DE60006487T2 - Erhöhung von zirkulierenden plättchen mit thrombopoietinzusammensetzungen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Regierung besitzt aufgrund des Zuschusses mit der Nummer RO1 HL56416, RO1 HL54037 und PO1 HL53586 von dem National Heart, Lung, and Blood Institute und U.S. Navy Contract N00014-96-C-0120 Rechte an der vorliegenden Erfindung.
  • 1. Bereich der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von Thrombopoietin für die Behandlung eines Patienten, der eine Thrombozytopenie oder ein Risiko dafür aufweist.
  • 2. Beschreibung des verwandten Stands der Technik
  • Die Thrombozytopenie ist ein wichtiges klinisches Problem bei der Handhabung von Patienten in hämatologischen und onkologischen Behandlungen. Insbesondere ist die Myelosuppression eine der schwerwiegendsten Komplikationen bei Krebspatienten, die eine zytotoxische Behandlung erhalten. Die Thrombozytopenie ist in erster Linie durch Blutplättchentransfusion und Modifikation der chemotherapeutischen Dosis behandelt worden. In den Vereinigten Staaten ist die Verwendung von Blutplättchentransfusionen, um schwere Thrombozytopenie zu behandeln, beständig angestiegen. Ungefähr 4 Millionen Einheiten wurden in 1982 übertragen und mehr als 8 Millionen Einheiten wurden in 1992 übertragen (Surgenor et al. 1990; Wallace et al. 1992). Die Verwendung von Blutplättchen aus Einzelspenderapherese hat sich in erster Linie aufgrund von Sorgen, die mit dem möglichen Risiko der Übertragung infektiöser Mittel und der Alloimmunisierung verbunden sind, nahezu versechsfacht (Heymann und Schiffer, 1990, Schiffer 1997). Diese deutliche Steigerung des Bedürfnisses nach Blutplättchen verlief parallel zu Fortschritten bei der Organtransplantation, der Knochenmarkstransplantation, der Herzchirurgie und der Verwendung der Hochdosistherapie bei der Behandlung chemosensitiver bösartiger Zustände. Während die Blutplättchentransfusion das Risiko für Blutungskomplikationen verringern kann, kann ihre wiederholte Verwendung das Risiko für Transfusionsreaktionen, eine Alloimmunisierung und die Transmission von infektiösen Mitteln erhöhen und zu erhöhten Kosten im Gesundheitswesens beitragen (Heymann und Schiffer, 1990). Die gewaltige Erhöhung des Bedürfnisses nach Blutplättchen hat den Patienten, dem Gesundheitssystem und den Blutbankquellen eine chronische Last auferlegt und hat eine Suche nach verbesserten Verfahren für die Gewinnung, Behandlung und Lagerung der Blutplättchen und nach neuen Mitteln, um die Erzeugung von Blutplättchen zu stimulieren, ausgelöst.
  • Im Verlaufe des letzten Jahrzehnts hat die Erkenntnis, daß myeloide Wachstumsfaktoren die Produktion von Neutrophilen (G-CSF und GM-CSF) und von Erythrozyten (Erythropoetin) kontrollieren, zu der klinischen Anwendung dieser Faktoren bei der Behandlung von Patienten mit Krebs, die sich einer myelosuppresiven Therapie unterziehen, geführt (Nemunaitis et al., 1992; Crawford et al., 1991; Vose et al., 1991; Am. Soc. of Clin. Oncol., 1994). Die Verwendung myeloider Wachstumsfaktoren, wie Granulozyten Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF = "granulocyte-colony-stimulating factor") und Granulozyten-Markophagen koloniestimulierender Faktor (GM-CSF = "granulacyte-macrophage colony-stimulating factor") hat die Häufigkeit der fiebrigen Neutropenie verringert (Crawford et al., 1991; Neumunaitis et al., 1991). Mehrere Zytokine mit thrombopoetischen Potential, die Interleukin-1, Interleukin-3, Interleukin-6, Interleukin-11 und PIXY321 umfassen (Smith et al., 1992; Vadhan-Raj et al. 1994; D'Hondt et al., 1993; Weber et al., 1993; Tepler et al., 1996; Vadhan-Raj et al., 1994), sind einer klinischen Evaluierung unterzogen worden. Die klinische Entwicklung einer Anzahl dieser Mittel ist durch ihre mäßige thrombopoetische Aktivität und/oder ein Toxizitätsprofil, das für ein unterstützendes Mittel unvorteilhaft ist, beschränkt worden. IL-11 ist das einzige thrombopoetische Zytokin, das bis heute zur klinischen Verwendung zugelassen worden ist. In einer randomisierten Placebo-kontrollierten Studie wurde gezeigt, daß IL-11 (50 μg/kg) als sekundäre Prophylaxe die Wahrscheinlichkeit einer Blutplättchentransfusion in 30% (8 von 27) der Patienten verringt (im Vergleich zu 4% bei Placebo) denen bereits Blutplättchen gegen eine Thrombozytopenie (≤ 20000/mm3), die sich aus verschiedenen Chemotherapieschemata ergab, transfundiert worden sind. Obwohl die Dauer der Thrombozytopenie reduziert war, war dies statistisch nicht signifikant. Die für IL-11 berichteten deutlichen Nebenwirkungen umfaßten Herzvorhofarrythmien, Synkopen, Dyspnoe und Ödem.
  • Das Thrombopoietin, der Ligand für den c-Mpl-Rezeptor (der auf Blutplättchen- und Megakaryozytenvorläuferzellen gefunden wird), wurde durch mehrere Forscher kloniert und für ihn wurde gezeigt, daß er einer der Hauptregulatoren der Blutplättchenfunktion in vivo ist (de Sauvage et al., 1994; Bartley et al., 1994; Lok et al., 1994; Kaushansky et al., 1994; Wendling et al., 1994). TPO ist ein Wachstumsfaktor, der direkt auf frühe Knochenmarksstammzellen und Megakaryozytenvorläuferzellen wirkt (de Sauvage et al., 1994; Lok et al., 1994; Kaushansky et al., 1994; Wendling et al., 1994; Bartley et al., 1994; Kuter und Rosenberg, 1994; Souyri et al., 1990). TPO induziert die Proliferation und die Differenzierung, um eine erhöhte Anzahl reifer Megakaryozyten zu erzeugen was zu einer erhöhten Anzahl von Blut plättchen im Blutkreislauf führt. An der Wirkung des TPOs auf die Proliferation und Differenzierung scheint die JAK/STAT-Familie der intrazellulären Signalmoleküle (Gruney et al., 1995) beteiligt zu sein.
  • In prä-klinischen Studien, die in normalen Mäusen und nichtmenschlichen Primaten durch geführt wurden, erhöhte Thrombopoietin die Blutplättchenzahl auf Mengen, die höher waren als die, die zuvor mit anderen Thrombopoietinzytokinen erreicht wurden (Kaushansky, 1995; Farese et al., 1995). Darüber hinaus verringerte rekombinantes Thrombopoietin, das als einzelne Dosis gegeben wurde, in einem Mausmodell der Myelosuppression den Tiefpunkt, und beschleunigte die Blutplättchenerholung in Mäusen, die durch nicht-letale Bestrahlung und Chemotherapie panzytopenisch gemacht worden waren (Thomas et al., 1996). In diesen Studien führte eine verlängere Behandlung (für bis zu 8 Tagen) zu keiner weiteren Verbesserung und war mit einer deutlichen Thrombozytose während der Erholungsphase assoziiert.
  • Frühe Ergebnisse von Versuchen, die Thrombopoietin verwenden (Vadhan-Raj et al., 1996), sowie eine Polyethylglycol-konjugierte Form des Moleküls (Fanucchi et al., 1997; Levin, 1997) zeigten eine klinische Aktivität. rhTPO hatte eine verlängerte Halbwertzeit (20 bis 30 h) mit einer verzögerten Antwortspitze (Durchschnittstag 12) (Vadhan-Raj et al., 1997; Bloedow et al., 1996). Frühere klinische Studien zeigen, daß die Verabreichung von beiden Molekülen voller Länge (rekombinantes humanes Thrombopoietin [rhTPO] genannt) oder die trunkierte, pegylierte Version des Moleküls (Megakaryozytenwachstums und Entwicklungsfaktor [PEG-rHuMGDF] genannt) zu einer Dosis-abhängigen Erhöhung der zirkulierenden Blutplättchenzahl vor der Chemotherapie führte und die Blutplättchenerholung auf den Grundwert nach myelosuppressiven Behandlungsschemata mittlerer Stärke verbesserte (Fanucchi et al., 1997; Vadhan-Raj et al., 1997; O'Malley et al., 1996; Basser et al., 1997; Suzuki et al. 1995). Vorherige Studien mit Wachstumsfaktoren deuten jedoch auf die entscheidende Bedeutung des Zeitpunkts der Wachstumsfaktorverabreichung im Hinblick auf die Chemotherapie hin, um den maximalen klinischen Nutzen zu erreichen (Vadhan-Raj et al., 1992; Neidhart et al., 1992; Crawford et al., 1992). Der Wert dieser Mittel bei der Verhinderung schwerer Thrombozytopenie und dem Vermeiden der Notwendigkeit für Blutplättchentransfusionen ist nicht bewiesen worden.
  • Die Transfusion autologer Blutplättchen kann viele Probleme beseitigen, die die Alloimmunisierung, das Risiko der Transmission infektiöser Agenzien und den chronischen Versor gungsmangel in Blutbanken umfassen. Die bisherige Erfahrung mit Blutplättchenapherese normaler Spender deutet darauf hin, daß die intensive mehrfache Einheit Blutplättchenapherese ein sicheres und praktikables Mittel für den Erhalt einer großen Anzahl von Blutplättchen für die Transfusion ist (Schiffer et al., 1996; Schiffer et al., 1976; Schiffer et al., 1974). Gemäß bestehenden Praktiken in Blutbanken können Blutplättchen aufgrund des möglichen Risikos einer bakteriellen Kontamination nur für 5 Tage bei 22°C aufbewahrt werden (Lazarus et al., 1982; Murphy, 1985; Owens et al., 1992). Alternativ können gespendete Blutplättchen Kälte konserviert werden, um eine längere Lagerzeit zu erreichen. Unglücklicher Weise sind die gegenwärtig zugelassenen Verfahren für die Blutplättchenkältekonservierung arbeitsintensiv und erfordern eine hohe Konzentration des Kälteschutzmittels DSMO (5 bis 6%). Des weiteren führt die Kältekonservierung von Blutplättchen durch dieses Verfahren zu einer Verringerung der Zellzahl und der funktionellen Aktivität (Daly et al., 1997; Balduini et al., 1993; Bock et al., 1995; Towell et al., 1986). Die Wiedergewinnung von Blutplättchen nach einer Einfrier-Auftau-Prozedur liegt typischer Weise bei 50 bis 70%. Nach der Transfusion dieser Blutplättchen verringert sich die Wiedergewinnung auf 20 bis 30% der ursprünglichen Blutplättchenanzahl. Zusätzlich zeigen die Kälte-konservierten Blutplättchen eine erhöhte Expression des Aktivierungsmarkers CD-62 und eine deutliche Verringerung der funktionellen Parameter. Diese nachteiligen Wirkungen der Kältekonservierung auf die Blutplättchen werden durch die Induktion von Vorratsschäden ausgelöst, von denen vermutete wird, daß sie sich aus der biochemischen Aktivierung der Blutplättchen über sekundäre Signaltransduktionswege ergeben. ThromboSol ist eine neu entwickelte Blutplättchenaufbewahrungslösung, die aus ausgewählten Effektoren der sekundären Signaltransduktionswege besteht, die spezifische Aktivierungssignalwege inhibieren, die den Blutplättchen endogen sind, was zu Zellen führt, die biochemisch stabilisiert sind und gegen Kältelagerungsschäden geschützt sind.
  • Aufgrund des Konzepts, daß eine erhöhte Dosis-Intensität möglicherweise wichtig ist, um das Gesamtergebnis zu verbessern, gab es die Verwendung einer aggressiveren Therapie bei einer bösartigen Chemotherapie-sensitiven Erkrankung. Diese Erwägungen haben zu einer Suche nach Mitteln oder Verfahren geführt, die die Thrombozytopenie verlangsamen und das Bedürfnis nach Blutplättchentransfusionen verringern können. Zusätzlich wären Mittel und Verfahren, die die Blutplättchenproduktion erhöhen und eine bessere Lagerung der Blutplättchen für Transfusionen erlauben, ein wichtiger Fortschritt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Offenbarung räumt diese und andere Nachteile, die dem Stand der Technik inne wohnen dadurch aus, daß sie neue Verwendungen von Thrombopoietin (TPO), auch als MGDF, mpI-Ligand und Megapoietin bekannt, für die Herstellung eines Medikaments für die Förderung der Blutplättchenproduktion in einem Tier zur Verfügung stellt. Diese Verwendungen von TPO können auch verwendet werden, um die Blutplättchenverringerung in einem Tier aufgrund eines Mittels, das die Thrombozytopenie auslöst oder verstärkt, zu lindern.
  • Die Erfindung stellt als nächstes eine Zusammensetzung die TPO umfaßt, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers, das eine Thrombozytopenie aufweist oder ein Risiko dafür besitzt, zur Verfügung, wobei die Behandlung, die Verabreichung eines Mittels, das Thrombozytopenie auslösen kann, an ein Säugetier, das Verabreichen von einem oder mehreren vorbereiteten Dosen einer Zusammensetzung, die TPO umfaßt, vor der Verabreichung des Mittels an das Säugetier und das Verabreichen von einem oder zwei anschließenden Dosen einer TPO-Zusammensetzung nach der Verabreichung des Mittels an das Säugetier, umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die vorbereitenden oder anschließenden Dosen nicht täglich verabreicht. Für bestimmte Ausführungsformen kann "nicht-täglich" etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa, 5 etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9 bis etwa 10 oder mehr Tage zwischen den Verabreichungen einer Zusammensetzung, die TPO umfaßt, bedeuten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Dosen jeden zweiten Tag verabreicht. Mehrere Dosen des TPO's können verabreicht werden sowie der Patient eine Thrombozytopenie aufweist oder ein Risiko dafür besitzt. Wie hierin verwendet bedeuten bestimmte Ausführungsformen des "Aufweisens einer Thrombozytopenie", daß das Tier weniger als etwa 100 000 Blutplättchen/μl Blut aufweist. Als solches würde es im Rahmen dieser Definition verstanden werden, daß ein Tier, das etwa 95 000, etwa 90 000, etwa 85 000, etwa 80 000, etwa 75 000, etwa 70 000, etwa 65 000, etwa 60 000, etwa 55 000, etwa 50 000, etwa 45 000, 40 000, etwa 35 000, etwa 30 000, 25 000, etwa 20 000, 15 000, etwa 10 000, etwa 5 000 bis etwa 10 000 Blutplättchen/μl Blut oder weniger aufweist, auch eine Thrombozytopenie aufweisen würde. Natürlich würde ein Fachmann im Lichte dieser Definition und der hierin zur Verfügung gestellten Offenbarungen in der Lage sein, ein Tier als Thrombozytopenie aufweisend zu diagnostizieren, obwohl die absoluten Zahlen der Blutplättchen/μl von den hier aufgeführten Werten variieren. Wie hierin in bestimmten Ausführungsformen verwendet bedeutet „ein Risiko für Thrombozytopenie aufweisen", daß für ein Tier vorhersagbar erwartet wird, das es eine Thrombozytopenie aufgrund eines Erkrankungszustandes, einer Behandlung oder einer Aussetzung gegenüber einem Mittel, von dem bekannt ist oder für das vermutet wird, das es die Anzahl der Blutplättchen/μl Blut eines Tieres verringert, entwickelt. Es wird erwogen, daß ein Patient Dosen, die TPO umfassen, während längerer Zeiträume der Thrombozytopenie oder der erwarteten Thrombozytopenie erhält. Akute Phasen können Stunden, Tage und/oder Wochen andauern. Es wird auch erwogen, daß ein Patient TPO Dosen in nahezu dauerhafter Form erhält, wenn die Thrombozytopenie oder das Risiko für eine Thrombozytopenie chronisch ist. Diese chronische Periode kann Monate oder Jahre dauern und TPO kann periodisch, wie benötigt, verabreicht werden, um einen Zustand der Thrombozytopenie zu verringern. Ein Fachmann wäre in der Lage die Notwendigkeit für die Verabreichung einer Zusammensetzung, die TPO umfaßt, über ausgedehnte nahezu ständige Zeiträume beruhend auf der Schwere und dem Andauern eines Zustandes, einer Erkrankung oder des Risikos einer Aussetzung gegenüber einem Mittel, das Thrombozytopenie auslöst, verschlimmert oder verstärkt oder die Antwort eines Tieres auf die Verfahren der Erfindung in der Behandlung der Thrombozytopenie, zu bestimmen. Daher können mindestens etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9, etwa 10, etwa 11, etwa 12, etwa 13, etwa 14, etwa 15, etwa 16, etwa 17, etwa 18, etwa 19, etwa 20, etwa 21, etwa 22, etwa 23, etwa 23, etwa 24, etwa 25, etwa 26, etwa 27, etwa 28, etwa 29, etwa 30, etwa 31, etwa 32, etwa 33, etwa 34, etwa 35, etwa 40, etwa 45, etwa 50, etwa 55, etwa 60, etwa 65, etwa 70, etwa 75, etwa 80, etwa 85, etwa 90, etwa 95, etwa 100, etwa 110, etwa 120, etwa 130, etwa 140, etwa 150, etwa 160, etwa 170, etwa 180, etwa 190, etwa 200, etwa 210, etwa 220, etwa 230, etwa 240, etwa 250 bis 300 oder mehr Dosen, die TPO umfassen, in dem Verfahren der Erfindung verabreicht werden. Bevorzugte Dosen für Zustände, die zyklische Thrombozytopenie, chronische Myelodysplasie, aplastische Anämie oder Knochenmarkerkrankungen umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind, wären etwa 10 bis etwa 150 Dosen einer Zusammensetzung, die TPO umfaßt, und natürlich alle Zahlen zwischen diesen wie oben beschrieben. Es wird jedoch erwogen, daß für viele Anwendungen wie für einen Chemotherapie- oder Bestrahlungstherapiezyklus die Gesamtzahl der Dosen des zu verabreichenden TPO's vorzugsweise weniger als etwa 20 Dosen beträgt. Die Dosen können an einem Patienten verabreicht werden, bis die erholte Blutplättchenzahl etwa 50 000 Blutplättchen/μl Blut oder größer beträgt, bevor die Verabreichung der TPO-Dosen unterbrochen wird. Ein geschulter Kliniker würde jedoch verstehen, daß TPO verabreicht werden könnte bis die Blutplättchenzahl des Säugetiers etwa 55 000, etwa 60 000, etwa 65 000, etwa 70 000, etwa 75 000, etwa 80 000, etwa 85 000, etwa 90 000, etwa 95 000 bis etwa 100 000 Blutplättchen/μl Blut oder so ungefähr beträgt, bevor die Verabreichung der TPO-Dosen unterbrochen wird. Natürlich ist ein Fachmann im Lichte der Beschreibung und der hierin enthaltenden Offenbarung in der Lage für ein Tier zu diagnostizieren, daß es erhöhte Zustände der Thrombozytopenie aufweist, so daß die absolute Anzahl der Blutplättchen/μl von den angeführten Werten abweicht, wenn die Entscheidung über die Nichtfortsetzung der Verabreichung des TPO's gemacht wird. Zusätzlich sollte TPO wieder verabreicht werden, sollte der Patient eine Thrombozytopenie entwickeln insbesondere wenn die Blutplättchenzahlen des Säugetiers unter 50 000 Blutplättchen/μl Blut oder so abfallen oder wenn für das Säugetier in andere Weise nachgewiesen wird, das es eine Thrombozytopenie aufweist. Ein Fachmann wird erkennen, daß eine geringere Menge des verabreichten TPO's in jeder Dosis bevorzugt wäre, da die Gesamtzahl der aufeinanderfolgenden Dosen ansteigt. Die Anpassung der Dosismengen, um einen optimalen Effekt auf die Blutplättchenmengen in einem Patienten zu erhalten, wäre im Lichte der vorliegenden Offenbarung eine Routinesache. Es wäre bevorzugt, daß die Dosen anders als täglich verabreicht werden. In anderen Ausführungsformen werden die Dosen an jedem zweiten Tag verabreicht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel ein Chemotherapiemittel oder eine Bestrahlungstherapie. In dieser Ausführungsform wird erwartet, daß die Aussetzung gegenüber dem Mittel einen akuten Zeitraum der Thrombozytopenie erzeugen wird. Es wird erwogen das mindestens etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5 bis etwa 6 oder mehr vorbereitende Dosen verabreicht werden. In einem Aspekt der Erfindung werden mindestens etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9, etwa 10 Dosen, etwa 11 Dosen bis etwa 12 Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Vorbereitungsdosen nicht täglich verabreicht. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Dosen an jedem zweiten Tag verabreicht.
  • In einem bevorzugten Aspekt kann die Gesamtzahl der vorbereitenden oder Vordosen etwa 3 bis etwa 6 Dosen betragen. In einem bevorzugten Aspekt wäre die Gesamtzahl der anschließenden Dosen etwa 4 bis etwa 8 Dosen. In einem anderen bevorzugten Aspekt, wenn sowohl Vor- und anschließende Dosen verabreicht werden, wäre die Gesamtzahl der Dosen etwa 4 bis etwa 10 Dosen. Wie hierin verwendet, wenn nicht als Vor- oder Vorbereitungsdosis gekennzeichnet, kann "Dosen" von TPO sich auf Vor- oder anschließende Dosen beziehen.
  • Die Erfindung stellt des weiteren eine Zusammensetzung, die TPO umfaßt, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers zur Verfügung, das eine Thrombo zytopenie aufweist oder ein Risiko dafür besitzt, wobei die Behandlung die Verabreichung eines Mittels, das eine Thrombozytopenie mit einem frühen Tiefpunkt auslöst und die Verabreichung von einer oder mehreren vorbereitenden Dosen einer Zusammensetzung, die TPO umfaßt, vor der Verabreichung des Mittels umfaßt. In einem Aspekt der Erfindung können die vorbereitenden Dosen etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5 und bis zu etwa 6 oder mehr vorbereitende Dosen, der zu verabreichenden TPO-Zusammensetzung, betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die vorbereitenden Dosen nicht täglich verabreicht. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Dosen an jedem zweiten Tag verabreicht.
  • Es ist die Verwendung einer Zusammensetzung, die TPO umfaßt zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Menschen, der Thrombozytopenie oder ein Risiko dafür aufweist, wobei die Behandlung die Schritte umfaßt:
    • (a) Verabreichung eines Mittels, das Thrombozytopenie verursachen kann, an einen Menschen; und
    • (b) Verabreichung an den Menschen von 2 oder mehr Anschluß-Dosen einer Zusammensetzung, die TPO umfaßt, nach der Verabreichung des Mittel, wobei die Anschluß-Dosen nicht täglich verabreicht werden, wobei die Anschluß-Dosen zwischen etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 9, etwa 10, etwa 11, etwa 12, etwa 13, etwa 14 bis etwa 15 Dosen betragen können. Alternativ können TPO-Dosen nach der Chemotherapie verabreicht werden bis die Erholung (nach dem Tiefpunkt) der Blutplättchenzahl etwa 50.000 bis etwa 100.000 pro μl Blut vor der Unterbrechung der Verabreichung der TPO-Dosen beträgt. Das TPO sollte wieder verabreicht werden, falls die Blutplättchenzahl des Patienten unter etwa 50.000 pro μl Blut fällt oder wenn das Tier Thrombozytopenie, wie sie durch einen Fachmann im Lichte der vorliegenden Erfindung verstanden würde, entwickelt. In einem bevorzugten Aspekt werden die Dosen nicht täglich verabreicht. In einem anderen bevorzugten Aspekt werden die Dosen an jedem zweiten Tag verabreicht.
  • In bestimmten Aspekten des Verfahrens der Offenbarung, die in den obigen Abschnitten beschrieben wurde, kann das Mittel im wesentlichen gleichzeitig (d. h. innerhalb von weniger als etwa 1 Minute) mit der Verabreichung der Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht werden. In anderen Aspekten kann das Mittel innerhalb von etwa 1 Minute, etwa 5 Minuten, etwa 10 Minuten, etwa 20 Minuten, etwa 30 Minuten, etwa 45 Minuten, etwa 60 Minuten, etwa 2 Stunden, etwa 3 Stunden, etwa 4 Stunden, etwa 5 Stunden, etwa 6 Stunden, etwa 7 Stunden, etwa 8 Stunden, etwa 9 Stunden, etwa 10 Stunden, etwa 11 Stunden, etwa 12 Stunden, etwa 13 Stunden, etwa 14 Stunden, etwa 15 Stunden, etwa 16 Stunden, etwa 17 Stunden, etwa 18 Stunden, etwa 19 Stunden, etwa 20 Stunden, etwa 21 Stunden, etwa 22 Stunden, etwa 22 Stunden, etwa 23 Stunden, etwa 24 Stunden, etwa 25 Stunden, etwa 26 Stunden, etwa 27 Stunden, etwa 28 Stunden, etwa 29 Stunden, etwa 30 Stunden, etwa 31 Stunden, etwa 32 Stunden, etwa 33 Stunden, etwa 34 Stunden, etwa 35 Stunden, etwa 36 Stunden, etwa 37 Stunden, etwa 38 Stunden, etwa 39 Stunden, etwa 40 Stunden, etwa 41 Stunden, etwa 42 Stunden, etwa 43 Stunden, etwa 44 Stunden, etwa 45 Stunden, etwa 46 Stunden, etwa 47 Stunden, etwa 48 Stunden, etwa 49 Stunden, etwa 50 Stunden, etwa 51 Stunden, etwa 52 Stunden, etwa 53 Stunden, etwa 54 Stunden, etwa 55 Stunden, etwa 56 Stunden, etwa 57 Stunden, etwa 58 Stunden, etwa 59 Stunden, etwa 60 Stunden, etwa 61 Stunden, etwa 62 Stunden, etwa 63 Stunden, etwa 64 Stunden, etwa 65 Stunden, etwa 66 Stunden, etwa 67 Stunden, etwa 68 Stunden, etwa 69 Stunden, etwa 70 Stunden, etwa 71 Stunden, etwa 72 Stunden, etwa 73 Stunden, etwa 74 Stunden, etwa 75 Stunden, etwa 76 Stunden, etwa 77 Stunden, etwa 78 Stunden, etwa 79 Stunden, etwa 80 Stunden, etwa 81 Stunden, etwa 82 Stunden, etwa 83 Stunden, etwa 84 Stunden, etwa 85 Stunden, etwa 86 Stunden, etwa 87 Stunden, etwa 88 Stunden, etwa 89 Stunden, etwa 90 Stunden, etwa 91 Stunden, etwa 92 Stunden, etwa 93 Stunden, etwa 94 Stunden, etwa 95 Stunden, etwa 96 Stunden, etwa 97 Stunden, etwa 98 Stunden, etwa 99 Stunden bis zu etwa 100 Stunden oder mehr vor oder nach der Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht werden. In bestimmten Ausführungsformen kann das Mittel innerhalb oder von etwa 1 Tag, etwa 2 Tagen, etwa 3 Tagen, etwa 4 Tagen, etwa 5 Tagen, etwa 6 Tagen, etwa 7 Tagen, etwa 8 Tagen, etwa 9 Tagen, etwa 10 Tagen, etwa 11 Tagen, etwa 12 Tagen, etwa 13 Tagen, etwa 14 Tagen, etwa 15 Tagen, etwa 16 Tagen, etwa 17 Tagen, etwa 18 Tagen, etwa 19 Tagen bis etwa 20 Tagen, bis zu etwa 21 Tagen vor der Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht werden. In bestimmten anderen Ausführungsformen kann das Mittel innerhalb von etwa 1 Tag, etwa 2 Tagen, etwa 3 Tagen, etwa 4 Tagen, etwa 5 Tagen, etwa 6 Tagen, etwa 7 Tagen, etwa 8 Tagen, etwa 9 Tagen bis etwa 10 Tagen nach der Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht werden. In einigen Ausführungsformen wird dem Säugetier mehr als eine therapeutische Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht. In anderen Ausführungsformen wird eine therapeutische Zusammensetzung als eine einzelne Dosis, die TPO umfaßt, verabreicht. In anderen Ausführungsformen wird mehr als eine Dosis einer therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht.
  • In bestimmten Aspekten der Erfindung wird jede Dosis von etwa 24 bis etwa 72 Stunden nach der vorhergehenden Dosis, die TPO umfaßt, verabreicht. In einigen Ausführungsformen wird jede Dosis von etwa 36 bis etwa 60 Stunden nach der vorhergehenden Dosis, die TPO umfaßt, verabreicht. In einigen Ausführungsformen wird jede Dosis, die verabreicht wird etwa 42 bis etwa 54 Stunden nach der vorhergehenden Dosis, die TPO umfaßt, verabreicht. In einigen Ausführungsformen wird jede Dosis etwa 48 Stunden nach einer vorhergehenden Dosis, die TPO umfaßt, verabreicht. In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird jede Dosis etwa jeden zweiten Tag nach der vorhergehenden Dosis, die TPO umfaßt, verabreicht. In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird jede Dosis nicht täglich nach der vorhergehenden Dosis, die TPO umfaßt, verabreicht. Der Fachmann wird erkennen, daß das Dosierungsschema variieren kann, um die verschiedenen oben beschriebenen Aspekte bei der Bestimmung des Zeitpunkts der Verabreichung zu kombinieren. Beispielsweise kann eine zweite Dosis etwa 36 bis etwa 60 Stunden nach der vorhergehenden Dosis verabreicht werden und eine anschließende Dosis kann etwa 48 Stunden nach der zweiten Dosis verabreicht werden. Solche Veränderungen werden von der vorliegenden Erfindung umfaßt wie sie von einem Fachmann im Lichte der hierin zur Verfügung gestellten Offenbarung ausgeführt wurden.
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung tritt der Tiefpunkt oder der tiefste Punkt der Blutplättchenzahl nach der Behandlung mit einem Mittel relative früh oder von etwa 7, etwa 8, etwa 9, etwa 10, etwa 12, etwa 13 bis etwa 14 Tagen auf. In bestimmten Ausführungsformen tritt der Tiefpunkt der Blutplättchenzahl bei etwa 10 bis etwa 14 Tagen auf, wobei der mittlere Tiefpunkt bei etwa 12 Tagen nach der Behandlung mit dem Mittel auftritt. In diesen Ausführungsformen ist es bevorzugt, daß das Mittel zuerst verabreicht wird, nach dem die therapeutische Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht wurde. In diesem Aspekt ist es bevorzugt, daß mehr als eine Dosis der therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht wird. In diesem Aspekt ist es bevorzugt, das jede Dosis, die verabreicht wird, jeden zweiten Tag nach einer vorhergehenden Dosis der therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht wird. Es ist besonders bevorzugt, daß etwa 3 bis etwa 6 Dosen verabreicht werden, wobei etwa 3 bis etwa 4 Dosen als besonders bevorzugt angesehen werden. In diesem Aspekt ist es auch bevorzugt, daß 1 Dosis bis etwa 8, die TPO umfassen, nach der Verabreichung des Mittels verabreicht werden. In dieser Ausführungsform können etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5 bis zu etwa 6 Dosen oder so verabreicht werden. In einem Aspekt wird die Zusammensetzung, die TPO umfaßt verabreicht, wenn die Blutplättchenzahl weniger als etwa 100.000/μl Blut beträgt.
  • In anderen Aspekten der Erfindung wird das Mittel über einen Zeitraum von etwa 3 bis etwa 6 Tagen verabreicht. In dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, daß das Mittel zuerst nach der therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht wird. In dieser Ausführungsform ist es auch bevorzugt, daß mehr als eine Dosis der therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht wird. Es ist bevorzugt, daß jede Dosis jeden zweiten Tag nach einer vorhergehenden Dosis der therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht wird. In diesem Aspekt ist es bevorzugt, daß jede Dosis an jedem zweiten Tag nach einer vorhergehenden Dosis, die TPO umfaßt, verabreicht wird. Es ist insbesondere bevorzugt, daß etwa 3 bis etwa 6 Dosen verabreicht werden, wobei 4 Dosen als besonders bevorzugt angesehen werden. In dieser Ausführungsform können etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5 bis zu etwa 6 Dosen oder so verabreicht werden. In diesem Aspekt ist es bevorzugt, daß eine Dosis, die TPO umfaßt nach der Verabreichung des Mittels verabreicht wird. In einem Aspekt wird die Zusammensetzung, die TPO umfaßt verabreicht, wenn die Blutplättchenzahl weniger als etwa 100.000/μl Blut beträgt.
  • In anderen Aspekten der Erfindung ist der Tiefpunkt des Mittels relativ spät oder von etwa 15, etwa 16, etwa 17, etwa 18, etwa 19, etwa 20, etwa 21, etwa 22, etwa 23, etwa 24, etwa 25, etwa 26, etwa 27, etwa 28, etwa 29, etwa 30, etwa 31, etwa 32, etwa 33, etwa 34, bis zu etwa 35 Tage oder mehr. In diesem Aspekt ist es bevorzugt, daß das Mittel vor der Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht wird. Es wird jedoch erwogen das Mittel, mit frühen Tiefpunkten wie von etwa 12 bis etwa 25 Tagen auch in dieser Ausführungsform bevorzugt werden. Es ist bevorzugt, daß mehr als eine Dosis, die TPO umfaßt, verabreicht wird. In diesem Aspekt ist bevorzugt, daß jede Dosis an jedem zweiten Tag nach einer vorangehenden Dosis der therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht wird. Es ist insbesondere bevorzugt, daß etwa 3 bis etwa 6 Dosen verabreicht werden, wobei etwa 3 bis etwa 4 Dosen als besonders vorteilhaft angesehen werden. In dieser Ausführungsform können etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5 bis zu etwa 6 Dosen oder so verabreicht werden. In einem Aspekt wird die Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht, wenn die Blutplättchenzahl weniger als etwa 100.000/μl Blut beträgt.
  • In anderen Aspekten der Erfindung wird das Mittel über einen Zeitraum von etwa 1 bis etwa 5 Tagen oder bevorzugt von etwa 1 bis 2 Tagen verabreicht. In dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, daß das Mittel zuerst vor der Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht wird. Es ist bevorzugt, daß mehr als eine Dosis, die TPO umfaßt verabreicht wird. In diesem Aspekt ist bevorzugt, daß jede Dosis an jedem zweiten Tag nach einer vorhergehenden Dosis der therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht wird. Es ist besonders bevorzugt, daß etwa 3 bis etwa 6 Dosen verabreicht werden, wobei etwa 4 Dosen bis etwa 6 Dosen als besonders vorteilhaft angesehen werden. In dieser Ausführungsform können etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9, bis zu etwa 10 Dosen oder so verabreicht werden. In diesem Aspekt ist es bevorzugt, daß mindestens eine Dosis, die TPO umfaßt, nach der Verabreichung des Mittels verabreicht wird. In einem Aspekt wird die Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht, wenn die Blutplättchenzahl weniger als etwa 100.000/μl Blut beträgt.
  • In bestimmten Ausführungsformen können Vordosen, Anschluß-Dosen und Kombinationen davon verabreicht werden, wenn der Tiefpunkt dazwischen liegt, bei beispielsweise etwa 12, etwa 13 bis etwa 14 Tagen. In dieser Ausführungsform kann die bevorzugte Verwendung die sein, die entweder für Mittel mit einem frühen Tiefpunkt oder die für Mittel mit einem späten Tiefpunkt beschrieben wurden.
  • In bestimmten Aspekten der Erfindung umfaßt ein Behandlungszyklus mehrere Verabreichungen des Mittels an ein Säugetier. In anderen Aspekten umfaßt der Behandlungszyklus die Behandlung des Tiers mit mehr als einem Mittel von dem bekannt ist, das es eine Thrombozytopenie auslöst. Das Säugetier kann in einem oder mehreren Behandlungszyklen oder mehreren Zyklen, bei denen ein Mittel über einen Zeitraum von etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9, etwa 10, etwa 11, etwa 12, etwa 13, etwa 14, etwa 15, etwa 16, etwa 17, etwa 18, etwa 19, bis zu etwa 20 oder mehr Tagen pro Zyklus behandelt wird. Das Dosierungsschema der Verabreichung des Mittels kann dauerhaft, täglich oder nicht täglich sein. Mehr als ein Mittel kann in einem Behandlungsschema oder Zyklus verabreicht werden. In einer Ausführungsform ist es bevorzugt, daß das Mittel insgesamt pro Zyklus über etwa 1 bis zu etwa 5 Tage verabreicht wird. Daher kann in diesem Aspekt das Mittel über etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, oder etwa 5 Tage oder so pro Zyklus verabreicht werden.
  • In bestimmten Aspekten der Erfindung kann eine therapeutische Zusammensetzung, die TPO umfaßt, ein TPO-Protein, -Polypeptid und/oder -Peptid sein, das aus einem Menschen oder einem anderen Tier isoliert wurde. Das TPO-Protein, -Polypeptide und/oder -Peptid kann ein Protein sein, das durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wurde oder kann chemisch synthetisiert sein und kann mit jeder der Technologien, die dem Fachmann bekannt sind, um Wildtypsequenzen eines TPO-Proteins, -Polypeptids und/oder -Peptids zu verändern oder zu modifizieren, wobei seine thrombopoetische und/oder seine Kältekonservierungsaktivität zum Teil oder ganz zurückbelassen wird, verändert oder modifiziert sein. Solche modifizierten TPO-Moleküle umfassen sind aber nicht eingeschränkt auf PEGylierte TPO-Moleküle. Eine Zusammensetzung des TPOs kann eine Kombination von sowohl modifizierten und unmodifizierten TPO-Protein, -Polypeptid und/oder -Peptid sein und kann selbst inaktive Form des TPOs umfassen. Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe "TPO" oder "Thrombopoietin" auf jede dieser Zusammensetzungen, die in den vorangehenden Passagen dieses Abschnitts beschrieben wurden. Es wird erwogen, daß andere Peptide, Proteine oder Polypeptide die Aktivität von TPO durch die Wirkung als Thrombopoietin-Rezeptoragonist imitieren. Solche TPO-Aktivitätspeptid-Imitatoren der TPO-Aktivität oder Thrombopoietin-Rezeptoragonisten umfassen sind aber nicht eingeschränkt auf die Peptide die durch Cwirla et al., 1997, offenbart wurden. Es wird erwogen, daß solch ein TPO-Peptid, -Peptidimitator oder -Rezeptoragonist in jeder der hierin offenbarten Zusammensetzungen und Verwendungen verwendet werden kann. Des weiteren wird erwogen, daß ein solcher Rezeptoragonist oder ein TPO-Aktivitätspeptid-Imitator oder ein anderer Rezeptor-Agonist durch jede der hierin offenbarten oder dem Fachmann bekannten Verfahren produziert, isoliert, synthetisiert, verändert oder in anderer Weise modifiziert werden kann und immer noch seine thrombopoetische und/oder Kälte-konservierende Aktivität bewahrt.
  • Wie hierin im Zusammenhang der verschiedenen vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren verwendet, wird der Begriff "Protein" so verstanden werden, daß er ein Protein-artiges Segment bezeichnet, das länger als etwa 200 zusammenhängende Aminosäuren ist und in den meisten Aspekten mehr als etwa 70 Prozent der Aminosäuren umfaßt, die durch kodierende Region eines Gens kodiert werden. Daher kann ein TPO-Protein eine Länge von etwa 201, etwa 202, etwa 203, etwa 204, etwa 205, etwa 206, etwa 207, etwa 208, etwa 209, etwa 210, etwa 211, etwa 212, etwa 213, etwa 214, etwa 215, etwa 216, etwa 217, etwa 218, etwa 219, etwa 220, etwa 221, etwa 222, etwa 223, etwa 224, etwa 225, etwa 226, etwa 227, etwa 228, etwa 229, etwa 230, etwa 231, etwa 232, etwa 233, etwa 234, etwa 235, etwa 236, etwa 237, etwa 238, etwa 239, etwa 240, etwa 241, etwa 242, etwa 243, etwa 244, etwa 245, etwa 246, etwa 247, etwa 248, etwa 249, etwa 250, etwa 251, etwa 252, etwa 253, etwa 254, etwa 255, etwa 256, etwa 257, etwa 258, etwa 259, etwa 260, etwa 261, etwa 262, etwa 263, etwa 264, etwa 265, etwa 266, etwa 267, etwa 268, etwa 269, etwa 270, etwa 271, etwa 272, etwa 273, etwa 274, etwa 275, etwa 276, etwa 277, etwa 278, etwa 279, etwa 280, etwa 281, etwa 282, etwa 283, etwa 284, etwa 285, etwa 286, etwa 287, etwa 288, etwa 289, etwa 290, etwa 291, etwa 292, etwa 293, etwa 294, etwa 295, etwa 296, etwa 297, etwa 298, etwa 299, etwa 300, etwa 301, etwa 302, etwa 303, etwa 304, etwa 305, etwa 306, etwa 307, etwa 308, etwa 309, etwa 310, etwa 311, etwa 312, etwa 313, etwa 314, etwa 315, etwa 316, etwa 317, etwa 318, etwa 319, etwa 320, etwa 321, bis zu etwa 322 zusammenhängenden Aminosäuren aufweisen. Ein bevorzugtes TPO-Protein umfaßt die Sequenz der SEQ ID Nr.: 1. Wie hierin im Zusammenhang mit den verschiedenen vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren wird der Begriff "Polypeptid" so verstanden werden, daß er ein Protein-artiges Segment bezeichnet, das eine Länge von etwa 100 bis etwa 200 zusammenhängende Aminosäuren aufweist. Somit kann ein TPO-Polypeptid eine Länge von etwa 101, etwa 102, etwa 103, etwa 104, etwa 105, etwa 106, etwa 107, etwa 108, etwa 109, etwa 110, etwa 111, etwa 112, etwa 113, etwa 114, etwa 115, etwa 116, etwa 117, etwa 118, etwa 119, etwa 120, etwa 121, etwa 122, etwa 123, etwa 124, etwa 125, etwa 126, etwa 127, etwa 128, etwa 129, etwa 130, etwa 131, etwa 132, etwa 133, etwa 134, etwa 135, etwa 136, etwa 137, etwa 138, etwa 139, etwa 140, etwa 141, etwa 142, etwa 143, etwa 144, etwa 145, etwa 146, etwa 147, etwa 148, etwa 149, etwa 150, etwa 151, etwa 152, etwa 153, etwa 154, etwa 155, etwa 156, etwa 157, etwa 158, etwa 159, etwa 160, etwa 161, etwa 162, etwa 163, etwa 164, etwa 165, etwa 166, etwa 167, etwa 168, etwa 169, etwa 170, etwa 171, etwa 172, etwa 173, etwa 174, etwa 175, etwa 176, etwa 177, etwa 178, etwa 179, etwa 180, etwa 181, etwa 182, etwa 183, etwa 184, etwa 185, etwa 186, etwa 187, etwa 188, etwa 189, etwa 190, etwa 191, etwa 192, etwa 193, etwa 194, etwa 195, etwa 196, etwa 197, etwa 198, etwa 199, bis zu etwa 200 zusammenhängenden Aminosäuren aufweisen. Ein bevorzugtes Polypeptid ist ein Polypeptid, das die ersten N-terminalen 153 Aminosäuren des reifen humanen TPOs umfaßt. Ein besonders bevorzugtes Polypeptid umfaßt die Reste 1–153 der SEQ ID Nr.: 1. Der Begriff "Peptid" wird so verstanden werden, das er ein Protein-artiges Segment, das eine Länge zwischen etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9, etwa 10, etwa 11, etwa 12, etwa 13, etwa 14, etwa 15, etwa 16, etwa 17, etwa 18, etwa 19, etwa 20, etwa 21, etwa 22, etwa 23, etwa 24, etwa 25, etwa 26, etwa 27, etwa 28, etwa 29, etwa 30, etwa 31, etwa 32, etwa 33, etwa 34, etwa 35, etwa 36, etwa 37, etwa 38, etwa 39, etwa 40, etwa 41, etwa 42, etwa 43, etwa 44, etwa 45, etwa 46, etwa 47, etwa 48, etwa 49, etwa 50, etwa 51, etwa 52, etwa 53, etwa 54, etwa 55, etwa 56, etwa 57, etwa 58, etwa 59, etwa 60, etwa 61, etwa 62, etwa 63, etwa 64, etwa 65, etwa 66, etwa 67, etwa 68, etwa 69, etwa 70, etwa 71, etwa 72, etwa 73, etwa 74, etwa 75, etwa 76, etwa 77, etwa 78, etwa 79, etwa 80, etwa 81, etwa 82, etwa 83, etwa 84, etwa 85, etwa 86, etwa 87, etwa 88, etwa 89, etwa 90, etwa 91, etwa 92, etwa 93, etwa 94, etwa 95, etwa 96, etwa 97, etwa 98, etwa 99 bis zu etwa 100 zusammenhängende Aminosäuren aufweist, bezeichnet. Somit werden Protein-artige TPO-Segmente verschiedener Gesamtlänge, die regulatorische oder thrombopoetische Eigenschaften und Funktionen bewahren, als nützlich in den hierin offenbarten Verwendungen und Zusammensetzungen erwogen. Ein Fachmann wird erkennen, daß bei der Produktion rekombinanten (rTPO) Peptids, Polypeptids oder Proteins, Aminosäuresequenzen hinzugefügt, mutiert, verändert, modifiziert und/oder entfernt werden können und das ein aktives TPO-Molekül, das thrombopoetische Aktivität oder kältekonservierende Aktivität fördert, für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann. Verfahren für die Produktion solcher Varianten sind hierin beschrieben.
  • In bestimmten Aspekten der Erfindung kann der Weg, über den die therapeutische Zusammensetzung verabreicht wird, die parenterale Verabreichung sein. Die parenterale Verabreichung kann eine intravenöse Injektion, subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion, intramedulare Injektion oder eine Kombination davon sein. In bestimmten Aspekten wird die Zusammensetzung, die TPO umfaßt, mit etwa 0,1 bis etwa 20 μg/kg/Körpergewicht pro Dosis verabreicht. In bestimmten Aspekten wird die Zusammensetzung, die TPO umfaßt mit etwa 1 bis etwa 5 μg/kg/Körpergewicht pro Dosis verabreicht. In bestimmten Aspekten wird die Zusammensetzung, die TPO umfaßt, mit etwa 1,2 bis etwa 3,6 μg/kg/Körpergewicht pro Dosis verabreicht. In bestimmten Aspekten wird die Zusammensetzung, die TPO umfaßt, mit etwa 1,2 bis etwa 2,4 μg/kg/Körpergewicht pro Dosis verabreicht. In bevorzugten Aspekten ist die Menge des TPOs, das pro Dosis verabreicht wird etwa 0,1, etwa 0,2, etwa 0,3, etwa 0,4, etwa 0,5, etwa 0,6, etwa 0,7, etwa 0,8, etwa 0,9, etwa 1,0, etwa 1,1, etwa 1,2, etwa 1,3, etwa 1,4, etwa 1,5, etwa 1,6, etwa 1,7, etwa, 1,8, etwa 1,9, etwa 2,0, etwa 2,1, etwa 2,2, etwa 2,3, etwa 2,4, etwa, 2,5, etwa 2,6, etwa 2,7, etwa 2,8, etwa 2,9, etwa 3,0, etwa 3,1, etwa 3,2, etwa 3,3, etwa 3,4, etwa 3,5, etwa 3,6, etwa 3,7, etwa 3,8, etwa 3,9, etwa 4,0, etwa 4,1, etwa 4,2, etwa 4,3, etwa 4,4, etwa 4,5, etwa 4,6, etwa 4,7, etwa 4,8, etwa 4,9, etwa 5,0, etwa 5,1, etwa 5,2, etwa 5,3, etwa 5,4, etwa 5,5, etwa 5,6, etwa 5,7, etwa 5,8, etwa 5,9, etwa 6,0, etwa 6,1, etwa 6,2, etwa 6,3, etwa 6,4, etwa 6,5, etwa 6,6, etwa 6,7, etwa 6,8, etwa 6,9, etwa 7,0, etwa 7,1, etwa 7,2, etwa 7,3, etwa 7,4, etwa 7,5, etwa 7,6, etwa 7,7, etwa 7,8, etwa 7,9, etwa 8,0, etwa 8,1, etwa 8,2, etwa 8,3, etwa 8,4, etwa 8,5, etwa 8,6, etwa 8,7, etwa 8,8, etwa 8,9, etwa 9,0, etwa 9,1, etwa 9,2, etwa 9,3, etwa 9,4, etwa 9,5, etwa 9,6, etwa 9,7, etwa 9,8, etwa 9,9, bis zu etwa 10,0 oder mehr μg/kg/Körper.
  • In bestimmten Aspekten der Erfindung ist das Mittel, für das bekannt ist, das es eine Thrombozytopenie induziert, eine myelosuppressive Behandlung, eine Myelodysplasie, eine aplastische Anämie, eine kongenitale Thrombozytopenie, eine Immunthrombozytopenie, eine zyklische Thrombozytopenie, eine Chemikalie, die Aussetzungen gegenüber einer Bestrahlung oder eine Kombination davon. In bestimmten Aspekten kann die Chemikalie ein Arzneistoff oder ein Gift sein. In bestimmten Aspekten kann die myelosuppressive Behandlung ein zytotoxisches Mittel sein, das für die Vorläuferzellmobilisierungs-Therapie und Leukaphereseverfahren, Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie oder eine Kombination davon verwendet wird. In bestimmten bevorzugten Aspekten kann die myelosuppressive Behandlung ein zytotoxisches Mittel sein, das für die Vorläuferzellmobilisations-Therapie und das Leukaphereseverfahren verwendet wird. Das zytotoxische Mittel, das für die Vorläuferzellmobilisations-Therapie und das Leukaphereseverfahren verwendet wird, kann ein Stammzelltransplantat sein. In besonders bevorzugten Aspekten ist die myelosuppressive Behandlung eine Chemotherapie. In diesen Aspekten kann die Chemotherapie eine myeloablative Chemotherapie für ein autologes Knochenmarkstransplantat, eine myeloablative Chemotherapie für ein allogenes Knochenmarktransplantat, eine myelotoxische Chemotherapie für die Behandlung einer Leukämie oder eine myelotoxische Chemotherapie für die Behandlung solider Tumore oder eine Kombination davon sein. In bestimmten Aspekten umfaßt die Chemotherapie die Verabreichung von chemotherapeutischen Mitteln, wobei die Mittel Adriamycin, Asparaginase, Bleomycin, Kalziumleucovorin, Carmustin, Carboplatin, Cisplatin, Cyklophosphamid, Cytarabin, Dakarbazin, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Etoposid, Fluorouracil, Fluoxymesteron, Flutamid, Hexamethylmelamin, Hydroxyharnstoff, Ifosfamid, Gencitabin, Levamisol, Busulfan, Lomustin, Mechlorethamin, Melphalan, Mercaptopurin, Methotrexat, Methyl-CCNU, Topoasin, Mitomycin C, Mitoxantron, Prednisolon, Procarbazin, Streptozocin, Taxol, Taxan, Taxoter, Thioguanin, Triehtylen-Thiophosphoramid, Vinblastin, Vincristin oder ein Gemisch davon umfaßt aber nicht darauf beschränkt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Chemotherapie in der Verabreichung von Carboplatin, Ifosfamid, Adriamycin oder einer Kombination davon.
  • In bestimmten Aspekten können Mittel mit einem frühen Tiefpunkt Azacytidin, Chlorambucil, 2-Chlordeoxyadenosin, Cytarbin, Dacarbacin, Daunorubicin, Epirubicin, Fluorouracil, Hydroxyharnstoff Idarubicin, Ifosfamid, Mechlorethamin, Methotrexat, Mitoxantron, Taxol, Taxoter, Teniposid, Thiotepa, Trimetrexat, Vinblastin, Vincristin, Verabreichungsschemata chemotherapeutischer Mittel wie AI, MAID, CyaDIC, Taxol plus Platin, CTX mit oder ohne Platin, Topatecan, ifex, ESHAP, DHAP oder eine Kombination davon umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt. In diesem Aspekt wäre der Tiefpunkt vorzugsweise zwischen etwa 10 und etwa 14 Tagen. Für ESHAP oder DHAP würde der Tiefpunkt vorzugsweise zwischen etwa 14 bis etwa 15 Tagen liegen. Diese Mittel und alle therapeutischen Kombinationen der Mittel können gemäß jedem Verfahren oder Verabreichungsschemata, die dem Fachmann bekannt sind, verabreicht werden. Beispiele, die für die Verabreichung, Verabreichungsschemata und Kombinationen solcher Mittel exemplarisch sind, umfassen "Combination Cancer Chemotherapy Regimens" Roger W. Anderson und William J. Dana, Herausgeber Laderley Laboratories (1991) und "The Cerenex Handbook", Robert S. Benjamin, Herausgeber, Cerenex Pharmaceuticals, Research Triangle Park, N.C. (1993).
  • In bestimmten Aspekten können Mittel mit einem späten Tiefpunkt Busulfan, Carboplatin, Carmustin, Dactinomycin, Etoposid, Fludarabin, Lomustin, Melphalan, Mitomycin, Procarbazin, Thioguanin, Thiotepa, Verabreichungsschemata chemotherapeutischer Mittel wie CEP, ICE (Ifosfamid, Carboplatin, Etoposid), Carboplatin und Taxol, Carboplatin und Etoposid, BUCAT (Busulfan, Thiotepa, Carboplatin) und Kombinationen davon umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. In diesem Aspekt ist es bevorzugt, daß der Tiefpunkt zwischen etwa 15 und 35 Tagen liegt.
  • In bestimmten Aspekten der Erfindung ist die myelosuppressive Behandlung eine Bestrahlungstherapie. Die Bestrahlungstherapie kann das Bestrahlen des Säugetiers oder die Verabreichung einer therapeutischen Zusammensetzung, die ein radioaktives Material umfaßt, an das Säugetier umfassen.
  • In bestimmten Aspekten der Erfindung hat das Säugetier, das eine Thrombozytopenie aufweist oder ein Risiko dafür hat, eine Lebererkrankung, eine Leukämie, solide Tumore, eine Myodisplasie, eine aplastische Anämie, eine kongenitale Thrombozytopenie, bakterielle oder virale Infektionen, Hepatitis und HIV-Immunthrombozytopenie oder Tuberkulose oder eine Kombination davon oder weißt ein Risiko dafür auf.
  • In bestimmten Aspekten der Verwendung der Erfindung umfaßt die Erfindung des weiteren den Schritt der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Zusammensetzung, die ein Zytokin, ein Hämatopoitin, einen Kolonie-stimulierenden Faktor, ein Interleukin, einen Wachstumsfaktor oder eine Kombination davon umfaßt. In einem bevorzugten Aspekt ist die Kombination davon eine therapeutisch wirksame Zusammensetzung, die ein Zytokin, ein Koloniestimulierenden Faktor und ein Interleukin umfaßt. Wie hierin in bestimmten Ausführungsformen verwendet, sind die Begriffe "Zytokin", "Zellinien-spezifisches Zytokin", "Behandlung" und "Säugetier" dieselben wie die, die in U.S. Patent Nr. 5,851,984, das hierin durch Verweis in seiner Gesamtheit aufgenommen wird, beschrieben sind, das in seinem relevanten Teil wie folgt lautet:
  • "Der Begriff 'Zytokin' ist ein generischer Begriff für Proteine, die von einer Zellpopulation freigesetzt werden, die auf eine andere Zelle als intrazelluläre Mediatoren einwirken. Beispiele solcher Zytokine sind Lymphokine, Monokine, Wachstumsfaktoren und übliche Polypeptidhormone. Von den Zytokinen umfaßt, sind Wachstumshormone wie menschliches Wachstumshormon, menschliches N-methionyl Wachstumshormon und Rinder-Wachstumshormon; Parathormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Relaxin; Prorelaxin; Glycoproteinhormone wie Follikelstimulierendes Hormon (FSH), Thyroidstimulierendes Hormon (TSH) und Luteohormon (LH); Leberwachstumsfaktor; Fibroblastenwachstumsfaktor; Prolaktin, plazentales Laktogen; OB-Protein; Tumornekrosefaktor-α und -β; Müllersche hemmende Substanz; Mäusegonadotropin-assoziiertes Peptid; Inhibin; Aktivin; vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nervenwachstumsfaktoren wie NGF-β; Blutplättchen-Wachstumsfaktoren; transformierende Wachstumsfaktoren (TGF) wie TGF-α und -β; Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II; Erythropoetin (EPO); osteoinduktive Faktoren; Interferone wie Interferon-α, -β, -γ; Kolonie-stimulierende Faktoren (CFS) wie Makrophagen-CFS (MCSF); Granulozyten-Makrophagen-CFS (GM-CFS); und Granulozyten-CFS (G-CSF); Interleukine (IL) wie IL-1, IL-1.α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 und andere Polypeptidfaktoren, die den Leukämie-inhibierender Faktor (LIF) und den Kit-Ligand (KL) umfassen. Wie hierin verwendet umfaßt der Begriff Zytokin Proteine aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive Äquivalente der Zytokine nativer Sequenz.
  • Ein 'Zellinien-spezifisches Zyotkin' ist eins, das auf Zellen wirkt, die sich relativ weit auf die hämatopoetische Kaskade festgelegt haben und die zu einer Vermehrung der Blutzellen einer einzelnen Zellinie führen. Beispiel solcher Zytokine umfassen EPO, TPO und G-CSF.
  • 'Behandlung' bezeichnet sowohl therapeutische Behandlung und prophylaktische oder präventive Schritte. Diejenigen, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, die bereits die Erkrankung oder Störung aufweisen sowie jene, in denen die Erkrankung oder Störung verhindert werden soll."
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen Zytokinen kann ein "Zytokin" ein hämatopoetischer Wachstumsfaktor, SCF, FLT-3-Ligand oder eine Kombination von allen hierin aufgeführten Zytokinen sein. In einem besonders bevorzugten Aspekt hat das Zytokin thrombopoetische Aktivität. Bevorzugte Zytokine umfassen den KIT-Liganden, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, FLT-3, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 oder IL-12 sind aber nicht darauf beschränkt. Andere besonders bevorzugte Zytokine sind G-CSF oder GM-CSF. In bestimmten Ausführungsformen kann das Wachstumshormon ein Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, ein menschliches Wachstumshormon oder Rinder-Wachstumshormon sein. In einigen Aspekten sind die Glycoproteinhormone das Follikelstimulierende Hormon, das Thyroidstimulierende Hormon oder das Luteohormon. In einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist der Tumornekrosefaktor TNF-α oder TNF-β. In bestimmten Aspekten der Erfindung ist der Nervenwachstumsfaktor NGF-β. In bestimmten Aspekten dieser Erfindung ist das Interferon Interferon-α, Interferon-β oder Interferon-γ. In bestimmten Aspekten dieser Erfindung können die Kolonie-stimulierenden Faktoren M-CSF, GM-CSF oder G-CSF sein, sind aber nicht darauf beschränkt. In bestimmten Aspekten der Erfindung kann das Interleukin IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11 oder IL-12 sein, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • In bestimmten Aspekten der Erfindung verringert die Verabreichung einer therapeutischen Zusammensetzung, die TPO umfaßt, die Neutropenie. Wie hierin verwendet bedeutet "Verabreichung" das Einbringen oder in Berührung bringen eines Mittels, eines Zytokins, eines TPO-Moleküls oder einer anderen hierin beschriebenen Zusammensetzung, der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung, unter Verwendung aller hierin beschriebenen Techniken oder derer, die einem Fachmann bekannt wären. Solche Verfahren umfassen die Verabreichung innerhalb eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers.
  • Wie hierin definiert, bezeichnet "Tier" einen Organismus, das als Tier entweder als Wirbeltier oder wirbelloses Tier klassifiziert wird. Bevorzugte Tiere für die Verwendung im Zzsammenhang mit den hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen umfassen "Säugetiere", welche alle umfassen, die als Säugetiere klassifiziert sind, umfassend Menschen, Haustiere, Nutztiere, und Zoo-, Sport- oder Schoßtiere, wie Hunde, Pferde, Katzen, Kühe, Nagetiere etc. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch. Zusätzlich ist ein "Patient" jemand der einer Behandlung wie hierin beschrieben, unterzogen wird. Bevorzugte Patienten sind Säugetiere und besonders bevorzugte Patienten sind Menschen.
  • In bestimmten Aspekten der Erfindung hat das Säugetier Krebs. Krebs umfaßt, ist aber nicht beschränkt auf Brust-, Darm-, Magen-, Urogenital-, Kopf- und Nacken-, Leukämie, Lungen-, Lymphom-, malignes Melanom, multiples Myelom, Ovarial-, Endometrial-, Bauchspeicheldrüsen-, pätriatisches, Sarkom, Ovarialkarzinom, einen primären peritonealen Tumor, Prostatakrebs, Gehirntumore, Hodgkin-Krankheit, Keimbahntumore, gynäkologische Tumore, endokrine Tumore oder eine Kombination davon.
  • Wie hierin verwendet, wird es verstanden werden, das die Begriffe "ein", "ein" und "die" sich auf ein oder mehr als ein beziehen können.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die folgenden Zeichnungen sind Teil der vorliegenden Beschreibung und sind aufgenommen, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung weiter darzustellen. Die Erfindung kann durch Verweis auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen im Zusammenhang mit der detaillierten Beschreibung der hierin dargestellten spezifischen Ausführungsform besser verstanden werden.
  • 1. Schema des therapeutischen Dosierungsplans. rhTPO (rhTPO-markierte Pfeile) wurde mit Dosismengen von 0,6, 1,2, 2,4 oder 3,6 μg/kg durch subkutane Injektion als einzelne Dosis 3 Wochen vor und nach einem zweiten Zyklus Carboplatin (C markiert •) (AUC = 11) verabreicht. Jeder Pfeil stellt eine Dosis dar.
  • 2. Die linke Abbildung zeigt den Dosiseffekt für rhTPO auf die zirkulierenden Blutplättchenzahlen. Die maximalen prozentualen Erhöhungen über die Grundlinie (Durchschnitt ± SEM) nach verschiedenen Dosierungen des rhTPOs werden gezeigt. Die rechte Abbildung zeigt die Kinetik der Blutplättchenantwort nach einer einzelnen Dosis rhTPO. Die gezeigten Daten stellen die Mittelwerte für alle Patienten (n = 16) dar.
  • 3. Die Wirkungen des rhTPO (1,2 μg/kg an den Tagen 2, 4, 6, 8), das als zweite Prophylaxe verwendet wird, auf die durchschnittlichen Blutplättchenzahlen (n = 6) auf Carboplatin in Zyklus-2 (gestrichelte Linie) folgend im Vergleich zu Carboplatin im Zyklus-1 (durchgezogene Linie). Der dunkel schattierte Bereich stellt den Grad und die Dauer der Thrombozytopenie im Zyklus-2 dar, der leicht schattierte Bereich stellt den Grad und die Dauer der Thrombozytopenie im Zyklus-1 dar.
  • 4A. Beispiel des verringerten Blutplättchen-Tiefpunkts und der verbesserten Blutplättchen-Erholung, der die Notwendigkeit für ein Blutplättchentransfusion aushebt, wobei rhTPO (1,2 μg/kg an den Tagen –1, 1, 3, 5) als zweite Prophylaxe auf Carboplatin im Zyklus-2 (gestrichelte Linie) folgend, verwendet wurde im Vergleich mit Carboplatin im Zyklus-1 (durchgezogene Linie) allein während dessen der Patient zwei Blutplättchentransfusionen benötigte (Tx markierte Pfeile). Der dunkel schattierte Bereich stellt den Grad und die Dauer der Thrombozytopenie in Zyklus-2 dar, der leicht schattierte Bereich stellt den Grad und die Dauer der Thrombozytopenie in Zyklus-1 dar.
  • 4B. Beispiel der Aushebung der kumulativen schweren Thrombozytopenie und der Notwendigkeit für eine Blutplättchentransfusion im Zyklus-3, wobei rhTPO (1,2 μg/kg an den Tagen –1, 1, 3, 5) als sekundäre Prophylaxe in einem Patienten mit dokumentierter schwerer Thrombozytopenie in Zyklus-2 mit Carboplatin allein, die eine Blutplättchentransfusion erforderte (Tx markierter Pfeil) verwendet wurde. Der schattierte Bereich stellt den Grad und die Dauer der Thrombozytopenie dar.
  • 5. Die linke Abbildung zeigt die Zeit bis zur Blutplättchen-Erholung auf ≥ 50.000/mm3 (P < 0,019) und die rechte Abbildung zeigt die Zeit bis zur Erholung auf ≥ 100.000/mm3 (P < 0,017) im Zyklus-1 (ohne rhTPO) und Zyklus-2 (mit rhTPO). Die TPO-verstärkte Blutplättchen-Erholung auf ≥ 50.000/mm3 (linke Abbildung) und ≥ 100.000/mm3 in Zyklus-2 im Gegensatz zu Zyklus-1.
  • 6. Wirkung des rhTPOs (Dosierungsschema I: 1 Voraus-Dosis und 3 Anschluß-Dosen) auf die AI-Chemotherapie-induzierte Thrombozytopenie. Siehe Beispiel 8 für Details.
  • 7. Wirkung des rhTPOs (Dosierungsschema II: 2 Vor-Dosen und 2 Anschluß-Dosen) auf die AI-Chemotherapie-induzierte Thrombozytopenie. Siehe Beispiel 8 für Details.
  • 8. Wirkung des rhTPOs (Dosierungsschema III: 3 Voraus-Dosen und 1 Anschluß-Dosis) auf die AI-Chemotherapie-induzierte Thrombozytopenie. Siehe Beispiel 8 für Details.
  • Beschreibung der beispielhaften Ausführungsformen
  • I. Kältekonservierung der Blutplättchen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verwendung von Zusammensetzungen des TPOs. TPO ist ein neu entdecktes thrombopoetisches Zytokin, das die zirkulierenden Blutplättchen sehr hoch anheben kann und dadurch die Ausbeute der Apherese um ein mehrfaches erhöhen kann und die Apheresezeit deutlich reduzieren kann. Um die klinische Entwicklung in diesem Bereich zu verfolgen, untersuchten die Erfinder Blutplättchen aus TPO-behandelten Patienten langfristig durch Kältekonservierung gelagert werden können. Diese Studien zeigten, daß kälte-konservierte Blutplättchen aus TPO-behandelten Patienten im Vergleich zu Kältekonservierten Blutplättchen aus normalen Spendern einen deutlich erhöhten Erhalt der Morphologie und der Funktion zeigten. Die Studien deuteten darauf hin, daß TPO die Blutplättchenzahl um ein mehrfaches erhöhen kann und es möglicherweise erlauben sollte, mehrere Blutplättcheneinheiten, die für einen langen Zeitraum (bis zu 6 Monaten) Kälte-konserviert werden können, zu sammeln, einhergehend mit einem exzellenten Erhalt der Zellzahl und – funktion.
  • Die Offenbarung umfaßt daher die Induktion der Thrombozytose durch die TPO-Behandlung, das Sammeln mehrere Blutplättcheneinheiten, die Kältekonservierung der Blutplättchen für die Langzeitaufbewahrung und die Lagerung autologer Blutplättchen, Einzelspender- oder Direktspender-Blutplättchen, Zufallsspender-Blutplättchen für die Notfallverwendung und die Erzeugung von Banken für HLA-abgeglichene Blutplättchen. Daher kann die Lagerung von Kälte-konservierten Blutplättchen mehrere Probleme der Transfusionsmedizin, die die Verfügbarkeit von abgeglichenen Blutplättchen in Notfallsituationen, Versorgungsengpässe und Bestandsprobleme bei Blutbanken umfassen, erleichtert werden. Die Lagerung autologer Blutplättchen vor einer Mehrfachzyklus myelosuppressiven oder myeloablativen Therapie kann bei der Unterstützung in Zeiträumen schwerer Thrombozytopenie durch schnell verfügbare autologe Zellen nützlich sein.
  • Eines der üblichen Probleme, das die Nützlichkeit mehrfacher Blutplättchentransfusionen von Zufallsspendern einschränkt, ist die Alloimmunisierung. Um dieses Problem zu minimieren, wäre die Exposition gegenüber einer minimalen Anzahl von Spendern bevorzugt. Die TPO-induzierte Thrombozytose würde die Gewinnung einer großen Anzahl von Blutplättchen erlauben, um Lagerungsbanken HLA-abgeglichener Blutplättchen zu erzeugen, die nach Bedarf verfügbar wären, insbesondere für die Verwendung bei hoch-alloimmunisierten Patienten.
  • Die Strategie der Kältekonservierung rhTPO-induzierter Blutplättchen kann auch in anderen nicht-onkologischen Bereichen, bei denen die Thrombozytopenie eine erwartete Komplikation der geplanten Behandlung ist (z. B. Herzchirurgie) (Alvarez et al. 1992; Graylee et al. 1994) eingesetzt werden. Die Verwendung autologer Blutplättchen in diesem Zusammenhang würde auch die ungerechtfertigte Angst und Besorgnis der Übertragung infektiöser Agenzien ausheben. Bei normalen Spendern erlaubt es der wirksame biologische Effekt und das Fehlen deutlicher Toxizität des TPOs, dies bei normalen Spendern oder Familienmitgliedern zu verwenden, um die Bevorratung einer großen Anzahl von Blutplättchen, die dann Kältekonserviert werden können und die wie benötigt verfügbar sind, zu ermöglichen. Somit hat diese neue Strategie das Potential, die Beschränkung der gegenwärtig verfügbaren Verfahren auszuräumen.
  • Es wird erwogen, daß Krebspatienten mit TPO und/oder rhTPO behandelt werden, um die Blutplättchen vor, während oder nach der Chemotherapie zu erhöhen und die Blutplättchen können durch Apherese gesammelt werden, so daß sie durch Kältekonservierung unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren gelagert werden können und daß sie zurück in den Patienten transfundiert werden können. Der Patient wird vorzugsweise ein Patient sein, der an einer Thrombozytopenie leidet, wie ein Krebspatient, der sich einer Chemotherapie unterzieht.
  • ThromboSol ist eine neuentwickelte Blutplättchen-stabilisierende Lösung, die bestimmte Aktivierungssignalwege behindert, und das gegen die negativen Wirkungen der Kältelagerung schützt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist dadurch einzigartig, das es TPO verwendet, um die Blutplättchenausbeute für die Apherese (für autologe sowie für allogene Verwendung) zu erhöhen und dadurch, daß es ein neues Verfahren der Blutplättchen-Kältekonservierung verwendet (d. h. vorzugsweise ThromboSol und 2% DMSO). In vitro Studien des Erfinders zeigen, daß Blutplättchen aus TPO-behandelten Patienten eine erhöhte Bewahrung der Zellfunktion im Vergleich zu Blutplättchen aus normalen Spendern, die mit üblichen Verfahren (5% oder 6% DMSO) oder mit ThromboSol + 2% DMSO Kältekonserviert worden sind, aufweisen. Es wird erwogen, daß TPO als Kältekonservierungsmittel für die Lagerung von Blutplättchen verwendet werden kann. Zusätzlich kann TPO vor, währen und/oder nach der Verabreichung von Blutplättchen verabreicht werden, um dabei zu helfen die Blutplättchen-Aktivität zu verstärken oder zu bewahren.
  • Obwohl das Protokoll auf Grundlage vernünftiger Erklärung und vorherigen Beobachtungen beruht, ist es wahrscheinlich, daß es vielen Verbesserungen und Feinabstimmungen beruhend auf den entscheidenden Beobachtungen, die während der Behandlung eines Patienten gemacht werden, unterzogen werden kann. Beruhend auf vorangegangener Erfahrung ist es auch möglich, daß die Veränderungen der ursprünglichen Planung notwendig sein kann, um die Zeitabfolge und die Ausbeute der Sammlung, der Kältekonservierung und der Transfusion autologer Blutplättchen zu optimieren. In der Ausgangslage, bei der beispielsweise ein Patient keine angemessene Antwort in Form der Blutplättchenzahl ausbauen kann, um ausreichende Blutplättcheneinheiten vor der Chemotherapie zu spenden oder in der Ausgangslage, bei der der Patient eine rasch fortschreitende Erkrankung aufweist und nicht darauf warten kann TPO zu erhalten um eine Blutplättchenapherese vor der Chemotherapie zu erhalten, kann der Erfinder dazu in der Lage sein, Blutplättchen während der Erholung nach der Chemotherapie plus TPO, um die Thrombozytose wieder herzustellen, zu sammeln. Die klinische und die aktuelle Laborstudie würde dieses unterstützen. Gleichermaßen können weitere Dosen der TPO-Verabreichung vor, während und nach der Transfusion Kälte-konservierter Blutplättchen notwendig sein, um das Überleben die Funktion der transfundierten Blutplättchen zu verbessern.
  • II. Verabreichung von TPO, um die Thrombozytopenie zu verringern
  • Die Verabreichung einer einzelnen Dosis rekombinanten humanen TPOs (rhTPO) bei Krebspatienten vor der Chemotherapie ist ein wirksamer Stimulus für eine andauernde Blutplättchenproduktion und erhöhte in vielen Patienten die zirkulierende Blutplättchenzahlen auf eine Million oder mehr. Die Beobachtung machte die Möglichkeit wahrscheinlicher, daß rhTPO an Krebspatienten für eine autologe Spende vor einer Mehrfachzyklus myelosuppresiven Therapie oder vor einer myeloablativen Behandlung gegeben werden kann. Daher umfaßt die Erfindung die Verwendung von TPO für die Herstellung eines Medikaments, um Thrombozytopenie zu verringern oder zu verhindern. Die vorliegende Erfindung zeigt, daß ein optimaler TPO-Dosierungsplan ein anderer als die tägliche Verabreichung ist.
  • Die Zeitabfolge der Verabreichung des TPOs im Verhältnis zu den myelosuppresiven Behandlungen erzeugt optimierte Ergebnisse für das verwendete Mittel wie oben in der Zusammenfassung und unten in den spezifischen Beispielen beschrieben. Mit den Behandlungsschemata die lang sind (wie AI ≥ 4 Tage) und/oder die einen frühen Tiefpunkt aufweisen (wie AI – etwa Tag 12) kann die Vordosierung von rhTPO zusammen mit der Anschlußdosierung vorteilhaft sein. Wobei bei Behandlungsschemata die kurz sind (wie Carboplatin als Einzelmittel – 1 oder 2 Tage Behandlungsschema) und/oder die einen verzögerten Tiefpunkt aufweisen (≥ Tag 12 und Tag 16 so wie bei Carboplatin) die Nachdosierung (allein) mit rhTPO wirksam sein kann. Diese Beobachtungen zeigen, daß die frühere Verabreichung des rhTPOs (d. h. vor der Chemotherapie oder die Vordosierung) vorteilhaft sein kann. In einem Beispiel bei dem eine Dosis von rhTPO vor der AI (Vordosierung) gegeben wurde und zwei Dosen nach der AI (Anschlußdosierung) steigerte rhTPO durch dieses Verfahren die Blutplättchenerholung und die Blutplättchenzahl am Tiefpunkt war in einigen Patienten höher. Diese Beobachtungen deutet darauf hin, daß die mehrfache Vordosierung mit rhTPO eine verbesserte Wirkung auf den Tiefpunkt der Blutplättchen und auf die Erholung zur Verfügung stellen kann.
  • III. Thrombopoietinnukleinsäuren
  • A. Gene und DNA-Segmente
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet Zusammensetzungen, die Thrombopoietin (TPO) umfassen. Die Nukleotid und Protein, Polypeptide und Peptidsequenzen für TPO und andere Zytokine und Peptidhormone sind vorher offenbart worden und können in den National Centre for Biotechnology Information GeneBank- und GenePept-Datenbanken (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gefunden werden. Insbesondere werden die Nukleotidsequenzen, die die Genbankzugangsnummern AB014683, AB014682, AB014681, L36052, L36051, E 12215, E 12214, E 12183, E 12182 und E 12181 umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind, als nützlich für die Erzeugung rekombinanten TPOs (rTPO) für die Verwendungen und die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung erwogen. Die Nukleotidsequenzen, die von humanen TPO-Sequenzen abgeleitet sind, umfassen sind aber nicht eingeschränkt auf die Genbankzugangsnummern AB014683, AB014682, AB014681, L36052, L36051, E12215, E12214, E12183 und E12182 werden als besonders nützlich für die Erzeugung rekombinanten humanen TPOs (rhTPO) für die Verwendungen und die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung erwogen.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft auch isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, die für Thrombopoietin kodieren und die Erzeugung und Verwendung rekombinanter Wirtszellen durch die Anwendung von DNA-Technologie, die Wildtyp, polymorphes oder mutiertes Thrombopoietin unter Verwendung der Sequenz der SEQ ID NR: 1 und biologisch funktionelle Äquivalente davon exprimieren. Zusätzlich zu den Verfahren für das Erhalten, das Isolieren, das Synthetisieren, das Mutieren, das chemische Modifizieren, das Exprimieren, das Reinigen, das Nachweisen der Aktivität von und der Verabreichung/oder der Verwendung von TPO, rTPO und verwandten thrombopoetischen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, die hierin beschrieben sind, sind solche Methoden auch beispielhaft durch U.S. Patent N. 5,641,655, 5,830,647, 5,795,569, 5,766,897, 5,766,581, 5,756,083, 5,744,587, 5,733,746, 5,696,250, 5,593,666, 5,571,686, 5,250,732 und 4,894,440 beschrieben.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft DNA-Segmente, die aus Säugetierzellen insbesondere aus Schweine-, Mäuse- und menschlichen Zellen isolierbar sind, die keine genomische Gesamt-DNA enthalten und die dazu in der Lage sind eine Protein, ein Polypeptide oder ein Peptid, das Thrombopoietinaktivität aufweist, zu exprimieren.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff "DNA-Segment" ein DNA-Molekül, daß ohne genomische Gesamt-DNA einer bestimmten Spezies isoliert worden ist. Daher bezeichnet ein DNA-Segment, das für TPO kodiert, ein DNA-Segment, das TPO kodierende Sequenzen enthält, das jedoch von Säugetier insbesondere Schweine, Mäuse oder menschlicher genomischer Gesamt-DNA wegisoliert wurde von oder frei davon gereinigt wurde. Im Begriff "DNA-Segment" umfaßt sind DNA-Segmente und kleinere Fragmente solcher Segmente und auch rekombinante Vektoren, die beispielsweise Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren und ähnliche umfassen.
  • Gleichermaßen bezeichnet ein DNA-Segment, das ein isoliertes oder gereinigtes Thrombopoietingen umfaßt, ein DNA-Segment, das Thrombopoietinprotein kodierende Sequenzen und in bestimmten Aspekten regulatorische Sequenzen umfaßt, die im Wesentlichen von anderen natürlicherweise auftretenden Gen- oder Protein-kodierenden-Sequenzen weggereinigt wurden. In dieser Hinsicht wird der Begriff "Gen" der Einfachheit halber verwendet, um eine kodierende Einheit für ein funktionelles Protein, Polypeptid oder Peptid zu bezeichnen. Wie durch den Fachmann verstanden werden wird, umfaßt dieser funktioneller Begriff sowohl genomische Sequenzen, cDNA-Sequenzen und kleinere konstruierte Gen-Segmente die Proteine, Polypeptide, Domänen, Peptide, Fusionsproteine und Mutanten exprimieren oder angepaßt werden können diese zu exprimieren.
  • "Im Wesentlichen von anderen kodierenden Sequenzen wegisoliert" bedeutet, daß das interessierende Gen in diesem Fall das Thrombopoietingen den wesentlichen Bestandteil der kodierenden Region des DNA-Segments bildet und daß das DNA-Segment keine großen Teile natürlich auftretender kodierender DNA wie große chromosomale Fragmente oder andere funktionelle Gene oder cDNA kodierende Regionen umfaßt. Natürlich bezieht sich das auf das DNA-Segment wie ursprünglich isoliert und schließt Gene oder kodierende Regionen nicht aus, die später durch Menschenhand an das Segment angefügt werden.
  • In besonderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, die DNA-Sequenzen inkorporieren, die für TPO-Protein, -Polypeptid oder -Peptid kodieren, das in seine Aminosäuresequenz eine zusammenhängende Aminosäuresequenz in Übereinstimmung mit oder im Wesentlichen wie in SEQ ID NR: 2 dargestellt, umfaßt.
  • Der Begriff "eine Sequenz im Wesentlichen wie in SEQ ID NR: 2" bedeutet, daß die Sequenz im Wesentlichen zu einem Teil der SEQ ID NR: 2 korrespondiert und nur wenige Aminosäuren aufweist die nicht identisch hierzu oder die ein biologisch funktionelles Äquivalent von der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 sind.
  • Der Begriff "biologisch funktionelles Äquivalent" ist im Stand der Technik gut bekannt und wird hierin im weiteren Detail definiert. Dementsprechend sind Sequenzen, die zwischen etwa 70% und etwa 80%; oder noch bevorzugter zwischen etwa 81% und 90%; oder sogar noch bevorzugter zwischen etwa 91% und etwa 99% identische Aminosäuren oder funktio nell äquivalente Aminosäuren zu den Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 aufweisen, Sequenzen, die eine "Sequenz im Wesentlichen wie in SEQ ID NR: 2" aufweisen unter der Voraussetzung, daß die biologische Aktivität, d. h. die thrombopoetische und/oder Kältekonservierungsaktivität des Proteins, Polypeptides oder Peptides bewarf wird.
  • Im bestimmten anderen Ausführungsformen betrifft die Offenbarung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, die innerhalb ihrer Sequenz eine Nukleinsäuresequenz im Wesentlichen wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt, umfassen. Der Begriff "im Wesentlichen wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt" wird in der selben Bedeutung wie oben beschrieben, verwendet und bedeutet, daß die Nukleinsäuresequenz im Wesentlichen zu einem Teil der SEQ ID NR: 1 korrespondiert und nur relativ wenige Codons aufweist, die nicht identisch oder funktionell äquivalent zu den Codons der SEQ ID NR: 1 sind. Wiederum werden DNA-Segmente, die für Proteine kodieren, welche thrombopoetische und/oder kältekonservierende Aktivität zeigen, am meisten bevorzugt sein.
  • Der Begriff "funktionell äquivalentes Codon" wird hierin verwendet, um Codons zu bezeichnen, die für die selbe Aminosäure kodieren wie die 6 Codons, die für Arginin oder für Serin kodieren, und bezeichnet auch Codons, die für biologisch äquivalente Aminosäuren kodieren. Für die Optimierung der Expression von TPO in menschlichen Zellen sind die Codons in der Reihenfolge ihrer Bevorzugung ihrer Verwendung von links nach rechts in Tabelle 1 gezeigt. Das am meisten bevorzugte Codon für Alanin ist daher "GCC" und das am wenigsten bevorzugte "GCG" (siehe Tabelle 1, unten).
  • Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Es wird auch verstanden werden, daß Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen zusätzliche Reste umfassen können wie zusätzliche N- oder C-terminale Aminosäuren oder 5' oder 3' Sequenzen und dennoch im wesentlichen wie in einer der hierin offenbarten Sequenzen seien können, solange die Sequenz die oben dargestellten Kriterien erfüllt, die die Bewahrung der biologischen Proteinaktivitäten, wenn die Proteinexpression betroffen ist, umfaßt. Das Hinzufügen endständiger Sequenzen betrifft insbesondere Nukleinsäuresequenzen, die beispielsweise verschieden nicht-kodierende Sequenzen, die entweder die 5' oder 3'-Teile der kodierenden Region flankieren oder die verschiedene interne Sequenzen, d. h. Introns umfassen, von denen bekannt ist, daß sie in Genen auftreten.
  • Unter Ausnahme von Introns oder flankierenden Regionen und unter der Zulassung der Degeneration des genetischen Codes sind Sequenzen, die zwischen etwa 70% und 79%, oder noch bevorzugter zwischen etwa 80% und etwa 89%, oder sogar noch bevorzugter zwischen etwa 90% und etwa 99% Nukleotide aufweisen, die identisch zu den Nukleotiden der SEQ ID NR: 1 sind, Sequenzen, die "im wesentlichen wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt" sind.
  • Die Sequenzen, die im wesentliche dieselben sind wie in SEQ ID NR: 1, können auch funktionell als die Sequenzen definiert werden, die dazu in der Lage sind an Nukleinsäuresequenzen, die das Komplement der SEQ ID NR: 1 enthalten, unter relativ stringenten Bedingungen zu hybridisieren. Geeignete, relativ stringente Hybridisierungsbedingungen werden dem Fachmann wohl bekannt sein, wie hierin offenbart.
  • Für die Hybridisierung wird verstanden werden, daß sie das Bilden eines doppelsträngigen Moleküls oder ein Moleküls mit partiell doppelsträngiger Natur bedeutet. Stringente Bedingungen sind die, die die Hybridisierung zwischen zwei homologen Nukleinsäuresequenzen erlauben, aber die Hybridisierung zwischen Zufallsequenzen verhindern. Beispielsweise wird die Hybridisierung bei niedriger Temperatur und/oder hoher ionischer Stärke als niedrigstringent bezeichnet. Die Hybridisierung bei hoher Temperatur und/oder niedriger ionischer Stärke wird als hochstringent bezeichnet. Niedrige Stringenz wird im allgemeinen bei 0,15 M bis 0,9 M Salz (beispielsweise NaCl) in einem Temperaturbereich von 20°C bis 50°C durchgeführt. Hohe Stringenz wird im allgemeinen bei 0.02 M bis 0.15 M Salz (z. B. NaCl) und in einem Temperaturbereich von 50°C bis 70°C durchgeführt. Es wird verstanden werden, daß die Temperatur und die ionische Stärke der gewünschten Stringenz zum Teil durch die Länge der jeweiligen Sonde, die Länge und die Basenzusammensetzung der Zielsequenzen und von der Gegenwart von Formamid, Tetramethylammoniumchlorid oder anderen Lösungsmitteln in dem Hybridisierungsgemisch bestimmt werden wird. Es wird auch verstanden, daß diese Bereiche lediglich beispielhaft erwähnt werden und daß die gewünschte Stringenz für eine bestimmte Hybridisierungsreaktion häufig empirisch durch Vergleich der positiven und negativen Kontrollen bestimmt wird.
  • Demgemäß können die Nukleotidsequenzen der Offenbarung aufgrund ihrer Fähigkeit verwendet werden selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Abschnitten von Genen oder RNA zu bilden oder um Primer für die Vervielfältigung von DNA oder RNA aus Gewebe zur Verfügung zu stellen. Abhängig von der beabsichtigten Anwendung ist es bevorzugt verschiedene Bedingungen der Hybridisierung einzusetzen, um verschiedene Grade der Selektivität der Sonde im Hinblick auf die Zielsequenz zu erreichen.
  • Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, ist es bevorzugt relativ stringente Bedingungen einzusetzen, um Hybride zu bilden. Beispielsweise relativ niedrige Salz- und/oder hohe Temperaturbedingungen, wie die, die durch etwa 0, 02 M bis etwa 0.10 M NaCl bei Temperaturen von etwa 50°C bis etwa 70°C zur Verfügung gestellt werden. Solche hochstringenten Bedingungen tolerieren nur wenig wenn überhaupt irgendwelche Fehlpaarungen zwischen der Sonde und der Matrize oder dem Zielstrang und wären besonders für die Isolierung spezifischer Gene oder den Nachweis spezifischer mRNA-Transskripte geeignet. Es wird im allgemeinen erkannt werden, daß die Bedingungen durch das Hinzufügen ansteigender Formamidmengen stringenter gemacht werden können.
  • Natürlich umfaßt die vorliegende Offenbarung auch DNA-Segmente, die komplementär oder im wesentlichen komplementär zu der Sequenz sind, die in SEQ ID NR: 1 dargestellt ist. Nukleinsäuresequenzen, die "komplementär" sind, sind die die dazu in der Lage sind Basenpaarung gemäß den Standard Watson-Crick Komplementaritätsregeln auszubilden. Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff "komplementäre Sequenzen" Nukleinsäuresequenzen, die im wesentlichen komplementär sind wie durch den selben Nukleotidvergleich der oben dargestellt wurde bewertet werden kann oder wie durch die Fähigkeit definiert werden kann mit den Nukleinsäuresequenzen der SEQ ID NR: 1 unter relativ stringenten Bedingungen wie die hierin beschriebenen, zu hybridisieren.
  • Die Nukleinsäuresegmente können, unabhängig von der Länge der kodierenden Sequenz selbst, mit anderen DNA-Sequenzen wie Promotoren, Enhancern, Polyadenylierungssignalen, zusätzlichen Restriktionsenzymschnittstellen, Mehrfachklonierungsstellen, anderen kodierenden Segmenten und ähnlichen verbunden werden, so daß ihre Gesamtlänge beträchtlich variieren kann. Es wird daher erwogen, daß ein Nukleinsäurefragment von nahezu jeder Länge eingesetzt werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die Leichtigkeit der Zubereitung und der Verwendung in dem beabsichtigten rekombinanten DNA-Protokoll begrenzt wird.
  • Beispielsweise können Nukleinsäurefragmente zubereitet werden die einen zusammenhängende Nukleotidbereich aufweisen, der identisch zu oder komplementär zu SEQ ID NR: 1 über etwa 8, etwa 9, etwa 10, etwa 11, etwa 12, etwa 13, etwa 14, etwa 15, etwa 16, etwa 17, etwa 18, etwa 19, etwa 20, etwa 21, etwa 22, etwa 23, etwa 24, etwa 25, etwa 26, etwa 27, etwa 28, etwa 29, etwa 30, etwa 31, etwa 32, etwa 33, etwa 34, etwa 35, etwa 36, etwa 37, etwa 38, etwa 39, etwa 40, etwa 41, etwa 42, etwa 43, etwa 44, etwa 45, etwa 46, etwa 47, etwa 48, etwa 49, etwa 50, etwa 51, etwa 52, etwa 53, etwa 54, etwa 55, etwa 56, etwa 57, etwa 58, etwa 59, etwa 60, etwa 61, etwa 62, etwa 63, etwa 64, etwa 65, etwa 66, etwa 67, etwa 68, etwa 69, etwa 70, etwa 71, etwa 72, etwa 73, etwa 74, etwa 75, etwa 76, etwa 77, etwa 78, etwa 79, etwa 80, etwa 81, etwa 82, etwa 83, etwa 84, etwa 85, etwa 86, etwa 87, etwa 88, etwa 89, etwa 90, etwa 91, etwa 92, etwa 93, etwa 94, etwa 95, etwa 96, etwa 97, etwa 98, etwa 99, etwa 100, etwa 125, etwa 150, etwa 250, etwa 300, etwa 400, etwa 600, etwa 750, etwa 800 oder etwa 900 Nukleotide ist und die eine Länge bis zu etwa 1 000 000, etwa 750 000, etwa 500 000, etwa 250 000, etwa 100 000, etwa 50 000, etwa 20 000 oder etwa 10 000 oder 5 000 Basenpaare aufweisen, wobei Segmente von 3 000 in bestimmten Fällen bevorzugt werden. In bestimmten Fällen werden Nukleotidsegmente mit 1 000 000 Basen oder mehr, die DNA-Stücke von Chromosomengröße umfasen, als nützlich erwogen. DNA-Segmente mit einer Gesamtlänge von etwa 1 000, etwa 500, etwa 200, etwa 100 und etwa 50 Basenpaarenlänge (umfassend alle Zwischenlängen) werden auch als nützlich erwogen.
  • Es wird ohne weiteres Verstanden werden, daß "Zwischenlängen" in diesem Zusammenhang alle Längen zwischen den genannten Bereichen bedeutet wie 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; umfassend alle geraden Zahlen in den Bereichen 200–500; 500–1000; 1000–2000; 2000–3000; 3000–5000; 5000–10000 bis zu und umfassend Sequenzen von etwa 12 001, 12002, 13 001, 13002, 15 000, 20 000 und ähnliche.
  • Die verschiedenen Sonden und Primer, die anhand der offenbarten Nukleotidsequenzen entworfen werden können, können jede beliebige Länge aufweisen. Durch das Zuweisen numerischer Werte an eine Sequenz, beispielsweise ist der erste Rest 1, der zweite Rest 2, etc. kann ein Algorithmus, der alle Primer definiert, aufgestellt werden: n bis n + ywobei n eine gerade Zahl von 1 bis zur letzten Zahl der Sequenz ist und y die Länge des Primers –1 ist, wobei n + y nicht die letzte Zahl der Sequenz übersteigt. Daher korrespondieren für ein 10-mer die Sonden zu den Basen 1 bis 10, 2–11, 3–12, ... usw. Für ein 15-mer korrespondieren die Sonden zu den Basen 1–15, 2–16, 3–17 ... usw. Für ein 20-mer korrespondieren die Sonden zu den Basen 1–20, 2–21, 3–23, usw.
  • Es wird auch verstanden werden, daß diese Offenbarung nicht auf die bestimmte Nukleinsäure und Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 1 beschränkt ist. Rekombinante Vektoren und isolierte DNA-Segmente können daher beliebig diese kodierenden Regionen selbst, kodierende Regionen, die ausgewählte Veränderung oder Modifikation in der Basis kodierenden Region umfassen, oder sie können größere Polypeptide, die nichtsdestoweniger solche kodierenden Regionen umfassen, oder biologisch funktionell äquivalente Proteine, Polypeptide oder Peptide, die abweichende Aminosäuresequenzen aufweisen, kodieren, umfassen.
  • Die DNA-Segmente umfassen biologisch funktionell äquivalente TPO-Proteine, -Polypeptide und -Peptide. Solche Sequenzen können sich als Konsequenz der Codonredundanz und der funktionellen Äquivalenz ergeben, von denen bekannt ist, daß sie natürlicherweise innerhalb von Nukleinsäuresequenzen und den dadurch kodierten Protein auftritt. Alternativ können funktionell äquivalente Proteine, Polypeptide oder Peptide durch die Anwendung rekombinanter DNA-Technologie erzeugt werden, wobei die Änderung der Proteinstruktur beruhend auf Erwägungen über die Eigenschaften der Aminosäuren, die ausgewechselt werden, konstruiert werden. Die vom Menschen entworfenen Änderungen können beispielsweise durch die Anwendung von Orts-gerichteter Mutageneseverfahren wie hierin weiter unten diskutiert, eingeführt werden, z. B. um Verbesserung der Antigenität des Proteins einzuführen, d. h. seine Antigenität bei Verabreichung an einen Patienten zu verringern oder, um Mutanten zu testen, um die Thrombopoietinaktivität eines Proteins auf der molekularen Ebene zu untersuchen.
  • Man kann auch Fusionsproteine, Polypeptide und Peptide erzeugen, worin z. B. die Thrombopoietinprotein-kodierende Region innerhalb derselben Expressionseinheit mit anderen Proteinen oder Peptiden, die gewünschte Funktionen wie für Reinigungs- oder Immunnachweiszwecke aufweisen (z. B. Proteine, die durch Affinitätschromatographie bzw. Enzym-Markierungs-Kodierungs-Regionen gereinigt werden können) angeordnet werden.
  • Zusätzlich zu den "Standard"-DNA- und -RNA-Nukleotidbasen werden auch modifizierte Basen für die Verwendung in bestimmten Anwendungen der vorliegenden Erfindung erwogen. Eine Liste beispielhafter aber nicht einschränkender modifizierter Basen wird hierin weiter unten zur Verfügung gestellt.
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • B. Rekombinante Vektoren, Wirtszellen und Expression
  • Der Begriff "Expressionsvektor oder Konstrukt" bedeutet jeden Typ eines genetischen Konstrukts, der Nukleinsäure enthält, die für ein Genprodukt kodiert, in dem ein Teil oder die gesamte kodierende Nukleinsäuresequenz dazu in der Lage ist, transkribiert zu werden. Das Transkript kann in ein Protein translatiert werden muß es aber nicht. Daher umfaßt in bestimmten Ausführungsformen die Expression sowohl die Transkription eines Gens als auch die Translation einer RNA in das Genprodukt. In anderen Ausführungsformen umfaßt die Expression nur die Transkription der Nukleinsäure beispielsweise, um Antisense-Konstrukte zu erzeugen.
  • Als besonders nützliche Vektoren werden die Vektoren erwogen, in denen der kodierende Teil des DNA-Segments unabhängig davon, ob er für ein Protein voller Länge, ein Polypeptid oder ein kleineres Peptid kodiert unter der transkriptionellen Kontrolle eines Promotors positioniert ist. Ein "Promotor" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die durch die synthetische Maschinerie der Zelle oder eine eingeführte synthetische Maschinerie erkannt wird, und die benötigt wird, um die spezifische Transkription eines Gens zu initiieren. Die Ausdrücke "operative positioniert", "unter der Kontrolle" oder "unter der transkriptionellen Kontrolle" bedeuten, daß der Promotor an der richtigen Stelle und Orientierung im Verhältnis zur Nukleinsäure ist, um RNA-Polymeraseinitiation und die Expression des Gens zu kontrollieren. Der Promotor kann in der Form eines Promotors vorliegen, der natürlicherweise mit einem Thrombopoietingen assoziiert ist oder kann durch die Isolierung von 5'-nicht-kodierenden Sequenzen, die stromaufwärts von dem kodierenden Segment oder Exon liegen beispielsweise unter Verwendung rekombinanter Klonierungs- und/oder PCRTM-Technologie im Zusammenhang mit den hierin offenbarten Zusammensetzungen (PCRTM-Technologie wird in U.S. Patent Nr. 4,683,203 und U.S. Patent Nr. 4,682,195 jedes hierin durch Verweis aufgenommen, offenbart) erhalten werden.
  • In anderen Ausführungsformen wird erwogen, daß bestimmte Vorteile durch die Positionierung des kodierenden DNA-Segments unter der Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promotors erhalten werden können. Wie hierin verwendet wird beabsichtigt, daß ein rekombinanter oder heterologer Promotor einen Promotor bezeichnet, der normalerweise nicht mit einem Thrombopoietingen in seiner natürlichen Umgebung assoziiert ist. Solche Promotoren können Promotoren umfassen, die normalerweise mit anderen Genen assoziiert sind und/oder Promotoren, die von jedem(r) beliebigen anderen Bakterium, Virus, eukaryontischer oder Säugetierzelle isoliert wurden und/oder Promotoren, die durch Menschenhand hergestellt worden sind, die nicht "natürlich vorkommend sind", d. h. die verschiedene Elemente von verschiedenen Promotoren oder die Mutationen, die die Expression erhöhen, verringern oder verändern, enthalten.
  • Natürlich wird es wichtig sein, einen Promotor einzusetzen, der die Expression des DNA-Segments in dem Zelltyp, Organismus oder sogar dem Tier, das (der) für die Expression gewählt wird, steuert. Die Verwendung von Promotor- und Zelltypkombinationen für die Proteinexpression ist dem Fachmann der Molekularbiologie im Allgemeinen bekannt, siehe beispielsweise Sambrook et. al. (1989) das hierin durch Verweis aufgenommen wird. Die eingesetzten Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein oder sie können unter geeigneten Bedingungen verwendet werden, um hohe Expressionsmengen der eingeführten DNA-Segmente zu steuern, wie es für die Produktion rekombinanter Proteine oder Peptide im großen Umfang vorteilhaft ist.
  • In einem Promotor wirkt in der Regel mindestens ein Modul, um die Startstelle für die RNA-Synthese zu positionieren. Das am besten bekannte Beispiel davon ist die TATA-Box, aber in einigen Promotoren, denen eine TATA-Box fehlt wie in dem Promotor für das terminale Deoxynukleotidyltransferasegen aus dem Säugetier und dem Promotor für die SV40-"Late"-Gene hilft ein begrenztes Element, das die Startstelle selbst überlappt, dabei den Ort der Initiation festzulegen.
  • Weitere Promotorelemente regulieren die Häufigkeit der transkriptionellen Initiation. Typischerweise sind diese in der Region 30–110 bp stromaufwärts von der Startstelle angeordnet, obwohl für eine Anzahl von Promotoren gezeigt worden ist, daß sie auch funktionelle Elemente stromabwärts von der Startstelle enthalten. Der Abstand zwischen Promotorelementen ist häufig flexibel, so daß die Promotorfunktion bewahrt werden kann, wenn die Elemente invertiert oder relativ zueinander bewegt werden. In dem tk-Promotor kann der Abstand zwischen den Promotorelementen bis auf einen 50 bp Abstand erhöht werden, bevor die Aktivität abzunehmen beginnt. Abhängig vom Promotor scheint es, daß die einzelnen Elemente entweder kooperativ oder unabhängig voneinander wirken können, um die Transkription zu aktivieren.
  • Der jeweilige Promotor, der eingesetzt wird, um die Expression einer Nukleinsäure zu kontrollieren, wird nicht als kritisch erachtet, solange er dazu in der Lage ist, die Nukleinsäure in der Zielzelle zu exprimieren. Daher ist es, wenn auf eine menschliche Zelle abgezielt wird, bevorzugt, Nukleinsäure-kodierende Regionen angrenzend zu und unter der Kontrolle von einem Promotor zu positionieren, der dazu in der Lage ist, in menschlichen Zellen exprimiert zu werden. Allgemein gesprochen kann ein solcher Promotor entweder einen menschlichen oder einen viralen Promotor umfassen.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann der menschliche Cytomegalovirus (CMV) "immediate early gene"-Promotor, der SV40-"Early"-Promotor und der Rous Sarcoma Virus "long terminal repeat" (lange endständige Wiederholung) verwendet werden, um hohe Expressionsmengen der Nukleinsäuren der Erfindung zu erhalten. Die Verwendung anderer viraler oder zellulärer Säugetier oder bakterieller Phagen-Promotoren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, um Expression zu erhalten, werden auch unter der Voraussetzung, daß die Expressionsmengen für den jeweiligen Zweck ausreichend sind, erwogen. Die Tabellen 3 und 4 unten führen mehrere Elemente/Promotoren auf, die im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um die Expression eines Thrombopoietingens zu regulieren. Diese Liste ist nicht als erschöpfend für alle möglichen Elemente gedacht, die an der Förderung der Expression teilnehmen, sondern lediglich als dafür beispielhaft.
  • Enhancer wurden ursprünglich als genetische Elemente entdeckt, die die Transkription von einem Promotor erhöhten, der an einer entfernten Stelle auf demselben DNA-Molekül angeordnet war. Diese Fähigkeit über große Distanzen zu wirken, hatte kein Beispiel in klassischen Studien der prokaryontischen transkriptionellen Regulation. Anschließende Arbeit zeigte, daß Regionen der DNA mit Enhancer-Aktivität ähnlich wie Promotoren organisiert sind.
  • Das bedeutet, sie sind aus vielen einzelnen Elementen zusammengesetzt, wobei jedes an ein oder mehr Transkriptionsproteine bindet.
  • Der grundlegende Unterschied zwischen Enhancern und Promotoren ist ein funktioneller. Eine Enhancer-Region als Ganzes, muß dazu in der Lage sein, die Transkription über einen Abstand zu stimulieren; dies muß nicht für eine Promotor-Region oder ihre Komponenten der Fall sein. Auf der anderen Seite muß ein Promotor ein oder mehrere Elemente aufweisen, die die Initiation der RNA-Synthese an einer bestimmten Stelle und in einer bestimmten Orientierung initiieren, wohingegen Enhancern diese Spezifität fehlt. Promotoren und Enhancer sind häufig überlappend und zusammenhängend und scheinen häufig eine sehr ähnliche modulare Organisation aufzuweisen.
  • Zusätzlich kann jede beliebige Promotor/Enhancer-Kombination (wie aus der eukaryontischen Promotor-Datenbank EPCB ersichtlich) auch verwendet werden, um die Expression anzutreiben. Die Verwendung eines T3, T7 oder eines SP6 zytoplasmatischen Expressionssystems ist eine weitere mögliche Ausführungsform. Eukaryontische Zellen können eine zytoplasmatische Transkriptionen von bestimmten bakteriellen Promotoren unterstützen, wenn die entsprechende bakterielle Polymerase zur Verfügung gestellt wird, entweder als Teil des Überträgerkomplexes oder als ein zusätzliches genetisches Expressionskonstrukt.
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Wenn man sich nunmehr der Expression der Thrombopoietinproteine zuwendet, sobald ein geeigneter Klon oder Klone erhalten worden ist (sind), unabhängig davon, ob sie auf cDNA oder auf genomischer DNA beruhen, kann man voranschreiten, um ein Expressionssystem herzustellen. Die Konstruktion eines (von) DNA-Segmenten) für die Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen System kann durch Techniken durchgeführt werden, die denen, die mit der rekombinanten Expression vertraut sind, im allgemeinen bekannt sind. Es wird angenommen, daß nahezu jedes Expressionssystem zur Expression der Proteine verwendet werden kann.
  • Sowohl cDNA als auch genomische Sequenzen sind für die eukaryontische Expression geeignet, da die Wirtszellen im allgemeinen die genomischen Transkripte bearbeiten, um funktionelle mRNA für die Translation in Protein zu ergeben. Allgemein gesagt, kann es bequemer sein, als rekombinantes Gen eine cDNA-Version des Gens einzusetzen. Es wird angenommen, daß die Verwendung einer cDNA-Version Vorteile zur Verfügung stellt, da die Größe des Gens im allgemeinen viel kleiner sein wird und da sie leichter, als ein genomisches Gen, das typischerweise bis zu einer Größenordnung oder mehr größer als das cDNA-Gen ist, eingesetzt werden kann, um die Zielzelle zu transfizieren. Es wird jedoch erwogen, daß die genomische Version eines bestimmten Gens verwendet werden kann, wenn gewünscht.
  • Bei der Expression wird man typischerweise ein Polyadenylierungssignal aufnehmen, um die richtige Polyadenylierung des Transkripts zu bewirken. Es wird angenommen, daß die Natur des Polyadenylierungssignals für die erfolgreiche Ausführung der Erfindung nicht entscheidend ist und das jede solche Sequenz eingesetzt werden kann. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen das SV40-Polyadenylierungssignal und das Rinder-Wachsstumshormon-Polyadenylierungssignal, das geeignet ist und für das bekannt ist, daß es gut in verschiedenen Zielzellen funktioniert. Als ein Element der Expressionskassette wird auch ein Terminator erwogen. Diese Elemente können dazu dienen, die Menge der Nachricht zu erhöhen und das Durchlesen über die Transkriptionskassette hinaus in andere Sequenzen zu minimieren.
  • Ein spezifisches Initiationssignal kann auch für die effiziente Translation der kodierenden Sequenzen erforderlich sein. Diese Signale umfassen das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. Es kann erforderlich sein exogene translationelle Kontrollsignale, die das ATG-Initiationscodon umfassen, zur Verfügung zu stellen. Der Fachmann wird ohne weiteres dazu in der Lage sein, dies zu bestimmen und die entsprechenden Signale zur Verfügung zu stellen. Es ist allgemein bekannt, daß das Initiationscodon im "Leseraster" mit dem Leseraster der gewünschten kodierenden Sequenz sein muß, um die Translation des gesamten eingefügten Elements sicherzustellen. Die exogenen translationellen Kontrollsignale und Initiationscodons können entweder natürlich oder synthetisch sein. Die Effizienz der Expression kann durch die Aufnahme geeigneter Transkriptions-Enhancer-Elemente verstärkt werden.
  • Es wird vorgeschlagen, daß die TPO-Proteine, -Polypeptide oder -Peptide mit anderen ausgewählte Proteinen koexprimiert werden können, wobei die Proteine in derselben Zelle koexprimiert werden können oder (ein) TPO-Gene) kann einer Zelle verabreicht werden, die bereits ein anderes ausgewähltes Protein aufweist. Die Koexpression kann durch die Kotransfektion der Zelle mit zwei verschiedenen rekombinanten Vektoren, wobei jeder eine Kopie der jeweiligen DNA trägt, erreicht werden. Alternativ kann ein einzelner rekombinanter Vektor konstruiert werden, um die kodierenden Regionen für beide Proteine zu umfassen, die dann in den Zellen, die mit dem einzelnen Vektor transfiziert sind, exprimiert werden können. In jedem Fall bezeichnet der Begriff "Koexpression" hierbei die Expression sowohl des (der) TPO-Gen(s) als auch anderer ausgewählter Proteine in derselben rekombinanten Zelle.
  • Wie hierin verwendet, ist es beabsichtigt, daß die Begriffe "konstruierte" und "rekombinante" Zelle oder Wirtszelle eine Zelle bezeichnen, in die ein exogenes DNA-Segment oder Gen wie eine cDNA oder ein Gen, das für ein TPO-Protein kodiert, eingeführt worden ist. Daher sind konstruierte Zellen von natürlich vorkommenden Zellen unterscheidbar, die keine rekombinant eingeführtes exogenes DNA-Segment oder Gen enthalten. Konstruierte Zellen sind daher Zellen, die (ein) durch Menschenhand eingeführte(s) Gen oder Gene aufweisen. Die rekombinanten Zellen umfassen die, die ein eingeführtes cDNA- oder genomisches Gen aufweisen und die auch Gene umfassen, welche angrenzend an einen Promotor positioniert sind, der natürlicherweise nicht mit dem jeweilig eingeführten Gen assoziiert ist.
  • Um ein rekombinantes TPO-Protein, Polypeptid oder Peptid zu exprimieren, ob mutiert oder Wildtyp, würde man in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ein Expressionsvektor herstellen, der eine Wildtyp oder eine mutierte Thrombopoietinprotein-kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle von einem oder mehreren Promotoren umfaßt. Um eine kodierende Sequenz "unter die Kontrolle eines" Promotors zu bringen, positioniert man das 5'-Ende der Transkriptions-Initiationsstelle des transkriptionellen Leserasters im allgemeinen zwischen etwa 1 und etwa 50 Nukleotiden "stromabwärts" (d. h. 3' von) dem ausgewählten Promotor. Der "stromaufwärts"-gelegene Promotor stimuliert die Transkription der DNA und fördert die Expression des kodierten rekombinanten Proteins. Dies ist in diesem Zusammenhang die Bedeutung von "rekombinanter Expression".
  • Viele Standardtechniken sind erhältlich, um Expressionsvektoren, die geeignete Nukleinsäuren und transkriptionellen/translationellen Kontrollsequenzen enthalten, um Protein-, Polypeptid- oder Peptidexpression in einer Vielzahl von Wirtsexpressionssystemen zu erreichen, zu konstruieren. Die Zelltypen, die für die Expression verfügbar sind, umfassen sind aber nicht eingeschränkt auf Bakterien wie E. coli und B. subtilis, die mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA Expressionsvektoren transformiert sind.
  • Bestimmte Beispiele prokaryontischer Wirte sind der E. coli-Stamm RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1176 (ATCC Nr. 31537) sowie E. coli W3110 (F-, λ-, prototrophisch, ATCC Nr. 273225); Bazilli wie Bacillus subtilis; und andere Enterobakteriae wie Salmonella typhimurium, Serratia marcescens und verschiedene Pseudonomas-Spezies.
  • Im allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikations- und Kontrollsequenzen enthalten, die von Spezies abgeleitet sind, die zu der Wirtszelle kompatibel sind, im Zusammenhang mit diesen Wirten verwendet. Die Vektoren tragen üblicherweise eine Replikationsstelle sowie Markierungssequenzen, die dazu in der Lage sind eine phenotypische Selektion der transformierten Zellen zur Verfügung zu stellen. Beispielsweise wird E. coli häufig unter Verwendung von Derivaten von pBR322, einem Plasmid, das von einer E. coli-Spezies abgeleitet ist, transformiert. Das pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt daher einfache Mittel für die Identifizierung der transformierten Zellen zur Verfügung. Das pBR-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder eine Phage muß auch Promotoren enthalten oder modifiziert sein diese zu enthalten, die von dem mikrobiellen Organismus für die Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden.
  • Zusätzlich enthalten Phagenvektoren Replikations- und Kontrollsequenzen, die zu dem Wirtsmikroorganismus kompatibel sind und die als transformierende Vektoren in Zusammenhang mit diesen Wirt verwendet werden können. Beispielsweise kann der Phage λ-GEMTM-11 zur Herstellung eines rekombinanten Phagenvektors eingesetzt werden, der verwendet werden kann, um Wirtszellen wie E. coli LE392 zu transformieren.
  • Weitere nützliche Vektoren umfassen pIN-Vektoren (Inouye et al., 1985); und pGEX-Vektoren für die Verwendung in Glutathion-S-Transferase (GST) löslichen Fusions-Proteinen für die spätere Reinigung und Abtrennung oder Spaltung. Andere geeignete Fusions-Proteine sind die mit β-Galactosidase, Ubiquitin und ähnlichem.
  • Die Promotoren, die am häufigsten bei der rekombinanten DNA-Konstruktion verwendet werden, umfassen die β-Lactamase- (Penicillinase), Lactose- und Tryptophan-(trp)-Promotorsysteme. Während diese die sind, die am häufigsten verwendeten werden, sind andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet worden und Details, die ihre Nukleotidsequenzen betreffen, sind publiziert worden, was den Fachmann in die Lage versetzt, sie funktionell in Plasmidvektoren zu ligieren.
  • Die folgenden Details betreffen die rekombinante Proteinproduktion in bakteriellen Zellen wie E. coli und sind als beispielhafte Information über die rekombinante Proteinproduktion im allgemeinen zur Verfügung gestellt, deren Anpassung an ein bestimmtes rekombinantes Expressionssystem dem Fachmann bekannt sein wird.
  • Bakterielle Zellen, beispielsweise E. coli, die den Expressionsvektor enthalten, werden in einer Vielzahl geeigneter Medien, beispielsweise LB, wachsen gelassen. Die Expression des rekombinanten Proteins kann induziert werden, z. B. durch das Hinzufügen von IPTG zu dem Medium oder durch das Wechseln der Inkubation auf eine höhere Temperatur. Nach dem Kultivieren der Bakterien über einen weiteren Zeitraum, im allgemeinen zwischen 2 und 24 Stunden, werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und gewaschen, um Restmedium zu entfernen.
  • Die bakteriellen Zellen werden dann lysiert, beispielsweise durch zerreißen in einem Zellhomogenisator und zentrifugieren, um dichte Einschlußkörper und Zellmembranen von den löslichen Zellbestandteilen abzutrennen. Diese Zentrifugation kann unter Bedingungen durchgeführt werden, bei denen die dichten Einschlußkörper selektiv durch die Aufnahme von Zuckern, wie Saccharose, in den Puffer angereichert werden und durch die Zentrifugation mit einer ausgewählten Geschwindigkeit.
  • Wenn das rekombinante Protein in Einschlußkörpern exprimiert wird, wie es häufig der Fall ist, können diese mit jeder einer Vielzahl von Lösungen gewaschen werden, um einige der kontaminierenden Wirtsproteine zu entfernen, dann können sie in Lösungen, die hohe Harnstoffkonzentrationen enthalten (z. B. 8 M) oder in chaotrophen Mitteln, wie Guanidinhydrochlorid, in der Gegenwart von reduzierenden Mitteln, wie β-Mercaptoethanol oder DTT (Dithiothreitol) gelöst werden.
  • Unter bestimmten Bedingungen kann es vorteilhaft sein, die Proteine für mehrere Stunden unter Bedingungen zu inkubieren, unter denen das Protein einen Rückfaltungsprozeß in eine Konformation, die der des nativen Proteins ähnlicher ist, durchmacht. Solche Bedingungen umfassen im allgemeinen eine niedrige Proteinkonzentration, weniger als 500 mg/ml, niedrige Mengen eines reduzierenden Mittels, Harnstoffkonzentrationen von weniger als 2 M und häufig die Gegenwart von Reagenzien, wie einem Gemisch aus reduzierten und oxidierten Glutathion, das den Austausch von Disulfidbrücken mit dem Proteinmolekül ermöglicht.
  • Der Rückfaltungsprozeß kann beispielsweise durch SDS-PAGE oder mit Antikörpern, die für das native Molekül spezifisch sind (die von Tieren erhalten werden können, die mit dem nativen Molekül oder geringen Mengen des rekombinanten Proteins vakziniert wurden) überwacht werden. Auf die Rückfaltung hin kann das Protein dann weiter gereinigt werden und von dem Rückfaltungsgemisch durch Chromatographie auf jedem einer Vielzahl von Trägern, die Ionenaustausch-Harze, Geldurchdringungs-Harze oder eine Vielzahl von Affinitätssäulen umfassen, abgetrennt werden.
  • Für die Expression in Saccharomyces wird beispielsweise häufig das Plasmid YRp7 verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das ein Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm zur Verfügung stellt, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, wie beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1. Die Gegenwart der trp1-Defiziens als Charakteristikum des Hefewirtszell-Genoms stellt dann eine wirksame Umgebung zur Verfügung, um die Transformation durch das Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan nachzuweisen.
  • Geeignete Promotorsequenzen in Hefe-Vektoren umfassen die Promotoren für die 3-Phosphorglycerat-Kinase oder andere glycolytische Enzyme wie die Enolase, die Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, die Hexokinase, die Pyruvatdecarboxylase, die Phosphofructokinase, die Glykose-6-Phosphatisomerase, die 3-Phosphoglyceratmutase, die Pyruvatekinase, die Triosephosphatisomerase, die Phosphoglucoseisomerase und die Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesem Gen assoziierten Ter minationssequenzen auch in die Expressionsvektoren 3' der Sequenzen von denen gewünscht wird, daß sie exprimiert werden, kloniert, um eine Polyadenylierung der mRNA und eine Termination zur Verfügung zu stellen.
  • Andere geeignete Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der Transkriptionskontrolle durch die Wachstumsbedingungen aufweisen, umfassen die Promotor-Regionen für die Alkoholdehydrogenase 2, das Isocytochrom C, die saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffwechsel assoziiert sind, und die zuvor genannte Glycerataldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galctose-Nutzung verantwortlich sind.
  • Zusätzlich zu den Mikroorganismen können auch Zellkulturen, die von multizellulären Organismen abgeleitet sind, als Wirte verwendet werden. Grundsätzlich ist jede solche Zellkultur verwendbar, unabhängig davon ob sie aus einer von Wirbeltier- oder nicht-Wirbeltierkultur stammt. Zusätzlich zu Säugetierzellen umfassen diese Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren Infiziert sind (z. B. Baculovirus); und Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionssystemen infiziert sind (z. B. Blumenkohlmosaik-Virus, CaMV, Tabakmosaik-Virus, TMV) oder die mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid) transformiert sind, die eine oder mehrere TPO-Protein-, – Polypeptid oder -Peptid-kodierende Sequenzen enthalten.
  • In einem nützlichen Insektensystem wird das Autograph californica nukleärer Polyhedrosisvirus (AcNPV) als Vektorsystem verwendet, um fremde Gene zu exprimieren. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die TPO-Protein-, -Polypeptid- oder -Peptid-kodierenden Sequenzen werden in nicht-lebensnotwendige Regionen (beispielsweise das Polyhydrin-Gen) des Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors kloniert (beispielsweise den Polyhydrin-Promotor). Die erfolgreich Einführung der kodierenden Sequenzen führt zu Inaktivierung des Polyhydrin-Gens und zur Herstellung nichtverschlossenen rekombinanten Virus (d. h. Virus, dem die Protein-artige Hülle, für die das Polyhydrin-Gen kodiert, fehlt). Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in denen das eingefügte Gen exprimiert wird (z. B. U.S. Patent Nr. 4,215,051, Smith, hierin durch Verweis aufgenommen).
  • Beispiele nützlicher Säugetierwirtszellinien sind VERO- und HeLa-Zellen, chinesische Hamstereizellzellinien (CHO = "Chinese hamster ovary"), WI38, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN und MDCK-Zellinien. Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm gewählt werden, der die Expression der eingefügten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der spezifisch gewünschten Weise modifiziert und prozessiert. Solche Modifikationen (z. B. Glycosylierung) und Prozessierung (z. B. Spaltung) von Proteinprodukten kann für die Funktion des Proteins wichtig sein.
  • Verschiedene Wirtszellen weisen charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationelle Prozessierung und Modifikation der Proteine auf. Geeignete Zellinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die richtige Modifikation und Prozessierung des exprimierten fremden Proteins sicherzustellen.
  • Expressionsvektoren für die Verwendung in Säugetierzellen umfassen üblicherweise einen Replikationsursprung (wie erforderlich), einen Promotor, der vor dem zu exprimierenden Gen angeordnet ist, zusammen mit allen notwendigen Ribosom-Bindungsstellen, RNA splice-Stellen, Polyadenylierungsstellen und transkriptionelle Terminationssequenzen. Der Replikationsursprung kann entweder durch die Konstruktion des Vektors in der Weise, das er einen exogenen Ursprung umfaßt, wie er von SV40 oder anderen viralen Quellen (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) abgeleitet werden kann, zur Verfügung gestellt werden oder kann durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle zur Verfügung gestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellchromosom integriert wird, ist das letztere meist ausreichend.
  • Die Promotoren können aus dem Genom von Säugetierzellen (z. B. Metallothionin-Promotor) oder aus Säugetier-Viren (z. B. der Adenovirus-"Late"-Promotor; der Vakzinia-Virus 7.5 K-Promotor) abgeleitet sein. Des weiteren ist es möglich und kann es wünschenswert sein Promotor- und Kontrollsequenzen zu verwenden, die normalerweise mit (der) TPO-Gensequenz(en) assoziiert sind unter der Voraussetzung das solche Sequenzen mit dem Wirtszellsystem kompatibel sind.
  • Eine Reihe von Expressionssystemen, die auf Viren beruhen, kann verwendet werden, beispielsweise sind häufig verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2 und am häufigsten von Simian Virus 40 (SV40) abgeleitet. Die frühen ("Early") und späten ("Late") Promo toren des SV40-Virus sind besonders nützlich, da sie ohne weiteres aus dem Virus als ein Fragment gewonnen werden können, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält. Kleinere und größere SV40-Fragmente können auch unter der Voraussetzung verwendet werden, daß die etwa 250 bp Sequenz, die sich von der HindIII-Restriktionsstelle zu der BgII-Restriktionsstelle, die in dem viralen Replikationsursprung angesiedelt ist, erstreckt, eingeschlossen ist.
  • In Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, können die kodierenden Sequenzen in einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex ligiert werden, z. B. den späten "Late"-Promotor und die dreiteilige Führungssequenz. Dieses chimäre Gen kann dann durch in vitro oder in vivo-Rekombination in das Adenovirus-Genom eingeführt werden. Die Insertion in eine nicht-wesentliche Region des viralen Genoms (z. B. die Region E1, E3 oder E4) wird zu einem rekombinanten Virus führen, der lebensfähig ist und der dazu in der Lage ist, TPO-Proteine, -Polypeptide oder -Peptide in infizierten Wirten zu exprimieren.
  • Spezifische Initiationssignale können auch für eine effiziente Translation der TPO-Protein, – Polypeptid- oder -Peptid-kodierenden Sequenzen erforderlich sein. Die Signale umfassen das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. Exogene translationelle Kontrollsignale, die das ATG-Initiationscodon umfassen, können zusätzlich zur Verfügung gestellt werden. Ein Fachmann würde ohne weiteres dazu in der Lage sein, dies zu bestimmen und die notwendigen Signale zur Verfügung zu stellen. Es ist gut bekannt, daß das Initiationscodon im Leseraster sein muß (oder in Phase) mit dem Leseraster der gewünschten Sequenz, um die Translation der gesamten Einfügung sicherzustellen. Diese exogenen translationellen Kontrollsignale und Initiationscodons können verschiedenen Ursprungs sein, sowohl natürlichen als auch synthetischen. Die Effizienz der Expression kann durch die Aufnahme geeigneter Transkriptionsenhancer-Elemente und Transkriptionsterminatoren verstärkt werden.
  • Bei der eukaryontischen Expression wird man typischerweise auch wünschen, daß in die transkriptionelle Einheit eine geeignete Polyadenylierungsstelle (z. B. 5'-AATAAA-3') eingebaut wird, wenn eine solche nicht in den ursprünglich klonierten Segment enthalten war. Typischerweise wird die poly-A-Anfügungsstelle etwa 30.000 bis 2.000 Nukleotide "stromabwärts" von der Terminationsstelle des Proteins an einer Position vor der Transkriptionstermination angeordnet.
  • Für die langandauernde Hochausbeute-Produktion des rekombinanten TPO-Proteins, – Polypeptid oder -Peptids ist die stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zellinien, die Konstrukte, welche für ein TPO-Protein, -Polypeptid oder -Peptid kodieren, stabil exprimieren, konstruiert werden. Statt der Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit Vektoren transformiert werden, die durch geeignete Expressionskontrollelemente (z. B. Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen, etc.) und einen auswählbaren Marker kontrolliert sind. Nach der Einführung der fremden DNA, kann es den konstruierten Zellen erlaubt werden für 1 bis 2 Tage in einem angereicherten Medium zu wachsen und dann werden sie auf ein selektives Medium gewechselt. Der auswählbare Marker in dem rekombinanten Plasmid vermittelt eine Resistenz gegen diese Selektion und erlaubt es den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und zu wachsen, um punktförmige Kolonien zu bilden, die wiederum kloniert und zu Zellinien expandiert werden können.
  • Eine Anzahl von Selektionssystemen kann verwendet werden, die Herpes Simplex-Virus-Thymidinkinase (tk), Hypoxanthin-guaninphosphoribosyltransferase (hgprt) und Adeninphoshoribosyltransferase (aprt) Gene, in tk–, hgprt– – bzw. aprt–-Zellen umfassen, aber nicht darauf limitiert sind. Es kann auch die Resistenz gegenüber Antimetaboliten als Grundlage für die Selektion auf Dihydrofolatreduktase (dhfr) verwendet werden, die eine Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht; gpt, das eine Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verleiht; Neomycin (neo), das eine Resistenz gegenüber dem Aminoglycosid G-418 verleiht; und Hygromycin (hygro), das eine Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht.
  • Die Tierzellen können in zwei Weisen in vitro vermehrt werden: als nicht-verankerungsabhängige Zellen, die in einem Großteil der Kultur in Suspension wachsen oder als verankerungs-abhängige Zellen, die eine Anheftung an ein festes Substrat für ihre Vermehrung benötigen (d. h. ein Zellwachstum des Einschicht-Typs).
  • Nicht-verankerungs-abhängige oder Suspensions-Kulturen aus kontinuierlich etablierten Zelllinien sind die am verbreitetsten verwendeten Mittel für die Produktion von Zellen und Zellprodukten im großen Maßstab. Suspensions-kultivierte Zellen haben jedoch Beschränkungen wie das onkogene Potential und eine niedrigere Proteinproduktion als anheftende Zellen.
  • Die Suspensions-Kultur von Säugetierzellen im großen Maßstab in gerührten Tanks ist ein verbreitetes Verfahren für die Herstellung rekombinanter Proteine. Zwei Ausführungen des Suspensions-Kulturreaktors werden weitverbreitet verwendet – der Rührreaktor und der Sprudelreaktor. Die Rühr-Ausführung ist erfolgreich bei einer Kapazität von 8.000 1 für die Herstellung von Interferon verwendet worden. Die Zellen werden in rostfreien Stahltanks mit einem Höhe-zu-Durchmesser-Verhältnis von 1 : 1 zu 3 : 1 wachsen gelassen. Die Kultur wird üblicherweise mit einem oder mehreren Rührern beruhend auf Schaufelscheiben- oder Seeschiffschraubenmustern, gemischt. Rührsysteme, die weniger Scherkräfte ermöglichen als Schaufeln, sind beschrieben worden. Das Rühren kann entweder direkt oder indirekt durch magnetisch gekoppelte Antriebe vorangetrieben werden. Indirekte Antriebe verringern das Risiko der mikrobiellen Kontamination über Dichtung an den Rührwellen.
  • Der Sprudelreaktor der anfänglich auch für die mikrobielle Fermentation beschrieben wurde und der später für die Säugetierkultur angepaßt wurde, stützt sich sowohl für das Mischen und die Sauerstoffversorgung der Kultur auf einen Gasstrom. Der Gasstrom tritt durch einen Steigleitungsabschnitt des Reaktors ein und treibt die Zirkulation an. Das Gas löst sich an der Oberfläche der Kultur, wodurch die dichtere Flüssigkeit, die keine Gasblasen enthält, nach unten in den Falleitungsteil des Reaktors wandert. Der Hauptvorteil dieser Ausführungsform ist die Einfachheit und das Fehlen der Notwendigkeit einer mechanischen Mischung. Typischerweise ist das Höhe-zu-Durchmesser-Verhältnis 10 : 1. Der Sprudelreaktor läßt sich relativ einfach maßstäblich vergrößern, weist einen guten Massetransfer der Gase auf und erzeugt nur relativ geringe Scherkräfte.
  • Es wird erwogen, daß die TPO-Proteine, Polypeptide oder Peptide der Erfindung "überexprimiert" werden können, d. h. in Mengen, die gegenüber ihrer natürlichen Expression in Zellen erhöht sind. Eine solche Überexpression kann durch eine Vielzahl von Verfahren bewertet werden, die die Radio-Markierung und/oder Proteinreinigung umfassen. Es werden jedoch die einfachen direkten Verfahren bevorzugt, wie beispielsweise die, die SDS/PAGE und Proteinfärbung oder "western-blotting" gefolgt von quantitativen Analysen, wie dem densiometrische Scannen des sich ergebenden Gels oder Abdrucks, beinhalten. Eine spezifische Erhöhung der Menge des rekombinanten Proteins, Polypeptids oder Peptids im Vergleich zu der Menge in natürlichen Zellen ist ein Hinweis auf eine Überexpression wie auch die relative Häufigkeit des spezifischen Proteins, Polypeptids oder Peptids im Verhältnis zu den anderen Proteinen, die durch die Wirtszelle hergestellt werden und die z. B. auf dem Gel erkennbar sind.
  • C. Nukleinsäurenachweis
  • Zusätzlich zu ihrer Verwendung zur Steuerung der Expression von TPO-Proteinen, – Polypeptiden oder -Peptiden können die hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen auch in einer Vielzahl anderer Anwendungen eingesetzt werden. Beispielsweise haben sie auch eine Nützlichkeit als Sonden oder Primer in Ausführungsformen der Nukleinsäurehybridisierung.
  • 1. Hybridisierung
  • Die Verwendung von Hybridisierungssonden mit einer Länge zwischen 17 und 100 Nukleotiden oder in einigen Aspekten der Erfindung einer Länge von sogar bis zu 1–2 kb oder mehr, erlaubt die Bildung eines Duplexmoleküls, das sowohl stabil als auch selektiv ist. Moleküle, die komplementäre Sequenzen über Abschnitte mit einer Länge von größer als 20 Basen aufweisen, sind im allgemeinen bevorzugt, um die Stabilität und Selektivität des Hybrids zu erhöhen und dadurch die Qualität und den Grad der jeweilig erhaltenen Hybridmoleküle zu verbessern. Man wird es im allgemeinen bevorzugen Nukleinsäuremoleküle zu entwerfen, die Abschnitte von 20 bis 30 Nukleotiden oder, wenn gewünscht, sogar länger aufweisen. Solche Fragmente können ohne weiteres beispielsweise durch direkte Synthetisierung des Fragments, durch chemische Mittel oder durch das Einführen ausgewählter Sequenzen in rekombinante Vektoren für die rekombinante Herstellung erzeugt werden.
  • Dementsprechend können die Nukleotidsequenzen der Erfindung aufgrund ihrer Fähigkeit selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Abschnitten von Genen oder RNAs zu bilden oder um Primer für die Vervielfältigung von DNA oder RNA aus Geweben zur Verfügung zu stellen, verwendet werden. Abhängig von der beabsichtigten Anwendung wird man wünschen unterschiedliche Hybridisierungsbedingungen einzusetzen, um im Hinblick auf die Zielsequenz unterschiedliche Grade der Selektivität der Sonde zu erreichen.
  • Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, wird man typischer Weise wünschen relativ stringente Bedingungen für die Bildung der Hybride einzusetzen, z. B. wird man relativ niedrige und/oder hohe Temperaturbedingungen wie die, die durch etwa 0,02 bis etwa 0,1 M NaCl bei Temperaturen von etwa 50°C bis etwa 70°C zur Verfügung gestellt werden, auswählen. Solche hochstringenten Bedingungen tolerieren nur wenig wenn überhaupt irgendwelche Fehlpaarungen zwischen der Sonde und der Matrize oder dem Zielstrang und wären besonders für die Isolierung spezifischer Gene oder den Nachweis spezifischer mRNA Transkripte geeignet. Es ist allgemein bekannt, daß die Bedingungen durch die Hinzufügung ansteigender Formamidmengen stringenter gemacht werden können.
  • Für bestimmte Anwendungen beispielsweise für die Substitution von Nukleotiden durch die Orts-vermittelte Mutagenese wird es erkannt werden, daß Bedingungen niedriger Stringenz erforderlich sind. Unter diesen Bedingungen kann die Hybridisierung sogar auftreten obwohl die Sequenzen der Sonde und des Zielstrangs nicht perfekt komplementär sondern an einer oder mehreren Positionen fehlgepaart sind. Die Bedingungen können durch die Erhöhung der Salzkonzentration und die Verringerung der Temperatur weniger stringent gemacht werden. Beispielsweise kann eine Bedingung mittlerer Stringenz bei etwa 0,1 bis 0,25 M NaCl bei Temperaturen von etwa 37°C bis etwa 45°C zur Verfügung gestellt werden, während eine niedrig stringente Bedingung bei etwa 0,15 M bis etwa 0,9 M Salz bei Temperaturen, die von etwa 20°C bis etwa 50°C reichen, zur Verfügung gestellt werden kann. Somit können die Hybridisierungsbedingungen ohne weiteres abhängig von den gewünschten Ergebnissen verändert werden.
  • In anderen Ausführungsformen kann die Hybridisierung unter Bedingungen von beispielsweise 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 1,0 mM Dithiothreitol bei Temperaturen zwischen etwa 20°C bis etwa 37°C erreicht werden. Andere verwendete Hybridisierungsbedingungen können ungefähr 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 bei Temperaturen, die von etwa 40°C bis etwa 72°C reichen, umfassen.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird es vorteilhaft sein, Nukleinsäuresequenzen in Zusammenhang mit geeigneten Mitteln wie einer Markierung für die Bestimmungen der Hybridisierung zu verwenden. Eine Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln sind im Stand der Technik bekannt, die fluoreszente, radioaktive, enzymatische oder andere Liganden wie Avidin/Biotin, die nachgewiesen werden können, umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen kann man wünschen eine fluoreszente Markierung oder eine Enzymmarkierung wie eine Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase anstelle radioaktiver oder anderer in der Umwelt unerwünschter Reagenzien einzusetzen. Im Fall von Enzym-Markierung sind colorimetrische Nachweissubstrate bekannt die verwendet werden können, um ein Nachweismittel, das für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, zur Verfügung zu stellen, um die spezifische Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäure-enthaltenden Proben zu identifizieren.
  • Im allgemeinen wird erwogen, daß die Hybridisierungssonden, die hierin beschrieben sind, sowohl als Reagenzien in Hybridisierungslösung in der PCRTM für den Nachweis der Expression korrespondierender Gene sowie auch in Ausführungsform, die eine feste Phase verwenden, nützlich sein werden. In Ausführungsformen, die eine feste Phase beinhalten, wird die Test-DNA (oder RNA) absorbiert oder in anderer Weise an einer ausgewählten Matrix oder Oberfläche befestigt. Diese fixierte, einsträngige Nukleinsäure wird dann der Hybridisierung mit ausgewählten Sonden unter gewünschten Bedingungen unterzogen. Die ausgewählten Bedingungen werden von dem besonderen Umständen, die auf den bestimmten erforderlichen Kriterien beruhen (abhängig beispielsweise von dem G + C-Gehalt, der Art der Zielnukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungssonde, etc) abhängen. Nach dem Waschen der hybridisierten Oberfläche, um nicht-spezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird die Hybridisierung mittels der Markierung nachgewiesen oder sogar quantifiziert.
  • 2. Vervielfältigung und PCRTM
  • Die Nukleinsäure, die als Matrize für die Vervielfältigung verwendet wird, wird gemäß Standardverfahren aus Zellen isoliert, die in der biologischen Probe enthalten sind (Sambrook et al., 1989). Die Nukleinsäure kann genomische DNA oder fraktionierte oder Gesamtzell-RNA sein. Wenn RNA verwendet wird kann es gewünscht sein, die RNA in eine komplementäre DNA umzuwandeln. In einer Ausführungsform ist die RNA Gesamtzell-RNA und wird direkt als Matrize für die Vervielfältigung verwendet.
  • Primerpaare, die selektiv an Nukleinsäuren, die zu den Thrombopoietingenen korrespondieren, hybridisieren, werden mit der isolierten Nukleinsäure unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine selektive Hybridisierung erlauben. Für den Begriff "Primer" wie hierin definiert wird angenommen, daß er jede Nukleinsäure umfaßt, die dazu in der Lage ist die Synthese einer sich entwickelnden Nukleinsäure in einem Matrizenabhängigen Prozeß zu primen. Typischer Weise sind Primer Oligonukleotide mit einer Länge von zehn bis zwanzig oder dreißig Basenpaaren aber längere Sequenzen können auch verwendet werden. Primer können in doppelsträngiger oder einzelsträngiger Form zur Verfügung gestellt werden obwohl die einzelsträngige Form bevorzugt ist.
  • Sobald sie hybridisiert sind wird der Nukleinsäure : Primerkomplex mit einem oder mehreren Enzymen in Kontakt gebracht, die die Matrizen-abhängige Nukleinsäuresynthese ermöglichen. Mehrere Runden der Vervielfältigung auch als "Zyklen" bezeichnet werden durchgefihrt bis eine ausreichende Menge des Vervielfältigungsprodukts erzeugt wird.
  • Als nächstes wird das Vervielfältigungsprodukt nachgewiesen. In bestimmten Anwendungen kann der Nachweis durch visuelle Mittel durchgeführt werden. Alternativ kann der Nachweis den indirekten Nachweis des Produkts über Chemilumineszenz, radioaktive Synthigraphie, aufgenommene radioaktive Markierung oder fluoreszente Markierung oder sogar über ein System unter Verwendung elektrischer oder thermischer Impulssignale (Affimax-Technologie) beinhalten.
  • Eine Anzahl Matrizen-abhängiger Verfahren ist erhältlich, um Markierungssequenzen, die in einer gegebenen Matrizenprobe vorhanden sind, zu vervielfältigen. Eines der bekanntesten Vervielfältigungsverfahren ist die Polymerase-Kettenreaktion (als PCRTM bezeichnet) die im Detail in U.S: Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159 beschrieben ist.
  • In Kürze: In der PCRTM werden 2 Primersequenzen hergestellt, die komplementär zur Region auf gegenüberliegenden komplementären Strängen der Markierungssequenz sind. Ein Überschuß von Deoxynukleosidtriphosphaten wird zusammen mit einer DNA-Polymerase, z. B. Taq-Polymerase, zu einem Reaktionsgemisch hinzugefügt. Wenn die Markierungssequenz in der Probe vorhanden ist, werden die Primer an den Marker binden und die Polymerase wird dafir sorgen, daß die Primer entlang der Markierungssequenz durch das Hinzufügen von Nukleotiden verlängert wird. Durch das Erhöhen und Verringern der Temperatur des Reaktionsgemisches werden die verlängerten Primer von der Markierung dissoziieren, um Reaktionsprodukte zu bilden, überschüssiger Primer wird an die Markierung binden und an die Reaktionsprodukte und der Prozeß wird wiederholt.
  • Ein reverses Transkriptase-PCRTM-Amplifikationsverfahren kann durchgefihrt werden, um die Menge der vervielfältigten mRNA zu quantifizieren. Verfahren für die reverse Transkription von RNA in cDNA sind gut bekannt und in Sambrook et al., 1989 beschrieben. Alternative Verfahren für die reverse Transkription verwenden thermostabile RNA-abhängige DNA-Polymerasen. Diese Verfahren werden in WO 90/07641, das am 21. Dezember 1990 einge reicht wurde, beschrieben. Die Polymerase-Kettenreaktionsverfahren sind im Stand der Technik gut bekannt.
  • Ein anderes Verfahren für die Vervielfältigung ist die Ligasekettenreaktion ("LCR"), die in EPA Nr. 0 320 308 offenbart wird. In der LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare hergestellt und in der Gegenwart der Zielsequenz wird jedes Paar an die gegenüberliegenden komplementären Stränge des Ziels binden, so daß sie aneinander stoßen. In der Gegenwart von Ligase werden sich die zwei Sondenpaare verknüpfen, um eine einzelne Einheit zu bilden. Durch die zyklische Änderung der Temperatur wie in der PCRTM dissoziieren gebundene legierte Einheiten von dem Ziel und dienen dann als "Zielsequenzen" für die Ligation von überschüssigen Sondenpaaren. U.S. Patent 4,883,750 beschreibt ein Verfahren, das der LCR ähnlich ist, für das Binden von Sondenpaaren an eine Zielsequenz.
  • Qbeta Replikase, die in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/LJS87/00880 beschrieben wird, kann auch als noch ein weiteres Vervielfältigungsverfahren in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In diesem Verfahren wird eine replikationsfähige Sequenz der RNA, die eine Region aufweist, die komplementär zu der des Ziels ist, zu einer Probe in der Gegenwart von RNA-Polymerase hinzugefügt. Die Polymerase wir dann die replikative Sequenz kopieren, die dann nachgewiesen werden kann.
  • Ein isotermisches Vervielfältigungsverfahren in dem Restriktionsendonukleasen und Ligasen verwendet werden, um die Vervielfältigung von Zielmolekülen, die 50'-[α-thio]-Triphosphatnukleotide in einem Strang einer Restriktionsstelle enthalten, zu erreichen, kann auch bei der Vervielfältigung der Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung nützlich sein.
  • Die Strangersatzvervielfältigung (SDA = "Strand Displacement Amplification") ist ein weiteres Verfahren zur Ausfihrung einer isothermen Vervielfältigung von Nukleinsäuren, die mehrere Runden des Strangersatzes und der Synthese, d. h. Kerbentranslation ("Nick Translation"), beinhaltet. Ein ähnliches Verfahren das Reparaturkettenreaktion (RCR = "Repair Chain Reaction") genannt wird, beinhaltet das Anlagern mehrerer Sonden über eine Region auf die für die Vervielfältigung abgezielt wird, gefolgt von einer Reparaturreaktion in der nur zwei der vier Basen vorhanden sind. Die anderen zwei Basen können als biotynilierte Derivate für den einfachen Nachweis hinzugefügt werden. Ein ähnlicher Ansatz wird bei der SDA verwendet. Zielspezifische Sequenzen können auch unter Verwendung einer zyklischen Sonden reaktion (CPR = "Cyclic Probe Reaction") nachgewiesen werden. Bei der CPR wird eine Sonde, die 3' und 5'-Sequenzen einer unspezifischen DNA und einer Mittelsequenz spezifischer RNA aufweist, an DNA hybridisiert, die in der Probe vorhanden ist. Nach der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNase H behandelt und die Produkte der Sonde als unterscheidbare Produkte identifiziert, die nach dem Verdau frei gesetzt werden. Die ursprüngliche Matrize wird an eine weitere zyklierende Sonde angelagert und die Reaktion wird wiederholt.
  • Andere Vervielfältigungsverfahren, die in GB Anmeldungsnummer 2 202 328 und in der PCT Anmeldungsnr. PCT/US89/01025 beschrieben sind, können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In der vorangehenden Anmeldung werden "modifizierte" Primer in einer PCRTM-ähnlichen Matrizen- und Enzym-abhängigen Synthese verwendet. Die Primer können durch Markierung mit einem Fängerrest (z. B. Biotin) und einem Nachweisrest (z. B. einem Enzym) modifiziert sein. In der letzteren Anmeldung wird ein Überschuß markierter Sonden zu der Probe hinzugefügt. In der Gegenwart der Zielsequenz bindet die Sonde und wird katalytisch gespalten. Nach der Spaltung wird die Zielsequenz intakt frei gesetzt, um durch die Überschußsonde gebunden zu werden. Die Spaltung der markierten Sonde deutet auf die Gegenwart der Zielsequenz hin.
  • Andere Nukleinsäurevervielfältigungsverfahren umfassend auf Transkription-beruhende Vervielfältigungssysteme (TAS = "Transcription-based Amplification Systems"), die die Nukleinsäuresequenz-beruhende Vervielfältigung (NASBA = "Nucleic Acid Sequence Based Amplification") und die 3SR (Gingeras et al., PCT Anmeldung WO88/10315) umfassen. In der NASBA können die Nukleinsäuren für die Vervielfältigung durch standard phenol/Chloroformextraktion, Hitzedenaturierung einer klinischen Probe, Behandlung mit Lysepuffer, Minispin-Säulen für die Isolierung von DNA und RNA oder durch Guanidiniumchloridextraktion von RNA vorbereitet werden. Diese Vervielfältigungstechniken beinhalten, das Anlagern eines Primers, der Ziel-spezifische Sequenzen aufweist. Nach der Polymerisation werden die DNA/RNA-Hybride mit RNase H verdaut, während doppelsträngige DNA-Moleküle erneut hitzedenaturiert werden. In jedem Fall wird die einzelsträngige DNA durch das Hinzufügen eines zweiten Zielspezifischen Primers gefolgt von einer Polymerisation voll doppelsträngig gemacht. Die doppelsträngigen DNA-Moleküle werden dann mehrfach durch eine RNA-Polymerase wie T7 oder SP6 transkribiert. In einer isothermen zyklischen Reaktion werden die RNAs revers in einzelsträngige DNA transkribiert, die dann in doppelsträngige DNA umgewandelt wird und dann erneut mit einer RNA-Polymerase wie T7 oder SP6 trans kribiert wird. Die sich ergebenden Produkte ob trunkiert oder vollständig deuten auf zielspezifische Sequenzen hin.
  • Davey et al., EPA Nr. 329 822 offenbart ein Nukleinsäurevervielfältigungsverfahren, das die zyklische Synthese einzelsträngiger RNA ("ssRNA"), ssDNA und doppelsträngige DNA (dsDNA) beinhaltet, das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die ssRNA ist eine Vorlage für ein erstes Primeroligonukleotid, das durch eine reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) verlängert wird. Die RNA wird dann von der sich ergebenden DNA : RNA-Duplex durch die Wirkung von Ribonuklease H (RNase H, eine RNase, die für RNA in Duplex mit entweder DNA oder RNA spezifisch ist) entfernt. Die sich ergebende ssDNA ist eine Matrize für eine zweiten Primer, der auch die Sequenzen für einen RNA-Polymerasepromotor (beispielhaft durch die T7-RNA-Polymerase erläutert) 5' zu seiner Homologie zu der Matrize umfaßt. Dieser Primer wird dann durch eine DNA-Polymerase (beispielhaft durch das große "Klenow"-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I verdeutlicht) verlängert, was zu einem doppelsträngigen DNA ("dsDNA") Molekül führt, das eine Sequenz aufweist, die zu der ursprünglichen RNA zwischen den Primern identisch ist und die an einem Ende zusätzliche Promotorsequenzen aufweist. Diese Promotorsequenz kann von der geeigneten RNA-Polymerase verwendet werden, um viele RNA-Kopien der DNA zu erzeugen. Diese Kopien können dann wiederum in den Zyklus eintreten, was zu einer sehr schnellen Vervielfältigung führt. Mit der geeigneten Wahl der Enzyme kann diese Vervielfältigung isotherm ohne das Hinzufügen von Enzymen bei jedem Zyklus durchgeführt werden. Aufgrund der zyklischen Natur des Verfahrens kann die Ausgangssequenz entweder in Form von DNA oder RNA gewählt werden.
  • Miller et al., PCT-Anmeldung WO 89/06700 offenbart ein Nukleinsäuresequenz-Vervielfältigungsschema, das auf der Hybridisierung einer Promotor/Primersequenz an eine Zieleinzelstrang-DNA ("ssDNA") gefolgt von der Transkription vieler RNA-Kopien der Sequenz beruht. Dieses Schema ist nicht zyklisch, d. h. neue Vorlagen werden nicht von den sich ergebenden RNA-Transkripten erzeugt. Andere Vervielfältigungsverfahren umfassen "RACE" und "einseitige PCRTM" (Frohman, 1990, hierin durch Verweis aufgenommen).
  • Verfahren, die auf Ligation von 2 (oder mehr) Oligonukleotiden in Gegenwart von Nukleinsäuren beruhen, die die Sequenz des sich ergebenden "di-Oligonucleotids" aufweisen, wo durch das "di-Oligonucleotid" vervielfältigt wird, können auch in dem Vervielfältigungsschritt verwendet werden.
  • Auf jede Vervielfältigung folgend, kann es wünschenswert sein, die Vervielfältigungsprodukte von der Matrize und dem Überschußprimer zum Zwecke der Bestimmung abzutrennen, ob eine spezifische Vervielfältigung stattgefunden hat. In einer Ausführungsform werden die Vervielfältigungsprodukte durch Agarose, Agarose-Acrylamid oder Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., 1989) aufgetrennt.
  • Alternativ können chromatographische Techniken eingesetzt werden, um die Abtrennung zu bewirken. Es gibt viele verschiedene Sorten der Chromatographie, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können: die Adsorption, die Teilung, den Ionenaustausch und das Molekularsieb und viele spezialisierte Techniken für deren Verwendung, die Säulen, Papier, Dünnschicht und Gas-Chromatographie umfassen.
  • Die Amplifikationsprodukte müssen, um die Vervielfältigung der Markierungssequenzen zu bestätigen, visualisiert werden. Ein typisches Verfahren der Visualisierung beinhaltet die Färbung eines Gels mit Ethidiumbromid und die Visualisierung unter UV-Licht. Alternativ können, wenn die Vervielfältigungsprodukte von Innen heraus mit radio- oder fluorimetrisch markierten Nukleotiden markiert sind, die Vervielfältigungsprodukte dann nach der Abtrennung gegenüber Röntgenfilm ausgesetzt werden oder mit geeigneten anregenden Spektren visualisiert werden.
  • Die Visualisierung kann indirekt erreicht werden. Nach der Separation der Vervielfältigungsprodukte kann eine markierte Nukleinsäuresonde mit der vervielfältigten Markierungssequenz in Kontakt gebracht werden. Die Sonde ist vorzugsweise an ein Chromophor konjugiert, kann aber auch radioaktiv markiert sein. In anderen Ausführungsformen ist die Sonde an einem Bindungspartner wie einen Antikörper oder Biotin konjugiert und das andere Mitglied des Bindungspaares trägt einen nachweisbaren Rest.
  • Der Nachweis kann durch "Southern-blotting" und Hybridisierung mit einer markierten Sonde erfolgen. Die beim "Southern-blotting" verwendeten Techniken sind dem Fachmann wohl bekannt und können in vielen Standardbüchern über molekulare Protokolle gefunden werden.
  • Siehe Sambrook et al., 1989. In Kürze: Die Vervielfältigungsprodukte werden durch Gelelektrophorese abgetrennt. Das Gel wird dann mit einer Membran, wie der Nitrozellulose in Kontakt gebracht, wodurch der Transfer der Nukleinsäuren und die nicht-kovalente Bindung erlaubt wird. Darauffolgend wird die Membran mit einer an ein Chromophor konjugierten Sonde inkubiert, die dazu in der Lage ist mit dem Zielvervielfältigungsprodukt zu hybridisieren. Der Nachweis erfolgt durch die Aussetzung der Membran gegenüber Röntgenfilm oder durch Ionen-emitierende Nachweisvorrichtungen.
  • Ein Beispiel des Vorangehenden ist in U.S. Patent Nr. 5,279,721 beschrieben, welches eine Vorrichtung und ein Verfahren für die automatisierte Elektrophorese und den Transfer von Nukleinsäuren offenbart. Die Vorrichtung erlaubt die Elektrophorese und das "Blotting" ohne äußere Handhabungsschritte des Gels und ist ideal dafür geeignet, Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auszuführen.
  • 3. Andere Nachweisverfahren
  • Andere Verfahren für das genetische Durchsuchen, um genaue Mutationen in genomischen DNA, cDNA oder RNA-Proben nachzuweisen, können abhängig von der speziellen Situation eingesetzt werden.
  • In der Vergangenheit sind eine Anzahl verschiedener Verfahren verwendet worden, um Punktmutationen nachzuweisen, die die denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese ("DGGE"), die Restriktionsenzympolymorphismus-Analyse, chemische und enzymatische Spaltungsverfahren und andere umfassen. Die gegenwärtig am häufigsten verwendeten Verfahren umfassen die direkte Sequenzierung von Zielregionen, die durch PCRTM (siehe oben) vervielfältigt worden sind und die Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse ("SSCP" = "single-strand conformation polymorphism analysis").
  • Ein weiteres Verfahren des Suchens nach Punktmutation beruht auf der RNAse-Spaltung von Basenpaarfehlpaarung in RNA/DNA und RNA/RNA-Heteroduplexen. Wie hierin verwendet ist der Begriff "Fehlpaarung" als eine Region von einem oder mehreren ungepaarten oder fehlgepaarten Nukleotiden in einem doppelsträngigen RNA/RNA, RNA/DNA oder DNA/DNA-Molekül definiert. Diese Definition umfaßt daher Fehlpaarungen aufgrund von Insertions-/Deletions-Mutationen sowie einzelne und mehrfache Basenpaar-Punktmutationen.
  • Das U.S. Patent Nr. 4,946,773 beschreibt ein RNAse A Fehlpaarungs-Spaltungstestverfahren, das das Anlagern einzelsträngiger DNA oder RNA-Testproben an eine RNA-Sonde und die daran anschließende Behandlung der Nukleinsäureduplex mit RNAse A beinhaltet. Nach der RNAse-Spaltungsreaktion wird die RNase durch einen proteolytischen Verdau und eine organische Extraktion inaktiviert und die Spaltprodukte werden durch Erhitzen denaturiert und durch Elektrophorese auf denaturierenden Polyacrylamid-Gelen analysiert. Für den Nachweis von Fehlpaarungen werden die einzelsträngigen Produkte der RNAse A-Behandlung, die elektrophoretisch gemäß ihrer Größe aufgetrennt sind, mit ähnlich behandelten Kontrollduplexen verglichen. Proben, die kleinere Fragmente (Spaltprodukte) enthalten, die nicht in den Kontrollduplexen erkannt werden, werden als positiv gewertet.
  • Gegenwärtig verfügbare RNase-Fehlpaarungsspaltungs-Testverfahren umfassen die, die gemäß U.S. Patent Nr. 4,946,773 durchgeführt werden, erfordern die Verwendung radioaktiver markierter RNA-Sonden. Myers und Maniatis beschreiben in dem U.S. Patent Nr. 4,946,773 den Nachweis von Basenpaar-Fehlpaarungen unter Verwendung von RNase A. Andere Forscher haben die Verwendung des E. coli-Enzyms RNase I in Fehlpaarungstestverfahren beschrieben. Aufgrund ihrer breiteren Spaltungsspezifität im Vergleich zu RNase A wäre RNase I ein wünschenswertes Enzym, um es bei dem Nachweis von Basenpaar-Fehlpaarungen einzusetzen, wenn Bestandteile gefunden werden können, die den Umfang der nicht-spezifischen Spaltung verringern und die Häufigkeit der Spaltung von Fehlpaarung erhöhen. Die Verwendung von RNase I für den Fehlpaarungsnachweis wird in der Literatur von Promega Biotech beschrieben. Promega vermarktet ein Kit enthaltend RNase I, für das in der Literatur gezeigt wird 3 von 4 bekannten Fehlpaarungen zu spalten, unter der Voraussetzung, daß die Enzymmenge ausreichend hoch ist.
  • Das RNase-Schutz-Testverfahren wurde zuerst dazu verwendet, um die Enden spezifischer mRNA-Ziele in Lösung nachzuweisen und zu kartieren. Das Testverfahren beruht darauf, daß man leicht dazu in der Lage war, durch in vitro-Transkription radioaktiv markierte RNA-Sonden mit hoher spezifischer Aktivität, die komplementär zu der interessierenden mRNA waren, zu erzeugen. Ursprünglich waren die Matrizen für die in vitro-Transkription rekombinanter Plasmide, die Bakteriophagen-Promotoren enthielten. Die Sonden werden mit Gesamtzell-RNA-Proben gemischt, um die Hybridisierung an ihre komplementären Ziele zu erlauben, dann wird das Gemisch mit RNase behandelt, um den Überschuß der unhybridisierten Sonde abzubauen. Auch ist die verwendete RNase, wie ursprünglich beabsichtigt, spezifisch für einzelsträngige RNA, so daß die hybridisierte doppelsträngige Sonde vor dem Abbau geschützt ist. Nach der Inaktivierung und Entfernung der RNase wird die geschützte Sonde (die in der Menge proportional zu der Menge der Ziel-RNA, die vorhanden war, ist) wiedergewonnen und auf einem Polyacrylamidgel analysiert.
  • Das RNase-Schutz-Testverfahren wurde für den Nachweis von Einzelbasen-Mutationen angepaßt. In diesem Typ des RNase A-Fehlpaarungs-Spaltungstestverfahrens werden radioaktiv markierte RNA-Sonden, die in vitro von Wildtyp-Sequenzen transkribiert wurden, zu komplementären Zielregionen, die aus den Testproben abgeleitet wurden, hybridisiert. Die Testziele enthalten im allgemeinen DNA (entweder genomische DNA oder DNA, die durch Klonierung der Plasmide oder durch PCRTM amplifiziert wurde), obwohl RNA-Ziele (endogene mRNA) gelegentlich verwendet worden sind. Wenn Einzelnukleotide (oder größere) Sequenzunterschiede zwischen der hybridisierten Sonde und dem Ziel auftreten, kann die sich ergebende Störung der Watson-Crick-Wasserstoffbindung an dieser Position ("Fehlpaarung") erkannt werden und in einigen Fällen durch Einzelstrang-spezifische Ribonuklease gespalten werden. Bis jetzt ist die RNase A fast ausschließlich für die Spaltung von Einzelpaar-Fehlpaarungen verwendet worden, obwohl für die RNase I kürzlich gezeigt worden ist, daß sie auch für die Fehlpaarungsspaltung nützlich ist. Es gibt aktuelle Berichte über die Verwendung des MutS-Proteins und anderer DNA-Reparaturenzyme für den Nachweis von Einzelbasen-Fehlpaarungen.
  • D. Mutagenese
  • Die Orts-spezifische Mutagenese ist eine Technik, die bei der Herstellung individueller Peptide oder biologisch funktionel äquivalenter Proteine oder Peptide durch die spezifische Mutagenese, der zugrunde liegenden DNA nützlich ist. Das Verfahren stellt durch das Einführen von einer oder mehreren Nukleotidsäureänderungen in die DNA des weiteren eine leichte Möglichkeit zur Verfügung Sequenzvarianten herzustellen und zu testen, die ein oder mehrere der vorgenannten Überlegung berücksichtigen. Die Orts-spezifische Mutagenese erlaubt die Erzeugung von Mutanten durch die Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die für DNA-Sequenzen der gewünschten Mutation kodieren sowie eine ausreichende Anzahl angrenzender Nukleotide, um eine Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität zur Verfügung zu stellen, damit eine stabile Duplex auf beiden Seiten der Deletionsgrenze überbrückt werden kann. Typischerweise ist ein Primer mit einer Länge von etwa 17 bis 25 Nukleotiden bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Grenze der Sequenz, die verändert wird, liegen.
  • Im allgemeinen ist die Technik der Orts-spezifischen Mutagenese im Stand der Technik gut bekannt. Es wird erkannt werden, daß die Technik typischerweise einen Bakteriophagenvektor verwendet, der sowohl in einzelsträngiger und doppelsträngiger Form vorliegt. Typische Vektoren, die für Orts-spezifische Mutagenese nützlich sind, umfassen Vektoren wie den M13-Phagen. Diese Phagenvektoren sind kommerziell erhältlich und ihre Verwendung ist im allgemeinen dem Fachmann wohl bekannt. Auch doppelsträngige Plasmide werden routinemäßig bei der Orts-spezifischen Mutagenese eingesetzt, was den Schritt der Überführung des interessierenden Gens von einem Phagen in ein Plasmid beseitigt.
  • Im allgemeinen wird die Orts-spezifische Mutagenese dadurch durchgeführt, daß zuerst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird oder durch das Schmelzen zweier Stränge eines doppelsträngigen Vektors, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz umfaßt, die für das gewünschte Protein kodiert. Ein Oligonukleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird synthetisch hergestellt. Dieser Primer wird dann an die einzelsträngige DNA-Zubereitung angelagert und gegenüber DNA-polymerisierende Enzyme wie das E. coli-Polymerase I Klenow-Fragment ausgesetzt, um die Synthese des die Mutationtragenden Strangs abzuschließen. Somit wird eine Heteroduplex gebildet, wobei der eine Strang für die ursprüngliche nicht-mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplexvektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen, wie E. coli-Zellen zu transformieren und Klone werden ausgewählt, die rekombinante Vektoren enthalten, welche das mutierte Sequenzarrangement tragen.
  • Die Zubereitung der Sequenzvarianten des ausgewählten Gens unter Verwendung der Ortsgeleiteten Mutagenese wird als Mittel für die Erzeugung potentiell nützlicher Spezies zur Verfügung gestellt und ist nicht einschränkend gemeint, da es andere Wege gibt, durch die Sequenzvarianten von Genen erhalten werden können. Beispielsweise können rekombinante Vektoren, die für das gewünschte Gen kodieren, mit mutagenisierenden Mitteln, wie Hydroxylamin behandelt werden, um Sequenzvarianten zu erhalten. Verfahren für die Zubereitung modifizierter Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen für TPO sind beispielhaft in U.S. Patent Nr. 5,753,083, 5,696,250, 5,641,655, 5,795,569, 5,766,581 und 5,766,897 erläutert.
  • IV. TPO-Proteine, -Polypeptide, -Peptide
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch gereinigte und in bevorzugten Ausführungsformen im wesentlichen reine TPO-Proteine, -Polypeptide, -Peptide zur Verfügung. Es ist beabsichtigt, daß der Begriff "gereinigte TPO-Proteine, -Polypeptide oder -Peptide" wie hierin verwendet, eine Protein-artige TPO-Zusammensetzung bezeichnet, die aus Säugetierzellen oder rekombinanten Wirtszellen isolierbar ist, wobei das TPO-Protein, -Polypeptid oder -Peptid in einem beliebigen Maße im Vergleich zu seinem natürlich zugänglichen Stadium gereinigt ist, d. h. relativ zu seiner Reinheit innerhalb des zellulären Extrakts. Ein gereinigtes TPO-Protein, Polypeptid oder -Peptid bezeichnet daher ein Wildtyp oder ein mutiertes TPO-Protein, -Polypeptid oder -Peptid, das aus der Umgebung befreit ist, in der es normalerweise auftritt.
  • Die reifen Thrombopoietin-Proteine können Proteine voller Länge sein, so daß sie eine Länge von 322 Aminosäuren aufweisen. Die Nukleotid- und Protein-, Polypeptid- und Peptid-Sequenzen für TPO und andere Zytokine und Peptidhormone sind bereits vorher offenbart worden und können in den National Center for Biotechnology Information's Genbank and GenPept-Datenbanken (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gefunden werden. Die Aminosäuresequenzen für TPO, die als in der vorliegenden Erfindung nützlich erwogen werden, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, die GenPept-Zugangsnummern AROO4221, AR004220, 3986139, 3986137, 3986135, 533217, 533215, P40225, P49745, P42706, P42705, P40226, I50264, I50263, I50262, 2351118, 971277, 577320, JC4125, I58350, JC4227, 545330, I80105, 1110579, 914226, 2013345A, 1401250, 1401248, 1401246 und 508541. Die Aminosäuresequenzen für humanes TPO, die als in der vorliegenden Erfindung nützlich erwogen werden, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf die GenPept-Zugangsnummern AROO4221, 3986139, 3986137, 3986135, 533217, 533215, P40225, I50264, I50263, 2351118, 577320, I80105, 914226, 1401250, 1401248 und 1401246. Eine bevorzugte Aminosäuresequenz für TPO ist in der SEQ ID NR. 2 gezeigt. Die Thrombopoietinproteine, – Polypeptide und -Peptide können auch weniger als Proteine voller Länge sein, wie individuelle Domänen, Regionen oder selbst epitopische Peptide. Wenn Thrombopoietinproteine mit weniger als voller Länge betroffen sind, sind die, die am meisten bevorzugten, die die vorausgesagten immunogenen Bereiche aufweisen und die, die die hierin identifizierten funktionellen Domänen enthalten.
  • Im allgemeinen wird "gereinigt" eine TPO-Protein, -Polypeptid, -Peptid-Zusammensetzung bezeichnen, die einer Fraktionierung unterzogen wurde, um verschiedene Nicht-Thrombopoietinproteine, -Polypeptide oder -Peptide zu entfernen und wobei die Zusammensetzung im wesentlichen ihre Thrombopoietinaktivität bewahrt, wie durch die hierin weiter unten beschriebenen Protein-Thrombopoietin-Nachweisverfahren überprüft werden kann.
  • Wenn der Begriff "im wesentlichen gereinigt" verwendet wird, wird dies eine Zusammensetzung bezeichnen, in der das TPO-Protein-, -Polypeptid- oder -Peptid die Hauptkomponente der Zusammensetzung bildet, so daß es etwa 50% des Proteins in der Zusammensetzung oder mehr darstellt. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein im wesentlichen gereinigtes Protein mehr als 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder sogar mehr des Proteins in der Zusammensetzung ausmachen.
  • Ein Peptid, Polypeptid oder Protein das "bis zur Homogenität gereinigt ist" wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, bedeutet, daß das Peptid, Polypeptid oder Protein einen Grad der Reinheit aufweist bei dem das Peptid, Polypeptid oder Protein im wesentlichen frei von anderen Proteinen und biologischen Bestandteilen ist. Beispielsweise wird ein gereinigtes Peptid, Polypeptid oder Protein häufig ausreichend frei von anderen Proteinkomponenten sein, so daß eine abbauende Sequenzierung erfolgreich durchgeführt werden kann.
  • Verschiedene Verfahren für die Quantifizierung des Grads der Reinigung von Thrombopoietinproteinen, -polypeptiden oder -peptiden werden dem Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Diese umfassen beispielsweise das Bestimmen der spezifischen Thrombopoietinproteinaktivität einer Fraktion oder die Beurteilung der Anzahl der Polypeptide innerhalb einer Fraktion durch die Gelelektrophorese.
  • Um Thrombopoietinprotein, -polypeptid oder -peptid zu reinigen, wird eine natürliche oder rekombinante Zusammensetzung, die mindestens einige Thrombopoietinproteine, – polypeptide oder -peptide umfaßt, einer Fraktionierung unterzogen werden, um verschieden Nicht-Thrombopoietinbestandteile aus der Zusammensetzung zu entfernen. Zusätzlich zu diesen Techniken die im Detail hierin weiter unten beschrieben werden, werden verschiedene andere Techniken, die für die Proteinreinigung geeignet sind, dem Fachmann gut bekannt sein. Diese umfassen beispielsweise die Präzipitation mit Amoniumsulfat, PEG, Antikörpern und ähnlichem oder durch Hitzedenaturierung gefolgt von Zentrifugation; Chromato graphieschritte, Ionenaustausch, Gel-Filtration, umgekehrte Phasen ("Reverse Phase"), Hydroxylapatit, Lectin-Affinität und andere Affinitätschromatographieschritte; isoelektrische Fokussierung; Gelelektrophorese; und Kombinationen solcher und anderer Techniken.
  • Ein weiteres Beispiel ist die Reinigung eines Thrombopoeitinfusionsproteins unter Verwendung eines spezifischen Bindungspartners. Solche Reinigungsverfahren sind im Stand der Technik Routine. Da die vorliegende Erfindung DNA-Sequenzen für Thrombopoietinproteine zur Verfügung stellt kann nunmehr jedes Fusionsprotein-Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Dies wird beispielhaft durch die Erzeugung eines Thrombopoietin-Glutathion-S-Transferasefusionsproteins, der Expression in E. coli und der Isolation bis zur Homogenität unter Verwendung von Affintätschromatographie an Glutathion-Agarose oder die Erzeugung einer Polyhistidin-Markierung an dem N- oder C- Terminus des Proteins und die anschließende Reinigung unter Verwendung von Ni-Affinitätschromatographie erläutert. Entsprechend der Tatsache das TPO-DNA und -Proteine bekannt sind, kann nunmehr jedoch jedes Reinigungsverfahren eingesetzt werden.
  • Obwohl es für die Verwendung in bestimmten Ausführungsformen bevorzugt, gibt es kein allgemeines Erfordernis, daß das TPO-Protein, -Polypeptid oder -Peptid immer in seiner am meisten gereinigten Form zur Verfügung gestellt werden muß. Tatsächlich wird es erwogen, daß TPO-Protein, -Polypeptid oder -Peptid, je das weniger als im wesentlichen gereinigt ist, das aber nichts desto trotz im Vergleich zu natürlichen Zustand an Thrombopoietinproteinzusammensetzung angereichert ist eine Verwendbarkeit in bestimmten Ausführungsformen aufweist.
  • Die Verfahren, die einen niedrigen Grad der relativen Reinigung aufweisen, können Vorteile bei der Gesamtausbeute des Proteinprodukts oder beim Erhalt der Aktivität des exprimierten Proteins aufweisen. Inaktive Produkte haben auch in bestimmten Ausführungsformen, wie z. B. in der Bestimmung der Antigenität über die Antikörpererzeugung eine gewisse Verwendbarkeit.
  • V. Antikörper gegen Thrombopoietinproteine
  • A. Epitopische Kernsequenzen
  • Peptide, die zu einer oder mehreren antigenen Determinanten oder "Epitopischen Kernregion" der Thrombopoietinproteine, Polypeptide und Peptide korrespondieren, können auch zuberei tet werden. Solche Peptide sollten im allgemeinen eine Länge von mindestens 5 oder 6 Aminosäureresten aufweisen, werden bevorzugt eine Länge von etwa 10, 15, 20, 25, oder etwa 30 Aminosäureresten aufweisen und können bis zu etwa 35–50 Resten oder so enthalten.
  • Synthetische Peptide werden im allgemeinen etwa 35 Reste lang sein, was in etwa das obere Längenlimit automatisierter Peptidsynthesemaschinen, wie die, die von Applied Biosystems (Foster City, CA) erhältlich sind, darstellt. Längere Peptide können z. B. auch durch rekombinante Mittel hergestellt werden.
  • Das U.S. Patent 4,554,101 (Hopp) das hierin durch Verweis aufgenommen wird, lehrt die Identifizierung und Zubereitung von Epitopen aus primären Aminosäuresequenzen auf der Grundlage der Hydrophilie. Durch die in Hopp offenbarten Verfahren kann der Fachmann dazu in der Lage sein, Epitope in eine Aminosäuresequenz wie der TPO-Sequenz der SEQ ID NR: 2 zu identifizieren.
  • Eine Vielzahl wissenschaftlicher Publikationen sind auch der Vorhersage der übergeordneten Struktur und der Identifizierung von Epitopen aufgrund der Analyse der Aminosäuresequenzen gewidmet (Chou und Fasman, 1947a, b; 1978a, b, 1979). Jede von diesen kann verwendet werden, wenn es gewünscht ist die Lehren von Hopp im U.S: Patent 4,554,101 zu ergänzen.
  • Darüber hinaus sind heutzutage Computerprogramme erhältlich, um bei der Vorhersage antigener Teile und epitoper Kernregionen von Protein zu helfen. Beispiele umfassen die Programme, die auf der Jameson-Wolf-Analyse beruhen (Jameson und Wolf, 1988; Wolf et al., 1988), das Programm PepPlot® (Brutlag et al., 1990; Weinberger et al., 1985), und andere neue Programme für die Tertiärstruktur-Vorhersage von Proteinen (Fetrow und Bryant, 1993). Ein anderes kommerziell erhältliches Softwareprogramm, das dazu in der Lage ist solche Analysen durchzuführen, ist MacVector (IBI, New Haven, CT).
  • In weiteren Ausführungsformen können antigene Hauptdeterminanten eines Polypeptides durch einen empirischen Ansatzes identifiziert werden, in dem Teile des Gens, das für das Polypeptid kodiert, in einem rekombinanten Wirt exprimiert werden und die sich ergebenden Proteine auf ihre Fähigkeit hin getestet werden eine Immunantwort auszulösen. Beispielsweise kann die PCRTM verwendet werden, um eine Reihe von Peptiden zu erzeugen, den zunehmend längere Fragmente des C-Terminus des Proteins fehlen. Die Immunreaktivität jedes dieser Peptide wird bestimmt, um die Fragmente oder Domänen des Polypeptids zu identifizieren, die immunodominant sind. Weiter Studien in den bei jedem Schritt nur eine kleine Anzahl Aminosäuren entfernt werden, erlauben es dann den Ort der Antigenen-Determinanten des Polypeptids genauer zu bestimmen.
  • Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung der antigenen Hauptdeterminanten eines Polypeptids ist das SPOTsTM-System (Genosys Biotechnologies, Inc., The Woodlands, TX). In diesem Verfahren werden überlappende Peptide auf einer Zellulosemembran synthetisiert, die nach der Synthese und der Entschützung unter Verwendung eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers durchsucht wird. Die Antigen-Determinanten der Peptide, die anfänglich identifiziert werden, können weiter durch das Durchführen anschließender Synthesen kleinerer Peptide mit größeren Überlappungen lokalisiert werden und durch den letztendlichen Ersatz einzelner Aminosäuren an jeder Position entlang des immunreaktiven Peptids.
  • Sobald eine oder mehrere solcher Analysen fertiggestellt worden sind, können Polypeptide hergestellt werden, die mindestens eines der wesentlichen der einen oder mehreren Antigen-Determinanten entfernen. Die Peptide werden dann in dem Verfahren der Erfindung eingesetzt, um die Verringerung der Erzeugung von Anti-TPO-Antikörpern zu verringern, wenn das TPO an ein Säugetier verabreicht wird. Minigene oder Genfusion die für die Determinanten kodieren, können auch konstruiert werden und in einem Expressionsvektor mit Standardverfahren beispielsweise unter Verwendung von PCRTM-Klonierungsverfahren eingefügt werden.
  • Wie hierin verwendet ist es beabsichtigt, daß der Begriff "Antikörper" breit verwendet jedes immunologisch bindende Mittel wie IgG, IgM, IgA, IgD und IgE bezeichnet. Im allgemeinen sind IgG und/oder IgM bevorzugt, da dies in der physiologischen Situation die häufigsten Antikörper sind und da sie im Laborumfeld am einfachsten hergestellt werden können.
  • Der Begriff "Antikörper" wird verwendet, um alle Antikörper-ähnlichen Moleküle zu bezeichnen, die eine Antigen-Bindungsregion aufweisen, und umfaßt Antikörperfragmente wie Fab', Fab, F(ab')2, Einzeldomänen-Antikörper (DAB), Fv, scFv (Einzelketten Fv = "Single Chain Fv") und ähnliche. Die Techniken für die Herstellung und Verwendung verschiedener auf Antikörper-beruhende Konstrukte und Fragmente sind dem Stand der Technik gut bekannt. Mittel für die Zubereitung Charakterisierung von Antikörpern sind auch im Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Antikörper: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • A. Immunnachweisverfahren
  • Im allgemeinen umfassen Immunbindungsverfahren das Gewinnen einer Probe, von der vermutet wird, daß sie ein Thrombopoietinprotein, -polypeptid oder -peptid enthält und das In-Kontakt-bringen der Probe mit einem ersten Antigen-TPO-Antikörper je nach Lage des Falls unter Bedingungen, die dabei wirksam sind, die Bildung eines Immunkomplexes zu erlauben. Die Entfernung der antigenen Region kann durch das Fehlen einer nachweisbaren Bindung eines veränderten oder mutierten TPO-Moleküls an ein Antikörper bestimmt werden, für den bekannt ist, das er an TPO bindet.
  • Diese Verfahren umfassen Verfahren für die Reinigung von Wild-Typ oder mutierten Thrombopoietinprotein, -polypeptiden oder -peptiden, wie sie gegebenenfalls bei der Reinigung von Wild-Typ oder mutierten Thrombopoietinprotein, -polypeptiden oder -peptiden aus Patientenproben oder bei der Reinigung rekombinant exprimierten Wild-Typ oder mutierten Thrombopoietinproteins, -polypeptids oder -peptids eingesetzt würden. In diesen Fällen entfernt der Antikörper die antigene Wild-Typ oder mutierte Thrombopoietinprotein-, – polypeptid-, oder -peptidkomponente aus der Probe. Der Antikörper wird vorzugsweise mit einem festen Träger verknüpft sein, wie in der Form einer Säulenmatrix und die Probe von der vermutet wird, daß sie die Wild-Typ oder mutierte antigene Thrombopoietinproteinkomponente enthält wird auf den immobilisierten Antikörper gegeben. Die unerwünschten Bestandteile werden von der Säule weggewaschen wodurch das Antigen an dem immobilisierten Antikörper immunkomplexiert gelassen wird, wobei das Wild-Typ oder das mutierte Thrombopoietinproteinantigen dann durch die Entfernung des Wild-Typ oder mutierten Thrombopoietinproteins, -polypeptids oder -peptids von der Säule erhalten wird.
  • Die Immunbindungsverfahren können auch Verfahren für den Nachweis oder die Quantifizierung der Menge einer Wild-Typ oder mutierten Thrombopoietinprotein-reaktiven Komponente in einer Probe umfassen, wobei die Verfahren den Nachweis oder die Quantifizierung jedes Immunkomplexes erfordern, der während des Bindungsprozesses gebildet wurde. Hier würde man eine Probe gewinnen, von der vermutet wird daß sie Wild-Typ oder mutiertes Thrombopoietinprotein, -polypeptid oder -peptid enthält und die Probe mit einem Antikörper gegen Wild-Typ oder mutiertes Thrombopoietin in Kontakt bringen und dann die Menge des Im munkomplexes, der unter den spezifischen Bedingungen gebildet wird, nachweisen oder quantifizieren.
  • Das In-Kontakt-bringen der gewählten biologischen Proben mit dem Antikörper unter Bedingungen, die wirksam sind und für einen Zeitraum der ausreichen ist, um die Bildung von Immunkomplexen (primäre Immunkomplexe) zu erlauben ist im allgemeinen nur eine Sache des einfachen Hinzufügens der Antikörperzusammensetzung zu der Probe und der Inkubation des Gemisches für einen Zeitraum, der lang genug ist, damit die Antikörper Immunkomplexe mit allen vorhandenen Thrombopoietinproteinantigenen bilden können, d. h. binden können. Nach dieser Zeit wird die Proben-Antikörperzusammensetzung wie ein Gewebeschnitt, eine ELISA-Platte, ein Punktblot oder ein "Western-Blot" im allgemeinen gewaschen werden, um nicht spezifisch gebundene Antikörperspezies zu entfernen, wodurch es nur den Antikörpern erlaubt wird, nachgewiesen zu werden, die spezifisch in den primären Immunkomplexen gebunden sind.
  • Im allgemeinen ist der Nachweis der Immunkomplexbildung im Stand der Technik gut bekannt und kann durch die Anwendung einer Vielzahl von Ansätzen erreicht werden. Diese Verfahren beruhen im allgemeinen auf dem Nachweis einer Markierung oder einer Kennzeichnung oder Markierung wie einer radioaktiven, fluoreszenten, biologischen und enzymatischen Markierungen. U.S. Patente, die die Verwendung solcher Markierungen betreffen, umfassen 3,817,937; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241. Natürlich kann man weitere Vorteile durch die Verwendung eines nachgeordneten Bindungsliganden wie eines Zweit-Antikörpers oder einem Biotin/Avidin-Ligandenbindungsanordnung, wie es im Stand der Technik bekannt ist, auffinden.
  • Der in dem Nachweis eingesetzte Thrombopoietinantikörper kann selbst mit einer nachweisbaren Markierung verknüpft sein, wobei man dann einfach diese Markierung nachweisen würde, wodurch es erlaubt würde die Menge des primären Immunkomplexes in der Zusammensetzung zu bestimmen. Alternativ kann der erst Antikörper der innerhalb der primären Immunkomplexe gebunden wird mit Hilfe eines zweiten Bindungsliganden, der eine Bindungsaffinität für den Antikörper aufweist, nachgewiesen werden. In diesen Fällen kann der zweite Bindungsligand mit einer nachweisbaren Markierung verknüpft sein. Dieser zweite Bindungsligand ist selbst häufig ein Antikörper der daher "Zweit"-Antikörper genannt werden kann. Die primären Immunkomplexe werden mit dem markierten Zweitbindungsliganden oder Antikörper unter Bedingungen, die wirksam sind und für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um die Bildung sekundärer Immunkomplexe zu erlauben, in Kontakt gebracht. Diese sekundären Immunkomplexe werden dann im allgemeinen gewaschen, um nicht spezifisch gebundene markierte Zweitantikörper oder Liganden zu entfernen und die verbleibende Markierung in den zweiten Immunkomplexen wird dann nachgewiesen. Weitere Verfahren umfassen den Nachweis von primären Immunkomplexen in einem Zwei-Schritt-Ansatz. Ein zweiter Bindungsligand wie ein Antikörper, der eine Bindungsaffinität für den Antikörper aufweist, wird verwendet, um den zweiten Immunkomplex wie oben beschrieben zu bilden. Nach dem Waschen werden die zweiten Immunkomplexe mit einem dritten Bindungsliganden oder Antikörper in Kontakt gebracht, der eine Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper aufweist, wiederum unter Bedingungen, die wirksam sind und für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um die Bildung der Immunkomplexe (tertiäre Immunkomplexe) zu erlauben. Der dritte Ligand oder Antikörper ist mit einer nachweisbaren Markierung verknüpft was den Nachweis der so gebildeten tertiären Immunkomplexe erlaubt. Dieses System kann eine Signalverstärkung zur Verfügung stelle, wenn dies gewünscht ist.
  • 1. ELISAs
  • Wie oben ausgeführt sind Immuntestverfahren in ihrer einfachsten Form und in ihrer direktesten Bedeutung Bindungstestverfahren. Bestimmte bevorzugte Immuntestverfahren sind die verschiedenen Sorten der Enzymgekoppelten Immunsorbenttestverfahren (ELISAs = "Enzym linked immunosorbent assays") und Radioimmuntestverfahren (RIA = "radioimmunoassays"), die im Stand der Technik bekannt sind. Der immunhistochemische Nachweis unter Verwendung von Gewebeschnitten ist auch besonders nützlich. Es wird jedoch sofort erkennbar sein, daß der Nachweis nicht auf solche Verfahren beschränkt wird und das "Western-Blotting", Punktblotting, FACS-Analysen und ähnliches auch verwendet werden können.
  • In einem beispielhaften ELISA werden die Anti-TPO-Antikörper der Erfindung auf einer ausgewählten Oberfläche, die eine Proteinaffinität zeigt, immobilisiert, wie eine Vertiefung in einer Polystyrolmikrotiterplatte. Dann wird eine Testzusammensetzung, von der vermutet wird, daß sie Wild-Typ oder mutiertes Thrombopoietinproteinantigen enthält wie eine klinische Probe zu den Vertiefungen hinzugefügt. Nach dem Binden und dem Waschen, um nicht-spezifisch gebundene Immunkomplexe zu entfernen kann das gebundene Wild-Typ oder mutierte Thrombopoietinproteinantigen nachgewiesen werden. Der Nachweis wird im allgemeinen durch das Hinzufügen eines weiteren Anti-TPO-Antikörpers erreicht, der mit einer nach weisbaren Markierung verknüpft ist. Diese Sorte des ELISA ist ein einfacher "Sandwich-ELISA". Der Nachweis kann auch durch das Hinzufügen eines Zweit-Anti-TPO-Antikörpers gefolgt von dem Hinzufügen eines Dritt-Antikörpers, der eine Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper aufweist, wobei der Dritt-Antikörper mit einer nachweisbaren Markierung verknüpft ist, erreicht werden.
  • In einem weiteren beispielhaften ELISA werden die Proben von denen vermutet wird, daß sie Wild-Typ oder mutiertes Thrombopoietinproteinantigen enthalten auf der Vertiefungsoberfläche immobilisiert und dann mit dem Anti-TPO-Antikörpern in Kontakt gebracht. Nach dem Binden und Waschen, um nicht-spezifisch gebundene Immunkomplexe zu entfernen werden die gebundnen Anti-TPO-Antikörper nachgewiesen. Im Falle, daß die anfänglichen Anti-TPO-Antikörper mit einer nachweisbaren Markierung verknüpft waren, können die Immunkomplexe direkt nachgewiesen werden. Wiederum können die Immunkomplexe unter Verwendung eines zweiten Antikörpers nachgewiesen werden der eine Bindungsaffinität für den ersten Anti-TPO-Antikörper aufweist, wobei der zweite Antikörper mit einer nachweisbaren Markierung verknüpft ist.
  • Ein weiterer ELISA in den Wild-Typ oder mutierte Thrombopoietinproteine, -polypeptide oder -peptide immobilisiert sind, beinhaltet die Verwendung einer Antikörperkompetition bei dem Nachweis. In diesem ELISA werden markierte Antikörper gegen Wild-Typ oder mutierte Thrombopoietinproteinzusammensetzungen zu den Vertiefungen zugefügt, es wird ihnen erlaubt zu binden und sie werden Mittels ihrer Markierung nachgewiesen. Die Menge des Wild-Typs oder mutierten Thrombopoietinproteinantigens in einer unbekannten Probe wird dann durch das Mischen der Probe mit den markierten Antikörpern gegen das Wild-Typ oder das mutierte Thrombopoietinprotein vor oder während der Inkubation mit dem beschichteten Vertiefungen bestimmt. Die Gegenwart des Wild-Typ oder des mutierten Thrombopoietinproteins in der Probe wirkt dahingehend, daß die Menge des Antikörpers gegen das Wild-Typ oder mutierte Thrombopoietinprotein, -polypeptid oder -peptid verringert wird, der für die Bindung an die Vertiefung zur Verfügung steht und dadurch wird das Endsignal verringert. Dies ist auch für den Nachweis von Antikörpern gegen Wildtyp oder mutiertes Thrombopoietinprotein, -polypeptid, oder -peptid in einer unbekannten Probe geeignet, wenn der unmarkierte Antikörper an die Antigen-beschichteten Vertiefungen bindet und auch die Menge des Antigens verringert, das für die Bindung an die markierten Antikörper zur Verfügung steht.
  • Unabhängig von dem eingesetzten Format haben ELISAs bestimmte übereinstimmende Eigenschaften wie die Beschichtung, die Inkubation oder die Bindung, das Waschen um nicht-spezifisch gebundene Spezies zu entfernen und den Nachweis des gebundenen Immunkomplexes. Diese sind unten beschrieben.
  • Bei der Beschichtung einer Platte mit entweder einem Antigen oder einem Antikörper wird man im allgemeinen die Vertiefung der Platte mit einer Lösung des Antigens- oder Antikörpers über Nacht oder für eine bestimmte Anzahl von Stunden inkubieren. Die Vertiefungen der Platte werden dann gewaschen werden, um unvollständig adsorbiertes Material zu entfernen. Alle verbleibenden zugänglichen Oberflächen der Vertiefung werden dann mit einem nicht-spezifischen Protein, das Antigen-neutral im Hinblick auf die Testantiseren ist, beschichtet. Diese umfassen Rinder-Serumalbumin (BSA = "bovine serum albumin"), Kasein und Lösung aus Milchpulver. Die Beschichtung erlaubt die Blockierungen nicht-spezifischer Adsorptionsstellen auf der Immobilisierungsoberfläche und reduziert daher den Hintergrund, der durch die nicht-spezifische Bindung von Antisera auf der Oberfläche ausgelöst wird.
  • Bei ELISAs ist es wahrscheinlich üblicher, zweite oder dritte Nachweismittel statt eines direkten Verfahrens zu verwenden. Daher wird die Immobilisierungsoberfläche nach der Bindung eines Proteins oder Antikörpers an die Vertiefung, dem Beschichten mit einem nichtreaktiven Material, um den Hintergrund zu reduzieren, und dem Waschen, um das ungebundene Material zu entfernen, mit der biologischen Probe, die getestet werden soll, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die wirksam darin sind, eine Immunkomplexbildung zu erlauben (Antigen/Antikörper). Der Nachweis des Immunkomplexes erfordert dann einen markierten Zweitbindungsliganden oder Antikörper oder einen Zweitbindungsliganden oder Antikörper im Zusammenhang mit einem markierten tertiären Antikörper oder Drittbindungsliganden.
  • "Unter Bedingungen, die wirksam sind Immunkomplex (Antigen/Antikörper)-Bildung zu erlauben" bedeutet, daß die Bedingung vorzugsweise das Verdünnen der Antigene und Antikörper mit Lösungen wie BSA, Rinder-Gammaglobulin (BGG = "bovine gamma globulin") und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS = "phosphate buffered saline")/Tween umfaßt. Diese hinzugefügten Mittel pflegen bei der Verringerung des nicht-spezifischen Hintergrunds behilflich zu sein.
  • Die "geeigneten" Bedingungen, bedeuten auch, daß die Inkubation bei einer Temperatur und für einen Zeitraum stattfindet, die ausreichend ist, um eine wirksame Bindung zu erlauben. Die Inkubationsschritte sind typischerweise von etwa 1 bis 2 bis 4 oder so Stunden bei Temperaturen vorzugsweise in der Größenordnung von 25°C bis 27°C oder können über Nacht bei etwa 4°C oder so ausgeführt werden.
  • Auf alle Inkubationsschritte in einem ELISA folgend, werden die in Kontakt gebrachten Oberflächen gewaschen, um nicht-komplexiertes Material zu entfernen. Ein bevorzugtes Waschverfahren umfaßt das Waschen mit einer Lösung wie PBS/Tween oder Boratpuffer. Auf die Bildung spezifischer Immunkomplexe zwischen der Testprobe und dem ursprünglich gebundenen Material folgend und dem anschließenden Waschen, kann das Auftreten selbst geringster Mengen des Immunkomplexes bestimmt werden.
  • Um ein Nachweismittel zur Verfügung zu stellen, wird der Zweit- oder Drittantikörper eine assoziierte Markierung aufweisen, die den Nachweis erlaubt. Vorzugsweise wird dies ein Enzym sein, das auf die Inkubation mit einem geeigneten homogenen Substrat hin eine Farbentwicklung erzeugt. Somit kann man beispielsweise wünschen den ersten oder den zweiten Immunkomplex mit einem Urease-, einem Glukoseoxidase-, einem alkalischen Phosphatase- oder Wasserstoffperoxid-konjugierten Antikörper für einen Zeitraum unter Bedingungen, die die Entwicklung weiterer Immunkomplexbildungen fördern (z. B. durch Inkubation über 2 Stunden bei Raumtemperatur in PBS-enthaltender Lösung wie PBS/Tween) in Kontakt zu bringen und zu inkubieren.
  • Nach der Inkubation mit dem markierten Antikörper und anschließend an das Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, wird die Menge der Markierung quantifiziert z. B. durch die Inkubation mit einem chromogenen Substrat wie Harnstoff und Bromcresol violett oder 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfon)-säure (ABTS) und H2O2 im Falle von Peroxidasen als Enzymmarkierung. Die Quantifizierung wird dann durch das Messen des Grads der Farberzeugung, z. B. unter Verwendung eines Spektrophotometers für die sichtbare Spektren, gemessen.
  • VI. Biologisch funktionelle Äquivalente
  • Da bestimmte Modifikationen Veränderungen in der Struktur der Thrombopoietingene und -proteine gemacht werden können und dabei immer noch Moleküle erhalten werden können, die ähnliche oder in anderer Weise wünschenswerte Charakteristika aufweisen, sind solche biologisch funktionellen Äquivalente auch von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
  • Beispielsweise können bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren in einer Proteinstruktur ersetzt werden ohne bemerkbaren Verlust der interaktiven Bindungskapazität mit anderen Strukturen wie beispielsweise mit Antigen-Bindungsregionen von Antikörpern, Bindungsstellen auf Substratmolekülen oder Rezeptoren oder ähnlichem. Da es die interaktive Kapazität und die Natur des Proteins ist, die die biologisch funktionelle Aktivität eines Proteins definiert, können bestimmte Aminosäuresequenz-Substitutionen in einer Proteinsequenz ausgeführt werden (oder natürlich in ihrer zugrundeliegenden DNA-kodierenden Sequenz) und nichtsdestoweniger ein Protein mit ähnlichen (agonistischen) Eigenschaften erhalten. Es wird daher von den Erfindern erwogen, daß verschiedenen Änderungen in der Sequenz der Thrombopoietinproteine, -polypeptide oder -peptide oder den ihnen zugrundeliegenden Nukleinsäuren ohne spürbaren Verlust ihrer biologischen Nützlichkeit oder Aktivität durchgeführt werden können.
  • Gleichermaßen können dieselben Erwägungen angewendet werden, um ein Protein, Polypeptid oder Peptid zu erzeugen mit kompensierenden, z. B. antagonistischen Eigenschaften. Dies ist für die vorliegende Erfindung, in der Thrombopoietinmutanten oder Analoge erzeugt werden können, von Bedeutung. Beispielsweise kann eine Thrombopoietinmutante erzeugt werden und auf Proteinthrombopoietinaktivität hin getestet werden, um die Reste zu identifizieren, die für die Thrombopoietinaktivität von Bedeutung sind. Thrombopoietinmutanten können auch synthetisiert werden, um eine Thrombopoietinmutante darzustellen, die weniger Antigen ist, aber die immer noch ihre thrombopoetischen und/oder kältekonservierenden Aktivitäten bewahrt.
  • Im Hinblick auf funktionelle Äquivalente wird es vom Fachmann gut verstanden werden, daß in der Definition ein "biologisch funktionell äquivalentes"-Protein, Polypeptid oder Peptid oder Gen das Konzept inhärent ist, daß es eine Grenze für die Anzahl der Veränderungen gibt, die innerhalb eines definierten Teils des Moleküls eingeführt werden können, und die immer noch zu einem Molekül mit einer annehmbaren Menge äquivalenter biologischer Aktivität führen. Biologisch funktionell äquivalente Peptide sind daher als die Peptide definiert, in denen bestimmte, nicht die meisten oder alle der Aminosäuren substituiert sein können.
  • Insbesondere wenn Peptide kürzerer Länge betroffen sind, wird erwogen, daß weniger Änderungen der Aminosäure innerhalb des gegebenen Peptids ausgeführt werden sollten. Längere Domänen können eine dazwischenliegende Anzahl von Änderungen aufweisen. Das Protein voller Länge wird die größte Toleranz für eine große Anzahl von Änderungen aufweisen. Natürlich können eine Vielzahl unterschiedlicher Proteinen/Polypeptiden/Peptiden mit verschiedenen Substitutionen einfach hergestellt und im Zusammenhang mit der Erfindung verwendet werden.
  • Es ist auch gut verstanden, daß, wenn für bestimmte Reste gezeigt wurde, das sie besonders für die biologischen oder strukturellen Eigenschaften eines Proteins, Polypeptids oder Peptids wichtig sind, z. B. Reste in Bindungsregionen oder aktiven Stellen, solche Reste im allgemeinen nicht ausgewechselt werden können. In dieser Weise sind hierin funktionelle Äquivalente als die Peptide definiert, die eine bedeutende Menge ihrer nativen biologischen Aktivität bewahren.
  • Aminosäure-Ersetzungen beruhen im allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäureseitenketten-Substituenten, beispielsweise ihrer Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung, Größe und ähnlichem. Eine Analyse der Größe, Form und des Typs der Aminosäureseitenketten-Substituenten offenbart, daß Arginin, Lysin und Histidin alle positiv geladene Reste sind; das Alanin, Glycin und Serin alle eine ähnliche Größe aufweisen und das Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin alle eine im allgemeinen ähnlich Form aufweisen. Daher werden hierin, beruhend auf diesen Erwägungen, Arginin, Lysin und Histidin; Alanin, Glycin und Serin; und Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin als biologisch funktionelle Äquivalente definiert.
  • Um quantitativere Änderungen auszuführen, kann der Hydropathische-Index der Aminosäuren berücksichtigt werden. Jeder Aminosäure ist beruhend auf ihrer Hydrophobie und Ladungscharakteristika ein Hydrophatischer-Index zugewiesen. Diese sind: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5); Aspartat (–3,5); Asparagin (– 3,5); Lysin (–3,9); und Arginin (–4,5).
  • Die Bedeutung des hydrophatischen Aminosäureindex bei der Übertragung interaktiver biologischer Funktionen auf ein Protein wird im Stand der Technik allgemein gut verstanden (Kyte und Doolittle, 1982, hierin durch Verweis aufgenommen). Es ist bekannt, daß bestimmte Aminosäuren für andere Aminosäuren substituiert werden können, die einen ähnlichen Hydrophatischer-Index oder Wert aufweisen und dabei immer noch eine ähnlich biologische Aktivität zurückbehalten werden kann.
  • Bei der Durchführung dieser Änderungen beruhend auf dem Hydrophatischen-Index ist die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophatische-Indices innerhalb von ± 2 bevorzugt von denen, die innerhalb von ± 1 liegen, besonders bevorzugt und von denen, die innerhalb von ± 0,5 oder mehr liegen, besonders bevorzugt.
  • Es ist auch im Stand der Technik verstanden, daß die Substitution von ähnlichen Aminosäuren auf Grundlage der Hydrophilie durchgeführt werden kann, insbesondere wenn das biologisch funktionell äquivalente Protein, Polypeptid oder Peptid, das dadurch erzeugt wird, für die Verwendung in immunologischen Ausführungsformen gedacht ist, wie in bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. U.S. Patent Nr. 4,554,101 stellt fest, daß die größte lokale Durchschnittshydrophilie eines Proteins, wie sie durch die Hydrophilie der angrenzenden Aminosäuren bestimmt ist, mit der Immunogenität und Antigenität, d. h. mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins, korreliert.
  • Wie in U.S. Patent 4,554,101 ausgeführt, sind die folgenden Hydrophilie-Werte den Aminosäureresten zugeordnet worden: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 ± 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+3,0); Asparagin (+2,0); Glutamin (+2,0); Glycin (0); Threonin (–0,4); Prolin (–0,5 ± 1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4).
  • Bei dem Einführen von Änderungen beruhend auf ähnlichen Hydrophiliewerten ist die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophiliewerte innerhalb von ± 2 liegt bevorzugt, die innerhalb von ± 1 besonders bevorzugt und die innerhalb von ± 0,5 oder mehr liegt, besonders bevorzugt.
  • Während sich die Diskussion auf funktionell äquivalente Polypeptide fokussiert hat, die sich aus Aminosäureänderungen ergeben, wird erkannt werden, daß diese Änderungen durch die Veränderung der kodierenden DNA hervorgerufen werden können; unter Berücksichtigung, daß auch der genetische Code degeneriert ist und daß zwei oder mehr Codons für dieselbe Aminosäure kodieren können. Eine Tabelle der Aminosäuren und ihrer Codons ist hierin weiter oben für die Verwendung in solchen Ausführungsformen sowie für andere Verwendungen wie in dem Design von Sonden und Primern und ähnlichem dargestellt.
  • Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Thrombopoietin-Peptidylverbindungen erwägen die Erfinder auch, daß andere sterisch ähnliche Verbindungen formuliert werden können, um Schlüsselbereiche der Peptidstruktur nachzuahmen. Solche Verbindungen die Peptidomimetics genannt werden können, können in derselben Weise, wie die Peptide der Erfindung verwendet werden und sind daher auch funktionelle Äquivalente.
  • Bestimmte Mimetica, die Elemente der Proteinsekundärstrukturen nachahmen, sind in Johnson et al. (1993) beschrieben. Das der Verwendung von Peptidmimetica zugrunde liegende Prinzip ist, daß das Peptidrückrat von Proteinen in erster Linie deshalb existiert, um die Aminosäureseitenketten in solch einer Weise auszurichten, daß molekulare Wechselwirkungen wie die zwischen Antikörper und Antigen ermöglicht werden. Ein Peptidmimetic wird daher entworfen, um molekulare Interaktionen ähnlich dem natürlichen Molekül zu erlauben.
  • Einige erfolgreiche Anwendungen des Peptid-mimetischen Konzepts haben sich auf Mimetica von Proteinen mit β-Windungen, von denen bekannt ist, daß sie hoch antigen sind, fokussiert. Gleichermaßen können β-Windungsstrukturen innerhalb eines Polypeptids durch auf Computerberuhenden Algorithmen, wie hierin diskutiert, vorausgesagt werden. Sobald die Aminosäurebestandteile der Windungen bestimmt sind, können Mimetica konstruiert werden, um eine ähnliche räumliche Anordnung der wesentlichen Elemente der Aminosäureseitenketten zu erreichen.
  • Die Erzeugung weiterer struktureller Äquivalente oder Mimetica kann durch Verfahren des Modulierens und des chemischen Designs, die dem Fachmann bekannt sind, erreicht werden. Die Kunst des Rezeptormodulierens ist nunmehr gut bekannt und durch solche Verfahren kann eine Chemikalie, die an Thrombopoietinproteine, -polypeptide oder -peptide bindet, entworfen und dann synthetisiert werden. Es wird verstanden werden, daß alle solchen sterisch entworfenen Konstrukte in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen.
  • Zusätzlich zu den 20 "Standard"-Aminosäuren, die durch den genetischen Code zur Verfügung gestellt werden, werden auch modifizierte oder ungewöhnliche Aminosäuren für die Verwendung der vorliegenden Erfindung erwogen. Eine Tabelle beispielhafter aber nicht einschränkender modifizierter oder ungewöhnlicher Aminosäuren wird hierin weiter unten zur Verfügung gestellt.
  • Figure 00780001
  • VII. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • A. Pharmazeutisch annehmbare Träger
  • Wäßrige Zusammensetzungen umfassen eine wirksame Menge des Thrombopoietinproteins, -polypeptids, -peptids oder ähnlichem gelöst oder dispergiert in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder wäßrigem Medium. Die Begriffe "pharmazeutisch oder pharmakologisch annehmbar" bezeichnen molekulare Einheiten oder Zusammensetzungen, die keine gegensätzliche allergische oder in anderer Weise unpassende Reaktion hervorrufen, wenn sie an ein Tier oder an einen Menschen, wie jeweils anwendbar, verabreicht werden.
  • Wie hierin verwendet umfaßt "pharmazeutisch annehmbarer Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und antipilz Mittel, isotonische und Absorptions-verzögernde Mittel und ähnliches. Die Verwendung solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik gut bekannt. Mit der Ausnahme insoweit ein übliches Medium oder Agens mit dem aktiven Wirkstoff inkompatibel ist, wird seine Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen erwogen. Ergänzende aktive Wirkstoffe können auch in die Zusammensetzung aufgenommen sein. Für die menschliche Verabreichung sollten die Zubereitungen die sterilitäts-, pyrogenitäts-, allgemeinen Sicherheits- und Reinheitsstandards, wie sie durch die FDA Office of Biologics Standards gefordert werden, erfüllen.
  • Das biologische Material sollte ausgiebig dialysiert sein, um unerwünschte Moleküle niederen Molekulargewichts zu entfernen und/oder lyophilisiert sein, um für eine leichtere Formulierung in einen gewünschten Träger, wie jeweils anwendbar. Die aktiven Wirkstoffe werden dann im allgemeinen wie parenterale Verabreichung formuliert z. B. als Formulierung für die Injektion über intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intralesionale oder selbst intraperitoneale Wege. Die Zubereitung einer wäßrigen Zusammensetzung, die ein Thrombopoietinmittel als aktiven Wirkstoff oder Inhaltsstoff enthält, wird dem Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung offensichtlich sein. Typischerweise können solche Zusammensetzungen als Injektionsstoffe entweder als flüssige Lösung oder Suspension zubereitet werden; feste Formen, die für die Verwendung zur Erzeugung von Lösung oder Suspension nach dem Hinzufügen einer Flüssigkeit vor der Injektion verwendet werden können, können auch zubereitet werden und die Zubereitungen können auch emulgiert werden.
  • Die pharmazeutischen Formen, die für die Injektionsverwendung geeignet sind, umfassen sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen. Die Formulierungen umfassen Sesamöl, Erdnußöl oder wäßriges Propylenglycol; und sterile Pulver für die unvorbereitete Zubereitung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muß die Arzneiform steril sein und muß bis zu dem Grad flüssig sein, daß eine leichte Spritzbarkeit besteht. Sie muß unter Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und muß gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen geschützt sein.
  • Lösungen des aktiven Wirkstoffs als freie Base oder pharmakologisch akzeptables Salz können in Wasser, das geeigneterweise mit einer Oberflächen-aktiven Substanz wie Hydroxypro pylcellulose gemischt ist, zubereitet werden. Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglycol und Gemischen davon und in Ölen zubereitet werden. Unter normalen Bedingungen der Lagerung und Verwendung können diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel enthalten, um das Wachsen von Mikroorganismen zu verhindern.
  • Ein Thrombopoietinprotein, -polypeptid und/oder -peptid kann in einer Zusammensetzung in einer neutralen oder Salzform formuliert sein. Pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen die Säureadditionssalze (die aus den freien Aminogruppen des Proteins gebildet werden) und die mit anorganischen Säuren wie beispielsweise Salz- oder Phosphorsäuren oder solchen organischen Säuren wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und ähnlichem gebildet werden. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen, wie beispielsweise Natrium, Kalium, Amonium, Calcium oder Eisenhydroxiden oder solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und ähnlichem abgeleitet werden. Im Hinblick auf die Verwendung von Peptid-Therapeutika als aktive Wirkstoffe, kann die Technologie der U.S. Patente 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; und 4,578,770 verwendet werden.
  • Der Träger kann auch ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und ähnliches), geeignete Gemische davon und Pflanzenöle enthält. Die angemessene Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung von Beschichtungsmitteln wie Lecithin, durch das Bewahren der erforderlichen Partikelgröße im Falle von Dispersion oder durch die Verwendung von Oberflächen-aktiven Substanzen erhalten werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antipilz Mittel beispielsweise Paraben, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und ähnliche erreicht werden. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein, isotonische Mittel beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid aufzunehmen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzung kann durch die Verwendung von Mitteln in den Zusammensetzungen erreicht werden, die die Absorption verlangsamen beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine.
  • Sterile injizierbare Lösungen werden durch die Aufnahme der aktiven Wirkstoffe in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösungsmittel mit verschiedenen anderen Inhaltsstoffen, die oben aufgeführt sind, wie erforderlich zubereitet gefolgt von einer Filtersterilisation. Im allgemeinen werden Dispersionen durch die Aufnahme der verschiedenen sterilisierten akti ven Wirkstoffe in einen sterilen Träger, der das zugrunde liegende Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Inhaltsstoffe, aus den oben aufgeführten enthält, zubereitet. Im Falle steriler Pulver für die Zubereitung steriler injizierbarer Lösungen, sind die bevorzugten Verfahren der Zubereitung Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken, die ein Pulver des aktiven Wirkstoffs zuzüglich jedes zusätzlichen gewünschten Inhaltsstoffs aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon ergeben. Die Zubereitung von mehr oder höher konzentrierten Lösungen für die direkte Injektion wird auch erwogen, wobei die Verwendung von DMSO als Lösungsmittel erwogen wird, um zu einer extrem schnellen Durchdringung zu führen, wodurch hohe Konzentration der aktiven Wirkstoffe an einen schmalen Bereich verabreicht werden.
  • Nach der Formulierung werden die Lösungen in einer Weise verabreicht, die mit der Dosis-Formulierung kompatibel sind und in einer solchen Menge, wie sie therapeutisch wirksam ist. Die Formulierungen werden in einer Vielzahl von Dosierungsformen, die vom Typ der oben beschriebenen injizierbaren Lösungen einfach verabreicht, aber Arzneistoffreisetzungskapseln und ähnliches können auch eingesetzt werden.
  • Für die parenterale Verabreichung von beispielsweise wäßrigen Lösungen sollte die Lösung ausreichend gepuffert sein, wenn erforderlich, und das flüssige Verdünnungsmittel sollte zuerst mit einer ausreichenden Salzmenge oder Glukose isoton gemacht werden. Diese bestimmten wäßrigen Lösungen sind für die intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Verabreichung besonders geeignet. In diesem Zusammenhang werden die sterilen wäßrigen Medien, die eingesetzt werden können, dem Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Beispielsweise könnte eine Dosierung in 1 ml isotonischer NaCl-Lösung aufgelöst werden und entweder zu 1.000 ml Hypodermoclysis-Flüssigkeit hinzugefügt oder an der vorgeschlagenen Stelle der Infusion injiziert werden (siehe beispielsweise "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. Ausgabe, Seiten 1035–1038 und 1570–1580). Einige Variationen in der Dosierung werden notwendigerweise auftreten abhängig vom Zustand der behandelten Person. Die für die Verabreichung verantwortliche Person wird in jedem Fall die für die jeweilige Person geeignete Dosierung bestimmen.
  • Zusätzlich zu den für die parenterale Verabreichung formulierten Verbindungen, wie intravenöse oder intramuskuläre Injektion, umfassen andere pharmazeutisch annehmbare Formen z. B. Tabletten oder andere feste Formen für die orale Verabreichung; liposomale Formulie rungen; zeitverzögerte Kapseln; und jede andere gegenwärtig verwendete Form umfassend Cremes.
  • Man kann auch Nasenlösung oder Sprays, Aerosole oder Inhalationsstoffe in der vorliegenden Erfindung verwenden. Nasenlösungen sind üblicherweise wäßrige Lösungen, die entworfen sind, um an den Nasengang in Tropfen oder Sprays verabreicht zu werden. Nasenlösungen werden so zubereitet, daß sie in vielerlei Hinsicht der Nasensekretion ähnlich sind, so daß die normale Ziliaraktivität bewahrt wird. Somit sind wäßrige Nasenlösungen üblicherweise isotonisch und leicht gepuffert, um einen pH von 5,5 bis 6,5 zu halten. Zusätzlich können antimikrobielle Konservierungsmittel ähnlich denen, die in Augenzubereitungen verwendet werden, und geeignete Arzneistoffstabilisatoren, wenn erforderlich in die Formulierung aufgenommen werden. Verschiedene kommerzielle Nasenzubereitungen sind bekannt und umfassen beispielsweise Antibiotika und Antihistamine und werden für die Asthmaprophylaxe verwendet.
  • Weitere Formulierung, die für andere Wege der Verabreichung geeignet sind, umfassen vaginale Suppositorien und Pessare. Ein rektales Pessar oder Suppositorium kann auch verwendet werden. Suppositorien sind feste Dosierungsformen verschiedener Gewichte und Größen, die üblicherweise für die Einführung in das Rektum, die Vagina oder die Harnröhre verschrieben werden. Nach der Einführung erweichen die Suppositorien, schmelzen oder lösen sich in den Flüssigkeiten der Körperhöhle. Im allgemeinen können in Suppositorien traditionelle Bindungsmittel und -träger enthalten sein, beispielsweise Polyalkylenglycole oder Triglyceride; solche Suppositorien können aus Gemischen, die den aktiven Wirkstoff im Bereich von 0,5% bis 10% vorzugsweise 1% bis 2% enthalten, gebildet werden.
  • Orale Formulierungen umfassen die normalerweise eingesetzten Exzipienten wie beispielsweise pharmazeutische Qualitäten von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Zellulose, Magnesiumcarbonat und ähnlichem. Diese Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösung, Suspension, Tabletten, Pillen, Kapseln, verzögerten Freisetzungsformulierungen oder Pulvern an. In bestimmten definierten Ausführungsformen werden orale pharmazeutische Zusammensetzungen, ein inertes Verdünnungsmittel oder einen assimilierbaren, eßbaren Träger umfassen oder sie können in einer Hart- oder Weichschalengelantinekapsel eingeschlossen sein oder sie können zu Tabletten gepreßt sein oder sie können direkt in das Essen oder die Nahrung aufgenommen sein. Für die orale therapeutische Verabreichung können die aktiven Verbindungen mit Exzipienten aufgenommen werden und in der Form von schluckbaren Tabletten, Lutschtabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspension, Sirupen, Scheiben und ähnlichem verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Zubereitungen sollten mindestens 0,1% des aktiven Wirkstoffs umfassen. Der Prozentsatz der Zusammensetzung und Zubereitung kann natürlich variiert werden und kann vorteilhaft zwischen 2% bis etwa 75% des Gewichts der Einheit oder bevorzugter zwischen 25% bis 60% betragen. Die Menge der aktiven Wirkstoffe in solchen therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist so, daß eine geeignete Dosierung erhalten werden wird.
  • Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und ähnliche können auch das folgende enthalten: ein Bindungsmittel wie Tragantgummi, Akazie, Kornstärke oder Gelatine; Exzipienten wie Dicalciumphosphat; ein Zerfallsmittel wie Kornstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und ähnliches; ein Befeuchtungsmittel wie Magnesiumstearat und ein Süßmittel wie Saccharose, Lactose oder Saccharin kann zugefügt werden, oder ein Geschmacksstoff wie Pfefferminz, Öl des Amerikanischen Immergrüns oder Kirschgeschmacksstoff. Wenn die Dosierungsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu den Materialien des obigen Typs einen flüssigen Träger umfassen. Eine Vielzahl anderer Materialien kann als Beschichtungsmittel vorhanden sein, oder um in anderer Weise die physikalische Form der Dosierungseinheit zu modifizieren. Beispielsweise können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beiden beschichtet sein. Ein Sirup oder Elixier kann die aktiven Bestandteile, Saccharose als Süßungsmittel, Methyl und Propylparaben als Konservierungsmittel, ein Farbstoff und Geschmacksstoffe wie Kirsch- oder Orangenaroma enthalten.
  • B. Liposomen und Nanokapseln
  • In bestimmten Ausführungsformen wird die Verwendung von Liposomen und/oder Nanopartikeln für die Einführung von Thrombopoietinproteinen, -polypeptiden, -peptiden oder Mitteln oder Gentherapievektoren, die sowohl Wildtyp als auch Antisensevektoren umfassen, in Wirtszellen erwogen. Die Bildung und Verwendung von Liposomen ist im allgemeinen dem Fachmann bekannt und ist auch unten beschrieben.
  • Nanokapseln fangen im allgemeinen Verbindungen in einer stabilen und reproduzierbaren Weise. Um Nebenwirkungen aufgrund intrazellulärer polymerer Ladung zu verhindern, sollten solche ultrakleinen Partikel (Größe etwa 0,1 μm) unter Verwendung von Polymeren entworfen werden, die dazu in der Lage sind in vivo abgebaut zu werden. Bioabbaubare Polyalky1-Cyanoakrylat-Nanopartikel, die diese Anforderung erfüllen, werden für die Verwendun gen der vorliegenden Erfindung erwogen und solche Partikel können ohne weiteres hergestellt werden.
  • Liposomen werden aus Phospholipiden gebildet, die in einem wäßrigen Medium dispergiert sind und spontan multilamellare konzentrische zweilagige Vesikel (auch multilamellare Vesikel (MLVs) genannt) bilden. MLVs haben im allgemeinen einen Durchmesser von 25 nm bis 4 μm. Die Sonifizierung der MLVs fährt zur Bildung kleiner einlamellarer Vesikel (SUVs = "small unilumellar vesicles") mit Durchmessern in Bereichen von 200 bis 500 Å, die eine wäßrige Lösung im Kern enthalten.
  • Die folgenden Informationen können auch bei der Erzeugung liposomaler Formulierungen verwendet werden. Phospholipide können auf die Dispersion im Wasser hin eine Vielzahl von Strukturen außer Liposomen bilden, abhängig von dem molaren Verhältnis von Lipid zu Wasser. Bei niedrigen Verhältnissen ist das Liposom die bevorzugte Struktur. Die physikalischen Charakteristika der Liposomen hängen vom pH, der ionischen Stärke und der Gegenwart divalenter Kationen ab. Liposomen können eine niedrige Permeabilität gegenüber ionischen und polaren Substanzen aufweisen, können aber bei erhöhten Temperaturen einen Phasenübergang durchmachen, der deutlich ihre Permeabilität erhöht. Dieser Phasenübergang beinhaltet eine Änderung von der dicht gepackten, geordneten Struktur, die als das Gelstadium bekannt ist zu einer locker gepackten, weniger geordneten Struktur, die als das fluide Stadium bekannt ist. Dies tritt bei einer charakteristischen Phasenübergangstemperatur auf und führt zu einer Erhöhung der Permeabilität gegenüber Ionen, Zuckern und Arzneistoffen.
  • Liposomen interagieren mit Zellen über vier verschiedene Mechanismen: Endozytose durch phagozytotische Zellen des retikuloendothelialen Systems wie Makrophagen und Neutrophile; Adsorption an der Zelloberfläche, entweder durch nicht-spezifische schwache hydrophobe oder elektrostatische Kräfte oder durch spezifische Interaktion mit Zelloberflächenbestandteilen; Fusion mit Plasmazellmembran durch Insertion der Lipid-Doppelschicht des Liposoms in die Plasmamembran mit gleichzeitiger Freisetzung des liposomalen Inhalts in das Zytoplasma; und durch Transfer liposomaler Lipide zu zellulären oder subzellulären Membran oder umgekehrt ohne Assoziation des Liposomeninhalts. Die Variation der Liposomenformulierung kann verändern, welcher Mechanismus wirksam ist, obwohl mehr als einer zum selben Zeitpunkt wirken kann.
  • C. Kits
  • Die therapeutischen Kits der vorliegenden Erfindung sind Kits, die ein Thrombopoietinprotein, -polypeptid, -peptid und/oder einen anderen Thrombopoietineffektor umfaßt. Das Kit kann des weiteren Instruktionen für seine Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung und/oder als Blutplättchen-Gefrierkonservierungsmittel enthalten. Solche Kits werden im allgemeinen in geeigneten Behältermitteln eine pharmazeutisch annehmbare Formulierung eines Thrombopoietinproteins, -polypeptids und/oder -peptids in einer pharmazeutisch annehmbaren Formulierung enthalten. Das Kit kann ein einziges Behältnismittel aufweisen oder es kann unterschiedliche Behältnismittel für jede Verbindung aufweisen.
  • Wenn die Bestandteile des Kits in einer oder mehreren flüssigen Lösungen zur Verfügung gestellt wird (werden), ist die flüssige Lösung eine wäßrige Lösung, wobei eine sterile wäßrige Lösung besonders bevorzugt ist. Die Thrombopoietinzusammensetzungen können auch als eine spritzbare Zusammensetzung formuliert werden. In diesem Fall kann das Behältermittel selbst eine Spritze, Pipette oder ein anderer ähnlicher Apparat sein, von dem aus die Formulierung auf einen infizierten Bereich des Körpers angewendet werden kann, einem Tier injiziert oder sogar auf die anderen Komponenten des Kits angewendet oder damit gemischt werden kann.
  • Die Bestandteile des Kits können jedoch als getrocknetes) Pulver zur Verfügung gestellt werden. Wenn Reagenzien oder Bestandteile als trocknes Pulver zur Verfügung gestellt werden, kann das Pulver wieder durch das Hinzufügen eines geeigneten Lösungsmittels rekonstruiert werden. Es wird beabsichtigt, daß das Lösungsmittel auch in einem weiteren Behältermittel zur Verfügung gestellt wird.
  • Das Behältermittel wird im allgemeinen mindestens ein Röhrchen, Teströhrchen, Fläschchen, Flasche, Spritze oder ein anderes Behältermittel umfassen, in das das Thrombopoietinprotein, -polypeptid, -peptid und/oder eine Thrombopoietin-Wirkformulierung eingebracht wird. Die Kits können auch weitere Behältermittel für die Aufnahme eines sterilen, pharmazeutisch annehmbaren Puffers oder eines anderen Verdünnungsmittels umfassen.
  • Die Kits der vorliegenden Erfindung werden typischerweise auch Mittel für das Aufbewahren der Fläschchen in dichter Bündelung für den kommerziellen Verkauf, wie z. B. Injektions- oder blasgeformte Plastikcontainer umfassen, in denen die gewünschten Fläschchen gehalten werden.
  • Unabhängig von der Zahl und Sorte der Container können die Kits der Erfindung auch ein Instrument für die Hilfestellung bei der Injektion/Verabreichung oder Plazierung des letztlichen Thrombopoietinproteins, -polypeptids, -peptids und/oder einer anderen Thrombopoietin-Effektorzusammensetzung innerhalb des Körpers des Tiers umfassen oder damit verpackt sein. Solch ein Instrument kann eine Spritze, Pipette, Zange oder jedes solches medizinisch zugelassene Verabreichungsmittel sein.
  • Die folgenden Beispiele sind aufgenommen, um die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung deutlich zu machen. Es sollte vom Fachmann erkannt werden, daß die in den Beispielen offenbarten Techniken, die folgen, Techniken darstellen, für die von dem Erfinder entdeckt worden ist, daß sie bei der Ausführung der Erfindung gut funktionieren und die daher als bevorzugte Weisen der Ausführung angesehen werden können. Der Fachmann wird jedoch im Lichte der vorliegenden Offenbarung erkennen, daß viele Änderungen in den spezifischen Ausführungsformen, die offenbart sind, eingeführt werden können, um immer noch das gleiche oder ein ähnliches Ergebnis zu erhalten.
  • BEISPIEL 1
  • STIMULATION DER MEGAKARYOZYTEN UND BLUTPLÄTTCHENPRODUKTION DURCH EINE EINZELNE DOSIS REKOMBINANTEN HUMANEN THROMBOPOIETINS IN PATIENTEN MIT KREBS
  • Um die hämatopoetische Antwort auf und die klinische Toleranz für rekombinantes humanes Thrombopoietin, ein kürzlich kloniertes neues Zytokin, zu bewerten, initiierte der Erfinder eine klinische Studie der Phase I und II und Laborstudien des rekombinanten humanen Thrombopoietins in Patienten mit Krebs, die ein hohes Risiko für eine schwere Chemotherapie induzierte Thrombozytopenie aufwiesen. Dieser Versuch war in zwei Teile geteilt: der Teil I untersuchte Thrombopoietin, das vor der Chemotherapie gegeben wurde und Teil II untersuchte Thrombopoietin, das nach der Chemotherapie gegeben wurde. Das Ziel des Teils I, über dessen Ergebnisse hier berichtet wird, war die Bewertung des hämatopoetischen Ef fekts, der Pharmakodynamik und der klinischen Toleranz für dieses neue Mittel bei Patienten, die normale hämatopoetische Funktion vor der Chemotherapie aufwiesen.
  • Methoden
  • Patienten
  • Patienten mit Sarkomen, die noch nie Chemotherapie erhalten hatten, die geeignete Kandidaten für eine anschließende Chemotherapie waren und die keine schnell fortschreitende Erkrankung aufwiesen, waren für diesen Versuch geeignet. Von den Patienten wurde gefordert, daß sie einen Karnofsky-Leistungsstatuswert von 80 oder mehr, eine angemessene Knochenmarksfunktion (Gesamt-Neutrophilenzahl = 1,5 × 109/l; eine Blutplättchenzahl ≥ 150 × 109/l und ≥ 450 × 109/l), eine angemessene Nierenfunktion (Serumkreatinin-Menge ≥ 120 μmol/l) und eine angemessene Leberfunktion (Alanin-Aminotransferase-Mengen < das 3-fache des normalen; Bilirubinmengen < das 1,5-fache des normalen) aufwiesen. Patienten mit einer Anamnese thromboembolischer oder Blutungsstörung, signifikanter Herzerkrankungen oder vorangehender Beckenbestrahlung wurden ausgeschlossen. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Patienten vor dem Studieneintritt in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien erhalten.
  • Planung
  • Während des Phase I Dosierungsbereichsabschätzungsteils dieser klinischen Kohortenstudie wurde Thrombopoietin als eine einzelne intravenöse Dosis 3 wk. vor der Chemotherapie verabreicht. Mit Studieneintritt wurden 3 Patienten zu jeden von 4 Dosierungsmengen zugeordnet (0,3, 0,6, 1,2 und 2,4 μg/kg Körpergewicht). Die Patienten, die keine dosierungsbeschränkende Toxizität zeigten und die keine neutralisierende Antikörper gegen Thrombopoietin entwickelten, waren dafür qualifiziert, Thrombopoietin nach der Chemotherapie mit derselben Dosierung zu erhalten.
  • Rekombinantes humanes Thrombopoietin
  • Das in dieser Studie verwendete Thrombopoietin wurde von Genentech, Inc. (South San Francisco, Kalifornien) zur Verfügung gestellt. Das Thrombopoietin ist ein glykosiliertes Molekül voller Länge, das in einer genetisch modifizierten Säugetierzellinie hergestellt wird und durch Standardtechniken gereinigt wird. Es wurde mit Konservierungsmittel freier normaler Salzlösung als Verdünnungsmittel für die Injektionen gemischt.
  • Klinische- und Laboratoriumsüberwachung
  • Vor und während der klinischen Studien wurden die Patienten durch gesamt Anamnese; physische Untersuchungen; und Labortests, umfassend eine gesamte Blutzellzählung mit differentiellen Zählungen, Serumchemie, Koagulationsprofil, Urinanalyse, Bewertung der Thrombopoietin-Antikörperbildung, Brustradiogramm und Elektrokardiogramm überwacht. Die Blutzahlen wurden täglich für die ersten 5 Tage erhalten und dann mindestens 3 mal pro Woche. Periphere Abstriche wurden aufeinanderfolgend auf die Blutplättchenmorphologie hin untersucht. Die Blutplättchenzahl und die durchschnittliche Größe der Blutplättchen (mittleres Blutplättchenvolumen) wurden aus 64 Kanal-Blutplättchenhistogrammen abgeleitet.
  • Eine Knochenmarkspunktion und -Biopsie wurden vor und eine Woche nach der Thrombopoietinbehandlung durchgeführt. Die Knochenmarksproben wurden anfänglich in 10% neutralem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, in 5 μm dicke Schnitte geschnitten und mit Hematoxilin-Eosin für eine morphologische Analyse und mit Masson-Trichrom für die Analyse des Collagenfibergehalts gefärbt. Frische, luftgetrocknete Abstriche des Knochenmarks wurden mit Wright-Giemsa gefärbt. Knochenmarksproben wurden auf ihre Gesamtzellularität und Morphologie hin in einer verdeckten Weise analysiert. Die Megakaryozytenzahlen wurden durch die Wahl von 10 starke (40x) Feldern in Bereichen ohne Artifaktenbereiche oder Knochenbälkchen gemessen. Die relative Größe der Megakaryozyten wurde durch die Untersuchung des Knochenmarkspunktionsabstrichs unter Verwendung des Magiscan Image Analysis System (Comp, Cranberry, Pennsylvania) bewertet. Knochenmarkspunktionen wurden auch auf hämatopoetische Vorläuferzellzahlen und Zellzyklusstatus, auf den Gehalt von CD34+ und CD41+ Zelluntergruppen (durch Flußzytometrie) und auf die Ploidie der Megakaryozyten (durch Flußzytometrie) hin untersucht. Blutproben wurden auf die hämatopoetisch Zellzahl und auf die Blutplättchenfunktion hin untersucht.
  • Pharmakokinetische Profile
  • Serumproben wurden davor und 2, 5, 10, 60 und 90 Minuten und 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 28, 48, 72, 96 und 120 Stunden nach der Thrombopoietinverabreichung gesammelt. Die Konzentrations-Zeitprofile bei jeder Dosierungsmenge wurden durch Standard pharmakokinetische Verfahren evaluiert. Die Serumthrombopoietinmengen wurden durch ein Enzym-gekoppeltes Immunosorbent Testverfahren für Thrombopoietin quantifiziert (Emmons et al., 1996).
  • Hämatopoetische Vorläuferzelltestverfahren
  • Testverfahren für Koloniebildende-Einheiten-Granulozyt-Makrophage (CFU-GM = "colonyforming unit-granulocyte-macrophage"); Häufungsbildende-Einheiten-Erythroid (BFU-E = "Burst-forming unit-erythroid"); und Koloniebildende-Einheiten-Granulozyt, Erythroid, Makrophage, Megakaryozyte (CFU-GEMM = "colony-forming unit-granulocyte, erythroid, macrophage, megakaryocyte") unter Verwendung von Knochenmark niedriger Dichte (Vadhan-Raj et al., 1995) und periphere Blutzellen (Murray et al., 1996) wurden mit Methylzellulose-Testverfahren durchgeführt. Der Prozentsatz der Knochenmarks CFU-GM und BFU-E in der DNA-Synthese (S-Phase des Zellzykluses) wurde durch eine tritiliertes Thymidin hoher spezifischer Aktivität verwendende Selbstmordtechnik (Broxmeyer et al., 1989) gemessen. Die Testverfahren für die Koloniebildende-Einheit-Megakaryozyte (CFU-MK) und Häufungsbildende-Einheit-Megakaryozyte (PFU-MK) wurden unter Verwendung des Fibrin-Verknüpfungstest-verfahrens (Bruno et al., 1988) durchgeführt.
  • Analyse der Ploidie
  • Megakaryozyten-angereicherte Zellfaktoren wurden aus Knochenmarkszellsuspension unter Verwendung der Percoll-Gradienten Technik zubereitet. Die Ploidie wurde durch flußzytometrische Messung des relativen DNA-Gehalts nach Färbung mit Propidiumiodid in einer hypotonen Nitratlösung (Krishan, 1975) bestimmt. Die Zellen wurden auch mit Anti-CD41b (8D9)-FITC (SyStemix, Palo Alto, Kalifornien) gefärbt, um das Ausblenden der CD41b+ Megakaryozyten zu erlauben. Mindestens 3 000 CD41+-Ereignisse wurden für jede Probe gesammelt. Der Prozentsatz der CD41+-Zellen in der Ploidieklasse wurde aus Punktauftragungen der fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung bestimmt.
  • Blutplättchenfunktion
  • Die Blutplättchenverklumpung wurde in Antwort auf drei Agonisten untersucht: Adenosindiphosphat (Endkonzentration 20 μg/ml), Collagen (6 μg/ml) und Thrombin (5 μg/ml). Standardverfahren wurden verwendet (Rodak, 1995). Die Konzentration der Agonisten wurden beruhend auf vorhergehenden in vitro Studien gewählt, die an Blut von normalen Kontrollen durchgeführt worden waren. Die Instrumente für die Testverfahren waren das Bio/Data Pap 4A (Horsham, Pennsylvania) und der Crono-log 560CA (Havertown, Pennsylvania).
  • Immunphenotypische Analysen
  • Die immunphenotypischen Analysen wurden unter Verwendung von Anti-CD34 (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien) und Anti-CD41 monoklonalen Antikörpern (Immunotech, Westbrook, Maine) mit einer Standard Zwei-Farben-Flußzytometrischen Technik durchgeführt (Korbling et al., 1995).
  • Statistische Analysen
  • Die Variablen wurden unter Verwendung des Wilcoxon matched-pairs signed-rank Tests fortlaufend verglichen. Tendenzen für eine mögliche Dosis-Antwortrelation wurden unter Verwendung der Spearman-Rankordnungskorrelationskofizienten (r Sub S) zwischen der Dosis und dem Ergebnis evaluiert.
  • Rolle der Industrie
  • Das Thrombopoietin und eine teilweise Unterstützung für diese Studie wurde durch Genentech Inc. zur Verfügung gestellt. Die Studie war eine gemeinsame Anstrengung zwischen dem Erfinder und dem industriellen Sponsor. Die Datensammlung, Datenanalyse und das Schreiben des Manuskripts und die Entscheidung das Manuskript zu publizieren stand unter der Kontrolle des Erfinders. Das Manuskript wurde durch den industriellen Sponsor vor der Einreichung durchgesehen.
  • Ergebnisse
  • Zwölf Chemotherapie-naive Patienten (7 Männer und 5 Frauen) mit Sarkomen unterschiedlicher histologischer Subtypen nahmen an dem Dosisbereichsabschätzungsteil dieser Phase I Studie, die Thrombopoietin vor der Chemotherapie studierte, teil. Alle Patienten wurden als evaluierbar auf die klinische Toleranz und die Respons auf Thrombopoietin eingestuft. Das mittlere Alter dieser Patienten lag bei 42 Jahren (Bereich 16 bis 63 Jahre) und der mittlere Karnofsky-Leistungsstatuswert war 90 (bereich 80 bis 100). 4 Patienten hatten vorher Bestrahlungstherapie erhalten und 8 waren vorher operiert worden.
  • Periphere Blutzahlen
  • Die Behandlung mit einer Dosis Thrombopoietin war mit einer Erhöhung (1,3-fach bis 3,6-fach) der Blutplättchenzahl (Grundliniemittelwert 264 × 109/l; Maximaldurchschnitt 592 × 109/l) (P = 0,002) verbunden. Die Erhöhung der Blutplättchenzahl wurde bei allen Dosierungsmengen in allen Patienten beobachtet. Die Daten wurden als Durchschnitt ± SA für alle Patienten bei jeder Dosis genommen. Die Spitzenantworten der Blutplättchenzahl war Dosisabhängig; Steigerungen über die Nulllinie um 61%, 107%, 118%, 212% wurden für die Dosierungsmengen mit 0,3, 0,6, 1,2 bzw. 2,4 μg/kg gesehen (r Sub S = 0,720, P = 0,01). Bei der höchsten getesteten Dosierungsmenge (2,4 μg/kg) erhöhte sich die Blutplättchenzahl auf etwa 1 000 000 oder mehr in 2 der 3 behandelten Patienten (970 × 109/l in einem Patient und 1392 × 109/l in dem anderen).
  • Eine Erhöhung der Blutplättchenzahl wurde früh gesehen; 10 der 12 Patienten zeigten nach 4 Tagen eine Erhöhung über die Grundlinie (Durchschnittlicher Anstieg 1,2-fach; P = 0,005) und alle Patienten zeigten eine Erhöhung gegenüber der Grundlinie am 8. Tag (durchschnittliche Erhöhung 1,8-fach; P = 0,002). Die Blutplättchenzahlen erreichten den Höchstwert im Durchschnitt am Tag 12 (Bereich 10 bis 15 Tage) (Durchschnittsanstieg 3,2-fach; P = 0,002). Nach der Maximalantwort nahmen die Blutplättchenzahlen graduell bis zur Grundlinie ab. Am Tag 21 (vor dem Beginn der Chemotherapie) waren die Blutplättchenzahlen immer noch höher als die Grundlinie insbesondere bei der höchsten Dosierungsmenge (bei der sie 1,5-fach erhöht war).
  • Insgesamt erschien die Blutplättchenmorphologie nach der Behandlung normal. Zum Zeitpunkt der Spitzenblutplättchenzahlen war das Durchschnittliche Blutplättchenvolumen leicht niedriger als die Grundlinie (7,6 fl im Vergleich zu 8,5 fl); am Tag 21 waren sie nahe der Grundlinie (8,2 fl).
  • Blutplättchenfunktionen
  • Um zu Bestimmen, ob die nach der Thrombopoietinbehandlung abgeleitenden Blutplättchen in der Lage waren, Funktionen zu vermitteln, die für die Homeostase entscheidend waren, wurden an Blutplättchen, die von dem Patienten sowohl vor als auch nach der Thrombopoietinbehandlung (Tag 7) und mit normalen Kontrollen (Tabelle 6) erhalten wurden, wurden Studien der Blutplättchenverklumpung in Antwort auf drei Agonisten ausgeführt. Keine statistisch bedeutsamen Änderungen in der Blutplättchenverklumpung wurden im Verhältnis zu Proben der Grundlinie oder Kontrollproben nach der Thrombopoietinbehandlung in Antwort auf Adenosindiphosphat, Collagen oder Thrombin (P > 0,2) beobachtet.
  • Figure 00920001
  • Andere Hämatopoetische Zellinien
  • Obwohl ein leichter Aufwärtstrend bei den Leukozytenzahlen nach der Thrombopoietinbehandlung beobachtet wurde blieben die Zahlen innerhalb der Grenzen normal; diese Änderungen waren nicht klinisch signifikant. Gleichermaßen änderten sich die Hämoglobinwerte bei keiner der Dosierungsmengen. Eine geringe Gesamterniedrigung der Hämoglobinmengen wurde mit der Zeit beobachtet (Mittelwert der Grundlinie, 13,4 ± 0,4; Mittelwert am Tag 21 12,8 ± 0,4) die wahrscheinlich mit den Phlebotomien in Zusammenhang standen, die während der Studie regelmäßig durchgeführt wurden.
  • Pharmakokinetiken
  • Vor der Behandlung war endogenes Serumthrombopoietin nachweisbar (0,096 bis 0,24 ng/ml) in 4 der 12 Patienten. Nach der Thrombopoietinverabreichung waren die anfänglichen maximalen Thrombopoietinkonzentrationen proportional zu Dosis und reichten von 5 bis 50 mg/ml. Die Daten wurden als Mittelwert ± SE für 3 Patienten pro Dosierungsmenge aufgenommen. Die Thrombopoietinkonzentration nahmen langsamer nach den hohen Dosierungen ab.
  • Beispielsweise hatten nach 6 h die mittleren Serumthrombopoietinmengen um 50% nach der 2,5 μg/kg und um 80% nach 0,3 μg/kg Dosis abgenommen. Die letztliche Serumhalbwertszeit für die höheren Dosen (1,2 bis 2,4 μg/kg) reichten von 18 bis 32 Stunden. Insgesamt verblieb Thrombopoietin für 5 bis 6 Tage nach der intravenösen Bolusverabreichung in dem Blutkreislauf.
  • Klinische Toleranz
  • Die Behandlung mit Thrombopoietin wurde von allen Patienten gut toleriert und keine signifikanten Nebenwirkungen wurden auf Thrombopoietin zurückgeführt. Sechs Patienten berichteten gelegentlich über schwache Kopfschmerzen in ihrem Symptomaufzeichnungstagebüchern, aber diese Kopfschmerzen waren nicht mit dem Zeitpunkt der Thrombopoietin eng assoziiert. Es wurden keine lokalen Hautreaktion, Knochenschmerzen, konstitutionellen Symptome, Gewichtsgewinne, Ödeme oder Änderungen der Chemie, die mit dem Arzneistoff der Studie in Verbindung standen, während dieses Zeitraums gesehen.
  • Antikörperanalyse
  • Um zu bestimmen, ob die Thrombopoietintherapie mit der Entwicklung von Antikörpern im Zusammenhang steht, die den hämatopoetischen Effekt des Thrombopoietins behindern könnten, wurden Serumproben von allen Patienten wöchentlich überprüft. Serumproben, die an den Tagen 13 und 22 nach der Dosierung von einem der 12 Patienten erhalten wurde, wurden positiv für Antikörper reaktiv für Thrombopoietin der vollen Länge getestet. Diese Antikörpertiter waren nur transient, waren nicht neutralisierend und waren nicht mit klinischen Folgekrankheiten assoziiert.
  • Wirkung auf das Knochenmark
  • Um die zelluläre Grundlage für die hämatopoetische Antwort auf Thrombopoietin besser zu verstehen untersuchte der Erfinder das Knochenmark sowohl vor und 7 Tage nach der Thrombopoietinbehandlung auf die Expansion von Vorläuferzellen, Abstammungslinienspezifität und Reifungen.
  • Knochenmarksmorphologie
  • Die Erhöhung der Blutplättchenzahl war mit einer deutlichen Erhöhung der Zahl der Knochenmarksmegakaryozyten (P = 0,003) in einer Dosis-abhängigen Weise assoziiert; sie reichte von einer 1,2-fachen Erhöhung bei der niedrigsten Dosierungsmenge zu einer 4-fachen Erhöhung bei der höchsten Dosierungsmenge (r Sub S = 0, 867, P < 0, 001). Obwohl die meisten Megakaryozyten eine normale Morphologie zeigten wurden mehrere große Megakaryozyten mit reichhaltigen Zytoplasma und mehrfach abgeflachten Nuklii identifiziert. Insgesamt erhöhte sich die Größe der Megakaryozyten deutlich über die Grundlinie (von einem Druchschnittsdurchmesser von 36 μm [Bereich, 17 bis 64 μm] zu einem Durchschnitt von 44 μm [Bereich, 20 bis 87 μm]; P < 0,001).
  • Die granulozytischen und erythroiden Reihen zeigten eine normal Reifung ohne besondere Änderung bei den Myeloiden, Erythroiden Zellverhältnis oder der Knochenmarkszellularität (Tabelle 7). Es wurde keine deutliche Erhöhung des KnochenmarksCollagens nach der Thrombopoietinbehandlung in irgendeiner der untersuchten Proben beobachtet.
  • Figure 00940001
  • Figure 00950001
  • Analyse der Megakaryozytenploidie
  • Um zu bestimmen, ob die Thrombopoietinbehandlung die Megakaryozytenreifung beeinflußte wurde die Ploidie von Knochenmarksmegakaryozyten bei allen Dosierungsmengen untersucht. Obwohl die modale Ploidie Höchstwert bei 16 N verblieb, wurden erhöhte Prozentsätze von Megakaryozyten mit niedrigeren Ploidieklassen (P < 0,001 bei eine 4 N und 8 N) bei allen Dosierungsmengen beobachtet. Die Daten wurden als Mittelwert + SA für die Patienten genommen. Die Patienten, die eine höhere Ploidieverteilung zum Beginn der Behandlung aufwiesen, wurden nicht aufgenommen. Zusätzlich wurde ein Trend auf höhere Ploidiemengen hin bei den höheren Dosierungen gesehen (P = 0,06 für 64 N und P = 0,06 für 128 N). Somit erhöhte die Thrombopoietinbehandlung sowohl die Reifung der Megakaryozyten als auch die Expansion weiterer unreifer Megakaryozyten.
  • Knochenmarksvorläufer und CD34+-Zellen
  • Um zu bestimmen, ob Thrombopoietin einen Zellinien-spezifischen Effekt auf dem Niveau der Vorläuferzellen besitzt wurden die Häufigkeiten der Knochenmarksvorläuferzellen für Megakaryozyten-(CFU-MK und BFU-MK), Myeloide (CFU-GM), Erythroide (BFU-E) und Multipotentiale (CFU-GEMM) Zellen bestimmt. Die Häufigkeit der Knochenmarks-CFU-MK (2,7-fach bis 33-fach) wurde in 5 von 11 untersuchten Patienten erhöht. Eine deutliche Erhöhung wurde auch in einer Anzahl von reifen Untergruppen der Myeloiden-(1,8-fach; P = 0,005) und Erythroiden-(1,7-fach; P = 0,016) Vorläuferzellen beobachtet und ähnliche Trends wurden für die unreifen Untergruppen der myeloiden und erythroiden Vorläuferzellen und multipotentialen Vorläuferzellen gesehen. Der Prozentsatz der Knochenmarkzellen in der S-Phase war auch deutlich über die Grundlinie erhöht (P = 0,013). Die Daten wurden als Mittelwert ± SA für alle getesteten Patienten genommen. Zusätzlich erhöhte sich der Prozentsatz der Knochenmarks-CD34+-(P = 0,012) und CD41+-Zellen (P = 0,002) im Durchschnitt um das 2-fache der Anzahl.
  • Wirkungen auf die Mobilisierung der Vorläuferzellen
  • Um zu bestimmen, ob die Erhöhung der Knochenmarksvorläuferzellen mit einem Mobilisierungseffekt assoziiert war wurde das periphere Blut auf Vorläuferzellen hin untersucht. Eine deutliche Erhöhung wurde in einer Anzahl von Vorläufern myeloider (CFU-GM), erythroider (BFU-E) und myelo-erythroider (CFU-MIX) Zellen beobachtet. Die Daten wurden als Spitzenwertantwort (Durchschnitt ± SA) genommen, die etwa zwischen den Tagen 3 und 7 beobachtet wurde. Obwohl die einzelnen Patientenantworten variierten wurde ein Dosisabhängiger Trend beobachtet. Bei den höchsten Dosismengen wurde eine mittlere/maximale Erhöhung der Vorläuferzellhäufigkeit bis zum 5,7-fachen für CFU-GM, 7,8-fachen für BFU-E, und 10-fachen für CFU-MIX beobachtet.
  • Diskussion
  • Das Ziel des Erfinders war es die biologischen in vivo Wirkungen des Thrombopoietins zu beurteilen, die die klinische Toleranz und die Pharmakodynamik umfassen, und die Natur der hämatopoetischen Antwort auf dieses Zytokin in Patienten mit Krebs, die, bevor sie eine Chemotherapie erhielten, eine normale hämatopoetische Funktion zeigten, zu definieren. Der Erfinder zeigt, daß die Behandlung mit einer einzelnen Dosis Thrombopoietin zu einer deutlichen Erhöhung der zirkulierenden Blutplättchenzahlen in einer Dosis-abhängigen Weise führte. Die Blutplättchenantworten (Erhöhungen vom 1,3-fachen bis zum 3,6-fachen) wurde in allen Patienten beobachtet auch umfassend die Kohorte, die die niedrigste Dosis des Thrombopoietins erhielt. Die Blutplättchen, die in Antwort auf das Thrombopoietin produziert wurden, hatten ein normales morphologisches Erscheinungsbild und zeigten eine normale Verklumpungsfunktion in Antwort auf verschieden Stimuli. Somit deuten die Studien darauf hin, daß Thrombopoietin ein wirksamer Stimulus für die Produktion von Blutplättchen mit normalen Funktionen im Menschen ist.
  • Der Erfinder beobachtete mehrere interessante Facetten der hämatopoetischen Antwort auf Thrombopoietin in diesem Patienten. Die Erhöhung der Blutplättchenzahl wurde bei den meisten Patienten am Tag 4 gesehen, was nahelegt, daß die anfängliche Komponente der Antwort mit der erhöhten Reifung von Megakaryozyten, der Blutplättchenfreisetzung oder beiden in Verbindung stand. Die Blutplättchenzahlen erhöhten sich fortgesetzt erreichten jedoch einen Spitzenwert zwischen den Tagen 10 und 15. Dies deutet darauf hin, daß ein zweiter Bestandteil der Antwort mit einer Expansion des Megakaryozytenbereichs in Verbindung steht. Nach der Maximalantwort nahmen die Blutplättchenzahlen in Richtung auf die Grundlinie hin ab. Die Blutplättchenzahlen waren jedoch am Tag 21 vor dem Beginn der Chemotherapie immer noch höher als die Grundlinienzahl insbesondere bei der höchsten Dosierungsmenge; diese Studie deutet auf eine fortgesetzte biologische Wirkung hin.
  • Die andauernde Antwort nach einer einzelnen Dosis Thrombopoietin kann durch mehrere mögliche Mechanismen erklärt werden. Zuerst beobachtete der Erfinder das Thrombopoietin eine anhaltende Serumhalbwertszeit von etwa 20 bis 30 Stunden aufweist und im Blutkreislauf für etwa 5 bis 6 Tage verbleibt. Des weiteren war, obwohl die Spitzenserumkonzentration zur Dosis proportional war, die endgültige Halbwertzeit bei höheren Dosen verlängert, vielleicht aufgrund der Sättigung des Thrombopoietinentfernungsprozesses (von dem vermutet wird, daß er in erster Linie in Blutplättchen durch Rezeptor-vermittelte Endozytose stattfindet) (Fielder et al., 1996).
  • Eine zweite Erklärung kann mit der proliferativen Wirkung von Thrombopoietin auf dem Niveau des Knochenmarks in Zusammenhang stehen. Einige Patienten wiesen eine Erhöhung der Anzahl der megakaryozytischen Vorläuferzellen (CFU-MK) auf. Die proliferative Wirkung des Thrombopoietins auf das Knochenmark war auch durch eine 2-fache Erhöhung des Prozentsatzes der CD34+-Zellen und eine gleichzeitige 2-fache Erhöhung der CD41+-Untergruppe gekennzeichnet, was eine selektive Reifung entlang des Megakaryozytenweges widerspiegelt. Tatsächlich erhöhte sich die Zahl der Megakaryozyten in Relation zu der Dosis und die Megakaryozyten zeigten eine normale Morphologie. Darüber hinaus deutete die Analyse der Ploidie nicht nur auf die Reifungswirkung des Thrombopoietins sondern auch auf die Expansion der unreifen Untergruppe der Megakaryozyten hin, was mit der proliferativen Wirkung in Verbindung stehen kann. Drittens, würde, da die Lebensspanne von Blutplättchen 9 bis 10 Tage beträgt, für die Antwort in der Form der Blutplättchenzahl erwartet werden, daß sie für mehrere Tage andauert.
  • Die proliferative Wirkung des Thrombopoietins auf das Knochenmark war nicht auf die Megakaryozytenentwicklungslinie beschränkt. Eine deutliche Steigerung wurde auch für die Häufigkeit der Vorläuferzellen der myeloiden, der erythroiden und multipotentialen Zellinien gesehen. Des weiteren steigerte sich auch der Anteil der Vorläuferzellen in der S-Phase nach der Behandlung mit Thrombopoietin. Trotz dieser Stimulationswirkung des Thrombopoietins auf mehrere Entwicklungslinien der Knochenmarksvorläuferzellen wurde keine deutliche Wirkung auf die peripheren Leukozytenzahlen oder die Hämatokritwerte beobachtet. Somit schien die proliferative Wirkung auf dem Vorläuferzellniveau in erster Linie mit der Differenzierung entlang des Megakaryozytenweges gekoppelt zu sein.
  • Trotz der Expansion des Vorläuferzellpools im Knochenmark blieb die Gesamtzellularität unverändert, möglicherweise aufgrund der extramedularen Freisetzung von Vorläuferzellen in das periphere Blut. Eine der biologischen Eigenschaften hämatopoetischer Wachstumsfaktoren, die eine nachweisbare klinische Wirkung entfalten, ist die Fähigkeit, hämatopoetische Vorläuferzellen zu mobilisieren, die geerntet werden können und nach myeloablativer Therapie hoher Dosis reinfundiert werden können (Socinski et al., 1988; Shea et al., 1992; Bensinger et al., 1993). In dieser Studie stimulierte eine einzelne Dosis Thrombopoietin die Vorläuferzellen mehrerer Abstammungslinien stark. Diese offensichtliche Steigerung des zirkulierenden Pools der Vorläuferzellen wurde des weiteren durch eine mehrfache Steigerung der sehr einfachen hämatopoetischen Zellen (CD34+/Thy-1+/Lin) im peripheren Blut unterstützt (Murray et al., 1996).
  • Die Behandlung mit Thrombopoietin wurde durch alle Patienten gut toleriert; es wurden keine signifikanten Nebenwirkungen, die mit Thrombopoietin oder Thrombozytose in Verbindung standen, beobachtet. Anders als andere Zytokine war Thrombopoietin nicht mit Fieber, konstitutionellen Symptomen, Knochenschmerzen, inflammatorischen Symptomen, Flüssigkeitsrückhaltungen oder irgendwelchen anderen Organtoxizitäten assoziiert (Smith et al., 1993; Vadhan-Raj et al., 1994; Biesma et al., 1992; Veldhuis et al., 1995; Vadhan-Raj et al., 1994; Tepler et al., 1996). Somit stellt das Fehlen einer deutlichen Toxizität und die Abstammungslinien-dominierte biologische Wirkung des Thrombopoietins ein besseres therapeutisches Verhältnis als andere Zytokine mit thrombopioetinen Potential zur Verfügung.
  • Eine mögliche Sorge, die mit der Induktion der Thrombozytose assoziiert ist, ist ein erhöhtes Risiko für eine Thrombose, die häufig in Patienten mit myeloproliferativen Erkrankungen beobachtet wird. Das Fehlen morphologischer und funktioneller Blutplättchen-Abnormalitäten und die transiente Natur der induzierten Thrombozytose kann in diesem klinischen Zusammenhang dieses Risiko begrenzen.
  • Zusammenfassend deuten die Studien darauf hin, daß Thrombopoietin ein wirksamer Stimulator, der Megakaryozytenpoese und der Thrombopoese in Menschen ist. Thrombopoietin, das in einer Einzeldosis verabreicht wird, erzeugt eine anhaltende Erhöhung der zirkulierenden Blutplättchenzahlen. Obwohl es eine Abstammungslinien-dominierte Wirkung auf die peripheren Blutzahlen hat, vermittelte es auf dem Niveau der Knochenmarksvorläuferzellen eine Wirkung auf mehrere Abstammungs-Linien und mobilisiert Vorläuferzellen verschiede ner Abstammungs-Linien in das periphere Blut. Diese Beobachtung hat mehrere mögliche Konsequenzen. Beispielsweise hat Thrombopoietin in einer Weise analog zu der klinischen Anwendung myeloider Wachstumsfaktoren das Potential die Chemotherapie-induzierte Thrombozytopenie zu verlangsamen. Die hierin berichteten Studien zeigen, daß die Spitzen-Blutplättchenantwort zwischen dem Tag 10 und dem Tag 15 auftritt. Somit kann die Behandlung mit Thrombopoietin vor der Chemotherapie einen Überbrückungszeitraum zur Verfügung stellen, bis die Blutplättchenproduktion nach der Chemotherapie wieder aufgenommen wird und kann möglicherweise weiter durch Thrombopoietin, das nach der Chemotherapie gegeben wird, verstärkt werden.
  • Eine zweite verlockende Möglichkeit ist die, das die starke biologische Wirkung einer einzelnen Dosis es erlauben wird, Thrombopoietin an Patienten oder normale Spender zu geben, nicht nur um Vorläuferzellen für periphere Stammzelltransplantationen zu mobilisieren, sondern auch um Blutplättchen zu sammeln, die als ein Aphereseprodukt transfundiert werden können, wodurch möglicherweise das Risiko für eine Alloimmunisierung, die mit der Aussetzung gegenüber mehreren Spendern verbunden ist, verringert wird. Es sollte jedoch bemerkt werden, daß die Studie eine kleine, definierte Patientengruppe mit Sarkomen betrifft, die eine ungestörte normale Hämatopoese aufwiesen.
  • BEISPIEL 2
  • EINZELDOSIS THERAPIE MIT REKOMBINANTEN HUMANEN THROMBOPOIETIN (rhTPO) IN PATIENTEN, DIE EINE ZYTOTOXISCHE CHEMOTHERAPIE ERHALTEN
  • Hintergrund
  • Prä-klinische Modelle der intensiven Chemoradiotherapie zeigen, daß eine einzelne Dosis rhTPOs den Tiefpunkt der Blutplättchen erhöht und den Zeitraum der schweren Thrombozytopenie verkürzt. Zwischenergebnisse aus zwei Phase I Studien, in denen Einzeldosen von rhTPO an Krebspatienten, die Chemotherapie erhielten, verabreicht wurde, werden gezeigt.
  • Patienten und Verfahren
  • Beide Studien begannen mit dem Tag 21 vor den Chemotherapieperioden (Zyklus 0) zur Bewertung der rhTPO-Sicherheit und der Blutplättchenantwort nach einer einzelnen I.V.-Bolusinjektion von 0,3, 0,6 oder 1,2 μg/kg (3 Patienten pro Gruppe in jeder Studie). Die Pati enten erhielten dieselbe Dosis des rhTPOs nach der Chemotherapie in ausgewählten anschließenden Zyklen. Die erste Studienpopulation bestand aus Patienten mit fortgeschrittenen Tumoren, die rhTPO am Tag folgend auf eine Rettungs-Thiotepa-Chemotherapie (65 mg/m2 q28d) in jedem der zwei aufeinanderfolgenden Chemotherapiezyklen erhielten. Die zweite Studie umfaßte Chemotherapie-naive Patienten mit Sarkomen, die einer Induktionsbehandlung mit AI-Chemotherapie (Doxorubicin 90 mg/m2, Ifosfamid 10 g/m2 g21d) unterzogen wurden. Nach dem Zyklus 0 wurden die Patienten in dieser Studie während des ersten Chemotherapiezyklus überwacht und erhielten eine einzelne rhTPO-Injektion am Tag nach dem Abschluß der Chemotherapie (d5) während des zweiten und den anschließender Zyklen.
  • Ergebnisse
  • 14 Patienten sind bisher behandelt worden. rhTPO wurde gut toleriert ohne berichtete schwere Nebenwirkungen, die dem Arzneistoff der Studie zugeordnet wurden. Antikörper gegen rhTPO sind nicht beobachtet worden. Im Zyklus 0 war die niedrigste (0,3 μg/kg) Dosis schwach-aktiv mit einer erhöhten Aktivität bei höheren Dosen wie unten gezeigt.
  • Figure 01000001
  • Die maximale Blutplättchenzahl während des Zyklus 0 trat im Durchschnitt am Tag 11 auf (Bereich 7–14). Keine deutlichen Änderungen wurden in den WBC oder HCT beobachtet. Die FACS-Analyse des Knochenmarks zeigte nach 0,6 μg/kg eine Erhöhungen für alle CD34+-Untergruppen in 2/2 Patienten. Steigerungen peripherer Blut-CD34+-Zellen wurde auch in diesen Patienten beobachtet, was nahelegt, daß TPO eine Stammzell-mobilisierende Aktivität besitzen kann. Die Dosissteigerung und die post-Chemotherapiebehandlung laufen fort.
  • Schlußfolgerungen
  • Zusammen zeigen diese Phase I Studien, daß die Verabreichung einer einzelnen Dosis des rhTPOs sicher ist und gut toleriert wird. Die 0,3, 0,6 und 1,2 μg/kg Dosismengen zeigen eine ansteigende thrombopoetische Aktivität. Die Behandlung von Patienten mit hohen Dosismengen überprüft die Hypothese, daß eine einzelne Dosis des rhTPOs wirksam bei der Behandlung der Thrombozytopenie nach einer intensiven Chemotherapie ist.
  • BEISPIEL 3
  • PHASE I-II UNTERSUCHUNG REKOMBINANTEN HUMANEN THROMBOPOIETINS (rhTPO) IN PATIENTEN MIT SARKOM, DIE EINE HOCHDOSIS CHEMOTHERAPIE (CT) MIT ADRIAMYCIN (A) UND IPHOSPHAMID (I) ERHALTEN
  • AI ist ein hochwirksames Behandlungsschema bei der Behandlung von Sarkomen, die Myelosuppression ist jedoch kumulativ und betrifft mehrere Abstammungslinien. In diesen präklinischen Modell der schweren Myelosuppression erhöhte rhTPO (Genentech, Inc.), das als einzelne Dosis gegeben wurde den Tiefpunkt und reduzierte den Zeitraum der schweren Thrombozytopenie. Beruhend auf diesen Beobachtungen iniziierte der Erfinder eine klinische Phase I-II Untersuchung des rhTPOs allein und nach AI, um die Toleranz zu bewerten und die biologischen Wirkungen zu untersuchen. rhTPO wurde durch I.V.-Bolus als einzelne Dosis (0,3, 0,6, 1,2, 2,4 μg/kg) im Studienarm A oder als zwei Dosen (0,3, 0,6, 1,2 μg/kg × 2) im Studienarm B vor AI (Zyklus 0) und auf einen zweiten Zyklus AI (Zyklus 2) folgend, verabreicht. 23 Patienten haben rhTPO (16 Arm A, 7 Arm B) erhalten. rhTPO vor AI erhöhte die Blutplättchenzahlen deutlich (bis zum 3,6- und 4,4-fachen im Arm A (N = 12) bzw. B (N = 7)). Die Erhöhung der Blutplättchen war andauernd und erreichte den Höchstwert am Tag 12. Diese anhaltende Antwort war mit einer verlängerten Serumhalbwertszeit (20–30 h) nach einer einzelnen rhTPO-Dosis verbunden. Die Blutplättchen hatten eine normale Morphologie und Verklumpungsfunktion. Die Antwort der Blutplättchen wurde mit einer 4-fachen Erhöhung der BM-Megakaryozyten und einer 2-fachen Erhöhung der CD34+-, CD41+-Untergruppen sowie einer deutlichen Erhöhung der Frequenz und der Zirkulationsrate der BM-Vorläuferzellen begleitet. Zusätzlich wurde eine Mobilisierung der Vorläuferzellen verschiedener Zellabstammung beobachtet. Die post-Chemotherapiedaten (Durchschnitt ± SEM) sind unten für 19 Patienten, die rhTPO erhielten, gezeigt:
  • Figure 01020001
  • Diese Daten deuten darauf hin, daß rhTPO ein starker Stimulus für die andauernde Blutplättchenproduktion ist und einen stimulatorischen Effekt auf dem Niveau der Vorläuferzellen auf mehrere Abstammungslinien zeigt.
  • BEISPIEL 4
  • WIRKUNG REKOMBINANTEN HUMANEN THROMBOPOIETINS (rhTPO) AUF KNOCHENMARKSMEGAKARYOCYTEN IN MENSCHEN
  • Um die Wirkungen von rhTPO (Genentech, Inc.) auf die Knochenmarksmegakaryozyten (MK)-Morphologie in vivo zu bewerten, untersuchte der Erfinder Knochenmarksproben von 12 Patienten, die eine einzelne Dosis von rhTPO (0,3–2,4 μg/kg) erhielten, in Chemotherapienaiven Patienten mit Sarkomen als Teil der klinischen Phase I-II Untersuchung (Vadhan-Raj, 1996). Die BM-Proben, die sowohl vor als auch nach (Tag 7) rhTPO erhalten wurden, wurden gefärbt [H und E (Biopsie); Wright-Giemsa (Punktion)] und auf Behandlungs-assoziierte Änderungen in der Größe und Morphologie hin untersucht. Die Größe der Megakaryozyten wurde durch die Untersuchung der Knochenmarkspunktions-Abstriche unter Verwendung des Magiscan Image Analysis System (Compic, PA) bewertet. 25 MKs mit klar definierten Grenzen und intakten Kernen und zytoplasmatischen Membranen wurden auf zelluläre und Kernbereiche hin bewertet. Die Zahl der Megakaryozyten stieg in einer Dosis-abhängigen Weise (p < 0,01) an. Obwohl die meisten Megakaryozyten normal erschienen, wurde ein Zytoplasmaüberfluß und mehrfach abgeflachte Nuclii beobachtet. Die gesamten Megakaryozyten stie gen deutlich über die Grundlinienwerte an (von Durchschnittsdurchmesser 36 μm μm auf 44 um, p < 0,001). Die Daten (Durchschnitts ± SEM) für zelluläre und Kernbereiche und die N/K-Verhältnisse sind unten gezeigt.
  • Figure 01030001
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß rhTPO als einzelne Dosis gegeben, sowohl die Anzahl und die Größe der Megakaryozyten erhöht. Während sowohl die Kern- und die zellulären Bereich in der Größe anwuchsen, schien der Anstieg in den zytoplasmatischen Bereichen deutlicher.
  • BEISPIEL 5
  • PHARMAKOKINETIK DES REKOMBINANTEN HUMANEN THROMBOPOIETINS (rhTPO) NACH INTRAVENÖSER VERABREICHUNG BEI KREBSPATIENTEN
  • Die rhTPO Pharmakokinetik und die Blutplättchen-Antworten wurden in 12 Chemotherapienaiven Patienten (Alter 16–63 Jahre) mit Sarkom als Teil der klinischen Phase VII Dosis-Steigerungsstudie untersucht (Vadhan-Raj, 1996).
  • Verfahren
  • Das rhTPO wurde als einzelne I.V.-Bolus-Dosis 3 Wochen vor der Chemotherapie verabreicht. 3 Patienten wurden mit jeder Dosismenge (0,3, 0,6, 1,2 oder 2,4 μg/kg) behandelt. Pharmakokinetische Serumproben wurden über 5 Tage nach der Dosierung gesammelt. Die TPO-Konzentrationen wurden durch einen ELISA gemessen, der zum Fang des TPOs rekombinanten c-Mpl-Rezeptor verwendet. Die pharmakokinetische Analyse wurde unter Verwendung von nicht-kompartimentalisierten Verfahren durchgeführt. Die Blutplättchenzahlen wurden routinemäßig über 21 Tage gemessen.
  • Ergebnisse
  • Vor der rhTPO-Dosierung wurde endogenes Serum-TPO in 4/12 Patienten nachgewiesen. Nach der rhTPO-Verabreichung war Serum-TPO in allen Dosierungsgruppen für 5 Tage nachweisbar. Die durchschnittlichen anfänglichen maximalen Serum-TPO-Mengen (etwa 5 und 50 ng/ml für die 0,3 bzw. 2,4 μg/kg Dosierungen) spiegelten die Verteilung in einem Volumen von 60 ml/kg wieder, das etwas größer ist als das Serumvolumen. Innerhalb jeder Dosierungsgruppe neigen die anfänglichen maximalen TPO-Mengen dazu, niedriger in Patienten mit höheren Grundlinien-Blutplättchenzahlen zu sein, was wahrscheinlich die anfängliche Bindung des TPOs an Blutplättchen widerspiegelt. Die Serum-TPO-Mengen nahmen in Patienten, die 1,2 und 2,4 μg/kg Dosierungen erhielten im Vergleich zu denen, die niedrigere Dosierungen erhielten, langsamer ab. Die endgültige geschätzte Serum-TPO-Halbwertszeit nach der 1,2 und 2,4 μg/kg Dosierung reichte von 18–32 h. In Übereinstimmung mit der Fähigkeit der Blutplättchen TPO zu entfernen, war die Fläche unter der TPO-Konzentration über Zeitkurve (AUC) innerhalb jeder Dosierungsmenge für Patienten niedriger, die hohe Grundlinien Blutplättchenzahlen aufwiesen. Die Serum-TPO-Entfernung verringerte sich mit ansteigender rhTPO-Dosis. Die maximalen Änderungen der Blutplättchenzahlen (61% und 212% über der Grundlinie für die 0,3 bzw. 2,4 μg/kg Dosierungsgruppen) waren proportional zur rhTPO-Dosis und zu TPO-AUC. Ansteigende Blutplättchenzahlen wurden bereits am Tag 4 beobachtet, die im Durchschnitt ein Maximum am Tag 12 (Bereich 10–15 Tage) nach der rhTPO-Dosierung erreichten. Die Zeit bis zur maximalen Blutplättchenzahl wurde nicht durch die rhTPO-Dosierungsmengen beeinflußt. Die Blutplättchen blieben in einigen Patienten für bis zu 21 Tage erhöht.
  • Zusammenfassung
  • TPO verblieb auf eine einzelne I.V.-Bolus-Dosis hin in dem Blutkreislauf für mindestens 5 Tage und die TPO-Mengen verringerten sich mit einer endgültigen Halbwertzeit von etwa 18 bis 32 h. Innerhalb dieser Dosierungsgruppe standen die maximalen TPO Mengen und die AUC im inversen Verhältnis zu den Grundlinien-Blutplättchenzahlen. Eine einzelne I.V.-Dosis des rhTPOs erzeugte eine zur Dosis proportionale Erhöhung der Blutplättchenzahl und die Blutplättchenzahl blieb für mehrere Tage erhöht.
  • BEISPIEL 6
  • REKOMBINANTES HUMANES THROMBOPOIETIN (rhTPO) VERLANGSAMT DIE DURCH HOCH-DOSIS CARBOPLATIN (C)-INDUZIERTE THROMBOZYTOPENIE IN PATIENTEN MIT GYNÄKOLOGISCHEN TUMOREN
  • Carboplatin ist in einer fortgeschrittener, Platin-sensitiver rezidivierender Erkrankung wirksam; eine kumulative Thrombozytopenie ist jedoch für die Dosis häufig limitierend. In den prä-klinischen Studien verringerte TPO den Tiefpunkt und beschleunigte die Blutplättchenerholung (PLT) in Mäusen, die panzytopenisch durch RT + Carboplatin gemacht waren. Beruhend auf dieser Beobachtung führte der Erfinder eine klinische Phase I-II Studie von rhTPO allein und auf Carboplatin folgend (AUC = 11) durch, um die Toleranz und die biologischen Wirkungen zu bewerten. Während der Dosis-Steigerunsphase wurde rhTPO durch S.C.-Injektion als eine einzelne Dosis (0,6, 1,2, 2,4, 3,6 μg/kg) vor Carboplatin gegeben und in 4 Dosen auf einen zweiten Zyklus des Carboplatins folgend. Während der Dosissteigerung erhielten 6 weitere Patienten rhTPO bei der optimalen biologischen Dosis (OBD) nur als sekundäre Prophylaxe gegen schwere Thrombozytopenie, rhTPO vor Carboplatin erhöhte deutlich die Blutplättchenzahlen (bis zum 3,5-fachen, p < 0,001) mit einer Spitzenwirkung im Mittel am Tag 15. Die Blutplättchenantwort wurde von einer Erhöhung der Knochenmarksmegakaryozyten und erythroider Elemente begleitet. Die Postchemotherapiedaten (Durchschnitt ± SEM) werden unten (Tabelle 11) für 22 Patienten, die rhTPO mit allen Dosierungen enthielten, gezeigt.
  • Figure 01050001
  • In den 11 Patienten, die rhTPO mit der OBD (1,2 μg/kg) im Zyklus 2 erhielten, vermied rhTPO die Notwendigkeit für Blutplättchentransfusion und bei 71% der Patienten (7 Patienten in Zyklus 1 im Vergleich zu 2 Patienten im Zyklus 2). Keine deutliche Nebenwirkung, die mit rhTPO in Verbindung stand, wurde beobachtet. Diese Daten deuten darauf hin, daß rhTPO bei der Verlangsamung der Carboplatin-induzierten Thrombozytopenie wirksam ist und Blutplättchentransfusionen verhindern kann, wenn es als sekundäre Prophylaxe verwendet wird.
  • BEISPIEL 7
  • EINE PILOTSTUDIE FÜR ADRIAMYCIN + IFOSFAMID MIT REKOMBINANTEN HUMANEN THROMBOPOIETIN (rhTPO) IN PATIENTEN MIT SACROMEN
  • Dieses Beispiel beschreibt Verfahren wie der optimale Dosierungsplan für die Verabreichung der Kombination von Adriamycin und Ifosfamid (AI) mit rhTPO bestimmt werden kann und wie anfängliche Information im Hinblick auf die Wirksamkeit des rhTPOs bei dem für die Verringerung der AI-induzierten Thrombozytopenie vorgeschlagenen Dosierungsplan erhalten werden kann.
  • Adriamycin und Ifosfamid sind die zwei wirksamsten chemotherapeutischen Mittel die gegenwärtig in der Behandlung von Sarkomen eingesetzt werden. Erhältliche Daten deuten auf eine positive Dosis-Antwort Verbindung für beide dieser Mittel hin. Häufig ist jedoch eine kumulative Myelosuppression limitierend für die Dosierung. rhTPO ist ein Abstammungslinien-dominanter Regulator der Thrombopoese und kann kumulativ die Thrombozytopenie verlangsamen. Die Ergebnisse aufeinander folgender Pilotstudien und aktuellerer klinischer Phase I-II-Versuche legen nahe, daß dieses Behandlungsschema mit einer Antwortrate von über 60% aktiv ist. Bei den Dosierungen die in den klinischen Versuchen des Erfinders verwendet wurden (90 mg/m2 Adriamycin und 10 g/m2 Ifosfamid) mit Ausnahme der kumulativen Myelosuppression wird das Behandlungsschemata gut toleriert. Der Erfinder hat daher die Verwendung von hämatopoetischen Wachstumsfaktoren (G-CSF und rhTPO) untersucht, um die hämatopoetische Toxizität zu verlangsamen.
  • Thrombopoietin (TPO), der Ligand für c-Mpl-Rezeptoren ist kürzlich gereinigt und kloniert worden. TPO reguliert alle Stadien der Entwicklung der Blutplättchenproduktion durch die Förderung der Proliferation der Megakaroyzytenvorläufer und ihre Reifung im Blutplättchenproduzierenden Megakaryozyten. In prä-klinischen Studien führte die Verabreichung von TPO zu einem schnellen Anstieg der Blutplättchenzahl um ein mehrfaches. Im Mäusemodell der Myelosuppression ist für rekombinantes Mäuse-TPO gezeigt worden, daß es die Thrombozytopenie in Mäusen aushebt, die durch Carboplatin und Bestrahlung panzytopenisch gemacht wurden. Die hauptsächlichen Sicherheitsbedenken die als Ergebnis der ausgiebigen prä-klinischen Studien vorgebracht wurden umfassen die Immunogenität und die sich ergebende Thrombozytopenie.
  • Rekombinantes menschliches TPO (rhTPO) wird gegenwärtig in mehreren I-II klinische Studien in Patienten, die sowohl myelosuppressive und myeloablative Chemotherapie erhalten, Untersuchungen unterzogen. In fortdauernden Studien ist für einfach und mehrfach I.V. Dosierung von rhTPO gezeigt wurden, daß sie sicher und ohne Hinweis auf konstitutionelle Toxizitäten (wie Fieber, Starren oder Hypotonie) sind. Bei über 150 behandelten Personen ist über zwei thrombotische Vorfälle (Thrombose der tiefen Vene) berichtet worden, die möglicherweise als zu rhTPO in Verbindung stehend angesehen werden. Anti-TPO-Antikörper sind in 10% der I.V. rhTPO-behandelten Personen beobachtet worden. Diese Antikörper waren transient und nicht-neutralisierend. Bis jetzt haben über 25 Personen rhTPO durch Subkutane (SC) Injektion erhalten und Anti-TPO-Antikörper wurden in 10% dieser beobachtet. Potentiell neutralisierende Antikörper wurden in einer einzelnen Person beobachtet, die mehrere SC-Injektionen des rhTPOs über 5 Monate erhalten hatte und die vor der Erholung eine langdauernde Thrombozytopenie erfahren hatte. Es ist unklar ob die Thrombozytopenie durch die Gegenwart der Antikörper oder durch die kumulative Wirkung der myelosuppressiven Chemotherapie bedingt war.
  • Patienteneinschlußkriterien
  • Um in der Studie aufgenommen zu werden mußten die Patienten folgende Kriterien erfüllen. Die Patienten mußten ein Sarkom aufweisen, das inoperabel lokal fortgeschritten oder mit hohem Risiko für einen Rückfall oder metastatisch war, so daß die Behandlung mit AI indiziert ist. Das Patientenalter sollte zwischen 15–65 liegen (für Alter 13 oder weniger als 15 nach Ermessen des Erfinders). Frauen mit der Fähigkeit Kinder zu gebären müssen wirksame Mittel der Kontrazeption verwenden. Die Patienten müssen angemessene hämatologische, Nieren- und Leberfunktion, ein Karnofsky-Leistungsstatus ≥ 80 und eine unterschriebene Einwilligungserklärung aufweisen.
  • Patientenausschlußkriterien
  • Patienten sollten aus den folgenden Gründen ausgeschlossen werden. Die Patienten wären Schwangere oder stillende Frauen, Patienten mit einem co-morbiden Zustand, der den Patienten ein hohes Risiko für Behandlungskomplikationen verleiht, Patienten mit unkontrollierter metastatischer Erkrankung, Patienten mit deutlicher Herzerkrankung (NYHA Klasse III oder IV), Disarythmie oder einer aktuellen Anamnese von MI oder Ischämie, Patienten die HBsAG positiv sind, Patienten die vorher Chemotherapie erhalten haben oder die ein hämatopoetischen Wachstumsfaktor erhalten, vor der Operation oder RT innerhalb von 2 Wochen nach Studieneintritt eine vorhergehende Anamnese der Beckenbestrahlung oder eine Anamnese anderer Blutplättchenerkrankung (ITP, TTP, etc.), Blutungserkrankungen oder irgendein Risiko für Blutungen aufweisen.
  • BEHANDLUNGSPLAN
  • Eine Gruppe Patienten wird mit jedem der fünf Dosierungspläne behandelt.
  • Figure 01080001
  • rhTPO wird durch I.V.-Bolus-Injektion verabreicht werden. G-CSF mit 5 μg/kg/Tag am 4. Tag starten, ungefähr 12 Stunden nach der ersten Dosis rhTPO und fortgesetzt bis der ANC ≥ 1500/mm3 für 2 aufeinander folgende Tage nach dem Tiefpunkt ist.
  • Im Patienten mit mindestens einer stabilen oder antwortenden Erkrankung und dem Fehlen einer deutlichen hämatopoetischen Toxizität (Blutplättchenzahl < 20 000/mm3 für > 7 Tage oder eine Thrombozytopenie, die mit einer klinisch bedeutsamen Blutung einhergeht) kann die Chemotherapie mit rhTPO-Behandlung für eine Gesamtzahl von 6 Zyklen fortgesetzt werden.
  • Die Chemotherapiezyklen werden all drei Wochen wiederholt, wenn sich der ANC auf ≥ 1500/mm3 und sich die Blutplättchen auf ≥ 100 000/mm3 erholt haben.
  • STATISTISCHE ERWÄGUNGEN
  • Die anfänglichen Informationen, die die Wirksamkeit von rhTPO betreffen, werden durch den Vergleich der Tiefpunktzahlen und die Erholung der Blutplättchen zwischen Zyklus-1 (kein rhTPO) und Zyklus-2 (mit rhTPO) und zwischen den verschiedenen Gruppen erhalten werden. Die erzeugten Daten werden verwendet, um bei der Planung zukünftigen klinischen Versuchen der Phase II-III zu helfen.
  • PATIENTENEVALUIERUNG: (vor der Behandlung und Zwischentestung)
  • Die Patientenanamnese, PE, der Leistungsstatus, CBE mit differentiel von Blutplättchen, Serumchemie, Elektrolyten, Magnesium, Serumbank, Knochenmarkspunktion und -biopsie (ausgewählte Patienten), Röntgenbrustbild, radiologische Studien für die Tumorbehandlung und das EKG wird ausgewertet werden.
  • GESCHÄTZTER ZUGANG
  • Es wird geschätzt, daß der Zugang bei etwa 30 bewertbaren Patienten liegt.
  • STUDIENPLANNUNG
  • Die Sicherheit und Wirksamkeit von rhTPO ist in den Sarkom-Patienten, die AI (Adriamycin 90 mg/m2 und Ifosfamid 10 g/m2) erhalten evaluiert worden. Von den 79 Patienten die in den Versuch aufgenommen wurden erhielten 74 Patienten rhTPO. Es wurden keine schwerwiegenden Nebenwirkungen, die auf rhTPO zurückgeführt wurden, während dieser Studie beobachtet. rhTPO das vor der Chemotherapie entweder als einzelne Dosis oder als 2 Dosen verabreicht wurde, war mit einer Dosis-abhängigen Erhöhung der zirkulierenden Blutplättchenzahl verbunden. Auf die Chemotherapie folgend sind 5 verschiedene Dosierungspläne der rhTPO-Verabreichung untersucht worden: Eine Dosis nach der Chemotherapie (A), 2 Dosen nach der Chemotherapie (B), 7 Dosen nach der Chemotherapie (C), 1 Dosis vor und 2 Dosen nach der Chemotherapie (D) und 1 Dosis bevor, während und nach der Chemotherapie (F). rhTPO in Dosen von 1,2 bis 2,4 μg/kg nach Dosierungsplan D (Tage –1, 4 und 5) verabreicht, scheint die Thrombozytopenie zu verringern und die Blutplättchenerholung zu beschleunigen. Sie ist jedoch nicht gleichermaßen bei der Reduktion der Thrombozytopenie wirksam insbesondere wenn dieses Behandlungsschema in beeinträchtigten Patienten (d. h. als sekundäre Prophylaxe), in weiblichen Patienten oder Patienten mit einem Alter > 50 Jahre verwendet wird.
  • Erklärung für die Studienplanung
  • Da der Tiefpunkt bei dem AI-Behandlungsschema früh auftritt (d. h. Tag 12) und die Spitzenwirkung von rhTPO auch noch um den Tag 12 (Tag 10–15) gesehen wird kann eine frühere Verabreichung von rhTPO hilfreich sein. Die Befunde des Erfinders aus den klinischen Versuchen im Patienten mit gynäkologischen Tumoren deuten darauf hin, das 4 Dosen rhTPO (Beginnend am Tag nach der Chemotherapie, jeden Zweiten Tag oder eine Dosis vor der Chemotherapie, eine Dosis am Tag der Chemotherapie und zwei Dosen nach der Chemotherapie) wirksam bei der Verringerung der Carboplatin-induzierten Thrombozytopenie sind. Daher würde der Erfinder gerne die Durchführbarkeit einer Verabreichung des rhTPOs mit 1,2 μg/kg für 4 Dosierungen in drei Patientengruppen mit drei leicht unterschiedlichen Verabreichungsschemata: rhTPO an den Tagen –3, –1, 4 und 6 (I) –5, –3, –1 und 4 (II) und –4, 4, 6 und 8 (III) bewerten.
  • Ein mögliches Bedenken gegen die Verwendung von Wachstumsfaktor vor oder während der Chemotherapie, könnte es sein, daß Knochenmarksvorläuferzellen zum Zeitpunkt der Verabreichung der Chemotherapie aktiv proliferieren können und gegenüber zytotoxischen Arzneistoffen sensitiv sein können. Die Laborbefunde des Erfinders hinsichtlich der proliferativen Kinetik der Vorläuferzelle legen nahe, daß es eine deutliche Erhöhung der Proliferationsrate der Vorläuferzellen am Tag 8 nach rhTPO aber nicht am Tag 4 gibt. Des weiteren hat der Erfinder die Dosierungspläne der rhTPO-Verabreichung an einem Tag vor und am Tag der Chemotherapie-Verabreichung sowohl für Sarkome und für gynäkologische Tumore evaluiert. Diese Daten deuten nicht auf einen offensichtlichen nachteiligen Effekt der Verabreichung von rhTPO vor der Chemotherapie hin. Aus Sicherheitsgründen würde der Erfinder mit einer zusätzlichen Dosis vor der Chemotherapie (d. h. an Tagen –3 und –1) beginnen. Wenn dieses Dosierungsschema als sicher erscheint und nicht mit einer größer als erwarteten hämatologischen Toxizität assoziiert ist würde der Erfinder eine oder mehrere Dosen vor der Chemotherapie (d. h. an Tagen –5, –3 und –1) in der nächsten Gruppe hinzufügen.
  • Klinische Aktualisierung
  • Bis heute wurden 21 Patienten (18 bewertbar) in dieser Studie behandelt. Die Behandlung mit rhTPO wird gut toleriert. Die vorläufige Analyse der hämatologischen Parameter läuft darauf hinaus, daß der mittlere Blutplättchentiefpunkt in Zyklus-2 höher ist als in Zyklus-1 in dem Dosierungsplan bei dem drei Dosen rhTPO vor und eine Dosis nach der Chemotherapie verabreicht werden. Der Erfinder hat vorher gezeigt, daß mit kürzeren Behandlungsschemata wie Carboplatin (AUC-11) das rhTPO, das in vier Dosen nach der Chemotherapie gegeben wurde, deutlich die Thrombozytopenie reduziert. Daher würde der Erfinder gerne zwei weitere Kohorten behandeln bei denen alle vier Dosen des rhTPOs nach der AI-Chemotherapie (Dosierungsplan IV) und alle vier Dosen des rhTPOs vor der Chemotherapie (Dosierungsplan V) gegeben werden. Dieses wäre eine nützliche Information vor der Durchführung der klinischen Phase III Studien, bei der geplant ist, daß alle Dosen des rhTPOs nach der Chemotherapie verabreicht werden.
  • Hintergrundarzneistoffinformation
  • Alle Arzneistoffe sind kommerziell erhältlich mit Ausnahme des rhTPO. rhTPO wird durch Genentech Inc., 460 Point San Bruno Boulevard, South San Franzisko, CA 94080 als sterile Flüssigkeit die für die parenterale Verabreichung bereit ist, zur Verfügung gestellt. Jedes 3 ml Glasgefäß der aktiven Verbindung enthält 2 ml. rhTPO wird als 0,1 mg/ml in gepufferter Lösung zur Verfügung gestellt. rhTPO wird geliefert und unter Kühlung bei 2°C–8°C (35°F– 46°F) gelagert. Die Formulierung enthält kein Konservierungsmittel und ist nur für die Einzeldosisverabreichung geeignet. Aussetzung gegenüber hellem Licht sollten vermieden werden. Nicht einfrieren. Verwende es nicht nach dem auf das Gefäß aufgestempelten Haltbarkeitsdatum.
  • rhTPO Zubereitung und Verabreichung
  • Während der Studie werden klinische Pharmakologen oder andere ausgewiesene Studienmitarbeiter rhTPO Injektionen beruhend auf dem Gewicht der Person, wie bei der Grundlinie gemessen, zubereiten. Der klinische Pharmakologe wird den Studienmitarbeitern Spritzen mit rhTPO zur Verfügung stellen, die mit der Person ID-Nr. markiert sind (und jeder anderen Identifizierungsmöglichkeit) der Protokollnummer und der Menge des rhTPOs (in Mikrogramm und Millilitern). Die Injektion des verdünnten rhTPOs muß innerhalb von 4 Stunden nach der Zubereitung verabreicht werden.
  • Patientenaufnahmekriterien
  • Um aufgenommen zu werden sollten Patienten ein Sarkom, das inoperabel ist, lokal fortgeschritten, ein hohes Risiko für einen Rückfall oder eine Metastasierung aufweisen, für das die Behandlung mit AI indiziert ist. Die Patienten sollten ein Alter von 15–65 aufweisen (für Alter 13 oder weniger als 15 nach dem Ermessen des Erfinders). Frauen die die Fähigkeit besitzen Kinder zu gebären müssen wirksame Mittel der Kontrazeption verwenden. Die Patienten sollten eine angemessene Knochenmarksfunktion und eine absolute Neutrophilenzahl ≥ 1500/μl, eine Blutplättchenzahl ≥ 100 000/μl und einen Hgb ≥ 10 gm/dl aufweisen. Die Patienten sollten eine angemessen Nierenfunktion, d. H. Serumkreatinin ≤ 1,5 mg% aufweisen. Die Patienten sollten eine angemessene Leberfunktion, d. h. SGPT ≤ 3 × normal und Bilirubin < 1,5 × normal aufweisen. Der Karnofsky-Leistungsstatus der Patienten sollte ≥ 80 sein und die Patienten sollten ein Einwilligungserklärung unterschrieben haben.
  • Patientenausschlußkriterien
  • Patienten würden ausgeschlossen, wenn sie schwangere oder stillende Frauen sind. Patienten würden ausgeschlossen, wenn sie einen co-morbiden Zustand aufweisen, der dazu führt, daß die Patienten ein hohes Risiko für Behandlungskomplikation aufweisen. Patienten würden ausgeschlossen, wenn sie eine unkontrollierte, metastatische Erkrankung zum ZNS aufweisen. Patienten mit deutlicher Herzerkrankung (NYHA Klasse III oder IV), Dysarrythmie oder eine aktuelle Anamnese von MI oder Ischämie werden ausgeschlossen. Patienten die HBsAG positiv sind, würden ausgeschlossen. Patienten würden ausgeschlossen, wenn sie eine vorherige Chemotherapie erhalten hätten oder hämatopoetische Wachstumsfaktoren verwenden, vor der Operation oder RT innerhalb von zwei Wochen vor dem Studieneintritt, eine vorherige Anamnese der Beckenbestrahlung oder eine Anamnese von Blutplättchenerkrankung (ITP, TTP, etc.), Blutungsstörungen, oder ein erhöhtes Risiko für Blutungen aufweisen.
  • Behandlungsplan
  • Alle Patienten werden im Patientenmanagementsystem (PDMS) registriert.
  • Studiendesign
  • Eine Gruppe von sechs Patienten wird in jedem der drei Dosierungspläne behandelt.
  • Figure 01130001
  • rhTPO wird durch I.V. Bolus-Injektion verabreicht.
  • Figure 01130002
  • Chemotherapie
  • Adriamycin wird mit einer Dosis von 90 mg/m2 als eine 72 h kontinuierliche I.V. Injektion über die Tage 0–2 verabreicht werden. Ifosfamid wird über 3 h an jedem Tag mit 2,5 g/m2/d × 4 Tagen Gesamtdosis 10 g/m2) an den Tagen 0–3 verabreicht. Messner (500 mg/m2 oder 20% der Dosis des Ifosfamids) wird I.V. über 3 Stunden der anfänglichen Dosis des Ifosfamids am Tag 0 verabreicht werden und als dauernde Infusion (1500 mg/m2/Tag für eine Gesamtmenge 6 g/m2) bis zu 24 Stunden nach der letzten Dose des Ifosfamids aufrechterhalten.
  • G-CSF mit 5 μg/kg/Tag am 4. Tag ungefähr 12 Stunden nach der ersten Dosis des rhTPOs beginnend und fortgesetzt bis ANC ≥ 1500/mm3 für zwei aufeinander folgende Tage nach dem Tiefpunkt. Zusätzlich werden alle Patienten Ciprofloxazin 500 mg P.O. B11 beginnend vom 5. Tag bis zur Erholung des ANC als antimikrobielle Prophylaxe erhalten.
  • In Patienten mit einer zumindest stabilen oder antwortenden Erkrankung und einem Anflug exzessiver hämatopoetischer Toxizität (d. H. Blutplättchenzahl < 20 000/mm3 für > 7 Tage oder Thrombozytopenie, die mit klinisch bedeutsamer Blutung einhergeht) kann die Chemotherapie unter rhTPO-Behandlung für insgesamt 6 Zyklen fortgesetzt werden. Die Chemotherapiezyklen können alle drei Wochen wiederholt werden, wenn sich der ANC auf ≥ 1500 mm3 und die Blutplättchen auf ≥ 100 000/mm3 erholt haben. Die Patienten werden mit Blutplättchen transfundiert, wenn die Blutplättchenzahlen auf < 15.000/mm3 fallen oder bei einer höheren, Menge, wenn irgendwelche klinisch bedeutsame Blutung auftritt. Rote Blutzelltransfusionen werden verwendet, für Hb < 8 gms/dl oder bei einer höheren Menge wenn es klinisch indiziert ist.
  • Dosismodifikationen
  • Jeder Versuch wird unternommen, um 6 Zyklen der Chemotherapie mit vollständiger Dosis an jede Person der Studie zu verabreichen. Im Falle der spezifischen in Tabelle 15 aufgeführten Nebenwirkungen können Dosisverringerungen oder -veränderungen der Infusionsdauer von Doxorubicin und/oder Ifosfamid wie angegeben ausgeführt werden, unter Verwendung der folgenden Parameter:
  • Figure 01140001
  • Figure 01150001
  • Wenn weitere Dosisreduktionen/Modifikationen notwendig sind, wird die Person aus der Studie genommen. Alle Personen werden für mindestens 28 Tage nach dem letzten Tag des letzten Zyklus mit rhTPO weiter beobachtet.
  • Beurteilung vor der Behandlung
  • Die Patienten werden aufgrund normaler Anamnese und physischer Untersuchung mit Messung der Tumorgrößen beurteilt. Die Laboruntersuchungen werden ein CBC mit differentieller Blutplättchenzahl, Elektrolyten, Magnesium und Chemie umfassen. Bruströntgenaufnahme, Elektrokardiogramm, radiologische Studien für die Tumormessung und Antikörper gegen TPO werden gemessen.
  • Beurteilung während der Studie
  • Die Personen werden während sie an der Studie teilnehmen genau hinsichtlich der Sicherheit, der physischen Befunde und der Tumorantwort überwacht. Die Personen werden bei jeder Untersuchung der Studie und während der nachfolgenden Untersuchungsperiode auf Nebenwirkungen hin untersucht. Die Lebensfunktionen werden bei jedem Besuch sowie vor und nach jeder rhTPO-Verabreichung gemessen. Zusätzlich wird die Laboratoriums-Evaluierung des CBCs, differentielle und Blutplättchenzahlen vor der Chemotherapie und mindestens 3 mal pro Woche auf die Chemotherapie folgend überwacht. Zusätzlich werden tägliche Zählungen durchgeführt werden, wenn der ANC < 500/μl und die Blutplättchenzahl < 50.000/μl (ungefähr an den Tagen 9 bis 13). Die Chemie, die Elektrolyte und Magnesium werden während jeder Runde wiederholt und so häufig wie es notwendig erscheint. Antikörper gegen TPO werden vor jedem Zyklus gemessen werden. Ein KM-Punktat vor (Grundlinie) und auf die rhTPO-Verabreichung im Zyklus-2 folgend, wird in ausgewählten Patienten durchgeführt werden.
  • Kriterien für Antwort und Toxizität
  • Standard-Sarkom-Kriterien werden angewendet werden.
  • Kriterien für den Abbruch der Therapie
  • Die Therapie wird abgebrochen werden, wenn eine fortschreitende Erkrankung eine anfängliche Antwort abändert oder beim Ausbleiben einer Antwort eines Patienten nach einem Minimum von zwei Runden der Therapie. Die Therapie wird abgebrochen, wenn eine unannehmbare Toxizität, die als unvorhersagbar, irreversibel oder nicht hämatologische Toxizität des Grades 4 definiert ist, in einem Patienten gefunden wird. Die Therapie wird aufgrund der Nichteinhaltung der Protokollanforderungen durch einen Patienten oder bei Patientenverweigerung unterbrochen.
  • Andere Parameter
  • Ungefähr 30 bewertbare Patienten werden behandelt. Wenn rhTPO an irgendeinem der vorgeschlagenen Dosierungsschemata die schwere Thrombozytopenie abschwächt oder das Erfordernis für Transfusionen gleichmäßig beseitigt, wird ein formales klinische Phase II-III Protokoll erzeugt werden. Die Daten werden gesammelt werden und durch die wissenschaftliche Krankenschwester, die der Studie zugeordnet ist, in das PDMS eingegeben. Tode, die klar mit der Behandlung in Zusammenhang stehen oder unerwartete lebensbedrohende Toxizitäten, sollten unmittelbar an den Leiter der Studie berichtet werden, der wiederum das Überwachunskomitee informieren muß.
  • BEISPIEL 8
  • DOSIERUNGSSCHEMA-ABHÄNGIGE VERRINGERUNG DER THROMBOZYTOPENIE DURCH REKOMBINANTES HUMANES THROMBOPOIETIN (rhTPO) IN PATIENTEN MIT SARKOM, DIE EINE HOCH-DOSIS CHEMOTHERAPIE MIT ADRIAMYCIN (A) UND IFOSFAMID (I) ERHALTEN
  • Adriamycin und Ifosfamid (AI) ist ein wirksames Behandlungsschema bei der Behandlung von Sarkomen; die Myelosuppression ist jedoch kumulativ. Der Erfinder hat vorher gezeigt, daß rhTPO bei der Reduktion schwerer Thrombozytopenie wirksam ist, wenn es in vier Dosen auf Hoch-Dosis Carboplatin folgend, verabreicht wird (Blood 90 (10): 580a, 1997), daß es aber nicht gleichmäßig wirksam ist, wenn es für 1, 2 oder 7 Dosen auf AI folgend gegeben wird (Vadhan-Raj et al., 1996). Diese Beobachtung, daß der Tiefpunkt des AI früh ist (± Tag 12) und daß der Höhepunkt der Wirkung des rhTPOs auf Blutplättchen und Vorläuferzellen in der S-Phase spät ist, deutetet darauf hin, daß eine frühere Verabreichung des rhTPOs nützlich sein könnte. Der Erfinder initiierte daher eine klinische Studie, um das Dosierungsschema des rhTPOs zu optimieren. Der erste Zyklus des AIs wurde ohne rhTPO verabreicht. In Zyklus-2 (C-2) wurde rhTPO durch I.V.-Bolus sowohl vor (vor Dosierung) und folgend (nach Dosierung) AI (Tagen 0–3) in 3 Dosierungsschemata gegeben: Tage –1, 4, 6, 8 (S-I), Tage –3, –4, 4, 6 (S-II) und Tage –5, –3, –1, 4 (S-III). Die Daten nach der Chemotherapie sind gezeigt (Durchschnitt ± SEM):
  • Figure 01170001
  • In nur einem von 6 Patienten aus S-III war der Tiefpunkt im Zyklus-2 tiefer als im Zyklus-1 im Vergleich zu 5 von 6 Patienten für sowohl S-I als auch S-II. Die KM-Vorläuferzell-Testverfahren, die der CT folgten und die letzte Dosis des rhTPOs zeigten die Gegenwart von Kolonien in 3 von 4 (S-III), 1 von 2 (S-II) und 0 von 2 (S-I) Patienten. Diese Studien deuten daraufhin, daß die zeitliche Abfolge der rhTPO-Verabreichung im Verhältnis zu Chemotherapie wichtig ist und daß die Vordosierung mit rhTPO für Behandlungsschema, die länger (≥ 4 Tage) sind und einen frühen Tiefpunkt auslösen, vorteilhaft sein können.
  • BEISPIEL 9
  • EINE PHASE-I STUDIE REKOMBINANTEN HUMANEN THROMBOPOIETINS (rhTPO), DAS ÜBER SUBKUTANE INJEKTION AN PERSONEN MIT REZIDIVIERENDEN UND FORTGESCHRITTENEN GYNÄKOLOGISCHEN TUMOREN, DIE CARBOPLATIN ENTHIELTEN, VERABREICHT WURDE
  • Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse prä-klinischer Tierstudien mit Thrombopoietin und die Planung und die Erklärung für die menschlichen Studien, die durchgeführt wurden.
  • Die Ergebnisse von prä-klinischen Sicherheitsstudien deuten daraufhin, daß eine einzelnen und mehrfach Dosen rekombinanten humanen Thrombopoietins (rhTPOs) zu den erwarteten Anstiegen der Zahl der Megakaryozyten und/oder der zirkulierenden Blutplättchen in Mäusen, Rhesusaffen, und Schimpansen führte(n). In der 4-Wochen-Studien in Mäusen waren leichte bis mittlere Veränderungen der klinischen und anatomischen Pathologie offensichtlich; in vielen Fällen korrelierten diese mit der beobachteten Zunahme der Blutplättchenzahlen. Nach der wiederholten subkutanen (SC) Verabreichung an Rhesusaffen und Schimpansen wurden leichte hämatologische Wirkungen neben der Wirkung auf die Blutplättchen beobachtete, sie wurden jedoch nicht als biologisch signifikante Wirkungen angesehen.
  • In Rhesusaffen erreichte die Blutplättchen-Antwort auf rhTPO 2 Wochen nach der Dosierung einen Höhepunkt, sank dann aber trotz weiterer Dosierung auf die Grundlinie ab. Auch in Rhesusaffen wurde 5–8 Wochen nach der Aufnahme der Behandlung beginnend eine Verringerung der Blutplättchenzahlen nach einer einzelnen IV/SC-Dosis von 500 μg/kg oder mehrfachen IV/SC-Dosen mit 100 μg/kg beobachtet. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung wurde eine Megakaryozytenhypoplasie im Knochenmark einiger Tiere 8 Wochen nach Einzel-Dosis IV- oder SC-Behandlung mit der 5.000 μg/kg Dosierungsmenge gefunden. Ähnliche histopathologische Beobachtungen, aber von größerer Schwere, wurden in Rhesusaffen beobachtet, die mehrfache Behandlungen mit IV oder SC rhTPO (1.000 μg/kg) erhielten.
  • Die Reduktionen der Blutplättchenzahlen nach der Dosierung wurden auch in Schimpansen bemerkt, die täglich für 2 Wochen mit rhTPO (3 oder 50 μg/kg SC) dosiert wurden, obwohl die Wirkung etwas später begann und bei der 3 μg/kg Dosierungsmenge vorübergehend war. Eine deutliche Erhöhung der Blutplättchenzahl wurde auch nach der erneuten Dosierung mit 3 μg/kg in einem Schimpansen nach einer 8 wöchigen Behandlungs-freien Periode beobachtet, was darauf hindeutet, daß die Antwort dieses Tieres auf die pharmakologische Wirkung des rhTPOs nicht als Ergebnis vorheriger Exposition dramatisch reduziert war.
  • Der Grund für die Reduktion der Blutplättchenzahlen schien mit positiven Antikörperlitern gegen TPO in Verbindung zu stehen, die bei allen Tieren mit niedrigen Blutplättchenwerten beobachtet wurden. Die Rhesusaffen mit den niedrigsten Blutplättchenwerten nach der Dosierung und einer Megakaryozytenhypoplasie in den Einzel-Dosisstudien wiesen die höchsten individuellen Titerwerte auf. Es ist vorher berichtet worden, daß rekombinanter menschlicher Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF) Anti-CSF-Antikörperbildung in Hunden auslösen kann, der zur Neutralisation des endogenen Hunde-G-CSF führt, was zur Neutropenie führt (Hammond et al., 1991). Ein ähnlicher Mechanismus könnte die in den Rhesusaffen und Schimpansen-Studien beobachteten Wirkungen erklären. TPO-spezifisches IgE war in Schimpansen nach Mehrfach-Dosierung vorhanden.
  • Diese Beobachtung in Schimpansen legen, beruhend auf dem Vorhersagewert dieser Spezies bei der Bewertung immunologischer Antworten auf rekombinante humane Proteine und der Homologie zwischen menschlichen und Schimpansen TPO (Hobson und Fuller, 1987) ein mögliches Risiko für die Antikörperbildung und oder ein Rückgang der Blutplättchenzahl in Menschen nach der Dosierung nahe.
  • Die Immunogenität und die Wirksamkeit wurden weiter in Studien bewertet, die rekombinantes Mäuse-Thrombopoietin (RMTPO) in CD-1-Mäusen verwendeten. In normalen CD-1-Mäusen entwickelten deutlich weniger Mäuse in der Einzel-SC-Dosisgruppe Antikörper gegen TPO im Vergleich zu der 14-Tage-Dosisgruppe. Ähnliche Mengen des Anti-TPO-Antikörpers wurden in den Gruppen beobachtet, die eine tägliche SC-Verabreichung für 14 Tage oder alle 3 Tage erhielten. In der Gruppe jedoch die rhTPO jeden dritten Tag über IV-Verabreichung erhielten, entwickelten nur 2 Mäuse Anti-TPO-Antikörper am Tag 31. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, daß die Verringerung der Häufigkeit der rmTPO-Verabreichung oder die Verwendung der I.V.-Verabreichung, die Immunogenität des rekombinanten TPOs verringern kann. In einer separaten Wirksamkeitsstudie verlangsamte eine einzelne Dosis rhTPO die Thrombozytopenie, die durch die Kombination von Bestrahlung und Carboplatin in dem Mäusemodell induziert wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, daß es ein therapeutisches Fenster für die Wirksamkeit in Abwesenheit von Immunogenität geben wird.
  • Zusammenfassend scheint rhTPO leicht stärker immunogen zu sein, wenn es Tieren S.C. als wenn es I.V. verabreicht wird. Es nicht bekannt, ob der S.C.-Verabreichungsweg in Menschen immunogener sein wird. Die prä-klinischen Daten sind im Hinblick auf die Wirkung, Dauer und/oder Umfang der Umkehrbarkeit der Blutplättchenwirkung in Tieren beschränkt. Es ist klar, daß eine Verringerung der Blutplättchenzahlen unter die Grundlinie potentiell ein wichtiges Risiko in Patienten ist, für die eine Chemotherapie-Behandlung geplant ist. Daher wird eine enge Überwachung mit einem spezifischen Sicherheitsplan, der die Thrombozytopenie betrifft, in dieser klinischen Studie durchgeführt werden.
  • Prä-klinische Pharmakokinetik
  • Die I.V.- und S.C.-Pharmakokinetik des rhTPOs ist in mehreren Tierspezies untersucht worden. Die pharmakokinetische Analyse der Plasma-TPO-Profile aus I.V.-Studien in Rhesusaffen deuteten auf ein beschränkte Verteilung des TPOs vom Plasma in andere Gewebe hin (stationäres Verteilungsvolumen von 62–66 ml/kg). Die niedrige Plasma-TPO-Entfernung (3,3– 5,4 ml/h/kg) wird durch die relativ lange endgültige Plasma-rhTPO-Halbwertszeit (11–18 h) widergespiegelt. Daten aus Gewebeverteilungsstudien in Mäusen deuten darauf hin, daß Blutplättchen an der Verteilung und Entfernung des TPOs beteiligt sein können. Nach der S.C.-Injektion in Rhesusaffen wurde ~ 43% der Dosis absorbiert und die Plasma-TPO-Mengen erreichten einen Spitzen-Wert ~ 6 h. Die End-Halbwertszeit des rhTPOs nach SC-Injektion betrug 13 h. Es wurde keine pharmakokinetische Arzneistoffinteraktion beobachtet, wenn S.C. rhTPO und S.C. G-CSF täglich gemeinsam über 14 Tage an Rhesusaffen verabreicht wurde.
  • Klinische Erfahrung: klinische Studien
  • rhTPO ist in mehreren als offen markierten klinischen Phase-I Studien Testen unterzogen worden. Die erste klinische Studie wurde im Oktober 1995 initiiert. Intravenös verabreichtes rhTPO wurde in Personen evaluiert, die eine mittlere bis Hoch-Dosis-Chemotherapie zusammen mit Thiotepa erhielten; in Personen, die eine Dosis-intensive konventionelle Chemotherapien mit Doxorubicin und Ifosfamid für Weichteilsarkom erhielten; in Personen, die vor der Hoch-Dosis-Chemotherapie für Hochrisiko-Brustkrebs einer peripheren Vorläuferzellmobilisierung unterzogen wurden; und in Personen, die eine verzögerte Blutplättchen-Erholung nach autologer oder allogener Transplantation erlitten.
  • rhTPO ist über Dosierung von 0,3–2,4 μg/kg gut toleriert worden. Obwohl eine Antikörperbildung auftrat, sind keine neutralisierenden Anti-TPO-Antikörper in den klinischen Studien beobachtet worden. Anti-TPO-Antikörper sind in nur 2/33 Personen beobachtet worden, diese wiesen eine nicht-neutralisierende Natur auf, lösten sich spontan und waren nicht mit irgendwelchen klinischen Folgekrankheiten assoziiert. Bis jetzt hat die rhTPO-Verabreichung über den I.V.-Weg biologische Aktivität bei den oberen Dosierungsmengen gezeigt, ist aber nicht mit irgendwelchen Wirkungen auf die hämatopoetischen Abstammungs-Linien mit Ausnahme der frühen Mobilisierung peripherer CFU-MS und BFU-Es in Verbindung gebracht worden. Es gab keine Anzeichen thrombotischer Vorgänge oder konstitutioneller Nebenwirkungen und keinen Hinweis auf eine Dosis-beschränkende Toxizität (DLT = "dose-limiting toxicity").
  • Klinische Pharmakokinetik
  • Die Serum-TPO-Konzentrationen sind nach I.V.-Bolus-Injektionen des rhTPOs an Personen mit Sarkom oder bösartigen Neoplasmen während eines Zyklus vor der Chemotherapie und erneut während eines Chemotherapiezyklus gemessen worden (rhTPO wurde am Tag nach Thiotepa oder Doxorubicin/Ifosfamid verabreicht). Während des Zyklus vor der Chemotherapie sind die anfänglich maximalen TPO-Konzentrationen (Cmax) proportional zur Dosis und reichen von ~ 5 bis 50 ng/ml nach den 0,3 bzw. 2,4 μg/kg Dosen. Dies deutet darauf hin, daß rhTPO sich auf ein anfängliches Verteilungsvolumen (60 ml/kg) ähnlich dem Plasmavolumen zu verteilen scheint. Die scheinbare letztliche Eliminierungs-Halbwertzeit für TPO beträgt 20–30 h. Die Fläche unter dem TPO-Konzentrations-Zeitprofil (AUC) erhöht sich nichtproportional mit ansteigender Dosierung, was wahrscheinlich eine Dosis-abhängige Sättigung des TPO-Entfernungsprozesses widerspiegelt, von dem vermutet wird, daß er in Blutplättchen in erster Linie durch Rezeptor-vermittelte Endozytose stattfindet. Nach der Chemotherapie ist die anfängliche Verteilung des TPOs ähnlich der, die während des Vor-Chemotherapie-Zyklus beobachtet wird, aber die scheinbare endgültige Halbwertzeit ist während des Chemotherapiezykluses verlängert. Diese langsamere letztliche Verringerung des Serum-TPOs kann eine Erhöhung des endogenen Serum-TPOs widerspiegeln, eine Erhöhung, die für die Thrombozytopenie beobachtet worden ist.
  • Carboplatin
  • Carboplatin hat eine Anti-Tumor-Aktivität mit einem breiten Spektrum und wird in der Behandlung von Ovarialkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Keimzelltumoren, Mesotheliomen, kleinzelligen Lungenkrebs, Blasenkrebs und Kopf- und Nackenkrebs verwendet.
  • Carboplatin ist ein geeignetes chemotherapeutisches Mittel für diese Studie, da es keine nichthämatologischen Toxizitäten bei Dosierung bis zu 1.000 mg/m2 aufweist. Seine Haupttoxizität ist die Myelosuppression, insbesondere die Thrombozytopenie. Ozols et al. (Ozols et al., 1987) behandelten 30 Patienten mit rezidivierenden Ovarialkrebs mit hohen Dosen Carboplatins (800 mg/m2 ohne Zytokinunterstützung). Deutliche Antworten wurden in 27% der Patienten beobachtet; die Myelosuppression war die am häufigsten beobachtete Toxizität. Gore et al. (Gore et al., 1987) verabreichten Dosierungen bis zu 1.600 mg/m2 an Lungenkrebs- und Mesotheliom-Patienten. Relativ geringe gastrointestinale neurologische Ototoxizitäten wurden beobachtet, es wurde jedoch eine relativ deutliche Myelosuppression beobachtet. In hohen Dosierungen verabreicht ist Carboplatin ein geeignetes chemotherapeutisches Mittel, um es zur Evaluierung der Wirkung von rhTPO auf die Dosis-beschränkende Thrombozytopenie zu verwenden.
  • Hauptziele
  • Die Hauptziele dieser Studie waren es die Sicherheit und die Tolerierbarkeit zu bestimmen, das pharmakokinetische Profil zu charakterisieren und die Immunogenität des rhTPOs, das über SC-Injektion an Patientinnen mit rezidivierenden gynäkologischen Tumorerkrankungen, die Carboplatin erhielten, gegeben wurde.
  • Sekundäre Ziele
  • Die nachgeordneten Ziele dieser Studie waren es die Pharmakodynamik zu bewerten, wie sie durch die Wirkung auf die Tiefe und Dauer des nach-chemotherapeutischen Blutplättchen-Tiefpunkts gemessen werden kann, die maximal tolerierte Dosis (MTD) zu bestimmen, oder im Falle, daß es keine MTD gibt, die optimale biologische Dosis (OBD) für rhTPO zu bestimmen, das über S.C.-Injektionen an Personen mit rezidivierenden, gynäkologischen Tumoren, die Carboplatin erhalten, verabreicht wird.
  • Studienplan: Überblick
  • Dies ist eine open-label-Dosis-Steigerungsstudie, in der Patienten mit rezidivierenden gynäkologischen Tumoren Carboplatin für die Behandlung ihrer Erkrankung erhalten werden. Bis zu 30 Personen werden in dieser klinischen Phase-I Studie, für die SC-Verabreichung von rhTPO aufgenommen. 3 Personen werden zu jeder von 6 Dosierungsmengen zugeordnet, beginnend mit der niedrigsten Dosierungsmenge. Sobald die OBD bestimmt ist, werden 12 weitere Personen behandelt werden. 6 Personen werden eine Carboplatin-Chemotherapie zusammen mit rhTPO entweder als Dosis unter der MTD oder mit der OBD erhalten. Die anderen 6 Personen werden Carboplatin ohne rhTPO erhalten, aber können rhTPO in anschließenden Zyklen nach jedem Zyklus, in dem die Person Thrombozytopenie erleidet (Blutplättchen < 30.000/μl) erhalten.
  • Die Studie ist in eine 14-tägige Überprüfungsperiode, 3 21-tägige Zyklen und 1 28-tägige Nachsorgeperiode aufgeteilt. Im ersten Zyklus (Zyklus 0) wird das rhTPO am Tag 1 und Tag 4 nur an Personen, die in die Dosierungsmengen 4, 5 und 6 aufgenommen sind, verabreicht werden. Im zweiten Zyklus (Zyklus-1) wird eine Carboplatin-Chemotherapie nur am Tag 1 verabreicht. Im dritten Zyklus (Zyklus-2) wird Carboplatin am Tag 1 verabreicht, rhTPO am Tag 2 und rhTPO am Tag 5 nur an Personen, die an den Dosierungsmengen 4, 5 und 6 teilnehmen. Auf den Zyklus-2 wird eine 28-tägige Nachuntersuchungsperiode folgen.
  • Die Dosis-Mengensteigerung wird durch alle 6 Dosierungsmengen fortschreiten mit der Ausnahme, daß der MTD oder der OBD bestimmt ist. Der MTD ist als die Dosierungsmenge definiert, die der Dosierungsmenge vorangegangen ist, an dem eines der folgenden beobachtet wurde: > 1/3 oder ≥ 2/3 der Personen entwickeln mit einer Dosierungsmenge eine nichthämatologische Toxizität des Grades ≥3, die mit rhTPO in Verbindung steht und die nicht durch unterstützende Maßnahmen erleichtert wird; ≥ 1 Person entwickelt eine nichthämatologische Toxizität des Grades 4, die mit rhTPO in Verbindung steht und die nicht durch unterstützende Maßnahmen erleichtert wird, ≥ 2/3 oder ≥ 4/6 Personen mit einer Dosierungsmenge entwickeln eine nicht-hämatologische Toxizität des Grads ≥ 3 (unabhängig von der Erleichterung) oder irgendeine entwickelt neutralisierende Anti-TPO-Antikörper.
  • Der OBD ist als die Dosierungsmenge definiert, an der der Vergleich zwischen 2 Dosierungsmengen zeigt, daß der Trend der Blutplättchen-Antwort während des Zyklus-2 im Ver gleich zu der Antwort bei der vorhergehenden Dosierungsmenge ein Plateau auszubilden scheint.
  • Beschreibung und Begründung
  • Dies ist eine 63 Tage Studie, auf die ein 28 Tage Nachuntersuchungszeitraum folgt. Geeignete Personen, denen die Carboplatin-Chemotherapie zu nützen scheint, wird ein optionaler Verlängerungszeitraum (OEP = "optional extension period") zwischen dem Studienzeitraum und dem Nachuntersuchungszeitraum angeboten, der zusätzliche Chemotherapiezyklen mit rhTPO umfaßt. Nach der anfänglichen rhTPO-Verabreichung im Zyklus-0 werden Serumproben für Anti-TPO-Antikörpermengen wöchentlich entnommen.
  • Alle Personen werden weiter auf Nebenwirkungen hin und auf die Sicherheit für mindestens 28 Tage nach dem letzten Zyklus währenddessen sie rhTPO erhalten haben, bewertet. Personen mit Bildung neutralisierender Anti-TPO-Antikörper mit einer assoziierter Thrombozytopenie werden weiter bis zum Rückgang der Thrombozytopenie beobachtet.
  • Bisher haben alle klinischen Studien des rhTPOs eine I.V.-Dosierung beinhaltet. Dieser Verabreichungsweg ist nicht immer praktikabel und in Patienten, die eine Chemotherapie erhalten, kann ein venöser Zugang nicht immer einfach etabliert werden. Die vorliegende Studie wird die Sicherheit, Toleranz, Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und potentielle Immunogenität von rhTPO, daß über den S.C.-Weg gegeben wird, bewerten.
  • Studienüberblick
  • a. Überwachungszeitraum
  • Dieser Studie wird ein 14-tägiger Überwachungszeitraum vorangehen. Während dieses Überwachungszeitraums werden die potentiellen Personen auf ihre Geeignetheit hin bewertet und ihre Zustimmung wird erhalten werden.
  • b. Studienzeitraum (Zyklen 0 bis 2)
  • Der Zyklus 0 wird aus den ersten 21 Tagen bestehen, die auf die anfängliche rhTPO-Verabreichung folgen. Personen in den Dosierungsmengen 1, 2 und 3 werden rhTPO als einzelne SC-Injektion am Tag 1 erhalten. Personen in den Dosierungsmengen 4, 5 und 6 werden rhTPO als SC-Injektionen an den Tagen 1 und 4 erhalten. Während des Zyklus 0 werden die Personen keine Chemotherapie erhalten. Dies wird die Beobachtung der Pharmakokinetik und mögliche Anti-TPO-Antikörperbildung in Abwesenheit der Chemotherapie erlauben. Wenn 2/3 Personen im Zyklus 0 eine Blutplättchenzahl-Antwort von ≥ 1.000.000 μl aufweisen kann Zyklus 0 in anschließenden Personen nach Diskussion zwischen dem medizinischen Überwacher und dem Erfinder entfernt werden.
  • Der Rest der Studie wird aus 2 21-tägigen Chemotherapiezyklen bestehen. In Zyklus-1 werden Personen eine Carboplatin-Chemotherapie ohne rhTPO erhalten, um die Grundlinie der Blutplättchen-Antwort jeder Person auf die Chemotherapie zu bestimmen. In Zyklus-2 werden alle Personen eine Carboplatin-Chemotherapie gefolgt von rhTPO erhalten. Personen in den Dosierungsmengen 1, 2 und 3 werden rhTPO als einzelne SC-Injektion am Tag 2 erhalten. Personen in den Dosierungsmengen 4, 5 und 6 werden rhTPO als SC-Injektion an den Tagen 2 und 5 erhalten. Die Zyklen 1 und 2 müssen innerhalb von 21–35 Tagen auf den Start des Zyklus 0 bzw. 1 folgend, beginnen.
  • c. Optionaler Verlängerungszeitraum (Zyklen 3–6)
  • Nach Abschluß des Studienzeitraums (Zyklen 0–2) werden Personen mit stabiler oder ansprechender Krankheit, die keine schwere Thrombozytopenie erlitten haben (d. h. Blutplättchenzahl von < 20.000/μl für > 7 Tage) und die keine neutralisierenden Anti-TPO-Antikörper entwickelt haben, geeignet sein weitere 21-tägige Zyklen der Carboplatin-Chemotherapie und rhTPOs gemäß dem Dosierungsschema des Zyklus-2 für ein Maximum von 6 Gesamtzyklen zu erhalten. Alle OEP-Zyklen müssen innerhalb von 21 bis 35 Tagen nach dem Beginn des vorhergehenden Zyklus beginnen.
  • d. Nachuntersuchungszeitraum
  • Die Personen werden für weitere 28 Tage nach dem letzten Zyklus mit rhTPO beobachtet, währenddessen sie weiter auf Sicherheit sich fortsetzende und neue Nebenwirkungen (umfassend Thrombozytopenie) und mögliche Anti-TPO-Antikörperbildung hin, untersucht werden. Dies ist der Nachuntersuchungszeitraum.
  • Studienendpunkte
  • Die folgenden variablen sind die primären Studienendpunkte: Die Sicherheit und Tolerierbarkeit des SC-gegebenen rhTPOs wie durch die Häufigkeit und Schwere der Nebenwirkungen bestimmt; die seriellen Serummengen des TPOs, wie durch das Studienfliesschema bestimmt; die Häufigkeit der Bildung von Antikörpern gegen TPO. Die folgende Variable ist ein sekun därer Studienendpunkt: serielle Blutplättchenzahlen und die Tiefe und Dauer des Tiefpunkts der Blutplättchen nach Verabreichung der Chemotherapie.
  • Sicherheitsbewertungen und Folgeuntersuchungen
  • Alle Personen werden eng überwacht und auf Nebenwirkungen während des Verlaufs der Studie hin untersucht. Die Personen werden bei jeder Untersuchung auf Nebenwirkungen hin untersucht. Alle unbegründeten medizinischen Vorgänge und klinisch bedeutsamen Änderungen von der Grundlinie (umfassen Laboratoriumsergebnisse und Vitalzeichen werden als Nebenwirkungen angesehen.
  • Der Erfinder oder sein Rechtsnachfolger wird alle Nebenwirkungen aufgrund der vorliegenden Kriterien bewerten: Schwere; NCI allgemeiner Toxizitätsgrad; Verbindung zur Erkrankung und Verbindung zu rhTPO.
  • Die obigen Informationen sowie der Beginn, die Verbesserung, die Wirkung auf die rhTPO-Verabreichung hin und die Behandlung der Nebenwirkung werden auf den Case Report Form (CRF) vermerkt. Alle Nebenwirkungen werden eine Angabe zur Verbesserung am Ende des Nachuntersuchungszeitraums umfassen. Alle Anti-TPO-Antikörper-bedingten Thrombozytopenien werden bis zur Besserung beobachtet.
  • Alle Nebenwirkungen werden unabhängig von der Kausalität in dem CRF aufgezeichnet. Nebenwirkungen werden mit der maximalen erlittenen Intensität berichtet. Wenn eine berichtete Nebenwirkung an Schwere oder Häufigkeit zunimmt wird sie als eine neue Wirkung angesehen werden. Wenn eine berichtete Nebenwirkung in ihrer Schwere oder Häufigkeit nachläßt, wird sie als fortbestehend angesehen werden, bis sie sich vollständig gebessert hat.
  • Sicherheitsplan
  • Die hauptsächlichen Sicherheitsfragen, die die rhTPO-Verabreichung in diesen klinischen Studien betreffen, sind wie folgt: Bildung neutralisierender Anti-TPO-Antikörper, allergische Reaktionen, umfassend Anaphylaxe und potentielle Thrombozytose mit einem erhöhten Risiko für thrombotische Ereignisse.
  • a. Antikörperbildung
  • Alle Personen, in dieser klinischen Studie werden einem wöchentlichen Testen der Anti-TPO-Antikörper unterzogen. Drei Serumproben werden für die Anti-TPO-Antikörpermengen erhalten, um eine sichere Grundlinie für die Anti-TPO-Antikörperbildung zu etablieren. Diese Proben (zwei als Grundlinienuntersuchung und eine vor der Dosis am Tag 1 des Zyklus 0) müssen mindestens 1 Tag voneinander getrennt erhalten werden. Wenn eine Anti-TPO-Antikörperbildung beobachtet wird, werden weitere Untersuchungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Anti-TPO-Antikörper eine neutralisierende Natur besitzen. Wenn die Anti-TPO-Antikörper neutralisierend sind, wird die Person keine weiteren rhTPO-Injektionen erhalten. Für alle Personen werden während dieser Studie häufig die Blutplättchenzahlen gemessen. Personen mit Thrombozytopenie werden durch Blutplättchentransfusion unterstützt, unabhängig davon, ob neutralisierende Anti-TPO-Antikörper vorhanden sind oder nicht. Wenn die Anti-TPO-Antikörper nicht neutralisierend sind, kann die Person an der Studie teilnehmen und weiteres rhTPO gemäß dem Protokoll erhalten.
  • b. Allergische Reaktion
  • Die Bildung von Anti-TPO-Antikörpern, die IgE umfassen, in den Tierstudien, deutetet auf das Risiko möglicher allergischer Reaktionen hin. Es sind keine anaphylaktischen Reaktionen in irgendwelchen der Tierstudien oder den laufenden menschlichen klinischen Studien berichtet worden, aber die Erfahrung mit einer erneuter Dosierung ist begrenzt. Alle an diesem klinischen Versuch teilnehmenden Personen werden rhTPO in einem streng überwachten Krankenhauszusammenhang erhalten, bei dem Anaphylaxe-Vorsorgemaßnahmen etabliert sind.
  • c. Thrombozytose
  • Für die Verabreichung des rhTPOs wird erwartet, daß sie zu einer erhöhten Blutplättchenzahl führt. Eine dramatisch erhöhte Blutplättchenzahl (Thrombozytose) kann zu einem erhöhten Risiko der Thrombose führen. Personen mit einer bekannten Anamnese thrombotischer Ereignisse werden aus dieser Studie ausgeschlossen. Zusätzlich rhTPO-Verabreichung kann in jeder Person mit einer Blutplättchenzahl von ≥ 1.000.000/μl nach Diskussion mit dem medizinischen Überwacher und dem Erfinder unterbrochen werden. Wenn eine Person Thrombozytose erleidet, wird der medizinische Überwacher und der Erfinder Behandlungsoptionen diskutieren, die Blutplättchenapherese und/oder Aspirin-Therapie umfassen können.
  • d. Dosis-beschränkende Toxizität
  • DBT ist als eines der folgenden definiert: neutralisierende Anti-TPO-Antikörperbildung; Anaphylaxe; ein klinisch signifikantes thrombotisches Ereignis; jede nicht-hämatologische Toxizität des Grads ≥ 3 (unter Verwendung des NCI-üblichen Toxizitätskriterien) für die bestimmt wird, daß sie mit rhTPO in Verbindung steht und die nicht durch unterstützende Maßnahmen verbessert wird; eine nicht-hämatologische Toxizität des Grads ≥ 3 NCI, für die bestimmt wird, daß sie mit rhTPO in Verbindung steht und die durch unterstützende Maßnahmen verbessert wird, ist nicht notwendigerweise Dosierungs-beschränkend, wenn sie kein mögliches Gesundheitsrisiko oder eine unannehmbare Toxizität darstellt.
  • e. Dosismengen-Steigerung
  • In der Abwesenheit von DLT wird eine Steigerung über alle Dosierungsmengen fortschreiten. Nach dem die Dosismenge 1 aufgenommen wurde, müssen mindestens 2/3 Personen in jeder Dosierungsmenge sicher die rhTPO-Verabreichung tolerieren, bevor die nächste Dosierungsmenge zugewiesen werden kann. Die sichere Tolerierung ist als die Abwesenheit von DBT innerhalb von 21 Tagen nach anfänglicher rhTPO-Verabreichung (Tag 1, Zyklus 0) definiert.
  • Die ersten drei Dosierungsmengen werden Einzel-Dosierungsverabreichungsschema sein. Mehrfach-Dosenverabreichungsschema (Dosierungsmengen 4–6) werden nicht aufgenommen, bis alle Einzel-Verabreichungsdosierungsschemata sicher toleriert worden sind. Wenn irgendeine der Einzel-Dosierungsmengen als Ergebnis von DBT ausgelassen wird, können eine oder mehrere der Mehrfach-Dosierungsmengen umgeschrieben werden. Die kumulative Dosis der Mehrfach-Dosisverabreichungsschemata sollte die MTD in den Einzel-Dosisverabreichungsschemata nicht vor Diskussion und Übereinstimmung übersteigen.
  • Dosierung und Dauer
  • Für alle Dosierungsmengen des rhTPOs in diesem klinischen Versuch, wird es erwartet, daß sie aktiv sind. Die Personen werden eine einzelne SC-Injektion des rhTPOs in jedem Zyklus, währenddessen die rhTPO-Verabreichung geplant ist, erhalten. Für die Blutplättchenzahl-Antwort wird es erwartet, daß diese innerhalb von 7–10 Tagen auftritt. Den Personen wird eine maximale Anzahl von 6 Zyklen mit rhTPO erlaubt werden.
  • Übereinstimmung mit Gesetzen und Regulierungen
  • Diese Studie wird in Übereinstimmung mit dem aktuellen Food and Drug Administration (FDA) Good Clinical Practices (GCPs), der Erklärung von Helsinki und lokalen ethischen und rechtlichen Anforderungen durchgeführt werden.
  • Materialien und Methoden
  • Personen: Personenauswahl
  • Mögliche Personen für diese Studie sind Patienten, die mit einem beliebigen rezidivierenden gynäkologischen Tumor diagnostiziert worden sind und für die Carboplatin injiziert ist. Die Personen können bis zu drei vorangehende Therapien erhalten haben. Zusätzlich zu diesen drei Behandlungen können die Personen vorhergehende Radiotherapie erhalten haben, unter der Voraussetzung, daß < 25% der Knochenmarks-produzierenden Bereiche so behandelt worden sind. Eine meßbare Erkrankung wird deutlich gefördert, ist jedoch für die Qualifizierung zur Studie nicht erforderlich. Die Personen müssen in der Lage sein mindestens 21 Tage auf den Beginn der Chemotherapie warten zu können und müssen eine Lebenserwartung von > 12 Wochen aufweisen.
  • Einschlußkriterien
  • Alle möglichen Personen müssen die folgenden Kriterien erfüllen, um sich für diese klinische Studie zu qualifizieren. Sie müssen in der Lage sein eine schriftliche Zustimmung zu geben; müssen ein histologisch oder zytologisch bestätigte gynäkologische Tumorerkrankung aufweisen; müssen ein Alter von 18 bis 65 Jahren haben; die Person, die dazu in der Lage sind Kinder zu bekommen, müssen ein negativen Serumschwangerschaftstest innerhalb von 7 Tagen vor dem Zyklus 0 Tag 1 nachweisen und alle Personen die die Fähigkeit haben, Kinder zu bekommen, müssen nach Auffassung des Untersuchers ein wirksames Mittel der Kontrazeption verwenden; Karnofsky-Leistungswert von ≥ 80%; adäquate Knochenmarksfunktion, d. h. WBC Zahl von ≥ 3000/μl und Blutplättchenzahl von ≥ 150 000 μl und ≤ 450 000 μl, adäquate Leberfunktionen, d. h. Gesamtbilirubin von ≤ 1,5 mg% und SGOT oder SGPT von ≤ 3-fach normal, adäquate Nierenfunktion, d. h. Serumkreatinin von ≤ 1,5 mg/dl oder eine berechnete Kreatininentfernung von ≥ 60 ml/min; und eine Lebenserwartung von ≥ 12 Wochen.
  • Ausschlußkriterien
  • Mögliche Personen werden von dieser klinischen Studie ausgeschlossen wenn sie eine der folgenden Kriterien aufweisen: eine Anamnese oder eine Diagnose für Leukämie; eine rasch voran schreitende Erkrankung; eine unkontrollierte klinisch bedeutsame Dysarrythmie; sind schwanger oder stillende Frauen; haben eine Anamnese oder irgendeine Blutplättchenerkrankung, die idiopatische Thrombozytopenie pupura, thrombotische Thrombozytopeniepupura, Blutungsdiathese oder jedes erhöhte Blutungsrisiko umfassen; eine anamanese bedeutender thrombotischer Ereignisse (umfassend pulmonare Embolien und Thrombophlebie der tiefen Vene) aufweisen; eine Anamnese von Herzinfarkt, Ischämie, transiente ischämische Attacken oder eines zerbrovasculären Unfall innerhalb von 6 Monaten vor dem Zyklus 0, Tag 1 aufweisen; eine Anamnese vom zentralen Nervensystem (ZNS) Metastase haben; wenn sie mehr als drei vorangehende chemotherapeutische Behandlungen aufweisen; wenn sie irgendeine Harnstoff-Chemotherapie (BCNU, CCNU) oder Mitomycin-C innerhalb von 6 Wochen vor dem Zyklus 0, Tag 1 verwendet haben, Granulozyten/Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) oder G-CSF innerhalb von 2 Wochen vor dem Zyklus 0, Tag 1 verwendet haben, Erythropoetin (Epogen®, Procrit®) innerhalb von 4 Wochen vor dem Zyklus 0, Tag 1 verwendet haben; irgendeinen experimentellen Arzneistoff innerhalb von 4 Wochen vor dem Zyklus 0, Tag 1 verwendet haben. Irgendeine zytotoxische Chemotherapie oder Immuntherapie innerhalb von 4 Wochen vor Zyklus 0, Tag 1 verwendet haben; irgendeine Bestrahlungstherapie innerhalb von 2 Woche vor Zyklus 0, Tag 1 oder irgendeine Bestrahlung des Beckens verwendet haben; irgendein chirurgisches Verfahren mit der Ausnahme der Legung eines dauerhaften Zugangs innerhalb von 2 Wochen vor Zyklus 0, Tag 1 verwendet haben; irgendeine andere bedeutsame medizinische Anamnese oder einen physischen Befund aufweisen, der eine begründetet Vermutung einer Erkrankung gibt, die (der) die Einnahme eines Forschungsarzneistoffes kontraindizieren würde oder die (der) die Interpretation der Ergebnisse dieser Studie beeinflussen könnte.
  • Verfahren der Behandlungszuordnung
  • Drei Personen werden zu jedem der sechs Dosierungsmengen die in Tabelle 17 aufgeführt werden zugeordnet. Die Dosierungsmengenzuordnung wird in aufsteigender Reihenfolge der Dosierungsmengen beginnend mit Dosierungsmenge 1 stattfinden. Mindestens 2/3 Personen müssen die rhTPO-Verabreichung sicher tolerieren bevor die nachfolgende Dosierungsmenge zugeordnet werden kann. Eine Gesamtzahl von 18 Personen werden in der Dosensteigerungsphase aufgenommen. Sobald der OBD etabliert ist, werden 12 weitere Personen behandelt werden. Sechs Personen werden eine Carboplatin-Chemotherapie zusammen mit rhTPO entweder mit einer Dosis unter dem MTD oder an dem OBD erhalten. Die anderen sechs Personen werden Carboplatin oder rhTPO erhalten können aber rhTPO in anschließenden Zyklen nach einem Zyklus erhalten in dem die Person eine Thrombozytopenie (eine Blutplättchenzahl von < 30 000/μl) erleidet. Die Personen werden ersetzt, wenn weniger als 2 Personen in jeder Dosierungsmenge die Evaluierung des Zyklus-2, Tag 22 abschließen. Da dies eine openlabel-Studie des rhTPOs ist, wird es keine Verblindung geben.
  • Studienbehandlung
  • Die Personen werden Carboplatin-Chemotherapie für die Behandlung ihrer Erkrankung im Zusammenhang mit rhTPO erhalten.
  • rhTPO
  • rhTPO wird durch Genentech, Inc. als sterile Flüssigkeit, die für die parenterale Verabreichung bereit ist in 3 ml Glasgefäßen zur Verfügung stellen. Jedes Gefäß liefert 2 ml rhTpO mit 0,5 mg/ml in einer isotonischen Pufferlösung (pH 7,4). Konservierungsmittelfreie normale Salzlösung ist das einzige kompatible Verdünnungsmittel und die Spüllösung für rhTPO. Die Formulierung enthält kein Konservierungsmittel und ist nur die Einzeldosisverabreichung geeignet.
  • a. Dosierung, Verabreichung und Lagerung
  • Personen werden zu den in Tabelle 17 gezeigten Dosierungsmengen zugeordnet.
  • Figure 01310001
  • Personen in den Dosierungsmengen 1, 2 und 3 werden die zugeordnete Dosierung des rhTPO als einzelne SC-Injektion am Tag 1 des Zyklus 0 und am Tag 2 des Zyklus 2 erhalten. Personen in den Dosierungsmengen 4, 5 und 6 werden TPO als einzelne SC-Injektion an den Tagen 1 und 4 des Zyklus 0 und an den Tage 2 und 5 des Zyklus 2 erhalten. Wenn die Patienten an dem OEP teilnehmen, werden sie rhTPO erhalten wie sie dies in Zyklus 2 erhielten. Es wird kein rhTPO während des folgenden Untersuchungszeitraums geben. Alle rhTPO-Injektionen werden gemäß den bestehenden Anaphylaxe Vorsichtsmaßnahmen zubereitet und dann verabreicht werden. Das rhTPO wird geliefert und muß unter Kühlung bei 2°C–8°C (35°F–46°F) gelagert werden. rhTPO kann verdünnt werden, um eine genaue Verabreichung zu ermöglichen.
  • b. Dosismodifikation
  • Es wird keine Modifikation der Dosis des rhTPOs in diesem klinischen Versuch geben. Die tatsächliche Dosis wird beruhend auf dem tatsächlichen Gewicht der Person während der Untersuchung berechnet.
  • Carboplatin Chemotherapie
  • Carboplatin wird von kommerziellen Quellen erhalten.
  • a. Dosierung, Verabreichung und Lagerung
  • Die Personen werden Carboplatin I.V. über 1 h am Tag 1 jedes Chemotherapiezyklus erhalten. Die tatsächliche Dosis wird als AUC = 11 unter Verwendung der Calvert's-Formel berechnet: Gesamtdosis = Ziel AUC × (GFR + 25). Wenn die erste Kohorte der Person die Carboplatinbehandlung gut toleriert (d. h. Blutplättchentiefpunkt von > 100 000/μl) kann die Dosierungsmenge der Carboplatins erhöht werden (z. B. AUC = 13). Die Carboplatin-Chemotherapie wird gemäß der Praxis der Institution und den Herstellerrichtlinien verabreicht und muß in Übereinstimmung mit den Herstellerrichtlinien gelagert werden.
  • b. Dosismodifikation
  • Es wird keine Dosisreduktion der Chemotherapie aufgrund einer hämatologischen Toxizität geben. Wenn eine Person eine hämatologische Toxizität erleidet, kann G-CSF wie klinisch indiziert verabreicht werden, um dabei zu helfen eine mögliche Neutropenie in anschließenden Chemotherapiezyklen zu verringern. Wenn eine Person eine schwere Thrombozytopenie (d. h. Blutplättchentiefpunkt von < 20 000/μl für > 7 Tage) im Zyklus 2 oder danach erleidet wird die Person aus der Studie genommen und in den 28 Tagen Nachuntersuchungszeitraum überführt.
  • Gleichzeitige Therapie
  • Gleichzeitige Medikationen sind alle verschreibungspflichtigen Medikationen, nicht verschreibungspflichtige Zubereitung oder medizinische Therapien die von der Person zwischen 28 Tagen vor den Studienzeitraum und den letzten Tag des Nachuntersuchtungszeitraums verwendet werden. Personen die orale Kontrazeptiva, hormonelle Ersatztherapie oder andere Erhaltungstherapie verwenden werden gebeten werden die Verwendung in einer beständigen Weise während der Studie fortzusetzen. Alle gleichzeitigen Medikationsverwendungen und Therapie sollten an den Forscher berichtet werden und in das CRF aufgenommen werden.
  • Erlaubte Medikationen
  • Den Personen können FDA-zugelassene Medikationen wie klinisch indiziert verabreicht werden, mit der Ausnahme wie sie für die ausgeschlossenen Therapien beschrieben sind. Die Liste der Arzneistoffe die in der in diesem Beispiel beschriebenen Studie vermieden werden sollten da sie in die Funktion der Blutverklumpung eingreifen können, umfassen die Funktionen der Blutplättchen umfassen Sallycylate, umfassend Acupurin®, Alka-Seltzer®, Arthritis Foundation®, sicherheitsbeschichtete Aspirintabletten, BC-Pulver in Arthritisstärke, Asacol® verzögerte Freisetzungstabletten, Aspirin (Acethylsalicylsäure), Ascriptin®, Axotal®, Azodone®, Bayer® Aspirin, BC®-Pulver, BC® Erkältungspulver, Bufferin®, Carisoprodeol® und Aspirintabletten, Damason-P, Darvon-Verbindung 65®, Diflunisal, Dolobid®, Ecotrin® enterisch beschichtete Tabletten, Empirin®, Equagesictabletten, Excedrin®, Fiorinal® Kapseln, Tabletten und mit Codein Tabletten, Gelpirin®, Halfprin®, Lortab ASA® Tabletten, Mesalamine, Methocarbamol® und Aspirintabletten, Mono-Gesic®-Tabletten, Norgesic®-Tabletten und Norgesic Forte®-Tabletten, Panasal 5/500®, PC-CAP® Propoxyphenehydrochloride-Verbindung, USP, Pentasa®, Percodan®, Robaxisal®, Rowasa® rectal Zäpfchen oder Einläufe, Roxiprin®, Saflex®-Tabletten, Salicylsalicylsäure (oral), Salsalat, Salsatab®-Tabletten, Soma®-Verbindung und mit Codein, Sulfasalazin, Synalgos-DC®-Kapseln, Talwin®-Verbindung, Trilisate®-Flüssigkeit oder Tablette, Ibuprofen, umfassend Advil®, Co-Advil®, Cramp-End®-Tabletten, Dimetapp Sinus-Käpselchen, Haltran®, Ibuprofen, Ibuprohm®, IBU®-Tabletten, Motrin®, Nuprin®, Sine-Aid® IB, Vicks Day-Quil® mit Ibuprofen; Naproxennatrium, umfassend Aleve®; Ketoprofen, umfassend Orudis®; andere nicht-steroidale antiinflammatorische Arzneistoffe (NSAIDS) umfassend Anaprox®, Anaprox® DS, Ansaid®, Cataflam®, Clinoril®, Daypro®, Diclofenac, Etodolac, Feldene®, Fenoprofen, Flubiprofen, Indocin®, Indomethacin, Ketorolac, Lodine®, Mefanamsäure, Nabumetone, Nalfon®-Tabletten und Nalfon 200®-Pulverkapseln, Naprosyn®-Suspension und Tabletten, Oruvail®-Kapseln, Piroxicam, Ponstel®, Relafen®-Tabletten, Sulindac, Tolectin®, Tolmetin, Toradol®, Voltaren®; ande re Mittel, umfassend Coumadin, Dipyridamol, Enoxaparin, Heparin (anticoagulative Therapie), Lovenox®, Persantin®, Ticlid® und Ticlopidin.
  • Blutplättchentransfusion
  • Prophylaktische Blutplättchentransfusionen können an alle Personen mit einer Blutplättchenzahl von ≤ 20 000/μl verabreicht werden und wie klinisch für Blutung oder das vermutete Risiko für Blutung klinisch indiziert. Die Blutplättchentransfusion sollte wenn möglich nach dem morgendlichen Blutplättchen zählen und der pharmakokinetische Probeentnahme verabreicht werden.
  • Ausgeschlossene Therapien
  • Aspirin, wenn es nicht in der Behandlung von Thrombozytose verwendet wird ist während der Studienteilnahme nicht erlaubt. Nicht-steroidale anti-inflammatorische Arzneistoffe (NSAID = "Non-Steroidal anti-inflammatory drugs") und Aspirin-enthaltende Produkte müssen während dieser Studie vermieden werden. Das Schmerzmanagement sollte Mittel umfassen, für die bekannt ist, daß sie keine Anti-Blutplättchenwirkung aufweisen. Andere hämatopoetische Mittel als rhTPO und G-CSF sind während dieses Studienzeitraumes auch ausgeschlossen. Die Verwendung aller experimentellen (für die Indikation nicht FDA-zugelassen) Arzneistoffe müssen während dieser Studie vermieden werden. Eine Bestrahlungstherapie kann während der Teilnahme an der Studie ohne Zustimmung nicht erlaubt werden.
  • Studienbewertung
  • Die Personen werden während des 14-tägigen Überprüfungszeitraums, der der ersten rhTPO-Verabreichung voran geht, auf ihre Qualifizierung hin, beurteilt. Personen werden während des Studienzeitraums, dem OEP (wenn anwendbar) und in dem Nachuntersuchungszeitraum eng überwacht. Personen werden bei jeder Untersuchung auf Nebenwirkung hin bewertet. Die tatsächlichen Daten der Studienuntersuchung können um ± 2 Tage abhängig davon wenn es für die Person geeignet ist variieren. Die Tabelle 18 enthält ein Schlußdiagramm für die Überprüfung und die Studienbewertungen. Die pharmakokinetischen Probenentnahmezeitpunkte werden in Tabelle 19 aufgezeigt und OEP und Nachuntersuchungszeitraumbewertungen sind in der Tabelle 20 gezeigt.
  • Figure 01350001
  • Figure 01360001
  • Figure 01360002
  • Durchsuchen und Bewertung vor der Behandlung
  • Alle Durchsuchungsbewertungen müssen innerhalb von 14 Tagen der ersten rhTPO-Verabreichung dem Tag 1 des Zyklus 0 vorausgehend, wenn nicht anders angegeben, abgeschlossen sein. Die Bewertungen vor der Behandlung (Grundlinie) werden vor der rhTPO-Verabreichung am Tag 1 des Zyklus 0 erhalten werden.
  • a. Durchsuchungsbewertungen
  • Die folgenden Durchsuchungsbewertungen werden aufgenommen werden: eine unterschriebene Einwilligungserklärung, vergangene/gegenwärtige medizinische Anamnese, umfassend demografische Aspekte und gleichzeitige Medikationsverwendung; eine physische Untersuchung; ein Elektrokardiogramm (innerhalb von 28 Tagen des Zyklus 0, Tag 1); eine Bruströntgenaufnahme (innerhalb von 28 Tagen des Zyklus 0, Tag 1); CBC, differentiell und Blutplättchenzahl; Serumchemie; und Serumschwangerschaftstest (wenn anwendbar).
  • b. Bewertung vor der Behandlung (Grundlinie)
  • Die folgenden Bewertungen werden aufgenommen, um die Grundwerte zu bestimmen; Vitalzeichen, CBC, differentiell und Blutplättchenzahl; Urinanalyse; Anti-TPO-Antikörpermengen (drei Proben von denen mindestens zwei ≥ 24 Stunden getrennt sind und eine Probe 5 Minuten vor der ersten rhTPO-Verabreichung); und eine Knochenmarksbiopsie und -punktion.
  • Bewertung während der Behandlung
  • a. Zyklus 0
  • Im Zyklus 0 werden die folgenden Bewertungen aufgenommen werden: Vitalzeichen (vor und eine Stunde nach der rhTPO-Verabreichung); CBC, differentiell und Blutplättchenzahl (täglich für die Tage 1–5 und dann mindestens 3 mal wöchentlich); Serumchemie (Tag 22); Urinanalyse (Tag 22); Anti-TPO-Antikörpermenge (Tage 8, 15 und 22); Knochenmarksbiopsie und -punktion (Tag 8; eine weitere Knochenmarksuntersuchung kann durchgeführt werden, um die Vorläuferzellgenetik zu bewerten); und Serum TPO-Mengen (in ausgewählten Patienten).
  • Die Bewertung wird für die Dosierungsmengen 1, 2 und 3 vor und 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden nach der rhTPO-Verabreichung am Tag 1 (siehe Tabelle 19) ge nommen werden. Die Bewertungen werden für die Dosismengen 4, 5 und 6: vor der rhTPO-Verabreichung an Tag 1; vor und 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, 96, 120 Stunden nach der rhTPO-Verabreichung am Tag 4 (siehe Tabelle 19) aufgenommen werden. Nebenwirkungen, Medikationsänderungen und Blutproduktverwendung wird aufgezeichnet werden.
  • b. Die Zyklen 1 und 2
  • Im Zyklus 0 werden die Bewertungen aufgenommen: Vitalzeichen (vor und 1 h nach rhTPO-Verabreichung); CBC, differentiell und Blutplättchenzahl (mindestens 3 mal wöchentlich; tägliche Zahlen, wenn die Blutplättchenzahl ≤ 50 000/μl ist); Serumchemie (Tag 22); Anti-TPO-Antikörpermengen (Tage 1, 8, 15 und 22); und Serum TPO-Menge (in ausgewählten Patienten).
  • Bewertungen werden für die Dosismengen 1, 2 und 3: vor 0, 5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden nach der ersten rhTPO-Verabreichung am Tag 2 (nur Zyklus 2; siehe Tabelle 19) aufgenommen. Bewertungen werden für die Dosierungsmengen 4, 5 und 6: vor der rhTPO-Verabreichung am Tag 2; vor und 0,5, 1, 2, 4, 6 ,8, 10, 24, 48, 72, 96, 120 Stunden nach der rhTPO-Verabreichung am Tag 5 (siehe Tabelle 19) aufgenommen.
  • Radiographische Untersuchungen, um den Tumorstatus zu bewerten (innerhalb von 4 Wochen vor Zyklus 1, Tag 1) Nebenwirkungen, Medikationswechsel und Blutproduktverwendung wird aufgezeichnet werden.
  • c. Optionaler Verlängerungszeitraum (Zyklen 3–6)
  • Bewertungen werden für die Vitalzeichen aufgenommen (vor dem Zyklus und vor und 1 Stunde nach der rhTPO-Verabreichung); CBC, differentiell und Blutplättchenzahl (mindestens 3 mal wöchentlich; tägliches Zählen wenn die Blutplättchenzahl < 50 000/μl ist); Serumchemie (Tag 22); Anti-TPO-Antikörpermenge (Tage 1, 8, 15 und 22); Nebenwirkungen, Medikationsänderungen und Blutproduktverwendung.
  • Nachuntersuchungsbewertung
  • Die Person wird für mindestens 28 Tage über den letzten Zyklus mit rhTPO hinaus beobachtet. Die Personen werden auch wie klinisch indiziert untersucht. Personen mit Thrombozytopenie, die mit irgendwelchem Anti-TPO-Antikörper in Verbindung steht, werden bis zur Besserung überwacht. Die Nachuntersuchungsbewertung wird das folgende umfassen: Vitalzeichen; Symptom-gerichtete physische Untersuchung; CBC, differentiell und Blutplättchenzahl; Serumchemie; Anti-TPO-Antikörpermenge; Aufzeichnung von Nebenwirkungen, Medikationsänderungen und Blutproduktverwendung.
  • PERSONENABBRUCH
  • Die Personen sind frei sich zu jedem Zeitpunkt während der Studie aus der Studienteilnahme zurückzuziehen. Wenn eine Person es wünscht, sich aus der Studie zurückzuziehen, sollte sie ermutigt werden, in die Klinik für eine Frühabbruch-Untersuchung zurückzukehren. Die Frühabbruch-Untersuchung sollte alle Untersuchungen umfassen, die für Tag 1 des Zyklus oder den Nachuntersuchungsperioden Tag 28 geplant sind. Die Frühabbruch-Untersuchungen sollten so dicht wie möglich an den tatsächlich geplanten Untersuchungstag geplant werden.
  • Die rhTPO-Verabreichung an die Person wird im Falle von DBT, der Bildung neutralisierender Anti-TPO-Antikörperbildung oder dem Fortschreiten der Krankheit am Ende des Zyklus-2 abgebrochen. Wenn die rhTPO-Verabreichung für eine Person abgebrochen wird, sollte sie ermutigt werden, alle regelmäßig geplanten Untersuchungen für diesen Zyklus zu beenden und den Nachuntersuchungszeitraum abzuschließen.
  • STUDIENABBRUCH
  • Gründe für den Abbruch der Studie können die folgenden umfassen: das Auftreten oder die Schwere der Nebenwirkungen in dieser oder in anderen Studien deuten auf ein mögliches Gesundheitsrisiko für die Personen hin; die Personenteilnahme ist unbefriedigend; die Datenaufnahme ist ungenau oder unvollständig.
  • STATISTISCHE VERFAHREN
  • Analyse der Durchführung der Studie
  • Die Personenaufnahme wird anhand der Dosierungsmenge zusammengefaßt. Der Zustand der Personen wird nach Dosierungsmenge und Chemotherapiezyklus tabellarisch geordnet; Gründe für den Abbruch von rhTPO oder die Studie werden aufgeführt. Die Chemotherapie und die rhTPO-Verabreichung wird auch anhand der Dosismengen und des Zyklus zusammengefaßt. Die Häufigkeit und die Dauer von Verzögerung der Verabreichung wird zusammengefaßt. Ein Protokoll der Protokollverletzung und Abweichung wird geführt und nach Dosierungsmengen zusammengefaßt. Schließlich werden die demographischen Personen und Krankheits-abhängigen Charakteristika nach der Dosierungsmenge zusammengefaßt, um die Vergleichbarkeit der Personen zu bewerten.
  • Aktivitätsanalyse
  • Im Hinblick auf die Größe der Versuchsprobe und die Ausrichtung wird die statistische Analyse der Aktivität in erster Linie deskriptiver Natur sein. Die Blutplättchenzahlen sind der pharmakodynamische Endpunkt des Hauptinteresses. Die Zeitprofile der Blutplättchen WBC und Neutrophilen-Zahlen werden für jede Person über die Chemotherapiezyklen vorbereitet. Absolute und relative maximale Blutplättchen-Änderungen von der Grundlinie werden graphisch über die Dosismengen zusammengefaßt, um die Dosisantwort zu bewerten.
  • Pharmakokinetische Analyse
  • Die Serum-TPO-Konzentrations-Zeitprofile werden graphisch für jede Person für die Zyklen 0 und 2 dargestellt. Die maximal gemessene Serumkonzentration (Cmax) und die Zeit der maximalen TPO-Konzentration (Tmax) wird für jedes Profil aufgezeichnet. Jedes Profil wird durch pharmakokinetische Standardanalyseverfahren bewertet. Die pharmakokinetischen Parameter, die berechnet werden sollen, umfassen die Fläche unter dem Serum-TPO-Konzentrations-Zeitprofil (AUC), die mittlere Verweildauer (MRTSC), und die Halbwertszeit für das Nachlassen der Serum-TPO-Konzentrationen.
  • Die pharmakokinetischen Parameter werden über die 6 Dosierungsmengen über die Untersuchung der Dosis-Proportionalität verglichen. Die Abhängigkeiten zwischen ausgewählten pharmakokinetischen Parametern und Antworten werden untersucht werden.
  • Sicherheitsanalyse
  • Demographische, physische Untersuchungs-, klinische Labor- und Nebenwirkungsdaten werden tabellarisch angeordnet und nach Dosierungsmenge und Chemotherapiezyklus, wenn angemessen, zusammengefaßt werden. Besondere Aufmerksamkeit wird auf die Häufigkeit schwerer Nebenwirkungen und Toxizitäten, die als Grad ≥ 3 gemäß der NCI-allgemeinen Toxizitätskriterien klassifiziert werden, gelegt. Die klinischen Laborwerte außerhalb des normalen Bereichs werden identifiziert. Jede Person, die eine oder mehr Dosen des rhTPOs erhält, wird als auf die Sicherheit evaluierbar angesehen werden.
  • Das Auftreten von Antikörpern gegen TPO wird tabellarisch aufgeführt werden und die Antikörpertiter werden nach Dosierungsmenge und Anzahl der vorhergehenden rhTPO-Dosen zusammengefaßt. Der Zusammenhang zwischen Antikörperlitern und anschließenden Blutplättchenzahlen wird untersucht werden.
  • Bestimmung der Beispielsgröße
  • Die Anzahl der Personen für jede Dosismenge wurde ausgewählt, um das mögliche Personenrisiko und die Informationen, die notwendig sind, um eine vorläufige Bewertung der Sicherheit, Pharmakokinetik und Aktivität zur Verfügung zu stellen, auszubalancieren. Diese Studie wird 3 Personen bei jeder Dosierungsmenge aufnehmen, bis die Steigerung abgeschlossen ist, oder aufgrund des Erreichens des MTD abgebrochen wurde oder die OBD definiert worden ist. Für Fälle, wie das Auftreten einer spezifischen Nebenwirkung, DBTs, oder der Bildung von Antikörper gegen TPO garantiert diese Stichprobengröße für jede Dosierungsmenge mindestens eine 80%-ige Möglichkeit, ein oder mehrere Ereignisse aufzudecken, wenn die tatsächliche Ereigniswahrscheinlichkeit ≥ 41% ist.
  • BEISPIEL 10
  • REKOMBINANTES HUMANES THROMBOPOIETIN VERLANGSAMT DIE CARBOPLATIN INDUZIERTE SCHWERE THROMBOZYTOPENIE UND DIE NOTWENDIGKEIT FÜR BLUTPLÄTTCHENTRANSFUSIONEN IN PATIENTEN MIT GYNÄKOLOGISCHEN TUMOREN
  • Die Thrombozytopenie ist ein bedeutendes klinisches Problem bei der Behandlung von Krebspatienten, die das Risiko von Blutungskomplikation erhöhen kann und die Notwendigkeit für Blutplättchentransfusion und die die Dosis-Intensität der Chemotherapie beeinträchtigen kann. Das Fehlen anderer bedeutender nicht-hämatologischer Toxizitäten über einen großen Dosierungsbereich macht Carboplatin zu einem geeigneten Mittel, um das Potential des thrombopoetischen Mittels zu testen, die kumulative Thrombozytopenie abzumildern ohne die Dosierung des Carboplatins über mehrere Zyklen zu beeinträchtigen. Um die klinische Sicherheit und die Fähigkeit rekombinanten menschlichen Thrombopoietins (rhTPO) schwere Chemotherapie-induzierte Thrombozytopenie zu lindern, zu bewerten, hat der Erfinder einen klinischen Phase I/II Studie mit rhTPO in Patienten mit fortgeschrittenen oder rezidivierenden gynäkologischen Tumor, die ein Risiko für eine Chemotherapie-induzierte schwere Thrombozytopenie aufwiesen, initiiert. Die Ziele dieses Versuches waren es, die klinischen Toleranz und die hämatopoetische Wirkung des rhTPOs allein vor der Chemotherapie zu untersuchen und die klinische Sicherheit und die Aktivität von rhTPO bei der Linderung schwerer Throm bozytopenie, die mit der Chemotherapie assoziiert ist, zu evaluieren, wodurch die Notwendigkeit für Blutplättchentransfusion auf die Chemotherapie folgend, verringert wird und es dem Patienten erlaubt wird mehrere Zyklen der Chemotherapie bei voller Dosierung zu erhalten. Die Verwendung von rhTPO verringert insbesondere die Notwendigkeit für Blutplättchentransfusionen, wenn sie als sekundäre Prophylaxe verwendet wird.
  • Verfahren
  • Der Erfinder führte eine Phase I/II Studie des rhTPOs vor und nach Carboplatin in 29 Patienten mit fortgeschrittenem gynäkologischen Tumor durch. Während der Dosis-Steigerungsphase wurde das rhTPO durch subkutane Injektion als Einzel-Dosis (0,6, 1,2, 2,4 und 3,6 μg/kg) vor dem Carboplatin und für 4 Dosen nach einem zweiten Carboplatinzyklus verabreicht. Während der Dosis-Ausweitungsphase (n = 12) wurde rhTPO mit der optimalen biologischen Dosis nur als nachrangige Prophylaxe für schwere Thrombozytopenie verwendet.
  • Patienten
  • Patienten mit beliebigen rezidivierenden oder fortgeschrittenem gynäkologischen Tumor, für die die Behandlung mit Carboplatin indiziert war, waren für diesen Versuch qualifiziert. Von den Patienten wurde verlangt, daß sie einen angemessenen Karnofsky-Leistungsstatus (≥ 80%) aufwiesen, Knochenmarks- (WBC-Zahl ≥ 3 × 103/mm3 und Blutplättchenzahl ≥ 150 × 103/mm3 und ≤ 450 × 103/mm3), Nieren- (Serumkreatinin ≤ 1,5 mg/dl oder eine kalkulierte Kreatininentfernung von ≥ 60 ml/min) und Leber- (Gesamt-Bilirubin ≤ 1,5 mg% und SGOT oder SGPT ≤ 3-fach normal) Funktionen und eine Lebenserwartung von ≥ 3 Monaten aufwiesen. Patienten mit einer rasch fortschreitenden Erkrankung, dem Fehlen einer Antwort vor der auf Platin-beruhenden Therapie, eine Anamnese von Beckenbestrahlung oder einer Hoch-Dosis-Chemotherapie mit Stammzelltransplantation, einer Operation innerhalb des letzten zwei Wochen, Verwendung von Chemotherapie oder Radiotherapie innerhalb von 4 Wochen, Nitrosoharnstoff oder Mitomycin-C innerhalb von 6 Wochen vor Eintritt in die Studie, ≥ 3 verschiedene Sorten vorangehender Chemotherapie, Behandlung einer Anamnese thromboembolischer oder Blutungserkrankungen oder eine deutlich Herzerkrankung wurden von der Studie ausgeschlossen. Eine schriftliche Einwilligungserklärung wurde von allen Patienten vor Studieneintritt in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien erhalten.
  • Studienplanung
  • Das Schema der Studienplanung ist in 1 gezeigt. Die Studie umfaßt zwei Bestandteile, einen Dosis-Steigerungs-(Sicherheits)-Bestandteil und einen Dosis-Verlängerungs(Aktivitäts)-Bestandteil unter Verwendung der optimalen Dosis. Während des Dosis-Steigerungsteils dieses Versuches wurde rhTPO als einzelne Dosis durch subkutane Injektion für 3 Wochen vor der Chemotherapie verabreicht, um die klinische Toleranz und die hämatopoetische Wirkung von rhTPO allein zu bewerten. Anschließend erhielten Patienten Carboplatin intravenös über eine Stunde mit einer Dosierung für die berechnet wurde, das sie eine Fläche unter der Kurve (AUC) von 11 unter Verwendung der Calvert's-Formel [Gesamtdosis = Ziel AUC × (glomeruläre Filtrationsrate [GFR] + 25)] ergibt. Nach der Erholung von Zyklus-1 erhielten die Patienten Carboplatin (AUC = 11) gefolgt von rhTPO in derselben Dosierung jeden zweiten Tag für die Dosen (Tage 2, 4, 6 und 8) verabreicht. Somit diente Zyklus-1 (Chemotherapie allein) als interne Kontrolle für jeden Patienten für Zyklus-2 (Chemotherapie mit rhTPO).
  • Mindestens drei Patienten wurden für jede Dosismenge des rhTPOs (0,6, 1,2, 2,4, 3,6 μg/m2/d) aufgenommen. Die optimale biologische Dosis (OBD) wurde als die niedrigste aktive Dosismenge definiert, für die Vergleich zwischen den Dosismengen zeigte, daß die Entwicklung der Blutplättchen Antwort während Zyklus-2 im Vergleich zur nächsten Dosierungsmenge ein Plateau bildete. Sobald die OBD bestimmt war, wurde der rhTPO-Zyklus vor der Chemotherapie entfernt und 12 Patienten wurden mit Chemotherapiezyklen behandelt, die aus Carboplatin allein bestanden, bis eine schwere Thrombozytopenie (Tiefpunkt der Blutplättchenzahl < 30 × 103/mm3) beobachtet wurde. In den anschließenden Zyklen wurde rhTPO mit der OBD als sekundäre Prophylaxe in demselben Dosierungsplan [Tage 2, 4, 6, 8 (n = 6)] oder mit einem modifizierten Dosierungsplan [Tage –1, 1, 3, 5 (n = 6)] verwendet. Der spätere Dosierungsplan wurde verwendet, um zu bewerten, ob die frühere Verabreichung von TPO den Grad des Schutzes weiter verstärken kann. Die Begründung für diesen Dosierungsplan beruhte auf aktuellen prä-klinischen Studien in Primaten und vorangehenden klinischen Erfahrungen des Erfinders mit Sarkomen, die darauf hindeuteten, daß die Verabreichung von rhTPO vor der Chemotherapie die Blutplättchen-Erholung verbessern kann.
  • Nach dem Abschluß der zwei Chemotherapiezyklen waren alle Patienten mit einer stabilen oder antwortenden Erkrankung, die keine schwere Thrombozytopenie (d. h. Tage Blutplättchenzahl ≤ 20.000/mm3 für > 7 Tage) in Zyklus-2 erlitten hatten und die keine neutralisieren den Anti-TPO-Antikörper gebildet hatten, qualifiziert weitere Zyklen derselben Dosis Carboplatin (maximal 6 Zyklen) zusammen mit rhTPO zu erhalten. Die Patienten erhielten Blutplättchentransfusionen bei schwerer Thrombozytopenie (d. h. Blutplättchenzahl < 20.000/mm3), RBC-Transfusionen aufgrund von Anämie (d. h. Hämoglobin [Hb] < 8 g/dl) und Antibiotika für neutropenes Fieber (d. h. Temperatur ≥ 38,3°C und eine Gesamt-Neutrophilenzahl < 500/mm3) oder wenn klinisch indiziert. Die Verwendung von G-CSF war während der ersten zwei Zyklen der Chemotherapie nicht erlaubt, aber es war in den späteren Zyklen (3–6) nur wenn klinisch indiziert (d. h. als sekundäre Prophylaxe in den Patienten, die eine andauernde Neutropenie oder eine verzögerte neutrophile Erholung erlitten) erlaubt.
  • Klinische und Laborüberwachung
  • Vor und während des klinischen Versuches wurden die Patienten mit der gesamten klinischen Anamnese, physischen Untersuchungen und Labortests, die gesamte Blutzellzählungen, Serumchemie, Urinanalyse, Röntgenbrustaufnahme und Elektrokardiogramm umfassen, überwacht. Die Blutzählungen wurden 3 mal pro Woche durchgeführt bis die erwartete Tiefpunktperiode erreicht war, und dann täglich bis sich die Zahlen erholten. Die Serumproben wurden auf Antikörper, die reaktiv gegen TPO voller Länge waren, dreimal vor der Studie und wöchentlich während der Studie hin untersucht. Positive Seren (optisches Dichteverhältnis ≥ 1,5) wurden des weiteren durch das anti-trunkierte-TPO-Antikörper-Testverfahren, das c-Mpl-Blockierungs-testverfahren und das biologische Zell-Proliferationstestverfahren analysiert. Patienten, die in allen Testverfahren positiv waren, wurden als solche angesehen, die ein Risiko für eine Antikörper-induzierte Thrombozytopenie aufwiesen. Knochenmarks(KM)-Punktion und Biopsie wurde bei allen Patienten vor und eine Woche nach der rhTPO-Behandlung und in ausgewählten Patienten zu späteren Zeitpunkten (Tag 10 oder 14) in dem Zyklus vor der Chemotherapie durchgeführt. Die Tumorantwort wurde durch physische Untersuchung, Tumormarker (CA-125)-Bewertung und Bild-gebende Studien, die in periodischen Intervallen durchgeführt wurden, bewertet.
  • Statistische Verfahren
  • Die hämatopoetische Toxizität des Zyklus-1 der Chemotherapie (kein rhTPO) wurde mit den Ergebnissen aus Zyklus-2 (mit rhTPO) mittels eines gepaarten T-Tests für beständig gemessene Variablen verglichen. Die Endpunkte, die für die Analyse berücksichtigt wurden, umfaßten Tiefpunkt-Blutplättchenzahlen und die Dauer der Thrombozytopenie (< 20.000/mm3 < 50.000/mm3 und < 100.000/mm3) und die Zeit der Erholung der Blutplättchenzahlen auf ≥ 100.000/mm3. Die Differenz der Tiefpunktzahlen (C2–C1) wurde auch für die Dosisantwort unter Verwendung der linearen Regressionsanalyse analysiert. Die Zeit der Erholung der Blutplättchenzahlen auf ≥ 50.000/mm3 und auf ≥ 100.000/mm3 wurde unter Verwendung des Mann-Whitney-Rank-Summen-Tests verglichen. Zusätzlich wurde der Anteil der Patienten, die Blutplättchentransfusionen in den Zyklen mit oder ohne rhTPO benötigten unter Verwendung des McNemar's-Tests verglichen.
  • Rekombinantes menschliches Thrombopoietin (rhTPO)
  • Das in dieser Studie verwendete rhTPO wurde von Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) erhalten. Das rhTPO ist ein glykosiliertes Molekül voller Länge, das in einer gentechnisch modifizierten Säugetierzellinie produziert wird. Es wurde durch Standardverfahren gereinigt und in einer Konservierungsmittel-freien normalen Salzlösung als Verdünnungsmittel für Injektionen zur Verfügung gestellt.
  • ERGEBNISSE
  • Patienten
  • 29 Patienten mit fortgeschrittenem gynäkologischen Tumor wurden in diese Studie aufgenommen (Tabelle 21). Alle Patienten waren mit Ovarialkarzinom diagnostiziert worden mit der Ausnahme einer Patientin, die einen primären peritonealen Tumor aufwies. Die Mehrzahl der Patientinnen hatte mindestens eine auf Platin-beruhende Behandlung erhalten und mehrere hatten zusätzliche systemische und/oder intraperitoneale Therapien erhalten. Alle mit Ausnahme einer Patientin waren bewertbar auf die klinische Toleranz und die hämatopoetische Antwort auf rhTPO; die eine Patientin, die die weitere Behandlung nach einem Zyklus der Chemotherapie verweigerte und die nicht rhTPO erhielt, wurde als unbewertbar angesehen.
  • Figure 01450001
  • Figure 01460001
  • rhTPO vor der Chemotherapie
  • Wirkung auf die Blutzahlen: Die Behandlung mit einer einzelnen Dosis rhTPO (n = 16) in dem Zyklus vor der Chemotherapie war mit einem Dosis-abhängigen Anstieg (2) der zirkulierenden Blutplättchenzahl verbunden (Durchschnitt der Grundlinie, 277 × 103/mm3; Durchschnitt maximal 462 × 103/mm3; P < 0,001). Der Anstieg der Blutplättchen war graduell, wobei die Höhepunktwirkung im Mittelwert am Tag 15 beobachtet wurde (2). Nach der Spitzen-Antwort sank die Blutplättchenzahl nach und nach auf die Grundlinie ab. Die Blutplättchenzahlen um den Tag 21 (vor der Chemotherapie) blieben etwas höher als die Grundmenge (374 im Vergleich zu 277 × 103/mm3, P < 0,01). Die Blutplättchen erschienen in der Morphologie normal und es wurden keine bedeutenden Änderungen in den Zahlen der weißen Blutzellen oder in den Hämatokritwerten beobachtet.
  • Wirkung auf das Knochenmark: Der Anstieg der Blutplättchenzahl war mit einer deutlichen Steigerung der Anzahl der KM-Megakaryozyten (34 ± 4 im Vergleich zu 48 ± 5 pro 10 HPF, P < 0,01) verbunden. Die Megakaryozyten schienen eine normale Morphologie aufzuweisen: einige hatten eine größere Größe mit mehrfach abgeflachten Kernen und reifem Zytoplasma. Die myeloiden und erythroiden Zellen zeigten eine normale Reifung. Während das Knochenmark aus 6 von 15 Patienten erhöhte erythroide Zellen zeigte, blieben die gesamten myeloiden : erythroiden Zellverhältnisse und die Zellularität unverändert. Alle 6 Patienten, deren KM an den späteren Zeitpunkten (Tagen 10 und 14) untersucht wurden, zeigten jedoch eine deutliche Erhöhung der erythroiden Zellen (durchschnittlicher Normoblast 21,8% im Vergleich zu 31,3%, P < 0,01).
  • Wirkungen des rhTPOs auf die Myelosuppression
  • 28 Patienten erhielten rhTPO auf Carboplatin folgend, sechzehn in dem Dosis-Steigerungsteil der Studie und zwölf in der Dosis-Ausdehnungsphase.
  • Dosis-Steigerungsphase: In dieser Gruppe (n = 16) führte die Verabreichung von rhTPO zu einer sowohl im Grad als auch der Dauer deutlichen Verringerungen der Thrombozytopenie. Der Zusammenhang zwischen der rhTPO-Dosis und dem Grad der Thrombozytopenie wird in Tabelle 22 gezeigt. Im Vergleich zum Zyklus-1 (ohne rhTPO) war die mittlere Tiefpunkt-Blutplättchenzahl im Zyklus-2 (mit rhTPO) nicht anders bei 0,6 μg/kg und war 2-fach höher bei 1,2 μg/kg, 1,7-fach höher bei 2,4 μg/kg und 1,2-fach bei 3,6 μg/kg. Es gab keinen Hinweis auf eine lineare Dosis-Antwortkurve als die Daten paarweise analysiert wurden unter Verwendung jeder Patientin als ihre eigene Kontrolle (Unterschied Zyklus-2 – Zyklus-1). Die Unterschiede in der Tiefpunkt Blutplättchenzahl war jedoch deutlich höher (P < 0,03 unter Verwendung des einseitigen t-Tests) für die Gruppen, die 1,2 und 2,4 μg/kg im Vergleich zu den Gruppen, die 0,6 und 3,6 μg/kg erhielten (Durchschnittsunterschied C2–C1, –6,0, 26,8, 26,6 und 7,0 für die Dosierungen 0,6, 1,2, 2,4 bzw. 3,6 μg/kg). Da es keinen Unterschied zwischen den 1,2 und den 2,4 μg/kg Kohorten gab (P < 0,99), wurde 1,2 μg/kg als die niedrigste aktive Dosis gefunden und wurde für diese Chemotherapie-Anwendung als OBD angesehen.
  • Figure 01470001
  • Die gezeigten Daten stellen den Mittelwert ± SEM-Werte dar.
  • Für alle Dosierungen des rhTPOs zusammengenommen (0,6 bis 3,6 μg/kg) war die Tiefpunkt-Blutplättchenzahl höher (53 × 103/mm3 im Vergleich zu 35 × 103/mm3, P = 0,007) und die Dauer der Thrombozytopenie (Tages-Blutplättchenzahl < 50 × 103/mm3, 6 im Vergleich zu 3 Tage, P = 0,002, Tages-Blutplättchenzahl < 100 × 103/mm3, 10 im Vergleich zu 7 Tage, P < 0,001) im Zyklus-2 im Vergleich zu Zyklus-1 kürzer (Tabelle 23).
  • Figure 01480001
  • Dosis-Ausdehnungsphase (sekundäre Prophylaxe): Um die Fähigkeit von rhTPO am OBD die schwere Thrombozytopenie und die Notwendigkeit für Blutplättchen-Transfusionen zu mildern, zu bewerten, erhielt eine Kohorte von 6 Patienten Carboplatin-Zyklen allein, bis sie eine schwere Thrombozytopenie erlitten. Das rhTPO wurde in anschließend Zyklen als anschließende Prophylaxe (1,2 μg/kg) verwendet, unter Verwendung des selben wie oben beschriebenen Dosierungsplans (d. h. an den Tagen 2, 4, 6 und 8). Wie in 3 gezeigt, verringerte das rhTPO in dieser Patientengruppe den Grad des Blutplättchen-Tiefpunkts (16 × 103/mm3 im Vergleich zu 49 × 103/mm3), verzögerte das Einsetzen des Tiefpunkts und beschleunigte die Blutplättchen-Erholung, so daß die Dauer der schweren Thrombozytopenie < 20 × 103/mm3 deutlich verringert war (4,2 im Vergleich zu 1,2 Tage, P < 0,01). 5 der 6 Patienten hatten Blutplättchen-Tiefpunkte < 20 × 103/mm3 erfahren, die ein Blutplättchen-Transfusion im Zyklus-1 erforderten. Die Verabreichung von rhTPO in Zyklus-2 beseitigte die Notwendigkeit für eine Blutplättchen-Transfusion in 3 dieser Patienten und reduzierte sie in einem 4. Patienten.
  • Zusätzlich wurde eine Gruppe von 6 Patienten mit rhTPO (1,2 μg/kg) beginnend vom Tag 1 vor der Chemotherapie (Tage –1, 1, 3, 5) behandelt, um zu bestimmen, ob das Ausmaß des Schutzes durch dieses Dosierungsschema ergänzt werden könnte. 5 der 6 Patienten dieser Gruppe erlitten eine schwere Thrombozytopenie nach Carboplatin allein im Zyklus-1. Die Verabreichung von rhTPO im Zyklus-2 führte zu einer Verringerung der Dauer der schweren Thrombozytopenie < 20 × 103/mm3 von 6 Tage auf 2 Tage und die Notwendigkeit für Blutplättchen-Transfusion wurde in 3 dieser 5 Patienten aufgehoben. Wie in 4a gezeigt, hatte eine Patientin eine schwere Thrombozytopenie in Zyklus-1 erfahren und benötigte zwei Blutplättchen-Transfusionen vor der Blutplättchen-Erholung. Die Verwendung von rhTPO im Zyklus-2 in diesem Dosierungsschema erhöhte den Blutplättchen-Tiefpunkt und beseitigte die Notwendigkeit für Blutplättchen-Transfusion im Zyklus-2. Wie in 4b gezeigt, erfuhr die sechste Patientin keine schwere Thrombozytopenie im Zyklus-1 (Blutplättchen-Tiefpunkt 47 × 103/mm3) und erhielt daher kein rhTPO im Zyklus-2. Der Zyklus-2 wurde von schwerer Thrombozytopenie (Blutplättchen-Tiefpunkt 18 × 103/mm3) begleitet, die eine Blutplättchen-Transfusion erforderte, was die kumulative Natur der hämatopoetischen Toxizität, die mit Carboplatin gesehen wird, aufzeigt. Die Verabreichung von rhTPO im Zyklus-3 erhöhte den Blutplättchen-Tiefpunkt (18 im Vergleich zu 47 × 103/mm3) und beseitigte die Notwendigkeit einer Blutplättchen-Transfusion. Somit erhielten von den 12 Patientinnen, die rhTPO als sekundäre Prophylaxe erhielten 11 rhTPO im Zyklus-2 und eine im Zyklus-3. Wie in Tabelle 22 gezeigt, erhöhte rhTPO als sekundäre Prophylaxe verwendet den Blutplättchen-Tiefpunkt um das 2-fache und verringerte die Dauer der schweren Thrombozytopenie um 4 Tage.
  • Blutplättchen-Transfusionen: Von den 28 bewertbaren Patienten erhielten 27 Carboplatin allein im Zyklus-1 und Carboplatin mit rhTPO im Zyklus-2. Die Patientinnen wurden mit Blutplättchen transfundiert unter Verwendung derselben Blutplättchen-Transfusionsauslöser (< 20.000/mm3) für die Zyklen mit oder ohne rhTPO. Die dokumentierten Tiefpunkt-Blutplättchenzahlen, bei denen die Patienten tatsächlich Blutplättchen-Transfusionen erhielten waren sowohl für Zyklus-1 (Durchschnitt 13,8 und Durchschnitt 16 × 103/mm3) und Zyklus-2 ähnlich (Durchschnitt 14,4 und Durchschnitt 16 × 103/mm3). Die Notwendigkeit einer Blutplättchen-Transfusion war im Zyklus-2 im Vergleich zu Zyklus-1 verringert (Tabelle 24). Insbesondere in der Gruppe, die rhTPO bei der OBD (1,2 μg/kg) im Zyklus-2 (n = 16) erhielt, war der Teil der Patienten, die einer Blutplättchen-Transfusion bedurften von 75% im Zyklus-1 auf 25% im Zyklus (P = 0,01) reduziert. Die Zahl der erforderlichen Transfusionen in dieser Gruppe war auch um 69% reduziert (16 im Vergleich zu 5 Transfusionen im Zyklus-1 bzw. Zyklus-2).
  • Figure 01500001
  • Blutplättchen-Erholung: Die Erholung der Blutplättchen auf ≥ 50 × 103/mm3 (P < 0,019) und ≥ 100 000/mm3 (P < 0,017) wurde durch rhTPO auch deutlich verstärkt (5). 67% der Patienten, die rhTPO im Zyklus-2 erhielten, hatten am Tag 21 eine Erholung der Blutplättchen auf eine Menge ≥ 100 × 103/mm3 im Vergleich zu 37% der Patienten im Zyklus-1 ohne rhTPO.
  • Wirkungen des rhTPOs auf die kumulative Myelosuppression
  • 23 der 28 Patientinnen erhielten mehr als 2 Zyklen des Carboplatins beruhend auf dem Hinweis auf eine stabile oder ansprechende Erkrankung und dem Fehlen exzessiver hämatologischer Toxizität. Von diesen 23 Patientinnen bedurften 13 Blutplättchen-Transfusionen im Zyklus-1. 10 dieser 13 Patientinnen bedurften keiner Blutplättchen-Transfusionen im Zyklus-2 mit rhTPO und 7 von diesen 10 Hochrisiko-Patientinnen blieben immer noch ohne Blutplättchen-Transfusion im Zyklus-3. Insgesamt betrug das Bedürfnis für eine Blutplättchen-Transfusion in allen Patienten in den späteren Zyklen (Zyklen 2–6) 41% (37 von 91 Zyklen).
  • Eine schwere Neutropenie wurde mit diesem Behandlungsschema im allgemeinen nicht beobachtet. Der mittlere Tiefpunkt der neutrophilen Zahlen (ANC) war 0,58 × 103/mm3 und 0,79 × 103/mm3 (P < 0,03) für die Zyklen-1 bzw. -2. Das Auftreten einer fiebrigen Neutropenie (Fieber = 38,3°C mit ANC < 500/mm3) war in beiden Zyklen niedrig (3 im Vergleich zu 0 in den Zyklen-1 bzw. -2) und verblieb während der gesamten Studiendauer niedrig (1 von 91 in den Zyklen 2–6). Der mittlere Tiefpunkt der Hämoglobinwerte war 9,1 und 8,3 (P < 0,01) für die Zyklen-1 bzw. -2. Die Anämie war kumulativer Natur, die eine Transfusion roter Blutkörperchen in einem hohen Anteil der Patienten in späteren Zyklen (19% im Zyklus-1 und 37% im Zyklus 2–6) erforderlich machte.
  • Tumorantwort:
  • 28 bewertbare Patientinnen erhielten eine Gesamtzahl von 119 Zyklen (Durchschnitt 5 Zyklen; Bereich 2–6 Zyklen) des Carboplatins mit der vollen Dosis. 26 Patientinnen hatten eine meßbare Erkrankung und 2 hatten ein mikroskopische Erkrankung. Deutliche Antworten wurden in 14 (54%) der Patientinnen (4 komplette und 10 teilweise Antworten) beobachtet. 9 der Patientinnen hatten eine geringere Antwort oder eine stabile Erkrankung und 4 hatten eine fortschreitende Erkrankung. Zusätzlich zu den 2 Patientinnen ohne eine meßbare Erkrankung hatte eine eine serologische partielle Antwort (eine Verringerung des CA-125 von 357 auf 55).
  • Klinische Toleranz
  • rhTPO wurde von allen Patienten gut toleriert. Es wurden keine deutlichen Nebenwirkungen, die mit rhTPO im Zusammenhang standen, oder Thrombozytose beobachtet. Während der Phase vor der Chemotherapie berichteten einige Patienten gelegentlich über Kopfschmerzen, Myalgia, eine geringe Appetitsverminderung oder Mattheit in ihrem Symptom-Aufzeichnungstagebüchern. Es gab jedoch weder einheitliche Symptome noch gab es einen zeitlichen Zusammenhang dieser Symptome mit dem Zeitpunkt der rhTPO-Verabreichung, um diese Symptome von der zugrunde liegenden Erkrankung zu unterscheiden. Die Nebenwirkungen waren während beider Zyklen der Chemotherapie mit oder ohne rhTPO (Tabelle 25) ähnlich und waren typisch für die, die für Carboplatin berichtet werden. Es wurden keine lokalen Hautreaktionen, Flüssigkeitsrückstau, thromboembolische Ereignisse oder eine weitreichende Organtoxizität beobachtet.
  • Figure 01520001
  • Eine 50 Jahre alte Patientin, die alle 6 Zyklen der Chemotherapie abschloß, zeigte eine Schwäche in den rechten oberen Extremitäten nach der letzten Dosis des rhTPOs. Der CT- Scan des Gehirns war negativ und die Patientin erholte sich innerhalb von 24 h vom Großteil der Bewegungsbehinderung, was einen milden zerebrovaskulären Unfall nahelegte. Die Gegenwart einer normalen Blutplättchenzahl (d. h. 228.000/mm3) und eines langen Zeitintervalls seit der rhTPO-Verabreichung macht es unwahrscheinlich, daß dieser Vorfall mit rhTPO in Verbindung steht.
  • Die Serumproben wurden auf die Gegenwart von Antikörpern gegen TPO vor und während der Studie hin untersucht. Für 7 Patientinnen wurde bemerkt, daß sie die Antikörperaktivität in einem Testverfahren aufwiesen, der auf das Molekül voller Länge gerichtet war. Drei dieser 7 Patienten hatten die Antikörperaktivität bei der Überprüfung selbst vor dem Beginn der Behandlung mit rhTPO. 3 von den verbleibenden 4 Patientinnen zeigten eine Antikörperaktivität gegen das trunkierte Molekül. Eine c-Mpl-blockierende Aktivität wurde jedoch nur in 2 dieser Patientinnen beobachtet. Die erste dieser Patientinnen war umfangreich mit Carboplatin und Cyklophosphamid vorbehandelt und erhielt 5 Zyklen Carboplatin mit der vollen Dosis. Am Tag 22 des Zyklus-5 wurden niedrige Titer der Antikörper (optische Dichteverhältnis 1,65 die auf 1,29 innerhalb von 30 Tagen abnahmen), die an TPO banden, bemerkt. Obwohl die Antikörper eine c-Mpl-blockierende Aktivität aufwiesen deuteten die Ergebnisse des Zellproliferations-Biotestverfahrens an, daß sie nicht neutralisierend waren. Die langsame Erholung der Blutplättchen auf 100.000/mm3 (Tag 84) in dieser Patientin könnte auch auf ihre kumulative Aussetzung gegenüber Carboplatin zurückgeführt werden. Die zweite Patientin war vorher auch mit Carboplatin und Cyklophosphamid behandelt worden. Sie erhielt 6 Zyklen Carboplatin und erreichte eine komplette Remission. Am Tag 23 des Zyklus 6 wurden Antikörper, die an TPO banden (ODR, 1,51, die bis zum Tag 115 auf 1,05 abnahmen), nachgewiesen. Sie hatte eine verzögerte Blutplättchen-Erholung im Zyklus-6 und gleichzeitig dazu wurde für sie bemerkt, daß sie fünfundsechzig Tage nach der letzten Dosis des TPOs im Zyklus-6 (Blutplättchenzahl 55.000/mm3) einen positiven biologischen Zellproliferationstest aufwies. Die Blutplättchenzahl verblieb stabil für 4 weitere Wochen und erholte sich dann auf > 100.000/mm3 am Tag 99. Somit zeigten von den 7 Patienten mit Antikörpern nur 2 c-Mpl-Aktivität; die anderen 5 Patienten (umfassend 3 Patienten nur bei der Durchsuchung) hatten niedrige Titer (ODR 1,5–2,3) des Antikörpers in transienter vorübergehender Natur, der beruhend auf einer negativen c-Mpl-Blockierung sowie in einem biologischen Zellproliferations-Test nicht neutralisierend war.
  • Die Verabreichung des rhTPOs drei Wochen vor der Chemotherapie erhöhte die zirkulierenden Blutplättchenzahlen und die Knochenmarksmegakaryozyten deutlich. Die Verabreichung von rhTPO nach der Chemotherapie, verringerte sowohl den Grad als auch die Schwere der Thrombozytopenie deutlich. In den Patienten (n = 16), die die optimale biologische Dosis des rhTPOs (1,2 μg/kg) im Zyklus-2 erhielten, war der mittlere Tiefpunkt der Blutplättchenzahl höher (44.000 im Vergleich zu 20.000/mm3, P < 0,01) und die Dauer der Thrombozytopenie war kürzer (Tage < 20.000/mm3, 1 im Vergleich zu 4 Tagen; Tage < 50.000/mm3, 4 im Vergleich zu 7 Tagen, P < 0,01) als die, die im Zyklus-1 (ohne rhTPO) beobachtet wurde. Dies verringerte die Notwendigkeit von Blutplättchen-Transfusionen in dieser Gruppe von 75% in Zyklus-1 auf 25% in Zyklus-2 (P = 0,01). Darüber hinaus erholten sich die Blutplättchen von 67% aller Patienten, die mit rhTPO behandelt wurden, auf ≥ 100.000/mm3 am Tag 21 im Zyklus-2 im Vergleich zu nur 33% im Zyklus-1.
  • DISKUSSION
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß rhTPO sowohl den Grad als auch die Dauer schwerer Thrombozytopenie deutlich verringern kann. Die Notwendigkeit der Blutplättchentransfusion war, selbst im Patientinnen, die bereits eine schwere Thrombozytopenie in vorrangehenden Chemotherapiezyklen erfahren hatten, deutlich verringert. Des weiteren förderte rhTPO die Zeit bis zur Blutplättchenerholung auf ≥ 100 000 m3 wodurch die geplante Dosis der Chemotherapie beibehalten wurde.
  • In dieser Patientenpopulation erhöhte rhTPO, das als einzelne Dosis vor der Chemotherapie gegebenen wurde, die zirkulierenden Blutplättchenzahlen in einer Dosis-anhängigen Weise. Die Blutplättchenantwort stand mit einer deutlichen Erhöhung der Anzahl der morphologisch normal scheinenden Knochenmarksmegakaryozyten in Verbindung. Interessanter Weise wurden Steigerungen der erythroiden Elemente auch im Knochenmark mehrere Patienten gesehen, Übereinstimmung mit den in vitro und prä-klinischen Beobachtungen das TPO die Erythropoese ergänzen kann und mit der vorhergehenden klinischen Beobachtung des Erfinder, das rhTPO die Erythroiden und myeloiden Vorläuferzellen der Population des Knochenmarks erweitern kann (Kobayashi et al., 1995; Kauschansky et al., 1995; Vadhan-Raj et al., 1997). Trotz dieser stimulatorischen Wirkung auf mehrere Abstammungslinien des Knochenmarks wurden keine wesentlichen Veränderungen in den Zellzahlen der weißen Blutzellen oder der Hämoglobinmengen beobachtet.
  • In diesem klinischen Zusammenhang eines chemotherapeutischen Arzneimittels das üblicherweise eine kumulative Thrombozytopenie induziert verringert rhTPO sowohl die Schwere und die Dauer der Thrombozytopenie in einer Dosis-abhängigen Weise. Wären keine deutliche Wirkung bei der niedrigsten Dosierungsmenge (0,6 μg/kg) gesehen wurde erhöhte rhTPO bei den mittleren Dosierungsmengen (1,2 bis 2,4 μg/kg) die Tiefpunktblutplättchenzahl nahezu um das 2-fache und reduzierte die Dauer der schweren Thrombozytopenie um die Hälfte im Zyklus-2, in dem erwartet wurde, das es dem Patienten mindestens so schlecht wie im Zyklus-1 ohne rhTPO gehen würde. Da die biologische Wirkung des rhTPOs bei 1,2 μg/kg ein Plateau bildete wurde diese Dosis für die anschließenden Studien verwendet.
  • Ein mögliches Bedenken bei dem Dosissteigerungsteil des Versuches war, daß die rhTPO-Behandlung drei Wochen vor der Chemotherapie die hämatopoetische Erholung auf den ersten Zyklus des Carboplatins folgend beeinflussen kann und die Höhe der hämatopoetischen Toxizität des Kontrollzyklus abschwächen kann. Die Daten des Erfinders unterstützen jedoch das Fehlen irgendeiner positiven oder negativen Wirkung des TPOs das drei Wochen vor der Chemotherapie gegeben wird, beruhend auf 2 Beobachtungen. Erstens stieg der Tiefpunkt der Blutplättchen bei Erhöhung der Dosis des rhTPOs in den Zyklus vor der Chemotherapie, im Zyklus-1 nicht an, was das Fehlen einer positiven Wirkung des rhTPOs nahelegt. Zweitens erhöhte die Entfernung des rhTPO-Zyklus vor der Chemotherapie in der Dosisausweitungsphase auch nicht den Blutplättchentiefpunkte im Zyklus-1 was das Fehlen einer negativen Wirkung des rhTPOs nahelegt. Somit deuten die Befunde des Erfinders darauf hin, daß TPO das drei Woche vor der Chemotherapie gegeben wird den Tiefpunkt der Blutplättchen und die effektive Dosis die der Erfinder für die Ausweitungsphase der Studie auswählte, nicht beeinflußte.
  • Um die Blutplättchen-schützende Wirkung des rhTPOs besser zu bewerten wurde rhTPO vor der Chemotherapie in der Dosisausweitungsphase weggelassen und diesen Patientinnenkohorten wurde rhTPO (1,2 μg/kg) nur als sekundäre Prophylaxe verabreicht, um eine schwere Thrombozytopenie in den Patientinnen, die bereits eine schwere Thrombozytopenie im vorangehenden Zyklus der Chemotherapie erfahren hatten, zu verhindern. Selbst in dieser beeinträchtigten Gruppe der Patientinnen verringerte rhTPO die Schwere des Blutplättchentiefpunkts und verkürzte die Dauer der schweren Thrombozytopenie, so daß die Notwendigkeit für eine Blutplättchentransfusion bei 11 der Patientinnen, die bereits Blutplättchentransfusion in dem vorangehenden Zyklus erhalten hatten, für 7 beseitigt und für eine andere reduziert wurde.
  • Der Trend einer reduzierten Notwendigkeit für eine Blutplättchentransfusion wurde über die gesamte Studie beobachtet. In den Patientinnen, die rhTPO mit der optimalen biologische Dosis erhielten war der Anteil der Patienten, die eine Blutplättchentransfusion benötigten (75% im Vergleich zu 25%) sowie die Anzahl der vorläufigen Bluttransfusionsereignisse vom Zyklus-1 zum Zyklus-2 deutlich reduziert (um 69%). Darüber hinaus beschleunigte rhTPO die Blutplättchenerholung, so daß sich ein höherer Teil der Blutplättchen der Patientinnen auf eine Menge ≥ 100 000/mm3 nach 3 Wochen im Zyklus-2 mit rhTPO erholten als im Vergleich zum Zyklus-1 ohne rhTPO (67% im Vergleich zu 33%). Durch die Förderung der Blutplättchenerholung kann rhTPO die Verabreichung der Chemotherapie wie geplant und die Einhaltung der Dosisintensität erlauben.
  • Um die Fähigkeit von rhTPO weiter zu untersuchen wiederholte Zyklen einer Chemotherapie voller Dosis zu erlauben, wurde Patientinnen, die auf die Anti-Tumor-Therapie ansprachen, erlaubt diese für bis zu 6 Zyklen Carboplatin fortzusetzen. Trotz der erwarteten kumulativen hämatopoetische Toxizität zeigte ein Teil der Patientinnen, die Blutplättchentransfusion im vorangehenden Zyklus benötigten, weiterhin einen Vorteil im Hinblick auf verringerte Transfusionserfordernisse in den späteren Zyklen was die mögliche vorteilhafte Wirkung des rhTPOs bei Überwindung der kumulativen Thrombozytopenie demonstriert. Eine schwere Neutropenie wurde im allgemeinen mit diesem Verabreichungsschema nicht gesehen. Tatsächlich schienen sich die neutrophilen Tiefpunkte unter rhTPO-Verabreichung zu verbessern und Infektion blieben über die Studie hinweg niedrig.
  • Der Grund für den Entwurf dieser Studie beruhte auf der klinischen Erfahrung des Erfinders mit diesem Zytokin und diesem chemotherapeutischen Mittel. Carboplatin weist einen verzögerten Blutplättchentiefpunkt um den Tag 16 des Zyklus auf und rhTPO hat eine verlängerte Halbwertzeit (20 bis 30 h) mit einer verzögerten Spitzenantwort (Mittelwert Tag 12) (Vadjan-Raj et al., 1997; Bloedow et al., 1996). Daher wurden vier Dosen des rhTPOs an jedem zweiten Tag, beginnend am Tag nach der Chemotherapie verwendet. Zusätzlich wünscht es der Erfinder zu bestimmen, ob die frühere Verabreichung des rhTPOs (d. h. 2 Tage vor der Chemotherapie beginnend) den Tiefpunkt weiter verbessert. Während rhTPO eine Blutplättchenbewahrende Wirkung bei beiden Dosierungsschemata zeigte, war kein zusätzlicher Vorteil durch die frühe Verabreichung des Zytokins mit diesem chemotherapeutischen Mittel bemerkbar. Nichtsdestotrotz wird es erwogen, daß bei einer Kombinationschemotherapie, die einen früheren Blutplättchentiefpunkt erzeugt, sich ein Vorteil aus der früheren Verabreichung von rhTPO ergeben kann.
  • In der Studie des Erfinders wurde die rhTPO-Behandlung sehr gut ohne irgendwelche konstitutionellen Symptome, kardiovasculären Symptome, lokale Hautreaktion und Flüssigkeitsstau toleriert. Die Ergebnisse der klinischen Studie des Erfinders haben die Wirksamkeit von rhTPO bei der Verwendung als sekundäre Prophylaxe gegen die Carboplatin-induzierte schwere Thrombozytopenie gezeigt.
  • In dieser Patientinnenpopulation mit in erster Linie rezidivierenden Ovarial-Carcinom wurden objektive Tumorantworten in 54% der Patientinnen beobachtet. Während die Bedeutung der Platin-Dosisintensität in diesen Tumortypen bisher nicht etabliert worden ist, erlaubt es die Verfügbarkeit von rhTPO nunmehr diese Frage in einer sicheren Weise anzugehen.
  • Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen, daß rekombinantes humanes Thrombopoietin selbst in zuvor Chemotherapie-behandelten Patientenpopulation eine Erhöhung der Blutplättchenproduktion induzieren kann. Die rhTPO-Verabreichung über diesen Verabreichungsweg und Dosierungsplan war bei der Abschwächung der kumulativen Thrombozytopenie, die mit Carboplatin assoziiert ist, wirksam und linderte die Notwendigkeit von Blutplättchentransfusionen. Die Studien des Erfinders deuteten auch darauf hin, daß in Hochrisikopatienten, die bereits vorher eine Notwendigkeit von Blutplättchentransfusion erfahren hatten, die Verwendung von rhTPO als sekundäre Prophylaxe den Grad und die Dauer der Thrombozytopenie verringern kann und die Notwendigkeit von Blutplättchentransfusion in darauffolgenden Chemotherapiezyklen verhindern kann. Somit kann in klinischen Zusammenhängen, bei denen der Erhalt der Dosisintensität wichtig ist die sekundäre prophylaktische Verwendung von rhTPO es dem Patienten erlauben, von einer solchen Therapie zu profitieren.
  • BEISPIEL 11
  • VERSTÄRKTER ERHALT DER IN VITRO FUNKTIONELLEN AKTIVITÄT DER BLUTPLÄTTCHEN AUS PATIENTEN, DIE MIT REKOMBINANTEN HUMANEN THROMBOPOIETIN (rhTPO) BEHANDELT WURDEN, NACH KÄLTEKONSERVIERUNG MIT THROMBOSOL UND 2% DMSO
  • Das vorliegende Beispiel zeigt die Wirkung der ThromboSolTM Kältekonservierung von Blutplättchen, die nach der rhTPO-Behandlung aus Patienten entnommen wurden. Da eine schwe re Thrombozytopenie in Krebspatienten häufig ein kumulatives Problem bei der mehrfach Zyklus-Chemotherapie darstellt, wünscht es der Erfinder die Wirkung der langfristigen Kältekonservierung auf die in vitro Morphologie und funktionellen Charakteristika gelagerter Blutplättchen, zu bestimmen. Blutplättchen von rhTPO-behandelten Patienten (n = 23) und normalen Spendern wurden mit ThromboSolTM und 2% DMSO behandelt und für bis zu 6 Monate Kälte-konserviert. Die Blutplättchen wurden zu verschiedenen Zeitintervallen aufgetaut und auf den Erhalt der Funktionen hin getestet.
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Patientenauswahl
  • Dreiundzwanzig Patienten mit einer Diagnose von entweder Ovarialkarzinom (n = 13) oder Weichteilsarkom (n = 10), die eine Behandlung mit rhTPO als Teil einer Phase I-II klinischen Studie erhielten, wurden untersucht. Bei den Patienten mit Ovarialkrebs wurde rhTPO mit Dosierungen von 1,2 bis 3,6 μg/kg jeden zweiten Tag subkutan für 4 Dosierungen nach der Chemotherapie (Carboplatin) verabreicht. In den Sarkom-Patienten wurde rhTPO mit 1,2 μg/kg intravenös für 3 Dosen verabreicht; eine Dosis am Tag vor der Chemotherapie und 2 Dosen nach der Chemotherapie (Adriamycin und Ifosfamid). Um die Blutplättchenmorpholgie und Funktionalität der Blutplättchen (von frischen sowie von Kälte-konservierten) zu bewerten, wurden Blutplättchenprobe zu dem Zeitpunkt gewonnen an dem sich die Blutplättchen nach der Chemotherapie und die rhTPO-Behandlung, erholt hatten. Die Verwendung von Aspirin oder nicht-steriodalen anti-inflammatorische Mitteln war während des Studienzeitraums nicht erlaubt. Gleichzeitig spendeten Kontrollfreiwillige Blutproben unter den selber Kriterien wie die Patientenpopulation.
  • Materialien
  • Alle Reagenzien, die für die Lagerung der Blutplättchen verwendet wurden, wurden von Sigma Chemical (St. Louis, MO) erhalten. Die Verklumpungsagonisten Adenosindiphosphat (ADP) Collagen und Ristocetin wurden von Chrono-log Corporation (Havertown, PA) gekauft. Alle Reagenzien (Amilurid, Adinosin und Natriumnitroprusid), die die ThiomboSolTM-Aufbewahrungslösung für die Kältekonservierung ausmachen, wurden als 50-faches Konzentrat in Dimethylsulfoxid (DMSO) zubereitet. Phycoerythrin-markierter (PE) Kaninchen monoklonaler Anti-Mensch Blutplättchen P-Selektiv- und Phycoerithrin-markierter Kontrollantikörper wurden von Becton Dickenson (Cockeysville, MD) gekauft. Phycoerithrin-markierter Mäuse monoklonaler Anti-Mensch GE-Ib Antikörper wurde von Immunotech (Cedex, Frankreich) gekauft.
  • Blutplättchenisolierung und Lagerung
  • Gesamtblut (70 ml) von entweder Patienten oder Kontrollspendern wurde über Venenpunktur in Röhrchen, die ACD (Becton Dickenson, Cockeysville, MD) enthielten, entnommen. Das Gesamtblut wurde für 2–6 Stunden bei Raumtemperatur gehalten gefolgt von einer Zentrifugation von 20°C für 12 Minuten bei einer 250 × g. Das Blutplättchen-reiche Plasma (BRP) wurde dann entfernt und in T-3101 150 ml Transferverpackung (CharterMed, Lakewood, NJ) aufgeteilt (29 ml/Beutel). Ein Teil des frischen unbehandelten BRP wurde für die Bestimmung der Morphologie und der in vitro funktionellen Aktivität wie unten beschrieben, zurückbehalten. Zu der 20 ml Probe wurden die folgenden Reagenzien durch Injektion über einen sterilen Zugang hinzugefügt: 400 μl eines 50-fach Konzentrates ThromboSolTM was zu einer DMSO-Endkonzentration von 2% führte. Das sich ergebende ThromboSolTM-behandelte BRP enthielt die folgenden Endkonzentration der Reagenzien: Amilurid (0,25 mM), Adenosin (0,1 mM) und Natriumnitroprusid (50 mM). Die behandelten Blutplättchen wurden dann durch leichtes Schütteln gemischt und unmittelbar in ein –80°C Gefrierschrank in einer Aluminiumkassette eingesetzt. Aufgrund der Beschränkung der von dem Patienten erhältlichen Volumen wurden die Kälte-konservierten Probenteile zufällig der Lagerung für die angegeben Zeiten zugeordnet.
  • Nach der Lagerung wurden die Blutplättchenproben für die Analyse wie folgt geerntet: Die Blutplättchen wurden bei 37°C in einem Wasserbad aufgetaut und in einem Orbitalschüttler der auf 70 upm eingestellt war für 15 Minuten plaziert. Ein Teil wurde aus dem Beutel entfernt und auf die Zellzahl und das mittlere Blutplättchenvolumen (MBV) unter Verwendung eines Biochem Immunosystems System 9110 CP+ Hematology Analyzer (Allentown, PA) analysiert. Zusätzlich wurde eine frisch aufgetaute Probe für die FACS-Analyse fixiert und auf ihre discoide Morphologie durch Lichtmikroskopie wie folgt beschrieben (Currie et al., 1998) untersucht. Frische luftgetrocknete Abstriche von Blutplättchenproben wurden mit Wright-Giemsa gefärbt. Für die ultrastrukturelle morphologische Untersuchung von gefriergetauten Blutplättchen (Vadhan-Raj et al., 1990) wurde eine Probe bei 950 x g für 20 Minuten zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Probe wurde in 1,5 ml Fixierungspuffer (1,5% Paraformaldehyd und 1,5% Glutaraldehyd in PBS) resuspendiert und bei 4°C inkubiert. Die verbleibende Blutplättchenprobe wurde bei 800 × g 30 Minuten bei 22°C zentrifugiert, um das ThromboSolTM und das DMSO zu entfernen. Der sich ergebende Blutplättchennieder schlag wurde in dem ursprünglichen Volumen unter Verwendung von autologen Plasma resuspendiert und die Blutplättchenzellzahl wurde wie oben beschrieben bestimmt. Die Blutplättchenprobe wurde mit orthologen Plasma angepaßt, um eine Blutplättchenkonzentration von 3 × 108 Zellen/ml zu erhalten, die für 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurde.
  • Blutplättchenfunktionsstudien
  • Die funktionellen Testverfahren der Rührgestaltsänderung (SSC = "Stirring shape change"), das Ausmaß der Gestaltsänderung (ESC = "Extend of shape change"), die hypotonische Schockantwort (HSR = "Hypotonic shock response") und die Agonisten ausgelöste Verklumpung wurden wie vorher beschrieben durchgeführt (Currie et al., 1998; Holme et al., 1998). Um die Natur der Gestaltsänderung bei Blutplättchen in Antwort auf die Rührgeschwindigkeiten oder die Agonisten-induzierte Aktivierung zu bestimmen, wurden optische Messungen durchgeführt. SSC ist eine optische Messung der in der Probe vorhandenen discoiden Population. In Antwort auf die Änderung der Rührgeschwindigkeiten löst die gleichförmige Bewegung des sphärischen Blutplättchen keine optische Ablenkung aus. Im Gegensatz dazu löst die nicht gleichmäßige Bewegung discoider Blutplättchen eine optische Ablenkung aus. Die SSC wurde wie folgt durchgeführt: Unter Verwendung eines Verklumpungsmessers wurde eine Blutplättchenprobe gegenüber PPP abgeglichen und eine Grundlinie wurde bestimmt. Der Rührer wurde dann ausgeschaltet und die Ablenkung von der Grundlinie wurde als Höchstwert gemessen.
  • ESC ist eine optische Messung der morphologischen Gestaltsänderung von discoid zu sphärisch, die Blutplättchen in Antwort auf die Agonisten-induzierte Aktivierung durchlaufen. Für die ESC wurde eine 500 μl Probe in einem Verklumpungsmesser eingebracht gefolgt von dem aufeinanderfolgenden Zufügungen von 20 μl 0,1 M EDTA und 10 μl 1 mM ADP. Die ESC wurde aus der Ablenkung von der Grundlinie bestimmt und als Prozentsatz der Erhöhung der maximalen optischen Dichte ausgedrückt (Holme et al., 1998).
  • Um die Gesamtlebensfähigkeit und dem Metabolismus der Blutplättchen zu bewerten untersuchte der Erfinder die Fähigkeit der Blutplättchen auf eine hypotonische Belastung nach 15 min zu reagieren. Für die HSR wurden 500 μl Probe jeweils in zwei Küvetten aufgeteilt. 250 μl PBS wurde zu der ersten Küvette hinzugeführt, um den Anstieg der Transmission als Ergebnis der Verdünnung unter Verwendung eines Verklumpungsmessers zu messen. Der zweite Teil wurde dem Zusetzen von 250 μl Wasser unterzogen und der Prozentsatz der Erholung von dem hypotonischen Schock wurde nach 15 Minuten bestimmt.
  • Um zu bewerten, ob das Verfahren der Kältekonservierung und das Auftauen eine deutlich Aktivierung der Blutplättchen auslöste wurden frische und Kälte-konservierte Blutplättchen durch eine flußzytometrischen Analyse auf die Oberflächenexpression von P-Selektin (CD-62) und den Oberflächenmarker GP-Ib hin untersucht. Für die FACS-Analyse der Blutplättchenoberflächenmarker wurde eine Teilmenge des Blutplättchenkonzentrats (BK) in 2% Paraformaldehyd fixiert. PE-markierter Anti-P-Selektin monoklonaler Antikörper oder PE-markierte Anti-GP-Ib monoklonaler Antikörper wurde zu den gewaschenen Proben der fixierten Blutplättchen hinzugefügt und bei Raumtemperatur für eine Stunde bei Dunkelheit inkubiert. Ein entsprechender monoklonaler Kontrollantikörper wurde gleichzeitig verwendet, um die Hintergrundbindung zu bestimmen. Die Proben wurden gewaschen, verdünnt und dann unter Verwendung eines Coulter EPICS FACS-Analysators analysiert. Die Gegenwart von Blutplättchenoberflächenmarkern wurde als Prozentsatz der Zellen, die das Epitop exprimieren, ausgedrückt.
  • Um zu bestimmen, ob die Kälte-konservierten Blutplättchen dazu in der Lage waren Funktion zu vermitteln, die für die Hämostase wichtig sind, wurde die Blutplättchenverklumpung unter Verwendung verschiedener Agonisten untersucht. Die Blutplättchenprobe wurde auf Verklumpung unter Verwendung von Ristocetin (25 mg/ml) oder eine Kombination aus ADP (5 μM) und Collagen (5 μg/ml) als Agonist mit einem Verklumpungsmesser (560 VS, Chrono-Log) bewertet. Die Verklumpung wurde als die prozentuale maximale Verklumpung unter Verwendung von BRP als Grundlinie und PPP als 100% bestimmt.
  • Statistische Analyse
  • Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (S.A.) angegeben. Die Vergleich der in vitro funktionellen Aktivität zwischen frischen und Kälte-konservierten Blutplättchen von Kontrollspendern und von Patienten, die rhTPO erhielten, wurde unter Verwendung eines t-Tests durchgeführt. Der Vergleich zwischen den Patienten-Blutplättchen und den Kontroll-Blutplättchen wurde unter Verwendung eines t-Tests durchgeführt. Der Vergleich zwischen den Blutplättchen, die für eine Woche gelagert wurden, und Blutplättchen, die für 1 Monat, 3 Monate und 6 Monate gelagert wurden, wurde unter Verwendung eines t-Tests durchgeführt.
  • ERGEBNISSE
  • Blutproben von normalen Spendern oder von rhTPO-behandelten Patienten wurden auf die Blutplättchen-Morphologie und die in vitro funktionelle Aktivität sowohl vor (frisch) und nach der Kälte-Konservierung (frieren-tauen) mit ThromboSolTM und 2% DMSO für einen kurzen (1 Woche) und für einen langen (bis zu 6 Monate) Lagerungszeitraum untersucht. Die sich ergebenden morphologischen Merkmale und die funktionelle Aktivität der Blutplättchen von den Patienten und den Kontrollgruppen sowohl vor als nach der Kältekonservierung über einen kurzen Zeitraum mit ThromboSolTM und 2% DMSO sind in Tabelle 26 gezeigt.
  • Vergleich frischer Blutplättchen-Populationen
  • Frisch geerntete Blutplättchen von den Kontrollspendern und den rhTPO-behandelten Patienten wurden auf die Grundlinien Zellmorphologie und die funktionelle Aktivität hin durch eine Reihe von in vitro Testverfahren wie oben beschrieben und wie in Tabelle 26 dargestellt, untersucht. Die Blutplättchen aus beiden Quellen zeigten ähnliche Charakteristika in der Mehrzahl der Untersuchungen. Die Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten ergaben eine deutlich höhere Zellzahl vermutlich als Ergebnis der rhTPO-Behandlung. Zwei Blutplättchen-Populationen zeigten keine deutlichen Unterschiede in morphologischen Charakteristika umfassend das mittlere Blutplättchenvolumen (MBV) oder den Prozentsatz der Blutplättchen-Populationen, die einen discoide Morphologie zeigten (Tabelle 26). Die Expression des Oberflächen GP-Ib und des P-Selektins waren sowohl für die Kontrollspender- und die rhTPO-behandelte Patientenpopulationen ähnlich. Die funktionellen Aktivitäten dieser beiden Blutplättchen-Populationen zeigten keine deutlichen Unterschiede in der SSC-, HSR- oder der Ristocetin-induzierten Verklumpung (Tabelle 26). Im Vergleich zu den Zellen von Kontrollspendern zeigten die Blutplättchen von rhTPO-behandelten Patienten jedoch deutlich höhere Werte für die ESC und niedrigere ADP/Collagen-induzierte Verklumpung (Tabelle 26).
  • Frische im Vergleich zu Kälte-konservierten Blutplättchen
  • Nach der Kälte-Konservierungslagerung für 1 Woche bei –80°C mit ThromboSolTM und 2% DMSO zeigten die Blutplättchen von rhTPO-behandelten Patienten einen Erhalt der morphologischen Charakteristika ähnlich denen frischer Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten (Tabelle 26). Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede bei der Zellzahlausbeute, der MBV, dem Prozentsatz der Blutplättchen, die eine discoide Morphologie zeigten, der Ristocetin-induzierten Verklumpung oder der Expression des Oberflächenmarkers GP-Ib (Tabelle 26). Die Blutplättchen aus Kontrollspendern zeigten im Vergleich zu frischen Blutplättchen aus Kontrollspendern auch eine ähnliche Zellzahlausbeute, discoide Morphologie und die Expression von GP-Ib (Tabelle 26). Im Vergleich zu frischen Zellen aus Spenderpopulationen zeigten Kälte-konservierte Blutplättchen sowohl aus rhTPO-behandelten Patienten und normalen Spendern einen statistisch signifikanten Verlust der funktionellen Aktivität, die SSC, ESC, HSR und ADP/Collagen-induzierte Verklumpung umfaßte (Tabelle 26). Auch die P-Selectin-Expression war nach der Kälte-Konservierungslagerung der Blutplättchen aus beiden Quellen deutlich erhöht.
  • Vergleich Kälte-konservierter Blutplättchen aus Normalspendern und rhTPO-behandelten Patienten
  • Nach der kurzfristigen Kälte-Konservierungslagerung, zeigten die Blättchen aus rhTPO-behandelten Patienten eine statistisch signifikanten höheren Erhalt sowohl von morphologischen als auch von funktionellen Aktivitätsparametern im Vergleich zu Blutplättchen aus normalen Spendern (Tabelle 26). Die gefrier-getauten Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten bewahrten einen besseren Erhalt des MPVs, der discoiden Morphologie, des SSC, des ESC und der HSR im Vergleich zu den Werten für Blutplättchen von normalen Spendern (Tabelle 26). Während die ADP/Collagen-induzierte Verklumpung für Kontrollspender-Blutplättchen vor der Kälte-Konservierung höher war, zeigten zwei Zellpopulationen ähnliche Verklumpungsprofile nach der Kälte-Konservierung. Dies liegt an einem höheren Erhalt der Agonisten-induzierten Verklumpung bei Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten im Vergleich zu dem Erhalt durch die Kontrollblutplättchen (73% im Vergleich zu 60%, jeweils im Vergleich zu den Werten frischer Blutplättchen).
  • Figure 01640001
  • Langfristige Kälte-Konservierung von Blutplättchen
  • Um die Wirkung der langfristigen Kälte-Konservierungslagerung zu bewerten wurden Blutplättchenproben aus rhTPO-behandelten Patienten und normalen Spendern unter Verwendung von ThromboSolTM und 2% DMSO für 1 Woche, 1 Monat, 3 Monate und 6 Monate bei –80°C gelagert. Die Tabelle 27 zeigt die Ergebnisse der morphologischen und funktionellen Aktivität der Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten nach langfristiger Lagerung. Über eine 6-monatige Lagerungszeit zeigten die Blutplättchen keinen statistisch bedeutsamen Verlust der Morphologie oder der funktionellen Aktivität im Vergleich zu Blutplättchen, die für eine Woche Kälte-konserviert waren (Tabelle 27). Somit bewahrten die Kälte-konservierten Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten, die für 6 Monate gelagert waren, eine Zellzahl, einen Prozentsatz der discoiden und eine GP-Ib-Expression die statistisch der von Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten ähnlich war. Die Kontrollspender-Blutplättchen, die für längere Zeiträume Kälte-konserviert wurden, zeigten einen guten Erhalt der Morphologie und der funktionellen Aktivität (Tabelle 28). Nach einem 1 Monat, 3 Monat und 6 Monaten der Kälte-Konservierungslagerung in ThromboSolTM und 2% DMSO zeigten die Kontrollspender-Blutplättchen keinen statistisch bedeutsamen Verlust der Morphologie oder der funktionellen Aktivität im Vergleich zu Blutplättchen, die für 1 Woche Kälte-konserviert waren. Die eine Ausnahme war eine statistische Abnahme des HSRs nach 6 Monaten der Lagerung.
  • Figure 01660001
  • Figure 01670001
  • Morphologie Kälte-konservierter Blutplättchen durch Licht- und Elektronenmikroskopie
  • Die Morphologie Kälte-konservierter Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten erschien unter Lichtmikroskopie normal. Wright-Giemsa gefärbte, Luft-getrocknete Abstriche von frischen Blutplättchen und mit ThromboSolTM und 2% DMSO Kälte-konservierten Blutplättchen wurden verglichen. Insgesamt schien die Morphologie sowohl für frische als auch für Kälte-konservierte Blutplättchen unter dem Lichtmikroskop (1.000 × Vergrößerung) normal.
  • Die gefrier-getauten Blutplättchen aus Patientenproben wurden unter Transmissions-Elektromikroskopie untersucht, um die Bewahrung der Ultrastruktur-Morphologie nach Kälte-Konservierung zu bewerten. Elektron-Mikrogramme von Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten, die mit ThromboSolTM und 2% DMSO Kälte-konserviert wurden, wurden bewertet. Die konservierten Blutplättchen zeigten unter niedriger Energie (17.500 × Vergrößerung) ein Gemisch aus discoiden und sphärischen Formen mit intakten Membranen. Unter hoher Energie (35.000 × Vergrößerung) waren ohne weiteres zytoplasmatische Organellen, die die α-Granula, Dichte-Granula, Glykogenpartikel und das mikrotubuläre System umfaßten, ohne weiteres erkennbar. Die Blutplättchen zeigten ein Gemisch aus discoiden und sphärischen Formen. Diese Zellen zeigten größtenteils eine normale Morphologie mit einem intakten mikrotubulären System, "fuzzy coat", α-Granula und Glykogen. In einigen Blutplättchen schien das Kannalikuläresystem irgendwie erweitert, jedoch waren Ballon-Form oder Geisterzellen rar.
  • DISKUSSION
  • Der Erfinder wünschte es die Wirkung der Kälte-Konservierung mit ThromboSolTM und 2% DMSO auf Blutplättchen, die nach rhTPO-Behandlung gewonnen wurden, zu bestimmen. Die Befunde des Erfinders deuten darauf hin, daß Kälte-konservierte Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten keinen deutlichen Verlust der Zellzahl und einen 100%-igen Erhalt der discoiden Morphologie zeigten. Darüber hinaus zeigten Kälte-konservierte Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten im Vergleich zu entsprechenden frischen Zellen einen 70% oder größeren Erhalt der funktionellen Aktivität, die die SSC, die ESC und die Verklumpungs-Antwort gegenüber verschiedenen Agonisten umfaßte. Die Befunde des Erfinders deuten darauf hin, daß die Blutplättchen, die aus Patienten nach rhTPO-Behandlung gewonnen werden, mit einem guten Erhalt der Morphologie und der funktionellen Aktivität Kältekonserviert werden können.
  • Die Kälte-konservierten Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten zeigten einen deutlich größeren Erhalt der Morphologie (Größe und discoide Form) und der funktionellen Aktivitäten (SSC, ESC, HSR) im Vergleich zu Kälte-konservierten Blutplättchen aus normalen Spendern. Des weiteren gab es keinen deutlichen Verlust der morphologischen und funktionellen Charakteristika nach langfristiger Lagerung für bis zu 6 Monaten im Vergleich zu Blutplättchen, die für eine Woche Kälte-konserviert waren. Nach kurzfristiger Lagerung (1 Woche) zeigten die Kälte-konservierten Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten einen deutlich höheren Erhalt der Funktionen, die die discoide Morphologie (70% im Vergleich zu 57%), den Umfang der Formänderung (19% im Vergleich zu 13%), die Rührformänderung (15% im Vergleich zu 11%) und die hypotonische Schock-Antwort (56% im Vergleich zu 25%) umfaßte, im Vergleich zu Kälte-konservierten Blutplättchen aus Kontrollen. Es gab keinen weiteren deutlichen Verlust von Funktionen nach der Kälte-Konservierung für bis zu 6 Monate. Diese Befunde deuten darauf hin, daß Blutplättchen aus rhTPO-stimulierten Patienten besser dazu in der Lage waren, der Belastung der Aufbereitung, der Kälte-Konservierung und der Auftauprozedur zu widerstehen.
  • Zwei möglich Mechanismen können diesen Befund erklären. Zuerst fördert rhTPO die zytoplasmatische Reifung der Megakaryozyten während der es ein Anstieg der zytoplasmatischen Masse, Granularität, der Bildung intrazellulärere Organellen und des Erwerbs biochemischer Eigenschaften gibt, die essentiell für die Produktion funktioneller Blutplättchen sind. Die Ultrastruktur-Analyse von Maus-Knochenmarkskulturen, die in Gegenwart von TPO (Zucker-Franklin und Kaushansky, 1996) wachsen gelassen wurden, sowie an menschlichen Knochenmark aus Patienten, die in den klinischen Versuchen des Erfinders rhTPO erhielten, zeigte, daß TPO die volle Megakaryozytenreifung stimuliert, wie durch die Erzeugung von Blutplättchen-spezifischer Granula, von Abgrenzungsmembran und die zytoplasmatischen Fragmentation in Blutplättchen gezeigt wurde. Daher können rhTPO-abgeleitete Blutplättchen strukturell und biochemisch reifer sein. Zweitens gibt es nach der TPO-Behandlung in Mäuse und in menschlichen Studien eine Steigerung der neusynthetisierten Blutplättchen in der Zirkulation (Zucker-Franklin, 1996; Omalley et al., 1996). Die jüngeren neusynthetisierten Blutplättchen können möglicherweise besser funktionell wirken als die älteren Blutplättchen. So mit können rhTPO-abgeleitete Blutplättchen nach der Kälte-Konservierung Zellen mit einer besseren Lebensfähigkeit und funktionellen Integrität zur Verfügung stellen.
  • Der klinische Versuch des Erfinders verglich Blutplättchen-Populationen nach der Chemotherapie, die in Abwesenheit von rhTPO erzeugt wurden, nicht. Daher ist es möglich, daß ähnliche Ergebnisse mit nicht-stimulierten Blutplättchen erreicht werden könnten, die während der Erholungsphase der Chemotherapie erhalten wurden. Wichtigerweise kann jedoch die Verwendung des rhTPOs die Anzahl erhöhen und würde die Ausbeute der Blutplättchen, die für die nachfolgenden Zeiträume der Thrombozytopenie Kälte-konserviert werden könnten, um ein mehrfaches erhöhen.
  • Zusammenfassend kann die Kälte-Konservierung von Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Spendern eine nützliche neue Strategie für die autologe oder allogene Spende für eine anschließende Transfusion sein, um Behandlungs-bedingte Thrombozytopenie zu kontrollieren. Die Kälte-Konservierung der Blutplättchen aus rhTPO-stimulierten Spendern unter Verwendung von ThromboSolTM und 2% DMSO kann eine neue nützliche Strategie für die Lagerung von Blutplättchen aus autologen oder normalen Spendern zur Verfügung stellen. Zweifellos kann diese Wirksamkeit der Strategie nur erreicht werden, bei Erreichen zirkulierender lebensfähiger Blutplättchen, die dazu in der Lage sind, die kritischen Funktionen der Hämostase zu vermitteln.
  • BEISPIEL 12
  • PILOTSTUDIE DER TRANSFUSION rhTPO-ABGELEITETER AUTOLOGER BLUTPLÄTTCHEN, DIE MIT THROMBOSOL (TC) UND 2% DMSO KÄLTEKONSERVIERT WURDEN, IN PATIENTEN MIT GYNÄKOLOGISCHEN TUMOREN, DIE CARBOPLATIN ERHALTEN
  • Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren, wie man die Sicherheit und die Durchfihrbarkeit der Transfusionen rhTPO-abgeleiteter autologer Blutplättchen, die mit TC und 2% DMSO Kälte-konserviert wurden, bestimmen kann, um die Wirkung der Erholung und der funktionellen Aktivität der autolog transfundierten Blutplättchen zu bewerten und wie man die Tumorantwort auf Carboplatin bei AUC = 11 in GYN-Tumoren dokumentieren kann.
  • Der Erfinder hat gezeigt, daß die Verabreichung von 1 oder 2 Dosen rekombinanten humanen TPOs (rhTPO) bei Krebspatienten vor der Chemotherapie ein wirksamer Stimulus für eine anhaltende Blutplättchenproduktion ist. In Chemotherapie-naiven Patienten steigerte rhTPO mit 2,4 μg/kg Dosis, die als einzelne oder als zwei geteilte Dosen verabreicht wurde(n) die Blutplättchenzahlen in mehreren Patienten auf 1 Million (106/μl) oder höher. Die in Antwort auf das rhTPO erzeugten Blutplättchen zeigten eine normale Morphologie und Verklumpungsfunktion. Diese Beobachtung warf die Möglichkeit auf, daß das rhTPO an normale Spender oder Krebspatienten für die autologe Spende vor eine myelosuppressiven Therapie gegeben werden kann.
  • ThromboSol (TC) ist eine neuentwickelte Blutplättchenlagerungslösung, die aus ausgewählten sekundären Boteneffektoren besteht, die bestimmte Aktivierungswege, die Blutplättchenendogen sind, inhibieren, was zu Zellen führt, die biochemisch stabilisiert sind und gegen Kältelagerungsschäden geschützt sind (Connor et al., 1996; Currie et al., 1997). Studien haben gezeigt, daß ThromboSol-Lagerungslösung die Lagerung von Blutplättchenkonzentraten (BC) bei 4°C für 9 Tage erlaubt. Des weiteren erlaubt die Anwendung von ThromboSol zur Kältekonservierung von Blutplättchen von normalen Spendern eine einfache Behandlung, eine Verringerung des DMSO auf 2% und einen exzellenten Erhalt der Zellzahl und der in vitro funktionellen Aktivität.
  • Der Erfinder hat die Wirkung von ThromboSol-Kältekonservierung auf Blutplättchen untersucht, die aus Patienten, welche rhTPO in klinischer Phase I-II Studien erhielten, abgeleitet waren. Die Befunde des Erfinders zeigten, daß Blutplättchen aus Patienten nach rhTPO-Behandlung, wenn sie mit TC und 2% DMSO Kälte-konserviert wurden eine höhere Wiedergewinnung der funktionellen Aktivitäten, die den Erhalt der discoiden Morphologie und den Umfang der Gestaltsänderung, die hypotonische Schockantwort, die ADP/Collagen-induzierte Verklumpung und eine niedrige Expression von P-Selektin umfaßten, im Vergleich zu Kontrollblutplättchen, die mit TC und 2% DMSO oder mit 6% DMSO allein Kälte-konserviert wurden, aufwiesen. Diese Befunde deuten darauf hin, daß die Kältekonservierung der rhTPO abgeleiteten autologen oder allogenen Blutplättchen mit TC und 2% DMSO einen nützlichen Ansatz für anschließende Transfusion zur Verfügung stellen könnte, um eine Behandlungsbedingte Thrombozytopenie zu steuern.
  • Carboplatin hat ein breites Spektrum der Anti-Tumoraktivität und wird in der Behandlung von Ovarialkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Keimzelltumoren, Mesotheliom, kleinzelligen Lungenkrebs, Blasenkrebs und Kopf- und Nackenkrebs verwendet. Carboplatin ist für diese Studie ein geeignetes chemotherapeutisches Mittel aufgrund des Fehlens nicht hämatologischer Toxizitäten bei Dosen bis zu 1600 mg/m2. Seine Haupttoxizität ist die Myelosuppression insbesondere die Thrombozytopenie. Ozols et al., (Ozols et al., 1987) behandelte 30 Patienten mit rezidivierenden Ovarialkrebs mit Hochdosis Carboplatin (800 mg/m2) ohne Zytokinunterstützung. Deutliche Antworten wurden in 27% der Patienten gesehen; die Myelosuppression war die häufigste beobachtete Toxizität. Gore et al., (1987) verabreichten Dosen bis 1600 mg/m2 an Lungenkrebs- und Mesotheliom-Patienten. Relativ geringe gastrointestinale, nekrologische, und otologische Toxizitäten wurden beobachtet; es wurde jedoch eine relativ deutliche Myelosuppression gesehen.
  • Der Erfinder hat eine klinische Studie mit Patientinnen mit einem rezidivierenden gynäkologischen Tumor unter Verwendung von Carboplatin mit AUC-11 mit oder ohne rhTPO-Unterstützung abgeschlossen. Eine deutliche Tumorantwort wurde in 50% der 25 bewertbaren Patientinnen (umfassend 4 Patientinnen mit CR) in dieser Studie beobachtet. Das Auftreten der Thrombozytopenie, die eine Blutplättchentransfusion erfordert, war jedoch im Zyklus-1 ohne rhTPO hoch (10 von 12 Patienten die mit rhTPO als sekundäre Prophylaxe behandelt wurden).
  • Studienplanung
  • In dieser Studie wird der Erfinder rhTPO vor der Chemotherapie verwenden, um die Blutplättchen zu steigern, die gesammelt werden, mit TC und 2% DMSO Kälte-konserviert werden und aufgetaut werden, wenn sie für eine Transfusion benötigt werden, um eine Carboplatin-induzierte Thrombozytopenie in Patientinnen mit gynäkologischen Tumoren zu steuern. Carboplatin ist ein kommerziell erhältliches chemotherapeutisches Mittel. 20 bewertbare Patientinnen werden in dieser Studie behandelt. Wenn die Strategie der Transfusion rhTPO-abgeleiteter autologer Blutplättchen, die mit TC und 2% DMSO Kälte-konserviert wurden als sicher und wirksam befunden wird, wird ein formales klinisches Phase I-III-Protokoll erzeugt werden können. Die Daten werden gesammelt und durch die Forschungsschwester, die der Studie zugeordnet, ist in ein PDMS eingegeben. Tote, die eindeutig im Zusammenhang mit der Behandlung stehen oder unerwartete Lebensbedrohende Toxizitäten sollten unmittelbar an den Leiter der Studie berichtet werden der wiederum das Überwachungskomitee informieren muß.
  • Prä-klinische Sicherheitsstudien sind in normalen Mäusen, Rhesusaffen und Schimpansen durchgeführt worden. In prä-klinischen Studien führte die Verabreichung von TPO zu einem schnellen Anstieg der Blutplättchenzahlen um das Vielfache. In dem Mäusemodell der Mye losuppression wurde für rekombinantes Mäuse-TPO gezeigt, daß es wirksam bei der Aushebung der Thrombozytopenie in Mäusen war, die durch Carboplatin und Bestrahlung panzytopenisch gemacht worden waren. Die hauptsächlichen Sicherheitsbedenken die als Ergebnis der umfangreichen prä-klinischen Studien erhoben wurden umfaßten die Immunität und die sich daraus ergebende Thrombozytopenie.
  • Rekombinantes menschliches TPO (rhTPO) wird gegenwärtig in mehreren klinischen Phasen I-II Studien im Patienten, die sowohl myelosuppressive als auch myeloablative Chemotherapie erhalten, Untersuchungen unterzogen. Für Einzel und mehrfach I.V.-Dosierung des rhTPOs ist es gezeigt worden, daß es sicher ist und ohne Hinweis auf konstitutionelle Toxizitäten (wie Fieber, Starre oder Hypertonie). In über 300 behandelten Personen ist über 2 thrombotische Ereignisse (Tiefvenenthrombose) berichtet worden für die angenommen wurde, daß sie möglicher weise im Zusammenhang mit rhTPO stehen. Anti-TPO-Antikörper sind in 10% der I.V. rhTPO behandelten Personen beobachtet worden, die Antikörper gehen transient zurück und sind nicht neutralisierend. Bisher haben über 25 Personen durch subkutane (S.C.) Injektion erhalten und anti-TPO-Antikörper sind bei 10% dieser beobachtet worden. Möglicherweise neutralisierende Antikörper wurden in einer einzelnen Person beobachtet, die mehrere SC-Injektionen des rhTPOs über 5 Monate erhalten hatte und die eine andauernde Thrombozytopenie vor der Erholung erfuhr. Es ist unklar, ob die Thrombozytopenie durch die Gegenwart der Antikörper oder durch die kumulativen Wirkungen der myelosuppressiven Chemotherapie ausgelöst wurde.
  • Klinische Pharmakokinetik
  • Die Serum-TPO-Konzentrationen sind nach I.V.-Bolus-Injektionen des rhTPOs in Patienten mir Sarkomen oder bösartigen Neoplasmen gemessen worden. Während des Zyklus vor der Chemotherapie sind die anfänglich maximalen TPO-Konzentrationen (Cmax) proportional zur Dosis, die von 5 bis 50 ng/ml nach den 0,3 bzw. 2,4 μg/kg Dosen reichen. Dies deutet darauf hin, daß sich rhTPO in einem anfänglichen Verteilungsvolumen (60 ml/kg) ähnlich dem Plasmavolumen zu verteilen scheint. Die scheinbare endgültige Entfernungs-Halbwertzeit für TPO beträgt 20–30 h. Die Fläche unter dem TPO-Konzentrations-Zeitprofil (AUC) erhöht sich nicht-proportional mit ansteigender Dosis, was wahrscheinlich eine Dosis-abhängige Sättigung des TPO-Entfernungsprozesses widerspiegelt, von dem vermutet wird, daß er in Blutplättchen und in erster Linie durch Rezeptor-vermittelte Endozytose statt findet.
  • rhTPO-Zubereitung und -verabreichung
  • rhTPO wird von Genentech, Inc. One DNA Way, South San Francisco, CA 94080 als sterile Flüssigkeit fertig für die parenterale Verabreichung zur Verfügung gestellt. Jedes 3 ml Glasgefäß der aktiven Verbindung enthält 2 ml. rhTPO wird mit 0,1 mg/ml in gepufferter Lösung zur Verfügung gestellt. Das rhTPO wird auf Eis geliefert und muß unter Kühlung bei 2°C– 8°C (35°F–46°F) gelagert werden. Die Formulierung enthält kein Konservierungsmittel und ist nur für die Einzel-Dosis-Verabreichung geeignet. Die Aussetzung gegenüber hellem Licht sollte vermieden werden. Die Lösung sollte weder gefroren werden noch sollte sie nach ihrem auf der Ampulle aufgedruckten Haltbarkeitsdatum verwendet werden.
  • Während der Studie werden klinische Pharmazeuten oder andere zugewiesene Studienmitarbeiter die rhTPO-Injektion beruhend auf dem Gewicht der Person wie beim Grundzustand gemessen, zubereiten. Der klinische Pharmakologe wird die Studienmitarbeiter mit Spritzen des rhTPOs versorgen, die mit der Person-ID-Nummer (und jedem anderen Identifizierungsmittel), der Protokollnummer und der Menge des rhTPOs (in Mikrogramm und Millilitern) markiert sind. Die Injektion des verdünnten rhTPOs müssen innerhalb von 4 Stunden nach der Zubereitung verabreicht werden.
  • ThromboSol-Formulierung
  • Die Entwicklung von ThromboSol beruht auf den folgenden Grundsätzen. Blutplättchen zirkulieren im Körper bereit auf extrinsische Signale, die an Stellen der Gewebeverletzung erzeugt werden, zu reagieren. In Abwesenheit externer Stimuli werden zirkulierende Blutplättchen durch Faktoren, die synergistisch über spezifische sekundäre Botenwegen wirken, in einem Stadium der chronischen Inhibition gehalten. Die feine Sensitivität gegenüber einer Vielzahl von sowohl physischen und chemischen Stimuli hat es extrem schwierig gemacht, Blutplättchen außerhalb der Umgebung des Blutkreislaufsystems zu erhalten. Die endogene tonische Inhibition der Blutplättchenaktivierung wird nach dem Ernten und der Lagerung der Blutplättchen verloren. Somit kann die Lagerungsbeschädigung zum Teil durch das Fehlen der spezifischen Modulation dieser Aktivierungswege bedingt sein. Der bei der Entwicklung der ThromboSol-Formulierung verfolgte Ansatz war es die endogene Inhibition der Blutplättchenaktivierung durch die direkte Stimulierung spezifischer sekundärer Botensignalwege, die die Aktivierung verhindern, nachzuahmen und damit die Blutplättchenunempfindlichkeit gegenüber Lagerungsschäden machen. Bei der Entwicklung des ThromboSols wurde jeder Bestandteil zusammen mit verschiedenen Kombinationen auf die Fähigkeit hin untersucht, die Antwort der Blutplättchen gegenüber einer Reihe bekannter Agonisten reversibel zu inhibie ren. Die reversible Inhibition die durch diese Formulierung induziert wird reduziert wirksam die Entwicklung der Blutplättchenlagerungsschädigung, wenn Blutplättchen Kälte-konserviert werden. Das folgende ist eine kurze Beschreibung der sekundären Botensignalwege in die eingegriffen wird, um die Aktivierung der Blutplättchen während der Lagerung zu kontrollieren und der spezifischen Inhibitoren, die verwendet werden, um die Aktivierung der jeweiligen Signalwege zu unterbinden. Die Wirksamkeit dieses Reagenzes wurde durch die Fähigkeit des sekundären Boteneffektors gezeigt in vitro reversibel, die ATP- und Collageninduzierte Verklumpung zu blockieren.
  • Na+/H+-Austauscher
  • Ein funktionell wirksamer Na+-H+-Austauscher ist für die Aktivierung der Blutplättchen aufgrund seiner Fähigkeit den internen pH zu erniedrigen und C++ zu mobilisieren von dem beide zu einem Aktivierungsereignis führen, essentiell. Amilurid ist ein Inhibitor des Na+-H+-Austauschers, der wirksam und reversibel die in vitro Verklumpung von Blutplättchen blockiert.
  • Zyklisches AMP (cAMP)
  • Die Stimulation der Adenylatzyklase führt zu einer Erhöhung der endogenen zytoplasmatischen cAMP-Konzentration, die die Aktivierung der Blutplättchen inhibiert. Dieses System der Blutplättcheninhibition ist physiologisch dadurch relevant, daß der natürliche in vivo Blutplättcheneffektor, Prostazyklin, der von Endothelialzellen freigesetzt wird, die Aktivierung der zirkulierenden Blutplättchen durch die Stimulation der cAMP-Produktion blockiert. Adenosin ist ein alternatives Reagenz, das die Blutplättchen-cAMP-Mengen erhöht und reversibel die in vitro Verklumpung von Blutplättchen inhibiert.
  • Zyklisches GMP (cGMP)
  • Ähnlich zu dem cAMP-System inhibiert die Stimulation der Guanylatzyklase, die zu einer erhöhten zytoplasmatischen Konzentration des cGMP führt, den Aktivierungssignalweg in Blutplättchen. cGMP wirkt über den selben Signalweg wie die physiologisch induzierten Effekte des endothelial abgeleiteten Entspannungsfaktors ("Relaxation Factor"). Das Reagenz Natriumnitroprussid (NP), das erhöhtes cGMP in Blutplättchen erzeugt, behindert reversibel die Agonisten-induzierte Verklumpung.
  • Der Beweis für die Überlegenheit der ThromboSol-behandelten BZ im Vergleich zu Kontrolle BZ wurde durch eine Reihe von in vitro Testsystemen festgestellt, die routinemäßig im Blutplättchenbereich verwendet werden, um die Blutplättchenfunktion zu bestimmen. Das Erste war die Wiedergewinnung der Zellzahl, in dem die Zellzahl nach dem Gefrier/Tauzyklus, unter Verwendung eines Hämatologie Analyzers bestimmt wird und mit dem Wert für frische Blutplättchen verglichen wird. Das Zweite war die discoide Morphologie, in dem die Blutplättchen auf den Erhalt der discoiden Morphologie hin durch Lichtmikroskopie untersucht werden. 100 Zellen werden unter Verwendung eine 40x Linse beobachted und der Prozentsatz der Population, die eine discoide Form zeigen, wird bestimmt. Das Dritte war das Ausmaß der Gestaltsänderung (ESC). Die ESC ist eine Messung der Formänderung von discoid zu sphärisch, die Blutplättchen in Antwort auf die Stimulation durch einen Agonisten erfahren und die ESC ist ein Maß des Erhalts der Blutplättchenaktivierungsfunktion. Das Vierte war die hypotonische Schockantwort (HSR). Die HSR ist ein Maß der Fähigkeit von Blutplättchen in Antwort auf das Hinzufügen einer hypotonischen Lösung ein Gleichgeweicht wieder herzustellen. Die HSR ist eine Bestimmung der Blutplättchenlebensfähigkeit und wird von 0–100% bewertet. Das Fünfte ist die FACS-Analyse der Blutplättchenmembranoberflächenmarker. FACS wird verwendet, um den Prozentsatz der Blutplättchen in einer Population zu bestimmen, die spezifische Blutplättchenproteinepitope exprimieren. Die gemessenen Blutplättchenmarker sind GP-Ib, das ein positiver Marker ist, der auf allen Blutplättchen vorhanden ist und CD62 (P-Selektin), das ein Aktivierungsmarker ist. Der Verlust von GP-Ib ist ein Hinweis auf die Beschädigung der Blutplättchenplasmamembran. Im Gegensatz dazu ist die Oberflächenexposition von CD62 ein Hinweis auf die spontane Aktivierung da seine Exposition das Ergebnis einer durch die Aktivierung induzierten Degranulation ist.
  • Die Tabelle 29 zeigt die Ergebnisse dieser funktionellen Testverfahren mit Blutplättchen aus normalen Spendern, Kälte-konserviert mit 6% DMSO allein oder mit ThromboSol mit 2% DMSO.
  • Figure 01760001
  • Figure 01770001
  • Diese Befunde zeigen, daß das ThromboSol-Stabilisierungssystem zu einer hervorragenden Wiedergewinnung der Zellzahl führt und darüber hinaus ist die Wiedergewinnung der funktionellen Aktivität für ThromboSol-behandelte Blutplättchen deutlich höher als für Blutplättchen die mit 6% DMSO Kälte-konserviert wurden.
  • Die Ergebnisse der Entwicklung der sekundären Botenformulierung, um die Lagerungsschadenereignisse zu beseitigen zeigen klar, daß ThromboSol dazu in der Lage ist Blutplättchen unter Lagerungsbedingungen, die typischer Weise zur Schädigung der Zellen und zum Verlust der funktionellen Aktivität führt, schützt. Die Entwicklung einer ThromboSol-Lösung für die Kältekonservierung wird die Lagerung der Blutplättchen bei –80°C, einer Temperatur die einfach mit üblichen Gefrierschränken erhalten werden kann, zu erlauben. Des weiteren könnte die Verringerung der DMSO-Konzentration oder der Ersatz des DMSOs durch ein alternatives, nicht toxisches Kältekonservierungsmittel, das bereits für die menschliche Verwendung zugelassen ist die direkte Transfusion der gelagerten Einheiten erlauben, wodurch der Waschschritt beseitigt würde. Die Beseitigung des Waschverfahrens würde eine verlängerte Lagerung nach dem Auftauprozess erlauben. Die Ergebnisse der verlängerten Lagerung nach dem Tauen, wäre die Fähigkeit Kälte-konservierte Einheiten zu Lagern und zu versenden. Die Fähigkeiten langfristige Lagerung für Blutplättchen zur Verfügung zu stellen mit einer Nachauftaupopulation von Zellen, die Charakteristika zeigen die denen frischer Blutplättchen ähnlich sind würde viele der Versorgungsprobleme der Blutbanklagerhaltung lösen.
  • Patienteneinschlußkriterien
  • Um in diese Studie aufgenommen zu werden müssen die Patienten die folgenden Kriterien erfüllen. Die Patientinnen sollten einen gynäkologischen Tumor aufweisen für den die Behandlung mit Carboplatin induziert ist. Das Alter der Patientinnen sollte ≥ 15 Jahre betragen (ein Alter von 13 oder weniger als 15, nach Ermessen des Erfinders). Adäquate hämatologische (ANC ≥ 1500/mm3, Blutplättchenzahl ≥ 150 000/mm3 und Hb ≤ 10 gm/dl) Nieren- (Serum Cr ≥ 1,5) und Leberfunktionen (Gesamtbilirubin ≥ 1,5, SGPT oder SCOT ≥ 3 × normal) müssen nachgewiesen sein. Die Lebenserwartung sollte ≥ 3 Monate betragen und der Karnofsky-Leistungsstatus sollte ≥ 80 sein. Die Patienten sollten eine Einwilligungserklärung unterschrieben haben. Die Patienten sollten in dem von der FDA geforderten Infektionskrankheitstest für Blutspender nicht reaktiv sein.
  • Patientenausschlußkriterien
  • Die Patientinnen sollten aus den folgenden Gründen ausgeschlossen werden. Die Patientinnen weisen eine rasch fortschreitende Erkrankung auf. Die Patientinnen sind schwangere oder stillende Frauen. Die Patientinnen weisen einen co-morbiden Zustand auf, der dazu führt, daß die Patientinnen ein hohes Risiko für Behandlungskomplikationen aufweisen. Die Patientinnen haben eine Kranken von ZNS-Metastasen. Die Patientinnen haben deutliche Herzerkrankungen (NYHA Klasse III oder IV) oder Disarrythmien oder eine aktuelle Kranken von Herzinfarkt oder Ischämie, einen transienten ischämischen Anfall oder CVA innerhalb von 6 Monaten vor Studieneintritt. Die Patienten haben vorher Chemotherapie, Immuntherapie, irgendeinen experimentellen Arzneistoff innerhalb von 4 Wochen genommen, verwenden Myeloide (G-CSF oder GM-CSF) Wachstumsfaktoren innerhalb von 2 Wochen oder Erythropoetin innerhalb von 4 Wochen. Die Patienten haben Nitrosoharnstoff (BCNU, CCNU) oder Mitomycin-C innerhalb von 6 Wochen verwendet. Die Patienten haben vorher eine Operation oder RT innerhalb von 2 Wochen vor dem Studieneintritt gehabt. Die Patienten haben eine vorherige Kranken der Beckenbestrahlung. Die Patienten haben eine Kranken vorheriger Hochdosis-Chemotherapie mit Stammzelltransplantat oder eine fortgesetzter Thrombozytopenie (≥ 2 Wochen). Die Patienten haben eine Kranken der Leukämie. Die Patienten haben eine Kranken einer beliebigen Blutplättchenerkrankung, die ITP, TTP oder Blutungsstörungen umfassen. Die Patienten haben eine Kranken von > 3 Chemotherapieanwendungen (alle Platinanwendungen werden als eine Anwendung gezählt). Die Patienten haben keine Antwort auf eine auf Platin-beruhende Therapie gezeigt.
  • Behandlungsplan
  • Alle Patienten werden in den Patientendatenmanagementsystem (PDMS) registriert. Die Patienten werden zufällig zu Gruppe A (n = 10) oder Gruppe B (n = 10) zugeordnet.
  • Die Phase vor der Chemotherapie:
  • Alle Patienten werden rhTPO-Apherese der Blutplättchen in der Phase vor der Chemotherapie wie folgt erhalten: Erstens, rhTPO wird mit 1,2 μg/kg I.V. × 2 Dosen (Tage 1 und 4) verabreicht. Zweitens, mit der Blutplättchenapherese wird vom 12. Tag an beginnend oder wenn die Blutplättchenzahl eine Menge von ≥ 750 000/mm3 (was auch immer zuerst kommt) begonnen werden. Die Apherese kann für ein Maximum von 4 Tagen wiederholt werden, um 250 Einheiten Blutplättchen (~ 30 × 1011 Blutplättchen) zu sammeln. Die sterile ThromboSol-DMSO-Lösung wird zu dem Blutplättchenkonzentrat hinzugefügt und gemischt, um eine homogene Verteilung des ThromoboSols/DMSO in den Blutplättchen herzustellen. Die endgültige DMSO-Konzentration wird 2 Volumenprozent betragen. Drittens, die Blutplättchen werden in der ThromboSol-Lagerungslösung in 5 Blutplättchen-Lagerungsbeutel aufgeteilt, jeder mit ungefähr 6 × 1011 Blutplättchen. Die Blutplättchenbeutel werden in Gefrierkassetten eingebracht und direkt in einen Standard –80°C Tiefkühlschrank eingebracht.
  • Viertens, wenn für die Transfusion erforderlich, werden die Tiefkühlkassetten aus dem Tiefkühlschrank entfernt und die behandelten Plättchen werden direkt in 37°C Wasserbad eingebracht, bis die Einheit vollständig getaut ist. Die aufgetaute Blutplättchenprobe wird in einem Schüttler plaziert und für 30 Minuten bei 20°C rotiert, um eine Erholung zu erlauben. Fünftens, wird die Blutplättchen-Einheit durch Zentrifugation bei 950 × g für 20 Minuten gewaschen, um ThromboSol und DMSO zu entfernen. Die Blutplättchen werden in autologen Plasma resuspendiert. Sechstens, wird eine 2 ml Teilmenge für die in vitro Untersuchung entfernt. Diese Blutplättchenprobe wird auf den Erhalt der funktionellen Aktivität, wie beschrieben, hin untersucht (% discoide Morphologie, ESC, HSR). Diese Tests werden durch die LifeCell Corporation durchgeführt. Siebtens, wird in ausgewählten Patienten (für das erste autologe Transfusionsereignis) eine Teilmenge der ThromboSol-behandelten Kälte-konservierten Blutplättchen mit 111In gemäß Standard-Verfahren radiomarkiert. Nach der Markierung werden die Blutplättchenproben zweimal durch Zentrifugation mit Thyrodes-Puffer (pH = 7,2) gewaschen und schließlich im Originalvolumen mit autologen Plasma resuspendiert. Die spezifische Aktivität der radioaktiv-markierten Blutplättchen wird für die Probe bestimmt wer den. Eine fertige Blutplättchenprobe wird 30 μCi des 111In enthalten. Die radioaktiv-markierte Probe der Blutplättchen wird mit den nicht-markierten Blutplättchen gemischt werden. Leichte Bewegung wird eingesetzt werden, um das komplette Mischen der zwei Blutplättchen-Population zu erlauben.
  • Achtens, die Blutplättchen werden in den Patienten reinfimdiert. Neuntens, nach der Infusion wird den Patienten, die an der Blutplättchen-Überlebensstudie teilnehmen, eine 10 ml Blutprobe in ein Vakutainer-Röhrchen nach 2 und 24 h nach der Infusion und 2, 4, 6 und 10 Tagen nach der Transfusion entnommen werden. Eine Probe der infundierten Blutplättchen-Population wird zurückbehalten werden, um über die Gamma-Zählung den Erhalt der radioaktiv markierten Blutplättchen zu analysieren. Eine Teilmenge des Gesamtbluts wird gezählt werden und eine Probe wird bei 400 × g für 12 Minuten zentrifugiert werden, um eine Blutplättchen-reiche Plasmafraktion zu erzeugen. Das BRP wird auf Radioaktivität des Isotops in der Blutplättchenfraktion hin gemessen. Schließlich wird eine Blutplättchen-arme Plasmafraktion durch Zentrifugation bei 950 × g für 22 Minuten erzeugt werden und das gesamt 111In, das in dem Plasma verbleibt, wird. Die anfängliche Entfernungsraten und die Halbwertzeit im Blutkreislauf wird, durch Vergleich der initiierten Dosis mit den radioaktiv markierten Blutplättchen, die zu den verschiedenen Zeitpunkten erhalten werden, bestimmt werden, bestimmt werden. Die Berechnung der Prozente der Wiedergewinnung nach der Transfusion und des Überlebens wird unter Verwendung einer mehrfach Treffer-Analyse nach Korrektur für die Plasmaaktivität, wie vorher beschrieben, durchgeführt werden. Unter Verwendung von Computerprogrammen wird die durchschnittliche numerische Lebensspanne und die verbleibende Lebensspanne berechnet werden. Zehntens, Blutplättchenzählungen nach der Transfusion werden zu 10 min–1 h und 18–24 h Zeitpunkten durchgeführt werden.
  • Chemotherapie-Zyklen
  • Alle Patienten werden Carboplatin mit einer Dosis erhalten, die unter Verwendung der Calvert's-Formel mit AUC von 11 berechnet wurde. Die Zyklen der Chemotherapie werden alle drei Wochen nach Erholung der Blutzahlen wiederholt. Der erste Zyklus der Chemotherapie wird 3 Wochen nach der ersten Dosis des rhTPOs beginnen.
  • Blutplättchentransfusionen
  • Alle Patienten werden wie folgt mit Blutplättchen transfundiert werden, wenn der Tiefpunkt der Blutplättchenzahl < 15.000/mm3 beträgt:
  • Gruppe A:
    • Zyklus-1: Allogene Einzelspender-Blutplättchen
    • Zyklus-2: Autologe Kälte-konservierte Blutplättchen
  • Gruppe B:
    • Zyklus-1: Autologe Kälte-konservierte Blutplättchen
    • Zyklus-2: Allogene Einzelspender-Blutplättchen
  • Jede Anstrengung wird unternommen, um Alogene Einzelspender-Blutplättchen im Zyklus-1 (Gruppe A) und Zyklus-2 (Gruppe B) zu transfundieren. Wenn jedoch Einzelspender-Blutplättchen nicht erhältlich sind, werden ungefähr gleiche Einheiten von Zufallsspender-Blutplättchen (10 Einheiten) transfundiert werden. Die autologen Blutplättchen, wenn verwendet (Zyklus-2 für Gruppe A und Zyklus-1 für die Gruppe B) werden etwa auch eine gleiche Anzahl von Blutplättchen enthalten (10 Einheiten).
  • Alle Patienten mit mindestens einer stabilen oder ansprechenden Erkrankung können mit bis zu 6 Gesamtzyklen Carboplatin fortfahren. Während der Zyklen 3–6 werden alle Patienten (Gruppe A und B) mit autologen Kälte-konservierten Blutplättchen während der Thrombozytopenie transfundiert, solange sie erhältlich sind.
  • Bewertung vor der Behandlung
  • Die Patienten werden eine Untersuchung der gesamten Anamnese und eine physische Untersuchung mit einer Messungen des Tumors erfahren. Laborstudien werden CBC umfassen mit differentiellen und Blutplättchenzahlen, Serumchemie, Serumschwangerschaftstest (wenn anwendbar), Urinanalyse, Anti-TPO-Antikörpermenge, Blutbank-Überprüfungstests nach Infektionserkrankungen. Bruströntgenaufnahme, EKG, und andere radiologische Studien für Tumormessungen werden aufgenommen werden.
  • Bewertung während der Studie
  • Die Personen werden während sie an der Studie teilnehmen eng auf Sicherheit, physische Befunde und die Tumorantwort hin überprüft. Die Personen werden bei jeder Untersuchung während der Studie und während der Nachuntersuchungsperiode auf Nebenwirkungen hin untersucht. Die Vitalzeichen werden bei jeder Untersuchung sowie vor und nach jeder rhTPO-Verabreichung gemessen. Zusätzlich werden Laborbewertungen wie folgt durchgeführt. Zuerst wird CBC differentiell und Blutplättchenzahlen mindestens drei mal pro Woche überprüft. Zusätzlich werden täglich Blutplättchenzählungen durchgeführt, wenn die Blutplättchenzahlen < 50.000/mm3 sind. Zweitens werden nach der Blutplättchentransfusion 1 h und 24 h nach der Transfusion die Blutplättchenzahl überprüft. Drittens, wird die Serum-Chemie und der Anti-TPO-Antikörper vor jedem Zyklus der Chemotherapie überprüft. Viertens wird in 5 Patienten, die bereit sind in der Blutplättchen-Überlebensstudie teilzunehmen, Blut entnommen und beschrieben werden. Fünftens werden in ausgewählten Patienten die Blutplättchen-Funktionen (ex vivo) 24 h nach der Transfusion von allogenen und autologen Blutplättchen getestet werden.
  • Kriterien für die Bewertung
  • Sicherheitsbewertung
  • Die Patienten werden eng wie oben beschrieben auf die Sicherheit überwacht. Die Patienten werden auf Nebenwirkungen, die im Zusammenhang mit der Erkrankung sowie den Blutplättchentransfusionen stehen, bei jeder Untersuchung während des Studienzeitraums sowie im Nachuntersuchungszeitraum bewertet.
  • Wirksamkeit der Transfusion
  • Das primäre Maß der Wirksamkeit der Blutplättchentransfusionen wäre das Inkrement der Blutplättchenzahlen bei 1 h und 24 h nach der Transfusion, wie durch das korrigierte Zählinkrement (KZI) gemäß der folgenden Formel gemessen:
  • Figure 01820001
  • In ausgewählten Patienten (~ 5 Patienten) werden 111In markierte Blutplättchen-Überlebensstudien nach autologer sowie allogener Blutplättchentransfusion durchgeführt und die prozentuale Wiedergewinnung und das Überleben nach der Transfusion wird wie oben beschrieben berechnet werden. In ausgewählten Patienten (~ 5 Patienten) wird die Matrizen-Blutungszeit nach der Transfusion autologer und allogener Blutplättchen durchgeführt werden, um die Korrektur der Blutungszeit, die mit niedrigen Blutplättchenzahlen assoziiert ist, zu bewerten.
  • Tumorantwort
  • Standardantwortkriterien für gynäkologischer Tumore werden verwendet werden.
  • Kriterien für den Abbruch der Therapie
  • Standardantwortkriterien für gynäkologische Tumore werden verwendet werden. Die Therapie wird abgebrochen, wenn es eine fortschreitende Erkrankung nach einer anfänglichen Antwort oder Versagen nach einem Minimum von zwei Runden der Therapie gibt, unannehmbare Toxizitäten, die als unvorhersagbar, irreversibel oder nicht-hämatologische Toxizität des Grades 4 definiert wird, Nicht-Befolgung durch Patienten der Protokollerfordernisse oder Verweigerung der Patienten, das Protokoll fortzusetzen.
  • Statistische Erwägungen
  • Dies ist eine klinische Pilotstudie, um die Sicherheit und Durchführbarkeit der Transfusion rhTPO-stimulierter autologer Blutplättchen, die mit ThromboSol und 2% DMSO Kältekonserviert werden, zu bewerten. Im Hinblick auf den Pilotcharakter dieser Studie und die kleine Stichprobe wird eine einfache deskriptive Statistik am Abschluß der klinischen Studie erstellt werden. Die Morphologie, Zellgewinnung und die funktionelle Aktivität der gefriergetauten Blutplättchen wird bewertet werden. Die Blutplättcheninkremente (1 h und 24 h nach der Transfusion), die für die Kälte-konservierten autologen Blutplättchen und für frische allogene Einzelspender-Blutplättchen beobachtet werden, werden nach der Zykluszahl tabellarisch aufgenommen. Gleichermaßen werden die anderen Maßzahlen des Blutplättchüberlebens (d. h. 111In-markierte Blutplättchenstudien) und die Blutplättchenfunktion (d. h. Korrektur der Matrix-Blutungszeit) nach dem Zyklus, der autologe Kälte-konservierte und der allogene frische Blutplättchen verwendet, tabuliert werden. Die aus dieser klinischen Studie erzeugten Daten werden dabei helfen, zukünftige formelle klinische Phase-II-III-Studien zu konzipieren, wenn diese Strategie als sicher und wirksam befunden wird.
  • BEISPIEL 13
  • KÄLTE-KONSERVIERUNG VON BLUTPLÄTTCHEN AUS SPENDERN, DIE MIT REKOMBINANTEN HUMANEN THROMBOPOIETIN BEHANDELT WURDEN, UNTER VERWENDUNG VON THROMBOSOLTM UND 2% DMSO
  • Studienplanung
  • Die Blutplättchen wurden aus rhTPO-behandelten Patienten nach der Chemotherapie isoliert. ThromboSol und DMSO (2% Endkonzentration) wurden zu den BRP hinzugefügt und die Blutplättchen wurden in einem –80°C Gefrierschrank eingefroren. Die Blutplättchen wurden nach 48 h aufgetaut und auf ihre in vitro funktionelle Aktivität hin untersucht.
  • Ergebnisse
  • Die Tabelle 30 zeigt die funktionellen Parameter der mit ThromboSol und 2% DMSO Kältekonservierten Blutplättchen (Durchschnitt +/– Standardabweichung).
  • Figure 01840001
  • Schlußfolgerungen
  • rhTPO-stimulierte Blutplättchen, die mit ThromboSol und 2% DMSO Kälte-konserviert wurden, bewahren eine exzellente Zellzahl und funktionelle Aktivität und stellen möglicherweise eine tragfähiges Verfahren für die Lagerung autologer Blutplättchen dar.
  • BEISPIEL 14
  • VERSTÄRKTER ERHALT DER IN VITRO FUNKTIONELLEN AKTIVITÄT VON rhTPO-INDUZIERTEN BLUTPLÄTTCHEN NACH KÄLTE-KONSERVIERUNG MIT THROMBOSOLTM UND 2% DMSO
  • Die Fähigkeit rhTPO-stimulierte Blutplättchen Kälte-zu-konservieren würde die Verwendung autologer Blutplättchen während der Thrombozytopenie nach der Chemotherapie ermögli chen. Unglücklicherweise verwenden die gegenwärtig zugelassenen Verfahren für die Blutplättchen-Kälte-Konservierung 5 oder 6% DMSO, sind arbeitsintensiv und führen zu einem Verlust der Zellzahl und der funktionellen Aktivität. ThromboSol ist eine Blutplättchenstabilisierende Lösung, die aus Effektoren sekundärer Botenstoffe zusammengesetzt ist, die spezifische Aktivierungs-Signalwege inhibieren, die Blutplättchen endogen sind. Vorhergehende Daten haben gezeigt, daß die Anwendung von ThromboSol für die Kälte-Konservierung von Blutplättchen eine einfache Bearbeitung, eine Verringerung des DMSOs auf 2% und eine exzellente Bewahrung der Nachauftau-Zellzahl und der funktionellen Aktivität erlaubte. Diese Studie untersucht die Wirkung der ThromboSol-Kälte-Konservierung auf Blutplättchen, die aus Patienten nach rhTPO-Behandlung entnommen wurden. BRP, das aus rhTPO-behandelten Patienten oder Kontrollfreiwilligen isoliert wurde, wurde auf seine funktionelle Blutplättchenaktivität in vitro hin getestet. Die Proben wurden dann mit ThromboSol und 2% DMSO behandelt und direkt in einen –80°C Gefrierschrank eingebracht. Nach der Lagerung wurden die Blutplättchen aufgetaut und auf den Erhalt der funktionellen Blutplättchenaktivität in vitro hin getestet. Die Tabelle 31 zeigt die Ergebnisse, die für Blutplättchen aus 10 TPO-behandelten Patienten nach der Chemotherapie und von gesunden Freiwilligen vor und nach der Kälte-Konservierung erhalten wurden.
  • Figure 01850001
  • Figure 01860001
  • Sowohl die rhTPO-induzierten als auch die Kontroll-Blutplättchen zeigten in vitro ein ähnliche funktionelle Aktivität wie frische Zellen, wenn sie getestet wurden. Nach der Kälte-Konservierung mit ThromboSol und 2% DMSO zeigten Blutplättchen aus rhTPO-behandelten Patienten einen höheren Erhalt vieler funktionellen Aktivitäten in vitro und schienen mit Licht und Ultrastruktur-Morphologie insgesamt morphologisch normal. Des weiteren deuten vorläufige Daten darauf hin, daß die rhTPO-stimulierten Blutplättchen dieses hohe Niveau der funktionellen Aktivität in vitro während der Lagerung bei Kälte-Konservierung bewahren. Die Verwendung von ThromboSol und 2% DMSO stellt daher ein möglicherweise nützliches Verfahren für die Kälte-Konservierung autologer rhTPO-induzierter Blutplättchen für die Transfusion nach der Chemotherapie dar.
  • Alle hierin offenbarten und beanspruchten Verfahren können im Lichte der vorliegenden Offenbarung ohne unangemessenes Experimentieren gemacht und ausgeführt werden.
  • LITERATURVERZEICHNIS
  • Die folgenden Referenzen werden, insoweit sie beispielhafte Verfahren oder andere Details zur Verfügung stellen, die ergänzend zu den hierin dargestellten sind, spezifisch durch Verweis hierin aufgenommen.
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    Figure 01980001
  • Figure 01990001
  • Figure 02000001
  • Figure 02010001

Claims (24)

  1. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend TPO (Thrombopoietin) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Menschen, der eine Thrombozytopenie oder ein Risiko dafür aufweist, wobei die Behandlung die Schritte umfaßt von: (a) Verabreichung eines Mittels an einen Menschen, das frühe-Nadir Thrombozytopenie verursachen kann; und (b) Verabreichung einer oder mehrerer vorbereitender Dosen einer Zusammensetzung umfassend TPO an den Menschen, vor der Verabreichung des Mittels.
  2. Verwendung nach Anspruch 1 einer Zusammensetzung umfassend TPO zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Menschen, der eine Thrombozytopenie oder ein Risiko dafür aufweist, wobei die Behandlung die Schritte umfaßt von: a) Verabreichen eines Mittels an einen Menschen, daß eine frühe-nadir Thrombozytopenie verursachen kann; und b) Verabreichen einer oder mehrerer vorbereitender Dosen der Zusammensetzung umfassend TPO, vor der Verabreichung des Mittels an den Menschen; und c) Verabreichung einer oder mehrerer Anschluß-Dosen einer TPO Zusammensetzung nach Verabreichung des Mittels an den Menschen.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei mindestens zwei vorbereitende-Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht werden müssen, bevorzugterweise mindestens drei vorbereitende Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht werden müssen, bevorzugterweise mindestens vier vorbereitende Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht werden müssen, bevorzugterweise mindestens fünf vorbereitende Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht werden müssen, bevorzugterweise mindestens sechs vorbereitende Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht werden müssen.
  4. Verwendung nach Anspruch 2, wobei mindestens zwei Anschluß-Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht werden müssen, bevorzugterweise mindestens drei Anschluß-Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht werden müssen, bevorzugterweise mindestens vier Anschluß-Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht werden müssen, bevorzugterweise mindestens fünf Anschluß-Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht werden müssen, bevorzugterweise mindestens sechs Anschluß-Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht werden müssen.
  5. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die vorbereitenden oder Anschluß-Dosis anders als täglich verabreicht werden müssen.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei bis zu sechs vorbereitende Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht werden müssen.
  7. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die vorbereitenden Dosen anders als täglich verabreicht werden müssen.
  8. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Nadir des Mittels von ungefähr bis ungefähr 14 Tage ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Mittel Ifosfamid, Adriamycin oder eine Kombination davon ist.
  10. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel über eine Zeitdauer von ungefähr 3 bis ungefähr 5 Tage verabreicht werden muß.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Mittel Ifosfamid, Adriamycin oder eine Kombination davon ist.
  12. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend TPO zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Menschen, der Thrombozytopenie oder ein Risiko dafür aufweist, wobei die Behandlung die Schritte umfaßt von: (a) Verabreichung eines Mittels an einen Menschen, das Thrombozytopenie verursachen kann; und (b) Verabreichung an den Menschen von zwei oder mehr Anschluß-Dosen einer Zusammensetzung umfassend TPO nach Verabreichung des Mittels, wobei die Anschluß-Dosen anders als täglich verabreicht werden.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei bis zu 15 Anschluß-Dosen der TPO-Zusammensetzung verabreicht werden müssen.
  14. Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Nadir des Mittels von ungefähr 12 bis ungefähr 25 Tage ist.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Nadir des Mittels von ungefähr 15 bis ungefähr 18 Tage ist.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Mittel Carboplatin ist.
  17. Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Mittel über eine Zeitdauer von ungefähr 1 bis ungefähr 5 Tage zu verabreichen ist.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Mittel über eine Zeitdauer von ungefähr 1 bis ungefähr 2 Tage zu verabreichen ist.
  19. Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das Mittel Carboplatin ist.
  20. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend TPO zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Menschen, der Thrombozytopenie aufweist, wobei die Zusammensetzung, die TPO umfaßt, an einen Menschen in einer oder mehreren Dosen der Zusammensetzung, die TPO umfaßt, verabreicht wird, wobei die Dosen anders als täglich verabreicht werden müssen.
  21. Verwendung nach Anspruch 7, 20 oder 24, wobei die Dosen jeden zweiten Tag verabreicht werden müssen.
  22. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Thrombozytopenie verursacht wird durch Myelodysplasie, aplastische Anämie, vererbte Thromobzytopenie, Immunthrombozytopenie, erworbene Thrombozytopenie, Lebererkrankung, bakterielle Infektionen, virale Infektionen oder eine Kombination davon.
  23. Verwendung nach Anspruch 12 von TPO bei der Herstellung eines Medikaments, das an einen Menschen ein oder mehrere Male von ungefähr 10 bis ungefähr 8 Tage vor oder ungefähr 16 bis ungefähr 21 Tage nach Verabreichung eines Mittels, das Thrombozytopenie verursacht, verabreicht werden muß.
  24. Verwendung nach Anspruch 12 von TPO bei der Herstellung eines Medikaments, das an einen Menschen ein oder mehrere Male von ungefähr 10 bis ungefähr 2 Tage vor der Verabreichung eines Mittels, das Thrombozytopenie verursachen kann, und ein oder mehrere Male bis zu 21 Tage nach solch einer Verabreichung eines Mittels verabreicht werden muß.
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