ES2307568T3 - Acidos nucleicos de tipo cpg y metodos de uso de los mismos. - Google Patents

Acidos nucleicos de tipo cpg y metodos de uso de los mismos. Download PDF

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ES2307568T3 ES01273824T ES01273824T ES2307568T3 ES 2307568 T3 ES2307568 T3 ES 2307568T3 ES 01273824 T ES01273824 T ES 01273824T ES 01273824 T ES01273824 T ES 01273824T ES 2307568 T3 ES2307568 T3 ES 2307568T3
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Abstract

Una composición, que comprende: un ácido nucleico inmunoestimulador que tiene una secuencia que incluye, al menos, la siguiente fórmula: 5''X1X2CGX3X43'' donde C es un nucleótido en el que la porción nucleosídica es 2''-metoxi citidina y donde X1, X2, X3 y X4 son nucleótidos, en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria.

Description

Ácidos nucleicos de tipo CpG y métodos de uso de los mismos.
Solicitud relacionada
La solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de EE.UU 60/254,341 presentada el 8 de Diciembre de 2000.
Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a ácidos nucleicos inmunoestimuladores, a composiciones de los mismos, y a métodos de utilización de ácidos nucleicos inmunoestimuladores.
Antecedentes de la invención
El ADN bacteriano, pero no el ADN de vertebrados, tiene fuertes efectos inmunoestimuladores para una amplia variedad de células inmunes humanas y de múridos. Krieg AM y cols. (1995) Nature 375:546-9; Hartmann y cols. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:9305-10; Hartmann G y cols. (2000) J Immunol 164:1617-24; Bauer M y cols. (1999) Immunology 97:699-705; Ballas ZK y cols. (1996) J Immunol 157:1840-5. Los dinucleótidos CpG no metilados son menos frecuentes en el ADN eucariótico que en el ADN bacteriano. Krieg AM y cols. (1995) Nature 375:546-9. Se ha demostrado que los dinucleótidos CpG no metilados dentro del contexto de bases flanqueantes específicas (llamados motivos CpG) tienen una amplia variedad de efectos en las células inmunes humanas, como las células B, las células asesinas naturales (NK), las células T, los macrófagos, los monocitos y las células dendríticas. Parronchi y cols. (1999) J immunol 163:5946-53; Krieg AM (1999) Biochim Biophys Acta 1489:107-16; Krieg AM y cols. (1995) Nature 375:546-9; Kranzer K y cols. (2000) Immunology 99:170-8; Hartmann G y cols. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:9305-10; Hartmann G y cols. (2000) J Immunol 164:944-53; Hartmann G y cols. (2000) J immunol 164:1617-24.
Como el ADN metilado de vertebrados no es inmunoestimulador y se conocía que los oligonucleótidos CpG metilados no son estimuladores de las células inmunes (Parronchi y cols. (1999) J immunol 163:5946-53; Hartmann G y cols. (2000) J Immunol 164:944-53), se pensó que la metilación podría, principalmente, prevenir la imnumoestimulación por los ácidos nucleicos que contienen CpG. Para más aplicaciones en el campo de la tecnología antisentido, donde la inmunoestimulación por los oligonucleótidos aplicados es indeseable, muchos de los trabajadores del campo de los antisentido comenzaron a utilizar oligonucleótidos metilados para su investigación con el propósito específico de evitar inmunoestimulación no deseada.
Además, mientras un número de estudios demuestran que la metilación de la C del dinucleótido CpG abortaba de forma efectiva el efecto inmunoestimulador de CpG, ningún estudio previo ha demostrado los efectos inmunoestimuladores del CpI.
Boggs, R.T. y cols. (1997) Antisense & Nucleic Acid Drug Development vol. 7 pp 461-471 investigaron los efectos estimuladores del motivo CpG en contextos específicos de secuencias, el efecto de las estructuras de fosforotioatos y de fosfodiester, metilando la citosina del CpG y modificando todas las citosinas en un ODN.
Henry, S. Et al (2000). The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics vol 292, nº 2, pp 468-479 investigaron las propiedades inmunoestimuladoras de oligodesoxinucleótidos fosforotioatos en ratones y el efecto de modificaciones químicas como los sustituyentes 5-metil citosina y 2'-metoxietilo.
Compendio de la invención
La invención proporciona composiciones y métodos útiles para inducir una respuesta inmunitaria y en el tratamiento de alergia, asma, cáncer, infección, anemia, trombocitopenia, y neutropenia. Las composiciones están relacionadas con ácidos nucleicos CpG que se llaman "ácidos nucleicos de tipo CpG" porque incorporan sustituciones específicas para la C, la G, o la C y la G del dinucleótido CpG mientras que sustancialmente retienen las propiedades inmunoestimulatorias de las moléculas de ácido nucleico CpG.
La presente invención proporciona una composición que comprende un ácido nucleico inmunoestimulador que tiene la secuencia que incluye, al menos, la siguiente fórmula:
5'X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
donde C es un nucleótido en donde la porción nucleosídica es 2'-metoxi citidina y donde X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria. Un ácido nucleico inmunoestimulador de acuerdo a esta realización de este aspecto de la invención se refiere aquí como un ácido nucleico CpG 2'-metoxi-C o 2'-OMe-C o, de forma equivalente, un oligonucleótido CpG 2'-metoxi-C o 2'-OMe-C. También, de acuerdo a este aspecto de la invención en algunas realizaciones, la composición además incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable y el ácido nucleico inmunoestimulador está presente en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria.
De acuerdo con los aspectos precedentes y las realizaciones de la invención, se aplica además lo siguiente. En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador es un ácido nucleico aislado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador tiene entre 6 y 100 nucleótidos, y en ciertas realizaciones preferidos, entre 8 y 40 nucleótidos.
También, de acuerdo con realizaciones preferidas, el ácido nucleido inmunoestimulador tiene una estructura modificada. En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador es un ácido nucleico sintético.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador tiene al menos 18 nucleótidos de longitud y no es un ácido nucleico antisentido.
Lo siguiente también se aplica a composiciones farmacéuticas precedentes de la invención que incluyen un ácido nucleico del de tipo CpG y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un dispositivo de liberación sostenida.
Las composiciones farmacéuticas, en algunas realizaciones, además incluyen un antígeno.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también incluye un medicamento anti-canceroso. Preferiblemente, el medicamento anti-canceroso se selecciona del grupo que cosiste en un anticuerpo monoclonal, un agente quimioterapéutico, y un agente radioterapéutico.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también incluye un agente antiviral, un agente antibacteriano, un agente antifúngico, o un agente antiparasitario.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también incluye un medicamento para la úlcera.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también incluye un medicamento para la alergia o un medicamento para el asma.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también incluye un medicamento para la anemia, un medicamento para la trombocitopenia, o un medicamento para la neutropenia.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también incluye una citoquina. Preferiblemente, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en interleuquina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-18, interferón alfa (IFN-\alpha), IFN-\gamma, factor alfa de necrosis tumoral (TNF-\alpha), ligando de Flt3, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), y factor estimulante de colonias granulocito-macrófago (GM-CSF).
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también incluye, al menos, dos ácidos nucleicos inmunoestimuladores que tienen diferentes secuencias.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también incluye un ácido nucleico CpG que tiene, al menos, un motivo CpG no metilado.
Otro aspecto de la invención proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria. El método implica la administración a un individuo de un ácido nucleico inmunoestimulador que tiene la secuencia que incluye, al menos, la siguiente fórmula:
5'X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
donde C es un nucleótido en donde la porción nucleosídica es 2'-metoxi citidina y donde X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria.
De acuerdo con cualquiera de los métodos precedentes de la invención, lo siguiente también se aplica. En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador es un ácido nucleico aislado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador tiene entre 6 y 100 nucleótidos, y en ciertos aspectos preferidos, entre 8 y 40 nucleótidos.
También, de acuerdo con realizaciones preferidas, el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una estructura modificada. En realizaciones más preferidas, la estructura modificada en una estructura fosfato modificada.
En algunas realizaciones, el individuo se selecciona del grupo que consiste en perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, conejo, cerdo de guinea, primate no humano (por ejemplo, mono), pollo, y pez (especies de piscifactoría, por ejemplo, salmón).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador es un ácido nucleico sintético.
De acuerdo con algunas realizaciones, el método también incluye administrar un antígeno. Preferiblemente, el antígeno se selecciona del grupo que consiste de un alergeno, un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno fúngico, y un antígeno parasitario. En algunas realizaciones, el antígeno se administra por ruta mucosal. Preferiblemente, la ruta mucosal se selecciona del grupo que consiste en oral, nasal, rectal, vaginal, transdérmica, y ocular. En algunas realizaciones, el antígeno se administra por una ruta parenteral. Preferiblemente, la ruta parenteral se selecciona del grupo que consiste en intravenosa, subcutánea, intramuscular, y por inyección directa.
En ciertas realizaciones, el individuo está en riesgo de desarrollar una enfermedad infecciosa y el ácido nucleico inmunoestimulador se administra en una cantidad eficaz para prevenir la enfermedad infecciosa.
En ciertas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad infecciosa y el ácido nucleico inmunoestimulador se administra en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad infecciosa.
En ciertas realizaciones, el individuo está en riesgo de desarrollar un cáncer y el ácido nucleico inmunoestimulador se administra en una cantidad eficaz para prevenir o para tratar el cáncer.
En ciertas realizaciones, el individuo tiene o está en riesgo de desarrollar una alergia y el ácido nucleico inmunoestimulador se administra en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la alergia.
En algunas realizaciones, el individuo tiene o está en riesgo de desarrollar asma y el ácido nucleico inmunoestimulador se administra en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el asma.
En algunas realizaciones, el método además incluye la administración de una terapia anti-cancerosa. Preferiblemente, la terapia anti-cancerosa es un anticuerpo monoclonal específico para una célula tumoral, una quimioterapia, o una radioterapia.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador se administra a un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar una inmunodeficiencia, en una cantidad eficaz para potenciar la estimulación de la proliferación de la médula ósea en el individuo. En algunas realizaciones, el individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar una inmunodeficiencia es un individuo que sufre o está en riesgo de sufrir quimioterapia.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador se administra a un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar anemia, en una cantidad eficaz para potenciar la eritropoyesis en el individuo.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador se administra a un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar trombocitopenia, en una cantidad eficaz para potenciar la trombopoyesis en el individuo.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador se administra a un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar neutropenia, en una cantidad eficaz para potenciar la proliferación de neutrófilos en el individuo.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador se administra en una cantidad eficaz para inducir la producción de citoquinas. Preferiblemente, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IL-1\beta, IL-2, IL-6, IL-12, IL-18, TNF-\alpha, IFN-\alpha, e IFN-\gamma.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador se administra en una cantidad eficaz para estimular la actividad de la célula asesina natural.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador se administra por ruta mucosal. Preferiblemente, la ruta mucosal se selecciona del grupo que cosiste en oral, nasal, rectal, vaginal, transdérmica y ocular.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador se administra por una ruta parenteral. Preferiblemente, la ruta parenteral se selecciona del grupo que cosiste en intravenosa, subcutánea, intramuscular, y por inyección directa.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador se administra en un vehículo de liberación sostenida.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que representa la activación de célula B humana por el ODN CpG metilado y no metilado. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC; 2x10^{6} células/ml) de un donante representativo (n=4) se incubaron con 0,4 \mug/ml, 1,0 \mug/ml o 5,0 \mug/ml del oligodesoxinucleótido (ODN) 2006, 1758, 2186, o el correspondiente ODN metilado 2117, 1812 o 5107. Los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). La expresión del marcador de activación CD86 sobre las células B CD19+ se midió por citometría de flujo.
La Figura 2 es un gráfico que representa la activación de células B humanas por el ODN CpG metilado y no metilado. Las PBMC de un donante representativo (n=3) se incubaron con 0,4 \mug/ml, 1,0 \mug/ml o 10,0 \mug/ml del ODN CpG 2006, los ODNs CpG antisentido 5114 y 5116, o los correspondientes ODNs metilados 5154 y 5155. Los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). La activación de la célula B se analizó por citometría de flujo, tal y como se describe en la Fig. 1.
La Figura 3 en un gráfico que representa el aumento de expresión de CD80 (panel izquierdo) y CD25 (panel derecho) sobre células B humanas tras incubación de PBMC con 0,4 \mug/ml, 1,0 \mug/ml o 10,0 \mug/ml del ODN 2006, 2117 (2006 metilado) y 2137 (motivo GpC 2006). Los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). La expresión de los marcadores de activación de célula B, CD80 y CD25, sobre células B CD19+ se determinó por citometría de flujo.
La Figura 4 es un par de gráficos que representan la activación de monocitos humanos de sangre periférica por ODN metilados. PBMC (2x10^{6} células/ml) del donante 35 (panel izquierdo) y del donante 24 (panel derecho) se incubaron con 6 \mug/ml de ODN 2006, 2117, o 2137. Los controles positivos se incubaron con 1 ng/ml de LPS, y los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). La expresión de CD80 sobre monocitos CD14+ se determinó por citometría de flujo.
La Figura 5 es un par de gráficos que representan la activación de células NK humanas por ODN CpG metilados. PBMC (2x10^{6} células/ml) de donantes 24 (panel izquierdo) se incubaron con 6 \mug/ml de ODN 2006, 2117, o 2137. Como control positivo (para el donante 24) PBMC se incubaron con 100 U/ml de IL-2 junto con 50 ng/ml de IL-12. Para aumentar la expresión de CD69 se añadió, con el ODN, una dosis submitogénica de IL-2 (10 U/ml). Los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). PBMC se tiñeron para CD56 (N-CAM, marcador de célula NK), CD3 (marcador de célula T) y CD69 (marcador de activación temprana). La expresión de CD69 en la población de células CD56+ se midió por citometría de flujo.
La Figura 6 en una gráfico que representa la activación de células asesinas T naturales humanas (NKT) por ODN CpG metilado. PBMC (2x10^{6} células/ml) se incubaron con 6 \mug/ml del ODN 2006, 2117, o 2137. La expresión de CD69 sobre células NKT CD56+/CD3+ se analizó por citometría de flujo.
La Figura 7 es un par de gráficos que representan la secreción de TNF-\alpha e IL-6 por PBCM humanos tras cultivarlos con ODN metilado y no metilado. PBMC (3x10^{6} células/ml) se incubaron con ODN 2006, 2117, o 2137. Los controles positivos se incubaron con 1 \mug/ml de lipopolisacárido (LPS), y los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). Las citoquinas presentes en los sobrenadantes se midieron por ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA). A. Secreción de TNF-\alpha (pg/ml) tras incubación con 6 \mug/ml de ODN. B. Secreción de IL-6 (pg/ml) tras incubación con 0,4 o 10,0 \mug/ml de ODN.
La Figura 8 es un gráfico que representa la secreción de IL-1\beta por PBMC humanas tras el cultivo con ODN metilado y no metilado. PBMC (3x10^{6} células/ml) se incubaron con 6 \mug/ml de ODNs 2006, 2117, o 2137. Los controles positivos se incubaron con 1 \mug/ml de LPS, y los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). Se midió por ELISA la IL-1\beta (pg/ml) presente en los sobrenadantes.
La Figura 9 es un par de gráficos que representan la secreción de IFN-\gamma por PBMC humanos tras cultivarlos con ODN metilado y no metilado. A. PBMC (5x10^{6} células/ml) se incubaron con 6 \mug/ml de ODNs 2006 o 2117. Los controles positivos se incubaron con 0,1 \mug/ml de LPS, y los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). Se midió por ELISA el IFN-\gamma (pg/ml) presente en los sobrenadantes. B. PBMC (5x10^{6} células/ml) se incubaron con 6 \mug/ml de ODNs 2006, 2117, o 2137, ambos con y sin IL-2 (19 U/ml). Los controles negativos eran células incubadas sin ODN (w/o) y células incubadas sólo con IL-2. Se midió por ELISA el IFN-\gamma (pg/ml) presente en los sobrenadantes.
La Figura 10 es un gráfico que representa la secreción de IL-10 por PBCM humanos tras incubarlos con ODN metilado y no metilado. PBMC (5x10^{6} células/ml) se incubaron con 6 \mug/ml de ODNs 2006, 2117, o 2137. Los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). Se midió por ELISA la IL-10 (pg/ml) presente en los sobrenadantes.
La Figura 11 es un gráfico que representa la activación de la célula B humana por el ODN CpI (G\rightarrowI) y por el ODN de estructura modificada de la citosina 2'-metoxi (2'-OMe-C). PBMC (2x10^{6} células/ml) de los donantes 60 y 62 se incubaron con 0,4 \mug/ml, 1,0 \mug/ml o 10,0 \mug/ml de cada ODN (2006, 1982, 5126, 5246, 5247, 5248, 5249, 5250 y 5251). Los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). La expresión del marcador de activación CD86 sobre células B CD19+ se midió por citometría de flujo.
La Figura 12 es un gráfico que representa la proliferación de célula B inducida por el ODN CpI (G\rightarrowI) y por el ODN de estructura modificada de la citosina 2'-metoxi (2'-OMe-C). PBMC (2x10^{6} células/ml) de los donantes 48 y 62 se tiñeron con el tinte carboxifluoresceína diacetato succinimidil diester (CFSE) y se incubaron con 0,4 \mug/ml, 1,0 \mug/ml o 10,0 \mug/ml de cada ODN (2006, 1982, 5126, 5246, 5247, 5248, 5249, 5250 y 5251). Los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). Se midió por citometría de flujo la proliferación de células B como el porcentaje de células B CD19+ con brillo decreciente con tinte CFSE.
La Figura 13 es un gráfico que representa la activación de células NK humanas por el ODN CpI (G\rightarrowI) y por el ODN de estructura modificada de la citosina 2'-metoxi (2'-OMe-C). PBMC (2x10^{6} células/ml) se incubaron con 1,0 \mug/ml o 6,0 \mug/ml de cada ODN. Los controles positivos se incubaron con IL-2 mas IL-12 (IL-1/IL-12), y los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). La expresión de CD69 sobre células NK CD56+/CD3- se midió por citometría de flujo. El control positivo IL-2/IL-12 para el Donante 41 activó el 90% de las células NK CD69 positivas.
La Figura 14 es un gráfico que representa la activación de monocitos humanos de sangre periférica por el ODN CpI (G\rightarrowI) y por el ODN de estructura modificada de la citosina 2'-metoxi (2'-OMe-C). PBMC (2x10^{6} células/ml) de los donantes 67, 66, y 41 se incubaron con 1,0 \mug/ml y 6,0 \mug/ml de cada ODN indicado. Los controles positivos se incubaron con 1 \mug/ml de LPS, y los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). Las células se tiñeron para CD14, CD19 y CD80 para medir por citometría de flujo la expresión del marcador de superficie celular CD80 sobre monocitos CD14+ excluyendo células B CD19+/CD14+. El LPS activó un 30% y un 48% de los monocitos CD80+ del Donante 67 y del Donante 66, respectivamente.
La Figura 15 es un gráfico que representa la secreción de TNF-\alpha por PBMC humanos tras cultivarlos con el ODN CpI (G\rightarrowI) y por el ODN de estructura modificada de la citosina 2'-metoxi (2'-OMe-C). PBMC (5x10^{6} células/ml) de los donantes 94 y 95 se incubaron con 6,0 \mug/ml del ODN indicado o de LPS (0,1 \mug/ml). Los controles negativos se incubaron sin ODN o LPS (w/o). Se midió por ELISA el TNF-\alpha presente en los sobrenadantes del cultivo celular (pg/ml). El LPS indujo 677 pg/ml y 1000 pg/ml de TNF-\alpha para los PMBC de los Donantes 95 y 94, respectivamente.
La Figura 16 es un gráfico que representa la secreción de IFN-\gamma por PMBC humanos tras cultivarlos con el ODN CpI (G\rightarrowI) y por el ODN de estructura modificada de la citosina 2'-metoxi (2'-OMe-C). PBMC (5x10^{6} células/ml) de los donantes 63 y 61 se incubaron con 6,0 \mug/ml del ODN indicado. Los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). Se midió por ELISA el IFN-\gamma de los sobrenadantes del cultivo celular (pg/ml).
La Figura 17 es un gráfico que representa la secreción de IL-10 por PBMC humanos tras incubarlos con el ODN CpI (G\rightarrowI) y por el ODN de estructura modificada de la citosina 2'-metoxi (2'-OMe-C). PBMC (5x10^{6} células/ml) de los donantes 63 y 61 se incubaron con 6,0 \mug/ml del ODN indicado. Los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). Se midió por ELISA la IL-10 de los sobrenadantes del cultivo celular (pg/ml).
La Figura 18 es un gráfico que representa la secreción de IL-6 por PBMC humanos tras incubarlos con el ODN CpI (G\rightarrowI) y por el ODN de estructura modificada de la citosina 2'-metoxi (2'-OMe-C). PBMC (5x10^{6} células/ml) de los donantes 95 y 94 se incubaron con 6,0 \mug/ml del ODN indicado. Los controles negativos se incubaron sin ODN (w/o). Se midió por ELISA la IL-6 de los sobrenadantes del cultivo celular (pg/ml).
Descripción detallada
De acuerdo a la invención, se descubrió de forma sorprendente que ciertos ácidos nucleicos de tipo CpG son ácidos nucleicos inmunoestimuladores a pesar de su falta de dinucleótidos CpG no metilados, que previamente han demostrado ser cruciales en los efectos inmunoestimuladores de los ácidos nucleicos CpG. Los ácidos nucleicos de tipo CpG son útiles en cualquier aplicación donde los ácidos nucleicos sean eficaces para inducir una respuesta biológica activadora, estimulante, o proliferativa.
Las secuencias CpG no metiladas, a pesar de que son relativamente raras en humanos, se encuentran comúnmente en el ADN de organismos infecciosos como las bacterias. El sistema inmunitario de seres humanos aparentemente se ha desarrollado para reconocer secuencias CpG no metiladas como una clara señal de advertencia de infección y para iniciar una respuesta inmunitaria potente e inmediata contra patógenos invasores. De esta manera, los ácidos nucleicos que contienen CpG no metilados, dependiendo de este mecanismo de defensa inmune innato, pueden utilizar una ruta única y natural para terapia inmune sin causar reacciones adversas vistas frecuentemente con otros agentes inmunes estimuladores. Los efectos de los ácidos nucleicos CpG no metilados sobre la modulación inmune han sido extensamente descritos en solicitudes de patente publicadas, como PCT/US95/01570; PCT/US97/19791; PCT/US98/03678; PCT/US98/10408; PCT/US98/04703; PCT/US99/07335; y PCT/US99/09863.
Un "ácido nucleico CpG" es un ácido nucleico que incluye, al menos, un dinucleótico CpG no metilado. Un ácido nucleico que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado es una molécula de ácido nucleico que contiene una citosina no metilada en una secuencia dinucleotídica citosina-guanina (es decir, "ADN CpG" o ADN que contiene una 5'citosina seguida por 3'guanina y unida por un enlace fosfato) y que activa al sistema inmunitario. Los ácidos nucleicos CpG pueden ser de doble cadena o de cadena sencilla. Generalmente, las moléculas de doble cadena son más estables in vivo, mientras que las moléculas de cadena sencilla tienen actividad inmune aumentada. Por ello, en algunos aspectos de la invención, se prefiere que el ácido nucleico sea de cadena sencilla y en otros aspectos se prefiere que el ácido nucleico sea de doble cadena. Los términos ácido nucleico CpG u oligonucleótido CpG aquí utilizados se refieren a un ácido nucleico CpG inmunoestimulador o a un oliginucleótido CpG inmunoestimulador a no ser que se indique lo contrario. La totalidad del ácido nucleido CpG inmunoestimulador puede estar no metilado o puede haber porciones no metiladas, pero al menos, la C del dinucleótido 5'-CG-3' debe estar no metilada.
Un "ácido nucleico inmunoestimulador", tal como se utiliza aquí, es cualquier ácido nucleico que contiene un motivo inmunoestimulador o una estructura que induce una respuesta inmunitaria. Una respuesta inmunitaria, tal como se utiliza aquí, incluye la estimulación de células inmunes y células no inmunes para secretar o expresar factores que participan en y/o caracterizan la activación inmune. Por tanto, este término incluye, sin limitaciones, estimulación de secreción de citoquinas por varios tipos de células, incluyendo linfocitos, células profesionales presentadoras de antígeno (APCs, que incluyen células dendríticas), y células epiteliales; estimulación de secreción de inmunoglobulinas por las células B; y estimulación de la expresión de moléculas de superficie celular de moléculas co-estimuladoras y co-receptores sobre células T, células B, células asesinas naturales (NK), monocitos, macrófagos, y APCs.
Una cantidad eficaz de ácido nucleico inmunoestimulador para inducir una respuesta inmunitaria es una cantidad de ácido nucleico inmunoestimulador que, cuando se administran a un individuo o se contactan con células de un individuo, induce la estimulación de células inmunes y/o células no inmunes para secretar o expresar factores que participan en y/o caracterizan una activación inmune. En ciertas realizaciones, la cantidad es eficaz para inducir secreción de citoquinas. Ejemplos de citoquinas se dan abajo. Son bien conocidos en el estado de la técnica los métodos para determinar la inducción y secreción de citoquinas, e incluyen ensayos inmunosorbentes unidos a enzima (ELISA), clasificación celular intracelular activada por fluorescencia (FACS), y bioensayos. En otras ciertas realizaciones, la cantidad es eficaz para estimular la actividad de células NK. Los métodos para determinar la actividad de células NK son bien conocidos en el estado de la técnica e incluyen la determinación de muerte de célula diana (lisis celular), expresión del marcador de activación CD69 en la superficie celular (por ejemplo, por FACS) y secreción de interferón gamma (IFN-\gamma; por ejemplo, por ELISA). Ejemplos adicionales de marcadores específicos de superficie celular de la activación inmune pueden incluir, sin limitaciones, la expresión de CD11b, CD25, CD28, CD43, CD54, CD62L, CD71, CD80, CD86, CD95L, CD106, CD134, y CD134L.
Los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se utilizan de forma intercambiable para denotar nucleótidos múltiples (es decir, moléculas que comprenden un azúcar (por ejemplo, ribosa o desoxirribosa) unidas a un grupo fosfato y a una base orgánica variable, que es tanto una pirimidina sustituida (por ejemplo, citosina (C), timina (T), o uracilo (U)) o una purina sustituida (por ejemplo, adenina (A) o guanina (G)). También se incluyen los derivados de C, incluyendo sin limitaciones 2',3'-dideoxicitidina (ddC), 5'-bromo-ddC, 3'-amino-2,3-ddC, 5-yodo-2'-deoxicitidina (dC), y derivados de G, que incluyen sin limitaciones 3'-azido-2',3'-dideoxiguanosina (ddG), 7-deaza-2'-deoxiguanosina (dG), 8-bromo-dG, 8-bromo-2'-dG, O6-metil-2'-dG. Tal como se utiliza aquí, los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se refieren a oligorribonucleótidos así como oligodesoxirribonucleótidos (ODN). Los términos podrían también incluir polinucleósidos (es decir, un polinucleótido menos el fosfato) y cualquier otro polímero orgánico que contenga una base. Los ácidos nucleicos incluyen vectores, por ejemplo, plásmidos, así como oligonucleótidos. Las moléculas de ácido nucleico se pueden obtener de fuentes naturales de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN genómico o cDNA de procariotas que incluyen bacterias y de eucariotas que incluyen lavaduras) y se refieren aquí como "aislados", pero son preferiblemente sintéticos (por ejemplo, producidos por síntesis de oligonucleótidos).
En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico de de tipo CpG. Tal como se utiliza aquí, un "ácido nucleico de tipo CpG" se refiere a un ácido nucleico inmunoestimulador que tiene todas las características de un ácido nucleico CpG tal como aquí se describe, con al menos una de las siguientes excepciones: (1) la base citosina de C de, al menos, un dinucleótido CpG está 5'metilada (CpG metilado); (2) la G de, al menos, un dinucleótido CpG está sustituida por una I (inosina; ácido nucleico CpI); (3) el azúcar de la C de, al menos, un dinucleótido CpG está modificado para ser una 2'-alcoxi citosina; (4) La C de, al menos, un dinucleótido CpG está sustituida por Z, donde Z se selecciona de 2'-deoxiuridina (dU), 5-fluoro-2'-dU, y dSpacer, donde dSpacer es una porción de azúcar sin una base; (5) la G de, al menos, un dinucleótido CpG está sustituida por Y, donde Y se selecciona de 2-aminopurina, xantosina, N7-metil-xantosina, nebularina, y dSpacer, donde dSpacer es una posición de azúcar sin una base. De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas, la 2'-alcoxi citosina es 2'-metoxi citosina (ácido nucleico 2'-OMe-citosina).
De esta manera, los ácidos nucleicos de tipo CpG pueden incorporar ciertas modificaciones o sustituciones que implican tanto a las bases como a las porciones de azúcar de la estructura. Aquellos con CpG metilado implican, en realizaciones preferidas, la metilación en posición 5' de la base citosina. Aquellos con CpI implican el uso de una base en particular, inosina. Aquellos con 2'-OMe-citosina implican la sustitución de un grupo metoxi (OCH3; OMe) por un grupo hidroxi (OH) en posición 2' de la porción del azúcar unido a la base citosina.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico de tipo CpG puede estar basado en un ácido nucleico CpG previamente conocido. En otros aspectos, un ácido nucleico de tipo CpG puede ser diferente de un ácido nucleico CpG previamente conocido. También, de acuerdo con algunos aspectos preferidos, el ácido nucleico de tipo CpG tiene una estructura modificada, que incluye una estructura fosfato modificada (ver abajo).
De acuerdo con una realización preferida de la invención, el ácido nucleico de tipo CpG es de, al menos, 18 nucleótidos de longitud y no es un ácido nucleico antisentido. Tal como se utiliza aquí, un "ácido nucleico antisentido" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que (1) tiene tanto una complementariedad de secuencia con una secuencia génica estructural del hospedador, o se puede hibridar específicamente, bajo condiciones estrictas, con una secuencia de ácido nucleico del hospedador tratado, y (2) cuando se acompleja con el gen estructural o la secuencia de ácido nucleico, causa una pérdida de función del gen estructural o secuencia del ácido nucleico. Un ácido nucleico antisentido se híbrida específicamente cuando la unión del compuesto al ADN diana o la molécula de ARN interfiere con la función normal del ADN o el ARN diana para causar una pérdida de utilidad, y hay un grado de complementariedad suficiente para impedir unión no específica del compuesto antisentido a secuencias no diana bajo condiciones donde se desea la unión específica, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o en un tratamiento terapéutico, y en el caso de ensayos in vitro, bajo condiciones en las que se realizan los ensayos. La mera complementariedad a ADN cromosómico o ARN mensajero no debe definir antisentido, debido a que no todas las secuencias complementarias con un gen en particular o una secuencia de ácidos nucleicos causan una pérdida de función del gen particular o la secuencia de ácidos nucleicos. Típicamente, un ácido nucleico antisentido será capaz de hibridar, bajo condiciones estrictas, con una secuencia o corresponder con la región codificante de un gen, incluyendo y, particularmente, implicando un intrón. De forma alternativa, un ácido nucleico antisentido, típicamente será capaz de hibridar, bajo condiciones estrictas, con una secuencia en un elemento regulador asociado a un gen, por ejemplo, un promotor o potenciador. Aquellos expertos en la materia pueden determinar, sin excesiva experimentación, si un ácido nucleico de tipo CpG es un ácido nucleico antisentido.
Tal como se utiliza aquí, un "ácido nucleico CpG metilado" se refiere a un ácido nucleico inmunoestimulador que tiene todas las características de un ácido nucleico CpG tal como se describe aquí, con la excepción de que la C de, al menos, un dinucleótido CpG está metilada. Este descubrimiento fue bastante inesperado. Está ampliamente demostrado que cuando la C de un dinucleótido CpG se sustituye por una 5-metilcitosina, se pierde la actividad inmunoestimuladora. Por ello, de forma sorprendente, se encontró que la sustitución de la C de un dinucleótido CpG por 5-metilcitosina no causaba esta profunda pérdida de actividad. Dicho ácido nucleico inmunoestimulador puede incluir, al menos, un dinucleótido CpG metilado y, al menos, un dinucleótido CpG no metilado. En un aspecto alternativo, el ácido nucleótido inmunoestimulador entero puede estar metilado, incluyendo todos los dinucleótidos CpG presentes.
Un aspecto de esta revelación proporciona un ácido nucleico inmunoestimulador que es un ácido nucleico CpG metilado representado por al menos la fórmula:
5'X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
donde C está metilada y X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos. En una versión, X_{2} es adenina, guanina, citosina, o timidina. En otra versión, X_{3} es adenina, guanina, citosina, o timidina. En otra versión, X_{2} es guanina, adenina, o timina y X_{3} es citosina, adenina, o timina.
En otra versión, el ácido nucleico inmunoestimulador en un ácido nucleico CpG metilado aislado representado por al menos la fórmula:
5'N_{1}X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}N_{2}3'
donde C está metilada y X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, y N_{1} y N_{2} son secuencias de ácidos nucleicos compuestas por alrededor de 0-25 nucleótidos cada una. En una versión, X_{1}X_{2} es un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: GpG, GpA, GpT, ApG, ApA, ApT, CpG, CpA, CpT, TpG, TpA, y TpT; y X_{3}X_{4} es un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: ApG, ApA, ApT, ApC, CpG, CpA, CpC, TpG, TpA, TpT, y TpC. Preferiblemente, X_{1}X_{2} es GpA o GpT y X_{3}X_{4} es TpT. En otras versiones, X_{1} o X_{2} o ambos son purinas y X_{3} o X_{4} o ambos son pirimidinas o X_{1}X_{2} es GpA y X_{3} o X_{4} o ambos son pirimidinas. En otra versión, X_{1}X_{2} es un dinucleótico seleccionado del grupo que consiste en:TpA, ApA, ApC, ApG, y GpG. En otra versión, X_{3}X_{4} es un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: ApG, ApA, ApC, TpG, TpA, TpT, y CpA. X_{1}X_{2}, en otra versión, es un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: GpT, GpC, ApT, TpG, TpT, TpC, CpG, CpT, y CpC.
En otra versión, el ácido nucleico inmunoestimulador tiene la secuencia
5'TCNTX_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
donde la C del dinucleótido CG está metilada, y X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, y N es una secuencia de ácido nucleico compuesta por alrededor de 0-25 nucleótidos. El ácido nucleico inmunoestimulador de la revelación, en algunas versiones, incluye X_{1}X_{2} seleccionado del grupo que cosiste en GpG, GpA, GpT, y ApA y X_{3}X_{4} se selecciona del grupo que consiste en TpT, TpC, y CpT.
Tal como se utiliza aquí, un "ácido nucleico CpI" se refiere a un ácido nucleico inmunoestimulador que tiene todas las características de un ácido nucleico CpG tal como se ha descrito aquí, con la excepción de que la G de, al menos, un dinucleótido CpG está sustituida por una inosina (I). La inosina es una purina que representa una forma desaminada de adenosina o guanosina en vertebrados. Atryer L, Biochemistry, 4th ed., WH Freeman, 1995. De acuerdo con este aspecto de la invención, se ha encontrado que los fosforotioato ODN con cambios de guanosina por inosina son tan eficaces como ácidos nucleicos inmunoestimuladores como los ODN CpG fosforotioato. Este descubrimiento fue bastante inesperado. De forma sorprendente, la sustitución de la G del dinucleótido CpG por otra purina, I, no causó una pérdida de actividad. Dicho ácido nucleico inmunoestimulador puede incluir, al menos, un dinucleótido CpI y, al menos, un dinucleótido CpG metilado o no metilado. En una versión alternativa, el ácido nucleico inmunoestimulador puede tener la misma secuencia que un ácido nucleico CpG excepto que todos los dinucleótidos CpG están sustituidos por dinucleótidos CpI. En una versión más alternativa, el ácido nucleico inmunoestimulador puede tener la misma secuencia que un ácido nucleico CpG excepto que todas las bases guanosina están sustituidas por bases inosina.
En una versión, se proporciona un ácido nucleico inmunoestimulador que es un ácido nucleico CpI representado por, al menos, la fórmula:
5'X_{1}X_{2}CIX_{3}X_{4}3'
donde C es citosina, I es inosina, y X_{1}, X_{2}, X_{3}. En ciertas versiones, la C del dinucleótido CpI de la fórmula de arriba no está metilada. En otras ciertas versiones, la C del dinucleótido CpI de la fórmula de arriba está metilada. En una versión, X_{2} es adenina, guanina, inosina, citosina, o timina. En otra versión, X_{3} es adenina, guanina, inosina, citosina, o timina. En otra versión, X_{2} es guanina, adenina, o timina y X_{3} es citosina, adenina, o timina.
En otra versión, el ácido nucleico inmunoestimulador es un ácido nucleico CpI aislado representado por, al menos, la fórmula:
5'N_{1}X_{1}X_{2}CIX_{3}X_{4}N_{2}3'
donde C es citosina, I es inosina, y X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, y N_{1} y N_{2} son secuencias de ácidos nucleicos compuestas por alrededor de 0-25 nucleótidos cada una. En ciertas versiones, la C del dinucleótido CpI de la fórmula de arriba no está metilada. En una versión, X_{1}X_{2} es un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: GpG, GpA, GpT, ApG, IpI, IpT, GpI, IpA, pT, ApI, ApA, ApT, CpG, CpI, CpA, CpT, TpG, TpI, TpA, y TpT; y X_{3}X_{4} es un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: ApG, ApI, ApA, ApT, ApC, CpG, CpI, CpA, CpC, TpG, TpI, TpA, TpT, y TpC. De forma alternativa, X_{2} es GpA, GpT, IpA, o IpT, y X_{3}X_{4} es TpT. En otras versiones, X_{1} o X_{2} o ambos son purinas y X_{3} o X_{4} o ambos son pirimidinas, o X_{1}X_{2} es GpA o IpA y X_{3} o X_{4} o ambos son pirimidinas. En otra versión, X_{1}X_{2} es un dinucleótico seleccionado del grupo que consiste en:TpA, ApA, ApC, ApG, ApI, IpI, IpG, GpI, y GpG. En otra versión más, X_{3}X_{4} es un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: ApG, ApI, ApA, ApC, TpG, TpI, TpA, TpT, y CpA. En otra versión, X_{1}X_{2} es un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: GpT, GpC, IpT, OpC, ApT, TpG, TpI, TpT, TpC, CpG, CpI, CpT, y CpC.
En otra versión, el ácido nucleico inmunoestimulador tiene la secuencia
5'TCNTX_{1}X_{2}CIX_{3}X_{4}3'
donde C es citosina, I es inosina, X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, y N es una secuencia de ácido nucleico compuesta por alrededor de 0-25 nucleótidos. En ciertas versiones, la C del dinucleótido CpI de la fórmula de arriba no está metilada. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores de esta revelación, en algunas versiones, incluyen X_{1}X_{2} seleccionado del grupo que cosiste en GpG, GpA, GpT, IpI, IpA, IpT, IpG, GpI, y ApA y X_{3}X_{4} se selecciona del grupo que consiste en TpT, TpC, y CpT.
Tal como se utiliza aquí, un "ácido nucleico CpG 2'-alcoxi citosina" se refiere a un ácido nucleico inmunoestimulador que tiene todas las características de un ácido nucleico CpG tal como aquí se describe, con la excepción de que la porción de azúcar de la C de, al menos, un dinucleótido CpG está alquilada en posición 2', de este modo, sustituyendo una C por una 2'-O-alquil citosina. En una realización preferida, la porción de azúcar de la C de, al menos, un dinucleótido CpG está metilada en posición 2', de este modo, sustituyendo una C por una 2'-O-metil citosina (2'-OMe C). Dichos ácidos nucleicos CpG quil citosina pueden incluir, al menos, un dinucleótido CpG O-alquil citosina y,al menos,un dinucleótido CpG no modificado. En una realización alternativa, toda citosina del ácido nucleico de tipo CpG puede ser una 2'-alcoxi citosina, incluyendo todos las dinucleótidos CpG presentes.
El descubrimiento de que los ácidos nucleicos CpG 2'-alcoxi citosina de la invención son inmunoestimuladores fue bastante inesperado. Estudios previos demostraron que la sustitución de un desoxinucleósido individual específico o pares de desoxinucleósidos que flanquean un dinucleótido CpG por los correspondientes 2'-metoxi desoxinucleósidos, afecta el potencial inmunoestimulador de la secuencia oligonucleotídica de una manera altamente dependiente de posición. Zhao Q y cols. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:3453-8; Zhao Q y cols. (2000) Bioorg Med Chem Lett 10:1051-4. De acuerdo con estas demostraciones, cuanto más cerca del dinucleótido CpG se realice la sustitución de nucleósidos, más débil es el potencial inmunoestimulador del oligonucleótido en su totalidad. De forma sorprendente, se encontró, de acuerdo con la inmediata invención, que la sustitución de citosina por 2'-alcoxi citosina no tenía influencias dramáticas sobre la actividad inmunoestimuladora del oligonucleótido.
En ciertas realizaciones preferidas, la invención proporciona un ácido nucleico inmunoestimulador que es un ácido nucleico CpG 2'-alcoxi citosina representado por, al menos, la fórmula:
5'X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
donde C es un nucleótido en el que la porción nucleosídica es 2'-alcoxi citosina. En un aspecto, X_{2} es adenina, guanina, citosina, o timina. En otro aspecto, X_{3} es adenina, guanina, citosina, o timina. En otro aspecto, X_{2} es guanina, adenina, o timina y X_{3} es citosina, adenina, o timina.
En otras realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulador es un ácido nucleico CpG 2'-alcoxi citosina aislado representado por, al menos, la fórmula:
5'N_{1}X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}N_{2}3'
donde C es 2'-alcoxi citosina, X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, y N_{1} y N_{2} son secuencias de ácidos nucleicos compuestas por alrededor de 0-25 nucleótidos cada una. En una realización, X_{1}X_{2} es un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: GpG, GpA, GpT, ApG, ApA, ApT, CpG, CpA, CpT, TpG, TpA, y TpT; y X_{3}X_{4} es un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: ApG, ApA, ApT, ApC, CpG, CpA, CpC, TpG, TpA, TpT, y TpC. Preferiblemente, X_{1}X_{2} es GpA o GpT y X_{3}X_{4} es TpT. En otras realizaciones, X_{1} o X_{2} o ambos son purinas y X_{3} o X_{4} o ambos son pirimidinas o X_{1}X_{2} es GpA y X_{3} o X_{4} o ambos son pirimidinas. En otra realización preferida, X_{1}X_{2} es un dinucleótico seleccionado del grupo que consiste en: TpA, ApA, ApC, ApG, y GpG. En otra realización, X_{3}X_{4} es un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: ApG, ApA, ApC, TpG, TpA, TpT, y CpA. X_{1}X_{2}, en otra realización, es un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: GpT, GpC, ApT, TpG, TpT, TpC, CpG, CpT, y CpC.
En otra realización preferida, el ácido nucleico inmunoestimulador tiene la secuencia
5'TCNTX_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
donde la C del dinucleótido CG es 2'-alcoxi citosina, X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, y N es una secuencia de ácido nucleico compuesta por alrededor de 0-25 nucleótidos. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores de la invención, en algunas versiones, incluyen X_{1}X_{2} seleccionado del grupo que cosiste en GpG, GpA, GpT, y ApA y X_{3}X_{4} se selecciona del grupo que consiste en TpT, TpC, y CpT.
En otras realizaciones más alejadas, la invención proporciona ácidos nucleicos de tipo CpG que incorporan una combinación de los tipos de modificaciones arriba enumeradas. Por ello, la invención también proporciona ácidos nucleicos de tipo CpG que incorporan un dinucleótido CpI y, o una C metilada en el dinucleótido CpI o una 2'-alcoxi citosina en el dinucleótido CpI. Así mismo, la invención también abarca ácidos nucleicos de tipo CpG que incorporan ambas, la citosina metilada en el dinucleótido CpG y una 2'-alcoxi citosina en el dinucleótido CpI.
Otro aspecto de la revelación proporciona ácidos nucleicos inmunoestimuladores de tipo CpG que tienen la secuencia que incluye, al menos, la fórmula
5'X_{1}X_{2}ZYX_{3}X_{4}3'
donde Z se selecciona del grupo que consiste en citosina y dSpacer, Y se selecciona del grupo que consiste en inosina, 2-aminopurina, nebularina, y dSpacer; Z no es citosina cuando Y es inosina; y X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos. Dichos ácidos nucleicos inmunoestimuladores de tipo CpG se refieren aquí como nucleótidos ZpY.
El término "dSpacer", tal como se utiliza aquí, se refiere a una porción azúcar-fosfato que es como un nucleótido carente de una base. Esta entidad puede ser incorporada dentro de la estructura de un ácido nucleico por uniones 5'-a-3'que unen nucleótidos.
En versiones donde Z es citosina, puede estar metilada o no metilada.
En algunas versiones, de acuerdo con este aspecto de la invención, el ácido nucleico inmunoestimulador tiene la secuencia que incluye, al menos, la fórmula
5'TCNTX_{1}X_{2}ZYX_{3}X_{4}3'
donde N es una secuencia de ácidos nucleicos compuesta por alrededor de 0-25 nucleótidos.
En algunas versiones, de acuerdo con este aspecto de la revelación, el ácido nucleico inmunoestimulador es un ácido nucleico aislado.
Es algunas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que incluye, al menos, una cantidad eficaz del ácido nucleico inmunoestimulador para inducir una respuesta inmunitaria y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica de acuerdo a esta realización de la invención, puede ser preparada colocando una cantidad eficaz del ácido nucleico inmunoestimulador para inducir una respuesta inmunitaria en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede, en algunas realizaciones, incluir un dispositivo de liberación sostenida. Otros medicamentos y agentes pueden ser incluidos en la composición farmacéutica, incluyendo un antígeno, un antibiótico (agentes antivirales, antibacterianos, antifúngicos, y antiparasitarios), un medicamento para la úlcera, un medicamento para alergia o asma, un medicamento para el tratamiento de la anemia, trombocitopenia, o neutropenia, y una citoquina. En ciertas realizaciones preferidas que incluyen una citoquina, la citoquina se selecciona de entre IL-2, IL-3, IL-4, IL-18, IFN-\alpha, IFN-\gamma, ligando de Flt3, G-CSF, y GM-CSF.
Las composiciones farmacéuticas que contienen un ácido nucleico inmunoestimulador de acuerdo con este aspecto de la invención, incluirán, en algunas realizaciones, una pluralidad de ácidos nucleicos inmunoestimuladores que tengan secuencias diferentes. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede incluir un ácido nucleico CpG que tenga, al menos, un motivo CpG no metilado.
En ciertas realizaciones preferidas, el ácido nucleico inmunoestimulador tiene entre 6 y 100 nucleótidos, preferiblemente entere 8 y 40 nucleótidos.
También, de acuerdo con este aspecto de la invención, en algunas realizaciones donde el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una estructura modificada. En ciertas realizaciones preferidas, la estructura modificada es una estructura fosfato modificada.
Para facilitar la incorporación en células, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son preferiblemente de un rango de 6 a 100 bases de longitud. Sin embargo, ácidos nucleicos de cualquier tamaño mayor de 6 nucleótidos (incluso muchas kb de longitud) son capaces de inducir una respuesta inmunitaria de acuerdo con la invención si están presentes suficientes motivos inmunoestimuladores. Preferiblemente, el ácido nucleico de tipo CpG está en el rango de tamaño de entre 8 y 100 y en algunas realizaciones, entre 8 y 40 o entre 8 y 30 nucleótidos de tamaño.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG pueden ser formulados juntos con al menos otro ácido nucleico. En algunos casos, el al menos otro ácido nucleico es un ácido nucleico inmunoestimulador, por ejemplo, un ácido nucleico CpG u otro ácido nucleico de tipo CpG. En otros casos, el al menos otro ácido nucleico es un ácido nucleico vector.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG pueden ser administrados conjuntamente con al menos otro ácido nucleico. En algunos casos, el al menos otro ácido nucleico es un ácido nucleico inmunoestimulador, por ejemplo, un ácido nucleico CpG u otro ácido nucleico de tipo CpG. En otros casos, el al menos otro ácido nucleico es un ácido nucleico vector.
En el caso de que el ácido nucleico inmunoestimulador sea administrado conjuntamente con un ácido nucleico vector, bajo ciertas circunstancias, es útil si la estructura del ácido nucleico inmunoestimulador es una combinación quimérica de fosfodiester y fosforotioato (u otra modificación fosfato). Una célula puede tener dificultades para incorporar un vector plasmídico en presencia de un oligonucleótido completamente fosforotioato. Por ello, cuando ambos, un vector y un oligonucleótido, son administrados a un individuo, se prefiere que el oligonucleótido tenga una estructura quimérica, o, si el oligonucleótido tiene una estructura completamente fosforotioato, que el plásmido esté asociado con el vehículo que administra éste directamente al interior celular, impidiendo con ello la necesidad de absorción celular. Dichos vehículos son conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, liposomas y pistolas de genes.
En el caso de que se administra más de un ácido nucleico inmunoestimulador, tanto solo o conjuntamente con un vector, la estructura de un ácido nucleico inmunoestimulador puede ser completamente fosforotioato y la estructura de otro ácido nucleico inmunoestimulador completamente fosfodiester. Por ello, por ejemplo, un ODN fosforotioato puede estar junto con un ODN fosfodiester.
Para su uso en la invención, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser sintetizados de novo utilizando cualquier número de procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Dichos compuestos son referidos como "ácidos nucleicos sintéticos". Estos métodos de síntesis incluyen, por ejemplo, el método \beta-cianoetil fosforamidita (Beaucage SL y Caruthers MH (1981) Tetrahedron Lett 22:1859), y el método nucleósido H-fosfonato (Garegg y cols. (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4054; Froehler y cols. (1986) Nucl Acid Res 14:5399-5407; Garegg y cols. (1986) Tetrahedron Lett 27:4055-4058; Gaffney y cols. (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-2622). Estas reacciones químicas pueden realizarse por una variedad de sintetizadores automáticos de nucleótidos disponibles en el mercado. Estos ácidos nucleicos se refieren a ácidos nucleicos sintéticos. De forma alternativa, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser producidos a gran escala en plásmidos (ver Sanbrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) y pueden ser separados en piezas más pequeñas o ser administrados enteros. Los ácidos nucleicos pueden ser preparados a partir de secuencias de ácido nucleico natural (por ejemplo, ADN genómico o cDNA) utilizando técnicas conocidas, como aquellas que emplean enzimas de restricción, exonucleasas o endinucleasas. Los ácidos nucleicos preparados de esta manera se denominan ácidos nucleicos aislados. El término "ácido nucleico inmunoestimulador" comprende ambos ácidos nucleicos estimuladores, sintéticos y aislados.
Para su uso in vivo, los ácidos nucleicos, preferiblemente, son relativamente resistentes a la degradación (por ejemplo, son estables). Una "molécula de ácido nucleico estable" significaría una molécula de ácido nucleico que es relativamente resistente a degradación in vivo (por ejemplo, vía una exo- o endo nucleasa). La estabilización puede ser una función de longitud o estructura secundaria. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores que tienen de decenas a cientos de kb de longitud son relativamente resistentes a la degradación in vivo. Para ácidos nucleicos inmunoestimuladores más cortos, la estructura secundaria puede estabilizar e incrementar su efecto. Por ejemplo, si el extremo 3' de un ácido nucleico tiene auto -complementariedad con una región aguas arriba, de modo que pueda replegarse y formar un tipo de estructura stem-loop, entonces el ácido nucleico se hace estable y, con ello, muestra más actividad.
De forma alternativa, la estabilización de un ácido nucleico puede lograrse vía modificaciones de la estructura.
Los ácidos nucleicos estabilizados preferidos de la invención tienen estructura modificada. Se ha demostrado que la modificación de la estructura del ácido nucleico proporciona actividad potenciada de los ácidos nucleicos inmunoestimuladores cuando se administran in vivo. Un tipo de estructura modificada es una modificación de estructura fosfato. La inclusión, en los ácido nucleicos inmunoestimuladores de, al menos, dos enlaces fosforotioato en o cerca del extremo 5' del oligonucleótido y múltiples (preferiblemente cinco) enlaces fosforotioatos en o cerca del extremo 3', en algunas circunstancias, pueden proporcionar máxima actividad y protegen al ácido nucleico de la degradación por exo- y endonucleasas extracelulares. Otros ácidos nucleicos fosfato modificados incluyen ácidos nucleicos fosfodiester modificados, combinaciones de ácidos nucleicos fosfodiester y fosforotioato, alquilfosfonato y arilfosfonato, alquilfosforotioato y arilfosforotioato, fosforoditionato, y combinaciones de los mismos. Cada una de estas combinaciones en los ácidos nucleicos CpG y sus efectos particulares sobre las células inmunes, está discutido con más detalle en las solicitudes de patente publicadas PCT/US95/01570 y PCT/US97/19791.
Aunque los Solicitantes no están vinculados por la teoría, se cree que estos ácidos nucleicos fosfato modificados pueden mostrar más actividad estimuladora debido a una potenciada resistencia a nucleasas, a aumento de absorción celular, a aumento de unión a proteínas, y/o localización intracelular alterada.
Las estructuras modificadas como los fosforotioatos pueden ser sintetizadas utilizando técnicas automatizadas que emplean tanto compuestos químicos fosforamidato como H-fosfonato tal como se describe arriba. Los aril- y alquil- fosfonatos pueden hacerse, por ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU Nº 4,469,863; y los alquilfosfotriésteres (en los que la porción de oxígeno cargada está alquilada tal como se describe en la Patente de EE.UU Nº 5,023,243 y en la Patente Europea Nº 092,574) se pueden preparar por síntesis en fase sólida automatizada utilizando reactivos disponibles comercialmente. Se han descrito métodos para hacer otras modificaciones y sustituciones en la estructura del ADN. Uhlmann E y Peyman A (1990) Chem Rev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165.
Ambos ácidos nucleicos fosforotioato y fosfodiester que contienen motivos inmunoestimuladores son activos en las células inmunes. Sin embargo, basados en la concentración necesaria para inducir los efectos estimuladores del ácido nucleico específico, son más potentes los ácidos nucleicos inmunoestimuladores de estructura fosforotioato resistente a nucleasa. En ciertos ensayos in vitro, el fosforotioato CpG es de 2 órdenes de magnitud más potente que el fosfodiester CpG. Krieg AM y cols. (1995) Nature 375:546-549.
Otra clase de modificaciones en la estructura incluyen 2'-metilrribonucleósidos (2'-OMe). Este tipo de sustituciones están extensamente descritas en el estado de la técnica y en particular, con respecto a sus propiedades inmunoestimulantes, en Zhao Q y cols. (1999) Bioor Med Chem Lett 9:3453-8. Zhao y cols. describen métodos para preparar modificaciones 2'-OMe en ácidos nucleicos.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden incluir bases heterocíclicas púricas o pirimidínicas naturales o sintéticas, así como estructuras modificadas. Las bases heterocíclicas púricas o pirimidínicas incluyen, pero no se limitan a, adenina, guanina, citosina, timina, uracilo, e inosina. Otras bases heterocíclicas representativas se muestran en la Patente de EE.UU Nº 3,687,808, publicada por Merigan, y cols. El término purina o pirimidina o bases se utilizan aquí para referirse tanto a purinas, pirimidinas o bases naturales como sintéticas.
Otros ácidos nucleicos estabilizados incluyen: análogos de ADN no iónicos, como alquil- y aril- fosfatos (en los que el oxígeno fosfonato cargado está sustituido por un grupo arilo o alquilo), alquilfosfodiester y alquilfosfotriésteres, en los que la porción de oxígeno cargada está alquilada. Los ácidos nucleicos que contienen diol, como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en uno o ambos extremos terminales, también han mostrado ser sustancialmente resistentes a la degradación por nucleasas.
De acuerdo con aspectos más alejados de la invención, los ácidos nucleicos de tipo CpG son útiles para tratar a un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar ciertas enfermedades, que incluyen una enfermedad infecciosa debida a una infección con un agente infeccioso, una alergia o asma donde se conoce o sospecha el alergeno o la predisposición a asma, o un cáncer en el que se ha identificado un antígeno cancerígeno específico. Los ácidos nucleicos de tipo CpG también pueden determinarse sin el antígeno o alergeno para protección a corto plazo contra infecciones, cáncer, alergia o asma, y en este caso, dosis repetidas permitirán una protección a largo plazo.
El término "tratar" se define como administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto (por ejemplo, un oligonucleótido de la invención) que es suficiente para prevenir el comienzo de, aliviar los síntomas de, o parar la progresión de un trastorno o enfermedad que está siendo tratada.
Un "individuo", de acuerdo con la invención, significaría un humano u otro animal vertebrado que incluye, pero no limita, a un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, conejo, cedo de guinea, rata, ratón, primate no humano (por ejemplo, mono), pollo, y pez (especies de piscifactoría, por ejemplo, salmón).
Un "individuo de riesgo", tal como se utiliza aquí, es un individuo que tiene predisposición para tener una enfermedad o que tiene un riesgo identificado o sospechoso de exposición a un agente o condición asociada con el desarrollo de una enfermedad. Generalmente, el riesgo de desarrollar una enfermedad en particular será mayor en el individuo en riesgo que en otros individuos que, se considera, no están en riesgo.
Con referencia a una enfermedad infecciosa, un "individuo con riesgo de desarrollar una enfermedad infecciosa", tal como se utiliza aquí, es un individuo que tiene cualquier riesgo identificado o sospechoso de exposición a un patógeno que causa la infección. Por ejemplo, un individuo con riesgo de desarrollar una infección puede ser un individuo que vive o planea viajar a un área donde se encuentra un tipo de agente infeccioso concreto. Un individuo de riesgo puede ser un individuo que, por su modo de vida, ocupación, o por un procedimiento médico, está potencialmente expuesto a fluidos corporales o materiales que puedan contener organismos o agentes infecciosos. De forma alternativa, un individuo de riesgo puede ser un individuo que, por su modo de vida, ocupación, o por un procedimiento médico, está expuesto a organismos o agentes infecciosos. Un individuo con riesgo de desarrollar una infección también puede ser un individuo en riesgo de guerra biológica, por ejemplo, personal militar o aquellos que viven en áreas con riesgo de ataque terrorista. Los individuos con riesgo de desarrollar una infección también incluyen poblaciones generales en las que una agencia médica recomienda la vacunación contra un organismo o agente infeccioso en
particular.
Con referencia a alergia o asma, un individuo de riesgo, tal como se utiliza aquí, es un individuo que tiene cualquier riesgo identificado o sospechoso de exposición a un antígeno que produce alergia o asma. Por ejemplo, un individuo con riesgo de desarrollar alergia o asma puede ser un individuo que vive o planea viajar a un área donde se encuentra un tipo de antígeno o alergeno concreto. Un individuo con riesgo de desarrollar alergia o asma puede ser un individuo que, por su modo de vida o su empleo, está directamente expuesto a un antígeno o alérgeno. Los individuos con riesgo de desarrollar alergia o asma también incluyen poblaciones generales en las que una agencia médica recomienda la vacunación con un antígeno en particular. Si el antígeno es un alergeno y el individuo desarrolla respuestas alérgicas estacionales frente a ese antígeno en particular, por ejemplo, durante la estación de polen, entonces el individuo puede estar en riesgo de desarrollar alergia durante el periodo de exposición al antígeno. Un individuo con riesgo de desarrollar una alergia o asma incluye aquellos individuos que han sido identificados como teniendo una alergia o asma pero que no tienen la enfermedad activa durante el tratamiento con ácido nucleico de tipo CpG, así como aquellos individuos considerados como de riesgo de desarrollar estas enfermedades debido a factores genéticos o ambientales.
Con referencia al cáncer, un "individuo con riesgo de desarrollar un cáncer" es aquel que tiene un aumentada la probabilidad de tener cáncer. Estos individuos incluyen, por ejemplo, individuos que tienen anormalidades genéticas, la presencia de ésta ha sido demostrada por tener una relación correlativa a una mayor probabilidad de tener cáncer, así como individuos expuestos a agentes causantes de cáncer como el tabaco, los asbestos, u otras toxinas químicas, o individuos que han sido previamente tratados contra el cáncer y están en aparente remisión. Cuando un individuo con riesgo de desarrollar un cáncer es tratado con un antígeno específico para el tipo de cáncer del que el individuo está en riesgo de desarrollarlo y un ácido nucleico de tipo CpG, el individuo puede ser capaz de matar las células cancerosas mientras se desarrollan. Si un tumor comienza a formarse en un individuo, el individuo desarrollará una respuesta inmunitaria específica contra el antígeno tumoral.
Además del uso de ácidos nucleicos de tipo CpG para tratamiento profiláctico, la invención también abarca el uso de ácidos nucleicos de tipo CpG para el tratamiento de un individuo que tiene una infección, una alergia, asma, o un cáncer.
Una enfermedad infecciosa, tal como se utiliza aquí, es una enfermedad que surge de la presencia de un microorganismo extraño o un patógeno infeccioso en el cuerpo. Un "individuo que tiene una enfermedad infecciosa" es un individuo que ha sido expuesto a un patógeno infeccioso y tiene niveles agudos o crónicos detectables del patógeno en el cuerpo. Los patógenos infecciosos incluyen virus, bacterias, hongos, parásitos, y otros agentes infecciosos. Los ácidos nucleicos de tipo CpG pueden ser usados con un antígeno para montar una respuesta inmunitaria mucosal o sistémica específica de antígeno que es capaz de reducir el nivel de o erradicar el patógeno infeccioso.
Un individuo que tiene una alergia es un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar una reacción alérgica en respuesta a un alergeno. Una alergia se refiere a hipersensibilidad adquirida a una sustancia (alergeno). Las condiciones alérgicas incluyen, pero no se limitan, a eczema, urticaria, asma alérgica, rinitis alérgica o coryza, fiebre del heno, conjuntivitis, alergias a alimentos, y otras condiciones atópicas.
Actualmente, las enfermedades alérgicas generalmente se tratan tanto sintomáticamente (ver abajo) como definitivamente, esta última por inyección de pequeñas dosis de antígeno seguidas de dosis posteriores crecientes del antígeno. Se cree que este procedimiento induce la tolerancia al alérgeno para prevenir otras reacciones alérgicas. Sin embargo, puede llevar varios años hasta que estos métodos puedan ser eficaces y están asociados al riesgo de efectos secundarios como shock anafiláctico. Los métodos de la invención evitan estos problemas.
Las alergias generalmente se caracterizan por generación de anticuerpo IgE contra alergenos inofensivos. Las citoquinas que se inducen por administración mucosal o sistémica de ácidos nucleicos de tipo CpG son predominantemente de la clase llamada Th1 (ejemplos son IL-2 e IFN-\gamma) y estos inducen tanto respuesta inmunitaria humoral (anticuerpos) como respuesta inmunitaria celular. Los tipos de anticuerpos asociados a una respuesta Th1 son generalmente más protectivos porque tienen altas capacidades de neutralización y opsomización. La otra respuesta inmunitarias mayoritaria, que se llaman respuesta inmunitaria Th2, está asociada con la producción de citoquinas IL-4, IL-5 e IL-10. Las respuestas Th2 involucra predominantemente anticuerpos y tienen menor efecto protectivo frente a la infección y algunos isotipos Th2 (por ejemplo, IgE) están asociados con la alergia. En general, parece que las enfermedades alérgicas están mediadas por respuestas inmunes tipo Th2, mientras que las respuestas Th1 están asociadas con enfermedad autoinmune. Basado en la habilidad de los ácidos nucleicos de tipo CpG para cambiar la respuesta inmunitaria en un individuo, desde una respuesta Th2 (que está asociada con producción de anticuerpos IgE y alergia) a una Th1 (que es protectiva frente reacciones alérgicas) puede ser administrada, a un individuo, una dosis eficaz del ácido nucleico de tipo CpG para inducir una respuesta inmunitaria para tratar o prevenir una alergia.
De esta manera, los ácidos nucleicos de tipo CpG tienen utilidad terapéutica significativa en el tratamiento de condiciones alérgicas y no alérgicas como el asma. Las citoquinas Th2, especialmente IL-4 e IL-5, están elevadas en las vías respiratorias de individuos asmáticos. Estas citoquinas promueven aspectos importantes de la respuesta inflamatoria asmática, incluyendo el intercambio del isótopo IgE, quimiotaxis y activación eosinofílica, y degranulación de mastocitos. Las citoquinas Th1, especialmente IFN-\gamma e IL-2, pueden suprimir la formación de clones Th2 y la producción de citoquinas Th2.
Un individuo que tiene asma es un individuo que tiene un trastorno del sistema respiratorio, caracterizado por inflamación, estrechamiento de las vías respiratorias, e incrementada reactividad de las vías respiratorias a agentes inhalados. Típicamente, el asma es una enfermedad crónica, caracterizada por episodios reversibles agudos de estrechamiento generalizado de vías respiratorias. Por ello, actualmente, un individuo que tiene asma no requiere que el individuo sea sintomático, es decir, que actualmente tiene una exacerbación aguda de asma. Los métodos de diagnóstico del asma son bien conocidos en el estado de la técnica, y éstos pueden incluir medida de obstrucción reversible de vías respiratorias en respuesta a pulso con agonistas beta-adrenérgicos, histaminas, metacolina, o aire frío. El asma está frecuentemente, aunque no exclusivamente, asociado a síntomas atópicos y alérgicos.
Un individuo que tenga cáncer es un individuo que tiene células cancerosas detectables. El cáncer puede ser un cáncer maligno o no maligno. Los cánceres o tumores incluyen, pero no se limitan a, cáncer del tracto biliar; cáncer de cerebro; cáncer de pecho; cáncer cervical; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer de endometrio; cáncer esofágico; cáncer gástrico; neoplasmas intraepiteliales; linfomas; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (por ejemplo, de célula pequeña y célula no pequeña); melanoma; neuroblastoma; cáncer oral; cáncer de ovario; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas; cáncer de piel; cáncer testicular; cáncer de tiroides; y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas. En una realización, el cáncer es leucemia de célula vellosa, leucemia mielógena crónica, leucemia cutánea de célula T, mieloma múltiple, linfoma folicular, melanoma maligno, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula renal, carcinoma de próstata, carcinoma de célula de vejiga, o carcinoma de colon.
En algunas realizaciones, la invención puede ser usada para tratar cáncer y tumores en individuos no humanos. El cáncer es uno de las principales causas de muerte en animales de compañía (por ejemplo, gatos y perros). Normalmente, el cáncer ataca a animales más viejos que, en el caso de mascotas de casa, están integrados en la familia. El cuarenta y cinco por ciento de los perros mayores de 10 años son susceptibles de sucumbir al cáncer. Las opciones más comunes de tratamiento incluyen cirugía, quimioterapia y terapia de radiación. Otras modalidades de tratamiento que han sido utilizadas con algo de éxito son la terapia de láser, crioterapia, hipertermia e inmunoterapia. La elección del tratamiento depende del tipo de cáncer y del grado de diseminación. A no ser que el crecimiento maligno esté confinado a un área discreta en el cuerpo, es difícil eliminar sólo el tejido maligno sin afectar también a las células normales.
Los trastornos malignos comúnmente diagnosticados en perros y gatos incluyen, pero no están limitados a, carcinoma adenoescamoso, tumor de cerebro, tumor de glándula bronquial, adenocarcinoma bronquiolar, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide de pulmón, sarcoma de Ewing, fibroma, fibrosarcoma, linfosarcoma, tumores mamarios, mastocitoma, melanoma, microglioma, mixocondroma, neuroblastoma, neurosarcoma, neoplasia oral, osteoclastoma, osteoma, osteosarcoma, papiloma, sarcoma pulmonar, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, y tumor de Wilms. Otras neoplasias en perros incluyen carcinoma de la glándula adrenal, tumor de célula basal, cloroma (sarcoma granulocítico), papiloma corneal, carcinoma de célula escamosa de córnea, cistadenoma, carcinoma de célula escamosa genital, hemangioendotelioma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, histiocitoma, papilomatosis oral, mesotelioma pleural, seminoma, tumor de células de Sertoli, tumor de estómago, tumor testicular, timoma, y tumor venéreo transmisible. Malignidades adicionales diagnosticadas en gatos incluyen fibrosarcoma, linfoma folicular, linfosarcoma intestinal, y carcinoma de célula escamosa pulmonar. El hurón, el animal doméstico más popular, se conoce que desarrolla adenocarcinoma gástrico, linfoma gástrico MALT, insulinoma, linfoma, neuroma, tumor de célula de islote pancreático, y sarcoma.
Los neoplasmas que afectan al ganado de agricultura incluyen leucemia, hemangiopericitoma y neoplasia ocular bovina (en ganado); fibrosarcoma de prepucio, carcinoma de célula escamosa ulcerosa, carcinoma de prepucio, neoplasia de tejido conectivo y mastocitoma (en caballos); carcinoma hepatocelular (en cerdo); linfoma y adenomatosis pulmonar (en oveja); sarcoma pulmonar, linfoma, sarcoma de Rous, reticulendoteliosis, fibrosarcoma, nefroblastoma, linfoma de célula B y leucosis linfoide (en especies aviares); retinoblastoma, neoplasia hepática, linfosarcoma (linfoma linfoblástico), leucemia plasmocítica y sarcoma de vejiga natatoria (en peces), linfadenitis caseosa (CLA): enfermedad crónica, infecciosa, contagiosa de ovejas y cabras causada por la bacteria Corynebacterium pseudotuberculosis, y tumor contagioso de pulmón de ovejas causado por jaagsiekte.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG pueden también ser formulados con o administrados a un individuo conjuntamente con un antígeno. Un "antígeno", tal como se utiliza aquí, es una molécula capaz de provocar una respuesta inmunitaria. Los antígenos incluyen, pero no están limitados a, células, extractos celulares, proteínas, polipéptidos, péptidos, polisacáridos, conjugados de polisacáridos, imitadores péptidos y no péptidos de polisacáridos y otras moléculas, moléculas pequeñas, lípidos, glucolípidos, carbohidratos, virus y extractos virales y organismos multicelulares como parásitos y alergenos. El término antígeno ampliamente incluye cualquier tipo de molécula que sea reconocida como extraña por el sistema inmunitario de un hospedador. Los antígenos incluyen, pero no se limitan a, antígenos cancerosos, antígenos microbianos, y alergenos.
El individuo está expuesto a un antígeno. Tal como aquí se utiliza, con referencia a un antígeno, el término "expuesto" se refiere tanto al paso activo de contactar al individuo con un antígeno como la exposición pasiva del individuo al antígeno in vivo. Los métodos para la exposición activa del individuo con un antígeno son bien conocidos en el estado de la técnica. En general, un antígeno es administrado directamente al individuo por cualquier medio como la administración intravenosa, intramuscular, oral, transdérmica, mucosal, intranasal, intratraqueal, o subcutánea. El antígeno puede ser administrado sistemáticamente o localmente. Los métodos de administración del antígeno y el ácido nucleico de tipo CpG se describen con más detalle abajo. Un individuo está pasivamente expuesto a un antígeno si un antígeno se encuentra disponible para la exposición a las células inmunes en el cuerpo. Un individuo puede estar pasivamente expuesto a un antígeno, por ejemplo, por entrada de un patógeno extraño al interior del cuerpo o por el desarrollo de una célula tumoral que expresa un antígeno extraño en su superficie.
Los métodos por los cuales un individuo está pasivamente expuesto a un antígeno pueden ser particularmente dependientes del tiempo de administración del ácido nucleico de tipo CpG. Por ejemplo, en un individuo con riesgo de desarrollar una enfermedad infecciosa o una respuesta alérgica o asmática, o un cáncer, el individuo puede ser administrado con el ácido nucleico de tipo CpG en una base regular cuando dicho riesgo es el mayor, es decir, durante la temporada de alergia o tras exposición a un agente causante de cáncer.
Además, el ácido nucleico de tipo CpG puede ser administrado a viajeros antes de su viaje a tierras extranjeras, donde están en riesgo de exposición a agentes infecciosos. Así mismo, el ácido nucleico de tipo CpG puede ser administrado a soldados o civiles con riesgo de exposición a guerra biológica para inducir una respuesta inmunitaria sistémica o mucosal al antígeno cuando y si el individuo está expuesto a éste.
Tal como se utiliza aquí, los términos "antígeno canceroso" y "antígeno tumoral" se usan de forma intercambiable para referirse a antígenos que son diferencialmente expresados por células cancerosas y con ello, pueden ser explotados con el fin de marcar células cancerosas. Los antígenos cancerosos son antígenos que pueden estimular de forma potencial respuestas inmunes aparentemente específicas de tumores. Algunos de estos antígenos son codificados, aunque no necesariamente expresados, por células normales. Estos antígenos pueden ser caracterizados como aquellos que normalmente están silenciados (es decir, no expresados) en células normales, aquellos que son expresados sólo en ciertos estadios de diferenciación, y aquellos que son expresados temporalmente como antígenos embrionarios y fetales. Otros antígenos cancerosos son codificados por genes celulares mutantes, como oncogenes (por ejemplo, el oncogen ras activado), genes supresores (por ejemplo, el mutante de p53), y proteínas de fusión resultantes de deleciones internas o translocaciones cromosómicas. También, otros antígenos cancerosos pueden ser codificados por genes virales como aquellos transportados en el ARN y el ADN de virus tumorales.
Un antígeno canceroso, tal como se utiliza aquí, es un compuesto, como un péptido o proteína, asociado a una célula tumoral o cancerosa y que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria cuando se expresa sobre la superficie de una célula cancerosa en el contexto de una molécula MHC.
Preferiblemente, el antígeno está expresado en la superficie celular de la célula cancerosa. Aún más preferido, el antígeno es aquel que no está expresado por células normales, o al menos, no expresado al mismo nivel que en las células cancerosas. Los antígenos cancerosos pueden ser preparados a partir de células cancerosas tanto por preparación de extractos crudos de células cancerosas, por ejemplo, como se describe en Cohen PA y cols. (1994) Cancer Research 54: 1055-8; como por purificación parcial de antígenos, por tecnología recombinante, o por síntesis de novo de antígenos conocidos. Los antígenos cancerosos pueden ser utilizados en forma de porciones inmunogénicas de un antígeno en particular o, en algunos casos, una célula completa o una masa tumoral pueden ser utilizadas como el antígeno. Los antígenos cancerosos incluyen, pero no están limitados a, antígenos que están expresados de forma recombinante, una porción inmunogénica de una célula cancerosa o tumor, o un tumor o cáncer completo.
Un antígeno microbiano, tal como se utiliza aquí, es un antígeno de un microorganismo e incluye, pero no se limita a, antígenos asociados a virus, bacterias, hongos, y parásitos. Dichos antígenos incluyen el microorganismo intacto, así como aislados y fragmentos naturales o derivados del mismo y también compuestos sintéticos que son idénticos o similares a los antígenos del microorganismo natural, e inducen una respuesta inmunitaria específica para ese microorganismo. Un compuesto es similar a un antígeno de un microorganismo natural si éste induce una respuesta inmunitaria (humoral y/o celular) de un antígeno de un microorganismo natural. Dichos antígenos se utilizan de forma rutinaria en el estado de la técnica y son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Ejemplos de virus infecciosos incluyen, pero no se limitan a: Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Arena viridae (virus de la fiebre hemorrágica); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la Hepatitis B); Bungaviridae (por ejemplo, Virus Hantaan, virus bunga, flebovirus y virus Nairo); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus); Filoviridae (por ejemplo, virus ébola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Herpesviridae (virus del herpes simples (HSV) 1 y 2, virus de la varicela zoster, citomegalovirus (CMV), herpes virus); Iridoviridae (por ejemplo, virus africano de la fiebre del cerdo); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus influenza); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus de polioma); Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la Hepatitis A, enterovirus, virus Coxsackie humano, rinovirus, ecovirus); Poxviridae (virus variola, virus vaccina, pox virus); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Retroviridae (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana, como HIV-1 (también llamado HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV, o HIV-III, y otros aislados, como HIV-LP)); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola); y virus no clasificados (por ejemplo, el agente etiológico de encefalipatías espongiformes, el agente de la hepatitis delta (se piensa que es un satélite defectivo del virus de la Hepatitis B), agentes de hepatitis no-A, no-B (clase1=transmitidos internamente; clase2=transmitidos parenteralmente (es decir, Hepatitis C); virus Norwalk y relacionados, y astrovirus).
Ejemplos de bacterias infecciosas incluyen, pero no se limitan a: Acinetobacter Spp., Actinomyces israelli, Bacillus anthracis, Bacteroides spp., Bordetella pertussis, Borrelia burgdorfeli, Brucell melitensis, Campylobacter spp. patogénico, clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetan, Corynebacterium diphtheriae, otras Corynebacterium spp. Enterobacter aerogenes, Enterococcus spp., Erysipelothrix rhusiophatiae, Escherichia coli, Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Haemophilus influenzae, Helicobacter pilori, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophilia, Leptospira spp., Listeria monocytogenes, Mycobacteria ssp., (por ejemplo, M. Tuberculosis, M. Avium, M. Gordonae, M. Intracellulare, y M. Kansasii), Neisseria gonorrheoae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Pasturella multocida, Peptostreptococcus spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, otras Pseudomonas spp., Rickettsia, Salmonella spp., Serratia spp., Shigella spp., Staphylococcus aureus, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus (ssp. Aeróbica), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus agalactiae (Streptococcus Grupo B), Streptococcus bovis, Streptococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyrogenes (Streptococcus Grupo A), Treponema pallidum, Treponema pertenue, Vibrio Cholerae, otras spp. Vibrio, y Yersinis spp.
Ejemplos de hongos infecciosos incluyen, pero no se limitan a: Aspergillus spp., Blastomices dermatitidis, Candida albicans, otras Candida spp., Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, y Rhizopus spp.
Otros organismos infecciosos incluyen, pero no se limitan a: Babesia divergens, Babesia microti, Chlamydia trachomatis, Giardia spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Leishmania major, Leishmania tropica, Plasmodium spp.(por ejemplo, Plasmodium falciparum, Plasmodium knowlesi, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, y Plasmodium vivax), Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis, Tripanosoma cruzi, Tripanosoma gambiense, y Tripanosoma Rhodesiense.
Han sido ampliamente descritos en la literatura otros microorganismos médicamente relevantes, por ejemplo, ver C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983.
Aunque muchos de los microorganismos arriba descritos se relacionan con enfermedades humanas, la invención también es útil para tratar vertebrados no humanos. Los vertebrados no humanos también son capaces de desarrollar infecciones que pueden ser prevenidas o tratadas con los ácidos nucleicos de tipo CpG aquí descritos. Por ejemplo, además del tratamiento de enfermedades infecciosas humanas, los métodos de la invención son útiles para tratar infecciones de animales.
En Bennett, K., Compendium of Veterinary Products, 3^{rd} ed., North American Compendiums, Inc., 1995, se describen muchas vacunas para el tratamiento de vertebrados no humanos.
Tal como se ha discutido arriba, los antígenos incluyen microbios infecciosos como virus, bacterias, parásitos, hongos, y fragmentos de los mismos, derivados de fuentes naturales o sintéticas.
Los virus infecciosos de humanos y vertebrados no humanos, incluyen retrovirus, virus ARN y virus ADN. El grupo de retrovirus incluye el subgrupo de retrovirus de tipo B, retrovirus de tipo C y retrovirus de tipo D. Un ejemplo de retrovirus de tipo B es el virus de tumor mamario de ratón (MMTV). Los retrovirus de tipo C incluyen subgrupos del grupo A de tipo C (que incluye el virus del sarcoma Rous (RSV), virus de leucemia aviaria (ALV), y virus de mieloblastosis aviaria (AMV)) y del grupo B de tipo C (que incluye el virus de leucemia felina (FeLV), virus de leucemia de simio gibón (GALV), virus de necrosis de bazo (SNV), virus de la reticuloendoteliosis (RV) y virus de sarcoma de simios (SSV)). Los retrovirus de tipo D incluyen el virus Mason-Pfizer de monos (MPMV) y el retrovirus tipo 1 de simios (SRV-1). Los retrovirus complejos incluyen los subgrupos de lentivirus, virus de leucemia de células T y los virus espumosos.
Los lentivirus incluyen HIV-1, HIV-2, SIV, virus Visna, virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), y virus de anemia infecciosa equina (EIAV). Los virus de leucemia de célula T incluyen HTLV-1, HTLV-II, virus de leucemia de célula T en simios (STLV), y virus de leucemia bovina (BLV). Los virus espumosos incluyen virus espumoso humano (HFV), virus espumoso de simios (SFV) y virus espumosos bovinos (BFV).
Ejemplos de otros virus ARN que son antígenos en los animales vertebrados incluyen, pero no se limitan a, miembros de la familia Reoviridae, incluyendo el género Orthoreovirus (múltiples serotipos de retrovirus, tanto de mamíferos como de aves), el género Orbivirus (virus Bluetongue, virus Eugenangee virus Kemerovo, virus africano de la enfermedad de los caballos, y virus Colorado Tick Fever), el género Rotavirus (rotavirus humano, virus Nebraska de la diarrea de crías, rotavirus de simios, rotavirus ovino o bovino, rotavirus de aves); la familia Picornaviridae, incluyendo el género Enterovirus (poliovirus, Coxsackie virus A y B, virus huérfano enterocitopático humano (ECHO), virus de la hepatitis A, enterovirus de simios, virus de la encefalomielitis de múridos (ME) Poliovirus muris, enterovirus bovino, enterovirus porcino, el género Cardiovirus (virus encefalomiocarditis (EMC), Mengovirus), el género Rhinovirus (rhinovirus humanos que incluyen al menos 113 subtipos; otros rhinovirus), el género Apthovirus (enfermedad de pie y boca (FMDV); la familia Calciviridae, incluyendo virus del exantema vesicular de cerdo, virus de león marino de San Miguel, picornavirus felino y virus Norwalk; la familia Togaviridae, incluyendo el género Alphavirus (virus de encefalitis equina del oeste, virus del bosque Semliki, virus Sindbi, virus Chikungunya, virus O'Nyong-Nyong, virus del río Ross, virus de la encefalitis equina de Venezuela, virus de la encefalitis equina del oeste), el género Flavivirus (virus de la fiebre amarilla terminal de mosquito, virus Dengue, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de St, Louis, virus de la encefalitis Murray Valley, virus del oeste del Nilo, virus Kunjin, virus Tick terminal Centroeuropeo, virus Tick terminal del lejano oeste, virus del bosque Kyasanur, virus Louping III, virus Powassan, virus de la fiebre hemorrágica Omsk), el género Robivirus (virus Rubéola), el género Pestivirus (virus de la enfermedad mucosal, virus cólera Hog, virus de la enfermedad Border); la familia Bunyaviridae, incluyendo el género Bunyvirus (virus Bunyamwera y relacionados, virus del grupo de la encefalitis de California), el género Phlebovirus (virus siciliano de la fiebre sandfky, virus de la fiebre de Rift Valley), el género Nairovirus (vieru de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, virus de la enfermedad de ovejas de Nairobi), y el género Uukuvirus (virus Uukuniemi y relacionados); la familia Orthomyxoviridae, incluyendo el género del virus Influenza (virus Influenza tipo A, muchos subtipos humanos); virus influenza de cerdos, y virus influenza aviar y equino; influenza tipo B (muchos subtipos humanos), e influenza tipo C (posibles géneros separados); la familia paramyxoviridae, incluyendo el género Paramixovirus (virus Parainfluenza tipo 1, virus Sendai, virus Hemadsorption, virus Parainfluenza tipos 2 a 5, Virus de la Enfermedad de Newcastle, virus de las Paperas), el género Morbillivirus (virus del sarampión, virus de la panencefalitis esclerosante subcutánea, virus del moquillo, virus Rinderpest), el género Pneumovirus (virus respiratorio sincitial (RSV), virus respiratorio sincitial bovino y virus Pneumonia); la familia Rhabdoviridae, incluyendo el género Vesiculovirus (VSV), virus Chandipura, virus Flanders-Hart Park), el género Lyssavirus (virus de la Rabia), Rhabdovirus de peces, y dos Rhabdovirus probables (virus Marburg y virus Ebola); la familia Arenaviridae, incluyendo virus de coriomeningitis linfocítica (LCM), el complejo virus Tacaribe, y el virus Lassa; la familia Coronoaviridae, incluyendo Virus de la Bronquitis Infecciosa (IBV), virus Hepatitis, corona virus entérico humano, y peritonitis infecciosa felina (coronavirus felino).
Virus de ADN ilustrativos que son antígenos en animales vertebrados incluyen, pero no son limitantes a, la familia Poxviridae, incluyendo el género Orthopoxvirus (Variola major, Variola minor, pox Vaccinia de mono, pox de vaca, pox de búfalo, pox de conejo, Ectromelia), el género Leporipoxvirus (Myxoma, Fibroma), el género Avipoxvirus (pox de aves de corral, otros poxvirus de aves), el género Capripoxvirus (pox de oveja, pox de cabra), el género Suipoxvirus (pox de cerdo), el género Parapoxvirus (virus de la dermatitis postular contagiosa, pseudocowpox, virus de la estomatitis postular bovina); la familia Iridoviridae (virus de la fiebre africana de cerdo, virus 2 y 3 de ranas, virus de linfocistis de peces); la familia Herpesviridae, incluyendo los alfa-Herpesvirus (Herpes Simplex Tipos 1 y 2, Varicela-Zoster, virus del aborto equino, virus del herpes equino 2 y 3, pseudorabia virus, virus de la queratoconjuntivitis infecciosa bovina, virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina, virus de la rinotraqueítis felina, virus de la laringotraqueítis infecciosa) los Beta-herpesvirus (cytomegalovirus humano y cytomegalovirus de cerdo y monos); los gamma-herpesvirus (virus Epstein-Barr (EBV), virus de la enfermedad de Marek, Herpes saimiri, Herpesvirus ateles, Herpesvirus sylvilagus, herpes virus del cerdo de guinea, virus del tumor Lucke); la familia Adenoviridae, incluyendo el género Mastadenovirus (subgrupos humanos A,B,C,D,E y no agrupados adenovirus de simios (al menos 23 serotipos), hepatitis infecciosa canina, y adenovirus del ganado, de cerdos, de ovejas, ranas y muchas otras especies, el género Aviadenovirus (adenovirus aviares); y adenovirus no cultivables; la familia Papoviridae, incluyendo el género Papillomavirus (virus del papiloma humano, virus del papiloma bovino, virus del papiloma de conejo Shope, y varios papiloma virus patogénicos de otras especies), el género Polyomavirus (polyomavirus, agente vacuolante de simios (SV-40), agente vacuolante de conejos (RKV), virus K, virus BK, virus JC, y otros polioma virus de primate como el papiloma virus linfotrópico); la familia Parvoviridae incluyendo el género de virus Adeno-associados, el género Parvovirus (virus de panleucopenia felina, parvovirus bovino, parvovirus canino, virus de la enfermedad de visón aleutiano, etc). Finalmente, los virus de ADN pueden incluir cirus que no encajan en las familias de arriba, como los virus de las enfermedades de Kuru y Creutzfeldt-Jacob y los agentes neuropáticos crónicos infecciosos (virus
CHINA).
Cada unas de las listas precedentes son ilustrativas, y no pretenden ser limitantes.
Además del uso de los ácidos nucleicos de tipo CpG para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno en humanos, los métodos de las realizaciones preferidas son particularmente apropiados para el tratamiento de pájaros como gallinas, pollos, pavos, patos, gansos, codornices, y faisán. Los pájaros son la diana principal de muchos tipos de infecciones.
Los pájaros que empollan están expuestos a microorganismos patogénicos tras el nacimiento. Aunque inicialmente, estos pájaros están protegidos contra patógenos por anticuerpos derivados de la madre, esta protección sólo es temporal, y el propio sistema inmunitario inmaduro de los pájaros debe empezar a proteger al pájaro contra los patógenos. Normalmente, es deseable prevenir la infección en pájaros jóvenes cuando son más susceptibles. También es deseable prevenir la infección en pájaros más viejos, especialmente cuando los pájaros se alojan en pequeños espacios, provocándose la rápida extensión de la enfermedad. Por ello, es deseable administrar el ácido nucleico de tipo CpG de la invención a pájaros que desarrollan una respuesta inmunitaria específica de antígeno cuando el antígeno está presente.
Un ejemplo de una infección viral común en pollos es el virus de la anemia infecciosa de pollos (CIAV). CIAV primero se aisló en Japón en 1979 durante una investigación de interrupción de la vacunación de la enfermedad de Marek. Yuasa y cols. (1979)- Avian Dis 23:366-385. Desde ese tiempo, CIAV había sido detectado en aves de corral comerciales en todos los países productores de aves de corral (van Bulow y cols., in Diseases of Poultry, 9th edition, Iowa State University Press, 1991, pp. 690-699).
La infección por CIAV resultó en una enfermedad clínica caracterizada por anemia, hemorragia e inmunosupresión, en pollos jóvenes susceptibles. También son características de la infección con CIAV, la atrofia del timo y la médula ósea y consistentes lesiones en pollos infectados con CIAV. La depleción de linfocitos en el timo, y ocasionalmente en la bursa de Fabricius, resulta en inmunosupresión y aumentada susceptibilidad a infecciones secundarias víricas, bacterianas, o fúngicas que con ello, complican el curso de la enfermedad. La inmunosupresión puede causar enfermedad agravada tras la infección con uno o más virus de la enfermedad de Marek (MDV), con virus de la enfermedad bursal infecciosa, con el virus de reticuloendoteliosis, con adenovirus, o reovirus. Se ha demostrado que la patogénesis de MDV está aumentada por CIAV (DeBoer y cols., 1989, p. 28, In: Proceedings of the 38th Western Poultry Diseases Conference, Tempe, Ariz.).
Además, se ha demostrado que CIAV agrava los signos de la enfermedad bursal infecciosa. Rosenberger y cols. (1989) Avian Dis 33:707-713. Con la edad, los pollos desarrollan una resistencia a la enfermedad inducida experimentalmente debido a CAA. Esta, es esencialmente completa a la edad de 12 semanas, pero pájaros más viejos son todavía susceptibles a la infección (Yuasa, N. y cols., 1979 supra; Yuasa, N. y cols., Avian Dis 24, 202-209, 1980). Sin embargo, si los pollos son infectados dualmente con CAA y un agente inmunosupresor (IBDV, MDV, etc), se retrasa la resistencia con la edad frente a la enfermedad (Yuasa, N. y cols., 1979 y 1980 supra; Bulow von V. y cols. J Veterinary Medicine 33:93-116,1986). Las características de CIAV que podrían potenciar la transmisión de la enfermedad incluyen alta resistencia a la inactivación ambiental y algunos desinfectantes comunes. El impacto económico de la infección CIAV en la industria de aves de corral está clara a partir del hecho de que del 10% al 30% de los pájaros infectados mueren en brotes de enfermedad.
La vacunación de pájaros, al igual que otros animales vertebrados, puede ser realizada a cualquier edad. Normalmente, las vacunaciones son realizadas a partir de las 12 semanas de edad para un microorganismo vivo y entre 14-18 semanas para un microorganismo inactivado u otro tipo de vacuna. Para la vacunación in ovo, la vacunación puede ser realizada en el último cuarto del desarrollo embrionario. La vacuna puede ser administrada de forma subcutánea, por spray, oralmente, de forma intraocular, intratraqueal, nasal, o por cualquier otro método de administración mucosal aquí descrito. Por ello, los ácidos nucleicos de tipo CpG de la invención pueden ser administrados a pájaros y otros vertebrados no humanos utilizando programas rutinarios de vacunación y el antígeno puede ser administrado tras un periodo de tiempo apropiado tal como aquí se describe.
El ganado y las propiedades ganaderas también son susceptibles de infección. Las enfermedades que afectan a estos animales pueden producir severas pérdidas económicas, especialmente contra el ganado. Los métodos de la invención pueden ser usados para proteger contra la infección en ganado, como vacas, caballos, cerdos, ovejas, y cabras.
Las vacas pueden ser infectadas por virus bovinos. El virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) es un virus de cadena de ARN positivo de envuelta pequeña y está clasificado, junto con el virus de cólera hog (OCT) y el virus de la enfermedad de ovejas (BDV), en el género Pestivirus. Aunque previamente se clasificaron los Pestivirus en la familia de los Togaviridae, algunos estudios han sugerido su reclasificación dentro de la familia Flaviviridae junto con el grupo de los flavivirus y el virus de la hepatitis C (HCV) (Francki, y cols., 1991).
BVDV, que es un patógeno importante en el ganado, puede distinguirse, basándose en análisis de cultivo celular, en biotipos citopatogénicos (CP) y no citopatogénicos (NCP). El biotipo NCP está más extendido, aunque ambos biotipos se pueden encontrar en el ganado. Si una vaca preñada se infecta con una cepa NCP, la vaca puede dar a luz a una cría infectada persistentemente y específicamente inmunotolerante que extenderá el virus durante su tiempo de vida. El ganado infectado de forma persistente puede sucumbir a enfermedades mucosales, y ambos biotipos pueden, entonces, ser aislados del animal. Las minifestaciones clínicas pueden incluir aborto, teratogénesis, y problemas respiratorios, enfermedad mucosal y diarrea leve. Además, se ha descrito una severa trombocitopenia, asociada con epidemias de la manada, que puede resultar en la muerte del animal, y las cepas asociadas a esta enfermedad parecen ser más virulentas que las clásicas BVDVs.
Los virus del herpes equino (EHV) comprenden un grupo de agentes biológicos antigénicamente diferentes que causan una variedad de infecciones en caballos, desde una gama subclínica hasta una enfermedad fatal. Éstos incluyen herpesvirus-1 equinos (EHV-1), un patógeno ubicuo en caballos. EHV-1 está asociado a epidemias de aborto, enfermedades del tracto respiratorio, y trastornos del sistema nervioso central. La infección principal del tracto respiratorio superior de caballos jóvenes resulta en una enfermedad febril que dura de 8 a 10 días. Las yeguas inmunológicamente experimentadas pueden ser re-infectadas vía tracto respiratorio sin que se dé enfermedad aparente, por lo que se produce aborto sin aviso. El síndrome neurológico está asociado a enfermedad respiratoria o aborto y puede afectar a animales de cualquier sexo y edad, provocando falta de co-ordinación, debilidad y parálisis posterior. Telford EAR y cols. (1992) Virology 189:304-316. Otros EHVs incluyen EHV-2, o citomegalovirus equino, EHV-3, virus de exantema coital equino, y EHV-4, previamente clasificado como EHV-1 subtipo 2.
Las ovejas y cabras pueden ser infectadas por una variedad de microorganismos peligrosos que incluyen visna-maedi.
Los primates como monos, simios y macacos pueden ser infectados por virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV). Se han demostrado vacunas de simio inactivadas de virus de inmunodeficiencia celular y células libres totales para permitir la protección en macacos. Stott y cols. (1990) Lancet 36:1538-1541; Desrosiers y cols. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:6353-6357; Murphey-Corb y cols. (1989) Science 246:1293-1297; y Carlson y cols. (1990) AIDS Res Human Retroviruses 6:1239-1246. Se ha mostrado una vacuna recombinante de gp120 de HIV para permitir la protección en chimpancés. Berman y cols. (1990) Nature 345:622-625.
Los gatos, tanto domésticos como salvajes, son susceptibles de infección con una variedad de microorganismos. Por ejemplo, La peritonitis infecciosa felina es una enfermedad que ocurre tanto en gatos domésticos como salvajes, como leones, leopardos, guepardos, y jaguares. Cuando se desea prevenir la infección con este u otros tipos de organismos patogénicos en gatos, los métodos de la invención pueden ser usados para vacunar gatos para protegerlos frente a la infección.
Los gatos domésticos se infectan con varios retrovirus, que incluyen, pero no están limitados a, virus de la leucemia felina (FeLV), virus del sarcoma felino (FeSV), Concornavirus de tipo endógeno (RD-114), y virus felino de formación de sincitios (FeSFV). De estos, FeLV es el patógeno más significativo, ya que causa diversos síntomas, que incluyen neoplasmas linforeticulares y mieloides, anemias, trastornos inmunes mediados, y un síndrome de inmunodeficiencia que es similar al síndrome de inmunodeficiencia adquirido humano (AIDS). Recientemente, un mutante particular de FeLV defectuoso en la replicación, llamado FeLV-AIDS, se ha asociado más particularmente con propiedades inmunosupresoras.
El descubrimiento del lentivirus T-linfocítico felino (también llamado como virus de la inmunodeficiencia felina, FIV) se demostró primero por Pedersen y cols. (1987) Science 235:790-793. Se han demostrado características del FIV en Yamamoto y cols. (1988) Leukemia 2(12 Supp):204S-215S; Yamamoto y cols. (1988) Am J Vet Res 49:1246-1258; y Ackley y cols. (1990) J Virol 64:5652-5655. El análisis de clonaje y de secuencias de FIV se ha demostrado en Olmsted y cols. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:2448-2452 y 86:4355-4360.
La peritonitis infecciosa felina (FIP) es una enfermedad esporádica que ocurre de forma impredecible en Félidos domésticos y salvajes. Mientras que FIP es principalmente una enfermedad de gatos domésticos, se ha diagnosticado en leones, leones de montaña, leopardos, guepardos, y en el jaguar. Los gatos salvajes más pequeños que han sido afectados de FIP incluyen el lince y caracal, el gato de arena, y el gato de pallas. En los gatos domésticos, la enfermedad ocurre predominantemente en animales jóvenes, aunque son susceptibles los gatos de cualquier edad. Un pico de incidencia ocurre entre los 6 y 12 meses de edad. Se advierte una disminución de la incidencia desde los 5 a los 13 años de edad, seguido de un incremento de la incidencia en gatos de 14 a 15 años de edad.
Las enfermedades víricas, bacterianas y parasitarias en peces con aleta, marisco u otras formas de vida acuáticas, plantean un serio problema para la industria de piscifactoría. Debido a la alta densidad de animales en los criaderos de peces o en las piscifactorías, las enfermedades infecciosas pueden erradicar una extensa proporción de la reserva, por ejemplo, peces con aleta, marisco, u otras formas de vida acuáticas. La prevención de la enfermedad es el remedio más deseado para estas amenazas en los peces, más que la intervención una vez que la enfermedad está en progreso. La vacunación de los peces es el único método preventivo, que puede ofrecer protección a largo plazo por medio de inmunidad. Las vacunas basadas en ácidos nucleicos se describen en la Patente de EE.UU Nº 5,780,448 emitida por Davis.
Las especies de piscifactoría incluyen, pero no se limitan a, peces con aleta, marisco, y otros animales acuáticos. Los peces con aleta incluyen todos los peces vertebrados, que pueden ser peces con hueso o cartilaginosos, como, por ejemplo, salmónidos, carpas, bagre, de cola amarilla, besugo, y lubina. Los salmoides son una familia de peces con aleta que incluyen trucha (incluyendo la trucha arcoiris), salmón, y Arctic char.
Ejemplos de mariscos incluyen pero no se limitan a, almejas, langosta, gamba, cangrejo, y ostras. Otros animales acuáticos de piscifactoría incluyen, pero no se limitan a, anguilas, calamar, y pulpos.
Los polipéptidos de los patógenos virales de las piscifactorías incluyen, pero no se limitan a, glucoproteína (G) o nucleoproteína (N) del virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV); proteínas G o N del virus de la necrosis hematopyética infecciosa (IHNV); proteínas estructurales VP1, VP2, VP3 o N del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV); proteína G de la viremia primaveral de la carpa (SVC), y una proteína asociada a membrana, tegumina o proteína de la cápsida o glicoproteína del virus del bagre de canal (CCV).
Los parásitos típicos que infectan a caballos son Gasterophilus spp.; Eimeria leuckarti; Giardia spp.; Tritrichomonas equi; Babesia spp. (RBC's); Theileria equi; Trypanosoma spp.; Klossiella equi; y Sarcocystis spp.
Los parásitos típicos que infectan a cerdos incluyen Eimeria bebliecki; Eimeria scabra; Isospora suis; Giardia spp.; Balantidium coli; Entamoeba histolytica; Toxoplasma gondii y Sarcocystis spp.; y Trichinella spiralis.
Los principales parásitos de las crías de establo y de vacas incluyen Eimeria spp.; Cryptosporidium spp.; Giardia spp.; Toxoplasma gondii; Babesia bovis (RBC); Babesia bigemina (RBC); Trypanosoma spp. (plasma); Theileria spp. (RBC); Theileria parva (linfocitos); Tritrichomonas foetus; y Sarcocystis spp.
Los principales parásitos de las aves de rapiña incluyen Trichomonas gallinae; Coccidia (Eimeria spp.); Plasmodium relictum; Leucocytozoon danilewskyi (búhos); Haemoproteus spp.; Trypanosoma spp.; Histomonas; Cryptosporidium meleagridis; Cryptosporidium baileyi; Giardia; Eimeria; Toxoplasma.
Los parásitos típicos que infectan a ovejas y cabras incluyen Eimeria spp.; Cryptosporidium spp.; Giardia spp.; Toxoplasma gondii; Babesia spp. (RBC); Trypanosoma spp. (plasma); Theileria spp. (RBC); y Sarcocystis spp.
Las infecciones parasitarias de aves de corral incluyen coccidiosis causada por Eimeria acervulina; E. necatrix; E. tenella; Isospora spp. y Eimeria truncata; histomoniasis; causada por Histomonas meleagridis e Histomonas gallinarum; tricomoniasis causada por Trichomonas gallinae; y hexamitiasis causada por Hexamita meleagridis. Las aves de corral también pueden ser infectadas por Emeria maxima; Emeria meleagridis; Eimeria adenoeides; Eimeria meleagrimitis; Cryptosporidium; Eimeria brunetti; Emeria adenoeides; Leucocytozoon spp.; Plasmodium spp.; Hemoproteus meleagridis; Toxoplasma gondii; y Sarcocystis.
Los métodos de la invención también pueden ser aplicados para el tratamiento y/o prevención de infecciones parasitarias en perros, gatos, pájaros, peces y hurones. Los parásitos típicos de los pájaros incluyen Trichomonas gallinae; Eimeria spp.; Isospora spp.; Giardia; Cryptosporidium; Sarcocystis spp.; Toxoplasma gondii; Haemoproteus/Parahaemoproteus; Plasmodium spp.; Leucocytozoon/Akiba; Atoxoplasma; y Trypanosoma spp. Los parásitos típicos que infectana perros incluyen Trichinella spiralis; Isopora spp.; Sarcocystis spp.; Cryptosporidium spp.; Hammondia spp.; Giardia duodenalis (canis); Balantidium coli; Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis; Toxoplasma gondii; Trypanosoma cruzi; Babesia canis; Leishmania amastigotes; y Neospora caninum.
Los parásitos típicos que infectan a las especies felinas incluyen Isospora spp.; Toxoplasma gondii; Sarcocystis spp.; Hammondia hammondi; Besnoitia spp.; Giardia spp.; Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis; Cytauxzoon spp.; Cytauxzoon spp.; y Cytauxzoon spp. (células rojas; células RE).
Los parásitos típicos que infectan a los peces incluyen Hexamita spp.; Eimeria spp.; Cryptobia spp.; Nosema spp.; Myxosoma spp.; Chilodonella spp.; Trichodina spp.; Plistophora spp.; Myxosoma Henneguya; Costia spp.; Ichthyophithirius spp.; y Oodinium spp.
Los parásitos típicos de mamíferos salvajes incluyen Giardia spp. (carnívoros; herbívoros); Isospora spp. (carnívoros); Eimeria spp. (carnívoros; herbívoros); Theileria spp. (herbívoros); Babesia spp. (carnívoros; herbívoros); Trypanosoma spp. (carnívoros; herbívoros); Schistosoma spp. (herbívoros); Fasciola hepatica (herbívoros); Fascioloides magna (herbívoros); Fasciola gigantica (herbívoros); and Trichinella spiralis (carnívoros: herbívoros).
Las infecciones parasitarias en zoos también pueden plantear serios problemas. Los parásitos típicos de la familia bovidae (blesbok, antílope, búfalo, eland, impala, klipsringer, kudu, gacela) incluyen Eimeria spp. Los parásitos típicos en la familia pinnipedae (foca, león marino) incluyen Eimeria Phocae. Los parásitos típicos de la familia camelidae (camellos, llamas) incluyen Eimeria spp. Los parásitos típicos de familia giraffldae (girafas) incluyen Eimeria spp. Los parásitos típicos en la familia elephantidae (africanos y asiáticos) incluyen Fasciola spp. Los parásitos típicos de primates inferiores (chimpancés, orangutanes, simios, babuínos, macacos, monos) incluyen Giardia spp.; Balantidium coli; Entamoeba histolytica; Sarcocystis spp.; Toxoplasma gondii; Plasmodim spp. (RBC); Babesia spp. (RBC); Trypanosoma spp. (plasma); y Leishmania spp. (macrófagos).
Los polipéptidos de patógenos bacterianos incluyen, pero no se limitan a, una proteína de la membrana externa regulada por hierro (IROMP), una proteína de la membrana externa (OMP), y una proteína-A de Aeromonis salmonicida que causa furunculosis, proteína p57 de Renibacterium salmoninarum que causa enfermedad bacteriana de riñón (BKD), antígeno principal asociado a superficie (msa), una citotoxina expresada en superficie (mpr), una hemolisina expresada en superficie (ish) y un antígeno flagelar de Yersiniosis; una proteína extracelular (ECP) una proteína de la membrana externa regulada por hierro (IROMP), y una proteína estructural de Pasteurellosis; una OMP y una proteína flagelar de Fibrosis anguillarum y V. ordalii; una proteína flagelar, una proteína OMP, aroA, y purA de Edwardsiellosis ictaluri y E. tarda; y un antígeno de superficie de Ichthyophthirius; y una proteína estructural y reguladora de Cytophaga columnari; y una proteína estructural y reguladora de Rickettsia.
Los polipéptidos de un patógeno parasitario incluyen, pero no se limitan a los antígenos de superficie de Ichthyophthirius.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG también pueden ser formulados con, o administrados a un individuo conjuntamente con un alergeno. Un alergeno se refiere a una sustancia (antígeno) que puede inducir una respuesta alérgica o asmática en un individuo susceptible. La lista de alergenos es enorme y puede incluir pólenes, venenos de insecto, escamas, pelos y plumas de animales, polvo, esporas de hongos y medicamentos (por ejemplo, penicilina). Ejemplos de alergenos de animales y de plantas incluyen, pero no se limitan a proteínas específicas de los siguientes géneros: Agropyron (por ejemplo, Agropyron repens); Agrostis (por ejemplo, Agrostis alba); Alder; Alnus (Alnus gultinoasd); Alternaria (Alternaria alternata); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia); Anthoxanthum (por ejemplo, Anthoxanthum odoratum); Apis (por ejemplo, Apis multiflorum); Arrhenatherum (por ejemplo, Arrhenatherum elatius); Artemisia (Artemisia vulgaris); Avena (por ejemplo, Avena sativa); Betula (Betula verrucosa); Blattella (por ejemplo, Blattella germanica); Bromus (por ejemplo, Bromus inermis); Canine (Canis familiar is); Chamaecyparis (por ejemplo, Chamaecyparis obtusa); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Cupressus (por ejemplo, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica, y Cupressus macrocarpa); Dactylis (por ejemplo, Dactylis glomerata); Dermatophagoides (por ejemplo, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Festuca (por ejemplo, Festuca elatior); Holcus (por ejemplo, Holcus lanatus); Juniperus (por ejemplo, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis, y Juniperus ashei); Lolium (por ejemplo, Lolium perenne or Lolium multiflorum); Olea (Olea europa); Parietaria (por ejemplo, Parietaria officinalis or Parietaria judaica); Paspalum (por ejemplo, Paspalum notatum); Periplaneta (por ejemplo, Periplaneta americana); Phalaris (por ejemplo, Phalaris arundinacea); Phleum (por ejemplo, Phleum pratense); Plantago (por ejemplo, Plantago lanceolate); Poa (por ejemplo, Poa pratensis ox Poa compressa); Quercus (Quercus alba); Secale (por ejemplo, Secale cereale); Sorghum (por ejemplo, Sorghum halepensis); Thuya (por ejemplo, Thuya orientalis); y Triticum (por ejemplo, Triticum aestivum).
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El antígeno puede ser un antígeno que es codificado por un vector de ácido nucleico o puede no ser codificado por un vector de ácido nucleico. En el primer caso, el vector de ácido nucleico es administrado al individuo y el antígeno es expresado in vivo. En el segundo caso, el antígeno puede ser administrado directamente al individuo. Un antígeno no codificado en un vector de ácido nucleico, tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier tipo de antígeno que no es un ácido nucleico. Por ejemplo, en algunos aspectos de la invención, el antígeno no codificado en un vector de ácido nucleico es un polipéptido. Las pequeñas modificaciones de las secuencias principales aminoacídicas de antígenos polipeptídicos también pueden resultar en un polipéptido que sustancialmente tiene actividad antigénica equivalente comparado con el polipéptido homólogo no modificado. Dichas modificaciones pueden ser deliberadas, como mutagénesis dirigidas a un lugar, o pueden ser espontáneas. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones están aquí incluidos mientras todavía exista antigenicidad. El polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido viral.
El término "sustancialmente purificado", tal como se utiliza aquí, se refiere al estado de un compuesto en particular debido a que sustancialmente está libre de otras proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que está naturalmente asociado. El término sustancialmente purificado, tal como se utiliza aquí, aplicado a un polipéptido, por tanto, se refiere a un polipéptido que está sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que está naturalmente asociado. Una persona experta en la técnica puede purificar polipéptidos virales o bacterianos utilizando técnicas clásicas para purificación de proteínas. El polipéptido sustancialmente puro normalmente producirá una banda principal en un gel de poliacrilamida no reductor. En el caso de polipéptidos parcialmente glucosilados o aquellos que tiene varios codones de inicio, habrá varias bandas en un gel de poliacrilamida no reductor, pero éstas formarán un patrón distintivo para ese polipéptido. La pureza del polipéptido viral o bacteriano también puede ser determinado por análisis de secuencia de aminoácido amino terminal. Otros tipos de antígenos no codificados por un vector de ácido nucleico como polisacáridos, moléculas pequeñas, mímicos, etc, también se describen arriba y están incluidos en la invención.
La invención también utiliza polinucleótidos que codifican polipéptidos antigénicos. Se prevé que el antígeno puede ser suministrado a un individuo en una molécula de ácido nucleico que codifica para el antígeno, de tal forma que el antígeno debe ser expresado in vivo. Dichos antígenos suministrados al individuo en un vector de ácido nucleico se refieren a antígenos codificados por un vector de ácido nucleico. El ácido nucleico que codifica el antígeno está operativamente unido a una secuencia de expresión génica que dirige la expresión del ácido nucleico antigénico dentro de la célula eucariótica. La secuencia de expresión génica es cualquier secuencia nucleotídoca reguladora, como una secuencia promotora o una combinación promotor-potenciador, que facilita la eficiente transcripción y traducción del ácido nucleico antigénico al que está operativamente unido. La secuencia de expresión génica puede, por ejemplo, ser un promotor de mamífero o de virus, como un promotor constitutivo o inducible. Los promotores constitutivos de mamífero incluyen, pero no se limitan a, promotores para los siguientes genes: hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), adenosina desaminasa, piruvato quinasa, promotor de \beta-actina, y otros promotores constitutivos. Ejemplos de promotores virales que funcionan constitutivamente en células eucarióticas incluyen, por ejemplo, promotores del citomegalovirus (CMV), de virus de simios, (por ejemplo, SV40), papiloma virus, adenovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), virus del sarcoma de Rous, las repeticiones terminales largas (LTS) del virus de la leucemia de Moloney y otros retrovirus, y el promotor de la timidita quinasa del virus herpes simplex. Otros promotores constitutivos son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los promotores útiles como secuencias de expresión génica de la invención también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles se expresan en presencia de un agente inductor. Por ejemplo, el promotor de metalotioneína está inducido para promover la transcripción y traducción en presencia de determinados iones metálicos. Otros promotores inducibles son conocidos por expertos en la técnica.
En general, la secuencia de expresión génica debería incluir, como necesarias, secuencias 5' no transcritas y 5' no traducidas implicadas en la iniciación de la transcripción y la traducción, respectivamente, como cajas TATA, secuencias caperuza, secuencia CAAT, y similares. De forma especial, las secuencias 5' no transcritas incluirán una región promotor que incluye una secuencia promotor para el control transcripcional del ácido nucleico antigénico operativamente unido. Como se desee, las secuencias de expresión génica opcionalmente incluyen secuencias potenciadoras o secuencias activadoras aguas arriba.
El ácido nucleico antigénico está operativamente unido a la secuencia de expresión génica. Tal como se utiliza aquí, la secuencia del ácido nucleico antigénico y la secuencia de expresión génica se dice que están operativamente unidas cuando están covalentemente unidas de una manera tal que tenga lugar la transcripción y/o traducción de la secuencia que codifica el antígeno bajo la influencia o el control de la secuencia de expresión génica. Se dice que hay dos secuencias de ADN que están operativamente unidas si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión génica 5' resulta en la transcripción de la secuencia antigénica y si la naturaleza de la unión entre ambas secuencias de ADN no (1) produce la introducción de una mutación de cambio de marco, (2) interfiere con la habilidad de la región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia antigénica, o (3) interfiere con la habilidad del correspondiente transcrito de ARN para ser traducido a una proteína. Por ello, una secuencia de expresión génica puede estar operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico antigénica si la secuencia de expresión génica fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ácido nucleico antigénica de tal forma que el transcrito resultante es traducido a la proteína o polipéptido deseado.
El ácido nucleico antigénico de la invención puede ser suministrado al sistema inmunitario solo o asociado a un vector. En su sentido más amplio, un vector es cualquier vehículo capaz de facilitar la transferencia del ácido nucleico antigénico a las células del sistema inmunitario, con lo que el antígeno puede ser expresado y presentado en la superficie de la célula inmune. El vector, generalmente transporta el ácido nucleico a las células inmunes con degradación reducida relacionada con la extensión de la degradación que podría resultar de la ausencia del vector. El vector opcionalmente incluye la secuencia de expresión génica descrita arriba para potenciar la expresión del ácido nucleico antigénico en las células inmunes. En general, los vectores útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagómidos, virus, otros vehículos derivados de fuentes víricas o bacterianas que han sido manipuladas por la inserción o incorporación de secuencias de ácido nucleico antigénico.
Los vectores virales son un tipo preferido de vector e incluye, pero no se limita a, secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: retrovirus, como el virus de la leucemia de Moloney de múridos, virus del sarcoma de múridos de Harvey, virus del tumor de múridos mamario, y virus del sarcoma de Rous; adenovirus; virus adeno-asociados; virus del tipo SV-40; polioma virus; virus Epstein-Barr; papiloma virus; herpes virus; virus vaccinia; polio virus; y virus de ARN como retrovirus. Uno puede, fácilmente, emplear otros vectores no nombrados aquí pero conocidos en el estado de la técnica.
Los vectores virales preferidos están basados en virus eucarióticos no citopáticos en los que los genes no esenciales han sido reemplazados por el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus, cuyo ciclo de vida implica transcripción inversa del ARN genómico viral a ADN con la subsiguiente integración proviral en el ADN celular del hospedador. Los retrovirus han sido aprobados para ensayos de terapia génica en humanos. Los más útiles son aquellos retrovirus que son deficientes en la replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Dichos vectores de expresión retroviral genéticamente alterados tienen utilidad general para la transducción de alta eficacia de genes in vivo. Los protocolos clásicos para la producción de retrovirus deficientes en la replicación (incluyendo los pasos de incorporación del material genético exógeno dentro de un plásmido, transfección con el plásmido de una línea celular enpaquetadora, producción por la línea celular enpaquetadora de retrovirus recombinantes, recogida del medio de cultivo tisular de partículas virales, e infección de las células dianas con las partículas virales) son proporcionados en Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) and Murry, E.J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991).
Un virus preferido para ciertas aplicaciones es el virus adeno-asociado (AAV), un virus de doble cadena de ADN. El virus adeno-asociado puede ser manipulado para ser deficiente en la replicación y es capaz de infectar a un amplia gama de tipos celulares y especies. Además, tiene ventajas como estabilidad en soluciones calientes y lipídicas; altas frecuencias de transducción en células de diversos linajes, incluyendo células hematopoyéticas; y falta de inhibición de superinfección, permitiendo con ello, múltiples series de transducción. Se ha demostrado que los virus adeno-asociados pueden integrarse dentro del ADN celular humano de una forma específica de lugar; minimizando, de ese modo, la posibilidad de mutagénesis insercional y la variabilidad de la expresión del gen insertado, característico de la infección retroviral. Además, las infecciones con virus adeno-asociados salvajes han sido seguidas en cultivo tisular durante más de 100 pases en ausencia de presión selectiva, suponiendo que la integración genómica del virus adeno-asociado es un acontecimiento relativamente estable. Los virus adeno-asociados también pueden funcionar de una manera extracromosómica.
Otros vectores incluyen vectores plasmídicos. Los vectores plasmídicos han sido extensamente descritos en el estado de la técnica y son bien conocidos en el estado de la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los últimos años, los vectores plasmídicos han sido particularmente ventajosos para suministrar, in vivo, genes a las células debido a su incapacidad de replicarse e integrarse dentro del genoma hospedador. Sin embargo, estos plásmidos, que tienen un promotor compatible con la célula hospedadora, pueden expresar un péptido de un gen operativamente codificado dentro del plásmido. Algunos de los plásmidos comúnmente utilizados incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNA3.1, pcDNA4, pZeoSV2, SV40, y pBlueScript. Otros plásmidos son bien conocidos por aquellos expertos en el estado de la técnica. Además, los plásmidos pueden ser diseñados utilizando enzimas de restricción y reacciones de ligación para eliminar y añadir fragmentos específicos de ADN.
Recientemente se ha descubierto que los plásmidos que llevan genes pueden ser suministrados al sistema inmunitario utilizando bacterias. Las formas modificadas de bacterias como Salmonella pueden ser transfectadas con el plásamido y usadas como vehículos de suministro. Los vehículos bacterianos de suministro pueden ser administrados a un individuo hospedador de forma oral o por otros medios de administración. La bacteria suministra el plásmido a las células inmunes, por ejemplo, células B y células dendríticas, probablemente por paso a través de la barrera intestinal. Se han establecido altos niveles de protección utilizando esta metodología. Dichos métodos de suministro son útiles para aspectos de la invención que utilizan el suministro sistémico del antígeno, el ácido nucleico de tipo CpG y/u otro agente terapéutico.
Semejantes a los ácidos nucleicos CpG, los ácidos nucleicos de tipo CpG son útiles como adyuvantes para inducir una respuesta inmunitaria sistémica. De esta manera, los ácidos nucleicos de tipo CpG pueden ser suministrados a un individuo expuesto a un antígeno para producir una respuesta inmunitaria potenciada frente al antígeno. Las combinaciones de dos o más ácidos nucleicos de tipo CpG diferentes también son útiles como adyuvantes para inducir una respuesta inmunitaria sistémica.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG también pueden ser combinados con otros agentes terapéuticos como adyuvantes para potenciar respuestas inmunes. El ácido nucleico de tipo CpG y otro agente terapéutico pueden ser administrados simultáneamente o secuencialmente. Cuando los otros agentes terapéuticos son administrados simultáneamente, pueden ser administrados en la misma o separadas formulaciones, pero son administrados al mismo tiempo. Los otros agentes terapéuticos son administrados secuencialmente con los otros y con el ácido nucleico de tipo CpG, cuando la administración de los otros agentes terapéuticos y el ácido nucleico de tipo CpG está temporalmente separada. La separación en el tiempo entre la administración de estos compuestos puede ser una cuestión de minutos o puede ser más larga. Otros agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes, citoquinas, anticuerpos, antígenos, etc.
Los ácidos nucleicos CpG son adyuvantes que pueden ser combinados con ácidos nucleicos de tipo CpG de la invención para potenciar respuestas inmunes. Otros ácidos nucleicos inmunoestimuladores, además de ácidos nucleicos CpG y ácidos nucleicos de tipo CpG, pueden también ser combinados con los ácidos nucleicos de tipo CpG de la invención para potenciar respuestas inmunes. Estos otros ácidos nucleicos inmunoestimuladores incluyen ácidos nucleicos poli-G y ácidos nucleicos ricos en T.
Un número de referencias describen las propiedades inmunoestimuladoras de los ácidos nucleicos poli-G. Pisetsky y Reich (1993) Mol Biol Reports 18:217-221; Krieger y Herz (1994) Ann RevBiochem 63:601-637; Macaya y cols. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:3745-3749; Wyatt y cols. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:1356-1360; Rando y Hogan (1998) en: Applied Antisense Oligonucleotide Technology, eds. Rrieg y Stein, p. 335-352; y Kirnura y cols. (1994) JBiochem 116:991-994.
El ácido nucleico poli-G, en realizaciones preferidas, comprende una de las siguientes fórmulas:
5' X_{1}X_{2}GGGX_{3}X_{4} 3',
donde X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, 5' GGGNGGG 3' o 5' GGGNGGGNGGG 3', donde N representa entre 0 y 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, al menos uno de X_{3} y X_{4} es una G y en otras realizaciones, ambos X_{3} y X_{4} son Gs.
Recientemente, el Dr. Arhur Krieg descubrió que los ácidos nucleicos ricos en T son inmunoestimuladores. En el simposio internacional "Immunobiology of Bacterial CpG-DNA", expuesto en Baviera del 26 al 29 de Septiembre de 1999, el Dr. Krieg presentó que los ácidos nucleicos poli-T de 24 bases de longitud son inmunoestimuladores, mientras que los nucleótidos poli-C de la misma longitud no son inmunoestimuladores. Tal como se utiliza aquí, "ácido nucleico rico en T" se refiere a un ácido nucleico que incluye al menos una secuencia poli-T y/o que tiene una composición nucleotídica de más del 25 por ciento de residuos de nucleótido timina (T). Una secuencia poli-T incluye, al menos, cuatro nucleótidos T consecutivos y no requiere de la presencia de un motivo CpG. Un ácido nucleico rico en A puede, opcionalmente, estar libre de dinucleótidos CpG no metilados o estar libre de dinucleóticos CpG
metilados.
Además, para combinar ácidos nucleicos de tipo CpG con otros ácidos nucleicos de tipo CpG u otros ácidos nucleicos inmunoestimuladores adyuvantes, las composiciones de la invención pueden también ser administradas con adyuvantes no ácidos nucleicos. Un adyuvante no ácido nucleico es cualquier molécula o compuesto excepto los ácidos nucleicos de tipo CpG aquí descritos que puedan estimular la respuesta inmunitaria humoral y/o celular. Los adyuvantes no ácido nucleicos incluyen, por ejemplo, adyuvantes que crean un efecto almacén, adyuvantes estimulantes inmunes, y adyuvantes que crean un efecto almacén y estimulen el sistema inmunitario.
Un adyuvante que crea un efecto almacén, tal como se utiliza aquí, es un adyuvante que causa que el antígeno sea liberado lentamente en el cuerpo, prolongando así la exposición del antígeno a células inmunes. Esta clase de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio); o formulaciones tipo emulsión que incluyen aceite mineral, aceite no mineral, emulsiones agua en aceite o aceite en agua, las emulsiones aceite en agua como adyuvantes ISA de las series de Montanida (por ejemplo, Montanida ISA 720, AirLiquide, Paris, France); MF-59 (una emulsión escualeno en agua estabilizada con Span 85 y Tween 80; Chiron Corporation, Emerville, CA; y PRO VAX (una emulsión aceite en agua que contiene un detergente estabilizante y un agente formador de micelas; IDEC, Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA).
Un adyuvante inmuno-estimulante es un adyuvante que causa activación de una célula del sistema inmunitario. Por ejemplo, podría causar que una célula inmune produzca y secrete citoquinas. Esta clase de adyuvantes incluyen, pero no se limita a, saponinas purificadas de la corteza del árbol Q. saponaria, como QS21 (un glucolípido que eluye en el 21º pico con fraccionamiento HPLC; Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, MA); poli[di(carboxilatofenoxi)fosfaceno (polímero PCPP; Virus Research Institute, USA); derivados de lipopolisacáridos como lípido monofosforil A (MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), dipéptido muramilo (MDP; Ribi) y dipéptido treonil-muramilo (t-MDP; Ribi); OM-174 (un disacárido glucosalina relacionado con el lípido A; OM Pharma SA, Meyrin, Switzerland); y el factor de elongación de Leishmania (una proteína purificada de Leishmania; Corixa Corporation, Seattle, WA).
Los adyuvantes que crean un efecto almacén y estimulan al sistema inmunitario son aquellos compuestos que tienen ambas de las funciones arriba identificadas. Esta clase de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, ISCOMS (complejos inmunoestimuladores que contienen saponinas mixtas, lípidos y forman partículas del tamaño de un virus con poros que pueden llevar un antígeno; CSL, Melbourne, Australia); SB-AS2 (Sistema adyuvante #2 de SmithKline Beecham que es una emulsión aceite en agua que contiene MPL y QS21: SmithKline Beecham Biologicals [SBB], Rixensart, Belgium); SB-AS4 (un sistema adyuvante #4 de SmithKline Beecham que contiene aluminio y MPL; SBB, Belgium); copolímeros bloque no iónicos que forman micelas como CRL 1005 (éstas contienen una cadena lineal de polixopropileno hidrofóbico flanqueado por cadenas de polioxietileno; Vaxcel, Inc., Norcross, GA); y Formulaciones Adyuvantes de Syntex (SAF, una emulsión aceite en agua que contiene Tween 80 y un copolímero bloque no iónico; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO).
Los ácidos nucleicos de tipo CpG también son útiles como adyuvantes mucosales. Previamente ha sido descubierto que ambas inmunidades, sistémica y humoral, están inducidas por el suministro mucosal de los ácidos nucleico CpG. La inmunidad sistémica inducida en respuesta a los ácidos nucleicos CpG incluía ambas respuestas, humoral y mediada por célula, a antígenos específicos, que no eran capaces de inducir la inmunidad sistémica cuando se administraban solos en la mucosa. Demás, tanto los ácidos nucleicos CpG como la toxina cólera (CT, un adyuvante mocosal que induce una respuesta de tipo Th2) inducen a los linfocitos T citotóxcos (CTL). Esto fue sorprendente, ya que, con inmunización sistémica, la presencia de anticuerpos de tipo Th2 se asocia normalmente con la falta de CTL (Schirmbeck y cols., 1995). Basados en los resultados aquí presentados, es de esperar que los ácidos nucleicos de tipo CpG funcionen de forma similar.
Además, los ácidos nucleicos de tipo CpG inducen una respuesta mucosal tanto en lugares de la mucosa local (por ejemplo, pulmón) como remora (por ejemplo, tracto digestivo inferior). Niveles significativos de anticuerpos IgA son inducidos en lugares distantes de la mucosa por los ácidos nucleicos de tipo CpG. Generalmente, se considera que CT es un adyuvante mucosal altamente eficaz. Como se ha demostrado previamente (Snider DP (1995) Crit Rev Immunol 15:317-48), CT predominantemente induce al isotipo IgG_{1} de los anticuerpos, que son indicativos de la respuesta de tipo Th2. Por el contrario, los ácidos nucleicos de tipo CpG son más Th1 con anticuerpos predominantemente IgG2_{a}, especialmente tras el estímulo o cuando se combinan los dos adyuvantes. En general, los anticuerpos de tipo Th1 tienen mejores capacidades estabilizantes, y además, una respuesta Th2 en el pulmón es altamente indeseable debido a que está asociado con el asma. Kay AB (1996) Ann NY Acad Sci 796:1-8; Hogg JC (1997) APMIS 105:735-45. Por ello, el uso de ácidos nucleicos de tipo CpG como adyuvantes mucosales tienen beneficios que no pueden conseguir otros adyuvantes mucosales. Los ácidos nucleicos de tipo CpG de la invención también son útiles como adyuvantes mucosales para inducir tanto la respuesta inmunitaria sistémica como mucosal.
Los adyuvantes mucosales referidos como adyuvantes mucosales no ácido nucleico, también pueden ser administrados con ácidos nucleicos de tipo CpG. Un adyuvante mucosal no ácido nucleico, tal como se utiliza aquí, es un adyuvante distinto del ácido nucleico de tipo CpG, que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria mucosal en un individuo cuando se le administra en una superficie mucosal conjuntamente con un antígeno. Los adyuvantes mucosales incluyen, pero no se limitan a, toxinas bacterianas, por ejemplo toxina del Cholera (CT), derivados de CT, que incluyen, pero no se limitan a, la subunidad B de CT (CTB) (Wu y cols., 1998, Tochikubo y cols., 1998); CTD53 (Asp por Val) (Fontana y cols., 1995); CTK97 (Lys por Val) (Fontana y cols., 1995); CTK104 (Lys por Tyr) (Fontana y cols., 1995); CTD53/K63 (Asp por Val, Lys por Ser) (Fontana y cols., 1995); CTH54 (His por Arg) (Fontana et al, 1995); CTN107 (Asn por His) (Fontana y cols., 1995); CTE114 (Glu por Ser) (Fontana y cols., 1995); CTE112K (Lys por Glu) (Yamamoto y cols., 1997a); CTS61F (Phe por Ser) (Yamamoto y cols., 1997a, 1997b); CTS106 (Lys por Pro) (Douce y cols., 1997, Fontana y cols., 1995); and CTK63 (Lys por Ser) (Douce y cols., 1997, Fontana y cols., 1995), toxina de zonula occludens, zot, enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli, toxina lábil (LT), derivados de LT que incluyen, pero no se limitan a, la subunidad B de LT (LTB) (Verweij y cols., 1998); LT7K (Lys por Arg) (Komase y cols., 1998, Douce y cols., 1995); LT61F (Phe por Ser) (Komase y cols., 1998); LT112K (Lys por Glu) (Komase y cols., 1998); LT118E (Glu por Gly) (Komase y cols., 1998); LT146E (Glu por Arg) (Komase y cols., 1998); LT192G (Gly por Arg) (Komase y cols., 1998); LTK63 (Lys por Ser) (Marchetti y cols., 1998, Douce y cols., 1997,1998, Di Tommaso y cols., 1996); y LTR72 (Ala to Arg) (Giuliani et al, 1998), Pertussis toxin, PT. (Lycke y cols., 1992, Spangler BD, 1992, Freytag and detriments, 1999, Roberts y cols., 1995, Wilson y cols., 1995) incluyendo PT-9K/129G (Roberts y cols., 1995, Cropley y cols., 1995); derivados de toxina (ver abajo) (Holmgren y cols., 1993, Verweij y cols., 1998, Rappuoli y cols., 1995, Freytag y Clements, 1999); derivados del lípido A (por ejemplo, lípido A monofosforilo, MPL) (Sasaki y cols., 1998, Vancott y cols., 1998; derivados del muramil dipéptido (MDP) (Fukushima y cols., 1996, Ogawa y cols., 1989, Michalek y cols., 1983, Morisaki y cols., 1983); proteínas de la membrana externa de bacterias (por ejemplo, proteína A de la superficie externa (OspA) lipoproteina de Borrelia burgdorferi, proteína de la membrana externa de Neisseria meningitidis) (Marinaro y cols., 1999, Van de Verg y cols., 1996); emulsiones aceite en agua (por ejemplo, MF59) (Barchfield y cols., 1999, Verschoor y cols., 1999, O'Hagan, 1998); sales de aluminio (Isaka y cols., 1998, 1999); y saponinas (e.g., QS21, Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, MA) (Sasaki y cols., 1998, MacNeal y cols., 1998), ISCOMS, MF-59 (una emulsión de escualeno en agua estabilizada con Span 85 y Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA); las series Seppic ISA series de los adyuvantes Montanide (por ejemplo, Montanide ISA 720; AirLiquide, Paris, France); PRO VAX (una emulsión de aceite en agua que contiene un detergente y un agente formador de micelas; EDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA); Syntext Adjuvant Formulation (SAF; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO);
poli[di(carboxilatofnoxi)fosfaceno (polímero PCPP; Virus Research Institute, USA) y el factor de elongación de Leishmania (Corixa Corporation, Seattle, WA).
Las respuestas inmunes también pueden ser inducidas o aumentadas por la co-administración o la expresión co-lineal de citoquinas (Bueler y Mulligan, 1996; Chow y cols., 1997; Geissler y cols.,1997; Iwasaki y cols.,1997; Kim y cols.,1997), o por moléculas co-estimuladoras (por ejemplo, B7-1 (CD20), B7-2 (CD86); Iwasaki y cols.,1997; Tsuji y cols., 1997) con los ácidos nucleicos de tipo CpG. Los ácidos nucleicos de tipo CpG también pueden ser formulados o administrados a un individuo conjuntamente con una citoquina. Las citoquinas pueden ser administradas directamente con los ácidos nucleicos de tipo CpG o pueden ser administrados en la forma de vectores de ácido nucleico que codifican la citoquina, de tal forma que la citoquina puede ser expresada in vivo. En una realización, la citoquina es administrada en la forma de un vector de expresión plasmídico.
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El término "citoquina" se utiliza como un nombre genérico para un grupo diverso de péptidos y proteínas solubles que actúan como reguladores humorales a concentraciones de nanomolar a picomolar y que, tanto en condiciones normales como patológicas, modulan las actividades funcionales de las células individuales y de los tejidos. Estas proteínas también median directamente las interacciones entre células y regulan procesos que tienen lugar en el ambiente extracelular. Ejemplos de citoquinas incluyen, pero no se limitan a, interleuquina (IL)-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, factor estimulante de colonias granulocito-macrófago (GM-CDF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interferón-\gamma (IFN-\Gamma), IFN-\alpha, factor de necrosis tumoral (TNF)-\alpha, factor transformante de crecimiento (TGF)-\beta, ligando de Flt3, y ligando de CD40. En ciertas realizaciones preferidas, la citoquina que está formulada o es administrada a un individuo conjuntamente con un ácido nucleico de tipo CpG se selecciona de entre IL-2, IL-3, IL-4, IL-18, IFN-\alpha, IFN-\gamma, TNF-\alpha, ligando de Flt3, G-CSF, y GM-CSF. En ciertas realizaciones donde el ácido nucleico de tipo CpG es administrado a un individuo en una cantidad eficaz para inducir a una citoquina como un aspecto de inducción de una respuesta inmunitaria, la citoquina inducida puede incluir a cualquiera de las siguientes: IL-1\beta, IL-2, IL-6, IL-12, IL-18, TNF-\alpha, IFN-\alpha, e IFN-\gamma.
Las citoquinas juegan un papel dirigiendo la respuesta de las células T. Las células T Helper (CD4+) orquestan la respuesta inmunitaria de mamíferos a través de la producción de factores solubles que actúan sobre otras células del sistema inmunitario, incluyendo otras células T. Muchas de las células maduras T helper CD4+ expresan uno o dos perfiles de citoquinas: Th1 o Th2. Las citoquinas Th1 característicamente incluyen IFN-\gamma, IL-12, e IL-2. El conjunto Th1 promueve la hipersensibilidad de tipo retardada, la inmunidad mediada por célula, y el intercambio de clase inmunoglobulina a IgG2_{a}. Por el contrario, el perfil de las citoquinas Th2, característicamente incluye IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. El conjunto Th2 induce la inmunidad humoral por activación de células B, promoviendo la producción de anticuerpos, e induciendo el intercambio de clase a IgG_{1} e IgE. En algunas realizaciones, se prefiere que la citoquina sea una citoquina Th1.
Los ácidos nucleicos de la invención también son útiles para redireccionar una respuesta inmunitaria desde una respuesta inmunitaria Th2 a una respuesta inmunitaria Th1. La redirección de una respuesta inmunitaria desde una respuesta inmunitaria Th2 a Th1 se puede valorar midiendo los niveles de las citoquinas producidas en respuesta al ácido nucleico (por ejemplo, induciendo a las células monocíticas y a otras células para producir citoquinas Th1, que incluyen IL-12, IFN-\gamma y GM-CSF). La redirección de la respuesta inmunitaria desde una respuesta Th2 a Th1 es particularmente útil para el tratamiento o prevención del asma. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un ácido nucleico de tipo CpG para tratar el asma, puede ser esa cantidad útil para redirigir una respuesta inmunitaria de tipo Th2, que está asociada con el asma, a una respuesta de tipo Th1. Las citoquinas Th2, especialmente IL-4 e IL-5, están elevadas en las vías respiratorias de los individuos asmáticos. Estas citoquinas promueven aspectos importantes en la respuesta inflamatoria asmática, que incluyen el intercambio del isotipo IgE, quimiotaxis eosinofílica, y activación y degranulación de células mastocíticas. Las citoquinas Th1, especialmente el IFN-\gamma E IL-12, pueden suprimir la formación de clones Th2 y la producción de citoquinas Th2.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser formulados con o administrados a un individuo con un agente anti-microbiano. Un agente anti-microbiano, se refiere a un compuesto que se da naturalmente, semi-sintético, o sintético, que es capaz de matar o inhibir microorganismos infecciosos. El tipo de agente anti-microbiano útil, de acuerdo a la invención, dependerá del tipo de microorganismo con el que el individuo está infectado o está en riesgo de ser infectado. Los agentes anti-microbianos incluyen, pero no se limitan a, agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes antifúngicos y agentes antiparasitarios.
Un tipo de agente anti-microbiano es un agente antibacteriano. Los agentes antibacterianos matan o inhiben el crecimiento o la función de las bacterias. Una gran clase de agentes antibacterianos son los antibióticos. Los antibióticos, que son eficaces para matar o inhibir una amplia gama de bacterias, se refieren a los antibióticos de amplio espectro. Otros tipos de antibióticos son predominantemente eficaces contra las bacterias de las clases Gram-positivas o Gram-negativas. Estos tipos de antibióticos se refieren a antibióticos de espectro estrecho. Otros antibióticos que son eficaces frente a un solo organismo o enfermedad y no contra otros tipos de bacterias, se refieren a antibióticos de espectro limitado.
A veces, los agentes antibacterianos son clasificados basándose en su principal modo de acción. En general, los agentes antibacterianos son inhibidores de la síntesis de la pared celular, inhibidores de la membrana celular, inhibidores de la síntesis de proteínas, inhibidores de la función o de la síntesis de ácidos nucleicos, e inhibidores competitivos. Los inhibidores de la síntesis de la pared celular inhiben el paso del proceso de síntesis de la pared celular, y, en general, la síntesis del peptidoglucano bacteriano. Los inhibidores de la síntesis de la pared celular incluyen los antibiómicos \beta-lactámicos, las penicilinas naturales, las penicilinas semi-sintéticas, la ampicilina, el ácido clavulánico, las cefalosporinas, y la bacitracina.
Los \beta-lactámicos son antibióticos que contienen un anillo miembro de \beta lactamo, que inhibe el último paso de la síntesis del peptidoglucano. Los antibióticos \beta-lactámicos pueden ser sintéticos o naturales. Los antibióticos naturales, son generalmente producidos por dos grupos de hongos, los mohos de Penicillium y Cephalosporium. Los antibióticos \beta-lactámicos producidos por Penicillium son las penicilinas naturales, como la penicilina G o la penicilina V. Éstas se producen por fermentación de Penicillium Chrysogenum. Las penicilinas naturales tienen un estrecho espectro de actividad y son generalmente eficaces contra Streptococcus, Gonococcus, y Staphylococcus. Otros tipos de penicilinas naturales, que también son eficaces contra las bacterias Gram-positivas, incluyen penicilinas F, X, K, y O.
Las penicilinas semi-sintéticas son, generalmente, modificaciones de la molécula del ácido 6-aminopenicilánico producido por un moho. El ácido 6-aminopenicilánico puede ser modificado por adición de cadenas laterales, que producen penicilinas que tienen espectros de actividad más amplios que las penicilinas naturales u otras propiedades ventajosas. Algunos tipos de penicilinas semi-sintéticas tienen amplio espectro frente las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, pero son inactivadas por penicilinasa. Las penicilinas semi-sintéticas incluyen ampicilina, azlocilina, carbenicilina, mezlocilina, oxacilina, y piperacilina. Otros tipos de penicilinas semi-sintéticas tienen actividades más estrechas frente a bacterias Gram-positivas, pero han desarrollado propiedades como que son desactivadas por penicilinasa. Éstas incluyen, por ejemplo, dicloxacilina, meticilina, y nafcilina. Algunas de las penicilinas semi-sintéticas de amplio espectro pueden ser usadas en combinación con inhibidores de la \beta-lactamasa, como los ácidos clavilánicos y el sulbactam. Los inhibidores de la \beta-lactamasa no tienen acción antimicrobiana, pero funcionan para inhibir la penicilinasa, protegiendo con ello a las penicilina semi-sintética de la degradación.
Unos de los efectos secundarios serios asociados con las penicilinas, tanto naturales como semi-sintéticas, son las alergias a penicilina. Las alergias a penicilina son muy serias y pueden causar la muerte rápidamente. En un individuo alérgico a penicilina, la molécula de \beta-lactamo atacará a una proteína del suero que inicia la respuesta inmunitaria mediada por IgE. La respuesta inmunitaria inflamatoria lleva a anafilaxis y posiblemente a la muerte.
Otro tipo de antibiótico \beta-lactámico es la cefalosporina. Las cefalosporinas son producidas por los mohos de Cephalolsporium, y tienen una forma de acción similar a la penicilina. Son sensibles a la degradación por \beta-lactamasas bacterianas, y por ello, ellas solas no siempre son eficaces. Sin embargo, las cefalosporinas son resistentes a la penicilinasa. Son eficaces frente a una variedad de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Las cefalosporinas incluyen, pero no se limitan a, Cefaclor, cefamandol, cefazolina, cefetamet, cefixima, cefoperazona, cefotaxima, cefoxitina, cefsulodina, ceftacidina, ceftriaxona, cefuroxina, cefalexina, cefalotina, cefapirina, y moxalactamo.
La Bacitracina es otro tipo de antibióticos que inhiben la síntesis de la pared celular. Estos antibióticos, producidos por las especias de Bacillus, previenen el crecimiento de la pared celular por la inhibición de la liberación de las subunidades de muropéptido o de peptidoglucano desde la molécula de la que deriva la subunidad al exterior de la membrana. Aunque la bacitracina es eficaz frente las bacterias Gram-positivas, su uso está, en general, limitado a administración tópica debido a su alta toxicidad. Puesto que se pueden usar dosis eficaces más bajas de bacitracina cuando el compuesto es administrado con los ácidos nucleicos inmunoestimuladores de la invención, este compuesto puede ser utilizado sistemáticamente y la toxicidad puede reducirse.
El carbapenem es otro antibiótico \beta-lactamo de amplio espectro, que es capaz de inhibir la síntesis de la pared celular. Ejemplos de carbapenem incluyen, pero no se limitan a, imipenem. Los monobactamos también son antibióticos \beta-lactamo de amplio espectro, e incluyen aztreonam. Un antibiótico producido por Streptomyces, vancomicina, también es eficaz frente las bacterias Gram-positivas para inhibir la síntesis de membrana celular.
Otra clase de agentes antibacterianos son los agentes antibacterianos que son inhibidores de la membrana celular. Estos compuestos desorganizan la estructura o inhiben la función de las membranas bacterianas. La alteración de la membrana citoplásmica de la bacteria tiene como resultado el escape de material celular de la célula. Los compuestos que inhiben o interfieren con la membrana celular causan la muerte de la célula debido a que la integridad de las membranas citoplásmicas y externas es vital para las bacterias. Un problema con los agentes antibacterianos que son inhibidores de la membrana celular es que pueden producir efectos en células eucarióticas así como en las bacterias, debido a la similitud de los fosfolípidos de las membranas bacterianas y eucarióticas. Por ello, estos compuestos, raramente son lo suficientemente específicos como para permitir que estos compuestos sean utilizados sistemáticamente y prevenir el uso de altas dosis para la administración local.
Un agente antibacteriano clínicamente útil que es un inhibidor de la membrana celular es Polimixina, producida por Bacillus polymyxis. Las polimixinas interfieren con la función de la membrana por unión a los fosfolípidos de la membrana. Mayormente, la polimixina es eficaz frente a bacterias Gram-negativas y se usa generalmente en infecciones severas de Pseudimonas o en infecciones de Pseudomonas que son resistentes a antibióticos menos tóxicos. También se utiliza en algunos ejemplos tópicos limitados. Su limitado uso se debe a los severos efectos secundarios asociados con la administración sistémica, como daño en el riñón y en otros órganos.
Otros inhibidores de la membrana celular incluyen Amfotericina B y Nistatina, producidas por la bacteria Streptomyces, que también son agentes antifúngicos, usados predominantemente en el tratamiento de infecciones fúngicas sistémicas y en infecciones de levadura Candida, respectivamente. Los imidazoles, producidos por la bacteria Streptomyces, son otra clase de antibióticos que son inhibidores de la membrana celular. Los imidazoles se utilizan como agentes antibacterianos así como agentes antifúngicos, por ejemplo, usados para el tratamiento de infecciones con levadura, infecciones dermatofíticas, e infecciones fúngicas sistémicas. Los imidazoles incluyen, pero no se limitan a, clotrimazol, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, y miconazol.
Muchos agentes antibacterianos son inhibidores de la síntesis de proteínas. Estos compuestos impiden que a la bacteria sintetice las proteínas estructurales y las enzimas, y por ello, causan la inhibición del crecimiento o función de la célula bacteriana o la muerte celular. En general, estos compuestos interfieren con los procesos de transcripción o traducción. Los agentes antibacterianos que bloquean la transcripción incluyen, pero no se limitan a, Rifampinas, producidas por el bacteria Streptomyces, y Etambutol, una sustancia química sintética. Las Rifampinas, que inhiben la enzima ARN polimerasa, tienen un amplio espectro o actividad y son eficaces frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, así como el Etambutol es eficaz frente a Mycobacterium tuberculosis.
Los agentes antibacterianos que bloquean la traducción, interfieren con los ribosomas bacterianos para prevenir que el ARNm sea traducido a proteínas. En general, esta clase de compuestos incluyen, pero no se limitan a, tetraciclinas, cloramfenicol, los macrólidos (por ejemplo, azitromicina, eritromicina) y los aminoglucósidos (por ejemplo, amikacina, gentamicina, kanamicina, streptomicina, tobramicina).
Algunos de estos compuestos se unen de forma reversible a la subunidad ribosomal 30S y causan una mala lectura del ARNm, por ejemplo, los aminoglucósidos. Los aminoglucósidos son una clase de antibióticos que son producidos por la bacteria Streptomyces, tales como, por ejemplo amikacina, gentamicina, kanamicina, streptomicina, y tobramicina. Los aminoglucósidos has sido utilizados frente una amplia variedad de infecciones bacterianas causadas por bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. La Streptomicina ha sido extensamente utilizada como medicamento principal en el tratamiento de tuberculosis. La Gentamicina se utiliza frente a muchas cepas de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, incluyendo infecciones con Pseudomonas, especialmente en combinación con tobramicina. La kanamicina es utilizada frente muchas bacterias Gram-positivas, incluyendo Staphylococci resistente a penicilina. Un efecto secundario de los aminoglucósidos, que ha limitado clínicamente su uso, es que a dosis que son esenciales para su eficacia,
se ha visto que su uso prolongado daña la función renal y causa daño en los nervios auditivos, llevando a la sordera.
Otro tipo de agente antibacteriano inhibidor de la traducción son las tetraciclinas. Las tetraciclinas se unen de forma reversible a la subunidad ribosomal 30S e interfieren en la unión del ARNt cargado con el ribosoma bacteriano. Las tetraciclinas son una clase de antibióticos, producidos por la bacteria Streptomyces, que son de amplio espectro y son eficaces frente a una variedad de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Ejemplos de tetraciclinas incluyen clortetraciclina, doxiciclina, monociclina, y tetraciclina. Éstas son importantes para el tratamiento de muchos tipos de bacterias, pero son particularmente importantes en el tratamiento de la enfermedad de Lyme (Borrelia burgdorferi).
Como resultado de su baja toxicidad y efectos secundarios mínimos, las tetraciclinas han sido muy utilizadas y mal usadas en la comunidad médica, generando problemas. Por ejemplo, su uso en exceso ha llevado al desarrollo de resistencias extendidas. Cuando se usan en combinación con los ácidos nucleicos inmunoestimuladores de la invención, estos problemas pueden ser minimizados y las tetraciclinas se pueden utilizar eficazmente para el amplio espectro de tratamiento de muchas bacterias.
Los agentes antibacterianos, como los macrólidos, se unen de forma reversible a la subunidad ribosomal 50S e inhiben la elongación de la proteína por la peptidil transferasa, o previenen la liberación del ARNt no cargado desde el ribosoma bacteriano, o ambos. Los macrólidos contienen muchos anillos lactona unidos a través de enlaces glucósido con amino azúcares. Estos compuestos incluyen azitromicina, claritromicina, clindamicina, eritromicina, lincomicina, oleadomicina, y roxitromicina. La eritromicina es activa frente a la mayoría de las bacterias Gram-positivas, Neisseria, Legionella y Haemophilus, pero no frente a Enter obacteriaceae. La Lincomicina y la clindamicina, que bloquean la formación del enlace peptídico durante la síntesis de proteínas, se utilizan frente a las bacterias Gram-positivas.
Otro tipo de inhibidor de la traducción es el cloramfenicol. El cloramfenicol se une al ribosoma 70S, inhibiendo a la enzima bacteriana peptidil transferasa y previniendo, con ello, el crecimiento de la cadena polipeptídica durante la síntesis de la proteína. El cloramfenicol se puede preparar a partir de Streptomyces o puede ser enteramente producido por síntesis química. Un efecto secundario serio asociado al cloramfenicol es la anemia aplásica. La anemia aplásica se desarrolla a dosis de cloramfenicol que son eficaces para tratar bacterias en pequeñas proporciones (1/50.000) de pacientes. Una vez altamente prescrito el antibiótico, el cloramfenicol rara vez se utiliza debido a muertes por anemia. Debido a su efectividad, todavía se utiliza en situaciones de amenaza de la vida (por ejemplo, fiebre tifoidea). Combinando cloramfenicol con los ácidos nucleicos inmunoestimuladores, los compuestos pueden, de nuevo, ser usados como agentes antibacterianos, ya que los agentes inmunoestimuladores permiten el uso de una dosis más baja del cloramfeicol, una dosis que no produce efectos secundarios.
Algunos agentes antibacterianos interrumpen la síntesis o función de los ácidos nucleicos, por ejemplo, la unión del ADN o ARN, de tal forma que sus mensajes no pueden ser leídos. Estos incluyen, pero no se limitan a, quinolonas y co-trimazol, ambos sustancias químicas sintéticas, y rifamucinas, una sustancia química natural o semisintética. Las quinolonas bloquean la replicación del ADN bacteriano por inhibición de la ADN girasa, la enzima necesaria por la bacteria para producir su ADN circular. Son de amplio espectro y ejemplos incluyen ciprofoxacino, enoxacino, ácido nalidíxico, norfloxacino, ofloxacino, y temafloxacino. El ácido nalidíxico es un agente antibacteriano que se une a la enzima ADN girasa (topoisomerasa), que es esencial para la replicación del ADN, y permite superespirales para ser relajada y reformada, inhibiendo la actividad de la ADN girasa. El principal uso del ácido nalidíxico es en el tratamiento de infecciones del tracto urinario inferior (UTI), debido a que es eficaz frente a varios tipos de bacterias Gram-negativas como E. coli, Enterobacter aerogenes, K. pneumoniae, y Proteus, especies que son la causa común de UTI. El co-trimazol es una combinación de sulfametoxazol y trimethoprim, que bloquea la síntesis bacteriana del ácido fólico, necesario para hacer los nucleótidos del ADN. La rifampicina es un derivado de rifamicina que es activo frente a bacterias Gram-positivas (incluyendo Mycobacterium tuberculosis y meningitis causada por Neisseria meningitidis) y algunas bacterias Gram-negativas. La rifampicina se une a la subunidad beta de la polimerasa y bloquea la adición del primer nucleótido, que es necesario para activar la polimerasa, y por ello, bloquea la síntesis de ARNm.
Otra clase de agentes antibacterianos son compuestos que funcionan como inhibidores competitivos de enzimas bacterianas. Los inhibidores competitivos son todos ellos mayormente similares estructuralmente al factor de crecimiento bacteriano y compiten para unirse, pero no llevan a cabo la función metabólica en la célula. Estos compuestos incluyen sulfonamidas y formas químicamente modificadas de sulfomanidas que incluso tienen mayor y más amplia actividad antibacteriana. Las sulfonamidas (por ejemplo, gastrisina y trimethoprim) son útiles para el tratamiento de Streptococcus pneumoniae, Streptococci beta-hemolíticos y E. coli, y han sido utilizadas en el tratamiento de UTI no complicadas causadas por E. Coli, y en el tratamiento de meningitis meningocócica.
Los agentes antivirales son compuestos que previenen la infección de células por virus o la replicación del virus dentro de la célula. Existen menos medicamentos antivirales que medicamentos antibacterianos, debido a que el proceso de la replicación viral está muy relacionado con la replicación del ADN dentro de la célula hospedadora, por lo que los agentes antivirales no específicos a veces, podrían ser tóxicos para el hospedador.
Hay varios escenarios dentro del proceso de la infección viral que pueden ser bloqueados o inhibidos por agentes antivirales. Estos escenarios incluyen acoplamiento del virus a la célula hospedadora (inmunoglobulina o péptidos de unión), desencapsulamiento del virus (por ejemplo, amantadina), síntesis o traducción del ARNm viral (por ejemplo, interferón), replicación del ARN o ADN viral (por ejemplo, análogos de nucleósidos), maduración de las nuevas proteínas virales (por ejemplo, inhibidores de proteasas), y preparación y liberación del virus.
Los análogos de nucleótidos son compuestos sintéticos que son similares a nucleótidos, pero que tiene una desoxirribosa o grupo ribosa incompleto o anormal. Una vez que los análogos de nucleótidos están en la célula, éstos se fosforilan, produciendo la forma trifosfato que compite con los nucleótidos normales por la incorporación al ADR o ARN viral. Una vez que la forma trifosfato del análogo del nucleótido está incorporado dentro de la cadena creciente del ácido nucleico, causa asociación irreversible con la polimerasa viral y con ello, la terminación de la cadena. Los nucleótidos análogos incluyen, pero no se limitan a, aciclovir (usado para el tratamiento del virus herpes simplex y el virus de la varicela zoster), ganciclovir (útil para el tratamiento del citomegalovirus), idoxuridina, ribavirina (útil para el tratamiento del virus respiratorio sincitial), dideoxiinosina, dideoxicitidina, y zidovudina (azidotimina).
Los interferones son citoquinas que son secretadas por las células infectadas por virus, así como por las células inmunes. Los interferones funcionan por unión a receptores específicos sobre las células adyacentes a las células infectadas, causando el cambio en la célula que la protege de la infección por el virus. Los interferones \alpha y \beta también inducen la expresión de moléculas MHC de clase I y II sobre la superficie de las células infectadas, dando como resultado un incremento en la presentación de antígeno para el reconocimiento de la célula inmune hospedadora. Los interferones \alpha y \beta están disponibles como formas recombinantes y han sido utilizados para el tratamiento de infección crónica de hepatitis B y C. A dosis que son eficaces para terapia entiviral, los interferones tienen severos efectos secundarios, como fiebre, malestar y pérdida de peso.
La terapia con inmunoglobulinas es utilizada para la prevención de infección viral. La terapia con inmunoglobulinas para infecciones virales es distinta de la terapia con inmunoglobulinas para infecciones bacterianas, porque, más que ser antígeno específica, la terapia con inmunoglobulinas funciona por unión a viriones extracelulares y los previene de ser atacados y de entrar a las células que son susceptibles a la infección viral. La terapia es útil para la prevención de infección viral durante el periodo de tiempo que el anticuerpo es presentado en el hospedador. En general, hay dos tipos de terapias con inmunoglobulinas, terapia inmune normal con globulina y terapia con globulina hiper-inmune. La terapia inmune normal con globulina utiliza un producto de anticuerpo que se prepara a partir de suero de donantes de sangre normales y que es agrupado. Este producto agrupado contiene títulos bajos de anticuerpo de una amplia gama de virus humanos, como hepatitis A, parvovirus, enterovirus (especialmente en neonatos). La terapia hiper-inmune globulina utiliza anticuerpos que están preparados a partir de suero de individuos que tienen altos títulos de un anticuerpo de un virus en particular. Estos anticuerpos son usados frente a un virus específico. Ejemplos de globulinas hiper-inmunes incluyen globulinas inmune zoster (útiles para la prevención de varicela en niños y neonatos inmunocomprometidos), inmunoglobulina de la rabia humana (útil en la profilaxis post-exposición de un individuo mordido por un animal rabioso), globulina inmune de hepatitis B (útil para la prevención del virus de la hepatitis B, especialmente en un individuo expuesto al virus), y globulina inmune RSV (útil en el tratamiento de infecciones del virus respiratorio sincitial).
Otro tipo de terapia con inmunoglobulinas es la inmunización pasiva. Ésta implica la administración de anticuerpos o fragmentos de proteínas de la superficie viral. Dos tipos de vacunas que están disponibles para inmunización pasiva para la hepatitis B incluyen anticuerpos de la hepatitis B derivados de suero y anticuerpos de la hepatitis B recombinantes. Ambas están preparadas a partir de antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Los anticuerpos son administrados en tres dosis a individuos con alto riesgo de infección con el virus de la hepatitis B, como trabajadores de centros de salud, parejas sexuales de portadores crónicos, y niños.
Los agentes antifúngicos son útiles para el tratamiento y prevención de hongos infecciosos. Los agentes infecciosos, a veces son clasificados por su mecanismo de acción. Algunos agentes infecciosos funcionan como inhibidores de la pared celular inhibiendo la glucosa sintasa. Estos incluyen, pero no se limitan a, basiungina/ECB. Otros agentes antifúngicos funcionan desestabilizando la integridad de la membrana. Estos incluyen, pero no se limitan a, imidazoles, como clotrimazol, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol, sertaconzole, y voriconazol, así como FK 463, amfotericina B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicina, UK 292, butenafme, y terbinafme. Otros agentes antifúngicos funcionan rompiendo la quitina (por ejemplo, quitinasa) o por inmunosupresión (crema 501). Algunos ejemplos de agentes antifúngicos disponibles comercialmente se muestran en la Tabla 1.
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TABLA 1 Agentes Antifúngicos
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Ejemplos de agentes antiparasitarios, también llamados parasiticidas, útiles para la administración humana, incluyen, pero no se limitan a, albendazol, amfotericina B, benznidazol, bitionol, cloroquinae HC1, cloroquina fosfato, clindamicina, deshidroemetina, dietilcarbamazina, diloxanide furoate, doxycycline, eflornithine, furazolidaone, glucocorticoids, halofantrine, iodoquinol, ivermectina, mebendazol, mefloquina, meglumina antimoniato, melarsoprol, metrifonato, metronidazol, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, paromomicina, pentamidina isethionato, piperazina, praziquantel, primaquina fosfato, proguanil, pyrantel pamoato, pirimetamina-sulfadoxino, pirimetamina-sulfonamidas, quinacrina HC1, quinina sulfato, quinidina gluconato, spiramicina, stibogluconata sódicio (antimonio gluconato sódico), suramina, tetraciclina, tiabendazol, tinidazol, trimetroprim-sulfametoxazol, y triparsamida, algunos de los cuales se usan solos o en combinación con otros.
Los parasiticidas utilizados en individuos no humanos incluyen albendazol, amprolium; decoquinato, benzimidazoles como fenbendazol, clorsulon, diclorvos, dietilcarbamazina, doramectic, epsiprantel, febantel, fenbendazol, higromicina B, tiacetarsemida sódica, iprinomectina, ivermectinaa, lasalocid, levamisol, melarsomina, metronidazol, milbemicin oxima, monensin sulfadimetoxina, moxidectina, N-butil cloruro, oxfendazol, oxibendazol, piperazina, praziquantel, pirantel pamoato, pirantel tartrato, sulfametazina, sulfaquinoxalina, tiabendazol, y tolueno. Los parasiticidas itulizadosen caballos incluyen mebendazol, oxfendazol, febantel, pirantel, diclorvos, triclorfon, ivermectina, piperazina; para S. westeri: ivermectina, benzimidazoles como tiabendazol, cambendazol, oxibendazol y fenbendazol. Parasiticidas útiles en perros incluyen milbemicina oxina, ivermectina, pirantel pamoato y la combinación de ivermectina y pirantel. El tratamiento de parásitos en credos puede incluir el uso de levamisol, piperazina, pirantel, tiabendazol, diclorvos y fenbendazol. En ovejas y cabras, los agentes antihelmínticos incluyen levamisol o ivermectina. El caparsolato ha mostrado cierta eficacia en el tratamiento de D. immitis (gusano del corazón) en gatos.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG también pueden ser formulados con o administrados a un individuo conjuntamente con una terapia anti-alérgica o anti asmática. En ciertas realizaciones, un medicamento para asma/alergia es un medicamento seleccionado del grupo que consiste en inhibidor de fosfodiesterasa (PDE)-4, Broncodilatador/beta-2 agonista, abridor del canal de K+, antagonista VLA-4, antagonista de Neurokina, inhibidor de la síntesis TXA2, Xantanina, antagonista del ácido Araquidónico, inhibidor de la 5 lipoxygenasa, antagonista del receptor de la Tromboxina A2, antagonista del Tromboxano A2, inhibidor de la proteína de activación 5-lipox, e inhibidor de la Proteasa, pero no tan limitado. En algunas realizaciones importantes, el medicamento para asma/alergia en un Broncodilatador/beta-2 agonista seleccionado del grupo que consiste en salmeterol, salbutamol, terbutaline, D2522/formoterol, fenoterol, y orciprenalina.
En otra realización, el medicamento para asma/alergia es un medicamento seleccionado del grupo que consiste en Anti-histaminas e inductores de Prostaglandinas. En una realización, la anti-histamina está seleccionada del grupo que consiste en astemizol, azelastina, betatastina, buclizina, cetirizina, análogos de cetirizina, CS 560, desloratadina, ebastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, levocabastina, loratidina, mizolastina, norastemizol, terfenadina, y tranilast. En otra realización, el inductor de Prostaglandina es S-5751.
Todavía, en otra realización, el medicamento para asma/alergia es seleccionado del grupo que consiste en Esteroides e Inmunomoduladores. Los inmunomoduladores pueden ser seleccionados del grupo que consiste en agentes anti-inflamatorios, antagonistas del leucotrieno, IL-4 muteínas, receptores solubles de IL-4, Inmunosupresores, anticuerpos anti-IL-4, antagonistas anti-IL-4, anticuerpos anti-IL-5, proteínas de fusión Fc del receptor soluble EL-13, anticuerpos anti-IL-9, antagonistas de CCR3, antagonistas de CCR5, inhibidores de VLA-4, y downreguladores de IgE, pero no tan limitado. En una realización, en donwregulador de IgE es un anti-IgE.
En otra realización, el esteroide se selecciona del grupo que consiste en beclometasona, budesonida, fluticasona, metilprednisolona, prednisona, y triamcinolona. Además, en una realización más alejada, el inmunosupresor es una vacuna del péptido Tolerizing.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG también pueden ser formulados con o administrados a un individuo conjuntamente con una terapia anti-cancerosa. Las terapias anti-cancerosas incluyen medicamentos para el cáncer, radiación y procedimientos quirúrgicos. Tal como se utiliza aquí, un "medicamento para el cáncer" se refiere a un agente farmacéutico que es administrado a un individuo con el propósito de tratar el cáncer. Tal como se utiliza aquí, "tratar el cáncer" incluye prevenir el desarrollo del cáncer, reducir los síntomas del cáncer, y/o inhibir el crecimiento de un cáncer establecido. En otros aspectos, el medicamento para el cáncer es administrado a un individuo con riesgo de desarrollar un cáncer, con el propósito de reducir el riesgo de desarrollar cáncer. Aquí se describen varios tipos de medicamentos para tratar el cáncer. Para el propósito de esta especificación, los medicamentos para el cáncer están clasificados como agentes quimioterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos, agentes radioterapéuticos, vacunas contra el cáncer, terapia hormonal, y modificadores de la respuesta biológica.
Además, los métodos de la invención pretenden abarcar el uso de más de un medicamento para el cáncer junto con los ácidos nucleicos de tipo CpG. Como ejemplo, cuando sea apropiado, los ácidos nucleicos de tipo CpG pueden ser administrados con ambos agentes, tanto quimioterapéuticos como inmunoterapéuticos. De forma alternativa, el medicamento para el cáncer puede abarcar un agente inmunoterapéutico y una vacuna contra el cáncer, o un agente quimioterapéutico y una vacuna contra el cáncer, o un agente quimioterapéutico, un agente inmunoterapéutico y una vacuna contra el cáncer, todos administrados a un individuo como el propósito de tratar al individuo que tiene cáncer o con riesgo de desarrollar cáncer.
Los medicamentos para el cáncer funcionan de formas variadas. Algunos medicamentos contra el cáncer trabajan focalizando mecanismos fisiológicos que son específicos de las células tumorales. Ejemplos incluyen, marcando como diana, genes específicos (y sus productos génicos, es decir, principalmente proteínas) que están mutados en el cáncer. Dichos genes incluyen, pero no se limitan a, oncogenes (por ejemplo, Ras, Her2, blc-2), genes supresores de tumores (por ejemplo, EGF, p53, Kb), y dianas del ciclo celular (por ejemplo, CDK4, p21, telomerasa). Los medicamentos para el cáncer, alternativamente, marcan como dianas las rutas de transducción de señales y los mecanismos moleculares que están alterados en las células cancerosas. La focalización de las células cancerosas, vía los epítopos expresados en su superficie celular, se logra a través del uso de anticuerpos monoclonales y derivados y análogos de anticuerpos monoclonales. Este último tipo de medicamentos para el cáncer, generalmente se refieren aquí como una forma de inmunoterapia. Las inmunoterapias también incluyen citoquinas como IFN-\alpha, IL-2, e
IL-12.
Otros medicamentos para el cáncer, marcan como diana células diferentes de las células cancerosas. Por ejemplo, algunos medicamentos preparan al sistema inmunitario para atacar células tumorales (es decir, vacunas contra el cáncer). Además otros medicamentos, llamados inhibidores de la angiogénesis, funcionan atacando el suministro sanguíneo de tumores sólidos. Debido a que los cánceres malignos son capaces de metastatizar (es decir, salen del el tumor principal y se asienta en tejido no adyacente, formando así un tumor secundario), los medicamentos que impiden esta metástasis también son útiles en el tratamiento del cáncer. Los mediadores angiogénicos incluyen factor de crecimiento de fibroblastos básico (b-FGF), factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF), angiopoyetinas, angiostatina, endostatina, factor de necrosis tumoral (TNF)-\alpha, TNP-470, trombospondina-1, factor 4 de plaquetas, carboxiamido-triazol (CAI), y ciertos miembros de las familia de las proteínas integrinas. Una categoría de este tipo de medicamento es un inhibidor de metaloproteasas, que inhibe la enzima utilizada por el cáncer para salir del tumor principal y extravasarse a otro tejido.
Algunas células cancerosas son antigénicas, con lo que pueden ser diana del sistema inmunitario. En un aspecto, la administración combinada de los ácidos nucleicos de tipo CpG y los medicamentos para el cáncer, particularmente aquellos que son clasificados como inmunoterapia contra el cáncer, es útil para estimular una respuesta inmunitaria específica contra un antígeno canceroso.
La teoría de la vigilancia inmune es que, una función principal del sistema inmunitario es la de detectar y eliminar células neoplásicas antes de que se forme el tumor. Un principio básico de esta teoría es que las células cancerosas son antigénicamente diferentes de las células normales y por ello, provocan reacciones inmunes similares a aquellas causadas por rechazo de aloinjertos (no propios) inmunológicamente incompatibles. Estudios han conformado que las células tumorales difieren, tanto cualitativamente como cuantitativamente, en su expresión de antígenos. Por ejemplo, los "antígenos específicos de tumor" son antígenos específicamente asociados a células tumorales, pero no a células normales. Ejemplos de antígenos específicos de tumor son antígenos virales en tumores inducidos por virus de ADN o ARN, así como neo-antígenos que surgen del empalme anormal de los genes. Los antígenos "asociados a tumor" están presentes tanto en células tumorales como en células normales, pero están presentes en diferente cantidad o en una forma diferente en células tumorales. Ejemplos de dichos antígenos son los antígenos oncofetales (por ejemplo, antígeno carcinoembriónico), antígenos de diferenciación (por ejemplo, antígenos T y Tn), y productos oncogénicos (por ejemplo, HER/neu).
Han sido identificados diferentes tipos de células que pueden matar dianas tumorales in vitro e in vivo: células asesinas naturales (células NK), linfocitos T citolíticos (CLTs), células asesinas activadas por linfoquinas (LAKs), y macrófagos activados. Las células NK pueden matar células tumorales sin tener que haber sido previamente sensibilizadas con antígenos específicos, y la actividad no requiere de la presencia de antígenos de clase I codificados por al complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de las células diana. Se piensa que las células NK participan en el control de tumores nacientes y en el control del crecimiento metastático. A diferencia de las células NK, los CTLs pueden matar células tumorales sólo tras haber sido sensibilizadas con los antígenos del tumor y cuando el antígeno diana está expresado en la célula tumoral, que también expresa MHC de clase I. Se piensa que los CTLs son células efectoras en el rechazo de tumores transplantados y de tumores causados por virus de ADN. Las células de LAK son un subconjunto de linfocitos nulos distintos de las poblaciones NK y CTL. Los macrófagos activados pueden matar células tumorales de una manera que no es ni antígeno dependiente ni restringido a MHC, una vez activados. Se piensa que los macrófagos activados disminuyen el índice de crecimiento de los tumores que infiltran. Ensayos in vivo han identificado otros mecanismos inmunes como los dependientes de anticuerpo, reacciones citotóxicas mediadas por célula (ADCC) y lisis por anticuerpos mas complemento. Sin embargo, se piensa que estos mecanismos inmunes efectores son menos importantes que la función de NK, CTLs, LAK y macrófagos in vivo (para su revisión, ver Piessens, W.F., and David, J., "Tumor Immunology", In: Scientific American Medicine, Vol. 2, Scientific American Books, N.Y., pp. 1-13, 1996).
La meta de la inmunoterapia es aumentar la respuesta inmunitaria del paciente hacia un tumor establecido. Un método de inmunoterapia incluye el uso de adyuvantes. Las sustancias adyuvantes derivadas de microorganismos, como Bacillus Calmette-Guerin (BCG), aumentan la respuesta inmunitaria y potencian la resistencia a tumores en animales.
Los agentes inmunoterapéuticos son medicamentos que derivan de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente o reconocen un antígeno canceroso. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo deriva de un anticuerpo monoclonal que es específico para una célula tumoral o un antígeno de célula tumoral. Los anticuerpos monoclonales son bien conocidos en el estado de la técnica, y son una variedad de moléculas derivadas de anticuerpos monoclonales, que incluyen anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados, y bien específicos, fragmentos Fab, fragmentos (Fab')2, fragmentos Fv, moléculas de cadena lateral de Fv, etc. Tal como se describe arriba, un antígeno canceroso, tal como se utiliza aquí, está ampliamente definido como un antígeno expresado por una célula cancerosa. Preferiblemente, el antígeno está expresado en la superficie celular de la célula cancerosa. Más preferiblemente, el antígeno es uno que no está expresado en células normales, o al menos, no expresado al mismo nivel que en las células cancerosas. Las inmunoterapias basadas en anticuerpos pueden funcionar por unión a la superficie celular de una célula cancerosa y, con ello, estimular el sistema inmune endógeno para que ataque a la célula cancerosa. Otra forma de funcionar de la terapia basada en anticuerpos es como un sistema de administración para el marcaje específico de sustancias tóxicas en las células cancerosas. En este aspecto, normalmente, los anticuerpos se conjugan con toxinas como la ricina (por ejemplo, de semillas de ricino), caliqueamicina y maitansinoides, a isótopos radiactivos como Yodo-131 (^{131}I) e Itrio-90 (^{90}Y), a agentes quimioterapéuticos (tal como aquí se describen), o a modificadores de la respuesta biológica. De esta manera, las sustancias tóxicas pueden estar concentradas en la región del cáncer y se puede minimizar la toxicidad no específica en células normales. Además del uso de anticuerpos que son específicos para los antígenos cancerosos, los anticuerpos que se unen al sistema vascular, como aquellos que se unen a las células endoteliales, también son útiles en la invención. Esto se debe a que los tumores sólidos son generalmente dependientes de la formación de nuevos vasos sanguíneos para su supervivencia, y por tanto, muchos de los tumores son capaces de reclutar y estimular el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Como resultado, una estrategia de muchos de los medicamentos contra el cáncer es la de atacar los vasos sanguíneos que alimentan a un tumor y/o a los tejidos conectivos (o estroma) que soportan dichos vasos
sanguíneos.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG en conjunción con agentes inmunoterapéuticos como anticuerpos monoclonales, son capaces de aumentar la supervivencia a largo plazo a través de un número de mecanismos que incluyen potenciación significativa de ADCC (tal como se discutió arriba), activación de células NK, y un incremento en los niveles de IFN-\alpha. Se cree que IFN-\alpha induce la activación de las células NK. Los ácidos nucleicos, cuando se usan en combinación con anticuerpos monoclonales, sirven para reducir la dosis del anticuerpo requerido para alcanzar un resultado biológico.
Ejemplos de inmunoterapias contra el cáncer, que actualmente están siendo utilizadas, se desarrollan en la
Tabla 2.
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TABLA 2 Inmunoterapias contra el cáncer en desarrollo o en el mercado
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Las vacunas contra el cáncer son medicamentos que pretenden estimular una respuesta inmunitaria endógena frente a células cancerosas. Las actuales vacunas producidas, predominantemente activan el sistema inmunitario humoral (es decir, la respuesta inmunitaria dependiente de anticuerpo). Otras vacunas, actualmente en desarrollo, están enfocadas en la activación del sistema inmunitario mediado por célula, incluyendo los linfocitos T citotóxicos, que son capaces de matar células tumorales. Las vacunas contra el cáncer, generalmente potencian la presentación de antígenos cancerosos tanto a APCs (por ejemplo, macrófagos y células dendríticas) y/o a otras células inmunes como células T, células B y células NK.
Aunque las vacunas contra el cáncer pueden ser de varias formas, como se ha discutido arriba, su propósito es el de mostrar a APCs las antígenos cancerosos y/o los antígenos asociados a cáncer, con el fin de facilitar el procesamiento endógeno de dichos antígenos por las APCs y la presentación final del antígeno sobre la superficie celular en el contexto de las moléculas MHC de clase I. Una forma de vacuna contra el cáncer es una vacuna de célula completa, que es una preparación de células cancerosas que han sido quitadas de un individuo, se han tratado ex vivo y después, se han reintroducido como células totales en el individuo. También se pueden utilizar lisados de células tumorales como vacuna contra el cáncer para obtener una respuesta inmunitaria. Otra forma de vacuna contra el cáncer es una vacuna peptídica que utiliza proteínas pequeñas específicas de cáncer o asociadas a cáncer para activar las células T. Las proteínas asociadas a cáncer son proteínas que no se expresan exclusivamente en células cancerosas (es decir, otras células normales pueden todavía expresar estos antígenos). Sin embargo, la expresión de antígenos asociados a cáncer está, generalmente y consistentemente, upregulada con cánceres de un tipo en particular.
Todavía otra forma de vacuna contra el cáncer es la vacuna de célula dendrítica, que incluye células dendríticas completas, que han sido expuestas a un antígeno canceroso o a un antígeno asociado a cáncer in vitro. Los lisados o fracciones de membrana de células dendríticas también pueden ser utilizadas como vacunas contra el cáncer. Las vacunas de célula dendrítica son capaces de activar directamente los APCs. Otras vacunas contra el cáncer incluyen vacunas de gangliósido, vacunas de proteínas de shock térmico, vacunas víricas y bacterianas, y vacunas de ácido nucleico.
El uso de los ácidos nucleicos de tipo CpG conjuntamente con vacunas contra el cáncer, proporcionan una respuesta inmunitaria humoral específica de antígeno y mediada por célula mejorada, además de activar a las células NK y a las células dendríticas endogénicas, e incrementar los niveles de IFN-\alpha. Esta potenciación permite usar una vacuna con una dosis reducida de antígeno para alcanzar el mismo efecto beneficioso que se alcanzaría utilizando dosis sin el ácido nucleico de tipo CpG. En algunos ejemplos, las vacunas contra el cáncer pueden ser utilizadas junto con adyuvantes, como los arriba descritos.
Otras vacunas toman la forma de células dendríticas que han sido expuestas a antígenos cancerosos in vitro, han sido procesadas y son capaces de expresar los antígenos cancerosos en su superficie celular en el contexto de las moléculas MHC, para la presentación eficaz del antígeno a otras células del sistema inmunitario.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG se utilizan, en un aspecto de la invención, conjuntamente con vacunas contra el cáncer, que están basadas en células dendríticas. Una célula dendrítica es una célula presentadora de antígeno profesional. Las células dendríticas forman una unión entre el sistema inmunitario innato y el adquirido, presentando antígenos y a través de su expresión de un patrón de receptores de reconocimiento que detectan moléculas microbianas como lipopolisacárido (LPS) en su ambiente local. De una forma eficaz, las células dendríticas internalizan, procesan, y presentan antígenos específicos solubles que son expuestos. El proceso de internalización y presentación del antígeno causa una rápida upregulación de la expresión del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y de moléculas coestimuladoras, la producción de citoquinas, y la migración hacia órganos linfáticos, donde se cree que están implicados en la activación de células T.
La Tabla 3 muestra una variedad de vacunas contra el cáncer que están siendo usadas actualmente o están en desarrollo.
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TABLA 3 Vacunas contra el cáncer en desarrollo o en el mercado
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Tal como se utiliza aquí, los agentes quimioterapéuticos (y, equivalentemente, los agentes de quimioterapia) abarcan todas las formas de medicamentos contra el cáncer que no entran dentro de las categorías de agentes inmunoterapéuticos o vacunas contra el cáncer. Los agentes quimioterapéuticos, tal como se utilizan aquí, abarcan tanto agentes químicos como biológicos. Estos agentes funcionan inhibiendo la actividad celular en el que la célula cancerosa en dependiente para que continúe sobreviviendo. Las categorías de los agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes/alcaloides, antimetabolitos, hormonas o análogos de hormonas, y una miscelánea de medicamentos antineoplásicos. Muchos, si no todos, de estos agentes son directamente tóxicos para las células cancerosas y no requieren de estimulación inmune. La combinación de quimioterapia y la administración de ácido nucleico inmunoestimulador aumenta la dosis máxima tolerable para quimioterapia.
Un "individuo que sufre o está en riesgo de sufrir quimioterapia" es un individuo bajo tratamiento activo con un agente quimioterápico o un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar un indicio para tratamiento con agente quimioterápico. Un individuo que sufre quimioterapia incluye a un individuo que actualmente recibe o recientemente recibe una dosis o curso de quimioterapia. Dicho individuo puede tener o estar en riesgo de desarrollar una inmunodeficiencia. Un individuo con riesgo de sufrir quimioterapia incluye a un individuo que está a punto de recibir una primera o subsiguientes dosis o rondas de quimioterapia. Dicho individuo puede tener una inmunodeficiencia o, más comúnmente, está en riesgo de desarrollar una inmunodeficiencia.
Una inmunodeficiencia puede implicar un número reducido o una capacidad reducida a generar células inmunes totalmente funcionales de, al menos, una clase, por ejemplo, células T CD4+, células B, células NK, monocitos, macrófagos. Un individuo que tiene una inmunodeficiencia es un individuo con capacidad reducida para tener una respuesta inmunitaria eficaz. Dichos individuos pueden tener, por ejemplo, un sistema inmunitario que es inmaduro; un sistema inmunitario que está suprimido en asociación con exposición a ciertos agentes farmacológicos o irradiación; o un sistema inmunitario que está suprimido en asociación con un defecto cromosómico, un defecto hereditario o innato o deficiencia enzimática, una deficiencia de anticuerpo, un defecto en la habilidad de las células T para procesar y/o presentar el antígeno, una deficiencia nutricional, una infección que afecta directamente a las células del sistema inmunitario (por ejemplo, HIV), o un neoplasma. Éstos y otros ejemplos de condiciones que causan que un individuo está inmunodeprimido, se pueden encontrar en Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th Ed., Fauci AS y cols., eds., McGraw-Hill, New York, 1998.
Por ello, otros tipos de agentes quimioterapéuticos que pueden ser utilizados de acuerdo con la invención incluyen Aminoglutetimida, Amsacrina (m-AMSA), Asparaginasa, Azacitidina, Busulfan, Carboplatina, Clorambucil, Cisplatino, Ciclofosfamida, Citarabina HC1, Dactinomicina, Daunorubicina HC1, Eritropoyetina, Estramustin fosfatosódico, Etopósido (VP16-213), Floxuridina, Fluorouracilo (5-FU), Flutamida, Hexametilmelamina (HMM), Hidroxiurea (hidroxicarbamida), Ifosfamida, Leuprolida acetata (análogo del factor de liberación LHRH), Lomustina (CCNU), Mecloretamina HC1 (mostaza de nitrógeno), Mercaptopurina, Mesna, Mitoguazona (metil-GAG; metil glioxal bis-guanilhidrazona; MGBG), Mitotano (o,p'-DDD), Mitoxantrona HC1, Octreotida, Paclitaxel, Pentostatina (2'deoxicoformicina), Plicamicina, Procarbazina HC1, Semustina (metil-CCNU), Streptozotocina, Tamoxifen citrato, Teniposida (VM-26), Tioguanina, Tiotepa, Vinblastina sulfato, y Vindesina sulfato.
Los agentes quimioterapéuticos que actualmente están en desarrollo o en uso clínico se muestran en la Tabla 4.
TABLA 4 Medicamentos en desarrollo o en el mercado para el Cáncer
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En una realización, los métodos de la invención utilizan ácidos nucleicos de tipo CpG como reemplazo en el uso de terapia TNF-\alpha en el tratamiento del cáncer. En otras realizaciones, los métodos de la invención utilizan ácidos nucleicos de tipo CpG como un suplemento para el uso de una terapia de TNF-\alpha en el tratamiento del cáncer. Actualmente, algunos protocolos de tratamiento requieren el uso de TNF-\alpha. Desde que el TNF-\alpha es producido tras la administración de algunos ácidos nucleicos inmunoestimuladores, estos ácidos nucleicos pueden ser usados para generar TNF-\alpha de forma endógena.
En ciertas realizaciones, la invención también proporciona métodos para tratar a un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar anemia, trombocitopenia, o neutropenia. Los métodos implican administrar a un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar anemia, trombocitopenia, o neutropenia, un ácido nucleico de tipo CpG en una cantidad eficaz para potenciar la eritropoyesis, trombopoyesis, o proliferación de neutrófilos, respectivamente. En otras palabras, de acuerdo a estos métodos, la administración del ácido nucleico de tipo CpG al individuo, promueve la generación de nuevos eritrocitos (células rojas de la sangre), plaquetas, o neutrófilos, respectiva-
mente.
La anemia es deficiencia de células rojas sanguíneas circulantes (eritrocitos). Un "individuo en riesgo de desarrollar anemia", tal como se utiliza aquí, es un individuo que tiene cualquier riesgo de exposición a un agente asociado a la supresión de formación de eritrocitos o sus progenitores, riesgo de pérdida de eritrocitos, asociada a cirugía o daño, o riesgo de desarrollar anemia por algún otro mecanismo que implica disminución de la producción, destrucción acelerada, y/o secuestro de eritrocitos, por ejemplo, destrucción autoinmune de eritrocitos, talasemia, e insuficiencia renal. Un "individuo que tiene anemia" es un individuo que tiene un número reducido de eritrocitos
circulantes.
La trombocitopenia es una deficiencia de plaquetas circulantes. Un "individuo en riesgo de desarrollar trombocitopenia", tal como se utiliza aquí, es un individuo que tiene cualquier riesgo de exposición a un agente asociado a la supresión de formación de plaquetas o sus progenitores, riesgo de pérdida de plaquetas, asociada a cirugía o daño, o riesgo de desarrollar trombocitopenia por algún otro mecanismo que implica disminución de la producción, destrucción acelerada, y/o secuestro de plaquetas, por ejemplo, destrucción autoinmune de plaquetas. Un "individuo que tiene trombocitopenia" es un individuo que tiene un número reducido de plaquetas circulantes.
La neutropenia es una deficiencia en neutrófilos circulantes. Un "individuo en riesgo de desarrollar neutropenia", tal como se utiliza aquí, es un individuo que tiene cualquier riesgo de exposición a un agente asociado a la supresión de formación de neutrófilos (también conocidos como granulocitos, leucocitos polimorfonucleares, PMNs) o sus progenitores, riesgo de pérdida de neutrófilos, asociada con infección y congestión periférica o destrucción periférica tras exposición a drogas que sirven como haptenos inmunes (por ejemplo, \alpha-metil-dopa), o riesgo de desarrollar neutropenia por algún otro mecanismo que implica disminución de la producción, destrucción acelerada, y/o secuestro de neutrófilos, por ejemplo, destrucción autoinmune de neutrófilos. Un "individuo que tiene neutropenia" es un individuo que tiene un número reducido de neutrófilos circulantes.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG son útiles, de acuerdo a estas realizaciones de la invención, como profilaxis para el tratamiento de un individuo en riesgo de desarrollar anemia, trombocitopenia, o neutropenia. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de tipo CpG pueden ser administrados a un individuo cuando se anticipa que el individuo estará expuesto a condiciones asociadas con el desarrollo de anemia, trombocitopenia, o neutropenia. De forma alternativa, los ácidos nucleicos de tipo CpG pueden ser administrados a un individuo cuando se sabe o sospecha que el individuo tiene predisposición a desarrollar anemia, trombocitopenia, o neutropenia.
Además del uso de los ácidos nucleicos de tipo CpG y el medicamento para la anemia, trombocitopenia, o neutropenia para el tratamiento profiláctico, la invención también abarca el uso de la combinación de medicamentos para el tratamiento de un individuo que tiene anemia, trombocitopenia, o neutropenia.
La anemia, trombocitopenia, y neutropenia se definen frecuentemente en términos de medidas de laboratorio, indicando un hematocrito reducido (porcentaje de volumen), un contaje de plaquetas reducido (por mm^{3}), y contaje de neutrófilos reducido (por mm^{3}), respectivamente. Los métodos para determinar estos valores son bien conocidos en el estado de la técnica, incluyendo tanto los métodos automatizados como los manuales. Los límites más bajos de contaje para hematocrito y plaquetas en humanos sanos no preñados son, de alguna forma, variables, dependiendo de la edad y sexo del individuo, el método de determinación, y las normas para el laboratorio que realiza las medidas. Generalmente, sin embargo, un individuo humano adulto se dice que tiene anemia cuando el hematocrito es menos de alrededor del 37-40%. Del mismo modo, generalmente, un individuo humano adulto se dice que tiene trombocitopenia cuando el contaje plaquetario está por debajo de alrededor de 100.000 por mm^{3}. También, la anemia frecuentemente se mide en términos de hemoglobina reducida (g/dL) o contaje de célula roja de la sangre (por mm^{3}). Los límites típicos más bajos de valores normales para estos humanos adultos sanos son 12-13 g/dL y alrededor de 4.1x10^{6} por mm^{3}, respectivamente. Los valores correspondientes para todos estos parámetros pueden diferir, pero son fácilmente asociables para otras especies.
La anemia, trombocitopenia, y neutropenia están también frecuentemente asociadas con signos clínicos y síntomas en relación a su grado de severidad. La anemia manifestada tal vez como palidez, fatiga generalizada debilidad, reducida tolerancia al ejercicio, acortamiento de la respiración con esfuerzo, ritmo rápido del corazón, ritmo irregular del corazón, dolor de pecho (angina), fallo congestivo del corazón, y dolor de cabeza. La trombocitopenia, generalmente se manifiesta en términos de sangrado espontáneo o incontrolado, petequias, y facilidad para los moratones. La neutropenia está asociada con infecciones, que incluyen infecciones notables de la flora microbiana endógena, y falta de inflamación.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG también pueden ser formulados con o administrados a un individuo conjuntamente con un medicamento para la anemia. Un "medicamento para anemia", tal como se utiliza aquí, es una composición, de manera que reduce los síntomas relacionados con anemia, previene el desarrollo de anemia, o trata la anemia existente. En ciertas realizaciones, el medicamento para la anemia se selecciona del grupo que consiste en eritropoyetina recombinante (EPO), factor estimulante recombinante de colonias macrófago-granulocito (GM-CSF), factor estimulante recombinante de colonias de granulocito (G-CSF), IL-11 recombinante, ión feroso, ión férrico, vitamina B12, vitamina B6, vitamina C, vitamina D, calcitriol, alfacalcidol, folato, andrógeno, y carnitina. En una realización preferida, el medicamento para la anemia es EPO recombinante. Los medicamentos para la anemia comúnmente utilizados que están actualmente en el mercado o en desarrollo, incluyen EPO humana recombinante (EPOGEN; PROCRIT), preparaciones de hierro (ferroso y férrico, CROMAGEN; FEOSOL; INFED; IROSPAN; NEFRO-FER; NEFRO-VITE; NTFEREX; NU-IRON; SLOW FE), vitamina B12, vitamina B6, ácido fólico (CROMAGEN; FERRO-FOLICO; NEFRO-FER; NIFEREX), ácido ascórbico, ciertos metabolitos de vitamina D (calcitriol y alfacalcidol; CALCIJEX; ROCALTROL), andrógenos,esteroides anabólicos (ANADROL), carnitina, IL-11 recombinante (NEUMEGA), y G-CSF (NEUPOGEN). En una realización preferida, el medicamento para la anemia es EPO
recombinante.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG también pueden ser formulados con o administrados a un individuo conjuntamente con un medicamento para la trombocitopenia. Un "medicamento para trombocitopenia", tal como se utiliza aquí, es una composición, de manera que reduce los síntomas relacionados con la trombocitopenia, previene el desarrollo de la trombocitopenia, o trata la trombocitopenia existente. En ciertas realizaciones, el medicamento para la trombocitopenia se selecciona del grupo que consiste en glucocorticoide, trombopoyetina recombinante (TPO), factor recombinante de crecimiento y desarrollo de megacariocito (MGDF), MDGF recombinante pegilada, lisofilina, IL-11 recombinante, IL-3 recombinante, IL-6 recombinante, eIL-6 recombinante. En una realización preferida, el medicamento para la anemia es TPO recombinante. Los medicamentos en el uso común o desarrollo para el tratamiento de la trombocitopenia incluyen glucocorticoides (prednisolona; prednisona; metilprednisolona; SOLUMEDROL), TPO recombinante, MGDF recombinante, MGDF recombinante pegilada, lisofilina, IL-1 recombinante, IL-3 recombinant, IL-6 recombinant, IL-11 recombinant (NEUMEGA), y G-CSF recombinant (NEUPOGEN). En una realización preferida, el medicamento para la trombocitopenia es TPO recombinante.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG también pueden ser formulados con o administrados a un individuo conjuntamente con un medicamento para la neutropenia. Un "medicamento para neutropenia", tal como se utiliza aquí, es una composición, de manera que reduce los síntomas relacionados con la neutropenia, previene el desarrollo de la neutropenia, o trata la neutropenia existente. En ciertas realizaciones, el medicamento para la tombocitopenia se selecciona del grupo que consiste en glucocorticoide, G-CSF recombinante, GM-CSF recombinante, factor estimulante recombinante de colonias de macrófagos (M-CSF), IL-1 recombinante, IL-3 recombinante, IL-6 recombinante, immunoglobulina, andrógenos, EFN-\gamma\betarecombinante, pequeños miméticos de la molécula G-CSF, antagonista del receptor de G-CSF, antagonistas del receptor de IL-3, y uteroferrina. En una realización preferida, el medicamento para la neutropenia es G-CSF recombinante. Los medicamentos comúnmente utilizados que están actualmente en el mercado o en desarrollo para el tratamiento de la neutropenia, incluyen glucocorticoides (prednisolona; prednisona; metilprednisolona; SOLUMEDROL), G-CSFrecombinante (NEUPOGEN), GM-CSF recombinante (LEUKINE), M-CSF recombinante, IL-1 recombinante, t IL-3 recombinante, IL-6 recombinante, immunoglobulina G (SANDOGLOBULIN, IVEEGAM, GAMMAR-P, GAMIMUNE N, GAMMAGARD S/D), andrógenos, IFN-\gamma recombinante (ACTIMMUNE), miméticos pequeños de la molécula G-CSF, antagonista del receptor de G-CSF, antagonistas del receptor de IL-3, y uteroferrina. En una realización preferida, el medicamento para la neutropenia es G-CSF recombinante. Los antibióticos son administrados frecuentemente en asociación con medicamentos para la neutropenia para tratar o reducir el riesgo de infección.
Los medicamentos para la anemia, trombocitopenia, o neutropenia útiles en combinación con los ácidos nucleicos de tipo CpG incluyen esteroides, inductores de esteroides, e inmunomoduladores. Los esteroides incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides administrados sistemáticamente, incluyendo metilprednisolona, prednisolona y prednisona, cortisona, e hidrocortisona. Los inductores de esteroides incluyen, pero no se limitan a, hormona adrenocorticotropa (ACTH).
Los corticosteroides inhiben la producción de citoquinas, la activación de adhesión celular, y la activación y migración de células inflamatorias. Los efectos secundarios asociados a los corticosteroides sistémicos incluyen, por ejemplo, anormalidades reversibles en el metabolismo de la glucosa, incremento del apetito, retención de líquidos, ganancia de peso, alteración del humor, hipertensión, úlcera péptica, y necrosis ascéptica de hueso. Algunos de los efector secundarios asociados al uso a largo plazo incluyen supresión del eje adrenal, supresión del crecimiento, disminución dérmica, hipertensión, diabetes mellitus, síndrome de Gushing, cataratas, debilidad muscular, y en casos raros, daño en la función inmune. Es recomendable que este tipo de compuestos sean usados a sus dosis eficaces más bajas.
La invención también incluye, todavía en otros aspectos, métodos para inducir activación inmune innata del antígeno no específica y un amplio espectro de resistencia a desafíos infecciosos, utilizando los ácidos nucleicos de tipo CpG. El término "activación inmune innata del antígeno no específica", tal como se utiliza aquí, se refiere a la activación de células inmunes diferentes de las células B y, por ejemplo, puede incluir la activación de células NK, células T u otras células inmunes que puedan responder de una manera antígeno independiente o alguna combinación de estas células. Un amplio espectro de resistencia a un desafío infeccioso se induce debido a que las células inmunes están en una forma activa y están preparadas para responder a cualquier componente invasor o microorganismo. Las células no tienen que estar específicamente preparadas frente a un antígeno en particular. Esto es particularmente útil en guerras biológicas, y otras circunstancias arriba descritas como en los viajeros.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG son eficaces en vertebrados no roedores. Diferentes ácidos nucleicos de tipo CpG pueden causar una óptima estimulación inmune, dependiendo del tipo de individuo y de la secuencia del ácido nucleico de tipo CpG. Se ha encontrado que muchos vertebrados, de acuerdo a la invención, que son sensibles a la misma clase de ácidos nucleicos de tipo CpG, a veces referidos como ácidos nucleicos de tipo CpG específicos de humano. Sin embargo, los roedores responden a diferentes ácidos nucleicos. Por ello, el ácido nucleico de tipo CpG que causa la estimulación óptima en humanos, generalmente no tiene por qué causar estimulación óptima en un ratón, y viceversa. Un ácido nucleico de tipo CpG que causa estimulación óptima en humanos, sin embargo, normalmente causa estimulación óptima en otros animales como vacas, caballos, ovejas, etc. Una persona experta en la técnica puede identificar las secuencias óptimas de ácidos nucleicos útiles para especies de interés en particular, utilizando ensayos de rutina aquí descritos y/o conocidos en el estado de la técnica, utilizando los consejos aquí
suministrados.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG pueden ser administrados directamente al individuo o pueden ser administrados conjuntamente con un complejo de suministro de ácido nucleico. Un "complejo de suministro de ácido nucleico" significaría una molécula de ácido nucleico asociada (por ejemplo, unida de forma iónica o covalente; o encapsulada) a medios diana (por ejemplo, una molécula que resulta en una mayor afinidad de unión a la célula diana (por ejemplo, superficies de célula B y/o aumento en la adsorción celular por las células diana)). Ejemplos de complejos de suministro de ácido nucleico incluyen ácidos nucleicos asociados a un esterol (por ejemplo, colesterol), un lípido (por ejemplo, lípido catiónico, virosoma o liposoma), o un agente de unión específico de la célula diana (por ejemplo, un ligando reconocido por un receptor específico de la célula diana). Los complejos preferidos pueden ser suficientemente estables in vivo para prevenir el desacoplamiento significativo previo a la internalización por la célula diana. Sin embargo, el complejo puede ser partido bajo condiciones apropiadas dentro de la célula, de tal forma que se libera el ácido nucleico de una forma funcional. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de tipo CpG puede estar conjugado con un antígeno a través de un enlace covalente.
Han sido descritos los vehículos de suministro o mecanismos de suministro para suministrar el antígeno y los ácidos nucleicos a las superficies. El ácido nucleico de tipo CpG y/o el antígeno y/u otros terapéuticos pueden ser administrados solos (por ejemplo, en salino o soluciones amortiguadoras) o utilizando cualquier vehículo de suministro conocido en el estado de la técnica. Por ejemplo, han sido descritos los siguientes vehículos de suministro: Cocleatos (Gould-Fogerite y cols., 1994, 1996); Emulsomas (Vancott y cols., 1998, Lowell y cols., 1997); ISCOMs (Mowat y cols., 1993, Carlsson y cols., 1991, Hu y cols., 1998, Morein y cols., 1999); Liposomas (Childers y cols., 1999, Michalek y cols., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); vectores bacterianos vivos (e.g., Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte-guerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone y cols., 1996, Pouwels y cols., 1998, Chatfield y cols., 1993, Stover y cols., 1991, Nugent y cols., 1998); vectores virales vivos (e.g., Vaccinia, adenovirus, Herpes Simplex) (Gallichan y cols., 1993,1995, Moss y cols., 1996, Nugent y cols., 1998, Flexner y cols., 1988, Morrow y cols., 1999); Microesferas (Gupta y cols., 1998, Jones y cols., 1996, Maloy y cols., 1994, Moore y cols., 1995, O'Hagan y cols., 1994, Eldridge y cols., 1989); vacunas de ácido nucleico (Fynan y cols., 1993, Kuklin y cols., 1997, Sasaki et al, 1998, Okada y cols., 1997, Ishii y cols., 1997); Polímeros (e.g., carboxymethylcellulose, chitosan) (Hamajima y cols., 1998, Jabbal-Gill y cols., 1998); anillos de polímeros (Wyatt y cols., 1998); Proteosomas (Vancott y cols., 1998, Lowell y cols., 1988, 1996,1997); Sodium Fluoride (Hashi y cols., 1998); plantas transgénicas (Tacket et al, 1998, Mason y cols., 1998, Haq y cols., 1995); Virosomas (Gluck y cols., 1992, Mengiardi y cols., 1995, Cryz et al, 1998); partículas de tipo viral (Jiang y cols., 1999, Leibl y cols., 1998). Otros vehículos de suministro son conocidos en el estado de la técnica y se proporcionan algunos ejemplos adicionales en la discusión de
vectores.
El lenguaje "cantidad eficaz" de una molécula de ácido nucleico se refiere a la cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico. Por ejemplo, una cantidad eficaz de ácido nucleico que contiene al menos un ácido nucleico de tipo CpG para tratar una deficiencia del sistema inmunitario podría ser aquella cantidad necesaria para eliminar un tumor, cáncer, o infección bacteriana, viral o fúngica, o parasitaria. Una cantidad eficaz para uso como una vacuna adyuvante podría ser aquella cantidad útil para estimular la respuesta inmunitaria del individuo con la vacuna. Una cantidad eficaz para tratar el asma puede ser aquella cantidad útil para redireccionar una respuesta inmunitaria de tipo Th2, que está asociada con el asma, a una respuesta de tipo Th1. La cantidad eficaz para cualquier aplicación en particular puede variar dependiendo de dichos factores como la enfermedad o condiciones a tratar, el ácido nucleico en particular que está siendo administrado (por ejemplo, el número de motivos CpG no metilados o su localización en el ácido nucleico), el tamaño del individuo, o la severidad de la enfermedad o condición. Una persona experta en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de un oligonucleótido en particular sin necesidad de excesiva experimentación. Para cualquier compuesto aquí descrito, una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser determinada inicialmente a partir de modelos animales in vivo o in vitro por comparación con oligonucleótidos conocidos para producir una respuesta inmunitaria.
La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" significa aquella cantidad de un compuesto que previene el comienzo de, alivia los síntomas de, o para la progresión de un trastorno o enfermedad que está siendo tratada.
La dosis de los compuestos aquí descritos para suministro mucosal o local está en la escala típica de alrededor de 0,1\mug a 10 \mug por administración que, dependiendo de la aplicación, puede ser dada diariamente, semanalmente, o mensualmente y cualquier otra cantidad de tiempo entre medias. Más típicamente, las dosis mucosales o locales están en la escala desde alrededor de 10 \mug a 5 mg por administración, y más típicamente, desde alrededor de 100 \mug a 1 mg, con 2-4 administraciones espaciadas entre días o semanas. Más típicamente, la escala de dosis estimulante inmune es desde 1 \mug a 10 mg por administración, y más típicamente10 \mug a 1 mg con administraciones diarias o semanales. Las dosis de los compuestos aquí descritos, para suministro parenteral con el propósito de inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno, donde los compuestos son suministrados con un antígeno pero no otro agente terapéutico, son típicamente de 5 a 10.000 veces superior que la dosis mucosal eficaz para vacuna adyuvante o aplicaciones inmuno estimulantes, y más típicamente de 10 a 1.000 veces superior, y más típicamente de 20 a 100 veces superior. Las dosis de los compuestos aquí descritos para suministro parenteral con el propósito de inducir una respuesta inmune innata o para incrementar ADCC o para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno cuando son administrados los ácidos nucleicos de tipo CpG en combinación con otros agentes terapéuticos o en vehículos de suministro especializados está en la escala típica de alrededor de 0,1 \mug a 10 mg por administración, dependiendo de si la aplicación es dada diariamente, semanalmente, o mensualmente y cualquier otra cantidad de tiempo entre medias. Más típicamente, las dosis parenterales para estos propósitos están en la escala desde alrededor de 10 \mug a 5 mg por administración, y más típicamente, desde alrededor de 100 \mug a 1 mg, con 2-4 administraciones espaciadas entre días o semanas. En algunas realizaciones, sin embargo, las dosis parenterales para estos propósitos pueden ser utilizadas en una escala de 5 a 10.000 veces superior a las típicas dosis arriba
descritas.
Para cualquier compuesto aquí descrito, la cantidad terapéuticamente eficaz puede ser determinada inicialmente a partir de modelos animales. Una dosis terapéuticamente eficaz también puede ser determinada a partir de datos humanos para oligonucleótidos CpG que han sido probados en humanos (se han iniciado ensayos clínicos en humanos) y para otros compuestos que se conocen exhiben similares actividades farmacológicas, como otros adyuvantes mucosales, por ejemplo, toxina lábil (LT) y otros antígenos para propósitos de vacunación, para la administración mucosal o local. Las dosis superiores son requeridas para administración parenteral. La dosis aplicada puede ser ajustada basándose en la biodisponibilidad relativa y de la potencia del compuesto administrado. El ajuste de la dosis para alcanzar la eficacia máxima, basada en los métodos arriba descritos y otros métodos debido a que son bien conocidos en el estado de la técnica, es conocido dentro de las capacidades de la persona experta en la materia.
Las formulaciones de la invención son administradas en soluciones farmacéuticamente aceptables, que rutinariamente podrían contener concentraciones de sales farmacéuticamente aceptables, agentes amortiguadores, conservantes, vehículos compatibles, adyuvantes, y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos.
Para su uso en terapia, la cantidad eficaz del ácido nucleico de tipo CpG puede ser administrada a un individuo por cualquier modo que suministre el ácido nucleico a la superficie deseada, por ejemplo, mucosal, sistémica. La administración de la composición farmacéutica de la presente invención puede lograrse por cualquier medio conocido por la persona experta en la materia.
Las rutas de administración preferidas incluyen, pero no se limitan a, enteral (oral o cualquier ruta que implique absorción a partir del tracto intestinal), parenteral (intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intratecal, inyección directa) mucosal (que incluye oral, nasal, rectal, vaginal, transdérmica, bucal, sublingual, pulmonar, ocular) y tópica.
Para la administración oral, los compuestos (es decir, los ácidos nucleicos de tipo CpG, antígenos y otros agentes terapéuticos) pueden ser formulados fácilmente combinando el/los compuesto(s) activo(s) con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en el estado de la técnica. Dichos vehículos permiten a los compuestos de la invención se formulados como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensión, suspensiones y similares, para ingestión oral por un individuo a tratar. La preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden ser obtenidas como excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, tras añadir auxiliares apropiados, si se desea, para obtener píldoras o núcleos de grageas. Los excipientes apropiados son, en particular, agregantes como azúcares, que incluyen lactosa, sucrosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papata, gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes desintegrantes, como polivinil pirrolidona entrecruzada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo como alginato sódico. De forma opcional, las formulaciones orales también pueden ser formuladas en salinos o soluciones amortiguadoras para neutralizar las condiciones ácidas internas o pueden ser administradas sin ningún tipo de vehículo.
Los núcleos de grageas se proporcionan con capas adecuadas. Para este propósito, deben utilizarse soluciones concentradas de azúcares, que opcionalmente pueden contener goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes orgánicos apropiados o mezclas de solventes. Los productos colorantes o pigmentos pueden ser añadidos a los comprimidos o cubiertas de las grageas para su identificación o caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse oralmente incluyen cápsulas flexibles hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, como glicerol o sorbitol. Las cápsulas flexibles pueden contener el ingrediente activo mezclado con rellenadores como lactosa, agregantes como almidones, y/o lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden ser disueltos o suspendidos en líquidos apropiados, como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos, además, se pueden añadir estabilizantes. La microesferas formuladas para administración oral también pueden ser usadas. Dichas microesferas están bien definidas en el estado de la técnica. Todas las formulaciones para administración oral puede ser de dosis apropiadas para dicha administración.
Para administración bucal, las composiciones podrían tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de una forma convencional.
Para administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo a la presente invención, pueden se suministrados convenientemente en la forma de una presentación de aerosol en spray a partir de paquetes presurizados o nebulizadores, con el uso de un propulsor apropiado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas apropiado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad dosis puede ser determinada añadiendo una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador, pueden ser formulados para que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo apropiada como lactosa o almidón.
Los compuestos, cuando se desee que se suministren sistemáticamente, pueden ser formulados para administración parenteral por inyección, por ejemplo por bolo de inyección o infusión contínua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas o en contenedores multi-dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar dichas formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación como agentes suspensores, estabilizantes y/o dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden ser preparadas como suspensiones de inyección oleica apropiadas. Los solventes lipofílicos o vehículos apropiados incluyen aceites grasos como aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos, como etil oleato o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, como carboximetil celulosa sódica, sorbitol, o dextrano. De forma opcional, la suspensión también puede contener estabilizadores apropiados o agentes que incrementen la solubilidad de los componentes, para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
De forma alternativa, los compuestos activos pueden estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo apropiado, por ejemplo, agua esteril libre de pirógenos, antes de su uso.
Los compuestos también pueden ser formulados en composiciones rectales y vaginales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo,que contengan bases supositorias convencionales como crema de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones previamente descritas, los compuestos también pueden ser formulados como preparación depósito. Dichas formulaciones de función prolongada pueden ser formuladas con materiales poliméricos o hidrofóbicos apropiados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de cambio iónico, o como derivados solubles de poca cantidad, por ejemplo, una sal soluble de poca cantidad.
Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender vehículos o excipientes de gase sólida o gel apropiados. Ejemplos de dichos vehículos o excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbonato cálcico, fosfato cálcico, varios azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros como polietilen glicoles.
Las formas de preparaciones parmacéuticas líquidas o sólidas apropiadas son, por ejemplo, soluciones acuosas o salinas para inhalación, microencapsuladas, encocleadas, cubiertas de partículas microscópicas de oro, contenidas en liposomas, nebulizadas, pelets para implantación dentro de la piel, o secadas dentro de un objeto para ser rascadas en la piel. Las composiciones farmacéuticas también incluyen gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos cubiertos, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, colirios o preparaciones con liberación prolongada de compuestos activos, en cuya preparación los excipientes y aditivos y/o auxiliares como desintegrantes, agregantes, agentes de recubrimiento, agentes de hinchamiento, lubricantes, condimentos, edulcorantes o solubilizantes, se usan como se describe arriba. Las composiciones farmacéuticas son apropiadas para su uso en una variedad de sistemas de suministro de drogas. Para un breve repaso de métodos de suministro de drogas, ver Langer R (1990) Science 249:1527-1533.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG y los antígenos pueden ser administrados per se (ordenado) o en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales, cuando se usan en medicina, pueden ser farmacéuticamente aceptables, pero se pueden usar de forma conveniente las sales no farmacéuticamente aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Dichas sales incluyen, pero no se limitan a, aquellas preparadas a partir de los siguiente ácidos: acético, benceno sulfónico, cítrico, fórmico, hidrobrómico, hidroclórico, maleico, malónico, metano sulfónico, naftalen-2-sulfónico, nítrico, fosfórico, p-toluen sulfónico, salicílico, succínico, sulfúrico, y tartárico. También, dichas sales pueden ser preparadas como sales de metal alcalino o tierras alcalinas, como sales de sodio, potasio o calcio del grupo del ácido carboxílico.
Los agentes de amortiguación apropiados incluyen: ácido acético y una sal (1-2% w/v), ácido cítrico y una sal (1-3% w/v), ácido bórico y una sal (0.5-2.5% w/v), y ácido fosfórico y una sal (0.8-2% w/v). Los conservantes apropiados incluyen Cloruro de benzalconio (0.003-0.03% w/v), clorobutanol (0.3-0.9% w/v), parabenos (0.01-0.25% w/v) y timerosal (0.004-0.02% w/v).
Las composiciones farmacéuticas de la invención contienen una cantidad eficaz de un ácido nucleico de tipo CpG y opcionalmente, antígenos y/u otros agentes terapéuticos opcionalmente incluidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa uno o más agregantes sólidos o líquidos, diluyentes o sustancias encapsulantes que son apropiadas para la administración a un humano u otro animal vertebrado. El término "vehículo" denota un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que el ingrediente activo se combina para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de ser combinados con los compuestos de la presente invención, y entre ellos, de una manera tal que no hay interacción que pudiera perjudicar de forma sustancial la eficacia farmacéutica deseada.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG útiles en la invención pueden ser suministrados en mezclas con adyuvante(s) adicional(es), otros terapéuticos, o antígeno(s). Una mezcla puede constar de varios adyuvantes además del ácido nucleico de tipo CpG o varios antígenos u otros terapéuticos.
Los ácidos nucleicos de tipo CpG útiles en la invención pueden ser formulados en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria junto con al menos un adyuvante adicional, otro agente terapéutico, o antígeno. Ejemplos de adyuvantes o antígenos se proporcionan arriba. Con respecto a otros agentes terapéuticos que pueden ser formulados con los ácidos nucleicos de tipo CpG, estos incluyen por ejemplo, un medicamento anticanceroso, agente antiviral, agente antibacteriano, agente antifúngico, agente antiparasitario, medicamento para úlcera, medicamento para alergia, medicamento para asma, medicamento para anemia, medicamento para trombocitopenia, medicamento para neutropenia, o una citoquina. Ejemplos de cada uno de estos otros agentes terapéuticos se proporcionan aquí. Las citoquinas preferidas en este contexto incluyen IL-2, IL-3, IL-4, IL-18, IFN-\alpha, IFN-\gamma, TNF-\alpha, ligando de Flt3, G-CSF, y GM-CSF. Los medicamentos para úlcera son agentes útiles en el tratamiento de úlceras gastrointestinales. Los medicamentos para úlcera incluyen antácidos, agentes anticolinérgicos, agentes citoprotectivos, agentes cubrientes/adherentes para úlcera, antagonistas del receptor de histamina H2, prostaglandinas, e inhibidores de la bomba de protones. Ejemplos no limitantes de medicamentos específicos para úlcera incluyen MAALOX, MYLANTA, ROBINUL, CYTOTEC, CARAFATE, AXED, FAMOTIDINA, PEPCID, TAGAMENT, ZANTAC, PRILOSEC, PROTONIX, y PREVACID.
Hay una variedad de rutas de administración disponibles. El modo particular seleccionado dependerá, por supuesto, de los adyuvantes en particular o del antígeno seleccionado, la condición que está siendo tratada en particular y la dosis requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos de esta invención, generalmente hablando, pueden practicarse utilizando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, queriendo decir, cualquier modo que produzca niveles eficaces de una respuesta inmunitaria sin causar efectos adversos clínicamente no aceptables. Los modos de administración preferidos se discuten abajo.
Las composiciones pueden ser convenientemente presentadas en forma de dosis unitarias y pueden ser preparadas por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Los métodos pueden incluir el paso de poner los compuestos en asociación con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones son preparadas por asociación uniforme e íntima de los compuestos con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y luego, si es necesario, dar forma al producto. Las unidades de dosis líquida son viales o ampollas. Las unidades de dosis sólida son comprimidos, cápsulas, pastillas, troches, polvos, y supositorios. Para el tratamiento de un paciente, dependiendo de la actividad del compuesto, forma de administración, propósito de la inmunización (es decir, profilaxis o terapéutica), naturaleza o severidad del trastorno, edad y peso corporal del paciente, serán necesarias diferentes dosis. La administración de una dosis dada puede llevarse a cabo tanto en una sola administración en forma de una dosis individual como en varias dosis únicas pequeñas. La administración múltiple de dosis a intervalos específicos de semanas o meses es normal para estimular las respuestas específicas de antígeno.
Otros sistemas de suministro pueden incluir liberación en el tiempo, liberación retardada o sistemas de suministro de liberación sostenida. Dichos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de los compuestos, aumentando la conveniencia del individuo y del médico. Hay muchos tipos de sistemas de liberación disponibles y son conocidos por expertos en la técnica. Éstos incluyen sistemas basados en polímeros como poli(láctido-glucólido), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutírico, y polianhidridas. Las microcápsulas de los polímeros precedentes que contienen medicamentos, se describen en, por ejemplo, la Patente de EE.UU 5,075,109. Los sistemas de suministro también incluyen sistemas no poliméricos que son: lípidos que incluyen esteroles como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras como mono-, di-, y tri-glicéridos; sistemas de liberación en hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; cubiertas de cera; comprimidos que utilizan agregantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fusionados; y similares. Ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas de erosión en los que el agente de la invención está contenido en una forma dentro de una matriz, como aquellas descritas en las Patentes de EE.UU Nº 4,452,775,4,675,189, y 5,736,152, y (b) sistemas de difusión en los que un compuesto activo se impregna en un índice controlado desde el polímero, como se describe en Patentes de EE.UU Nº 3,854,480, 5,133,974 y5,407,686. Además, pueden ser usados los sistemas de suministro de objetos duros basados en bombas, algunos de los cuales, están adaptados para su
implantación.
La presente invención se ilustra por los siguientes Ejemplos, que no pretenden limitar el alcance de la invención.
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Ejemplos Materiales y Métodos
Oligonucleótidos. Los ODN fosforotioato modificados(PS ODN) se compraron a Hybridon Speciality Products (Milford, MA, USA) y a ARK Scientific GmbH (Darmstadt, Germany). Las secuencias utilizadas fueron (todas se muestran en dirección 5' a 3' de izquierda a derecha):
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En los ODN metilados 2117, 1812, 5107, 5154, y 5155, z = 5-metilcitidina. Los ODN 5246-5248 son estructuras fosforotioato del ODN que incorpora una modificación 2'-metoxi en el azúcar de la desoxirribosa sólo en los residuos de citosina (2'-meoxi C; 2'-OMe-C). En ODN 5280 - 5285, d=dSpacer. En ODN 5249, 5250, 5251, 5331, y 5387, i = inosina. En ODN 5389, m=2,6-diaminopurina. En ODN 5384, u=uracilo. En ODN 5290, w=nebularina. En ODN 5279 y 5388, 2=2-aminopurina. En ODN 5286, 7=7-deaza-guanosina. Abajo, se presentan algunos de estos ODN en forma de tabla para destacar las relaciones entre el ODN de referencia y el modificado (Tabla 5).
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Previamente, se ha demostrado que las modificaciones 2'-metoxi en el azúcar de la desoxirribosa disminuyen la inmunoestimulación, pero potencian el efecto inmunoestimulador de los ODN con modificaciones en lugares específicos 2'. Henry S y cols. (2000) J Pharmacol Exp Ther 292:468-79; Zhao Q y cols.(1999) BioorgMed Chem Lett 9:3453-8; Zhao Q y cols.(2000) BioorgMed Chem Lett 10:1051-4. La estimulación immune se vió marcadamente reducida con oligonucleótidos que contenían las modificaciones 2'-metoxietoxi, de tal forma que la administración, a ratones, de estos oligonucleótidos modificados no producía esplenomegalia, incluso a dosis de 59 mg/kg. Henry S y cols. (2000) J Pharmacol Exp Ther 292:468-79. La sustitución de desoxinucleósidos en la región flanqueante de los oligodesoxinucleósidos fosforotioato que contienen CpG con 2'-O-metilribonucleósidos resultó en una disminución o incremento significativo en sus actividades inmunoestimuladoras. Zhao Q y cols. (1999) BioorgMed Chem Lett 9:3453-8. La actividad inmunoestimuladora del oligo-PS que contiene un motivo CpG puede estar modulada por sustitución de un solo desoxinucleósido en sitios específicos tanto con 2'-O-metil ribonucleósido como con 3'-O-metil ribonucleósido en la región flanqueante del motivo CpG. Zhao Q y cols. (2000) BioorgMed Chem Lett 10:1051-4.
Los ODN se probaron para el contenido en endotoxina (LPS) utilizando el ensayo de lisado de Limulus amoebocyte (LAL) o el ensayo cinético de LAL (BioWhittaker, Belgium; límite de detección más bajo 0,1 unidades de endotoxina (EU)/ml o 0.005EU/ml, respectivamente) o un método recientemente publicado por Hartmann y cols.Hartmann G y cols.(1999) Gene Therapy 6:893-903. Para todos los ensayos, los ODN se diluyeron en solución amortiguadora TE y se guardaron a -20ºC. Todas las diluciones se condujeron usando reactivos libres de pirógenos.
Preparación de células y cultivo celular. PMBC humanas se aislaron de sangre periférica de voluntarios sanos, se obtuvieron por German Red Cross (Ratingen, Germany), por centrifugación en placa de densidad-Ficoll (Histopaque-1077, Sigma, Germany) como se describe. Hartmann G y cols.(1999) Gene Therapy 6:893-903. Las células se suspendieron en medio de cultivo RPMI1640 suplementado con 10% (v/v) de suero fetal de crías inactivado por calor (FCS, Sigma), 1.5 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina y 100 \mug/ml estreptomicina (todo de Life Technologies, Germany). Todos los compuestos se compraron y analizaron con endotoxinas. Para ensayos de activación de célula B, célula NK y monocitos, las PBMC se cultivaron en medio completo a una concentración de of 2x10^{6} células/ml en 200 \mul de volumen en placas de 96 pocillos en un incubador humidificado a 37ºC. Los diferentes DONs (ver arriba), LPS (Sigma), IL-2, o IL-12 (R&D Systems, USA) se utilizaron como estímulo. A los punto de tiempo indicados, las células se recolectaron por citometría de flujo.
Citometría de flujo. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) usados para teñir los antígenos de superficie fueron específicos de: CD3, CD14, CD19, CD25, CD40, CD54, CD56, CD69, CD80 y CD86 (todos obtenidos de Pharmingen/Becton Dickinson, Germany). Para los monocitos, se bloquearon los receptores Fc utilizando IgG humana (Myltenyi, Germany). Como se describe previamente. Bauer M y cols. (1999) Immunology 97:699-705. Los datos de la citometría de flujo de, al menos, 1000 células de una subpoblación específica (células B, monocitos, células NK, células NKT o células T) se adquirieron en FACSCalibur (Becton Dickinson) cell sorter. Los datos se analizaron utilizando el programa CellQuest (Becton Dickinson).
Ensayo de proliferación celular. Las células B CD19 positivas proliferantes se identificaron por disminución del contenido en diester carboxifluorescein diacetato succinimidilo (CFSE), utilizando citometría de flujo de acuerdo a un protocolo recientemente publicado. Hartmann G et al. (2000) J Immunol 164:944-53.
ELISA. Excepto cuando se diga lo contrario, PBMC (3-5x10^{6} células/ml) se cultivaron con las concentraciones especificadas del ODN o LPS durante 24 h (IL-6, TNF-\alpha, IFN-\gamma, e IL-10) o 8h (IL-1\beta) en placas de 48 pocillos en atmósfera humidificada a 37ºC. Se recogieron los sobrenadantes y se midieron las citoquinas utilizando kits de ELISA OPTeia (Pharmigen) para IL-6, TNF-\alpha, y IFN-\gamma o un ensayo de ELISA Eli-pair (Hoezel, Germany) para IL-1b e IL-10, de acuerdo a los protocolos del fabricante.
Ensayo TLR9.Las células utilizadas para este ensayo eran transfectantes estables (293 HEK, células de riñón de embrión humano) que expresan el receptor TLR9 humano y que contienen un cassette genómico NF\kappaB-luciferasa. Las células se incubaron con ODNs a 1.0 \mug/ml, 6.0 \mug/ml y 12.0 \mug/ml por 16h. Cada dato se obtuvo por triplicado. Se lisaron las células y se analizaron para la actividad luciferasa (LucLite-system, Packard). Los índices de estimulación se calcularon en referencia a la actividad luciferasa del medio sin adición de ODN. La actividad de los ODNs se da como % de actividad de la actividad medida con ODN 2006, que fue fijado a 100%. La actividad de todos los ODNs probados se calculó como el valor medio de todos los experimentos y todas las concentra-
ciones.
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Ejemplo 1
Respuesta de células B humanas a oligonucleótidos CpG metilados
Un primer grupo de experimentos examinaron diferentes ODN, metilados y no metilados, para su efecto estimulador sobre las células B humanas. PBMC de varios donantes de sangre voluntarios machos o hembras sanos se incubaron durante 48 horas en presencia de 0,4 \mug/ml, 1,0 \mug/ml ó 5,0 \mug/ml de los siguientes ODN; 2006 y su homólogo metilado 2117; 1758 (ODN antisentido G3139, Genta) y su homólogo metilado 1812; 2186 (DSP30, Liang H y cols. (1996) J Clin Invest 98: 1119-29) y su homólogo metilado 5107. Los controles negativos se incubaron de forma similar durante 48h en ausencia del ODN añadido. Luego, las PBMC se tiñeron con mAb para CD19 (marcador de célula B) y CD86 (marcador de activación de célula B, B7-2), y la expresión de CD86 socre células B CD19+ humanas se midió por citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Fig. 1.
La Fig. 1 muestra que, con excepción del ODN 1812, todos los ODN metilados exhiben un potencial de estimulación de célula B casi al mismo grado que las correspondientes secuencias no metiladas. El ODN 2006 a todas las concentraciones, inducían una fuerte activación de células B similar, en contraste con su forma metilada ODN 2117, que mostró un aumento de estimulación dependiente de concentración desde 0,4 \mug/ml a 5 \mug/ml. En algunos experimentos, el ODN 2117 sólo fue marginalmente muy poco estimulador en comparación con 2006. Se obtuvieron resultados equivalentes para el ODN 2186 con el ODN 5107 metilado que tiene potencial estimulador. Solo el ODN 1812 no inducía la activación de célula B a estas concentraciones. En otro grupo de experimentos, sólo se detectó un aumento de expresión de CD86 por ODN 1812 a muy altas concentraciones de ODN (es decir, 50 \mug/ml y más altas), aunque el grado de estimulación nunca alcanzó al observado con el ODN 1758.
Este inesperado alto grado de estimulación de célula B humana, inducida por oligonucleótidos CpG metilados, se investigó más a fondo y se confirmó en estudios de otras dos secuencias metiladas, los oligonucleótidos estimuladores antisentido 5114 (13312, Formivirsen, ISIS) (metilado: 5154) y 5116 (2302 ISIS) (metilado:5155).
Como se muestra en la Fig. 2, ambos ODN antisentido 5114 y 5116 exhibían significativa capacidad estimuladora sobre las células B humanas, aunque varía entre diferentes experimentos, además, las correspondientes formas metiladas 5154 y 5155 también inducen estimulación, aunque a un menor nivel que 5114 y 5116. Estos resultados estaban en acuerdo con los resultados obtenidos en la Fig. 1 y demostraban que los ODN inmunoestimuladores metilados, en efecto se comparan con las secuencias no metiladas en su capacidad para inducir la activación de las células B humanas.
Para excluir la posibilidad de que los resultados observados se debían a errores durante las preparaciones o por modificaciones incompletas de los ODNs no metilados, se probaron varios ODNs (2117) obtenidos del mismo o de diferente fabricante para probar su actividad sobre PBMC humanas. Los resultados de estos estudios demostraron claramente que todas las preparaciones tenían actividad comparable en células B humanas.
Este efecto tampoco podía ser atribuído a contaminación de los ODN con endotoxinas bacterianas tal como se mostró en las células B que sólo eran pobres respondedoras a LPS.
Se realizaron más experimentos para determinar si estos ODN metilados sólo eran capaces de potenciar la expresión de otras moléculas sobre la superficie de células B. De forma análoga a los experimentos descritos, PBMC de hombres o mujeres voluntarios sanos donantes de sangre se incubaron durante 48h en presencia de 0,4 \mug/ml, 1,0 \mug/ml ó 10,0 \mug/ml de los siguientes ODN: 2006; su homólogo metilado 2117; y 2137, el homólogo GcP de 2006. Los controles negativos se incubaron de forma similar durante 48 horas en ausencia de OND añadido. Tras 48horas de incubación, PBMC se tiñeron con mAb para CD19 (marcador de célula B) y CD80 (marcador de activación de célula B, B7-1), CD25 (IL-2Ra), o CD54 (molécula de adhesión ICAM-1). La expresión de CD25, CD54, y C80 sobre las células B CD19+ se midió por citometría de flujo. Los resultados para CD80 y CD25 se muestran en la Fig. 3.
La Fig. 3 demuestra que los oligonucleótidos metilados, además de potenciar la expresión del marcador de activación CD86, inducían la expresión de otros marcadores como CD80 y CD25 sobre la superficie de las células B. Estos experimentos también demostraban que los oligonucleótidos metilados inducían la expresión de CD54 sobre la superficie de las células B humanas. En contraste, el ODN GpC 2137 era menos estimulador que ambos ODN 2006 y ODN 2117, consistente con un rango de orden de potencia de activación de 2006>2117>2137 (GpC no metilado>CpG metilado>GpC).
En los ensayos de poliferación de célula B, ODN 2117 (2006 metilado) y ODN 5107 (2186 metilado) además se mostraba que inducen la proliferación de células B humanas comparable con los resultados mostrados arriba.
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Ejemplo 2
Respuesta de monolitos humanos a oligonucleótidos CpG metilados
Los complejos efectos del CpG ADN no sólo se deben a su activación de células B de sangre periférica. Recientemente se demostró que estos ODN también inducen la secrección de una amplia variedad de citoquinas, por interacción con otras células, por ejemplo, monolitos, macrófagos, y células dendríticas. Krieg AM (1999) Biochim Biophys Acta 1489:107-16; Kranzer K y cols. (2000) Immunology 99:170-8; Hartmann G y cols. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:9305-10; Hartmann G y cols. (1999) Gene Therapy 6:893-903. Con el fin de investigar el papel de los ODN metilados en la mediación de la activación de monocitos humanos, PBMC (2xl0^{6} células/ml) de varios donantes de sangre se incubaron durante 24h con 6 \mug/ml de ODN 2006, ODN 2117 (2006 metilado), ODN 2137 (GpC 2006), o 1 \mug/ml de LPS. Los controles negativos se incubaron de forma similar durante 24h en ausencia de ODN o LPS añadidos. Las células se tiñeron (tras bloqueo de Fc-receptor) con mAb para Cd14 y CD80, y la expresión de CD80 sobre monolitos CD4+ se determinó por citometría de flujo. La Fig. 4 muestra dos resultados representativos de cinco experimentos separados para comparar los ODN 2006, 2117, y 2137.
De forma similar a los resultados presentados en el Ejemplo 1 para las células B, se encontró que el ODN 2117 metilado induce la estimulación de monocitos humanos. El ODN 2006 mostró la activación más fuerte, seguido por los correspondientes ODN GpC metilados 2117 y 2137. El ODN 2137 no potencia (Fig. 4, donante 24) o potenció sólo a un bajo grado (Fig. 4, donante 35) la expresión del marcador de activación CD80. LPS a una concentación de 1 \mug/ml, en ambos casos, fue menos estimulador que el ODN 2006.
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Ejemplo 3
Respuesta de células NK a los oligonucleótidos CpG metilados
Las células NK son responsables de más del 15% de los linfocitos sanguíneos, y su función principal es reconocer y matar el tumor y las células infectadas por virus. Roitt I, Brostoff J, and Male D, Immunology, Mosby, London, 1990. Previamente se ha demostrado que las células NK son activadas, aunque no directamente, por citoquinas proinflamatorias inducidas por ODN para secretar IFN-\gamma y tener una actividad lítica aumentada para las células tumorales. Ballas ZK y cols. (1996) J Immunol 157:1840-5; Takahashi T y cols. (2000) J Immunol 164:4458-64; Bohle B y cols. (1999) Eur J Immunol 29:2344-53; Krieg AM (1999) Biochim Biophys Acta 1489:107-16. Para evaluar la extensión de la activación mediada por los ODN metilados, se midió la expresión del marcador de activación temprana CD69 sobre células NK, células T y células NKT, sobre su activación, en relación a exposición a ODN metilado.
PBMC (2x10^{6} células/ml) obtenidas de varios donantes de sangre se incubaron durante 24h con 6 \mug/ml de ODN 2006, 2117 (2006 metilado), o 2137 (GpC 2006). Los controles negativos se incubaron de forma similar durante 24h en ausencia de ODN añadido. Como control positivo, PBMC se incubaron con 100 U/ml de IL-2 junto con 50 ng/ml de IL-12. Para potenciar la expresión de CD69, los respectivos ODN se añadieron junto con una dosis submitogénica de IL-2 (10 U/ml). PBMC se tiñeron para CD56 (marcador de célula NK, N-CAM), CD3 (marcador de célula T) o CD69 (marcador de activación temprana). La expresión de CD69 en la población celular CD56+ se midió por citometría de flujo. Los resultados representativos obtenidos de dos donantes se muestran en la Fig. 5.
Tal como se muestra en ambos donantes de la Fig. 5, el ODN 2117 metilado estimuló las células NK para potenciar la expresión del marcador de activación CD69, aunque el grado de activación fue bajo en casi todos los experimentos. Por el contrario, el cultivo con ODN 2137 (GpC 2006) resultó sólo en una estimulación de células NK humanas muy débil. De forma similares a los resultados del Ejemplo 2 para monocitos humanos (Fig. 4), se observó un ranking de 2006>2117>2137 para la activación de células NK.
Como también se muestra en la Fig. 5, la activación de células NK por los diferentes ODN se potenció por adición de IL-2. Takahashi T y cols. (2000) J Immunol 164:4458-64. De esta forma, la estimulación de células NK por ODN 2006 marcó, incluso, el estímulo más fuerte facilitado por la adición simultánea de IL-2 e IL-12. Se observó el mismo patrón de fuerza de activación, 2006>2117>2137.
Más experimentos investigaron la activación de células T y células NKT en PBMC por los diferentes DON. Las células NKT tienen similitudes tanto con las células NK como con las células T. Se definen por ser activadas por glucolípidos, exhibir citotoxicidad frente a células tumorales e influenciar en el patrón Th1/Th2 de la respuesta inmunitaria. Takahashi T y cols. (2000) J Immunol 164:4458-64. PBMC (2xl0^{6} células/ml) se incubaron con 6 \mug/ml de los ODN 2006, 2117, y 2137 durante 24h a 37ºC, como arriba. Los controles negativos se incubaron de forma similar durante 24h en ausencia de ODN añadido. Tras la recogida, las células se tiñeron para CD3 (marcador de célula T), CD56 (marcador de célula NK), y CD96. La expresión de CD69 sobre las células NKT CD56+/CD3+ se analizó por citometría de flujo. Los resultados representativos para las células NKT se muestran en la Fig. 6.
Ambas poblaciones de células T y células NKT potenciaban la expresión de CD69 en el cultivo con ODN 2006. También mostraron un patrón similar de estimulación 2006>2117>2137. Este resultado estaba en conformidad con un esquema uniforme de activación de linfocitos en sangre periférica humana por ODN metilado y no metilado.
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Ejemplo 4
Secreción de citoquinas proinflamatorias IL-6 y TNF-\alpha inducida por oligonucleótidos CpG metilados
Las citoquinas proinflamatorias como IL-6 y TNF-\alpha juegan un papel importante en la patogénesis de las enfermedades. Akira S, (1990) FASEB J4:2860-7. Ambas citoquinas se producen principalmente por macrófagos y monocitos, pero también por células T (IL-6 y TNF-\alpha) y células B (sólo IL-6). Trabajos anteriores demostraron que los ODNs CpG inducen de forma eficaz la secreción de IL-6 y TNF-\alpha. Hartmann G y cols. (1999) Gene Therapy 6:893-903. Para investigar más a fondo el efecto estimulador de los ODN CpG metilados, se midió la secreción de estas citoquinas por PBMC tras su cultivo con los distintos ODN.
PBMC (3x10^{6} células/ml) se obtuvieron de varios donantes de sangre y se incubaron durante 24h con 0,4, 1,0 y 6 \mug/ml de ODN 2006, 2117 (2006 metilado), 2137 (GpC 2006), o 1 \mug/ml de LPS como control positivo. Los controles negativos se incubaron de forma similar durante 24h en ausencia de ODN o LPS añadidos.
Tras 24h, se recogieron los sobrenadantes y se midió IL-6 y TNF-\alpha por ELISA como se describe arriba. Los resultados representativos se muestran en la Fig. 7.
La secreción de IL-6 y TNF-\alpha se indujo por todos los ODN probados (Fig. 7A y Fig. 7B). De nuevo, se observó un claro rango de orden de activación 2006>2117>2137. Se observó la misma dosis-respuesta para la inducción de los marcadores de activación sobre las células B humanas (Fig. 7B). Se sabe que IL-6 media la diferenciación y activación de células B, así como la secreción de anticuerpos (Akira S (1990) FASEB J4:2860-7), por tanto, posiblemente refleja el grado de activación de célula B.
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Ejemplo 5
Secreción de IL1\beta inducida por oligonucleótidos CpG metilados
De las dos formas casi funcionalmente equivalentes de IL-1, IL-1\beta es la forma predominante en humanos. Ésta se secreta principalmente por monocitos y tiene una amplia variedad de funciones inmunológicas. Bomford R and Henderson B, Interleukin-1, Inflammation and Disease, Elsevier, New York, 1989. IL-1\beta juega un papel en la estimulación de células B, T y NK; participa en la conversión de las células de Langerhans a células dendríticas profesionales presentadoras de antígeno; actúa como un quimioatrayente para los leucocitos; y afecta directamente al sistema nervioso central. Estudios previos no han demostrado que la secreción de IL-1\beta inducida por ODN CpG en PBMC humanas, aunque estos estudios existen para PBMC de múrido. Chelvarajan RL et al. (1999) Eur J Immunol 29:2808-18. Los siguientes experimentos investigaron el efecto de ODN CpG sobre la secreción de IL-1\beta humana por incubación de PBMC, aisladas de sangre de donantes sanos, con ODN 2006, 2117, y 2137 (Fig. 8).
PBMC (3x10^{6} células/ml), obtenidas de varios donantes de sangre, se incubaron durante 8h con 6 \mug/ml de ODN 2006, 2117, 2137, o 1 \mug/ml de LPS como control positivo. Los controles negativos se incubaron de forma similar durante 8h en ausencia de ODN y LPS añadidos. Tras 8h, se recogieron los sobrenadantes y se midió IL-1\beta por ELISA, como se describe arriba.
Se obtuvieron dos importantes resultados al medio IL-1\beta. Primero, los experimentos mostraron (Fig. 8), que los ODN CpG, en efecto, son potentes inductores de la secreción de IL-1\beta. Secundo, los resultados demostraron el mismo patrón de orden de activación diferencial por los OND no CpG metilados y no metilados 2006, 2117, y 2137, respectivamente.
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Ejemplo 6
Secreción de citoquinas Th1 y Th2 inducidas por oligonucleótidos CpG metilados
Una característica importante de los ODN CpG es su potencial para inducir una respuesta de tipo Th1 in vivo. Los monocitos y otros tipos celulares, son directamente activados para secretar citoquinas Th1, por ejemplo, IL-12.
Por sí misma, IL-12 media la activación de células NK y, con ello, la secreción de IFN-\gamma por este tipo celular. Krieg AM (2000) Curr Opin Immunol 12:35-43. Un estudio previo, demostró que la secreción de IFN-\gamma de células NK, puede ser potenciada por la adición de dosis submitogénicas de IL-2. Iho S et al. (1999) J Immunol 163:3642-52.
Para examinar el efecto de ODN CpG metilado en la secreción de de IFN-\gamma, se cultivaron PBMC (5x10^{6} células/ml), aisladas de sangre de donantes sanos, con 6 \mug/ml de ODN 2006, 2117, 2137, o 0.1 \mug/ml de LPS durante 16-24h en placas de 48 pocillos en atmósfera humidificada a 37ºC. Se añadieron cantidades submitogénicas de IL-2 (10 U/ml) a algunos pocillos que contenían células y ODN, para su incubación durante toda la noche. Se recogieron los sobrenadantes y se midieron las citoquinas por ELISA como se describe arriba. Los resultados están presentados en la Fig. 9.
La Fig. 9A ilustra que, en efecto, el ODN 2117 induce la secreción de IFN-\gamma en incubación de monocitos humanos de sangre periférica (PBMC) con este ODN. La adición de cantidades submitogénicas de IL-2 potenciaron la secreción de IFN-\gamma en un factor de 5 a 10 (Fig. 10). Ambas figuras muestran resultados representativos para 7 donantes de sangre probados. Aunque no existían grandes diferencias entre el ODN, ODN 2006 indujo de forma consistente la mayor cantidad de IFN-\gamma, seguida del ODN 2117 y 2137.
La IL-10 es una citoquina que tiene propiedades proinflamatorias y se piensa que juega un papel como regulador de la respuesta inmunitaria inducida por ODN CpG. Un estudio previo demostró la inducción de IL-10 tras cultivo de esplenocitos de múridos con ODN CpG. Redford TW et al. (1998) J Immunol 161:3930-5.
Para evaluar el posible efecto de los ODN CpG metilados sobre la secreción de IL-10, se cultivaron PBMC (5x10^{6} células/ml), aisladas de sangre periférica de donantes de sangre sanos, con 6 \mug/ml de ODN 2006, 2117, o 2137, durante 16-24h en placas de 48 pocillos en atmósfera humidificada a 37ºC. Los controles negativos se incubaron de forma similar en ausencia de ODN añadidos. Se recogieron los sobrenadantes y se midió IL-10 por ELISA, como se describe arriba. Los resultados están representados en la Fig. 10.
La Fig. 10 demuestra la inducción de IL-10 tras incubación de PBMC humanos con distintos ODN. Como se muestra arriba para IFN-\gamma, los ODN 2006 y 2117 inducen concentraciones más altas de citoquinas que el ODN 2137. De forma consistente con los resultados de arriba, el grado de inmunoestimulación obtenido fue: ODN no metilado>ODN metilado>ODN no CpG GpC.
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Ejemplo 7
Respuesta de células B a oligonucleótidos CpI
PBMC (2x10^{6} células/ml), obtenidas de donantes de sangre sanos (n=3) se incubaron durante 48h con 0,4 \mug/ml, 1,0 \mug/ml, y 10,0 \mug/ml de cada ODN (2006, 1982, 5126, 5246, 5247, 5248, 5249, 5250, y 5251). Los controles negativos se incubaron de forma similar durante 48h en ausencia de los ODN añadidos. Las células se recogieron y tiñeron con mAb para CD19 y CD86. Se midió la expresión del marcador de activación CD86 sobre las células B CD19+ por citometría de flujo. Los resultados representativos de 2 donantes (Donante 60 y Donante 62) se muestran en la Fig. 11.
Los resultados de la Fig. 11, demuestran que 2006 representa al mejor ODN inmunoestimulador de este grupo, seguido de los ODN no CpG 5126 y 1982. Los ODN que contienen residuos de citosina en su estructura modificada 2'-metoxi (5246-5248) no se vieron afectados por estas modificaciones, es decir, fueron tan inmunoestimuladores como los correspondientes ODN no modificados (2006, 1982, y 5126) (Fig. 11).
En experimentos relacionados, designados para investigar la proliferación de la célula B, más que su activación, se tiñeron PBMC (2x10^{6} células/ml), de 2 donantes (Donante 48 y Donante 62), con el tinte CFSE y luego se incubaron con 0,4, 1,0 y 10,0 \mug/ml del mismo panel de ODN durante 5 días a 37ºC. Los controles negativos se incubaron de forma similar durante 5 días en ausencia de ODN añadidos. La células fueron recogidas y teñidas con mAb para CD19. Se midió la proliferación de células B CD19+ por citometría de flujo y se expresaron como porcentaje de células B con disminución en luminiscencia con el tinte CFSE. Los resultados se muestran en la Fig. 12.
Comparando los resultados para la inducción de la proliferación de la célula B (Fig. 12) con la activación de la célula B (Fig. 11), esencialmente se pueden observar las mismas diferencias, aunque en el caso del ODN PS 2'-metoxi modificado, el efecto de la modificación no es tan profundo. De forma significativa, los ODN que contiene inosina en lugar de guanina (5249-5251) no se vieron afectados por estas modificaciones, es decir, en este ensayo, eran tan inmunoestimuladores como los correspondientes ODN no modificados (2006, 1982, y 5126).
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Ejemplo 8
Activación de células NK y monocitos por oligonucleótidos CpI
Para examinar el efecto en las células NK, se incubaron PBMC (2x10^{6} células/ml) de dos donantes distintos, durante 24h con 1,0 \mug/ml y 6,0 \mug/ml de cada ODN (2006,1982, 5126, 5246, 5247, 5248, 5249, 5250 y 5251). Los controles negativos se incubaron de forma similar durante 24h en ausencia de ODN añadidos. Los controles positivos se incubaron de forma similar durante 24h con adición de IL-2 (100 U/ml) mas IL-12 (50 ng/ml). Las células se recogieron y tiñeron con los marcadores de superficie celular CD56 (células NK), CD3 (células T) y CD69 (marcador de activación temprana). Se midió la expresión de CD69 sobre las células NK CD56+/CD3+ por citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Fig. 13.
Para examinar el efecto sobre monocitos, PBMC (2x10^{6} células/ml), de estos donantes diferentes (Donantes 41, 66, y 67) se incubaron durante 24h con 1,0 \mug/ml y 6,0 \mug/ml del mismo panel de ODN. Los controles negativos se incubaron de forma similar durante 24h en ausencia de ODN añadidos. Los controles positivos se incubaron de forma similar durante 24h con adición de LPS (1 ng/ml). Las células se recogieron y tiñeron con los marcadores de superficie celular CD14, CD19, y CD80 para medir la expresión del marcador de superficie celular B7-1 (CD80) sobre monocitos CD14+ (excluyendo las células B CD19+CD14+) por citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Fig. 14.
Para las células NK, el ODN 2006 claramente potenció la expresión de CD69 (Fig. 13), 5126 fue menos activo, y 1982 no mstró efecto estimulador. La inmunoestimulación por el ODN con citosinas de estructura 2'-metoxi modificadas (5246-5248) y cambios de guanosina por inosina (5249-5251) no se alteró desde los respectivos ODN PS no modificados (2006, 1982, y 5126).
Esencialmente, se obtuvo la misma gráfica de actividad inmunoestimuladora para los monocitos (Fig. 14). De nuevo, el grado de activación fue: ODN PS = ODN PS guanosina por inosina = ONS PS 2'-metoxi citosina. Por ello, para todos las tipos celulares probados, el ODN con las citosinas de la estructura 2'-metoxi modificadas o los de inosina en lugar de guanosina, mostraron los mismos efectos que los ODN PS de referencia de sí mismos.
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Ejemplo 9
Secreción de citoquinas inducida por oligonucleótidos CpI
PBMC (5x10^{6} células/ml) de diferentes donantes se incubaron durante 20h 6,0 \mug/ml de ODN (2006, 1982, 5126, 5246, 5247, 5248, 5249, 5250, y 5251). Los controles negativos se incubaron de forma similar durante 20h en ausencia de los ODN añadidos. Los controles positivos se incubaron de forma similar durante 20h en presencia de LPS (0.1 \mug/ml). Los sobrenadantes celulares fueron analizados por ELISA para la citoquina proinflamatoria TNF-\alpha, la citoquina Th1 IFN-\gamma, la citoquina Th1 IL-10, y la citoquina IL-6 Los resultados se muestran en las Figs. 15-18.
La Fig. 15 muestra resultados representativos (de donantes 2 y 4) para TNF-\alpha. TNF-\alpha es una citoquina que no está fuertemente reguladas por ODN PS; típicamente, se pueden obtener cantidades entre 10 y 200 pg/ml, en comparación con alrededor de 1000 pg/ml con LPS. En estos experimentos, todos los ODN probados inducían la secreción de TNF-\alpha (Fig. 15). Para los ODN 5246, 5247, y 5248 (ODN PS 2'-OMe-C) y los ODN 5249, 5250, y 5251 (ODN PS inosina), estos resultados confirman nuestras observaciones previas con niveles de TNF-\alpha similares a aquellos inducidos por los ODN referencia 2006, 1982, y 5126.
Para IFN-\gamma, estos resultados variaban dependiendo del donante. Los resultados representativos de 2 a 3 donantes estudiados se muestran en la Fig. 16. Las cantidades de IFN-\gamma en cultivos humanos in vitro fueron muy bajos,resultando en variaciones intra-experimentales. Sin embargo, de nuevo, los resultados demostraron que los ODN con citosinas de la estructura 2'-metoxi modificadas o con inosina, tenían potencial inmunoestimulador. Para estos ODN, la cantidad de IFN-\gamma obtenido fue mayor que la original de los ODN referencia.
Para IL-10, se obtuvieron, mayormente, los mismos resultados para los 2 donantes estudiados (Fig. 17). Los ODN 5246-5248 y 5249-5251 ODN con citosina de la estructura 2'-metoxi modificada y ODN PS guanosina por inosina) indujeron IL-10, con el ODN que contenía inosina induciendo las cantidades mayores.
Los resultados para IL-6 (Fig. 18) fueron consistentes con aquellos obtenidos para la activación y proliferación de la célula B (Ejemplo 5). El orden de grado de activación para los 4 donantes estudiados, de nuevo se encontró que fue: ODN PS guanosina por inosina = ODN PS con citosina en la estructura 2'-metoxi modificada.
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Ejemplo 10
Secreción de la Th1 quimioquina IP-10 inducida por oligonucleótidos CpI
En este experimento, ODN 5331, en el que los dinucleótidos CpG de ODN 2006 se sustituyeron por dinucleótidos CpI, se examinó su habilidad para inducir la secreción de la quimioquina IP-10 inducida por IFN-\gamma. PBMCs descongelados o frescos y se resuspendieron a una concentración de 5x10^{6}/ml y se añadieron a placas de 48 pocillos (1 ml/pocillo) con o sin ODNs. Los ODNs se añadieron antes de que las células alcanzaran una variedad de concentraciones finales de ODN, variando desde 0,4 \mug/ml hasta 3,0 \mug/ml. Estas células se cultivaron en una atmósfera humidificada a 37ºC. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron tras 48h para realizar ELISA. Si no se usan de forma inmediata, los sobrenadantes se congelaron a -20ºC hasta que se necesiten.
El ODN 5331 (VpI) indujo niveles comparables de IP-10, a 3,0 mg/ml e incluso mayores, en comparación con el ODN 2006.
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Ejemplo 11
Nucleótidos que incluyen dSpacers en lugar de los nucleótidos C, G, o C y G de CpG que estimula células B humanas
Los siguientes grupos de experimentos examinaban si el cambio de C, G o ambos nucleótidos del dinucleótido CpG por el llamado "dSpacer" (un "nucleótido" con una sola porción de azúcar; dSp) puede afectar a la actividad inmunoestimuladora de los ODNs 2006 o 5122. Por ello, se cultivaron in vitro dichos ODNs con PBMCs derivados de sangre de voluntarios sanos, para medir tanto la expresión de los marcadores de expresión celular sobre las células B como la proliferación de las células B. De forma sorprendente, todos estos ODNs 5280 (CpdSpacer por CpG), 5281 (dSpacerG por CpG), y 5282 (dSpacerpdSpacer por CpG)) exhibía, al menos, alguna actividad inmunoestimuladora. En particular, el ODN 5280 mostró una actividad muy alta, casi comparable al ODN 2006 (sólo alrededor del 10-15% menos de actividad). Por el contrario, los ODNs 5281 y 5282 indujeron, como mucho, sobre el 50% de estimulación de células B, comparado con el ODN 2006, y la estimulación no se potenció por el uso de concentraciones mayores del ODN (más de 10 \mug/ml). Los mismos resultados se observaron para el ODN referencia 5122 y su correspondientes ODN de tipo CpG 5283-5285. EL ODN 5122 difiere del ODN 2006 porque tiene menos motivos CpG estimuladores.
Esencialmente, el mismo efecto de arriba se observó para la inducción de la proliferación de células B por estos ODNs, aunque la diferencia entre 2006, 5280, y los otros ODNs fue más pronunciada. Como arriba, el cambio de G no tuvo el mismo efecto que el cambio de C.
Estos resultados muestran que la C y/o la G del dinucleótido CpG pueden ser sustituídas por el "dSpacer", resultando en una disminución, pero no una pérdida, de la actividad inmunoestimuladora. Este efecto conservado parece ser más fuerte para los ODN similares del ODN 2006 (el ODN CpG humano optimizado) que para los correspondientes ODN similares del ODN 5122. El ODN 2006 no sólo tiene motivos dinucleótido CpG, sino también un alto contenido de T. Como se ha descrito previamente, dichas secuencias poli T median un efecto inmunoestimulador. Por tanto, el ODN 2006 podría conservar parte de su actividad inmunoestimuladora tras la sustitución los dinucleótidos CpG normalmente esenciales. Para otros ODNs como 5122, la actividad se acerca al origen (aquí, inmunoestimulación por el ODN no CpG 1982) tras el cambio de los dinucleótidos Cpg por un "dSpacer". Otra observación importante es que el cambio sólo de la G, obviamente tiene menos efecto sobre la inmunoestimulación que el cambio de la C o de ambos nucleótidos.
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Ejemplo 12
Secreción de citoquinas inducida por oligonucleotides ZpY
Es estas series de experimentos, se examinaron las variantes del ODN 2006 que incorporan varias sustituciones, diferentes de CpI, para CpG, para su habilidad para inducir la secreción de las citoquinas IL-10 e IFN-\gamma. El OND incluye ODN 5279 (CpG\rightarrowCp2, 2=2-aminopurina), 5280 (CpG\rightarrowCpdSpacer (CpdSp), 5282 (CpG\rightarrowdSppdSp), y 5290 (CpG\rightarrowCpW, W=nebularina). PBMCs descongelados o frescos se resuspendieron a una concentración de 5x10^{6}/ml y se añadieron a placas de 48 pocillos (1 ml/pocillo) con o sin ODNs. Los ODNs se añadieron antes de que las células alcanzaran una variedad de concentraciones finales de ODN, variando desde 0,2 \mug/ml hasta 0,8 \mug/ml. Las células se cultivaron en una atmósfera humidificada a 37ºC. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron tras 48h para realizar ELISA. Si no se usan de forma inmediata, los sobrenadantes se congelaron a -20ºC hasta que se necesiten.
Los ODNs 2006, 5279, 5280, 5282, y 5290, a concentraciones de 0.4 \mug/ml y 0.8 \mug/ml, todos indujeron IL-10 sobre lo observado en los controles negativos (no ODN añadido). El ODN 5280 (CpdSp) indujo niveles similares de IL-10 en comparación con ODN 2006. Además, ODN 5290 (CpW) también indujo altos niveles comparables de IL-10 (700 pg/ml a 0,8 \mug/ml). El ODN 5279 (Cp2) fue menos estimulador, pero todavía indujo cantidades sustanciales de IL-10 a 0,8 \mug/ml. Resultados similares se obtuvieron para la secreción de IFN-\gamma, aunque los ODNs 5280 y 5290 indujeron, de alguna forma, menores cantidades de esta citoquina Th1 de lo que lo hizo el ODN 2006.
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Ejemplo 13
Activación de células B inducida por oligonucleótidos ZpY
PBMC humanos se incubaron con varios ODNs ZpY y se midió la expresión de un marcador de activación (CD86) sobre la superficie de las células B. PBMC humano, obtenido de tres donantes, se incubó con varias concentraciones (0,2 \mug/ml a 5,0 \mug/ml) de cada ODN durante 48h. Después, las células se recogieron y tiñeron para el marcador de célula B, CD19 y para CD86, los datos se tomaron por citometría de flujo. Los datos se evaluaron como índice de estimulación calculado en referencia a muestras incubadas sin ODNs. El ODN 5286 con un cambio CpG a Cp7 (7=7-deaza-guanosina) retenía mucha de su estimulación a todas las concentraciones examinadas en comparación con ODN 2006. Sin embargo, ODN 5286 activaba las células B mucho mas eficientemente que el ODN no CpG 1982, usado como ODN control. Los siguientes ODNs (también derivados de la secuencia del ODN 2006) también fueron probados para su potencial para activas células B: CpG a UpG (ODN 5384), CpG a GpG (ODN 5385), CpG a CpC (ODN 5386), CpG a Gpl (ODN 5387), CpG a 2pG (ODN 5388) y CpG a CpM (5389, M=2,6-diaminopurina). Todos estos ODNs exhibieron, al menos, algo de estimulación immune de las células inmunes humanas. Los mejores ODNs fueron aquellos con los cambios CpG a CpC, CpM, UpG y 2pG.
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Ejemplo 14
Estimulación de TLR9
La estimulación por ODN CpG depende de su gran extensión sobre la activación del receptor 9 de tipo peaje (TLR9). En este ejemplo, se examinó y comparó la activación de transfectantes TLR9 por ODN CpG y ODN de tipo CpG. Como se demostró arriba, el cambio CpG a CpI retuvo alrededor del 80% de la actividad original (es decir, ODN 2006). Además, El siguiente mejor ODN examinado (con alrededor del 40% de actividad) de estos transfectantes, fue ODN 5280 (CpG a CpdSpacer), seguido del ODN 5286 (Cpg a Cp7) y el ODN 5290 (CpG aCpW). Estos resultados fueron consistentes con las observaciones de arriba sobre la activación de PBMC humanos.
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<110> Coley Pharmaceutical Group, Ltd.
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<120> ÁCIDOS NUCLEICOS TIPO CpG Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS
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<130> C1041/7018WO (AWS)
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<150> US 60/254,341
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<151> 2000-12-08
<1S0> 36
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<170> FastSEQ for Windows Version 3.0
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<210> 1
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 1
16 
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<210> 2
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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17 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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19 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<221> Base modificada
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<221> Base modificada
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<221> Base modificada
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<223> m5c
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido sintético
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<223> m5c
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)...(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
27 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
<2 21> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
28 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
<22l> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
29 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
<22l> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
<22l> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
30 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
<22l> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
31 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
<22l> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)...(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
32 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-aminopurina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-aminopurina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-aminopurina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-aminopurina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-aminopurina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)...(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-aminopurina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
35 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)...(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
36 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
37 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
38 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)...(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
39 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
<22l> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> separador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 7-deaza-guanosina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 7-deaza-guanosina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 7-deaza-guanosina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)...(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 7-deaza-guanosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
42 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nebularina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nebularina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nebularina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)...(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nebularina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
43 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)...(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
44 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
45 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
46 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
47 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)...(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
48 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
<22 3> 2-aminopurina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-aminopurina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-aminopurina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-aminopurina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
49 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2,6-diaminopurina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2,6-diaminopurina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
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<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2,6-diaminopurina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Base modificada
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<222> (22)...(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2,6-diaminopurina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
50

Claims (14)

1. Una composición, que comprende:
un ácido nucleico inmunoestimulador que tiene una secuencia que incluye, al menos, la siguiente fórmula:
5'X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
donde C es un nucleótido en el que la porción nucleosídica es 2'-metoxi citidina y donde X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria.
2. Una composición según la reivindicación 1, donde el ácido nucleico inmunoestimulador:
i)
es un ácido nucleico aislado,
ii)
tiene entre 6 y 100, ó 8 y 40, nucleótidos,
iii)
tiene una cadena principal, preferiblemente una cadena principal modificada con fosfato,
iv)
es un ácido nucleico sintético, y/o
v)
tiene, al menos, 18 nucleótidos de longitud y no es un ácido nucleico antisentido.
3. Una composición según la reivindicación 1 o 2, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el vehículo farmacéuticamente aceptable es un mecanismo de liberación sostenida.
5. Una composición según se reivindicó en las reivindicaciones 2 y 3, que además comprende:
i)
un antígeno,
ii)
un medicamento anticanceroso, preferiblemente, donde el medicamento anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un agente quimioterapéutico, y un agente radioterapéutico.
iii)
un agente antiviral,
iv)
un agente antibacteriano,
v)
un agente antifúngico,
vi)
un agente antiparasitario,
vii)
un medicamento para úlcera,
viii)
un medicamento para alergia,
ix)
un medicamento para asma,
x)
un medicamento para anemia,
xi)
un medicamento para trombocitopenia,
xii)
un medicamento para neutropenia, o
xiii)
una citoquina, preferiblemente donde la citoquina se selecciona del grupo que consiste en interleuquina-2 (IL-2), IL-3, IL-4. IL-18, interferón alfa (IFN-\alpha), IFN-\gamma, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha), ligando de Flt3, factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF).
6. Una composición según se reivindicó en las reivindicaciones 3 y 4, donde la composición incluye, al menos, dos ácidos nucleicos inmunoestimuladores que tienen secuencias diferentes.
7. Una composición según se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo.
8. Uso de una composición según se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo.
9. Un uso según se reivindicó en la reivindicación 8, donde el individuo es un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, conejo, cobaya, primate no humano, pollo, o pez.
10. Un uso según se reivindicó en la reivindicación 8 o 9, donde el medicamento es para administración:
i)
a un individuo con riesgo de desarrollar una enfermedad infecciosa, en una cantidad eficaz para prevenir la enfermedad infecciosa,
ii)
a un individuo con una enfermedad infecciosa, en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad infecciosa,
iii)
a un individuo con riesgo de desarrollar un cáncer, en una cantidad eficaz para prevenir el cáncer,
iv)
a un individuo con un cáncer, en una cantidad eficaz para tratar el cáncer,
v)
a un individuo con riesgo de desarrollar una alergia, en una cantidad eficaz para prevenir la alergia,
vi)
a un individuo con una alergia, en una cantidad eficaz para tratar la alergia,
vii)
a un individuo con riesgo de desarrollar asma, en una cantidad eficaz para prevenir el asma,
viii)
a un individuo con asma, en una cantidad eficaz para tratar el asma,
ix)
a un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar una inmunodeficiencia, en una cantidad eficaz para potenciar la proliferación de la médula ósea en el individuo, preferiblemente cuando el individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar una inmunodeficiencia es un individuo que está sometiéndose o tiene riesgo de someterse quimioterapia,
x)
a un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar anemia, en una cantidad eficaz para potenciar la eritropoyesis en el individuo,
xi)
a un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar trombocitopenia, en una cantidad eficaz para potenciar la trombopoyesis en el individuo,
xii)
a un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar neutropenia, en una cantidad eficaz para potenciar la proliferación de neutrófilos en el individuo,
xiii)
en una cantidad eficaz para inducir la producción de citoquinas, preferiblemente donde la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IL-1 beta (IL-1\beta), IL-2, IL-6, IL-12, IL-18, TNF-\alpha, IFN-\alpha, e IFN-\gamma, o
xiv)
en una cantidad eficaz para estimular la actividad celular asesina natural.
11. Un uso según se reivindicó en la reivindicación 8 o 9, donde el medicamento es para administración al individuo con un antígeno, preferiblemente donde el antígeno se selecciona del grupo que consiste en un alérgeno, un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno fúngico, y un antígeno parasitario.
12. Un uso según se reivindicó en la reivindicación 11, donde el antígeno es administrado por:
i)
una ruta mucosal, preferiblemente donde la ruta mucosal se selecciona del grupo que consiste en oral, nasal, rectal, vaginal, transdérmica y ocular, o
ii)
una ruta parenteral, preferiblemente donde la ruta parenteral se selecciona del grupo que consiste en intravenosa, subcutánea, intramuscular, e inyección directa.
13. Un uso según se reivindicó en la reivindicación 8 o 9, donde el medicamento es para administración al individuo con una terapia anticancerosa, preferiblemente donde la terapia anticancerosa es:
i)
un anticuerpo monoclonal específico para una célula tumoral,
ii)
una quimioterapia, o
iii)
una radioterapia.
14. Un uso según se reivindicó en la reivindicación 8 o 9, donde el medicamento es para administración:
i)
por una ruta mucosal, preferiblemente donde la ruta se selecciona del grupo que cosiste en oral, nasal, rectal, vaginal, transdérmica y ocular,
ii)
por una ruta parenteral, preferiblemente donde la ruta parenteral se selecciona del grupo que consiste en intravenosa, subcutánea, intramuscular, e inyección directa, o
iii)
un vehículo de liberación sostenida.
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