pi eine säurespaltbare Schutzgruppe ist. Der markierte Festträger wird in einer zyklusartigen Weise mit Reagenzien umgesetzt, um: (1) P1 von Y zu entfernen, (2) Y mit der 5'-Position eines 5'-Phosphoramidit-3'-geschützten Nukleosids zu koppeln, (3) jegliche nicht umgesetzte Stelle auf dem Träger, z. B. Y, falls nötig, zu cappen und (4) jegliche Phosphitbindungen zu oxidieren. Die vier Schritte werden wiederholt, bis das gesamte markierte Oligonukleotid synthetisiert ist.
  • Nach Abschluss der Synthese können die Schutzgruppen auf den Internukleotidphosphaten und Nukleobasen des markierten Oligonukleotids durch Entschützen entfernt werden, während das Oligonukleotid auf dem Festträger verbleibt. Alternativ kann nach Abschluss der Synthese das markierte Oligonukleotid von dem Festträger abgespalten und sodann entschützt werden.
  • In einem zweiten Aspekt umfasst die Erfindung ein an einem Festträger gebundenes Nukleosid mit der Struktur
    Figure 00070001
    worin S, A, X, L und Y wie vorstehend definiert sind, R eine Phosphat-Schutzgruppe oder ein Phosphotriestersubstituent ist, B eine Nukleobase ist, P2 eine Schutzgruppe für ein exozyklisches Stickstoffatom ist und P3 eine säurelabile Schutzgruppe ist.
  • In einem dritten Aspekt umfasst die Erfindung ein an einem Festträger gebundenes Oligonukleotid mit der Struktur
    Figure 00070002
    worin die variablen Substituenten wie vorstehend definiert sind und n eine ganze Zahl vorzugsweise von etwa 0 bis 100 ist.
  • In einem vierten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren eines markierten Oligonukleotids durch Umsetzen von: (i) einem Markierungsreagenz, das eine Funktionalität trägt, die in ein Elektrophil, z. B. eine Carbonsäure, Sulfonsäure, Phosphonsäure oder Phosphorsäure, umgewandelt werden kann, (ii) einem Oligonukleotid auf einem Festträger mit einer nukleophilen Funktionalität, z. B. einem Alkohol, Amin oder Thiol, und (iii) einem Kopplungsmittel, wodurch eine Ester-, Amid-, Thioester-, Sulfonamid-, Sulfonat-, Phosphonat-, Phosphoramidat-, Phosphorothioat- oder Phosphatbindung gebildet wird. Das Markierungsverfahren kann an einem Oligonukleotid an Markierungsstellen erfolgen, einschließlich des 5'-Terminus, des 3'-Terminus, einer Nukleobase, einer Internukleotid-Bindung, eines Zuckers, einer Amino-, Sulfid-, Hydroxyl- und Carboxylgruppe. Die Markierungsreaktion kann an einem Oligonukleotid erfolgen, das eine oder mehrere DNA-, RNA-, PNA- und Nukleinsäure-Analogon-Monomereinheiten umfasst. Die Nukleinsäure-Analoga können Nukleobasen-, Zucker- und/oder Internukleotid-Analoga sein.
  • Das markierte Oligonukleotid kann entweder in der 5'- zu 3'-Richtung oder in der 3'- zu 5'-Richtung synthetisiert werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 Oligonukleotid, das an einem markierten Träger am 5'-Terminus gebunden ist.
  • 2 Syntheseweg zu Träger-Linker-Markierungs-Reagenzien 1 bis 6.
  • 3 Fluoreszenzfarbstoff-Markierungen: FAM, TET, HEX, JOE, NED, VIC
  • 4 Fluoreszenzfarbstoff-Markierungen: dJON, dR139, JODA und Energie-Transfer-Donor FAM
  • 5 Fluoreszenzlöscher-Markierungen: TAMRA, ROX, DABCYL, DABSYL, NTB
  • 6 Markierungen, die an die kleine Furche binden: MGB1, CDPI-Monomer, CDPI3
  • 7 Koppeln von TAMRA-Markierungsreagenz mit HBTU-Kopplungsreagenz an ein 5'-Aminohexyl-Oligonukleotid auf einem Festträger
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Es wird nun im Detail auf erfindungsgemäße bevorzugte Ausführungsformen verwiesen, wobei Beispiele davon in den angefügten Zeichnungen veranschaulicht werden.
  • Obwohl die Erfindung im Zusammenhang mit den bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wird, versteht es sich, dass die Erfindung nicht auf diese Ausführungsformen beschränkt sein soll. Im Gegensatz dazu soll die Erfindung Alternativen, Modifikationen und Äquivalente umfassen, die von der Erfindung, wie sie durch die angefügten Ansprüche definiert ist, eingeschlossen sein können.
  • I. Definitionen
  • Wenn nicht anders angegeben, sollen die nachstehenden Begriffe und Ausdrücke, wie sie hierin verwendet werden, die nachstehenden Bedeutungen aufweisen:
  • Die Begriffe "Nukleinsäure", "Polynukleotid" oder "Oligonukleotid" bedeuten Polymere von Nukleotidmonomeren oder Analoga davon, einschließlich doppel- und einzelsträngigen Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden, α Formen davon und dergleichen. Das Oligonukleotid kann eine oder mehrere DNA-, RNA- und Nukleinsäure-Analogon-Monomereinheiten umfassen. Die Monomere sind über Internukleotid-Bindungen verbunden, einschließlich Phosphodiesterbindungen oder Phosphat-Analoga davon und zugehöriger Gegenionen, z. B. H+, NH4 +, Na+. Oligonukleotide weisen typischerweise eine Größe von wenigen Monomereinheiten, z. B. 5–40, bis mehreren Tausend Monomereinheiten auf. Wann immer ein Oligonukleotid durch eine Sequenz von Buchstaben dargestellt ist, wie "ATGCCTG", soll verstanden werden, dass die Nukleotide von links nach rechts in der 5'- zu 3'-Richtung angegeben sind und dass "A" Desoxyadenosin bedeutet, "C" Desoxycytidin bedeutet, "G" Desoxyguanosin bedeutet und "T" Thymidin bedeutet, wenn nicht anders angegeben.
  • "Nukleosid" betrifft eine Verbindung, die aus einer Purin-, Deazapurin- oder Pyrimidin-Nukleobase besteht, z. B. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Deazaadenin, Deazaguanosin und dergleichen, die an eine Pentose an der 1'-Position gebunden ist. Wenn die Nukleosidbase Purin oder 7-Deazapurin ist, ist die Pentose an die Nukleobase an der 9-Position des Purins oder Deazapurins gebunden und, wenn die Nukleobase Pyrimidin ist, ist die Pentose an die Nukleobase an der 1-Position des Pyrimidins gebunden.
  • "Nukleotid" betrifft einen Phosphatester eines Nukleosids, z. B. einen Triphosphatester, wobei die üblichste Stelle der Veresterung die Hydroxylgruppe ist, die an die C-5-Position der Pentose gebunden ist.
  • Der Begriff "Watson/Crick-Basenpaarung" betrifft ein Muster von spezifischen Paaren von Nukleotiden und Analoga davon, die über sequenzspezifische Wasserstoffbindungen aneinander binden, z. B. paan A mit T und U und G paart mit C.
  • Der Begriff "Analogon" betrifft Analoga von Nukleinsäuren, die aus monomerischen Nukleotid-Analogon-Einheiten hergestellt werden, und sie weisen einige der Qualitäten und Eigenschaften auf, die mit Nukleinsäuren verbunden sind. Nukleinsäure-Analoga können modifizierte Nukleobasengruppen, modifizierte Zuckergruppen und/oder modifizierte Internukleotid-Bindungen aufweisen (Englisch, 1991). Eine bevorzugte Klasse von Nukleinsäure-Analoga, in denen die Zucker- und Internukleotidgruppen mit einem 2-Aminoethylglycinamid-Rückgratpolymer ersetzt wurden, sind Peptidnukleinsäuren PNA (Nielsen, 1991).
  • "Bindungsstelle" betrifft eine Stelle, an die ein Linker gebunden ist.
  • "Linker" betrifft ein oder mehrere Atome, die eine Kette umfassen, die ein Oligonukleotid mit einer Markierung oder einem Festträger verbinden.
  • "Chimär", wie hierin verwendet, betrifft ein Oligonukleotid, einschließlich einer oder mehrerer Nukleotid- und einer oder mehrerer Nukleotid-Analogon-Einheiten.
  • "Niederalkyl", "Niederalkylen" und "substituiertes Niederalkylen" betreffen geradkettige, verzweigte oder cyclische Gruppen, die aus 1–12 Kohlenstoffatomen bestehen.
  • "Markierung" betrifft eine Gruppe, die kovalent an ein Oligonukleotid gebunden ist. Eine bevorzugte Klasse von Markierungen stellt ein Signal zum Detektieren bereit, z. B. Fluoreszenz, Chemilumineszenz und elektrochemische Lumineszenz (Kricka, 1992). Eine weitere bevorzugte Klasse von Markierungen dient dazu, eine Hybridisierung zu verstärken, zu stabilisieren oder zu beeinflussen, z. B. Interkalatoren, Binder an die kleine Furche und vernetzende funktionelle Gruppen (Blackburn, 1996). Detektionsmarkierungen umfassen in nicht-begrenzender Weise Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluorescein- und Rhodamin-Derivate, Cyaninfarbstoffe (Kubista, 1997), chemilumineszierende Farbstoffe (Bronstein, 1990; Bronstein, 1994) und Energie-Transfer-Farbstoffe (Clegg, 1992; Cardullo, 1988). Eine noch weitere bevorzugte Klasse von Markierungen dient dazu, die Trennung oder Immobilisierung eines Moleküls durch spezifische oder nicht-spezifische Abfangmittel zu beeinflussen (Andrus, 1995).
  • "Detektion" betrifft ein Detektieren, Beobachten oder Messen eines Oligonukleotids auf der Basis der Eigenschaften einer Markierung.
  • "Kopplungsreagenzien" umfassen jedes Reagenz, jeden Aktivator oder jedes Additiv, das/der eine Ester-, Amid-, Thioester-, Sulfonamid-, Sulfonat-, Phosphonat-, Phosphoramidat-, Phosphorothioat- oder Phosphatbindung zwischen dem nukleophilen Oligonukleotid auf dem Festträger und der Markierung bilden kann.
  • II. Markierte Träger
  • Ein erfindungsgemäßer Aspekt umfasst Träger zur Synthese von markierten Oligonukleotiden. Die markierten Träger gemäß diesem erfindungsgemäßen Aspekt weisen die Struktur:
    Figure 00110001
    auf, worin S allgemein ein Festträgermaterial betrifft, das für eine Oligonukleotidsynthese verwendbar ist, A ein spaltbarer Linker ist, X eine Gruppe mit drei oder mehreren Bindungsstellen ist, L eine Markierung ist, Y ein Nukleophil ist, d. h. ein O-Atom, eine NH-, NR-Gruppe oder ein S-Atom, und Pi eine säurespaltbare Schutzgruppe ist.
  • Die Festträger stellen ein unlösliches Medium für eine aufeinander folgende Anbindung von Monomereinheiten bereit. Ein signifikanter Vorteil von heterogenen Syntheseverfahren besteht darin, dass ein Überschuss an Reagenzien in der flüssigen Phase leicht durch Filtration entfernt werden kann, wodurch die Notwendigkeit für Aufreinigungsschritte zwischen jeder Umsetzung oder jedem Zyklus beseitigt wird. Die Eigenschaften des Festträgers wie Porengröße, Vernetzungsgehalt, Aufquellen, Partikelgröße und Oberfläche sollten für eine wirksame Diffusion der Reagenzien optimiert werden, um schnelle Kinetiken und Reaktionen mit hoher Ausbeute zu ergeben. Bevorzugte Trägermaterialien umfassen hochvernetztes, nicht aufquellendes Polystyrol (Andrus, 1993), kontrolliertes Porenglas (Caruthers, 1984), Silica-Material, Silica-Gel, Polyacrylamid, magnetische Kügelchen (Stamm, 1995), Polyacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Polyamid, Polyethylen, Polyethylenoxid und Copolymere oder Pfropf-Copolymere von diesen. Die EP 0 786 468 beschreibt Festträger-Reagenzien für die direkte Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden. Physikalische Konfigurationen von Festträgern umfassen kleine Partikel, Kügelchen, Membranen, Fritten, nicht-poröse Oberflächen, Objektträger, Platten, mikromaschinierte Chips, Alkanthiol-Gold-Schichten, adressierbare Anordnungen, Vektoren, Plasmide oder Polynukleotid-immobilisierende Medien (Fodor, 1995). In einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, eine Anordnung von physikalisch getrennten Syntheseregionen auf dem Träger mit z. B. Wells, erhabenen Regionen, Vertiefungen, Kontakten, Rinnen, Stäben, inneren oder äußeren Zylinderwänden und dergleichen herzustellen.
  • Der spaltbare Linker A kann aus jeglicher Funktionalität bestehen, wie z. B.: (i) Estern und anderen Basen-labilen Linkern, die durch basische Reagenzien gespalten werden, (ii) Silylethern, die durch Nukleophile wie Fluorid gespalten werden, oder (iii) Disulfidgruppen und andere Gruppen, die unter Oxidations-/Reduktionsbedingungen mit Reagenzien wie Dithiothreitol (DTT) gespalten werden. Die Bindungen, die in den vorstehenden Beispielen der Linker A gespalten werden, sind nachstehend durch Pfeile gezeigt:
  • Figure 00120001
  • Die Gruppe X kann eine jegliche Gruppe sein, die aus Bindungsstellen zum Anbinden des Festträgers über einen Linker A, einer Markierung L und des Oligonukleotids besteht.
  • Markierungen L können eine jegliche Gruppe oder ein jeglicher Rest sein, der kovalent an das Oligonukleotid gebunden ist. Markierungen können aus Hybridisierungsstabilisierenden Gruppen (z. B. Binder an die kleine Furche, Interkalatoren und Vernetzungsmittel), Fluoreszenzfarbstoffen, Fluoreszenzlöschern, Energie-Transfer-Farbstoffgruppen, chemilumineszierenden Farbstoffen, Aminosäuren, Proteinen, Peptiden, Enzymen und Affinitätsliganden bestehen.
  • Y ist eine Gruppe, die bezüglich eines Kohlenstoffatoms nukleophil ist, z. B. ein O-Atom, eine NH-, NR-Gruppe und ein S-Atom, und bindet X an das Oligonukleotid. Y weist eine säurespaltbare Schutzgruppe P1 auf, die DMT, MMT, Trityl, substituiertes Trityl, Pixyl oder Trialkylsilyl sein kann. Die Schutzgruppe P1 wird entfernt, um die Oligonukleotidsynthese ausgehend von dem Nukleophil Y zu starten.
  • III. Synthese von markierten Trägern
  • Die Festträger S werden mit einer reaktiven Funktionalität derivatisiert, an die eine Linkereinheit, A-X-Y, gebunden ist. Vorzugsweise ist die reaktive Funktionalität eine primäre Aminogruppe mit einer bevorzugten Beladung von 5–100 NH2 pro Gramm. Eine Linkereinheit oder ein Spacer, A-X-Y, wird sodann kovalent an die reaktive Funktionalität auf dem Festträger gebunden. Eine zweite Bindungsstelle auf A-X-Y bindet an Markierungen. Eine dritte Bindungsstelle auf A-X-Y erlaubt eine Synthese der Oligonukleotidkette. Typischerweise enthält A eine Estergruppe, die unter basischen Bedingungen, z. B. Ammoniumhydroxid, spaltbar ist, um eine Trennung des Festträgers von dem Oligonukleotid und jeglichen Markierungen, die an dem Oligonukleotid gebunden sind, zu erlauben.
  • Die EP 0 323 152 beschrieb ein Spaltreagenz zum Hydrolysieren von Basen-labilen verbindenden Gruppen zwischen einem Festphasenträger und Oligonukleotiden, umfassend einen Niederalkylalkohol, Wasser und ein nicht-nukleophiles gehindertes Alkylamin, und die US-PS 5,367,066 stellte modifizierte Polynukleotide bereit, die mindestens eine spaltbare oder abasische Stelle enthalten.
  • Die Linkereinheit A-X-Y kann an den Festträger als (i) eine Einheit mit einer Markierung L oder (ii) als eine Einheit ohne eine Markierung L gebunden werden, wobei die Markierung L dann an den Linker X durch die Reaktionen:
    Figure 00130001
    gebunden wird.
  • 2 zeigt den beispielhaften Weg zu einem markierten Träger (ii), worin der Linker 1 (X-Y-P1) in 2 (A-X-Y-P1) umgewandelt und an hochvernetztes Aminomethylpolystyrol 3 gebunden wird. Das sich ergebende Produkt 4 wird zu 5 entschützt. Eine voraktivierte Markierung, z. B. TAMRA-NHS (N-Hydroxysuccinimidester von 5-Carboxytetramethylrhodamin), wird kovalent an 5 gebunden, um den markierten Träger 6 zu ergeben, der für eine Oligonukleotidsynthese einsetzbar ist.
  • Eine bevorzugte Gruppe von markierten Festträgern ist in der Struktur 6 (2 und nachstehend)
    Figure 00140001
    verkörpert, worin S ein hochvernetztes Polystyrol oder kontrolliertes Porenglas ist,
    Figure 00140002
    L ein Binder an die kleine Furche, Cyanine, Fluoreszenzfarbstoffe oder Energie-Transfer-Farbstoffgruppen ist, Y ein Sauerstoffatom ist und P1 DMT ist.
  • Das asymmetrische Kohlenstoffatom in X von 6 führt zu diastereomeren Isomeren von markierten Oligonukleotiden. Diese spezifischen Isomere weisen den Vorteil auf, dass sie nicht in einzelne Peaks während einer Analyse durch HPLC oder Kapillarelektrophorese aufgelöst werden. Andere diastereomere Linker zum Anbinden von Markierungen an Oligonukleotide können eine diastereomere Auflösung zeigen, die durch Doppel-Peaks in einer Analyse veranschaulicht wird (Mullah, 1998; Woo, 1996). Wenn markierte Oligonukleotide, die aus 6 hergestellt werden, in Primer-Extensiorisexperimenten wie DNA-Sequenzierung (Lee, 1997), DNA-Fragmentanalyse (Grossman, 1994) und PCR (Livak, 1996) verwendet werden, weisen die Fragmente und Amplifikations produkte ähnliche Vorteile dadurch auf, dass sie nicht in diastereomere Populationen aufgetrennt werden, die eine Datenanalyse behindern können.
  • IV. Synthese von markierten Oligonukleotiden auf einem markierten Träger in der 5'- zu 3'-Richtung
  • Im Allgemeinen verwenden die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen das Phosphoramidit-Syntheseverfahren, das aufgrund seiner Wirksamkeit und schnellen Kopplung und der Stabilität der Start-Nukleosidmonomere bevorzugt ist (Caruthers, 1983; Beaucage, 1983; Beaucage, 1992). Das Phosphoramidit-Verfahren bedingt eine cyclische Addition von Nukleotidmonomereinheiten an eine Oligonukleotidkette, die auf einem Festträger üblicherweise in die 3'- zu 5'-Richtung wächst, worin das 3'-terminale Nukleosid an den Festträger am Anfang der Synthese gebunden ist. Das Verfahren erfolgt gewöhnlich mittels automatisierter, käuflich erhältlicher Synthesegeräte (PE Biosystems, Caruthers, 1984). Die erfindungsgemäße 5'- zu 3'-Richtungs-Ausführungsform fügt cyclisch ein 5'-Phosphoramidit-3'-geschütztes Nukleosidmonomer (Wagner, 1997) mit der Struktur 7:
    Figure 00150001
    hinzu, worin R eine Schutzgruppe oder ein Substituent ist, z. B. Cyanethyl-, Methyl-, Niederalkyl-, substituierte Alkyl-, Phenyl-, Aryl- und substituierte Arylgruppen, R1 und R2 Aminsubstituenten sind, z. B. Isopropyl-, Morpholino-, Methyl-, Ethyl-, Niederalkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppen, P2 eine Schutzgruppe für ein exocyclisches Stickstoffatom ist wie Benzoyl-, Isobutyryl-, Acetyl-, Phenoxyacetyl-, Aryloxyacetyl-, Dimethylformamidin-, Dialkylformamidin- und Dialkylacetamidingruppen, und P3 eine säurelabile Schutzgruppe ist wie DMT, MMT, Pixyl-, Trityl- und Trialkylsilylgruppen.
  • Ein Oligonukleotid wird hergestellt, wobei der 5'-Terminus an dem Festträger gebunden ist und der 3'-Terminus frei und ungebunden verbleibt (1).
  • Das Nachstehende beschreibt kurz die Schritte eines erfindungsgemäßen Synthesezyklus unter Verwendung des Phosphoramidit-Verfahrens. Zunächst wird ein Festträ ger, z. B. 6, mit einer protischen Säure, z. B. Trichloressigsäure oder Dichloressigsäure, behandelt, um eine säurelabile Schutzgruppe, z. B. DMT, zu entfernen, wodurch ein Nukleophil, z. B. eine Hydroxylgruppe, für eine nachfolgende Kopplungsreaktion frei wird. Ein aktiviertes Zwischenprodukt wird sodann dadurch gebildet, dass gleichzeitig ein 5'-Phoshporamidit-3'-geschütztes Nukleosidmonomer 7 und eine schwache Säure, z. B. Tetrazol oder dergleichen, zu dem Reaktionsgefäß in dem Synthesegerät, d. h. eine Synthesesäule, gegeben werden. Eine Nukleosid-Addition wird typischerweise innerhalb von 30 bis 300 s, vorzugsweise etwa 90 s abgeschlossen sein. Als nächstes kann ein Capping-Schritt erfolgen, der jegliche Oligonukleotidketten, die keine Nukleosid-Addition durchlaufen haben, durch Acylierung der 3'-Hydroxylgruppe terminiert. Ein Capping erfolgt vorzugsweise mit Essigsäureanhydrid und 1-Methylimidazol, aber andere Acylierungsmittel können verwendet werden. Die Internukleotid-Bindung wird sodann von dem Phosphit zu der stabileren Phosphotriesterbindung durch Oxidation mittels Iod als bevorzugtes Oxidationsmittel und Wasser als Sauerstoff-Donor umgewandelt, um die Struktur:
    Figure 00160001
    zu ergeben.
  • Alternativ kann das Internukleotid-Phosphit zu einem Internukleotid-Analogon wie Phosphorothioat oder Phosphoramidat oxidiert werden. Nach Oxidation wird die nächste 3'-Hydroxyl-Schutzgruppe, z. B. DMT, mit der protischen Säure, z. B. Trichloressigsäure oder Dichloressigsäure, entfernt und der Zyklus wird wiederholt, bis die Kettenverlängerung abgeschlossen ist (1).
  • V. Markierung von Oligonukleotiden auf einem Festträger nach einer Synthese
  • Markierungen können an verschiedenen Bindungsstellen auf Oligonukleotiden und Nukleinsäure-Analoga gebunden werden, einschließlich: (i) eines Terminus, z. B. 5'- und/oder 3'-Termini von Sonden, (ii) einer Internukleotid-Bindung, (iii) eines Zuckers oder (iv) einer Nukleobase. Markierungen werden am üblichsten und wirksamsten an dem 5'-Terminus eingebracht, der Markierungsstelle, die am wenigsten eine Hybridisierung destabilisiert und am wenigsten mit den 3'-Primer-Extensionsreaktionen wechselwirkt (Kricka, 1992; Hermanson, 1996). Ein bevorzugtes 5'-Linkerreagenz ist ein Amino-geschütztes Phosphoramidat mit der Struktur 8:
    Figure 00170001
    worin R eine Sauerstoff-Schutzgruppe oder ein Substituent ist, z. B. Cyanethyl-, Methyl-, Niederalkyl-, substituierte Alkyl-, Phenyl-, Aryl- oder substituierte Arylgruppen, und R1 und R2 Aminosubstituenten sind, z. B. Isopropyl-, Morpholino-, Methyl-, Ethyl-, Niederalkyl-, Cycloalkyl- oder Arylgruppen. Ein Koppeln des vorstehenden Reagenzes mit einer 5'-Hydroxylgruppe eines Träger-gebundenen Oligonukleotids und mit einem schwachen Säureaktivator, z. B. Tetrazol, ergibt das Monomethoxytrityl (MMT)-geschützte Oligonukleotid. Nach Phosphitoxidation kann die MMT-Gruppe von der Amingruppe mit dem gleichen Säurereagenz, z. B. TCA oder DCA, entfernt werden, um das reaktive primäre Amin-Nukleophil für ein Koppeln mit einem Markierungsreagenz freizumachen. Der Hexyl-Linker kann leicht durch andere inerte Linker von kürzerer, z. B. Ethyl, oder größerer Länge, z. B. Dodecyl, ersetzt werden, wobei auch Arylgruppen und andere Funktionalitäten eingeschlossen sind. Alternativ können Thiol- oder Hydroxyl-Nukleophile an dem 5'-Terminus oder anderen Stellen auf einem an einem Festträger gebunden Oligonukleotid eingebracht werden. Bevorzugte Thiolgeschützte Phosphoramiditreagenzien sind 9 und 10:
  • Figure 00170002
  • Solche Reagenzien können in ähnlicher Weise an die 5'-Hydroxylgruppe gekoppelt, das Phosphit oxidiert und die Thiol-Schutzgruppe entfernt werden, um eine reaktives Thiol-Nukleophil zu ergeben. Die sich ergebenden 5'-gebundenen Nukleophil-Oligonukleotide, die an einem Festträger gebunden sind, können wie folgt dargestellt werden:
  • Figure 00180001
  • Die Markierungsreaktion erfolgt zwischen: (i) einem an einem Festträger gebundenen Oligonukleotid, wobei das Oligonukleotid eine reaktive nukleophile Funktionalität, z. B. HO, HNR, H2N oder HS, aufweist, (ii) einer Markierung mit CO2H (Carboxyl)-, SO3H (Sulfonat)-, RPO3H (Phosphonat)- oder OPO3H (Phosphat)-Funktionalität, (iii) einem Kopplungsreagenz und (iv) einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch. Die Reaktion kann bei einer Temperatur zwischen 0–100°C und vorzugsweise bei Raumtemperatur von etwa 20°C erfolgen.
  • Bevorzugte Kopplungsreagenzien umfassen HATU (O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat), HBTU ((O-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat), TBTU (2-(1H-Benzotriazo-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat), TFFH (N,N',N",N"'-Tetramethyluronium-2-fluorohexafluorophosphat), BOP (Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat), PyBOP (Benzotriazol-1-yloxytrispyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphat), EEDQ (2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydrochinolin), DCC (Dicyclohexylcarbodiimid), DIPCDI (Diisopropylcarbodiimid), HOBt (1-Hydroxybenzotriazol), N-Hydroxysuccinimid, MSNT (1-(Mesitylen-2-sulfonyl)-3-nitro-1H-1,2,4-triazol) und Arylsulfonylhalogenide, z. B. Triisopropylbenzolsulfonylchlorid.
  • Eine vorausgehende oder getrennte Aktivierung ("Voraktivierung") einer Markierungsfunktionalität ist dabei nicht notwendig, um die Erfindung durchzuführen. Zum Beispiel benötigt die Erfindung keine vorausgehende Umwandlung einer Carboxylgruppe zu einem NHS-Ester für eine Reaktion mit einem Nukleophil-Oligonukleotid (7).
  • VI. Markierungen
  • Eine Markierung L kann eine jegliche Gruppe sein, die kovalent an ein Oligonukleotid oder Nukleinsäure-Analogon gebunden ist.
  • Eine bevorzugte Klasse von Markierungen sind Detektionsmarkierungen, die ein Signal zum Detektieren des markierten Oligonukleotids durch Fluoreszenz, Chemilumineszenz und elektrochemische Lumineszenz bereitstellen können (Kricka, 1992). Für ein Markieren von Oligonukleotiden verwendbare Fluoreszenzfarbstoffe umfassen Fluoresceine (Menchen, 1993), Rhodamine (Bergot, 1994), Cyanine (Kubista, 1997) und Metallporphyrin-Komplexe (Stanton, 1988).
  • Beispiele von Fluoresceinfarbstoffen umfassen 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 2',4',1,4-Tetrachlorfluorescein (TET), 2',4',5',7',1,4-Hexachlorfluorescein (HEX), 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyrhodamin (JOE), 2'-Chlor-5'-fluor-7',8'-anelliertes Phenyl-1,4-dichlor-6-carboxyfluorescein (NED), 2'-Chlor-7'-phenyl-1,4-dichlor-6-carboxyfluorescein (VIC) und (JODA) (3 und 4). Das 5-Carboxyl- und andere Regioisomere können auch geeignete Detektionseigenschaften aufweisen. Fluorescein- und Rhodaminfarbstoffe mit 1,4-Dichlor-Substituenten sind besonders bevorzugt.
  • Eine weitere bevorzugte Klasse von Markierungen umfassen Löschergruppen. Das Emissionsspektrum einer Löschergruppe überlappt mit einem nahen intramolekularen oder intermolekularen Fluoreszenzfarbstoff, so dass die Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffs durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) wesentlich verringert oder gelöscht wird. Oligonukleotide, die intramolekular mit sowohl einem Fluoreszenzfarbstoff als auch Löschergruppen markiert sind, sind in Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays, z. B. dem "TagmanTM"-Exonuklease-Spaltungs-PCR-Assay (Livak, 1998; Livak, 1996) verwendbar.
  • Besonders bevorzugte Löscher umfassen in nicht-begrenzender Weise (i) Rhodaminfarbstoffe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), Tetrapropano-6-carboxyrhodamin (ROX) und (ii) DABSYL, DABCYL, Cyaninfarbstoffen, einschließlich Nitrothiazol-Blau (NTB), Anthrachinon, Malachit-Grün, Nitrothiazol- und Nitroimidazol-Verbindungen und dergleichen (5). Erfindungsgemäße Fluorescein- (links) und Rhodamin- (rechts) Derivate können die nachstehende allgemeine Struktur und das nachstehende Zählsystem aufweisen, worin X ein Linker ist, und können an einer oder mehreren der aufgezählten Positionen substituiert sein.
  • Figure 00200001
  • Cyanin-Markierungen können die Struktur
    Figure 00200002
    aufweisen, worin R1 oder R2 ein H-Atom, eine Niederalkyl-, Niederalkylen-, substituierte Niederalkylen-, Phenyl- oder Arylgruppe ist, Z CR1R2, S, O, NH oder N-R1 ist, R2 eine Nitro-, Halogen-, Sulfonat-, Hydroxy-, Amino-, Niederalkyl- oder Trihalogen methylgruppe ist und n 0 bis 2 ist (Kubista, 1997). Die Bindungsstelle X zum Markieren von Oligonukleotiden kann bei R1, R2 oder R3 liegen.
  • Energie-Transfer-Farbstoffe sind eine bevorzugte Klasse von Oligonukleotid-Markierungen. Eine Energie-Transfer-Farbstoff-Markierung umfasst einen Donor-Farbstoff, der mit einem Akzeptor-Farbstoff verbunden ist (Lee, 1998). Strahlung, z. B. von einem Laser, bei einer ersten Wellenlänge wird von einem Donor-Farbstoff, z. B. FAM, absorbiert. Der Donor-Farbstoff emittiert Anregungsenergie, die durch den Akzeptor-Farbstoff absorbiert wird. Der Akzeptor-Farbstoff fluoresziert bei einer zweiten Wellenlänge, wobei ein Emissionsmaximum etwa 100 nm höher als das Absorptionsmaximum des Donor-Farbstoffs auftritt.
  • Die Donor-Farbstoff- und Akzeptor-Farbstoffgruppen einer Energie-Transfer-Markierung können durch einen Linker wie
    Figure 00210001
    gebunden sein, wobei die 4'- oder 5'-Positionen des Donor-Farbstoffs, z. B. FAM, mit einer 5- oder 6-Carboxylgruppe des Akzeptor-Farbstoffs gekoppelt sind.
  • Metallporphyrin-Komplexe sind auch eine bevorzugte Klasse von Oligonukleotid-Markierungen (Stanton, 1988). Ein Beispiel ist Aluminiumphthalocyanintetrasulfonat mit der nachstehend gezeigten Struktur:
  • Figure 00210002
  • Eine weitere bevorzugte Klasse von Markierungen umfasst Chemilumineszenzverbindungen. Besonders bevorzugt sind 1,2-Dioxetan-Chemilumineszenzgruppen (Bronstein, 1994; Bronstein, 1990) mit der Struktur
    Figure 00220001
    worin R1 ein Wasserstoff- oder Halogenatom ist, R2 eine Phosphat-, Galactosid-, Glucosid-, Glucuronid-, Trialkylsilyloxy-, Acyloxygruppe oder ein Wasserstoffatom ist, R3 eine Methyl-, Ethyl- und Niederalkylgruppe ist und X ein Linker zu einem Oligonukleotid ist. Affinitätsliganden umfassen Biotin, 2,4-Dinitrophenyl, Digoxigenin, Cholesterin, Polyethylenoxid und Peptide.
  • Eine weitere bevorzugte Klasse von Markierungen, die hierin als Hybridisierungs-stabilisierende Gruppen bezeichnet werden, umfassen in nicht-begrenzender Weise Binder an die kleine Furche, Interkalatoren, Polykationen wie Polylysin und Spermin, und vernetzende funktionelle Gruppen. Hybridisierungs-stabilisierende Gruppen können die Stabilität einer Basenpaarung, d. h. die Affinität, oder die Geschwindigkeit einer Hybridisierung, veranschaulicht durch hohe thermische Schmelztemperaturen, Tm, des Duplex, erhöhen. Hybridisierungs-stabilisierende Gruppen dienen dazu, die Spezifität einer Basenpaarung zu erhöhen, die durch große Unterschiede in den Tm-Werten zwischen perfekt komplementären Oligonukleotid- und Zielsequenzen veranschaulicht werden und wo das sich ergebende Duplex ein oder mehrere Fehler in der Watson/Crick-Basenpaarung enthält (Blackburn, 1996). Bevorzugte Binder an die kleine Furche umfassen Hoechst 33258, CDPI1-3, MGB1, Netropsin und Distamycin (6). Ein Beispiel für einen Binder an die kleine Furche ist CDPI3 (Kutyavin, 1996; Lukhtanov, 1995) mit der Struktur
    Figure 00220002
    worin X ein Linker oder eine Bindungsstelle zum Markieren von Oligonukleotiden ist. Binder an die kleine Furche können, wenn sie Oligonukleotide markieren, die Affinität und Spezifität einer Hybridisierung zu manchen oder im Wesentlichen den meisten Zielsequenzen erhöhen (Blackburn, 1996, Seiten 337–46).
  • VII. Nukleinsäure-Analoga
  • Oligonukleotide können verschiedene Nukleinsäure-Analoga enthalten, die Modifikationen an der Nukleobase, dem Zucker und/oder den Internukleotidgruppen aufweisen.
  • Bevorzugte Nukleobase-Analogon-Modifikationen umfassen in nicht-begrenzender Weise C-5-Alkylpyrimidine, 2-Thiopyrimidin, 2,6-Diaminopurin, C-5-Propinpyrimidin, Phenoxazin (Flanagan, 1999), 7-Deazapurin, Isocytidin, Pseudo-Isocytidin, Isoguanosin, 4(3H)Pyrimidon, Hypoxanthin, 8-Oxopurine und Universalbase (Meyer, 1994).
  • Bevorzugte Zucker-Analogon-Modifikationen in einem oder mehreren der Nukleotide umfassen in nicht-begrenzender Weise 2'- oder 3'-Modifikationen, worin die 2'- oder 3'-Position ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, Methoxy-, Ethoxy-, Allyloxy-, Isopropoxy-, Butoxy-, Isobutoxy-, Methoxyethyl-, Alkoxy-, Phenoxy-, Azido-, Amino-, Alkylamino-, Fluor-, Chlor- und Bromgruppe sein kann.
  • Andere bevorzugte Zucker-Analogon-Modifikationen umfassen 4'-α-anomere Nukleotide, 1'-α-anomere Nukleotide, 2'-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotide und 2'-O-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotide. Die nachstehende Struktur veranschaulicht verschiedene bevorzugte 2'-Zucker-Modifikationen.
  • Figure 00230001
  • Bevorzugte Internukleotid-Analoga zwischen einem oder mehreren Nukleotiden umfassen in nicht-begrenzender Weise: (i) eine Substitution des Sauerstoffatoms in der Internukleotid-Bindung durch ein Schwefel-, Kohlenstoff- oder Stickstoffatom und (ii) Sulfat-, Carboxylat- und Amid-Internukleotid-Phosphodiester-Bindungen. Andere bevorzugte Internukleotid-Analoga umfassen 2-Aminoethylglycin (PNA), 2'-5'-Bindung, invertierte 3'-3'-Bindung, invertierte 5'-5'-Bindung, Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Methylphosphonat, nicht-verbrücktes N-substituiertes Phosphoramidat, alkylierte Phosphodiester-verzweigte Struktur und 3'-N-Phosphoramidat.
  • Ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Analogon ist das Peptid-Nukleinsäure-Oligomer, PNA, in dem das natürliche Phosphodiester-Desoxyribose-Rückgrat durch N-(2-Aminoethyl)glycin, einer peptidartigen Einheit, ersetzt wurde (Nielsen, 1991). PNA-Oligomere sind zur Basenpaarung mit komplementären Sequenzen in dem klammerspezifischen Anteil der Sonde durch Watson/Crick-Basenpaarung fähig. PNA und PNA/DNA-Chimäre können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren auf käuflich erhältlichen automatisierten Synthesegeräten mit käuflich erhältlichen Reagenzien synthetisiert werden (Dueholm, 1994; Vinayak, 1997; Van der Laan, 1997).
  • VIII. Spalten und Entschützen von markierten Oligos von Trägern
  • Nach einer Synthese kann das Oligonukleotid auf dem Festträger verbleiben oder es kann von dem Festträger durch eine Spaltungsreaktion entfernt oder abgetrennt werden. Es ist wünschenswert, das Oligonukleotid auf dem Festträger zu belassen, da manche Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays Oligonukleotide verwenden, die kovalent an einen Festträger in Konfigurationen wie nicht-porösen Oberflächen, planaren Oberflächen-Anordnungen, eingeschlossenen oder eingekapselten Partikeln oder losen Partikeln, die in wässrigen Medien suspendiert sind, gebunden sind.
  • Oligonukleotide können von dem Träger unter Verwendung einer Base, z. B. Ammoniumhydroxid, tert-Butylamin, Methylamin, Ethylamin, Kaliumcarbonat oder Natriumhydroxid, abgespalten werden. Eine bevorzugte Lösung zum Spalten und Entschützen ist ein Gemisch von Methanol : tert-Butylamin : Wasser (1 : 1 : 2, v/v/v) (Woo, 1993). Die Spaltungslösung entfernt auch Phosphat-Schutzgruppen, z. B. Cyanethylgruppen, und Schutzgruppen an den exocyclischen Aminen der Nukleobasen beim Erhitzen der Oligonukleotid-enthaltenden Lösung bei einer erhöhten Temperatur, z. B. 55–85°C, für eine Zeitspanne von 1 bis 16 Stunden.
  • Ein weiteres bevorzugtes Spaltungsverfahren ist eine reduktive oder oxidative Spaltung eines Disulfid-Linkers A, worin A
    Figure 00250001
    ist, worin n den Wert 1 bis 12 aufweist. Ein bevorzugtes Spaltungsreagenz ist Dithiothreitol (DTT).
  • Ein weiteres bevorzugtes Spaltungsverfahren ist die Fluoridionenspaltung einer Silyletherbindung A, worin A
    Figure 00250002
    ist und worin R ein Niederalkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ist. Bevorzugte Spaltungsreagenzien umfassen Tetrabutylammoniumfluorid und Fluorwasserstoff/Trietriylamin.
  • IX. Beispiele
  • Die Erfindung wird in Anbetracht der nachstehenden Beispiele veranschaulicht, die für die Erfindung rein beispielhaft und in keiner Weise für ihren Umfang begrenzend sein sollen.
  • Beispiel 1. Synthese von Polystyrolträger-Linker-TAMRA 6
  • Eine Lösung von Diglykolsäureanhydrid (64 mg, 0,55 mmol) in CHaCl2 (5 ml) wurde zu einem Gemisch von Et3N (67 mg, 0,66 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (34 mg, 0,28 mmol) und Verbindung 1 (400 mg, 0,55 mmol) in CH2Cl2 (15 ml) bei 0°C unter Argon gegeben (2). Nach vollständiger Zugabe (10 min) wurde das Eisbad entfernt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH2Cl2 (30 ml) verdünnt und mit 5%iger wässriger Citronensäure (1 × 50 ml) und gesättigter Salzlösung (2 × 50 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO4) und verdampft, um einen Schaum zu ergeben. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie auf Silicagel gereinigt, wobei mit einem CHCl3-EtOH-Gradienten (2–10% EtOH) eluiert wurde. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und verdampft, um Verbindung 2 als einen farblosen Schaum (260 mg, 56%) zu ergeben. 1H-NMR (CDCl3) d: 1,20 (m, 2H), 1,39 (m, 2H), 1,58 (m, 2H), 2,18 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,90–3,25 (m, 4H), 3,80 (s, 6H), 3,86 (s, 4H), 4,00–4,40 (m, 6H), 4,85 (nicht aufgelöstes t, 1H), 5,92 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,75 (d, J = 8,1 Hz, 4H), 7,20–7,40 (m, 13H), 7,52 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,69 (d, J = 7,2 Hz, 2H).
  • Hochgradig vernetztes Polystyrol 3 (1000 A, 10 μmol/g Aminbeladung, 1 g, 10 μmol) wurde mit Verbindung 2 (17 mg, 20 μmol), HOBt (3 mg, 20 μmol), HBTU (8 mg, 20 μmol) und Diisopropylethylamin (8 mg, 60 μmol) in DMF (10 ml) auf einem Wrist-Action-Schüttler 4 Stunden bei Raumtemperatur behandelt, um 4 zu ergeben. Der Träger wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH3CN (2 × 10 ml) und CH2Cl2 (1 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte, dass 0,5 μmol/g Amin auf dem Träger zurückgelassen wurden. Der Träger wurde mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 5 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 5 ml) 2 Stunden bei Raumtemperatur gecappt. Der Träger 4 wurde mit CH3CN (3 × 10 ml) und CH2Cl2 (1 × 10 ml) gewaschen. Ein Tritylkation-Test ergab einen Wert von 9,2 μmol/g Beladung der Verbindung 2 auf dem Polystyrol-Träger. Der Träger 4 wurde mit 20%igem Piperidin in DMF (3 × 10 ml, 10 min für jeden Waschgang) behandelt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen und den Träger 5 zu ergeben, der mit DMF (3 × 10 ml), CH3CN (2 × 10 ml) und CHaCl2 (1 × 10 ml) gewaschen und unter vermindertem Druck über Nacht getrocknet wurde. Der Träger 5 (1 g, 9,2 μmol) wurde mit TAMRA-NHS-Ester (15 mg, 28,5 μmol) und Et3N (8,6 mg, 85 μmol) in DMF (10 ml) bei Raumtemperatur 36 Stunden auf einem Schüttler behandelt, um den Träger 6 (L = TAMRA) zu ergeben. Der Träger wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH3CN (2 × 10 ml) und CH2Cl2 (1 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte, dass weniger als 0,5 μmol/g Amin auf dem Träger zurückgelassen wurden. Der Träger wurde mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 5 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 5 ml) 1 Stunde gecappt und sodann mit CH3CN (3 × 10 ml) und CH3Cl2 (2 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Der Tritylkation-Test zeigte eine endgültige Beladung von 8,8 μmol/g für Polystyrol-Träger-Linker-TAMRA 6.
  • Beispiel 2. Synthese eines FAM-M 13-21-Primers auf einem markierten Träger 6
  • Synthese des FAM-M 13-21-Primers:
    Figure 00260001
    erfolgte auf dem ABI 394-DNA/RNA-Synthesegerät (Perkin-Elmer Co.) im 0,2 μmol-Maßstab mit FAM-markiertem Polystyrol-Träger 6 (2, L = 6-Carboxyfluorescein FAM, S = Polystyrol). Der Standard-0,2 μmol-CE-Zyklus wurde dadurch modifiziert, dass die Kopplungsdauer von 25 s auf 90 s für ein Koppeln aller 5'-Phosphoramidit-, 3'-DMT-Phosphoramidit-Nukleoside 7 (Glen Research) erhöht wurde. Nach vollständiger Synthese in der 5'- zu 3'-Richtung wurde der FAM-M 13-21-Primer abgespalten und in MeOH : t-BuNHa : H2O (1 : 1 : 2) bei 65°C 3 Stunden entschützt. Der Primer wurde mittels herkömmlicher Mittel, d. h. Anionen-Austausch-HPLC, analysiert und beim DNA-Sequenzieren verwendet.
  • Beispiel 3. Markieren eines Amino-207av-18-mer-Oligonukleotids auf einem Festträger mit TAMRA-CO2H
  • Die Synthese von 5'-TCACAGTCTGATCTCGAT-3' erfolgte auf dem ABI 394-DNA/RNA-Synthesegerät (Perkin-Elmer Co.) im 0,2 μmol-Maßstab mit unmarkiertem Polystyrol-Träger in der 3'- zu 5'-Richtung mit 5'-DMT, 3'-Phosphoramidit-Nukleosiden (Abz, Gdmf Cbz, T). Das Amino-Linker-Phosphoramiditreagenz 8 (Glen Research) wurde als das letzte Monomer angekoppelt und mit 3%iger Trichloressigsäure in CH2Cl2 detrityliert. Die Synthesesäule, die das 5'-Amino-207av-Oligonukleotid trug, wurde von dem Synthesegerät entfernt. Zwei 1 ml-Spritzen mit Luer-Spitzen wurden an jedem Ende der Synthesesäule angebracht. Eine Spritze war mit 10,7 mg (25 μmol) TAMRA-CO2H in 500 μl trockenem Dimethylformamid (DMF) gefüllt. Die zweite Spritze war mit 9,25 mg (25 μmol) HBTU und 9 μl (50 μmol) Diisopropylethylamin in 250 μl 1 : 1 DMF : CH3CN gefüllt. Die Kopplungsreagenzien in den Spritzen wurden durch die Säule dadurch geleitet, dass nacheinander jeder Kolben niedergedrückt wurde. Nach gründlichem Mischen für etwa 1 Minute wurde der Aufbau für etwa 15 Minuten für ein Fortsetzen der Kopplungsreaktion stehen gelassen. Die Reagenzien wurden in eine Spritze eingezogen und verworfen. Die Synthesesäule wurde mit 5 ml 1 : 1 DMF : CH3CN und 5 ml CH3CN gewaschen und mit 1 ml MeOH : t-BuNH2 : HaO (1 : 1 : 2) behandelt, um TAMRA-N-207av:
    Figure 00270001
    von dem Träger abzuspalten. Der Überstand mit TAMRA-N-207av wurde erhitzt und bei 65°C 3 Stunden entschützt, um alle Schutzgruppen zu entfernen. TAMRA-N- 207av wurde durch HPLC mit reverser Phase und MALDI-TOF-Massenspektroskopie analysiert, die eine homogene Reinheit und Identität bestätigten.
  • Beispiel 4. Markierung eines Thiol-Oligonukleotids mit CDPI3-CO2H
  • Die Synthese von 5'-TCACAGTCTGATCTCGAT-3' erfolgt auf dem ABI 394-DNA/RNA-Synthesegerät (Perkin-Elmer Co.) in einem 0,2 μmol-Maßstab mit unmarkiertem Polystyrol-Träger in der 3'- zu 5'-Richtung mit 5'-DMT, 3'-Phosphoramidit-Nukleosiden (Abz Gdmf, Cbz, T). Das Thiol-Linker-Phosphoramidit-Reagenz 10 wird als das letzte Monomer gekoppelt und mit Silbernitrat in DMF detrityliert. Die Synthesesäule, die das 5'-Thiol-207av-Oligonukleotid trägt, wird von dem Synthesegerät entfernt. Zwei 1 ml-Spritzen mit Luer-Spitzen werden an jedes Ende der Synthesesäule befestigt. Eine Spritze ist mit 15 mg (25 μmol) CDPI3-CO2H (6, CDPI3, X = OH) in 500 μl trockenem Dimethylformamid (DMF) gefüllt. Die zweite Spritze ist mit 9,25 mg (25 μmol) HATU und 9 μl (50 μmol) Diisopropylethylamin in 250 μl 1 : 1 DMF : CH3CN gefüllt. Die Kopplungsreagenzien in den Spritzen werden durch die Säule dadurch geleitet, dass nacheinander jeder Kolben niedergedrückt wird. Nach gründlichem Mischen für etwa 1 Minute wird der Aufbau für etwa 15 Minuten für ein Fortsetzen der Kopplungsreaktion stehen gelassen. Die Reagenzien werden in eine Spritze abgezogen und verworfen. Die Synthesesäule wird mit 5 ml 1 : 1 DMF : CH3CN und 5 ml CH3CN gewaschen und mit 1 ml MeOH : t-BuNH2 : H2O (1 : 1 : 2) behandelt, um CDPI3-S-207av:
    Figure 00280001
    von dem Träger abzuspalten. Der Überstand mit CDPI3-207av wird erhitzt und bei 65°C 3 Stunden entschützt, um alle Schutzgruppen zu entfernen. CDPI3-S-207av wird durch HPLC mit reverser Phase analysiert, um eine homogene Reinheit zu bestätigen. Die Analyse durch MALDI-TOF-Massenspektroskopie bestätigt die Identität.
  • Beispiel 5. Markierung eines 5'-Amino-SG1-Oligonukleotids auf einem Festträger mit NTB-CO2H
  • Die Synthese von 5'-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-3' erfolgte auf dem ABI 394-DNA/RNA-Synthesegerät (Perkin-Elmer Co.) in einem 0,2 μmol-Maßstab mit unmarkiertem Polystyrol-Träger in der 3'- zu 5'-Richtung mit 5'-DMT, 3'-Phosphoramidit-Nukleosiden (Abz, Gdmf, Cbz, T). Das Amino-Linker-Phosphoramidit-Reagenz 8 (Glen Research) wurde als das letzte Monomer gekoppelt und mit 3%iger Trichloressigsäure in CH2Cl2 detrityliert. Die Synthesesäule, die das 5'-Amino-SG1-Oligonukleotid trägt, wurde von dem Synthesegerät entfernt. Zwei 1 ml-Spritzen mit Luer-Spitzen wurden an jedes Ende der Synthesesäule befestigt. Eine Spritze war mit 11 mg (25 μmol) NTB-CO2H in 500 μl trockenem Dimethylformamid (DMF) gefüllt. Die zweite Spritze war mit 9,25 mg (25 μmol) HBTU und 9 μl (50 μmol) Diisopropylethylamin in 250 μl 1 : 1 DMF : CH3CN gefüllt. Die Kopplungsreagenzien in den Spritzen wurden durch die Säule dadurch geleitet, dass nacheinander jeder Kolben niedergedrückt wurde. Nach gründlichem Mischen für etwa 1 Minute wurde der Aufbau für etwa 15 Minuten für ein Fortsetzen der Kopplungsreaktion stehen gelassen. Die Reagenzien wurden in eine Spritze abgezogen und verworfen. Die Synthesesäule wurde mit 5 ml 1 : 1 DMF : CH3CN und 5 ml CH3CN gewaschen und mit 1 ml MeOH : t-BuNH2 : HaO (1 : 1 : 2) behandelt, um NTB-N-SG1:
    Figure 00290001
    von dem Träger abzuspalten. Der Überstand mit NTB-SG1 wurde erhitzt und bei 65°C 3 Stunden entschützt, um alle Schutzgruppen zu entfernen. NTB-SG1 wurde durch HPLC mit reverser Phase analysiert, um eine homogene Reinheit zu bestätigen. Die MALDI-TOF-Massenspektroskopie ergab eine molekulare Masse von 8390,27, was die Identität bestätigte.
  • Beispiel 6. Markierung von SG1 auf einem Festträger mit NTB-Phosphat und MSNT
  • Die Synthese von 5'-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-3' erfolgte auf dem ABI 39.4-DNA/RNA-Synthesegerät (Perkin-Elmer Co.) in einem 0,2 μmol-Maßstab mit unmarkiertem Polystyrol-Träger in der 3'- zu 5'-Richtung mit 5'-DMT, 3'-Phosphoramidit-Nukleosiden (Abz, Gdmf Cbz, T). Die 5'-terminale Hydroxylgruppe wurde mit 3%iger Trichloressigsäure in CH2Cl2 detrityliert. Die Synthesesäule, die das 5'-Hydroxyl-SG1-Oligonukleotid trägt, wurde von dem Synthesegerät entfernt. Zwei 1 ml-Spritzen mit Luer-Spitzen wurden an jedes Ende der Synthesesäule befestigt. Eine Spritze war mit 12 mg (25 μmol) NTB-Phosphat in 500 μl trockenem DMF gefüllt. Die zweite Spritze war mit 7,5 mg (25 μmol) MSNT und 9 μl (50 μmol) Diisopropylethylamin in 250 μl DMF gefüllt. Die Kopplungsreagenzien in den Spritzen wurden durch die Säule dadurch geleitet, dass nacheinander jeder Kolben niedergedrückt wurde. Nach gründlichem Mischen für etwa 1 Minute wurde der Aufbau für etwa 60 Minuten für ein Fortsetzen der Kopplungsreaktion stehen gelassen. Die Reagenzien wurden in eine Spritze abgezogen und verworfen. Die Synthesesäule wurde mit 5 ml 1 : 1 DMF : CH3CN und 5 ml CH3CN gewaschen und mit 1 ml MeOH : t-BuNH2 : H2O (1 : 1 : 2) behandelt, um NTB-P-SG1:
    Figure 00300001
    von dem Träger abzuspalten. Der Überstand mit NTB-P-SG1 wurde erhitzt und bei 65°C 3 Stunden entschützt, um alle Schutzgruppen zu entfernen. NTB-P-SG1 wurde durch HPLC mit reverser Phase und MALDI-TOF-Massenspektroskopie analysiert, um die homogene Reinheit und Identität zu bestätigen.
  • Beispiel 7. Markierung von PNA auf einem Festträger mit MGB1
  • Eine automatische Synthese von PNA und PNA/DNA-Chimären erfolgte unter Verwendung eines ABI Modell 394-DNA/RNA-Synthesegeräts oder eines 433A-Peptidsynthesegeräts (Perkin-Elmer Co.) gemäß den allgemeinen Verfahren, die im Handbuch des Synthesegerätherstellers als auch bei Egholm, 1993, beschrieben sind.
  • PNA wurden in einem 2–5 μmol-Maßstab auf einem hoch beladenen MBHA (Methylbenzhydrylamin)-Linker-Polystyrolträger, mit Standardsynthesetechniken und Nukleobasen (Abz, Cbz, Gibu, T) und Schutzgruppen für primäre Aminogruppen (MMT, Fmoc oder Boc), im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (Dueholm, 1994) synthetisiert. Ein 3 ml-Reaktionsgefäß wird bei dem 5 μmol-Maßstab und bei einem Gesamt-Reaktionsvolumen von 440 μl verwendet.
  • PNA wurden mit einem Carboxy-terminalen Lysin auf dem MBHA-Festträger durch Vorbeladen mit t-Boc-lys(Fmoc) hergestellt. PNA mit Carboxy-terminalen Amiden wurden entweder direkt auf einem MBHA-Träger oder auf einem MBHA-Träger, der mit dem t-Boc T PNA-Monomer vorbeladen worden war, synthetisiert. Alle Harze wurden mit 0,1 bis 0,25 mmol/g beladen. Ein Spacer O, 2-(2-Aminoethoxy)essigsäure, kann als das Fmoc-Amino-geschützte Synthon gekoppelt werden. Eine oder mehrere Spacer-O-Einheiten fungieren als eine flexible, nicht-basenpaarende Gelenkregion in PNA-Sequenzen.
  • Der für die PNA/DNA-Chimär-Synthese verwendete Träger ist ein nicht-quellendes, hochvernetztes Polystyrolkügelchen mit einem Hydroxymethylbenzoesäure-Linker (Vinayak, 1997). PNA-Monomere für eine Chimär-Synthese verwenden die MMT-Gruppe zum Schützen einer primären Aminogruppe. In dem ersten Schritt werden die Monomere, HATU und DIPEA, jeweils in DMF/CH3CN, 1/1 gelöst, gleichzeitig zu der Reaktionskartusche gegeben. Nach 16 min werden die Capping-Reagenzien zugeführt. Um die Neigung der primären Aminofunktion von PNA, zu wandern oder zu cyclisieren, zu minimieren, wird der Amino-Terminus nach Entfernen der letzten MMT-Gruppe acetyliert. Reagenzien, um DNA- und PNA-Gruppen zu verbinden, und andere Verfahren für eine Chimär-Synthese, -Spaltung, -Entschützung und -Aufreinigung wurden beschrieben (Van der Laan, 1997). In diesem Ansatz kann das Chimär kontinuierlich in einer einzigen Kartusche und auf einem einzigen Synthesegerät hergestellt werden.
  • Das PNA-Oligomer H2N-TCCTCCTT (1 μmol) auf einem Festträger wurde mittels der vorstehenden Verfahren synthetisiert. Das PNA auf einem Polystyrolträger wurde mit einem Gemisch aus MGB1-CO2H (5 mg, 10 μmol, 6, Gong, 1997), HATU (10 μmol), 5 μl DIEA und 100 μl DMF umgesetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Träger wurde sodann mit DMF und CH2Cl2 gewaschen, mit TFMSA (Trifluormethansulfonsäure) bei Raumtemperatur 1 Stunde abgespalten und in Ether ausgefällt, um MGB1-PNA:
    Figure 00310001
    zu ergeben. MGB1-PNA wurde mittels HPLC mit reverser Phase und MALDI-TOF-Massenspektroskopie analysiert, die die homogene Reinheit und Identität bestätigten.
  • Beispiel 8. Markierung von PNA auf einem Festträger mit CDPI3
  • Mittels der gleichen Verfahren und Reagenzien wie in Beispiel 9 wurde CDPI3 an das PNA H2N-TCCTCCTT durch drei aufeinander folgende Kopplungen von Fmoc-CDPI (6, Lukhtanov, 1995) angebunden, um CDPI3-markierte PNA zu ergeben. Die CDPI-Monomereinheit, 1,2-Dihydro-(3H)-pyrrolo[3,2-e]indol-7-carboxylat, geschützt mit Fmoc (5 mg, 0,012 mmol), wurde in 100 μl NMP gelöst und durch 0,95 Äquivalente HATU (0,2 M in DMF) und 2 Äquivalente DIEA (0,4 M in DMF) aktiviert. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde die aktivierte Fmoc-CDPI-Lösung zu dem an PNA gebundenen Träger gegeben und für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gekoppelt. Der Träger wurde nach dem Koppeln mit 20 ml DMF gewaschen. Die Fmoc-Gruppe wurde durch Behandlung des Harzträgers mit 1 : 4 Piperidin : DMF für 10 Minuten bei Raumtemperatur entfernt. Dieser Kopplungs- und Entschützungszyklus wurde zwei weitere Male für eine Gesamtzahl von 3 manuellen Kopplungen wieder holt. Der Träger wurde sodann mit DMF und CH2Cl2 gewaschen, gefolgt von einer Abspaltung mit TFMSA (Trifluormethansulfonsäure) bei Raumtemperatur für 1 Stunde, gefolgt von Ether-Ausfällung der rohen CDPI3-PNA:
  • Figure 00320001
  • CDPI3-PNA wurde durch HPLC mit reverser Phase und MALDI-TOF-Massenspektroskopie analysiert, die die homogene Reinheit und Identität bestätigten.
  • Beispiel 9. Markierung einer Taqman-selbstlöschenden Sonde auf einem markierten Träger 6
  • Das Oligonukleotid 5'-FAM-CCTGCAGGCCCGTGCCCGT-3' wird auf dem ABI 394-DNA/RNA-Synthesegerät in einem 0,2 μmol-Maßstab mit FAM-markiertem Polystyrolträger 6 synthetisiert (2, L = 6-Carboxyfluorescein FAM, S = Polystyrol). Der Standard-0,2 μmol-CE-Zyklus wird dahingehend modifiziert, dass die Kopplungsdauer von 25 s auf 90 s für ein Koppeln aller 5'-Phosphoramidit-3'-DMT-Phosphoramidit-Nukleoside (Glen Research) erhöht ist. Nach vollständiger Synthese in der 5'- zu 3'-Richtung wird das Amino-Linker-Phosphoramiditreagenz 8 (Glen Research) als das letzte Monomer an den 3'-Terminus gekoppelt und mit 3%iger Trichloressigsäure in CH2Cl2 detrityliert. Die Synthesesäule, die das 3'-Amino-5'-FAM-Oligonukleotid an dem Festträger trägt, wird aus dem Synthesegerät entfernt. Zwei 1 ml-Spritzen mit Luer-Spitzen werden an jedes Ende der Synthesesäule befestigt. Eine Spritze ist mit 10,7 mg (25 μmol) TAMRA-CO2H in 500 μl trockenem Dimethylformamid (DMF) gefüllt. Die zweite Spritze ist mit 9,25 mg (25 μmol) HBTU und 9 μl (50 μmol) Düsopropylethylamin in 250 μl 1 : 1 DMF : CH3CN gefüllt. Die Kopplungsreagenzien in den Spritzen werden durch die Säule dadurch geleitet, dass nacheinander jeder Kolben niedergedrückt wird. Nach gründlichem Mischen für etwa 1 Minute wird der Aufbau für etwa 15 Minuten für ein Fortsetzen der Kopplungsreaktion stehen gelassen. Die Reagenzien werden in eine Spritze eingezogen und verworfen. Die Synthesesäule wird mit 5 ml 1 : 1 DMF : CH3CN und 5 ml CH3CN gewaschen und mit 1 ml MeOH :t-BuNH2 : H2O (1 : 1 : 2) behandelt, um die 5'-FAM-3'-N-TAMRA-Taqman-selbstlöschende Sonde:
    Figure 00320002
    von dem Träger abzuspalten. Der Überstand mit der Sonde wird erhitzt und bei 65°C 3 Stunden entschützt, um alle Schutzgruppen zu entfernen. Die Sonde wird mittels HPLC mit reverser Phase und MALDI-TOF-Massenspektroskopie analysiert, die die homogene Reinheit und Identität bestätigten.
  • Obwohl nur wenige Ausführungsformen im Detail vorstehend beschrieben wurden, wird der Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Chemie eindeutig verstehen, dass viele Modifikationen in der bevorzugten Ausführungsform möglich sind, ohne von deren technischen Lehre abzuweichen. Alle solche Modifkationen sollen von den nachstehenden Ansprüchen umfasst sein.

Claims (33)

  1. Verfahren für eine 5' nach 3'-Synthese von 5'-markierten Oligonukleotiden, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines markierten Festphasenträgers mit der Struktur
    Figure 00340001
    worin S ein Festphasenträger ist, A ein spaltbarer Linker ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Estern und anderen basenlabilen Linkern, Silylethern, Silylgruppen oder anderen Gruppen, die unter Oxidations-/Reduktions-Bedingungen mit Reagenzien wie Dithiothreitol gespalten werden, X eine Gruppe mit drei oder mehreren Bindungsstellen ist, L eine Markierung ist, Y aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sauerstoffatom, einer NH-, NR-Gruppe, worin R eine Methylgruppe, geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe aus 1–12 Kohlenstoffatomen, eine substituierte Alkyl-, Phenyl-, Aryl- und substituierte Arylgruppe ist, und Schwefelatom besteht, und P1 eine säurespaltbare Schutzgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DMT, MMT, einer Trityl-, substituierten Trityl-, Pixyl- oder Trialkylsilylgruppe, b) Umsetzen des markierten Festphasenträgers mit einer Säure, um die säurespaltbare Schutzgruppe P1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DMT, MMT, einer Trityl-, substituierten Trityl-, Pixyl- oder Trialkylsilylgruppe, zu entfernen, und c) Zusetzen eines 5'-Phosphoramidit-3'-geschützten Nukleosids und eines Aktivators, wodurch eine Bindung zwischen Y und dem 5'-Terminus des Nukleosids gebildet wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend die Schritte d) Capping jeder nicht-umgesetzten Stelle auf dem Festphasenträger und e) Zusetzen eines Oxidationsmittels.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, ferner umfassend die Schritte d) Capping jeder nicht-umgesetzten Stelle auf dem Festphasenträger, e) Zusetzen eines Oxidationsmittels und f) Wiederholen der Schritte b) bis e), bis das markierte Oligonukleotid vollständig synthetisiert ist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, ferner umfassend den Schritt eines Entschützens des markierten Oligonukleotids.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 3, ferner umfassend die Schritte eines Abspaltens des markierten Oligonukleotids von dem Festphasenträger und eines Entschützens des markierten Oligonukleotids.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Festphasenträger S ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, kontrolliertem Porenglas, Silicagel, Silicamaterial, Polyacrylamid, magnetischen Kügelchen, Polyacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Polyamid, Polyethylen, Polyoxyethylen und Copolymeren und Pfropfpolymeren davon.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Form des Festphasenträgers S ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus kleinen Partikeln, Kügelchen, Membranen, Fritten, Objektträgern, Platten, mikrobearbeiteten Chips, Alkanthiol-Gold-Schichten, nichtporösen Oberflächen, adressierbaren Anordnungen und Polynukleotid-immobilisierenden Medien.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der spaltbare Linker A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
    Figure 00360001
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
    Figure 00360002
    worin n 1 bis 12 ist.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Markierung L ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hybridisierungs-stabilisierenden Gruppen, fluoreszierenden Farbstoffen, Fluoreszenzlöschern, Energie-Transfer-Farbstoffgruppen, chemielumineszierenden Farbstoffen, Aminosäuren, Proteinen, Peptiden, Enzymen und Affinitätsliganden.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Fluoreszenzfarbstofte und Fluoreszenzlöscher ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus FAM, TET, HEX, JOE, TAMRA, d-TAMRA, JODA, ROX, VIC, NED, dJON, dR139, DABCYL, DABSYL, Malachitgrün, 4,7-Dichlorfluorescinen, 4,7-Dichlorrhodaminen, NTB und Cyaninen.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Hybridisierungs-stabilisierenden Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hoechst 33258, CDPI1-3, MGB1, Netropsin und Distamycin.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das 5'-Phosphoramidit-3'-geschützte Nukleosidmonomer die Struktur:
    Figure 00370001
    aufweist, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Cyanethyl-, Methyl-Gruppe, einer geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Alkylgruppe aus 1–12 Kohlenstoffatomen, einer substituierten Alkyl-, Phenyl-, Aryl- und substituierten Arylgruppe; R1 und R2 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Isopropyl-, Morpholino-, Methyl-, Ethyl-, Niederalkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppen, P2 eine Schutzgruppe für ein exocyclisches Stickstoffatom ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Benzoyl-, Isobutyryl-, Acetyl-, Phenoxyacetyl-, Aryloxyacetyl-, Dimethylformämidin-, Dialkylformamidin- und Dialkylacetamidingruppe, und P3 eine säurelabile Schutzgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DMT, MMT, einer Pixyl-, Trityl- und Trialkylsilylgruppe.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Oligonukleotid eine oder mehrere DNA-, RNA- und Nukleinsäure-Analog-Monomereinheiten umfasst, wobei das Nukleinsäure-Analog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nukleobasen-Analoga, Zucker-Analoga und Internukleotid-Analoga.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Nukleobasen-Analoga ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus C-5-Alkylpyrimidin, 2,6-Diaminopurin, 2-Thiopyrimidin, C-5-Propinpyrimidin, Phenoxazin, 7-Deazapurin, Isocytidin, Pseudoisocytidin, Isoguanosin, Hypoxanthin, 8-Oxopurin und Universalbase.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Zucker-Analoga ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 2'-O-Alkyl-Ribonukleotiden, 2'-O-Methyl-Ribonukleotiden, 2'-O-Allyl-Ribonukleotiden, 2'-Allyl-Ribonukleotiden, 2'-Halogen-Ribonukleotiden, 2'-O-Methoxyethyl-Ribonukleotiden, 2'-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotiden, 2'-O-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotiden, 4'-α-anomeren Nukleotiden und 1'-α-anomeren Nukleotiden.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Internukleotid-Analoga ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 2-Aminoethylglycin (PNA), 2'-5'-Bindung, invertierter 3'-3'- Bindung, invertierter 5'-5'-Bindung, Phosphorthioat, Methylphosphonat, nichtverbrückendem N-substituiertem Phosphoramidat, alkylierter Phosphotriester-verzweigten Struktur und 3'-N-Phosphoramidat.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der markierte Festphasenträger eine Verbindung der Formel
    Figure 00380001
    umfasst, worin S Polystyrol oder kontrolliertes Porenglas ist und L eine Markierung ist.
  19. Festphasenträger, umfassend eine Verbindung der Formel
    Figure 00380002
    worin S ein Festphasenträger ist, A ein spaltbarer Linker ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Estern und anderen basenlabilen Linkern, Silylethern, Silylgruppen oder anderen Gruppen, die unter Oxidations-/Reduktions-Bedingungen mit Reagenzien wie Dithiothreitol gespalten werden, X eine Gruppe mit drei oder mehreren Bindungsstellen ist, L eine Markierung ist, Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem O-Atom, einer NH-, NR-Gruppe und einem S-Atom, R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Cyanethyl-, Methyl-Gruppe, einer geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Alkylgruppe aus 1–12 Kohlenstoffatomen, einer substituierten Alkyl-, Phenyl-, Aryl- und substituierten Arylgruppe, P2 eine Schutzgruppe für ein exocyclisches Stickstoffatom ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Benzoyl-, Isobutyryl-, Acetyl-, Phenoxyacetyl-, Aryloxyacetyl-, Dimethylformamidin-, Dialkylformamidin- und Dialkylacetamidingruppe, und P3 eine säurelabile Schutzgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DMT, MMT, einer Trityl-, substituierten Trityl-, Pixyl- und Trialkylsilylgruppe.
  20. Festphasenträger, umfassend eine Verbindung der Formel
    Figure 00390001
    worin n eine ganze Zahl von 0 bis 100 ist, S ein Festphasenträger ist, A ein spaltbarer Linker ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Estern und anderen basenlabilen Linkern, Silylethern, Silylgruppen oder anderen Gruppen, die unter Oxidations-/Reduktions-Bedingungen mit Reagenzien wie Dithiothreitol gespalten werden, X eine Gruppe mit drei oder mehreren Bindungsstellen ist, L eine Markierung ist, Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem O-Atom, einer NH-, NR-Gruppe und einem S-Atom, R eine Cyanethyl-, Methyl-Gruppe, eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe aus 1–12 Kohlenstoffatomen, eine substituierte Alkyl-, Phenyl-, Aryl- und substituierte Arylgruppe ist und P2 eine Schutzgruppe für ein exocyclisches Stickstoffatom ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Benzoyl-, Isobutyryl-, Acetyl-, Phenoxyacetyl-, Aryloxyacetyl-, Dimethylformamidin-, Dialkylformamidin- und Dialkylacetamidingruppe.
  21. Verfahren zum Synthetisieren eines markierten Oligonukleotids auf einen Festphasenträger mit der Struktur
    Figure 00400001
    worin S ein Festphasenträger ist, A ein spaltbarer Linker ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Estern und anderen basenlabilen Linkern, Silylethern, Silylgruppen oder anderen Gruppen, die unter Oxidations-/Reduktions-Bedingungen mit Reagenzien wie Dithiothreitol gespalten werden, X eine Gruppe mit drei oder mehreren Bindungsstellen ist, L eine Markierung ist, Y aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Sauerstoffatom, einer NH-, NR-Gruppe, worin R eine Methylgruppe, geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe aus 1–12 Kohlenstoffatomen, eine substituierten Alkyl-, Phenyl-, Aryl- und substituierte Arylgruppe ist, und einem Schwefelatom besteht, und P, eine säurespaltbare Schutzgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DMT, MMT, einer Trityl-, substituierten Trityl-, Pixyl- oder Trialkylsilylgruppe, oder auf einem Festphasenträger gemäß Anspruch 19 oder 20, umfassend: Synthetisieren eines Oligonukleotids auf einem Festträger, wobei das Oligonukleotid eine nukleophile Funktionalität, bestehend aus Alkohol, Amin oder Thiol, umfasst, und Koppeln eines Markierungsreagens mit einer Funktionalität, die aus einer Carbonsäure, Sulfonsäure, Phosphonsäure oder Phosphorsäure besteht, an das an dem Festphasenträger gebundene Oligonukleotid mit einem Kopplungsreagens, wobei das Kopplungsreagens HATU, HBTU, TBTU, BOP, PyBOP, EEDQ, DCC, DIPCDI, HOBt, MSNT, Triisopropylbenzolsulfonylchlorid oder ein Arylsulfonylhalogenid ist, wodurch eine Ester-, Amid-, Thioester-, Sulfonamid-, Sulfonat-, Phosphonat-, Phosphoramidat-, Phosphorthioat- oder Phosphatbindung gebildet wird.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Markierungsreagenzien ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hybridisierungs-stabilisierenden Gruppen, Fluoreszenzfarbstoffen, Fluoreszenzlöschern, Energie-Transfer-Farbstoffgruppen, chemielumineszierenden Farbstoffen, Aminosäuren, Proteinen, Peptiden, Enzymen und Affinitätsliganden.
  23. Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Fluoreszenzfarbstoffe und Fluoreszenzlöscher ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus FAM, TET, HEX, JOE, TAMRA, d-TAMRA, JODA, ROX, VIC, NED, dJON, dR139, DABCYL, DABSYL, Malachitgrün, 4,7-Dichlorfluorescinen, 4,7-Dichlorrhodaminen, NTB und Cyaninen.
  24. Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Hybridisierungs-stabilisierenden Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hoechst 33258, CDPI1-3, MGB1, Netropsin und Distamycin.
  25. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Markierungen an das Oligonukleotid bei den Markierungsstellen, die aus dem 5'-Terminus, 3'-Terminus, einer Nukleobase, einer Internukleotidbindung, einem Zucker, einer Amino-, Sulfid-, Hydroxyl- und Carboxylgruppe bestehen, gekoppelt werden.
  26. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei der Festphasenträger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, kontrolliertem Porenglas, Silicagel, Silicamaterial, Polyacrylamid, magnetischen Kügelchen, Polyacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Polyamid, Polyethylen, Polyoxyethylen und Copolymeren oder Pfropfpolymeren davon.
  27. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei die Form des Festphasenträgers ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus kleinen Partikeln, Kügelchen, Membranen, Fritten, nichtporösen Oberflächen, Objektträgern, Platten, mikrobearbeiteten Chips, Alkanthiol-Gold-Schichten, adressierbaren Anordnungen oder Polynukleotid-immobilisierenden Medien.
  28. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei das Oligonukleotid eine oder mehrere DNA-, RNA-, PNA- und Nukleinsäure-Analog-Monomereinheiten umfasst, wobei das Nukleinsäure-Analog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nukleobasen-Analoga, Zucker-Analoga und Internukleotid-Analoga.
  29. Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die Nukleobasen-Analoga ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus C-5-Alkylpyrimidin, 2,6-Diaminopurin, 2-Thiopyrimidin, C-5-Propinpyrimidin, Phenoxazin, 7-Deazapurin, Isocytidin, Pseudoisocytidin, Isoguanosin, Hypoxanthin, 8-Oxopurin und Universalbase.
  30. Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die Zucker-Analoga ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 2'-O-Alkyl-Ribonukleotiden, 2'-O-Methyl-Ribonukleotiden, 2'-O-Allyl-Ribonukleotiden, 2'-Allyl-Ribonukleotiden, 2'-Halogen-Ribonukleotiden, 2'-O-Methoxyethyl- Ribonukleotiden, 2'-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotiden, 2'-O-Verzweigungsgruppe-Ribonukleotiden, 4'-α-anomeren Nukleotiden und 1'-α-anomeren Nukleotiden.
  31. Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die Internukleotid-Analoga ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 2-Aminoethylglycin (PNA), 2'-5'-Bindung, invertierter 3'-3'-Bindung, invertierter 5'-5'- Bindung, Phosphorthioat, Methylphosphonat, nichtverbrückendem N-substituiertem Phosphoramidat, alkylierter Phosphotriester-verzweigter Struktur und 3'-N-Phosphoramidat.
  32. Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Richtung der Oligonukleotidsynthese 5' nach 3' ist.
  33. Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Richtung der Oligonukleotidsynthese 3' nach 5' ist.
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Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6881570B1 (en) * 1998-12-15 2005-04-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. Test piece and quantitative method and apparatus for an organism-oriented substance
US6255476B1 (en) * 1999-02-22 2001-07-03 Pe Corporation (Ny) Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports
JP3957118B2 (ja) * 1999-05-18 2007-08-15 富士フイルム株式会社 試験片およびこの試験片からの画像情報読取装置
US6593464B1 (en) * 1999-05-24 2003-07-15 Invitrogen Corporation Method for deblocking of labeled oligonucleotides
US7183405B2 (en) * 1999-06-25 2007-02-27 Syn Gen, Inc. Compositions and methods for labeling oligonucleotides
US7211390B2 (en) 1999-09-16 2007-05-01 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US6451588B1 (en) * 2000-06-30 2002-09-17 Pe Corporation (Ny) Multipartite high-affinity nucleic acid probes
JP3398366B2 (ja) * 2000-08-09 2003-04-21 富士写真フイルム株式会社 Ｄｎａ分析用マイクロアレイの製造方法
US6559279B1 (en) 2000-09-08 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing peptide derivatized oligomeric compounds
CA2436857A1 (en) * 2000-12-14 2002-06-20 Gen-Probe Incorporated Method and kit for enhancing the association rates of polynucleotides
US6534646B2 (en) 2001-06-04 2003-03-18 Barrskogen, Inc. Oligonucleotide labeling reagents
US6448016B1 (en) * 2001-06-12 2002-09-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Nucleotide sequences for detection of Bacillus anthracis
US20050009022A1 (en) * 2001-07-06 2005-01-13 Weiner Michael P. Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter
US20030054396A1 (en) * 2001-09-07 2003-03-20 Weiner Michael P. Enzymatic light amplification
US6902921B2 (en) * 2001-10-30 2005-06-07 454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
US20050124022A1 (en) * 2001-10-30 2005-06-09 Maithreyan Srinivasan Novel sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
US6956114B2 (en) 2001-10-30 2005-10-18 '454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
US6686162B2 (en) 2001-12-04 2004-02-03 Quest Diagnostics Investments, Incorporated Oligonucleotides and methods for detecting Borrelia burgdorferi
US6946245B2 (en) 2001-12-04 2005-09-20 Quest Diagnostics Investments Incorporated Oligonucleotides and methods for detecting hepatitis C viral nucleic acids
DE10206616A1 (de) * 2002-02-15 2003-09-04 Qiagen Gmbh Verfahren zur Reduktion der Background-Kontamination nach Markierungsreaktionen
CA2498320A1 (en) * 2002-09-20 2004-04-01 Integrated Dna Technologies, Inc. Anthraquinone quencher dyes, their methods of preparation and use
US6913890B2 (en) * 2002-12-18 2005-07-05 Palo Alto Research Center Incorporated Process for preparing albumin protein conjugated oligonucleotide probes
US20060292438A1 (en) * 2002-12-23 2006-12-28 Applera Corporation; Applied Biosystems Group Heteroconfigurational Polynucleotides and Methods of Use
US20080015349A1 (en) * 2003-01-24 2008-01-17 Third Wave Technologies, Inc. Oligonucleotide production
US7575865B2 (en) * 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
CA2513889A1 (en) * 2003-01-29 2004-08-19 454 Corporation Double ended sequencing
EP1466919A1 (de) * 2003-04-05 2004-10-13 Roche Diagnostics GmbH Sechsgliedrige Ringe Nukleotidanalogue
CA2463719A1 (en) * 2003-04-05 2004-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleotide analogs with six membered rings
WO2005049849A2 (en) 2003-11-14 2005-06-02 Integrated Dna Technologies, Inc. Fluorescence quenching azo dyes, their methods of preparation and use
US20050153300A1 (en) * 2004-01-09 2005-07-14 Quest Diagnostics Incorporated Methods and compositions for the detection of mucolipidosis IV mutations
US20050214779A1 (en) * 2004-03-29 2005-09-29 Peck Bill J Methods for in situ generation of nucleic acid arrays
EP1627926A1 (de) * 2004-08-19 2006-02-22 Roche Diagnostics GmbH Eine Methode zur Reduktion von falsch-positiven Messergebnissen
US7879569B2 (en) 2004-11-09 2011-02-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for diagnosis of myelodysplastic syndromes (MDS)
CA2601554A1 (en) * 2005-05-20 2006-11-30 Integrated Dna Technologies, Inc. Compounds and methods for labeling oligonucleotides
US7955864B2 (en) 2005-08-22 2011-06-07 Life Technologies Corporation Device and method for making discrete volumes of a first fluid in contact with a second fluid, which are immiscible with each other
EP1801114B8 (de) 2005-11-23 2009-12-02 Roche Diagnostics GmbH Polynukleotid mit Phosphatmimetikum
WO2007106907A2 (en) * 2006-03-15 2007-09-20 Integrated Dna Technologies, Inc. Nucleic acid monomers with 2'-chemical moieties
WO2007115265A2 (en) * 2006-03-31 2007-10-11 Applied Biosystems Inc. Reagents useful for synthesizing rhodamine-labeled oligonucleotides
US8895711B2 (en) * 2006-04-18 2014-11-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mutated ACVR1 for diagnosis and treatment of Fibrodyplasia Ossificans Progressiva (FOP)
US8859752B2 (en) 2006-04-18 2014-10-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania SIRNA-based therapy of Fibrodyplasia Ossificans Progressiva (FOP)
US7759062B2 (en) * 2006-06-09 2010-07-20 Third Wave Technologies, Inc. T-structure invasive cleavage assays, consistent nucleic acid dispensing, and low level target nucleic acid detection
US20080153135A1 (en) * 2006-12-20 2008-06-26 Liu Timothy Z Methods and apparatus for conducting amplification reactions on high density hydrophilic patterned microplates
US20080153134A1 (en) * 2006-12-22 2008-06-26 Willy Wiyatno Methods and apparatus for generating hydrophilic patterning of high density microplates using an amphiphilic polymer
US20080268440A1 (en) * 2007-04-26 2008-10-30 Liu Timothy Z Biomolecule immobilization on surface via hydrophobic interactions
EP2036897B1 (de) * 2007-09-04 2017-10-18 Roche Diagnostics GmbH Stabiles Reagens zur Rhodaminmarkierung
WO2009038791A1 (en) 2007-09-18 2009-03-26 Applied Biosystems Inc. Methods, systems and apparatus for light concentrating mechanisms
US20090139311A1 (en) * 2007-10-05 2009-06-04 Applied Biosystems Inc. Biological Analysis Systems, Devices, and Methods
JP5365005B2 (ja) * 2008-01-17 2013-12-11 富士通株式会社 中性で切断可能な核酸合成用レジン
KR101419980B1 (ko) 2008-03-15 2014-07-15 홀로직, 인크. 증폭 반응 도중에 핵산 분자를 분석하기 위한 조성물 및 방법
JP5438922B2 (ja) * 2008-06-25 2014-03-12 日東電工株式会社 核酸の製造方法
US8097412B2 (en) * 2008-07-12 2012-01-17 Biodiagnostics, Inc. DNA-based test for detection of annual and intermediate ryegrass
EP2192198A1 (de) 2008-12-01 2010-06-02 Biotype AG Neuartige Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen zur Erkennung von Nukleinsäuren
US9347092B2 (en) * 2009-02-25 2016-05-24 Roche Molecular System, Inc. Solid support for high-throughput nucleic acid analysis
US12410463B2 (en) 2009-09-18 2025-09-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Molecular beacons
CN105973686A (zh) * 2009-10-02 2016-09-28 生命科技公司 样品制备装置和方法
WO2011066330A2 (en) * 2009-11-24 2011-06-03 Life Technologies Corporation Selective amplification of polynucleotide sequences
EP2553123B1 (de) 2010-03-26 2016-08-24 Integrated DNA Technologies, Inc. Verfahren zur verstärkung einer nukleinsäurehybridisierung
US9506057B2 (en) 2010-03-26 2016-11-29 Integrated Dna Technologies, Inc. Modifications for antisense compounds
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2614149B1 (de) 2010-09-07 2015-04-08 Integrated Dna Technologies, Inc. Modifizierungen für antisense-verbindungen
ES3005233T3 (en) 2010-10-01 2025-03-14 Modernatx Inc Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
WO2012134813A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 St. Jude Children's Research Hospital Methods and compositions for identifying minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia
JP5808025B2 (ja) * 2011-08-12 2015-11-10 国立研究開発法人産業技術総合研究所 アミノ化オリゴヌクレオチド用固相担体
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2763701B1 (de) 2011-10-03 2018-12-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
JP2015501844A (ja) 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物
CN108103147B (zh) 2012-02-09 2021-06-01 生命技术公司 缀合的聚合物颗粒及其制备方法
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
WO2013151663A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US8859098B2 (en) * 2012-05-18 2014-10-14 Lord Corporation Acrylic adhesion promoters
WO2014062723A1 (en) 2012-10-15 2014-04-24 Sudhir Sinha Method for genetic detection using interspersed genetic elements: a multiplexed dna analysis system
ES2921623T3 (es) 2012-11-26 2022-08-30 Modernatx Inc ARN modificado terminalmente
WO2014158628A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Hologic, Inc. Compositions and methods for analysis of nucleic acid molecules
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US20160194625A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
KR20160067219A (ko) 2013-10-03 2016-06-13 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 저밀도 지단백질 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
HK1222209A1 (zh) * 2013-10-19 2017-06-23 Trovagene, Inc. 隨時間檢測疾病中的突變
US20150132256A1 (en) * 2013-10-19 2015-05-14 Trovagene, Inc. Detecting and monitoring mutations in histiocytosis
US10533216B2 (en) 2014-05-23 2020-01-14 Centrillion Technology Holdings Corporation Oligonucleotide probe inversion process for in situ synthesized probe arrays
EP3169693B1 (de) 2014-07-16 2022-03-09 ModernaTX, Inc. Chimäre polynukleotide
WO2016014846A1 (en) 2014-07-23 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
CN107922974B (zh) 2015-07-02 2021-11-09 生命技术公司 羧基官能亲水微珠的偶合
WO2017007774A1 (en) * 2015-07-06 2017-01-12 Life Technologies Corporation Substrates and methods useful in sequencing
WO2017031278A1 (en) * 2015-08-18 2017-02-23 Centrillion Technology Holdings Corporation Probe inversion process for in situ synthesized probe arrays
US10695735B2 (en) 2015-08-18 2020-06-30 Centrillion Technology Holdings Corporation Probe inversion process for in situ synthesized probe arrays
WO2019202536A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 St. Jude Children's Research Hospital Genotyping assays to identify mutations in xaf1
US11384376B2 (en) * 2018-05-31 2022-07-12 Roche Molecular Systems, Inc. Reagents and methods for post-synthetic modification of nucleic acids
MX2021007492A (es) * 2018-12-20 2021-10-13 Life Technologies Corp Colorante de rodamina asimétrica y uso de este en ensayos biológicos.
EP4151597B1 (de) * 2020-05-13 2026-04-15 Sumitomo Chemical Company, Limited Anorganisches poröses substrat, anorganischer poröser träger und nukleinsäureherstellungsverfahren
WO2021259881A1 (en) * 2020-06-22 2021-12-30 Illumina Cambridge Limited Nucleosides and nucleotides with 3' acetal blocking group
US20230304932A1 (en) 2020-07-23 2023-09-28 Life Technologies Corporation Compositions, systems and methods for biological analysis involving energy transfer dye conjugates and analytes comprising the same
CA3186955A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Scott Benson Energy transfer dye conjugates for use in biological assays
CN116333006A (zh) * 2023-04-07 2023-06-27 苏州欧利生物医药科技有限公司 一种带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法
CN119350418A (zh) * 2024-12-24 2025-01-24 中肽生化有限公司 一种寡核苷酸的合成方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4965349A (en) 1987-12-24 1990-10-23 Applied Biosystems, Inc. Method of synthesizing oligonucleotides labeled with ammonia-labile groups on solid phase supports
US5141813A (en) 1989-08-28 1992-08-25 Clontech Laboratories, Inc. Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis
US5290925A (en) * 1990-12-20 1994-03-01 Abbott Laboratories Methods, kits, and reactive supports for 3' labeling of oligonucleotides
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
JPH0649100A (ja) * 1992-05-06 1994-02-22 Eastman Kodak Co カルボキシル化基体への化合物の結合方法
US5552471A (en) 1994-08-17 1996-09-03 The Perkin-Elmer Corporation Solid support reagents for the synthesis of 3'-Nitrogen containing polynucleotides
EP0778845A1 (de) * 1994-09-02 1997-06-18 Novartis AG Oligonukleotidkonjugate, zusammensetzungen und verfahren zur spaltung von ribonukleinsäuren
US5908926A (en) * 1995-03-16 1999-06-01 Duke University 5'to 3' nucleic acid synthesis using 3'-photoremovable protecting group
US5736626A (en) 1996-01-29 1998-04-07 The Perkin-Elmer Corporation Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labeled polynucleotides
US6255476B1 (en) * 1999-02-22 2001-07-03 Pe Corporation (Ny) Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports
JP2007161641A (ja) * 2005-12-14 2007-06-28 Pola Chem Ind Inc 液体洗浄料

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