DE60008565T2 - Extrakorporales verfahren zur entfernung von endotoxin - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf Material zur Blutbehandlung mit der Fähigkeit, selektiv Endotoxin und Cytokin induzierende Substanzen aus Blut oder Plasma durch extrakorporale Adsorption für die therapeutische Behandlung von septischem Schock zu entfernen.
  • Endotoxine sind Lipopolysaccharide gram-negativer Bakterien und die Hauptursache für Sepsis und septischen Schock mit Sterberaten von höher als 50%. Endotoxine können in Blut nach der Infektion überdauern, sogar in Abwesenheit von lebenden Bakterien. Endotoxinmoleküle haben einen hoch konservierten Bereich, der aus einer Lipid-A-Einheit besteht, umfassend etliche lange Fettsäureketten und Zuckerringe mit wenigstens zwei negativ geladenen Phosphatgruppen. Die Lipid-A-Einheit ist mit Polysaccharidketten verbunden, die stark in Abhängigkeit vom Bakterientyp variieren. Die pathologische Wirkung wird hauptsächlich durch die Lipid-A-Einheit des Moleküls erhalten. Die Zugänglichkeit der Lipid-A-Einheit wird überwiegend moduliert durch die Art der Polysaccharidketten und der umgebenden Medien, einschließlich solcher Faktoren, wie Salzgehalt, Wasser, Zuckermoleküle, Plasma, Blut, pH, Detergenzien und Ähnlichem. Zum Beispiel führt eine hohe Salzkonzentration zu micellären und anderen supermolekularen Strukturen von Endotoxinen, was in unterschiedlichen Aktivitäten resultiert.
  • Endotoxin wird durch Messen seiner Cytokin induzierenden Wirkung auf CD14-positive Leukozyten untersucht, um z. B. TNF-α zu produzieren, das durch eine ELISA-Technik unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits, z. B. R&D Systems, Bad Homburg, Deutschland, oder durch eine LAL-induzierte chromogene Substratreaktion (Chromogenics, Moeldwagen, Schweden) analysiert werden kann. Das Molekulargewicht von Endotoxin bewegt sich im Bereich von 5.000 Da bis zu einigen Millionen Da in Abhängigkeit von der Länge der Polysaccharidkette und seiner supermolekularen Struktur.
  • Die meisten extrakorporalen Strategien der Entfernung nützten die negativ geladenen Phosphatgruppen von Endotoxin aus, unter Verwendung von positiv geladenen adsorbierenden Materialien, die auf einer Reihe an Substraten immobilisiert waren. Kodama, et al. (EP 0107119, EP 0129786 ) offenbarten polykationisches Polymyxin B, kovalent immobilisiert auf Polystyrolfasern, und beschrieben das Adsorbieren von Endotoxinen aus Blut in einer Vorrichtung, die mit verwobenen Fasern solchen Materials gefüllt war. Otto, et al. ( EP 424698 ) offenbarten ebenfalls immobilisiertes polykationisches Polymyxin B auf Poly(comethacrylat)-Perlen, um Endotoxin aus Blut zu adsorbieren. Falkenhagen, et al. [Artificial Organs (1996) 20: 420] beschrieben das Adsorbieren von Endotoxin aus Plasma auf polykationischen, mit Polyethylenimin überzogenen Kugeln aus Cellulosederivat. Mitzner, et al. [Artificial Organs (1993) 17(9): 775] beschrieben Polyethylenimin und Polymyxin B, immobilisiert auf makroporösen Celluloseperlen, für die Entfernung von Endotoxin aus Plasma. Ein Produkt, das die Kodama-Technik einschloss, wurde in Japan vermarktet; die Tatsache, dass Polymyxin B stark nephrotoxisch ist, hat jedoch einen Nachteil, was die Registrierung in anderen Ländern wegen dem Risiko, dass Polymyxin B in Blut leckt, verhindert. Polyethylenimin als ein Endotoxin-Ligand hat die doppelten Nachteile, dass es stark Heparin adsorbiert und auch mit Blutplättchen in Wechselwirkung tritt, was zu Koagulierungsproblemen in einer in vivo-Anwendung führt. Das Potenzial für das Adsorbieren von Plasmaproteinen stellt ein signifikantes Problem für die Entwicklung eines Endotoxin-Adsorptionsmittels dar, das sowohl spezifisch als auch selektiv ist.
  • Die Europäischen Patentanmeldungen ( EP 0494848 , EP 0129786 , Pharmacia Upjohn) offenbarten die Entfernung von Endotoxin unter Verwendung eines Arginin-Liganden auf Sepharose. Während in vitro-Versuche viel versprechend schienen, scheint keine weitere Entwicklung gemacht worden zu sein. Anspach (WO 97/33683, DE 196 09 479 ) beschrieb die Immobilisierung kationischer Liganden wie z. B. Polylysin, N,N- Diethylaminoethan, Lysin, Arginin, Histidin oder Histamin auf Polyamid-Mikrofiltrationsmembranen und offenbarte Daten für die Entfernung von bis zu 50% Endotoxin aus Proteinlösungen. Die Anwendbarkeit war jedoch beschränkt auf Lösungen mit einem geringeren Proteingehalt als Blut oder Plasma. Hoess, et al. (WO 95/05393) beschrieben ein Peptid mit einer Endotoxin adsorbierenden Eigenschaft. Das Peptid bestand aus hydrophilen, positiv geladenen Aminosäuren, die mit hydrophoben Aminosäuren abwechselten. Keine Daten wurden berichtet für die Endotoxinadsorption aus Blut oder Plasma. Evans, et al. (WO 96/41185) beschrieben immobilisierte Amidingruppen auf makroporösen Perlen, so dass die Gruppen einen spezifischen Abstand zwischen den positiv geladenen Zentren hatten Von dem Material wurde berichtet, dass es geeignet war für die Endotoxinentfernung aus Plasma und anderen Fluiden; das Material scheint jedoch nicht im Handel erhältlich zu sein. Otto, et al. (EP-Anmeldung 0858831) offenbarten die Endotoxinentfernung aus Gesamtblut unter Verwendung von Albumin als einem Liganden, der kovalent auf makroporösen Polymethylmethacrylat-Perlen immobilisiert war. Obwohl die in vitro-Daten unter statischen Bedingungen in Plasma eine ausgezeichnete Endotoxinadsorptionsfähigkeit zeigten, war das Verhalten der Endotoxinentfernung, wenn es auf Gesamtblut unter fließenden Bedingungen, wie in einer therapeutischen Anwendung, angewandt wurde, sehr beschränkt, vielleicht wegen der schwachen Bindung von Endotoxin an immobilisiertes Albumin.
  • Andere Arbeiter untersuchten die Verwendung nichtselektiver Oberflächen für die Entfernung der Endotoxinentfernung aus Plasma. Ash, et al. (Biologic DTPF-system TM, ISFA-Kongress, Saarbrücken/Deutschland, 15. – 19. April 1999) behandelten Endotoxin enthaltendes Plasma in vitro mit feinpudriger Kohle, ohne Liganden, mit einer Oberfläche von annähernd 1.000 m2/g Kohle/10 ml Plasma. Obwohl von einer hohen Endotoxinentfernung berichtet wurde, gab der Bericht nicht mehr Details dahingehend, welche anderen Bestandteile entfernt worden waren, einschließlich günstiger Substanzen. Tetta, et al. ( EP 0787500 ) beschrieben die Verwendung positiv geladener Ionenaustauschperlen für die Endotoxinentfernung von Plasmen und berichteten von einer 90%-igen Entfernung in Tierversuchen.
  • Zusammengefasst, ein Ansatz liegt darin, soviel Endotoxin als möglich einfach durch die Verwendung von sehr großen adsorbierenden Bereichen zu entfernen. Es kann jedoch eine unspezifische Bindung resultieren bei der begleitenden Entfernung von normalen Blutbestandteilen, wie gewisse Antikörper und Koagulierungsfaktoren. Die begleitende Entfernung ist unerwünscht. Auch ist die Verwendung nichtspezifischer Bindungsmaterialien beschränkt auf die Behandlung von Plasma, um Zellaktivierung zu vermeiden. Nichtspezifische Bindungsmaterialien werden als unpraktisch für die Gesamtblut-Anwendung erachtet, wegen dem möglichen Risiko unerwarteter Nebenreaktionen.
  • Ein anderer Ansatz wird durch die Offenbarung von Kodama, et al., oben, oder Otto, et al., oben, dargestellt, basierend auf der Verwendung spezifisch bindender Liganden. wie z. B. Polymyxin B oder Histidin. Während solche Liganden eine ausreichende Spezifität zeigen, um die begleitende Entfernung von Blutbestandteilen zu vermeiden, variiert die Bindungskapazität über den Bereich von Endotoxinen, die wahrscheinlich entgegentreten. Um die geringe Bindungskapazität zu kompensieren, könnte eine große Adsorptionskammer benötigt werden, was ein nicht akzeptierbar großes extrakorporales Blutvolumen notwendig macht, um eine rasche Endotoxinbeseitigung zu erreichen. Das Fehlen an Bindungskapazität für ein Adsorptionsmittel für einen Polymyxin B-Liganden wurde in Tierstudien gezeigt, bei denen das Adsorptionsmittel nur fähig war, das Endotoxin für eine begrenzte Zeit zu beseitigen [Otto et al. (1997) Therapeutic Apheresis 1: 67]. Obwohl die Tiere etwas länger lebten als unbehandelte Kontrollen, war die Überlebensrate nicht beeinflusst.
  • Von der Verwendung von Serumalbumin als einem Adsorptionsmittel wurde berichtet. Von dem nichtkovalenten Anhängen von Albumin an Abstützungsmaterialien in Perlenart wurde durch Hirae et al. EP 800862 , und Suzuki et al. EP 028937 berichtet. Kovalent angehängtes Albumin wurde ebenfalls offenbart (Otto, EP 848831 ). Das Grundprinzip für die Verwendung von Albumin ist, dass es bereits als ein Bindungs- und Transportprotein im Blutstrom funktioniert. Die praktische Verwendung von immobilisiertem Albumin wird begrenzt durch die Tatsache, dass Albumin Endotoxin nicht mit ausreichender Avidität bindet.
  • Haemodialysemembranen mit einer höheren Proteinadsorption wie z. B. AN69 (Gambro-Hospal) werden als gute Oberflächen für sepsisverwandte Reaktionen mit sehr geringer Häufigkeit ihrer Endotoxin- und Cytokinadsorptionsfähigkeit erachtet.
  • WO 96/38410 offenbart monodisperse und polydisperse Verbindungen, im Allgemeinen bezeichnet als Nα-substituierte Diaminosäure-Oligopeptide. Materialien, die solche Verbindungen enthalten, werden offenbart für die Verwendung bei optischen Lagerungs- und Verarbeitungsanwendungen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Das durch die vorliegende Erfindung gelöste Problem ist, Endotoxinadsorptionsliganden zu ersinnen, die auf der einen Seite eine ausreichende Heterogenität aufweisen, um eine breite Reihe an Endotoxinen wirksam zu adsorbieren, während sie zur selben Zeit eine ausreichende Spezifität für Endotoxine allgemein haben, um das Adsorbieren anderer physiologischer Bestandteile von Blut zu vermeiden, um keine unangebrachten Nebenreaktionen zu verursachen. Zu diesem Zweck wurden polykationische Arten synthetisiert aus Aminosäuren, ausgewählt aus Arginin, Lysin und Histidin, die positiv geladen sind bei einem physiologischen pH-Wert von 7,2 unter Verwendung eines Polykondensationsschrittes in verdünnter Lösung in Wasser, dergestalt, dass ein sehr hoher Grad an Polydispersität (Polykondensationsgrad, Grad der Verzweigung, Verknäuelungszustand) resultiert. Die weit verbreiteten Oligopeptide können auf einem Festphasenmedium immobilisiert, z. B. auf einem porösen, aktivierten Substrat, einschließlich Perlen oder Membranen, unter Verwendung von gewöhnlichen Kopplungsreaktionsmitteln wie z. B. Cyanurchlorid, Carbonyldiimidazol, Promcyan oder wasserlösliches Carbodiimid, gewaschen, in ein Gehäuse gefüllt und sterilisiert werden. Überraschenderweise entspricht der hohe Grad der Oligopeptidheterogenität dem hohen Grad der Heterogenität von Endotoxin, was in einer hohen Kapazität für die Entfernung von Endotoxinen aus unterschiedlichen Quellen resultiert.
  • Die extrakorporale Entfernung von Endotoxin aus Blut von einem menschlichen oder tierischen Subjekt wird durchgeführt durch in Kontakt bringen des Bluts mit einem Adsorptionsmittel, zusammengesetzt aus polydispersem Oligopeptid der Erfindung, immobilisiert auf einem Festphasenträgermedium. Das Adsorptionsmittel umfasst eine Zubereitung, bestehend im Wesentlichen aus einer Mischung von irgendwelchen linearen oder verzweigten Oligopeptiden, zusammengesetzt aus einer oder mehreren Aminosäuren, die positiv geladen sind bei einem physiologischen pH-Wert von 7,2, z. B. Arginin, Lysin oder Histidin, wobei diese Oligopeptide polydispers sind bezüglich dem Molekulargewicht und der Anzahl der Verzweigungen pro Molekül. Das Trägermedium ist vorzugsweise ein poröses Material, wie zum Beispiel eine Membran, ein Partikelbett oder ein Fasergewebe, mit einer Porosität, die ausreichend ist, um das Hindurchtreten von Blutzellen zu erlauben. Besonders bevorzugte Trägermaterialien haben die Form von Perlen, die in einen Behälter gefüllt werden können, wobei die Perlen eine Größe haben, die ausreichend ist, um die erforderliche Porosität bereitzustellen, wenn sie in eine Säule oder ein Filterbett gepackt werden. Beispiele geeigneter Perlenmaterialien, bekannt im Stand der Technik, sind unten bereitgestellt.
  • Eine Vorrichtung für die extrakorporale Entfernung von Endotoxin aus Gesamtblut kann gemäß den im Stand der Technik bekannten allgemeinen Prinzipien konstruiert werden. Die Grundbestandteile solch einer Vorrichtung sind ein Behälter, der gebaut ist, um das Adsorptionsmittel mit einem Endotoxinliganden, immobilisiert auf einem Festphasenträgermedium wie beschrieben, aufzunehmen und zurückzuhalten, ein Einlass und ein Auslass. Der Einlass und Auslass werden in Bezug auf das Adsorptionsmittel dergestalt angeordnet, dass Blut, das durch den Einlass eintritt das Adsorptionsmittel kontaktieren muss, ehe es durch den Auslass austritt. Vorzugsweise ist die Geometrie der Vorrichtung gestaltet, um den Kontakt von Blut mit dem Adsorptionsmittel während der Passage durch die Vorrichtung zu maximieren. Eine Reihe solcher Gestaltungen sind im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel kann die Vorrichtung ein hohler Zylinder sein, gepackt mit adsorbierenden Perlen, mit dem Einlass an einem Ende und dem Auslass an dem gegenüberliegenden Ende. Andere Vorrichtungen wie zum Beispiel microtubuläre Anordnungen können konstruiert werden. Sämtliche solcher Variationen an Behältergeometrie und -volumen und des darin enthaltenen Adsorptionsmittels können gemäß den bekannten Prinzipien gestaltet werden.
  • Ein Verfahren für das Entfernen von Endotoxin aus dem Blut eines menschlichen oder tierischen Subjektes schließt das Entfernen einer Blutportion von dem Subjekt ein, das in Kontakt bringen des Blutes mit einem Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung, wobei das Endotoxin an das Adsorptionsmittel bindet, und dann die Rückgabe des Blutes an das Subjekt. Vorzugsweise wird das Verfahren in einem kontinuierlichen Durchfluss durchgeführt. Die Stelle der Blutgefäße des Subjektes, an der Blut entfernt und wieder zugeführt wird, kann sich voneinander unterscheiden oder dieselbe sein. Im letzteren Fall sind Einzelnadeltechniken im Stand der Technik bekannt, die die Intensität des Eingriffs des Verfahrens reduzieren.
  • Die Behandlungsdauer wird von der Endotoxinkonzentration in dem Blut, der Art des anwesenden Endotoxins, der Kapazität des Adsorptionsmittels, um das Endotoxin zu entfernen, der Durchflussgeschwindigkeit und Ähnlichem abhängen, was alles überwacht und angepasst werden kann, wie es im Stand der Technik bekannt ist.
  • Die Erfindung stellt weit verbreitete und/oder hochverzweigte Peptide mit einem Molekulargewichtsbereich von 500 bis 50.000 Da bereit, zusammengesetzt aus einer oder mehreren Aminosäuren, die bei physiologischem pH-Wert positiv geladen sind (isoelektrischer Punkt > 7,2).
  • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Spiegel von Lipopolysaccharid (LPS) in menschlichem Blut zu verschiedenen Zeitpunkten vor (O) und nach (
    Figure 00080001
    ) der Passage durch eine Säule, die polydisperse Argininoligomere, immobilisiert auf Perlen, enthält (siehe Beispiel 2 für Details). Der LPS-Gehalt wurde bestimmt unter Verwendung des chromogenen Limulus-Amoebocyten-Lysat-(LAL) Tests. Ebenfalls sind die LPS-Gehalte in menschlichem Blut (markiert als ∎) nach der Passage durch eine Säule, die keine polydispersen Oligomere enthält, gezeigt.
  • 2 zeigt die Anzahl der weißen Blutzellen in menschlichem Blut zu verschiedenen Zeitpunkten vor (O) und nach (
    Figure 00080001
    ) der Passage durch eine Säule, enthaltend polydisperse Argininoligomere immobilisiert auf Perlen (siehe Beispiel 2 für Details). Ebenfalls ist die Anzahl weißer Blutzellen in menschlichem Blut (markiert als ∎) nach der Passage durch eine Säule, die keine polydispersen Argininoligomere enthält, gezeigt.
  • 3 zeigt die Anzahl roter Blutzellen in menschlichem Blut zu verschiedenen Zeitpunkten vor (O) und nach (
    Figure 00080001
    ) der Passage durch eine Säule, enthaltend polydisperse Argininoligomere immobilisiert auf Perlen (siehe Beispiel 2 für Details). Ebenfalls ist die Anzahl roter Blutzellen in menschlichem Blut (markiert als ∎) nach der Passage durch eine Säule, die keine polydispersen Argininoligomere enthält, gezeigt.
  • 4 zeigt die freien Hämoglobinspiegel in menschlichem Blut zu verschiedenen Zeitpunkten vor (O) und nach (
    Figure 00080001
    ) der Passage durch eine Säule, enthaltend polydisperse Argininoligomere immobilisiert auf Perlen (siehe Beispiel 2 für Details).
  • Zum Vergleich wurden die freien Hämoglobinspiegel in menschlichem Blut (markiert als ∎) nach der Passage durch eine Säule, die keine polydispersen Argininoligomere enthält, gemessen.
  • 5 erläutert das Ausmaß der Thrombin-Antithrombin-III-Komplex-(TAT) Bildung von menschlichem Blut zu verschiedenen Zeitpunkten vor (O) und nach (
    Figure 00080001
    ) der Passage durch eine Säule, enthaltend polydisperse Argininoligomere immobilisiert auf Perlen (siehe Beispiel 2 für Details). Zum Vergleich wurden die menschlichen Blutproben (markiert als ∎) nach der Passage durch eine Säule, die keine polydispersen Argininoligomere enthält, ähnlich untersucht.
  • 6 erläutert das Ausmaß der terminalen Komplement-Komplex-(TCC) Aktivierung von menschlichem Blut zu verschiedenen Zeitpunkten vor (O) und nach (
    Figure 00080001
    ) der Passage durch eine Säule, enthaltend polydisperse Argininoligomere immobilisiert auf Perlen (siehe Beispiel 2 für Details). Zum Vergleich wurden die menschlichen Blutproben (markiert als ∎) nach der Passage durch eine Säule, die keine polydispersen Argininoligomere enthält, ähnlich untersucht.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Im Allgemeinen haben die hierin verwendeten Begriffe und Sätze ihre im Stand der Technik bekannte Bedeutung, die herausgefunden werden kann durch Bezug auf Standardtexte, Fachzeitschriftenbezüge und aus Zusammenhängen, die Fachleuten bekannt sind. Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um ihre spezifische Verwendung in dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung klarzustellen.
  • Polydispersität wird hierin definiert, um nicht nur die gewöhnliche Definition, Mw/Mn (Verhältnis der massegemittelten Molekülmasse Mw zu dem Molekulargewicht-Zahlenmittel Mn) einzuschließen, sondern um auch die Heterogenität in dem Grad der Verzweigung einzuschließen. Polydispersität, wie sie hier definiert ist, kann festgestellt werden durch Dünnschichtchromatographie unter Bedingungen, bei denen chromatographische Mobilität (Rf) erhöht wird, ebenso wie die Ladungsdichte wegen der Verzweigung reduziert ist, im Vergleich zu einem Standardmaterial bekannter Polydispersität.
  • „Oligopeptid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Polymer, das mehr als eine Aminosäure, im Allgemeinen bis zu 20 Reste, gekoppelt aneinander durch Peptidbindungen enthält. Lineares Oligopeptid bezieht sich auf ein Oligopeptid, gebildet durch Amidbindungen zwischen den α-Carboxyl- und den α-Aminogruppen benachbarter Reste, und verzweigtes Oligopeptid bezieht sich auf ein Oligopeptid, gebildet durch Amidbildungen, die eine oder mehrere Nicht-alpha-Aminogruppen einschließt.
  • Zubereitung des polydispersen Argininliganden
  • 5,2 g L-Arginin (Sigma, A-5006) wurden in 26 g mit Umkehrosmose (RO) behandeltem Wasser bei 40°C gelöst. 4,16 g WSC.HCL (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, Novabiochem, 01-62-011) wurde bei Raumtemperatur in 26 g RObehandeltem Wasser gelöst. Diese beiden Lösungen wurden vermischt und über eine Reaktionszeit von 18 h bei Raumtemperatur gerührt.
  • Die Polykondensation wurde durchgeführt bei einem pH-Wert von 11,5. Bei dem gegebenen ungefähren pK-Wert von 12,5 für die Guanidgruppe von Arginin sind ungefähr 10 % der Guanidgruppen unprotoniert und deswegen zugänglich, um in einer Kettenverzweigungsreaktion zu reagieren. Der Verzweigungsgrad wurde reguliert durch Anpassen des Reaktions-pH-Wertes. Die Verwendung der wasserlöslichen Carbodiimidperlen führt zur Razemisierung, dergestalt, dass beide, D- und L-Aminosäuren, in den resultierenden Oligopeptiden vorhanden waren.
  • Der Grad der Polydispersität wurde gemessen durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel (Kieselgel 60F, Merck) unter Verwendung von CHCl3 : CH3OH : NH3/40 : 40 : 20 (45% NH3-Lösung) als mobile Phase. Die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt. Tabelle I
    Figure 00100001
    Figure 00110001
  • Die vorangegangenen Reaktionen können auch durchgeführt werden unter Verwendung von Lysin oder Histidin oder anderen Aminosäuren mit einer positiven Nettoladung bei einem pH-Wert von > 7,2 oder durch eine Polykondensation von Mischungen solcher Aminosäuren. Wie mit dem als Beispiel angeführten Polyarginin kann die Polydispersität kontrolliert werden durch Auswahl des Reaktions-pH-Wertes, um den Anteil zugänglicher unprotonierter Aminogruppen, um als Verzweigungspunkte zu dienen, zu kontrollieren, wie im Stand der Technik verstanden werden wird.
  • Der Grad der Polydispersität, der gemäß der augenblicklichen Erfindung gemachten Oligopeptide, kann gemessen werden durch jegliche im Stand der Technik erkannte Methode. Chromatographische Verfahren, die bekannt sind, um den Grad der Polydispersität zu messen, können verwendet werden, um die Oligopeptide der Erfindung gemeinsam mit einem Standardmaterial bekannter Polydispersität zu bestimmen. Die Polydispersität kann auch gewöhnlich bestimmt werden durch Dünnschichtchromatographie, wie in Tabelle I gezeigt, wo der Rf-Wert einer Zubereitung, hergestellt gemäß der Erfindung, verglichen wurde mit dem Rf-Wert eines Standardmaterials mit bekannter Polydispersität. Oligopeptide, geeignet für die Erfindung, sind ausreichend polydispers, falls sie einen Rf-Wert von 0,4 oder höher haben, vorzugsweise von 0,6 oder höher, wie gemessen durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel (z. B. Kieselgel 60F) unter Verwendung einer Lösungsmittelphase CHCl3 : CH3OH : NH3/40 : 40 : 20 in 45%iger NH3-Lösung.
  • Konditionieren von Substrat
  • 1. Aktivierte Perlen
  • Die folgenden im Handel erhältlichen aktivierten Perlen können konditioniert werden für die Immobilisierung von polydispersem Liganden durch nukleophile Ringöffnungsaddition des Epoxy- und/oder Azlactonrings.
    Toyo Pearl HW70EC (TosoHaas)
    Toyo Pearl HW65EC (TosoHaas)
    Toyo Pearl AF650M (TosoHaas)
    Eupergit C250L (Röhm)
    Eupergit 250 (Röhm)
    Fractogel EMD Epoxy (M) (Merck)
    Fractogel EMD Azlactone (S) (Merck)
    Poros EP (Perkin Elmer-Biosystems)
  • Feinstpartikel wurden entfernt durch wiederholtes Waschen mit Salzlösung und gefiltert durch 20 μm bzw. 50 μm Gewebenetze. Die Perlen wurden dann für 24 Stunden in Aceton getaucht.
  • 2. Aktivierte Membranen
  • Microfiltrationshohlfaser (Wandstärke 100 μm, innerer Durchmesser 300 μm) und Flachtafelmembranen (Wandstärke 90 μm) mit Aminogruppen mit einem Siebkoeffizienten von > 95% Protein aus Plasma wurden mit Ethanollösung mit 3% Cyanurchlorid und 1% Schwefelsäure für 20 Min. bei Raumtemperatur im Filtrationsmodus behandelt und danach mit 40°C warmer Trockenluft getrocknet. Die Aktivierungsmenge wurde bestimmt durch Chloridtitration nach alkalischer Hydrolyse, was in einem Wert von 0,035 mmol Cl–/g trockener Membran resultierte.
  • Beispiel 1
  • Zubereitung von Adsorbermaterial aus aktivierten Perlen
  • 13 g (Trockengewicht) aktivierte Perlen (z. B. Toyo Pearl HW70EC TosoHaas, Stuttgart, Deutschland), Durchmesser 140 μm, wurden in 52 g Aceton 24 Stunden eingeweicht. Die Lösung des oben beschriebenen polydispersen Argininliganden wurde mit den Perlen vermischt und sanft bei 70°C für 6 Stunden gerührt. Die Perlen wurden mit alkalischer Salzlösung/Ethanollösung gespült, um Endotoxin zu entfernen, gewaschen mit pyrogenfreiem Wasser und in einem Büchner-Trichter filtriert und getrocknet im Vakuum bei 40°C für 4 Stunden. Die Menge des polydispersen Argininliganden wurde gemessen durch Fluoreszenzspektroskopie nach alkalischer Hydrolyse und dem Fluorescamin-Färben als 9,3 mg/g trockene Perlen. Dieselbe Reaktion kann durchgeführt werden unter Verwendung irgendwelcher der oben beschriebenen Perlenprodukte.
  • Beispiel 2
  • Entfernung von Endotoxin aus menschlichem Blut in einem in vitro-Einzeldurchgangssystem
  • 10 g gemäß Beispiel 1 zubereitete Perlen wurden durch Schwerkraft in kleine Polycarbonatsäulen (62 mm lang, 23 mm Innendurchmesser, mit einem gepackten Bettvolumen von ungefähr 25 ml) gepackt und bei 121°C für 20 Min. autoklaviert. 10 g aktivierte Perlen, ähnlich behandelt, jedoch nicht mit irgendeinem Liganden zur Reaktion gebracht, wurden als Kontrolle verwendet. Die Packqualität der Säulen wurde charakterisiert durch gewöhnliche chromatographische Säulencharakterisierung (siehe G. Sofer, L. Hagel, „Handbook of Process Chromatography", Academic Press 1997, Kapitel 15) als 320 HETP (äquivalente Füllkörperhöhe) und 1,7 Peak-Asymmetrie (As). Unmittelbar vor der Verwendung wurden die mit Perlen bepackten Säulen mit 100 ml steriler physiologischer Salzlösung gewaschen. 500 ml frisches menschliches Blut, behandelt mit ACD, wurde mit 30 EU/ml LPS isoliert aus E. coli 055:B5 (Sigma) vermischt und durch die Säulen bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/min durchgeführt. Aliquoten von 2 ml wurden vor und nach den Testsäulen entnommen und auf ihren LPS-Gehalt unter Verwendung des chromogenen Limulus-Amoebocyten-Lysat-Testes (LAL) untersucht, wie beschrieben von K. Duner, (1993) Journal of Biochem. and Biophys. Methods 26: 131-142. Blutzellzählungen, freies Hämoglobin, Thrombin-Antithrombin-III-Komplex-(TAT-)Bildung [Deppisch, R. et al. (1994) Nephrol. Dial. Transplant Suppl. 3: 17-23] und die terminale Komplement-Komplex(TCC-)Aktivierung [Deppisch, R. et al. (1990) Kidney Int. 37: 696-706] wurden für die Bestimmung der Biokompatibilität bestimmt. Die Ergebnisse sind in den 1 bis 6 gezeigt.
  • Beispiel 3
  • Minimodule aus 50 Hohlfasermembranen mit einer Länge von 12 – 13 cm, aktiviert gemäß dem oben beschriebenen Verfahren, wurden im rezirkulierenden Filtrationsmodus für 30 Min. bei 60°C mit einer Lösung aus 50 mg Poly-L-Arginin (Sigma, P7762, Mw = 42000, Mw/Mn = 1,2) in 75 ml Wasser gespült. Die Membranen wurden mit Salzlösung gewaschen und die Arginindichte wurde bestimmt gemäß dem oben beschriebenen Fluoreszenzverfahren, was einen Wert von 0,8 mg/g getrockneter Membran ergab.
  • Beispiel 4
  • Gemäß Beispiel 1 wurden Perlen mit 3,3% L-Arginin-Lösung anstelle der polydispersen Ligandlösung modifiziert. Die immobilisierte L-Argininmenge war 0,43 mg/g getrocknete Perlen.
  • Beispiel 5
  • Perlen wurden gemäß Beispiel 1 mit einer 1-Methanolaminlösung als einem Referenzliganden modifiziert.
  • Beispiel 6
  • 5 g Perlen wurden gemäß Beispiel 1 mit 100 mg Poly-L-Arginin (Sigma P7762, Mw = 42000, Mn/Mw = 1,2) in 10 ml Wasser modifiziert. Die immobilisierte L-Argininmenge war 13,8 mg/g getrocknete Perlen.
  • Tabelle II Vergleich dynamischer Kapazitäten für die Endotoxinentfernung aus menschlichem Blut mit unterschiedlichen Liganden, immobilisiert auf Membranen.
    Figure 00150001
  • Tabelle III Vergleich dynamischer Kapazitäten für die Endotoxinentfernung durch verschiedene Liganden, immobilisiert auf Perlen, perfundiert mit Plasma oder Blut
    Figure 00160001
  • Diese Daten zeigen die überragenden dynamischen Adsorptionskapazitäten des polydispersen Argininoligomers im Vergleich zu anderen bekannten Liganden wie zum Beispiel Polyarginin, monomerem Arginin, Ethanolamin, wenn sie, wie hierin beschrieben, auf Perlen immobilisiert sind.

Claims (14)

  1. Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus einem Gemisch aus linearen oder verzweigten Oligopeptiden besteht, zusammengesetzt aus einer oder mehreren aus Arginin, Lysin und Histidin ausgewählten Aminosäuren, die beim physiologischen pH von 7,2 positiv geladen sind, wobei die Oligopeptide in Bezug auf das Molekulargewicht und die Anzahl von Verzweigungen pro Molekül polydispers sind.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der die Oligopeptide polydispers sind mit einem Rf-Wert von 0,4 oder größer, gemessen durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel unter Verwendung eines Systems aus CHCl3 : CH3OH : NH3/40 : 40 : 20 in einer 45%igen NH3-Lösung.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, in der die Oligopeptide polydispers sind mit einem Rf-Wert von 0,6 oder größer, gemessen durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel unter Verwendung eines Systems aus CHCl3 : CH3OH : NH3/40 : 40 : 20 in einer 45%igen NH3-Lösung.
  4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, in der die Aminosäure Arginin ist.
  5. Adsorptionsmittel zur Entfernung von Endotoxin, umfassend einen auf einem Festphasenträgermedium immobilisierten Liganden, wobei der Ligand eine Zusammensetzung ist, die im Wesentlichen aus einem Gemisch aus linearen oder verzweigten Oligopeptiden besteht, zusammengesetzt aus einer oder mehreren Aminosäuren, die beim physiologischen pH von 7,2 positiv geladen sind, wobei die Oligopeptide in Bezug auf das Molekulargewicht und die Anzahl von Verzweigungen pro Molekül polydispers sind.
  6. Adsorptionsmittel nach Anspruch 5, bei dem der Ligand eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ist.
  7. Adsorptionsmittel nach Anspruch 5 oder 6, bei dem das Festphasenträgermedium ausreichend porös ist, um den Durchtritt von Blutzellen zu gestatten.
  8. Adsorptionsmittel nach Anspruch 5, 6 oder 7, bei dem das Festphasenträgermedium in Form von Kügelchen vorliegt.
  9. Adsorptionsmittel nach Anspruch 5, bei dem der Ligand kovalent an das Festphasenträgermedium gebunden ist.
  10. Vorrichtung zur extrakorporalen Entfernung von Endotoxin aus Vollblut, umfassend einen Behälter, der ein Adsorptionsmittel zur Entfernung von Endotoxin nach einem der Ansprüche 7 bis 9 enthält und festhält, wobei das Festphasenträgermedium ausreichend porös ist, um den Durchtritt von Blutzellen zu gestatten, und wobei der Behälter einen Einlass und einen Auslass aufweist, die bezüglich des Adsorptionsmittels so positioniert sind, dass durch den Einlass eintretendes Blut mit dem Adsorptionsmittel in Kontakt kommt, ehe es durch den Auslass aus dem Behälter austritt.
  11. Adsorptionsmittel nach einem der Ansprüche 5 bis 9 zur Verwendung in einem Verfahren zur Entfernung von Endotoxin aus dem Blut eines tierischen oder menschlichen Individuums, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen des Blutes mit dem Adsorptionsmittel umfasst, wodurch das Endotoxin durch Adsorption auf das Adsorptionsmittel aus dem Blut entfernt wird.
  12. Verfahren zur Herstellung eines endotoxinbindenden Liganden, bei dem eine aus Arginin, Lysin und Histidin ausgewählte Aminosäure bei einem derart gewählten pH, dass ein Teil der basischen Gruppen der Aminosäuren entprotoniert wird, mit einem Kupplungsmittel umgesetzt wird, wodurch ein polydisperses, verzweigtes Oligopeptidgemisch gebildet wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Aminosäure Arginin ist, der pH der Reaktion 12 beträgt und das Kupplungsmittel 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid ist.
  14. Endotoxinbindender Ligand, der durch das Verfahren von Anspruch 12 oder 13 erhältlich ist.
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