DE60036019T2

DE60036019T2 - Synthetische oligonukleotide die therapeutisch nützlich sind

Info

Publication number: DE60036019T2
Application number: DE60036019T
Authority: DE
Inventors: Nigel C. Pointe-Claire PHILLIPS; Mario C. Laval FILION
Original assignee: Bioniche Life Sciences Inc
Current assignee: Telesta Therapeutics Inc
Priority date: 1999-12-13
Filing date: 2000-12-12
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2020-12-13
Also published as: US20070213291A1; EP1867718A3; WO2001044465A3; AU785212B2; WO2001044465A2; US7157436B2; ES2340807T3; CN101491536A; CA2393808A1; EP1238070B1; NO330508B1; US20010041681A1; EP1238070A2; NO20022820L; EP1867718A2; DK1867718T3; CZ20022372A3; NO20022820D0; KR20020079752A; CN1433469A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Oligonukleotidzusammensetzung zur Behandlung von Krebs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Krebs ist eine anormale Netzakkumulation von atypischen Zellen, welche sich aus übermäßiger Proliferation, unzureichendem Zelltod oder einer Kombination von beiden ergeben kann.
Proliferation stellt den Höhepunkt der Entwicklung einer Zelle während des Zellzyklus dar, wobei Proliferation zur Teilung von einer Zelle in zwei Zellen führt. Die 5 Hauptphasen des Zellzyklus sind G₀, G_I, S, G₂ und M. Während der G₀-Phase befinden sich die Zellen im Ruhezustand. Zu einem beliebigen Zeitpunkt befinden sich die meisten Zellen im Körper in diesem Zustand. Während der G₁-Phase erzeugen Zellen, die auf Signale zur Teilung reagieren, die RNA und die Proteine, welche zur DNA-Synthese notwendig sind. Während der S-Phase (SE, frühe S-Phase; SM, mittlere S-Phase; und SL, späte S-Phase) replizieren die Zellen ihre DNA. Während der G₂-Phase werden Proteine in Vorbereitung auf die Zellteilung erstellt. Während der mitotischen (M) Phase teilt sich die Zelle in zwei Tochterzellen. Abweichungen beim Durchlaufen des Zellzyklus treten in allen Krebsarten auf und können sich aus der Überexpression von Genen, der Mutation von regulatorischen Genen oder dem außer Kraft setzen von Kontrollstellen für DNA-Schaden ergeben (Hochhauser D. Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents 8:903, 1997).
Anders als Krebszellen können die meisten normalen Zellen aufgrund eines Prozesses, der als zelluläre Alterung bezeichnet wird, nicht unbegrenzt proliferieren. Zelluläre Alterung ist eine programmierte Zelltodreaktion, welche zum Wachstumsarrest von Zellen führt (Dimri et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:20, 1995). Es werden DNA-Schädigung, Exposition von Dickdarmkrebszellen, Brustkrebszellen und ovarialen Krebszellen gegenüber Topoisomeraseinhibitoren sowie die Exposition von nasopharyngealen Krebszellen gegenüber Cisplatin beschrieben, um die Proliferation dieser Zellen durch Induktion von Alterung zu hemmen (Wang et al. Cancer Res. 58:5019, 1998; Poele et al. Br. J. Cancer 80:9, 1999).
Synthetische Oligonukleotide sind polyanionische Sequenzen, welche in Zellen internalisiert werden (Vlassov et al. Biochim. Biophys. Acta 1197:95, 1994). Es wird beschrieben, dass synthetische Oligonukleotide selektiv an Nukleinsäuren (Wagner, R. Nature: 372:333, 1994), an spezifische zelluläre Proteine (Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999) und an spezifische Kernproteine (Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998) binden, um die Proliferation von Krebszellen zu hemmen.
Von synthetischen 27-Basensequenzen, welche Guanin (G) und variable Mengen Thymin (T) (Oligonukleotid GTn) enthalten, wobei n ≥ 1 oder ≤ 7 ist und wobei die Zahl an Basen ≥ 20 ist (Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998), wird beschrieben, dass sie das Wachstum von Krebszelllinien durch sequenzspezifische Bindung an ein 45 kDa Kernprotein hemmen, wohingegen von GTn, wobei die Zahl an Basen ≤ 20 ist, beschrieben wird, dass es gegenüber Krebszelllinien inaktiv ist (Morassutti et al. Nucleosides and Nucleotides 18:1711, 1999). Von zwei synthetischen GT-reichen Oligonukleotiden mit 15 und 29 Basen mit 3'-Aminoalkülmodifikationen wird beschrieben, dass sie G-Quartetts ausbilden, welche an Nukleolin binden und die Proliferation von Krebszelllinien hemmen (Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999). Vom synthetischen 6-Basen-TTAGGG-Phosphorothioat, welches eine Sequenz identisch zu der der Telomererepeatsequenz aus Säuger aufweist, wird beschrieben, dass es die Proliferation von Burkitt-Lymphomazellen in vitro und in vivo hemmt (Mata et al. Toxicol. Applied Pharmacol. 144:189, 1997). Von dem synthetischen 6-Basen- TTAGGG-Phosphodiester wird aber beschrieben, dass er keine Anti-Telomeraseaktivität aufweist ( US-Patent Nr. 5,643,890 ).
Zelltod wird durch Immunmediatoren bewirkt, welche Apoptose fördern und durch Apoptoseinduktoren, welche direkt Wege initiieren, die zum Zelltod führen (Muzio et al. Cell 85:817, 1996; Levine, A. Cell 88:323, 1997). Apoptose ist ein aktiver Zelltodprozess, welcher durch charakteristische morphologische Veränderungen gekennzeichnet ist, die die Kondensation von Kernchromatin, Zellschrumpfung, Kerndisintegration, Bildung von Plasmamembranausstülpungen (plasma membran blebbing) und die Bildung von membrangebundenen apoptotischen Körperchen umfassen (Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980). Ein molekulares Kennzeichen von Apoptose ist der Abbau der Kern-DNA der Zelle in Fragmente mit oligonukleosomaler Länge als Ergebnis der Aktivierung von endogenen Endonukleasen (Wyllie A. Nature 284:555, 1980).
Kaspasen (Cystein-Aspartyl-spezifische Proteasen) wurden als Schlüsselenzyme mit der Ausführung des späten Stadiums von Apoptose in Zusammenhang gebracht. Die Kaspasefamilie besteht aus wenigstens vierzehn miteinander in Beziehung stehenden Cysteinaspartylproteasen. Alle Kaspasen enthalten ein konserviertes QACXG (wobei X R, Q oder G ist)-Pentapeptid als Motiv der aktiven Stelle (Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997). Mehrere Kaspasen werden als inaktive Proenzyme synthetisiert, welche im Anschluss an die Spaltung an Kaspase-spezifischen Spaltungsstellen aktiviert werden (Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997) oder als inaktive Enzyme, welche zur Aktivierung einer Assoziierung mit regulatorischen Molekülen bedürfen (Stennicke et al. J. Biol. Chem. 274:8359, 1999).
Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Apoptose spielen Kaspasen bei der Aktivierung und Proliferation von B- und T-Lymphozyten, bei der zytokinen Reifung während Entzündung, bei der Differenzierung von Vorläuferzellen während Erythropoese und bei der Entwicklung von Linsenfasern (Fadeel et al. Leukemia 14:1514, 2000) eine Rolle. Im Hinblick auf B- und T-Lymphozyten wird Kaspase 3 während der Aktivierung von B-Lymphozyten und von CD4 (+)-, CD8 (+)-, CD45RA (+)- und CD45RO (+)-Untergruppen von T-Lymphozyten prozessiert (Alam et al. J. Exp. Med. 190:1879, 1999). Darüber hinaus ist die Stimulierung von T-Lymphozyten durch Mitogene und durch Interleukin-2 mit der Aktivierung des Kaspasewegs und mit der Spaltung von PARP assoziiert (Wilheim et al. Eur. J. Immunol. 28:891, 1998). Im Hinblick auf Zytokine ist Kaspase 3-Aktivität für die Freisetzung von IL-2 durch aktivierte T-Lymphozyten (Posmantur et al. Exp. Cell Res. 244:302, 1998) und für die Prozessierung und Maturierung des proinflammatorischen Zytokins Interleukin-16 (Zhang et al. J. Biol. Chem. 273:1144, 1998) notwendig. In Bezug auf Erythropoese spielt Kaspaseaktivierung bei der Erythropoeseregulation eine Rolle und es wurde gezeigt, dass Kaspaseaktivierung GATA-1 moduliert, wobei es sich um ein regulatorisches Kernprotein handelt, welches für die Maturierung von Erythroidvorläufern wichtig ist (De Maria, et al. Nature 401:489, 1999).
Zytolyse ist die vollständige oder teilweise Zerstörung einer Zelle und wird durch das Immunsystem vermittelt. Aktivierte Makrophagen und Monozyten erzeugen bioaktive Moleküle, welche Zytokine umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Zytokine umfassen Interleukin (IL)-1, IL-1-Beta, IL-6, IL-10, IL-12 und TNF-Alpha, sind aber nicht darauf beschränkt.
IL-1-Beta reduziert die Sensitivität von Knochenmarkszellen gegenüber zytoreduktiven Arzneimitteln, gegenüber Bestrahlung und gegenüber in vitro-Tumorzellspülung mit Arzneimitteln bei autologer Knochenmarkstransplantation (Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551, 1993).
IL-6 induziert B-Zelldifferenzierung, stimuliert IgG-Sekretion (Tags et al. J. Exp. Med. 166:967, 1987), induziert zytotoxische T-Zelldifferenzierung (Lee et al. Vaccine 17:490, 1999), fördert Megakaryozytenmaturierung (Ishibashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8953, 1989) und wirkt sowohl als antiproliferativer Faktor (Mori et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 257:609, 1999; Alexandroff et al. Biochem. Soc. Trans. 25:270, 1997; Takizawa et al. Cancer Res. 53:18, 1993; Novick et al. Cytokine 4:6, 1992) und als pro-proliferativer Faktor (Okamoto et al. Cancer Res. 57:141, 1997; Okamoto et al. Int. J. Cancer 72:149, 1997; Chiu et al. Clin. Cancer Res. 2:215, 1996; Lu et al. Clin. Cancer Res. 2:1417, 1996) für Krebszellen.
IL-10 steigert die Wirksamkeit von Impfstoffen in Maustumormodellen (Kauffman et al. J. Immunother. 22: 489, 1999) und reguliert Anti-Krebs-autoreaktive T-Zell-Reaktionen nach oben (Alleva et al. Immunobiol. 192:155, 1995).
IL-12, allein und in Kombination mit anderen Zytokinen, fördert die Maturierung von Leukozyten und induziert die Sekretion von Interferon-Gamma. Von IL-12 wird beschrieben, dass es Antikrebsaktivität aufweist (Stine et al. Annals NY Academy of Science 795:420, 1996; Chen et al. Journal of Immunol. 159:351, 1997), umfassend die Aktivierung von spezifischen zytolytischen T-Lymphozyten, die Aktivierung von natürlichen Killer (NK)-Zellen und die Induktion der antiangiogenischen Proteine IP-10 und MiG, ohne darauf beschränkt zu sein.
TNF-Alpha verursacht Nekrose von festen Tumoren (Porter et al. Trends in Biotech. 9:158, 1991), sensibilisiert Krebszellen gegenüber mit Gammastrahlung induzierter Apoptose (Kimura et al. Cancer Res. 59:1606, 1999) und schützt Knochenmarksvorläuferzellen vor den Wirkungen von antineoplastischen Mitteln (Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551, 1993).
Jedoch haben sich die meisten Antikrebstherapien gemäß dem Stand der Technik, ob sie nun auf die Induktion von Zellzyklusarrest, die Hemmung von Proliferation, die Induktion von Apoptose oder die Stimulierung des Immunsystems gerichtet sind, für klinische Anwendungen als nicht geeignet erwiesen. Viele dieser Therapien sind ineffizient oder toxisch, weisen signifikante nachteilige Nebenwirkungen auf, führen zur Entwicklung von Arzneimittelresistenzen oder Immunosensibilisierung und wirken für den Empfänger entkräftend.
Deshalb besteht ein andauernder Bedarf für neue Zusammensetzungen und Verfahren, welche in Krebszellen Zellzyklusarrest induzieren, Proliferation von Krebszellen hemmen, Kaspasen in Krebszellen aktivieren, Apoptose in Krebszellen induzieren und die Zytokinproduktion durch Immunsystemzellen stimulieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis durch Bereitstellen einer Zusammensetzung und eines Verfahrens umfassend ein 3'-OH, 5'-OH synthetisches Oligonukleotid gemäß SEQ ID NO:45: gggagg, und wobei die Sequenz eine Antwort induziert, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Induktion von Zellzyklusarrest, Hemmung von Proliferation, Aktivierung von Kaspasen und Induktion von Apoptose in Krebszellen und Produktion von Zytokinen in Immunsystemzellen.
Eine Zusammensetzung umfassend die Sequenz gemäß SEQ ID NO:45 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger wird an ein Lebewesen, umfassend Menschen, mit Krebs, in einer wirksamen Menge verabreicht, um den Krebs im Lebewesen zu behandeln. Die unerwartete und überraschende Fähigkeit der Sequenz, Zellzyklusarrest zu induzieren, Proliferation zu hemmen, Kaspasen zu aktivieren und Apoptose zu induzieren und in Krebszellen und die Zytokinproduktion durch Immunsystemzellen zu stimulieren, adressiert ein lange verspürtes unerfülltes Bedürfnis in den Medizinwissenschaften und stellt einen wichtigen Vorteil für Lebewesen, einschließlich Menschen, bereit.
Entsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung bereitzustellen und ein Verfahren, welche(s) zur Behandlung einer Erkrankung in einem Lebewesen, umfassend Menschen, wirksam ist.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) zur Behandlung von Krebs wirksam ist.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) in Zellen Alterung induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) in Zellen Zellzyklusarrest induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) in Krebszellen Zellzyklusarrest induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) die Proliferation von Zellen hemmt.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) die Proliferation von Krebszellen hemmt.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) Apoptose in Zellen induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) Apoptose in Krebszellen induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) unabhängig von Fas in Krebszellen Apoptose induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) unabhängig von TNFR1 Apoptose in Krebszellen induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) unabhängig von p53/p21 Apoptose in Krebszellen induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) unabhängig von p21/waf-1/CIP Apoptose in Krebszellen induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) unabhängig von p15^ink4B Apoptose in Krebszellen induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) unabhängig von p16^ink4 Apoptose in Krebszellen induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) unabhängig von Kaspase-3 Apoptose in Krebszellen induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) unabhängig vom TGF-Beta 1-Rezeptor Apoptose in Krebszellen induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) unabhängig von Hormonabhängigkeit Apoptose in Krebszellen induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) unabhängig von Arzneimittelresistenz Apoptose in Krebszellen induziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) Kaspasen in Zellen aktiviert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) Kaspasen in Krebszellen aktiviert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Behandlung einer lymphoproliferativen Erkrankung bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Behandlung einer Infektion bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Behandlung einer Entzündung bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Modulierung von T- oder B-Zell-Aktivierung bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Modulierung von Vorläuferzellmaturierung bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Modulierung von Erythropoese bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Modulierung von Transkriptionsfaktoren in Zellen bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) die Wirkungen von anderen therapeutischen Mitteln auf Zellen potenziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) die Wirkung von chemotherapeutischen Mitteln auf Krebszellen potenziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) die antineoplastische Wirkung von Strahlung potenziert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) die Zytokinproduktion durch Zellen des Immunsystems stimuliert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) die IL-1-Beta-Produktion durch Zellen des Immunsystems stimuliert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) die IL-6-Produktion durch Zellen des Immunsystems stimuliert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) die IL-10-Produktion durch Zellen des Immunsystems stimuliert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) die IL-12-Produktion durch Zellen des Immunsystems stimuliert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, welche(s) die TNF-α-Produktion durch Zellen des Immunsystems stimuliert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, welche auf einfache Art und Weise herzustellen ist.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, welche für den Empfänger minimal toxisch ist.
Diese und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Durchsicht der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung der offenbarten Ausführungsform und der angefügten Ansprüche offensichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Fluoreszenz [Fluo-3-AM] von humanen Jurkat-T-Leukämiezellen, inkubiert mit 0 μg/ml und 100 μg/ml der 6 Basen GT SEQ ID NO:25 (Vergleich).
2. Kaspase-3-Aktivierung in humanen Jurkat-T-Zell-Leukämiezellen, inkubiert ohne 0 μg/ml und 100 μg/ml von GT SEQ ID NO:66, 67, 81, 82 und 83, zytometrisch (A) und kolorimetrisch (B) gemessen (Vergleich).
3. Kaspaseaktivierung in humanen Jurkat-T-Zell-Leukämiezellen. (A) Kaspase-3-Aktivierung in Zellen inkubiert mit 0 μg/ml und 100 μg/ml der 6 Basen GT SEQ ID NO:25; (B) Kaspase-7-Aktivierung (a) und PARP-Gehalt (b) in Zellen inkubiert mit 0 μg/ml und 100 μg/ml der 6 Basen GT SEQ ID NO:25 (Vergleich).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, umfassend eine 3'-OH, 5' synthetische Phosphodiesternukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:45: gggagg, wobei die Sequenz eine Reaktion induziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Induktion von Zellzyklusarrest, Hemmung von Proliferation, Aktivierung von Kaspasen und Induktion von Apoptose in Krebszellen sowie Produktion von Zytokinen durch Immunsystemzellen.
Eine Zusammensetzung, welche die Sequenz SEQ ID NO:45 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, wird an ein Lebewesen, einschließlich Menschen, mit Krebs in einer Menge verabreicht, welche zur Behandlung des Krebs im Lebewesen, einschließlich des Menschen, wirksam ist. Die unerwartete und überraschende Fähigkeit der Sequenz, Zellzyklusarrest zu induzieren, Proliferation zu hemmen, Apoptose zu induzieren und Kaspase zu aktivieren in Krebszellen und die Zytokinproduktion durch Immunsystemzellen zu stimulieren, adressiert ein lang verspürtes unerfülltes Bedürfnis in den Medizinwissenschaften und stellt einen wichtigen Vorteil für Lebewesen, einschließlich Menschen, bereit.
Wie hierin verwendet, bezieht sich das Wort „Sequenz" auf ein 2 bis 20 Basen 3'-OH, 5'-OH synthetisches Oligonukleotid umfassend A-, C-, G- und T-Basen.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Abkürzungen „GT", „AG", „CG", „GG", „AGT" und „CGT" auf Sequenzen, umfassend die benannten Basen, welche in einer beliebigen Reihenfolge synthetisiert sind.
Wie hierin verwendet, bezieht sich das Wort „Reaktion" auf die Induktion von Zellzyklusarrest, die Hemmung von Proliferation, die Aktivierung von Kaspasen und die Induktion von Apoptose in Krebszellen sowie auf die Stimulierung von Zytokinproduktion durch Immunsystemzellen.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Formulierungen „therapeutische Behandlung" und „Menge wirksam zu" auf eine Menge einer Sequenz, welche wirksam ist, Zellzyklusarrest zu induzieren, Proliferation zu hemmen, Kaspase zu aktivieren und Apoptose zu induzieren in Krebszellen sowie die Zytokinproduktion durch Immunsystemzellen zu stimulieren.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Formulierungen „Suspensionstumormodell" und „Festtumormodelle" auf primäre oder sekundäre Karzinome oder Sarkome.
Wie hierin verwendet, ist die Formulierung „chemotherapeutisch" ein beliebiges Mittel, welches von einem Aufsichtsamt einer Landes- oder Staatenregierung zugelassen ist oder welches in der US-Pharmakopoe oder in einer anderen allgemein anerkannten Pharmakopoe aufgelistet ist zur Behandlung von Krebs in einem Lebewesen, einschließlich Mensch.
Wie hierin verwendet, bezieht sich das Wort „antineoplastisch" auf die Vorbeugung der Entwicklung, Maturierung, Proliferation oder Ausbreitung von Krebszellen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich das Wort „potenziert" auf einen Grad an Synergismus, welcher größer ist als die additive Aktivität eines jeden Mittels.
Wie hierin verwendet, bezieht sich das Wort „Synergismus" auf die koordinierte Wirkung von zwei oder mehreren Mitteln.
Die Verabreichung einer wirksamen Menge an Sequenz SEQ ID NO:45 der vorliegenden Erfindung an ein Lebewesen, einschließlich eines Menschen, ist eine therapeutische Behandlung, welche eine Erkrankung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Krebs, rheumatoide Arthritis, lymphoproliferative Erkrankungen und Asthma, vorbeugt, behandelt oder beseitigt. Krebsarten umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Plattenepithelkarzinom, Fibrosarkom, Sarkoidkarzinom, Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs, kolorektaler Krebs, Nierenkrebs, Osteosarkom, Hautkrebs, Basalzellkarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Blasenkrebs, Hirnkarzinom, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Leukämie, Lymphoma und davon abgeleitete Metastasen.
Die therapeutische Wirksamkeit einer Sequenz kann durch Verfahren gesteigert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, chemische Modifizierung der Base, des Zuckers oder des Phosphatrückgrats, chemische Supplementierung oder biotechnologische Amplifizierung der Sequenzen unter Verwendung bakterieller Plasmide, welche die geeigneten Sequenzen enthalten, Komplexierung der Sequenzen an biologische oder chemische Träger oder Kopplung der Sequenzen an auf einen Gewebetyp oder Zelltyp ausgerichtete Liganden oder Antikörper.
Zusammensetzungen umfassend die Sequenz SEQ ID NO:45 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger werden hergestellt durch gleichmäßiges und enges in Verbindung bringen der Sequenz und des pharmazeutisch annehmbaren Trägers. Pharmazeutisch annehmbare Träger umfassen flüssige Träger, feste Träger oder beides. Flüssige Träger sind wässrige Träger, nicht wässrige Träger oder beides und umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, wässrige Suspensionen, Ölemulsionen, Wasser-in-Öl-Emulsionen, Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen, ortsspezifische Emulsionen, Emulsionen mit langer Verweildauer (long-residence emulsions), klebrige Emulsionen, Mikroemulsionen und Nanoemulsionen. Feste Träger sind biologische Träger, chemische Träger oder beides und umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, virale Vektorsysteme, Partikel, Mikropartikel, Nanopartikel, Mikrosphären, Nanosphären, Minipumpen, bakterielle Zellwandextrakte und bioabbaubare oder nicht-bioabbaubare natürliche oder synthetische Polymere, welche eine anhaltende Freisetzung der Sequenzen ermöglichen. Verfahren, welche verwendet werden, um eine Sequenz mit einem festen Träger zu komplexieren, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, direkte Absorption an die Oberfläche des festen Trägers; kovalente Kopplung an die Oberfläche des festen Trägers, entweder direkt oder mittels eines Verknüpfungsrest; und kovalente Kopplung an das Polymer, welches zur Herstellung des festen Trägers verwendet wird. Gegebenenfalls kann eine Sequenz durch Zugabe von nicht-ionischen oder ionischen Polymeren stabilisiert werden, wie beispielsweise Polyoxyethylensorbitanmonooleate (Tweens) oder Hyaluronsäure.
Bevorzugte wässrige Träger umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Wasser, Salzlösung und pharmazeutisch annehmbare Puffer. Bevorzugte nicht-wässrige Träger umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Mineralöl und ein Neutralöl und Gemische davon. Gegebenenfalls können Hilfsmittel umfasst sein, ungeachtet des pharmazeutisch annehmbaren Trägers, welcher verwendet wird, um die Sequenz den reagierenden Zellen zu präsentieren. Diese Hilfsmittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Antioxidationsmittel, Puffer und Bakteriostatika und können suspendierende Mittel und verdickende Mittel umfassen.
SEQ ID NO:45 kann allein oder in Kombination mit anderen therapeutischen Anwendungsverfahren verabreicht werden, umfassend, aber nicht beschränkt auf, chemotherapeutische Mittel, immunotherapeutische Mittel, antimikrobielle Mittel, antivirale Mittel oder in Kombination mit Bestrahlungstherapie. Chemotherapeutische Mittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Antimetaboliten, DNA-schädigende Mittel, Mikrotubuli-destabilisierende Mittel, Mikrotubuli-stabilisierende Mittel, Actin-depolymerisierende Mittel, wachstumshemmende Mittel, Topoisomerase-hemmende Mittel, HMG-CoA-hemmende Mittel, Purin-hemmende Mittel, Pyrimidin-hemmende Mittel, Metalloproteinase-hemmende Mittel, CDK-hemmende Mittel, Angiogenese-hemmende Mittel und Differenzierung-fördernde Mittel.
Verabreichungswege umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, oral, topisch, subkutan, transdermal, subdermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravesikal, intraartikulär, intravenös, intradermal, intracraneal, intraläsional, intratumoral, intraokular, intrapulmonar, intraspinal, intraprostatisch, Platzierung in Hohlräumen im Körper, nasale Inhalation, pulmonale Inhalation, Eindrücken in die Haut und Elektroporation.
Abhängig von dem Verabreichungsweg beträgt das Volumen pro Dosis vorzugsweise etwa 0,001 bis 100 ml pro Dosis, stärker bevorzugt etwa 0,01 bis 50 ml pro Dosis und am stärksten bevorzugt etwa 0,1 bis 30 ml pro Dosis. Vorzugsweise ist die Menge der verabreichten Sequenz pro Dosis von etwa 0,001 bis 100 mg/kg, stärker bevorzugt von etwa 0,01 bis 10 mg/kg und am stärksten bevorzugt von etwa 0,1 bis 5 mg/kg. Die Sequenz SEQ ID NO:45 oder die Sequenz plus ein therapeutisches Mittel kann in einer Behandlung mit einer einzigen Dosis verabreicht werden, in Behandlungen mit mehreren Dosen oder kontinuierlich infundiert werden gemäß eines Verabreichungsplans und über einen Zeitraum, welcher für die zu behandelnde Erkrankung, den Zustand des Empfängers und den Verabreichungsweg geeignet ist. Darüber hinaus kann die Sequenz vor, zur gleichen Zeit oder nach der Verabreichung des therapeutischen Mittels verabreicht werden.
Die Sequenz SEQ ID NO:45 in Kombination mit einem chemotherapeutischen Mittel wird an ein Lebewesen mit Krebs in einer wirksamen Menge verabreicht, um die antineoplastische Wirkung des chemotherapeutischen Mittels zu potenzieren. Vorzugsweise ist die Menge eines therapeutischen Mittels, welches pro Dosis verabreicht wird, von etwa 0,001 bis 1000 mg/m² oder von etwa 0,01 bis 1000 mg/kg, stärker bevorzugt von etwa 0,01 bis 500 mg/m² oder von etwa 0,01 bis 500 mg/kg und am stärksten bevorzugt von etwa 0,1 bis 100 mg/m² oder von etwa 0,1 bis 100 mg/kg. Die bestimmte Sequenz und das bestimmte verabreichte therapeutische Mittel, die Menge pro Dosis, der Dosisverabreichungsplan und der Verabreichungsweg sollten durch den Ausführenden entschieden werden, wobei Verfahren verwendet werden, welche dem Fachmann bekannt sind und von der Art des Krebses, der Schwere der Krebserkrankung, der Lokalisierung des Krebses und anderen klinischen Faktoren, wie beispielsweise der Größe, dem Gewicht und dem physischen Zustand des Empfängers abhängen. Darüber hinaus können gegebenenfalls in vitro-Assays verwendet werden, um zu helfen, die optimalen Bereiche zur Sequenzverabreichung und zur Verabreichung von Sequenz plus therapeutisches Mittel zu bestimmen.
Obwohl es nicht erwünscht ist, durch die nachstehende Hypothese gebunden zu sein, wird angenommen, dass die Sequenz SEQ ID NO: 45 der vorliegenden Erfindung zu einer neuen Strukturfamilie gehört und dass sie nicht als Antisens-RNA, DNA, Triple-Helix-bildende DNA, Telomeraseinhibitor, Transkriptionsaktivator oder Transkriptionsinhibitor wirkt.
Die nachfolgenden Beispiele dienen dazu, die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen, wobei sie gleichzeitig aber keine Beschränkung davon darstellen.
Beispiel 1
Herstellung von Sequenzen
Phosphodiester- und Phosphorothioatesequenzen wurden hergestellt von HUKABEL Scientific Ltd, (Montréal, Québec, Kanada) unter Verwendung des EXPEDITE^TM 8900 automatisierten DNA-Synthesesystems (PersSeptive Biosystems, Inc., Farminghan, MA) und durch Sigma-Genosys (Woodlands, TX) unter Verwendung von Abacus Segmented Synthesis Technology. Soweit nicht anders angegeben, handelte es sich bei den verwendeten Sequenzen um Phosphodiestersequenzen. Soweit nicht anders angegeben, wurden die Sequenzen unmittelbar vor der Verwendung in autoklaviertem deionisiertem Wasser oder in einem autoklaviertem pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, Salzlösung, dispergiert.
Beispiel 2
Zellen und Reagenzien

Alle Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) bezogen und wurden in dem Medium, welches von der ATCC empfohlen wird, kultiviert. Tabelle 1 zeigt die Zelllinien, ihre Ursprünge und ihre Eigenschaften. Tabelle 1 Zelllinien

ZELLLINIE	URSPRUNG	EIGENSCHAFTEN
THP-1	humane akute monozytische Leukämie	Suspensionstumormodell p53 Null
MCF-7	humaner Brustkrebs	festes Tumormodell; nicht-metastatisch Kaspase 3-negativ; Östrogen-abhängig
JURKAT	humane T-Zell-Leukämie	Suspensionstumormodell atypische Multi-Arzneimittelresistenz assoziiert mit p190-MRP-Protein
PC-3	humaner Prostatakrebs	festes Tumormodell; metastatisch p53-mutiert; Androgen-unabhängig (hormonrefraktär)
LNCaP	humaner Prostatakrebs	festes Tumormodell; metastatisch TGF-Beta 1-Rezeptor-negativ; androgen-abhängig
OVCAR-3	humaner Eierstockkrebs	festes Tumormodell; metastatisch p53-mutiert; p21/waf-1/Cip-1-deletiert;
SK-OV-3	humaner Eierstockkrebs	festes Tumormodell; metastatisch p53-deletiert; p21/waf-1/Cipdeletiert; p15^ink4B, p16^ink4-deletiert
HL-60	humane promyelozytische Leukämie	Suspensionstumormodell p53-mutiert
EL-4	T-Lymphoma aus Maus	Suspensionstumormodell
A20	B-Zell-Leukämie aus Maus	Suspensionstumormodell
L-1210	Mausleukämie	Suspensionstumormodell
D-17	Osteosarkom aus Hund	Festtumormodell
CF-51	Brustdrüsenkrebs aus Hund	Festtumormodell

Die Zellen wurden in 6 (1 ml/Well), 24 (0,5 ml/Well) oder 96 (0,1 ml/Well) Wellmikroplatten mit flachem Boden ausgesät und wurden bei 37°C in einer 5% CO₂-Atmosphäre gehalten. Soweit nicht anders angegeben, wurden 2,5 × 10⁵ Zellen/ml mit 0 μg/ml (Kontrolle) und 100 μg/ml (behandelt) von 2 bis 45 Basen Sequenzen, welche A, C, G und T enthielten, für 48 Stunden inkubiert.
Beispiel 3
Messung von Zellproliferation
Die Zellproliferation wurde unter Verwendung von Dimethylthiazoldiphenyltetrazolium (MTT)-Reduktion gemessen (Mosmann et al. J. Immunol. Methods 65:55, 1983). Die MTT wurde bei einer Wellenlänge von 570 nm unter Verwendung einer Multiplattenspektrometerlesevorrichtung (ELX800, Bio-TEK Instruments Inc., Winooski, VT) gemessen.
Beispiel 4

Jurkat-T-Zellen wurden mit 6 Basen GT, AG, CG, GG, AGT und CGT Sequenzen inkubiert (Tabelle 2). Tabelle 2 %-Hemmung der Proliferation von humanen Jurkat-Leukämie-T-Zellen

Sequenz	%-Hemmung
TGTGTG-(TG)₃ SEQ ID NO:9-(6 Basen)	36
GTGTGT-(GT)₃ SEQ ID NO:10-(6 Basen)	48
TTTGTT-TT(TG)₁TT SEQ ID NO:23-(6 Basen)	31
GGTGGG-GG(TG)₁GG SEQ ID NO:24-(6 Basen)	48
GGGTGG-GG(GT)₁GG SEQ ID NO:25-(6 Basen)	60
TTGTTT-TT(GT)₁TT SEQ ID NO:26-(6 Basen)	34
AAGTAA-AA(GT)₁AA SEQ ID NO:27-(6 Basen)	13
CCGTCC-CC(GT)₁CC SEQ ID NO:28-(6 Basen)	11
TGGTTG-TG(GT)₁TG SEQ ID NO:29-(6 Basen)	42
ATGTAT-AT(GT)₁AT SEQ ID NO:30-(6 Basen)	26
AGGTGA-AG(GT)₁GA SEQ ID NO:31-(6 Basen)	10
GAGTGA-GA(GT)₁GA SEQ ID NO:32-(6 Basen)	24
GGGTCT-GG(GT)₁CT SEQ ID NO:33-(6 Basen)	15
CCGTGG-CC(GT)₁GG SEQ ID NO:34-(6 Basen)	37
GGGTCC-GG(GT)₁CC SEQ ID NO:35-(6 Basen)	20
CTGTCT-CT(GT)₁CT SEQ ID NO:36-(6 Basen)	19
TCGTTC-TC(GT)₁TC SEQ ID NO:37-(6 Basen)	20
CGGTGC-CG(GT)₁GC SEQ ID NO:38-(6 Basen)	16
TTGTGG-TT(GT)₁GG SEQ ID NO:39-(6 Basen)	35
GGGTTT-GG(GT)₁TT SEQ ID NO:40-(6 Basen)	31
GGTTGG-GG(TT)₁GG SEQ ID NO:41-(6 Basen)	43
GGAAGG-GG(AA)₁GG SEQ ID NO:42-(6 Basen)	22
GGCCGG-GG(CC)₁GG SEQ ID NO:43-(6 Basen)	29
GGGGGG-GG(GG)₁GG SEQ ID NO:44-(6 Basen)	26
GGGAGG-GG(GA)₁GG (Erfindung) SEQ ID NO:45-(6 Basen)	28
GGGCGG-GG(GC)₁GG SEQ ID NO:46-(6 Basen)	23
GGAGGG-GG(AG)₁GG SEQ ID NO:47-(6 Basen)	14
GTGGGG-(GT)₁G₄ SEQ ID NO:48-(6 Basen)	26
TTAGGG-TT(AG)₁GG SEQ ID NO:49-(6 Basen)	45

Wie in Tabelle 2 gezeigt, hemmten 6 Basen GT-Sequenzen Jurkat-T-Zellproliferation. GT SEQ ID NO:25 hemmte die Proliferation 60% und AGT SEQ ID NO:49 hemmte die Proliferation 45%. Ein Vergleich der relativen Wirksamkeit von GT SEQ ID NO:25 und AGT SEQ ID NO:49 unter Verwendung von PHARM/PCS-4 Software (Microcomputer Specialists, Philadelphia, PA) zeigte, dass die Wirksamkeit von GT SEQ ID NO:25 3,4-mal die von AGT SEQ ID NO:49 war. Von AGT SEQ ID NO:49-Phosphorothioat wird beschrieben, dass es Telomeraseaktivität hemmt und Apoptose in Burkitt-Lymphom-Zellen induziert (Mata et al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189, 1997).
Um die Telomeraseaktivität zu bestimmen, wurden Extrakte von 2 × 10⁵ Jurkat-T-Zellen unter Verwendung des PCR-Telomer-Repeat-Amplifizierungsprotokolls (Telomeric Repeat Amplification Protocol) (TRAP) untersucht (Roche, Laval, Québec, Kanada). Bei Konzentrationen zwischen 1 und 100 μg/ml zeigte GT SEQ ID NO:25-Phosphodiester zwischen 0 und 10% Anti-Telomeraseaktivität, wohingegen AGT SEQ ID NO:49-Phosphorothioat zwischen 30 und 75% Anti-Telomeraseaktivität zeigte. Weder GT-SEQ ID NO:25-Phosphorothiat noch GT SEQ ID NO:49-Phosphodiester zeigten irgendein Anti-Telomeraseaktivität.
Beispiel 5 (Vergleich)
Hemmung der Zellproliferation durch Phosphodiester- und Phosphorothioatsequenzen
Die Modifizierung von natürlichen Phosphodiestersequenzen durch Substitution eines Schwefelatoms für ein nicht-verbrückendes Sauerstoffatom an einer oder mehreren der Phosphatgruppen ist beschrieben worden, um die Stabilität von Oligonukleotidsequenzen gegenüber Endonukleasen in biologischen Fluiden und Zellen zu steigern (Crooke et al. Anticancer Drugs 6:609, 1991).

Humane Jurkat-Leukämie-T-Zellen (Tabelle 3), humane LNCaP-Prostatakrebszellen (5 × 10⁵ Zellen/ml) (Tabelle 4) und humane MCF-7-Brustkrebszellen (5 × 10⁵ Zellen/ml) (Tabelle 5) wurden mit 6 Basen GT Sequenzen inkubiert, welche entweder Sauerstoff (Phosphodiester) oder Schwefel (Phosphorothioat) als nicht-verbrückendes Atom an der Phosphatgruppe aufwiesen. Tabelle 3 %-Hemmung der Proliferation von humanen Jurkat-Leukämie-T-Zellen

Sequenz	%-Hemmung
	Phosphodiester	Phosphorothioat
TGTGTG-(TG)₃ (6 Basen) SEQ ID NO:9 Phosphodiester; Phosphorothioat	37	–17
GTGTGT-(GT)₃ (6 Basen) SEQ ID NO:10 Phosphodiester; Phosphorothioat	44	0
TTTGTT-TT(TG)₁TT (6 Basen) SEQ ID NO:23 Phosphodiester; Phosphorothioat	31	4
GGTGGG-GG(TG)₁GG (6 Basen) SEQ ID NO:24 Phosphodiester; Phosphorothioat	48	6
GGGTGG-GG(GT)₁GG (6 Basen) SEQ ID NO:25 Phosphodiester; Phosphorothioat	60	0
TTGTTT-TT(GT)₁TT (6 Basen) SEQ ID NO:26 Phosphodiester; Phosphorothioat	34	0

Tabelle 4 %-Hemmung der Proliferation von humanen LNCaP-Prostatakrebszellen

Sequenz	%-Hemmung
	Phosphodiester	Phosphorothioat
TGTGTG-(TG)₃ (6 Basen) SEQ ID NO:9 Phosphodiester; Phosphorothioat	–9	–16
GTGTGT-(GT)₃ (6 Basen) SEQ ID NO:10 Phosphodiester; Phosphorothioat	–4	–20
TTTGTT-TT(TG)₁TT (6 Basen) SEQ ID NO:23 Phosphodiester; Phosphorothioat	14	–11
GGTGGG-GG(TG)₁GG (6 Basen) SEQ ID NO:24 Phosphodiester; Phosphorothioat	17	–17
GGGTGG-GG(GT)₁GG (6 Basen) SEQ ID NO:25 Phosphodiester; Phosphorothioat	18	–8
TTGTTT-TT(GT)₁TT (6 Basen) SEQ ID NO:26 Phosphodiester; Phosphorothioat	22	–1

Tabelle 5 %-Hemmung der Proliferation von humanen MCF-7-Brustkrebszellen

Sequenz	%-Hemmung
	Phosphodiester	Phosphorothioat
TGTGTG-(TG)₃ (6 Basen) SEQ ID NO:9 Phosphodiester; Phosphorothioat	6	6
GTGTGT-(GT)₃ (6 Basen) SEQ ID NO:10 Phosphodiester; Phosphorothioat	31	12
TTTGTT-TT(TG)₁TT (6 Basen) SEQ ID NO:23 Phosphodiester; Phosphorothioat	7	8
GGTGGG-GG(TG)₁GG (6 Basen) SEQ ID NO:24 Phosphodiester; Phosphorothioat	41	12
GGGTGG-GG(GT)₁GG (6 Basen) SEQ ID NO:25 Phosphodiester; Phosphorothioat	41	12
TTGTTT-TT(GT)₁TT (6 Basen) SEQ ID NO:26 Phosphodiester; Phosphorothioat	20	6

Wie in den Tabellen 3, 4 und 5 gezeigt, hemmten 6 Basen GT Phosphodiestersequenzen Jurkat-T-, LNCaP- und MCF-7-Zellproliferation wirksamer als 6 Basen GT Phosphorothioatsequenzen.
Beispiel 6 (Vergleich)
Hemmung der Zellproliferation durch gemischte Phosphodiester- und Phosphorothioatsequenzen

Humane Jurkat-Leukämie-T-Zellen (Tabelle 16) und humane MCF-7-Brustkrebszellen (5 × 10⁵ Zellen/ml) (Tabelle 17) wurden mit der 6 Basen GT SEQ ID NO:25 inkubiert, wobei entweder Sauerstoff (Phosphodiester) oder Schwefel (Phosphorothioat) das nicht-verbrückende Atom an der Phosphatgruppe darstellte. Tabelle 6 %-Hemmung der Proliferation von humanen Jurkat-Leukämie-T-Zellen

Sequenz*	%-Hemmung
G_oG_oG_oT_oG_oG_o-G_oG_o(G_oT_o)₁G_oG_o; (Sauerstoffatom 1 bis 6) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	60
G_oG_oG_sT_oG_oG_o-G_oG_o(G_sT_o)₁G_oG_o; (Sauerstoffatom 1, 2, 4, 5, 6; Schwefelatom 3) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	17
G_oG_oG_oT_sG_oG_o-G_oG_o(G_oT_s)₁G_oG_o; (Sauerstoffatom 1, 2, 3, 5, 6; Schwefelatom 4) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	12
G_oG_oG_sT_sG_oG_o-G_oG_o(G_sT_s)₁G_oG_o; (Sauerstoffatom 1, 2, 5, 6; Schwefelatom 3, 4) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	13
G_sG_oG_oT_oG_oG_o-G_sG_o(G_oT_o)₁G_oG_s; (Sauerstoffatom 2, 3, 4, 5; Schwefelatom 1, 6) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	16
G_oG_sG_oT_oG_sG_o-G_oG_s(G_oT_o)₁G_sG_o; (Sauerstoffatom 1, 3, 4, 6; Schwefelatom 2, 5) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	11
G_sG_sG_oT_oG_sG_s-G_sG_s(G_oT_o)₁G_sG_s; (Sauerstoffatom 3, 4; Schwefelatom: 1, 2, 5, 6) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	–13
G_sG_sG_sT_sG_sG_s-G_sG_s(G_sT_s)₁G_sG_s; (Schwefelatom 1 bis 6) SEQ ID NO:25-(6 Basen; Phosphorothioat)	0

*Anmerkung: „o" stellt ein Sauerstoffatom dar und „s" stellt ein Schwefelatom an der Phosphatgruppe dar.

Sequenz*	%-Hemmung
G_oG_oG_oT_oG_oG_o-G_oG_o(G_oT_o)₁G_oG_o; (Sauerstoffatom 1 bis 6) SEQ ID NO:25-(6 Basen; Phosphodiester)	41
G_oG_oG_sT_oG_oG_o-G_oG_o(G_sT_o)₁G_oG_o; (Sauerstoffatom 1, 2, 4, 5, 6; Schwefelatom 3) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	12
G_oG_oG_oT_sG_oG_o-G_oG_o(G_oT_s)₁G_oG_o; (Sauerstoffatom 1, 2, 3, 5, 6; Schwefelatom 4) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	0
G_oG_oG_sT_sG_oG_o-G_oG_o(G_sT_s)₁G_oG_o; (Sauerstoffatom 1, 2, 5, 6; Schwefelatom 3, 4) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	43
G_sG_oG_oT_oG_oG_o-G_sG_o(G_oT_o)₁G_oG_s; (Sauerstoffatom 2, 3, 4, 5; Schwefelatom 1, 6) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	12
G_oG_sG_oT_oG_sG_o-G_oG_s(G_oT_o)₁G_sG_o; (Sauerstoffatom 1, 3, 4, 6; Schwefelatom 2, 5) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	13
G_sG_sG_oT_oG_sG_s-G_sG_s(G_oT_o)₁G_sG_s; (Sauerstoffatom 3, 4; Schwefelatom: 1, 2, 5, 6) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	–3
G_sG_sG_sT_sG_sG_s-G_sG_s(G_sT_s)₁G_sG_s; (Schwefelatom 1 bis 6) SEQ ID NO:25-(6 Basen; Phosphorothioat)	12

* Anmerkung: „o" stellt ein Sauerstoffatom dar und „s" stellt ein Schwefelatom an der Phosphatgruppe dar.

Wie in den Tabellen 6 und 7 gezeigt führt die Substitution von einem Schwefelatom für ein nicht-verbrückendes Sauerstoffatom an einer oder mehreren Phosphatgruppen der 6 Basen GT SEQ ID NO:25 zu einer signifikanten Verringerung der Hemmung von Jurkat-T- und MCF-7-Zellproliferation.
Beispiel 7 (Vergleich)
Induktion von Zellzyklusarrest
Die Zellzyklusstufe wurde unter Verwendung eines handelsüblichen CYCLETEST^TM PLUS DNA-Kits (Becton Dickinson) bestimmt. In Kürze, Kerne aus Zellen wurden durch Lösen der Zellmembran in einem nicht-ionischen Detergens, Entfernen des Zellzytoskeletts und. von Kernproteinen mit Trypsin, Verdau der zellulären RNA mit RNase und Stabilisieren des Kernchromatins mit Spermin erhalten. Es wurde Propidiumiodid zu den Zellkernen hinzugegeben und es wurde ihre Fluoreszenz in einem Flusszytometer, welches mit der Fähigkeit zur elektonischen Duplettunterscheidung ausgestattet war, analysiert (FACSCalibur, Becton Dickinson, San José, CA). Es wurde die Akkumulierung von Zellen in G₀/G₁-, frühen S (SE)-, mittleren S (SM)-, späten S (SL)- oder G₂/M-Phasen des Zellzyklus unter Verwendung von MODFIT LT-Software (Verity Software House Inc., Topsham, MA) analysiert.

Exponentiell wachsende humane Jurkat-Leukämie-T-Zellen (Tabelle 8) und humane MCF-7-Brustkrebszellen (5 × 10⁵ Zellen/ml) (Tabelle 9) wurden für 24 Stunden mit 2, 6, 15, 18, 27 und 45 Basen Sequenzen, welche A, C, G und T enthielten, inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt und zentrifugiert und es wurde das Zellzyklusstadium bestimmt. Tabelle 8 Induktion von Zellzyklusarrest in humanen Jurkat-T-Leukämiezellen

	% Zellen in Phase:
	G₀/G₁	SE	SM	SL	G₂/M	Arrest*
unbehandelte Zellen	31,4	19,1	14,3	11,6	23,6	Keiner
GG(GT)₁GG SEQ ID NO:25-(6 Basen)	28,5	46,3	14,6	10,7	0,0	Ende SE
TT(GT)₁TT SEQ ID NO:26-(6 Basen)	32,6	11,5	12,8	10,7	32,4	Ende G₂/M (schwach)
GT(GT)₁GT SEQ ID NO:10-(6 Basen)	30,8	41,9	16,8	10,2	0,3	Ende SE
AG(GT)₁GA SEQ ID NO:31-(6 Basen)	35,2	29,1	10,4	8,2	17,1	Mitte SE
GG(AA)₁GG SEQ ID NO:42-(6 Basen)	48,0	19,8	8,5	5,8	34,1	Ende G₀/G₁
GG(CC)₁GG SEQ ID NO:43-(6 Basen)	26,5	21,3	22,8	10,7	18,7	Ende SM (schwach)
GG(GT)₁GG SEQ ID NO:25-(6 Basen Phosphorothioat)	34,9	14,8	15,0	10,6	24,7	keiner
(G₁T)₁₃G SEQ ID NO:1-(27 Basen)	40,6	35,6	14,2	9,3	0,3	Ende SE
(G₁T)₁₃G SEQ ID NO:1-(27 Basen Phosphorothioat)	33,7	17,6	13,2	11,0	24,5	keiner
(G₃T₆)G₃ SEQ ID NO:2-(27 Basen)	34,3	15,5	13,6	10,3	26,4	keiner
(G₅T)₄G₃ SEQ ID NO:3-(27 Basen)	40,5	13,3	12,9	9,7	23,6	keiner
(G₇T₃)G₃ SEQ ID NO:4-(27 Basen)	36,5	16,3	13,8	11,1	22,3	keiner
AACCACAAGCCCAAC SEQ ID NO:67-(15 Basen)	39,6	13,5	12,8	9,5	24,6	keiner
TT(AG)₁GG SEQ ID NO:49-(6 Basen)	24,6	37,2	19,5	5,9	12,8	Mitte SM
(GT)₉ SEQ ID NO:18-(18 Basen)	24,2	26,7	24,0	8,7	16,4	Mitte SM
BCG A-1 SEQ ID NO:71-(45 Basen)	19,8	31,7	22,5	14,0	12,0	Mitte SM
BGC A-3 SEQ ID NO:73-(45 Basen)	32,3	20,2	14,1	12,0	21,4	keiner
TG SEQ ID NO:51-(2 Basen)	23,1	52,3	14,8	9,8	0,0	Ende SE

Wie in Tabelle 8 gezeigt, induzierten in Jurkat-T-Zellen 2, 6 und 27 Basen GT Sequenzen Arrest in der SE-Phase des Zellzyklus, 6 Basen CG und AGT, 18 Basen GT und 45 Basen BCG A-1 Sequenzen induzierten Arrest in der SM-Phase des Zellzyklus und eine 6 Basen AG Sequenz induzierte Arrest in der G₀/G₁-Phase des Zellzyklus. Tabelle 9 Induktion von Zellzyklusarrest in humanen MCF-7-Brustkrebszellen

	% Zellen in Phase:
	G₀/G₁	SE	SM	SL	G₂/M	Arrest*
unbehandelte Zellen	23,6	14,4	10,8	11,1	40,1	Keiner
GG(GT)₁GG SEQ ID NO:25-(6 Basen)	21,9	27,6	22,2	10,9	17,4	Ende SM
TT(AG)₁GG SEQ ID NO:49-(6 Basen)	20,0	18,6	25,7	20,7	15,0	Mitte SM
(GT)₉ SEQ ID NO:18-(18 Basen)	25,3	31,6	16,9	10,5	15,7	Mitte SM
TG SEQ ID N0:51-(2 Basen)	17,2	36,4	13,4	14,1	17,9	Ende SE

Wie in der Tabelle 29 gezeigt, induzierten in MCF-7 Zellen 2 und 6 Basen GT Sequenzen Arrest in der SE-Phase des Zellzyklus, eine 6 Basen AGT Sequenz und eine 18 Basen GT Sequenz induzierten Arrest in der SM-Phase des Zellzyklus.
Beispiel 8 ( Vergleich)
Induktion des Zellzyklusarrests durch GT SEQ ID NO:25, AC SEQ ID: 79 und GT SEQ ID NO:25 + AC SEQ ID NO:79

Humanzellen Jurkat-Leukämie-T-Zellen (1 × 10⁶ Zellen/ml) wurden für 24 Stunden mit 6 Basen GT SEQ NO:25, komplementären 6 Basen AC SEQ ID NO:79 und 6 Basen GT SEQ ID NO:25 + 6 Basen AC SEQ ID NO:79 inkubiert. GT SEQ ID NO:25 und AC SEQ ID NO:79 wurden durch Mischen der Oligonukleotide (1:1) und Erwärmen für 10 Minuten bei 65°C hybridisiert. Als Kontrollen wurden GT SEQ ID NO:25 und AC SEQ ID NO:79 für 10 Minuten bei 65°C erwärmt (Tabelle 30). Tabelle 10 Induktion von Zellzyklusarrest in humanen Jurkat-Leukämie-T-Zellen

	% Zellen in Phase:
	G₀/G₁	SE	SM	SL	G₂/M	Arrest
unbehandelte Zellen	31,7	15,2	13,7	14,0	25,4	Keiner
GG(GT)₁GG SEQ ID NO:25-(6 Basen)	28,0	45,8	14,0	11,3	0,9	Ende SE
CC(AC)₁CC SEQ ID NO:79-(6 Basen)	36,0	10,4	13,4	9,7	30,5	Keiner
GG(GT)₁GG + CC(AC)₁CC SEQ ID NO:25 + SEQ ID NO:79-(12 Basen)	35,0	13,0	10,1	8,7	33,2	Keiner

Wie in Tabelle 30 gezeigt, induzierte 6 Basen GT SEQ ID NO:25 Arrest am Ende der SE-Phase des Zellzyklus, wohingegen die komplementäre 6 Basen AC SEQ ID NO:79 keine Wirkung auf den Zellzyklus aufwies. Hybridisierung von GT SEQ ID NO:25 und AC SEQ ID NO:79 neutralisierte die GT SEQ ID NO:25-Induktion des Zellzyklusarrests. Diese Daten zeigen, dass die Sequenzen der vorliegenden Erfindung einzelsträngig sein müssen, um wirksam zu sein.
Beispiel 9
Induktion von Apoptose
Die Umverteilung von Plasmamembranphosphatidylserin und die Freisetzung von Kernmatrixprotein (NuMA) sind Merkmale für Zellen, welche Apoptose durchlaufen (Martin et al. J. Exp. Med., 182:1545, 1995; Miller et al. Biotechniques, 15:1042, 1993).
Die Umverteilung von Phosphatidylserin in der Plasmamembran während Apoptose wurde durch Flusszytometrie unter Verwendung von FITC-konjugiertem Annexin V (BD Pharmingen, San Diego, CA) gemessen. Die NuMA-Freisetzung in den Überstand wurde unter Verwendung eines handelsüblichen ELISA-Kits bestimmt (Oncogen/Calbiochem, Cambridge, MA).

Humane Jurkat-Leukämie-T-Zellen wurden mit 50 μM 3, 4, 5, 6 und 7 GT Basen Sequenzen, einer 5 Basen ACGT-Sequenz, 6 Basen AG, GG, AGT und CGT Sequenzen und einer 7 Basen GG-Sequenz inkubiert. Tabelle 31 zeigt % Zellen in Apoptose (positiv für Phosphatidylserin/Annexin V-Färbung (PS/A-V)) und % NuMA, welches aus den Zellen freigesetzt wird. Tabelle 11 Induktion von Apoptose in Jurkat-T-Zell-Leukämiezellen

Sequenz	% Zellen in Apoptose (hinsichtlich PS/A-V-Färbung positiv)	% NuMA freigesetzt (behandelte gegenüber unbehandelten Zellen)
unbehandelte Zellen	4	0
GG(GT)₁GG SEQ ID NO:2-(6 Basen)	27	69
GG(GA)₁GG (Erfindung) SEQ ID NO:45-(6 Basen)	27	74
GG(GC)₁GG SEQ ID NO:46-(6 Basen)	16	11
GG(GG)₁GG SEQ ID NO:44-(6 Basen)	5	0
AA(GT)₁AA SEQ ID NO:27-(6 Basen)	20	56
CC(GT)₁CC SEQ ID NO:28-(6 Basen)	6	0
TT(GT)₁TT SEQ ID NO:26-(6 Basen)	14	23
GT(GT)₁GT SEQ ID NO:10-(6 Basen)	33	90
GG(GT)₁ SEQ ID NO:78-(4 Basen)	21	64
(GT)₁GG SEQ ID NO:52-(4 Basen)	24	60
G(GT)₁G SEQ ID NO:56-(4 Basen)	24	112
(GT)₁G SEQ ID NO:8-(3 Basen)	21	97
T(GT)₁ SEQ ID NO:7-(3 Basen)	10	35
GG(GT)₁G SEQ ID NO:6-(5 Basen)	25	92
G(GT)₁GG SEQ ID NO:60-(5 Basen)	25	120
GG(GG)₁GGG SEQ ID NO:63-(7 Basen)	12	26
GGG(GT)₁GG SEQ ID NO:62-(7 Basen)	30	123
CG(GT)₁A SEQ ID NO:80-(5 Basen)	6	9

Wie in Tabelle 31 gezeigt, induzierten 3, 4, 5 und 6 Basen GT, AG, CG und AGT Sequenzen Apoptose von Jurkat-T-Zellen. Fünf Basen ACGT und 6 Basen CGT und GG Sequenzen induzierten keine Apoptose von Jurkat-T-Zellen.
Beispiel 10 (Vergleich)
Anstieg von intrazellulärem Calcium (Ca²⁺)_i
Es wird beschrieben, dass Anstiege von intrazellulärem Calcium (Ca² ⁺)_i mit Apoptose-Induktion assoziiert sind (Lam et al. Mol. Endocrinol. 7:686, 1993). (Ca²⁺)_i wurde unter Verwendung der fluoreszierenden Sonde Fluo-3-AM (Cell Permaant, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) verfolgt. Ein Anstieg an Fluo-3-AM-Fluoreszenz ist für einen Anstieg an (Ca² ⁺)_i indikativ.
Humane Jurkat-Leukämie-T-Zellen wurden für 24 Stunden mit 6 Basen GT SEQ. NO:25 inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, in PBS, welches 1% FBS enthielt, suspendiert und mit 10 μM Fluo-3-AM für 1 Stunde bei 37°C beladen. Die Zellfluoreszenz wurde bei 488 nm Anregung und 530 nm Emission (FL1-Detektor) gemessen. Die Daten wurden auf einem FACSCALIBUR analysiert, wobei das Programm CellQUEST (Becton Dickinson) verwendet wurde.
Wie in 1 gezeigt, verursachte die Inkubation von Jurkat-T-Zellen mit 6 Basen GT SEQ ID NO:25 einen 88%-igen Anstieg der Zellfluoreszenz, welcher für einen Anstieg von (Ca² ⁺)_i indikativ ist.
Beispiel 11
Induktion von Zytokinproduktion
Soweit nicht anders angegeben, wurden 1 × 10⁶ Zellen mit 100 μg/ml einer jeden der Sequenzen, welche für 48 Stunden bei 27°C in 5% CO₂ getestet worden waren, inkubiert. Die Produktion der Zytokine IL-6, IL-10, IL-12, IL-1-Beta und TNF-Alpha wurde in pg/ml in 100 μl Kulturüberstand bestimmt, wobei der geeignete handelsübliche ELISA (BioSource, Camarillo, CA) verwendet wurde. Der IL-12 ELISA misst sowohl den IL-12 p70-Komplex als auch die freie p40-Untereinheit. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als der „mehrfache" (x) Anstieg der Zytokinproduktion durch behandelte Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen.
Humane THP-1 akute monozytische Leukämiezellen wurden mit 2, 3, 6, 9, 12, 14, 15 und 18 Basen GT Sequenzen inkubiert und es wurde die Produktion des Zytokins IL-6 bestimmt (Tabelle 35). Tabelle 12 Zytokinproduktion durch humane THP-1 akute monozytische Leukämiezellen
Wie in Tabelle 35 gezeigt, erhöhten 2, 3, 6, 9, 12, 14, 15 und 18 Basen GT Sequenzen die THP-1-Zellproduktion des Zytokins IL-6.
Humane THP-1 akute monozytische Leukämiezellen wurden mit 6 Basen GT, AG, CG, GG, AGT und CGT Sequenzen inkubiert und es wurde die Produktion der Zytokine IL-12 und IL-6 bestimmt (Tabelle 13). Tabelle 13 Zytokinproduktion durch humane THP-1 akute monozytische Leukämiezellen
Wie in Tabelle 13 gezeigt, erhöhten 6 Basen GT, AG, CG, GG, AGT und CGT Sequenzen die THP-1-Zellproduktion der Zytokine IL-12 und IL-6.

Tabelle 14 fasst die Induktion von IL-12- und IL-6-Synthese durch 6 Basen Sequenzen zusammen. Tabelle 14 IL-6- und IL-12-Synthese induziert durch 6 Basen Sequenzen

-facher Anstieg	IL-12-Synthese SEQ ID NOn:	IL-6 Synthese SEQ ID NOn:
≤ 2,0	9, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 44, 45, 49
> 2,0 und ≤ 10,0	10, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 45	9, 10, 23, 24, 25, 26, 30, 31, 32, 33, 38, 39, 46, 49
> 10,0		25, 27, 29, 34, 35, 36, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 45

Von BCG-abgeleiteten Sequenzen A-3 (SEQ ID NO:73), A-4 (SEQ ID NO:74), A-6 (SEQ ID NO:75), A-7 (SEQ ID NO:76), M3 (SEQ ID NO:77) und Alpha 1 (SEQ ID NO:78) wird beschrieben, dass sie NK-Zellen in vivo aktivieren (Kataoka et al., Jpn. J. Cancer Res. 83:244, 1992). Humane THP-1 akute monozytische Leukämiezellen wurden mit 45 Basen BCG-abgeleiteten Sequenzen inkubiert und es wurde die Produktion der Zytokine IL-12 und IL-6 bestimmt (Tabelle 15). Tabelle 15 (Vergleich) Zytokinproduktion durch humane THP-1 akute monozytische Leukämiezellen
Wie in Tabelle 15 gezeigt, erhöhten 45 Basen BCG-abgeleitete Sequenzen die THP-1-Zellproduktion von IL-12 und IL-6 minimal.
Beispiel 12 (Vergleich)
Induktion von IL-12 Produktion durch Phosphodiester- und Phosphorothioatsequenzen

Humane THP-1 akute monozytische Leukämiezellen wurden mit 6 Basen GT Sequenzen inkubiert, welche entweder ein Sauerstoffatom (Phosphodiester) oder ein Schwefelatom (Phosphorothioat) als das nicht-verbrückende Atom an den Phosphatgruppen enthielten und es wurde die Produktion des Zytokins IL-12 bestimmt (Tabelle 16). Tabelle 16 IL-12-Produktion durch humane THP-1 akute monozytische Leukämiezellen

Sequenz	Anstieg
	Phosphodiester	Phosphorothioat
TGTGTG-(TG)₃ (6 Basen) SEQ ID NO:9 Phosphodiester; Phosphorothioat	1,8 x	–0,1 x
GTGTGT-(GT)₃ (6 Basen) SEQ ID NO:10 Phosphodiester; Phosphorothioat	2,2 x	–0,2 x
TTTGT-TT(TG)₁TT (6 Basen) SEQ ID NO:23 Phosphodiester; Phosphorothioat	3,5 x	0,1 x
GGTGGG-GG(TG)₁GG (6 Basen) SEQ ID NO:24 Phosphodiester; Phosphorothioat	3,7 x	–0,1 x
GGGTGG-GG(GT),GG (6 Basen) SEQ ID NO:25 Phosphodiester; Phosphorothioat	2,0 x	0,0 x
TTGTTT-TT(GT)₁TT (6 Basen) SEQ ID NO:26 Phosphodiester; Phosphorothioat	3,8 x	–0,1 x

Wie in Tabelle 16 gezeigt, führte die Substitution eines Schwefelatoms (Phosphorothioat) für ein nicht-verbrückendes Sauerstoffatom (Phosphodiester) an den Phosphatgruppen zu einer signifikanten Verringerung der THP-1 Zellproduktion von IL-12.

Humane THP-1 akute monozytische Leukämiezellen wurden mit 6 Basen GT SEQ ID NO:25 inkubiert, welche entweder ein Sauerstoffatom (Phosphodiester) oder ein Schwefelatom (Phosphorothioat) als das nicht-verbrückende Atom an den Phosphatgruppen aufwiesen und es wurde die Produktion des Zytokins IL-12 bestimmt (Tabelle 17). Tabelle 17 IL-12-Produktion durch humane THP-1 humane akute monozytische Leukämiezellen

Sequenz*	Anstieg
G_oG_oG_oT_oG_oG_o-G_oG_o(G_oT_o)₁G_oG_o; (Sauerstoffatom: Base 1 bis 6) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	2,0
G_oG_oG_sT_oG_oG_o-G_oG_o(G_sT_o)₁G_oG_o; (Sauerstoffatom: Base 1, 2, 4, 5, 6; Schwefelatom: Base 3) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	0,1
G_oG_oG_oT_sG_oG_o-G_oG_o(G_oT_s)₁G_oG_o; (Sauerstoffatom: Base 1, 2, 3, 5, 6; Schwefelatom: Base 4) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	0,2 x
G_oG_oG_sT_sG_oG_o-G_oG_o(G_sT_s)₁G_oG_o; (Sauerstoffatom: Base 1, 2, 5, 6; Schwefelatom: Base 3, 4) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	0,5 x
G_sG_oG_oT_oG_oG_s-G_sG_o(G_oT_o)₁G_oG_s; (Sauerstoffatom: Base 2, 3, 4, 5; Schwefelatom: Base 1, 6) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	–0,1 x
G_oG_sG_oT_oG_sG_o-G_oG_s(G_oT_o)₁G_sG_o; (Sauerstoffatom: Position 1, 3, 4, 6; Schwefelatom: Position 2, 5) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	–0,1 x
G_sG_sG_oT_oG_sG_s-G_sG_s(G_oT_o)₁G_sG_s; (Sauerstoffatom: Position 3, 4; Schwefelatom: Position 1, 2, 5, 6) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	0
G_sG_sG_sT_sG_sG_s-G_sG_s(G_sT_s)₁G_sG_s; (Schwefelatom: Position 1 bis 6) SEQ ID NO:25-(6 Basen)	0

Wie in Tabelle 17 gezeigt, führte die Substitution eines Schwefelatoms (Phosphorothioat) für ein nicht-verbrückendes Sauerstoffatom (Phosphodiester) in 6 Basen GT SEQ ID NO:25 zu einer signifikanten Verringerung hinsichtlich der THP-1-Zellproduktion von IL-12.
Beispiel 13
Stimulierung von Zytokinsynthese in humanen mononuklearen peripheren Blut- Zellen

Es wurden mononukleare periphere Blut-Zellen (peripheral blond mononuclear cells) (nachfolgend „PBMCs") aus 7 gesunden Menschen durch Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfée, Québec, Kanada) mittels Dichtegradientenzentrifugation von Gesamtblut isoliert. Die PBMCs wurden mit 6 Basen GT, AGT, CGT, AG, CG und GG Sequenzen inkubiert und es wurde die Produktion der Zytokine IL-1-Beta, IL-6, IL-10 und IL-12 bestimmt. Tabelle 18 Zytokinproduktion durch humane PBMC

Sequenzen	IL-1 beta fache Zunahme: Mittelwert +/– SD (Bereich)	IL-6 fache Zunahme: Mittelwert +/– SD (Bereich)	IL-10 fache Zunahme: Mittelwert +/– SD (Bereich)	IL-12 fache Zunahme: Mittelwert +/– SD (Bereich)
TG(TG)₁TG SEQ ID NO:9-(6 Basen)	1,2 +/– 0,4 (0,8–1,5)	8,3 +/– 12,8 (1,2–37,0)	1,0 +/– 0,1 (0,9–1,1)	2,7 +/– 2,6 (1,0–6,6)
GT(GT)₁GT SEQ ID NO:10-(6 Basen)	2,0 +/– 1,6 (0,9–3,8)	9,8 +/– 14,2 ( 0,8–39,1)	1,0 +/– 0,1 (0,9–1,1)	4,0 +/– 6,3 (0,9–18,1)
TG(TG)₄TG SEQ ID NO:13-(12 Basen)	2,4 +/– 1,9 (0,9–4,5)	12,1 +/– 6,5 (2,9–20,8)	1,2 +/– 0,4 (0,9–1,9)	4,4 +/– 5,3 (1,2–15,0)
GT(GT)₄GT SEQ ID NO:14-(12 Basen)	1,1 +/– 0,2 (0,9–1,3)	2,0 +/– 1,5 (0,9–4,9)	1,0 +/– 0,1 (0,9–1,2)	2,0 +/– 1,1 (0,9–2,6)
TT(TG)₁TT SEQ ID NO:23-(6 Basen)	1,0 +/– 0,1 (0,9–1,0)	11,8 +/– 9,0 (1,3–25,6)	1,0 +/– 0,1 (0,9–1,1)	1,1 +/– 0,3 (0,9–1,6)
GG(TG)₁GG SEQ ID NO:24-(6 Basen)	0,9 +/– 0,1 (0,9–1,0)	15,9 +/– 14,9 (0,7–37,1)	2,4 +/– 2,9 (1,0–7,5)	2,3 +/– 1,6 (0,9–5,5)
GG(GT)₁GG SEQ ID NO:25-(6 Basen)	1,0 +/– 0,1 (1,0–1,2)	20,9 +/– 18,0 (1,6–50,0)	11,6 +/– 1,2 (9,9–13,2)	13,2 +/– 11,5 (1,0–26,8)
TT(GT)₁TT SEQ ID NO:26-(6 Basen)	1,5 +/– 0,9 (0,9–2,5)	5,8 +/– 8,0 (0,5–21,7)	1,0 +/– 0,1 (1,0–1,2)	1,6 +/– 1,3 (0,8–4,5)
AA(GT)₁AA SEQ ID NO:27-(6 Basen)	1,3 +/– 0,5 (0,9–1,8)	9,6 +/– 7,3 (1,8–16,0)	1,0 +/– 0,1 (0,9–1,1)	2,4 +/– 2,2 (0,8–6,7)
CC(GT)₁CC SEQ ID NO:28-(6 Basen)	2,1 +/– 1,8 (0,8–4,1)	10,4 +/– 13,0 (1,4–35,8)	1,0 +/– 0,1 (1,0–1,1)	5,9 +/– 10,7 (0,9–30,0)
TG(GT)₁TG SEQ ID NO:29-(6 Basen)	1,7 +/– 1,0 (1,1–2,8)	9,3 +/– 12,1 (0,8–33,8)	1,0 +/– 0,1 (1,0–1,1)	3,3 +/– 4,2 (0,8–12,7)
AT(GT)₁AT SEQ ID NO:30-(6 Basen)	1,1 +/– 0,2 (1,0–1,4)	4,6 +/– 4,4 (1,6–14,4)	1,0 +/– 0,1 (0,9–1,1)	1,3 +/– 0,2 (1,0–1,6)
CT(GT)₁CT SEQ ID NO:36-(6 Basen)	1,2 +/– 0,3 (1,0–1,5)	5,3 +/– 3,6 (0,9–10,6)	1,0 +/– 0,1 (0,9–1,2)	1,2 +/– 0,3 (0,9–1,8)
TC(GT)₁TC SEQ ID NO:37-(6 Basen)	1,2 +/– 0,4 (0,9–1,6)	7,5 +/– 9,8 (0,7–27,0)	1,0 +/– 0,1 (0,9–1,1)	1,4 +/– 1,1 (0,9–3,8)
GG(TT)₁GG SEQ ID NO:41-(6 Basen)	3,2 +/– 3,0 (0,8–6,5)	7,8 +/– 12,8 (0,9–36,4)	1,0 +/– 0,1 (0,9–1,1)	4,9 +/– 8,6 (0,8–24,3)
GG(AA)₁GG SEQ ID NO:42-(6 Basen)	3,5 +/– 3,9 (0,8–8,0)	11,8 +/– 5,8 (1,2–15,6)	1,1 +/– 0,2 (0,9–1,5)	3,0 +/– 2,7 (1,1–8,6)
GG(CC)₁GG SEQ ID NO:43-(6 Basen)	1,5 +/– 0,9 (0,8–2,5)	14,9 +/– 10,2 (1,2–29,8)	1,2 +/– 0,3 (1,0–1,8)	2,5 +/– 2,0 (1,0–7,0)
GG(GG)₁GG SEQ ID NO:44-(6 Basen)	7,1 +/– 9,4 (0,8–17,9)	21,0 +/– 14,7 (4,6–42,0)	1,7 +/– 1,6 (0,9–4,6)	7,0 +/– 12,5 (1,3–35,3)
GG(GA)₁GG (Erfindung) SEQ ID NO:45-(6 Basen)	13,6 +/– 14,9 (1,2–30,2)	24,7 +/– 16,5 (5,9–50,0)	6,0 +/– 5,5 (2,1–15,5)	20,7 +/– 10,3 (5,7–35,3)
GG(GC)₁GG SEQ ID NO:46-(6 Basen)	1,2 +/– 0,3 (1,0–1,5)	15,8 +/– 16,2 (1,3–37,8)	10 +/– 0,1 (0,9–1,1)	3,0 +/– 3,8 (1,1–10,7)

Wie in Tabelle 18 gezeigt, erhöhten 6 Basen GT, AGT, CGT, AG, CG und GG Sequenzen die humane PBMC–Produktion der Zytokine IL-1-Beta, IL-6, IL-10 und IL-12.
Beispiel 14
Cytokinsynthese durch mononukleare periphere Blut-Zellen von Schimpansen

PBMCs wurden aus 4 gesunden Schimpansen wie in Beispiel 35 isoliert. Schimpansen PBMCs wurden mit 6 Basen GT, AGT, CGT, AG, CG und GG Sequenzen inkubiert und es wurde die Produktion der Zytokine IL-10, IL-12 und TNF-Alpha bestimmt (Tabelle 19). Tabelle 19 Zytokinproduktion durch Schimpansen-PBMC

Sequenzen	IL-10 fache Zunahme: Mittelwert +/– SD (Bereich)	IL-12 fache Zunahme: Mittelwert +/– SD (Bereich)	TNF-alpha fache Zunahme: Mittelwert +/– SD (Bereich)
TG(TG)₁TG SEQ ID NO:9-(6 Basen)	2,3 +/– 1,3 (1,3–4,1)	13,5 +/– 8,9 (2,8–21,1)	11,3 +/– 6,9 (5,3–19,5)
GT(GT)₁GT SEQ ID NO:1-(6 Basen)	4,0 +/– 2,1 (1,8–6,7)	14,0 +/– 8,5 (3,0–21,3)	12,9 +/– 6,4 (6,5–19,6)
TT(TG)₁TT SEQ ID NO:23-(6 Basen)	1,5 +/– 0,6 (1,0–2,4)	12,9 +/– 8,2 (2,7–20,1)	9,0 +/– 5,5 (4,1–14,4)
GG(TG)₁GG SEQ ID NO:24-(6 Basen)	2,9 +/– 1,5 (1,3–4,8)	14,3 +/– 9,1 (3,0–22,5)	11,9 +/– 7,0 (5,8–19,8)
GG(GT)₁GG SEQ ID NO:25-(6 Basen)	2,5 +/– 1,5 (1,4–4,6)	13,5 +/– 8,4 (2,8–20,8)	11,7 +/– 6,7 (5,9–19,6)
TT(GT)₁TT SEQ ID NO:26-(6 Basen)	1,4 +/– 0,9 (1,1–2,1)	12,3 +/– 8,5 (2,5–20,1)	7,5 +/– 4,6 (3,4–13,1)
AA(GT)₁AA SEQ ID NO:27-(6 Basen)	2,1 +/– 1,1 (1,1–3,7)	13,2 +/– 8,2 (2,8–19,8)	7,9 +/– 3,9 (4,6–12,0)
CC(GT)₁CC SEQ ID NO:28-(6 Basen)	3,8 +/– 2,8 (1,5–7,7)	13,3 +/– 8,4 (2,8–20,4)	10,3 +/– 5,7 (5,0–15,8)
TG(GT)₁TG SEQ ID NO:29-(6 Basen)	3,1 +/– 2,0 (1,6–5,9)	13,6 +/– 8,8 (2,9–21,9)	12,4 +/– 7,3 (6,1–20,8)
AT(GT)₁AT SEQ ID NO:30-(6 Basen)	1,4 +/– 0,4 (1,2–1,9)	10,7 +/– 7,0 (2,5–18,6)	5,9 +/– 3,3 (3,4–10,5)
CT(GT)₁CT SEQ ID NO:36-(6 Basen)	3,0 +/– 2,1 (1,2–5,9)	13,4 +/– 8,9 (2,8–20,4)	12,4 +/– 6,3 (7,0–19,6)
TC(GT)₁TC SEQ ID NO:37-(6 Basen)	3,4 +/– 2,6 (1,4–7,1)	14,1 +/– 10,0 (2,4–24,9)	11,4 +/– 6,4 (6,1–19,3)
GG(TT)₁GG SEQ ID NO:41-(6 Basen)	9,1 +/– 7,7 (3,0–20,3)	15,3 +/– 10,0 (2,9–25,9)	14,1 +/– 7,3 (7,7–23,2)
GG(AA)₁GG SEQ ID NO:42-(6 Basen)	9,9 +/– 8,9 (2,6–22,7)	15,6 +/– 10,6 (2,6–26,6)	14,4 +/– 7,1 (8,0–22,9)
GG(CC)₁GG SEQ ID NO:43-(6 Basen)	13,6 +/– 9,0 (4,3–26,7)	15,1 +/– 10,2 (2,8–26,6)	14,0 +/– 6,6 (7,9–22,3)
GG(GG)₁GG SEQ ID NO:44-(6 Basen)	11,2 +/– 9,1 (3,9–24,3)	15,1 +/– 10,0 (2,9–25,9)	13,8 +/– 6,5 (7,6–21,8)
GG(GA)₁GG (Erfindung) SEQ ID NO:45-(6 Basen)	9,9 +/– 9,2 (2,6–23,1)	15,9 +/– 10,7 (2,9–26,9)	14,5 +/– 6,9 (7,9–23,0)
GG(GC)₁GG SEQ ID NO:46-(6 Basen)	4,7 +/– 3,4 (1,7–9,3)	15,8 +/– 10,4 (3,0–26,2)	14,1 +/– 6,6 (8,3–21,7)

Wie in Tabelle 19 gezeigt, erhöhten 6 Basen GT, AGT, CGT, AG, CG und GG Sequenzen die Schimpansen-PBMC-Zellproduktion der Zytokine IL-10 und IL-12 und TNF-Alpha.
Beispiel 15
Zytokinsynthese durch mononukleare periphere Blut-Zellen von Rhesusaffen

PBMCs wurden aus 4 gesunden Rhesusaffen wie in Beispiel 35 isoliert. Die PBMCs wurden mit 6 Basen GT, AGT, CGT, AG, CG und GG Sequenzen inkubiert und es wurde die Produktion der Zytokine IL-6, IL-12 und TNF-Alpha bestimmt (Tabelle 42). Tabelle 20 Zytokinproduktion durch Rhesusaffen-PBMC

Sequenzen	IL-10 fache Zunahme: Mittelwert +/– SD (Bereich)	IL-12 fache Zunahme: Mittelwert +/– SD (Bereich)	TNF-alpha fache Zunahme: Mittelwert +/– SD (Bereich)
TG(TG)₁TG SEQ ID NO:9-(6 Basen)	1,1 +/– 0,2 (0,9–1,3)	10,6 +/– 4,2 (5,6–14,3)	14,3 +/– 6,3 (6,2–21,2)
GT(GT)₁GT SEQ ID NO:10-(6 Basen)	1,3 +/– 0,1 (1,1–1,4)	10,7 +/– 4,1 (6,1–15,8)	16,1 +/– 4,2 (11,0–21,6)
TT(TG)₁TT SEQ ID NO:23-(6 Basen)	1,0 +/– 0,1 (0,8–1,0)	6,7 +/– 3,6 (3,6–11,7)	4,4 +/– 3,8 (1,3–9,5)
GG(TG)₁GG SEQ ID NO:24-(6 Basen)	1,0 +/– 0,1 (1,0–1,1)	11,2 +/– 4,8 (5,6–16,8)	14,5 +/– 5,4 (7,7–20,0)
GG(GT)₁GG SEQ ID NO:25-(6 Basen)	1,0 +/– 0,1 (1,0–1,1)	10,6 +/– 4,7 (5,5–16,5)	12,5 +/– 5,2 (6,2–18,6)
TT(GT)₁TT SEQ ID NO:26-(6 Basen)	1,0 +/– 0,1 (1,0–1,2)	4,9 +/– 2,9 (2,6–8,8)	2,1 +/– 1,0 (1,3–3,4)
AA(GT)₁AA SEQ ID NO:27-(6 Basen)	0,9 +/– 0,1 (0,9–1,0)	7,6 +/– 2,6 (5,9–11,5)	6,0 +/– 5,0 (2,4–13,4)
CC(GT)₁CC SEQ ID NO:28-(6 Basen)	1,1 +/– 0,2 (0,9–1,2)	10,1 +/– 3,7 (6,2–15,7)	14,2 +/– 3,7 (9,6–18,6)
TG(GT)₁TG SEQ ID N:29-(6 Basen)	1,1 +/– 0,2 (0,9–1,2)	11,1 +/– 4,2 (6,5–15,7)	16,5 +/– 2,7 (14,0–19,1)
AT(GT)₁AT SEQ ID NO:30-(6 Basen)	1,9 +/– 1,4 (1,0–4,0)	6,0 +/– 1,9 (5,6–8,5)	6,9 +/– 4,7 (2,2–13,4)
CT(GT)₁CT SEQ ID NO:36-(6 Basen)	1,0 +/– 0,1 (0,9–1,1)	10,7 +/– 4,6 (6,2–16,4)	15,3 +/– 3,6 (11,2–19,8)
TC(GT)₁TC SEQ ID NO:37-(6 Basen)	1,1 +/– 0,2 (0,9–1,3)	10,0 +/– 3,8 (6,3–14,1)	14,71 +/– 3,1 (13,7–19,1)
GG(TT)₁GG SEQ ID NO:41-(6 Basen)	1,9 +/– 1,5 (1,0–4,1)	11,5 +/– 5,9 (4,3–17,2)	14,1 +/– 8,2 (2,5–20,7)
GG(AA)₁GG SEQ ID NO:42-(6 Basen)	1,2 +/– 0,2 (1,0–1,4)	11,9 +/– 5,4 (5,9–17,1)	16,5 +/– 4,5 (11,4–21,2)
GG(CC)₁GG SEQ ID NO:43-(6 Basen)	1,0 +/– 0,2 (0,8–1,2)	11,7 +/– 4,8 (6,2–16,4)	16,9 +/– 3,5 (13,9–21,1)
GG(GG)₁GG SEQ ID NO:44-(6 Basen)	2,1 +/– 1,0 (1,1–3,5)	10,7 +/– 5,6 (3,7–15,9)	13,9 +/– 8,5 (2,0–20,9)
GG(GA)₁GG (Erfindung) SEQ ID NO:45-(6 Basen)	1,1 +/– 0,1 (1,0–1,3)	11,9 +/– 4,5 (6,8–16,0)	16,7 +/– 4,6 (11,6–21,5)
GG(GC)₁GG SEQ ID NO:46-(6 Basen)	1,2 +/– 0,2 (1,0–1,4)	11,0 +/– 4,4 (6,3–16,1)	16,8 +/– 4,1 (11,9–21,8)

Wie in Tabelle 20 gezeigt, erhöhten 6 Basen GT, AGT, CGT, AG, CG und GG Sequenzen die Rhesusaffen-PBMC-Zellproduktion der Zytokine IL-10, IL-12 und TNF-Alpha.
Beispiel 16 (Vergleich)
Wirkung von 6 Basen GT SEQ ID NO:25, von 6 Basen GT SEQ ID NO:25 + 5-Fluoruracil und von 6 Basen GT SEQ ID NO:25 + Tamoxifen auf humane MCF-7-Brusttumore
Humane MCF-7-Brustkrebszellen werden subkutan als Heterotransplantate in weibliche nackte BALB/c-Mäuse implantiert. Die Mäuse werden in 6 Gruppen von 10 Mäusen aufgeteilt. An Tag 0 empfangen Mäuse der Gruppe 1 Salzlösung, Mäuse der Gruppe 2 empfangen 6 Basen GT SEQ ID NO:25, Mäuse der Gruppe 3 empfangen 5-Fluoruracil, Mäuse der Gruppe 4 empfangen Tamoxifen, Mäuse der Gruppe 5 empfangen 6 Basen GT SEQ ID NO:25 + 5-Fluoruracil und Mäuse der Gruppe 6 empfangen 6 Basen GT SEQ ID NO:25 + Tamoxifen. Nach 4 Wochen Behandlung werden die Mäuse geopfert und es wird die Tumormasse bestimmt. Mäuse der Gruppe 1 weisen die größte Tumormasse auf, Mäuse der Gruppen 2, 3 und 4 weisen eine niedrigere Tumormasse als Mäuse der Gruppe 1 auf und Mäuse der Gruppen 5 und 6 weisen eine niedrigere Tumormasse als Mäuse der Gruppen 1, 2, 3 und 4 auf.
Beispiel 17
Wirkung von 3 und 6 Basen GT Sequenzen und einer 45 Basen BCG A-3 Sequenz auf humane LNCaP Prostatakrebstumore
Humane LNCaP Prostatakrebszellen werden subkutan als Heterotransplantate in männliche nackte nu/nu-Mäuse implantiert. Die Mäuse werden in 5 Gruppen von 10 Mäusen aufgeteilt. An Tag 0 empfangen Mäuse der Gruppe 1 Salzlösung, Mäuse der Gruppe 2 empfangen 3 Basen SEQ ID NO:8, Mäuse der Gruppe 3 empfangen 6 Basen GT SEQ ID NO:25, Mäuse der Gruppe 4 empfangen 6 Basen AG SEQ ID NO:45 und Mäuse der Gruppe 5 empfangen 45 Basen BCG A-3 SEQ ID NO:69. Nach 4 Wochen Behandlung werden die Mäuse geopfert und es wird die Tumormasse bestimmt. Mäuse der Gruppe 1 weisen die größte Tumormasse auf, Mäuse der Gruppe 5 weisen eine niedrigere Tumormasse als Mäuse der Gruppe 1 auf und Mäuse der Gruppen 2, 3 und 4 weisen eine niedrigere Tumormasse als Mäuse der Gruppen 1 und 5 auf.
Beispiel 18
Wirkung von 3, 6, 8 und 27 Basen Sequenzen auf EL-4-Maus-T-Lymphoma
EL-4-Maus-T-Lymphomazellen werden in C57/BL6-Mäuse implantiert. Die Mäuse werden in 6 Gruppen von 10 Mäusen aufgeteilt. An Tag 0 empfangen Mäuse der Gruppe 1 Salzlösung, Mäuse der Gruppe 2 empfangen 3 Basen GT SEQ ID NO:8, Mäuse der Gruppe 3 empfangen 6 Basen AG SEQ ID NO:25, Mäuse der Gruppe 4 empfangen 6 Basen AG SEQ ID NO:45, Mäuse der Gruppe 5 empfangen 18 Basen GT SEQ ID NO:18 und Mäuse der Gruppe 6 empfangen 27 Basen GT SEQ ID NO:1. Nach 4 Wochen Behandlung werden die Mäuse geopfert und es wird die Tumormasse bestimmt. Mäuse der Gruppe 1 weisen die größte Tumormasse auf, Mäuse der Gruppen 2, 3, 4, 5 und 6 weisen eine niedrigere Tumormasse als Mäuse der Gruppe 1 auf.
Beispiel 19
Humane Dickdarmkrebszelllinien werden als adhärente Zellkulturen gehalten. Die Zellen werden in der exponentialen Wachstumsphase mit 2–20 Basen GT, GA, GC oder GG Sequenzen im Dosisbereich 0 μg/ml bis 100 μl/ml für 24–72 Stunden behandelt. Die Hemmung der Zellproliferation wird mittels MTT-Reduktion, Zellzyklusarrest mittels Flusszytometrie und Apoptose mittels Annexin-V-Bindung oder NuMA-Freisetzung gemessen. GT, GA, GC oder GG Sequenzen hemmen die Proliferation, induzieren Zellzyklusarrest und induzieren Apoptose in den Dickdarmkrebszelllinien.
SCID-Mäuse, welche subkutan humane kolorektale Krebszelllinien tragen, werden mit Salzlösung oder mit 2–20 Basen GT, GA, GC oder GG Sequenzen behandelt, welche Antikrebsaktivität gegen humane kolorektale Krebszelllinien in vitro aufweisen. Mäuse, welche mit 2–20 Basen GT, GA, GC oder GG Sequenzen behandelt werden, welche Antikrebsaktivität gegen humane kolorektale Krebszelllinien in vitro aufweisen, zeigen eine signifikante Verringerung der Tumormasse im Vergleich zu Mäusen, welche mit Salzlösung behandelt werden.
Sequenzprotokoll

Claims

Zusammensetzung umfassend eine isolierte 3'-OH, 5'-OH synthetische Phosphodiesternukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:45:gggagg und ferner umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, ferner umfassend ein chemotherapeutisches Mittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das chemotherapeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antimetaboliten, einem alkylierenden Mittel und einem Hormonantagonisten.
Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–3 bei der Herstellung eines Medikaments zur Induzierung einer Reaktion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Induktion von Zellzyklusarrest, Hemmung von Proliferation, Aktivierung von Kaspasen und Induktion von Apoptose in Krebszellen sowie Produktion von Zytokinen durch Immunsystemzellen, wobei die Zytokine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus IL-1-Beta, IL-6, IL-10, IL-12 und TNF-Alpha.
Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 oder 5, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Primärkarzinom, einem Sekundärkarzinom, einem Primärsarkom und einem Sekundärsarkom.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Leukämie, Lymphomakrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, kolorektalem Krebs, ovarialem Krebs und Knochenkrebs.