DE60008006T2

DE60008006T2 - Kationische dosper virosomen

Info

Publication number: DE60008006T2
Application number: DE60008006T
Authority: DE
Inventors: Rudolf Ernst WÄLTI; Reinhard Glück; Peter Klein
Original assignee: Nika Health Products Ltd
Current assignee: Nika Health Products Ltd
Priority date: 1999-10-08
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2020-09-30
Also published as: CA2388053A1; CO5280052A1; JP2003512306A; DK1217990T3; EP1217990A1; SK4782002A3; RU2002112224A; PE20010703A1; ES2215073T3; AU7785000A; DE60008006D1; PL355231A1; ATE258428T1; KR100869195B1; NO20021607L; HUP0202809A2; WO2001026628A1; AU778399B2; KR20020063872A; NO20021607D0

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liegt auf den Gebieten der Biochemie, Genbiotechnologie und Gentherapie und bezieht sich auf neuartige Virosomen, d. h. positiv geladene liposomale Vesikeln, die in ihrer Membran virale Glykoproteine enthalten, für eine hochwirksame Überführung von erwünschtem und insbesondere genetischem Material zu Zielorten sowie nützliche Anwendungen dafür. Die vorliegenden kationischen Virosomen sind besonders nützlich für die spezifische und unspezifische, nicht infektiöse Überführung von negativ geladenen Verbindungen, bevorzugt von Genen, zu Targetzellen in vitro und in vivo.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In der WO 92/13525 wird berichtet, dass Virosomen, die aus Phospholipid-Doppelschichtmembranen bestehen, die mit viralen Spike-Proteinen aus Influenzaviren und mit zellspezifischen Markern wie zum Beispiel monoklonalen Antikörpern beladen sind, auf Grund eines virenartigen Penetrationsmechanismus über rezeptor-vermittelte Endocytose sehr wirksam mit Modellmembranen und mit Tierzellen verschmelzen. Diese Virosomen werden erfolgreich angewandt, um chemische Substanzen und erwünschte Arzneien zu Zielorten zu bringen, haben aber bestimmte Nachteile bezüglich eines stabilen Einbaus und Transfers von geladenen Molekülen wie zum Beispiel negativ geladenen Nucleinsäuren.
In der WO 97/41834 wird über kationische Virosomen für eine wirksame, zellspezifische Überführung von genetischem Material zu Targetzellen in vitro und in vivo berichtet. Weiter wird darin über eine Möglichkeit der Herstellung solcher Virosomen wie auch über Verfahren für die Anwendung dieser Virosomen berichtet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist eine Weiterentwicklung der in der WO 97/41834 berichteten Erfindung und bezieht sich auf ein neuartiges kationisches Virosom, das wegen seiner speziellen Membranzusammensetzung sehr wirksam mit allen erwünschten, negativ geladenen Materialien beladen werden kann, bevorzugt mit genetischem Material mit lang- und kurzkettigen DNA oder RNA, Oligodesoxynucleotiden, Ribonucleotiden, Peptid-Nucleinsäuren (PNA), Ribozymen (RNA-Molekülen mit enzymatischer Aktivität), Genen, Plasmiden und Vektoren. Unerwartet wurde gefunden, dass hoch leistungsfähige Virosomen erzeugt werden können, die die bereits hohe Transfektionseffizienz der DOTAP-Virosomen der WO 97/41834 noch um einen Faktor von bis zu zehn übertreffen, wenn DOSPER als ein kationisches Lipid in Verbindung mit anderen Lipiden verwendet wird. Dieser überraschende Effekt wird aber nur erreicht, wenn DOSPER als ein kationisches Lipid verwendet wird und wenn DOSPER mit anderen Lipiden in einem Verhältnis kombiniert wird, das sich vom bekannten Verhältnis der kationischen Lipide (DOTAP) zu den anderen Lipiden unterscheidet, das in der WO 97/41834 ausdrücklich offenbart und beansprucht wurde.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Einfluss der Länge der Transfektionszeit auf die Menge aufgenommenen DNA-Plasmids. 5 × 10⁵ Zellen der menschlichen transformierten primären embryonalen Nierenzelllinie 293T in 0,5 ml Medium wurden mit DOSPER-Virosomen und DOSPER-Liposomen transfiziert, die ³H-markiertes pGreen Lantern-Plasmid enthielten.
2: Einfluss der Länge der Transfektionszeit auf die Menge aufgenommenen DNA-Plasmids. 5 × 10⁵ Zellen der Affenfibroblasten-Zelllinie COS-1 wurden mit DOSPER-Virosomen und DOSPER-Liposomen transfiziert, die ³H-markiertes pGreen Lantern-Plasmid enthielten.
3: Einfluss der Länge der Transfektionszeit auf die Menge aufgenommenen DNA-Plasmids. 5 × 10⁵ Zellen der menschlichen epitheloiden Cervixkarzinom-Zelllinie HeLa in 0,5 ml Medium wurden mit DOSPER-Virosomen und DOSPER-Liposomen transfiziert, die ³H-markiertes pGreen Lantern-Plasmid enthielten.
4: Einfluss der Länge der Transfektionszeit auf die Menge aufgenommenen DNA-Plasmids. 5 × 10⁵ Zellen der Mäusefibroblasten-Zelllinie NIH3T3 wurden mit DOSPER-Virosomen und DOSPER-Liposomen transfiziert, die ³H-markiertes pGreen Lantern-Plasmid enthielten.
5: Einfluss der Länge der Transfektionszeit auf die Menge aufgenommenen DNA-Plasmids. 5 × 10⁵ Zellen der menschlichen chronischen myelogenen Leukämie-Zelllinie K562 wurden mit DOSPER-Virosomen und DOSPER-Liposomen transfiziert, die ³H-markiertes pGreen Lantern-Plasmid enthielten.
6: Einfluss der Länge der Transfektionszeit auf die Menge aufgenommenen DNA-Plasmids. 5 × 10⁵ Zellen der Mäusemyeloma-Zelllinie P3 wurden mit DOSPER-Virosomen und DOSPER-Liposomen transfiziert, die ³H-markiertes pGreen Lantern-Plasmid enthielten.
7: Einfluss der Länge der Transfektionszeit auf die Menge aufgenommenen DNA-Plasmids. 5 × 10⁵ Zellen der Zelllinien COS-1, 293T, K562 und P3X63Ag8 wurden mit DOSPER-Virosomen transfiziert, die ³H-markiertes pcDNA3.1/His B/lacZ-Plasmid enthielten.
8: Einfluss der Länge der Transfektionszeit auf die Menge aufgenommenen DNA-Plasmids. 5 × 10⁵ Zellen der menschlichen transformierten primären embryonalen Nierenzelllinie 293T in 0,5 ml Medium wurden mit DOSPER-Virosomen und DOTAP-Virosomen transfiziert, die ³H-markiertes pcDNA3.1/His B/lacZ his-Plasmid enthielten (0,4 μg DNA; 24 000 dpm = 100%).
9: Einfluss der Länge der Transfektionszeit auf die Menge aufgenommenen DNA-Plasmids. 5 × 10⁵ Zellen der menschlichen chronischen myelogenen Leukämie-Zelllinie K562 in 0,5 ml Medium wurden mit DOSPER-Virosomen und DOTAP-Virosomen transfiziert, die ³H-markiertes pcDNA3.1/HIS B/lacZ his-Plasmid enthielten (0,4 μg DNA; 24 000 dpm = 100%).
10: Einfluss der Länge der Transfektionszeit auf die Menge aufgenommenen DNA-Plasmids. 5 × 10⁵ Zellen der nicht sekretierenden Mäuse-Hybridzelllinie Sp2 in 0,5 ml Medium wurden mit DOSPER-Virosomen und DOTAP-Virosomen transfiziert, die ³H-markiertes pcDNA3.1/HIS B/lacZ his-Plasmid enthielten (0,4 μg DNA; 24 000 dpm = 100%).
11: Einfluss der Länge der Transfektionszeit auf die Menge aufgenommenen DNA-Plasmids. 5 × 10⁵ Zellen der menschlichen epitheloiden Karzinom-Zelllinie HeLa wurden mit DOSPER-Virosomen und DOTAP-Virosomen transfiziert, die ³H-markiertes pGreen Lantern-Plasmid enthielten.
12: Expression von β-Galactosidase in NIH3T3-Zellen, die mit DOSPER-Virosomen bzw. DOSPER-Liposomen transfiziert wurden; Mittelwerte aus drei Versuchen A, B und C.
13: Expression von β-Galactosidase in NIH3T3- und 293T-Zellen, die mit DOSPER-Virosomen (Versuch A) unter Verwendung von pcDNA3.1/His B/lacZ-Plasmid in verschiedenen Konzentrationen transfiziert und durch eine verschiedene Anzahl von Virosomen zugeführt worden waren; Werte in ng/mg Protein nach vier Tagen.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Virosomen der vorliegenden Erfindung sind Lipidvesikeln, die typischerweise eine Vesikelmembran umfassen, die wegen des Vorhandenseins kationischer Lipide eine positive Nettoladung besitzt. Sie umfassen ferner fusogene Peptide viralen Ursprungs, vorwiegend Glykopeptide von viralen Hüllen wie Influenzavirus-Hämagglutinin, und diese Peptide bewirken, dass die Virosomen über einen rezeptor-vermittelten Penetrationsmechanismus durch die Targetzellen aufgenommen werden. Sie können wahlweise des Weiteren mit zellspezifischen Markern zur bevorzugten Anheftung an die erwünschten In-vivo-Targetzellen ausgestattet sein.
Das Vorhandensein von Phosphatidylethanolamin (PE) in der Membran wird zur Verankerung eines solchen zellspezifischen Markers durch einen bifunktionellen Crosslinker am Virosom bevorzugt. Wo eine zellspezifische Anbringung der Virosomen nicht erforderlich ist (zum Beispiel bei Anwendungen in definierten In-vitro-Zellkulturen) oder wo der zellspezifische Marker anders als durch einen bifunktionellen Crosslinker an der Membran befestigt wird, kann PE wahlweise von der Virosomenmembran abwesend sein.
In einer Ausführungsform, die für In-vivo-Anwendungen der Virosomen bevorzugt wird, bezieht sich die vorliegende Erfindung ferner auf die irreversible kovalente Bindung von zellspezifischen Markern an die kationischen Virosomen, darunter (aber nicht ausschliesslich) monoklonale Antikörper, Antibody-Fragmente wie F(ab')2- und Fab'-Fragmente, Cytokine und/oder Wachstumsfaktoren, die für eine selektive Erkennung und Bindung von Targetzellen nützlich sind. Sie sind so mit der Vesikelmembran verbunden, dass sie sich nach aussen erstrecken und bezüglich der Rezeptorerkennung und -bindung im Wesentlichen ihre volle funktionelle Aktivität ausüben. Ein bevorzugtes Verfahren, Virosomen herzustellen, das eine platzgerichtete Vernetzung eines zellspezifischen Markers umfasst, wird in Beispiel 1 der WO 97/41834 für DOTAP-Virosomen offenbart. Diesem Verfahren zufolge werden die zellspezifischen Marker in Gegenwart eines Tensids an vorgeformte Phosphatidylethanolamin-Vernetzer-Moleküle wie zum Beispiel N-[4-(p-Maleimido-phenylbutyryl]phosphatidylethanolamin (MPB.PE) gekoppelt.,
Um die bestmöglichen Ergebnisse zu erzielen, ist es von Vorteil, die viralen Glykoproteine vor der Rekonstitution sorgfältig zu isolieren und zu reinigen, um eine Desaktivierung entweder durch proteolytischen Abbau oder eine Reduktion von intramolekularen S-S-Bindungen zu vermeiden. Entsprechend wird bevorzugt, die konjugierten Marker (zum Beispiel MPB.PE) durch Affinitätschromatographie mit einer aktivierten Agarosematrix, bevorzugt mit reduzierter Thiopropyl-Sepharose 6B, von nicht konjugierten Phosphatidylethanolamin-Crosslinker-Molekülen (zum Beispiel MPB.PE) abzutrennen. Aliquote Teile der gereinigten konjugierten Phosphatidylethanolamin-Crosslinker-Markermolekülkomplexe werden dann zu der Tensidlösung hinzugefügt, die die Mischung von aufgelösten Membranlipiden, Fusionspeptiden und anderen erwünschten Bestandteilen enthält, ehe die kationischen Virosomen daraus gebildet werden.
Es ist vorteilhaft, die Kupplung der bifunktionellen Crosslinker mit dem Phospolipid und dem zellspezifischen Marker vor Herstellung der Virosomen in einem getrennten Prozess vorzunehmen. Dieses Vorgehen erlaubt eine bessere Kontrolle und Optimierung der Oberflächendichte der Virosomenmembranen, insbesondere bezüglich der Anzahl von daran gebundenen zellspezifischen Markern. Die verbesserte Kontrolle der Konzentration der in die Membran eingebetteten oder daran gebundenen Proteinmnoleküle ist insofern wichtig, als ein unausgewogenes Verhältnis von Fusionspeptiden (zum Beispiel Hämagglutinin) und zellspezifischen Markern (zum Beispiel Antikörper-Fab'-Fragmenten) auf der Viro somenmembran ihre selektiven Eigenschaften verringern oder sogar zerstören und im Extremfall zu einer Koagulation und Ausfällung der Vesikeln führen kann.
Der Vorteil, anstelle von ganzen Antikörpermolekülen Antikörper-Fragmente F(ab')2 und Fab' als zellspezifische Marker zu verwenden, ist in der WO 97/41834 ausführlich diskutiert worden. Die vorliegenden zellspezifischen Virosomen üben dank ihrer auf der Membran sitzenden zellspezifischen Marker eine Selektivität für verschiedene Zelltypen aus und besitzen gleichzeitig dank des viralen fusogenen Peptids, zum Beispiel des Hämagglutinins, ein grosses Vermögen für Zellpenetration durch Endocytose. Virosomen mit Fab'-Fragmenten, die mit Tumoren assoziierte Antigene wie TAG72, CEA, 17-1A und CA 19-9 oder mit Leukämie assoziierte Antigene wie CD10 (CALLA = Common Acute Lymphoblastic Leukemia Antigen [akutes lymphoblastisches Common Leukämie-Antigen) und CD 20 erkennen, binden selektiv, d. h. bevorzugt, an Tumor- oder Leukämiezellen, die die erwähnten Antigene auf ihrer Zelloberfläche tragen.
Die neuartigen Vesikeln oder Virosomen sind besonders nützlich, um jegliches erwünschte, negativ geladene Material und bevorzugt genetisches Material zu Zielorten zu überführen, insbesondere zu Tier- und Menschenzellen in vitro und in vivo. Es wird betont, dass die neuartigen Virosomen in der Lage sind, nicht nur in proliferierende, d. h. replizierende Zellen einzudringen, sondern auch in nicht proliferierende, d. h. im Ruhezustand befindliche Zellen, durch welche Eigenschaft sie auf den Gebieten der biologischen Wissenschaften, der Pharmakologie und der Medizin sowohl als Forschungs- und/oder diagnostisches Werkzeug als auch als ein Medikament breiter Anwendung zugänglich werden. Indem die vorliegenden Virosomen als Pendelvektoren für die Überführung von cytotoxischen Mitteln oder Nucleinsäurematerial verwendet werden, werden sie für Anwendungen in unterschiedlichen pathologischen Zuständen wie zum Beispiel viralen Infektionen, Karzinomen, Tumoren, Leukämien oder anderen Krankheiten brauchbar, darunter Krankheiten, die auf genetische Defekte zurückgehen und gen-therapeutischen Verfahren unter Verwendung der vorliegenden Virosomen zugänglich sein können.
Die Virosomen der vorliegenden Erfindung können in vitro oder in vivo angewendet werden. Zum Beispiel wird die Reinigung von Knochenmark als Komponente bei der Behandlung verschiedener Neoplasmen, darunter akuter und chronischer Leukämie, verwendet. Gegenwärtig wird Knochenmark durch verschiedene Mittel wie immunologische Reagentien und Chemotherapeutika von leukämischen Zellen gereinigt. Virosomen verkapselte ODN, die gegen ein Onkogen gerichtet werden, das leukämischen Zellen einen Wachstumsvorteil verschafft, werden sich als therapeutisch nützlich und, was am wichtigsten ist, selektiver als herkömmliche Chemotherapeutika bei der Eliminierung leukämischer Zellen erweisen, während sie normale Progenitorzellen nicht angreifen.
Zur Benutzung als ein Medikament können die vorliegenden Virosomen Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung sein, die des Weiteren die gewöhnlichen Zusatzstoffe und pharmazeutisch annehmbare Träger umfasst. Es wird bevorzugt, dass die pharmazeutische Zusammensetzung als eine Injektionslösung zubereitet wird, aber andere Zubereitungsarten wie Emulsionen, Cremes, Gele und Salben zur topischen oder systemischen Verabreichung können bei einigen Anwendungen von Vorteil sein.
Es ist daher auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die vorliegenden Virosomen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zu verwenden, die für die prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung tierischer oder menschlicher Individuen geeignet ist, die von einer solchen Behandlung Vorteil ziehen können. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, die vorliegenden Virosomen für die Herstellung eines Diagnosekits für In-vitro- und In-vivo-Anwendungen zu verwenden.
Die vorliegenden Vesikeln werden bevorzugt durch ein Verfahren gewonnen, das analog zu einem beliebigen der in Beispielen 1 bis 3 und 6 der WO 97/41834 für die Herstellung von DOTAP-Virosomen offenbarten Verfahren ist, ausser dass DOTAP durch DOSPER ersetzt wird und dass die DOSPER-Konzentration in der fertigen Virosomenmembran richtig eingestellt wird, wie hierunter definiert, und dass sie insbesondere nicht 30 Gewichtsprozent des gesamten Lipidgehalts des Virosoms übersteigt. Grundsätzlich umfasst das Herstellungsverfahren der vorliegenden Virosomen die folgenden Schritte:

a) Zubereitung einer Pufferlösung, die ein nichtionisches Tensid enthält und die weiter DOSPER und andere Lipide sowie zumindest ein aktives, fusogenes Peptid enthält, das ein virales Nicht-Sendaivirus-Hämagglutinin ist und die Vesikeln durch rezeptor-vermittelte Phagocytose oder Endocytose veranlasst, durch Targetzellen internalisiert zu werden;
b) Einstellung der Lipidkonzentrationen relativ zu den gesamten Membranlipiden auf 5 bis 30 Gewichtsprozent DOSPER und eine Differenz von 95 bis 70 Gewichtsprozent der besagten anderen Lipide, darunter Phosphatidylcholin (PC) oder eines Abkömmlings davon sowie wahlweise Phosphatidylethanolamin (PE) und/oder kationischer Lipide ausser DOSPER; und
c) Entfernung des Tensids durch Dialyse oder durch Behandlung der Lösung mit Microcarrier-beads, was zur Bildung der positiv geladenen Lipid-Doppelschichtvesikeln führt; und bevorzugt
d) Einbau einer Menge einer erwünschten Arznei oder Substanz in die Vesikeln zur Abgabe an Targetzellen, wobei diese Arznei bzw. Substanz bevorzugt negativ geladen und speziell aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Farbstoff, einer Tracersubstanz, einem Kosmetikum, einer pharmazeutisch oder biologisch aktiven Substanz und einem Nucleinsäurematerial besteht.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung, die für In-vivo-Anwendungen der Virosomen bevorzugt wird, wird ein geeigneter bifunktioneller Crosslinker eingesetzt, um einen zellspezifischen Marker irreversibel an die Vesikelmembran zu binden. Der zellspezifische Marker, der auf einen Zellrezeptor gerichtet ist, der für die selektive Bindung des Virosoms an die Zelle verantwortlich ist, wird so an den Crosslinker gebunden, dass er biologisch weiter voll aktiv ist. Es wird bevorzugt, dass der Crosslinker in Gestalt eines vorgeformten Molekülkomplexes eingesetzt wird, in dem der Crosslinker kovalent an Phosphatidylethanolamin und einen zellspezifischen Marker gebunden ist, wie in den Ansprüchen definiert.
Der Begriff „fusogenes Peptid" bezieht sich auf Peptide oder Proteine, die in der Lage sind, eine Fusionsreaktion zwischen der Virosomenmembran und einer Lipidmembran der Targetzelle zu induzieren und/oder zu fördern. In den meisten Ausführungsformen bezieht er sich auf virale Spike-Glykoproteine, die das Fusionspeptid enthalten, und insbesondere auf das vollständige Hämagglutinin-Trimer der viralen Oberflächenspikes, sein Monomer oder die eine oder beide der gespaltenen Untereinheiten, nämlich die Glykopeptide HA1 und HA2, die das funktionelle Fusionspeptid enthalten. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff auf das reine Fusionspeptid selbst, entweder aus natürlichen Quellen isoliert oder synthetisch erzeugt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind diese das Fusionspeptid enthaltenden Polypeptide die Influenzavirus-Hämagglutinine, zum Beispiel dasjenige des A-H1N1-Untertyps.
An der Stelle von oder zusätzlich zu Influenzavirus-Hämagglutinin können die Hämagglutinine von anderen Viren ebenfalls als geeignete Fusionspeptide (oder -proteine) für die vorliegenden Virosomen verwendet werden, solange sie im Wesentlichen den gleichen pH-vermittelten Zellpenetrationsmechanismus wie das Influenza-Hämagglutinin aufweisen. Zu diesen Hämagglutininkandidaten gehören zum Beispiel das Rhabdovirus, das Typ-III-Parainfluenzavirus, das Semliki Forest-Virus und das Togavirus, wie in der WO 97/41834 offenbart.
Der Begriff „Crosslinker" bezieht sich auf ein heterobifunktionelles organisches Molekül, das in der Lage ist, an die Oberfläche von gemäss dieser Erfindung hergestellten Vesikeln anzubinden und Polypeptide zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält dieses Molekül eine N-Hydroxysuccinimidgruppe zur Ankopplung an die Aminogruppe von Phosphatidylethanolamin und eine Maleimidgruppe zur Konjugation mit einem zellspezifischen Marker wie zum Beispiel einem monoklonalen Antikörperfragment. Zu geeigneten Crosslinkern zählen Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimidester, Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat und Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat; der Crosslinker kann wechselweise ein Molekül sein, das eine N-Hydroxysuccinimidgruppe und eine photoreaktive Azidogruppe zur Kupplung mit Markern wie Cytokinen enthält, zum Beispiel N-Hydroxysuccinimidylsuberat (NHS-SA), N-Hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoat (HASAB), N-Succinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoat (SANPAH) und N-Sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2-nitrophenylamino)hexanoat. Es wird bevorzugt, dass der Crosslinker in Gestalt, eines vorgeformten Molekülkomplexes des Lipids -mit Crosslinker und zellspezifischem Marker verwendet wird.
Der Begriff „zellspezifisches Protein" oder „zellspezifischer Marker" bezieht sich auf ein Protein, das in der Lage ist, an den Crosslinker bzw. den Crosslinker-Lipid-Komplex anzubinden und das weiter in der Lage ist, an den Rezeptor der Targetzellen anzubinden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich dieses Molekül auf einen monoklonalen Antikörper, auf ein Antikörperfragment, ein Cytokin oder einen Wachstumsfaktor. Der zellspezifische Marker sorgt für eine selektive Erkennung und Bindung von Targetzellen und verbessert somit die Wirkung des fusogenen Peptids, das gleichzeitig in der virosomalen Membran vorliegt. Die bevorzugten Anti körperfragmente umfassen die Fragmente F(ab')2 und Fab', während die zellspezifischen Marker weiter Interleukine und andere Cytokine umfassen, insbesondere die unten in Tabelle 1 aufgeführten.
Tabelle 1
Der Begriff „kationisches Lipid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein organisches Molekül, das eine kationische Komponente und einen nichtpolaren Schwanz enthält, d. h. ein sogenanntes Kopf-Schwanz-Amphiphil wie N-[(1,2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) (Felgner und Mitautoren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7417 (1987)), N-[1,2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium-methylsulfat (DOTAP); oder N-t-Butyl-N'-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidin (Ruysschaert und Mitautoren, Biochem. Biophys. Res. Commun. 203: 1622–1628 (1994)). Sofern nicht ausdrücklich anderweit erwähnt, schliesst der Begriff auch die unten definierten polykationischen Lipide ein.
Der Begriff „polykationisches Lipid" bezieht sich auf ein organisches Molekül, das eine polykationische Komponente und einen nichtpolaren Schwanz enthält, wie das Lipospermin: 1,3-Dipalmitoyl-2-phosphatidylethanolamido-spermin (DPPES) und Dioctadecylamidoglycyl-spermin (DOGS) (Behr und Mitautoren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982–6986 (1989)); 2,3-Dioleoyloxy-N-[2-(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoracetat (DOSPA); 1,3-Dioleoyloxy-2-(6-carboxyspermyl)propylamid (DOSPER); und N,N,N',N'-Tetramethyl-N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-2,3-dioleoyloxy-1,4-butandiammoniumiodid (THDOB).
Es ist wesentlich, dass alle Virosomen der vorliegenden Erfindung DOSPER sowie ein oder mehrere weitere natürliche oder synthetische Lipide enthalten, die positiv geladen oder neutral sind. „Positiv geladen" bedeutet, dass die Lipide bei physiologischen pH-Werten eine positive Nettoladung besitzen. Somit sollen „positiv geladene" Lipide, Membranen oder Virosomen Lipide, Membranen oder Virosomen bedeuten, die bei physiologischen pH-Werten eine positive Nettoladung besitzen. Die „neutralen Lipide" weisen bei physiologischen pH-Werten keinerlei Nettoladung auf und umfassen Lipide wie Cholesterol oder dessen Abkömmlinge und/oder Phospholipide vom Zwitterionentyp, die innerhalb des Moleküls positiv und negativ geladene Bereiche besitzen, deren Ladungen sich stöchiometrisch ausgleichen.
Der Begriff „negativ geladenes Material", wie hierin verwendet, umfasst jegliche erwünschte Arznei oder Substanz, die bei physiologischen pH-Werten eine negative Nettoladung trägt.
Der Begriff „erwünschte Arznei oder Substanz", wie hierin verwendet, versteht sich so, dass alle chemischen Substanzen, Verbindungen oder Mischungen von Verbindungen einbezogen sind, die für kosmetische, diagnostische, pharmazeutische, medizinische oder alle anderen wissenschaftlichen Zwecke anwendbar sind. Solche Substanzen umfassen Verbindungen, die in vitro oder in vivo analytisch verfolgt werden können, wie Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, radioaktiv oder anderweitig markierte Verbindungen, Tracer- oder Markersubstanzen; sie umfassen aber auch proteinische oder nichtproteinische Arzneien oder alle anderen, pharmazeutisch oder biologisch aktiven Substanzen, insbesondere herkömmliche antivirale oder antikarzinogene Mittel, aber auch Nucleinsäureverbindungen, wie hierin definiert. Da die vorliegenden Virosomen bei physiologischen pH-Werten positiv geladen sind, wird bevorzugt, dass sie entweder mit neutralen oder mit negativ geladenen, erwünschten Arzneien oder Substanzen beladen werden, da diese den wirkungsvollsten und stabilsten Einbau in die Virosomen ermöglichen.
Die Begriffe „Nucleinsäure" oder „genetisches Material", wie hierin verwendet, umfassen kurzkettige DNA oder RNA, Desoxyribonucleotide, Oligodesoxyribonucleotide, Oligodesoxyribonucleotid-selenoate, Oligodesoxyribonucleotid-phosphorothioate (OPT), Oligodesoxyribonucleotid-phosphoramidate, Oligodesoxyribonucleotid-methylphosphonate, Peptid-Nucleinsäuren (PNA), Ribonucleotide, Oligoribonucleotide, Oligoribonucleotid-phosphorothioate, 2'-OMe-Oligoribonucleotid-phosphate, 2'-OMe-Oligoribonucleotidphosphorothioate, Ribozyme (RNA-Moleküle mit enzymatischen Aktivitäten), Gene, Plasmide und Vektoren (Klonierungsvektoren).
Der Begriff „Virosomen", wie hierin verwendet, bezieht sich – in seiner einfachsten Gestalt – auf liposomale Vesikeln mit einer Doppelschichtmembran, die kationische Lipide und einen Innenraum, bevorzugt wässrig, umfassen, worin die Membran weiter virale Proteine und insbesondere virale Glykoproteine enthält. In der bevorzugten Ausführungsform umfassen die viralen Proteine zumindest ein fusogenes Peptid oder Protein, das volle biologische Fusionsaktivität besitzt, insbesondere das Spike-Glykoprotein Hämagglutinin und/oder Neuraminidase des Influenza A-Virus (zum Beispiel A/Singapore). Es ist zu verstehen, dass die viralen Proteine auch synthetisch erzeugte Aminosäuresequenzen umfassen, die dem Fusionspeptid des Influenzavirus, wie hierin beschrieben, entsprechen oder gleichen. Die Membranlipide umfassen die oben definierten kationischen Lipide, können aber weiter wahlweise andere natürliche und/oder synthetische Lipide umfassen, bevorzugt Phospholipide wie Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE).
Obwohl die kationischen Virosomen der vorliegenden Erfindung in vielen Fällen, insbesondere bei In-vitro-Zellkulturversuchen, ohne zellspezifische Marker auf der Membran erfolgreich angewendet werden können, wird für In-vivo-Anwendungen besonders bevorzugt, dass sie weiter zumindest einen zellspezifischen Marker auf der Membran umfassen, wie oben definiert. Der mittlere Durchmesser der Vesikeln liegt im Bereich von 120 bis 180 nm, wie durch Elektronenmikroskopie und dynamische Lichtstreuung bestimmt.
Durch die Verwendung der kationischen Virosomen der vorliegenden Erfindung als Träger für erwünschte Arzneien oder Substanzen, darunter genetisches Material, können unerwünschte Nebenwirkungen auf Grund von Toxizität verhindert oder zumindest beträchtlich vermindert werden. Dieser nützliche Effekt wird erreicht, weil die vorliegenden kationischen Virosomen im Vergleich zu bisher bekannten Liposomen oder Virosomen eine weitaus höhere Aktivität und Wirksamkeit für die Überführung eingeschlossenen Materials, insbesondere negativ geladenen Materials wie der Antisense-Oligonucleotide, in Targetzellen sowie – was sogar noch wichtiger ist – für die Expression des transfizierten Nucleinsäurematerials durch die Targetzellen besitzen.
Entsprechend ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die in Anspruch 1 definierten DOSPER-Virosomen sowie deren als weitere Ausführungsformen in den nachfolgenden Ansprüchen 2 bis 11 definierte Varianten zur Verfügung zu stellen. Es ist ferner ein Gegenstand der Erfindung, eine Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die die neuartigen Virosomen zusammen mit einem geeigneten Träger für verschiedene Anwendungen enthalten, wie sie zum Beispiel in Anspruch 12 definiert sind.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, die neuartigen Virosomen herzustellen, wie es in Anspruch 13 mit den in Ansprüchen 14 bis 24 definierten Abwandlungen definiert ist.
Es ist noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, konkretere Verfahren der Verwendung der vorliegenden Virosomen, wie sie in Ansprüchen 25 bis 29 definiert werden, zu lehren und zu beanspruchen.
Die folgenden Beispiele werden vorgestellt, damit die hierin beschriebene Erfindung vollständiger verstanden werden kann. Die Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sind nicht so zu verstehen, dass sie diese Erfindung in irgendeiner Beziehung einschränken.
Beispiel 1: Herstellung von DOSPER-Virosomen mit vollständig fusionsaktiven viralen Hämagglutinin-Trimeren aus Influenzaviren
Hämagglutinin (HA) aus dem A/Singapore/6/86-Stamm des Influenzavirus wurde isoliert, wie von Skehel und Schild in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 968–972 (1971)) beschrieben. Kurz gesagt, wurden die Viren in der Allantoishöhle von Hühnereiern gezüchtet und zweimal durch Ultrazentrifugieren in einem Sucrosegradienten gereinigt. Die gereinigten Viren wurden in einem Puffer von pH 7,3 stabilisiert, der 7,9 mg/ml NaCl, 4,4 mg/ml Trinatriumcitrat-2H₂O, 2,1 mg/ml 2-Morpholinoethansulfonsäure und 1,2 mg/ml N-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure enthielt. Von der 345 μg HA pro ml enthaltenden Virusaufschlämmung wurden 53 ml durch Ultrazentrifugieren während 10 min bei 100 000 g pelletiert. Von einer gepufferten Tensidlösung von pH 7,4, die 145 mM NaCl, 25 mM HEPES und 54 mg/ml des nichtionischen Tensids Octaethylenglykolmonododecylether (OEG = C12E8) enthielt, wurden 7,7 ml zum Influenzaviruspellet hinzugefügt. Das Pellet wurde durch 2 Minuten Ultraschallbehandlung bei Zimmertemperatur völlig aufgelöst. Die Lösung wurde während einer Stunde einer Ultrazentrifugierung bei 100000 g ausgesetzt. Das anfallende Überstehende enthielt die solubilisierten HA-Trimeren (1,635 mg HA pro ml) sowie Spuren von Neuraminidase. Zu 3,7 ml des Über stehenden (6 mg HA) wurden 0,5 bis 2 mg DOSPER und 5,5 bis 4 mg (die Differenz zu 6 mg Gesamtlipid) Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) hinzugefügt. Die Lösung wurde durch Passieren eines 0,2-μm-Filters sterilisiert und dann in ein Glasgefäss überführt, das 1,15 g steriler Microcarrier-beads enthielt, bevorzugt Biobeads SM-2. Das Gefäss wurde mit einem REAX2-Schüttelgerät von Heidolph (Kelheim, Deutschland) während einer Stunde geschüttelt. Wenn erforderlich, wurde diese Prozedur bis zu dreimal mit 0,58 mg der Biobeads wiederholt. Nach diesen Prozeduren wurde eine geringfügig durchsichtige Lösung von DOSPER-Virosomen erhalten.
Die besten Ergebnisse wurden mit Virosomenzubereitungen erhalten, die ein Lipidverhältnis von 1,5 mg DOSPER (25 Gewichtsprozent der gesamten Lipide) je 4,5 mg DOPC enthielten. Höhere DOSPER-Konzentrationen, zum Beispiel von mehr als 30 bis 35 Gewichtsprozent, ergaben nach Tensidentfernung keine geeignete Virosomenbildung.
Ein teilweiser Ersatz von DOPC durch PE (Phosphatidylethanolamin) und/oder andere kationische Lipide wie DOTAP oder DOSPA ist ohne signifikante Einbusse an Transfektionsaktivität möglich.
Einbau von Phosphorothioat-Oligodesoxyribonucleotiden in DOSPER-Virosomen:
Das Antisense- und das Sense-Oligodesoxyribonucleotid-phosphorothioat (OPT) des L-myc-Gens wurde als ein Beispiel zum Nachweis der hohen Wirksamkeit kationischer Virosomen in der Transfektion verwendet. Die 5'-FITG-OPTs wurden über Phosphoramidit-Chemie (Microsynth GmbH, Balgach, Schweiz) synthetisiert. Das Pentadekamer (5'-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3') und das Pentadekamer (5'-FITC-GCGGACATGGACTAC-3') wurden als das Antisense- bzw. Sense-OPT verwendet. Ein OPT-Vergleichsmuster von gemischter Sequenz (msc: mixed sequence control), das aus der gleichen Länge von Nucleotiden wie das Antisense- und Sense-OPT bestand, wurde synthetisiert.
Von den DOSPER-Virosomen wurde je 1 ml hinzugefügt zu

a) 2 mg Antisense-FITC-OPT (1,3 μmol),
b) 3,4 mg Sense-FITC-OPT (1,3 μmol) und
c) 3,1 mg msc-FITC-OPT (1,3 μmol).

Die FITC-OPTs wurden aufgelöst, und die Lösungen wurden dann während 2 min bei 26°C mit Ultraschall behandelt. Nicht verkapselte FITC-OPTs wurden durch Gelfiltration auf einer High-Load Superdex-200-Säule (Pharmacia, Schweden) von den Virosomen abgetrennt. Die Säule wurde mit steriler PBS ins Gleichgewicht gebracht. Die Leervolumenanteile, die die DOSPER-Virosomen mit verkapseltem FITC-OPT enthielten, wurden mit PBS eluiert und gesammelt. Die Konzentrationen des in den Virosomen eingeschlossenen FITC-OPT wurden fluorimetrisch bestimmt, nachdem die Virosomen komplett in 0,1 M NaOH aufgelöst worden waren, die 0,1% (v/v) Triton X-100 enthielt. Zur Kalibrierung der Fluoreszenzskala wurde die Fluoreszenz von leeren DOSPER-Virosomen, die in der obigen Tensidlösung aufgelöst worden waren, gleich null gesetzt.
Ankopplung von Fab'-Fragmenten an Virosomen mittels vorgeformter Komplexe aus Phosphatidylethanolamin und bifunktionellen Crosslinkermolekülen:
Von frisch reduziertem Fab' aus murinem monoklonalem Anti-CD 10- (AntiCALLA-) Antikörper wurden 3 mg, aufgelöst in 2,8 ml einer Citronensäurepufferlösung (100 mM NaCl, 40 mM Citronensäure, 35 mM NaHP₂O₄ 2H₂O, 2 mM EDTA, pH 5,5), zu einer Lösung von 0,524 mg N-[4-(p-Maleimido-phenyl)butyryl]phosphatidylethanolamin (MPB.PE) in 215 μl Citronensäwepuffer, der 0,5% n-Octyl-oligo-Oxyethylen enthielt, hinzugefügt. Die Mischung wurde dann während 16 Stunden bei 4 °C unter Stickstoff und gelindem Rühren inkubiert. Nach der Inkubation wurde das nicht gekoppelte MPB.PE durch eine Füllung von 400 μl frisch reduzierter, feuchter Thiopropyl-Sepharose 6B (Pharmacia, Schweden) entfernt. Die Mischung wurde während 4 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Thiopropyl-Sepharose 6B wurde durch Zentrifugieren entfernt, die anfallende Lösung wurde zu pH 7,0 neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wurde mit OEG (54 mg/ml) ergänzt.
Die Lösungen, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, wurden zu den Lösungen für die Herstellung der DOSPER-Virosomen hinzugefügt. Die Fab'-MPB.PE-Moleküle werden während der Virosomenbildung in die Lipid-Doppelschicht eingebaut.
Mikrophotographien von DOSPER-Virosomen bestätigen die bevorzugte einlamellige Struktur der Vesikeln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 120 bis 180 nm, wie durch Laserlichtstreuung bestimmt. Die HA-Proteinspikes des Influenzavirus sind deutlich sichtbar.
Die volle fusogene Aktivität der vorliegenden DOSPER-Virosomen wurde durch die quantitative Prüfung bestätigt, die auf Fluoreszenz-Dequenching beruht und von Hoekstra und Mitautoren (Biochemistry 23: 5675–5681 (1984)) und L. Lüscher und Mitautoren (Arch. Virol. 130: 317–326 (1993)) beschrieben wurde. Die Fluoreszenzsonde Octadecylrhodamin B-Chlorid (R18) (von Molecular Probes Inc., Eugene, USA) wurde in hohen Dichten in die Membran von DOSPER-Virosomen eingeführt, indem die gepufferte OEG- (C₁₂E₈-) Lösung, die DOSPER und HA enthielt, zu einem dünnen, trockenen Film der Fluoreszenzsonde hinzugegeben wurde, das Muster dann während 5 bis 10 Minuten geschüttelt wurde, um die Sonde aufzulösen, und weiter wie unter „Herstellung von DOSPER-Virosomen..." beschrieben verfahren wurde. Die Verdünnung des quenchenden Rhodamins wurde durch Inkubation der rhodamin-markierten DOSPER-Virosomen mit Modellliposomen beobachtet (Verhältnis DOSPER/DOPC : liposomales Phospholipid = 1 20). Die Fluoreszenz wurde mit einem Perkin-Elmer 1000-Spektrofluorimeter bei einer Anregungs- bzw. Emissionswellenlänge von 560 und 590 nm gemessen.
Beispiel 2: Einbau von Virosomen durch Zellen
Einbau von ³H-markierten Plasmiden in DOSPER-Virosomen: Grundsätzlich wurde der Einbau von Nucleinsäureverbindungen in die Virosomen mit den folgenden drei Verfahren erreicht:

1. Dialyse: Die Nucleinsäureverbindungen wurden während der Bildung der Virosomen verkapselt, wobei das Tensid Octyl-POE (von der Firma Alexis, Läufelfingen, Schweiz) durch Dialyse entfernt wurde.
2. Biobeads: Die Nucleinsäureverbindungen wurden während der Bildung der Virosomen verkapselt, wobei das Tensid OEG durch Microcarriers, zum Beispiel Biobeads SM2, entfernt wurde.
3. Ultraschallbehandlung: Die Nucleinsäureverbindungen wurden mit kationischen Lipiden verkapselt, bevorzugt mit DOSPER, und die anfallenden, mit Nucleinsäure beladenen Liposomen oder Lipidkomplexe, bevorzugt DOSPER-Liposomen oder -Lipidkomplexe, wurden durch Ultraschallbehandlung mit DOSPER-Virosomen verschmolzen.

Da die besten Einbauraten mit dem dritten Verfahren erhalten wurden, sind die meisten Versuche mit diesem Verschmelzungsverfahren zum Einbau von Nucleinsäurematerial in die Virosomen ausgeführt worden.
Das Plasmid pGreen Lantern^TM-I (Gibco BRL) wurde in Gegenwart von ³H-Methylthymidin in E. coli erzeugt, um zur genauen Quantifizierung der Transfektionseffizienz radioaktiv markierte Plasmide zu gewinnen. Die spezifische Aktivität des Plasmids betrug 6,625 × 10¹⁰ dpm/g (= 29,84 mCi/g).
Vom ³H-markierten Plasmid wurden 11,6 μg (17,5 μl) in 480 μl HEPES-NaCl-Puffer aufgelöst. Nach Zugabe von 116 μg DOSPER (1 μg,μl) wurde das anfallende Gemisch während 30 Sekunden mit Ultraschall behandelt und danach für 15 Minuten stehen gelassen. Durch diese Behandlung bilden sich aus DOSPER und dem Plasmid bestehende Lipidkomplexe. Wechselweise können statt der Lipidkomplexe DOSPER-Liposomen durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel aus einer gepufferten OEG-Lösung, die DOSPER sowie das Plasmid enthält, und nachfolgende Entfernung des Tensids mit Dialyse oder tensid-absorbierenden Microcarriers, wahlweise gefolgt von Ultraschallbehandlung, was zu mit den Plasmiden beladenen DOSPER-Liposomen führt.
Zu der die mit Plasmid beladenen Lipidkomplexe oder Liposomen enthaltenden Lösung werden 93 μl im Voraus (zum Beispiel gemäss Beispiel 1) hergestellter leerer DOSPER-Virosomen hinzugefügt. Die Mischung wird während 1 min mit Ultraschall behandelt, um die DOSPER-Virosomen mit den Liposomen oder Lipidkomplexen zu verschmelzen und die Plasmide in die Virosomen einzubauen. Dieses Verfahren des Einbaus erwünschten Materials in Virosomen kann auch für den Einbau von Arzneien oder anderen Substanzen als Nucleinsäurematerial anwendbar sein, bevorzugt für negativ geladene Substanzen.
Vergleich der Transfektionseffizienz von ³H-markiertem Plasmid durch DOSPER-Virosomen und DOSPER-Liposomen:
Von der markierten Plasmid-DNA wurden 33 μg in DOSPER-Virosomen, 11,7 μg in vorgefertigte DOSPER-Liposomen verkapselt. Vier verschiedene, in Suspensionskulturen wachsende Adhäsionszelllinien, nämlich HeLa, 293T, COS-1 und NIH3T3 sowie zusätz lich die Zelllinien K562 und P3/NSI/1-Ag4-1 wurden mit DOSPER-Virosomen und DOSPER-Liposomen transfiziert.
Von jedem Zelltyp wurden 5 × 10⁵ Zellen in 500 μl (= 0,5 ml) des Mediums mit 25 μl der Lösung, entweder der Plasmid enthaltenden DOSPER-Virosomen oder der Plasmid enthaltenden DOSPER-Liposomen während 2, 4, 6 und 24 h bei 37°C inkubiert. Die hinzugefügten aliquoten Teile von DOSPER-Virosomen und DOSPER-Liposomen enthielten 400 ng des markierten Plasmids, was einer Radioaktivität von 26500 dpm (= 100%) entsprach. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und lysiert, und die aufgenommene Radioaktivität wurde mit einem Betazähler gemessen.
Der Einfluss der Länge der Transfektionszeit (Inkubationszeit) auf die Menge aufgenommenen Plasmids wurde ausgewertet und die Ergebnisse in 1 bis 6 aufgetragen. Die obige kurze Beschreibung der Figuren gibt eine Zusammenfassung der Zelllinien in jeder der Figuren. 1 bis 6 zeigen deutlich, dass DOSPER-Virosomen bei allen Zelltypen und für alle Inkubationszeiten den DOSPER-Liposomen in der Transfektion überlegen sind. Die längeren Inkubationszeiten von 6 und 24 h führten bei DOSPER-Liposomen nur zu einem ganz minimalen Zuwachs an DNA-Aufnahme, während die längeren Inkubationszeiten bei DOSPER-Virosomen zu beträchtlich höherer DNA-Aufnahme führten. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die HA-vermittelte Aufnahme durch Virosomen weitaus wirksamer als die durch DOSPER-Liposomen ohne die Hilfe jeglicher viraler Bindungsliganden für Zellrezeptoren induzierte Aufnahme ist. Es ist von Interesse, dass im Falle der DOSPER-Virosomen Inkubationszeiten von 6 bis 24 h nicht zu einer Sättigung des DNA-Einbaus führten, sondern zu einem weiteren Anwachsen der DNA-Aufnahme, was auf einen schnellen Ersatz der Membranrezeptoren nach ihrer Entfernung durch rezeptor-vermittelte Endocytose der Virosomen auf der Zelloberfläche zurückzuführen sein könnte. Allgemein wurde gefunden, dass (in Monoschichten wachsende) Adhäsionszelllinien wirksamer transfiziert wurden als die in Suspensionskulturen wachsenden Zelllinien.
Beispiel 3: Zeitabhängige Aufnahme von Plasmiden durch eukaryotische Zellen
Beispiel 2 wurde mit einem anderen ³H-markierten Plasmid wiederholt, nämlich mit pcDNA3.1/His B/lacZ (Lieferant: Invitrogen, Groningen, Niederlande). Zelllinien COS-1, K562, 293T und P3X63Ag8 wurden mit DOSPER-Virosomen transfiziert, die mit diesem Plasmid beladen waren, und während einer Zeitdauer von 2, 4 oder 72 Stunden inkubiert. Ein Vergleich mit DOSPER-Liposomen wurde in diesem Versuch nicht angestellt.
Die Ergebnisse sind in 7 aufgetragen. Daraus ist zu entnehmen, dass eine Verlängerung der Inkubationszeit sehr wohl zu einem weiteren Anstieg der zellulären Aufnahme des markierten Plasmids führen kann, wenn die vorliegenden Virosomen verwendet werden. Es ist tatsächlich möglich, 60 bis 80% der Gesamtmenge an Nucleinsäure (zum Beispiel an Plasmid) in die gewünschten Targetzellen einzuführen, wenn die vorliegenden DOSPER-Virosomen als ein Hochleistungs-Transfersystem für das Nucleinsäurematerial verwendet werden. Alle geprüften Zelllinien waren vergleichbar empfänglich für die Virosomen- und somit die Plasmidaufnahme.
Beispiel 4: Ein Vergleich der DOSPER-Virosomen mit DOTAP-Virosomen
Virosomen dringen über den vom Influenza A-Virus bekannten HA-getriebenen, rezeptor-vermittelten Mechanismus in Säugetierzellen ein. Es wurde nicht erwartet, dass die chemische Natur der Lipid-Doppelschicht der Virosomenmembran eine wichtige Rolle spielen könnte, solange der native Zustand und die fusogene Aktivität des HA ordentlich aufrechterhalten wurden. Es wurde daher angenommen, dass DOSPER-Virosomen und DOTAP-Virosomen ungefähr die gleiche Wirksamkeit für die Transfektion des Nucleinsäurematerials in Säugetierzellen besitzen.
Überraschend lieferten aber Versuche, die ausgelegt waren, um die Transfektionseffizienzen von DOSPER- und DOTAP-Virosomen zu vergleichen, ein anderes Ergebnis, nämlich ein von den Erwartungen bemerkenswert abweichendes. Die Versuche wurden gemäss Beispielen 1 und 2 durchgeführt, wobei das tritium-markierte Plasmid pcDNA3.1/His B/lacZ für die Verkapselung und die Transfektion verwendet wurde. Die DOTAP-Virosomen wurden gemäss Beispiel 1 der WO 97/41834 hergestellt, während der Einbau des Plasmids wie weiter oben beschrieben und unter Verwendung der gleichen Prozedur wie für die DOSPER-Virosomen erfolgte. Die gleiche Menge von ³H-markiertem Plasmid, wie in Beispiel 2 für die DOSPER-Virosomen beschrieben, wurde in die DOTAP-Virosomen eingekapselt. Zelllinien 293T, K562, Sp2 und HeLa wurden unter den gleichen Bedingungen wie oben in Beispiel 2 beschrieben mit DOSPER- und DOTAP-Virosomen inkubiert.
Die Ergebnisse sind in 8 bis 11 aufgetragen. Sie zeigen deutlich, dass die Transfektionseffizienz der DOSPER-Virosomen mindestens zweimal so hoch wie die der DOTAP-Virosomen ist und sogar bis zu zehnmal höher sein könnte. Der Unterschied in der Transfektionseffizienz ist äusserst deutlich sichtbar insbesondere bei den in Suspensionskulturen wachsenden Zelllinien wie Sp2 (10). Der Grund dafür ist noch nicht voll verstanden, aber der Unterschied kann zumindest teilweise auf die verschiedene chemische Natur der beiden Lipide zurückzuführen sein, da der polare Kopf des DOSPER-Moleküls vier freie Aminogruppen enthält, während der polare Kopf des DOTAP-Moleküls nur eine freie Aminogruppe enthält. Ohne durch Theorie gebunden sein zu wollen, vermuten wir, dass die Verkapselung von negativ geladenem Material wie Plasmiden in DOSPER enthaltende Virosomen zu grösseren Mengen nützlicher Virosomen führt. Im Gegensatz dazu kann die Verkapselung von Plasmid in DOTAP-Virosomen zu einer grösseren Anzahl von defekten Vesikeln mit niedrigem Transfektionspotenzial führen. Eine zweite Hypothese würde einen Verstärkungseffekt von DOSPER während der Bindung der Virosomen an die Zellmembran der Targetzellen heranziehen; wir können diesen Standpunkt nicht ausschliessen.
Die Ergebnisse zeigen somit, dass bei Benutzung des polykationischen Lipids DOSPER eine erstaunlich höhere Transfektionseffizienz als bei dem am häufigsten verwendeten kationischen Lipid DOTAP auftritt.
Beispiel 5: Genexpression nach Transfektion mit den vorliegenden Virosomen
Die quantitative Bestimmung der β-Galaktosidase-Expression durch die Targetzellen in den Versuchen des Beispiels 3, die durch virosomale Transfektion das Plasmid pcDNA3.1/His B/lacZ empfangen hatten, mit einem β-Gal-ELISA-Testkit (Lieferant: Boehringer Mannheim) bestätigte weiter, dass nicht nur die Transfektionsrate des virosomen-überführten Plasmids, sondern auch dessen Expression in den Targetzellen höher als die des liposomen-überführten Plasmids war. Die Versuche ergaben eine zwanzig- bis vierzigmal höhere Expression der β-Galaktosidase, wenn für die Transfektion des Plasmids in die Targetzellen statt der DOSPER-Liposomen DOSPER-Virosomen verwendet wurden (12).
Es wurde aber auch beobachtet, dass das Niveau der β-Galaktosidase-Expression stark von der Plasmidkonzentration in den Virosomen abhing:
Tabelle 2
Die Virosomen der Zubereitung 2 enthalten nur halb so viel Plasmid wie die Virosomen der Zubereitung 1, während die Anzahl von Virosomen in beiden Zubereitungen die gleiche ist.
Zubereitung 1 entspricht der bevorzugten Virosomenzubereitung, die für die meisten der hier beschriebenen Versuche verwendet worden ist.
Zubereitung 3 enthält die gleiche Menge von Plasmid, aber über die doppelte Anzahl von Virosomen verteilt.
Zubereitung 4 enthält eine noch kleinere Menge von Plasmid, die in der gleichen Anzahl von Virosomen wie in Zubereitungen 1 und 2 verkapselt ist.
Zubereitung 5 enthält die gleiche Menge von Plasmid wie die Zubereitungen 1 und 3, aber in einer Anzahl von Virosomen verkapselt, die dreimal so hoch wie in Zubereitung 1 ist.

Die in 13 aufgetragenen Ergebnisse bezeugen, dass die empirisch abgeleitete, bevorzugte DOSPER-Virosomenformulierung ziemlich optimal war, und weiter, dass die Verringerung der Plasmidkonzentration in Zubereitungen 2, 3 und 4 nicht zu einem höheren Niveau der Expression führte. Die Annahme, dass eine Überladung der Targetzellen durch eine Transfektion mit der obigen Zubereitung 1 ähnlichen Virosomenzubereitungen möglicherweise die Expression inhibiert haben könnte, war daher nicht länger haltbar. In der Beschreibung verwendete Abkürzungen

2'-OMe	2'-O-Methyl
CALLA	akutes lymphoblastisches Common Leukämie-Antigen
CAT	Chloramphenicol-acetyltransferase
dpm	Zerfallsereignisse pro Minute (disintegrations per minute)
DOSPER	1,3-Dioleoyloxy-2-(6-carboxy-spermyl)propylamid
DOTAP	N-[(1,2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium-methylsulfat
FITC-OPT	mit Fluorescein-isothiocyanat markiertes Oligodesoxyribonucleotidphosphorothioat
G418	Geneticin^®-disulfat (Antibiotikum G418)
HA	Hämagglutinin
MPB.PE	N-[4-(p-Maleimido)phenylbutyryl]phosphatidylethanolamin (= ein Crosslinker-Phospholipid-Komplex)
msc	Vergleichsmuster von gemischter Sequenz (mixed sequence control)
NA	Neuraminidase
Octyl-POE	n-Octyl-oligooxyethylen
ODN	Oligodesoxynucleotide
OEG	Octaethylenglykol-monododecylether (C12E8)
OPT	Oligodesoxyribonucleotid-phosphorothioat(e)
PC	Phosphatidylcholin
PE	Phosphatidylethanolamin
PNA	Peptidnucleinsäure
SCLC	kleinzelliges Bronchialkarzinom (small-cell lung cancer)
SV40	Simianvirus 40

Claims

Lipidvesikel mit einer Doppelschichtmembran, die bei physiologischen pH-Werten eine positive Nettoladung besitzt, und worin das Vesikel weiter zumindest ein aktives fusogenes Peptid umfasst, das ein Nicht-Sendaivirus-Hämagglutinin ist, das die Vesikel durch rezeptor-vermittelte Phagocytose oder Endocytose veranlasst, durch Targetzellen internalisiert zu werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Vesikelmembran relativ zu den gesamten Membranlipiden 5 bis 30 Gewichtsprozent an 1,3-Dioleoyloxy-2-(6-carboxy-spermyl)propylamid (DOSPER) und eine Differenz bzw. Rest von 95 bis 70 Gewichtsprozent an anderen Lipiden enthält, darunter Phosphatidylcholin (PC) oder einen Abkömmling bzw. Derivat davon sowie wahlweise Phosphatidylethanolamin (PE) und/oder kationische Lipide ausser DOSPER.
Vesikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es weiter eine erwünschte Arznei oder Substanz zur Abgabe an Targetzellen enthält, wobei diese Arznei bzw. Substanz bevorzugt negativ geladen und speziell aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Farbstoff, einer Tracersubstanz, einem Kosmetikum, einer pharmazeutisch oder biologisch aktiven Substanz und einem Nucleinsäurematerial besteht.
Vesikel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die gewünschte Arznei bzw. Substanz ein Nucleinsäurematerial ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus kurzkettigen DNA oder RNA, Desoxyribonucleotiden, Oligodesoxyribonucleotiden, Oligodesoxyribonucleotid-selenoaten, Oligodesoxyribonucleotid-phosphorothioaten, Oligodesoxyribonucleotid-phosphoramidaten, Oligodesoxyribonucleotid-methylphosphonaten, Peptidnucleinsäuren, Ribonucleotiden, Oligoribonucleotiden, Oligoribonucleotidphosphorothioaten, 2'-OMe-Oligoribonucleotid-phosphaten, 2'-OMe-Oligoribonucleotidphosphorothioaten, Ribozymen, Genen, Plasmiden und Vektoren besteht.
Vesikel nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die erwünschte Arznei bzw. Substanz ein Nucleinsäurematerial ist und das Vesikel dieses Nucleinsäurematerial in einer Menge zwischen 0,03 und 0,1, bevorzugt zwischen 0,045 und 0,065 μg Nucleinsäurematerial pro 1 μg DOSPER enthält.
Vesikel nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der durchschnittliche Vesikeldurchmesser im Bereich von 120 bis 180 nm liegt.
Vesikel nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es weiter zumindest einen an die Vesikelmembran angehängten, zellspezifischen Marker umfasst.
Vesikel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Vesikelmembran weiter Phosphatidylethanolamin (PE) und einen bifunktionellen Crosslinker umfasst, der mit einer seiner Bindungsstellen an eine freie Aminogruppe des PE und mit seiner anderen Bindungsstelle an den zellspezifischen Marker gebunden ist.
Vesikel nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der zellspezifische Marker ein biologisch aktives Protein zur Bindung an einen Rezeptor von Targetzellen ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Cytokin und einem Wachstumsfaktor besteht.
Vesikel nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Hämagglutinin von einem Virus abgeleitet ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Rhabdovirus, Parainfluenzavirus des Typs 3, Semliki Forest-Virus und Togavirus besteht.
Vesikel nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Vesikelmembran relativ zu den gesamten Membranlipiden DOSPER in einer Konzentration von 10 bis 30 Gewichtsprozent, bevorzugt von 20 bis 25 Gewichtsprozent enthält.
Vesikel nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Vesikelmembran relativ zu den gesamten Membranlipiden 25 Gewichtsprozent DOSPER und 75 Gewichtsprozent PC, bevorzugt Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC), enthält.
Zusammensetzung aus einer Mehrzahl von Vesikeln, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 11 definiert, in Kombination mit einem geeigneten Träger zur Verwendung in kosmetischen, pharmazeutischen oder diagnostischen Anwendungen.
Verfahren zur Herstellung eines Lipidvesikels, wie in Anspruch 1 definiert, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst, a) eine Pufferlösung zuzubereiten, die ein nichtionisches Tensid enthält und die weiter DOSPER und andere Lipide sowie zumindest ein aktives, fusogenes Peptid enthält, das ein Nicht-Sendaivirus-Hämagglutinin ist und die Vesikel durch rezeptorvermittelte Phagocytose oder Endocytose veranlasst, durch Targetzellen internalisiert zu werden; b) die Lipidkonzentrationen relativ zu den gesamten Membranlipiden auf 5 bis 30 Gewichtsprozent DOSPER und eine Differenz von 95 bis 70 Gewichtsprozent dieser anderen Lipide, darunter Phosphatidylcholin (PC) oder einen Abkömmling davon sowie wahlweise Phosphatidylethanolamin (PE) und/oder kationische Lipide ausser DOSPER, einzustellen; und c) das Tensid durch Dialyse oder durch Behandlung der Lösung mit Microcarrier-beads zu entfernen, was zur Bildung dieser positiv geladenen Lipid-Doppelschichtvesikel führt.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es weiter einen Schritt umfasst, in die Vesikel eine Menge einer erwünschten Arznei oder Substanz zur Abgabe an Targetzellen einzubauen, wobei diese Arznei bzw. Substanz bevorzugt negativ geladen und speziell aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Farbstoff, einer Tracersubstanz, einem Kosmetikum, einer pharmazeutisch oder biologisch aktiven Substanz und einem Nucleinsäurematerial besteht.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass es weiter einen Schritt umfasst, konjugierte Molekülkomplexe, die aus Phosphatidylethanolamin (PE), einem bifunktionellen Crosslinker und einem zellspezifischen Marker bestehen, derart herzustellen, dass der bifunktionelle Crosslinker mit einer Bindungsstelle an die Aminogruppe von PE und mit einer anderen Bindungsstelle an eine Thiolgruppe des zellspezifischen Markers bindet, nicht konjugiertes Material abzutrennen und die Molekülkomplexe zur Lösung im Schritt (a) hinzuzufügen.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Einbau der erwünschten Arznei bzw. Substanz durch Zugabe der erwünschten Arznei bzw. Substanz zur Lösung in Schritt (a) erreicht wird, wonach im Schritt (c) Vesikel gebildet werden, die die erwünschte Arznei bzw. Substanz enthalten.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Einbau der erwünschten Arznei bzw. Substanz in die Vesikel erreicht wird, indem zu den aus Schritt (c) sich ergebenden Vesikeln die erwünschte Arznei bzw. Substanz hinzugefügt wird, das Gemisch mit Ultraschall behandelt wird, um die Arznei bzw. Substanz in die Vesikel zu integrieren, und nichtintegriertes Material bevorzugt mittels Gelfiltration abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Einbau der erwünschten Arznei bzw. Substanz in die Vesikel erreicht wird, indem zu den aus Schritt (c) sich ergebenden Vesikeln positiv geladene Lipidkomplexe oder Liposome hinzugefügt werden, die mit der erwünschten Arznei bzw. Substanz beladen sind, und das anfallende Gemisch mit Ultraschall behandelt wird, um die Lipidkomplexe oder Liposomen mit diesen Vesikeln zu verschmelzen und die Arznei bzw. Substanz in diese Vesikel zu integrieren.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die positiv geladenen Lipidkomplexe oder Liposomen relativ zum Gesamtgehalt an Lipiden 50 bis 100 Gewichtsprozent des DOSPER-Lipids enthalten.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 15 bis 19, worin der zellspezifische Marker aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Cytokin und einem Wachstumsfaktor besteht.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die erwünschte Arznei bzw. Substanz ein Nucleinsäurematerial ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus kurzkettigen DNA oder RNA, Desoxyribonucleotiden, Oligodesoxyribonucleotiden, Oligodesoxyribonucleotid-selenoaten, Oligodesoxyribonucleotid-phosphorothioaten, Oligodesoxyribonucleotid-phosphoramidaten, Oligodesoxyribonucleotid-methylphosphonaten, Peptidnucleinsäuren, Ribonucleotiden, Oligoribonucleotiden, Oligoribonucleotid-phosphorothioaten, 2'-OMe-Oligoribonucleotid-phosphaten, 2'-OMe-Oligoribonucleotid-phosphorothioaten, Ribozymen, Genen, Plasmiden und Vektoren besteht.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Nucleinsäurematerial in einer Konzentration zwischen 0,03 und 0,1, bevorzugt zwischen 0,045 und 0,065 μg Nucleinsäurematerial pro 1 μg DOSPER-Lipid in die Virosomen eingebaut wird.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 13 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das nichtionische Tensid Octaethylenglykol-monododecylether (C₁₂E₈)() oder n-Octyl-oligooxyethylen ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Vernetzungsmittel ein hetero-bifunktionelles organisches Molekül ist, das zumindest eine Maleimido- und zumindest eine Carboxylgruppe besitzt und bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bis-N-succinimidylabkömmlingen bzw. -derivaten und photoaktivierbaren Succinimidylabkömmlingen bzw. -derivaten besteht.
Verwendung eines in Anspruch 1 definierten Vesikels zur Herstellung einer Zusammensetzung für kosmetische, diagnostische oder medizinische Anwendungen, insbesondere zur Abgabe einer erwünschten Arznei oder Substanz an im Ruhezustand befindliche oder proliferierende Targetzellen.
Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass diese Targetzellen in vitro in Gegenwart dieser Vesikel inkubiert werden und dass diese inkubierten Targetzellen wahlweise zu einem Organismus in vivo überführt werden können.
Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Targetzellen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Krebszellen, leukämischen Zellen und virusinfizierten Zellen besteht.
Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Stoffwechsel- oder proliferative Aktivität dieser Targetzellen nach Inkubation in Gegenwart dieser Vesikel vermindert ist.
Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die erwünschte Arznei bzw. Substanz ein Nukleinsäurematerial ist, das zumindest ein Antisense-Oligonucleotid umfasst, bevorzugt ein Antisense-Oligonucleotid, das auf proto-onkogen- oder onkogen-kodierte mRNA abzielt.