ES2252143T3 - Virus de la anemia del pollo de baja patogenidad. - Google Patents
Virus de la anemia del pollo de baja patogenidad.Info
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Abstract
Un virus de la anemia del pollo (CAV), que se caracteriza porque el virus es neutralizado por una muestra de referencia que comprende el anticuerpo monoclonal R2 secretado por una línea celular de hibridomas, una muestra de la cual está depositada en la ECACC bajo el nº de acceso 00020304.
Description
Virus de la anemia del pollo de baja
patogenicidad.
La presente invención se refiere a un virus de la
anemia del pollo (CAV), a una vacuna que comprende un CAV y un
método para la preparación de una vacuna de CAV.
El virus de la anemia del pollo (CAV) es el
agente causante de una enfermedad conocida como anemia infecciosa
aviar, síndrome de la dermatitis anémica o enfermedad de las alas
azules y fue descrita por vez primera por Yuasa y col. en 1979
(Avian Diseases 23, 366-385, 1979).
La mayoría de los brotes de la enfermedad
inducida por CAV que ocurre de forma natural han sido descritos en
pollos jóvenes. La enfermedad es aguda y los primeros signos tienen
lugar normalmente a los 10-14 días de edad. Esta
enfermedad clínica se caracteriza por un incremento repentino de la
mortalidad, normalmente alrededor del 5-10%, pero
se ha descrito hasta un 60%. El pico de mortalidad tiene lugar
durante los 5 a 6 días siguientes a la aparición de la enfermedad.
Signos clínicos adicionales incluyen depresión y anorexia. Además,
se ha observado en los pollos afectados anemia grave, hemorragias
por todo el cuerpo, atrofia del timo y de la bolsa de Fabricio y
una médula ósea amarillenta (McNulty, Avian Pathol. 20,
187-203, 1991).
El CAV se propaga en los pollos horizontalmente y
verticalmente. Cuando los reproductores ponedores sin exposición
previa al virus resultan infectados, el CAV se transmite
verticalmente a la progenie. No se observan signos clínicos en los
reproductores y no hay un efecto aparente sobre la producción de
huevos, sobre la capacidad de eclosión de los mismos o sobre la
fertilidad. Los pollos de la progenie infectados verticalmente
parecen normales en el momento de la eclosión, pero muestran una
mortalidad incrementada y desarrollan la enfermedad típica
(síndrome de la dermatitis anémica) a partir de los 10 a 14 días de
edad. La propagación horizontal tiene lugar a través del contacto
con pollos infectados verticalmente, con fómites contaminados,
granjas contaminadas, etc. La propagación horizontal a pollos
susceptibles jóvenes, lo cual significa sin anticuerpos hacia CAV
derivados de la madre, puede dar lugar también a la enfermedad
clínica dos semanas más tarde.
Puede controlarse el síndrome de la dermatitis
anémica asegurándose de que las bandadas parentales desarrollen
anticuerpos hacia el CAV antes del inicio de la puesta. Un nivel
elevado de anticuerpos contra el CAV antes del inicio de la
puesta, evitará la transmisión vertical durante la puesta y
proporcionará a la prole anticuerpos derivados de la madre, que son
protectores durante las primeras semanas después de la eclosión
frente a la infección horizontal.
Por tanto, es importante que todas las aves sean
vacunadas con una vacuna de CAV antes del inicio de la puesta.
Los anticuerpos maternos hacia el CAV han
desaparecido normalmente hacia las 3 semanas de edad
aproximadamente. En ese momento pueden tener lugar las infecciones
horizontales. Estas infecciones son normalmente subclínicas, sin
embargo esta infección subclínica está asociada con pérdidas
económicas significativas debido al crecimiento reducido de los
pollos de engorde (McNulty y col., Avian Diseases 35, 263-
268, 1991). La enfermedad subclínica puede ser prevenida vacunando
a los pollos inmediatamente después de la eclosión, preferiblemente
cuando tienen un día de edad.
Existe claramente la necesidad de una vacuna
segura que induzca una protección eficaz contra la enfermedad
clínica y subclínica asociada con la infección por CAV. Como en la
práctica existe la posibilidad de la propagación de los virus
vacuna a bandadas susceptibles de pollos jóvenes, las vacunas vivas
de CAV para la vacunación de las poblaciones parentales deben estar
basadas en CAVs de baja patogenicidad. Además, como los pollos
jóvenes son muy susceptibles a la infección por CAV, las vacunas
vivas para administración directa a pollos jóvenes requieren la
disponibilidad de aislados de CAV de baja patogenicidad que no
afecten de manera adversa a los pollos jóvenes.
Sin embargo, todos los CAVs existentes en la
naturaleza aislados hasta ahora son patógenos para los pollos
jóvenes (McNulty, Avian Pathology 20,
187-203, 1991; Noteborn y Koch, Avian Pathology
24, 11-31, 1995; McNulty, British Poultry
Science 38, 7-13, 1997).
Además, la atenuación de aislados de CAV mediante
pases in vitro en cultivo celular ha dado lugar a
resultados ambiguos. Bulow y Fuchs (J. Vet. Med. B 33,
568-573, 1986) describieron una disminución de la
patogenicidad del aislado Cux-1 después de 12 pases
en células MDCC-MSB1, que fue adicionalmente
reducida después de 100-112 pases adicionales. Sin
embargo, Yuasa (Nat. Inst. Anim. Health Quarterly 23,
13-20, 1983) y Goryo y col. (Avian Pathology
16, 149-163, 1987) no encontraron pruebas de
atenuación cuando aislados de CAV fueron sometidos a 19 y 40 pases
en cultivo celular, respectivamente. Todd y col. (Avian Pathology
24, 171-187, 1995) demostraron la atenuación
del aislado Cux-1 mediante pases (173 veces) en
células MDCC-MSB1, pero se estableció que esta
atenuación no era estable y tuvo lugar una reversión a la
virulencia.
La Solicitud de Patente Europea Nº 0533294
describe aislados de CAV atenuados mediante pases en huevos
embrionados. Estos aislados presentan todavía cierta virulencia
remanente para pollos de un día de edad y, por tanto, no son
particularmente adecuados para vacunar pollos menores de 1 semana de
edad. Además, estos aislados de CAV atenuados inducen lesiones en
los embriones de pollo que hacen que estos virus vacuna sean poco
adecuados para la vacunación in ovo.
El pollo ha sido considerado como el huésped
natural del CAV. No se encontró CAV en un estudio de sueros de
pavo y pato del R.U. y crías de pavo de un día de edad inoculadas
con CAV no mostraron signos clínicos de anemia y no desarrollaron
anticuerpos hacia el virus (McNulty y col., Avian Pathology
17, 315-324, 1988 y McNulty, Avian Pathology
20, 187-203, 1991). Sólo recientemente
Farkas y col. (Avian Pathology 27, 316-320,
1998) informaron que se habían detectado anticuerpos hacia CAV en
una especie distinta del pollo (a saber, en codornices).
Es un objeto de la presente invención
proporcionar CAVs de baja patogenicidad adicionales que puedan ser
utilizados de forma ventajosa para la preparación de una vacuna
viva de CAV, por ejemplo para la vacunación de pollos de
engorde.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar CAVs de baja patogenicidad, en particular CAVs no
patógenos que puedan ser utilizados para vacunar aves muy
susceptibles al CAV, por ejemplo para la vacunación in ovo
o para la vacunación de aves de un día de edad.
Se ha encontrado ahora que estos objetos pueden
ser cumplidos proporcionando un virus de la anemia del pollo
(CAV), caracterizado porque el virus es neutralizado por una muestra
de referencia que comprende el anticuerpo monoclonal R2 secretado
por una línea celular de hibridomas, una muestra de la cual fue
depositada en la European Collection of Animal Cell Cultures
(ECACC), Salisbury, R.U., el 3 de Febrero de 2000 bajo el número de
acceso 00020304.
Sorprendentemente, se ha encontrado que existen
cepas de CAV de baja patogenicidad en la naturaleza. Los CAVs de
acuerdo con esta invención presentan una patogenicidad
significativamente reducida en pollos de un día de edad, si se
compara con la de las cepas de CAV existentes en la naturaleza
descritas hasta ahora, según se determinó por la capacidad del
virus para inducir atrofia del timo, una médula ósea pálida y/o
anemia (Tabla 2). De forma inesperadamente similar, se ha
encontrado que estos CAVs pueden ser aislados de pavos infectados
en el
campo.
campo.
Los CAVs de acuerdo con la invención son
antigénicamente distinguibles de las cepas de CAV conocidas hasta
ahora aisladas de pollos infectados, así como de otras ciertas cepas
de CAV aisladas de pavos.
Los anticuerpos monoclonales (Moabs) son útiles
para identificar características de un agente infeccioso y para
determinar similitudes y diferencias antigénicas entre diferentes
aislados del mismo microorganismo o de microorganismos similares.
En la Tabla 1, se muestra que los CAVs de acuerdo con la presente
invención tienen un patrón de reacción con un Moab que es diferente
del observado con cepas de pollo conocidas o con otras cepas de
pavo con carácter patógeno.
En particular, se ha encontrado que una cepa de
CAV de acuerdo con la invención es un virus que es neutralizado
por una muestra que comprende el Moab R2, en contraste con las cepas
de CAV conocidas aisladas de pollos que no son neutralizadas por
este Moab.
Para examinar si una cepa de CAV es neutralizada
por una muestra que contiene el Moab R2, debe establecerse
primeramente el título de anticuerpos neutralizantes de la muestra
de Moab R2 contra la cepa 319 de CAV depositada en la European
Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury, R.U., el 26
de Enero de 2000 bajo el número de acceso 00012608, en un ensayo de
neutralización de virus según se describe en el Ejemplo 1 más
adelante. Dependiendo del título de anticuerpos, se prepara la
muestra de referencia de Moab R2 mediante dilución o concentración
de la muestra de Moab R2, de tal manera que 50 \mul contengan un
título de anticuerpos de 16 (log_{2}) cuando se examinen frente a
300-1000 DICT_{50} por 50 \mul de cepa 319 de
CAV en un ensayo de neutralización de virus según se describe en el
Ejemplo 1.
Se considera que una cepa de CAV pertenece a la
presente invención cuando es neutralizada específicamente en el
ensayo de neutralización de virus por la muestra de Moab R2 de
referencia. Esto significa que en el ensayo de neutralización de
virus el título de anticuerpos de la muestra de Moab R2 de
referencia es al menos 5 (log_{2}) por 50 \mul cuando se
examina frente a 300-1000 DICT_{50} por 50 \mul
de una cepa de CAV.
En particular, la presente invención proporciona
una cepa de CAV que es neutralizada por diluciones mayores de la
muestra de Moab R2 de referencia. Las cepas de CAV que son
neutralizadas por diluciones mayores de la muestra de Moab R2 de
referencia presentan también una menor patogenicidad para los
pollos. Por tanto, en una realización preferida de la invención, se
proporciona una cepa de CAV que se caracteriza por el hecho de que
el título de anticuerpos de la muestra de Moab R2 de referencia
frente a esa cepa de CAV es al menos
10 (log_{2}) por 50 \mul, más preferiblemente al menos 12 (log_{2}) por 50 \mul o incluso al menos 14 (log_{2}) por 50 \mul y, particularmente, al menos 16 (log_{2}) por 50 \mul cuando se examina frente a 300-1000 DICT_{50} por 50 \mul de una cepa
de CAV.
10 (log_{2}) por 50 \mul, más preferiblemente al menos 12 (log_{2}) por 50 \mul o incluso al menos 14 (log_{2}) por 50 \mul y, particularmente, al menos 16 (log_{2}) por 50 \mul cuando se examina frente a 300-1000 DICT_{50} por 50 \mul de una cepa
de CAV.
Una cepa de CAV que es neutralizada por
diluciones mayores de la muestra de Moab R2 de referencia es
esencialmente no patógena para pollos jóvenes y para embriones de
pollo. Por tanto, tal cepa de CAV es particularmente adecuada para
ser utilizada en una vacuna viva de CAV para la administración a
pollos que son muy susceptibles a la infección por CAV, tales como
los embriones de pollo o los pollos de un día de edad.
Una cepa muy preferida de acuerdo con la presente
invención es la cepa 319 de CAV, una muestra de la cual está
depositada en la ECACC bajo el número de acceso 00012608. A la vista
de sus propiedades no patógenas, esta cepa es particularmente
idónea como componente de una vacuna para inmunizar pollos jóvenes
o embriones de
pollos.
pollos.
La identificación de las nuevas cepas de CAV de
acuerdo con la presente invención permite la preparación de
vacunas vivas de CAV con baja patogenicidad que pueden proteger
eficazmente a las aves de corral, en particular a pollos jóvenes,
frente a las condiciones de enfermedad resultantes de la infección
por el CAV. Por tanto, en una realización preferida de esta
invención, se proporciona una cepa de CAV según se definió
anteriormente, que está en forma viva.
Por supuesto, la presente invención proporciona
también una cepa de CAV en forma inactivada. La cepa de CAV
inactivada puede ser utilizada como base de una vacuna inactivada
particularmente idónea para la vacunación de reproductores.
Un CAV de acuerdo con la invención puede ser
también aislado de pavos del campo. Brevemente, puede llevarse a
cabo un estudio serológico de sueros de pavo recogidos de bandadas
de pavos para identificar muestras de suero que sean capaces de
neutralizar CAV en un ensayo estándar de neutralización de virus.
Un ejemplo de tal estudio está descrito en Farkas y col. (1998,
supra). Posteriormente, el CAV puede ser aislado de órganos
de los pavos, según se describe en el Ejemplo 1. Finalmente, puede
identificarse un CAV de acuerdo con la presente invención mediante
el examen de la reacción con el anticuerpo monoclonal R2.
Si se desea, los CAVs de baja patogenicidad
caracterizados anteriormente pueden ser adaptados a huevos
embrionados mediante el pase de estos CAVs en huevos embrionados,
de tal manera que los virus resultantes sean capaces de crecer
hasta títulos elevados en huevos embrionados. La Solicitud de
Patente Europea Nº 0533294 describe que la capacidad de un CAV
para inducir lesiones en los embriones está asociada con un
beneficio de crecimiento y describe además cómo pueden obtenerse
tales virus. Por tanto, la presente invención proporciona también
CAVs del tipo anteriormente mencionado, que tienen adicionalmente la
propiedad de inducir lesiones en embriones de pollo. Tales CAVs
son adecuados para la vacunación in ovo de embriones de 17
días de edad y mayores, o para la vacunación después de la eclosión
de pollos de un día de edad o mayores.
La invención proporciona en un aspecto adicional
una vacuna para ser utilizada en la protección de las aves de
corral frente a las condiciones de enfermedad, clínicas y
subclínicas, resultantes de una infección por CAV, que comprende
un CAV de acuerdo con la presente invención y un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
El CAV de acuerdo con la presente invención puede
ser incorporado a la vacuna como un virus vivo o inactivado. Sin
embargo, la baja patogenicidad de los presentes CAVs hace que estos
virus sean particularmente adecuados para ser incorporados a una
vacuna viva de CAV.
Una vacuna de acuerdo con la invención puede ser
preparada mediante métodos convencionales tales como, por ejemplo,
los utilizados comúnmente para las vacunas de CAV comercialmente
disponibles. La preparación de composiciones para vacunas
veterinarias está también descrita en "Handbuch der
Schutzimpfungen in der Tiermedizin" (eds.: Mayr, A. y col,
Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, Alemania, 1984) y en
"Vaccines for Veterinary Applications" (ed.: Peters, A.R. y
col., Butterworth-Heinermann Ltd., 1993).
Brevemente, un sustrato adecuado es inoculado con
un CAV vivo de acuerdo con la invención y se propaga hasta que el
virus replique y se alcance un título infeccioso deseado o un
contenido de masa antigénica deseado, después de lo cual se recoge
el material que contiene el CAV y se formula en una composición
farmacéutica con actividad profiláctica.
Puede utilizarse para producir una vacuna de
acuerdo con la presente invención cualquier sustrato que sea capaz
de soportar la replicación del CAV definido anteriormente. Los
sustratos adecuados incluyen cultivos celulares tales como células
MDCC-MSB1, embriones de pollo y pollos para la
producción de vacunas in vivo.
Para la producción en cultivo celular, el virus
es propagado normalmente durante 3-10 días después
de la inoculación de las células, después de lo cual se recoge el
sobrenadante del cultivo celular y, si se desea, se filtra o se
centrifuga con el fin de eliminar los desechos celulares.
Alternativamente, el CAV de acuerdo con la
invención puede ser propagado en huevos de pollo embrionados
seguido por la recogida del material CAV mediante métodos
rutinarios tales como los descritos en la Solicitud de Patente
Europea Nº 0533294.
La vacuna de acuerdo con la invención que
contiene el CAV vivo puede ser preparada y comercializada en forma
de una suspensión (congelada) o en forma liofilizada. La vacuna
contiene adicionalmente un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable utilizado habitualmente para tales composiciones. Los
vehículos incluyen estabilizantes, conservantes y tampones.
Estabilizantes adecuados son, por ejemplo, SPGA, carbohidratos
(tales como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano,
glutamato o glucosa), proteínas (tales como suero de leche en
polvo, albúmina o caseína) o productos de degradación de los
mismos. Son tampones adecuados, por ejemplo, los fosfatos de
metales alcalinos. Son conservantes adecuados timerosal, mertiolato
y gentamicina. Los diluyentes incluyen agua, tampones acuosos
(tales como solución salina tamponada) alcoholes y polioles (tales
como glicerol).
Si se desea, las vacunas vivas de acuerdo con la
invención pueden contener un adyuvante. Ejemplos de compuestos y
composiciones adecuadas con actividad adyuvante son los mismos que
los mencionados más adelante para la preparación de vacunas
inactivadas.
Aunque es posible la administración por
inyección, por ejemplo intramuscular, subcutánea, de la vacuna viva
de acuerdo con la presente invención, la vacuna viva es
administrada preferiblemente mediante las técnicas más baratas de
aplicación masiva comúnmente utilizadas para la vacunación de aves
de corral. Estas técnicas incluyen el agua de bebida y la
vacunación por pulverización.
Métodos alternativos para la administración de la
vacuna viva incluyen la administración in ovo, en forma de
colirio y la inmersión del pico.
Como la presente invención proporciona CAVs que
son sustancialmente no patógenos cuando son administrados in
ovo en el último cuarto del periodo de incubación, una vía de
administración particularmente ventajosa de una vacuna de acuerdo
con la presente invención es la administración in ovo.
Normalmente, la vacuna es inyectada en huevos
embrionados durante las últimas etapas del periodo embrionario,
generalmente durante el cuarto final del periodo de incubación (día
15-21), preferiblemente el día 18 del periodo de
incubación.
El mecanismo de inyección de los huevos incubados
no es particularmente crítico, siempre que no dañe excesivamente
tejidos y órganos del embrión. Por ejemplo, se perfora un pequeño
orificio con una aguja (1-1½ pulgada, calibre 22
aproximadamente) fijada a una jeringa en el extremo grande de la
cáscara y se inyecta la vacuna por debajo de la membrana interna
de la cáscara y de la membrana corioalantoidea. Posteriormente, los
huevos embrionados vacunados son transferidos a un incubador para
que eclosionen (Patente de EE.UU. N^{os} 4.458.630, 5.427.791,
WO 98/56413 y WO 95/35121). Preferiblemente, el proceso completo de
vacunación de embriones se lleva a cabo utilizando sistemas de
vacunación automatizados, tal como el sistema Inovoject® disponible
comercialmente.
En otra realización, la presente invención
proporciona una vacuna contra las condiciones de enfermedad
resultantes de la infección por CAV, que comprende el CAV en forma
inactivada. Las ventajas de una vacuna inactivada son los niveles
elevados de anticuerpos protectores de larga duración que pueden ser
obtenidos. Esta propiedad hace que tal vacuna inactivada sea
idónea en particular para la vacunación de reproductores. La
preparación de una vacuna de CAV inactivado de acuerdo con la
presente invención puede ser obtenida mediante métodos rutinarios
bien conocidos por las personas expertas en la técnica (tal como
está descrito en la Solicitud de Patente Europea Nº 0533294).
Una vacuna conteniendo el CAV inactivado puede
contener, por ejemplo, uno o más de los vehículos o diluyentes
farmacéuticamente aceptables anteriormente mencionados adecuados
para este fin.
Preferiblemente, una vacuna inactivada de acuerdo
con la invención comprende uno o más compuestos con actividad
adyuvante. Compuestos o composiciones adecuadas para este fin
incluyen hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, una emulsión
aceite-en-agua o
agua-en-aceite basada en, por
ejemplo, un aceite mineral tal como Bayol F® o Marcol 52®, o un
aceite vegetal tal como acetato de vitamina E y saponinas.
Las vacunas inactivadas son normalmente
administradas parenteralmente, por ejemplo intramuscularmente o
subcutáneamente.
La vacuna de acuerdo con la invención comprende
una dosis eficaz del CAV definido anteriormente como componente
activo, esto es, una cantidad de material CAV inmunizante que
inducirá inmunidad en las aves vacunadas o en su progenie frente
al desafío por un virus virulento. En la presente se define
inmunidad como la inducción de un nivel de protección en una
población de aves después de la vacunación significativamente mayor
en comparación con un grupo no vacunado.
Típicamente, la vacuna viva de acuerdo con la
invención puede ser administrada en una dosis de
10^{2}-10^{9} DICT_{50} por ave,
preferiblemente en una dosis que varía de
10^{2}-10^{6} DICT_{50}, y una vacuna
inactivada puede contener el equivalente antigénico de
10^{4}-10^{10} DICT_{50} por ave.
Aunque la vacuna de CAV de acuerdo con la
presente invención puede ser utilizada eficazmente en pollos, otras
aves de corral tales como pavos y codornices pueden ser también
vacunadas con éxito con la vacuna. Los pollos incluyen pollos de
engorde, la población de reproducción y la población de
ponedoras.
Como las condiciones de enfermedad clínicas y
subclínicas resultantes de la infección por CAV han sido descritas
principalmente en pollos jóvenes, en particular en pollos de
engorde, la presente invención proporciona preferiblemente una
vacuna para ser utilizada en la protección de pollos de engorde
frente a las condiciones de enfermedad inducidas por el CAV.
La edad de los animales que reciban una vacuna
viva o inactivada de acuerdo con la invención puede ser la misma
que la de los animales que reciben las vacunas de CAV actualmente
conocidas. Adicionalmente, el carácter de baja patogenicidad de los
CAVs de acuerdo con la presente invención permite la administración
de la vacuna de CAV a aves jóvenes, esto es de menos de dos semanas
de edad, en particular a aves de un día de edad o incluso a
embriones mediante la vía in ovo en el cuarto final del
periodo de incubación. Por ejemplo, aves jóvenes, por ejemplo
pollos de engorde, pueden ser vacunados directamente a partir de un
día de edad en adelante con la vacuna viva de acuerdo con la
invención para prevenir la enfermedad subclínica resultante de la
transmisión horizontal del CAV. La vacunación de la población
parental, tal como la de los reproductores de pollos de engorde,
puede ser realizada con una vacuna viva o inactivada de acuerdo con
la invención o con un protocolo que comprenda una combinación de
ambas vacunas. La ventaja de estos tipos de programas de
inmunización incluye la protección inmediata de la progenie de un
día de edad proporcionada por los anticuerpos derivados de la
madre transmitidos verticalmente a las aves jóvenes. Un programa de
vacunación típico de reproductores incluye la vacunación de los
reproductores desde las 6 semanas de edad en adelante con una
vacuna viva, o la vacunación con una vacuna inactivada entre las
14-18 semanas de edad.
La presente invención proporciona también una
vacuna combinada que comprende, además del CAV de acuerdo con la
invención, uno o más componentes vacuna de otros patógenos
infecciosos para las aves de corral.
Preferiblemente, la vacuna combinada comprende
una o más cepas vacuna (inactivadas) del virus de la Enfermedad de
Marek (MDV), del virus de la bronquitis infecciosa (IBV), del virus
de la Enfermedad de Newcastle (NDV), del virus de la enfermedad
infecciosa de la bolsa (IBDV), del adenovirus aviar (FAV), del
virus de la EDS, del virus de la rinotraqueitis del pavo (TRTV),
del virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) y de
reovirus.
En particular, la presente invención proporciona
una vacuna combinada viva que comprende un CAV de acuerdo con la
invención y una cepa vacuna de MDV tal como HVT. Esta vacuna
combinada puede ser utilizada ventajosamente para la vacunación
in ovo.
Ejemplo
1
A
Las cepas de CAV fueron aisladas de órganos
derivados de diferentes pavos de acuerdo con el procedimiento
siguiente:
Los órganos fueron homogeneizados y centrifugados
durante 15 minutos a 3000 g. El sobrenadante fue añadido a células
MDCC-MSB1 y posteriormente las suspensiones fueron
incubadas a +37ºC. Después de 2-3 días de
incubación, las células fueron examinadas microscópicamente y
posteriormente subcultivadas. Este procedimiento fue repetido
hasta que tuvo lugar el efecto citopático (ECP) característico de
CAV. Cuando estuvo presente el ECP de CAV, la suspensión fue
centrifugada durante 15 minutos a 3000 g y posteriormente el
sobrenadante fue recogido y almacenado a -70ºC. Se produjeron pases
posteriores de acuerdo con el mismo procedimiento.
Aislados de CAV de pollo fueron también
multiplicados en células MDCC-MSB1 según el
procedimiento descrito anteriormente.
Se aisló de manera similar un grupo más de cepas
de CAV de acuerdo con la invención de pavos que estaban deprimidos
debido a causas desconocidas. Después de su llegada, los pavos
fueron sacrificados y se extrajo su hígado. En el laboratorio, se
añadió un volumen igual de medio RMPI 1640 y posteriormente se
preparó un homogenado de hígado al 50% mediante la utilización de
un Ultra Turrax. Después de centrifugar 10 minutos a 4000 g, el
sobrenadante fue recogido a través de un filtro de 15 \mum. El
sobrenadante fue almacenado a -70ºC hasta su utilización en
pruebas de reaislamiento del virus.
Para los ensayos de reaislamiento del virus, 0,2
ml de cada uno de los sobrenadantes de hígado fueron añadidos a 30
ml de medio RPMI 1640 (5% de FCS) que contenía 3 x 10^{5} células
MDCC- MSB1 por ml. Después de incubación durante 2 ó 3 días a +37ºC
(5% de CO_{2}), las células MDCC-MSB1 fueron
examinadas microscópicamente para detectar la presencia de ECP
característico del CAV (células grandes hinchadas con un citoplasma
claro). Cuando el ECP característico de CAV resultó a estar
ausente, las células fueron subcultivadas mediante la adición de 5
ml de la suspensión de células MDCC-MSB1 a 25 ml de
medio RPMI 1640 nuevo (5% de FCS). Posteriormente, las
suspensiones celulares fueron incubadas de nuevo durante 2 ó 3 días
a +37ºC (5% de CO_{2}). Las suspensiones de células
MDCC-MSB1 fueron subcultivadas hasta 10 veces o
hasta que se observó el ECP característico
del CAV.
del CAV.
Cuando se observó el ECP característico del CAV,
la suspensión de células-virus fue recogida y
centrifugada durante 10 minutos a 4000 g. El sobrenadante fue
recogido y almacenado a -70ºC hasta su uso posterior.
\newpage
B
En un experimento posterior, se examinó si las
cepas de CAV de acuerdo con la presente invención podían ser
distinguidas de cepas de CAV de pollo (conocidas) y de otras cepas
de pavo, por medio de un ensayo de neutralización de virus
utilizando el anticuerpo monoclonal R2, suero de pollo policlonal
positivo y negativo dirigido contra el CAV.
- Cepa 26P4 de CAV de pollo (tipo salvaje y atenuada): Solicitud de Patente EP Nº 0533294.
- Cepa Gifu de CAV de pollo (tipo salvaje y atenuada): Solicitud de Patente EP Nº 0533294.
- Cepa Angstrom de CAV de pollo: Angstrom y col., Avian Path. 17, 23-32, 1988.
- Cepa Cux de CAV de pollo: von Bülow y col., Zentralbl. Veterinarmed. 30, 742-750, 1983.
- Cepa Clon-1 de CAV de pollo: Lamichane y col., Avian Dis. 35, 515-522, 1991.
- Cepa de CAV de pollo: aislado de Holanda, cepa de referencia.
- Cepas 18938, SP6198, 18933, 17382, 319, 3571, 3533, 3527, 3570, 3572, 18012, 18936, 18010 y 18941 de CAV de pavo.
- Moab R2
- Suero CAV positivo
- Suero CAV negativo
Comenzando con una dilución de al menos 1:16, se
realizaron diluciones seriadas de dos veces de la muestra del Moab
de referencia en una placa de microvaloración en medio de cultivo de
tejidos (RPMI 1640 + 5% de FCS) finalizando con 50 \mul de cada
dilución (se incluyó un suero de referencia positivo y negativo
utilizando las mismas diluciones). Posteriormente, se añadió a cada
dilución del Moab R2 un volumen igual de cada suspensión
de CAV.
de CAV.
Con el fin de monitorizar el título de
infectividad del CAV en el ensayo de neutralización, la dilución de
trabajo de CAV fue titulada simultáneamente. Por tanto, se
prepararon diluciones seriadas de diez veces (10^{-1} a
10^{-4}) de cada dilución de trabajo de CAV en tubos fuera de la
placa de microvaloración. Posteriormente, 50 \mul de cada
dilución fueron transferidos en doce veces a una placa de
microvaloración. Otros doce pocillos de la misma placa de
microvaloración fueron rellenados con 100 \mul de medio de
cultivo de tejidos con el fin de que sirvieran como control
negativo. Posteriormente, se añadieron 50 \mul de medio de
cultivo de tejidos a las diluciones del virus. Las mezclas
virus-Moab y las diluciones de virus de la
titulación fueron luego incubadas durante un periodo de una noche a
+4ºC. Posteriormente, se añadieron 100 \mul de una suspensión de
células MDCC-MSB1 que contenía 6 x 10^{5} células,
a las mezclas virus-Moab y a las diluciones del
virus y al control de la titulación. Las placas de microvaloración
fueron luego transferidas a un incubador (+37ºC, 5% de
CO_{2}).
Después de incubar durante dos a tres días a
+37ºC, las células incluidas en la titulación fueron examinadas
para detectar la presencia del efecto citopático (ECP)
característico del CAV. Cuando la titulación reveló que estaban
presentes menos de 300 a 1000 DICT_{50} de CAV por 50 \mul, las
células incluidas en el ensayo de neutralización y en la titulación
fueron subcultivadas e incubadas de nuevo durante dos a tres días a
+37ºC. Este procedimiento de incubación y subcultivo de las células
se realizó hasta que se obtuvo en la titulación un título de CAV
de 300 a 1000 DICT_{50} por 50 \mul. Los títulos de CAV fueron
calculados de acuerdo con el método de Reed y Muench (The American
Journal of Hygiene 27, 493-497, 1937).
Los títulos de anticuerpo fueron determinados
examinando las células añadidas a las mezclas
virus-Moab para detectar la presencia del ECP
característico del CAV. El título de anticuerpos (log_{2}) está
expresado como el recíproco de la dilución más elevada de la
muestra de Moab R2 de referencia a la cual las cepas de CAV son
neutralizadas completamente, esto es, no se observa el ECP
característico del CAV. Cuando el título de anticuerpos de la
muestra de Moab R2 de referencia es <5 (log_{2}), se considera
que la cepa de CAV particular no ha sido neutralizada por el
Moab R2.
Moab R2.
| R2 | Suero CAV Positivo | Suero CAV Negativo | |
| Cepas de pollo | |||
| CAV 26P4 (tipo salvaje) | <4 | 13 | <4 |
| CAV 26P4 (atenuada) | <4 | 13 | <4 |
| CAV Gifu (tipo salvaje) | <4 | 13 | <4 |
| CAV Gifu (atenuada) | <4 | 13 | <4 |
| CAV Cux-1 | <4 | 13 | <4 |
| CAV Angstrom | <4 | 12 | <4 |
| CAV Clon-1 | <4 | 13 | <4 |
| CAV, aislado de Holanda | <4 | 11 | <4 |
| Cepas de pavo | |||
| CAV SP6198 | <4 | 12 | <4 |
| CAV 319 | 16 | 11 | <4 |
| CAV 18938 | 16 | 12 | <4 |
| CAV 18933 | 14 | 10 | <4 |
| CAV 17382 | 7 | 10 | <4 |
| CAV 3571 | 16 | 11 | <4 |
| CAV 3533 | 16 | 12 | <4 |
| CAV 3527 | 16 | 12 | <4 |
| CAV 3570 | 16 | 12 | <4 |
| CAV 3572 | 16 | 12 | <4 |
| CAV 18012 | 16 | 12 | <4 |
| CAV 18936 | 16 | 12 | <4 |
| CAV 18010 | 16 | 12 | <4 |
| CAV 18941 | 16 | 12 | <4 |
El ensayo de neutralización de virus reveló que
un grupo de cepas de CAV de pavo que presentan una baja
patogenicidad para los pollos puede ser distinguido de aislados de
CAV de pollo atenuados y patógenos y de aislados patógenos de pavo
(Tabla 1). El Moab R2 neutraliza únicamente las cepas de CAV de baja
patogenicidad aisladas de pavos, mientras que no neutraliza el
aislado patógeno de pavo ni ninguna de las cepas de pollo
conocidas. Los resultados de los experimentos de patogenicidad
están mostrados en el Ejemplo 2.
Ejemplo
2
A
En este experimento, los aislados de CAV fueron
evaluados para determinar su patogenicidad en pollos SPF. La
patogenicidad de los aislados de CAV fue establecida mediante examen
macroscópico del timo y de la médula ósea y mediante la
determinación del valor del hematocrito (Ht).
Pollos SPF de un día de edad fueron inoculados
intramuscularmente con 10^{6,0} DICT_{50} de cada aislado de
CAV. Un grupo de pollos no fue inoculado con el fin de que sirviera
como control. A los 14 días de edad, se retiraron varios pollos de
cada grupo. Se recogieron muestras de sangre para la determinación
del valor del Ht. El timo y la médula ósea fueron examinados
macroscópicamente. Los pollos restantes fueron mantenidos hasta
las cuatro semanas de edad. Se recogieron muestras de sangre antes
del inicio del experimento y a las cuatro semanas de edad.
Los sueros fueron examinados para determinar la
presencia/ausencia de anticuerpos hacia CAV mediante un ensayo de
neutralización de virus, según se describió anteriormente.
Se determinaron los títulos de infectividad
reales de las preparaciones utilizadas para la inoculación mediante
titulación en células MDCC-MSB1, de acuerdo con
procedimientos estándar. Las suspensiones de
virus-células fueron subcultivadas cada 2 a 3 días,
hasta 10 veces. Posteriormente, se determinó el título de punto
final mediante examen microscópico de las células para detectar la
presencia del ECP característico de CAV. El título fue calculado
de acuerdo con el método de Reed y Muench (1937, supra).
Los resultados del examen macroscópico y de la
determinación del hematocrito están resumidos en la Tabla 2.
Los resultados de la serología están resumidos en
la Tabla 3. No pudieron detectarse anticuerpos hacia CAV en los
sueros derivados de 10 individuos de la pollada de un día de edad.
Tampoco pudieron detectarse anticuerpos hacia CAV en los sueros
derivados de los pollos control de cuatro semanas de edad.
| Inóculo | Título de infectividad | % de pollos con | % de pollos con | % de pollos con |
| real administrado | atrofia del timo | médula ósea pálida | anemia (Ht<27%) | |
| (log_{10} DICT_{50}) | ||||
| Cepas de pollo | ||||
| CAV Clon-1 | 6,0 | 79% | 50% | 21% |
| CAV Gifu | 5,8 | 100% | 100% | 67% |
| Cepas de pavo | ||||
| CAV SP6198 | 4,9 | 100% | 93% | 20% |
| CAV 18938 | 4,9 | 40% | 0% | 0% |
| CAV 18933 | 5,3 | 0% | 0% | 0% |
| CAV 17382 | 6,6 | 53% | 27% | 7% |
| CAV 319 | 6,1 | 13% | 0% | 0% |
| Inóculo | Título medio de anticuerpos hacia CAV (log_{2}) a las cuatro semanas de edad |
| CAV Clon-1 | n.r. |
| CAV Gifu | 12,0 (\pm 0,0) |
| CAV SP6198 | 9,9 (\pm 1,7) |
| CAV 18938 | 10,3 (\pm 1,6) |
| CAV SP6198 | 9,9 (\pm 1,7) |
| CAV 18933 | 10,8 (\pm 1,3) |
| CAV 17382 | 10,2 (\pm 1,5) |
| CAV 319 | 11,4 (\pm 1,0) |
| ()= desviación estándar \hskip4,7cm n.r.= no realizado |
Los resultados obtenidos en este experimento
muestran que las cepas de CAV de acuerdo con la invención presentan
una patogenicidad reducida para los pollos cuando se comparan con
las cepas de CAV derivadas de pollos o de otras cepas de pavo.
B
En este experimento se examinó si las cepas de
CAV aisladas de pavos inducían lesiones embrionarias
características del CAV. La Solicitud de Patente Europea Nº 0533294
describe CAVs atenuados con una virulencia reducida para los
pollos. Esta ventajosa propiedad está asociada con la propiedad de
estos virus de la técnica anterior de inducir lesiones en huevos
embrionados.
Treinta huevos SPF fertilizados fueron inoculados
cada uno con 0,2 ml de cada cepa de CAV vía saco vitelino. El
volumen de inóculo contenía un título de infectividad de 10^{6,0}
DICT_{50}. Como control positivo, se inocularon 30 huevos SPF
fertilizados con la cepa CAV 26P4 atenuada, una cepa de CAV que se
sabe que induce lesiones en los embriones. Se incluyeron 30 huevos
SPF fertilizados, que no fueron inoculados, como control negativo.
Posteriormente, los huevos fueron incubados en un incubador de
huevos a +37ºC. Desde el día 7 de vida embrionaria en adelante,
los huevos fueron mirados al trasluz diariamente. Se consideró que
la muerte de embriones que tenía lugar hasta el día 10 de vida
embrionaria no había sido causada por el CAV y, por tanto, estos
huevos fueron desechados. Se consideró que la muerte de embriones
que tenía lugar a partir del día 11 de vida embrionaria en
adelante estaba causada por el CAV y, por tanto, los embriones
fueron recogidos y examinados macroscópicamente para detectar la
presencia de lesiones inducidas por el CAV. A los 17 días de vida
embrionaria, se recogieron todos los embriones restantes y se
examinaron macroscópicamente para determinar la presencia de
lesiones inducidas por el CAV.
La muerte de embriones está mostrada en la Tabla
4.
\vskip1.000000\baselineskip
| Inóculo | Nº de huevos | Días de vida embrionaria | ||||||||||
| Inoculados | ||||||||||||
| 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | ||
| CAV 319 | 30 | 13 | 1 | - | 1 | - | - | - | 1 | - | - | - |
| CAV 18933 | 30 | 15 | 1 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| CAV 18938 | 30 | 15 | - | - | 1 | - | - | - | 1 | - | - | - |
| CAV 26P4 Atenuada | 30 | 11 | - | - | 1 | - | - | - | 3 | 1 | - | 2 |
| Control No inocul. | 30 | 3 | 1 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
\vskip1.000000\baselineskip
El embrión que murió a los 14 días de vida
embrionaria no presentaba lesiones características del CAV. En el
examen macroscópico de los catorce embriones de 17 días de edad
supervivientes no se observaron tampoco lesiones características
del CAV.
En el examen macroscópico de los catorce
embriones de 17 días de edad supervivientes no se observaron
lesiones características del CAV.
El embrión que murió a los 14 días de vida
embrionaria no presentaba lesiones características del CAV. En el
examen macroscópico de los trece embriones de 17 días de edad
supervivientes no se observaron tampoco lesiones características
del CAV.
Los embriones que murieron a los 14, 15 y 17 días
de vida embrionaria presentaban todos lesiones características del
CAV. En el examen macroscópico de los doce embriones de 17 días de
edad supervivientes, se observaron lesiones características del
CAV en seis embriones.
A partir de este experimento puede concluirse que
las cepas de CAV existentes en la naturaleza aisladas de pavos no
inducen lesiones en los embriones.
Ejemplo
3
Se inocularon in ovo 60 huevos SPF
embrionados de 18 días de edad con 0,2 ml de la cepa vacuna de CAV
Nobilis P4® comercialmente disponible (EP 0533294), de CAV cepa 319
o de un homogenado embrionario obtenido de huevos SPF embrionados.
Se inoculó por huevo un título de infectividad calculado de
10^{3,0} DICT_{50}. Después de la inoculación, los huevos
fueron transferidos a un incubador de eclosión y después de la
eclosión los pollos fueron colocados en aisladores de presión
negativa.
A los 7, 14 y 21 días de edad se retiraron 5
pollos de cada grupo. Se recogieron muestras de sangre para la
determinación de los valores del hematocrito. Posteriormente, los
pollos fueron sacrificados para el examen post mortem. En
el examen post mortem se examinaron macroscópicamente el
timo y la médula ósea.
A las 6 y 8 semanas de edad se recogieron
muestras de sangre de varios pollos de cada grupo y se examinaron
los sueros para determinar la presencia/ausencia de anticuerpos
hacia CAV.
Durante un periodo de 8 semanas después de la
eclosión, se observaron los pollos diariamente para detectar la
aparición de signos clínicos de enfermedad o mortalidad.
Los títulos reales de infectividad inoculados
fueron determinados mediante titulación en células
MDCC-MSB1 de acuerdo con procedimientos estándar
según se describió anteriormente.
Se recogieron muestras de sangre periférica por
duplicado en tubos capilares de microhematocrito (Ht)
heparinizados. Después de centrifugar durante 10 minutos a 15000 g,
se determinaron los valores del hematocrito. Posteriormente, se
calculó el valor medio del Ht para cada pollo. Los pollos con
valores inferiores al 27% fueron considerados anémicos.
Después del examen macroscópico, se determinó el
porcentaje de animales afectados con atrofia del timo y palidez de
la médula ósea.
A lo largo del experimento, se observaron todos
los pollos diariamente para detectar la aparición de signos
clínicos de enfermedad o mortalidad.
Las muestras de suero fueron examinadas para
determinar la ausencia/presencia de anticuerpos hacia CAV
utilizando un ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido
(ELISA) competitivo, con un antígeno de CAV unido a una fase
sólida, un anticuerpos monoclonal biotinilado específico de CAV y
HRP acoplada a avidina. Los títulos de anticuerpo (log_{2}) eran
el recíproco de la mayor dilución de suero a la que el anticuerpo
monoclonal biotinilado no se unía de forma máxima. Las muestras de
suero con títulos de <5 (log_{2}) son consideradas negativas
para anticuerpos hacia CAV.
El extremo romo de huevos SPF embrionados de 18
días de edad fue limpiado con un algodón con una solución de yodo
para desinfectar la superficie. Posteriormente, se practicó un
orificio en la cáscara del huevo mediante la utilización de un
llamado taladro de huevos. Los huevos fueron luego inoculados con
cada una de las diluciones del virus mediante la utilización de
jeringas Discardit de 1,0 ml y agujas naranjas Microlance de 0,6 x
25. Antes de transferir los huevos a un incubador de eclosión, los
orificios fueron sellados con parafina.
A continuación se enumeran los títulos de
infectividad reales encontrados en los inóculos:
\vskip1.000000\baselineskip
| CAV vacuna Nobilis cepa P4 | : | 10^{1,9} DICT_{50} por huevo. |
| CAV cepa 319 | : | 10^{2,9} DICT_{50} por huevo. |
\vskip1.000000\baselineskip
Las puntuaciones medias obtenidas en el examen
macroscópico están mostradas en la Tabla 5.
A los 7 y 21 días de edad no se observaron
cambios en el timo. A los 14 días de edad, tres pollos presentaban
una ligera atrofia del timo y dos pollos presentaban una atrofia
moderada del timo. A los 7, 14 y 21 días de edad no se observaron
cambios en la médula ósea.
A los 7, 14 y 21 días de edad no se observaron
cambios en el timo ni en la médula ósea.
A los 7, 14 y 21 días de edad no se observaron
cambios en el timo ni en la médula ósea.
Los valores del hematocrito determinados a los 7,
14 y 21 días de edad están mostrados en la Tabla 6. Todos los
valores del hematocrito determinados fueron superiores al 27%.
Los títulos medios de anticuerpos hacia CAV están
mostrados en la Tabla 7.
A las seis semanas de edad, se detectaron
anticuerpos hacia CAV en 15 de los 17 sueros examinados. A las ocho
semanas de edad, los diecisiete pollos respondían todos al CAV.
A las seis semanas de edad, se detectaron
anticuerpos hacia CAV en 17 de los 18 sueros examinados. A las ocho
semanas de edad, los dieciocho pollos respondían todos al CAV.
A las seis y ocho semanas de edad no pudieron
detectarse anticuerpos hacia CAV en ninguno de los sueros
examinados.
A lo largo de todo el experimento, no se
observaron signos clínicos de enfermedad ni mortalidad en los
pollos inoculados con la cepa P4, la cepa 319 o el homogenado de
embriones negativos.
Después de la inoculación de huevos embrionados
de 18 días de edad con CAV cepa P4 o con CAV cepa 319, no se
observaron signos clínicos de enfermedad ni mortalidad a lo largo de
todo el experimento. La determinación de los valores del
hematocrito reveló que ninguno de los pollos era anémico.
El examen serológico reveló que la mayoría de los
pollos inoculados con CAV cepa 319 o con CAV cepa P4 eran
seroconvertidos respecto a CAV a las seis semanas de edad.
El examen macroscópico reveló que CAV cepa P4
inducía cierta atrofia del timo de ligera a moderada solamente a
los 14 días de edad. Sin embargo, CAV cepa P4 no inducía cambios en
la médula ósea. El examen macroscópico reveló además que CAV cepa
319 no inducía cambios en el timo ni en la médula ósea.
A partir de este experimento puede concluirse
que, después de la inoculación in ovo de huevos SPF
embrionados de 18 días de edad, CAV cepa 319 es menos patógeno para
los pollos que CAV vacuna Nobilis cepa P4 atenuado.
| Inóculo | Porcentaje de cambios patológicos observados a los x días de edad | |||||
| Médula ósea | Timo | |||||
| 7 | 14 | 21 | 7 | 14 | 21 | |
| CAV vacuna Nobilis cepa P4 | 0% | 0% | 0% | 0% | 100% | 0% |
| CAV cepa 319 | 0% | 0% | 0% | 0% | 0% | 0% |
| Homogenado de embriones negativos | 0% | 0% | 0% | 0% | 0% | 0% |
| Inóculo | Valores medios del hematocrito (%) determinados a los x días de edad | ||
| 7 | 14 | 21 | |
| CAV vacuna Nobilis cepa P4 | 33,0 (\pm1,0) | 34,6 (\pm2,3) | n.r. |
| CAV cepa 319 | 32,4 (\pm1,1) | 34,4 (\pm3,4) | 34,2 (\pm1,5) |
| Homogenado de embriones negativos | 32,4 (\pm1,1) | 34,2 (\pm1,6) | n.r. |
| n.r. = no se realizó porque se rompieron todos los tubos de hematocrito durante la centrifugación | |||
| () = desviación estándar. |
| Inóculo | Título medio de anticuerpos (log_{2}) hacia CAV a las x semanas de edad | |
| 6 semanas | 8 semanas | |
| CAV vacuna Nobilis cepa P4 | 6,5 (\pm1,4) | 7,8 (\pm1,2) |
| CAV cepa 319 | 6,9 (\pm1,8) | 8,8 (\pm2,2) |
| Homogenado de embriones negativos | <4,0 (\pm0,0) | <4,0 (\pm0,0) |
| () = desviación estándar. |
Claims (12)
1. Un virus de la anemia del pollo (CAV), que se
caracteriza porque el virus es neutralizado por una muestra
de referencia que comprende el anticuerpo monoclonal R2 secretado
por una línea celular de hibridomas, una muestra de la cual está
depositada en la ECACC bajo el nº de acceso 00020304.
2. Un CAV de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque el virus está en forma viva.
3. Un CAV de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
que se caracteriza porque el título de la muestra de
referencia frente al CAV es al menos 10 (log_{2}) por 50 \mul,
más preferiblemente al menos 12 (log_{2}) por 50 \mul o
incluso al menos
14 (log_{2}) por 50 \mul, cuando se examina frente a 300-1000 DICT_{50} por 50 \mul del CAV.
14 (log_{2}) por 50 \mul, cuando se examina frente a 300-1000 DICT_{50} por 50 \mul del CAV.
4. Un CAV de acuerdo con la reivindicación 3, que
se caracteriza porque el título de la muestra de referencia
frente al CAV es al menos 16 (log_{2}) por 50 \mul cuando se
examina frente a 300-1000 DICT_{50} por 50
\mul del CAV.
5. Un CAV de acuerdo con la reivindicación 4, que
se caracteriza porque es el CAV cepa 319, una muestra del
cual está depositada en la ECACC bajo el nº de acceso 00012608.
6. Una vacuna para proteger a las aves de corral
frente a condiciones de enfermedad resultantes de una infección
por CAV, que comprende un CAV de acuerdo con las reivindicaciones
1-5 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
7. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 6,
que se caracteriza porque la vacuna comprende además un
adyuvante.
8. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones
6 ó 7, caracterizada porque la vacuna comprende además uno
o más componentes vacuna de otros patógenos infecciosos para las
aves de corral.
9. Un método para la preparación del CAV definido
en las reivindicaciones 1-5 que comprende las
etapas de:
- a.
- inoculación de un sustrato susceptible con el CAV,
- b.
- propagación del virus y
- c.
- recogida del material que contiene el CAV.
10. Un método para la preparación de una vacuna
para la protección de aves de corral frente a condiciones de
enfermedad resultantes de una infección por CAV, que comprende la
combinación del CAV recogido obtenido mediante el método de
acuerdo con la reivindicación 9, si se desea después de la
inactivación del CAV, con un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
11. Utilización de un CAV definido en las
reivindicaciones 1-5 para la fabricación de una
vacuna para administración in ovo.
12. Utilización de un CAV definido en las
reivindicaciones 1-5 para la fabricación de una
vacuna para administración parenteral a pollos de un día de
edad.
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