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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung bezieht sich auf
die Verwendung von N,N-Dimethylglycin (DMG) in Kombination mit mindestens
einer Komponente, die von Perna canaliculus abgeleitet ist, zur
Herstellung eines Medikaments, welches Immunantworten moduliert,
zur Behandlung von Entzündungserkrankungen
im Menschen oder in Tieren.
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N,N-Dimethylglycin (DMG), welches
eine tertiäre
Aminosäure
ist, ist ein intermediärer
Metabolit, der in geringen Mengen in vielen Nahrungsmitteln gefunden
wird. Im Körper
wird es aus Cholin gebildet, und es wurde als Nährstoff ohne Brennwert verwendet.
Die physiologischen und potentiellen therapeutischen Wirkungen von
N,N-Dimethylglycin wurden in den letzten Jahren untersucht. Literaturstellen,
die N,N-Dimethylglycin und sein Potential betreffen, schließen die
folgenden ein: Graber et al., 1981, J. of Infectious Diseases 143:101–105 (DMG-Stimulierung
von sowohl der humoralen als auch der zellulären Immunität); Kendall und Graben, US-Patent-Nummer
4,385,068 (darin wird die DMG-Linderung der Wirkungen von übermäßiger Bestrahlung auf
das Immunsystem diskutiert); Pacific Slope Biochemical Konferenz
1980, eine Veröffentlichung
mit dem Titel "Decrease
of Lactic Acid Concentration in Blood of Animals Given N,N-Dimethylglycine"; Ausgabe März 1982
von Equine Practice, ein Artikel mit dem Titel "Effect of a Nutritional Supplement Containing
N,N-Dimethylglycine (DMG) on the Racing Standardbred" (DMG erhöhte die
Sauerstoffverwertung und verringerte dadurch die Milchsäurelevel
in Tieren unter extremem Stress); November bis Dezember 1982 Ausgabe
von Canine Practice, ein Artikel mit dem Titel "A Clinical Evaluation of N,N-Dimethylglycine
(DMG) and Diisopropylammonium Dichloroacetate (DIPA) on the Performance
of Racing Greyhounds";
Februar, 1987 Ausgabe des Let's
Live-Magazins, ein Artikel mit dem Titel "Dimethylglycine Update, New Studies
Confirm DMG Improves Health" (DMG
als immunomodulierendes Mittel); Februar, 1987 Ausgabe von Health
Consciousness, ein Artikel mit dem Titel "N,N-Dimethylglycine
and the Immune Response" (DMG
als immunomodulierendes Mittel); 1987 jährliche ASM Konferenz, eine
Veröffentlichung mit
dem Titel "The Effect
of DMG on the Immune Response of Rabbits" (DMG als immunomodulierendes Mittel);
27. Juni 1987 Ausgabe von The Blood Horse, ein Artikel mit dem Titel "DMG, Properties and
Proprieties" (in
Menschen stimulierte DMG B-Zellen, um stärkere Antikörper-Reaktionen zu erzeugen,
und DMG verstärkte
die Aktivität
von T-Zellen und Makrophagen); Kendall et al., US-Patent-Nummer 4,994,492
(Behandlung von Melanom unter Verwendung von DMG); Kendall und Lawson,
US-Patent-Nummer 5,026,728 (Behandlung von Arthritis und Entzündungen
unter Verwendung von DMG); Kendall und Lawson, US-Patent-Nummer
5,118,618 (Verwendung von DMG zur Verstärkung der Antikörperproduktion).
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Die Verwendung von Präparationen,
die aus Pema canaliculus hergestellt werden, für eine therapeutische Wirkung,
geht auf die letzten 25 Jahre seit Mitte der 70er Jahre zurück. Von
den Ernährungseigenschaften
und therapeutischen Eigenschaften von gefriergetrockneter Perna
canaliculus bei der Linderung der Symptome von Arthritis wurde in
Croft, 1979, Relief from Arthritis (Thorsons Publishing Group, Rochester,
Vermont) berichtet. Untersuchungen bei Tier- und Menschenversuchen
haben verschiedene Ergebnisse ergeben, zeigen aber alle, dass bestimmte
Komponenten in den Muscheln potentiell hilfreich waren, um mit Arthritis
im Zusammenhang stehende Entzündungen
und Schmerz zu lindern. Bestimmte dieser Studien sind die folgenden: McFarlane,
Juni 1975, New Zealand Medical Journal, Seite 569 (es werden Ergebnisse
einer Studie dargelegt, in der die Wirkungen eines Perna canaliculus-Produktes,
das "Seatone" genannt wird, auf
eine kleine Gruppe von arthritischen Individuen untersucht wurden);
Rainsford und Whitehouse, 1980, Arzneim-Forsch, Seiten 2128–2131 (eine
gefriergetrocknete gepulverte Präparation
ganzer Muschel, welche Ratten oral verabreicht worden war, zeigte eine
mäßige entzündungshemmende
Aktivität
in einem Modell induzierter rheumatoider Arthritis); Miller und
Ormrod, 1980, The New Zealand Medical Journal 92:187 (eine rohe
Fraktion von Pema canaliculus wies eine deutliche entzündungshemmende
Wirkung auf, wenn sie durch intraperitoneale Injektion an Ratten
verabreicht wurde); Couch et al., 1982, The New Zealand Medical
Journal 95:803 (eine Protein-enthaltende Fraktion von Pema canaliculus
wies eine entzündungshemmende
Wirkung auf); Caughey et al., 1983, European Journal of Rheumatology
and Inflammation 6:197 (in einer Untersuchung an Menschen, an welcher
47 Patienten mit rheumatoider Arthritis teilnahmen, wurde keine
Verbesserung bei Patienten beobachtet, denen Muschelextrakt verabreicht
wurde, verglichen mit Patienten, die den entzündungshemmenden Wirkstoff Naproxen
genommen hatten); Gibson et al., 1980, Practitioner 224:955 (93:111
(in Versuchen an Menschen für
sowohl Osteoarthritis als auch rheumatoide Arthritis wurden beträchtliche
Vorteile nach 3 Monaten mit einer Pema canaliculus-Präparation
erreicht, einschließlich
verringerten Schmerzes und Steifheit und einer Verbesserung bei
Funktionstests); Audeval und Bouchart, 1986, Gazette Medicale 93:111
(in Osteoarthritis-Versuchen an Menschen zeigten 40 % der Patienten
eine beträchtliche
Verbesserung nach der Behandlung mit einer Pema canaliculus-Präparation);
Miller et al., 1993, Agents Actions 38:139 (eine wässrige Fraktion
von Pema canaliculus inhibierte experimentell induzierte Entzündung in
Ratten); Whitehouse et al., 1997, Inflammopharmacology (ein Lipidextrakt
von Pema canaliculus zeigte eine Dosis-abhängige entzündungshemmende Aktivität).
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß dieser Erfindung wurde gefunden, dass
eine Kombination von N,N-Dimethylglycin (DMG)
und einer von Pema canaliculus abgeleiteten Komponente (hierin als
Pema canaliculus-Extrakt (PCE) bezeichnet) einen synergistischen
Effekt bei der Behandlung von Entzündungskrankheiten besitzt.
Insbesondere wurde festgestellt, dass die Kombination eine synergistische
Wirkung bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, einschließlich Lupus
erythematosus und bei der Modulierung von Immunreaktionen auf Entzündungskrankheiten
besitzt. Gemäß dieser
Erfindung wurde auch festgestellt, dass die anormalen Immunantwortprofile
in Menschen mit rheumatoider Arthritis oder Osteoarthritis vorteilhaft
durch die Verabreichung einer Kombination von DMG und PCE verändert werden
können.
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Behandlung, wie hierin verwendet,
betrifft die therapeutische Verabreichung der Verbindungen der Erfindung
zur Vorbeugung, Verbesserung oder Heilung der Krankheit.
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Entzündungserkrankungen, die gemäß dieser
Erfindung behandelt werden können,
schließen systemische
Autoimmunkrankheiten wie z.B. Lupus erythematosus, rheumatoide Arthritis
und Multiple Sklerose, und organspezifische Autoimmunkrankheiten
wie z.B. Myasthenia gravis, Grave-Krankheit, Hashimoto-Thyroiditis, Crohn'sche Krankheit, hämolytische
Autoimmunanämie,
insulinabhängiger
Diabetes mellitus, Glomerulonephritis und rheumatisches Fieber ein.
Weitere Entzündungskrankheiten, die
gemäß dieser
Erfindung behandelt werden können,
schließen
andere entzündliche
arthritische Bedingungen wie Osteoarthritis und Lichtarthritis sowie andere
entzündliche
Bedingungen wie Konjunktivitis, Dermatitis, Bronchitis, Rhinitis
etc. ein, welche durch Verletzung, Allergien, Infektionen, Mikroorganismen, Traumata
oder physikalische oder chemische Mittel verursacht werden können. Zusätzlich ist
auch die Behandlung von entzündlichen
Aspekten von Asthma als Teil dieser Erfindung umfasst.
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Ein Aspekt dieser Erfindung ist eine
Zusammensetzung umfassend eine Kombination einer DMG-Komponente
und mindestens einer PCE-Komponente. Die PCE-Komponente kann jede
therapeutisch wirksame Komponente sein, die von dem Fleisch der
Muschel oder ihren Organen, welche zur Verwendung bei der Präparation
von Nahrungsergänzungsmitteln
oder pharmazeutischen Präparationen
geeignet sind, abgeleitet ist. Die Endung umfasst die Verwendung
von ungereinigten Komponenten der Muschel, wie die ganze Muschel,
oder beliebige therapeutisch wirksame Extrakte davon. Wie es hierin
verwendet wird, ist eine therapeutisch wirksame PCE-Komponente gemäß dieser
Erfindung eine Komponente, die bei der Verringerung von Entzündung in
Tieren oder Menschen wirksam ist, oder welche in Menschen oder Tieren
immunomodulierende Wirkungen besitzt. Z.B. können mehrere Tiermodelle für Arthritis,
welche im Fachgebiet wohl bekannt sind, verwendet werden, um die
therapeutische Wirksamkeit einer PCE-Komponente zu bestimmen. Solche Modelle
schließen
z.B. Kollagen-induzierte Arthritis in Ratten oder Mäusen, Carrageenan-induziertes entzündliches Ödem in Ratten,
wie es in Miller et al., 1980, New Zealand Medical Journal, 92:667
beschrieben ist, und durch die Injektion von Hilfsmitteln, die von
getrocknetem Mycobactenum tuberculosis hergestellt sind, induzierte
Arthritis in Ratten und Mäusen,
wie es in Whitehouse et al., 1997, Inflammopharmacology 5:237-246
beschrieben ist, ein. Die therapeutische Wirksamkeit einer PCE-Komponente kann
auch bestimmt werden, indem bewertet wird, ob die PCE-Komponente
wirksam ist, um antinukleäre Antikörper, insbesondere
anti-ssDNA-Antikörper oder
anti-dsDNA-Antikörper in
Menschen mit SLE oder in dem Mausmodell für SLE zu verringern, wie es
in den Beispielen beschrieben ist. Insbesondere kann das PCE eine
Präparation
der ganzen Muschel sein, welche gefriergetrocknet und gemahlen wurde, wie
z.B. das von FoodScience Corporation, Essex Junction, Vermont erhältliche
Sea Mussel-Produkt oder das von DaVinci Laboratories, Essex Junction, Vermont
erhältliche
Pema-Produkt. Zusätzlich
können
auch therapeutisch wirksame Extrakte von Pema canaliculus verwendet
werden. Solche therapeutisch wirksamen Extrakte wurden wie folgt
beschrieben: Macrides und Kalafatis, PCT/AU95/00485, WO 96/05164
(ein aufgereinigtes Lipidextrakt); Whitehouse et al., 1997, Inflammopharmacology 5:237-246
(ein aufgereinigtes Lipidextrakt); Kosuge und Sugiyama, US-Patent-Nummer
4,801,453 (stabilisiertes Muschelextrakt); Couch et al., 1982, The New
Zealand Medical Journal 95:803 (eine Proteinfraktion); Miller et
al., 1993, Agents Actions 38:139 (eine wässrige Fraktion).
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Die DMG-Komponente kann N,N-Dimethylglycin
oder ein pharmakologisch annehmbares Salz davon sein. Eine Zusammensetzung,
die sowohl DMG als auch PCE enthält,
kann als pharmazeutischer oder diätetischer Zusatz unter Verwendung von
im Fachgebiet wohl bekannter Techniken formuliert werden. Eine bevorzugte
Formulierung der Zusammensetzung ist eine Formulierung zur oralen Verabreichung.
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Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung
ist die Verwendung einer DMG-Komponente
und mindestens einer therapeutisch wirksamen PCE-Komponente zur
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen
Krankheit, umfassend die Verabreichung einer Kombination von sowohl
einer DMG-Komponente als auch mindestens einer PCE-Komponente an
ein Tier. Wie es hierin verwendet wird, bedeutet der Ausdruck Tier
Säugetiere,
ist aber nicht darauf beschränkt.
Bevorzugte Säugetiere schließen Menschen,
Pferde, Nutztiere und Haustiere ein. Die DMG- und PCE-Komponenten
können über die gleiche Route verabreicht werden oder sie können über verschiedene
Routen verabreicht werden. Z.B. können DMG und PCE beide oral
verabreicht werden, entweder gleichzeitig oder zu verschiedenen
Zeiten. Eine bevorzugte Route für
die Verabreichung von PCE, insbesondere gemahlener ganzer Muschel,
ist über
die orale Verabreichung. Eine bevorzugte Route für die Verabreichung von DMG
ist über
die orale Verabreichung, insbesondere als Mischung mit Wasser. DMG
oder PCE können auch über eine
intramuskuläre
Injektion, intraperitoneale Injektion, parenterale Verabreichung
etc. verabreicht werden.
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Die in dieser Erfindung verwendeten
DMG und PCE können
als Mischung mit konventionellen Hilfsmitteln, d.h. pharmazeutisch
annehmbaren organischen oder anorganischen Trägersubstanzen, die für eine parenterale,
enterale (z.B. orale) Anwendung geeignet sind, welche den Wirkstoff
nicht nachteilig beeinflussen, verwendet werden. Geeignete pharmazeutisch
annehmbare Träger
schließen
Wasser, Salzlösungen,
Alkohole, Gummiarabicum, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Polyethylenglycole,
Gelatine, Kohlenhydrate wie Lactose, Amylose oder Stärke, Magnesiumstearat,
Talg, Kieselsäure,
viskoses Paraffin, Parfümöl, Fettsäuremonoglyceride
und Diglyceride, Pentaerythritylfettsäureester, Hydroxymethylcellulose,
Polyvinylpyrrolidon etc. ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die
pharmazeutischen Präparationen
können
sterilisiert werden und, wenn erwünscht, mit Hilfsmitteln wie
z.B. Gleitmitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Benetzungsmitteln,
Emulgatoren, Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, Puffern,
Farbstoffen, Geschmacksstoffen und/oder Aromasubstanzen und dergleichen,
welche den Wirkstoff nicht nachteilig beeinflussen gemischt werden.
Weitere pharmazeutisch annehmbare Träger schließen wässrige Lösungen, ungiftige Hilfsmittel,
Salze, Konservierungsmittel, Puffer und dergleichen eingeschlossen,
wie es z.B. in Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe (1990), Mack Publishing Co.,
Easton, PA, beschrieben ist, wobei die Inhalte davon hierdurch durch
Bezugnahme darauf enthalten sind. Der pH-Wert und die genaue Konzentration
der verschiedenen Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung
werden gemäß im Fachgebiet
geläufiger Routine
eingestellt. Gilman et al. (Herausgeber) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases
of Therapeutics, B. Ausgabe, Pergamon Press. Die DMG und/oder PCE
können
auch, wenn erwünscht,
mit anderen Wirkstoffen einschließlich PCE bzw. DMG kombiniert
werden.
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Die pharmazeutischen Zusammensetzungen
werden vorzugsweise in Dosiseinheiten hergestellt und können in
Dosiseinheiten verabreicht werden. Feste Dosiseinheiten sind Tabletten,
Kapseln und Zäpfchen.
Zur Behandlung eines Patienten sind abhängig von der Aktivität der Verbindung,
der Art der Verabreichung, der Natur und Schwere der Störung, dem
Alter, dem Körpergewicht
des Patienten, verschiedene tägliche
Dosen notwendig. Unter bestimmen Umständen können jedoch höhere oder niedrigere
tägliche
Dosen angemessen sein. Die mittlere tägliche Dosis der Verbindungen
dieser Erfindung, wenn sie verwendet werden, um eine Entzündungskrankheit
zu behandeln oder um die Immunantwort zu modulieren, sind typischerweise
wie folgt: für
DMG beträgt
die mittlere tägliche
Dosis im Allgemeinen ungefähr
1 bis ungefähr
500 mg/kg/Tag, vorzugsweise 10 bis ungefähr 100 mg/kg/Tag, mehr bevorzugt
ungefähr
2 bis ungefähr
30 mg/kg/Tag; für PCE,
wenn PCE gemahlene ganze Muscheln umfasst, beträgt die mittlere tägliche Dosis
im Allgemeinen ungefähr
1 bis 500 mg/kg/Tag, vorzugsweise ungefähr 10 bis ungefähr 100 mg/kg/Tag,
mehr bevorzugt ungefähr
20 bis ungefähr
60 mg/kg/Tag. Für PCE-Komponenten,
die keine gemahlene ganze Muschel sind, kann die mittlere tägliche Dosis
variieren, sie kann aber durch den Fachmann leicht bestimmt werden.
Die tägliche
Dosierung kann als Einzeldosis pro Tag oder als eine Mehrzahl von
unterteilten Dosen pro Tag verabreicht werden. Die tägliche Dosis kann
auch auf nicht-täglicher
Basis verabreicht werden, wie z.B. jeden zweiten oder dritten Tag,
vorausgesetzt, dass eine mittlere tägliche Dosis wie oben beschrieben
erreicht wird.
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Die Kombination von PCE und DMG kann gemeinsam
oder alternierend mit anderen therapeutischen Behandlungen verabreicht
werden, die normalerweise zur Behandlung entzündlicher Krankheiten verwendet
werden. Z.B. können
zur Behandlung von Lupus erythematosus, rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis
PCE und DMG zusammen mit entzündungshemmenden
Mitteln, einschließlich
Corticosteroid-Mitteln wie z.B. Prednison oder Methylprednisolon und
entzündungshemmenden
nicht-Steroiden Mitteln wie z.B. Salicylaten und Ibuprofen verabreicht werden.
Zur Behandlung von Lupus erythematosus, zum Beispiel, können die
Verbindungen dieser Erfindung auch zusammen mit Antimalaria-Wirkstoffen, einschließlich z.B.
Hydroxychlorchinon, oder zusammen mit zytotoxischen Chemotherapeutika,
einschließlich
z.B. Azathioprin und Cyclophosphamid verabreicht werden.
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Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung
ist die Verwendung einer DMG-Komponente
und mindestens einer therapeutisch wirksamen PCE-Komponente zur
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von systemischem Lupus
erythematosus, umfassend die Verabreichung einer Kombination von DMG
und PCE. In einer bevorzugten Ausführungsform verringert die Verabreichung
der Kombination die Serumkonzentration von antinukleären Antikörpern wie
z.B. antinukleären
Antikörpern,
die an Chromatin, Nukleosomen, Histon/DNA-Komplexe, Histone, doppelsträngige DNA
(dsDNA), einzelsträngige DNA
(ssDNA), doppelsträngige
RNA (dsRNA), einzelsträngige
RNA (ssRNA) und transfer-RNA (tRNA) binden. Vorzugsweise wird die
Serumkonzentration von anti-ssDNA- und/oder anti-dsDNA-Antikörpern verringert.
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Die folgenden Wirkungen auf die Immunantwort
oder jede Kombination davon werden erreicht: Eine Verringerung der
Serumlevels von Interleukin 6 (il-6), eine Verringerung der Serumlevels
von Interleukin 10 (il-10), eine Erhöhung der Serumlevels von Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) oder eine
Verringerung der Konzentration von CD8--Lymphozyten
im Blut. Diese Effekte wirken typischerweise abnormalen Immunprofilen,
die bei Entzündungskrankheiten beobachtet
werden, entgegen. Ein bevorzugter Effekt ist eine Verringerung der
Serumlevels von il-10 oder eine Erhöhung der CD8+-Lymphozyten
im Blut.
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Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung
ist ein Kit enthaltend eine Kombination von DMG- und PCE-Formulierungen,
wobei die PCE-Formulierung mindestens eine therapeutisch wirksame
PCE-Komponente umfasst. Insbesondere bevorzugt ist ein Kit enthaltend
sowohl DMG- als auch PCE-Formulierungen, die zur oralen Verabreichung
nützlich
sind, vorzugsweise als diätetische
Zusätze.
Ein Kit wird typischerweise eine mittlere tägliche Dosis von PCE oder DMG,
wie oben beschrieben, bereitstellen.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 ist
ein Diagramm, das Gewichtszunahme-Vergleiche für Kontrollmäuse und für Mäuse zeigt, die mit DMG, PCE
oder einer Kombination von DMG und PCE behandelt wurden.
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2 ist
ein Diagramm, in welchem die Cytokin-Konzentrationen, einschließlich il-4,
il-6, il-10 und TNF-α,
in Kontrollmäusen
und in mit DMG, PCE oder einer Kombination von DMG und PCE behandelten
Mäusen
verglichen werden.
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3 ist
ein Diagramm, in welchem die Lymphozytenpopulations-Levels, einschließlich Lymphozyten
mit CD4-, CD8- und CD19-Markern, in Kontrollmäusen und in Mäusen, die
mit DMG, PCE oder einer Kombination von DMG und PCE behandelt wurden,
verglichen werden.
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4 ist
ein Diagramm, in welchem die Konzentrationen von anti-Doppelstrang-DNA-Antikörpern in
Kontrollmäusen
und in Mäusen,
die mit DMG, PCE oder einer Kombination von DMG und PCE behandelt
wurden, verglichen werden. Es wurden zwei Experimente, (#1) und
(#2), durchgeführt.
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5 ist
ein Diagramm, in dem die Konzentrationen von anti-Einzelstrang-DNA-Antikörpern in Kontrollmäusen und
in Mäusen,
die mit DMG, PCE oder einer Kombination von DMG und PCE behandelt
wurden, verglichen werden.
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6 ist
ein Diagramm, in dem die Lymphozyten-Populationen in gesunden Patienten
mit Lymphozyten-Populationen in Patienten mit Osteoarthritis oder
rheumatoider Arthritis verglichen werden. Die Zellpopulationen,
die gemessen wurden, schließen die
gesamten T-Zellen (T Zellen), Helfer-T-Zellen (Th) (CD4-), zytotoxische
T-Zellen (Tc) (CD8–), B-Zellen (B) (CD19–)
und natürliche
Killerzellen (NK) ein. Innerhalb einer Subpopulation sind Säulen mit
verschiedenen Indizes (d.h. a und b) deutlich verschieden (p ≤ 0,01).
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7 ist
ein Diagramm, in dem die Cytokin-Konzentrationen in gesunden Patienten
mit Cytokin-Konzentrationen in Patienten mit Osteoarthritis oder rheumatoider
Arthritis verglichen werden. Innerhalb einer Subpopulation sind
Säulen
mit verschiedenen Indizes, (d.h. a und b) deutlich verschieden (p ≤ 0,01).
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Ohne weitere Erklärung wird es für den Fachmann
möglich
sein, die vorliegende Erfindung unter Berücksichtigung der vorangegangenen
Beschreibung in vollem Umfang anzuwenden. Die folgenden bevorzugten
spezifischen Ausführungsformen
sind daher nur zur Veranschaulichung gedacht und sollen den Rest
der Offenbarung nicht einschränken.
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BEISPIELE
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In den folgenden Beispielen sind
alle Teile und Prozentangaben Gewichtsangaben, wenn es nicht anders
angegeben ist.
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Beispiel 1
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Herstellung einer therapeutisch
wirksamen PCE-Komponente
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Eine therapeutisch wirksame Formulierung von
Pema canaliculus wird hergestellt, indem das Fleisch der Muschel
gefriergetrocknet wird und in ein Pulver gemahlen wird. Das Produkt
wird mit den Hilfsmitteln von Alfalfa, Cellulose und Magnesiumstearat
in Kapseln formuliert.
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Beispiel 2
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Behandlung von systemischem
Lupus erythematosus mit einer Kombination von DMG und PCE-Extrakt
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Systemischer Lupus erythematosus
(SLE) wird als die prototypische Autoimmunkrankheit angesehen. SLE
ist durch verschiedene Schweregrade der Krankheit gekennzeichnet,
wobei milde Formen zu einem geringen Hautausschlag und zu Gelenkschmerzen
führen
und ernste Formen zu Glomerulonephritis, Immunkomplexkrankheit,
ernster Lymphknotenvergrößerung und
multiplem Organversagen führen.
SLE ist ferner durch die Entwicklung von auto-Antikörpern gegen
zytoplasmatische und nukleäre Komponenten
gekennzeichnet. Zusätzlich
zu klinischen Symptomen ist das Vorhandensein von antinukleären Antikörpern ein
Merkmal der Krankheit und das Vorhandensein davon ist ein wichtiges
Anzeichen bei der Diagnose der Krankheit (Tan, 1989, Adv. Immunology
44:93). MRI-Ipr-Mäuse
sind ein akzeptiertes und gut dokumentiertes Modell für SLE (Cohen
und Eisenberg, 1991, Ann. Rev. Immunol. 9:203; Kotzin, 1996, Cell
85:303). Diese Mäuse
zeigen einen homozygoten genetischen Defekt in dem Fas-TNF-Rezeptor,
der mit der Apoptose im Zusammenhang steht. Das Fas-Protein ist
ein wichtiger Weg zur Induzierung von Apoptose und das Fas-Protein
ist verantwortlich für
die Lymphozyten-Entfernung. Diese Mäuse produzieren ein breites
Spektrum von auto-Antiköpern
gegen nukleäre
und zytoplasmatische Proteine, und die MRI-Ipr-Mäuse sterben an klassischen
Lupus-ähnlichen
Symptomen.
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Es wurden MRI-Ipr-Mäuse verwendet,
um die Wirkungen einer Kombination von DMG und PCE auf Komponenten
des Immunsystems und auf den Verlauf der SLE-Krankheit zu untersuchen.
40 MRI-Ipr-Mäuse
wurden in 4 Gruppen mit jeweils 10 Mäusen unterteilt: in eine Kontrollgruppe,
eine PCR-behandelte Gruppe, eine DMG-behandelte Gruppe und eine
PCE-DMG-behandelte Gruppe. Der Kontrollgruppe wurden Standard-Mäusefutter
und Wasser verabreicht. Der DMG-Gruppe wurden Standard-Mäusefutter
und Wasser, gemischt mit 34 mg/l DMG (AANGAMIK® DMG,
FoodScience Corporation, Essex Junction, Vermont) verabreicht. Der PCE-Gruppe
wurden eine PCE-Mäusefutter-Mischung
und Wasser verabreicht. Der PCE-DMG-Kombinations-Gruppe wurden eine PCE-Mäusefutter-Mischung
und DMG-Wasser verabreicht. Der PCE-Zusatz, der in den Untersuchungen
verwendet wurde, war ein Produkt, das gefriergetrocknete gemahlene
ganze Perna canaliculus-Muschel
enthielt (Pema, FoodScience Corporation, Essex Junction, Vermont).
Den Mäusen
wurden Nahrung und Wasser nach Belieben verabreicht. Es wird geschätzt, dass
die Mäuse
mit einer Größe im Bereich
von 30–50
g ungefähr
1-3 mg/Tag an DMG und
2–6 mg/Tag
an PCE verzehrten. Die Mäuse
wurden wöchentlich
gewogen und wöchentlich
wurden 100 μl
Blut über
die Orbitalader gesammelt. Das gesammelte Blut wurde zentrifugiert
und das Serum wurde gewonnen und bei –20 °C zur Analyse am Ende des 12-wöchigen Experiments
aufbewahrt. Nach 12 Wochen wurden die Mäuse getötet und die Milzen, Nieren,
Leber wurden entnommen. Als die Mäuse getötet wurden, wurde auch Blut über einen Herzstab
gesammelt. Das Serum wurde gesammelt und wie oben beschrieben aufbewahrt.
Die Milzen wurden bearbeitet und die gewonnenen Zellen wurden durch
Flusszytometrie unter Verwendung von fluoreszierenden anti-CD4,
anti-CD8 und anti-CD19-Antikörpern
quantifiziert (Pharmingen, San Diego, CA). Unter Verwendung eines
Enzym-gebundenen Immunadsorbtionsassay (ELISA) wurden die Cytokin-Levels
in dem Serum und die anti-Einzelstrang- und Doppelstang-DNA-Antikörper-Levels
in dem Serum bestimmt.
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Die Tiere, deren Nahrung mit PCE
alleine oder mit der DMG-PCE-Kombination versetzt worden war, zeigten
eine höhere
Gewichtszunahme als die Kontrolloder die DMG-behandelten Tiere,
was angibt, dass die mit der Kombination behandelten Mäuse durch
die Behandlung nicht negativ beeinträchtigt waren (1). Eine beträchtliche Verringerung der CD8-T-Zellen
wurde bei Tieren beobachtet, die mit der Standard-DMG-PCE-Kombination
gefüttert
wurden, wobei ein Trend in Richtung niedrigeren Levels in Tieren
zu beobachten war, denen nur PCR gefüttert worden war (3). Einen Trend in Richtung niedrigere
CD19+-B-Zell-Prozentanteile wurde auch bei
DMG-PCE-behandelten Tieren beobachtet, während Tiere, die mit PCE alleine
behandelt worden waren, CD19+-B-Zell-Levels
aufwiesen, die vergleichbar waren mit denen der Kontrolltiere. Bei
DMG alleine konnte keine Wirkung auf CD8+-T-Zell-
oder CD19+-B-Zell-Levels detektiert werden
(3).
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Es wurden auch die Effekte auf die
Cytokin-Produktion in Mäusen,
die mit der DMG-PCE-Kombination behandelt worden waren, untersucht.
Wie es in 2 gezeigt
ist, zeigten Tiere, die mit der DMG-PCE-Kombination behandelt worden
waren, beträchtlich
niedrigere Levels an Serum il-6, als entweder Kontrolltiere oder
Tiere, die mit DMG alleine behandelt worden waren. Obwohl Tiere, die
mit entweder DMG oder PCE alleine behandelt worden waren, beträchtlich
niedrigere Levels an il-6 als Kontrolltiere aufwiesen, zeigten Tiere,
die mit einer Kombination der beiden behandelt worden waren, noch
niedrigere Levels. DMG-PCE-behandelte Tiere zeigten auch beträchtlich
niedrigere Levels an Serum il-10 als entweder Kontrolltiere oder
Tiere, die mit entweder DMG oder PCE alleine behandelt worden waren.
Diese Veränderungen
der Cytokin-Serum-Levels
sind auch hinweisend auf eine Verschiebung einer Th2-Reaktion zu
einer Th1-Reaktion. Die beträchtliche
Erhöhung
der Serumlevels von Tumornekrosefaktor (TNF) in DMG-PCE-behandelten
Tiere ist auch hinweisend auf eine Verschiebung einer Th2-Reaktion
zu einer Th1-Reaktion.
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Die Behandlung von Tieren mit DMG
alleine führte
zu höheren
Levels an il-10 als bei Kontrollen, was auf eine Verschiebung in
Richtung einer Th2-Reaktion hinweist. Obwohl DMG ein bekannter Verstärker der
Antikörper-Produktion
ist, ist nicht bekannt, ob die beobachtete verstärkte Antikörper-Produktion eine pathologische
IgG2a-Produktion darstellt. Die Levels von Serum il-10 und TNFα waren in
Kontrolltieren und in Tieren, die mit PCE alleine behandelt worden
waren, vergleichbar. Daher schien die DMG-PCE-Behandlung die Lymphozyten-Reaktion von
einer Th2-Reaktion mit einer einhergehenden Erniedrigung einer übermäßigen Antiköperproduktion, einschließlich der
Produktion antinukleärer
Antiköper,
wie unten diskutiert, zu einer Th1-Reaktion zu verschieben.
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Es wurden auch die Levels an antinukleären Antiköpern in
Kontrollen und behandelten Mäusen untersucht.
Nach 11 Wochen der Behandlung waren antidsDNA-Antikörper-Levels
im Serum von DMG-PCE-behandelten Tieren beträchtlich niedriger als in Kontrolltieren
oder in Tieren, die mit DMG alleine oder PCE alleine behandelt worden
waren (4). Noch deutlicher
waren die anti-ssDNA-Antikörper-Levels
im Serum von DMG-PCE-behandelten Tieren im Gleichklang mit den Levels
von Kontrolltieren, bis zur 7. Woche, als diese Serumkonzentrationen
niedriger waren (5).
Dieser beträchtliche Unterschied
wurde weiter beobachtet, bis die Tiere nach der 11. Woche getötet wurden.
Die Serumlevels von anti-ssDNA-Antikörpern in Kontrolltieren und
in mit PCE alleine behandelten Tieren nahmen über den Verlauf der Behandlung
hinweg weiter zu. In der 11. Woche schienen sich die Serumlevels
in mit DMG alleine behandelten Tieren einzupendeln.
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Beispiel 3
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Vergleich von Lymphozyten-Populationen
in gesunden Patienten mit Lymphozyten-Populationen in Patienten
mit Osteoarthritis oder rheumatoider Arthritis
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sEs wurden Lymphozyten-Populationen
gemessen, und es wurden die von gesunden Patienten mit den von Patienten
verglichen, die Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis hatten
(6). Die gemessenen
Lymphozyten-Populationen
schlossen ganze T-Zellen (T-Zellen), Helfer-T-Zellen (Th) (CD4–-Zellen), zytotoxische
T-Zellen (Tc) (CD8+-Zellen), B-Zellen (B)
und natürliche Killerzellen
(NK) ein. Die Zellpopulationen wurden durch externes Anfärben der
Gesamtblutlymphozyten unter Verwendung der folgenden Antiköper identifiziert:
anti-CD3-Antikörper
für ganze
T-Zellen; anti-CD4-Antikörper
für Helfer-T-Zellen;
anti-CD8-Antikörper
für zytotoxische T;
anti-CD5- und anti-CD19-Antikörper für B-Zellen; anti-CD56-Antikörper für natürliche Killerzellen;
und anti-CD45-Antikörper
für Monozyten.
Die Antiköper wurden
entweder von Caltag Corp. oder Coulter Corp. erhalten und wurden
zur Analyse auf einem EPICs 751 Flusscytometer (Coulter F1) mit
einem Cicero Zusatzmodul und Cyclops-Analysesoftware (Cytomation,
CA) markiert. Wie es durch die Daten in 6 gezeigt wird, wurde bei beiden Krankheiten verglichen
mit gesunden Kontrollen eine CD4–/CD8–-T-Zellen-Verschiebung
beobachtet, wobei eine beträchtliche
Verringerung von CD4+-Zellen in Patienten
mit jeder Krankheit und eine Erhöhung der
CD8–-Zellen
in Patienten mit jeder der Krankheiten beobachtet wurde.
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Beispiel 4
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Vergleich von Cytokin-Konzentrationen
in gesunden Patienten mit Cytokin-Konzentrationen in Patienten mit
Osteoarthritis oder rheumatoider Arthritis
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Es wurden Cytokin-Levels gemessen,
und die von gesunden Patienten wurden mit den von Patienten mit
Osteoarthritis oder rheumatoider Arthritis verglichen (7). Die gemessenen Cytokine schlossen
Gammainterferon, Interleukin 1-beta,
Interleukin 2, Interleukin 4, Interleukin 6, Interleukin 10 und
TNF-α ein.
Die Cytokine wurden unter Verwendung spezifischer ELISA-Kits gemäß den Hersteller-Instruktionen
gemessen (Immunotech, Frankreich). Interleukin 6-Levels waren in Patienten mit jeder
der Krankheiten verglichen mit Kontroll-Patienten beträchtlich höher. Die TNF-α-Levels waren
in Patienten mit rheumatoider Arthritis verglichen mit normalen
Kontrollen beträchtlich
erhöht,
waren aber in Patienten mit Osteoarthritis nicht erhöht.
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Die vorangehenden Beispiele können mit vergleichbarem
Erfolg durch Ersetzen der allgemein oder spezifisch beschriebenen
Reaktanten und/oder Durchführungsbedingungen
dieser Erfindung gegen solche, die in den vorangehenden Beispielen
verwendet wurden, wiederholt werden.
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Es wird davon ausgegangen, dass ein
Fachmann ohne weitere Erläuterung
die vorliegende Erfindung unter Berücksichtigung der vorangegangenen
Beschreibung in ihrem vollen Umfang anwenden kann. Die vorangegangenen
bevorzugten spezifischen Ausführungsformen
sind daher nur zur Veranschaulichung angegeben und sollen die übrige der Offenbarung
auf keinste Weise einschränken.