ES2204537T3 - Sistesis de oligonucleotidos marcados sobre soportes solidos. - Google Patents
Sistesis de oligonucleotidos marcados sobre soportes solidos.Info
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Abstract
Procedimiento para la síntesis 5'' a 3'' de oligonucleótidos marcados en el extremo 5'', que comprende las etapas siguientes: a) proporcionar un soporte sólido marcado que tiene la estructura: en la que S es un soporte sólido; A es un engarce fragmentable, seleccionado de entre el grupo constituido por ésteres y otros engarces lábiles básicos, éteres silílicos, grupos silílicos u otros que son fraccionados bajo condiciones de oxidación /reducción con reactivos tales como el ditiotreitol; X es una fracción con tres o más sitios de unión; L es un marcador; Y se selecciona de entre el grupo formado por oxígeno, NH, NR, en el que R es metilo, o un grupo alquilo cíclico o de cadena ramificada o no, formado por 1 a 12 átomos de carbono, alquilo sustituído, fenilo, arilo, y arilo sustituído y azufre; y P1 es un grupo protector capaz de fragmentarse con ácido y que se selecciona de entre el grupo formado por DMT, MMT, tritilo, tritilo sustituído, pixilo o trialquilsililo. b) hacer reaccionar con ácido el soporte sólido marcado para eliminar el grupo protector capaz de fragmentarse con ácido, P1, seleccionado de entre el grupo formado por DMT, MMT, tritilo, tritilo sustituído, pixilo o trialquilsililo; y c) añadir un nucleósido protegido en el extremo 3'' y con fosforamidita en el extremo 5'', y un activador, formando de este modo un enlace entre Y y el extremo 5'' del nucleósido.
Description
Síntesis de oligonucleótidos marcados sobre
soportes sólidos.
La invención se refiere generalmente al campo de
la química de los ácidos nucleicos y, particularmente, a
procedimientos y composiciones para marcar oligonucleótidos sobre
soportes sólidos. Los reactivos de marcado incluyen fracciones que
estabilizan la hibridación, colorantes fluorescentes, extintores de
señal fluorescente, conjuntos de colorantes de transferencia de
energía, colorantes quimioluminiscentes, metaloporfirinas,
aminoácidos, proteínas, péptidos, enzimas, y ligandos de
afinidad.
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containing polynucleotides", patente U.S. Nº 5.552.471, publicada
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Los oligonucleótidos no marcados isotópicamente
constituyen componentes esenciales en muchas aplicaciones
importantes de la biología molecular, tales como la amplificación
PCR, secuenciación del ADN, control traduccional y transcripcional
antisentido de la expresión génica, análisis genético, y ensayos (o
pruebas) diagnósticos-as basados en sondas del ADN
(Keller, 1993; Kricka, 1992). La detección de la fluorescencia de
los oligonucleótidos marcados con colorantes fluorescentes es la
base para los ensayos de detección de la secuencia de los ácidos
nucleicos tal como el Taqman^{TM} (Livak, 1996), el Molecular
Beacons (Tyagi, 1996), la elaboración de mapas de enlace genético
(Dib, 1996), y el ensayo de unión de oligonucleótidos (Grossman,
1994).
Se han establecido dos procedimientos generales
para el marcado de los oligonucleótidos sintéticos. En un primer
procedimiento, al que se hace referencia en la presente memoria
como el "procedimiento de marcado en solución de dos fases",
un grupo funcional nucleofílico, por ejemplo, una amina alifática
primaria, se introduce en un sitio de unión del marcaje en un
oligonucleótido, por ejemplo, en un extremo 5'. Después de que la
síntesis en soporte sólido, automatizada, se ha completado, el
oligonucleótido se libera del soporte y todos los grupos
protectores se eliminan. El oligonucleótido nucleofílico se hace
reaccionar con un exceso de un reactivo marcado que contiene una
fracción electrofílica, por ejemplo, isotiocianato o un éster
activado, por ejemplo N-hidroxisuccinimida (NHS),
bajo condiciones homogéneas de solución (Hermanson, 1996; Andrus,
1995).
En un segundo procedimiento alternativo, al que
se hace referencia en la presente memoria como "procedimiento de
marcado directo", se incorpora directamente un marcador al
oligonucleótido durante o previamente a la síntesis (Mullah, 1998;
Nelson, 1992). El procedimiento de marcado directo se prefiere
porque (i) no necesita una etapa reactiva después de la síntesis,
simplificando por ello la síntesis de los polinucleótidos
marcados; y (ii) evita los problemas asociados con los escasos
rendimientos de la reacción (rendimientos < 60%), que se
presentan típicamente en el procedimiento de marcado en solución de
dos fases, particularmente: (a) purificación del oligonucleótido
marcado del marcaje en exceso; (b) purificación del
oligonculeótido marcado del oligonucleótido no marcado; (c) altos
costes debidos al bajo rendimiento del producto y a los laboriosos
procedimientos analíticos y de purificación, y (d) cubierta
irreversible del grupo funcional nucleofílico durante la
síntesis.
Ciertos colorantes fluorescentes y otros
marcadores se han funcionalizado como reactivos fosforamidíticos
para el marcado del extremo 5' (Theisen, 1992). Por ejemplo, la
patente US nº 5.583.236 describe fosforamiditas marcadas con
fluoresceína. Sin embargo, dichos marcajes, por ejemplo, colorantes
de digoxigenina, rodamina y cianina, son demasiado inestables para
sobrevivir a las duras condiciones y a los reactivos empleados en
la preparación y sintesis de los oligonucleótidos, y en la
fragmentación y desprotección de éstos. Así, cada vez que dichos
marcadores se utilicen en los protocolos habituales de síntesis en
fase sólida, deben unirse utilizando el procedimiento menos
preferido del marcado en solución de dos fases.
Por tanto, es deseable proporcionar
procedimientos y reactivos para marcar los oligonucleótidos y
análogos directamente sobre un soporte sólido después de que se
hayan sintetizado, bajo condiciones que sean rápidas, económicas y
compatibles con el funcionalismo químicamente lábil.
La presente invención se refiere a nuevos
procedimientos y composiciones para la síntesis de oligonucleótidos
marcados sobre soportes sólidos.
En un primer aspecto, la invención comprende un
procedimiento para la síntesis de oligonucleótidos marcados sobre
un soporte sólido marcado que tiene la estructura:
donde S es un soporte sólido, A un engarce
fragmentable, X es una fracción con tres o más sitios de unión, L
es un marcador, Y es un nucleófilo, es decir O, NH, NR o S, y
P_{1} es un grupo protector ácido capaz de fragmentarse. El
soporte sólido marcado se hace reaccionar de forma cíclica con
reactivos para: (1) quitar P_{1} de Y, (2) unir Y con la
posición 5' de un nucleósido protegido en el extremo 3' con una
5'-fosforamidita, (3) cubrir cualquier sitio que no
haya reaccionado sobre el soporte, por ejemplo Y, si es necesario, y
(4) oxidar cualesquiera enlaces fosfitos. Las cuatro etapas se
repiten hasta que es sintetizado el oligonucleótido marcado
completo.
Después de que se ha completado la síntesis, los
grupos protectores (que se encuentran) sobre los fosfatos
internucleotídicos y las bases nucleótidas del oligonucleótido
marcado, pueden eliminarse desprotegiéndolos, mientras que el
oligonucleótido permanece sobre el soporte sólido.
Alternativamente, después de que se ha completado la síntesis, el
oligonucleótido marcado puede separarse del soporte sólido y,
entonces, desprotegerlo.
En un segundo aspecto, la invención comprende un
nucleósido unido a un soporte sólido que tiene la estructura
donde S, A, X, L e Y se definen como
anteriormente, R es un grupo protector fosfato o un sustituyente
fosfotriéster; B es una nucleobase; P_{2} es un grupo protector
del nitrógeno exocíclico; y P_{3} es un grupo protector
ácido-labil.
En un tercer aspecto, la invención comprende un
oligonucleótido unido a un soporte sólido, que tiene la
estructura
donde los sustituyentes variables se definen como
antes, y n es un entero preferentemente de entre 0 a
100.
En un cuarto aspecto, la invención comprende un
procedimiento para sintetizar un oligonucleótido marcado, haciendo
reaccionar: (i) un reactivo marcado funcional que puede
convertirse en un grupo electrofílico, por ejemplo, ácido
carboxílico, ácido sulfónico, ácido fosfónico o ácido fosfórico,
(ii) un oligonucleótido sobre un soporte sólido con un grupo
funcional nucleofílico, por ejemplo, alcohol, amina, o tiol, y
(iii) un reactivo de unión, por lo que se forma un enlace éster,
amida, tioester, sulfonamida, sulfonato, fosfonato, fosforamidato,
fosforotioato, o fosfato. El procedimiento de marcado puede
llevarse a cabo en un oligonucleótido en sitios de marcaje que
incluyen el extremo 5', el extremo 3', una base nucleótida, un
enlace internucleótido, un azucar, un (grupo) amino, un sulfuro, un
hidroxilo y un carboxilo. La reacción de marcado puede realizarse
en un oligonucleótido que comprende uno o más ADN, ARN, PNA y
unidades monoméricas análogas al ácido nucleico. Los análogos del
ácido nucleico pueden ser base nucleica, azúcar, y/o análogos
internucleótidos.
El oligonucleótido marcado puede ser sintetizado
bien en la dirección 5' a 3', o en la dirección 3' a 5'.
Fig. 1 Oligonucleótido unido al soporte marcado
en el extremo 5'.
Fig. 2 Vía sintética para los reactivos
marcadores 1 a 6 del engarce-soporte.
Fig. 3 Marcadores de colorantes fluorescentes:
FAM, TET, HEX, JOE, NED, VIC.
Fig. 4 Marcadores de colorantes fluorescentes:
dJON, dR139, JODA y el donador FAM transfector de energía.
Fig. 5 Marcadores extintores de fluorescencia:
TAMRA, ROX, DABCYL, DABSYL, NTB.
Fig. 6 Marcadores poco importantes que se unen a
ranuras: MGB1, monómero CDPI, CDPI_{3}.
Fig. 7 Acoplamiento del reactivo marcador TAMRA
con el reactivo de unión HBTU al oligonucleótido
5'-aminohexil sobre el soporte sólido.
Se aludirá ahora detalladamente a las formas de
realización preferidas de la invención, ejemplos de las cuales se
ilustran en los dibujos que se acompañan. Aunque la invención será
descrita conjuntamente con las formas de realización preferidas, se
entenderá que ellas no tienen el propósito de limitar la invención
a éstas, sino que, por el contrario, la invención tiene el
propósito de abarcar alternativas, modificaciones y equivalentes,
que pueden incluirse en ella, tal como se define por las
reivindicaciones que se añaden.
Si no se manifiesta lo contrario, los términos y
frases siguientes tal como se utilizan en la presente memoria,
tienen la intención de significar:
Los términos "ácido nucleico",
"polinucleótido" u "oligonucleótido" significan polímeros
de monómeros nucleótidos o análogos suyos, que incluyen
desoxiribonucleótidos mono o bicatenarios, ribonucleótidos, sus
formas \alpha-anoméricas y similares. El
oligonucleótido puede comprender uno o más ADN, ARN y unidades
monoméricas análogas de ácido nucleico. Los monómeros está unidos
mediante uniones internucleótidas, que incluyen enlaces
fosfodiéster o análogos fosfato suyos, e iones asociados de carga
distinta, por ejemplo, H^{+}, NH_{4}^{+}, Na^{+}. Los
oligonucleótidos poseen típicamente un tamaño del orden de entre
algunas unidades monoméricas, por ejemplo, 5-40, a
varios cientos de unidades monoméricas. Cada vez que un
oligonucleótido se representa mediante una secuencia de letras, tal
como "ATGCCTG", se entenderá que los nucleótidos están en el
orden 5' a 3' desde la izquiera a la derecha y que "A"
significa desoxiadenosina, "C" desoxicitidina,"G"
desoxiguanosina y "T" timidina, si no se afirma lo
contrario.
"Nucleósido" se refiere a un compuesto
formado por una base nucleica de purina, deazapurina o pirimidina,
por ejemplo, adenina, guanina, citosina, uracilo, timina,
deazaadenna, deazaguanosina, y similares, unidas a una pentosa en
la posición 1'. Cuando la base nucleósida es purina o
7-deazapurina, la pentosa se une a la base nucleica
en la posición 9 de la purina o deazapurina, y cuando la base
nucleica es pirimidina, la pentosa se une a la base nucleica en la
posición 1 de la pirimidina.
"Nucleótido" se refiere a un éster fosfato
de un nucleósido, por ejemplo, un éster trifosfato, en el que el
sitio más habitual de esterificación es el grupo hidroxilo unido a
la posición C-5 de la pentosa.
El término "emparejamiento de bases
Watson/Crick" se refiere a un patrón de emparejamientos
específicos de nucleótidos, y de sus análogos, que se unen juntos
mediante enlaces de hidrógeno específicos de la secuencia, por
ejemplo, A se empareja con T y U, y G, con C.
El término "análogo" se refiere a análogos
de ácidos nucleicos sintetizados a partir de unidades similares de
nucleótidos monoméricos, y que poseen algunas de las cualidades y
propiedades asociados con los ácidos nucleicos. Los análogos de
ácidos nucleicos pueden tener porciones de bases nucleicas
modificadas, porciones de azúcares modificadas, y/o enlaces
internucleótidos modificados (Englisch, 1991). Un tipo preferido de
análogos de ácido nucleico en el que las porciones del
internucleótido y del azúcar han sido reemplazadas con un polímero
de estructura 2-aminoetilglicina es el PNA (Nielsen,
1991).
"Sitio de unión" se refiere a un sitio al
que se une un engarce.
"Engarce" se refiere a uno o más átomos que
comprenden una cadena que conecta un oligonucleótido a un marcador
o a un soporte sólido.
"Quimera" tal como se utiliza en la presente
memoria, se refiere a un oligonucleótido que incluye uno o más
nucleótidos y una o más unidades análogas a nucleótidos.
"Alquilo más inferior", "alquileno más
inferior" y "alquileno más inferior sustituido" se refieren
a grupos cíclicos o de cadena ramificada o sin ramificar que están
formados por 1-12 átomos de carbono.
"Marcador" se refiere a una fracción unida
covalentemente a un nucleótido. Un tipo preferido de marcadores
proporciona una señal para la detección, por ejemplo,
fluorescencia, quimioluminiscencia y luminiscencia electroquímica
(Kricka, 1992). Otro tipo preferido de marcadores sirven para
aumentar, estabilizar, o influenciar la hibridación, por ejemplo,
grupos de intercalación, marcadores poco importantes que se unen a
ranuras y grupos funcionales de entrecruzamiento (Blackburn, 1996).
Los marcadores de detección incluyen, pero no se limitan
acolorantes fluorescentes, tales como derivados de fluoresceína y
rodamina, colorantes de cianina (Kubista, 1997), colorantes
quimioluminiscentes (Bronstein, 1990; Bronstein, 1994) y colorantes
de transferencia de energía (Clegg, 1992; Cardullo, 1988).
Todavía, otro tipo preferido de marcadores sirve para llevar a cabo
la separación o inmovilización de una molécula mediante medios de
captura específicos o no (Andrus, 1995).
"Detección" se refiere a la detección,
observación, o medición de un oligonucleótido basándose en las
propiedades de un marcaje.
"Reactivos de acoplamiento" incluyen
cualquier reactivo, activador, o aditivo que pueda forma un enlace
éster, amida, tioester, sulfonamida, sulfonato, fosfonato,
fosforamidato, fosforotioato, o fosfato entre el oligonucleótido
nucleofílico sobre el soporte sólido y el marcador.
En un aspecto, la presente invención comprende
soportes para la síntesis de los oligonucleótidos marcados. Los
soportes marcados según este aspecto de la presente invención
tienen la estructura
donde S se refiere generalmente a un material de
soporte sólido para la síntesis del oligonucleótido, A es un
engarce fragmentable, X es una fracción con tres o más sitios de
unión, L es un marcador, Y es un nucleófilo, es decir O, NH, NR o
S, y P_{1} es un grupo protector ácido capaz de
fragmentarse.
Los soportes sólidos proporcionan un medio
insoluble para la unión secuencial de las unidades monoméricas. Una
ventaja significativa de los procedimientos heterogéneos de
síntesis es que los reactivos en exceso en la fase líquida pueden
ser fácilmente eliminados mediante filtración, eliminando por ello
la necesidad de que existan etapas de purificación entre cada
reacción o cada ciclo. Las características del soporte sólido, tales
como el tamaño del poro, contenido de enlaces transversales (o
entrecruzamiento), hinchazón, tamaño de las partículas, y área
superficial, deberán optimizarse para permitir la difusión
eficiente de los reactivos, con objeto de proporcionar una cinética
rápida y unas reacciones de alto rendimiento.
Los materiales de soporte preferidos incluyen un
alto contenido en enlaces transversales, poliestireno no hinchable
(Andrus,1993), vidrio de poro controlado (Caruthers, 1984), sílice,
gel de sílice, poliacrilamida, perlas magnéticas (Stamm, 1995),
poliacrilato, hidroxietilmetacrilato, poliamida, polietileno,
polietilenoxi, y copolímeros o injertos de ellos. La patente EP 0
786 468 describe reactivos de soporte sólido para la síntesis
directa de polinucleótidos marcados en el extremo 3'. Las
configuraciones físicas de los soportes sólidos incluyen partículas
pequeñas, perlas, membranas, fritas, superficies no porosas,
superficies resbaladizas, placas, trocitos micromaquinados (hechos
a máquina), capas de oro-alcanetiol, series
direccionales, vectores, plásmidos, o medios inmovilizadores de
polinucleótidos (Fodor, 1995).
En algunas formas de realización, puede ser
deseable crear series de regiones de síntesis separadas físicamente
sobre el soporte, por ejemplo, pocillos, regiones elevadas,
pequeñas depresiones, pernos, zanjas, bastoncillos, paredes
internas o externas de cilindros, y similares.
El engarce A capaz de fragmentarse puede
componerse de cualquier grupo funcional tal como: (i) ésteres y
otros engarces lábiles básicos que son fragmentados por reactivos
básicos, (ii) éteres silílicos que son fragmentados por nucleófilos
tales como grupos fluoruros o disulfuro y otros grupos que son
fragmentados bajo condiciones de oxidación/reducción con reactivos
tales como ditiotreitol (DTT). Los enlaces que son fragmentados en
los ejemplos anteriores de los engarces A se muestran a
continuación por las flechas:
La fracción X puede consistir en cualquier grupo
compuesto por sitios de unión para la unión del soporte sólido a
través del engarce A, un marcador L y el oligonucleótido.
Los marcadores L son cualquier grupo o fracción
unidos covalentemente al oligonucleótido. Los marcadores pueden
componerse de fracciones de
estabilización-hibridación (por ejemplo, grupos de
intercalación, marcadores poco importantes que se unen a ranuras y
agentes de entrecruzamiento), colorantes fluorescentes, extintores
de fluorescencia, conjuntos de colorantes de transferencia de
energía, colorantes quimioluminiscentes, aminoácidos, proteínas,
péptidos, enzimas y ligandos de afinidad.
Y es un grupo nucleofílico relativo al carbono,
por ejemplo, O, NH, NR y S, y une X al oligonuclótido. Y tiene un
grupo protector ácido capaz de fragmentación, P_{1}, que puede
ser DMT, MMT, tritilo, tritilo sustituído, pixilo, o
trialquilsililo. El grupo protector P_{1} es eliminado para
empezar la síntesis oligonucleótida a partir del nucleófilo Y.
Los soportes sólidos S son derivatizados con un
grupo funcional reactivo al cual se une una unidad de engarce,
A-X-Y, referentemente, el grupo
funcional reactivo es un grupo amino primario con una carga
preferible de 5-100 NH_{2} por gramo. Una unidad
de engarce, o espaciador, A-X-Y, se
une entonces covalentemente al grupo reactivo funcional del soporte
sólido. Un segundo sitio de unión sobre
A-X-Y se une a los marcadores. Un
tercer sitio de unión sobre A-X-Y
permite la síntesis de la cadena oligonucleótida. Típicamente, A
contiene un grupo éster que es capaz de fragmentarse bajo
condiciones básicas, por ejemplo, hidróxido amónico, para permitir
la separación del soporte sólido del oligonucleótido y de cualquier
marcador unido a éste. La patente EP 0 323 152 describió un
reactivo de fragmentación para la hidrólisis de grupos básicos de
unión lábil entre un soporte de fase sólida y oligonucleótidos que
comprendan un alcohol alquilo más inferior, agua, y una alquilamina
no nucleofílica obstaculizada y la Patente US 5.367.066 proporcionó
polinucleótidos modificados que contenían por lo menos un sitio
abásico o capaz de fragmentarse.
La unidad de engarce
A-X-Y puede unirse al soporte sólido
como: (i) una unidad con un marcador L o (ii) como una unidad sin
un marcador L, en la que el marcador L se une entonces al engarce X
mediante las reacciones:
La Figura 2 muestra la vía de ejemplo a un
soporte marcado (ii) en el que el engarce 1
(X-Y-P_{1}) se convierte a 2
(A-X-Y-P_{1}) y se
une al poliestireno 3 con un alto contenido en enlaces
transversales enlazado al aminometilo. El producto resultante 4 es
desprotegido al 5. Un marcador precavido, por ejemplo,
TAMRA-NHS (éster
N-hidroxisuccinimídico de la
5-carboxi tetrametilrodamina) se une covalentemente
a 5 para dar lugar al soporte marcado 6, preparado para la síntesis
oligonucleótida.
Un grupo preferido de soportes sólidos marcados
se materializa en la estructura 6 (Figura 2 y a continuación)
donde S es poliestireno con un alto contenido en
enlaces transversales o vidrio de poros
controlados,
L son marcadores poco importantes que se unen a
ranuras, cianinas, colorantes fluorescentes, o conjuntos de
colorantes de transferencia de energía, Y es oxígeno, y P_{1} es
DMT.
El carbono asimétrico en X de 6 conduce a
isómeros diastereómeros de oligonucleótidos marcados. Estos isómeros
particulares tienen la ventaja de que no se resuelven en picos
separados durante el análisis mediante HPLC o electroforesis
capilar. Otros engarces diastereoméricos para unir marcadores a
oligonucleótidos, pueden mostrar resolución diastereomérica, que se
ejemplifica mediante picos dobles en el análisis (Mullah, 1998;
Woo, 1996). En el lugar en que los oligonucleótidos marcados,
preparados a partir de 6, se utilizan en experimentos de extensión
de iniciadores, tal como en la secuenciación del ADN (Lee, 1997),
análisis de fragmentos de ADN (Grossman, 1994) y PCR (Livak,
1996), los fragmentos y los productos de amplificación muestran una
ventaja similar no separándose en poblaciones diastereoméricas,
que pueden dificultar el análisis de los datos.
Generalmente, los procedimientos y composiciones
de la presente invención utilizan el procedimiento de la síntesis
fosforamidita, que se prefiere a causa de su rápido y eficiente
acoplamiento y a la estabilidad de los monómeros nucleosídicos de
salida (Caruthers, 1983; Beaucage, 1983; Beaucage, 1992). El
procedimiento de la fosforamidita ocasiona la adición cíclica de
unidades monoméricas nucleótidas a una cadena oligonucléotida que
crece sobre un soporte sólido, muy a menudo en la dirección 3' a 5',
en la que el nucleósido terminal 3' se une al soporte sólido en el
principio de la síntesis. El procedimiento se lleva a cabo
habitualmente utilizando sintetizadores automatizados
comercialmente disponibles (PE Biosystems, Caruthers, 1984). La
forma de realización en la dirección 5' a 3' de la presente
invención añade cíclicamente un monómero nucleósido protegido en el
extremo 3' y con una fosforamidita en el extremo 5', (Wagner,
1997), que tiene la estructura 7:
donde R es un grupo protector o sustituyente, por
ejemplo cianoetilo, metilo, alquilo más inferior, alquilo
sustituído, fenilo, arilo, y el arilo sustituído; R_{1} y R_{2}
son sustituyentes amino, por ejemplo, isopropilo, morfolino,
metilo, etilo, alquilo más inferior, cicloalquilo, y arilo; P_{2}
es un grupo protector de nitrógeno exocíclico, tal como benzoilo,
isobutirilo, acetilo, fenoxiacetilo, arilosiacetilo,
dimetilformamidina, dialquilformamidina, y dialquilacetamidina; y
P_{3} es un grupo protector ácido-lábil tal como
DMT, MMT, pixilo, tritilo y
trialquilsililo.
Un oligonucléotido se sintetiza con el extremo 5'
unido al soporte sólido y un extremo 3' libre no unido (Figura
1).
A continuación se describen brevemente las etapas
de un ciclo de síntesis, en la presente invención, utilizando el
procedimiento de la fosforamidita. En primer lugar, un soporte
sólido, por ejemplo, 6, es tratado con un ácido prótico, por
ejemplo, ácido tricloroacético o ácido dicloroacético, para
eliminar un grupo protector ácido lábil, por ejemplo, DMT,
liberando un nucleófilo, por ejemplo, hidroxilo, para una reacción
de acoplamiento posterior. Se forma entonces un intermediario
activado añadiendo simultáneamente un monómero nucleósido 7
protegido en el extremo 3' con una fosforamidita en el extremo 5,'
y un ácido débil, por ejemplo, tetrazol o similar, al recipiente de
reacción en el sintetizador, es decir, en la columna de síntesis.
La adición del nucleósido se completa típicamente entre los 30 y
300 s, preferentemente alrededor de los 90 s. A continuación, puede
llevarse a cabo una etapa de cubrimiento que finaliza cualesquiera
cadenas oligonucleótidas que no experimentaron la adición
nucleósida, mediante acilación del hidroxilo en posición 3'. El
cubrimiento se realiza preferentemente con anhídrido acético y
1-metilimidazol, pero opueden utilizarse otros
agentes acilantes. El enlace internucleótido se convierte entonces
del fosfito al más estable fosfotriéster mediante oxidación,
utilizando yodo como agente de oxidación preferido y agua como
donador de oxígeno, para dar lugar a la estructura:
Alternativamente, el fosfito internucleótido
puede oxidarse a un análogo internucleótido tal como el
fosforotioato o el fosforamidato. Después de la oxidación, el
grupo protector 3' hidroxilo siguiente, por ejemplo, DMT, es
eliminado con el ácido prótico, por ejemplo, ácido tricloroacético o
ácido dicloroacético, y el ciclo se repite hasta que el
alargamiento de la cadena se completa (Figura 1).
Los marcadores pueden unirse en varios sitios de
unión a los oligonucleótidos y a los análogos de ácidos nucleicos,
incluyendo; (i) un extremo, por ejemplo los extremos 5' y/o el 3'
de las sondas (ii) un enlace internucleótido, (iii), un azúcar, o
(iv) una base nucleótida. Los marcadores se introducen más
conveniente y eficientemente en el extremo 5', el sitio de marcaje
que desestabiliza menos la hibridación e interfiere menor con las
reacciones de prolongación de los iniciadores en el extremo 3'
(Kricka, 1992; Hermanson, 1996). Un reactivo preferido del engarce
del extremo 5' es una fosforamidita amino protegida con la
estructura 8:
donde R es un grupo protector del oxígeno o
sustituyente, por
ejemplo,
cianoetilo, metilo, alquilo más inferior, alquilo
sustituído, arilo, o arilo sustituído;
y R_{1} y R_{2} son sustituyentes amino, por
ejemplo, isopropilo, morfolino, metilo, etilo, alquilo más
inferior, cicloalquilo, o arilo. El acoplamiento del reactivo
anterior con un grupo 5'-hidroxilo de un
oligonucleótido unido a un soporte y un activador de ácido ddébil,
por ejemplo, tetrazol, da lugar al oligonucleótido
monometoxitritil protegido (MMT). Después de la oxidación del
fosfito, el grupo MMT puede eliminarse del grupo amino con el mismo
reactivo ácido, por ejemplo, TCA o DCA, para descubrir el
nucleófilo reactivo de la amina primaria para acoplarlo con un
reactivo marcador. El engarce hexilo puede reemplazarse fácilmente
por otros engarces inertes de longitud más corta, por ejemplo,
etilo, o más larga, por ejemplo, dodecilo, incluyendo también
grupos arilo y otros grupos funcionales. Alternativamente, los
nucleófilos tioles o hidroxilos pueden introducirse en los extremos
5' o en otros sitios de un oligonucleótido unido a un soporte
sólido. Los reactivos de fosforamidita tiol protegidos preferidos
son 9 y 10:
Tales reactivos pueden acoplarse de modo similar
al grupo 5'-hidroxilo, oxidados por el fosfito, y
ser eliminados por el grupo protector tiol, para dar lugar a un
nucleófilo tiol reactivo. Los
oligonucleótidos-nucleófilos ligados al extremo
5'unidos a un soporte sólido pueden representarse como:
La reacción de marcado se lleva a cabo entre (i)
un oligonucleótido unido a un soporte sólido en el que el
oligonucleótido posee grupos funcionales reactivos, por ejemplo,
HO, HNR, H_{2}N, o HS, (ii) un marcador con un grupo funcional
CO_{2}H (carboxilo), SO_{3}H (sulfonato), RPO_{3}H
(fosfonato), u OPO_{3}H (fosfato), (iii) un reactivo de
acoplamiento, y (iv) un solvente o mezcla de solventes. Las
reacciones pueden llevarse a cabo a una temperatura entre
0-100ºC y preferentemente a una temperatura ambiente de alrededor de 20ºC.
0-100ºC y preferentemente a una temperatura ambiente de alrededor de 20ºC.
Reactivos de acoplamiento preferido incluyen HATU
(O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
hexafluorofosfato), HBTU
(O-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
hexafluorofosfato), TBTU
(2-(1H-benzotriazo-1-il)-1-1,3,3'-tetrametiluronio
hexafluorofosfato), TFFH
N,N',N'',N'''tetrametiluronio-2-fluoro-hexafluorofosfato),
BOP
(benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfoniohexafluorofosfato),
PyBOP
(benzotriazol-1-il-oxi-tris-
pirrolidino-fosfoniohexafluorofosfato), EEDQ (2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidro-quinolina), DCC (diciclohexil-
carbodiimida); DIPCDI (diisopropilcarbodiimida), HOBt(1-hidroxibenzotriazol), N-hidroxisuccinimida, MSNT (1-
(mesitilen-2-uslfonil)-3-nitro-1H-1,2,4-triazol, y arilsulfonilhaluros, por ejemplo, cloruro de triisopropilbencenosulfonilo.
pirrolidino-fosfoniohexafluorofosfato), EEDQ (2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidro-quinolina), DCC (diciclohexil-
carbodiimida); DIPCDI (diisopropilcarbodiimida), HOBt(1-hidroxibenzotriazol), N-hidroxisuccinimida, MSNT (1-
(mesitilen-2-uslfonil)-3-nitro-1H-1,2,4-triazol, y arilsulfonilhaluros, por ejemplo, cloruro de triisopropilbencenosulfonilo.
La activación previa o separada
(pre-activación) de un grupo funcional marcado no
es necesaria por tanto para la práctica de la presente invención.
Por ejemplo, la presente invención no necesita una conversión
previa de un grupo carboxilo a un éster NHS para la reacción con
un oligonucleótido-nucleofílico (Fig 7).
Un marcador L puede ser cualquier fracción unida
covalentemente a un oligonucleótido o análogo de ácido
\hbox{nucleico}.
Un tipo preferido de marcadores son los de
detección, que pueden proporcionar una señal para la detección del
oligonucleótido marcado mediante fluorescencia, quimioluminiscencia
y luminiscencia electroquímica (Kricka, 1992). Los colorantes
flurescentes útiles para marcar oligonucleótidos incluyen
fluoresceínas (Menchen, 1993), rodaminas (Bergot, 1994), cianinas
(Kubista,1997) y complejos metalo porfirínicos (Stanton,1988).
Ejemplos de colorantes de fluoresceína incluyen
6-carboxifluoresceína (6-FAM),
2',4',1,4,-tetraclorofluoresceína (TET), 2',4',5',7',1,
4-hexaclorofluoresceína (HEX),
2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxirodamina
(JOE),
2'-cloro-5'-fluoro-7',8'-fenil-1,4-dicloro-6-carboxifluoresceína
fundida (NED),
2'-cloro-7'-fenil-1,4-dicloro-6-carboxifluoresceína
(VIC) y (JODA) (Figuras 3 y 4). El 5-carboxilo, y
otros regio-isómeros, pueden también tener
propiedades de detección útiles. Los colorantes de fluoresceína y
rodamina con sustituyentes 1,4-dicloro son
especialmente preferidos.
Otro tipo preferido de marcadores incluyen las
fracciones extintoras. Los espectros de emisión de una fracción
extintora se solapan con un colorante fluorescente intermolecular
o intramolecular próximo, de forma que la fluorescencia del
colorante fluorescente disminuye sustancialmente, o se extingue,
mediante la transferencia de energía fluorescente de resonancia
(FRET). Los oligonucleótidos que están marcados intramolecularmente
con, tanto el colorante fluorescente como con la fracción
extintora, son útiles en los ensayos de hibridación de ácidos
nucleicos, por ejemplo, el ensayo PCR de fragmentación
exonucleásica "Taqman^{TM}" (Livak, 1998; Livak, 1996).
Los extintores particularmente preferidos
incluyen pero no se limitan a (i) colorantes de rodamina,
seleccionados a partir del grupo formado por
tetrametil-6-carboxirodamina
(TAMRA),
tetrapropano-6-carboxirodamina
(ROX), y (ii) DABSYL, DABCYL, colorantes de cianina incluyendo los
compuestos azul de nitrotiazol (NTB), antraquinona, verde
malaquita, nitrotiazol, nitroimidazol y análogos (Figura 5).
Los derivados de la fluoresceína (izquierda) y
rodamina (derecha) de la presente invención pueden exhibir la
estructura general y el sistema de numeración que se muestra a
continuación, en la que X es un engarce, y puede ser sustituído en
una o más de las posiciones numeradas.
Los marcadores cianínicos tienen la
estructura:
Donde R_{1} o R_{2} es H, alquilo más
inferior, alquileno más inferior, alquileno más inferior
sustituido, fenilo, o arilo; Z es CR_{1}R_{2}, S, O, NH, o
N-R_{1}; R_{3} es nitro, halo, sulfonato,
hidroxilo, amino, alquilo más inferior, o trihalometilo, y n =
0-2 (Kubista, 1997). El sitio X de unión para el
marcado de los oligonucleótidos puede estar en R_{1}, R_{2} o
R_{3}.
Los colorantes de transferencia de energía
constituyen un tipo preferido de marcadores oligonucleótidos. Un
colorante marcador de transferencia de energía incluye un
colorante donador unido a un colorante aceptor (Lee, 1998). Luz,
por ejemplo, procedente de un laser, a una primera longitud de
onda, es sbsorbida por un colorante donador, por ejemplo, FAM. El
colorante donador emite energía excitatoria que es absorbida por el
colorante aceptor. El colorante aceptor emite fluorescencia a una
segunda longitud de onda, con un máximo de emisión de alrededor de
100 nm, superior al máximo de absorbancia del colorante
donador.
Las fracciones del colorante aceptor y donador de
un marcador de transferencia de energía pueden unirse mediante un
engarce, tal como
que une las posiciones 4' o 5' del colorante
donador, por ejemplo, FAM, y un grupo 5 - o
6-carboxilo del colorante
aceptor.
Los complejos metal porfirínicos constituyen
también un tipo preferido de marcadores oligonucleóidos (Stanton,
1988). Un ejemplo es el tetrasulfonato ftalocianínico de aluminio,
estructura que se muestra a continuación:
Otro tipo preferido de marcadores comprende
compuestos quimioluminiscentes. Son particularmente preferidas las
fracciones quimioluminiscentes de 1,2-dioxetano
(Bronstein, 1994; Bronstein, 1990), que tienen la estructura
Donde R_{1} es hidrógeno o halógeno; R_{2} es
fosfato, galactósido, flucósido, glucurónido, trialquilsililoxilo,
aciloxilo, o hidrógeno; R_{3} es metilo, etilo, y alquilo más
inferior, y X es un engarce a un oligonucleótido. Los ligandos de
afinidad incluyen biotina, 2,4-dinitrofenilo,
digoxigenina, colesterol, polietilenoxi, y péptidos.
Otro tipo preferido de marcadores, a los que en
la presente memoria se hace referencia como fracciones
estabilizantes de la hibridación, incluyen pero no se limitaan
intercaladores, marcadores de menor importancia que se unen a
ranuras, policationes, tales como poli-lisina y
espermina, y grupos funcionales de entrecruzamiento. Las
fracciones de estabilización de la hibridación pueden aumentar la
estabilidad del emparejamiento de las bases, es decir, la afinidad,
o de la tasa de hibridación, ejemplificada por las altas
temperaturas de fusión térmica, T_{m}, del dúplex. Las fracciones
de estabilización de la hibridación sirven para aumentar la
especificidad del emparejamiento, ejemplificado por grandes
diferencias en la T_{m} entre secuencias diana y secuencias de
oligonucleótidos perfectamente complementarias y en las que el
dúplex resultante contiene uno o más malos emparejamientos del de
las bases de Watson-Crick (Blackburn, 1996). Los
marcadores de menor importancia preferidos que se unen a ranuras
incluyen Hoechst 33258, CDPI_{1-3}, MGB1,
netropsina, y distamicina (Figura 6). Un ejemplo de un marcador de
menor importancia que se une a ranutas es CDPI_{3} (Kutyavin,
1996; Lukhtanov, 1995) que tienen la estructura:
donde X es un engarce o sitio de unión para el
marcado de los oligonucleótidos. Cuando se marcan en los
oligonucleótidos, los marcaodres de menor importancia ue se unen a
ranuras pueden aumentar la afinidad y especificidad de la
hibridación para algunas o sustancialmente la mayoría de las
secuencias diana (Blackburn, 1996, pág
337-46).
Los oligonucleótidos pueden contener varios
análogos de ácidos nucleicos que portan modificaciones en las bases
nucleicas, azúcares y/o en las fracciones internucleótidas.
Las modificaciones preferidas de análogos de
bases nucleótidas incluyen pero no se limitan a
C-5-alquil
pirimidinas, 2-tiopirimidina,
2,6-diaminopurina,
C-5-propin pirimidina, fenoxazina
(Flanagan, 1999), 7-deazapurina, isocitidina,
pseudo-isocitidina, isoguanosina,
4(3H)-pirimidona, hipoxantina,
8-osopurinas y bases universales (Meyer, 1994).
Las modificaciones preferidas de análogos de
azúcares en uno o más de los nucleósidos incluyen pero no se limitan
a modificaciones 2' o 3', en las que la posición 2' o 3' pueden ser
hidrógeno, hidroxilo, metoxilo, etoxilo, alliloxilo, isopropoxilo,
butoxilo, isobutoxilo, metoxietilo, alcoxilo, fenoxilo, azido,
amino, alquilamino, fluoro, cloro y bromo.
Otras modificaciones preferidas de análogos de
azúcares incluyen nucleótidos
4'-\alpha-anoméricos, nucleótidos
1'-\alpha-anoméricos,
ribonucleótidos-grupo ramificado en 2' y
ribonucleótidos - grupo
ramificado-O-2'. La estructura que
sigue a continuación ilustra diversas modificaciones preferidas de
azúcares en 2'.
Los análogos internucleótidos preferidos entre
uno o más nmucleótidos incluyen pero no se limitan a: (i)
sustitución del oxígeno en el enlace internucleótido por azufre,
carbono o nitrógeno, y (ii) enlaces sulfato, carboxilato y
fosfodiéster amida internucleótido. Otros análogos internucleótidos
preferidos incluyen: 2-aminoetilglicina (PNA),
enlace 2'-5', enlace
3'-3'invertido, enlace invertido
5'-5' invertido, fosforotioato, fosforoditioato,
metil fosfonato, fosforamidato sustituído por N no unido,
estructura ramificada fosfotriester alquilada, y
3'N-fosforamidato.
Un análogo especialmente preferido de la presente
invención es el oligómero ácido nucleico-péptido,
PNA, en el cual la estructura natural
fosfodiéster-desoxiribosa se ha reemplazado por la
N-(-2-aminoetil)-glicina, una
unidad de tipo peptídico (Nielsen, 1991). Los oligómeros de PNA son
capaces de emparejar las bases con secuencias complementarias en
la parte específica que abraza la sonda mediante el emparejamiento
de bases de Watson/Crick. Las quimeras PNA y PNA/ADN pueden
sintetizarese utilizando procedimientos convencionales en
sintetizadores automatizados comercialmente disponibles, con
reactivos comercialmente disponibles (Dueholm, 1994; Vinayak, 1997;
Van der Laan, 1997).
Después de la síntesis, el oligonucleótido puede
dejarse en el soporte sólido, o puede eliminarse o separarse de
éste mediante una reacción de fragmentación. Es deseable dejar al
aoligonucleótido en el soporte sólido, porque algunos ensayos de
hibridación de ácidos nucleicos utilizan oligonucleótidos unidos
covalentemente a un soporte sólido, en configuraciones tales como
superficies no porosas, formaciones superficiales planares,
partículas encapsuladas o encerradas, o partículas sueltas
suspendidas en medio acuoso.
Los oligonucleótidos pueden fragmentarse a partir
del soporte, utilizando una base, por ejemplo, hidróxido amónico,
tert-butil amina, metilamina, etilamina, carbonato
potásico, o hidróxido sódico. Una solución preferida para la
fragmentación y desprotección es una mezcla de
metano:tert-butilamina: agua (1:1:2, v:v:v) (Woo, 1993). La
solución de fragmentación elimina también los grupos protectores
de fosfato, por ejemplo, cianoetilo, y grupos protectores sobre las
aminas exocíclicas de las bases nucleicas después de calentar la
solución que contiene el oligonucleótido a una temperatura elevada,
por ejemplo, 55-85ºC durante un tiempo de 1 a 16
horas.
Otro procedimiento de fragmentación preferido es
la fragmentación reductora u oxidativa de un engarce disulfuro A,
en donde A es
-(CH_{2})_{n}
-S-S-(CH_{2})_{n}-
donde n es de 1 a 12. Un reactivo preferido de la
fragmentación es el ditiotreitol
(DTT).
Otro procedimiento de fragmentación preferido es
la fragmentación mediante el ión fluoruro de un engarce A éter
sililo donde A es
y donde R es un radical alquilo más bajo de 1 a
20 átomos de carbono. Los reactivos preferidos de fragmentación
incluyen el fluoruro tetrabutil amonio y el fluoruro de
hidrógeno/trietilamina.
La invención se aclarará considerando los
ejemplos siguientes, que tienen la intención de ejemplificar
puramente la presente invención y no limitar de ninguna manera su
alcance.
Se añadió una solución de anhídrido diglicólico
(64 mg, 0,55 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (5 ml) a una mezcla de
Et_{3}N (67 mg, 0,66 mmol),
4-dimetilaminopiridina (34 mg, 0,28 mmol) y el
compuesto 1 (400 mg, 0,55 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (15 ml)
a 0ºC bajo atmósfera de argón (Figura 2). Después de que se
completó la adición (10 minutos), el baño de hielo se quitó y la
mezcla reactiva se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La
mezcla reactiva se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (30 ml) y se lavó
con ácido cítrico acuoso al 5% (1 x 50 ml) y salmuera saturada (2
x 50 ml). La capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para
dar espuma. El producto se purificó mediante cromatogravía en
columna sobre gel de sílice, llevándose a cabo la elución con un
gradiente CHCl_{3} -EtOH (del 2-10% de EtOH).
Fracciones apropiadas se combinaron y se evaporaron para dar lugar
al compuesto 2 como una espuma sin color (260 mg, 56%).
^{1}H RMN (CDCl_{3})d: 1,20 (m, 2H), 1,39 (m, 2H), 1,58
(m, 2H), 2,18 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,90-3,25 (m,
4H), 3,80 (s, 6H), 3,86 (s, 4H), 4,00-4,40 (m, 6H),
4,85 (t no resuelto, 1H), 5,92 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,75 (d, J =
8,1 Hz, 4H), 7,20-7,40 (m, 13H), 7,52 (d, J = 7,2
Hz, 2H), 7,69 (d, J = 7,2 Hz, 2H).
Poliestireno altamente entrecruzado 3
(1000\ring{A}, cargado con 10 \mumol/g de amina, 1 g, 10
\mumol), se trató con el compuesto 2 (17 mg, 20 \mumol),
HOBt (3 mg, 20 \mumol), HBTU (8 mg, 20 \mumol) y
diisopropiletilamina (8 mg, 60 \mumol) en DMF (10 ml) en un
agitador accionado por la muñeca durante 4 horas a temperatura
ambiente para dar 4. El soporte se lavó con DMF (3 x 10 ml),
CH_{3}CN (2 x 10 ml) y CH_{2}Cl_{2} (1 x 10 ml), secándose
bajo alto vacío durante la noche. Una prueba de ninhidrina mostró
0,5 \mumol/g de amina que se dejaron sobre el soporte. Este
se cubrió con anhídrido acético/lutidina en THF (solución al 10%, 5
ml) y 1-metilimidazol en THF (solución al 16%, 5 mL)
durante 2 horas a temperatura ambiente. El soporte 4 se lavó
con CH_{3}CN (3 x 10 ml) y CH_{2}Cl_{2} (1 x 10 ml). El
ensayo del catión tritilo dió una carga de 9,2 \mumol/g del
compuesto 2 en el soporte de poliestireno. El soporte
4 se trató con piperidina al 20% en DMF (3 x 10 ml, 10 min
cada lavado) para eliminar el grupo protector Fmoc, para dar lugar
al soporte 5, que se lavó con DMF (3 x 10 ml), CH_{3}CN (2
x 10 ml) y CH_{2}Cl_{2} (1 x 10 ml), secándose al vacío durante
la noche. El soporte 5 (1 g, 9,2 umol)se trató con
TAMRA-NHS éster (15 mg, 28,5 \mumol) y Et_{3}N
(8,6 mg, 85 \mumol) en DMF (10 ml) a temperatura ambiente durante
36 horas en un agitador, para dar lugar al soporte 6. (L =
TAMRA). El soporte se lavó con DMD (3 x 10 ml), CH_{3}CN (2 x 10
ml) y CH_{2}Cl_{2} (1 x 10 ml), secándose bajo alto vacío
durante 24 horas. Una prueba de ninhidrina mostró menos de 0,5
\mumol/g de amina que se dejaron sobre el soporte. Este se cubrió
con anhídrido acético/lutidina en THF (solución al 10%, 5 ml) y
1-metilimidazol en THF (solución al 16%, 5 ml)
durante 1 hora y se lavó entonces con CH_{3}CN (3 x 10 ml),
CH_{2}Cl_{2} (2 x 10 ml), secándose bajo alto vacío durante 24
horas. El ensayo del catión tritilo mostró una carga final de 8,8
\mumol/g para el soporte de
poliestireno-engarce-TAMRA 6.
La síntesis del iniciador
FAM-M13-21:
5'FAM-TGTAAAACGACGGCCAGT
3'
\hskip0,5cmSEC ID nº1
se llevó a cabo en el sintetizador de ADN/ARN ABI
394 (Perkin-Elmer Co) a una escala de 0,2 \mumol
con un soporte de poliestireno 6 marcado con FAM (Figura 2,
L = 6-carboxifluoresceína FAM, S = poliestireno). El
ciclo CE estándar de 0,2 \mumol se modificó aumentando el tiempo
de acoplamiento desde 25 s a 90 s para el acoplamiento de la
totalidad de los nucleósidos 7 de 3'-DMT
fosforamidita con fosforamidita en el extremo 5' (Glen Research).
Después de que se completó la síntesis en la dirección 5' a 3', el
iniciador M13-21 se fragmentó y desprotegió en
MeOH:t-BuNH_{2}:H_{2}O (1:1:2) a 65ºC durante 3 horas.
El iniciador se analizó mediante medios convencionales, es decir,
HPLC de intercambio aniónico y se utilizó en la secuenciación del
ADN.
La síntesis del 5'TCACAGTCTGATCTCGAT 3' se llevó
a cabo en el sintetizador de ADN/ARN ABI 394
(Perkin-Elmer Co.) a escala de 0,2 \mumol con
soporte de poliestireno no marcado en la dirección 3' a 5' con los
nucleósidos de fosforamidita en el extremo 3' y DM en el extremo 5'
(A^{bz}, G^{dmf}, C^{bz}, T). El reactivo 8 de
fosforamidita engarzada al grupo amino (Glen Research) se acopló
como el monómero final, sustrayéndose los grupos tritilo con ácido
tricloroacético al 3% en CH_{2}Cl_{2}. La columna de
síntesis, portando el oligonucleótido
5'-amino-207av, se quitó del
sintetizador. Dos jeringas tipo Luer de 1 ml se montaron en cada
extremo de la columna de síntesis. Una jeringa se rellenó con 10,7
mg (25 \mumoles) de TAMRA-CO_{2}H en 500 \mul
de dimetilformamida en seco (DMF). La segunda jeringa se rellenó
con 9,25 mg (25 \mumol) de HBTU y 9 \mul (50 \mumol) de
diisopropiletilamina en 250 \mul de 1:1 DMF:CH_{3}CN. Los
agentes de acoplamiento en las jeringas atravesaron la columna
presionando secuencialmente cada émbolo. Después de mezclarlo todo
durante un minuto aproximadamente, el conjunto se dejó reposar
durante 15 minutos para que la reacción de acoplamiento tuviera
lugar. Los reactivos se condujeron a una jeringa y se desecharon.
La columna de síntesis se lavó con 5 ml 1:1, DMF:CH_{3}CN, 5 ml
CH_{3}CN, y se trataron con 1 ml de
MeOH:t-BuNH_{2}:H_{2}O (1:1:2) para liberar
TAMRA-N-207av:
5'TAMRA-N-TCACAGTCTGATCTCGAT
3'
\hskip0,5cmSEC. ID nº2
del soporte. El sobrenadante conteniendo
TAMRA-N-207av se calentó y
desprotegió a 65ºC durante 3 horas para eliminar a todos los grupos
protectores. TAMRA-N-207v se
analizó mediante HPLC inversa y espectroscopía de masa
MALDI-TOF que confirmó la pureza homogénea y la
identidad.
La síntesis del 5'TCACAGTCTGATCTCGAT 3' se llevó
a cabo en el sintetizador de ADN/ARN ABI 394
(Perkin-Elmer Co.) a escala de 0,2 \mumol con
soporte de poliestireno no marcado en la dirección 3' a 5' con los
nucleósidos de fosforamidita en el extremo 3' y DMT en el extremo
5'(A^{bz}, G^{dmf}, C^{bz}, T). El reactivo 10 de
fosforamidita engarzada al grupo tiol se acopló como monómero final,
sustrayéndose los grupos tritilo con nitrato de plata en DMF. La
columna de síntesis, portando el oligonucleótido
5'-tiol-207av, se quitó del
sintetizador. Dos jeringas tipo Luer de 1 ml se montaron en cada
extremo de la columna de síntesis. Una jeringa se rellenó con 15 mg
(25 \mumoles) de CDPI_{3}-CO_{2}H (Figura 6,
CDPI_{3}, X = OH) en 500 \mul de dimetilformamida en seco (DMF).
La segunda jeringa se rellenó con 9,25 mg (25 \mumol) de HATU y 9
\mul (50 \mumol) de diisopropiletilamina en 250 \mul de 1:1
DMF:CH_{3}CN. Los agentes de acoplamiento en las jeringas
atravesaron la columna presionando secuencialmente cada émbolo.
Después de mezclarlo todo durante un minuto aproximadamente, el
conjunto se dejó reposar durante 15 minutos para que la reacción de
acoplamiento tuviera lugar. Los reactivos se condujeron a una
jeringa y se desecharon. La columna de síntesis se lavó con 5 ml de
1:1, DMF:CH_{3}CN, 5 ml de CH_{3}CN, y se trataron con 1 ml de
MeOH:t-BuNH_{2}:H_{2}O (1:1:2) para liberar
CDPI_{3}-S-207av:
5'CDPI_{3}-S-TCACAGTCTGATCTCGAT
3'
\hskip0,5cmSEC. ID. nº3
del soporte. El sobrenadante conteniendo
CDPI_{3}-207av se calentó y desprotegió a 65ºC
durante 3 horas para eliminar a todos los grupos protectores.
CDPI_{3}-S-207av se analizó
mediante HPLC inversa para confirmar la pureza homogénea. El
análisis mediante espectroscopía de masa MALDI-TOF
confirmó la
identidad.
La síntesis del 5'ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT 3'
se llevó a cabo en el sintetizador de ADN/ARN ABI 394
(Perkin-Elmer Co.) a escala de 0,2 \mumol con
soporte de poliestireno no marcado en la dirección 3' a 5' con los
nucleósidos de fosforamidita en el extremo 3' y de DMT en el extremo
5'(A^{bz}, G^{dmf}, C^{bz}, T). El reactivo 8 de
fosforamidita engarzada al grupo AMINO (Glen Research) se acopló
como monómero final, sustrayéndose los grupos tritilo con ácido
tricloroacético al 3% en CH_{2}Cl_{2}. La columna de síntesis,
portando el oligonucleótido
5'-amino-SG1 se quitó del
sintetizador. Dos jeringas tipo Luer de 1 ml se montaron en cada
extremo de la columna de síntesis. Una jeringa se rellenó con 11 mg
(25 \mumoles) de NTB-CO_{2}H en 500 \mul de
dimetilformamida en seco (DMF). La segunda jeringa se rellenó con
9,25 mg (25 \mumol) de HBTU y 9 \mul (50 \mumol) de
diisopropiletilamina en 250 \mul de 1:1, DMF:CH_{3}CN. Los
reactivos de acoplamiento en las jeringas atravesaron la columna
presionando secuencialmente cada émbolo. Después de mezclarlo todo
durante un minuto aproximadamente, el conjunto se dejó reposar
durante 15 minutos para que la reacción de acoplamiento tuviera
lugar. Los reactivos se condujeron a una jeringa y se desecharon.
La columna de síntesis se lavó con 5 ml 1:1, DMF:CH_{3}CN, 5 ml
CH_{3}CN, y se trataron con 1 ml MeOH:t-BuNH_{2}:H_{2}O
(1:1:2) para liberar NTB-N-SG1:
5'NTB-N-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT
3'
\hskip0,5cmSEC. ID. nº4
del soporte. El sobrenadante conteniendo
NTB-SG1 se calentó y desprotegió a 65ºC durante 3
horas para eliminar todos los grupos protectores.
NTB-SG1 se analizó mediante HPLC inversa para
confirmar la pureza homogénea. La espectroscopía de masa
MALDI-TOF dió un peso molecular de 8390,27, que
confirmó la
identidad.
La síntesis del 5' ATGCCCTCCCCATGCCATCCTGCGT 3'
se llevó a cabo en el sintetizador de ADN/ARN ABI 394
(Perkin-Elmer Co.) a escala de 0,2 \mumol con
soporte de poliestireno no marcado en la dirección 3'
a 5' con los nucleósidos de 5'-DMT,
3'-fosforamidita (A^{bz}, G^{dmf}, C^{bz},
T). Se sustrajeron los grupos tritilo del grupo hidroxilo del
extremo 5' con ácido tricloroacético al 3% en CH_{2}Cl_{2}. La
columna de síntesis, portando el oligonucleótido 5'-
hidroxi-SG1, se quitó del sintetizador. Dos
jeringas tipo Luer de 1 ml se montaron en cada extremo de
la columna de síntesis. Una jeringa se rellenó con 12 mg (25
\mumoles) de NTB-fosfato en 500 \mul de DMF.
La segunda jeringa se rellenó con 7,5 mg (25 \mumol) de MSNT y 9
\mul (50 \mumol) de diisopropiletilamina en 250 \mul de DMF.
Los agentes de acoplamiento en las jeringas atravesaron la columna
presionando secuencialmente cada émbolo. Después de mezclarlo todo
durante un minuto aproximadamente, el conjunto se dejó reposar
durante 60 minutos para que la reacción de acoplamiento tuviera
lugar. Los reactivos se condujeron a una jeringa y se desecharon.
La columna de síntesis se lavó con 5 ml 1:1, DMF:CH_{3}CN, 5 ml
CH_{3}CN, y se trataron con 1 ml
MeOH:t-BuNH_{2}:H_{2}O (1:1:2) para fragmentar
NTB-P-SG1:
5'NTB-P-
ATGCCCTCCCCATGCCATCCTGCGT 3'
\hskip0,5cmSEC. ID. nº5
del soporte. El sobrenadante conteniendo
NTB-P-SG1 se calentó y desprotegió
a 65ºC durante 3 horas para eliminar todos los grupos protectores.
NTB-P-SG1 se analizó mediante HPLC
inversa y espectroscopía de masa MALDI-TOF que
confirmó la pureza homogénea y la
identidad.
La síntesis automatizada de PNA y de las quimeras
PNA/ADN se llevó a cabo utilizando un sintetizador de ADN/ARN modelo
ABI 394 o un sintetizador peptídico 433A
(Perkin-Elmer Co), según los procedimientos
generales descritos en el Manual del Usuario del fabricante del
sintetizador, así como Egholm, 1993.
EL PNA se sintetizó a una escala de
2-5 \mumoles sobre un soporte muy cargado de
poliestireno con un engarce de MBHA (metilbenzidrilamina), y con
técnicas estándar de síntesis y grupos protectores aminos primarios
(MMT, Fmoc o Boc) y de bases nucleótidas (A^{bz}, G^{bz},
C^{ibu}, T), esencialmente tal como se informó previamente
(Dueholm, 1994). Se utilizó un recipiente reactivo de 3 ml a una
escala de 5 \mumol con un volumen total de reacción de 440
\mul.
El PNA se preparó con una lisina
carboxi-terminal sobre el soporte sólido de MBHA,
realizando una precarga con
t-Boc-lys(Fmoc). El PNA con
amidas carboxi- terminales se sintetizó bien directamente sobre un
soporte MBHA o sobre un soporte de MBHA precargado con el
monómero t-Boc T PNA. Todas las resinas se
cargaron hasta 0,1 a 0,25 mmol/g. Un ácido acético
O,2-(2-aminoetoxi) espaciador puede acoplarse como
el sinton protegido por Fmoc-amino. Una o más
unidades espaciadoras O actuan como una región bisagra flexible con
bases que no se emparejan, en las secuencias de PNA.
El soporte utilizado para la síntesis de la
quimera PNA/ADN es una perla de poliestireno no hinchable provista
con un alto entrecruzamiento, con un engarce de ácido
hidroximetilbenzoico (Vinayak, 1997). Los monómeros de PNA para la
síntesis de la quimera utilizan el grupo MMT para la protección
amino primaria. Al principio, el monómero, HATU y DIPEA, cada uno
disuelto en DMF/CH_{3}CN, 1/1, son suministrados a la vez al
cartucho reactivo. A los 16 minutos, se suministran los reactivos
de recubrimiento. Para minimizar la tendencia de la función amino
primaria del PNA a migrar o ciclizarse, el extremo amino es
acetilado después de eliminación del grupo MMT final. Se ha descrito
reactivos que unen las fracciones de PNA, y otros procedimientos
para la síntesis quimérica, fragmentación, desprotección, y
purificación (Van der Laan, 1997). En este planteamiento, la
quimera puede llevarse a cabo continuamente en un único cartucho y
en un único sintetizador.
El oligómero PNA
H_{2}N-TCCTCCTT (1 \mumol) en soporte sólido fue
sintetizado mediante los procedimientos anteriores. El PNA sobre el
soporte de poliestireno se hizo reaccionar con una mezcla de
MGB1-CO_{2}H (5 mg, 10 \mumol, Figura 6, Gong,
1997), HATU (10 \mumol), 5 \mul DIEA y 100 \mul de DMF,
dejándole reposar durante 1 hora a temperatura ambiente. El soporte
se lavó entonces con DMF y CH_{2}Cl_{2}, se fragmentó con TFMSA
(ácido trifluorometanosulfónico) a temperatura ambiente durante 1
hora, y se precipitó en éter para dar MGB1-PNA:
MGB1-TCCTCCTT
\hskip0,5cmSEC. ID. nº6
MGB1-PNA se analizó mediante HPLC
de fase inversa y espectroscopía de masas MALDI-TOF
que confirmaron la pureza homogénea y la
identidad.
Mediante los mismos procedimientos y reactivos
que en el Ejemplo 9, CDPI_{3} se unió a PNA
H2N-TCCTCCTT mediante tres acoplamientos
consecutivos de Fmoc-CDPI (Figura 6, Lukhtanov,
1995) para dar lugar a PNA marcado con CDPI_{3}. La unidad
monomérica CDPI,
1,2-dihidro-(3H)-pirrolo[3,2-e]indol-7-carboxilato,
protegida con Fmoc (5 mg, 0,012 mmol), se disolvió en 100 \mul
de NMP y se activó mediante 0,95 equivalentes HATU (0,2 M en DMF) y
2 equivalentes DIEA (0,4 m en DMF). Después de una hora a
temperatura ambiente, la solución Fmoc-CDPI activada
se añadió al PNA unido al soporte y se dejó que se acoplara durante
otra hora a temperatura ambiente. El soporte se lavó después del
acoplamiento con 20 ml de DMF. El Fmoc se eliminó mediante
tratamiento del soporte de resina con 1:4 piperidina:DMF durante 10
minutos a temperatura ambiente. Este acoplamiento y dciclo de
desprotección se repitió dos veces más durante un total de de 3
acoplamientos manuales. El soporte se lavó entonces con DMF y
CH_{2}Cl_{2}, seguido por fragmentación con TFMSA (ácido
trifluorometanosulfónico) a temperatura ambiente durante 1 hora,
seguido por precipitación etérica del CDPI_{3}-PNA
en bruto:
CDPI_{3}-TCCTCCTT
\hskip0,5cmSEC. ID. nº7
CDPI_{3}-PNA se analizó
mediante HPLC de fase inversa y espectroscopía de masas
MALDI-TOF que confirmaron la pureza homogéna y la
identidad.
El oligonucleótido
5'FAM-CCTGCAGGCCCGTGCCCGT 3' se sintetizó en el
sintetizador de ADN/ARN ABI 394 a escala de 0,2 \mumol con soporte
de poliestireno 6 marcado con FAM (Figura 2, L =
6-carboxifluoresceína FAM, S = poliestireno). El
ciclo 0,2 \mumol CE estándar se modifica aumentando el tiempo de
acoplamiento desde 25 s a 90 s para acoplar la totalidad de los
nucleósidos 3'-DMT fosforamidita,
5'-fosforamidita (Glen Research). Después de la
síntesis en la dirección 5' a 3' se completara, el reactivo 8
de fosforamidita engarzada al grupo amino (Glen Research) se acopló
como monómero final en el extremo 3', sustrayéndose los grupos
tritilo con ácido tricloroacético al 3% en CH_{2}Cl_{2}. La
columna de síntesis, portando el oligonucleótido
3'-amino, 5'-FAM sobre el soporte
sólido, se quitó del sintetizador. Dos jeringas tipo Luer de 1 ml se
montaron en cada eextremo de la columna de síntesis. Una jeringa se
rellenó con 10,7 mg (25 \mumoles) de
TAMRA-CO_{2}H en 500 \mul de
dimetilformamida en seco (DMF). La segunda jeringa se rellenó
con 9,25 mg (25 \mumol) de HBTU y 9 \mul (50 \mumol) de
diisopropiletilamina en 250 \mul de 1:1 DMF:CH_{3}CN. Los
agentes de acoplamiento en las jeringas atravesaron la columna
presionando secuencialmente cada émbolo. Después de mezclarlo todo
durante un minuto aproximadamente, el conjunto se dejó reposar
durante 15 minutos aprox. para que la reacción de acoplamiento
tuviera lugar. Los reactivos se condujeron a una jeringa y se
desecharon. La columna de síntesis se lavó con 5 ml 1:1,
DMF:CH_{3}CN, 5 ml CH_{3}CN, y se trataron con 1 ml de
MeOH:t-BuNH_{2}:H_{2}O (1:1:2) para fdesprender la sonda
de auto extinción Taqman
5'-FAM,3'-N-TAMRA:
5'FAM-CCTGCAGGCCCGTGCCCGT-N-TAMRA
3'
\hskip0,5cmSEC. ID. nº8
el soporte. El sobrenadante conteniendo la sonda
se calentó y se desprotegió a 65ºC durante 3 horas para eliminar a
todos los grupos protectores. La sonda se analizó mediante HPLC
inversa y espectroscopia de masa MALDI-TOF que
confirmó la pureza homogénea y la
identidad.
Aunque sólo se han descrito anteriormente en
detalle algunas formas de realización, los expertos en la materia
en las disciplinas de biología molecular y química entenderán
claramente que son posibles muchas modificaciones en las formas de
realización preferidas, sin apartarse de sus enseñanzas. Se pretende
que la totalidad de tales modificaciones estén cubiertas por las
reivindicaciones siguientes.
Claims (33)
1. Procedimiento para la síntesis 5' a 3' de
oligonucleótidos marcados en el extremo 5', que comprende las
etapas siguientes:
a) proporcionar un soporte sólido marcado que
tiene la estructura:
en la
que
S es un soporte sólido;
A es un engarce fragmentable, seleccionado de
entre el grupo constituido por ésteres y otros engarces lábiles
básicos, éteres silílicos, grupos silílicos u otros que son
fraccionados bajo condiciones de oxidación /reducción con reactivos
tales como el ditiotreitol;
X es una fracción con tres o más sitios de
unión;
L es un marcador;
Y se selecciona de entre el grupo formado por
oxígeno, NH, NR, en el que R es metilo,
o un grupo alquilo cíclico o de cadena ramificada
o no, formado por 1 a 12 átomos de carbono,
alquilo sustituído, fenilo, arilo, y arilo
sustituído y azufre; y
P_{1} es un grupo protector capaz de
fragmentarse con ácido y que se selecciona de entre el grupo
formado por DMT, MMT, tritilo, tritilo sustituído, pixilo o
trialquilsililo.
b) hacer reaccionar con ácido el soporte sólido
marcado para eliminar el grupo protector capaz de fragmentarse con
ácido, P_{1}, seleccionado de entre el grupo formado por DMT,
MMT, tritilo, tritilo sustituído, pixilo o trialquilsililo; y
c) añadir un nucleósido protegido en el extremo
3' y con fosforamidita en el extremo 5', y un activador, formando
de este modo un enlace entre Y y el extremo 5' del nucleósido.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además las etapas siguientes:
d) cubrir cualesquiera sitios que no han
reaccionado sobre el soporte sólido; y
e) añadir un reactivo oxidante.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además las etapas siguientes:
d) cubrir cualesquiera sitios que no han
reaccionado sobre el soporte sólido;
e) añadir un reactivo oxidante; y
f) repetir las etapas b) a e) hasta que el
oligonculeótido marcado esté completamente sintetizado.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, que
comprende además la etapa de desprotección del oligonucleótido
marcado.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, que
comprende además las etapas de fragmentación del oligonucleótido
marcado del soporte sólido y desprotección del oligonucleótido
marcado.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el soporte sólido S se selecciona de entre el grupo formado por
poliestireno, vidrio de poro controlado, gel de sílice, sílice,
poliacrilamida, perlas magnéticas, poliacrilato,
hidroxietilmetacrilato, poliamida, polietileno, polietilenoxi, y
copolímeros e injertos de los mismos.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la forma del soporte sólido S se selecciona de entre el grupo
formado por partículas pequeñas, perlas, membranas, fritas,
rebanadas, placas, trocitos micromaquinados (hechos a máquina),
capas de oro-alcanetiol, superficies no porosas,
series direccionales, y medios inmovilizadores de
polinucleótidos.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que A es un engarce fragmentable que se selecciona de entre el
grupo formado por:
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que X se selecciona de entre el grupo formado por:
en el que n es 1 a
12.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el marcador L se sseleccion de entre el grupo formado por
fracciones de estabilización-hibridación,
colorantes fluorescentes, extintores de fluorescencia, conjuntos de
colorantes de transferencia de energía, colorantes
quimioluminiscentes, aminoácidos, proteínas, péptidos, enzimas y
ligandos de afinidad.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que los colorantes fluorescentes y los extintores de
fluorescencia se seleccionan de entre el grupo formado por FAM,
TET, HEX, JOE, TAMRA, d-TAMRA, JODA, ROX, VIC, NED,
dJON, dR139, DABCYL, DABSYL, verde malaquieta,
4,7-dicloro-fluoresceínas,
4,7-dicloro rodaminas, NTB y cianinas.
12. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que las fracciones de estabilización-hibridación
se seleccionan de entre el grupo formado por Hoechst 33258,
CDPI_{1-3}, MGB1, netropsina y distamicina.
13. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el monómero nucleósido protegido en el extremo 3' y con una
fosforamidita en el extremo 5' presenta la estructura:
en la
que
R se selecciona de entre el grupo formado por
cianoetilo, metilo, o un grupo alquilo cíclico o de cadena
ramificada o no, formado por 1-12 áttomos de
carbono, alquilo más inferior, alquilo sustituído, fenilo, arilo, y
el arilo sustituido;
R_{1} y R_{2} se seleccionan individualmente
de entre el grupo formado por isopropilo, morfolino, metilo, etilo,
alquilo más inferior, cicloalquilo, y arilo;
P_{2} es un grupo protector de nitrógeno
exocíclico, seleccionado de entre el grupo formado por benzoilo,
isobutirilo, acetilo, fenoxiacetilo, ariloxiacetilo,
dimetilformamidina, dialquilformamidina, y dialquilacetamidina;
y
P_{3} es un grupo protector
ácido-lábil seleccionado de entre el grupo formado
por DMT, MMT, pixilo, tritilo y trialquilsililo.
14. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que el oligonucleótido comprende uno o más ADN, ARN y unidades
monoméricas de análogos de ácidos nucleicos, en el que el análogo
del ácido nucleico se selecciona de entre el grupo formado por
análogos de bases nucleótidas, análogos de azúcar, y análogos
internucleótidos.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que los análogos de las bases nucleótidas se seleccionan de
entre el grupo formado por
C-5-alquil pirimidina,
2,6-diaminopurina, 2-tiopirimidina,
C-5-propin pirimidina, fenoxazina,
7-deazapurina,isocitidina,
pseudo-isocitidina, isoguanosina, hipoxantina,
8-oxopurinas y bases universales.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que los análogos de azúcares se seleccionan de entre el grupo
formado por
2'-O-alquil-ribonucleótidos,
2'-O-metil-ribonucleótidos,
2'-O-alquil-ribonucleótidos,
2'-alil ribonucleótidos,
2'-halo-ribonucleótidos,
2'-O-metoxietil ribonucleótidos,
noméricos, grupo de ribonucleótidos ramificado en 2', grupo de
ribonucleótidos ramificado -O-2', nucleótidos
4'-\alpha-anoméricos y nucleótidos
1'-\alpha-a.
17. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que los análogos internucleótidos se seleccionan de entre el
grupo formado por 2-aminoetilglicina (PNA), enlace
2'-5', enlace 3'-3'invertido, enlace
5'-5' invertido, fosforotioato, metil fosfonato,
fosforamidato sustituido por N no unido, estructura ramificada
fosfotriester alquilada, y 3'N-fosforamidato.
18. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el soporte sólido marcado comprende un compuesto de
fórmula
en la
que
S es poliestireno o vidrio de poro controlado;
y
L es un marcador.
19. Soporte sólido, que comprende un compuesto de
fórmula
en la
que
S es un soporte sólido;
\newpage
A un engarce fragmentable, seleccionado de entre
el grupo de ésteres y otros engarces lábiles básicos, éteres
silílicos, grupos silílicos u otros que son fraccionados bajo
condiciones de oxidación /reducción con reactivos tales como
el ditiotreitol;
X es una fracción con tres o más sitios de
unión;
L es un marcador;
Y se selecciona de entre el grupo formado por O,
NH, NR, y S
R se selecciona de entre el grupo formado por
cianoetilo, metilo, o un grupo alquilo cíclico o de cadena
ramificada o no, formado por 1-12 átomos de carbono,
alquilo sustituido, fenilo, arilo, y arilo sustituido;
P_{2} es grupo protector de nitrógeno
exocíclico seleccionado de entre el grupo formado por benzoilo,
isobutirilo, acetilo, fenoxiacetilo, ariloxiacetilo,
dimetilformamidina, dialquilformamidina, y dialquilacetamidina;
y
P_{3} es un grupo protector
ácido-lábil seleccionado de entre el grupo formado
por DMT, MMT, pixilo, tritilo y trialquilsililo.
20. Soporte sólido, que comprende un compuesto de
fórmula
en la
que,
n es un entero de 0 a 100;
S es un soporte sólido;
A un engarce fragmentable, seleccionado de entre
el grupo de ésteres y otros engarces lábiles básicos, éteres
silílicos, grupos silílicos u otros que son fraccionados bajo
condiciones de oxidación /reducción con reactivos tales como el
ditiotreitol;
X es una fracción con tres o más sitios de
unión;
L es un marcador;
Y se selecciona de entre el grupo formado por O,
NH, NR, y S;
\newpage
R es cianoetilo, metilo, o un grupo alquilo
cíclico o de cadena ramificada o no, formado por
1-12 átomos de carbono, alquilo sustituido, fenilo,
arilo, y arilo sustituido;
P_{2} es grupo protector de nitrógeno
exocíclico seleccionado de entre el grupo fformado por benzoilo,
isobutirilo, acetilo, fenoxiacetilo, ariloxiacetilo,
dimetilformamidina, dialquilformamidina, y dialquilacetamidina.
21. Procedimiento para sintetizar un
oligonucleótido marcado sobre un soporte sólido, que presenta la
estructura
en la
que
S es un soporte sólido;
A un engarce fragmentable, selecciona de entre el
grupo de ésteres y otros engarces lábiles básicos, éteres
silílicos, grupos silílicos u otros que son fraccionados bajo
condiciones de oxidación /reducción con reactivos tales como el
ditiotreitol;
X es una fracción con tres o más sitios de
unión;
L es un marcador;
Y se selecciona de entre el grupo formado por
oxígeno, NH, NR, donde R es metilo o un grupo alquilo cíclico o de
cadena ramificada o no, formado por 1-12 átomos de
carbono, alquilo sustituido, fenilo, arilo, y arilo sustituido y
azufre; y
P_{1} es un grupo protector capaz de
fragmentarse con ácido y que se selecciona de entre el grupo
formado por DMT, MMT, tritilo, tritilo sustituido, pixilo o
trialquilsililo,
o sobre un suporte sólido de cadena 19 ó 20, el
cual procedimiento comprende:
la síntesis de un oligonucleótido sobre un
soporte sólido en el que el oligonucleótido incluye grupos
funcionales nucleofílicos formados por alcoholes, aminas, o tioles,
y
el acoplamiento de un reactivo marcado con grupos
funcionales formados por ácido carboxílico, ácido sulfónico, ácido
fosfónico o ácido fosfórico; al oligonucleótido, unido al soporte
sólido con un reactivo de acoplamiento;
en el que el reactivo de acoplamiento es HATU,
HBTU, TBTU, BOP, PyBOP, EEDQ, DCC, DIPCDI, HOBt, MSNT, cloruro de
triisopropilbencenosulfonilo, o un haluro aril sulfonilo:
por medio del cual se forma un enlace éster,
amida, tioéster, sulfonamida, sulfonato, fosfonato, fosforamidato,
fosforotioato, o fosfato.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que los reactivos marcadores se seleccionan de entre el grupo
formado por fracciones de
estabilización-hibridación, colorantes
fluorescentes, extintores de fluorescencia, conjuntos de colorantes
de transferencia de energía, colorantes quimioluminiscentes,
aminoácidos, proteínas, péptidos, enzimas y ligandos de
afinidad.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, en
el que los colorantes fluorescentes y los extintores de
fluorescencia se seleccionan de entre el grupo formado por FAM,
TET, HEX, JOE, TAMRA, d-TAMRA, JODA, ROX, VIC,
NED, dJON, dR139, DABCYL, DABSYL, verde malaquita,
4,7-dicloro-fluoresceínas,
4,7-dicloro rodaminas, NTB y cianinas.
24. Procedimiento según la reivindicación 22, en
el que las fracciones de estabilización-hibridación
se seleccionan de entre el grupo formado por Hoechst 33258,
CDPI_{1-3}, MGB1, netropsina, y distamicina.
25. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que los marcadores se acoplan al oligonucleótido en sitios de
marcaje formados por el extremo 5', el extremo 3', una base
nucleótida, un enlace internucleótido, un azúcar, amino, sulfuro,
hidroxilo y carboxilo.
\newpage
26. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que el soporte sólido se selecciona de entre el grupo formado
por poliestireno, vidrio de poro controlado, sílice, gel de
sílice, poliacrilamida, perlas magnéticas, poliacrilato,
hidroxietilmetacrilato, poliamida, polietileno, polietilenoxi, y
copolímeros o injertos de los mismos.
27. Procedimiento según la reivindicación 26, en
el que la forma del soporte sólido se selecciona de entre el grupo
formado por partículas pequeñas, perlas, membranas, fritas,
superficies no porosas, superficies resbaladizas, placas, trocitos
micromaquinados (hechos a máquina), capas de
oro-alcanetiol, series direccionales, o medios
inmovilizadores de polinucleótidos.
28. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que el oligonucleótido comprende uno o más ADN, ARN, PNA y
unidades monoméricas de análogos de ácidos nucleicos, en el que el
análogo del ácido nucleico se selecciona de entre el grupo formado
por análogos de bases nucleótidas, análogos de azúcares, y análogos
de internucleótidos.
29. Procedimiento según la reivindicación 28, en
el que los análogos de las bases nucleótidas se seleccionan de
entre el grupo formado por
C-5-alquil pirimidina,
2-tiopirimidina, 2,6-diaminopurina,
C-5-propin pirimidina, fenoxazina,
7-deazapurina,isocitidina,
pseudo-isocitidina, isoguanosina, hipoxantina,
8-oxopurinas y bases universales.
30. Procedimiento según la reivindicación 28, en
el que los análogos de azúcares se seleccionan de entre el grupo
formado por 2'-O-alquil
ribonucleótidos,
2'-O-metil-ribonucleótidos,
2'-O-alquil-ribonucleótidos,
2'-alil ribonucleótidos,
2'-halo-ribonucleótidos,
2'-O-metoxietil-ribonucleótidos,
grupo de ribonucleótidos ramificado en 2', grupo de
ribonucleótidos ramificado -O-2', nucleótidos
4'-\alpha-anoméricos y nucleótidos
1'-\alpha-anoméricos.
31. Procedimiento según la reivindicación 28, en
el que los análogos internucleótidos se seleccionan de entre el
grupo formado por 2-aminoetilglicina (PNA), enlace
2'-5', enlace 3'-3'invertido, enlace
5'-5' invertido, fosforotioato, metil fosfonato,
fosforamidato sustituido por N no unido, estructura ramificada
fosfotriester alquilada, y 3'N-fosforamidato.
32. Procedimiento según la reivindicación 22, en
el que la dirección de la síntesis del oligonucleótido es de 5' a
3'.
33. Procedimiento según la reivindicación 22, en
el que la dirección de la síntesis del oligonucleótido es de 3' a
5'.
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