DE60020962T2 - Liganden für metabotropische Glutamat-Rezeptoren - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Glutamat ist ein bedeutender erregender Neurotransmitter im zentralen Nervensystem von Säugetieren. Die Neurotransmitter-Aktivität von Glutamat wird primär durch Liganden-gesteuerte Ionenkanäle vermittelt. Die Beobachtung, dass Glutamat auch durch zweite Boten vermittelte Reaktionen induziert, hat zu der Entdeckung einer eigenen Gruppe von an G-Proteine gekoppelten Glutamat-Rezeptoren geführt, welche als metabotropische Rezeptoren (mGluRs) bezeichnet werden. Schoepp und Conn, Trends Pharmacol. Sci. 14: 13–20 (1993). Die erste beschriebene Aktivität der metabotropischen Glutamat-Rezeptoren war Inositol-Phospholipid(PI)-Hydrolyse. Nicoletti et al., J. Neurochem. 46: 40–46 (1986) und Sugiyama et al., Nature 325: 531–533 (1987). Molekulare Klonierungstechniken haben eine große Familie von metabotropischen Rezeptoren mit verschiedenen Transduktionsmechanismen, Expressionsmustern und Empfindlichkeiten gegenüber Glutamat-Agonisten offenbart. Schoepp und Conn, supra.
  • Konsistent mit der für die metabotropischen Rezeptoren beobachteten molekularen Heterogenität haben elektrophysiologische Studien diverse Rollen für diese Rezeptoren in synaptischer Plastizität, präsynaptischer Inhibierung und Regulierung von Zellenerregbarkeit durch Ionenkanal-Modulation nahegelegt. Bashir et al., Nature 363: 347–363 (1993); Linden et al., Neuron 7: 81–89 (1991); Baskys und Malenka, J. Physiol. (Lond.) 444: 687–701 (1991); Charpak et al., Nature 347: 765–767 (1990); und Lester und Jahr, Neuron 5: 741–749 (1990). Jedoch sind die spezifischen mGluR-Rezeptoren, welche diese zellulären Funktionen vermitteln, im Großen und Ganzen undefiniert.
  • Anzeichen für eine physiologische Rolle spezifischer mGluR-Subtypen sind aus Arbeiten mit selektiven Agonisten und Antagonisten der Rezeptoren abgeleitet worden. Zum Beispiel ist (1S,3R)-1-Aminocyclopentan-1,3-dicarbonsäure (ACPD) ein selektiver und potenter Aktivator der mGluR1-, mGluR2-, mGluR3- und mGluR5-Rezeptoren. Masu et al., Nature 349: 760–765 (1991); Abe et al., J. Biol. Chem. 267: 13361–13368 (1992); Tanabe et al., Neuron 8: 169–179 (1992); und Tanabe et al., J. Neurosci. 13: 1372–1378 (1993). Es ist gezeigt worden, dass L-2-Amino-4-phosphonobuttersäure (L-AP4) mGluR4 und mGluR6 aktiviert. Id., Thomsen et al., Eur. J. Pharmacol. 227: 361–362 (1992); Nakajima et al., J. Biol. Chem. 268: 11868–11873 (1993). L-AP4 inhibiert Transmitter-Freisetzung und spannungs-abhängigen Kalziumeintritt in ausgewählte Gehirn- und Rückenmarks-Neuronen. Koerner und Cotman, Brain Res. 216: 192–198 (1981); Trombley und Westbrook, J. Neurosci. 12: 2043–2050 (1992); und Sahara und Westbrook, J. Neurosci. 13: 3041–3050 (1993). In retinalen bipolaren Neuronen jedoch aktivieren postsynaptische L-AP4-Rezeptoren Aphosphodiesterase. Nawy und Jahr, Nature 346: 269–271 (1990).
  • Es können innerhalb der gleichen Gruppe von Neuronen multiple mGluR-Subtypen vorhanden sein. Da die zelluläre und subzelluläre Lokalisierung von spezifischen mGluRs wichtig sein kann bei der Bildung eingehender Sinnesinformation, ist es wichtig, andere Rezeptoren der mGluR-Gruppe zu identifizieren. Wenn sie einmal identifiziert sind, können spezifische Agonisten und Antagonisten hergestellt werden, um die mit dem Rezeptor verbundenen Reaktionen zu modulieren. Recht überraschend identifiziert die vorliegende Erfindung einen L-AP4-sensitiven Rezeptor, welcher Transmitter-Freisetzung in Neuronen moduliert, welche weder mGluR4 noch mGluR6 exprimieren, und erfüllt andere damit in Zusammenhang stehende Bedürfnisse.
  • Wie bereits erwähnt sind die metabotropischen Glutamat-Rezeptoren (mGluRs) eine heterogene Familie von G-Protein-verbundenen Rezeptoren, welche mit multiplen zweiten-Boten-Systemen gekoppelt sind. Diese umfassen die negative Modulierung von Adenylatcyclase, Aktivierung von Phosphoinositid-spezifischer Phospholipase C, und Modulierung von Ionenkanal-Strömen [Science, 1992, 258, 597; Trends in Pharmacol. Sci. 1993, 14, 13; J. Med. Chem. 1995, 1417]. Drei Typen von mGluR-Rezeptoren sind identifiziert worden. Die Gruppe I-Rezeptoren koppeln an Phosphoinositid-Hydrolyse und umfassen mGluR1 und mGluR5; Gruppe II-Rezeptoren sind mit der Inhibierung der Bildung von cyclischem Adenosin 5'-Monophosphat (cAMP) gekoppelt und umfassen mGluR2 und mGluR3. Gruppe III-Rezeptoren (mGluR4, mGluR6, mGluR7 und mGluR8) koppeln negativ an cAMP. Jeder der mGluR-Subtypen ist damit auf der Basis seiner Pharmakologie und Sequenzhomologie differenziert. Übermäßige Aktivierung von Glutamat-Rezeptoren oder Störungen in den zellulären Mechanismen, welche gegen die möglichen nachteiligen Konsequenzen von physiologischer Glutamat-Rezeptor-Aktivierung schützen, sind mit der Pathogenese einer Vielzahl von neurologischen Störungen in Verbindung gebracht worden. Diese Störungen umfassen Epilepsie, Ischämie, Trauma des zentralen Nervensystems, neuropathischen Schmerz und chronische neurodegenerative Krankheiten. Aufgrund der allgegenwärtigen Verteilung von glutamatergen Synapsen haben mGluRs das Potential, an einer großen Vielfalt von Funktionen im zentralen Nervensystem von Säugetieren teilzunehmen. Zusätzlich existiert aufgrund der großen Diversität und heterogenen Verteilung der mGluR-Subtypen die Gelegenheit, hochselektive Wirkstoffe zu entwickeln, welche eine begrenzte Anzahl von Funktionen des zentralen Nervensystems von Säugetieren beeinflussen. Die mGluRs stellen daher neue Targets für die Entwicklung von therapeutischen Mitteln bereit, welche eine dramatische Auswirkung auf die Behandlung einer großen Vielfalt von psychiatrischen und neurologischen Störungen haben könnte.
  • Ischämie, eine örtliche begrenzte Gewebsanämie, welche aus der Behinderung des Einflusses von arteriellem Blut resultiert, kann erheblichen Schaden hervorrufen, wenn sie im Gehirn oder zentralen Nervensystem auftritt. Zentrales Gewebe des zentralen Nervensystems, und zu einem geringeren Ausmaß Gewebe des peripheren Nervensystems, weist schlechte Instandsetzungseigenschaften auf. Daher verursacht Schaden an Nervengewebe erhebliche permanente Behinderung und stellt einen häufigen Todesgrund dar. Schaden an Nervengewebe kann auf viele Arten und Weisen auftreten, nicht nur durch Ischämie in zerebrovaskulären Unfällen, sondern auch bei zerebralen Durchblutungsstörungen, Episoden absoluter und relativer Hypoxie, bei metabolischen Störungen und verschiedenen Formen von Traumata.
  • Globale Ischämie tritt unter Bedingungen auf, in welchen Blutfluss zum gesamten Gehirn für eine Zeitspanne aufhört, wie es etwa als Folge von Herzstillstand auftreten kann. Fokale Ischämie tritt unter Bedingungen auf, in welchen ein Abschnitt des Gehirns von seiner normalen Blutzufuhr abgeschnitten ist, wie es etwa als Folge von thromboembolytischer Okklusion eines zerebralen Gefäßes, traumatischer Kopfverletzung, Ödemen und Gehirntumoren auftreten kann. In Gebieten fokaler Ischämie oder Schaden gibt es einen Kern mit ausgeprägterem Schaden, umgeben von einer perifokalen Penumbra von geringerem Schaden. Dies kommt daher, dass die Neuronen in der Penumbra eine zeitlang Homeostase aufrecht erhalten können, wodurch sie potentiell besser mittels pharmakologischer Mittel gerettet werden können.
  • Sowohl globale als auch fokale ischämische Zustände weisen das Potential auf, weit ausgedehnten neuronalen Schaden zu erzeugen, selbst wenn der ischämische Zustand vorübergehend ist. Obwohl eine permanente neuronale Verletzung in dem anfänglichen Gemisch auf das Aufhören des Blutflusses im Gehirn folgend auftreten kann, tritt der Schaden bei globaler und fokaler Ischämie über Stunden oder selbst Tage nach Einsetzen der Ischämie auf. Viel dieses neuronalen Schadens wird der Glutamat-Toxizität und sekundären Konsequenzen von Reperfusion des Gewebes zugeschrieben, wie etwa der Freisetzung von vasoaktiven Produkten durch beschädigtes Endothel und die Freisetzung von zytotoxischen Produkten von dem beschädigtem Gewebe, einschließlich freier Radikale, Leukotrienen und dergleichen.
  • Glutamat-Neurotoxizität, welches ein bedeutender Faktor bei ischämischer neuronaler Verletzung ist, scheint mit der Aufnahme des oxidativen Metabolismus zu beginnen und tritt damit sowohl während reversibler Ischämie als auch während der Erholung auf. Es sind viele Versuche unternommen worden, dieses Problem zu vermeiden durch Blockierung der verschiedenen Rezeptoren, einschließlich NMDA-Rezeptoren, AMPA-Rezeptoren, Kainate-Rezeptoren und MGR-Rezeptoren, welche durch Glutamat stimuliert werden und auch sehr stark in nach dem Einsetzen von globaler oder fokaler Ischämie auftretendem Nervenzellentod involviert sind. Wenn Ischämie auftritt, wie etwa während eines Schlags oder Herzanfalls, kommt es zu einer übermäßigen Freisetzung von endogenem Glutamat, was zu der Überstimulierung von NMDA-Rezeptoren, AMPA-Rezeptoren, Kainate-Rezeptoren und MGR-Rezeptoren führt. Wechselwirkung des Glutamats mit diesen Rezeptoren verursacht, dass sich der Ionenkanal, welcher mit diesen Rezeptoren in Verbindung steht, öffnet, und so einen Fluss von Kationen durch die Zellmembran erlaubt. Dieser Ionenfluss, insbesondere von Ca2+ in die Zellen, spielt eine wichtige Rolle bei Nervenzelltod.
  • Prostatakrebs ist jetzt die führende Krebsform bei Männern und die zweithäufigste Ursache für Tod durch Krebs bei Männern. Es wird geschätzt, dass 1993 mehr als 165.000 neue Fälle von Prostatakrebs diagnostiziert wurden, und mehr als 35.000 Männer starben in dem Jahr an Prostatakrebs. Zusätzlich ist das Auftreten von Prostatakrebs seit 1981 um 50% gestiegen, und die Mortalität aufgrund dieser Krankheit ist fortdauernd gestiegen. Zuvor sind die meisten Männer an anderen Krankheiten oder Erkrankungen gestorben, bevor sie an ihrem Prostatakrebs starben. Wir stehen jetzt einer erhöhten Morbidität von Prostatakrebs gegenüber, da Männer länger leben und die Krankheit die Gelegenheit erhält, fortzuschreiten. Gegenwärtige Therapien für Prostatakrebs legen ihren Schwerpunkt exklusiv auf die Verringerung der Dihydrotestosteron-Gehalte, um das Wachstum von Prostatakrebs zu verringern oder zu verhindern. Zusätzlich zu der Verwendung von digitaler rektaler Untersuchung und transrektaler Ultrasonografie wird bei der Diagnose von Prostatakrebs häufig die Prostata-spezifische Antigen(PSA)-Konzentration verwendet.
  • PSA ist ein Protein, welches von Prostatazellen erzeugt wird, und kommt im Blut von Männern, welche Prostatakrebs haben, häufig in erhöhten Gehalten vor. Es ist gezeigt worden, dass PSA mit der Tumorbelastung korreliert, als ein Indikator metastatischer Involvierung dient und einen Parameter bereitstellt, um die Reaktion auf Operation, Bestrahlung und Androgen-Ersatz-Therapie bei Prostatakrebspatienten zu verfolgen. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass Prostata-spezifisches Antigen (PSA) ein völlig unterschiedliches Protein ist als Prostata-spezifisches Membran-Antigen (PSMA). Die beiden Proteine weisen verschiedene Strukturen und Funktionen auf und sollten nicht aufgrund ihrer ähnlichen Nomenklatur miteinander verwechselt werden.
  • 1993 wurde von der molekularen Klonierung eines Prostata-spezifischen Membran-Antigens (PSMA) als einem potenziellen Prostatakarzinom-Marker berichtet und die Hypothese aufgestellt, es könnte als ein Target für Abbildung und zytotoxische Behandlungsmodalitäten für Prostatakrebs dienen. Antikörper gegen PSMA sind beschrieben und klinisch hinsichtlich der Diagnose und Behandlung von Prostatakrebs untersucht worden. Insbesondere sind Indium-111-markierte PSMA-Antikörper beschrieben und hinsichtlich der Diagnose von Prostatakrebs untersucht worden, und Yttrium-markierte PSMA-Antikörper sind beschrieben und mit Hinblick auf die Behandlung von Prostatakrebs untersucht worden.
  • PSMA wird im duktalen Epithel der Prostata exprimiert und kommt in seminalem Plasma, Prostatafluid und Urin vor. 1996 hat man herausgefunden, dass die Expression von PSMA cDNA tatsächlich die Aktivität von NAALADase vermittelt. Dies ist völlig unerwartet, da bis vor kurzem Forschung bezüglich NAALADase auf seine Rolle im Gehirn und seine Wirkung auf Neurotransmitter beschränkt war, während PSMA beschrieben und in Hinblick auf die Diagnose und Therapie von Prostatakrebs untersucht wurde.
  • Das Dipeptid NAAG ist ein reichlich vorhandenes, für das Nervensystem spezifisches Peptid, welches in synaptischen Vesikeln vorkommt und bei neuronaler Stimulierung in mehreren Systemen freigesetzt wird. Als eine bedeutende peptidische Komponente des Gehirns kommt NAAG in Gehalten vor, welche mit denen des bedeutenden inhibierenden Neurotransmitters Gamma-Aminobutansäure (GADA) vergleichbar sind. Obgleich NAAG erstmals 1964 isoliert wurde, gab es wenig Aktivität zur Aufklärung seiner Rolle im zentralen Nervensystem von Säugetieren, bis die schädliche Natur von überschüssigem Glutamat bei einer Vielfalt von Krankheitszuständen offenkundig wurde. Aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit mit Glutamat ist für NAAG vorgeschlagen worden, es habe eine Vielfalt von Rollen ähnlich denen des Glutamats selbst, einschließlich der Funktion als ein Neurotransmitter oder ein Co-Transmitter, Neuromodulator oder als ein Vorgänger des Neurotransmitters Glutamat. NAAG hat erregende Reaktionen sowohl in vitro als auch in vivo hervorgerufen, ist jedoch signifikant weniger potent als Glutamat.
  • 1988 wurde ein Gehirnenzym, NAALADase, identifiziert, welches NAAG zu N-Acetylaspartat (NAA) und Glutamat hydrolisiert. NAALADase, welche ihren Namen von ihrer strukturellen Spezifität für N-acetylierte saure Dipeptide ableitet, ist eine Membran-gebundene Metallopeptidase mit einer detanurierten molekularen Masse von 94 kDa[x], welche NAAG zu N-Acetylaspartat (NAA) und Glutamat katabolisiert. Es ist gezeigt worden, dass [3H]NAAG in vivo durch ein Enzym mit den pharmakologischen Eigenschaften von NAALADase abgebaut wird, was unterstützt, dass NAALADase in dem Metabolismus von endogenem NAAG eine Rolle spielt.
  • Ratten-NAALADase-Aktivität ist extensiv charakterisiert worden und zeigt eine hohe Affinität für Hydrolyse ihres putativen Substrats NAAG, mit Km = 140 nM. Neulich ist auch gezeigt worden, dass NAALADase das nicht-acetylierte Peptid, Aspartylglutamat, mit hoher Affinität spaltet. Von der Forschung ist auch gefunden worden, dass das Enzym Membran-gebunden ist, von Chloridionen stimuliert wird, und durch polyvalente Kationen-Chelatoren inhibiert wird, was nahe legt, dass es eine Metallopeptidase ist.
  • In Tieren ist NAALADase in synaptischen Plasma-Membranen angereichert und ist örtlich primär auf neurales Gewebe und die Nieren beschränkt. NAALADase ist nicht in großen Mengen in Säugetier-Leber, -Herz, -Bauchspeicheldrüse oder -Milz gefunden wurde. Untersuchung von NAAG und NAALADase ist für mehrere verschiedene menschliche und tierische pathologische Zustände durchgeführt worden. Es ist gezeigt worden, dass intra-hippocampale Injektionen von NAAG verlängerte Anfall-Aktivität hervorrufen. In jüngerer Zeit ist berichtet worden, dass Ratten, welche genetisch für epileptische Anfälle anfällig sind, eine anhaltende Erhöhung ihres Grundniveaus von NAALADase-Aktivität aufweisen. Diese Beobachtungen sind mit der Hypothese konsistent, dass eine erhöhte Verfügbarkeit von synaptischem Glutamat die Empfindlichkeit für Anfälle erhöht, und legen nahe, dass NAALADase-Inhibitoren anti-epileptische Aktivität bereitstellen könnten.
  • NAAG und NAALADase sind auch in Verbindung gebracht worden mit der Pathogenese von ALS und der pathologisch ähnlichen Tierkrankheit, die als vererbliche hündische spinale Muskelatrophie bezeichnet wird (Hereditary Canine Spinal Muscular Atrophy HCSMA) genannt. Es ist gezeigt worden, dass Konzentrationen von NAAG und seinen Metaboliten – NAA, Glutamat und Aspartat – in dem zerebrospinalen Fluid von ALS-Patienten und HCSMA-Hunden zwei- bis dreifach erhöht sind.
  • Zusätzlich ist die Aktivität von NAALADase in post-mortem Rückenmarksgewebe von ALS-Patienten und HCSMA-Hunden signifikant erhöht (zwei- bis dreifach). Obwohl dies sehr stark spekulativ ist, könnten NAALADase-Inhibitoren beim Beschränken der Progression von ALS klinisch nützlich sein, wenn ein erhöhter Metabolismus von NAAG für die Veränderungen der CSF-Gehalte dieser sauren Aminosäuren und Peptide verantwortlich ist. Abnormalitäten bei NAAG-Gehalten und NAALADase-Aktivität sind auch bei post-mortem schizophrenischem Gehirn dokumentiert worden, spezifisch in den präfrontalen und limbischen Gehirnregionen, was die Wichtigkeit einer Untersuchung des Metabolismus von NAAG in der Pathophysiologie von Schizophrenie unterstreicht. Die Identifizierung und Reinigung von NAALADase führte zu dem Vorschlag einer weiteren Rolle für NAAG: spezifisch, dass das Dipeptid als eine Speicherform synaptischen Glutamats dienen könnte.
  • Nur wenige NAALADase-Inhibitoren sind identifiziert worden, und diejenigen, welche identifiziert wurden, sind nur in nicht-klinischer neurologischer Forschung verwendet worden. Beispiele für solche Inhibitoren umfassen allgemeine Metallopeptidase-Inhibitoren, wie etwa o-Phenanthrolen, Metall-Chelatoren, wie etwa EGTA und EDTA, und Peptid-Analoge, wie etwa Quisqualinsäure und beta-NAAG.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen neue Liganden für metabotropische Glutamat-Rezeptoren und Zusammensetzungen, welche die Liganden umfassen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können verwendet werden, um Glutamat-Rezeptor-gesteuerte Zellen zu beeinflussen, einschließlich Neuronen und Gliazellen in dem zentralen Nervensystem.
  • In weiteren Ausführungsformen besteht die vorliegende Erfindung aus Inhibitoren der NAALADase-Enzymaktivität und diese umfassende Zusammensetzungen. Zusätzliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bestehen aus Verfahren zum Behandeln von Glutamat-Abnormalitäten und damit in Verbindung stehender Schädigung von Nervengewebe in einem Tier durch Inhibierung von NAALADase-Enzym mit den zuvor genannten Inhibitoren oder Zusammensetzungen davon.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 stellt bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
  • 2 zeigt die Wirkungen von sechs Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Aktivität von NAALADase.
  • 3 zeigt die Wirkung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung auf sechs Subtypen von metabotropischen Glutamat-Rezeptoren (mGluRs).
  • 4 zeigt die Wirkung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung auf einen einzelnen Subtypus von metabotropischem Glutamat-Rezeptor.
  • 5 zeigt die Wirkungen einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung und 2-(Phosphomethyl)pentandisäure (PMPA) auf die Aktivität von NAAG-Peptidase in Rattenhirn-Membranen.
  • 6 zeigt die Wirkungen einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung, PMPA und Quis auf die Aktivität von Ratten-NAAG-Peptidase.
  • 7 zeigt die Wirkungen von fünf erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Aktivität von Ratten-NAAG-Peptidase.
  • 8 zeigt die Wirkungen einer erfindungsgemäßen Verbindung, PMPA und Quis auf die Aktivität von Prostata-spezifischem Membran-Antigen (PMSA).
  • 9 zeigt die Wirkungen zweier erfindungsgemäßer Verbindungen auf die Aktivität von Ratten-NAAG-Peptidase.
  • 10 zeigt bestimmte erfindungsgemäße Verbindungen, ihre Aktivität gegen NAAG-Peptidase und ihre Aktivität gegen bestimmte metabotropische Glutamat-Rezeptoren.
  • 11 zeigt bestimmte Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung, ihre Aktivität gegen NAAG-Peptidase und ihre Aktivität gegen bestimmte metabotropische Glutamat-Rezeptoren.
  • 12 zeigt bestimmte Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung, ihre Aktivität gegen NAAG-Peptidase und ihre Aktivität gegen bestimmte metabotropische Glutamat-Rezeptoren.
  • 13 zeigt bei geringer Vergrößerung die antiangiogene Wirkung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung auf ein Glioblastom-Xenotransplantat.
  • 14 zeigt bei hoher Vergrößerung die antiangiogene Wirkung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung auf ein Glioblastom-Xenotransplantat.
  • 15 stellt eine Auftragung von Tumorvolumen gegen Behandlungsdauer für Glioblastom-Xenotransplantate dar, welche mit einer erfindungsgemäßen Verbindung bei 10 und 100 μM behandelt wurden, dargestellt gegenüber einem Vergleich.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Bis dato sind alle herkömmlich verwendeten Agonisten und Antagonisten, welche in biologischen Studien der mGluRs verwendet werden, Aminosäuren, welche oft einen strukturell versteiften Glutamat-ähnlichen Kern verkörpern [Neuropharmacology, 36, 1–11 (1997); Neuropharmacology 37, 1–12 (1998); Neuropharmacology 35, 1661–1672 (1996); J. Med. Chem. 38, 1417 (1995); J. Med. Chem. 41, 347 (1998); Current Pharmaceutical Design, 1, 355 (1995)]. Während unserer Bemühungen, potente und selektive Liganden zu identifizieren, welche auf diese Rezeptoren wirken, haben wir mGluR3-selektive Agonisten entdeckt, welche nur Säuregruppen enthalten.
  • Unsere Studien begannen mit dem Dipeptid N-Acetyl-L-aspartat-L-glutamat (NAAG), einem Dipeptid, welches im Gehirn relativ reichlich vorkommt, und von welchem geglaubt wird, dass es als ein Transmitter oder Co-Transmitter im zentralen Nervensystem wirkt, sehr wie Glutamat selbst. NAAG zeigt sowohl in vitro als auch in vivo Erreger-Eigenschaften, ist aber weniger aktiv als Glutamat und stellt eine Speicherform von Glutamat dar. In Studien, in welchen mit mGluR1-6 transfizierte Zelllinien verwendet werden, wurde gefunden, dass NAAG den mGluR3-Rezeptor selektiv aktiviert, mit einem EC50-Wert im Bereich von 65 ± 20 μM [J. Neurochem. 69, 174 (1997)]. Neulich wurde ein Gehirnenzym identifiziert, welches für die Spaltung von N-acetylierten α-verbundenen sauren Dipeptiden spezifisch ist, und demzufolge wurde das Enzym NAALADase benannt [J. Biol. Chem., 1987, 262, 14498].
  • Figure 00140001
  • NAAG und NAALADase sind mit mehreren pathologischen Zuständen, welche mit Glutamat-Abnormalitäten und Neurotoxizität in Zusammenhang stehen, in Verbindung gebracht worden. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass intra-hippocampale Injektionen von NAAG verlängerte Anfalls-Aktivität hervorrufen [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 1116–1119]. Es ist auch berichtet worden, dass Ratten, welche genetisch für epileptische Anfälle anfällig sind, eine anhaltende Erhöhung ihrer Grundgehalte an NAALADase-Aktivität aufweisen [Brain Research, 593 (1992), 140–143]. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass die erhöhte Erhältlichkeit von synaptischem Glutamat die Empfindlichkeit für Anfälle erhöht. Als ein Ergebnis davon ist vorgeschlagen worden, dass NAALADase-Inhibitoren wirksame anti-epileptische Therapien bereitstellen könnten.
  • NAAG und NAALADase sind auch mit der Pathogenese von ALS (amyotrophischer Lateralsklerose) [Brain Research, 556 (1991), 151–156] in Verbindung gebracht worden. Von daher könnten NAALADase-Inhibitoren klinisch nützlich sein bei der Beschränkung der Progression von ALS, wenn ein erhöhter Metabolismus von NAAG für Änderungen des CSF-Gehalts dieser sauren Aminosäuren verantwortlich ist [siehe Ann. Neurol. 28 (1990), 18–25].
  • Bestimmte Phosphonat-Analoge von NAAG, wie etwa 2-(Phosphonomethyl)-pentandisäure, wirken Berichten zufolge als potente Inhibitoren von NAALADase [J. Med. Chem. 39, 619 (1996)]. Interessanterweise haben wir gefunden, dass während diese Verbindung Berichten gemäß wenig in Richtung Rezeptoraktivität zeigt, sie tatsächlich als ein Agonist auf mGluR3 wirkt.
  • Erfindungsgemäße Verbindungen
  • Auf der Basis dieses unerwarteten Ergebnisses haben wir die Aktivität von damit in Zusammenhang stehenden Analogen erforscht. Als Teil unserer Designstrategie haben wir beschlossen, die Aktivität von solchen NAAG-ähnlichen Analogen zu erforschen, denen die Amid-Bindung zwischen dem Asp- und Glu-Rest (die standardgemäße Ketomethylen-Typ-Substitution) fehlt, aber aus welchen auch die N-Acetyl-Gruppe entfernt wurde, da diese besondere Gruppe Berichten zufolge kein absolutes Erfordernis für NAALADase-Aktivität ist.
  • Demgemäss wurde eine Serie von Verbindungen hergestellt und hinsichtlich mGluR-Aktivität untersucht. Von den synthetisierten Verbindungen erwies sich die Verbindung, welche eine von den zwei Pentandisäuregruppen (A) flankierte Acetongruppe enthält, als interessant, da sie signifikante mGluR3-Aktivität beibehielt.
  • Figure 00160001
  • Basierend auf dieser Beobachtung haben wir uns entschieden, die Aktivität von Verbindungen zu erforschen, in welchen die zentrale Carbonylgruppe von A durch P(O)OH, CHOH, und R3CHOH ersetzt war, mit dem Gedanken, dass diese Verbindung nicht nur als ein mGluR3-selektiver Ligand agieren könnte, sondern dass sie auch als NAALADase-Inhibitor fungieren könnte. Die Phosphorverbindung (B) war als ein NAALADase-Inhibitor besonders potent, mit einer IC50 von 4 nM. Zusätzliche Daten zu den neuen Verbindungen werden hierin bereitgestellt.
  • Figure 00170001
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung durch die verallgemeinerte Struktur 1 dargestellt:
    Figure 00170002
    wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -C(O)-, -C(S)-, -P(O)(OR)-, -P(O)(NR2)-, -P(NR)(OR)-, -P(NR)(NR2)-, -C(R)(OR)-, -C(R)(SR)-, -C(NR)-, -NR(O)-, und -N(OR)-;
    Y für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (CR2)n, (NR)n und einer Bindung;
    Z für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C(R), C(NR2), C(NHAcyl);
    W für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (CR2)m und einer Bindung;
    G für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -COOH, -C(O)NHOH, -C(O)NH2, -C(S)SH, -SO3H, -SO2H, -SOH, -S(O)2NH2, -P(O)(OH)2 und -P(OH)2;
    R für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl und Aralkyl; und auch umfassend eine negative Ladung für Fälle, in denen R an ein Heteroatom gebunden ist; und m und n ganze Zahlen sind, welche für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt sind aus dem Bereich von 0 bis 3 inklusive.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -P(O)(OR)- und -P(O)(NR2)-.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei Y gleich (CR2)n ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei Y gleich (CR2)n ist; und n gleich 1 ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei Z gleich C(R) ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei W gleich (CR2)m ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei W gleich (CR2)m ist; und m gleich 2 ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei G unabhängig für jedes Auftreten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -COOH, -C(O)NHOH, -C(O)NH2, -SO3H, -SO2H, -S(O)2NH2 und -P(O)(OH)2.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei G für jedes Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -COOH, -C(O)NHOH, -SO3H, und -P(O)(OH)2.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei G unabhängig für jedes Auftreten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -COOH und -C(O)NHOH.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei G gleich -COOH ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei m und n ganze Zahlen sind, welche für jedes Auftreten unabhängig ausgewählt sind aus dem Bereich von 1 bis 2 inklusive.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -C(O)-, -C(S)-, -C(NR)-, -C(R)(OR)-, -C(R)(SR)-, -P(O)(OR)-, -P(O)(NR2)-, -P(NR)(OR)- und -P(NR)(NR2)-; und Y gleich (CR2)n ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -C(O)-, -C(S)-, -C(NR)-, -C(R)(OR)-, -C(R)(SR)-, -P(O)(OR)-, -P(O)(NR2)-, -P(NR)(OR)- und -P(NR)(NR2)-; Y gleich (CR2)n ist; und Z unabhängig für jedes Auftreten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C(R), C(NR2) und C(NHAcyl).
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -C(O)-, -C(S)-, -C(NR)-, -C(R)(OR)-, -C(R)(SR)-, -P(O)(OR)-, -P(O)(NR2)-, -P(NR)(OR)- und -P(NR)(NR2)-; Y gleich (CR2)n ist; Z unabhängig für jedes Auftreten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C(R), C(NR2) und C(NHAcyl); und W gleich (CR2)m ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -C(O)-, -C(S)-, -C(NR)-, -C(R)(OR)-, -C(R)(SR)-, -P(O)(OR)-, -P(O)(NR2)-, -P(NR)(OR)- und -P(NR)(NR2)-; Y gleich (CR2)n ist; Z unabhängig für jedes Auftreten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C(R), C(NR2) und C(NHAcyl); W gleich (CR2)m ist; und G unabhängig für jedes Auftreten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -COOH, -C(O)NHOH, -C(O)NH2, -SO3H, -SO2H, -S(O)2NH2 und -P(O)(OH)2.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -C(O)-, -C(S)-, -C(NR)-, -C(R)(OR)-, -C(R)(SR)-, -P(O)(OR)-, -P(O)(NR2)-, -P(NR)(OR)- und -P(NR)(NR2)-; Y gleich (CR2)n ist; Z unabhängig für jedes Auftreten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C(R), C(NR2) und C(NHAcyl); W gleich (CR2)m ist; G unabhängig für jedes Auftreten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -COOH, -C(O)NHOH, -C(O)NH2, -SO3H, -SO2H, -S(O)2NH2 und -P(O)(OH)2; und m und n ganze Zahlen sind, welche für jedes Auftreten unabhängig ausgewählt sind aus dem Bereich von 1 bis 2 inklusive.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -P(O)(OR)- und -P(O)(NR2)-; und Y gleich (CR2)n ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -P(O)(OR)- und -P(O)(NR2)-; Y gleich (CR2)n ist; und Z gleich C(R) ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -P(O)(OR)- und -P(O)(NR2)-; und Y gleich (CR2)n ist; Z gleich C(R) ist; und W gleich (CR2)m ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -P(O)(OR)- und -P(O)(NR2)-; und Y gleich (CR2)n ist; Z gleich C(R) ist; W gleich (CR2)m ist; und G unabhängig für jedes Auftreten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -COOH und -C(O)NHOH.
  • In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -P(O)(OR)- und -P(O)(NR2)-; Y gleich (CR2)n ist; Z gleich C(R) ist; W gleich (CR2)m ist; G unabhängig für jedes Auftreten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -COOH und -C(O)NHOH; und m und n ganze Zahlen sind, welche für jedes Auftreten unabhängig ausgewählt sind aus dem Bereich von 1 bis 2 inklusive.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist eine erfindungsgemäße Verbindung durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei die Verbindung ein Ligand für einen metabotropischen Glutamat-Rezeptor ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist eine erfindungsgemäße Verbindung durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei die Verbindung ein Agonist eines metabotropischen Glutamat-Rezeptors ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist eine erfindungsgemäße Verbindung durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei die Verbindung ein Antagonist eines metabotropischen Glutamat-Rezeptors ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist eine erfindungsgemäße Verbindung durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei die Verbindung ein Ligand für einen einzelnen Subtypus eines metabotropischen Glutamat-Rezeptors ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist eine erfindungsgemäße Verbindung durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei die Verbindung ein Agonist eines einzelnen Subtypus eines metabotropischen Glutamat-Rezeptors ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist eine erfindungsgemäße Verbindung durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei die Verbindung ein Antagonist eines einzelnen Subtypus eines metabotropischen Glutamat-Rezeptors ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist eine erfindungsgemäße Verbindung durch die verallgemeinerte Struktur 1 und die begleitenden Definitionen dargestellt, wobei die Verbindung ein Inhibitor von NAALADase ist.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zum Behandeln von Ischämie, insbesondere globaler und fokaler Ischämie, unter Verwendung von Zusammensetzungen, welche die Enzymaktivität von N-acetylierter alpha-verbundener saurer Dipeptidase (NAALADase) in Menschen und warmblütigen Tieren inhibieren. Bestimmte Verbindungen, welche durch die verallgemeinerte Struktur 1 dargestellt sind, sind Inhibitoren für NAALADase. Fachleute auf diesem Gebiet werden fähig sein, unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten herauszufinden, welche Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung Antagonisten von NAALADase sind.
  • NAALADase ist ein Enzym, welches eine Membran-gebundene Metalloprotease ist, welche das Dipeptid, N-Acetyl-L-aspartat-L-glutamat (NAAG) hydrolisiert, um Glutamat und N-Acetylaspartat zu erzielen. Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen die Verwendung von Phosphinsäure-Derivate enthaltenden Zusammensetzungen, welche NAALADase-Enzym-Aktivität inhibieren und welche sich zur Behandlung von Ischämie als nützlich erwiesen haben. Die Aminosäure L-Glutamat ist ein Neurotransmitter, welcher schnelle neuronale Erregung in einer Vielzahl von Synapsen in dem zentralen Nervensystem (CNS) vermittelt. Wenn es einmal in die Synapse freigesetzt wurde, kann L-Glutamat den N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)Rezeptor stimulieren, einen Subtypus eines erregenden Aminosäurerezeptors. Es ist entdeckt worden, dass übermäßige Aktivierung des NMDA- Rezeptors in eine Vielzahl von akuten sowie chronischen neuropathologischen Prozessen involviert ist, wie etwa Ischämie, Epilepsie und Huntington's Krankheit. Daher sind beachtliche Anstrengungen auf das Auffinden neuer therapeutischer Mittel schwerpunktmäßig gerichtet worden, um die postsynaptischen Wirkungen von L-Glutamat, welche durch den NMDA-Rezeptor vermittelt werden, zu antagonisieren.
  • Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bestehen aus einem Verfahren zum Behandeln von Ischämie, welches den Schritt der Verabreichung eines NAALADase-Inhibitors und pharmazeutisch akzeptablen Trägers für den NAALADase-Inhibitor an ein an Ischämie leidendes Tier umfasst. In Verfahren zur Behandlung von Schlaganfall, insbesondere akutem ischämischen Schlaganfall, und globaler Ischämie, welche durch Ertrinken, Kopftrauma usw. verursacht ist, kann ein NAALADase-Inhibitor mit einem oder mehreren Mitteln zusammen verabreicht werden, welche bei der Verringerung des Risikos von Schlaganfall aktiv sind, wie etwa Aspirin oder Ticlopidin (vorzugsweise Ticlopidin, für welches gezeigt wurde, dass es das Risiko eines zweiten ischämischen Ereignisses reduziert). Co-Verabreichung kann in der Form einer einzigen Formulierung (welche beispielsweise einen NAALADase-Inhibitor und Ticlopidin mit pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten (Arzneimittelträger) kombiniert, optional die beiden aktiven Inhaltsstoffe in verschiedenen Exzipienten-Gemischen auftrennt, welche ausgelegt sind, ihre jeweiligen Freisetzungsraten und -zeitspannen unabhängig zu steuern) oder durch unabhängige Verabreichung von separaten Formulierungen, welche die aktiven Mittel enthalten, durchgeführt werden.
  • Wenn erwünscht, kann die zu verabreichende pharmazeutische Zusammensetzung auch geringe Mengen an nicht-toxischen Hilfssubstanzen enthalten, wie etwa Benetzungs- oder Emulgiermitteln, pH-puffernden Mitteln und dergleichen, wie etwa beispielsweise Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat, etc.
  • Die NAALADase-Inhibitoren gemäß der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen als eine pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, welche einen pharmazeutischen Exzipienten in Kombination mit dem Inhibitor umfasst. Der Gehalt des Wirkstoffs in einer Formulierung kann innerhalb des vollen Bereichs variieren, wie er von Fachleuten auf dem Gebiet verwendet wird, nämlich von etwa 0,01 Gewichtsprozent (Gew.-%) bis etwa 99 Gew.-% des Wirkstoffs, basierend auf der Gesamtformulierung und etwa 0,01 Gew.-% bis 99,99 Gew.-% Exzipient. Vorzugsweise wird die Formulierung etwa 3,5 bis 60 Gew.-% des NAALADase-Inhibitors umfassen, wobei der Rest aus geeigneten pharmazeutischen Exzipienten besteht.
  • Definitionen
  • Aus Gründen der Bequemlichkeit sind vor weiterer Beschreibung der vorliegenden Erfindung bestimmte in der Beschreibung, den Beispielen und angehängten Ansprüchen verwendete Terme hier aufgelistet.
  • "NAALADase", wie hierin verwendet, bezieht sich auf N-acetylierte alpha-verbundene saure Dipeptidase (N-Acetylatd Alpha-Linked Acidic dipeptidase). Das Enzym wurde ursprünglich benannt nach seiner Substratspezifität für Hydrolyse von N-acetylierten alpha-verbundenen sauren Dipeptiden. Gegenwärtig ist bekannt, dass das Enzym einen breiteren Bereich von Substratspezifität aufweist als ursprünglich entdeckt, insbesondere dass das Enzym N-Acetylierung oder Alpha-Bindung nicht erfordert. Damit umfasst "NAALADase", wie hierin verwendet, andere in der Literatur verwendete Namen, wie etwa NAAG-hydrolisierendes Enzym und NAALA-Dipeptidase.
  • Der Begriff "Inhibierung" betrifft im Kontext der Enzym-Inhibierung reversible Enzyminhibierung, wie etwa kompetitive, unkompetitive und nicht-kompetitive Inhibierung. Dies kann experimentell durch die Wirkungen des Inhibitors auf die Reaktionskinetik des Enzyms unterschieden werden, welche im Hinblick auf die grundlegende Michaelis-Menten-Geschwindigkeitsgleichung analysiert werden kann. Kompetitive Inhibierung tritt auf, wenn der Inhibitor sich mit dem freien Enzym auf solche Weise kombinieren kann, dass er mit dem normalen Substrat um Bindung an die aktive Stelle konkurriert. Ein kompetitiver Inhibitor reagiert reversibel mit dem Enzym, um einen Enzym-Inhibitor-Komplex [EI] zu bilden. Dem Michaelis-Menten-Formalismus folgend können wir die Inhibitor-Konstante, K[i] als die Dissoziationskonstante des Enzym-Inhibitor-Komplexes definieren. Damit ist gemäß dem oben Gesagten und wie hierin verwendet K[i] im wesentlichen ein Maß für die Affinität zwischen einem Molekül und seinem Rezeptor, oder in Bezug auf die vorliegende Erfindung zwischen den vorliegenden erfindungsgemäßen Verbindungen und dem zu inhibierenden Enzym. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass IC50 ein damit zusammenhängender Begriff ist, welcher verwendet wird, wenn die Konzentration oder Menge einer Verbindung definiert wird, welche erforderlich ist, um eine 50%ige Inhibierung des Zielenzyms zu verursachen.
  • Der Begriff "Ischämie" betrifft örtlich beschränkte Gewebsanämie aufgrund von Behinderung des Einflusses von arteriellem Blut. Globale Ischämie tritt auf unter Bedingungen, in welchen Blutfluss zum gesamten Gehirn für eine Zeitspanne aussetzt, wie es etwa als Ergebnis eines Herzstillstands auftreten kann. Fokale Ischämie tritt auf unter Bedingungen, in welchen ein Abschnitt des Gehirns von seiner normalen Blutzufuhr abgeschnitten ist, wie es etwa als Ergebnis von tromboembolytischer Okklusion eines zerebralen Gefäßes, traumatischer Kopfverletzung, Ödemen und Gehirntumoren auftreten kann.
  • Der Begriff "Nervengewebe" betrifft die verschiedenen Komponenten, welche das Nervensystem ausbilden, einschließlich Neuronen, neuralen Unterstützungszellen, Glia, Schwann-Zellen, das darin enthaltene und diese Strukturen versorgende Gefäßsystem, das zentrale Nervensystem, das Gehirn, das Stammhirn, das Rückenmark, die Verbindungsstelle zwischen dem zentralen Nervensystem mit dem peripheren Nervensystem, das periphere Nervensystem und damit verbundene Strukturen.
  • Der Begriff "Nervenfunktion" betrifft die verschiedenen Funktionen des Nervensystems und seiner Teile, welche sich bei der Wahrnehmung der Umgebung, Bewusstsein darüber, Homeostase dazu und Wechselwirkung mit ihr manifestieren, wie beispielsweise durch die Fähigkeit gezeigt, Aktivitäten des täglichen Lebens, Arbeit, Denkfähigkeit und Sprache auszuführen.
  • Der Begriff "Nervenbeschädigungen" betrifft Schaden an Nervengewebe, welcher Gehirn- und Nervengewebeschaden und -zerstörung, gesamt oder in Teilen, und sich daraus ergebende Morbidität, Behinderung, neurologische Defizite und Tod umfasst. Nervöse Beschädigung kann verschiedene Ursprünge haben, einschließlich Ischämie, Hypoxie, zerebrovaskulärer Unfall, metabolisch, toxisch, neurotoxisch, Trauma, Operation, iatrogen, Druck, Masseneffekt, Blutung, thermal, chemisch, Bestrahlung, Vasospasmus, neurodegenerative Krankheit, neurodegenerativer Prozess, Infektion, Parkinsonsche Krankheit, amyotrophische Lateralsklerose, Myelinations/Demyelinations-Prozesse, Epilepsie, kognitive Störungen, Glutamat-Abnormalitäten und ihrer sekundären Effekten.
  • Der Begriff "Glutamat-Abnormalitäten" betrifft einen jeglichen Zustand, eine jegliche Krankheit oder Störung, welche Glutamat involviert, und umfasst, jedoch nicht beschränkt ist, auf die oben aufgelisteten Nervenbeschädigungen.
  • Der Begriff "Glutamat-Modulator" betrifft eine jegliche Zusammensetzung von Stoff, allein oder in Kombination mit einem weiteren Mittel, welcher den Gehalt an Glutamat in einem Tier, einschließlich einem Menschen, beeinflusst.
  • Der Begriff "neuroprotektiv" ist eine Wirkung, welche Nervenbeschädigung verringert, aufhält oder verbessert und für Nervengewebe, welches Nervenbeschädigung erlitten hat, schützend, wieder erweckend oder wieder belebend ist.
  • Der Begriff "Behandlung" betrifft einen jeglichen Prozess, eine jegliche Aktivität, Anwendung, Therapie oder dergleichen, bei der ein Tier, einschließlich eines Menschen, medizinische Hilfe mit der Absicht erhält, den Zustand des Tiers direkt oder indirekt zu verbessern. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zum Behandeln globaler Ischämie umfasst, einem Subjekt, von welchem erwartet wird, dass es einen positiven Nutzen davon davonträgt, eine wirksame Menge eines NAALADase-Inhibitors intern zu verabreichen. Dosen dieses Isomers, welche in den vorliegenden Verfahren und pharmazeutischen Zusammensetzungen umfasst sind, sind eine wirksame, nicht-toxische Menge. Fachleuten auf diesem Gebiet ist es unter Verwendung von routinemäßigen klinischen Tests möglich, optimale Dosen zu bestimmen. Die gewünschte Dosis wird einem Subjekt von einem bis sechs oder mehr Male täglich oral, rektal, parenteral oder topisch verabreicht und kann auf eine höhere anfängliche Menge folgen, welche als eine Bolus-Dosis verabreicht wurde.
  • Der Begriff "Nukleophil" ist im Fachbereich bekannt und bedeutet, wie hierin verwendet, eine chemische Gruppe mit einem reaktiven Elektronenpaar.
  • Der Begriff "Elektrophil" ist im Fachbereich bekannt und betrifft chemische Gruppen, welche ein Elektronenpaar von einem wie oben definierten Nukleophil akzeptieren können. Elektrophile Gruppen, welche in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Halogenide und Sulfonate.
  • Der Begriff "elektronenabziehende Gruppe" ist im Fachbereich bekannt und bezieht sich auf die Neigung eines Substituenten, Valenzelektronen von benachbarten Atomen anzuziehen, d.h. der Substituent ist bezüglich benachbarter Atome elektronegativ. Eine Quantifizierung des Ausmaßes der elektronenabziehenden Fähigkeit ist durch die Hammett Sigma(s)-Konstante gegeben. Diese wohl bekannte Konstante wird in vielen Literaturstellen beschrieben, beispielsweise im J. March, Advanced Organic Chemistry, McGraw Hill Book Company, New York, (1977 Ausgabe), Seiten 251–259. Die Hammett-Konstanten-Werte sind im Allgemeinen für elektronenspendende Gruppen negativ (s[P] = –0,66 für NH2) und positiv für elektronenabziehende Gruppen (s[P] = 0,78 für eine Nitro-Gruppe), wobei s[P] para-Substitution anzeigt. Beispiele für elektronenabziehende Gruppen umfassen Nitro, Keton, Aldehyd, Sulfonyl, Trifluormethyl, -CN, Chlorid und dergleichen. Beispiele für elektronenspendende Gruppen umfassen Amino, Methoxy und dergleichen.
  • Der Begriff "Alkyl" betrifft das Radikal gesättigter aliphatischer Gruppen, einschließlich geradkettiger Alkyl-Gruppen, verzweigtkettiger Alkyl-Gruppen, Cycloalkyl-(alizyklischer)Gruppen, Alkyl-substituierter Cycloalkylgruppen, und Cycloalkyl-substierter Alkylgruppen. In bestimmten Ausführungsformen weist ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl 30 oder weniger Kohlenstoffatome in seinem Grundgerüst auf (z.B. C1-C30 für gerade Ketten, C3-C30 für verzweigte Ketten) und weiter bevorzugt 20 oder weniger. Ähnlich haben bevorzugte Cycloalkyle von 3–10 Kohlenstoffatome in ihrer Ringstruktur und weiter bevorzugt 5, 6 oder 7 Kohlenstoffe in der Ringstruktur.
  • Außerdem soll der Begriff "Alkyl" (oder "niederes Alkyl"), wie durch die Beschreibung und Ansprüche hindurch verwendet, sowohl "unsubstituierte Alkyle" wie auch "substituierte Alkyle" umfassen, wobei letztere sich auf Alkyl-Gruppen mit Substituenten beziehen, welche ein Wasserstoff an einem oder mehreren Kohlenstoffen des Kohlenwasserstoff-Grundgerüsts ersetzen. Solche Substituenten können beispielsweise ein Halogen, ein Hydroxyl, ein Carbonyl (wie etwa ein Carboxyl, einen Ester, ein Formyl oder ein Keton), ein Thiocarbonyl (wie etwa einen Thioester, ein Thioacetat oder ein Thioformat), ein Alkoxyl, ein Phosphoryl, ein Phosphonat, ein Phosphinat, ein Amino, ein Amido, ein Amidin, ein Imin, ein Cyano, ein Nitro, ein Azido, ein Sulfhydryl, ein Alkylthio, ein Sulfat, ein Sulfonat, ein Sulfamoyl, ein Sulfonamido, ein Sulfonyl, ein Heterocyclyl, ein Aralkyl oder eine aromatische oder eine heteroaromatische Gruppe umfassen. Es wird von Fachleuten auf diesem Gebiet verstanden werden, dass die an der Kohlenwasserstoffkette substituierten Gruppen selbst gegebenenfalls substituiert sein können. Beispielsweise können die Substituenten eines substituierten Alkyls substituierte und unsubstituierte Formen von Amino, Azido, Imino, Amido, Phosphoryl (einschließlich Phosphonat und Phosphinat), Sulfonyl (einschließlich Sulfat, Sulfonamido, Sulfamoyl und Sulfonat) und Silylgruppen, sowie Ether, Alkylthios, Carbonyle, (einschließlich Ketone, Aldehyde, Carboxylate und Ester), -CF3, -CN und dergleichen umfassen. Beispiele für substituierte Alkyle sind unterstehend beschrieben. Cycloalkyle können weiter mit Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Alkylthio, Aminoalkyl, Carbonyl-substituiertem Alkyl, -CF3, -CN und dergleichen substituiert sein.
  • Der Begriff "Aralkyl", wie hierin verwendet, betrifft eine Alkylgruppe, welche mit einer Arylgruppe (z.B. einer aromatischen oder heteroaromatischen Gruppe) substituiert ist.
  • Die Begriffe "Alkenyl" und "Alkinyl" betreffen ungesättigte aliphatische Gruppen, welche in Länge und möglicher Substitution den oben beschriebenen Alkylgruppen analog sind, aber welche wenigstens eine Doppel- bzw. Dreifachbindung enthalten.
  • Wenn die Anzahl an Kohlenstoffatomen nicht anderweitig spezifiziert ist, bedeutet "niederes Alkyl", wie hierein verwendet, eine Alkylgruppe, wie oben definiert, aber mit von 1 bis zu 10 Kohlenstoffatomen, weiter bevorzugt von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in seiner Grundgerüststruktur. Dementsprechend haben "niederes Alkenyl" und "niederes Alkinyl" ähnliche Kettenlängen. Bevorzugte Alkylgruppen sind niedere Alkyle. In bestimmten Ausführungsformen ist ein hierin als Alkyl bezeichneter Substituent ein niederes Alkyl.
  • Der Begriff "Aryl", wie hierin verwendet, umfasst 5-, 6- und 7-gliedrige aromatische Einzel-Ring-Gruppen, welche von 0 bis 4 Heteroatome umfassen können, beispielsweise Benzol, Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Triazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrazin, Pyridazin und Pyrimidin und dergleichen. Diese Arylgruppen mit Heteroatomen in der Ringstruktur können auch als "Arylheterocyclen" oder "Heteroaromaten" bezeichnet sein. Der aromatische Ring kann an einer oder mehreren Ringpositionen mit Substituenten wie oben beschrieben substituiert sein, beispielsweise Halogen, Azid, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amino, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Sulfonamido, Keton, Aldehyd, Ester, Heterocyclyl, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, -CF3, -CN oder dergleichen. Der Begriff "Aryl" umfasst auch polycyclische Ringsysteme mit zwei oder mehr zyklischen Ringen, in welchen zwei oder mehr Kohlenstoffatome zwei benachbarten Ringen gemeinsam sind (die Ringe sind "annelierte Ringe"), wobei wenigstens einer der Ringe aromatisch ist, z.B. können die anderen zyklischen Ringe Cycloalkyle, Cycloalkenyle, Cycloalkinyle, Aryle und/oder Heterocyclyle sein.
  • Die Abkürzungen Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, Ms stellen Methyl, Ethyl, Phenyl, Trifluormethansulfonyl, Nonafluorbutansulfonyl, p-Toluolsulfonyl bzw. Methansulfonyl dar. Eine ausführlichere Liste der von organischen Chemikern durchschnittlichen Fachwissens verwendeten Abkürzungen erscheint in der ersten Ausgabe jedes Bandes des Journal of Organic Chemistry. Diese Liste wird typischerweise in einer Tabelle dargestellt, welche den Titel "Standard List of Abbreviations" trägt. Die in dieser Liste enthaltenen Abkürzungen und alle von organischen Chemikern durchschnittlichen Könnens verwendeten Abkürzungen sind hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Die Begriffe ortho, meta und para beziehen sich auf 1,2-, 1,3- bzw. 1,4-disubstituierte Benzole. Zum Beispiel sind die Namen 1,2-Dimethylbenzol und ortho-Dimethylbenzol synonym.
  • Die Begriffe "Heterocyclyl" oder "heterocyclische Gruppe" betreffen 3- bis 10-gliedrige Ringstrukturen, bevorzugter 3- bis 7-gliedrige Ringe, deren Ringstrukturen 1 bis 4 Heteroatome umfassen. Heterocyclen können auch Polycyclen sein. Heterocyclylgruppen umfassen beispielsweise Thiophen, Thioanthren, Furan, Pyran, Isobenzofuran, Chromen, Xanthen, Phenoxathiin, Pyrrol, Imidazol, Pyrazol, Isothiazol, Isoxazol, Pyridin, Pyrazin, Pyrimidin, Pyridazin, Indolizin, Isoindol, Indol, Indazol, Purin, Chinolizin, Isochinolin, Chinolin, Phthalazin, Naphthyridin, Chinoxalin, Chinazolin, Cinnolin, Pteridin, Carbazol, Carbolin, Phenanthridin, Acridin, Pyrimidin, Phenanthrolin, Phenazin, Phenarsazin, Phenothiazin, Furazan, Phenoxazin, Pyrrolidin, Oxolan, Thiolan, Oxazol, Piperidin, Piperazin, Morpholin, Lactone, Lactame, wie etwa Azetidinone und Pyrrolidinone, Sulfame, Sulfone und dergleichen. Der heterocyclische Ring kann an einer oder mehr Positionen mit solchen Substituenten wie oben beschrieben substituiert sein, wie beispielsweise Halogen, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Keton, Aldehyd, Ester, einem Heterocyclyl, einer aromatischen oder heteroaromatischen Gruppe, -CF3, -CN oder dergleichen.
  • Die Begriffe "Polycyclyl" oder "polycyclische Gruppe" betrifft zwei oder mehr Ringe (z.B. Cycloalkyle, Cycloalkenyle, Cycloalkinyle, Aryle und/oder Heterocyclyle), in welchen zwei oder mehr Kohlenstoffe zwei benachbarten Ringen gemeinsam sind, z.B. sind die Ringe "annelierte Ringe". Ringe, welche durch nicht-benachbarte Atome verbunden sind, werden als "verbrückte Ringe" bezeichnet. Jeder dieser Ringe des Polycyclus kann mit Substituenten wie den oben beschriebenen substituiert sein, wie beispielsweise Halogen, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Keton, Aldehyd, Ester, einem Heterocyclyl, einer aromatischen oder heteroaromatischen Gruppe, -CF3, -CN oder dergleichen.
  • Der Begriff "Carbocyclus" betrifft, wie hierin verwendet, einen aromatischen oder nicht-aromatischen Ring, in welchem jedes Atom des Rings Kohlenstoff ist.
  • Der Begriff "Heteroatom", wie hierin verwendet, bedeutet ein Atom eines jeglichen Elements ausser Kohlenstoff oder Wasserstoff. Bevorzugte Heteroatome sind Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor.
  • Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff "Nitro" -NO2; der Begriff "Halogen" bezeichnet -F, -Cl, -Br oder -I; der Begriff "Sulhydryl" bedeutet -SH; der Begriff "Hydroxyl" bedeutet -OH; und der Begriff "Sulfonyl" bedeutet -SO2-.
  • Die Begriffe "Amin" und "Amino" sind im Fachbereich anerkannt und beziehen sich sowohl auf unsubstituierte als auch substituierte Amine, z.B. eine Gruppe, welche durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00360001
    wobei R9, R10 und R'10 unabhängig voneinander einen Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl, -(CH2)m-R8 bedeuten oder R9 und R10 zusammen mit dem N-Atom, an welches sie gebunden sind, einen Heterocyclus mit von 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen; R8 ein Aryl, ein Cycloalkyl, ein Cycloalkenyl, einen Heterocyclus oder einen Polycyclus darstellt; und m 0 oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 ist. In bevorzugten Ausführungsformen kann nur eines von R9 oder R10 ein Carbonyl sein, z.B. bilden R9, R10 und der Stickstoff zusammen nicht ein Imid. In noch weiter bevorzugten Ausführungsformen stellen jedes von R9 und R10 (und optional R'10) unabhängig voneinander einen Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8 dar. Damit bedeutet der Begriff "Alkylamin", wie hierin verwendet, eine Amingruppe, wie oben definiert, mit einem daran gebundenen substituierten oder unsubstituierten Alkyl, d.h. wenigstens eines von R9 und R10 ist eine Alkylgruppe.
  • Der Begriff "Acylamino" ist im Fachbereich anerkannt und betrifft eine Gruppe, welche durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00370001
    wobei R9 wie oben definiert ist und R'11 einen Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8 darstellt, wobei m und R8 wie oben definiert sind.
  • Der Begriff "Amido" ist im Fachbereich anerkannt als ein amino-substituiertes Carbonyl und umfasst eine Gruppe, welche durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00370002
    wobei R9, R10 wie oben definiert sind. Bestimmte Ausführungsformen des Amids umfassen keine Imide, welche instabil sein können.
  • Der Begriff "Alkylthio" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, wie oben definiert, welche daran ein Schwefel-Radikal gebunden hat. In bestimmten Ausführungsformen ist die "Alkylthio"-Gruppe dargestellt durch eines von -S-Alkyl, -S-Alkenyl, S-Alkinyl und -S-(CH2)m-R8, wobei m und R8 wie oben definiert sind. Repräsentative Alkylthio-Gruppen umfassen Methylthio, Ethylthio und dergleichen.
  • Der Begriff "Carbonyl" ist im Fachbereich anerkannt und umfasst solche Gruppen, wie sie durch die allgemeine Formel dargestellt werden können:
    Figure 00380001
    wobei X eine Bindung ist oder einen Sauerstoff oder ein Schwefel darstellt, und R11 einen Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl, -(CH2)m-R8 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz darstellt, R'11 einen Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8 darstellt, wobei m und R8 wie oben definiert sind. Wenn X ein Sauerstoff ist und R11 oder R'11 nicht Wasserstoff sind, stellt die Formel einen "Ester" dar. Wenn X ein Sauerstoff ist und R11 wie oben definiert ist, wird die Gruppe hierin als eine Carboxylgruppe bezeichnet, und besonders wenn R11 ein Wasserstoff ist, stellt die Formel eine "Carbonsäure" dar. Wenn X ein Sauerstoff ist und R'11 Wasserstoff ist, stellt die Formel ein "Format" dar. Im Allgemeinen stellt die Formel, wenn das Sauerstoffatom der obigen Formel durch Schwefel ersetzt ist, eine "Thiolcarbonyl"-Gruppe dar. Wenn X ein Schwefel ist und R11 oder R'11 nicht Wasserstoff sind, stellt die Formel einen "Thiolester" dar. Wenn X ein Schwefel ist und R11 Wasserstoff ist, stellt die Formel eine "Thiolcarbonsäure" dar. Wenn X ein Schwefel ist und R'11 Wasserstoff ist, stellt die Formel ein "Thiolformat" dar. Auf der anderen Seite stellt die obige Formel, wenn X eine Bindung ist und R11 nicht Wasserstoff ist, eine "Keto"-Gruppe dar. Wenn X eine Bindung ist und R11 Wasserstoff ist, stellt die obige Formel eine "Aldehyd"-Gruppe dar.
  • Die Begriffe "Alkoxyl" oder "Alkoxy", wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine Alkylgruppe, wie oben definiert, mit einem daran gebundenen Sauerstoffradikal. Repräsentative Alkoxylgruppen umfassen Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, tert-Butoxy und dergleichen. Ein "Ether" besteht aus zwei kovalent durch ein Sauerstoff verbundene Kohlenwasserstoffe. Demgemäss ist oder ähnelt der Substituent eines Alkyls, welcher das Alkyl zu einem Ether macht, einem Alkoxyl, wie es dargestellt werden kann durch eines von -O-Alkyl, -O-Alkenyl, O-Alkinyl, -O-(CH2)m-R8, wobei m und R8 oben beschrieben sind.
  • Der Begriff "Sulfonat" ist im Fachbereich anerkannt und umfasst eine Gruppe, welche durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00390001
    in welcher R41 ein Elektronenpaar, Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl ist.
  • Die Begriffe Triflyl, Tosyl, Mesyl, und Nonaflyl sind im Fachbereich anerkannt und beziehen sich auf Trifluormethansulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, Methansulfonyl- bzw. Nonafluorbutansulfonyl-Gruppen. Die Begriffe Triflat, Tosylat, Mesylat und Nonaflat sind im Fachbereich anerkannt und betreffen Trifluormethansulfonatester-, p-Toluolsulfonatester-, Methansulfonatester- und Nonafluorbutansulfonatester-funktionelle Gruppen bzw. Moleküle, welche diese Gruppen enthalten.
  • Der Begriff "Sulfat" ist im Fachbereich anerkannt und umfasst eine Gruppe, welche durch die allgemeine Formel darstellt werden kann:
    Figure 00400001
    in welcher R41 wie oben definiert ist.
  • Der Begriff "Sulfonamido" ist im Fachbereich anerkannt und umfasst eine Gruppe, welche durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00400002
    in welcher R9 und R'11 wie oben definiert sind.
  • Der Begriff "Sulfamoyl" ist im Fachbereich anerkannt und umfasst eine Gruppe, welche durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00400003
    in welcher R9 und R10 definiert sind.
  • Die Begriffe "Sulfoxido" oder "Sulfinyl", wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine Gruppe, welche durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00410001
    in welcher R44 aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aralkyl oder Aryl.
  • Ein "Phosphoryl" kann im Allgemeinen durch die Formel dargestellt werden:
    Figure 00410002
    wobei Q1 S oder O darstellt und R46 Wasserstoff, ein niederes Alkyl oder ein Aryl darstellt. Bei Verwendung zur Substitution beispielsweise eines Alkyls kann die Phosphoryl-Gruppe des Phosphorylalkyls durch die allgemeine Formel dargestellt werden:
    Figure 00410003
    wobei Q1 S oder O darstellt und jedes R46 unabhängig Wasserstoff, ein niederes Alkyl oder ein Aryl darstellt, Q2 O, S oder N darstellt. Wenn Q1 ein S ist, ist die Phosphorylgruppe ein "Phosphorothioat".
  • Ein "Phosphoramidit" kann durch die allgemeine Formel dargestellt werden:
    Figure 00420001
    wobei R9 und R10 wie oben definiert sind und Q2 O, S oder N darstellen.
  • Ein "Phosphonamidit" kann in der allgemeinen Formel dargestellt werden:
    Figure 00420002
    wobei R9 und R10 wie oben definiert sind, Q2 O, S oder N darstellt und R48 ein niederes Alkyl oder ein Aryl darstellt, und Q2 O, S oder N darstellt.
  • Ein "Selenoalkyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe mit einer daran gebundenen substituierten Seleno-Gruppe. Beispielhafte "Selenoether", welche an dem Alkyl substituiert sein können, sind ausgewählt aus einem von -Se-Alkyl, -Se-Alkenyl, -Se-Alkinyl, und -Se-(CH2)m-R8, wobei m und R8 oben definiert sind.
  • Analoge Substitutionen können durchgeführt werden an Alkenyl- und Alkinyl-Gruppen, um beispielsweise Aminoalkenyle, Aminoalkinyle, Amidoalkenyle, Amidoalkinyle, Iminoalkenyle, Iminoalkinyle, Thioalkenyle, Thioalkinyle, Carbonyl-substituierte Alkenyle oder Alkinyle herzustellen.
  • Der Ausdruck "Schutzgruppe", wie hierin verwendet, bedeutet temporäre Modifikationen einer potentiell reaktiven funktionellen Gruppe, welche sie vor unerwünschten chemischen Transformationen schützt. Beispiele solcher Schutzgruppen umfassen Ester von Carbonsäuren, Silylether von Alkoholen und Acetale und Ketale von Aldehyden bzw. Ketonen. Das Gebiet der Schutzgruppenchemie ist in einem Review dargestellt worden (Greene, T. W.; Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Auflage; Wiley: New York, 1991).
  • Es ist zu verstehen, dass "Substitution" oder "substituiert mit" die implizite Voraussetzung umfasst, dass eine solche Substitution mit der erlaubten Valenz des substituierten Atoms und des Substituenten im Einklang ist, und dass die Substitution zu einer stabilen Verbindung führt, welche z.B. nicht spontan einer Transformation, wie etwa durch Umordnung, Ringschluss, Eliminierung, etc. unterliegt.
  • Wie hierin verwendet, ist beabsichtigt, dass der Begriff "substituiert" alle erlaubten Substituenten von organischen Verbindungen umfassen. Unter einem breiten Gesichtspunkt umfassen die erlaubten Substituenten acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nicht-aromatische Substituenten von organischen Verbindungen. Beispielhafte Substituenten umfassen beispielsweise die oben hierin beschriebenen. Die erlaubten Substituenten können einer oder mehrere sein und die gleichen oder verschiedene für geeignete organische Verbindungen. Zu Zwecken dieser Erfindung können die Heteroatome, wie etwa Stickstoff, Wasserstoff-Substituenten und/oder jegliche erlaubte Substituenten organischer Verbindungen, welche hierin beschrieben sind, aufweisen, welche zu den Valenzen des Heteroatoms passen. Diese Erfindung soll nicht in irgendeiner Art und Weise durch die erlaubten Substituenten organischer Verbindungen eingeschränkt sein.
  • Ein "polares Lösungsmittel" bedeutet ein Lösungsmittel mit einem Dipolmoment (ε) von 2,9 oder mehr, wie etwa DMF, THF, Ethylenglykoldimethylether, DMSO, Aceton, Acetonitril, Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol, t-Butanol oder 2-Methoxyethylether. Bevorzugte Lösungsmittel sind DMF, Diglyme und Acetonitril.
  • Ein "aprotisches Lösungsmittel" bedeutet ein Lösungsmittel, welches kein Wasserstoffbindungsdonor ist. Beispiele für solche Lösungsmittel sind Acetonitril, Toluol, DMF, Diglyme, THF oder DMSO.
  • Ein "polares, aprotisches Lösungsmittel" bedeutet ein Lösungsmittel, welches einen Dipolmoment (ε) von 2,9 hat, und kein Wasserstoffbindungsdonor ist, z.B. DMF, Acetonitril, DMSO und THF.
  • Zu Zwecken dieser Erfindung sind die chemischen Elemente gemäß dem Periodensystem der Elemente, CAS-Version, Handbuch der Chemie und Physik, 67. Auflage, 1986–87, Innenumschlag identifiziert. Auch zu Zwecken dieser Erfindung soll der Begriff "Kohlenwasserstoff" alle erlaubten Verbindungen mit wenigstens einem Wasserstoff und einem Kohlenstoffatom umfassen. Unter einem breiten Gesichtspunkt umfassen die erlaubten Kohlenwasserstoffe acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nicht- aromatische organische Verbindungen, welche substituiert oder unsubstituiert sein können.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Unter einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Verbindung pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzungen bereit, welche eine therapeutisch wirksame Menge einer oder mehr der oben beschriebenen Verbindungen umfassen, formuliert zusammen mit einem oder mehr pharmazeutisch akzeptablen Trägern (Additiven) und/oder Verdünnungsmitteln. Wie im Detail untenstehend beschrieben, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung speziell für die Verabreichung in fester oder flüssiger Form formuliert sein, einschließlich der, welche an die folgenden angepasst sind: (1) orale Verabreichung, z.B. Arzneitränke (wässrige oder nicht-wässrige Lösungen oder Suspensionen), Tabletten, Bolus, Pulver, Granulate, Pasten zur Anwendung auf der Zunge; (2) parenterale Verabreichung, z.B. durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, beispielsweise als eine sterile Lösung oder Suspension; (3) topische Applikation, z.B. als eine Creme, Salbe oder Spray, welche auf die Haut aufgebracht werden; oder (4) intravaginal oder intrarektal, z.B. als ein Pessar, eine Creme oder ein Schaum.
  • Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge", wie hierin verwendet, bedeutet die Menge einer Verbindung, eines Materials oder einer Zusammensetzung, welche eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, welche wirksam darin ist, eine gewünschte therapeutische Wirkung in wenigstens einer Sub-Population von Zellen in einem Tier zu erzeugen, in einem vernünftigen Nutzen-/Risiko-Verhältnis, wie es auf eine jegliche medizinische Behandlung anwendbar ist.
  • Der Ausdruck "pharmazeutisch akzeptabel" wird hierin verwendet, um Bezug zu nehmen auf diejenigen Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen, welche innerhalb des Bereichs verlässlicher medizinischer Beurteilung geeignet sind, in Kontakt mit den Geweben von Menschen und Tieren ohne übermäßige Toxizität, Irritation, allergische Reaktion oder ein anderes Problem oder eine andere Komplikation verwendet zu werden, entsprechend einem vernünftigen Nutzen-/Risiko-Verhältnis.
  • Der Ausdruck "pharmazeutisch akzeptabler Träger", wie hierin verwendet, bedeutet ein pharmazeutisch akzeptables Material, Vehikel oder eine pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung, wie etwa einen flüssigen oder festen Füllstoff, Verdünnungsmittel, Exzipient, Lösungsmittel oder einkapselndes Material, welcher involviert ist im Tragen oder Transportieren der betreffenden Verbindung von einem Organ, oder Körperabschnitt, zu einem anderen Organ oder Körperabschnitt. Jeder Träger muss "akzeptabel" in dem Sinn sein, dass er kompatibel mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung und für den Patienten nicht schädlich ist. Einige Beispiele für Materialien, welche als pharmazeutisch akzeptable Träger dienen können, umfassen: (1) Zucker, wie etwa Lactose, Glucose und Sucrose; (2) Stärken, wie etwa Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Cellulose und seine Derivate, wie etwa Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; (4) pulverförmiges Tragacanth; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Talk; (8) Exzipienten, wie etwa Kakaobutter und Zäpfchenwachse; (9) Öle, wie etwa Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojaöl; (10) Glycole, wie etwa Propylenglycol; (11) Polyole, wie etwa Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglycol; (12) Ester, wie etwa Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) puffernde Mittel, wie etwa Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) Pyrogen-freies Wasser; (17) isotonische Salzlösung; (18) Ringer'sche Lösung; (19) Ethylalkohol; (20) Phosphatpufferlösungen; und (21) andere nicht toxische, kompatible Substanzen, welche in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden.
  • Wie oben ausgeführt, können bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Verbindungen eine basische funktionelle Gruppe, wie etwa Amino oder Alkylamino enthalten und sind daher fähig, pharmazeutisch akzeptable Salze mit pharmazeutisch akzeptablen Säuren zu bilden. Der Begriff "pharmazeutisch akzeptable Salze" bezieht sich in dieser Hinsicht auf die relativ nicht-toxischen, anorganischen und organischen Säureadditionssalze von erfindungsgemäßen Verbindungen. Diese Salze können in situ während der endgültigen Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellt werden, oder durch separates Umsetzen einer gereinigten erfindungsgemäßen Verbindung in ihrer freien Basenform mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure und Isolieren des Salzes, welches derart gebildet wurde. Repräsentative Salze umfassen die Hydrobromid-, Hydrochlorid-, Sulfat-, Bisulfat-, Phosphat-, Nitrat-, Acetat-, Valerat-, Oleat-, Palmitat-, Stearat-, Laurat-, Benzoat-, Lactat-, Phosphat-, Tosylat-, Citrat-, Maleat-, Fumarat-, Succinat-, Tartrat-, Naphthylat-, Mesylat-, Glucoheptonat-, Lactobionat-, und Laurylsulfonat- Salze und dergleichen. (Siehe beispielsweise Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1–19)
  • Die pharmazeutisch akzeptablen Salze der in Frage stehenden Verbindungen umfassen die herkömmlichen nicht-toxischen Salze oder quarternären Ammoniumsalze der Verbindungen, z.B. von nicht-toxischen organischen oder anorganischen Säuren. Z.B. umfassen solche herkömmlichen nicht-toxischen Salze diejenigen, welche von anorganischen Säuren abgeleitet sind, wie etwa Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff, Schwefelsäure, Sulfamsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen; und die Salze, welche hergestellt sind aus organischen Säuren wie etwa Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Glycolsäure, Stearinsäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Palmitinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Phenylessigsäure, Glutaminsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Sulfanilsäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Fumarsäure, Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Ethandisulfonsäure, Oxalsäure, Isethionsäure und dergleichen.
  • In anderen Fällen können die erfindungsgemäßen Verbindungen eine oder mehrere saure funktionelle Gruppen enthalten und daher fähig sein, pharmazeutisch akzeptable Salze mit pharmazeutisch akzeptablen Basen zu bilden. Der Begriff "pharmazeutisch akzeptable Salze" betrifft in diesen Fällen die relativ nicht-toxischen, anorganischen und organischen Basenadditionssalze von erfindungsgemäßen Verbindungen. Diese Salze können gleichfalls in situ während der endgültigen Isolierung und Reinigung der Verbindungen hergestellt werden, oder durch separates Umsetzen der gereinigten Verbindung in ihrer freien Säureform mit einer geeigneten Base, wie etwa dem Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat eines pharmazeutisch akzeptablen Metallkations, mit Ammoniak, oder mit einem pharmazeutisch akzeptablen organischen primären, sekundären oder tertiären Amin. Repräsentative Alkali- oder Erdalkalisalze umfassen die Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- und Aluminiumsalze und dergleichen. Repräsentative organische Amine, welche für die Bildung von Basenadditionssalzen nützlich sind, umfassen Ethylamin, Diethylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperazin und dergleichen. (Siehe beispielsweise Berge et al., supra)
  • Benetzungsmittel, Emulgatoren und Schmiermittel, wie etwa Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat, sowie farbgebende Mittel, freisetzende Mittel, Beschichtungsmittel, süßende, geschmackgebende und parfümierende Mittel, Konservierungsstoffe und Antioxidantien können auch in den Zusammensetzungen vorliegen.
  • Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Antioxidantien umfassen: (1) wasserlösliche Antioxidantien, wie etwa Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumbisulfat, Nariummetabisulfit, Natriumsulfit und dergleichen; (2) öllösliche Antioxidantien, wie etwa Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecithin, Propylgallat, alpha-Tocopherol und dergleichen; und (3) Metall-Chelierungsmittel, wie etwa Zitronensäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbitol, Weinsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
  • Verabreichung der Adenosin-Antagonisten und -Agonisten zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren kann über einen jeglichen der akzeptierten Verabreichungsmodi erfolgen. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, orale, parenterale, transdermale, intraartikuläre und auf andere Weise systemische Verabreichung. Orale Verabreichung wird bevorzugt. Die Verbindungen werden in einer therapeutisch wirksamen Menge entweder alleine oder in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten verabreicht.
  • In Abhängigkeit von dem beabsichtigten Verabreichungsmodus kann der Adenosin-Antagonist oder -Agonist der Wahl in einer jeglichen pharmazeutisch akzeptablen Dosierungsform aufgenommen sein, wie etwa beispielsweise Tabletten, Transdermalpflaster, Pillen, Kapseln, Pulvern, Flüssigkeiten, Suspensionen, Emulsionen, Aerosolen oder dergleichen, vorzugsweise in Einheitsdosierungsformen, welche geeignet sind für einzelne Verabreichung von präzisen Dosierungen, oder Langzeitfreisetzungsdosierungsformen für kontinuierliche, gesteuerte Verabreichung. Vorzugsweise wird die Dosierungsform einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten umfassen und kann zusätzlich andere medizinische Mittel, pharmazeutische Mittel, Träger, Hilfsstoffe und dergleichen enthalten.
  • Für feste Dosierungsformen umfassen nicht-toxische Träger, sind jedoch nicht beschränkt auf beispielsweise Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, die Polyalkylenglycole, Talk, Cellulose, Glucose, Sucrose und Magnesiumcarbonat pharmazeutischer Qualität. Flüssige pharmazeutisch verabreichbare Dosierungsformen können beispielsweise eine Lösung oder Suspension eines aktiven Adenosin-Agens und optional pharmazeutische Hilfsmittel in einem Träger umfassen, wie etwa beispielsweise Wasser, Salzlösungs-wässriger Dextrose, Glycerol, Ethanol und dergleichen, um dadurch eine Lösung oder Suspension zu bilden. Wenn erwünscht, kann die zu verabreichende pharmazeutische Zusammensetzung auch geringere Mengen nicht-toxischer Hilfssubstanzen umfassen, wie etwa Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-puffernde Mittel und dergleichen. Typische Beispiele für solche Hilfsmittel sind Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolamin, Natriumacetat, Triethanolaminoleat, etc. Verfahren zum Herstellen solcher Dosierungsformen sind bekannt, oder werden Fachleuten in diesem Bereich offensichtlich sein; siehe beispielsweise: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 16. Auflage, 1980. Die Zusammensetzung der zu verabreichenden Formulierung wird auf jeden Fall eine Menge des aktiven Adenosin-Agens in einer zur Behandlung wirksamen Menge enthalten.
  • Parenterale Verabreichung ist im Allgemeinen charakterisiert durch Injektion, entweder subkutan, intramuskulär oder intravenös. Injektionen können hergestellt werden in herkömmlichen Formen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspension, festen Formen, welche zur Bildung von Lösung oder Suspension in Flüssigkeit vor Injektion geeignet sind, oder als Emulsionen. Geeignete Exzipienten sind beispielsweise Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol und dergleichen. Zusätzlich können die zu verabreichenden injizierbaren pharmazeutischen Zusammensetzungen auch geringere Mengen nicht-toxischer Hilfssubstanzen enthalten, wie etwa Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-puffernde Mittel und dergleichen.
  • Die Menge an aktivem Adenosin-Antagonisten oder -Agonist, welche verabreicht wird, wird natürlich von dem zu behandelnden Subjekt abhängen, der Schwere und Natur des Leidens, der Art der Verabreichung, der Potenz und der Pharmakodynamik des besonderen Mittels und der Beurteilung des verschreibenden Arztes. Die therapeutisch wirksame Dosierung zur Verwendung in dieser Erfindung wird jedoch im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,01 mu g/kg (Körpergewicht) bis 5 mg/kg sein.
  • Erfindungsgemäße Formulierungen umfassen solche, welche geeignet sind für orale, nasale, topische (einschließlich bukkale und sublinguale), rektale, vaginale und/oder parenterale Verabreichung. Die Formulierungen können bequem in Einheitsdosierungsform vorgelegt werden und können durch jegliche im Bereich der Pharmazie bekannte Verfahren hergestellt werden. Die Menge an aktivem Inhaltsstoff, welcher mit einem Trägermaterial kombiniert werden kann, um eine Einzeldosierungsform herzustellen, wird in Abhängigkeit von dem behandelten Wirt variieren, und der besonderen Art der Verabreichung. Die Menge an aktivem Inhaltsstoff, welcher mit einem Trägermaterial kombiniert werden kann, um eine Einzeldosierungsform herzustellen, wird im Allgemeinen diejenige Menge der Verbindung sein, welche eine therapeutische Wirkung hervorruft. Im Allgemeinen wird bezogen auf 100% diese Menge im Bereich von etwa 1% bis etwa 99% aktiver Inhaltsstoff, vorzugsweise von etwa 5% bis etwa 70%, am meisten bevorzugt von etwa 10% bis etwa 30% liegen.
  • Verfahren zum Herstellen dieser Formulierungen oder Zusammensetzungen umfassen den Schritt, eine erfindungsgemäße Verbindung mit dem Träger und optional einem oder mehreren begleitenden Inhaltsstoffen in Kontakt zu bringen. Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt durch gleichförmiges und inniges Inkontaktbringen einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung mit flüssigen Trägern, oder fein aufgespalteten festen Trägern, oder beiden, und dann, falls nötig, Formen des Produkts.
  • Erfindungsgemäße Formulierungen, welche für orale Verabreichung geeignet sind, können in der Form von Kapseln, Gelatinekapseln, Pillen, Tabletten, Lutschtabletten (unter Verwendung einer mit Geschmack versehenen Grundlage, üblicherweise Sucrose und Akazie oder Tragacanth), Pulvern, Granulaten oder als eine Lösung oder eine Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit oder als eine Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Flüssigemulsion oder als ein Elixier oder Sirup oder als Pastillen (unter Verwendung einer inerten Grundlage, wie etwa Gelatine und Glycerin oder Sucrose und Akazie) und/oder als Mundspülungen und dergleichen vorliegen, wobei jede eine vorbestimmte Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung als einen aktiven Inhaltsstoff enthält. Eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch als ein Bolus, Electuarium oder eine Paste verabreicht werden.
  • In festen Dosierungsformen der Erfindung für orale Verabreichung (Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pulvern, Granulaten und dergleichen) wird der aktive Inhaltsstoff mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern gemischt, wie etwa Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder einem jeglichen der folgenden: (1) Füllstoffen oder Streckmitteln, wie etwa Stärken, Lactose, Sucrose, Glucose, Mannitol und/oder Kieselsäure; (2) Bindemitteln, wie etwa beispielsweise Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Sucrose und/oder Akazie; (3) Feuchthaltemittel, wie etwa Glycerin; (4) auflösende Mittel, wie etwa Agar Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmte Silikate und Natriumcarbonat; (5) Lösungs-verzögernde Mittel, wie etwa Paraffin; (6) Absorptionsbeschleuniger, wie etwa quarternäre Ammoniumverbindungen; (7) Benetzungsmittel, wie etwa beispielsweise Cetylalkohol und Glycerinmonostearat; (8) Absorptionsmittel, wie etwa Kaolin und Bentonit-Ton; (9) Schmiermittel, wie etwa Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglycole, Natriumlaurylsulfat und Gemische davon; und (10) farbgebende Mittel. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen auch puffernde Mittel umfassen. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können auch als Füllstoffe in weichen und hart-gefüllten Gelatinekapseln verwendet werden, unter Verwendung solcher Exzipienten wie Lactose oder Milchzuckern, sowie Polyethylenglycolen hohen Molekulargewichts und dergleichen.
  • Eine Tablette kann hergestellt werden durch Pressen oder Gießen, optional mit einem oder mehreren begleitenden Inhaltsstoffen. Gepresste Tabletten können hergestellt werden unter Verwendung von Bindemittel (z.B. Gelatine oder Hydroxypropylmethylcellulose), Schmiermittel, inertem Verdünnungsmittel, Konservierungsstoff, auflösendem Mittel (z.B. Natriumstärkeglycolat oder quer-vernetzter Natriumcarboxymethylcellulose), oberflächenaktivem oder dispergierendem Mittel. Gegossene Tabletten können hergestellt werden durch Gießen in einer geeigneten Maschine von einem Gemisch der pulverförmigen Verbindung, welche mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchtet ist.
  • Die Tabletten und anderen festen Dosierungsformen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie etwa Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate, können optional eingekerbt oder mit Beschichtungen und Hüllen hergestellt werden, wie etwa enterischen Beschichtungen und anderen Beschichtungen, welche im Bereich der Herstellung von Pharmazeutika wohl bekannt sind. Sie können auch derart formuliert werden, dass sie langsame oder gesteuerte Freisetzung des aktiven Inhaltsstoffs darin bereitstellen, unter Verwendung von beispielsweise Hydroxypropylmethylcellulose in variierenden Anteilen, um das erwünschte Freisetzungsprofil bereitzustellen, anderen Polymermatrizes, Liposomen und/oder Mikrocentrosomen. Sie können sterilisiert werden beispielsweise durch Filtration durch einen Bakterien zurückhaltenden Filter oder durch Einarbeiten von Sterilisierungsmitteln in der Form von sterilen festen Zusammensetzungen, welche in sterilem Wasser aufgelöst werden können oder einem anderen sterilen, injizierbaren Medium, unmittelbar vor Verwendung. Diese Zusammensetzungen können auch optional trübende Mittel enthalten, und sie können von einer derartigen Zusammensetzung sein, dass sie den aktiven Inhaltsstoff bzw. die aktiven Inhaltsstoffe nur oder vorzugsweise in einem bestimmten Abschnitt des gastrointestinalen Trakts, optional in einer verzögerten Art und Weise, freisetzen. Beispiele für einbettende Zusammensetzungen, welche verwendet werden können, umfassen polymere Substanzen und Wachse. Der aktive Inhaltsstoff kann auch in mikro eingekapselter Form vorliegen, geeignetenfalls, mit einem oder mehr der oben beschriebenen Exzipienten.
  • Flüssige Dosierungsformen für orale Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen pharmazeutisch akzeptable Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere. Zusätzlich zu dem aktiven Inhaltsstoff können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel, welche häufig im Fachbereich verwendet werden, enthalten, wie beispielsweise etwa Wasser oder andere Lösungsmittel, solubilisierende Mittel und Emulgatoren, wie etwa Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Öle (insbesondere Baumwollsamen-, Walnuss-, Mais-, Keim-, Oliven-, Rizinus- und Sesamöle), Glycerin, Tetrahydrofurylalkohol, Polyethylenglycole und Fettsäureester von Sorbitan und Gemische davon.
  • Neben inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen auch Hilfsstoffe wie etwa Benetzungsmittel, emulgierende und suspendierende Mittel, süßende, geschmackgebende, farbgebende, parfümierende und konservierende Mittel umfassen.
  • Suspensionen können zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Suspendiermittel enthalten, wie beispielsweise etwa ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylsorbitol und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar Agar und Tragacanth und Gemische davon.
  • Formulierungen der pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung für rektale und vaginale Verabreichung können vorgelegt werden als ein Zäpfchen, welches hergestellt werden kann durch Mischen einer oder mehr der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem oder mehreren geeigneten, nicht reizenden Exzipienten oder Trägern, welche beispielsweise Kakaobutter, Polyethylenglycol, ein Zäpfchenwachs oder ein Salicylat umfassen und wobei das Zäpfchen bei Raumtemperatur fest ist, jedoch flüssig bei Körpertemperatur und daher im Rektum oder der Vaginalhöhle schmelzen und die aktive Verbindung freisetzen wird.
  • Erfindungsgemäße Formulierungen, welche für vaginale Verabreichung geeignet sind, umfassen auch Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Spray-Formulierungen, welche im Fachbereich als geeignet bekannte Träger enthalten.
  • Dosierungsformen für die topische oder transdermale Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung umfassen Pulver, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Lösungen, Pflaster und Inhalationsmittel. Die aktive Verbindung kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und mit jeglichen Konservierungsstoffen, Puffern oder Treibmitteln, welche erforderlich sein können, gemischt werden.
  • Die Salben, Pasten, Cremes und Gele können zusätzlich zu der erfindungsgemäßen aktiven Verbindung Exzipienten, wie etwa tierische und pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragacanth, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talk und Zinkoxid oder Gemische davon enthalten.
  • Pulver und Sprays können zusätzlich zu einer erfindungsgemäßen Verbindung Exzipienten enthalten wie etwa Lactose, Talk, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikate und Polyamidpulver oder Gemische dieser Substanzen. Sprays können zusätzlich übliche Treibmittel enthalten, wie etwa Chlorfluorkohlenwasserstoffe und flüchtige unsubstituierte Kohlenwasserstoffe, wie etwa Butan und Propan.
  • Transdermalpflaster haben den zusätzlichen Vorteil, gesteuerte Abgabe einer erfindungsgemäßen Verbindung an den Körper bereitzustellen. Solche Dosierungsformen können hergestellt werden durch Auflösen oder Dispergieren der Verbindung in dem richtigen Medium. Absorptionsverstärker können ebenfalls verwendet werden, um den Fluß der Verbindung durch die Haut zu erhöhen. Die Rate eines solchen Flusses kann gesteuert werden entweder durch Bereitstellen einer ratensteuernden Membran oder durch Dispergieren der Verbindung in einer Polymermatrix oder einem Gel.
  • Ophthalmische Formulierungen, Augensalben, Pulver, Lösungen und dergleichen sollen ebenfalls in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung, welche für parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen in Kombination mit einer oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen, sterilen, isotonischen, wässrigen oder nicht-wässrigen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen, oder sterilen Pulvern, welche unmittelbar vor Verwendung in sterile injizierbare Lösungen oder Dispersionen rekonstitutiert werden können, welche Antioxidantien, Puffer, Bacteriostatica, gelöste Stoffe, welche die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen, oder suspendierende oder verdickende Mittel enthalten können.
  • Beispiele für geeignete wässrige und nicht-wässrige Träger, welche in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden können, umfassen Wasser, Ethanol, Polyole (wie etwa Glycerin, Propylenglycol, Polyethylenglycol und dergleichen) und geeignete Mischungen davon, pflanzliche Öle, wie etwa Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie etwa Ethyloleat. Geeignete Fluidität kann beispielsweise aufrechterhalten werden durch die Verwendung von Beschichtungsmaterialien, wie etwa Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle von Dispersionen und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen.
  • Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsstoffe wie etwa Konservierungsstoffe, Benetzungsmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel enthalten. Verhinderung der Aktivität von Mikroorganismen auf die fraglichen Verbindungen kann sichergestellt werden durch die Einfügung verschiedener antibakterieller und Antipilz-Mittel, z.B. Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure, und dergleichen. Es kann auch wünschenswert sein, isotonische Mittel wie etwa Zucker, Natriumchlorid und dergleichen in die Zusammensetzungen einzufügen. Zusätzlich kann verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form bewirkt werden durch die Einfügung von Mitteln, welche Absorption verzögern, wie etwa Aluminiummonostearat und Gelatine.
  • Um die Wirkung eines Wirkstoffs zu verlängern, ist es in einigen Fällen wünschenswert, die Absorption des Wirkstoffs von subkutaner oder intramuskulärer Injektion zu verlangsamen. Dies kann erreicht werden durch die Verwendung einer flüssigen Suspension kristallinen oder amorphen Materials mit schlechter Wasserlöslichkeit. Die Absorptionsrate des Wirkstoffs hängt dann von der Rate seiner Auflösung ab, welche wiederum von Kristallgröße und kristalliner Form abhängen kann. Alternativ wird verzögerte Absorption einer parenteral verabreichten Wirkstoffform erreicht durch Auflösen oder Suspendieren des Wirkstoffs in einem Öl-Vehikel.
  • Injizierbare Depotformen werden hergestellt durch Bilden von Mikroeinkapselungsmatrizes der fraglichen Verbindungen in bioabbaubaren Polymeren, wie etwa Polylactid-Polyglycolid. In Abhängigkeit von dem Verhältnis von Wirkstoff zu Polymer und der Natur des besonderen verwendeten Polymers kann die Rate der Wirkstofffreisetzung gesteuert werden. Beispiele für andere bioabbaubare Polymere umfassen Poly(orthoester) und Poly(anhydride). Injizierbare Depotformulierungen werden auch hergestellt durch Einfangen des Wirkstoffs in Liposomen oder Mikroemulsionen, welche mit Körpergewebe kompatibel sind.
  • Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen als Pharmazeutica Menschen und Tieren verabreicht werden, können sie per se gegeben werden oder als eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche beispielsweise 0,1 bis 99,5% (weiter bevorzugt 0,5 bis 90%) an aktivem Inhaltsstoff in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
  • Die Präparationen der vorliegenden Erfindung können oral, parenteral, topisch oder rektal gegeben werden. Sie werden natürlich in Formen gegeben, welche für jeden Verabreichungsweg geeignet sind. Beispielsweise werden sie in Tabletten- oder Kapselform, durch Injektion, Inhalation, Augenlotion, Salbe, Zäpfchen etc. verabreicht, Verabreichung durch Injektion, Infusion oder Inhalation; topisch durch Lotion oder Salbe; und rektal durch Zäpfchen. Orale Verabreichungen sind bevorzugt.
  • Die Ausdrücke "parenterale Verabreichung" und "parenteral verabreicht", wie hierin verwendet, bedeuten Verarbreichungsmodi mit Ausnahme von enteraler und topischer Verabreichung, üblicherweise durch Injektion, und sie umfassen ohne Beschränkung intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrathekale, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutikulare, intraartikulare, subkapusuläre, subarachnoide, intraspinale und intrasternale Injektion und Infusion.
  • Die Ausdrücke "systemische Verabreichung", "systemisch verabreicht", "periphere Verabreichung" und "peripher verabreicht", wie hierin verwendet, bedeuten die Verabreichung einer Verbindung, eines Wirkstoffs oder anderen Materials anders als direkt in das zentrale Nervensystem, derart, dass sie in das System des Patienten eintritt und damit Metabolismus und anderen ähnlichen Prozessen unterworfen ist, beispielsweise subkutane Verabreichung.
  • Diese Verbindungen können Menschen und anderen Tieren zur Therapie über einen jeglichen geeigneten Verabreichungsweg verabreicht werden, einschließlich oral, nasal, wie beispielsweise durch ein Spray, rektal, intravaginal, parenteral, intrazysternär und topisch, wie durch Pulver, Salben oder Tropfen, einschließlich bukkal und sublingual.
  • Unabhängig von dem ausgewählten Verabreichungsweg werden die erfindungsgemäßen Verbindungen, welche in einer geeigneten hydrierten Form verwendet werden können, und/oder die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung in pharmazeutisch akzeptable Dosierungsformen durch herkömmliche, Fachleuten auf diesem Gebiet bekannte Verfahren formuliert.
  • Tatsächliche Dosierungsniveaus der aktiven Inhaltsstoffe in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können variiert werden, um eine Menge des aktiven Inhaltsstoffs zu erhalten, welcher wirksam ist, um die gewünschte therapeutische Reaktion für einen besonderen Patienten, eine besondere Zusammensetzung und einen besonderen Verabreichungsmodus zu erzielen, ohne für den Patienten toxisch zu sein.
  • Das ausgewählte Dosierungsniveau wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich der Aktivität der besonderen erfindungsgemäßen Verbindung, welche verwendet wird, oder des Esters, Salzes oder Amids davon, dem Verabreichungsweg, der Verabreichungszeit, der Ausscheidungsrate der besonderen verwendeten Verbindung, der Behandlungsdauer, anderen Wirkstoffen, Verbindungen und/oder Materialien, welche in Kombination mit der besonderen verwendeten Verbindung verwendet werden, dem Alter, Geschlecht, Gewicht, Zustand, der allgemeinen Gesundheit und vorausgehenden medizinischen Geschichte des behandelten Patienten und ähnlichen im Bereich der Medizin wohl bekannten Faktoren.
  • Ein Arzt oder Tierarzt mit durchschnittlichem Fachwissen kann ohne weiteres die wirksame Menge der erforderlichen pharmazeutischen Zusammensetzung bestimmen und verschreiben. Beispielsweise könnte der Arzt oder Tierarzt mit Dosen der erfindungsgemäßen Verbindungen beginnen, welche in der pharmazeutischen Zusammensetzung in geringeren Gehalten verwendet sind, als sie erforderlich sind, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen, und nach und nach die Dosierung erhöhen, bis die gewünschte Wirkung erreicht wird.
  • Im Allgemeinen ist eine geeignete tägliche Dosis einer erfindungsgemäßen Verbindung die Menge der Verbindung, welches die geringste Dosis darstellt, welche wirksam ist, um eine therapeutische Wirkung hervorzurufen. Eine solche wirksame Dosis hängt allgemein von den oben beschriebenen Faktoren ab. Allgemein liegen intravenöse, intrazerebroventrikulare und subkutane Dosen der erfindungsgemäßen Verbindungen für einen Patienten, wenn sie für die indizierten analgesischen Wirkungen verwendet werden, im Bereich von etwa 0,0001 bis etwa 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag.
  • Wenn gewünscht, kann die wirksame tägliche Dosis der aktiven Verbindung als zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Sub-Dosen verabreicht werden, welche separat in geeigneten Intervallen über den Tag verteilt, optional in Einheitsdosierungsformen, verabreichten werden.
  • Während es möglich ist, dass eine erfindungsgemäße Verbindung allein verabreicht wird, ist es bevorzugt, die Verbindung als eine pharmazeutische Formulierung (Zusammensetzung) zu verabreichen.
  • Unter einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzungen bereit, welche eine therapeutisch wirksame Menge einer oder mehr der fraglichen Verbindungen, wie oben beschrieben, umfassen, formuliert zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern (Additiven) und/oder Verdünnungsmitteln. Wie untenstehend im Detail beschrieben, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung speziell für Verabreichung in fester oder flüssiger Form formuliert werden, einschließlich derer, welche hergerichtet sind für folgendes: (1) orale Verabreichung, z.B. Arzneitränke (wässrige oder nicht-wässrige Lösungen oder Suspensionen), Tabletten, Bolus, Pulver, Granulate, Pasten zur Auftragung auf die Zunge; (2) parenterale Verabreichung, z.B. durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, als beispielsweise eine sterile Lösung oder Suspension; (3) topische Anwendung, z.B. als eine Creme, Salbe oder Spray, welche auf die Haut aufgebracht werden; oder (4) intravaginal oder intrarektal, z.B. als ein Pessar, eine Creme oder ein Schaum.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Verabreichung in einer jeglichen bequemen Art und Weise zur Verwendung in Human- oder Veterinärmedizin formuliert werden, in Analogie zur anderen Pharmazeutika.
  • Der Begriff "Behandlung" soll auch Prophylaxe, Therapie und Heilung umfassen.
  • Der diese Behandlung empfangene Patient ist ein jegliches bedürftiges Tier, einschließlich Primaten, insbesondere Menschen, und anderen Säugetiere, wie etwa Pferden, Rindern, Schweinen und Schafen; und Geflügel und Haustiere im Allgemeinen.
  • Die erfindungsgemäße Verbindung kann als solche oder in Gemischen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern verabreicht werden und kann auch in Verbindung mit antimikrobiellen Mitteln, wie etwa Penicillinen, Cephalosporinen, Aminoglycosiden und Glycopeptiden verabreicht werden. Verbindende Therapie umfasst damit sequentielle, simultane und separate Verabreichung der aktiven Verbindung in einer Art und Weise, dass die therapeutischen Wirkungen der zuerst verabreichten noch nicht ganz abgeklungen sind, wenn die nachfolgende verabreicht wird.
  • Die Zugabe der aktiven erfindungsgemäßen Verbindung zu Tierfutter wird vorzugsweise erreicht durch Herstellen eines geeigneten Futtervorgemischs, welches die aktive Verbindung in einer wirksamen Menge enthält, und Einbringen des Vorgemischs in die gesamte Ration.
  • Alternativ kann ein Zwischenkonzentrat oder Futterzusatz, welches/r den aktiven Inhaltsstoff enthält, in das Futter eingemischt werden. Die Art und Weise, auf welche solche Futtervorgemische und vollständige Rationen hergestellt werden und verabreicht werden können, sind in Nachschlagebüchern beschrieben (wie etwa "Applied Animal Nutrition", W. H. Freedman und CO., San Francisco, USA, 1969 oder "Livestock Feeds and Feeding" O und B books, Corvallis, Ore., USA, 1977).
  • Kombinatorische Bibliotheken
  • In der gegenwärtigen Ära der Wirkstoffentwicklung spielt Hochdurchsatz-Screening von Tausenden bis Millionen von Verbindungen eine Schlüsselrolle. Hochdurchsatz-Screening beinhaltet im Allgemeinen Automatisierung und Robotereinsatz, um zu ermöglichen, dass diese Tausenden bis Millionen von Verbindungen in einem oder mehr Bioassays in einer relativ kurzen Zeitperiode getestet werden. Diese Screening-Technik hoher Kapazität erfordert enorme Mengen an "Rohmaterialien" mit immenser molekularer Vielfalt, um zur Verfügung stehende Kapazität zu füllen. Demgemäss wird kombinatorische Chemie eine bedeutende Rolle dabei spielen, diese Anforderung für neue Moleküle zum Screenen zu erfüllen. Wenn einmal "Leads" unter Verwendung von Hochdurchsatz-Screening-Techniken identifiziert sind, wird kombinatorische Chemie vorteilhaft verwendet, um diese anfänglichen Leads zu optimieren (welche Analoge/Varianten in dem gleichen Hochdurchsatz-Screening-Assay getestet werden, welches das anfängliche Lead identifiziert hat).
  • Eine kombinatorische Bibliothek für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein Gemisch von chemisch verwandten Verbindungen, welche zusammen auf eine gewünschte Eigenschaft hin gescreent werden können; diese Bibliotheken können in Lösung oder kovalent an einen festen Träger gekoppelt sein. Die Herstellung von vielen verwandten Verbindungen in einer einzelnen Reaktion verringert und vereinfacht die Anzahl von Screening- Prozessen, welche ausgeführt werden müssen, sehr stark. Screening im Hinblick auf die geeignete biologische, pharmazeutische, agrochemische oder physikalische Eigenschaft kann mittels herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden.
  • Vielfalt in einer Bibliothek kann auf einer Vielzahl von unterschiedlichen Niveaus erzeugt werden. Beispielsweise können die Substrat-Arylgruppen, welche in einer kombinatorischen Herangehensweise verwendet werden, hinsichtlich der Kern-Arylgruppe vielfältig sein, z.B. eine Variation in Bezug auf die Ringstruktur, und/oder sie können bezüglich der anderen Substituenten variieren.
  • Eine Vielzahl von Techniken ist im Fachbereich erhältlich zum Erzeugen kombinatorischer Bibliotheken kleiner organischer Moleküle. Siehe beispielsweise Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14: 83; die Affymax U.S. Patente 5,359,115 und 5,362,899; das Ellman U.S. Patent 5,288,514; die Still et al. PCT-Veröffentlichung WO 94/08051; Chen et al. (1994) JACS 116: 2661; Kerr et al. (1993) JACS 115: 252; PCT-Veröffentlichungen WO 92/10092, WO 93/09668 und WO 91/07087; und die Lerner et al. PCT-Veröffentlichung WO 93/20242). Demgemäss kann eine Vielzahl von Bibliotheken im Bereich von etwa 16 bis 1.000.000 oder mehr Diversomeren synthetisiert und auf eine besondere Aktivität oder Eigenschaft hin gescreent werden.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform kann eine Bibliothek substituierter Diversomere synthetisiert werden unter Verwendung der in Frage stehenden Reaktionen, welche angepasst sind an die Techniken, welche in der Still et al. PCT-Veröffentlichung WO 94/08051 beschrieben sind, z.B. Anknüpfung an ein Polymerkügelchen durch eine hydrolysierbare oder photolysierbare Gruppe, z.B. angeordnet an einer der Substratpositionen. Gemäß der Still et al. Technik ist die Bibliothek auf einem Satz von Kügelchen synthetisiert, wobei jedes Kügelchen einen Satz von Tags (Anhängseln) umfasst, welcher das besondere Diversomer auf dem Kügelchen identifiziert. In einer Ausführungsform, welche besonders geeignet ist zur Entdeckung von Enzyminhibitoren, können die Kügelchen auf der Oberfläche einer permeablen Membran verteilt werden und die Diversomere von dem Kügelchen durch Lyse des Kügelchen-Linkers freigesetzt werden. Das Diversomer von jedem Kügelchen wird durch die Membran hin zu einer Assayzone diffundieren, wo es mit einem Enzymassay wechselwirken wird. Detaillierte Beschreibungen einer Anzahl von kombinatorischen Methodologien sind nachfolgend bereitgestellt.
  • A) Direkte Charakterisierung
  • Ein wachsender Trend auf dem Gebiet kombinatorischer Chemie besteht im Ausnutzen der Empfindlichkeit von Techniken wie beispielsweise etwa Massenspektrometrie (MS), welche verwendet werden können, um sub-femtomolare Mengen einer Verbindung zu charakterisieren und die chemische Konstitution einer aus einer kombinatorischen Bibliothek ausgewählten Verbindung direkt zu bestimmen. Z.B. können, wenn die Bibliothek auf einer unlöslichen Trägermatrix bereitgestellt ist, diskrete Populationen von Verbindungen als erstes von dem Träger freigesetzt und mittels MS charakterisiert werden. In anderen Ausführungsformen können als Teil der MS-Probenvorbereitungstechnik MS-Techniken wie MALDI verwendet werden, um eine Verbindung von der Matrix zu befreien, insbesondere dort, wo ursprünglich eine labile Bindung verwendet wird, um die Verbindung an die Matrix zu binden. Z.B. kann ein aus einer Bibliothek ausgewähltes Kügelchen in einem MALDI-Schritt bestrahlt werden, um das Diversomer aus der Matrix zu befreien und um das Diversomer für die MS-Analyse zu ionisieren.
  • B) Multipin-Synthese
  • Die Bibliotheken des fraglichen Verfahrens können Multipin-Bibliothek-Format annehmen. Kurz gefasst haben Geysen und Mitarbeiter (Geysen et al. (1984) PNAS 81: 3998–4002) ein Verfahren eingeführt zum Herstellen von Verbindungsbibliotheken durch eine parallele Synthese auf Polyacrylsäure-gerasterten Polyethylen-Stiften, welche im Mikrotiterplattenformat angeordnet sind. Die Geysen-Technik kann verwendet werden, um Tausende von Verbindungen pro Woche zu synthetisieren und zu screenen, unter Verwendung des Multipin-Verfahrens, und die gebundenen Verbindungen können in vielen Assays wieder verwendet werden. Es können auch geeignete Linker-Gruppen an die Stifte angegliedert werden, so dass die Verbindungen nach Synthese von den Trägern zum Untersuchen von Reinheit und zur weiteren Evaluierung abgespalten werden können (c.f., Bray et al. (1990) Tetrahedron Lett 31: 5811–5814; Valerio et al. (1991) Anal Biochem 197: 168–177; Bray et al. (1991) Tetrahedron Lett 32: 6163–6166).
  • C) Teilen-Koppeln-Rekombinieren
  • In einer weiteren Ausführungsform kann eine abgewandelte Verbindungsbibliothek auf einem Satz von Kügelchen unter Verwendung der Strategie des Teilen-Koppeln-Rekombinierens bereitgestellt werden (siehe z.B. Houghten (1985) PNAS 82: 5131–5134 und U.S. Patente 4,631,2111 5,440,016; 5,480,971). Kurz gesagt, wie der Name bereits impliziert, werden bei jedem Syntheseschritt, bei welchem Degenerierung in die Bibliothek eingeführt wird, die Kügelchen in separate Gruppen eingeteilt, welche gleich sind zu der Anzahl von verschiedenen Substituenten, welche an einer bestimmten Position in der Bibliothek zugefügt werden sollen, wobei die verschiedenen Substituenten in separaten Reaktionen gekoppelt werden, und die Kügelchen in einen Pool für die nächste Iteration rekombiniert werden.
  • In einer Ausführungsform kann die Teilen-Koppeln-Rekombinieren-Strategie ausgeführt werden unter Verwendung eines analogen Ansatzes zu der sogenannten "Teebeutel"-Methode, welche zuerst von Houghten entwickelt wurde, wobei die Verbindungssynthese auf Harz stattfindet, welches in porösen Polypropylenbeuteln versiegelt ist (Houghten et al. (1986) PNAS 82: 5131–5135). Substituenten werden an die Verbindungs-tragenden Harze gekoppelt durch Plazieren der Beutel in geeigneten Reaktionslösungen, während alle gemeinsamen Schritte, wie etwa Harzwaschen und Schutzgruppenentfernung simultan in einem Reaktionsbehälter ausgeführt werden. Am Ende der Synthese enthält jeder Beutel eine einzelne Verbindung.
  • D) Kombinatorische Bibliotheken durch licht-geleitete, räumlich adressierbare parallele chemische Synthese
  • Ein Modell einer kombinatorischer Synthese, bei welcher die Identität einer Verbindung durch ihre Anordnung auf einem Synthesesubstrat gegeben ist, wird als räumlich adressierbare Synthese bezeichnet. In einer Ausführungsform wird der kombinatorische Prozess durchgeführt durch Steuerung der Addition eines chemischen Reagenzes an spezifische Orte auf einem festen Träger (Dower et al. (1991) Annu Rep Med Chem 26: 271–280; Fodor, S. P. A. (1991) Science 251: 767; Pirrung et al. (1992) U.S. Patent 5,143,854; Jacobs et al. (1994) Trends Biotechnol 12: 19–26). Die räumliche Auflösung der Photolithographie ermöglicht Miniaturisierung. Diese Technik kann mit Hilfe der Verwendung von Schutz-/Schutzgruppen-Entfernungsreaktionen mit photolabilen Schutzgruppen durchgeführt werden.
  • Die Schlüsselpunkte dieser Technologie sind aufgezeigt in Gallop et al. (1994) J Med Chem 37: 1233–1251. Ein Synthesesubstrat wird durch die kovalente Anbindung von photolabilen Nitroveratryloxycarbonyl(NVOC)-geschützten Amino-Linkern oder anderen photolabilen Linkern für die Kopplung hergestellt. Licht wird verwendet, um selektiv eine spezifische Reaktion des Syntheseträgers zum Koppeln zu aktivieren. Entfernen der photolabilen Schutzgruppen durch Licht (Schutzgruppenentfernung) führt zur Aktivierung von ausgewählten Gegenden. Nach Aktivierung wird das erste eines Satzes von Aminosäureanalogen, von denen jedes eine photolabile Schutzgruppe am Aminoterminus trägt, der gesamten Oberfläche ausgesetzt. Kopplung findet nur in Regionen statt, welche im vorangehenden Schritt Licht ausgesetzt wurden. Die Reaktion wird gestoppt, die Platten gewaschen und das Substrat wieder durch eine zweite Maske beleuchtet, wodurch eine unterschiedliche Region zur Reaktion mit einem zweiten geschützten Baublock aktiviert wird. Das Muster von Masken und die Reihenfolge von Reaktanden definieren die Produkte und ihre Orte. Da dieser Prozess photolithographische Techniken einsetzt, ist die Anzahl von Verbindungen, die synthetisiert werden können, lediglich durch die Anzahl von Synthesestellen begrenzt, welche mit geeigneter Auflösung adressiert werden können. Die Position jeder Verbindung ist präzise bekannt; daher können ihre Wechselwirkungen mit anderen Molekülen direkt untersucht werden.
  • In einer licht-gesteuerten chemischen Synthese hängen die Produkte von dem Muster der Beleuchtung und von der Reihenfolge der Addition von Reaktanden ab. Durch Variation der lithographischen Muster können viele verschiedene Sätze von Testverbindungen simultan synthetisiert werden; dieses Charakteristikum führt zu der Erzeugung von vielen verschiedenen Maskierungsstrategien.
  • E) Kodierte kombinatorische Bibliotheken
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das in Frage stehende Verfahren eine Verbindungsbibliothek verwenden, welche mit einem kodierten Tag-System ausgestattet ist. Eine neuere Verbesserung bei der Identifizierung von aktiven Verbindungen aus kombinatorischen Bibliotheken verwendet chemische Indexsysteme, welche Tags verwenden, welche die Reaktionsschritte, welche ein gegebenes Kügelchen durchlaufen hat, einzigartig kodieren und durch Rückschluss die Struktur, die es trägt. Konzeptuell ahmt dieser Ansatz Phagen-Display-Bibliotheken nach, bei denen Aktivität sich von exprimierten Peptiden ableitet, aber die Strukturen der aktiven Peptide von der korrespondierenden Genom-DNA-Sequenz abgeleitet werden. Die erste Kodierung von synthetischen kombinatorischen Bibliotheken verwendeten DNA als den Code. Eine Vielzahl anderer Formen der Kodierung sind berichtet worden, einschließlich Kodierung mit sequenzierbaren Bio-Oligomeren (z.B. Oligonucleotiden und Peptiden) und binärem Kodieren mit zusätzlichen nicht-sequenzierbaren Tags.
  • 1) Tagging mit sequenzierbaren Bio-Oligomeren
  • Das Prinzip der Verwendung von Oligonucleotiden zum Kodieren kombinatorischer synthetischer Bibliotheken wurde 1992 beschrieben (Brenner et al. (1992) PNAS 89: 5381–5383), und ein Beispiel für eine solche Bibliothek erschien im folgenden Jahr (Needles et al. (1993) PNAS 90: 10700–10704). Eine kombinatorische Bibliothek von nominal 77 (= 823.543) Peptiden, bestehend aus allen Kombinationen von Arg, Gln, Phe, Lys, Val, D-Val und Thr (Drei-Buchstaben-Aminosäurecode), von denen jedes durch ein spezifisches Dinucleotid (TA, TC, CT, AT, TT, CA bzw. AC) kodiert war, wurde durch eine Serie von alternierenden Runden von Peptid- und Oligonucleotid-Synthese auf festem Träger hergestellt. In dieser Arbeit wurde die Amin-bindende Funktionalität auf dem Kügelchen speziell für Peptid- oder Oligonucleotid-Synthese differenziert durch simultanes Vor-Inkubieren der Kügelchen mit Reagenzien, welche geschützte OH-Gruppen für die Oligonucleotidsynthese und geschützte NH2-Gruppen für die Peptidsynthese erzeugen (hier in einem Verhältnis von 1:20). Nach Beendigung bestand jeder Tag aus 69-meren, von denen 14 Einheiten den Code trugen. Die Kügelchen-gebundene Bibliothek wurde mit einem fluoreszierend markierten Antikörper inkubiert, und die Kügelchen, welche gebundene Antikörper enthielten und stark fluoreszierten, wurden mittels Fluoreszenz-aktiviertem Zellensortieren (FACS) geerntet. Die DNA-Tags wurden mittels PCR amplifiziert und sequenziert, und die vorhergesagten Peptide wurden synthetisiert. Gemäß solchen Techniken können Verbindungsbibliotheken zur Verwendung in dem in Frage stehenden Verfahren abgeleitet werden, wo die Oligonucleotid-Sequenz des Tags die aufeinanderfolgenden kombinatorischen Reaktionen identifizieren, welche ein besonderes Kügelchen durchlief, und daher die Identität der Verbindung auf dem Kügelchen liefert.
  • Die Verwendung von Oligonucleotid-Tags erlaubt besonders empfindliche Tag-Analyse. Dennoch erfordert das Verfahren sorgfältige Auswahl von orthogonalen Sätzen von Schutzgruppen, welche erforderlich sind zum Alternieren von Co-Synthese des Tags und des Bibliothekmitglieds. Darüber hinaus kann die chemische Labilität des Tags, insbesondere der Phosphat- und Zucker-Anomeren-Verknüpfungen, die Auswahl an Reagenzien und Bedingungen limitieren, welche für die Synthese von nicht-oligomeren Bibliotheken verwendet werden können. In bestimmten Ausführungsformen verwenden die Bibliotheken Linker, welche selektives Entfernen des Testverbindungsbibliotheksmitglieds für Assay erlauben.
  • Peptide sind ebenfalls verwendet worden zum Taggen von Molekülen für kombinatorische Bibliotheken. Zwei beispielhafte Ansätze sind im Fachbereich beschrieben, von welchen beide verzweigte Linker an fester Phase verwenden, an welchen Kodierungs- und Liganden-Stränge alternierend ausgearbeitet werden. In dem ersten Ansatz (Kerr JM et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 2529–2531) wird Orthogonalität bei der Synthese erreicht durch Verwendung von Säure-labilem Schutz für den kodierenden Strang und Basen-labilem Schutz für den Verbindungsstrang.
  • In einem alternativen Ansatz (Nikolaiev et al. (1993) Pept. Res. 6: 161–170) werden verzweigte Linker verwendet, so dass die kodierende Einheit und die Testverbindung beide an die gleiche funktionelle Gruppe auf dem Harz gebunden werden können. In einer Ausführungsform kann ein spaltbarer Linker zwischen den Verzweigungspunkt und das Kügelchen platziert werden, so dass Spaltung ein Molekül freisetzt, welches sowohl Codes als auch die Verbindung enthält (Ptek et al. (1991) Tetrahedron Lett 32: 3891–3894). In einer weiteren Ausführungsform kann der spaltbare Linker derart platziert werden, dass die Testverbindung selektiv von dem Kügelchen getrennt werden kann, und so den Code zurücklässt. Das letzte Konstrukt ist besonders wertvoll, da es Screenen der Testverbindung ohne potentielle Interferenz der kodierenden Gruppen erlaubt. Beispiele auf diesem Gebiet von unabhängiger Spaltung und Sequenzierung von Peptid-Bibliotheksmitgliedern und ihren entsprechenden Tags hat bestätigt, dass die Tags die Peptidstruktur genau vorhersagen können.
  • 2) Nicht-sequenzierbares Tagging: Binäres Kodieren
  • Eine alternative Form der Kodierung der Testverbindungsbibliothek verwendet einen Satz von nicht-sequenzierbaren elektrophoren Tagging-Molekülen, welche als ein binärer Code verwendet werden (Ohlmeyer et al. (1993) PNAS 90: 10922–10926). Beispiele für Tags sind halogenaromatische Alkylether, welche als ihre Trimethylsilylether, welche in kleiner als femtomolaren Konzentrationen durch Elektroneneinfanggaschromatographie (electron capture gas chromatography ECGC)) detektierbar sind. Variationen in der Länge der Alkylkette sowie der Natur und Position der Halogen-Aromaten-Substituenten erlauben die Synthese von wenigstens 40 solcher Tags, welche prinzipiell 240 (z.B. mehr als 1012) verschiedene Moleküle kodieren können. In dem ursprünglichen Bericht (Ohlmeyer et al., supra) wurden die Tags an etwa 1% der zur Verfügung stehenden Amingruppen einer Peptidbibliothek über einen photospaltbaren o-Nitrobenzyl-Linker gebunden. Dieser Ansatz ist bequem, wenn kombinatorische Bibliotheken von Peptid-ähnlichen oder anderen Amin-enthaltenden Molekülen hergestellt werden. Ein vielfältigeres System ist jedoch entwickelt worden, welches Kodierung von im wesentlichen einer jeglichen kombinatorischen Bibliothek erlaubt. Hier wird die Verbindung über den photospaltbaren Linker an den festen Träger gebunden, und der Tag wird über einen Catecholether-Linker über Carben-Insertion an die Kügelchenmatrix gebunden (Nestler et al. (1994) J. Org. Chem. 59: 4723–4724). Diese orthogonale Befestigungsstrategie erlaubt die selektive Entfernung von Bibliotheksmitgliedern zum Assay in Lösung und nachfolgendes Dekodieren durch ECGC nach oxidativem Entfernen des Tag-Satzes.
  • Obwohl mehrere Amid-verknüpfte Bibliotheken im Fachbereich binäres Kodieren verwenden, wobei die elektrophoren Tags an Amin-Gruppen gebunden sind, stellt Binden dieser Tags direkt an die Kügelchenmatrix weitaus größere Vielfalt bei den Strukturen bereit, welche in kodierten kombinatorischen Bibliotheken hergestellt werden können. Auf diese Art und Weise gebunden sind die Tags und ihr Linker fast so unreaktiv wie die Kügelchenmatrix selbst. Zwei binär kodierte kombinatorische Bibliotheken sind veröffentlicht worden, in denen die elektrophoren Tags direkt an die feste Phase gebunden sind (Ohlmeyer et al. (1995) PNAS 92: 6027–6031), und sie liefern eine Richtlinie zum Erzeugen der in Frage stehenden Verbindungsbibliothek. Beide Bibliotheken wurden unter Verwendung einer orthogonalen Bindungsstrategie konstruiert, bei welcher das Bibliotheksmitglied durch einen photolabilen Linker an den festen Träger gebunden war und die Tags über einen nur durch starke Oxidation spaltbaren Linker gebunden waren. Da die Bibliotheksmitglieder wiederholt partiell von dem festen Träger photoeluiert werden können, können Bibliotheksmitglieder in vielen Assays verwendet werden. Sukzessive Photoelution erlaubt auch eine iterative Screening-Strategie mit sehr hohem Durchsatz: Als Erstes werden viele Kügelchen in 96-Well-Microtiter-Platten platziert; als Zweites werden Verbindungen partiell entfernt und auf Assay-Platten transferiert; als Drittes identifiziert ein Metallbindungsassay die aktiven Wells; als Viertes werden die entsprechenden Kügelchen einzeln auf neue Microtiter-Platten Array-mäßig angeordnet; als Fünftes werden einzelne aktive Verbindungen identifiziert; und als Sechstes werden die Strukturen dekodiert.
  • Beispiele
  • Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben ist, wird sie leichter durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verstanden, welche lediglich zu Zwecken der Veranschaulichung bestimmter Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beigefügt sind und die Erfindung nicht einschränken sollen.
  • Allgemeine, in den Beispielen verwendete Verfahren
  • NMR-Spektren wurden bei Protonenfrequenzen von 270 und 300 MHz aufgenommen, unter Verwendung von CDCl3 als Lösungsmittel, soweit nicht anders angegeben. 1H chemische Verschiebungen werden relativ zu Me4Si ("TMS"; δ = 0,00 ppm) oder CHCl3 (δ = 7,26 ppm) als interne Standards berichtet; 31P chemische Verschiebungen sind relativ zu externer wässriger 85% H3PO4 (δ = 0,00 ppm); und 13C chemische Verschiebungen sind relativ zu CHCl3 (δ = 77,00 ppm) oder TMS (δ = 0,00 ppm) als internen Standards. Massenspektren wurden im Elektronen-Stoß-Ionisierungs-Modus bei 70 eV aufgenommen. Optische Rotationen wurden bei Raumtemperatur gemessen.
  • Beispiel 1 Synthese von racemischem Diester 2
    Figure 00780001
  • Trockenes Natriumhypophosphit (hergestellt aus Natriumhydrophosphitmonohydrat durch azeotrope Destillation mit Toluol in vacuo bei 50°C) (940 mg, 10,8 mmol) wurde in 60 mL trockenem CH2Cl2 suspendiert und auf 0°C abgekühlt, dann wurden Triethylamin (2,50 mL, 18,9 mmol) und Chlortrimethylsilan (2,32 mL, 18,4 mmol) zugegeben. Nach 5 Minuten wurde Verbindung I (500 mg, 1,54 mmol) in 5 mL trockenem CH2Cl2 zugegeben. Das Gemisch wurde bei RT 24 h lang gerührt, bevor 1 N HCl (20 mL) zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH2Cl2 (3 × 40 mL) extrahiert, und die vereinigten organischen Phasen getrocknet (MgSO4). Nach Aufkonzentrierung wurde der Rückstand in 6 mL trockenem CH2Cl2 und 0,6 mL Pyridin gelöst und auf 0°C abgekühlt, dann wurde Trimethylacetylchlorid (0,3 mL, 2,25 mmol) zugegeben, gefolgt von Benzylalkohol (0,21 mL, 1,8 mmol). Das Gemisch wurde bei 0°C bis RT 2 h lang gerührt, dann mit Ether verdünnt. Die organische Lage wurde mit 1 N HCl (10 mL), H2O (10 mL) und Salzlösung (10 mL) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und auf konzentriert. Flash-Chromatographie über Silicagel mit CHCl3-MeOH (30:1) als Eluent ergab racemische Verbindung II (657 mg, 89%) als ein farbloses Öl: 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,22 (d, JH,P = 555 Hz, 0,6H), 7,19 (d, JH,P = 550 Hz, 0,4H), 7,39–7,34 (m, 15H), 5,15–4,95 (m, 6H), 2,98 (m, 1H), 2,47–2,17 (m, 3H), 2,14–1,79 (m, 3H); 31P NMR (CDCl3, 121 MHz) δ 36,06, 35,08; 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 173,46, 173,39, 172,13, 135,70, 135,30, 128,73, 128,60, 128,58, 128,53, 128,46, 128,43, 128,38, 128,33, 128,26, 128,20, 67,88, 67,79, 67,07, 66,99, 66,46, 38,05, 38,02, 31,25, 30,02, 28,29, 28,13.
  • Beispiel 2 Synthese von racemischem Tetraester 3
    Figure 00790001
  • Zu einer Lösung von II (210 mg, 0,44 mmol) in 5 mL trockenem THF wurde Natriumhydrid (15 mg, 60% Dispersion in Öl, 0,44 mmol) zugegeben, gefolgt von Verbindung I (140 mg, 0,44 mmol) bei 0°C, und das Gemisch wurde bei RT 2 h lang gerührt, bevor 1 N HCl zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH2Cl2 extrahiert (3 × 20 ml). Die vereinigten organischen Lagen wurden getrocknet (MgSO4) und auf konzentriert. Flash-Chromatographie über Silicagel mit Ethylacetat-Hexanen (1:1) als Eluent ergab Verbindung 3 (45 mg, 13%) als ein farbloses Öl: 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,34–7,27 (m, 25H), 5,06–4,89 (m, 10H), 2,83 (m, 2H), 2,33–2,14 (m, 6H), 2,00–1,60 (m, 6H); 31P NMR (CDCl3, 121 MHz) δ –28,51, –28,90, –29,34; 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 173,80, 172,19, 136,27, 135,78, 135,50, 128,60, 128,56, 128,42, 128,33, 128,28, 128,24, 128,19, 128,14, 66,91, 66,87, 66,80, 66,37, 66,10, 66,02, 38,65, 38,51, 31,71, 30,32, 31,24, 30,67, 30,57, 30,04, 28,85, 28,69.
  • Beispiel 3 Synthese von racemischer Tetrasäure FN-6
    Figure 00800001
  • Zu einer Lösung von 3 (42 mg, 0,52 mmol) in tert-Butanol wurden 30 mg 20% Pd(OH)2/C (Aldrich, ≤ 50% H2O) zugegeben, und dann wurde das Gemisch unter 70 psi Wasserstoff 24 h lang hydriert. Der Katalysator wurde mittels Filtration durch Celit entfernt, und das Filtrat auf konzentriert. Der Rückstand wurde in 5 ml Wasser gelöst und lyophilisiert, um 17 mg (92%) FN-6 als einen weißen Feststoff zu ergeben: 1H NMR (D2O, 300 MHz) δ 2,77 (m, 2H), 2,44 (t, J = 7,3 Hz, 4H), 2,20 (dt, J = 13,2, 11,3 Hz, 2H), 2,00–1,82 (m, 6H); 31P NMR (D2O, 121 MHz) 6 –33,12; 13C NMR (D2O, 75 MHz) δ 179,69, 179,61, 178,61, 39,89, 32,70, 32,28, 31,49, 29,68, 29,58, 29,52, 29,42.
  • Beispiel 4 Synthese von Diester 5
    Figure 00810001
  • Verbindung 4 (130 mg, 0,33 mmol) wurde in 2 mL trockenem CH2Cl2 und 0,2 mL Pyridin gelöst und auf 0°C abgekühlt, dann wurde Trimethylacetylchlorid (80 μL, 0,6 mmol) zugegeben, gefolgt von (R)-(+)-1-Phenyl-1-butanol (65 mg, 0,44 mmol). Das Gemisch wurde bei 0°C bis RT 2 h lang gerührt, dann mit Ether verdünnt, und das Reaktionsgemisch wurde mit 1 N HCl (10 mL), H2O (10 mL), und Salzlösung (10 mL) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und auf konzentriert. Flash-Chromatographie über Silicagel mit CHCl3-MeOH (30:1) als Eluent ergab 5 (164 mg, 94%) als ein Gemisch von 4 Diastereomeren. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,45–7,28 (m, 15H), 7,26 (d, JH,P = 558 Hz, 0,24H), 7,23 (d, JH,P = 554 Hz, 0,16H), 6,91 (d, JH,P = 552 Hz, 0,60H), 5,37–5,24 (m, 1H), 5,17–5,03 (m, 4H), 3,05–2,68 (m, 1H), 2,56–1,60 (m, 8H), 1,50–1,20 (m, 2H), 0,98–0,91 (m, 3H); 31P NMR (CDCl3, 121 MHz) δ 34,88, 34,10, 32,22, 31,32.
  • Beispiel 5 Synthese von Tetraestern 6
    Figure 00820001
  • Zu einer Lösung von 5 (220 mg, 0,44 mmol) in 5 mL trockenem THF wurde Natriumhydrid (15 mg, 60% Dispersion in Öl, 0,44 mmol) zugegeben, gefolgt von Verbindung 1 (See Beispiel 1; 140 mg, 0,44 mmol) bei 0°C, und das Gemisch wurde bei RT 2 h lang gerührt. 1 N HCl wurde zugegeben und das Gemisch mit CH2Cl2 extrahiert (3 × 20 mL). Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (MgSO4) und auf konzentriert. Flash-Chromatographie über Silicagel mit CHCl3-MeOH (30:1) als Eluent ergab eine Gemisch von 4 Isomeren (110 mg, 27%). 31P NMR zeigte 4 Peaks: δ –29.91, –30.21, –30.37, and –30.66. Sorgsame präparative TLC-Trennung (Ethylacetat-Hexane 2:3) ergab homogene Verbindungen 6a–d.
    6a: Rf 0.60 (Ethylacetat-Hexane 1:1); [α]D +12.1° (c 0,7, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,37–7,28 (m, 25H), 5,30 (dt, J = 8,7, 7,2 Hz, 1H), 5,20–4,97 (m, 8H), 2,91 (m, 1H), 2,56 (m, 1H), 2,39–2,22 (m, 3H), 2,10–1,60 (m, 11H), 1,35–1,09 (m, 2H), 0,87 (t, J = 7,2 Hz, 3H); 31P NMR (CDCl3, 121 MHz) δ –29,90; 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 173,93, 173,86, 173,78, 173,70, 172,23, 172,12, 140,98, 135,78, 135,55, 128,59, 128,51, 128,46, 128,25, 128,23, 128,17, 126,55, 77,19, 77,10, 66,82, 66,76, 66,31, 66,23, 40,45, 40,38, 38,67, 38,63, 38,59, 38,56, 32,18, 31,30, 31,09, 30,93, 30,11, 29,66, 28,84, 28,69, 28,64, 28,48, 18,58, 13,68.
    6b: Rf 0,58 (Ethylacetat-Hexane 1:1); [α]D +12,9° (c 0,35, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,37–7,28 (m, 25H), 5,30 (dt, J = 9,0, 6,6 Hz, 1H), 5,21–4,99 (m, 8H), 2,99 (m, 1H), 2,55 (m, 1H), 2,41–2,20 (m, 3H), 2,10–1,62 (m, 11H), 1,40–1,20 (m, 2H), 0,86 (t, J = 7,2 Hz, 3H); 31P NMR (CDCl3, 121 MHz) δ –30,32; 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 173,94, 173,90, 173,87, 173,81, 172,25, 172,15, 141,01, 135,82, 135,58, 135,52, 128,62, 128,57, 128,54, 128,49, 128,32, 128,28, 128,26, 128,24, 128,22, 128,21, 128,19, 126,58, 77,20, 77,16, 66,82, 66,79, 66,33, 66,25, 40,44, 40,37, 38,70, 38,67, 38,43, 38,38, 32,25, 31,90, 31,34, 31,13, 31,00, 30,75, 29,70, 28,81, 28,67, 28,53, 28,38, 18,55, 13,71.
    6c: Rf 0,57 (Ethylacetat-Hexane 1:1); [α]D 0° (c 0,42, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,35–7,20 (m, 25H), 5,29 (dt, J = 9,3, 6,9 Hz, 1H), 5,17–4,94 (m, 8H), 2,91 (m, 1H), 2,45–2,25 (m, 3H), 2,20–1,20 (m, 14H), 0,84 (t, J = 7,5 Hz, 3H); 31P NMR (CDCl3, 121 MHz) δ –30,11; 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 173,84, 173,74, 173,70, 173,62, 172,25, 172,10, 140,84, 135,80, 135,60, 135,49, 128,62, 128,53, 128,41, 128,32, 128,24, 128,21, 126,68, 77,24, 77,15, 66,87, 66,79, 66,33, 66,25, 40,27, 40,21, 38,86, 38,83, 38,46, 38,41, 31,95, 31,62, 31,30, 31,19, 30,80, 30,39, 29,70, 28,64, 28,53, 28,48, 28,40, 18,63, 13,73.
    6d: Rf 0,55 (Ethylacetat-Hexane 1:1); [α]D –2,8° (c 0,42, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,41–7,20 (m, 25H), 5,31 (dt, J = 9,3, 6,9 Hz, 1H), 5,23–4,98 (m, 8H), 2,97 (m, 1H), 2,50–2,17 (m, 4H), 2,15–1,82 (m, 6H), 1,80–1,50 (m, 5H), 1,45–1,20 (m, 2H), 0,85 (t, J = 7,2 Hz, 3H); 31P NMR (CDCl3, 121 MHz) δ –30,57; 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 173,77, 173,70, 173,66, 173,59, 172,18, 172,06, 140,81, 135,77, 135,50, 135,46, 128,59, 128,53, 128,51, 128,41, 128,30, 128,23, 128,19, 126,58, 77,16, 77,05, 66,82, 66,31, 66,24, 40,29, 40,23, 38,79, 38,30, 38,24, 31,96, 31,44, 31,34, 31,14, 30,81, 30,20, 28,95, 28,80, 28,69, 28,53, 18,54, 13,69.
  • Beispiel 6 Synthese von optisch reinen Stereoisomeren von Tetrasäure FN-6(F)
    Figure 00840001
  • Das oben für die Synthese von FN-6(F) umrissene Syntheseverfahren (siehe Beispiel 3) wurde für die Herstellung von optisch reinen Stereoisomeren FN-6a–d verwendet.
    FN-6a (Ausbeute 94%): weißer Feststoff; 1H NMR (D20, 300 MHz) δ 2,76 (m, 2H), 2,45 (t, J = 7,5 Hz, 4H), 2,14 (dt, J = 12,9, 9,6 Hz, 2H), 2,00–1,89 (m, 4H), 1,83 (dt, J = 14,4, 4,2 Hz, 2H); 31P NMR (D2O, 121 MHz) δ –37,63; 13C NMR (D2O, 75 MHz) δ 179,95, 178,74, 40,16, 32,55 (d, J1,P = 90,23 Hz), 32,38, 29,67 (d, J3,P = 11,48 Hz).
    FN-6b (Ausbeute 96%): weißer Feststoff; 1H NMR (D20, 300 MHz) δ 2,76 (m, 2H), 2,45 (t, J = 7,8 Hz, 4H), 2,13 (dt, J = 12,6, 10,5 Hz, 2H), 2,04–1,89 (m, 4H), 1,83 (dt, J = 15,0, 4,2 Hz, 2H); 31P NMR (D2O, 121 MHz) δ –36,42; 13C NMR (D2O, 75 MHz) δ 180,07, 178,76, 40,10, 32,67 (d, J1,P = 90,75 Hz), 32,40, 29,57 (d, J3,P = 11,25 Hz).
    FN-6c (Ausbeute 99%): weißer Feststoff; 1H NMR (D20, 300 MHz) δ 2,76 (m, 2H), 2,45 (t, J = 7,5 Hz, 4H), 2,09 (dt, J = 12,6, 9,0 Hz, 2H), 2,04–1,88 (m, 4H), 1,79 (dt, J = 15,0, 4,2 Hz, 2H); 31P NMR (D2O, 121 MHz) δ –37,96; 13C NMR (D2O, 75 MHz) δ 179,88, 178,72, 40,13, 32,46 (d, J1,P = 90,75 Hz), 32,36, 29,66 (d, J3,P = 12 Hz).
    FN-6d (Ausbeute 96%): weißer Feststoff; 1H NMR (D20, 300 MHz) δ 2,76 (m, 2H), 2,45 (t, J = 7,5 Hz, 4H), 2,14 (dt, J = 13,2, 9,6 Hz, 2H), 2,00–1,86 (m, 4H), 1,85 (dt, J = 14,7, 3,6 Hz, 2H); 31P NMR (D2O, 121 MHz) δ –35,56; 13C NMR (D2O, 75 MHz) δ 179,88, 178,72, 40,13, 32,46 (d, J1,P = 90,75 Hz), 32,37, 29,66 (d, J3,P = 12 Hz),
  • Beispiel 7
    Figure 00860001
  • Zu einer Lösung von 4 (400 mg, 1,23 mmol) in Nitromethan wurden 0,1 mL Triton B (40% Lösung in Methanol) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 5 h lang gerührt. Das Nitromethan wurde bei vermindertem Druck entfernt. Flash-Chromatographie über Silicagel mit Ethylacetat-Hexanen (8:1 bis 3:1) als Eluent ergab Verbindungen 5 (200 mg, 42%) und 6 (150 mg, 17%) als farbloses Öl.
    5: IR (Film) ν 1730 cm–1, 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,40–7,28 (m, 10H), 5,13 (s, 2H), 5,10 (s, 2H), 4,35 (m, 2H), 2,45–2,15 (m, 4H), 2,08–1,82 (m, 2H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 173,52, 172,22, 135,67, 135,32, 128,66, 128,57, 128,51, 128,32, 128,28, 73,01, 66,89, 66,48, 41,40, 31,41, 28,95, 26,94.
    6: IR (Film) ν 1731 cm–1, 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,39–7,20 (m, 20H), 5,15–5,02 (m, 8H), 4,53 (m, 1H), 2,52–2,22 (m, 6H), 2,08–1,75 (m, 8H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 173,34, 172,10, 135,70, 135,37, 128,57, 128,40, 128,29, 128,27, 84,35, 66,87, 66,44, 41,17, 41,06, 35,83, 35,62, 31,32, 27,55, 27,41.
  • Beispiel 8
    Figure 00870001
  • Zu einer Lösung von Verbindung 5 (58 mg, 0,15 mmol) und Benzylacrylat (25 mg, 0,15 mmol) in 1 mL trockenem CH2Cl2 wurde eine katalytische Menge Triton B (40% Lösung in Methanol) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 4 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, und Flash-Chromatographie über Silicagel mit Ethylacetat-Hexanen (5:1) als Eluent ergab Verbindung 7 (75 mg, 91%). 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,40–7,25 (m, 15H), 5,20–5,03 (m, 6H), 4,64–4,46 (m, 1H), 2,55–1,80 (m, 11H), 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 173,63, 172,10, 171,34, 135,67, 135,49, 128,60, 128,55, 128,41, 128,31, 128,27, 85,67, 85,03, 66,86, 66,67, 66,44, 41,17, 35,41, 35,32, 31,35, 30,07, 29,96, 29,07, 28,36, 27,48, 26,64.
  • Beispiel 9
    Figure 00870002
  • Zu einer Lösung von Verbindung 8 (54 mg, 0,076 mmol) in 2 mL trockenem CH2Cl2 wurden 18 uL Triethylamin zugegeben, nachdem 10 min lang bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurden 80 mg CATP zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde weitere 4 h lang gerührt. Dann wurden 10 mL Ether zugegeben, und es wurde durch Celit filtriert und mit Ether gewaschen. Das Filtrat wurde auf konzentriert. Chromatographie lieferte 8 (30 mg, 58%): 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,40–7,22 (m, 20H), 5,15–5,01 (m, 8H), 3,00–2,79 (m, 4H), 2,50–2,30 (m, 6H), 2,00–1,78 (m, 4H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 205,98, 205,73, 174,20, 174,03, 172,45, 172,40, 135,78, 135,68, 128,53, 128,51, 128,22, 128,16, 66,58, 66,33, 43,95, 39,27, 31,62, 31,59, 29,68, 26,66, 26,59.
  • Beispiel 10
    Figure 00880001
  • Zu einer Lösung von Verbindung 7 (70 mg, 0,13 mmol) in 5 mL trockenem CH2Cl2 wurden 30 uL Triethylamin zugegeben, nachdem 10 min lang bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurden 120 mg CATP zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde weitere 4 h lang gerührt, dann wurden 20 mL Ether zugegeben, und es wurde durch Celit filtriert und mit Ether gewaschen. Das Filtrat wurde auf konzentriert. Chromatographie lieferte 9 (40 mg, 60%). 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,40–7,25 (m, 15H), 5,16–5,05 (m, 6H), 3,02–2,90 (m, 2H), 2,80–2,50 (m, 5H), 2,36 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,00–1,89 (m, 2H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 206,30, 174,20, 172,43, 172,36, 135,76, 135,70, 128,51, 128,49, 128,20, 128,17, 128,15, 66,57, 66,47, 66,33, 43,92, 39,33, 37,06, 31,62, 27,85, 26,65.
  • Beispiel 11
    Figure 00890001
  • Zu einer Lösung von 9 (40 mg, 0,078 mmol) in tert-Butanol wurden 30 mg 20% Pd(OH)2/C (Aldrich, ≤ 50% H2O) zugegeben, und das Gemisch wurde unter 1 atm Wasserstoff 24 h lang hydriert. Der Katalysator wurde mittels Filtration durch Celit entfernt, und das Filtrat auf konzentriert. Der Rückstand wurde in 5 ml Wasser gelöst und lyophilisiert, um 18 mg (94%) FN3(c) als einen Sirup zu ergeben. FN3(c): 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 3,03–2,74 (m, 5H), 2,59 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 2,44 (t, J = 1,2 Hz, 2H), 1,96–1,76 (m, 2H).
  • Beispiel 12
    Figure 00890002
  • Zu einer Lösung von 8 (24 mg, 0,034 mmol) in tert-Butanol wurden 10 mg 20% Pd(OH)2/C (Aldrich, ≤ 50% H2O) zugegeben, und das Gemisch wurde unter 1 atm Wasserstoff 24 h lang hydriert. Der Katalysator wurde mittels Filtration durch Celit entfernt und das Filtrat auf konzentriert. Der Rückstand wurde in 5 ml Wasser gelöst und lyophilisiert, um 10 mg (93%) FN4(D) als einen Sirup zu ergeben. FN4(D): 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 3,03–2,72 (m, 6H), 2,45 (t, J = 7,5 Hz, 4H), 1,96–1,75 (m, 4H).
  • Beispiel 13
    Figure 00900001
  • Zu einer Suspension von Dibenzyl-L-glutamat-tosylat (1 g, 2 mmol) in 20 mL of CH2Cl2 wurde Triphosgen (110 mg, 0,37 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde auf –78°C abgekühlt und Et3N (0,53 mL, 4 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde sich auf Raumtemperatur erwärmen lassen und wurde weitere 2 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 100 mL EtOAc verdünnt und mit H2O (3 × 30 mL), Salzlösung (30 mL) gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand in 5 mL CH2Cl2 gelöst, und es wurde Hexan im Überschuss zugegeben. Der weiße Feststoff 10 wurde gesammelt (600 mg, 88%). 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,40–7,25 (m, 20H), 5,17 (br s, 2H), 5,13 (br s, 4H), 5,08 (s, 4H), 4,53 (dt, J = 8,1, 4,8 Hz, 2H), 2,41 (m, 4H), 2,19 (m, 2H), 1,97 (m, 2H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 172,70, 172,51, 156,53, 135,67, 135,12, 128,51, 128,46, 128,33, 128,14, 67,18, 66,38, 52,47, 30,17, 27,84.
  • Beispiel 14
    Figure 00910001
  • Zu einer Lösung von 10 (510 mg, 0,75 mmol) in tert-Butanol wurden 200 mg 20% Pd(OH)2/C (Aldrich, ≤ 50% H2O) zugegeben, und das Gemisch wurde unter 1 atm Wasserstoff 24 h lang hydriert. Der Katalysator wurde mittels Filtration durch Celit entfernt und das Filtrat auf konzentriert. Der Rückstand wurde in 15 ml Wasser gelöst und lyophilisiert, um 235 mg (98%) FN11 als einen weißen Feststoff zu ergeben: [α]D –16.4° (c 0,5, H2O); 1H NMR (D2O, 300 MHz) δ 4,26 (br s, 2H), 2,51 (t, J = 9,9 Hz, 4H), 2,18 (m, 2H), 1,98 (m, 2H); 13C NMR (D2O, 75 MHz) δ 178,59, 177,59, 160,55, 53,91, 31,36, 27,51.
  • Beispiel 15
    Figure 00910002
  • Zu einer Suspension von Dibenzyl-L-glutamat-tosylat (1 g, 2 mmol) in 20 mL CH2Cl2 wurde Triphosgen (200 mg, 0,66 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde auf –78°C abgekühlt, dann wurde Et3N (0,60 mL, 4 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h lang bei –78°C gerührt, dann sich auf Raumtemperatur erwärmen lassen und mit 100 mL EtOAc verdünnt und mit H2O (30 mL), 1 N HCl (30 mL) und Salzlösung (30 mL) gewaschen. Das Gemisch wurde über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand auf Silicagel mit Hexanen/EtOAc (2:1) chromatographiert, um Isyocyanat (230 mg) zu ergeben. Das Isycyanat (230 mg, 0,65 mmol) wurde in 5 mL CH2Cl2 gelöst, und Dibenzyl-L-glutamat (213 mg, 0,65 mmol) bei 0°C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Hexan wurde im Überschuss zugegeben. Der weiße Feststoff 11 wurde gesammelt (440 mg, 99% aus Isycyanat). 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7,35–7,25 (m, 20H), 5,51 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 5,11 (s, 4H), 5,06 (s, 4H), 4,52 (dt, J = 7,8, 5,4 Hz, 2H), 2,41 (m, 4H), 2,19 (m, 2H), 1,98 (m, 2H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 172,79, 172,68, 156,78, 135,75, 135,21, 128,57, 128,53, 128,38, 128,23, 128,19, 67,22, 66,42, 52,53, 30,25, 27,88.
  • Beispiel 16
    Figure 00920001
  • Dem in Beispiel 14 umrissenen allgemeinen Verfahren wurde für die Herstellung von FN16 aus 11 gefolgt. FN16: 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 4,24 (m, 2H), 2,45 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 2,15 (m, 2H), 1,95 (m, 2H); 13C NMR (D20, 75 MHz) δ 178,48, 177,40, 160,34, 53,80, 31,34, 27,62.
  • Beispiel 17
    Figure 00930001
  • Dem in Beispiel 13 umrissenen allgemeinen Verfahren wurde für die Herstellung von 12 aus Dibenzyl-D-glutamat-tosylat gefolgt.
  • Beispiel 18
    Figure 00930002
  • Dem in Beispiel 14 umrissenen allgemeinen Verfahren wurde für die Herstellung von FN13 aus 12 gefolgt. FN13: [α]D +17,1° (c 0,84 H2O); 1H NMR (D2O, 300 MHz) und 13C NMR (D20, 75 MHz) waren die gleichen wie für FN11.
  • Beispiel 19
    Figure 00940001
  • Zu einer Suspension von Dimethyl-L-glutamat-chlorid (2,1 g, 10 mmol) in 40 mL CH2Cl2 wurde Triphosgen (1 g, 3,3 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde auf –78°C abgekühlt, dann wurde Et3N (3 mL, 20 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 0,5 h lang bei –78°C gerührt, dann sich auf Raumtemperatur erwärmen lassen und mit 100 mL EtOAc verdünnt und mit H2O (30 mL), 1 N HCl (30 mL) und Salzlösung (30 mL) gewaschen. Das Gemisch wurde über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand auf Silicagel mit Hexanen/EtOAc (2:1) chromatographiert, um das entsprechende Isyocyanat (870 mg) zu ergeben. Das Isocyanat (870 mg, 4,3 mmol) wurde in 10 mL CH2Cl2 gelöst, und es wurde Dimethyl-L-glutamat (752 mg, 4,3 mmol) bei 0°C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Hexan wurde im Überschuss zugegeben und der weiße Feststoff FN15 gesammelt (1,50 g, 92% aus Isycyanat). 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 5,47 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 4,50 (dt, J = 8,1, 5,1 Hz, 2H), 3,75 (s, 6H), 3,67 (s, 6H), 2,42 (m, 4H), 2,17 (m, 2H), 1,96 (m, 2H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 173,47, 173,36, 156,71, 52,45, 52,40, 51,79, 30,03, 27,92.
  • Beispiel 20
    Figure 00950001
  • Zu einer Suspension von Dimethyl-L-glutamat (575 mg, 3,28 mmol) in 15 mL CH2Cl2 wurde Triphosgen (187 mg, 1,64 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde auf –78°C abgekühlt, dann wurde Et3N (0,43 mL, 3,28 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde eine kurze Zeit lang bei –78°C gerührt, dann sich über 15 h auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Das Gemisch wurde dann mit 100 mL EtOAc verdünnt und mit H2O (30 mL), 1 N HCl (30 mL) und Salzlösung (30 mL) gewaschen. Das Gemisch wurde über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand auf Silicagel mit Hexanen/EtOAc (3:1→1:1) chromatographiert, um FN18 zu ergeben (410 mg, 64%). 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 5,08 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 4,50 (m, 2H), 3,78 (s, 6H), 3,68 (s, 6H), 2,46 (m, 4H), 2,25 (m, 2H), 2,12 (m, 2H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 182,89, 173,47, 172,89, 56,19, 52,57, 51,82, 29,87, 27,40.
  • Beispiel 21
  • Antitumor-Aktivität von FN11
  • Implantierte Xenotransplantate wurden durch s.c. Inokulation mit 2 × 106 U-87 Glioblastom-Multiform-Zellen, gemischt mit 0,5 mg Matrigel gebildet. FN11 wurde in PBS gelöst zu einer Konzentration von entweder 10 oder 100 μM, und Injektionen (0,1 ml) in die Basis der s.c. implantierten Xenotransplantate wurden einmal täglich vorgenommen. Die Startvolumina der Tumore betrugen etwa 250 mm3. Die Ergebnisse dieses Protokolls sind in 15 dargestellt.
  • Beispiel 22
  • Antiangiogenese-Aktivität von FN11
  • Vergleichstumore und Tumore, welche unter den in Beispiel 21 beschriebenen Bedingungen gewachsen waren, wurden am Ende von 7 Tagen geerntet, in Formalin fixiert und zum Sektionieren in Paraffin eingebettet. Gewebe wurde immunohistochemisch für von Willebrand's Faktor (vWF) gefärbt, um ein Maß für die Vaskularisierung zu erhalten. 13 und 14 stellen die Ergebnisse dieses Protokolls für den Tumor dar, welcher mit FN11 bei 100 μM behandelt wurde. 13 wurde bei geringer Vergrößerung aufgenommen (100 ×), wohingegen 14 bei hoher Vergrößerung (400 ×) aufgenommen wurde. Die Figuren zeigen ein Überwiegen von avaskulären und niedrig-vaskulären Bereichen, zumeist kleine Gefäße, in dem mit FN11 bei 100 μM behandelten Tumor.
  • Beispiel 23
  • Studien von neuroprotektiven Eigenschaften von FN-Verbindungen
  • Das Testen von neuroprotektiven Wirkungen von Liganden, welche auf metabotropische Glutamat-Rezeptoren wirken, erfordert die Verwendung von spezifischen Modellen, welche es erlauben, die Wirkung dieser Verbindungen zu visualisieren. Wie in mehreren Veröffentlichungen gezeigt wurde, erfordert Schutz gegen Excitotoxizität (welche durch NMDA-Applikation induziert werden kann) oft die Gegenwart von Gliazellen und kann in Kulturen, welche nur neuronale Zellen enthalten, nicht gezeigt werden. Es wird angenommen, dass die neuroprotektive Wirkung von Gruppe II mGluR Agonisten von einer Wirkung auf mGluR3 oder mGluR2 Rezeptoren, welche an Gliazellen lokalisiert sind, resultiert, was die Freisetzung von neurotrophischen Faktoren von diesen Gliazellen induziert.
  • Wir haben die Validität dieser Feststellungen unter Verwendung von drei Modellen von MMDA-Toxizität in Kulturen von kortikalen Neuronen, welche aus Mäuseföten hergestellt wurden, getestet. Das erste Modell (A) besteht aus der Verwendung einer Kultur, welche Neuronen ohne Gliazellen enthält. NMDA (75 μM) wird 10 Minuten lang ohne oder mit der getesteten Verbindung appliziert. Dann wird das Kulturmedium ersetzt und die Zellen 24 Stunden lang belassen, um Toxizität zu entwickeln. Das zweite Modell (B) beinhaltet die Verwendung von kortikalen Neuronen von Mäusen, welche auf einer Lage von konfluenten Gliazellen (zumeist Astrozyten), welche aus zerebralem Cortex von neugeborenen Mäusen hergestellt ist, ausgesät sind. Die Inkubationen sind identisch wie in Modell A.
  • Das dritte Modell (C) trennt die neuronalen und glialen Kulturen. Gliale Kulturen werden mit der getesteten neuroprotektiven Verbindung behandelt, um die Freisetzung von protektiven Faktoren in das Medium zu induzieren. Parallel dazu werden Kulturen von kortikalen Neuronen (ohne Glia) 10 Minuten lang mit NMDA (20 μM) behandelt. Dann wird NMDA ausgewaschen und die Neuronen mit dem Medium behandelt, welches von den behandelten Gliazellen gesammelt wurde. In allen Fällen wird Toxizität 24 Stunden nach NMDA-Behandlung durch Messungen von Lactatdehydrogenase(LDH)- Aktivität, welche sich während dieser Zeitspanne in dem Medium angesammelt hat, untersucht.
  • Der Vergleich der drei Modelle ist in Säulenauftragung 1 dargestellt. Wie erwartet, war im Modell A ABHxD-I nicht fähig, gegen NMDA-Toxizität zu schützen. Im Gegensatz dazu produzierte ABHxD-I in Gegenwart von Gliazellen (Modell B) einen bedeutenden Schutz, wodurch die toxische Wirkung von NMDA zu über 40% verringert wurde. Dies legte nahe, dass ABHxD-I tatsächlich die Freisetzung von protektiven Faktoren von Gliazellen induzieren kann. Diese Möglichkeit wurde in Modell C getestet. Wie in Säulenauftragung 1c gezeigt, war ABHxD-I bei separater Inkubation mit Gliazellen so wirksam wie in Modell B. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass Medium von unbehandelten Gliazellen nicht neuroprotektiv war. Dies bestätigt die Hypothese, dass die Wirkung von ABHxD-I durch die Freisetzung von neuroprotektiven Faktoren von Gliazellen vermittelt wird. Wichtiger noch zeigt dies an, dass die neuroprotektive Wirkung von ABHxD-I nicht von der Gegenwart des Wirkstoffs während des toxischen Ereignisses abhängt, sondern dass der Wirkstoff wirksam sein kann, wenn er nach dem toxischen Stimulus zugegeben wird.
  • Der Vergleich von Modellen B und C zeigt, dass beide Modelle die indirekte neuroprotektive Wirkung von ABHxD-I wiederspiegeln, welche durch die Handlung des Wirkstoffs an auf Gliazellen angeordneten Rezeptoren vermittelt ist. Dies unterstreicht die Rolle von Gliazellen in Mechanismen von Hirnschädigung und identifiziert diese Zellen als ein Target von möglicher therapeutischer Intervention. Von einem praktischen Gesichtspunkt aus erscheint zu dem Zweck des Testens von Verbindungen, welche über diesen Mechanismus wirken, Modell C Modell B überlegen, da die Variabilität der Messungen in Modell C verringert ist. Dies wird wiedergespiegelt durch eine zweifache Verringerung der Standardabweichung für die berechneten Mittelwerte. Dieser Unterschied rührt aller Wahrscheinlichkeit nach von der Natur der LDH-Messungen her. In Modell C kann LDH nur von absterbenden Neuronen freigesetzt werden und spiegelt damit direkt die Anzahl von toten Zellen wieder. Im Gegensatz dazu können in Modell B LDH-Gehalte durch LDH-Entweichen von Gliazellen beeinflusst sein. Wenn die Anzahl von Gliazellen verglichen mit Neuronen groß ist, kann selbst ein geringes Entweichen zu bedeutenden Veränderungen der LDH-Gehalte führen. Es ist bekannt, dass Gliazellen gegenüber NMDA-Toxizität nicht sensitiv sind, so dass solche Erhöhungen nicht NMDA-Toxizität wiederspiegeln, sondern vielmehr eine zufällige Variation, welches in jedem lebenden System auftritt. Damit wird in Modell B LDH-Freisetzung von sterbenden Neuronen vor einem höheren Hintergrund von variablen Vergleichsgehalten gemessen, welches das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis herabsetzt und die zufällige Variabilität von Messungen erhöht. In unseren Studien haben wir anfänglich Modell B (wie in Säulenauftragungen 2 und 3 zu sehen) verwendet, jedoch dann zu Modell C (Säulenauftragungen 4 und 5) gewechselt, welches verlässlichere Messungen lieferte.
  • Testen von FN-Verbindungen
  • Anfänglich wurden FN-Verbindungen im Modell B getestet. Säulenauftragung 2 zeigt die Wirkungen von FN1–FN8, welche bei 300 μM Konzentration verwendet wurden. Nur FN1(A) und FN6(F) zeigen etwa 30% Neuroprotektion. Von den FN6-Enantiomeren, welche bei 100 μM Konzentration verwendet wurden (Säulenauftragung 2) erscheinen die 6/1- und 6/4-Verbindungen wirksamer.
  • FN6(F)-Enantiomere wurden auch in Modell C (Säulenauftragung 4) getestet. Wie in Modell B waren die 6/1- und 6/4-Verbindungen wirksamer, wobei der Schutz etwa 30% erreichte. Die Guilford-Verbindung PMPA, welche FN6(F) ähnlich ist, war weniger wirksam. Wir haben auch mehrere neuere FN-Verbindungen im Modell C getestet. Wie in Säulenauftragung 5 gezeigt, zeigte von diesen Verbindungen nur FN13 eine neuroprotektive Wirkung, welche sich auf etwa 20% Schutz belief.
  • Zusammenfassung
  • Die stärksten Wirkungen – etwa 30% – werden von FN1(A) und FN6(F) gezeigt. Diese Wirkungen sind geringer als die bei ABHxD-I beobachtete Neuroprotektion, aber besser als die Wirkung von PMPA. Die getesteten Verbindungen können größere Wirksamkeit in Modellen von Toxizität mit einer geringeren nekrotischen Komponente und einer größeren apoptotischen Komponente zeigen.
  • Säulenauftragungen für Beispiel 23
    Figure 01010001
  • Säulenauftragung 1: Vergleich der neuroprotektiven Wirkung von ABHxD-I in drei Modellen von NMDA-Toxizität zeigt ein Fehlen einer Wirkung in Kulturen reiner Neuronen ohne Glia (A), während signifikanter Schutz in dem Modell beobachtet wird, in welchem gemischte kortikal-neuronale-gliale Kulturen verwendet werden (B) und wenn Neuronen mit Medium von Gliazellen gerettet werden, welche der schützenden Verbindung ausgesetzt wurden (C). "Control" bezieht sich auf Zellen, welche nur mit NMDA (ohne die schützende Verbindung) behandelt wurden. ABHxD-I wurde in 10 μM Konzentration verwendet. Säulen stehen für Mittelwerte und Standardabweichungen von 16 bis 30 Messungen.
  • Figure 01020001
  • Säulenauftragung 2: Wirkung von FN Verbindungen auf NMDA Toxizität in gemischten Kulturen von kortikal-neuronalen-glialen Zellen (Modell B). FN Verbindungen waren 300 μM. "Control" bezieht sich auf Zellen, welche nur mit NMDA (ohne die schützende Verbindung) behandelt wurden. ABHxD-I (10 μM) wurde als positiver Vergleich verwendet. Säulen stehen für Mittelwerte und Standardabweichungen von 8–40 Messungen.
  • Figure 01020002
  • Säulenauftragung 3: Wirkung von FN6(F) Enantiomeren auf NMDA Toxizität in gemischten Kulturen von kortikal-neuronalen-glialen Zellen (Modell B). FN Verbindungen waren 100 μM. "Control" bezieht sich auf Zellen, welche nur mit NMDA (ohne die schützende Verbindung) behandelt wurden. ABHxD-I (10 μM) wurde als positiver Vergleich verwendet. Säulen stehen für Mittelwerte und Standardabweichungen von 8–11 Messungen.
  • Figure 01030001
  • Säulenauftragung 4: Wirkung von FN6(F) Enantiomeren auf NMDA Toxizität in kortikal-neuronalen Zellen, die Medium von mit der schützenden Verbindung behandelten Gliazellen ausgesetzt wurden (Modell C). FN Verbindungen waren 100 μM. "Control" bezieht sich auf Zellen, welche nur mit NMDA (und Medium von unbehandelter Glia) behandelt wurden. ABHxD-I (10 μM) wurde als positiver Vergleich verwendet. Ergebnisse mit der Guilford Verbindung PMPA sind zum Vergleich dargestellt. Säulen stehen für Mittelwerte und Standardabweichungen von 12–30 Messungen.
  • Figure 01040001
  • Säulenauftragung 5: Wirkung von FN Verbindungen auf NMDA Toxizität in kortikal-neuronalen Zellen, die Medium von mit Wirkstoff behandelten Gliazellen ausgesetzt wurden (Modell C). FN Verbindungen waren 100 μM. "Control" bezieht sich auf Zellen, welche nur mit NMDA (und Medium von unbehandelter Glia) behandelt wurden. ABHxD-I (10 μM) wurde als positiver Vergleich verwendet. Säulen stehen für Mittelwerte und Standardabweichungen von 8–61 Messungen.
  • Äquivalente
  • Fachleute auf diesem Gebiet werden viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung erkennen oder unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten auffinden können. Solche Äquivalente sollen durch die folgenden Ansprüche umfasst sein.

Claims (15)

  1. Verbindung, dargestellt durch die verallgemeinerte Struktur 1:
    Figure 01050001
    wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -C(O)-, -C(S)-, -P(O)(OR)-, -P(O)(NR2)-, -P(NR)(OR)-, P(NR)(NR2)-, -C(R)(OR)-, -C(R)(SR)-, -C(NR)-; Y für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (CR2)n, (NR)n und einer Bindung; Z für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C(R), C(NR2), C(NHAcyl); W für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (CR2)m und einer Bindung; G für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -COOH, -C(O)NHOH, -C(O)NH2, -C(S)SH, -SO3H, -SO2H, -SOH, -S(O)2NH2, -P(O)(OH)2 und -P(OH)2; R für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl und Aralkyl; und auch umfassend eine negative Ladung für Fälle, in denen R an ein Heteroatom gebunden ist; und m und n ganze Zahlen sind, welche für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt sind aus dem Bereich 0 bis 3 inklusive.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -P(O)(OR)- und -P(O)(NR2)-.
  3. Verbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei Y (CR2)n ist.
  4. Verbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei Z C(R) ist.
  5. Verbindung nach Anspruch 1, wobei W (CR2)m ist.
  6. Verbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei G für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -COOH, -C(O)NHOH, -C(O)NH2, -SO3H, -SO2H, -S(O)2NH2, und -P(O)(OH)2.
  7. Verbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei G für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -COOH und -C(O)NHOH.
  8. Verbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei m und n ganze Zahlen sind, welche für jedes einzelne Auftreten unabhängig ausgewählt sind aus dem Bereich 1 bis 2 inklusive.
  9. Verbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Verbindung ein Liganden-Agonist oder ein Antagonist für einen metabotropen Glutamatrezeptor ist.
  10. Verbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Verbindung ein Liganden-Agonist oder Antagonist für einen einzelnen Subtyp eines metabotropen Glutamatrezeptors ist.
  11. Verbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Verbindung ein NAALADase-Inhibitor ist.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche.
  13. Verwendung einer Verbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche bei der Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von NAALADase.
  14. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 9 oder 10 bei der Herstellung eines Medikaments zur Agonisierung eines metabotropen Glutamatrezeptors.
  15. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 9 oder 10 bei der Herstellung eines Medikaments zur Antagonisierung eines metabotropen Glutamatrezeptors.
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