DE60006434T2

DE60006434T2 - Mikrobielle Umwandlung von 2-Methylquinoxalin

Info

Publication number: DE60006434T2
Application number: DE60006434T
Authority: DE
Inventors: Michael Paul Groton Burns; James Joseph Groton Cawley; John Wing Groton Wong
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 2000-02-07
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2020-02-08
Also published as: IL134421A0; TWI223004B; BR0000375A; HUP0000625A2; PT1028164E; CA2298427A1; TR200000347A3; PL338405A1; ES2208221T3; HU0000625D0; CA2298427C; ID24792A; JP2000270889A; ATE254181T1; KR20000076650A; DE60006434D1; TR200000347A2; RU2213777C2; YU7100A; AU1639600A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zum Herstellen von 2-Chinoxalincarbonsäure und betrifft insbesondere die mikrobielle Oxidation von 2-Methylchinoxalin zu 2-Chinoxalincarbonsäure.
Hintergrund der Erfindung
Verfahren für die mikrobielle Oxidation von bestimmten aromatischen Heterocyclen und insbesondere für die mikrobielle Oxidation von Methylgruppen an bestimmten aromatischen Heterocyclen sind auf dem Fachgebiet bekannt, wie beispielsweise jene, die in den nachstehenden zwei Artikeln beschrieben werden: „Gene Order of the TOL Catabolic Plasmid Upper Pathway. Operon and Oxidation of Both Toluene and Benzyl Alcohol by the xylA Product," von S.Harayama et al., J.Bacteriol., 167(2): 455–461 (1986) und „Enzymatic Oxidation of Methyl Groups on Aromatic Heterocycles: A Versatile Method for the Preparation of Heteroaromatic Carboxylic Acids," von A.Keiner, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 31(6): 774–775 (1992).
U.S. Patent Nr. 4 859 592 offenbart ein mikrobielles Verfahren für die Herstellung von Picolinsäure, welche dann mit chemischen Mitteln zu Pyridinprodukten umgewandelt werden kann.
U.S. Patente Nrn. 5 104 798, 5 213 973 und 5 236 832 offenbaren ein mikrobielles Verfahren für die Oxidation von Methylgruppen in bestimmten aromatischen Heterocyclen mit 5-oder 6-gliedrigem Ring zu den entsprechenden Carbonsäuren, welches durch ein Bakterium der Spezies Pseudomonas unter Anwenden von Toluol, Xylol oder Cymol als Induktor ausgeführt wird. Wie hierin beschrieben, ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass die Oxidation der Methylgruppe von Toluol zu Benzoesäure durch den Stamm Pseudomonas Putida ATCC Nr. 33015 drei Schritte umfasst, die durch Toluolmonooxygenase, Alkoholdehydrogenase bzw. Aldehyddehydrogenase katalysiert werden.
Wie bereits mit Bezug auf den vorstehend erwähnten Artikel von Harayama et al. beschrieben, ist das TOL-Plasmid pWWO von P.putida mt-2 ein übertragbares extrachromosomales Element, welches alle die für den oxidativen Katabolismus von verschiedenen aromatischen Kohlenwasserstoffen, einschließlich Toluol, m-Xylol und p-Xylol, erforderlichen Enzyme kodiert. Bakterien, die TOL-Plasmide tragen, beispielsweise P.putida ATCC Nr. 33015, können bestimmte aromatische Kohlenwasserstoffe zu deren entsprechenden aromatischen Carbonsäuren umwandeln: sowohl der xyl-Operon, der für Enzyme von Xylol-Abbau kodiert, als auch die Gene, die für die Regulierung des xy1-Gens verantwortlich sind, liegen auf dem TOL-Plasmid pWWO. Die Gene auf dem TOL-Plasmid pWWO, die für die Enzyme kodieren, die für die vorstehend genannten Oxidationen erforderlich sind, müssen für die Herstellung solcher Enzyme eingeführt werden. Die Beschreibung solcher Induktion findet man folglich in den vorstehend erwähnten U.S. Patenten Nrn. 5 104 798, 5 213 973 und 5 236 832.
Wie in einem Artikel von Gaucher et al. in Dev. Ind. Microbiol., 22: 219–232 (1981) beschrieben, enthält der Pilz Penicillium griseofulvum drei Enzyme für die Umwandlung von m-Cresol zu m-Hydroxybenzoesäure: m-Cresolmethylhydroxylase, m-Hydroxybenzylalkoholdehydrogenase und m-Hydroxybenzaldehydhydroxylase.
Wie auf dem Fachgebiet bekannt, enthalten – wie gesagt – bestimmte Pilze und Bakterien Enzyme für die Oxidation von Methylgruppen an bestimmten aromatischen Ringen zu deren entsprechenden Carbonsäuren. Obwohl es bekannt ist, dass Methylgruppen an solchen heteroaromatischen Ringen zu ihren entsprechenden Carbonsäuren unter Verwendung von Mikroorganismen oxi diert werden können, variieren, wie dem Fachmann sicher geläufig, die chemischen und optischen Ausbeuten von solchen mikrobiellen Oxidationen im Allgemeinen im Wesentlichen in Abhängigkeit von beispielsweise dem jeweiligen ausgewählten Mikroorganismus, der Konzentration des Substrats, der Struktur des Substrats und dergleichen.
Es wurde nun gefunden, dass ein Bereich von Mikroorganismen, einschließlich Pilze und Bakterien, im Wesentlichen 2-Methylchinoxalin zu 2-Chinoxalincarbonsäure oxidieren. Zusätzlich erlaubt das vorliegende Verfahren die geeignete Wiedergewinnung der 2-Chinoxalincarbonsäure.
Die provisorische US Patentanmeldung Nr. 60/073 801 („die Anmeldung 801"), eingereicht am 5. Februar 1998, nun internationale PCT-Anmeldung Nr. PCT/IB99/00067, eingereicht am 18. Januar 1999, offenbart die Verwendung von 2-Chinoxalincarbonsäure als ein Zwischenprodukt bei der Synthese von neuen Dihydroxyhexansäuren, die beispielsweise zum Behandeln von Entzündung und anderen Immunstörungen verwendbar sind. Die durch die neuen erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellte 2-Chinoxalincarbonsäure kann zum Synthetisieren solcher Dihydroxyhexansäuren verwendet werden.
Alle von den hierin zitierten Dokumente, einschließlich der vorangehenden, werden durch Hinweis hierin in ihrer Gesamtheit einbezogen.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zum Herstellen von 2-Chinoxalincarbonsäure aus 2-Methylchinoxalin.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung mikrobiologische Verfahren zum Herstellen der Verbindung der Formel I
durch das Kontaktieren einer Verbindung der Formel II
mit einem Mikroorganismus, der die Oxidation der Methylgruppe der Verbindung der Formel II zu der Carboxylgruppe der Verbindung der Formel I bewirken kann, und Inkubieren des erhaltenen Gemisches unter geeigneten Bedingungen zur Gewinnung einer Menge der Verbindung der Formel I.
Folglich stellt die vorliegende Verbindung Verfahren zum Ausführen der mikrobiellen Oxidation der Verbindung der Formel II, 2-Methylchinoxalin, bereit, das umfasst:
Kontaktieren der Verbindung der Formel II mit einem Mikroorganismus oder einer Mutante davon, welche bekannt ist oder auf andere Weise durch den Fachmann des entsprechenden Fachgebiets erhältlich ist und trotz solcher Mutation die vorliegende Oxidation bewirken kann („eine geeignete Mutante davon") und Inkubieren der dabei gebildeten Mischung unter Bedingungen, die ausreichen, um eine Menge der Verbindung der Formel I, 2-Chinoxalincarbonsäure, zu bilden, wobei der Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Absidia glauca ATCC Nr. 22752, Absidia glauca ATCC Nr. 74480, Absidia pseudocylindrospora ATCC Nr. 24169, Absidia repens ATCC Nr. 14849, Absidia repens ATCC Nr. 74481, Actinomucor elegans ATCC Nr. 6476, Alternaria solani ATCC Nr. 11078, Aspergillus tamani ATCC Nr. 16865, Coniophora puteana ATCC Nr. 12675, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 8688b, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 8983, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 9244, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 9245, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 10028b, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 26269, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 36190, Cunninghamel-1a echinulata ATCC Nr. 36112, Cunninghamella homothallica ATCC Nr. 16161, Cylindrocarpon destructans ATCC Nr. 66963, Diplodia gossypina ATCC Nr. 20575, Epicoccum neglectum ATCC Nr. 12723, Glomerella lagenaria ATCC Nr. 14724, Penicillium claviforme ATCC Nr. 10426, Penicillium duclauxii ATCC Nr. 10440, Penicillium glabrum ATCC Nr. 11080, Pseudocochliobolus lunatus ATCC Nr. 24155, Pseudomonas putida ATCC Nr. 33015, Pseudomonas putida ATCC Nr. 202190, Rhodococcus rhodochrous ATCC Nr. 19067 und Thamnostylum piriforme ATCC Nr. 8686 und geeigneten Mutanten derselben besteht, unter der Voraussetzung, dass, wenn es sich bei dem Mikroorganismus um Pseudomonas putida ATCC Nr. 33015 oder Pseudomonas putida ATCC Nr. 202190 handelt, die Pseudomonas putida ATCC Nr. 33015 oder die Pseudomonas putida ATCC Nr. 202190 durch Wechselwirkung mit einem Induktor vor dem Kontaktieren der Pseudomonas putida ATCC Nr. 33015 oder der Pseudomonas putida ATCC Nr. 202190 mit dem 2-Methylchinoxalin induziert wird.
Die vorliegenden Verfahren umfassen weiterhin gegebenenfalls die Isolierung des gewünschten Produkts, 2-Chinoxalincarbonsäure, durch jedes beliebige geeignete Verfahren. Beispielsweise kann das Reaktionsgemisch mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Ethylacetat, extrahiert werden und dann kann das extrahierte Material chromatographiert werden. Alternativ kann die 2-Chinoxalincarbonsäure aus dem Reaktionsgemisch an einem Harz, vorzugsweise einem polymeren Adsorptionsmittelharz, adsorbiert werden, das unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, vorzugsweise Ethylacetat, eluiert wird und aus dem eluierten Material unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels oder einer Kombination von organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Ethylacetat und Methanol, kristallisiert werden. Außerdem kann die durch die vorliegenden Verfahren hergestellte 2-Chinoxalincarbonsäure mit einer geeigneten Base, beispielsweise Natriumhydroxid, behandelt werden, was zur Bildung eines Salzes, beispielsweise Natriumsalz von 2-Chinoxalincarbonsäure, führt. Das Alkalisalz von 2-Chinoxalincarbonsäure kann dann aus dem Bioumwandlungsmedium durch Entfernen der Zellen aus dem Medium durch Filtra tion oder Zentrifugation, gefolgt von Aufkonzentrierung des freien Zellmediums, beispielsweise durch Verdampfung, isoliert werden.
Der vorliegende Mikroorganismus ist vorzugsweise ein intakter Mikroorganismus.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Mikroorganismus ein Pilz.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin der Mikroorganismus ein Pilz ist, ist der Pilz ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Gattung Absidia, Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Diplodia und Cunninghamella.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin der Mikroorganismus ein Pilz ist, ist der Pilz von der Gattung Absidia. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin der Mikroorganismus ein Pilz der Gattung Absidia ist, ist der Mikroorganismus insbesondere A. glauca ATCC Nr. 22752 oder A. glauca ATCC Nr. 74480 oder eine geeignete Mutante davon oder außerdem eine beliebige Hinterlegung von A. glauca ATCC Nr. 22752 oder einer geeigneten Mutante davon, die gemäß dem Budapester Vertrag erfolgt ist.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin der Mikroorganismus ein Pilz der Gattung Absidia ist, ist der Mikroorganismus A. repens ATCC Nr. 14849 oder A. repens ATCC Nr. 74481 oder eine geeignete Mutante davon oder außerdem eine beliebige Hinterlegung von A. repens ATCC Nr. 14849 oder einer geeigneten Mutante davon, die gemäß dem Budapester Vertrag erfolgt ist.
Eine bevorzugte Zelldichte für Pilzkulturen der vorliegenden Erfindung ist etwa 10 bis etwa 30 Gramm Trockenzellgewicht/l.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Mikroorganismus ein Bakterium.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin der Mikroorganismus ein Bakterium ist, ist das Bakterium ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Gattung Pseudomonas und Rhodococcus.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin der Mikroorganismus ein Bakterium ist, ist das Bakterium von der Gattung Pseudomonas.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin der Mikroorganismus ein Bakterium der Gattung Pseudomonas ist, ist der Mikroorganismus P. putida ATCC Nr. 33015 oder P. putida ATCC Nr. 202190 oder eine geeignete Mutante davon oder außerdem eine beliebige Hinterlegung von P. putida ATCC Nr. 33015 oder einer geeigneten Mutante davon, die gemäß dem Budapester Vertrag erfolgt ist.
Eine bevorzugte Zelldichte für die erfindungsgemäßen bakteriellen Kulturen ist eine Dichte, die eine optische Dichte von etwa 10 bis etwa 30 bei 650 nm aufweist.
Wie vorstehend erörtert, wird in den erfindungsgemäßen Ausführungsformen, worin der Mikroorganismus P. putida ATCC Nr. 33015 oder P. putida ATCC Nr. 202190 oder eine geeignete Mutante davon darstellt, der Mikroorganismus oder geeignete Mutante davon vor oder während des Kontaktierens eingeführt. Es ist bevorzugt, dass das Kontaktieren stattfindet, nachdem die Einführung des Mikroorganismus beendet ist. Bevorzugte Induktoren schließen p-Xylol oder m-Xylol ein. Ein besonders bevorzugter Induktor ist p-Xylol.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin der Mikroorganismus P. putida ATCC Nr. 33015 oder P. putida ATCC Nr. 202190 oder eine geeignete Mutante davon ist und der Mikroorganismus in einem Wachstumsmedium in einem Kolben kultiviert wird, wird der Induktor vor dem Kontaktieren des Mikroorganismus mit 2-Methylchinoxalin zu solchem Wachstumsmedium zugegeben und in solchem Wachstumsmedium für einen ausreichenden Zeitraum zur wesentlichen Vervollständigung solcher Induktion inkubiert. Die Zellen des induzierten Mikroorganismus werden durch Zentrifugieren des Kolbeninhalts entfernt, beispielsweise Dekantieren des verbliebenen Wachstumsmediums (und somit vorliegenden Induktors), Waschen des Zellpellets und Resuspendieren des Pellets in einem wässrigen Medium, wie DPBS (Biowhittaker), vor dem Kontaktieren des 2-Methylchinoxalins mit dem Mikroorganismus gesammelt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin der Mikroorganismus P. putida ATCC Nr. 33015 oder P. putida ATCC Nr. 202190 oder eine geeignete Mutante davon ist und der vorliegende Mikroorganismus in einem Wachstumsmedium in einem Fermenter kultiviert wird, wird der Induktor kontinuierlich oder fortgesetzt zu solchem Wachstumsmedium vor dem vorliegenden Kontaktieren des Mikroorganismus mit 2-Methylchinoxalin zugegeben und in solchem Wachstumsmedium für einen ausreichenden Zeitraum für die wesentliche Vervollständigung solcher Induktion inkubiert und dann vor dem Kontaktieren des 2-Methylchinoxalins mit dem Mikroorganismus abgebrochen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das vorliegende Kontaktieren durch Zugabe von 2-Methylchinoxalin zu einem Wachstumsmedium, das den vorliegenden Mikroorganismus umfasst, wobei der Mikroorganismus ein Pilz ist, bewirkt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin das vorliegende Kontaktieren durch Zugeben von 2-Methylchinoxalin zu einem Wachstumsmedium, das den Pilz umfasst, ausgeführt wird, ist das Wachstumsmedium Maisquellfeststoffmedium. Ein besonders bevorzugtes Maisquellfeststoffmedium umfasst etwa 20 g bis etwa 40 g/l Maisquellfeststoffe und etwa 20 g/l Dextrose mit einem pH-Wert von etwa 4,85. Ein weiteres bevorzugtes Wachstumsmedium umfasst etwa 20 g/l Pharmamedia° (Traders Protein) und etwa 20 g/l Dextrose mit einem pH-Wert von etwa 7,2.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Kontaktieren durch Zugeben der an ein Harz adsorbierten Verbindung der Formeln II. Siehe bei spielsweise den Artikel von J. T. Vicenzi et al., „Large-scale stereoselective enzymatic ketone reduction with in situ product removal via polymeric adsorbent resins", Enzyme and Microbial Technology, 20: 494–499 (1997).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird außerdem das Kontaktieren durch Zugeben von 2-Methylchinoxalin zu einem wässrigen Medium, das gewaschene Zellen des Mikroorganismus umfasst, ausgeführt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird außerdem der Mikroorganismus vor dem Kontaktieren des Mikroorganismus mit 2-Methylchinoxalin gewaschen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin der Mikroorganismus vor dem Kontaktieren des Mikroorganismus mit 2-Methylchinoxalin gewaschen wird, wird der gewaschene Mikroorganismus vor dem Kontaktieren immobilisiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Mikroorganismus in einem Maisquellfeststoffmedium für etwa 24 Stunden bis etwa 27 Stunden vor dem Kontaktieren wachsen lassen, was durch Zugeben von 2-Methylchinoxalin dazu ausgeführt wird.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen gegebenenfalls Isolierung oder Abtrennung von 2-Chinoxalincarbonsäure, beispielsweise ausgeführt durch Extraktion mit dem organischen Lösungsmittel, Adsorption an ein Harz, Kristallisation oder wie vorstehend erörtert, worin das Alkalisalz von 2-Chinoxalincarbonsäure durch Aufkonzentrierung durch Verdampfung eines zellfreien Mediums oder dergleichen bereitgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung schließt weiterhin die Verwendung von 2-Chinoxalincarbonsäure bei der Synthese der neuen in der vorstehend erwähnten Anmeldung '801 offenbarten Dihydroxyhexansäuren gemäß beliebigen der in der Anmeldung '801 offenbarten Verfahren oder durch Anwenden beliebiger anderer geeigneter Verfahren dafür ein.
Der Fachmann wird die hierin verwendeten Begriffe zum Beschreiben der vorliegenden Erfindung ausnahmslos verstehen, dennoch sind die hierin verwendeten nachfolgenden Begriffe wie unmittelbar unten beschrieben.
„Intakter Mikroorganismus" bedeutet, dass die Zellen des Mikroorganismus im Wesentlichen ihre innewohnende (und/oder gegebenenfalls induzierte) mechanische, physikalische und biochemische Integrität besitzen.
„Mikrobielle Oxidation" bedeutet die erfindungsgemäße Oxidation wie durch den intakten Mikroorganismus oder beliebige Zubereitung davon und dergleichen ausgeführt.
„Mikroorganismus" schließt beliebigen intakten Mikroorganismus oder ein geeignetes Präparat davon ein, einschließlich beispielsweise Mikroorganismus freigewaschen von z.B. Fermentationsmedium, Wachstumsmedium, Kulturbrühe und dergleichen, wie der Fall sein kann; und Mikroorganismus immobilisiert beispielsweise in einer Säule, gebunden an Kugeln und dergleichen.
Beschreibung der Erfindung im Einzelnen Sofern nicht anders ausgewiesen, gilt innerhalb dieser Beschreibung und der beigefügten Ansprüche:
°C ist Grad Celsius;
% ist Prozent;
ACN ist Acetonitril;
DMSO ist Dimethylsulfoxid;
DPBS ist Dulbeccos Phosphat-Puffer-Salzlösung;
EtOAC ist Ethylacetat;
EtOH ist Ethanol;
g ist Gramm;
HPLC ist Hochleistungsflüssigchromatographie;
L ist Liter; MeOH ist Methanol;
mg ist Milligramm;
min ist Minute oder Minuten;
mm ist Millimeter;
mMol ist Millimol;
ml ist Milliliter;
m-Xylol ist meta-Xylol;
N ist normal (Konzentration);
nM ist nanomolar (Konzentration);
PBS ist Phosphat-Puffer-Salzlösung;
p-Xylol ist para-Xylol;
U/min ist Umdrehungen pro Minute;
TFA ist Trifluoressigsäure;
μl ist Mikroliter;
V/V ist Volumen pro Volumen;
American National Can^® ist in Menasha, Wisconsin, USA, ansässig;
Becton Dickinson^® Labware ist in Franklin Lakes, New Jersey, USA ansässig;
Becton Dickinson^® Microbiology Systems, Sparks, Maryland, USA;
Biowhittaker^® ist in Walkersville, Maryland, USA, ansässig;
Column Engineering^®, Inc. ist in Ontario, Kalifornien, USA, ansässig;
IEC^® Centrifuge ist in Needham Heights, Massachusetts, USA, ansässig;
Rohm and Haas^® ist in Philadelphia, Pennsylvania, USA, ansässig; und
Traders Protein^® ist in Memphis, Tennessee, USA, ansässig.
Weiterhin ist ATCC die American Type Culture Collection, welche in 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, USA, ansässig ist. Nachstehende Tabelle 1 listet die hierin offenbarten Mikroorganismen und deren Hinterlegungen) (siehe www.ATCC.com). Tabelle 1
³ A.repens, 14849, hinterlegt gemäß dem Budapester Vertrag am 13. Januar 1999.
⁴ P.putida, 33015, hinterlegt gemäß dem Budapester Vertrag am 13. Januar 1999.
Wie vorstehend erörtert, betrifft die vorliegende Erfindung mikrobiologische Verfahren zum Herstellen der Verbindung der Formel I
durch Kontaktieren der Verbindung der Formel II
mit einem Mikroorganismus, der die Oxidation der Methylgruppe der Formel II, 2-Methylchinoxalin, zu der Carboxylgruppe der Formel I, 2-Chinoxalincarbonsäure, bewirken kann und Inkubieren der dabei gebildeten Mischung unter geeigneten Bedingungen zur Gewinnung von 2-Chinoxalincarbonsäure.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden in einfacher Weise ausgeführt. Der Mikroorganismus wird kultiviert, falls erforderlich, mit Induktion, beispielsweise wenn der Mikroorganismus P. putida ATCC Nr. 33015 oder P. putida ATCC Nr. 202190 oder eine geeignete Mutante davon ist, und dann mit 2-Methylchinoxalin zum Oxidieren der Methylgruppe von 2-Methylchinoxalin zu der Gruppe -COOH von 2-Chinoxalincarbonsäure kontaktiert. Die 2-Chinoxalincarbonsäure kann dann beispielsweise durch in der vorstehend erwähnten Anmeldung '801 beschriebene Verfahren zur letztendlichen Erzeugung der neuen Dihydroxyhexansäuren, die in der Anmeldung '801 offenbart sind, welche zum Behandeln von Entzündung und anderen Immunstörungen verwendbar sind, umgesetzt werden. Die Wirkung, Verfahren zum Testen der Wirkungen, Dosierungen, Dosierungsformen, Verabreichungsverfahren und Hintergrundinformation, die die neuen in der Anmeldung '801 offenbarten Dihydroxyhexansäuren betreffen, werden hierin angeführt.
Wie vorstehend erörtert, kann ein beliebiger geeigneter Mikroorganismus oder geeignete Mutante davon in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Wie durch den Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung verständlich, würden die Bedingungen der vorliegenden Verfahren in Abhängigkeit von beispielsweise der Art des Mikroorganismus und der jeweiligen Herstellung davon ausgewählt. Beispielsweise werden der pH-Wert, die Temperatur, die Komponentenkonzentrationen und dergleichen, z.B. von dem Fermentationsmedium, und das organische Lösungsmittel, sowie die Konzentrationen von 2-Methylchinoxalin und dem Induktor (falls angewendet) so ausgewählt, dass das jeweilige gewünschte Ergebnis unter Verwendung des ausgewählten Mikroorganismus bereitgestellt wird.
Bevorzugte Pilze schließen die Mitglieder der Gattungen Rbsidia, Actinomucor, Alternaria, Aspergillus, Coniophora, Cunninghamella, Cylindrocarpon, Diplodia, Epicoccum, Fusarium, Glomerella, Penicillium, Pseudocochliobolus, Thamnostylum und Verticillium ein, jedoch sind die Arten davon nicht besonders begrenzt, vorausgesetzt, dass die Mikroorganismen oder Mutanten davon, die vorliegende Oxidation bewirken können.
Besonders bevorzugte Pilze gehören zu der Gattung Absidia, Alternaria, Aspergillus, Cunninghamella, Diplodia und Penicillium.
Besonders bevorzugte Pilze gehören insbesondere zu der Gattung Absidia.
Bevorzugter schließen bevorzugte Pilze A. glauca ATCC Nr. 22752, A. glauca ATCC Nr. 74480, A. pseudocylindrospora ATCC Nr. 24169, A. repens ATCC Nr. 14849, A. repens ATCC Nr.74481, A. elegans ATCC Nr. 6476, A. solani ATCC Nr. 11078, A. tamarii ATCC Nr. 16865, C. puteana ATCC Nr. 12675, C. echinulata ATCC Nr. 8688a, C. echinulata ATCC Nr. 8688b, C. echinulata ATCC Nr. 8983, C. echinulata ATCC Nr. 9244, C. echinulata ATCC Nr. 9245, C. echinulata ATCC Nr. 10028b, C. echinu- lata ATCC Nr. 26269, C. echinulata ATCC Nr. 36190, C. echinulata ATCC Nr. 36112, C. homothallica ATCC Nr. 16161, C. destructans ATCC Nr. 66963, D. gossypina ATCC Nr. 20575, E. neglectum ATCC Nr. 12723, G. lagenaria ATCC Nr. 14724, P. claviforme ATCC Nr. 10426, P. duclauxii ATCC Nr. 10440, P. glabrum ATCC Nr. 11080, P. lunatus ATCC Nr. 24155 und T. piriforme ATCC Nr. 8686 und geeignete Mutanten davon ein.
Bevorzugtere Pilze schließen A. glauca ATCC Nr. 22752, A. glauca ATCC Nr. 74480, A. repens ATCC Nr. 14849, A. repens ATCC Nr. 74481, A. solani ATCC Nr. 11078, A. tamarii ATCC Nr. 16865, C. echinulata ATCC Nr. 8983, D. gossypina ATCC Nr. 20575 und P. glabrum ATCC Nr. 11080 und geeignete Mutanten davon ein.
Besonders bevorzugte Pilze schließen A. glauca ATCC Nr. 22752, A. glauca ATCC Nr. 74480, A. repens ATCC Nr. 14849 und A. repens ATCC Nr. 74481 und geeignete Mutanten davon ein.
Besonders bevorzugte Pilze schließen insbesondere A. repens ATCC Nr. 14849 und A. repens ATCC Nr. 74481 und geeignete Mutanten davon ein.
Bevorzugte Bakterien schließen jene ein, die zu den Gattungen gehören: Bacillus, Brevibacterium, Micrococcus, Pseudomonas und Rhodococcus, jedoch sind die Arten davon nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt, dass der Mikroorganismus oder Mutanten davon die vorliegende Oxidation ausführen können.
Besonders bevorzugte Bakterien schließen jene ein, die zu den Gattungen von Pseudomonas und Rhodococcus gehören. Besonders bevorzugte Bakterien schließen insbesondere jene ein, die zu der Gattung Pseudomonas gehören.
Besonders bevorzugtere Bakterien schließen insbesondere P. putida ATCC Nr. 33015, P. putida ATCC Nr. 202190 und R. rhodochrous ATCC Nr. und geeignete Mutanten davon ein.
Besonders bevorzugte Bakterien sind vor allem P. putida ATCC Nr. 33015 oder P. putida ATCC Nr. 202190 und geeignete Mutanten davon.
Wie bereits erörtert, schließt die vorliegende Erfindung die Verwendung von beliebigen geeigneten Mutanten von beliebigen der geeigneten Mikroorganismen ein. Zusätzlich kann eine Gruppe von Mutanten mit gewünschten Eigenschaften, die beispielsweise in der Lage ist, verglichen mit dem Elternstamm, größere Mengen Substrat zu oxidieren, auch in den vorliegenden Verfahren verwendet werden und diese neuen Stämme können unter Verwendung bekannter Verfahren, einschließlich beispielsweise Standardmutagenese und Auswahltechniken und Rekombinantenverfahren, einschließlich beispielsweise ortsgerichtete Mutagenese, erzeugt werden.
Standardmutageneseverfahren schließen chemische Mutagenesen mit N-Methyl-N'-nitrosoguanidin (Delic et al. (1970), Mutat. Res. 9:167), salpetrige Säure (Crueger and Crueger (1984), Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Seite 16, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, USA) und Bestrahlung mit Ultraviolettlicht (Thrum (1984), in Biotechnology of Industrial Antibiotics (Vandamme, Herausg.), Marcel Dekker, New York, Seiten 373-374) ein.
Auswahltechniken schließen einfache Wiederisolierung des Stamms durch Auswahl einer isolierten Kolonie Auswahl von speziellen Koloniemorphologenen und Auswahl auf Resistenz gegen Analoge von Komponenten, von denen bekannt ist, dass sie in dem biosynthetischen Weg der Verbindung der Formel I vorkommen oder von denen dies angenommen wird (Crueger and Crueger (1984), Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Seite 24–25, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, USA), ein.
Diese neuen Stämme werden in den vorliegenden Verfahren angewendet, weil sie beispielsweise verbesserte Eigenschaften bezüglich ihrer entsprechenden Elternstämme aufweisen, z.B. erzeugen sie mehr 2-Chinoxalincarbonsäure, sie zeigen weniger unerwünschte innewohnende Abbauwirkung von 2-Methylchinoxalin und/oder 2-Chinoxalincarbonsäure und/oder die Zwischenproduktverbindungen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren in Abhän gigkeit von beispielsweise dem jeweiligen ausgewählten Mikroorganismus erzeugt werden können. Wenn außerdem die Mutante angewendet wird, weil ihre Verwendung mehr 2-Chinoxalincarbonsäure ergibt, wird weniger Volumenkultur zum Wachsen benötigt, um das notwendige Material zum Erzeugen einer Menge von 2-Chinoxalincarbonsäure gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten, welches wesentliche Kosteneinsparungen ergeben kann.
Wie bereits beschrieben, kann ein beliebiges geeignetes Präparat des Mikroorganismus in dem erfindungsgemäßen Verfahren als solches verwendet werden, beispielsweise Mikroorganismen in Wachstumsmedium, Mikroorganismen, freigewaschen von beispielsweise Fermentationsmedium, Kulturbrühe und dergleichen, oder Mikroorganismen, immobilisiert beispielsweise in einer Säule, gebunden an Kugeln und dergleichen.
Der Fachmann wird aus der hierin bereitgestellten Beschreibung verstehen, wie geeigneter, immobilisierter, intakter Mikroorganismus, wie beschrieben herzustellen ist, beispielsweise von A. Bauer et al. in dem Artikel „Polyvinyl al-cohol-immobilized whole-cell preparations for biotransformation of nitriles", veröffentlicht in Biotechnology Letters, 18 (3): 343–348 (1996) .
Bevorzugte intakte Mikroorganismen sind jene, die im - Wesentlichen 2-Methylchinoxalin zu dem Produkt, insbesondere 2-Chinoxalincarbonsäure, oxidieren, wobei das Produkt im Wesentlichen unverändert zurückbleibt, beispielsweise frei von innewohnender Aktivität, die abbauen oder in anderer Weise das gewünschte Produkt an einer beliebigen Stufe der vorliegenden Verfahren negativ beeinflussen könnte.
Die zur Verwendung in der vorliegenden mikrobiellen Oxidation geeigneten Mikroorganismen können durch beliebiges geeignetes Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, hergestellt werden. Ein Beispiel für ein geeignetes Herstellungsverfahren eines Mikroorganismus aus einem kommerziell bezogenen Stamm wird nachstehend bereitgestellt. Basierend auf der vorliegenden Offenbarung, einschließlich der nachstehend be reitgestellten Verfahren, würde der Fachmann verstehen, wie jeder Teil dieser Verfahren zu modifizieren ist, beispielsweise Herstellungsverfahren des Mikroorganismus, frei oder immobilisiert, Verfahren zum Kontaktieren von 2-Chinoxalincarbonsäure mit dem Mikroorganismus, Wachstumsmedium-Komponenten und Bedingungen, beispielsweise Temperatur, pH-Wert und dergleichen, entsprechende Kombinationen von 2-Methylchinoxalin, Induktor (falls verwendet), oder Inkubationsbedingungen, um das gewünschte Ergebnis unter Anwendung von beliebigem, geeignetem Mikroorganismus zu erreichen.
In erfindungsgemäßen Ausführungsformen, worin der Mikroorganismus ein Pilz ist, ist ein bevorzugter Konzentrationsbereich von 2-Methylchinoxalin etwa 0,01 g/l bis etwa 2,5 g/l und ein besonders bevorzugter Bereich ist etwa 0,1 g/l bis etwa 2,0 g/l. In erfindungsgemäßen Ausführungsformen, worin der Mikroorganismus ein Pilz darstellt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus A. repens ATCC Nr. 14849, A. repens ATCC Nr. 74481, A. glauca ATCC Nr. 22752, A. glauca ATCC Nr. 74480 und geeigneten Mutanten davon, ist ein bevorzugter Konzentrationsbereich von 2-Methylchinoxalin etwa 0,1 g/l bis etwa 2,0 g/l.
In den erfindungsgemäßen Ausführungsformen, worin der Mikroorganismus ein Bakterium ist, ist ein bevorzugter Konzentrationsbereich von 2-Methylchinoxalin etwa 0,01 g/l bis etwa 1,5 g/l und ein besonders bevorzugter Bereich ist etwa 0,1 g/l bis etwa 1,0 g/l. In erfindungsgemäßen Ausführungsformen, worin das Bakterium ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus P. putida ATCC Nr. 33015, P. putida ATCC Nr. 202190 und geeignete Mutanten davon, ist ein bevorzugter Konzentrationsbereich von 2-Methylchinoxalin etwa 0,1 g/l bis etwa 1,0 g/l.
Zusätzlich und wie vorstehend erörtert, muss ein TOLplasmidtragendes Bakterium, beispielsweise P. putida ATCC Nr. 33015 oder P. putida ATCC Nr. 202190, erforderlich für die vorliegende Oxidation, induziert werden. In erfindungsgemäßen Ausführungsformen, worin P. putida ATCC Nr. 33015 oder P. putida ATCC Nr. 202190 in einem Medium in einem Fermenter kultiviert wird, wird der Induktor, vorzugsweise p-Xylol, bei einer geeigneten Zugabegeschwindigkeit von etwa 4,5 mMol/l/h bis etwa 6,5 mMol/l/h und einer besonders bevorzugten Zugabegeschwindigkeit von etwa 4,9 mMol/l/h bis etwa 6,1 mm/l/h kultiviert.
In den erfindungsgemäßen Ausführungsformen, worin P. putida ATCC Nr. 33015 oder P. putida ATCC Nr. 202190 in einem Medium in einem Kolben vorliegt, wird der Induktor, vorzugsweise p-Xylol, kontinuierlich in Gasform zu dem Medium gegeben. Wie dem Fachmann aus der vorliegenden Offenbarung und aus den vorstehend erwähnten Artikeln und Patenten (beispielsweise U.S. Patent Nr. 5 236 832) verständlich wird, wird die Induktorkonzentration gewöhnlich so ausgewählt, dass sie niedriger als die minimale Inhibitorkonzentration der für die Oxidation verantwortlichen Enzyme ist. Siehe auch Claus und Walker, J. Gen. Microbiol., 36: 107–122 (1964).
Ein beliebiges geeignetes Verfahren des Kontaktierens des Substrats 2-Methylchinoxalin mit dem Mikroorganismus kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das Substrat kann mit dem Mikroorganismus in beliebiger geeigneter Reihenfolge in Kontakt gebracht werden. Beispielsweise kann 2-Methylchinoxalin zu einem Medium, wie einer Kulturbrühe, das den Mikroorganismus frei oder immobilisiert oder eine Kombination davon umfasst, gegeben werden oder das Medium kann 2-Methylchinoxalin umfassen und der Mikroorganismus kann dann zu solchem Medium gegeben werden oder 2-Methylchinoxalin und der Mikroorganismus können zusammen zu solchem Medium gegeben werden oder entweder 2-Methylchinoxalin oder der Mikroorganismus können zu einem geeigneten Lösungsmittel, das den Anderen umfasst, gegeben werden oder 2-Methylchinoxalin kann an ein Harz adsorbiert sein und dergleichen. Der Fachmann wird aus der hierin bereitgestellten Beschreibung verstehen, wie jeder Teil der vorliegenden Verfahren erwünschtenfalls zu modifizieren ist.
Wie vorstehend erörtert, ist es in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass der Mikroorganismus A. glauca ATCC Nr. 22752 ist. Wie ebenfalls vorstehend erörtert, wurde eine lyophilisierte Probe von A. glauca ATCC Nr. 22752 mit der ATCC unter Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag am 13. Januar 1999 hinterlegt. Dieser neuerlich hinterlegten Kultur wurde die neue Hinterlegungsnummer von ATCC Nr. 74480 gegeben. Folglich ist es in der vorliegenden Erfindung ebenfalls bevorzugt, dass der Mikroorganismus A. glauca ATCC Nr. 74480 ist. Alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit der so hinterlegten Mikroorganismen für die Öffentlichkeit werden nach Herausgabe eines Patents aus der Beschreibung der vorliegenden Erfindung unwiderruflich entfernt.
Wie ebenfalls vorstehend erörtert, ist es in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt, dass der Mikroorganismus A. repens ATCC Nr. 14849 ist. Eine lyophililsierte Probe von A. repens ATCC Nr. 14849 wurde mit dem ATCC gemäß dem Budapester Vertrag am 13. Januar 1999 hinterlegt. Dieser neuerlich hinterlegten Kultur wurde die neue Hinterlegungsnummer von ATCC Nr. 74481 gegeben. Folglich ist es in der vorliegen den Erfindung auch besonders bevorzugt, dass der Mikroorganismus A. repens ATCC Nr. 74481 ist. Alle Beschränkungen auf die Verfügbarkeit für die Öffentlichkeit der Mikroorganismenkultur, die so hinterlegt wurde, werden nach Herausgabe eines Patents aus der Beschreibung der vorliegenden Erfindung unwiderruflich entfernt.
Kulturen des Pilzes A. repens ATCC Nr. 14849 (oder A. repens ATCC Nr. 74481, A. glauca ATCC Nr. 22752 oder A. glauca ATCC Nr. 74480) können aus der ATCC erhalten werden, wobei ein Beispiel eines geeigneten Verfahrens zur Herstellung aus solchem verfügbarem Stamm unmittelbar nachstehend bereitgestellt werden. Stammkulturen können aus Reiskulturen hergestellt werden, wie beispielsweise die Nachstehenden: Erlenmeyer-Kolben (250 ml), enthaltend etwa 50 g braunen Reis und etwa 20 ml destilliertes Wasser, werden bei etwa 121°C für etwa 30 min im Autoklaven behandelt, eine Suspension von A. repens ATCC Nr. 14849 (oder A. repens ATCC Nr. 74481, A. glauca ATCC Nr. 22752 oder A. glauca ATCC Nr. 74480) vegetativen Zellen oder Sporen wird durch Zugeben von entweder einer aliquoten Menge einer flüssigen Kultur oder einem Abstrich aus einer Schrägkultur, gewachsen auf Agarmedium zu sterilem Wasser, hergestellt. Jedes Reisgefäß wird mit etwa 5 ml der Sporen oder Zellsuspension inokuliert und etwa 10 Tage bei etwa 28°C inkubiert, wobei der Sporenstamm durch Waschen der Reiskultur mit etwa 0,5%iger Lösung von Tween 80 in destilliertem Wasser, Abdekantieren der Sporensuspension von dem Reiswasser und Zugeben von etwa 10% bis etwa 20% Glycerin hergestellt wird. Der Sporenstamm wird bei etwa –70°C gelagert.
Wie dem Fachmann verständlich, ist für einen beliebigen ausgewählten Pilz, und wie er hierin speziell in den Beispielen für den bevorzugten A. glauca ATCC Nr. 22752 oder ATCC Nr. 74480 und den speziell bevorzugten A. repens ATCC Nr. 14849 oder ATCC Nr. 74481 bereitgestellt wird, ein geeignetes Verfahren zum Präparieren des ausgewählten Pilzes wie nachstehend: der Pilz wird mit der gefrorenen vegetativen Zelle oder Sporenstammkultur, wie vorstehend beschrieben, in einem Kolben oder einem Glasrohr mit einem Metallverschluss, der ein Wachstumsmedium enthält (enthaltend eine aliquote Menge aus einer sterilen Lösung, die Tween 80, Glycerin und destilliertes Wasser einschließt), dessen Zusammensetzung genauer nachstehend beschrieben wird, inokuliert. Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von etwa 22°C bis etwa 32°C und vorzugsweise bei etwa 29°C unter geeignetem Schütteln, vorzugsweise von etwa 200 U/min bis etwa 220 U/min und besonders bevorzugt bei etwa 210 U/min, ausgeführt. Falls so gewünscht, kann der pH-Wert des Wachstumsmediums durch die Verwendung von geeigneten Puffern, die in das Fermentationsmedium eingearbeitet sind, gehalten werden und/oder periodisch durch Zugabe von entweder Base oder Säure, wie erforderlich, eingestellt werden. Ein bevorzugter pH-Bereich ist etwa pH 6 bis etwa pH 7.
Ein beliebiger geeigneter Zeitraum zum Wachstum der Mikroorganismen (d.h. Pilz oder Bakterien), Kontaktieren des Mikroorganismus mit 2-Methylchinoxalin und Inkubation von 2-Methylchinoxalin mit dem Mikroorganismus kann in der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Geeignetes Wachstum des Mikroorganismus kann beispielsweise innerhalb etwa 24 Stunden erreicht werden, wobei zu der Zeit entweder (a) 2-Methylchinoxalin selbst, (b) eine geeignete aliquote Menge einer Lösung von 2-Methylchinoxalin in einem geeignetem Lösungsmittel, vorzugsweise EtOH, das beispielsweise nicht unerwünschtes Wachstum oder Funktion des Mikroorganismus beeinträchtigt oder (c) 2-Methylchinoxalin, adsorbiert an ein Harz, zu der Kultur gegeben werden. Die Inkubation kann dann für beispielsweise etwa 2 bis etwa 24 Tage in Abhängigkeit von beispielsweise dem Gefäß in dem die Bioumwandlung stattfindet, dem Medium und Bedingungen, beispielsweise Temperatur, pH-Wert und Rühren der Inkubation, fortgesetzt werden. Die Inkubationsbrühe kann dann unter Verwendung von beliebigen geeigneten Extraktionsverfanren extrahiert werden, beispielsweise (a), wobei ein geeignetes Lösungsmittel, wie beispielsweise EtOAc, Methylisobutylketon, Methylethylketon, Methylenchlorid und dergleichen, vorzugsweise EtOAc, die organischen Komponenten aus der Inkubationsbrühe entfernt oder (b) durch Adsorption des Produkts, Ω-Chinoxalincarbonsäure an einem geeigneten Harz, vorzugsweise ein polymeres Adsorptionsmittelharz, bevorzugter ein Harz, ausgewählt aus jenen mit dem Handelsnamen Amberlite^® (Rohm and Haas), besonders bevorzugt XAD4 (von den Amberlite-Harzen. Nach Extraktion der Inkubationsbrühe mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel und Abtrennung der organischen und wässrigen Phasen können die den organischen Rückstand umfassenden Verbindungen unter Verwendung von beliebigen geeigneten Verfahren, wie beispielsweise Chromatographie, bestimmt werden. Alternativ kann nach Extraktion von 2-Chinoxalincarbon säure aus der Inkubationsbrühe unter Verwendung eines Harzes 2-Ch daraus eluiert werden unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels, vorzugsweise EtOAc oder McOH und dann aus dem beispielsweise EtOAc unter Verwendung von z.B. EtOAc und McOH kristallisiert werden.
Beliebiges geeignetes Wachstumsmedium kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden und das geeignete Wachstumsmedium wird eine Quelle oder Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff, assimilierbarem Stickstoff und anorganischen Salzen, die essentielle Mineralien enthalten, enthalten. Im Allgemeinen können viele Kohlenhydrate, wie beispielsweise Glucose, Maltose, Mannose, Saccharose, Stärke, Glycerin, Millet-Jelly, Molassen, Sojabohnen und dergleichen, als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff verwendet werden. Quellen für assimilierbaren Stickstoff schließen beispielsweise Materialien, wie Hefe und Kaseinhydrolysate, primäre Hefe, Hefeextrakte, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenfeststoffe, Weizenkeim, Fleischextrakte, Peptone, Maisquellflüssigkeit, Maisquellfeststoffe und Ammoniumsalze, ein. Geeignete anorganische Salznährmittel zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Kulturmedium schließen z.B. übliche Salze, wie Natrium, Eisen, Magnesium, Kalium, Kobalt, Phosphate und dergleichen, ein.
Insbesondere schließen Komponenten für Wachstumsmedien, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, wenn der Mikroorganismus ein Pilz ist, beispielsweise Maisquellflüssigkeit, Maisquellfeststoffe, Pharmamedia^® und Malzextrakt ein. Maisquellflüssigkeitsmedium wird mit etwa 40 g/l Maisquellflüssigkeit und etwa 20 g/l Dextrose hergestellt und vor der Sterilisierung auf etwa pH 4,85 eingestellt. Maisquellfeststoffmedium wird auf etwa 20 g/l bis etwa 40 g/l Maisquellfeststoff und etwa 20 g/l Dextrose hergestellt und vor der Sterilisierung auf etwa pH 4,85 eingestellt. Ein weiteres geeignetes Medium für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren wird mit etwa 20 g/l Pharmamedia^® und etwa 20 g/l Dextrose und vor der Sterilisierung auf etwa pH 7,2 eingestellt. Malzextraktmedium wird mit etwa 10 g/l Malzextrakt und etwa 10 g/l Dextrose, etwa 5 g/l Pepton und etwa 2 g/l Hefeextrakt hergestellt und vor der Sterilisierung auf etwa pH 7 eingestellt. Ein weiteres geeignetes Medium zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren wird mit etwa 20 g/l Dextrose, etwa 5 g/l Nährmehl, etwa 5 g/l Hefeextrakt, etwa 5 g/l NaCl und etwa 5 g/l K₂HPO₄ hergestellt, wobei der pH-Wert auf etwa pH 7,0 mit H₂SO₄ vor der Sterilisierung eingestellt wird. Ein besonders bevorzugtes Wachstumsmedium für den Pilz, das für das vorliegende Verfahren geeignet ist, ist das vorstehend erwähnte Maisquellfeststoffmedium.
Wie vorstehend erörtert, ist es besonders in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass der Mikroorganismus P. putida ATCC Nr. 33015 ist. Ebenfalls wie vorstehend erörtert, wurde eine lyophilisierte Probe von P. putida ATCC Nr. 33015 bei dem ATCC gemäß dem Budapester Vertrag am 13. Januar 1999 hinterlegt. Dieser neuerlich hinterlegten Kultur wurde die neue Hinterlegungsnummer von ATCC Nr. 202190 gegeben. Folglich ist es ebenfalls in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass der Mikroorganismus P. putida ATCC Nr. 202190 ist. Alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit für die Öffentlichkeit der so hinterlegten Mikroorganismuskulturen werden nach Herausgabe eines Patents aus der Beschreibung der vorliegenden Erfindung unwiderruflich entfernt.
Außerdem schließen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Wachstumsmedien, wenn der Mikroorganismus ein Bakterium ist, beliebige geeignete bekannte Medien, beispielsweise Nährbrühe (etwa 32 g/l, Becton Dickinson Microbiology Systems) und Glycerin (etwa 5 g/l) ein. Wie dem Fachmann geläufig, ist für ein beliebiges ausgewähltes Bakterium und wie speziell hierin anschließend in den Beispielen für P. putida ATCC Nr. 33015 dargelegt, ein geeignetes Verfahren zum Herstellen des ausgewählten Bakteriums wie nachstehend: das Bakterium wird aus einer gefrorenen Stammkultur, hergestellt, wie auf dem Fachgebiet bekannt (etwa 17% Glycerinstamm) in ei nen Kolben oder in einen Glasröhrchen mit einem Metallverschluss oder einen Fermenter, enthaltend ein Wachstumsmedium (enthaltend eine aliquote Menge aus einer sterilen Lösung, die Tween 80, Glycerin und destilliertes Wasser einschließt), dessen Zusammensetzung nachstehend genauer beschrieben wird, inokuliert. Die Fermentation erfolgt bei Temperaturen im Bereich von etwa 20°C bis etwa 40°C und vorzugsweise bei Temperaturen im Bereich bei etwa 25°C bis etwa 32°C unter geeignetem Schütteln, vorzugsweise bei etwa 200 U/min bis etwa 220 U/min und besonders bevorzugt bei etwa 210 U/min. Falls so erwünscht, kann der pH-Wert des Wachstumsmediums durch die Verwendung von geeigneten Puffern, die in das Fermentationsmedium eingearbeitet werden und/oder periodisch eingestellt durch die Zugabe von entweder Base oder Säure, falls erforderlich, gehalten werden. Ein bevorzugtes Inokulum ist etwa 1% bis etwa 20% v/v (Inokulum/Medium). Ein bevorzugter pH-Bereich ist etwa pH 6 bis etwa pH 8.
Es sollte angemerkt werden, dass Bezug auf bestimmte Puffer, Medien, Reagenzien, Kontaktier- oder Kulturbedingungen, Menge von Substrat, Menge von Induktor, wenn verwendet, und dergleichen in einem beliebigen Teil der vorliegenden Offenbarung nicht zum Begrenzen vorgesehen sind, sondern so gelesen werden sollten, dass alle solche verwandten Materialien, die der Durchschnittsfachmann im jeweiligen Zusammenhang in der hierin dargelegten Erörterung als interessant oder von Wert erkennen würde, umfasst sind. Beispielsweise ist es häufig möglich, ein Puffersystem oder Kulturmedium gegen ein anderes zu ersetzen, sodass ein verschiedener, jedoch bekannter Weg, verwendet wird, um die gleichen Ziele zu erreichen, wie jene, auf die die Verwendung eines vorgeschlagenen Verfahrens, Material oder Zusammensetzung gerichtet ist. Darüber hinaus sollte es selbstverständlich sein, dass die vorliegende Erfindung das Ausweiten des vorliegenden Verfahrens für kommerzielle Zwecke einschließt.
Die vorliegende mikrobielle Oxidation umfasst weiterhin gegebenenfalls die Isolierung des gewünschten Produkts, 2-Chinoxalincarbonsäure. Die 2-Chinoxalincarbonsäure kann wie nachstehend beschrieben aus dem Medium isoliert werden, indem das neue, mikrobielle Oxidationsverfahren ausgeführt wurde und spezieller aus beliebigen Zwischenproduktverbindungen, die hergestellt werden können, jedoch in Abhängigkeit von beispielsweise dem ausgewählten Mikroorganismus und den Inkubationsbedingungen nicht vollständig zu 2-Chinoxalincarbonsäure umgewandelt werden.
Beliebige geeignete Verfahren zum Isolieren und/oder Reinigen von beliebigen der Zwischenprodukte oder des gewünschten Produkts des vorliegenden Verfahrens können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich Filtration, Extraktion, Kristallisation, Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie, präparative Niederdruckflüssigchromatographie, HPLC, Harzadsorption oder beliebige geeignete Kombination solcher Verfahren.
Die detaillierten Beispiele, die nachstehend bereitgestellt werden, zeigen, dass ein Bereich von Mikroorganismen, insbesondere Pilze und Bakterien, 2-Methylchinoxalin oxidieren, um 2-Chinoxalincarbonsäure zu ergeben, die dann von beliebigem, unerwünschtem, unverändertem 2-Methylchinoxalin oder beliebigen Zwischenproduktverbindungen getrennt werden können und weiterhin gemäß Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, umgesetzt werden, um beispielsweise die Verbindungen der Anmeldung '801 zu erhalten.
Obwohl die vorliegende Offenbarung hauptsächlich auf die Verwendung von intakten Mikroorganismen in dem vorliegendem Verfahren gerichtet ist, würde der Fachmann verstehen, dass die vorliegenden mikrobiellen Verfahren durch geeignete Herstellungen davon, beispielsweise aufgebrochene und entwässerte Zellpräparationen, extrahierte Materialien, umfassend die mikrobiellen Enzyme, die die vorliegenden Oxidationen ausführen können oder die Enzyme selbst, zusammen mit beliebigen, notwendigen Cofaktoren und dergleichen ausgeführt werden können.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert. Die vorangehende und folgende Beschreibung der vorliegenden Erfindung und die verschiedenen Ausführungsformen sind nicht vorgesehen, die Erfindung zu beschränken, sondern sollen sie erläutern. Folglich wird es verständlich sein, dass die Erfindung nicht durch die speziellen Einzelheiten dieser Beispiele begrenzt ist.
Beispiel I
Oxidation von 2-Methylchinoxalin in Röhrchenkulturen unter Verwendung von A. repens ATCC Nr. 14849
A. Bioumwandlung unter Verwendung des Pizes A. repens ATCC Nr. 14849
Drei „Test"-Kulturen (T1, T2 und T3) wurden wie nachstehend hergestellt: etwa 2,5 ml steriles Wachstumsmedium (etwa 20 g/l Dextrose, etwa 5 g/l Nährmehl, etwa 5 g/l Hefeextrakt, etwa 5 g/l NaCl und etwa 5 g/l K₂HPO₄ mit dem pH-Wert eingestellt auf etwa pH 7,0 mit H₂SO₄ vor der Sterilisierung) wurden zu jeder von drei Glasröhrchen mit 16 × 125 mm jeweils mit einem Metallverschluss (T1, T2 und T3) gegeben, gefolgt von Zusatz von Sporen (etwa 1% v/v der Sporenstammkultur) von A. repens ATCC Nr. 14849 zu T1, T2 und T3.
Die drei Röhrchenkulturen wurden bei etwa 29°C unter Schütteln bei etwa 210 U/min inkubiert. Nach etwa 48 Stunden (T1), 72 Stunden (T2) oder 96 Stunden (T3) wurden etwa 0,05 ml einer Stammlösung (etwa 50 mg/ml in etwa 100% Ethanol, Endkonzentration etwa 1 mg/ml) 2-Methylchinoxalin zu den Röhrchenkulturen gegeben.
Nach weiterer Inkubation bei etwa 29°C (siehe nachstehende Tabelle 2) wurden die Fermentationsbrühen der Röhrchenkulturen mit 4N HCl auf etwa pH 2 eingestellt. Der Inhalt von jeder Rohrkultur wurde mit einem gleichen Volumen EtOAc (rein) extrahiert: das EtOAc wurde zugegeben, die Röhrchenkultur wur de vortex-behandelt und dann bei etwa 2000 U/min (IEC-Zentrifuge) zentrifugiert. Die EtOAc-Schicht wurde entfernt und die wässrige Schicht für ein zweites Mal extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden unter Stickstoff in einem Wasserbad bei etwa 50°C heruntergetrocknet.
B. Ausbeute von 2-Chinoxalincarbonsäure wurde durch Umkehrphasen-HPLC bestimmt
Jedes von den Extrakten, hergestellt wie vorstehend beschrieben, wurde in etwa 1 ml ACN : Wasser (1 : 9 v/v) resuspendiert und etwa 20 μl von jedem resuspendierten Extrakt wurden durch Einspritzen aus einer HPLC-Säule: Inertsil^® C8 HPLC-Säule (4,6 × 250 mm, Column Engineering, Inc.) analysiert. Die in jedem eingespritzten resuspendierten Extrakt enthaltenden Verbindungen wurden isokratisch bei etwa 1,0 ml pro Minute in einer mobilen Phase (ACN : 0,05% wässriger TFA, 1 : 4 v/v) getrennt. Unter diesen Bedingungen eluierte 2-Chinoxalincarbonsäure bei etwa 8,6 min und 2-Methylchinoxalin eluierte bei etwa 15 min. Die Ausbeuten an 2-Chinoxalincarbonsäure wurden aus solcher HPLC-Analyse für verschiedene Einstellungen der Versuchsbedingungen (d.h. T1, T2 und T3) bestimmt und diese Ausbeuten werden in nachstehender Tabelle 2 bereitgestellt. Tabelle 2
Wie durch die Daten von T1, T2 und T3 von Tabelle 2 erläutert, zeigt HPLC-Analyse, dass das vorliegende mikrobielle Verfahren 56%, 76% bzw. 79% Ausbeuten der gewünschten 2-Chinoxalincarbonsäure ergibt.
Folglich ergibt der Einschluss von intakten Mikroorganismen, d.h. A. repens ATCC Nr. 14949, die Oxidation von 2-Methylchinoxalin zu 2-Chinoxalincarbonsäure und eine wesentliche Menge an 2-Chinoxalincarbonsäure bleibt intakt.
Beispiel II
Oxidation von 2-Methylchinoxalin in Röhrenkulturen unter Verwendung von A. repens ATCC Nr. 14849 in vier verschiedenen Wachstumsmedien
A. Herstellung von vier verschiedenen Wachstumsmedien
Medium 1 wurde auf etwa 40 g/l Maisquellflüssigkeit in etwa 20 g/l Dextrose hergestellt und auf etwa pH 4,85 vor der Sterilisierung eingestellt.
Medium 2 wurde mit etwa 40 g/l Maisquellfeststoff und etwa 20 g/1 Dextrose hergestellt und auf etwa pH 4,85 vor der Sterilisierung eingestellt.
Medium 3 wurde mit etwa 20 g/l Pharmamedia^® und etwa 20 g/l Dextrose hergestellt und auf etwa pH 7,2 vor der Sterilisierung eingestellt.
Medium 4 wurde mit etwa 10 g/l Malzextrakt, etwa 10 g/l Dextrose, etwa 5 g/l Pepton und etwa 2 g/l Hefeextrakt hergestellt und auf etwa pH 7 vor der Sterilisierung eingestellt.
B. Bioumwandlung unter Verwendung des Pilzes A. repens ATCC Nr. 14849 Acht „Test"-Kulturen (T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a und T4b) wurden wie nachstehend hergestellt: etwa 2,5 ml steriles Wachstumsmedium (Medium 1, Medium 2, Medium 3 bzw. Medium 4) wurden zu jedem der acht 16 × 125 mm Glasröhrchen, jeweils mit einem Metallverschluss (T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a, und T4b) gefolgt von der Zugabe von Sporen (etwa 1% v/v Sporenstammkultur) von A. repens ATCC Nr. 14849 zu allen der Röhrchenkulturen gegeben.
Die acht Röhrchenkulturen wurden bei etwa 29°C unter Schütteln bei etwa 210 U/min inkubiert. Nach etwa entweder 48 Stunden (T1a, T2a, T3a und T4a) oder etwa 72 Stunden (T1b, T2b, T3b und T4b) wurden etwa 0,05 ml einer Stammlösung (etwa 50 mg/ml in DMSO, Endkonzentration etwa 1 mg/ml) 2-Methylchinoxalin zu den Röhrchenkulturen gegeben.
Nach weiterer Inkubation bei etwa 29°C für 12 Tage wurde die Fermentationsbrühe von jeder Röhrchenkultur extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte heruntergetrocknet, wie in Beispiel I beschrieben.
C. Ausbeute von 2-Chinoxalincarbonsäure wie durch Umkehrphasen-HPLC bestimmt
Jeder von den Extrakten, hergestellt wie vorstehend beschrieben, wurde dann verarbeitet für und analysiert durch Umkehrphasen-HPLC, wie in Beispiel I beschrieben. Ausbeuten an 2-Chinoxalincarbonsäure wurden aus solcher HPLC-Analyse für verschiedene Einstellungen von Versuchsbedingungen (d.h. T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a und T4b) bestimmt und diese Ausbeuten werden in nachstehender Tabelle 3 bereitgestellt. Tabelle 3
Wie durch die Daten von Tabelle 3 erläutert, zeigt HPLC-Analyse, dass das vorliegende mikrobielle Verfahren, worin der Mikroorganismus A. repens ATCC Nr. 14849 ist, in allen der getesteten Medien zur Herstellung von 2-Chinoxalincarbonsäure führt. Die Daten von Tabelle 3 zeigen auch an, dass von den vier getesteten Medien, Medium 2 die höchste %-Ausbeute des gewünschten Produkts 2-Chinoxalincarbonsäure liefert.
Beispiel III
Oxidation von 2-Methylchinoxalin in Kolbenkulturen unter Verwendung A. repens ATCC Nr. 14849 oder A. glauca ATCC Nr. 22752
A. Bioumwandlung unter Verwendung des Pilzes A. repens ATCC Nr. 14849 oder des Pilzes A. glauca ATCC Nr. 22752
Vier „Test"-Kulturen (T1a, T1b, T2a und T2b) wurden wie nachstehend hergestellt: etwa 25 ml steriles Wachstumsmedium (etwa 20 g/l Dextrose, etwa 5 g/l Nährmehl, etwa 5 g/l Hefeextrakt, etwa 5 g/l NaCl und etwa 5 g/l K₂HPO₄ mit dem eingestellten pH-Wert auf etwa pH 7,0 mit H₂SO₄ vor Sterilisierung) wurden zu jedem der vier konischen Kolben (300 ml) gegeben, gefolgt von der Zugabe von Sporen (etwa 1% v/v Sporenstammkultur) von entweder A. repens ATCC Nr. 14849 (T1a, T1b) oder A. glauca ATCC Nr. 22752 (T2a, T2b).
Die vier Kolbenkulturen wurden bei etwa 29°C unter Schütteln bei etwa 210 U/min inkubiert. Unmittelbar nach Inokulation (T2a) oder nach etwa 24 Stunden (T2b) wurden etwa 0,5 ml einer Stammlösung (etwa 50 mg/ml in etwa 100% EtOH, Endkonzentration etwa 1 mg/ml) 2-Methylchinoxalin zu den Kolbenkulturen von A. glauca ATCC Nr. 22752 und nach etwa 48 Stunden (T1a) oder 72 Stunden (T1b) etwa 0,5 ml einer Stammlösung (etwa 50 mg/ml in etwa 100% EtOH, Endkonzentration etwa 1 mg/ml) 2-Methylchinoxalin zu den Kolbenkulturen von A. repens ATCC Nr. 14849 gegeben.
Nach weiterer Inkubation bei etwa 29°C für 24 (T1a), 16 (T1b), 25 (T2a) oder 24 (T2b) Tage wurden die Fermentations brühen der Kolbenkulturen bei etwa pH 2 mit 4N HCl eingestellt. Der Inhalt von jeder Kolbenkultur wurde mit 25 ml aliquoten Mengen EtOAc extrahiert und das Lösungsmittel wurde aus den vereinigten EtOAc-Extrakten unter vermindertem Druck entfernt unter Gewinnung der Rohprodukte.
B. Ausbeute von 2-Chinoxalincarbonsäure wie durch Umkehrphasen-HPLC bestimmt.
Jeder von den Extrakten, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, wurde in etwa 5 ml MeOH : ACN (3 : 2 v/v) resuspendiert und 1 : 19 mit Wasser für HPLC-Analyse verdünnt. HPLC-Analysen wurden wie in Beispiel I beschrieben ausgeführt. Ausbeuten an 2-Chinoxalincarbonsäure wurden aus solchen HPLC-Analysen für verschiedene Einstellungen von Versuchsbedingungen (d.h. T1a, T1b, T2a und T2b) bestimmt und diese Ausbeuten werden in nachstehender Tabelle 4 bereitgestellt.
Tabelle 4
Wie durch die Daten von Tabelle 4 erläutert, ergibt der Einschluss des intakten Mikroorganismus, d.h. A. glauca ATCC Nr. 22752 oder A. repens ATCC Nr. 14849 die Oxidation von 2-Methylchinoxalin zu 2-Chinoxalincarbonsäure. Die % des Ausgangsmaterials, d.h. 2-Methylchinoxalin, die in T1a, T1b, T2a und T2b verbleiben, ist etwa 7%, 7%, 6% bzw. 6%.
Beispiel IV
Absuchen hinsichtlich mikrobieuller Umwandlung von 2-Methylchinoxalin zu 2-Chinoxalincarbonsäure Zellen von verschiedenen Mikroorganismen wurden in den Röhrchen, die 2,5 ml Dextrose, Nährmehlmedium, wie in Beispiel I beschrieben, enthalten, wachsen lassen. Einzelne Röhrchen wurden mit Sporen oder vegetativen Zellen (etwa 1% v/v Sporen oder vegetative Zellstammkultur) von verschiedenen Mikroorganismen, gelagert als gefrorene Glycerinsuspensionen, inokuliert bei etwa 29°C unter Rühren (210 U/min) an einem Rotationsschüttler, inkubiert. Nach etwa 48 Stunden wurden 0,05 ml einer 10 mg/ml Lösung von 2-Methylchinoxalin in DMSO zu jedem Röhrchen gegeben. Nach etwa 4 Tagen Inkubation wurde der Inhalt von jedem Röhrchen extrahiert und die einzelnen Extrakte wurden durch HPLC, wie in Beispiel I beschrieben, analysiert.
Die Ausbeuten an 2-Chinoxalincarbonsäure wurden durch HPLC bestimmt und die Ergebnisse werden in Tabelle 5 zusammengefasst.
Tabelle 5

Pilzkultur ATCC Nr. % Ausbeute

A. glauca, 22752 83

A. repens, 14849 83

A. tamarii, 16865 53

A. solani, 11078 53

P. glabrum, 11080 47

D. gossypina, 20575 31

C. echinulata, 8983 25
Beispiel V
Oxidation von 2-Methylchinoxalin in Kolbenkultur unter Verwendung von P. putida ATCC Nr. 33015
Zellen von P. putida ATCC Nr. 33015 wurden in Medium 5 (Nährbrühe (etwa 32 g/l) und Glycerin (etwa 5 g/l)) wachsen lassen. Sechs konische Kolben (300 ml), enthaltend etwa 30 ml Medium, wurden mit etwa 0,10 ml Glycerinsuspension von P. putida ATCC Nr. 33015-Zellen, die vorher bei etwa –70°C gelagert wurden, inokuliert. Nach Zugeben von etwa 2 ml p-Xylol, das in einem etwa konischen 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenrohr enthalten war (Falcon^®, Becton Dickinson Labware), wurden die Kolben mit Parafilm^® (American National Can) verschlossen und (etwa 225 U/min) an einen Rotationsschüttler für etwa 18 Stunden bei etwa 29°C bewegt. Diese Kolbenkulturen hatten eine optische Dichte von etwa 1,9, gemessen bei 650 nm. Die Zellen wurden aus den sechs Kolben durch Zentrifugation gesammelt, einmal mit etwa 250 ml DPBS gewaschen und in etwa 20 ml PBS (Biowhittaker) in einem konischen 300 ml-Kolben resuspendiert.
Die Bioumwandlung wurde durch Zugabe von etwa 0,1 ml etwa einer 100 mg/ml Lösung von 2-Methylchinoxalin in DMSO, entsprechend einer Anfangskonzentration von etwa 0,5 g/l, begonnen. Inkubation wurde für etwa 4 Tage bei etwa 29°C unter Bewegen bei etwa 225 U/min fortgesetzt. Die Proben der Bioumwandlungsbrühe wurden zu verschiedenen Zeiten entfernt und nach Entfernen der Zellen durch Zentrifugation und Verdünnung mit McOH, wie erforderlich, durch HPLC analysiert. Etwa 20 μl von jeder von diesen Proben wurden durch Einspritzen auf eine Inertsil^® HPLC C8-Säule (4,6 × 250 mm) analysiert. Jede Säule wurde bei etwa 1,0 ml/min mit einer mobilen Phase, bestehend aus ACN : etwa 0,05% wässriger TFA (1 : 4 v/v), eluiert. Ausbeuten von 2-Chinoxalincarbonsäure waren etwa 86%, 90% bzw. 94% nach etwa 1, 2 und 4 Tagen Inkubation.
Beispiel VI
Oxidation von 2-Methylchinoxalin in einer Fermenterkultur unter Verwendung von P. putida ATCC Nr.33015
P. putida ATCC Nr. 33015 wurde in einem Fermenter mit etwa 10 1 Medium 5 wachsen lassen. Der Fermenter wurde mit sechs Kulturen P. putida, jeweils in einem konischen Kolben (300 ml), enthaltend etwa 50 ml Medium 5, wachsen lassen, inokuliert. Jede Kolbenkultur wurde mit etwa 175 μl eines Sporenstamms von P. putida ATCC Nr. 33015 inokuliert, wobei ein 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenrohr, enthaltend etwa 2 ml p-Xylol, eingesetzt wurde und der Kolben mit Parafilm° verschlossen wurde. Diese Kolbenkulturen wurden bei etwa 29°C für etwa 27 Stunden unter Schütteln bei etwa 210 U/min inkubiert. Nach Inkubation des Fermenters mit sechs Kolbenkulturen wurde p-Xylol zu dem Fermenter in etwa 2 ml aliquoten Mengen etwa alle 20 Minuten für 2 Stunden zugegeben. Anschließend wurde eine aliquote Menge von etwa 2,5 ml p-Xylol zu dem Fermenter etwa alle 20 Minuten für etwa 3,5 Stunden gegeben. Die Xylol-Zugabe wurde dann unterbrochen und 2-Methylchinoxalin wurde bei etwa 5,25 Stunden (etwa 1,95 g) und etwa 7,75 Stunden (etwa 7,76 g) nach Inokulation zugegeben. Inkubation wurde für etwa 22 Stunden nach der letzten 2-Methylchinoxalin-Zugabe fortgesetzt. Eine Probe des Inkubationsmediums wurde zum Entfernen der Zellen zentrifugiert, mit McOH verdünnt und durch HPLC unter Verwendung des in Beispiel V beschriebenen Verfahrens analysiert. Diese Analyse bestätigte etwa 81% Ausbeute an 2-Chinoxalincarbonsäure.

Claims

Verfahren für die mikrobielle Oxidation von 2-Methylchinoxalin zu 2-Chinoxalincarbonsäure, welches Verfahren das Kontaktieren des 2-Methylchinoxalins mit einem Mikroorganismus und das Inkubieren der dabei gebildeten Mischung unter Bedingungen umfasst, die ausreichen, um eine Menge der 2-Chinoxalincarbonsäure zu bilden, wobei der Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Absidia glauca ATCC Nr. 22752, Absidia glauca ATCC Nr. 74480, Absidia pseudocylindrospora ATCC Nr. 24169, Absidia repens ATCC Nr. 14849, Absidia repens ATCC Nr. 74481, Actinomucor elegans ATCC Nr. 6476, Alternaria solani ATCC Nr. 11078, Aspergillus tamarii ATCC Nr. 16865, Coniophora puteana ATCC Nr. 12675, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 8688b, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 8983, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 9244, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 9245, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 10028b, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 26269, Cunninghamella echinulata RTCC Nr. 31690, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 36112, Cunninghamella homothallica ATCC Nr. 16161, Cylindrocarpon destructans ATCC Nr. 66963, Diplodia gossypina ATCC Nr. 20575, Epicoccum neglectum ATCC Nr. 12723, Glomerella lagenaria ATCC Nr. 14724, Penicillium claviforme ATCC Nr. 10426, Penicillium duclauxii ATCC Nr. 10440, Penicillium glabrum ATCC Nr. 11080, Pseudocochliobolus lunatus ATCC Nr. 24155, Pseudomonas putida ATCC Nr. 33015, Pseudomonas putida ATCC Nr. 202190, Rhodococcus rhodochrous ATCC Nr. 19067 und Thamnostylum piriforme ATCC Nr. 8686 und geeigneten Mutanten derselben besteht, unter der Voraussetzung, dass, wenn es sich bei dem Mikroorganismus um Pseudomonas putida ATCC Nr. 33015 oder Pseudomonas putida ATCC Nr. 202190 handelt, die Pseudomonas putida ATCC Nr. 33015 oder die Pseudomonas putida ATCC Nr. 202190 durch Wechselwirkung mit einem Induktor vor dem Kontaktieren der Pseudomonas putida ATCC Nr. 33015 oder der Pseudomonas putida ATCC Nr. 202190 mit dem 2-Methylchinoxalin induziert wird.
Verfahren wie in Anspruch 1 definiert, das des Weiteren das Isolieren der 2-Chinoxalincarbonsäure umfasst.
Verfahren wie in Anspruch 2 definiert, wobei das Isolieren durch Extrahieren der Mischung mit einem organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
Verfahren wie in Anspruch 3 definiert, wobei es sich bei dem organischen Lösungsmittel um Ethylacetat handelt.
Verfahren wie in Anspruch 4 definiert, das des Weiteren das Unterwerfen der Extraktion einer chromatographischen Untersuchung umfasst.
Verfahren wie in Anspruch 2 definiert, wobei das Isolieren durch Adsorption der 2-Chinoxalincarbonsäure aus der Mischung auf ein Harz und Eluieren der adsorbierten 2-Chinoxalincarbonsäure aus dem Harz mit einem organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
Verfahren wie in Anspruch 6 definiert, wobei es sich bei dem Harz um ein polymeres, adsorptionsfähiges Harz handelt.
Verfahren wie in Anspruch 7 definiert, wobei es sich bei dem organischen Lösungsmittel um Ethylacetat oder Methanol handelt.
Verfahren wie in Anspruch 8 definiert, das des Weiteren das Kristallisieren der eluierten 2-Chinoxalincarbonsäure aus Ethylacetat umfasst.
Verfahren wie in Anspruch 8 definiert, das des Weiteren das Kristallisieren der eluierten 2-Chinoxalincarbonsäure aus Ethylacetat und Methanol umfasst.
Verfahren wie in Anspruch 1 definiert, wobei der Mikroorganismus ein intakter Mikroorganismus ist.
Verfahren wie in Anspruch 11 definiert, wobei der Mikroorganismus gewaschene Zellen des Mikroorganismus umfasst.
Verfahren wie in Anspruch 12 definiert, das des Weiteren das Immobilisieren der gewaschenen Zellen umfasst.
Verfahren wie in Anspruch 12 definiert, wobei die gewaschenen Zellen sich in einem wässrigen Lösungsmittel befinden.
Verfahren wie in Anspruch 14 definiert, wobei das Kontaktieren durch Zusatz des 2-Methylchinoxalins zu dem Lösungsmittel erfolgt.
Verfahren wie in Anspruch 11 definiert, wobei der Mikroorganismus sich in einem Wachstumsmedium befindet.
Verfahren wie in Anspruch 16 definiert, wobei das Kontaktieren durch Zusatz des 2-Methylchinoxalins zum Wachstumsmedium erfolgt.
Verfahren wie in Anspruch 1 definiert, wobei der Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus der Absidia glauca ATCC Nr. 22752, Absidia glauca ATCC Nr. 74480, Absidia repens ATCC Nr. 14849, Absidia repens ATCC Nr. 74481, Alternaria solani ATCC Nr. 11078, Aspergillus tamarii ATCC Nr. 16865, Cunninghamella echinulata ATCC Nr. 8983 und Diplodia gossypina ATCC Nr. 20575 und den Mutanten derselben.
Verfahren wie in Anspruch 18 definiert, wobei der Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus der Absidia glauca ATCC Nr. 22752, Absidia glauca ATCC Nr. 74480, Absidia repens ATCC Nr. 14849, Absidia repens ATCC Nr. 74481, Alternaria solani ATCC Nr. 11078 und Aspergillus tamarii ATCC Nr. 16865 und den Mutanten derselben.
Verfahren wie in Anspruch 19 definiert, wobei der Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus der Absidia glauca ATCC Nr. 22752, Absidia glauca ATCC Nr. 74480, Absidia repens ATCC Nr. 14849 und Absidia repens ATCC Nr. 74481 und den Mutanten derselben.
Verfahren wie in Anspruch 20 definiert, wobei es sich, bei dem Mikroorganismus um Absidia repens ATCC Nr. 14849 oder Absidia repens ATCC Nr. 74481 handelt.
Verfahren für die mikrobielle Oxidation von 2-Methylchinoxalin zu 2-Chinoxalincarbonsäure, welches Verfahren das Kontaktieren des 2-Methylchinoxalins mit einem Mikroorganismus und das Inkubieren der dabei gebildeten Mischung unter Bedingungen umfasst, die ausreichen, um eine Menge der 2-Chinoxalincarbonsäure zu bilden, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um Absidia repens ATCC Nr. 14849 oder Absidia repens ATCC Nr. 74481 und geeignete Mutanten derselben handelt.
Verfahren wie in Anspruch 22 definiert, wobei der Mikroorganismus sich in einem Wachstumsmedium befindet.
Verfahren wie in Anspruch 23 definiert, wobei das Kontaktieren durch Zusatz von 2-Methylchinoxalin zum Wachstumsmedium erfolgt.
Verfahren wie in Anspruch 1 definiert, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um Pseudomonas putida ATCC Nr. 33015 oder Pseudomonas putida ATCC Nr. 202190 handelt.
Verfahren wie in Anspruch 25 definiert, wobei es sich bei dem Induktor um p-Xylol handelt.
Verfahren wie in Anspruch 26 definiert, wobei sich die Pseudomonas putida ATCC Nr. 33015 oder die Pseudomonas putida ATCC Nr. 202190 in einem Wachstumsmedium befindet.
Verfahren wie in Anspruch 27 definiert, wobei das p-Xylol dem Wachstumsmedium zugegeben wird.
Verfahren wie in Anspruch 28 definiert, wobei sich das Wachstumsmedium in einem Kolben befindet.
Verfahren wie in Anspruch 29 definiert, das den Schritt des Einsammelns des Mikroorganismus nach Beendingung der Induktion umfasst.
Verfahren wie in Anspruch 30 definiert, wobei das Einsammeln durch Zentrifugieren des Inhalts des Kolbens, Dekantieren der Flüssigkeit, Waschen des Zellgranulats und erneutes Suspendieren des Granulats in einem Puffermittel erfolgt.
Verfahren wie in Anspruch 31 definiert, wobei das Kontaktieren durch Zusatz des 2-Methylchinoxalins zu dem Puffermittel auf das wiederholte Suspendieren hin erfolgt.
Verfahren wie in Anspruch 28 definiert, wobei sich das Wachstumsmedium in einem Fermentor befindet.
Verfahren wie in Anspruch 33 definiert, wobei der Zusatz des p-Xylols zu dem Wachstumsmedium nach der Induktion abgebrochen wird.
Verfahren wie in Anspruch 34 definiert, wobei das Kontaktieren durch Zusatz des 2-Methylchinoxalins zu dem Wachstumsmedium auf das Abbrechen des p-Xylolzusatzes hin erfolgt.
Verfahren für die mikrobielle Oxidation von 2-Methylchinoxalin zu 2-Chinoxalincarbonsäure, welches Verfahren das Kontaktieren des 2-Methylchinoxalins mit einem Mikroorganismus umfasst, nachdem die Enzyme des Mikroorganismus durch Wechselwirkung mit einem Induktor induziert und die dabei gebildete Mischung unter Bedingungen inkubiert worden ist, die ausreichen, um eine Menge der 2-Chinoxalincarbonsäure zu bilden, wobei der Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Pseudomonas putida ATCC Nr. 33015 und Pseudomonas putida ATCC Nr. 202190 oder geeigneten Mutanten derselben.
Verfahren wie in Anspruch 36 definiert, wobei es sich bei dem Induktor um p-Xylol oder m-Xylol handelt.