JPH06500558A - 組み換えコロニー刺激因子―１の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組み換えコロニー刺激因子−１の使用 本発明は、組み換え的に生産されたコロニー刺激因子−１（Ｃ３Ｆ−１）の種々 の治療的使用に関する。

マクロファージおよび／または顆粒球への骨髄の先祖細胞の成長および発育を刺 激する種々の組織の中で非常に低い濃度で生産される種々の因子の能力は、はぼ １５年間知られてきている。ある数の種からの血清、尿の試料、および組織の抽 出物の中のこのような因子の存在は、半固体の培地の中でプレートした骨髄細胞 によりコロニー形成の刺激を測定するｉｎ　ｖｉｔｒｏのアッセイを使用して証 明することができる。許容されうるｉｎ　ｖｉｖｏのアッセイは存在しない。こ れらの因子はこのようなコロニーの形成を誘発するので、集合的にコロニー刺激 因子（Ｃ３Ｆ）と呼ばれてきている。

より最近、生ずるコロニーの中に見いだされる細胞の型に従い定義てきるヒトＣ ＳＦのタンパク質の少なくとも４つのサブクラスが存在することが示された。１ つのサブクラスのＣ５Ｆ−１は、主としてマクロファージを含有するコロニーを 生ずる。他のサブクラスは、好中球の顆粒球およびマクロファージの両者を含有 するコロニー（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）　；主として好中球の顆粒球を含有するコロニー （Ｇ−Ｃ３Ｆ）　；並びに好中球および好酸球の顆粒球、マクロファージ、およ び他の骨髄様細胞の型（好塩基球、赤血球および巨核球）を含有する（［Ｌ−３ ）コロニーを生産する。

ＧＭ−Ｃ３ＦはＧｏｕｇｈ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８４）　３０９　：　７ ６３−７６７に記載されている。このタンパク質はさらに、ＷＯ３７１０２０６ ０，１９８７年４月９日公開に、伝統的癌の処置後に癌患者を処置して白血球を 再生し、及び免疫無防備化個体、例えば、後天性免疫欠損症候群（エイズ）を有 する個体におけるウィルス、細菌、真菌および寄生生物の感染の可能性を減少す るために有用であると記載されている。ヒトＴＬ−３は、Ｙａｎｋ、　Ｙ、　Ｃ ，ら、Ｃｅ１ｌ　（１９８６）　４７：　３によりクローニングされた。

前述のヒトＣＳＦに類似するネズミ因子か存在し、このような因子はすべてのこ れらの細胞の型＋巨核球、赤血球およびマスト細胞を種々の組合せでを含有する ネズミ骨髄細胞からのコロニーを誘発する、ＩＬ−３とちょぶネズミ骨髄細胞を 包含する。ネズミＩＬ−３は、Ｆｕｎｇ。

Ｇ−Ｃ３Ｆのクローニングおよび発現は米国特許第４．８１０．６４３号に記載 されており、そしてヒトの口の癌組織からのＧ−Ｃ３Ｆを精製する方法は米国特 許第４．８３３．１２７号に記載されている。

本発明は、これらのサブクラスの第１のＣ５Ｆ−１の構成員であるタンパク質の 組み換え生産に関する。このサブクラスは、さらに、他のサブクラスの生物学的 活性に影響を与えないで、Ｃ５Ｆ−１の活性を特別に抑制するための特定のラジ オイムノアッセイおよびラジオレセプタにより特性決定および描写され、そして マクロファージ細胞系Ｊ７７４はＣ３Ｆ−１に特異的に結合するレセプタを含有 する。これら表された。

一般にＣＳＦタンパク質、とくにＣ３Ｆ−１を任意の有用な機能にすることがか なり困難であることは、それらの治療的使用を実際的にするまたは可能とするた めにさえ十分な量で、個々のなかつ特性決定可能な形態で入手可能できないこと であった。本発明は、組み換え技術により有用な量で、精製されたヒトおよびネ ズミのＣ３Ｆ−１を提供することによって、これらの困難を除去し、そしてその 種々の治療的使用を開示する。

エイズに悩む患者をＣ３Ｆ−１単独でまたはそえとエリスロボイエチンおよび／ または抗ウィルス剤および／またはＩＬ−２との組み合わせで処置することは、 ＷＯ３７１０３２０４，１９８７年６月４日公開、に報告された。米国特許第４ ．４８２．４８５号、１９８４年１１月１３日発行は、ヒトの尿から単離された ＣＳＦは癌の処置における支持的役割のために使用できることを述べている。さ らに、欧州特許（ＥＰ）第１１８．９１５号、１９８４年９月１９日発行は、癌 の治療を受けている患者における顆粒球血症およびマクロファージ血症の予防お よび治療のために、感染の予防のために、そして骨髄を移植された患者の処置の ためにＣ３Ｆを生産することを報告している。

さらに、Ｃ５Ｆ−１は非特異的殺腫瘍活性を刺激すると報告された生物活性のた めの、マクロファージの活性化において直ちの直接の役割をもたないと報告した 。Ｒａ１ｐｈら、Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８７）　１０５　：２７ ０−２７９は、ネズミ肉腫Ｔ［Ｊ５標的へのＣ３Ｆ−１単独の遅延した殺腫瘍作 用およびＣ５Ｆ−１とリンフ才力インとの組み合わせの付加された殺腫瘍作用を 報告している。継続中の米国出願環１２６．２２１号、１９８８年２月１８日出 願、は、免疫系を刺激するためのＣ３Ｆ−１およびＧ−Ｃ３Ｆの相乗作用を開示 している。

さらに、Ｗａｒｒｅｎら、Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８６）　１３ ７　：　２２８１−２２８５は、Ｃ５Ｆ−１がインターフェロンの単球生産、Ｔ ＮＦおよびコロニー刺激活感染に対するＣ５Ｆ−１誘発耐性を開示している。

本発明の１つの面において、バクテリア、ウィルスまたは真菌により引き起こさ れるものを包含する、ある数の感染症に対する耐性を誘発するＣＳＦ〜１の能力 に基づく治療的処置を開示する。なおさらに他の面は、創傷の治癒において使用 するための組織の損傷の修復を促進Ｃ５Ｆ−１の能力に関する。最後に、本発明 は、腫瘍の悩みを処置するために有効量のＣ３Ｆ−１を使用することによって、 哺乳類における腫瘍細胞を処置する方法を提供する。本発明の１つの面において 、本発明は、すべてが２官能性抗体により仲介される、腫瘍細胞に対してヒトエ フェクター細胞、例えば、骨髄由来細胞、組織マクロファージ、または末梢血液 単核細胞を使用して、抗体依存性ターゲテッド細胞の細胞障害性の刺激を増大す る方法に関する。さらに、本発明は、Ｃ５Ｆ−１またはそれとサイトメガロ、リ ンフ才力インとの混合物、または前述の種々の応用において使用するための賦形 剤との混合物を含んでなる医薬組成物に関する。

第１図は、腫瘍細胞を殺すマクロファージの能力の増強における、Ｃ５Ｆ−１お よび他のコロニー刺激因子の活性の比較である。

第２図は、Ｃ５Ｆ−１の存在および不存在下に付着性血液単核細胞（ＡＭＣ）に よる癌細胞の溶解を仲介する、ｌμｇ／ｍｌのへテロ接合体１１３ＰＩＦ（ａｂ ’　）ｚ−３Ｇ８Ｆ（ａｂ’　）ｔの能力を示す。

第３図は、抗体単独と比較した、１４〜１００　ｎｇ／ｍ１（７）ＣＳＦ−１と 共に予備インキュベーションしたＡＭＣによる溶解を仲介する、二重特異性抗体 ２Ｂ１の能力を示す。

第４図は、１００　ｎｇ／ｍｌの２８１を使用してのＡｌ１ＩＣについてのＣ３ Ｆ−１の投与量の範囲の研究の結果を示す。

第５図は、ネズミのサイトメガロウィルス（ｍｃＭＶ）の致死的投与量に対する Ｃ３Ｆ−１の保護作用を示す。

第６図は、対照およびＣ５Ｆ−１処置したマウスにおける創傷閉鎖のデータを示 す。

「コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１またはＭ−ＣＳＦ）Ｊは、Ｃ５Ｆ−１につ いてこの分野において理解されている活性スペクトルを示すタンパク質、すなわ ち、Ｍｅｔｃａｌｆ、　Ｄ、、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｙｓｉｏｌ、　（１９７ ０）　７６：　８９の標準的ｉｎ　ＶｉｔｒＯコロニー刺激アッセイに適用した とき、−次的マクロファージのコロニーの形成を刺激することができるタンパク 質を意味する。天然Ｃ５Ｆ−１はグリコジル化された二量体であり、モノマーは Ｍｅｔｃａｌｆのコロニー刺激アッセイ（前掲）または種々の他の１ｎｖｉｔｒ ｏ生物活性のアッセイにおいて活性ではないので、二重化は活性のために必要で あると報告されている（Ｒａｌｐｈ、　Ｐ、ら、Ｂｌｏｏｄ（１９８６）　６８ 　：　６３３　；　５ｔａｎｌｅｙ、　Ｅ、　Ｒ，、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、　（１９７７）　２５　ｇ：４３０５）。ここで使用するとき、Ｃ５Ｆ−１ 単位はタイトレージョン可能な範囲におけるマウス骨髄コロニーのアッセイにお けるコロニーの数に相当する（Ｒａｌｐｈら、Ｂｌｏｏｄ、前掲、に記載されて いる）。本発明の範囲内およびＣ３Ｆ−１の定義内に、二量体およびモノマーの 両者の形態が包含される。モノマーの形態は、同時係属出願のＰＣＴ　ＷＯ３８ １０８００３、１９８８年ｌＯ月２０日公開、および米国特許第４．９２９．７ ００号、１９９０年５月２９日発行、に記載されているような適当なりフォルデ ィング条件をｉｎ　ＶｉｔｒＯて準備することによって二量体の形態に転化する ことができ、そしてモノマーそれ自体は抗Ｃ５Ｆ−１抗体の生産のための抗原と して有用である。

いくらかの種特異性が存在するように思われる：ヒトＣ５Ｆ−１はヒトおよびネ ズミの両者の骨髄細胞で作用可能である。したがって、「ヒトＣ３Ｆ−Ｉ　Ｊは 、Ｄａｓ、　１９８１、前掲、の特異的ネズミラジオリセプターアッセイにおい て陽性であるが、必然的に完全な相関関係があるわけではない。タンパク質の生 物学的活性は、一般に、またヒト尿Ｃ５Ｆ−１に対する中和抗によって阻害され るであろう（Ｄａｓ、　１９８１゜前掲）。しかしながら、ある種の特別の場合 （例えば、特定の抗体調製物は生物学的機能に必須ではないＣ５Ｆ−１のエピト ープを認識することができ、そして前記エピトープは試験する特定のＣ５Ｆ−１ のムティンの中に存在しない）において、この基準は満足されないことがある。

Ｃ３Ｆ−１のある種の他の性質は、より最近認識されてきており、ネズミのマク ロファージからの系列Ｅのプロスタグランジン類、インターリューキン−１およ びインターフェロンの分泌を刺激するこのタンパク質の能力を包含する（Ｍｏｏ ｒｅ、　Ｒ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）　２２３　：１７８）。これら の後者の活性についてのメカニズムは現在理解されておらず、そしてここにおい て定義する目的で、定義を満足する基準は、出発物質として適当な種からの骨髄 細胞を使用して、単球／マクロファージのコロニーを刺激する能力にあり、そし てほとんどの環境（上を参照）下で、精製されたヒト尿Ｃ５Ｆ−１に対する中和 抗血清によってこの活性の阻害を示し、そして、種の型について適当ならば、ラ ジオリセブターアッセイにおいて陽性の応答を示す。（Ｃ３Ｆ−１の増殖作用は 単核食細胞の系統の細胞に制限されること（Ｓｔａｎｌｅｙ。

Ｅ、　Ｒ，、Ｔｈｅ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ　（１９８１）、Ｓｔｅｗａｒｔ 、　Ｗ、Ｅ、、Ｉｒ、ら、纏、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、ニュージャーシイ州 りリフトン）、ＰＩ）、、１０２−１３２）およびＣ５Ｆ−１のためのりセブタ ーはこの系統の細胞（Ｂｙｒｎｃ、　Ｐ、　Ｖ、　ら、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、 　（１９８１，）　９１　：　８４８）、胎盤のトロホブラストおよびいくつか の他の細胞の上に見いだされることか知られている）。

「有効量」は、特定した機能を実行する、例えば、腫瘍細胞を殺すか、あるいは 腫瘍負荷を減少か、あるいは感染症を予防または治癒するために有効な量を意味 する。

「治療的処置」は、病気にかかった後の被検体を処置することを示し、そして予 防的治療を包含する。

「哺乳動物」は、任意の哺乳動物の種を示し、そしてウサギ、マウス、イヌ、ネ コ、霊長類およびヒト、好ましくはヒトを包含する。

「免疫抑制」は、感染、化学的物質、熱傷、主要な外傷、または照射による、免 疫応答の予防または減少を意味する。

「発現系ｊは、所望のコード配列および調節配列を作用可能な連鎖で含有するＤ ＮＡ配列を呼び、こうしてこれらの配列で形質転換された宿主はコードされたタ ンパク質を発現することができる。形質転換を実施するために、発現系をベクタ ーの中に含めることもできるが、次いて関係するＤＮＡを宿主の染色体の中に組 み込むことができる。

ここで使用するとき、「細胞Ｊ、「細胞系」および「細胞培養物」は互換的に使 用し、そしてすへてのこのような表示は子孫を包含する。こうして「形質転換体 」または「形質転換された細胞」は、被検体の一次的細胞および、継代の数に無 関係に、その細胞から誘導された培養物を包含する。また、すべての子孫は、意 図的なまたは不注意な突然変異ために、ＤＮＡ含量が正確な同一でないことがあ る。

もとの形質転換された細胞においてスクリーニングしたのと同一の機能を有する 突然変異体子孫が含められる。別の表示を意図する場合、文脈から明らかであろ う。

ここにおいて述べる、すべての特許、特許出願および刊行物は、前掲および後掲 の両者を含めて、ここに詳しく引用によって加える。

Ｃ５Ｆ−１は明らかに多数の形態で存在し、それらのすべては本発明の態様の中 に含められる。３つの異なる長さく２５６アミノ酸＝５５４アミノ酸：および４ ３８アミノ酸）のＣ５Ｆ−１のｐｒｅ−ｐｒｏ−ポリペプチドをコードするヒト Ｃ３Ｆ−ｉのｃＤＮＡのクローンは、単一のＣ５Ｆ−１遺伝子を発現する細胞か ら単離された（参照、米国特許第４．８４７．２０１号、１９８９年７月１１日 発行および米国特許第４．８６８．１１９号、１９８９年９月１９日発行；Ｗｏ ｎｇ、　Ｇ、　Ｇ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８７）　２３５　：　１５０４ ．　Ｋａｗａｓａｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２３０　：　２９１ 　；　Ｌａｄｎｅｒら、ＥＭＢＯＪ、（１９８７）　６　：　２６９３　；Ｃｅ ｒｒｔｔｉ、　Ｄ、　Ｐ、ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９ ８８）　２５　：　７６１　ｏ　ここにおいて開示する治療において有用なＣ５ Ｆ−１タンパク質は、また、例えば、長い形態の、２３８におけるＬｙｓ残基、 ２４９におけるＡｒｇ残基、および４１１におけるＡｒｇ残基を包含する、タン パク質分解によりプロセシングされることができる。Ｃ３Ｆ−１は１または２以 上のＣ−末端が欠失された形態で天然に存在する。さらに、最初の２または４ア ミノ酸を欠如するＣ５Ｆ−１タンパク質は、ヒト細胞系ＡＧＲ−ＯＮ（ＣＥＩｉ ｌ−ＯＮ号、１９８７年６月２３日発行）の上澄み液から活性な形態で単離され た。

アミノ酸１４５をコードするモノマーを含むＣ５Ｆ−１タンパク質は１ｎｖｉｔ ｒｏ生物学的活性を有することが報告された（欧州特許公開第２６１、５９２号 、１９８８年３月３０日公開）。いくつかの生物学的活性は、アミノ酸１３２を コードするモノマーから構成された二量体のＣ５Ｆ−１タンパク質について報告 された（欧州特許（ＥＰ）第３２８．０６１号、１９８９年８月１６日公開）。

モノマーのＣ５Ｆ−１ポリペプチド（Ｃ−末端において切断されているか否かに かかわらず）を、また、リフオルディングしてマルチマー、最も頻繁には二量体 を形成することがてきる。

天然ヒト尿Ｃ３Ｆ−１は、４５〜９０ｋＤの高度にグリコジル化された二量体と して、源、測定法および報告者の同一性に依存して単離された。

Ｗｏｎｇら（前掲）により報告された、組み換え的に生産された未グリコジル化 Ｃ３Ｆ−１は、はぼ２１ｋＤの分子量を有するように思われる。他方において、 Ｋａｗａｓａｋｉら（前掲）（参照、米国特許第４．８４７．２０１号（前掲） およびＰＣＴ公開第ＷＯ３６１０４６０７号、１９８６年８月１４日公開）によ りＣ３Ｆ（ＳＣＳＦ）の「短い」２２４アミノ酸について推定されたアミノ酸配 列に基づいて推定された分子量は、２６ｋＤ程度であるが、「長い」アミノ酸の 形態（ＬＣＳＦ）のそれは５５ｋＤ程度である（Ｗｏｎｇら（前掲）：Ｌａｄｎ ｅｒら（前掲）；欧州特許（ＥＰ）第２７２．７７９号、１９８８年６月２９日 公開：およびＰＣＴ公開第ＷＯ３７１０６９５４号、１９８７年１１月１９日公 開）。これらの遺伝子の欠失された構成体をＥ、　ｃｏｌｉの中で発現するたお き（グリコジル化が起こらない場合）、それらはもちろんかなり低い分子量のタ ンパク質を生ずるであろう。

本発明において有用な１の他の形態は、米国特許第４．８４７．３２５号に記載 されているポリマー接合Ｃ５Ｆ−１を包含する。欧州特許（ＥＰ）第２４９．４ ７７号、入９８７年１２月１６日公開に開示されているトランスメンプレイン領 域欠失突然変異体および欧州特許（ＢＰ）第２７２．７７９号、前掲、に開示さ れているグリコジル化部位欠失突然変異体もまた、現在開示する治療に有用であ ると考えられる。

種々の源からこれらの種々の形態のＣ３Ｆ−１を生産する方法は、米国特許第４ ．８７９．２２７号、■９８９年１１月７日発行、　ＷＯ３６１０４５８７号、 １９８６年８月１４日公開、　ＷＯ３９／１０４０７号、１９８９年１１月２日 公開；　ＷＯ３８１０８００３号、前掲および欧州特許（ＥＰ）第２７６、５５ １号、１９８８年８月３日公開、に報告されている。

ＡＴＧ開始コドンが直ぐ前に存在するバクテリアで生産された成熟タンパク質は 、Ｎ−末端のメチオニンを含むか、あるいは含まないことができることは、もち ろん、知られており、そして欧州特許（ＥＰ）第２７２．７７９号、前掲、に示 されているように、残基ｌおよび２（両者はグルタミン酸）または残基１〜３　 （Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ）の欠失はこのように役立つ。欠失はマおよび引き続 くＮ−末端配列から欠失されたアミノ酸数、あるいはアミノ酸がＣ−末端配列か ら欠失されるとき、残りのアミノ酸の数で記載される。こうして、最初の２およ び最初の３残基の欠失を有する前述のＮ−末端の欠失は、それぞれ、Ｎマ２およ びＮマ３と表示される。例えば、長さ１５０．１５８゜１９０および２２１アミ ノ酸のタンパク質を生ずるＣ３Ｆ−１のＣ−末端の切頭は、ツレツレ、Ｃマ１５ ０　、Ｃｖ１５８　、　ＣＹ１９０　オヨヒＣＶ２２１と呼ばれる。３アミノ酸 のＮ−末端の欠失を有するＬＣＳＦから誘導された２２１アミノ酸のＣ５Ｆ−１ 分子は、例えば、ＬＣ３Ｆ／Ｎマ３Ｃマ２２１と記載される。アミノ酸の置換は 、置換されるアミノ酸の位置に言及して表示される。例えば、Ｌａｄｎｅｒら（ 前掲）の第４図の中の位置１５７のシスティン残基のセリンによる置換はＣ５Ｆ −１ｓｅｒ＋　ｓ□と呼ばれる。

要約すると、Ｎ−末端およびＣ−末端の欠失へおよび集成に加えて、鎖の中の個 々のアミノ酸残基は酸化、還元、欠失または他の誘導体化により修飾することが でき、そしてまたこれらのタンパク質は切断および／または重合して、活性を保 持する二量体生成物を得ることかできる。活性を破壊しないこのような変更は定 義からタンパク質配列を除去せず、そして実質的な同等体として特別に包含され る。他の種から誘導されたＣ３Ｆ−１は、［ヒトＣ５Ｆ−Ｉ　Ｊの活性を存する タンパク質の定義に、ヒト基質に関する前述の要求される活性のパターンのその 表示のおかげで適合することができる。

すべてのタンパク質の場合におけるように、正確な構造はある数の因子に依存す る。イオン化可能なアミノおよびカルボキシル基か分子の中に存在するので、特 定のタンパク質は酸性または塩基性の塩として、あるいは中性の形態で得ること かできる。適当な環境的状態に置かれたとき、それらの活性を保持するすべての このような調製物は、この定義の中に包含される。さらに、主なアミノ酸配列は 、糖部分を使用して誘導体化（グリコジル化）によるか、あるいは他の補助的分 子、例えば、脂質、ボスフェート、アセチル基などにより、より普通には糖類、 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリオキシエチレングリコール（ＰＯ Ｇ）との接合により米国特許第４、８４７．３２５号に示されているように増大 することができる。このような増大のある種の面は、生産性宿主の翻訳後のプロ セシング系を通して達成される：他のこのような修飾はｉｎ　ｖｉｔｒｏで導入 することができる。いずれの場合においても、このような修飾は、上に定義した 、二量体のタンパク質の活性が破壊されないかぎり、定義の中に包含される。こ のような修飾は、タンパク質の活性を種々のアッセイにおいて増強または減少す ることによって、量的または質的に活性に影響を与えることができる。

さらに、鎖の中で個々のアミノ酸残基は酸化、還元または他の誘導化により修飾 することかでき、そしてタンパク質を切断して活性を保持する断片を得ることが できる。活性を破壊しないこのような変更は定義からタンパク質配列を除去しな い。

翻訳の間に配列の中に組み込まれたアミノ酸の欠失、付加または変更による、− 次構造それ自体の修飾は、タンパク質の活性を破壊しないで、なすことかできる 。このような置換および他の変更は、ｒＣ３Ｆ−１のそれに実質的に等しいアミ ノ酸配列を有する」タンパク質の定義内に入るアミノ酸配列を有するタンパク質 を生ずる。事実、ヒトおよびネズミ由来のＣ３Ｆ−１タンパク質は、高い相同性 を表す、同一でないが、同様な一次アミノ酸配列を有する。

本発明のＣ５Ｆ−１タンパク質は、先祖骨髄細胞からの単球−前駆体／マクロフ ァージの細胞の両者の生産を刺激し、こうして免疫系の有効性を増強し、そして 成熟マクロファージの中のリンフ才力インの分泌のような分化する細胞の機能を 刺激することができる。

１つの応用において、これらのタンパク質は化学療法への付加物として有用であ る。化学療法の処置は免疫系の抑制を生ずることか理解されるであろう。しばし ば、化学療法の処置は、腫瘍細胞の破壊において有望であるが、骨髄細胞へのこ れらの毒性剤の副作用のために、対象の死亡を生ずる。このような患者へのＣ５ Ｆ−１の投与は、骨髄由来の前駆体のマクロファージおよび単球への成長および 分化を仲介および増強しかつこれらの成熟細胞の機能を刺激するＣ５Ｆ−１の能 力のために、この副作用を防止し、こうして二次感染に屈する患者の傾向を防止 するために免疫系の再刺激をもたらす。

Ｃ５Ｆ−１は、また、白血球減少症、すなわち、白血球の合計数の減少を包含す る疾患を治療するために使用することができる。好中球減少症は多形性の白血球 （好中球、顆粒球）に主として影響を与える欠陥を反映し、そして種々の感染、 ある種の薬物（例えば、細胞障害性薬物）またはイオン化放射線に基づくであろ う。こうして、Ｃ３Ｆ−１のｉｎ　ｖｉｖｏ投与を使用して幹細胞を誘導して多 形性白血球の生産を増加し、こうして白血球の計数を増加することができる。

このような処置により助けられる他の患者は、骨髄移植により白血病を処置され る患者を包含する：このような患者はしばしば拒絶反応を予防するために免疫抑 制されている。これらの患者について、また、免疫抑制はＣ５Ｆ−１の投与によ り逆転されることがある。

一般に、化学療法、骨髄移植、または他の形態の免疫抑制、例えば、疾患（例え ば、後天性免疫欠損症候群）のためかどうかにがかわらず、免疫抑制に悩む対象 は薬理学的使用のためのＣ５Ｆ−１入手可能性から利益を受けるであろう。

日和見感染には免疫抑制の結果としてかかることかある。例えば、記載されてい る。Ｍｉｌｌｓらは、普通の一次感染は次の因子により引き起こされることを示 す：サイトメガロウイルス、ニューモジステイス・アリニイイ（Ｐｎｅｕｍｏｃ ｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）　、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　 ａｌｂｉｃａｎｓ）　、水痘−帯状庖疹ウィルス、ニスバインバールウィルス、 トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉ）、鳥型結核 菌（Ｍｙｃｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）　、クリブトコッス・ネオフォ ルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）など。著者らは また、これらの感染を処置するために使用される種々の薬物を記載している。Ｃ ３Ｆ−１をそれらの薬物の１種または２種以上と組み合わせて、これらおよび日 和見感染を処置することができるか考えられる。

さらに、Ｃ５Ｆ−１をクリプトコツカル（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｌ）　、例え ば、クリプトコツカル・メニンギチス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｍｅｎｉｎ ｇｉｔｉｓ）の感染の処置のために使用することか思い浮かぶ。クリプトコツカ ル・メニンギチス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）は米国 において菌類の髄膜炎の最も普通の形態であり、そしてエイズの患者においてヒ ト免疫不全ウィルス（ｌ（ＩＶ）およびトキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐ 　ｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ）後の神経学の疾患の第３の最も重要な因子である。

クリプトコックス症は米国においてエイズ患者の５〜７％において病気の間のあ る時点において発生するが、散在性クリプトコツカス症はアフリカのエイズの患 者の第３までにおいて発生することかある。

これらの日和見性の感染のための治療的処置は、菌類の病気について下に記載す るものと同様であることかできる。例えば、ｃｓｐ−ｉは同様な投与レベルあつ 同一のスケジュールで投与することができる。

さらに、対象者に固有の系の量を補充するために前板て分化したマクロファージ の増大量を投与することができ、これらのマクロファージは骨髄のｉｎ　ｖｉｔ ｒｏ培養によるか、あるいは血液の単球、または他の適当な調製物および引き続 ＜　Ｃ３Ｆ−１の処理から生産される。

これらの調製物は、患者自身の血液の単球または骨髄誘導細胞の調製物を包含し 、これらはそのように培養し、そして局所的または全身的処置のために戻すこと ができる。

Ｃ５Ｆ−１がマクロファージによるリンフ才力インの生産を刺激し、そして榎的 細胞を殺すマクロファージの能力を増強する能力は、また、新形成および感染の 処置においてＣ３Ｆ−１を直接有用とする。そのうえ、Ｃ５Ｆ−１を使用する創 傷の処置は組織の修復を促進する。

Ｃ５Ｆ−１はネズミ由来マクロファージによりインターフェロンの生産を増強し くＦｌｅｉｔ、　Ｉｌ、　Ｂ、ら、Ｊ、　Ｃｅ１１．　ＰＹＳｉｏｌ、　（１９ ８１）　１０８　：３４７）、そしてＭｒＡＰａＣａ細胞からのヒトの、部分的 に精製されたＣ３Ｆ−１は、ＰＣＰ　ＷＯ３６１０４６０７、前掲、に例示され ているように、ヒト単球からのインターフェロンおよびＴＮＰのポリ（■）：ポ リ（ｃ）誘発生産を刺激する。さらに、Ｃ５Ｆ−１はヒト血液単球により骨髄様 ＣＳＦの生産を刺激する。

そのうえ、ここに記載する種々の使用のために、Ｃ５Ｆ−１を他の効率よい因子 と組み合わせて使用することができ、このような因子は、例えば、ＩＦＮ−７ル ア　ｙ、ＩＦＮ−ベータ、ｒＦＮ−ガンマ、ｒＬ−２，ＴＮＦ　、または腫瘍を 処置するためのネズミジベブチドおよびその類似体を包含する。

また、正常Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス腹膜のマクロファージを刺激して、ネズミ肉腫 ＴＵ５ターゲットを殺すＣ５Ｆ−１（ネズミＬ−細胞一コンディションドおよび Ｅ、ｃｏｌｉ生産ヒト組み換えＣ５Ｆ−１からの）の能力を下において証明する 。Ｃ５Ｆ−１を予備処置としておよびエフェクター相の間に使用するとき、この 活性は最も有効である。そのよう（こするＣ３Ｆ−１の能力は、他のＣ３Ｆが示 すものより非常に大きし）。

Ｃ５Ｆ−１はまた、リンフ才力イン誘発の抗体依存性細胞の細胞障害性（ＡＤＣ Ｃ）またはターゲラテッドＡＤＣＣを腫瘍細胞に対するマクロファージまたは天 然キラー細胞により増大するため（こ使用すること力為できる。この活性が特に 効果的である場合、Ｃ５Ｆ−１をＩＬ−２，１ＦＮ−アＣ３Ｆ−１の投与量、お よびエフェクター／タープ・ソトの比に依存すると信じられる。ターゲラテッド 細胞の細胞障害性は、細胞障害性細胞、例えば、単球、マクロファージ、ナチュ ラルキラー細胞なとの上の細胞表面のりセブターに頼ると考えられる。これらの 細胞表面のりセブタ−ＣＤ１６の発現は、追加のリンフ才力イン、例えば、ＩＬ −２の存在または不存在下に、Ｃ５Ｆ−１の中のこれらのエフェクター細胞を培 養することによって増強される。細胞障害性細胞はタープ・ソト細胞に対するま で上に位置つけされる場合、２価の抗体は、その結合部位の１つを通してターゲ ット細胞に結合しかつその第２結合部位を通して細胞障害性細胞上の溶菌促進リ セブターに結合し、これにより２つの細胞の型を接合しそして細胞障害性細胞が 殺しのシグナルを送り出すようにさせることによって、このプロセスを促進する ことができる。「２価の抗体」は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）またはハイブリ ッドのハイブリドーマ細胞系における抗体鎖のｉｎ　ｖｉｖｏ組み換えにより生 産された抗体、および２つの抗体または抗体断片のｉｎ　Ｖｉｔｒｏ化学的接合 により生産された抗体を包含する；後者の化学的に連鎖された抗体はへテロ接合 体と呼ぶ。

本発明において、このような２価の抗体は白血球上のヒトリセプター１１１（Ｆ ｃＲＩＩＩ）として知られているＣＤ１６抗原をターゲットする、ハイブリッド のハイブリドーマ誘導二重特異性またはへテロ接合した抗体を包含する。３Ｇ８ 、ヒトＦｃＲｒ　Ｉ　Ｉに対するＩｇＧ＋モノクローナル抗体を分泌するネズミ ハイブリドーマは、Ｕｎｋｅｌｅｓｓ、　Ｊ、　Ｂ、ら、Ａｎｎ　Ｒｅｖ　１ｍ ｍ　（１９８８）　６　：　２５１に記載されている。ハイブリッドのハイブリ ドーマ誘導二重特異性抗体２Ｂ１を発生するために、この抗体およびモノクロー ナル抗体５２０Ｃ９を使用することは、同時継続米国出願第０７／２４９．７１ ０号、１９８８年９月２７日提出、に記載されている。

生ずる二重特異性抗体はＣＤ１６ＦｃリセブターＩＩＩ陽性細胞への結合、なら びに陽性のプロト腫瘍遺伝子生産物ｃｒｂＢ−２を表す肺癌細胞への結合を示す 。３Ｇ８はまた１１３Ｆ１抗体、肺癌関連抗原に対するネズミモノクローナル抗 体（米国特許第４．７５３．８９４号）に化学的に交差結合され（例えば、Ｋａ ｒｐｏｖｓｋｙら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　（１９８４）　１６０　：　１ ６８６、に記載されているように化学的クロスリンカ−を使用して）、また、２ 価の特異性を有する抗体が生成された。

このようなターゲラテッド細胞障害性のアッセイにおけるｃｓｐ−ｉのｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ存効投与量はｌＯ〜２００　ｎｇ／ｍｌの範囲である。しかしながら、 そのｉｎ　ｖｉｖｏ投与量は、種々の因子、例えば、癌のひどさ、宿主の免疫の 状態、体重、エフェクター／ターゲット細胞の比に依存し、それらの多くは場合 に応じて決定することができるだけである。

Ｃ５Ｆ−１は、全身の毒性反応を引き起こさないが、エフェクター細胞上に強化 の応答を誘発する投与量で投与すべきである。

２価の抗体のｉｎ　ｖｉｔｒｏ有効投与量はｌｏｇ／ｍ１〜２００　ｎｇ／ｍｌ の範囲である。ｉｎ　ｖｉｖｏ投与量は、ある数の因子、例えば、腫瘍の大きさ の臨床的推定、転移の程度、および活性薬物および活性化された細胞の生物分布 に依存する。有効なｉｎ　ｖｉｔｒｏエフェクター／細胞の比はほぼ１０：１〜 ８０：１である。実際のエフェクター／ターゲットの比ｉｎ　ｖｉｖｏは、エフ ェクター細胞および抗体への腫瘍の接近可能性に依存する。

を引き起こすものを包含するバクテリアの因子、および菌類を攻撃するネズミ細 胞の能力は、Ｃ３Ｆ−１により増強される。（ネズミＣ３Ｆ−１はネズミマクロ ファージかＰ８１５腫瘍細胞に対して静細胞性であることを刺激する（Ｗｉｎｇ 、　Ｅ、　、Ｌ　ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、（１９８２）　６９　 ：２７０）か、あるいは他の白血病のターゲットを殺さない（Ｒａｌｐｈ、　Ｐ 、ら、の調製物かマクロファージがカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）を摂取および 殺あることが発見された。これらの菌類の感染は、典型的には、免疫抑制された 患者（例えば、骨髄移植体、エイズを有する患者など）において発生するが、ま た、免疫抑制されていない個体において起こることがある。処置することかでき る菌類は、次の属からのものである：カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）　、アスペ ルギルス＠（Ａｓｐｅｒｇｉ　１ｌｕｓ）、クリプトコツカス属（Ｃｒｙｐｔｏ ｃｏｃｃｕｓ）　、ヒストブラスマ属０（ｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）　、プラスト ミセス！！（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）　、コシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉ ｏｉｄｅｓ）　、バラコシジオイデス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ） 、ケカビＢＥ（Ｍｕｃｏｒ）　、ａドトルラ＠（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）　、 スボロロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）　、ダーマトフイトシス属（Ｄｅ ｒｍａｔｏｐｈｙｔｏｓｉｓ）、シュードアレスケリア＠　（Ｐｓｅｕｄａｌｌ ｅｓｃｈｅｒｉａ）　、ブロトセカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）　、リノスボリ ジウム＠（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）　、または菌腫またはクロモミコー シスを引き起こす菌類など（参照、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔ ｉｃｅ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第３版、Ｍａｄｅｌ ｌら、Ｃｈｕｒｃｅｌｌ　Ｌｉｖｉｇｔｏｎｅ　［１９９０］　１）、１９４２ −２０１６）。

好ましくは、Ｃ３Ｆ−１は、菌類の感染か陰性の培養結果により決定して除去さ れるまで、非経口的に投与する。Ｃ５Ｆ−１は、皮下的に、連続的注入により、 ポーラス注射により、あるいは一定の注入により投与することができる。「連続 的注入」とは少なくとも２４時間の投与を意味し、そして「一定の注入」は２４ 時間以下の投与を意味する。Ｃ５Ｆ−１は好ましくは１〜４時間持続する一定の 注入を意味する。

菌類の感染を処置するために有効な１日のＣ５Ｆ−１の投与量は好ましくは０． ０１〜５０ｍｇ／　ｒｄ、より好ましくは０．０５〜１０ｍｇ／　ｒｄ、最も好 ましくは０．５〜５　ｍｇ／イである。好ましくは、Ｃ５Ｆ−１は少なくとも１ ４日間、より好ましくは２１〜５９日間投与する。上の処置が不都合な結果を引 き起こす場合（しかしながら、最小の効果はｉ、　Ｖ、ポーラスにより３０ｍｇ ／　ｒｄ　／日までの投与量で観測された）あるいはより効率よい結果を示すこ とができる場合、他の投与のスケジュールをまた使用することができる。

好ましくは、前述したようにかつ下に詳しくを示すように、Ｃ５Ｆ−１はカンジ ダ＠　（Ｃａｎｄ　１ｄａ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉ　１ｌｕ ｓ）の感染を処置するために使用することができる。クリプトコックス属（Ｃｒ ｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の感染、例えば、クリプトコックスの髄膜炎は同様に処 置することかできる。

こうして、免疫抑制それ自体を克服ことに加えて、Ｃ３Ｆ−１はマクロファージ の分泌および活性の刺激により侵入性有機体または悪性細胞を破壊するために使 用できる。マクロファージの活性は抗微生物剤、例えば、１種または２種以上の 抗ウィルス、抗菌剤または抗バクテリア剤と組み合わせたＣ３Ｆ−１の治療によ り増強することができる。

抗菌剤の例は次のものを包含する：アンフすテリシンＢ、フルコナゾール（Ｄｉ ｆｌｕｃａｎ）　、５フルオロ−サイドシン（Ｆｌｕｃｙｔｏｓｉｎｅ。

５−ＦＣ）　、ケトコナゾール、ミコナゾール、イトラコナゾールなと（参照、 また、Ｍａｄｅｌｌら、前掲、９．３６１−３７０またはＭｉｌｌｓら、ｐ。

５４−５５）。上の抗菌剤の１つの臨床的スペクトルの例として、典型的にはア シフオテリシンは次の菌類および原生動物を阻害する：アスペルギルス・フミガ ラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）　、バラコシジオイデス ーブラシリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎ ｓｉｓ）　、コシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　１ｍｍ１ ｔｉｓ）　、クリブトコッス°ネオフオルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｅｏｃｅｕｓ　 ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）　、ヒストブラスマ゛カブスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａ ｓ［ｌｌａ　ｅａｐｓｕｌａｔｕｍ）　、ムコル・ムセド（Ｍｕｃｏｒ　ｍｕｅ ｅｄｏ）　、ロドトルラ＠　（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）種、スポロロトリクス ・デルマチチジス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）　、カ ンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種、レイシュマニア＠（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種 、およびアカンタメバ属（Ａｅａｎｔｈａｍｏｅｂａ）種。抗菌剤は、Ｃ５Ｆ− １の投与の前に、間にまたは後に、投与することができる。これらの剤の投与量 は当業者に知られており、そして１日量の範囲、例えば、アンプォテリシンＢ（ こついて０．４〜０．６　ｍｇ／ｋｇ／日、フルコナゾ−ツしについて２００ｍ ｇ／日〜４００　ｍｇ／日、５−フルオロ−サイトシンについて約１５０　ｍｇ ／ｋｇ７日、そしてケトコナゾ−ル（二ついて２００　ｍｇ／日〜４００　ｍｇ ／日を包含する。これらの範囲は単に例示であり、そしていかなる方法において も限定的として解釈すべきでない。また、Ｃ３Ｆ−１は菌類の感染の処置に有効 であるか、あるいは有効であろう他の剤と組み合わせることかできると考えられ る。抗菌剤はポリマーに接合して、それらのｉｎ　ｖｉｖｏ半減期および毒性を 調節することができる、参照、米国特許出願第３６５．９１４号、その開示の全 体をここに引用によって加える。

前述したように、Ｃ５Ｆ−１は池の抗微生物剤、例えば、抗バクテリア剤と組み 合わせることができる。Ｃ５Ｆ−１と組み合わせることができる抗生物質の例は 、次のカテゴリーから選択されるものを包含する：β−ラクタム環（ペニシリン ）、グリコシド結合にあるアミノ糖（アミノグリコシド）、マクロサイクルのラ クトン環（マクロリド）、ナフタセンカルボキシアミドのポリサイクルの誘導体 （テトラサイクリン）、ジクロロ酢酸のニトロベンゼン誘導体、ペプチド（バシ トラシン、グラミシンおよびポリミキシン）、共役二重結合系をもつ大きい環（ ポリエン）、スルファニルアミドから誘導されたスルファ薬物（スルホンアミド ）、５−ニトロ−２−フラニルの群にトロフラン）、キノロンカルボン酸（すな わち、ナリジキシン酸）、および多数の他のもの。前述の抗生物質の群はは好ま しい抗生物質の例であり、それらの群の範囲内の例は次の通りである：ペプチド の抗生物質、例えば、アンフォマイシン、バシトラシン、プレオマイシン、カブ レオマイシン、カブレオマイシン、コリスチン、ダクチノマイシン、エンヅラシ ジン、グラミシジンＡ１グラミシジンＪ　（Ｓ）、ミカマイシン類、ポリミキシ ン類、ステンドマイシン、チオペブチン、チウトレブトン、チロレジン類、ビオ マイシン、ピルギニマイシン類、およびアクチノマイシン（参照、化学技術の百 科事典（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｃｈｅｎ＋１ｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ）　、第３版、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ　ＩＩ、　Ｖｏｌ、　２．　ｐ 、　９９１　（１９７８）　二アミノグリコシド類、例えば、ストレプトマイシ ン、ネオマイシン、バシトラシン、ゲンタマイシン、リボメタマイシン、トブラ マイシン、アミカシン、およびリビドマイシン（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ 、　Ｖｏｌ、　２．　ｐ、　８−１９）　；β−ラクタム類、例えば、ベジルペ ニシリン、ｍｅｔｉｓｉｌｉｎ　、オキサシリン、ヘタシリン、ピペラジリン、 アモキシリン、およびカルベニシリン（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　Ｖｏ ｌ、　２．　ｐ、　８７１）　；フロラ：／　７　エニーコール（参照、Ｋｉｒ ｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　Ｖｏｌ、　２．　ｐ、　９２０）　；リンコサミニド類、 例えば、タリンダマイシン、リンコマイシンセレスセチン、デサリセチン（参照 、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　Ｖａｔ、　２．　ｐ、　９３０）　；マクロリド 類、例えば、エリスオマイシンＡ−Ｅ　、ランカマイシン、ロイコマイシン、お よびピクロマイシン（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　Ｖｏｌ、　２．　ｐ、 　９３７）　；ヌクレオシド類、例えば、５−アザシチジン、アミセチン、プロ マイシン、およびセブタシジン（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　Ｖｏｌ、　 ２．　ｐ、　９６２）　；オリゴ糖類、例えば、クラマイシン、およびエベルニ ノミシンＢ（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　Ｖｏｌ、　２．９．９８６）　 ；フェナジン類、例えば、ミキシン、ロモフンギン、イオジニンなど（参照、Ｋ ｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ。

Ｖｏｌ、　３．　ｐ、　１）　；ポリエン類、例えば、アンフォテリシン類、カ ンジンジン、二スタチンなど（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　Ｖｏｌ、　３ ．　Ｉ）、　２１）　；ポリエーテル票（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　Ｖ ｏｌ、　３．　ｐ、　４７）　；テトラサイクリン類、例えば、り四ロチトラサ イクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロシクリン、メタサイクリン、ドキ シサイクリン、およびミノサイクリン（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　Ｖｏ ｌ、　３．　ｐ、　６５）　；スルホンアミド類、例えば、スルファチアゾール 、スルファジアジン、スルファピラジン、およびスルファニルアミド（参照、Ｋ ｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ。

Ｖｏｌ、　２．　ｐ、　７９５）　；ニトロフラン類、例えば、ニトロフラン類 ラジリジン、ニトロフラン類ン、ツリウム、ニトロビン、およびンミフロキシム （参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　Ｖｏｌ、　２．　ｐ、　７９０）　；キノ ロンカルボン酸類、例えば、ナリジキシン、ピロミド酸、ピペミド酸、およびオ キソリン酸（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　Ｖｏｌ、　２．　ｐ、　７８２ ）。

Ｃ５Ｆ−１は、また、抗ウィルス剤、例えば、次のものと組み合わせることがで きる：アマンタジン、リマンタジナジルドン、リバビリン、あしくろびる、９− ［（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシ）メチルｊグアニ（Ｄ）ＩＰＧ）　 、ビダラビン（ＡＲＡ−Ａ）　、ガンシクロビル、エンピロキシム、フォスカー ネト、インターフェロン（アルファー、ベーターおよびガンマ−）、アンブリゲ ン、ボドフオルロトキシン、２．３−シトキシシトジン（ＤＤＣ）　、ヨードデ オキシウリジン（ＩＤＵ）、トリフルオロチミジン（ＴＰＴ）　、ジデオキシイ ノシン：ｄｄＤ、ジデオキシサイトジン（ｄｄｅ）　、シトプシンおよび特定の 抗ウイルス性免疫第１１版、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ、　Ｅ、ら纏、ニューヨーク： 　ＭｃＧｒａｗ　Ｈｉｌｌ　ＢｏｏｋＣｏ、、　１９８７．　ｐｐ６６８−６７ ２）。

最後に、Ｃ５Ｆ−１は、局所的または全身的に適用したとき、創傷の治癒のため の組織の修復を促進するために使用できる。Ｃ５Ｆ−１はマクロファージを補充 しくＷａｎｇ、　Ｊ、　Ｍ、ら、Ｊ、　！ｍ＋ｎｕｎｏｌ　（１９８８）　１４ １　：５７５）ならびにマクロファージを誘発して結合組織の成長因子、例えば 、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）　、および活性因子、例えば、腫瘍壊死因子 （ＴＦＮ）を、細胞増殖の刺激として、提供することができる。

創傷のマクロファージは、線維増殖、コラーゲンの合成、および脈管形成をｉｎ 　ｖｉｖｏで刺激する物質を解放すると報告された（Ｈｕｎｔ　Ｔ。

Ｋ、ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ　（１９８４）　９６　：　４８）。

本発明のＣ５Ｆ−１は、タンパク質物質の投与する分野において標準の普通の方 法で配合することができる。注射による投与は１つの好ましいルートである：そ してこのような配合物は、溶液または懸濁液、乳濁液、または注射可能なまたは ゲルの配合物に再構成するための固体の組成物を包含する。適当な賦形剤は、例 えば、リンゲル溶液、ハング溶液、水、生理食塩水、グリセロール、テキストロ ースまたはマンニトール溶液などを包含する。Ｃ５Ｆ−１の液体の溶液はｍ＊の 包帯の上または下に直接使用することができるが、再構成された組成物は創傷の 治癒のための軟膏、ゲル配合物、泡沫剤などに有用である。再構成された配合物 は、創傷部位にＣ３Ｆ−１のためのコントロールされた供給系を提供する。コン トロールされた解放は、延長された期間、例えば、２４時間またはそれ以上、好 ましくは２４〜７２時間にわたって治療的レベルを維持するために十分な薬物の 解放を意味する。成長因子の接触時間の増加は、創傷の治癒速度の有意な増加を 達成するために必要であることがある。

さらに、本発明のＣ５Ｆ−１は細胞の調製物と予備インキュベーションして適当 な応答を刺激することができ、そして全体の調製物またはそれからの上澄み液を 被検体に導入することができる。下に示すように、種々の型の血球によりＣ５Ｆ −１の刺激に応答して生産された物質は所望のターゲットに対して有効であり、 そして侵入性有機体または新形成を攻撃する血球それら自体の性質は増強される ことができる。被検体自身の細胞を抜き出しそしてこのようにして使用すること ができるか、あるいは、例えば、他の適合性の個体からの単球またはリンパ球を を包含するにおいて使用することができる。

前に、とくに米国特許第４．８７４．２０１号（前掲）に開示されている液系に 適用可能な発現ベクターは構成され、そして解読配列は発現された。米国特許第 ４．８７４．２０１号において提供された発現系に加えて、バキュロウィルスに より提供されたコントロール系を利用する昆虫の細胞を使用して発現系は記載さ れた（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｄ、　Ｗ、ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎ ｇ　（１９８６）　Ｓｅｔｌｏｗ、Ｊ、Ｋ、ら編、　ＰｌｅｎｕＴＩＩＰｕｂｌ ｉｓｈｉｎｇ、　Ｖｏｌ、　８．　り１１．２７７−２７９　、米国特許第４． ７４５．０５１号、１９８８年５月１７日発行、および同時継続米国出願第０７ ７、１８８号、１９８７年７月２７日提出。昆虫の細胞に基づく発現は、スポド ブテラ・フルギペイダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｉｄａ）の中で 実施することができる。

これらの系はまたＣ５Ｆ−１の生産に有望である。哺乳動物の発現はＣＯ３−７ ，ＣＨＯ、マウス、およびＣＶ−１細胞、およびまたＣＶ−Ａ２　、ハムスター およびネズミの細胞であることかできる。

種々の利用可能な宿主、ならびにこのような宿主のために適当な発現ベクターは 、翻訳後のプロセシング合成の選択、およびこうして生産されたタンパク質のコ ンフォメーションの調節を提供する環境的因子の選択を可能とする。こうして、 この情報の利用可能性はここに記載する種々の治療において使用するために十分 な量でＣ５Ｆ−１タンパク質を提供する。

前述の特許刊行物の中に開示されているベクターの中で、プラスミドｐＬｃｓＦ ２２１Ａ（これはａＳｐ　ｓ　ｓ　ＬＣＳＦ／Ｎマ３Ｃマ２２１を１中コードす る遺伝子を含有する）およびｐｃｃｓＦ−１７（これは５ＣＳＦをシラコードす る遺伝子を含有する）は、ヒトＣ５Ｆ−１の、それぞれ、原核生物および真核生 物の発現のために好ましい。Ｅ、　ｃｏｌｉ株ＤＧ１１６の中に形質転換された プラスミドｐＬｃｓＦ２２１Ａ（以後Ｅ、　ｃｏｌｉ　（２２１））は、ＡＴＣ ＣＣに１９８７年４月１４日に受け入れ番号６７３９０で受託された。Ｅ、　ｃ ｏｌｉ　ＭＭ２９４の中のｐｃＣ３Ｆ−１７は、ＡＴＣＣＣに１９８５年６月１ ４日に受け入れ番号５３１４９で受託された。

また、５ＣＳＦおよびＬＣＳＦの最初の３−１５０または４−１５０酢酸および Ｃ−末端の欠失を含有するアミノ酸配列、例えば、ＬＣＳＦ／マ２２１からなる Ｃ３Ｆ−１タンパク質が好ましい。

Ｃ５Ｆ−１の活性は、以下の実施例において、部分的に精製されたＭＩＡＰａＣ ａのＣ５Ｆ−１、ネズミＬ細胞Ｃ３Ｆ−１、ＣＶ−１により生産された組み換え 物質またはＥ、　ｃｏｌｉにより生産されたヒトＣ３Ｆ−１を使用して決定され た。Ｃ５Ｆ−１は、誘発されたヒト単球によるインターフェロン（ＩＦＮ）およ び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の生産を、１０〜３０倍まで増強することか示された 。Ｃ３Ｆ−１はまた、マクロファージのｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗腫瘍毒性を刺激し、 ｉｎ　ｖｉｖｏ腫瘍増殖を阻止し、マウスを致死的バクテリアの感染から保護し 、組織損傷のｉｎ　ｖｉｖｏ修復を促進し、サイトメガロウィルスのｉｎ　ｖｉ ｖｏ増殖を阻止し、そして酵母のｉｎ　ｖｉｖ。

増殖を阻止することか証明された。次の実施例によって、特許請求した治療的使 用を説明する。これらの実施例は本発明を限定しない。

ヒト単球によるＴＮＦの生産の刺激 ＭＩＡＰａＣａのＣ５Ｆ−１を上澄み液からリン酸カルシウムゲル濾過およびレ ンチルレクチンクロマトグラフィーにより精製した。リンフ才力イン生産のアッ セイのために、末梢血液−付着性細胞を各々１０７細胞を含有する二重反復実験 のフラスコの中でインキュベーションした。１個のフラスコを１００ＯＵ　／ｍ ｌの上のようにして精製されたＣ３Ｆ−１で処置した。３日後、細胞を収獲し、 洗浄し、そして５Ｘ１０５／ｍｌの細胞濃度に再懸濁し、そして２４ウエルプレ ートの中に０．５ｍｌ／ウェルでプレートした。ウェルを１０μｇ／ｍｌリポ多 糖（ＬＰＳ）および２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡで処理し、そして上澄み液をＴＮＦ アッセイのために収獲した。Ｃ３Ｐで処理した細胞は、未処理細胞よりほぼ９倍 高いＴＮＦの分泌を示した（１６２Ｕ／ｍｌに比較して、＋５００Ｕ／ｍｌ）。

ヒト単球によるインターフェロンの生産の刺激インターフェロンの生産に対する Ｃ５Ｆ−１の効果を決定する類似する実験において、末梢血液−付着性細胞を、 前述したように、１０００Ｕ／ｍｌのＣ３Ｆ−１の存在および不存在下に３日間 インキュベーションし、収獲し、５　ｘ　１０’　／ｍｌて再懸濁させ、そして 前述したように２４ウエルのプレートの中にプレートした。インターフェロンの 生産のために、変化する量のポリ（■）：ポリ（Ｃ）の添加により細胞を誘発し た。上澄み液を、ＶＳ■感染した０Ｍ２５０４細胞への細胞変性作用により、イ ンターフェロンの生産についてアッセイした。Ｃ３Ｆ−１刺激した細胞は、５０ μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）で誘発したとき、１００　Ｕ／ｍｌの生産 を示したが、同等に誘発された未処理細胞は３Ｕ／ｍｌより少なくを生産した。

ヒト単球による骨髄様Ｃ３Ｆの生産の刺激単球を士Ｃ３Ｆ−１と３日間インキュ ベーションし、次いで表１におけるように骨髄様ＣＳＦの生産について誘発した 。示した３つの代表的な実験において、異なるドナーからの血液を使用した。

実験ｌ　実験２　実験３ 誘導　−ＣＳＦ　＋ＣＳＦ　−Ｃ３Ｆ　＋Ｃ３Ｆ　−ＣＳＦ　＋Ｃ３Ｆ媒地　ｏ ｏｏｏｏ。

したかって、Ｃ５Ｆ−１は骨髄様Ｃ３Ｆまたはコロニー刺激活性の生産を刺激す る。

ネズミマクロファージによる腫瘍細胞の殺しの刺激：マクロファージの刺激を測 定するために、ネズミマクロファージが肉腫ターゲットを殺す能力の刺激を示す アッセイにおいて、ｐｃＣ３Ｆ−１７から組み換え的に生産されたＣ３Ｆ−１の ためのモデルとして、Ｌ−細胞−コンディショニング培地から得られたネズミＣ ３Ｆ−１を使用した。このアッセイにおいて、２時間の付着性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマ ウスの腹膜のマクロファージを、Ｃ５Ｆ−１の存在および不存在下に、１日間ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏインキュベーションし、次いで２０：ｌの比で３Ｈ−チミジン標 識したマウス肉１１１ＴｔＪ５細胞と１０％（Ｖ／Ｖ）のＣｏｎＡで誘発した（ １０μｇ／ｍｌ）牌臓すンフォカイン（ＬＫ）　（これはガンマ−インターフェ ロンを含有する）と−緒に混合した。このアッセイにおいてＬＫ調製物を精製さ れたガンマ−インターフェロンにより置き換えることができる。次の４８時間に わたる標識したチミジンの解放を腫瘍細胞の殺しの測定値として使用した。１２ ００Ｕ／ｍｌのＣ３Ｆ−１を含有するネズミＬ−細胞コンディショニング培地と してＣ５Ｆ−１を添加する効果を表２に示す。

精製されたネズミＣ３Ｆ−１並びにＣＶ−１およびＥ、　ｃｏｌｉ　（２２１） からのｒｈＣ３Ｆ−１もまた、このアッセイにおいて有効であった。

表２ 処　理　殺し　Ｃ５Ｆ−１による増加 第１日　第１３日　％　％ −ＣＳＦ−１＋ＬＫ　４９　２６ Ｃ３Ｆ−Ｉ　ＬＫ　５１　３１ Ｃ３Ｆ−Ｉ　Ｃ３Ｆ−１＋ＬＫ　６０　５４−Ｃ３Ｆ−１＋ＬＫ　４７　３４ ＣＳＦ−１７−− Ｃ５Ｆ−Ｉ　ＬＫ　４９　４０ Ｃ３Ｆ−Ｉ　Ｃ３Ｆ−１＋ＬＫ　６９　９７増殖の前１日または誘発期間の間に Ｃ３Ｆ−１を添加するかどうかにかかわらず、ターゲット細胞を殺す能力の増加 が認められた；しかしながら、最も劇的な効果は、Ｃ３Ｆ−１がこれらの両者の 期間の間に存在したときに観察された。

単球およびマクロファージの刺激の原因としての汚染するバクテリアのＬＰＳの 可能性は排除された：適用したＣ３Ｆ−１のＬＰＳの含量は低かった（　＜０． ３ｎｇ／　３０００　ＵのＣ５Ｆ−１、リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）の変形細胞 のリゼイト（ＬＡＬ）アッセイによる）；活性を抗Ｃ５Ｆ−１カラムへの適用に より除去した；ポリミキシンＢを使用してＬＰＳを中性した；Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマ ウスからのマクロファージはＣ５Ｆ−１に応答したが、ＬＰＳに応答しなかった 。

他のミニロイドＣ３Ｆの効果 ５μｇのＬＰＳの静脈内ｃｉ、　ｖ、）投与後５時間に得られた６匹のマウスの 肺から、ＣＳＦ−ＧＭを調製した。肺を細かく切り、血清不含培地の中で３日間 インキュベーションしそして、ＷＯ３６１０４５８７、前掲、に記載されている ように、ＹＹＧ１０６免疫アフィニティーカラムを使用して上澄み液からＣ３Ｆ −１を消耗した（Ｃ３Ｆ−１の含量は２２７　Ｕ／ｍｌから７８Ｕ／ｍｌに減少 した）。Ｃ５Ｆ−Ｇを同様に処理したＬＤＩ（黒色腫細胞系）の血清不含培地か ら調製した。ＣＳＦ−ＧＭおよびＣ３Ｆ−Ｇの両者の含量は、コロニー刺激アッ セイにより、２０００Ｕ／ｍｌにおいて測定した。

腹腔マクロファージを４０％の前述の培地または２０００Ｕ／ｍｌのＣ５Ｆ−１ で測定したＬ−細胞培地と１日間インキュベーションし、次いで追加の培地また はＬＫと４８時間インキュベーションし、そして前述したようにＴＵ５の殺しに ついて測定した。

結果を第１図に示す。Ｃ５Ｆ−１はＴＵ５に対する毒性の顕著な増強を示したが 、Ｃ５Ｆ−ＧおよびＣＳＦ−ＧＭはいずれも効果をもたなかった。

ＡＤＣＣの刺激因子としてのＣ５Ｆ−１のｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験ＭＩＡＰａＣａ 細胞系から精製されたＣ５Ｆ−１（はぼ４０％の純度、比活性はぼ２　ＸＩＯ’ 　Ｕ／ｍｇ）　、ネズミＬ−細胞コンディション培地（比活性はぼ２．３ｘ１０ ６Ｕ／ｍｇ）　、およびＣＶ−１からの組み換えヒト（ｒｈ）（〉９５％の純度 、比活性はぼ４Ｘ１０７）は、ＩＬ−２またはアルファー、ベーターまたはガン マ−ＩＦＮと組み合わせて、腫瘍ターゲットに対するマウスのマクロファージの ＡＤＣＣを刺激することが見出された。

ＡＤＣＣのアッセイにおいて、雌のＣ３Ｈ／ＨｅＮまたはＣ３Ｈ／ＨｅＪ　７ウ スに１．５ｍｌのプロテ才−スペブトン（［ｆｃＬｌｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミ シガン州デトロイト）を腹腔内（ｉ、　ｐ、）注射した。３日後、腹膜の滲出細 胞を３Ｘ１０’個のｂｉｇ細胞１０．５ｍｌアルファーＭＥＭ培地＋１０％加熱 不活性化胎児仔ウシ血清において平行の組のレプリカ１ｍｌのウェルに付着させ た。２時間後、ウェルをＰＢＳで３回よく洗浄し、そしてＣ５Ｆ−１またはリン フ才力インを添加し、モして３７°Ｃにおいて２日間インキュベーションした。

細胞集団は形態的に〉９５％のマクロファージであり、そして第２日に平行のウ ェルにおいて回収された細胞数は異なる処理について同様であった。第２日に、 加熱不活性化抗血清（抗Ｔｈｙ　、ウサギ抗マウス脳、Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ、　＝！−ヨーク州ウつストバーリイ）を、種々の希釈で平行の 組の１つの添加した。

ターゲット、Ｒ１，１，７−リンパ腫の細胞系をマクロファージのウェルおよび マクロファージ±Ｃ３Ｆ−１、リンフ才力インまたは抗血清を含まない平行のウ ェルに添加した。

高い濃度（１Ｈｇ／ｍｌ）のバクテリアＬＰＳはマクロファージのＡＤＣＣを刺 激するので、ネズミおよびヒトのＣ５Ｆ−１ｍ製物をＬＡＬアッセイにより試験 し、そして０．２ｍｇ／ｍｌより少ないＬＰＳを有していた。

次いで、１０ｓのＲ１，１タ一ゲツト士抗血清を導入し、そして生きているター ゲット細胞を９．２４．４８および９６時間に計数することによって、マクロフ ァージを３：ｌのエフエクタｍ：ターゲットの比でＡＤＣＣについて試験した。

対照マクロファージ＋抗体を伴うＲ１，１の増殖は、抗体の不存在下に対照また はサイトカイニン処理したマクロファージの増殖、あるいはＲ１，１単独士抗体 士サイトカイニンを伴う増殖のそれと同一であった。結果を表３に示す。

表３ 培地　０　０　０ Ｍ−Ｃ３Ｆ　０　０　０ ＩＦＮ−ガンマ−４４±５　６３±３　７２±３本ＡＤＣＣ殺し％＝　１００（ ｙ−ｘ）／ｙ１　ここでｙ＝ツタ−ット細胞の数−抗血清、そしてＸ＝ターゲッ ト細胞の数＋ｌ　：　２０．０００希釈の抗血清。

ｒＦＮ−ガンマを５Ｕ／ｍｌで使用した。

ＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−ベータは５ＯＵ／ｍｌにおいて５Ｕ／ｍｌのＩ ＦＮ−ガンマと同一のＡＤＣＣ−刺激作用を有した。ＩＦＮ−アルファおよびｒ ＦＮ−ベータは５ＯＵ／ｍｌにおいてＡＤＣＣに対する作用を本質的にもたない か、Ｃ５Ｆ−１の存在下に腫瘍の殺しを５ＯＵ／ｍｌの各々［ＦＮの単独を使用 して見られるレベルに刺激した。同様な作用はｒｈＩＬ−２で見られた：５Ｕ／ ｍｌ５Ｕ／マクロファージを２日間処理すると、マクロファージのＡＤＣＣか有 意に促進された。Ｃ５Ｆ−１はこの強いＩＬ−２誘発された活性を適度に増強し た。しかしながら、ＩＬ−２はＩＵ／ｍｌまたは０゜２Ｕ／ｍｌのより低い無効 の濃度で使用したとき、Ｃ３Ｆ−１の添加は殺腫瘍活性について強い増強作用を 示した。

他のリンフすカインをＡＤＣＣの一次的刺激因子として試験した。ｌ。

ｌＯまたは１００　Ｕ／ｍｌのｒｈＴＮＦ単独と共に、あるいは１００ＯＵ／ｍ ｌのＣ３Ｆ−１と共にマクロファージを２日間インキュベーションすると、ＡＤ ＣＣ活性は有意に誘発されなかった。ｒｈＩＬ−１アルフアまたはベータは０． ２〜５０Ｕ　／　ｍｌにおいて、そしてネズミｒｌＬ−４はｌ−１００Ｕ／＋ｎ ｌにおいて、やはりＡＤＣＣ単独でまたはＣ３Ｆ−１とともに刺激しなかった。

Ｃ３Ｆ−Ｉの代わりに使用することかできる他のコファクターを発見することを 試みた。ネズミｒＧＭ−ＣＳＦおよびｒｌＬ−３は、１０．１００または１００ ０Ｕ／ｍｌにおいて試験したとき、ＡＤＣＣ単独またはＩＦＮ−ガンマとともに マクロファージの標準的２日の予備処理において、Ｃ３Ｆ−１と対照的に、促進 しなかった。これらのサイトカイニンは、培地の中で２日間インキュベーション した後、マクロファージの不存在下にＲ１，１ターゲツトの増殖について作用を もたなかった。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏターゲッテッドＡＤＣＣアッセイ末梢血液のマクロファージへ のＣ３Ｆ−１の作用を研究して、Ｃ５Ｆ−１を使用する予備処理がターゲラテッ ドＡＤＣＣを増強することができるかどうかを決定した。

ヒトエフェクター細胞をスタッフォード大学の血液銀行（ＳｔａｎｆｏｒｄＵｎ ｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｏｏｄ　Ｂａｎｋ）　（カリフォルニア州パロアルト） から入手したドナーのバフィーコートから単離した。単核細胞をフィコール−ハ イバーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）分別遠心により分離した。付着性単 核細胞（ＡＭＣ）を単離するために、全単核細胞を２４ウエルの組織培養プレー トの中にプレートし、そして３７°Ｃ，５％ｃｏ、において３０分間付着させた 。付着しない細胞を加温したバンク均衡塩溶液および５０Ｍｇ／ｍｌのゲンタマ イシンで洗浄除去した。すべてのエフェクター細胞の調製物の生存可能性はトリ ブタンブルー色素の排除により〉９５％であった。付着性単核細胞をＦＩＴＣ抗 ＬｅｕＭ３（Ｂｅｅｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州マウンテン ビュー）で染色し、そしてＥＰＩＣ３Ｖ細胞ソーターで〉８５％のＬｅｕＭ３陽 性であると分析された。

抗体のへテロ接合体１１３ＰＩＦ（ａｂ’）ｚ−３Ｇ８Ｆ（ａｂ’）、　、肺癌 関連抗原およびヒトＦｃＲＩＩ［（ＣＤ１６）の両者を認識する化学的に連結し た抗体、およびハイブリッドのハイブリドーマ由来の二重特異性抗体２Ｂ１（こ れは抗ＣＤ１６および抗ｅｒｂＢ−２の活性を有する）を次の実験において使用 した。これらの抗体の両者は、エフェクターとしてヒトの全体単核細胞を使用し て、５Ｋ−Ｂｒ〜３−ターゲット細胞のすぐれた特異的溶解を仲介する。

ＡＤＣＣアッセイの１日前に、Ｔ７５フラスコの中にターゲット細胞（５０％の フンフルエンド）を２５ｍ１の培地の中て６２．５μＣｉの３Ｈチミジン（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　６．７μＣｉ／μＣ上ル）て標識した 。３０時間後、細胞をフラスコの中でトリプシン処理し、そして３回洗浄した。

４０．０００／ウエルの標識したターゲット細胞をアッセイに使用した。

エフェクター細胞、抗体およびＣ５Ｆ−１を希釈するためにアッセイを通じて使 用した培地は、８［１１Ｍのグルタミンを含むＡＩＭ、　Ｖ血清不含培地（Ｇｉ ｂｃｏ）であった。最終の合計の体積は１ｍ１／ウエルであった。

Ｃ３Ｆ−１の処理のために、Ｃ３Ｆ−１を含むか、あるいは含まない培地をエフ ェクター細胞に添加し、そして２〜３日間インキュベーションした。次いて、抗 体および標識したターゲット細胞を添加した。３日後に、上澄み液の中のトリチ ウムの解放をシンチレーション流体としてのシトシント（ＣｙｔｏｓｃｉｎｔＸ ＩＣＮ）を用いて測定した。

各試料を各実験において４平行において試験した。平行のウェル対ウェルの変動 は通常平均値の±２０％より小さかった。平行の平均のトリチウムの解放を使用 して、式：　（平均の試料の解放−自然的解放）（最大の解放−自然的解放）に より、特異的溶解％を計算した。

自然的解放を測定するために、標識したターゲット細胞を培地単独の中でインキ ュベーションし、そして上澄み液を３ヨ後に計数した。

ターゲット細胞からのトリチウムの自発然解放（エフェクター細胞の不存在下） はすべての実験において平均して１０％より小さかった。

ターゲット細胞単独とインキュベーションしたとき、抗体およびＣ５Ｆ−１のい ずれも自然的溶解を増加しなかった。最大の解放を測定するために、標識したタ ーゲット細胞を０．５％のＳＤＳの最終濃度で溶解した。

ヘテロ接合体の１１３ＰＩＦ（ａｂ’　）ｚ−３Ｇ８Ｆ（ａｂ’　）２力月μｇ ／ｍｌにおいて２つのドナーからのＡＭＣて溶解を仲介する能力を、第２図に示 す。

ＡＭＣ十へテロ接合体を５Ｋ−Ｂｒ−３に対して２０：ｌのＥＡＴ比で試験した とき、観測された平均の抗体依存性溶解は２８％であった。第２図に示すように 、エフェクター細胞を１４％ｇ／ｍｌのＣ５Ｆ−１と予備インキュベーションし たとき、ヘテロ接合体仲介の溶解はほぼ１１０％だけ増強された。

合計の１１ドナーからの付着性細胞を二重特異性抗体２Ｂ１のＦ（ａｂ’　）２ 断片を使用して試験した。ヒトＡＭＣ上のＦｃＲＩおよびＦｃＲＩ　Ｉの起こり 得る参加を回避するために、２Ｂ１のＦｃＲＩ　Ｉをこの研究において全２Ｂｌ の代わりに使用した。（２Ｂ１の２つの親の抗体、　５２０Ｃ９および３Ｇ８の Ｆ（ａｂ’）ｚ断片は特異的溶解を仲介しないが、２Ｂ１のＦ（ａｂ’）、がタ ーゲット細胞のほとんど完全な溶解を引き起こすことを示すために、さらに実験 を実施した。）ＣＳＦ−１の作用を１０−１００　ｎｇ／ｍｌのにおいて研究し て、Ｃ３Ｆ−１か２Ｂ１のＦ（ａｂ’　）ｚにより仲介される溶解の増大におい て有効であるかどうかを観察した。１４〜１００　ｎｇ／ｍｌのＣ３Ｆ−１と予 備インキュベーションしたＡＭＣは、Ｃ５Ｆ−１を使用しないＡＭＣの予備イン キュベーションより高い特異的溶解を与えた（第３図）。

得られたターゲット細胞の溶解の合計量はドナー毎に変化したが、Ｃ３Ｆ−１処 理を使用する比溶解活性の増加はすべての単球調製物において再現性があった。

応答性が最小であるか、あるいは応答しないドナーのＡＭＣを刺激するためには Ｃ５Ｆ−１のより高いレベルが必要であるので、Ｃ３Ｆ−１の投与量の応答の研 究は１００　ｎｇ／ｍｌの２８１のＦ（ａｂ’＞２を使用して実施し、そして結 果を第４図に示す。２８１のＦ（ａｂ’　）２の導入前に、ＡＭＣを増加する濃 度のＣ５Ｆ−１と予備インキュベーションすると、１０ｎｇ／ｍｌので開始して 、より高い特異的溶解か得られ、そしてすべてのドナーにおいて１００　ｎｇ／ ｍｌにおいてなおプラトーとなｃｖ−ｉ細胞系から組み換え的に生産されたＣ５ Ｆ−１（Ｃ１５８）（ＬＡＬアッセイ；２ＢのＬＰＳ　／ｍｌ、８ｎｇのＬＰＳ 　／ｍｇのＣ３Ｆ　、２　Ｘｌ、０”　Ｕ／ｍｇ）を、７日前にＭｅｔｈＡ肉腫 を皮下的に移植した２０ｇのマウス（３匹のマウス／群）の中に、５０ｇｇ／投 与で１日２回５日間ｉ、　ｐ、注射した。

Ｃ３Ｆ−１処置の開始後６日間、３匹の未処置および３匹の処置したマウスを体 重および腫瘍の体積に一ついて評価した。体重の変化により測定して、毒性の証 拠は存在し２なかった。第７日に、各群からの１匹のマウスを比較組織病理学的 分析のために殺した（全体の徴候なし）。４匹の残りのマウスをＭｅｔｈＡのモ デルにおいて通常１４日間評価した。結果を下表４に示す。

表４ 処理　％ Ｄａｙ　Ｃ３Ｆ−１緩衝化生理食塩水　ΔＴＶ処理腫瘍体積の平均の変化（ΔＴ Ｖ）　ΔＴＶ対照３　２．０　２．２　９１ ６　２．０　６．８　３８ ７　４．１　８．０　５１ ８　５．７　１１．０　５２ ＋４　１３．９　２９．４　４７ ΔＴＶ＝マウスの単一群内の示された日における平均の腫瘍体積／第０日におけ る平均腫瘍体積の比 結果が示すように、Ｃ５Ｆ−１仲介の効力が、とくに第６日の腫瘍体積の測定に おいて、存在した。Ｃ５Ｆ−１群と対照群との間の差は、処置の開始後最初の７ 日問およびその後７日間最大であり、その後腫瘍はその通常の増殖速度に戻った 。これらのデータが示唆するように、多数回の毎日投与（より長い期間の間、こ の投与レベルにおいて効力を改良するための連続的注入）またはより高い投与レ ベルおよび薬物なしの日を含むように変更したスケジュールは効力を増強するで あろう。

同様な結果は、Ｅ、　ｃｏｌｉからノＬＣＳＦｃマ１９０　、およびＬＣ３Ｆ／ ｃマ２２１を使用して見られた。プロトコルは５匹のマウスの群を使用して実施 した：５０μｇ／５０ｇ各生産物を使用し、そして投与（１日２回、５日間）は 類似しタカ、タタしＥ、　ｃｏｌｉ　（７）ＣＶ１５０おヨヒｃマ１９゜の物質 を使用し、ここでスケジュールを１０日に増加し、そして投与を７〜８時間に間 隔にした。各Ｃ５Ｆ−１誘導した物質について、ΔＴＶ処置／ΔＴＶ対照の百分 率として、結果を表５に表す。

ＣＳＦ−１を８１６の実験的転移のモデルにおいて試験して、肺の転移の予防へ の効果を評価した。

ｌＸｌ０’腫瘍細胞を０．２ｍｌのＣａ”およびＩＪｇ　＋！不含のＨＢＳＳの 中に懸濁させ、麻酔しないマウスの横の尾の静脈に接種した。腫瘍の接種後、肺 および脳を取り出し、水の中にリンスし、そして秤量した。

ボウイン（Ｂｏｕｉｎ）溶液の中で固定し、そして表面の腫瘍の節の数／肺の対 を解剖スコー９の助けにより決定した。

組み換えヒトＣ３Ｆ−１（Ｎマ３Ｃ２２１）をすへての実験について使用した。

Ｃ５Ｆ−１は各実験の前に凍結ストックから新しく準備し、そして注射直前に米 国薬局方０．９％の生理食塩水の中で希釈した。Ｃ５Ｆ−１を１日１回（ＱＤ） 　Ｘ１０日のスケジュールで静脈内に供給した。使用する投与量のレベルは次の 錠剤に記載されている。非特異的および非治療的タンパク質から成る陰性の対照 として、米国薬局方ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または沸騰したＣ５Ｆ−１を 使用した。Ｃ３Ｆ−１を３０分間沸騰させてＣ５Ｆ−１活性を不活性化した。

表６に示す効力のデータが証明するように、ｌＸｌ０’腫瘍細胞の静脈内接種３ 日前に開始した、ＱＤＸＩＯで静脈内に与えたＣ５Ｆ−１は、肺の転移のメジア ン数の有意な減少を生成する。対照的に、Ｃ５Ｆ−１の治療を腫瘍細胞接種後１ 日に開始した場合、肺の転移のメジアン数の有意な減少は観察されなかった。致 死率により測定した、明白な毒性はこの投与量レベル（２，５〜５．０）におい て観察されなかった。

表６ 肺転移のメジアン数 群　投与量　治療開始日　（範囲） ８この群と対照との間の差はｐ　＝　０．００２において有意である（Ｍａｎｎ −Ｗｈｊ　ｔｎｅｙ）。

第２の実験において、Ｃ３Ｆ−１をｉ、　Ｖ、　ｇｐｘ　５投与した。Ｂ１６− ＷＩＯ腫瘍細胞を短時間の１分のトリプシン処理により収穫し、遠心し、次いで ＣａおよびＭｇ不含のＨＢＳＳ中の単一の細胞懸濁液として調製した。

第０８に、０．８　ＸＩＯ’細胞をマウス当たりに０．２０１１の合計の体積で 横の尾の静脈に注射した。Ｃ５Ｆ−１（Ｅ、　ｃｏ１ｉＮマ３Ｃマ２２１）処理 （０，２５〜５、０　ｍｇ／　ｋｇ／日）を、第一３日に開始して、ＱＤＸ５． 　ｉ、　ｖ、投与した。第１４日に、マウスを殺し、肺を取り出し、水の中でリ ンスし、次いでボウイン固定液で固定した。表面の腫瘍の節を解剖スコープの助 けにより計数した。表７に下に示すように、Ｃ５Ｆ−１は、１．０゜２．５また は５．０　ｍｇ／ｋｇ／日、ＱＤＸ５でｉ、　Ｖ、投与したとき、肺の転移のメ ジアン数を有意に減少した。

表７ 群　投与量　メジアン　肺転移の数（個々の値）　ｐ−値８０、０００の腫瘍細 胞ｉ、　Ｖ、第０日処置：　ＨＳＡまたはＭ−ＣＳＦ　ＱＤＸ　５、第３日に開 始１０ＢＤＦ−１マウス／群、第４日に殺す次の実験は、ｉ、　ｖ、投与すると きのＣ５Ｆ−１と等しく有効である皮下（ｓ、　ｃ、）または腹腔内（ｉ、　ｐ 、）のルートによりＣ３Ｆ−１を投与できることを示す。

腫瘍細胞は上に教示されるように調製した。第０日に、７．５Ｘ１０’細胞をマ ウス（５〜１０匹の雌のＢＤＦ−１マウス／群）当たりに０．２ｍｌの合計の体 積で横の尾の静脈に注射した。Ｃ３Ｆ−１を５　ｍｇ／　ｋｇ／日で、第一３日 に開始して、ＱＤＸ５．３つの異なるルートで投与した。第１８日にマウスを上 に教示するように調製した。結果を下表８に示す。

表８ 肺転移の数 群３１　投与経路　メジアン　個々の数２、　Ｍ−Ｃ３Ｆ　ｉ、　Ｖ、　１．０ 　０．０．　ｌ、　１０．３０３、　ＨＳＡ　ｉ、　ｐ、２２．０　１６．１７ ．２２．３３．３４４、　Ｍ−ＣＳＦ　ｉ、ｐ、　１．０　０．１．１．３．４ ’５、Ｍ−Ｃ３Ｆ　ｓ、ｃ、　２．０　０．１．２，２．９’８、　Ｍ−ＣＳＦ 　ｉ、ｖ、　２．０　０．０．０．１，１．３．４．４．６．３３’９、Ｍ−Ｃ ３Ｆ　ｓ、ｃ、　２．５　０，０，０，２．２，３．３．４．４．７２’６群６ 〜９は群１〜５からの別の実験において使用したｂ　ｐ−値は適切なＩＳＡ対照 と比較して０．０５より小さい次の実験は、アルゼト（Ａｌｚｅｔ）浸透圧ポン プおよび皮下ポーラス投与を使用して皮下的に実施した連続的注入により投与し たＣ３Ｆ−１の効力を比較する。Ｃ５Ｆ−１をＳ、　Ｃ，ポーラスとして、ある いは０．９％のＮａＣ１中の連続的注入として投与した。連続的注入をＳ、　Ｃ ，移植したアルゼトボンブ、１００３Ｄｆｆｉおよび２００１型（これらはＣ５ Ｆ−１を、それぞれ、第３日または第１４日に供給した）を使用して実施した。

１００３Ｄ型ポンプは１μｍ／時の平均ポンピング速度および８７μｍの平均充 填体積を有する。ポンプの移植のために、ＢＤＦ−１雌（１８〜２０ｇ）をメト ファン（Ｍｅｔｈｏｆａｎｅ）で麻酔し、そして小さい背中の切開を皮膚の中に 作った。ポンプは皮膚の下に切開から離れた方向をさす流れモデレータ−ととも に移植した。切開を創傷のリップで閉じた。すべての治療は第一３日に開始した 。

第０日に、７．５　Ｘ　ＩＯ’Ｂ１６−ＷＩＯ腫瘍細胞をマウス当たりに０．２ ｍｌの合計の体積で横の尾の静脈に２７ゲージの針を使用して注射した。第１８ 日に、マウスを殺し、肺を取り出し、水の中でリンスし、次いでボウイン固定液 で固定した。

表９に示すように、Ｓ、　Ｃ，連続的注入により０．２５ｍｇ／　ｋｇ／日程日 程像い投与量で投与したＣ３Ｆ−１は肺転移のメジアン数を減少するとき高度に 有効であった。

これらの研究が示唆するように、Ｃ５Ｆ−１は、Ｓ、　Ｃ，連続的注入により投 与したとき、１日１回Ｓ、　Ｃ，ポーラスにより同一期間にわたって与えた同一 投与量より、少なくとも１０倍以上効力かある。

表９ マウスにアセルゼト浸透圧ポンプを皮下的に移植した。

この実施例は、Ｃ５Ｆ−１およびＩＦＮ−γの外に、ある数のサイトカイニンを 腫瘍細胞の細胞障害性の増強について試験した。単核細胞（ＭＮＣ）を、正常の 健康なボランティアのヘパリン処理した静脈の血液またはバッフィコートから、 リンパ球分離媒質上の密度勾配遠心（ＬＳＭ−Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ 　Ｃｏｐｒ、、ノースカロライナ州ダーハム）により分離した。次いてＭＮＣを ＰＢＳで２回洗浄し、そして４９．２％の等張パーフル（Ｐｅｒｃｏｌｌ）（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）上に層状にしそして１５００Ｘｇで２５分間遠心した。界面 における単球（細胞遠心調製物の形態学的分析により２８０％の純度の単球）を 収穫し、モして３７°Ｃにおいてプラスチックの付着によりさらに精製した。付 着を９６ウエルのプレートの中で１．２　ＸＩＯ’細胞／ウェルの密度で実施し た。１１時間後、非付着性細胞を激しい洗浄により除去して、はぼｌＸｌ０’細 胞／ウエルの残した。

精製された単球を、Ｃ５Ｆ−１（Ｅ、　ｃｏ１ｉＮマ３Ｃマ２２１）、ＩＬ−１ ，ＴＬ−３，ＩＬ−４゜ＧＭ−ＣＳＦ　（すべてＧｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ、か ら）　、ＩＬ−２（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ、）を含有する０、１％のＦｅ２　、 または培地単独（１’誘発）の中で３日間培養した。３日後、単球を洗浄し、次 いで２°誘発因子とさらに２日間インキュベーションした。Ｃ５Ｆ−１の存在ま たは不存在下の１°誘発をいくつかの実験においてフラスコの中で実施した。単 球を組織培養フラスコの中で実施した。単球を直接組織培養フラスコの中で付着 させ、非付着性細胞を除去し、そして１°誘発因子を添加した。

１０誘発後、単球をトリプシン処理およびおだやかな引っ掻きにより収穫した： 生存可能な細胞の計数をトリパンブルーの排除により実施し、そしてｌＸｌ０’ 細胞／ウエルをプロトコルの残りの２日のために９６ウエルのプレートの中でプ レートした。

ＷＥＨ１１６４殺腫瘍アッセイ（Ｃｏｌｏｔｔａら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１ ９８４）　１３２　；９３６）を使用して、サイトカイニンの細胞障害性を試験 した。簡単に述へると、活性な対数期のＷＥＨ１１６４ターゲット細胞をアクチ ノマイノンＤ　（ａｃｔＤ）でｌμｇ／ｍｌにおいて３時間処理し、洗浄し、そ して２００μＣｉのＧ　Ｉ　Ｃｒて標識するか、あるいはａｃｔＤおよびｓｌＣ 「で１時間３７°Ｃにおいて５％のＣ０２の中で同時に処理した。単球から１０ ０μｌの培養上澄み液を除去した後、標識したターゲット細胞を１００μｌの体 積のエフェクター細胞に添加して、特記しない限り、１０：ｌのエフェクター／ ターゲットの比を達成した。細胞を２００μｌの体積で５％の００２の中で３７ °Ｃにおいて６時間インキュベーションした。

次いでプレートをテーブルトップのスウィンギングバッヶットの遠心機で１２０ ０ｒｐｍにおいて５分間遠心した。１００μｍの上澄み液を各ウェルから除去し 、そしてガンマカウンターで計数した。

Ｐ８１５ターゲット細胞を同様に処理したが、ただしアクチノマイシンＤの予備 処理を省略し、そしてターゲット細胞およびエフェクター細胞を同時に１８時間 インキュベーションした。

誘発された細胞障害性％は、次の式を使用して計算した：（実験のｃｐｍ−自発 的ｃｐｍ）　／　（最大のｃｐｍ−自発的ｃｐｍ）］　ｘ　１００ここで、 実験のｃｐｍ　＝エフェクター細胞＋ターゲット細胞＋誘発因子自発的ｃｐａ＋ 　＝エフェクター細胞＋ターゲット細胞＋培地最大のｃｐｍ　＝　１％のＳＤＳ で溶解したターゲット細胞単独結果を表ＩＯおよび１１に示す： 誘導のプロトコル １、　培地　Ｃ５Ｆ−Ｉ　Ｃ５Ｐ−１ ２、Ｃ５Ｆ−Ｉ　Ｃ５Ｆ−１培地 実験２　１２％　４９％　３７％ 実験３　４％　８％　５％ 実験４　７％　１９％　９％ Ｃ５Ｆ−１により誘発される活性のレベルは可変であるが、４ｏのこのようなド ナーのうちの１６はＣ３Ｆ−１単独で刺激したとき１０％〜４９％の増強された 殺腫瘍活性を示した。

表１１．　Ｃ３Ｆ−１を種々の２°誘発因子の添加前に１０誘発因子として使用 した。

２°刺激　１０刺激　Ｍ−Ｃ３Ｆ、　１００００／ｍｌ培地対照　２ Ｍ−ＣＳＦ　１００ＯＵ／ｍｌ　１　１１ＬＰＳ　ｌμｇ／ｍｌ　４　２６ ［ＦＮ−７１０／ｍｌ　Ｏ７ ＩＦＮ−７１０００／ｍｌ　２　１３ ＬＰＳ　ｌμｇ／ｍｌ＋ ＩＦＮ−７（１０／ｍｌ）　１１　２９ＬＰＳ　ｊμｇ／ｍｌ＋ ［ＦＮ−γ（１０００１０１１）　７　４９ＬＰＳ　ｌμｇ／ｍｌ→ ＰＭＡ　２ｏｇ／ｍｌ　２２　５３ ＬＰＳ　１０ｇｇ／ｍｌ＋ ＰＭＡ　２ｏｇ／ｍｌ　２４　４５ ［Ｌ−２５ＯＵ／ｍｌ　２　５ ［Ｌ−２５０００／ｍｌ　２　７ ２°誘発因子として試験しモしてＣ３Ｆ−１の存在または不存在下に効果をもた なかった他の因子は、５００　Ｕ／ｍｌまでにおいてＩＬ−１゜ＩＬ−３，ＩＬ −４およびＧＭ−ＣＳＦ　を包含した。

ネズミ抗ウィルス活性のｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激付着性チオグリコレート誘発マク ロファージをＣ５Ｆ−１と３日間インキュベーションし、そして■Ｓ■で一夜感 染させた（Ｌｅｅ、　Ｍ、Ｔ、ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７）１３８： ３０１９−３０２２）　ｏ表１２は、付着したままである細胞の５５０ｎｍにお ける吸収により測定した、結晶の紫色の染色を示す。

表１２ 培地／ウィルスなし　０．３４６±０．０２培地＋ウイルス　０．１７０±０． ０２ＣＳＦ−１，１０００Ｕ／＋ｎｌ＋ウィルス　０．２６４±０．０２ＣＳＦ −１，２０００Ｕ／ｍｌ＋ウィルス０．３５６±０．０４したがって、ＣＳＦ〜 １処理した細胞はｖＳ■に対するマクロファージの保護を示す。

ＣＭＶの感染のＣ５Ｆ−１によるｉｎ　ｖｉｖｏ処理異壓交配したＣＤ−１マウ スをＣＶ−１細胞系から生産されたＣ５Ｆ−１（Ｃ１５８）で４００ｍｇ　／ｋ ｇＳｉ、ｌ）、の投与量で、１日１回５日間、致死投与量より少ないサイトメガ ロウィルス（ＣＭＶ）で感染２日前に開始して、処置した。マウスを感染後第３ 日に殺し、そしてターゲットの器官、例えば、膵臓におけるウィルスの複製の程 度をプラークアッセイにより評価した。結果が示すように、Ｃ３Ｆ−１で処置し たマウスは、生理食塩水で処置した対照マウスと比較して、有意に低下した（５ ７．８％の減少）膵臓のウィルスの力価を有し、ＣＭＶの感染はＣ３Ｆ−１処理 したマウスにおいて厳しくない。

第２の実験において、２０ｇのＢａ１ｂ／Ｃマウス（５匹／群）を、最後のＣ５ Ｆ−１の投与後４時間に、致死量より少ない量のＯＩＣＭＶ（２Ｘ　１０’ｐｆ ｕ／マウス、ｉ、ｐ、）で感染させた。Ｃ３Ｆ−１を１日１回４日間、４つの投 与量のレベル（３，６，０，９，０，２３および０．０６［Ｄｇ／　ｋｇ／日） でｉ、　１１．投与した。この亜急性の感染のモデルにおいて、マウスは、感染 後７日で血液および器官（膵臓、肝臓および腎臓）の中のウィルスの力価（マウ スの胚細胞上のプラーク形成単位）を測定することによって、感染のひどさにつ いて評価した。Ｃ５Ｆ−１で予備処置したマウスは、膵臓、腎臓および肝臓の中 のウィルスの力価を、生理食塩水で処置した対照に比較して７５〜９７％の減少 を示した（Ｐ＜０．０１）。

Ｃ５Ｆ−１の作用は投与量依存性である。３．６．０．９．０．２３および０． ０６ｏ＋ｇ／　ｋｇ／日のＣ３Ｆ−１の投与量において、それぞれ、９７．８． ９５．３．８０．９および６３．１％の平均膵臓ウイルス力価の減少が表１３に 示すように観測された。

平均ウィルス力価（減少％）。

３．６　１６．０＋２．１（９７，８）’　１７．５＋′２．５（９２，１）’ 　２．５＋Ｚ５（９５，７）’０．９　３２．９±６．４（９５，３）’　３５ ．０±１０．０（８４，３）ゝ　１７．５±Ｚ　５（６９，６）’０．２３１３ ５．０±２５．０（８０，９）’　９７．５±ＩＺ５（５ａ２）’　７．５±７ ．５（８７，０）　’０、Ｏｆｉ　２６０．Ｏ＋２５．０（６３，１）　９０． ０＋５．０（５９，６）’　Ｚ５±０（５６，５）ａ＝データは個々に測定した ５匹の動物からの平均の器官の力価を表ｃ＝ｐ＜０．０５ 別々に、Ｅ、ｃｏｌｉ　（Ｎマ３Ｃマ２２１）の中で生産されたＣ３Ｆ−１を致 死的ｍＣＭＶ感染のモデルにおいて試験した（これはＣＭＶの致死的投与量より 少ないＣＭＶを使用する上の実験と対照的である）。５０μｇ　１０．００５１ １ＩｌのＣ５Ｆ−１を１３．５〜１４．５　ｇのＢａ１ｂ／　Ｃ７ウスに第一１ 日または第一１、　０．　１．　２および３日に（与えた単一の投与量／マウス ）ウィルスの対抗前に（４Ｘ　１０Ｓｐｆｕ／マウス、０．２ｍｌ　ｉ、ｐ、） および７日後に投与ｉ、ｐ、Ｉ、たとき、表１４に示すように、生理食塩水で処 置した対照と比較して、生存率の有意の増加が存在した。

対照　３／１０ 急性の感染のモデルにおける予防的作用について、１３〜１４ｇのＢａ１ｂ／　 Ｃマウスを致死的投与量のｍｃＭＶ　（５Ｘ　１０’　〜２　ｘ　ｌｏ’ｐｆｕ ／　マウス、ｉ、　ｐ、　）で最後のＣ５Ｆ−１投与量（０，９ｍｇ／　ｋｇ／ 日〜７．２ｍｇ　／ｋｇ／日の投与量のレベルを使用する）後４時間に感染させ 、そして生存を１４日間監視した。この急性の感染のモデルにおいて、第５図に 示すようにＣ３Ｆ−１は５０．０００１）ｆｕ　／マウスで対抗したマウスにお いて生存率を有意に増加したが、Ｃ３Ｆ−１のより低い投与量（０，９ｍｇ／　 ｋｇおよび３．６ｍｇ／ｋｇ）は１００．０００ｐｆｕ／　７ウスにおけるｍｃ ＭＶで対抗したマウスにおいて効果に劣るように思われた。

これらのデータが証明するように、Ｃ５Ｆ−１は臨床医学においてウィルスの感 染に対する免疫予防剤として使用することができる。Ｃ３Ｆ−１は単独でまたは 他のリンフ才力インまたは抗ウィルス剤と組み合わせて一般にウィルスの感染の 処置において使用することができ、そしてとくに免疫抑制のウィルスの感染、例 えば、後天性免疫欠損症候群（エイズ）において利益である。

好ましいｉ、　ｐ、投与量の範囲は約０．０５〜８．０ｍｇ　／　ｋｇのＣ５Ｆ −１／ｖウス／日である。

Ｃ３Ｆ−１によるバクテリアの感染のｉｎ　ｖｉｖｏ予防的処置異型交配のＣＤ −１マウスに、ＣＶ−１細胞系（短いクローンＣＶ　１５８）から生産されたＣ ３Ｆ−１を個々に投与し、宿主の中に導入したときグラム陰性セブシスを引き起 こすの原因となるバクテリアのＥ、　ｃｏｌｉ（ＳＭ１８）の臨床的分離物の致 死的投与量（ＬＤ、。。６　ｘ　１０７ｃｆｕ）で対抗する１日前に、１回投与 ｉ、ｐ、Ｌ、た（１０μｇ／投与）。次いでマウスを感染後７日間生存について 監視した。

この実験は、また、　ＬＣＳＦＮマ３Ｃマ２２１のバクテリア的に生産されたＣ ５Ｆ−１を使用して実施した。Ｃ５Ｆ−１の各ロットをｌＸｌＯ７〜１．７×１ ０８単位／ｋｇ体重の合計の投与量範囲で４倍の希釈で試験した。

最小の保護的投与量をＥ、　ｃｏｌｉ　（６ｘ　１０”ｃｆｕ／　７ウス）のｉ 、　Ｉ）、感染前の単一の１日量として定義し、この投与量、生理食塩水または 沸騰したＣ５Ｆ−１の対照マウスに比較して、処置したマウスの生存率の統計学 的に有意の（０，０５フイツシヤーの抽出物試験より小さいｐ値）増強を生成し た。

５ａｌｉｎｅ　０ Ｃ３Ｆ−１２，９７ｍｇ／　ｋｇ　１００ＣＳＦ−１０，７４ｍｇ／　ｋｇ　９ ０ＣＳＦ−１０，１８ｍｇ／　ｋｇ　１０煮騰した”’Ｃ５Ｆ−１２，９７ｍｇ ／ｋｇ　Ｏ煮騰したＣ５Ｆ−１０，７４ｍｇ／　ｋｇ　２０煮騰したＣ５Ｆ−１ ０，１８ｍｇ／ｋｇ　Ｏａ　データは感染後第７日に生存する動物の％を表す。

ｂ　加熱不活性化した対照。

宿主の耐性へのＣ５Ｆ−１の作用の誘発に対する投与のスケジュールの効果を研 究するために実験を実施した。マウスの群（１０匹）にＣ３Ｆ−１を０．９ｍｇ 　／ｋｇ／投与７日で第１．　２．　３．　４または５日に投与した。次いで、 マウスをＥ、　ｃｏｌｉ　（６ｘ　１０”ｃｆｕ／　マウス）ｉ、ｐ、で、最後 のＣ５Ｆ−１注射後４時間に、対抗した。

保護的作用を誘発するためには、表１６のデータが示すように、バクテリアの感 染の５２〜１００時間前に開始するＣ５Ｆ−１の多数回の投与は有効である。

Ｃ５Ｆ−１°　ｌ＆＊＊　第７ＥＩ（Ｄ　益゛投与のスケジュール　の時間ゝ　 生存率６ＱＤＸ　１　４　１０ ＱＤＸ２　２８　１０ ＱＤＸ３　５２　６０　＜０．０５ ＱＤＸ４　７６　９０　＜０．０１ ＱＤＸ　５　１００　１００　＜０．０１Ｓａｌｉｎｅ　７６　０　− ”〜１０匹のマウスの群を、最後のＣ３Ｆ−１投与量４時間においてＥ、ｃｏｌ ｉの感染前にＣ５Ｆ−１でｉ、　Ｉ）、処置した（０．９ｍｇ／　ｋｇ／投与投 口７日１．　２．　４または５日間（すなわち、ＱＤＸＩ〜ＱＤＸ５）。

ｂ＝Ｃ３Ｆ−１の最初の投与とＥ、ｃｏｌｉの感染の時間との間の時間。

°＝感染後第７日に生存する動物の百分率を表す。

ｄ＝フィッシャー抽出物試験による、生理食塩水の対照群との比較。

感染の４．１８．２８．５２または７６時間前の単一のポーラスの注射（０，２ 〜９．０ｍｇ　／ｋｇ）は、増強された宿主の耐性を誘発するとき、有効ではな かった。

データが示すように、Ｃ５Ｆ−１を使用する予備処置は致死的投与量のＥ、ｃｏ ｌｉで対抗したマウスの生存率を有意に増大する。しかしながら、この効果はＣ ３Ｆ−１の投与量、タイミング、および投与のスケジュールに依存する。はぼ０ ．７〜３、Ｏｍｇ　／ｋｇ／日のより高い投与量において、はとんど完全な保護 が見られた。０．２ｍｇ／ｋｇのより低い投与量において、また、保護が存在し たが、効果は小さかった。

白血球減少症のモデル Ｃ３Ｆ−１は、ｓｏｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＹ）で予備処置したマ ウスにおけるＩｌ：、ｃｏｌｉの感染に対する保護を誘発した。マウスについて のＬＤ、。は約４００　ｍｇ／ｋｇであり、より低いＣＹの投与量はＬＤ、。の ｌ／８を表す。この投与は、３８早＜ｉ、ｐ、注射したとき、合計の白血球およ び好中球お減少を誘発し、そしてマウスをＥ、ｃｏｌｉの感染に対していっそう 感受性とした（例えば、３　ｘ　１０７ｃｆｕ／マウスを使用する感染は、ＣＹ 処装したマウスの１００％を殺したが、このＣＹを投与しなかったマウスの２０ ％のみを殺した）。ＣＹ処装したマウスにＣ５Ｆ−１を与えたとき（ＣＳＦ−１ ，０，８９ｍｇ／ｋｇ、１日１回、４日間、ｉ、　ｐ、　）、１００９６の生存 率であったが、その代わり生理食塩水を与えたマウスの生存率は３０％であった 。

Ｃ３Ｆ−１を異型交配のＣＤＩマウス（２７〜２８ｇ、雌）に、致死的投与量の カンジダ・アルビカンス（Ｃ，ａｌｂｉｃａｎｓ）　（１，５ｘｌＯ”酵母菌細 胞／マウス、ｉ、　ｐ、　）で対抗する３〜４日前に、毎日投与した。この対抗 は、処置しないマウスおよび生理食塩水で処置したマウスにおいて、３．０日の メジアン生存時間（ＭＳＴ）を生じた。Ｃ３Ｆ−１処置したマウスは、１．９お よび０．１ｍｇ／ｋｇの投与量において、それぞれ、１５および１３日のＭＳＴ を示した。生存時間のこの４倍の増加はｐ＝０．０１（対数範囲試験）において 有意である。内毒素からの妨害の可能性を最小とするために、内毒素を事実土倉 まない（＜　０．０５ｎｇ／　ｍｇのタンパク質）高度に精製したＣ５Ｆ−１を 使用した。また、予防作用はＣ５Ｆ−１の試験物質の加熱不活性化により除去さ れることが示された。

この保護は、末梢血液の循環する単球および好中球の数の増加および腹膜のマク ロファージの２〜３倍の増加に関連した。したがって、Ｃ５Ｆ−１はカンジダ・ アルビカンス（Ｃ，ａｌｂｉｃａｎｓ）の感染に対する宿主の耐性を増強し、そ してこの作用は多分マクロファージおよび好中球の活性化により仲介される。

Ｃ５Ｆ−１をまた追加のモデルにおいて試験し、ここでカンジダ・アルビカンス （Ｃ，ａｌｂｉｃａｎｓ）を全身的（ｉ、　ｖ、　）に供給した。Ｃ３Ｆ−１は １．９ｍｇ／ｋｇ／日の投与量ＱＤＸ４においてｉ、　ｐ、またはｉ、　Ｖ、投 与した。

Ｃ５Ｆ−１の最後の投与後４時間に、２　ｘ　１０’ｃｆｕ／　７ウスをｉ、　 ｖ、注射した。これらの投与のいずれも、生理食塩水を注射した対照マウスと比 較したとき、生存率の有意の増大を生じた。

Ｃ３Ｆ−１の処置後の菌類の感染のラットの生存時間抗ウィルス剤のフルコナゾ ールと組み合わせてＣ５Ｆ−１を使用して、与えたＣ３Ｆ−１の毎日のポーラス の皮下（ＳＱ）注射は感染した動物のメジアン生存時間をラットのカンジダ症の モデルにおいて５日（フルコナゾール単独を与えた動物において）から３０日以 上（ＣＳＦ−１およびフルコナゾールの組み合わせを与えた動物において）治療 的に改良した。

雄のフィッシャー　（Ｆｉｓｈｅｒ）−３４４ラツト（体重２ｏｏ〜２５０ｇ） を千ャールス・リバーラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手した。ラットを５匹／ケージで収容し、そして水お よび実験室の餌を任意に与えた。付随的ウィルスおよびマイコプラズマについて の血清学的試験は、これらの動物において日常的に陰性である。

アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ｖリイランド州ベセスダ）からのカ ンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）株ＡＴＣＣＮａ１ ８８０４を、３７°Ｃにおいてトリブチカーゼ大豆ブロスの中で一夜増殖させ、 次いで遠心分離した。芽状胞子を再懸濁させ、そして９５％の胎児子ウシ血清お よび５％のジメチルスルホキシドの中にアリコートを取り、そして−８０°Ｃに おいて凍結した。各実験の日に、２つのアリコートをプールし、次いて注射のた めにリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）の中で４Ｘ１０’芽状胞子／ｍｌに希釈した。各 実験の接種を酵母エキスペプトン寒天上にプレートシて。生存可能な有機体の計 数を確証した。

フィッシャー−３４４ラツトを２Ｘ１０“のカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄ ｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）の芽状胞子（０，５ｍ１）で横の尾の静脈の中への ｉ、　Ｖ、注射により感染させた。Ｃ３Ｆ−１の作用の研究において、単一の０ 、３ｍｇ／　ｋｇの投与量のフルコナゾール（Ｄｉｆｌｕｃａｎ、　Ｐｆｉｚｅ ｒ、ニューヨーク州ニューヨーク）を２時間後に皮下（ＳＱ）投与した。フルコ ナゾールの処置後直ちに、０．５ｍｌのＳＱ投与量のＣ５Ｆ−１を異なる部位に 与えた。Ｃ３Ｆ−１の処置は１０回の合計の投与でさらに９日間続けた。

動物を３０日間毎日死亡率について評価した。

未処置のフィッシャー−３４４ラツトにおいて１００％の死亡率を生成するため に必要なカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）の投与 量は、２Ｘ１０’芽状胞子であると決定された（表１７）。この投与量は３〜６ 日で死亡を生じ、メジアン生存時間は４日であった。

表１８は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）の感 染後Ｃ３Ｆ−１の治療的ＳＱ投与とフルコナゾールを組み合わせた、４回の実験 の結果を表す。０．３および１．０　ｍｇ／ｋｇ／日のＣ３Ｆ−１の投与量は最 も効力かあるように思われ、対照動物のメジアン生存時間（５日）より少なくと も６倍の、〉３０日のメジアン生存時間を生ずる。

表１７ カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）で感染したフィ ッシャー−３４４ラツトの死亡率の表１．２５　５　０　＞３０ ２．５　５　２０　＞３０　５．０ ５　１６　３８　＞３０　５．０ １０　１６　８８　４　４．４ ２０　５０　１００　４　４．４ ４０　５１００４　４．４ １００　８　１００　２　２．８ ３３０　８　１００　１　１．５ 表１８ カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｅａｒ＋ｓ）で感染したラ ットにおけるＣ３Ｆ−１およびフルコナゾールの治療的使用した。すべての動物 に、注射後２時間で０．３　ｍｇ／ｋｇのフルコナゾールの一回投与を行った。

ＮＤ、データなし Ｃ３Ｆ−１を使用する菌類の感染の消散１５人の治療に対して抵抗力のある侵入 性の菌類の感染をもつ患者をＣ３Ｆ−１で処置した。骨髄移植（ＢＭＴ）センタ ーと呼ぶ患者は研究に適格であったが、再発性において悪性である患者は不適格 であった。

診断、年令、移植片対宿主の病気（ＧＶＨＤ）の状態または患者の全体の状態に ついて排除を行わなかった。１８人の患者の臨床的特性を表侵入性菌類の感染の 診断は、バイオプシーの標本における有機体の証明、閉じた体液（すなわち、大 脳を髄液）の培養物または陽性の血液培養物の存在下の侵入性の病気について放 射性学の証拠を必要とした。気管支鏡検査の洗浄液、胃腸バイオプシーの標本ま たは単一の血液培養物の中に存在する菌類のみの証明は、侵入性の病気の不十分 の証拠であると考えた。感染性菌類の有機体、関係する器官、および感染の追跡 に使用した診断の方法を表１９に示す。

すべての患者を検査し、そして毎日日常的血液培養物を取り、ならびに血液化学 および完全な血球の計数を毎日実施した。一般に、骨髄の吸引およびバイオプシ ーを治療の前に実施して悪性を除外した。周期的基準でかつ剖検で初期の診断手 順を使用して、菌類の感染を再評価した。

この研究を相Ｉの投与量のニスカレーションと表示し、ここで患者を連続的に登 録した。すべての患者を最大の許容され投与量で最良の有効な抗菌的治療で維持 した。Ｃ５Ｆ−１（比活性、はぼ３〜１０×１０’　Ｕ／ｍｇ）を０．０５〜２ ．０　ｍｇ／　ｒｒｉの投与量で与えた。Ｃ５Ｆ−１を１００ｍ１の０．５％の アルブミンを含む通常の生理食塩水で中央の静脈カテーテルにより、毎日２時間 の静脈内注入で７日間投与した。７日後、臨床的応答が存在しない場合、投与量 をさらに７日間２倍にした。

３回の投与量のニスカレーションを単一の患者に許した。抗菌剤効力が認められ た場合、菌類の感染の消散が記録することができるまで、Ｃ５Ｆ−１を続けた。

２ｍｇ／ｍで処置した患者はその投与量で維持した。

Ｃ５Ｆ−１はすべての投与量でよく許容された。それに帰することができる特定 の症候または血液化学の変化は存在しなかった。Ｃ５Ｆ−１の注入の過程の間に 、前取て存在するＧＶＨＤのひどさへの有意の悪影１１人の患者は侵入性のカン ジダ症を有し、４人はアスペルギルス症を有し、２人は酵母菌種をもつと診断さ れ、そして１人はロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）をもつと診断された （表１９）。３人の患者は、アンフォテリシンＢに対して応答しなかった進行性 の菌類の疾患についてのＢＭＴの前に、Ｃ５Ｆ−１を与えられた。これらの患者 のうちの１人は、アスペルギルス症のために２つの腔（ｓｉｎｕｓ　ｃａｖｉｔ ｉｅｓ）の切除を実施されていた。しかしながら、ＣＴスキャンは残留する腔の 固まりを証明し、そして吸引の培養物はアスペルギルスを証明し続けた。空洞化 する多葉の肺の節が発生しそして患者カ月ｍｇ／ｍｇのアン７すテリシンで進行 的に窒素過剰血症となったとき、Ｃ５Ｆ−１を開始し、そしてアンフォテリシン の投与量をｏ、ｓｍｇ／ｋｇに減少した。

治療の３５日後、ＣＴスキャンは腔の除去を示し、そしてアスペルギルスについ て培養物は陰性となった。２つの最大の空洞の肺の節を除外してすべては消散し た。両者の節を引き続いて切除し、そして菌類の要素の不存在を示した。患者は 抗菌の治療なしに止まり、無関係のＢＭＴを待っていた。第２の処置された患者 は、ＢＭＴの前に、臨床的または放射線学的応答なしでカンジダ・アルビカンス （Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）のため（こ２ｇのアンフオテリシンを与 えられた（肝臓および膵臓を含む）。Ｃ３Ｆ−１の３５回の投与後、改良の顕著 な放射線学的証拠が認められ、そして肝臓を再バイオプシーして、残留する菌類 の感染の証拠はなかった。第３の患者は進行性の肝臓のカンジダ症を有した。彼 女は、２８回のＣ５Ｆ−１の投与を受けた後、菌類の感染の臨床的および放射線 学的消散を有した。

１８人の患者のうちの１３人は、菌類の感染において消散または臨床的改良を示 した（表１９）。廃人かの患者は菌類の感染の完全な消散を有し、そして病院か ら解放された。２人の患者は、感染が除去された後、骨髄の移植を受けるために 十分に良好であった。残りの５人の患者のうちで、１人の患者は評価不可能であ り、他の患者は侵入性菌類の感染をもっていなかったかも知れないが、肺臓炎の ために死亡し、そして残りの３人の患者は応答を示さなかったが、Ｃ５Ｆ−１の 処置を８日間以下受けた。

白血球の計数のｉｎ　ｖｉｖｏ刺激 異型交配のＣＤ−１７ウスに、精製されたヒトＣ５Ｆ−１を、２ｍｇ／ｋｇ／投 与で１日３回、連続する５日間投与した。合計の血球の計数は、生理食塩水で処 置したマウスにおける８、７００／μｌからＣ３Ｆ−１処置したマウスにおいて １２．０００〜１３．０００μｍに増加した。さらに、好中球の計数は生理食塩 水で処置したマウスにおける１、０７８／μｍに比較してＣ３Ｆ−１処置したマ ウスにおいて６，８２１μｌに増加した。

この作用はＣ５Ｆ−１の投与量および投与のスケジュールに依存する。

末梢血液ｎＯ好中球の増加は、単一の投与量のＣ５Ｆ−１を投与ｉ、　ｐ、後、 ２〜４時間における検出可能てあった。これらの結果が示すように、Ｃ３Ｆ−１ の投与は臨床的および獣医学的に顆粒球の生産の刺激因子および白血球の計数の 増大因子として有用である。

創傷の治癒におけるＣ５Ｆ−１ 動物のモデルおよびプロトコル、例えば、ＧｏｏｄｓｏｎおよびＨｕｎ　ｔ（Ｊ 、　Ｓｕｒｇ、　Ｒｅｓ、　、！９８２．３３　：　３９４）のゴレテックス（ Ｇｏｒｅｔｅｘ）　ミアチュア創傷治癒のモデルを使用して、Ｃ３Ｆ−１をアッ セイし、ここで移植されたゴレテックス管に侵入性マクロファージ、線維芽およ び他の結合組織の細胞を充填する。治癒を管の内容物を穎微鏡検査により評価す る。第２のモデルはＥｉｓｅｎｇｃｒら（１９８８，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、　８ ５：１９３７）の切除の創傷治癒のモデルであり、ここで創傷を視的に観察し、 そしてパンチバイオプシーを実施して毛の小胞から生ずる表皮細胞層の数を監視 する。第３のモデルは景勝のモデル、例えば、Ｆｏｔｉｖら（１９８７，Ｊ、　 Ｐａｔｈｏｌ、、　１５１　：　２０９）の熱損傷した栗丸の景勝てあり、ここ で治癒を固定した区画において損傷した部位の中皮のリサーフエシング（ｒｅｓ ｕｒｆｅｃｉｎｇ）の程度により評価する。これらのモデルの各々の教示をここ に引用によって加える。

一般に、切除の創傷治癒のモデルの参考文献に記載されているように、局所的創 傷のための表皮細胞誘導因子（ＥＧＦ）を使用して、生理食塩水の中で１０’〜 １０”　Ｕ／ｍｌのＣ３Ｆ−１の中で非付着性包帯をソーキングすることによっ て、Ｃ５Ｆ−１を創傷の部位に適用する。あるいは、同様な量のＣ３Ｆ−１をゴ レテックス管の中にＧｏｏｄｓｏｎおよびＨｕｎｔ、前掲、に記載されているよ うに移植の時に導入するか、あるいはＣ３Ｆ−１をまた遅く解放性のマトリック スの中に混入し、そして創傷の部位に（ゴレテックス管の中で、または包帯の中 で、遅く解放性のゼラチンまたはコラーゲンに基づくマトリックスの中で、ある いは腹腔内申の注射により）全身的処置により１２１１〜３回（１゜■２、ｉ、 　ｐ、またはｓ、ｃ、）　ｔｏ　〜１０，０００μｇ／ｋｇ／日の投与量で適用 することかできる。

完全な厚さの皮膚の切除のモデルにおいて、５匹の雌のＢＤＦ−１マウス（体重 １８〜２０ｇ）の実験群をメトキシフルランの吸入（Ｍｃｔｏｆａｎｃ。

Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ、　Ｉｎｃ、、ニュージャーシイ州りロシング）によ り麻酔した。きれいな外科的技術を使用して創傷をつくった。透明なテープのス トリブを背中の上の仙骨と肩骨との間に適用した。皮膚をマウスの長さに対して 平行に持ち上げ、そして完全な厚さの切除の創傷を６ｍｍの直径のボンドを使用 して作った。テープを除去し、左および右の円形の両側の創傷の間において無傷 の皮膚の幅８〜ｌ　Ｏｎ＋＋ｎのストリブを露出した。３成分の抗生物質の軟膏 （ポリミキシンＢ−バシトラシンーネオマイシン）を新しい創傷に綿の先端のス パブ捧を使用して適用した。

創傷を手持ちのノギスで前後および横方向の寸法で第０．　１．　２゜３、　４ ．　７．　９および１０日（第０日は創傷形成の日を表す）。創傷は最初は円形 であったが、楕円形に治癒する傾向があった。この理由で、概算の創傷の面積は 楕円の領域についての式Ａ＝ｌ）ｉ（ＢＸＣ）／４を使用して計算し、ここでＡ ＝領領域ｍｍす、８２前後の軸の創傷の直径（ｍｍ）　、モしてＣ＝横方向の軸 の創傷の直径（ｍｍ）である。各創傷について、任意の所定の時点における面積 を第０日における最初の創傷の面積で割ることによって創傷の閉鎖％を計算した 。

Ｅ、　ｅｏｌｉが生産した長いクローンＣ３Ｆ−ＩＮマ３Ｃマ２２１（比活性〉 ６．ＯＸ　１０’単位／ｍｇ）を０．９％の塩化ナトリウム（米国薬局方）の中 に希釈し、そして１００μｍの最終の注射体積で横の尾の静脈の中で静脈内注射 した。０．５ｍｇ／ｋｇ／日（１０μｇ／日）　〜１０．　Ｏｍｇ／　ｋｇ／日 （２００μｇ／日）の範囲の投与量のＣ５Ｆ−１を毎日合計７日間投与し、最初 の投与は創傷形成後はぼ４時間に実施した。０．９％のＮａＣ１の中で希釈した ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を非特異的対照として選択し、そして５．０　ｍ ｇ／ｋｇ／日の投与量で対照動物に投与した。

各日に処置の群の間で個々のスチューデント式テストにより統計学的分析を実施 した。すべての比較について、ｐ＜０．５のとき、統計学的意味が認められた。

新しい創傷において出血はほとんどあるいはまったく起こらなかった。薄い線維 質の皮膜か１２〜２４時間以内に明らかとなり、１〜２日以内に５皮に進行した 。５皮は乾燥すると、収縮し、下に横たわる造粒化組織に付着する程度か徐々に 低くなったが、創傷の面積の測定を歪めなかった。各群および日について５匹の マウスの右および左の創傷の測定値から、平均の創傷の面積を計算した。初期の 創傷の面積は処置群のいずれに間においても異ならなかった。

第６図に示すように、創傷の閉鎖はＩＳＡ処置した対照よりＣ５Ｆ−１処置した マウスにおいて急速であり、ここで閉鎖は所定の日における初期の創傷の面積の 減少％として定義される。第６図に記載されている値は各時点における５匹のマ ウスの平均を表す。Ｃ５Ｆ−１処置した群はすべての時点において対照と異なっ た（ｐ＜０．０５）。「正方形」は対照を表す：「＋」はＣ５Ｆ−１を表す（１ ０，０ｍｇ／　ｋｇ／　日）　；「三角形」はＣ３Ｆ−１を表す（５，Ｏｍｇ／ ｋｇ／日）：そして「×」はＣ３Ｆ−１を表す（０，５ｍｇ／ｋｇ／日）。創傷 の閉鎖の最大の増大は１０．０ｍｇ／ｋｇ／日を受け取ったマウスにおいて観察 された。中間の（５，０ｍｇ／ｋｇ／日）および低い（０，５ｍｇ／ｋｇ／日） の投与量のＣ３Ｆ−１は、また、創傷の閉鎖速度を有意に増加したが、これらの 投与量において、２つの応答はほぼ等しかった。

Ｃ３Ｆ−１処置した創傷において見られた創傷の閉鎖速度の増大は、最初の数日 以内に起こったより急速な初期相から生ずるように思われた。この期間の間に、 閉鎖は表１８に示すようにＣ５Ｆ−１によりほぼ４０％増大した。その後、すべ ての群における閉鎖速度はほぼ同一であり、そして創傷が完全に治癒されるまで 、一定して減少し始める。

Ｃ５Ｆ−１処置したマウスの創傷はＨ３Ａ処置した対照より１〜２日速く５０％ の閉鎖に到達しく第６図）、シかも１００％の閉鎖に到達するために要求される 時間をすべての群についてほぼ１０日であった。

前辺 対照　”Ｃ５Ｆ−１ ０３５゜２　７．５　０．０　３４４　８．１　０．０　−　０．８２８＋　２ ５．２　６．９　２８．４　１８．４　３．６　４６．６　＆４．０　０．０１ ７２　１９．４　４．８　４４．７　１１．６　２．３　６６．１　４７．９　 ０．０００３　１７．４　５．２　５０．５　９、ＯＺ４　７３．９　４６．４ 　０．０００４　１１．２　３．７　８８．１　７．８　２．６　７７．２　１ ３．４　０．０３７５　９．９　ａｌ　７１．８　５．１　１．９　８５．２　 １８．７　０．００１７　５．０　３．１．８５．７　２．６　１．０　乾４　 ７．９　０．０４５１０　０．０　０．０　１ＣＸ）、０　０．０　０．０　１ ００．０　０．０　−ＣＳＦ−１をマウスｆ：３．Ｏｍｇ／ｋｇ／日の投与量で 合計７日間、創傷後４時間に開始して、静朋年雫父与した。

次の式で計算した閉鎖の増大：（閉鎖％（処ｌ−閉鎖％（Ｍ））ＡＡ鎖％（対胛 ０第３日から第１Ｏ日までの時点において実施した全体の観察において、創傷の 空間を取り囲む皮膚の脈管の含量の変化は対照およびＣ３Ｆ−１形質転換された 創傷における治癒の過程の間に起こることか示唆された。創傷後３日程度に早く 、脈管構造の増加（より大きいかつより曲がりくねった血管）は、対照マウスに おける創傷部位を取り囲む皮膚の領域において、肉眼により明らかであった。７ 日までに、対照の創傷を取り囲む皮膚の脈管の含量は減少したが、Ｃ３Ｆ−１処 置したマウスにおける創傷を取り囲む皮膚は、創傷を取り囲む面積および創傷の 部位に隣接しない血管の両者において、対照のマウスより有意に大きい脈管形成 を示した。この応答はより大きい数の血管およびより広範な分岐形成の両者を包 含するＣ５Ｆ−１は、また、他の成長因子と組み合わせて創傷の治癒を促進する ことができ、このような成長因子の例は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽成長 因子（塩基性および酸性ＦＧＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）または形質 転換体Ｇ−Ｃ３Ｆ（ＴＧＦアルファおよびベータ）　、ＩＬ−１，ＩＬ−２、血 小板誘導創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）および他の物質、例えば、ソマトメジンＣ およびビタミンＣである。

Ｃ５Ｆ−１の配合および投与 組み換え的に生産されたヒトＣ５Ｆ−１を、標準の製剤学的手順を使用して、投 与のために配合することができる。究極的適用に依存して、Ｃ５Ｆ−１は注射可 能なまたは局所的形態で調製し、そして唯一の活性成分として、あるいは相補的 または同様な活性を有する他のタンパク質または化合物と組み合わせて使用する ことができる。このような他の化合物は、別の抗腫瘍剤、例えば、化学療法剤、 例えば、アドリアマイシン、またはリンフ才力イン類、例えば、ＩＬ−１，−２ 、−３、−４および−６、アルファー、ベーターおよびガンマ−インターフェロ ン、ＣＳＦ−ＧＭおよびＣ３Ｆ−Ｇ　、および腫瘍壊死因子を包含することがで きる。Ｃ５Ｆ−１活性成分の作用はこのような個々の化合物の存在により増強ま たは改良することができる。前述したように、Ｃ５Ｆ−１は有益な方法で適当な 血球と相互作用することができ、したがって、本発明の化合物はこのような細胞 とＣ５Ｆ−１との混合物を、必要に応じて追加のリンフ才力イン類またはサイト カイン類の存在下に、インキュベーションすることを包含する。このようなイン キュベーション混合物の上澄み液の分画、あるいは細胞を含有する全体の混合物 を同様によく使用することができる。食い違いのタイミングはある組み合わせ、 例えば、Ｃ５Ｆ−１および１〜２日後にガンマ−インターフェロンについて好ま しいことがある。

ここに記載するＣ３Ｆ−１は、一般に、治療的に０．　Ｏ１〜１０ｍｇ／　ｋｇ ／日の量で、単一のポーラスの投与または分別して２４時間かけて、すへての適 用のために、例えば、感染症、創傷の治癒、骨髄造血および免疫性の回復、およ び癌のために投与される。

本発明の範囲はここに記載する例示的実施態様により限定されると解釈すべきて なく、添付する請求の範囲に従い決定されるべきである。

ＦＩＧ、１ 培地　Ｃ９Ｆ−Ｉ　ＧＭ−Ｃ９Ｆ　Ｇ−Ｃ３Ｆ測定中の培地又は１０％リンホト キシン特異的溶解（％） 特異的溶解（％） 特異的溶解（％） ０　δ　”８　ｇｏ’ｏ　ざ　８８８ 生存率（％）０１ 国際調査報告 ｂＩｎ−一鴫−ＡＩｔｈＩｍＮ＠Ｄｒ丁ノ１１（０１７％ｎＣ）Ｆ＋ｙｍ　ＰＯ Ｔ／ＩＷＩＯ＋ｆｉｌ　ｇｒａｍ　１２１１１８ｔ＋２１　（１＆？＋国際調査 報告 ＵＳ　９１０６０５２ Ｓ＾　５１９３９ フロントページの続き （７２）発明者　デブリン、ジエイムズアメリカ合衆国、カリフォルニア　９４ ５４９゜ラフアイエツト、アッパー　ハラピー　バレー　ロード　１１４６ （７２）発明者　シマーマン、ロバートアメリカ合衆国、カリフォルニア　９４ ５６３゜オリンダ、ラ　クレスタ　ロード　６４（７２）発明者　オーカーマン 、シャロン　リーアメリカ合衆国、カリフォルニア　９４６２０゜オークランド 、ピー、オー、ボックス （７２）発明者　リング、デビット　ビー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４０６１゜レッドウッド　シティ、トラマ ン　ストリート１２４８ （７２）発明者　マ、シルビア　シー アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４５５５゜フレモント、ステファノ　コー ト３３５３５

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトに有効量のコロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）を０．５〜５０ｍｇ／ ｍ２の１日量で投与することを含んでなる、ヒトにおける菌類の感染を治療的に 処置する方法。
2. ２．感染が、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇ ｉｌｌｕｓ）、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラ スマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉ ｄｅｓ）、パラコシジオイデス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、ケカ ビ属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロロトリ クス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）およびブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅ ｓ）から本質的に成る群より選択される少なくとも１種の真菌により生ずるもの である上記第２項記載の方法。
3. ３．真菌がカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の種である、請求項２に記載の方法。
4. ４．組み換えＣＳＦ−１を１種または２種以上の抗真菌剤とともに投与する、上 記第１項記載の方法。
5. ５．抗真菌剤がアンフォテリシン（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）Ｂ、フルコナゾ ール（Ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ）、５フルオロ−サイトシン、ケトコナゾール（ Ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、ミコナゾール（Ｍｉｃｏｎａｚｏｌｅ）およびイ ントラコナゾール（Ｉｎｔｒａｃｏｎａｚｏｌｅ）から本質的に成る群より選択 される、上記第４項記載の方法。
6. ６．菌類の感染が除去されるまで、ＣＳＦ−１を非経口的に投与する、上記第１ 項記載の方法。
7. ７．ＣＳＦ−１をボーラスの注射により、ｉ，ｖ，ボーラスにより、一定の注入 によるか、あるいは連続的注入により皮下投与する、上記第６項記載の方法。
8. ８．真菌の感染に対して有効である１日のＣＳＦ−１の投与量が０．５〜１０ｍ ｇ／ｍ２である、上記第１項記載の方法。
9. ９．真菌の感染に対して有効である１日のＣＳＦ−１の投与量が０．５〜５ｍｇ ／ｍ２である、上記第８項記載の方法。
10. １０．ＣＳＦ−１を少なくとも１４日間投与する、上記第６項記載の方法。
11. １１．ＣＳＦ−１を少なくとも２旧聞投与する、上記第１０項記載の方法。
12. １２．ＣＳＦ−１を免疫抑制した個体に投与する、上記第１項記載の方法。
13. １３．エイズまたは他の感染のために、骨髄移植とともにまたは癌の化学療法に おいて与えられる化学薬物のために、あるいは熱傷または他の主要な外傷のため に、免疫抑制された個体にＣＳＦ−１を投与する、上記第１２項記載の方法。
14. １４．ウイルスまたはバクテリアの感染を処置するために、治癒を促進するため に、および腫瘍の苦しみを処置するためにＣＳＦ−１を投与することを含んでな る哺乳動物を処置する方法。