DE60114908T2

DE60114908T2 - Hühner-Anäemie-Virus mit geringer Pathogenität

Info

Publication number: DE60114908T2
Application number: DE60114908T
Authority: DE
Inventors: Carla Christina Schrier; Henricus Johannes Maria Jagt
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2001-02-22
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2021-02-23
Also published as: US20040157311A1; KR20020013361A; DE60114908D1; KR100755811B1; PL202168B1; ZA200101583B; EP1132466B1; US6723324B2; DK1132466T3; PL346195A1; ATE310078T1; EP1132466A1; US7090981B2; AU780550B2; AU2326201A; HU225801B1; JP2001275664A; US20010023664A1; US7090854B2; NZ510130A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Hühneranämie Virus (chicken anemia virus, CAV), einen Impfstoff umfassend ein CAV und ein Verfahren zur Herstellung eines CAV Impfstoffes.
Das Hühneranämie Virus (CAV) ist der Erreger einer Erkrankung, welche als infektiöse Hühneranämie, Anämie-Dermatitis-Syndrom oder Blue-Wing Disease bekannt ist und von Yuasa et al. (Avian Diseases 23, 366–385, 1979) 1979 zuerst beschrieben wurde.
Die meisten Ausbrüche der natürlich vorkommenden CAV-bedingten Erkrankung wurden in Küken beobachtet. Die Krankheit ist akut und die ersten Anzeichen treten im allgemeinen in einem Alter von 10–14 Tagen auf. Diese klinische Krankheit zeichnet sich durch einen plötzlichen Anstieg der Mortalität von im allgemeinen ungefähr 5–10% aus, es wurde jedoch auch von bis zu 60% berichtet. Die Mortalität gipfelt innerhalb 5 bis 6 Tagen nach Krankheitsbeginn. Weitere klinische Anzeichen umfassen Depression und Anorexie. Weiter werden schwere Anämie, Blutungen am ganzen Körper, eine Atrophie des Thymus und der Bursa Fabricii sowie gelbliches Knochenmark in den betroffenen Küken beobachtet (McNulty, Avian Pathol. 20, 187–203, 1991).
Das CAV verbreitet sich sowohl horizontal wie auch vertikal in Hühnern. Wenn Zuchthennen ohne vorgängigen Viruskontakt infiziert werden, wird das CAV vertikal auf die Nachkommenschaft übertragen. Keine klinischen Zeichen werden in Brütern beobachtet und es gibt keinen offensichtlichen Effekt auf die Eiproduktion, Schlupfrate oder Fruchtbarkeit. Die vertikal infizierte Küken Nachkommenschaft erscheinen beim Schlüpfen normal, zeigen jedoch eine erhöhte Mortalität und entwickeln die typische Krankheit (Anemia Dermatitis Syndrome) im Alter von 10 bis 14 Tagen. Eine horizontale Ausbreitung kommt durch Kontakt mit vertikal infizierten Hühnern, kontaminierten Infektionsträgern, Häusern etc. vor. Eine horizontale Ausbreitung auf anfällige Küken, das heisst ohne mütterlich hergeleitete Antikörper gegen CAV, kann ebenso zwei Wochen später zu klinischer Krankheit führen.
Das Anämie-Dermatitis-Syndrom kann kontrolliert werden, indem sichergestellt wird, dass die elterliche Schar vor Legebeginn Antikörper gegen CAV entwickeln. Ein hoher Spiegel an Antikörpern gegen CAV vor Legebeginn wird eine vertikale Übertragung während dem Legen verhindern und wird die Nachkommenschaft mit mütterlich hergeleiteten Antikörpern versehen, die während der ersten Wochen nach dem Schlüpfen gegen eine horizontale Infektion schützen.
Demzufolge ist es wichtig, dass alle Vögel vor Legebeginn mit einem CAV Impfstoff geimpft werden.
Mütterliche Antikörper gegen CAV verschwinden im allgemeinen bis zu einem Alter von 3 Wochen. Zu diesem Zeitpunkt können horizontale Infektionen vorkommen. Diese Infektionen sind im allgemeinen subklinisch, wobei diese subklinische Infektion jedoch aufgrund von reduziertem Wachstum der Fleischhühner mit signifikanten wirtschaftlichen Verlusten verbunden ist (McNulty et al., Avian Diseases 35, 263–268, 1991). Die subklinische Erkrankung kann durch Impfen der Hühner gleich nach dem Schlüpfen, vorzugsweise im Alter von einem Tag, verhindert werden.
Es besteht eindeutig ein Bedarf an einem sicheren Impfstoff, der einen effektiven Schutz gegen die mit CAV-Infektionen assoziierte klinische und subklinische Erkrankung induziert. Da die Möglichkeit der Verbreitung von Impfstoffviren auf anfällige Kükenscharen in der Praxis besteht, sollten lebende CAV Impfstoffe für eine Impfung der elterlichen Gruppe auf CAVs mit niedriger Pathogenität basieren. Da die Küken gegenüber einer CAV Infektion sehr anfällig sind, benötigen Lebendimpfstoffe für eine direkte Verabreichung an Küken zudem die Verfügbarkeit von CAV-Isolaten von niedriger Pathogenität, die die Küken nicht nachteilig beeinträchtigen.
Alle bislang isolierten, natürlich vorkommenden CAVs sind jedoch pathogen für Küken (McNulty, Avian Pathology 20, 187–203, 1991; Noteborn and Koch, Avian Pathology 24, 11–31, 1995; McNulty, British Poultry Science 38, 7–13, 1997).
Zusätzlich führte eine Abschwächung der CAV Isolate mittels in vitro Passagen in Zellkultur zu zweideutigen Resultaten. Bulow und Fuchs (J. Vet. Med. B 33, 568–573, 1986) berichteten über eine Abnahme der Pathogenität des Cux-1 Isolates nach 12 Passagen in MDCC-MSB1 Zellen, was nach zusätzlichen 100–112 Passagen weiter reduziert wurde. Yuasa (Nat. Inst. Anim. Health Quarterly 23, 13–20, 1983) und Goryo et al. (Avian Pathology 16, 149–163, 1987) fanden kein Indiz für eine Abschwächung wenn die CAV Isolate 19 beziehungsweise 40 Zellkultur Passagen unterzogen wurden. Todd et al. (Avian Pathology 24, 171–187, 1995) zeigte eine Abschwächung des Cux-1 Isolates bei Passagen (173 mal) in MDCC-MSB1 Zellen, es wurde jedoch erwiesen, dass diese Abschwächung nicht stabil war und eine Umkehr zu Virulenz stattfand.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 533 294 offenbart CAV Isolate, die durch Passagen in embryonierten Eiern abgeschwächt wurden. Diese Isolate zeigen immer noch eine gewisse Restvirulenz für Küken im Alter von einem Tag und sind deshalb nicht besonders geeignet um Küken, die jünger als eine Woche sind, zu impfen. Zusätzlich induzieren diese attenuierten CAV Isolate Läsionen in Hühnerembryos, wodurch diese Impfstoffviren für eine in ovo Impfung weniger geeignet sind.
Das Huhn wurde als natürlicher Wirt für CAV betrachtet. Kein CAV wurde in einer Untersuchung von UK Truthahn- und Enten- Seren gefunden und mit CAV geimpfte, ein Tag alte Truthahn Küken zeigten keine klinische Anzeichen von Anämie und entwickelten keine Antikörper gegen das Virus (McNulty et al., Avian Pathology 17, 315–324, 1988 und McNulty, Avian Pathology 20, 187–203, 1991). Erst kürzlich berichtete Farkas et al. (Avian Pathology 27, 316–320, 1998) dass CAV Antikörper in einer anderen Spezies als Hühner (d.h. Wachtel) entdeckt wurden.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung zusätzliche CAVs mit niedriger Pathogenität bereitzustellen, die von Vorteil zur Herstellung eines lebenden CAV-Impfstoffes verwendet werden können, z.B. für eine Impfung von Fleischhühnern.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung CAVs mit niedriger Pathogenität, insbesondere nicht-pathogene CAVs, bereitzustellen, die zur Impfung von Vögeln, die am meisten auf CAV anfällig sind, verwendet werden können, z.B. für eine in ovo Impfung oder eine Impfung von ein Tag alten Vögeln.
Es wurde nun festgestellt, dass diese Ziele durch Bereitstellen eines Hühneranämie Virus (CAV) erreicht werden können, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Virus durch eine Referenzprobe umfassend einen monoklonalen Antikörper R2, der durch eine Hybridoma Zelllinie ausgeschieden wird, von der eine Probe bei der Europäischen Sammlung von Tier Zellkulturen (European Collection of Animal Cell Cultures, ECACC), Salisbury, UK, am 3. Februar 2000 unter der Hinterlegungsnummer 00020304 hinterlegt ist, neutralisiert wird.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass natürlich vorkommende CAV Stämme mit niedriger Pathogenität existieren. Die CAVs gemäss der vorliegenden Erfindung weisen eine bedeutend reduzierte Pathogenität in ein Tag alten Küken auf im Vergleich mit bis anhin natürlich vorkommenden CAV Stämmen, wie durch die Fähigkeit des Virus eine Thymusatrophie, blasses Knochenmark und/oder Anämie zu induzieren bestimmt wurde (Tabelle 2) Gleichfalls unerwartet wurde festgestellt, dass diese CAVs von infizierten Truthähnen im Feld isoliert werden können.
Die CAVs gemäss der vorliegenden Erfindung können antigen von den bislang bekannten, von infizierten Hühnern isolierten CAV Stämmen sowie von gewissen anderen, von Truthähnen isolierten CAV Stämmen unterschieden werden.
Monoklonale Antikörper (Moabs) sind zur Identifizierung von Eigenschaften eines infektiösen Agens und zur Bestimmung von antigenen Ähnlichkeiten und Unterschieden unter den verschiedenen Isolaten desselben oder eines ähnlichen Mikroorganismus nützlich. In Tabelle 1 wird gezeigt, dass CAVs gemäss der vorliegenden Erfindung ein Reaktionsmuster mit einem Moab haben, das sich von dem, welches mit bekannten Hühnerstämmen oder anderen Truthahnstämmen mit einem pathogenen Charakter beobachtet wurde, unterscheidet.
Insbesondere wurde festgestellt, dass ein CAV Stamm gemäss der vorliegenden Erfindung ein Virus darstellt, das durch eine Probe umfassend den Moab R2 neutralisiert wird, im Gegensatz zu den bekannten, von Hühnern isolierten CAV Stämmen, die durch diesen Moab nicht neutralisiert werden.
Um zu untersuchen ob ein CAV Stamm durch eine Probe umfassend den Moab R2 neutralisiert wird, muss zuerst der neutralisierende Antikörper Titer der Moab R2 Probe gegen den bei der Europäischen Sammlung von Tier Zellkulturen (European Collection of Animal Cell Cultures, ECACC), Salisbury, UK, am 26. Januar 2000 unter der Hinterlegungsnummer 00012608 hinterlegten CAV Stamm 319 in einem Virus Neutralisationstest gemäss der Beschreibung in Beispiel 1 festgestellt werden. Je nach Antikörper Titer wird eine Moab R2 Referenzprobe entweder durch Verdünnung oder Konzentration der Moab R2 Probe hergestellt, sodass in einem Virus Neutralisationstest gemäss der Beschreibung in Beispiel 1, 50 μl einen Antikörper Titer von 16 (log₂) enthalten bei Untersuchung gegen 300–1000 TCID₅₀ pro 50 μl des CAV Stammes 319.
Ein CAV Stamm wird als zugehörig zu der vorliegenden Erfindung betrachtet, wenn er spezifisch im Virus Neutralisationstest durch die Moab R2 Referenzprobe neutralisiert wird. Das bedeutet, dass im Virus Neutralisationstest der Antikörper Titer der Moab R2 Referenzprobe mindestens 5 (log₂) pro 50 μl beträgt bei Untersuchung gegen 300–1000 TCID₅₀ pro 50 μl eines CAV Stammes.
Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere einen CAV Stamm bereit, der durch höhere Verdünnungen der Moab R2 Referenzprobe neutralisiert wird. CAV Stämme, die durch höhere Verdünnungen der Moab R2 Referenzprobe neutralisiert werden, zeigen auch eine niedrigere Pathogenität bei Hühnern. Demzufolge wird in einer bevorzugten Variante der Erfindung ein CAV Stamm bereitgestellt, der durch die Tatsache gekennzeichnet ist, dass der der Antikörper Titer der Moab R2 Referenzprobe gegen diesen CAV Stamm mindestens 10 (log₂) pro 50 μl, mehr bevorzugt mindestens 12 (log₂) pro 50 μl oder sogar mindestens 14 (log₂) pro 50 μl und insbesondere mindestens 16 (log₂) pro 50 μl beträgt bei Untersuchung gegen 300–1000 TCID₅₀ pro 50 μl eines CAV Stammes.
Ein CAV Stamm, der durch höhere Verdünnungen der Moab R2 Referenzprobe neutralisiert wird, ist im wesentlichen nicht-pathogen für junge Hühner und für Hühnerembryos. Demzufolge ist ein solcher CAV Stamm insbesondere zur Verwendung in einem lebenden CAV Impfstoff zur Verabreichung an Hühner, die am meisten für eine CAV Infektion anfällig sind, wie zum Beispiel Hühnerembryos oder ein Tag alte Küken, geeignet
Ein am meisten bevorzugter Stamm der vorliegenden Erfindung ist der CAV Stamm 319, wovon eine Probe bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer Nr. 00012608 hinterlegt ist. In Anbetracht seiner nicht-pathogenen Eigenschaften, ist dieser Stamm insbesondere als Impfstoff Komponente zur Immunisierung junger Hühner und Hühnerembryos geeignet.
Die Identifizierung der neuen CAV Stämme gemäss der vorlie genden Erfindung erlaubt die Herstellung von lebenden CAV Impfstoffen mit niedriger Pathogenität, die Geflügel, insbesondere junge Hühner, gegen Krankheitsbeschwerden, die von einer Infektion mit CAV herrühren, wirksam schützen. Demzufolge wird in einer bevorzugten Variante ein wie hierin zuvor beschriebener CAV Stamm bereitgestellt, der in Lebendform ist.
Natürlich stellt die vorliegende Erfindung auch einen CAV Stamm in inaktivierter Form bereit. Der inaktivierte CAV Stamm kann als Basis für einen inaktivierten Impfstoff, der insbesondere für eine Impfung von Fleischhühnern geeignet ist, verwendet werden.
Ein CAV gemäss der vorliegenden Erfindung kann ebenso von Truthähnen im Feld isoliert werden. Kurz gesagt kann eine serologische Untersuchung von Truthahn-Seren, die von Truthahngruppen gesammelt wurden, durchgeführt werden, um Serumproben zu identifizieren, die ein CAV in einem Standard Virus Neutralisationstest neutralisieren können. Ein Beispiel solch einer Untersuchung ist in Farkas et al. (1998, supra) geschildert. Anschliessend kann das CAV von den Organen der Truthähne gemäss der Beschreibung in Beispiel 1 isoliert werden. Schlussendlich kann ein CAV gemäss der vorliegenden Erfindung durch Untersuchung der Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper R2 identifiziert werden.
Falls erwünscht können die hierin zuvor charakterisierten CAVs mit niedriger Pathogenität den embryonierten Eiern durch Passagieren dieser CAVs in embryonierten Eiern angepasst werden, sodass die erhaltenen Viren bis zu hohen Titern in embryonierten Eiern wachsen können. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 533 294 offenbart, dass die Fähigkeit eines CAV im Embryo Läsionen zu induzieren mit einem Wachstumsvorteil assoziiert ist und beschreibt ferner wie solche Viren erhalten werden können. Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung ebenso CAVs des oben er wähnten Typs bereit, die zusätzlich die Eigenschaft besitzen, Läsionen in Hühnerembryos hervorzurufen. Solche CAVs sind für eine in ovo Impfung von Embryos im Alter von 17 Tagen und älter oder eine Impfung von Hühnern nach dem Schlüpfen im Alter von einem Tag oder älter geeignet.
Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt einen Impfstoff zur Verwendung beim Schutz von Geflügel gegen sowohl klinische wie auch subklinische Krankheitszustände, die von einer CAV Infektion herrühren, bereit, umfassend ein CAV gemäss der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Das CAV gemäss der vorliegenden Erfindung kann als lebendes oder inaktiviertes Virus in einen Impfstoff eingebaut werden. Die niedrige Pathogenität der vorliegenden CAVs macht diese Viren jedoch besonders geeignet zum Einbau eines lebenden CAV Impfstoffes.
Ein Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung kann mittels konventioneller Verfahren, die zum Beispiel gewöhnlich für die kommerziell erhältlichen CAV Impfstoffe verwendet werden, hergestellt werden. Die Herstellung von Veterinär Impfstoffzusammensetzungen ist ebenso in "Handbuch der Schutzimpfungen in der Tiermedizin" (Hrsg.: Mayr, A. et al., Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, Germany, 1984) und "Vaccines for Veterinary Applications" (Hrsg.: Peters, A. R. et al., Butterworth-Heinemann Ltd, 1993) beschrieben.
Kurz gesagt wird ein geeignetes Substrat mit einem lebenden CAV gemäss der vorliegenden Erfindung inokuliert und propagiert bis sich das Virus zu einem erwünschten infektiösen Titer oder einem Gehalt an antigener Masse repliziert hat, wonach das CAV enthaltende Material gesammelt wird und zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit prophylaktischer Aktivität formuliert wird.
Jedes Substrat, das fähig ist die Replikation des oben definierten CAV zu unterstützen, kann zur Herstellung eines Impfstoffes gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geeignete Substrate umfassen Zellkulturen, wie zum Beispiel MDCC-MSB1 Zellen, Hühnerembryonen und Hühner für eine in vivo Impfstoff Herstellung.
Zur Herstellung auf Zellkultur wird das Virus im allgemeinen nach Inokulation der Zellen für 3–10 Tage propagiert, wonach der Zellkultur Überstand gesammelt wird und falls erwünscht gefiltert oder zentrifugiert wird, um Zellablagerungen zu entfernen.
Andrerseits kann das CAV gemäss der vorliegenden Erfindung in embryonierten Hühnereiern propagiert werden und anschliessend kann das CAV Material mittels Routineverfahren wie zum Beispiel in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 533 294 beschrieben geerntet werden.
Der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung enthaltend das lebende CAV kann in Form einer (gefrorenen) Suspension oder in einer lyophilisierten Form hergestellt und vertrieben werden. Der Impfstoff enthält zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, die gewöhnlich für solche Zusammensetzungen verwendet werden. Träger umfassen Stabilisatoren, Konservierungsmittel und Puffer. Geeignete Stabilisatoren sind zum Beispiel SPGA, Carbohydrate (wie zum Beispiel Sorbitol, Mannitol, Stärke, Sucrose, Dextran, Glutamat oder Glukose), Proteine (wie zum Beispiel getrocknetes Milchserum, Albumin oder Casein) oder Abbauprodukte davon. Geeignete Puffer sind zum Beispiel Alkalimetallphosphate. Geeignete Konservierungsstoffe sind Thimerosal, Merthiolat und Gentamycin. Verdünnungsmittel umfassen Wasser, wässrige Puffer (wie zum Beispiel gepufferte Salzlösung), Alkohole und Polyole (wie zum Beispiel Glycerol).
Falls erwünscht können die Lebendimpfstoffe gemäss der vor liegenden Erfindung ein Adjuvans enthalten. Bespiele geeigneter Verbindungen und Zusammensetzungen mit Adjuvans Aktivität sind dieselben wie im folgenden für die Herstellung von inaktivierten Impfstoffe erwähnt.
Obwohl eine Verabreichung mittels Injektion, z.B. intramuskulär, subkutan des Lebendimpfstoffes gemäss der vorliegenden Erfindung möglich ist, wird der Lebendimpfstoff vorzugsweise mittels der zur Geflügelimpfung gewöhnlich verwendeten, preiswerten Massenanwendungsverfahren verabreicht. Diese Verfahren umfassen Trinkwasser- und Spray-Impfung.
Alternative Verfahren zur Verabreichung des Lebendimpfstoffes umfassen eine Verabreichung in ovo, mittels Augentropfen und Schnabeleintauchen.
Da die vorliegende Erfindung CAVs bereitstellt, die im wesentlichen bei Verabreichung in ovo im letzten Quartal der Inkubationsperiode nicht-pathogen sind, ist eine besonders vorteilhafte Verabreichungsroute eines Impfstoffs gemäss der vorliegenden Erfindung die in ovo Verabreichung.
Im allgemeinen wird der Impfstoff während der späten Phasen der Embryonierung, im allgemeinen während des letzten Quartals der Inkubationsperiode (Tag 15–21), vorzugsweise am 18. Tag der Inkubationsperiode in die embryonierten Eier injiziert.
Der Injektionsmechanismus der inkubierten Eier ist nicht besonders kritisch, vorausgesetzt dass er Gewebe und Organe des Embryos nicht unnötig beschädigt. Zum Beispiel wird mit einer an der Spritze befestigten Nadel (1–1½ Inch, ungefähr 22 Gauge) ein kleines Loch in das dicke Ende der Hülle gebohrt und der Impfstoff wird unter die innere Hüllenmembran und die Chorioallantoismembran injiziert. Anschliessend werden die geimpften embryonierten Eier zum Schlüpfen in einen Inkubator transferiert (US Patent Nr. 4,458,630, 5,427,791, WO 98156413 and WO 95135121). Vorzugsweise wird der gesamte Embryo-Impfprozess unter Verwendung automatisierter Impfsysteme, wie zum Beispiel dem kommer ziell erhältlichen Inovoject^®, durchgeführt.
In einer weiteren Variante stellt die vorliegende Erfindung einen Impfstoff gegen Krankheitszustände, die von einer CAV Infektion herrühren, umfassend das CAV in aktivierter Form dar. Der Vorteil eines inaktivierten Impfstoffes sind die erhöhten Werte an schützenden Antikörpern von langer Beständigkeit die erhalten werden können. Diese Eigenschaft macht einen solchen inaktivierten Impfstoff insbesondere geeignet für eine Impfung von Fleischhühnern. Die Herstellung eines inaktivierten CAV Impfstoffes gemäss der vorliegenden Erfindung kann mittels in Fachkreisen wohlbekannten Routineverfahren (wie zum Beispiel in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 533 294 beschrieben) erhalten werden.
Ein Impfstoff enthaltend das inaktivierte CAV kann zum Beispiel einen oder mehrere der oben erwähnten pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, die zu diesem Zweck geeignet sind, enthalten.
Vorzugsweise umfasst ein inaktivierter Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere Verbindungen mit Adjuvans Aktivität. Für diesen Zweck geeignete Verbindungen oder Zusammensetzungen umfassen Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionen basierend auf, zum Beispiel einem Mineralöl wie Bayol F^® oder Marcol 52^®, oder ein Pflanzenöl wie zum Beispiel Vitamin E Acetat, sowie Saponine.
Inaktivierte Impfstoffe werden im allgemeinen parenteral, z.B. intramuskulär oder subkutan, verabreicht.
Der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst eine effektive Dosierung des hierin zuvor definierten CAV als aktive Komponente, d.h. eine Menge an immunisierendem CAV Material, die in geimpften Vögeln oder deren Nachkommenschaft gegen einen Challenge mit einem virulenten Virus Immunität hervorrufen wird. Immunität wird hierin als die Induktion eines bedeutend höheren Masses an Schutz in einer Vogelpopulation nach Impfung verglichen mit einer ungeimpften Gruppe definiert.
Typischerweise kann der erfindungsgemässe Lebendimpfstoff in einer Dosis von 10²–10⁹ TCID₅₀ pro Vogel, vorzugsweise in einer Dosis zwischen 10²–10⁶ TCID₅₀ verabreicht werden und ein inaktivierter Impfstoff kann das antigene Äquivalent von 10⁴–10¹⁰ TCID₅₀ pro Vogel enthalten.
Obwohl der CAV Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung wirksam in Hühnern verwendet werden kann, kann ebenso anderes Geflügel wie zum Beispiel Truthähne und Wachteln erfolgreich mit dem Impfstoff geimpft werden. Hühner umfassen Fleischhühner, Zuchthennen und Legehennen.
Da die klinischen und subklinischen Krankheitszustände, die von einer CAV Infektion herrühren, primär in jungen Hühnern, insbesondere in Fleischhühnern, beobachtet wurden, stellt die vorliegende Erfindung vorzugsweise einen Impfstoff zur Verwendung beim Schutz von Fleischhühnern gegen durch CAV induzierte Krankheitszustände bereit.
Das Alter der Tiere, die einen lebenden oder inaktivierten Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung erhalten, kann dasselbe sein wie das der Tiere, die die zur Zeit bekannten CAV Impfstoffe erhalten. Zusätzlich erlaubt der niedrige pathogene Charakter der CAVs gemäss der vorliegenden Erfindung die Verabreichung des CAV Impfstoffes an junge Vögel, d.h. in einem Alter von weniger als zwei Wochen, insbesondere an ein Tage alte Vögel oder sogar an Embryos mittels der in ovo Route im letzten Quartal der Inkubationsperiode. Zum Beispiel können junge Vögel, z.B. Fleischhühner, vom Alter von einem Tag an direkt mit dem Lebendimpfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung geimpft werden, um eine subklinische Erkrankung, die von einer horizontalen Übertragung von CAV herrührt, zu verhindern. Eine Impfung des Elternbestandes, wie zum Beispiel Zucht-Fleischhühner, kann mit tels einem lebenden oder inaktivierten Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung oder mittels eines Protokolls umfassend eine Kombination beider Impfstoffe vorgenommen werden. Der Vorteil dieser Arten von Immunisierungsprogrammen umfasst den umgehenden Schutz von ein Tag alter Nachkommenschaft, der durch mütterlich hergeleitete Antikörper, die vertikal an die jungen Vögel übertragen werden, bereitgestellt wird. Ein typisches Zucht-Impfprogramm umfasst die Impfung von Fleischhühnern von einem Alter von 6 Wochen an mit einem Lebendimpfstoff oder die Impfung in einem Alter von zwischen 14–18 Wochen mit einem inaktivierten Impfstoff.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso einen Kombinationsimpfstoff bereit umfassend zusätzlich zu dem CAV gemäss der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere Impfstoffkomponenten anderer Pathogene, die für Geflügel infektiös sind.
Vorzugsweise umfasst der Kombinationsimpfstoff einen oder mehrere (inaktivierte) Impfstoffstämme des Virus der Marek'schen Krankheit (MDV), des Infektiösen Bronchitis-Virus (IBV), des Newcastle Disease Virus (NDV), des infektiösen Bursitis-Virus (IBDV), des Fowl Adenovirus (FAV), des EDS Virus, des Rhinotracheitisvirus des Truthahns (TRTV), des infektiösen Laryngotracheitis Virus (ILTV) und des Reovirus.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen lebenden Kombinationsimpfstoff bereit umfassend einen CAV gemäss der vorliegenden Erfindung und einen MDV Impfstoffstamm, wie zum Beispiel HVT. Dieser Kombinationsimpfstoff kann von Vorteil für eine in ovo Impfung verwendet werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Isolierung und in vitro Identifizierung der CAV Stämme mit niedriger Pathogenität
A
Die CAV Stämme wurden von Organen isoliert, die von verschiedenen Truthähnen gemäss des folgenden Verfahrens hergeleitet wurden:
Die Organe wurden homogenisiert und für 15 Minuten bei 3000 G zentrifugiert. Der Überstand wurde zu MDCC-MSB1 Zellen gegeben und anschliessend wurden die Suspensionen bei +37°C inkubiert. Nach 2–3 Tagen Inkubation wurden die Zellen mikroskopisch untersucht und anschliessend subkultiviert. Dieses Verfahren wurde wiederholt bis der für das CAV charakteristische zytopathische Effekt (CPE) auftrat. Wenn der für das CAV charakteristische CPE vorhanden war wurde die Suspension für 15 Minuten bei 3000 G zentrifugiert und anschliessend wurde der Überstand geerntet und bei –70°C aufbewahrt. Nachfolgende Passagen wurden gemäss desselben Verfahrens durchgeführt.
Die CAV Hühner Isolate wurden ebenfalls in MDCC-MSB1 Zellen gemäss des hierin zuvor aufgeführten Verfahrens multipliziert.
Eine weitere Gruppe von CAV Stämmen gemäss der vorliegenden Erfindung wurde auf ähnliche Wiese von Truthähnen, die aus unbekannten Gründen deprimiert waren, isoliert. Nach Ankunft wurden die Truthähne geopfert und deren Leber wurden entfernt. Im Laboratorium wurde ein gleiches Volumen an RPMI 1640 Medium hinzu gegeben und anschliessend wurde unter Verwendung eines Ultra Turrax ein 50% Leberhomogenat hergestellt. Nach Zentrifugation für 10 mMInuten bei 4000 G wurde der Überstand durch einen 15 μm Filter geerntet. Der Überstand wurde bis zu seiner Verwendung für die Virus Rückgewinnungsversuche bei –70°C aufbewahrt.
Für die Virus Rückgewinnungsversuche wurden 0.2 ml von jedem der Leber-Überstände zu 30 ml RPMI 1640 Medium (5% FCS) enthaltend 3 × 10⁵ MDCC-MSB1 Zellen pro ml hinzugegeben. Nach Inkubation für 2 oder 3 Tage bei +37°C (5% CO₂) wurden die MDCC-MSB1 Zellen mikroskopisch auf die Anwesenheit von für das CAV charakteristische CPE untersucht (grosse geschwollene Zellen mit einem klaren Zytoplasma). Bei Abwesenheit des für das CAV charakteristische CPE wurden die Zellen durch Zugabe von 5 ml der MDCC-MSB1 Zellsuspension zu 25 ml frischem RPMI 1640 Medium (5% FCS) subkultiviert. Anschliessend wurden die Zellsuspensionen wiederum für 2 oder 3 Tage bei +37°C (5% CO₂) inkubiert. Die MDCC-MSB1 Zellsuspensionen wurden bis zu 10 mal oder bis das für das CAV charakteristische CPE beobachtet wurde subkultiviert.
Wenn das für das CAV charakteristische CPE beobachtet wurde, wurde die Zell-Virus-Suspension geerntet und für 10 Minuten bei 4000 G zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und bis zu weiterer Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
B
In einem anschiessenden Experiment wurde untersucht, ob die CAV Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung von den (bekannten) Hühner CAV Stämmen und anderen Truthahn Stämmen mittels des Virus Neutralisisationstests unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers R2, positivem und negativem polyklonalen Hühnerserum gegen CAV unterschieden werden konnten.
Materialien und Methoden
CAV Stämme

CAV Hühnerstamm 26P4 (Wildtyp und attenuiert): EP Patent Anmeldung Nr. 0 533 294
CAV Hühnerstamm Gifu (Wildtyp und attenuiert): EP Patent Anmeldung Nr. 0 533 294
CAV Hühnerstamm Angstrom: Angstrom et al., Avian Path. 17, 23–32, 1988
CAV Hühnerstamm Cux: von Bülow et al., Zentralbl. Veterinarmed. 30, 742–750, 1983
CAV Hühnerstamm Clone-1: Lamichane et al., Avian Dis. 35, 515–522, 1991
CAV Hühnerstamm: Holland Isolat, Referenzstamm
CAV Truthahnstämme 18938, SP6198, 18933, 17382, 319, 3571, 3533, 3527, 3570, 3572, 18012, 18936, 18010 and 18941.

Antikörper gegen CAV

Moab R2
Positives CAV Serum
Negatives CAV Serum

Virus Neutralisationstest
Beginnend mit mindestens einer 1:16 Verdünnung wurden zweifache Serienverdünnungen der Moab Referenzprobe in einer Mikrotiterplatte in Gewebekulturmedium (RPMI 1640 + 5% FCS) durchgeführt, um 50 μl von jeder Verdünnung zu erhalten (ein positives und ein negatives Referenzserum wurde unter Verwendung derselben Verdünnungen mit eingeschlossen). Anschliessend wurde ein gleiches Volumen von jeder CAV Suspension zu jeder Moab R2 Verdünnung hinzugegeben.
Um gleichzeitig den Titer der CAV Infektiosität im Neutralisationstest zu überwachen, wurde die CAV Gebrauchsverdünnung titriert. Demzufolge wurden zehnfache Serienverdünnungen (10^–1 bis 10^–4) von jeder CAV Gebrauchsverdünnung in Röhrchen ausser halb der Mikrotiterplatte hergestellt. Anschliessend wurden 50 μl von jeder Verdünnung zwölffach in eine Mikrotiterplatte transferiert. Weitere zwölf Vertiefungen dergleichen Mikrotiterplatte wurden mit 100 μl Gewebekulturmedium gefüllt, um als negative Kontrolle zu dienen. Anschliessend wurden 50 μl des Gewebekulturmedium zu den Virus Verdünnungen hinzugegeben. Die Virus-Moab Gemische und Virusverdünnungen der Titration wurden dann über Nacht bei +4°C inkubiert. Anschliessend wurden 100 μl einer MDCC-MSB1 Zellsuspension enthaltend 6 × 10⁵ Zellen zu den Virus-Moab Gemischen und den Virusverdünnungen und der Kontrolle hinzugegeben. Die Mikrotiterplatten wurden dann in einen Inkubator (+37°C, 5% CO₂) transferiert.
Nach Inkubation von zwei bis drei Tagen bei +37°C wurden die in der Titration mit eingeschlossenen Zellen auf Anwesenheit eines für das CAV charakteristischen, zytopathischen Effektes (CPE) untersucht. Wenn die Titration ergab, dass weniger als 300 bis 1000 TCID₅₀ des CAV pro 50 μl vorhanden sind, wurden die im Neutralisationstest und der Titration mit eingeschlossenen Zellen subkultiviert und nochmals für zwei bis drei Tage bei +37°C inkubiert. Dieses Vorgehen von Inkubation und Subkultivation der Zellen wurde durchgeführt bis ein CAV Titer von 300 bis 1000 TCID₅₀ pro 50 μl in der Titration erhalten wurde. Die CAV Titer wurden gemäss der Methode von Reed und Muench (The American Journal of Hygiene, 27, 493–497, 1937) berechnet.
Die Antikörper Titer wurden bestimmt, in dem die zu den Virus-Moab Gemischen hinzugegebenen Zellen auf die Anwesenheit von für das CAV charakteristischem CPE untersucht wurden. Der Antikörper Titer (log₂) wird als Kehrwert der höchsten Verdünnung der Moab R2 Referenzprobe, bei welcher die CAV Stämme vollständig neutralisiert wurden, d.h. kein für das CAV charakteristisches CPE beobachtet wurde, ausgedrückt. Wenn der Antikörper Titer der Moab R2 Referenzprobe < 5 (log₂) ist, wurde der spezifische CAV Stamm als nicht durch Moab R2 neutralisiert erachtet.
Resultate Tabelle 1: Log₂ Antikörper Titer gemäss VN Test bestimmt
Schlussfolgerung
Der Virus-Neutralisationstest ergab, dass eine Gruppe von CAV Truthahnstämmen, die eine niedrige Pathogenität für Hühner aufweisen, von attentuierten und pathogenen CAV Hühnerisolaten und pathogenen Truthahnisolaten unterschieden werden kann (Tabelle 1). Der Moab R2 neutralisiert nur die wenig pathogenen, von Truthähnen isolierten CAV Stämme, während er weder die pathogenen Truthahnisolate noch jegliche der bekannten Hühnerstämme neutralisierte. Die Resultate der Pathogenitätsexperimente sind in Beispiel 2 wiedergegeben.
Beispiel 2
In vivo Charakterisierung der CAV Stämme mit niedriger Pathogenität
A
In diesem Experiment wurden die CAV Isolate auf ihre Pathogenität in SPF Hühnern untersucht. Die Pathogenität der CAV Isolate wurde mittels makroskopischer Untersuchung des Thymus und Knochenmarks sowie mittels Bestimmung des Hämatokrit (Ht) Wertes bestimmt.
Experimentelles Design
Ein Tag alte SPF Küken wurden intramuskulär mit 10⁶⁰ TCID₅₀ von einem der CAV Isolate inokuliert. Eine Gruppe der Küken wurde nicht inokuliert, um als Kontrolle zu dienen. Im Alter von 14 Tagen wurde von jeder Gruppe eine Anzahl Küken entfernt. Blutproben wurden zur Bestimmung des Ht Wertes gesammelt. Der Thymus und das Knochenmark wurden makroskopisch untersucht. Die restlichen Küken wurden bis zum Alter von vier Wochen behalten. Vor Beginn des Experimentes und im Alter von vier Wochen wurden Blutproben gesammelt.
Die Seren wurden auf Abwesenheit/Anwesenheit von CAV Antikörpern mittels eines hierin zuvor beschriebenen Virus-Neutralisationstests untersucht.
Der effektive Titer der Infektiosität der für die Inokulation verwendeten Zubereitungen wurde mittels Titration auf MDCC-MSB 1 Zellen gemäss Standardverfahren bestimmt. Die Virus-Zellsuspensionen wurden alle 2 bis 3 Tage bis zu 10 mal subkultiviert. Anschliessend wurde der Endpunkt mittels mikroskopischer Untersuchung der Zellen auf für das CAV charakteristische CPE bestimmt. Der Titer wurde gemäss der Methode von Reed und Muench (1937, supra) berechnet.
Resultate
Die Resultate der makroskopischen Untersuchung und der Hämatokrit Bestimmung sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Die Resultate der Serologie sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Keine CAV Antikörper konnten in den von 10 ein Tag alten Schlüpfgenossen hergeleiteten Seren nachgewiesen werden. Ebenso konnten keine CAV Antikörper in den von vier Wochen alten Kontrollhühner hergeleiteten Seren nachgewiesen werden. Tabelle 2: Resultate der makroskopischen Untersuchung und Hämatokrit Bestimmung
Tabelle 3: Serologie Untersuchungsresultate

(): = Standardabweichung
n.d.: = nicht bestimmt

Schlussfolgerung
Die in diesem Experiment erhaltenen Resultate zeigen, dass die CAV Stämme gemäss der Erfindung im Vergleich zu den von Hühnern oder anderen Truthahnstämmen hergeleiteten CAV Stämmen eine reduzierte Pathogenität für Hühner aufweisen.
B
In diesem Experiment wurde untersucht, ob die von Truthähnen isolierten CAV Stämme für das CAV charakteristische Embryo Läsionen hervorrufen. Die europäische Patentanmeldung Nr. 0 533 294 offenbart attenuierte CAVs mit reduzierter Virulenz für Hühner. Diese vorteilhafte Eigenschaft ist mit der Eigenschaft dieser Viren des Stands der Technik in embryonierten Eiern Läsionen hervorzurufen assoziiert.
Experimentelles Design
Dreissig befruchtete SPF Eier wurden je mit 0.2 ml von jedem CAV Stamm mittels der Dottersack Route inokuliert. Das Inokulum Volumen enthielt einen Infektiositätstiter von 10^6.0 TCID₅₀. Als positive Kontrolle wurden 30 befruchtete SPF Eier mit dem attenuierten CAV 26P4 Stamm, einem Stamm der dafür bekannt ist Embryoläsionen hervorzurufen, inokuliert. Dreissig befruchtete SPF Eier, die nicht inokuliert wurden, wurden als negative Kontrolle mit eingeschlossen. Anschliessend wurden die Eier in einem Ei-Inkubator bei +37°C inkubiert. vom Tag 7 des Embryolebens an wurden die Eier täglich durchleuchtet. Der Tod eines Embryos, der vor 10 Tagen Embryolebens eintrat wurde nicht als durch CAV verursacht betrachtet und demzufolge wurden diese Eier entsorgt. Der Tod eines Embryos, der vom Tag 11 des Embryolebens an eintrat, wurde als durch CAV verursacht betrachtet und demzufolge wurden diese Eier gesammelt und makroskopisch auf die Anwesen heit von durch CAV verursachte Läsionen untersucht. Am Tage 17 des Embryolebens wurden alle restlichen Embryos gesammelt und makroskopisch auf die Anwesenheit von durch CAV verursachte Läsionen untersucht.
Resultate
Der Tod der Embryos ist in Tabelle 4 wiedergegeben.
Tabelle 4: Embryo Mortalität
Makroskopische Untersuchung:
CAV Stamm 319
Das Embryo das am Tage 14 des Embryolebens starb zeigte keine für CAV charakteristische Läsionen. Nach makroskopischer Untersuchung der vierzehn überlebenden 17-Tage-alten Embryos wurden ebenfalls keine für CAV charakteristische Läsionen beobachtet.
CAV Stamm 18933
Nach makroskopischer Untersuchung der vierzehn überlebenden 17-Tage-alte Embryos wurden keine für CAV charakteristische Läsionen beobachtet.
CAV Stamm 18938
Das Embryo das am Tage 14 des Embryolebens starb zeigte keine für CAV charakteristische Läsionen. Nach makroskopischer Untersuchung der dreizehn überlebenden 17-Tage-alte Embryos wurden ebenfalls keine für CAV charakteristische Läsionen beobachtet.
CAV 26P4 (attenuiert)
Die Embryonen die an den Tagen 14, 15 und 17 des Embryolebens starben zeigten keine für CAV charakteristische Läsionen. Nach makroskopischer Untersuchung der zwölf überlebenden 17-Tage-alte Embryos wurden in sechs Embryos für CAV charakteristische Läsionen beobachtet.
Schlussfolgerung
Von diesem Experiment kann geschlossen werden, dass die natürlich vorkommenden, von Truthähnen isolierten CAV Stämme keine Embryoläsionen hervorrufen.
Beispiel 3
In ovo Impfung
Experimentelles Design
Sechzig 18-Tage-alte embryonierte SPF Eier wurden in ovo mit 0.2 ml von entweder dem kommerziell erhältlichen CAV Impfstoff Nobilis Stamm P4^® ( EP 0533294 ), dem CAV Stamm 319 oder Embryohomogenat, das von embryonierten SPF Eiern erhalten wurde inokuliert. Ein berechneter Titer der Infektiosität von 10³⁰ TCID₅₀ wurde pro Ei inokuliert. Nach Inokulation wurden die Eier zu einem Schlüpfinkubator transferiert und nach dem Schlüpfen wurden die Küken in Negativdruck Isolatoren untergebracht.
Im Alter von 7, 14 und 21 Tagen wurden jeweils 5 Hühner von jeder Gruppe entfernt. Blutproben wurden vor Bestimmung der Hämatokrit Werte gesammelt. Anschliessend wurden die Hühner für eine Post mortem Untersuchung geopfert. Bei der post mortem Untersuchung wurde der Thymus und das Knochenmark makroskopisch untersucht.
Im Alter von 6 und 8 Wochen wurden Blutproben von einer Zahl Hühner in jeder Gruppe gesammelt und die Seren wurden auf die Anwesenheit/Abwesenheit von CAV Antikörpern untersucht.
Für einen Zeitraum von acht Wochen nach dem Schlüpfen wurden die Hühner täglich auf das Vorkommen klinischer Anzeichen von Erkrankung oder Mortalität untersucht.
Materialien und Methoden
Virus Titration
Die effektiven inokulierten Infektiositätstiter wurden mittels Titration in MDCC-MSB1 Zellen gemäss hierein zuvor beschriebenen Standardverfahren bestimmt.
Hämatokrit Bestimmung
Peripherale Blutproben wurden in zweifacher Ausführung in heparinisierten Mikrohämatokrit Kapillarröhrchen gesammelt. Nach Zentrifugation für 10 Minuten bei 15000 g wurden die Hämatokrit Werte bestimmt. Anschliessend wurde der mittlere Ht Wert für jedes Huhn berechnet. Hühner mit Werten unter 27% wurden als anä misch betrachtet.
Makroskopische Untersuchung
Nach makroskopischer Untersuchung wurde der Prozentsatz an betroffenen Tieren mit Atrophie des Thymus und Blässe des Knochenmarks bestimmt.
Beobachtungen auf klinische Anzeichen von Erkrankung
Während des ganzen Experimentes wurden alle Hühner täglich auf das Vorkommen von klinischen Anzeichen von Erkrankung oder Mortalität beobachtet.
Serologie
Serumproben wurden unter Verwendung eines kompetitiven Enzymgebundenen-Immunosorbent-Assays (ELISA) mit einem Festphasegebundenen CAV Antigen, einem CAV-spezifischen biotinylierten monoklonalen Antikörper und an Avidin gekuppeltem HRP auf die Anwesenheit/Abwesenheit von CAV Antikörpern untersucht. Die Antikörpertiter (log₂) waren der Kehrwert der höchsten Serumverdünnung bei welcher der biotinylierte Antikörper nicht maximal band. Serumproben mit Titern von < 5 (log₂) wurden als negativ für CAV Antikörper betrachtet.
In ovo Inokulierung
Das glatte Ende von 18 Tag alten embryonierten SPF Eiern wurde mit einer Iod Lösung abgetupft um die Oberfläche zu desinfizieren. Anschliessend wurde mittels eines sogenannten Eierbohrers ein Loch in die Eierschale gebohrt. Die Eier wurden dann mit einer der Virusverdünnungen unter Verwendung von Discardit 1.0 ml Spritzen und Microlance Orange 0.6 × 25 Nadeln inokuliert. Vor dem Transferieren der Eier in einen Schlüpfinkubator wurden die Löcher mit Paraffin versiegelt.
Resultate
Infektiositäts-Titration
Die effektiven Infektiositätstiter, die in den Inokula gefunden wurden sind im folgenden aufgeführt:

CAV Impfstoff Nobilis Stamm P4: 10¹⁹ TCID₅₀ pro Ei

CAV Stamm 319: 10²⁹ TCID₅₀ pro Ei
Makroskopische Untersuchungsresultate
Die bei der makroskopischen Untersuchung erhaltenen mittleren Werte sind in Tabelle 5 angegeben.
CAV Impfstoff Nobilis Stamm P4
Im Alter von 7 und 21 Tagen wurden keine Veränderungen des Thymus beobachtet. Im Alter von 14 Tagen zeigten drei Hühner eine leichte Atrophie des Thymus und zwei Hühner zeigten eine moderate Atrophie des Thymus. Im Alter von 7, 14 und 21 Tagen wurden keine Veränderungen des Knochenmarks beobachtet.
CAV Stamm 319
Im Alter von 7, 14 und 21 Tagen wurden keine Veränderungen weder des Thymus noch des Knochenmarks beobachtet.
Negatives Embryo Homogenat
Im Alter von 7, 14 und 21 Tagen wurden keine Veränderungen weder des Thymus noch des Knochenmarks beobachtet.
Bestimmung der Hämatokrit Werte
Die im Alter von 7, 14 und 21 Tagen bestimmten Hämatokrit Werte sind in Tabelle 6 wiedergegeben.
Alle bestimmten Hämatokrit Werte lagen über 27%.
Serologie
Die mittleren CAV Antikörpertiter sind in Tabelle 7 wiedergegeben.
CAV Impfstoff Nobilis Stamm P4
Im Alter von sechs Wochen wurden in 15 von 17 Seren CAV Antikörper nachgewiesen. Im Alter von acht Wochen reagierten alle siebzehn Hühner auf CAV.
CAV Stamm 319
Im Alter von sechs Wochen wurden in 17 von 18 Seren CAV Antikörper nachgewiesen. Im Alter von acht Wochen reagierten alle achtzehn Hühner auf CAV.
Negatives Embryo Homogenat
Im Alter von sechs und acht Wochen konnten in allen untersuchten Seren keine CAV Antikörper nachgewiesen werden.
Beobachtungen auf klinische Anzeichen von Erkrankung
Während des Experimentes wurden keine klinischen Anzeichen von Erkrankung oder Mortalität in den mit dem Stamm P4, Stamm 319 oder negativen Embryohomogenat inokulierten Hühnern beobachtet.
Diskussion
Nach der Inokulation von 18 Tage alten embryonierten Eiern mit dem CAV Stamm P4 oder dem CAV Stamm 319, wurden während des ganzen Experimentes keine klinischen Anzeichen von Erkrankung oder Mortalität beobachtet. Die Bestimmung der Hämatokrit Werte zeigte, dass keines der Hühner anämisch war.
Die serologische Untersuchung zeigte dass die Mehrheit der mit dem CAV Stamm 319 oder dem CAV Stamm P4 inokulierten Hühner im Alter von sechs Wochen zu CAV serokonvertierten.
Die makroskopische Untersuchung ergab dass der CAV Stamm P4 nur im Alter von 14 Tagen eine gewisse leicht bis moderate Thymus Atrophie hervorrief. Der CAV Stamm P4 rief jedoch keine Veränderungen des Knochenmarks hervor. Die makroskopische Untersuchung ergab zudem dass der CAV Stamm 319 keine Veränderungen des Thymus und des Knochenmarks hervorrief.
Schlussfolgerung
Von diesem Experiment kann geschlossen werden, dass nach einer in ovo Inokulierung von 18 Tage alten embryonierten SPF Eiern der CAV Stamm 319 für Hühner weniger pathogen ist als der attenuierte CAV Impfstoff Nobilis Stamm P4. Tabelle 5: Resultate der makroskopischen Untersuchung
Tabelle 6: Hämatokrit Werte

n.d.: = nicht durchgeführt da alle Hämatokrit Röhrchen während der Zentrfugation zerbrachen
(): = Standardabweichung

(): = Standardabweichung

Claims

Hühneranämie-Virus (CAV), dadurch gekennzeichnet, dass das Virus durch eine Referenzprobe umfassend den monoklonalen Antkörper R2, der durch eine Hybridoma Zelllinie ausgeschieden wird, von der eine Probe bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer 00020304 hinterlegt ist, neutralisiert wird.
CAV gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus in lebender Form ist.
CAV gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Titer der Referenzprobe gegen CAV mindestens 10 (log₂) pro 50 μl, mehr bevorzugt mindestens 12 (log₂) pro 50 μl oder sogar mindestens 14 (log₂) pro 50 μl beträgt bei Untersuchung gegen 300–1000 TCID₅₀ pro 50 μl des CAV.
CAV gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Titer der Referenzprobe gegen CAV mindestens 16 (log₂) pro 50 μl beträgt bei Untersuchung gegen 300–1000 TCID₅₀ pro 50 μl des CAV.
CAV gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es den CAV Stamm 319 darstellt, von dem eine Probe bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer 00012608 hinterlegt ist.
Ein Impfstoff zum Schutz von Geflügel gegen Krankheitszustände, die von einer CAV Infektion herrühren, umfassend ein CAV gemäss Ansprüchen 1–5 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Impfstoff gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff ferner ein Adjuvans umfasst.
Impfstoff gemäss Ansprüchen 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff ferner einen oder mehrere Impfstoffkomponenten anderer Pathogene, die für Geflügel infektiös sind, umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines CAV gemäss Ansprüchen 1–5 umfassend die Schritte von a. Inokulieren eines anfälligen Substrates mit dem CAV, b. Propagieren des Virus, und c. Sammeln des CAV enthaltenden Materials.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zum Schutz von Geflügel gegen Krankheitszustände, die von einer CAV Infektion herrühren, umfassend das Kombinieren des gesammelten, mittels des Verfahrens gemäss Anspruch 9 erhaltenen CAV, falls erwünscht nach Inaktivierung des CAV, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Verwendung eines CAV gemäss Ansprüchen 1–5 in der Herstellung eines Impfstoffes für eine in ovo Verabreichung.
Verwendung eines CAV gemäss Ansprüchen 1–5 in der Herstellung eines Impfstoffes für eine parenterale Verabreichung an ein Tage alte Küken.