DE60226253T2 - Humanisierter antikörper gegen fibroblastenwachstumsfaktor 8 und fragment des antikörpers - Google Patents

Humanisierter antikörper gegen fibroblastenwachstumsfaktor 8 und fragment des antikörpers Download PDF

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Description

  • Technischer Hintergrund
  • Die vorliegende Erfindung betrifft humanisierte Antikörper gegen FGF-8 und Antikörperfragmente davon. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, welche diese Antikörper oder das Antikörperfragment codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor, umfassend die DNA-Sequenz, sowie eine Wirtszelle, welche mit dem Vektor transformiert ist. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der vorstehenden Antikörper oder der Antikörperfragmente unter Verwendung der Wirtszelle sowie ein therapeutisches Mittel und ein diagnostisches Mittel für Krebs unter Verwendung der Antikörper oder der Antikörperfragmente.
  • Hintergrund des Fachgebiets
  • Der durch ein Androgen induzierte Wachstumsfaktor (AIGF) ist ein Faktor, welcher in 1992 aus einem Kulturüberstand der Maus-Brusttumorzelllinie SC-3 [J. Steroid Biochem. 27 (1987), 459], die ein Geschlechtshormon-abhängiges Wachstum zeigt, isoliert wurde. Der AIGF ist ein Wachstumsfaktor, welcher unter Androgenstimulation induziert und hergestellt wird und das Wachstum von SC-3-Zellen in einer autokrinen Weise aktiviert [Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 8928–8932]. Als Ergebnis einer Genclonierung wurde festgestellt, dass er in Bezug auf die Aminosäuresequenz eine Homologie von 30% bis 40% mit der Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF)-Familie aufweist, und er wurde als FGF-8 bezeichnet. Danach wurde das menschliche FGF-8-Gen unter Verwendung eines Maus-FGF-8-Gens als Sonde aus einer menschlichen Plazenta-Genombank cloniert, und es wurde gezeigt, dass es mit dem Maus-FGF-8 zu 85% hinsichtlich der Nucleotidsequenz und zu 100% hinsichtlich der Aminosäuresequenz übereinstimmte [FEBS Letters 363 (1995), 226]. Es ist angenommen worden, dass Geschlechtshormon-induzierte Wachstumsfaktoren bei Krebserkrankungen wie Prostatakrebs und Brustkrebs, die ein Geschlechtshormon- abhängiges Wachstum zeigen, eine autokrine Funktion haben, und die Entdeckung von FGF-8, obgleich in einem Maussystem, war der erste Beweis für einen solchen Mechanismus. Es ist vermutet worden, dass FGF-8 durch einen ähnlichen Mechanismus auch mit der Entstehung und dem Wachstum von Krebs beim Menschen in Beziehung steht, aber dies ist nicht bewiesen worden. Jedoch wurde berichtet, dass das Wachstum einer bestimmten menschlichen Prostatakrebszelllinie durch die Zugabe von FGF-8 begünstigt wurde [FEBS Letters 363 (1995), 226]. Die Expression der mRNA wurde auch in verschiedenen menschlichen Krebszelllinien wie Prostatakrebs, Brustkrebs und Eierstockkrebs bestätigt [Cell Growth & Differ. 7 (1996), 1425; Oncogene 18 (1999), 1053; Int. J. Cancer 88 (2000), 718]. Es wurde auch gezeigt, dass der in menschlichen Krebsgeweben wie Prostatakrebs, Brustkrebs und Eierstockkrebs vorkommende FGF-8 im Vergleich zu dem FGF-8 in normalen Geweben überexprimiert wurde [Cancer Res. 58, 2053; Oncogene 18 (1999), 2755; Oncogene 18 (1999), 1053; Int. J. Cancer 88 (2000), 718]. Daher wurde von der Möglichkeit ausgegangen, dass FGF-8 in Bezug auf das Geschlechtshormon-abhängige Wachstum von Krebszellen beim Menschen auch eine autokrine und eine parakrine Funktion hat. Andererseits, da auch bei verschiedenen hormonunabhängigen menschlichen Prostatakrebszellen, Prostatakrebsgeweben und Brustkrebszellen eine Expression von FGF-8 mit einer hohen Häufigkeit beobachtet worden ist [Cell Growth & Differ. 7 (1996), 1425; Oncogene 18 (1999), 2755; Oncogene 18 (1999), 1053], besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass die Expression von FGF-8 auf eine Geschlechtshormon-unabhängige Weise kontrolliert wird. Außerdem, da es einen Bericht gibt, dass eine Antisense-DNA gegen FGF-8 das in-vitro- und in-vivo-Wachstum einer hormonunabhängigen Prostatakrebszelllinie hemmte [Oncogene 16 (1998), 1487], wird auch das Vorhandensein eines FGF-8-abhängigen Wachstumsmechanismus für Krebsarten angenommen, welche ihre Hormonabhängigkeit verloren haben.
  • Basierend auf diesen Fakten sind Antikörper gegen FGF-8 bei der Untersuchung der biologischen Funktion von FGF-8 für Krebszellen und auch bei der Diagnose von Krebszellen wie Prostatakrebs und Brustkrebs durch ein immunologisches Nachweisverfahren nützlich. Außerdem wird bei neutralisierenden Antikörpern, welche die Funktionen von FGF-8 inhibieren, erwartet, dass sie bei der Untersuchung der biologischen Funktion von FGF-8, der Diagnose von Krebserkrankungen wie Prostatakrebs, Brustkrebs und Eierstockkrebs sowie bei der Behandlung von Geschlechtshormon-abhängigen Krebserkrankungen und Geschlechtshormon-unabhängigen Krebserkrankungen nützlich sind. Daher betrieben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Herstellung eines Antikörpers gegen FGF-8, wobei ihnen als Ergebnis die Herstellung des monoclonalen Maus-Antikörpers KM1334 gelang, der mit FGF-8 spezifisch reagiert und die Funktion von FGF-8 inhibiert (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 271391/97 ; EP-A2 799 835 ).
  • Es ist allgemein bekannt, dass, wenn ein Antikörper, der von einem nicht-menschlichen Tier stammt, z. B. ein Maus-Antikörper, an einen Menschen verabreicht wird, dieser Antikörper als eine fremde Substanz erkannt wird und einen menschlichen Antikörper gegen den Maus-Antikörper (menschlichen Anti-Maus-Antikörper; nachstehend bezeichnet als "HAMA") in dem menschlichen Körper induziert. Es ist bekannt, dass der HAMA mit dem verabreichten Mausantikörper reagiert, wodurch Nebenwirkungen hervorgerufen werden [J. Clin. Oncol. 2 (1984), 881; Blood 65 (1985), 1349; J. Natl. Cancer Inst. 80 (1988), 932; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 1242], die Eliminierung des verabreichten Mausantikörpers aus dem Körper beschleunigt wird [J. Nucl. Med. 26 (1985), 1011; Blood 65 (1985), 1349; J. Natl. Cancer Inst. 80 (1988), 937] und die therapeutische Wirkungen des Mausantikörpers vermindert werden [J. Immunol. 135 (1985), 1530; Cancer Res. 46 (1986), 6489].
  • Um diese Probleme zu lösen, sind Versuche unternommen worden, um einen Antikörper, der von einem nicht-menschlichen Tier stammt, mit Hilfe der Gentechnik in einen humanisierten Antikörper wie einen menschlichen chimären Antikörper oder einen menschlichen CDR-transplantierten Antikörper („CDR-grafted antibody”) umzuwandeln.
  • Der menschliche chimäre Antikörper besteht aus einem Antikörper, wobei die V-Region von einem Antikörper eines nicht-menschlichen Tieres abgeleitet ist und die C-Region von einem menschlichen Antikörper stammt [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 6851]. Der menschliche CDR-transplantierte Antikörper umfasst die Aminosäuresequenz einer CDR-Region in der V-Region, welche von einem Antikörper eines nicht-menschlichen Tieres stammt, transplantiert in eine geeignete Position eines menschlichen Antikörpers [Nature 321 (1986), 522]. Im Vergleich zu Antikörpern, welche von nicht-menschlichen Tieren stammen, wie Mausantikörper und dergleichen, weisen diese humanisierten Antikörper verschiedene Vorteile für die klinische Anwendung auf. Zum Beispiel ist im Hinblick auf die Immunogenität und die Stabilität im Blut berichtet worden, dass sich die Halbwertszeit im Blut eines menschlichen chimären Antikörpers bei der Verabreichung an einen Menschen um etwa das sechsfache der Halbwertszeit eines Mausantikörpers verlängert [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 4220]. Im Falle eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers ist berichtet worden, dass dessen Immunogenität und dessen Halbwertszeit im Serum in einem Experiment unter Verwendung eines Affens im Vergleich zu einem Mausantikörper geringer war bzw. verlängert wurde [J. Immunol. 147 (1991), 1352]. Es wird daher erwartet, dass die humanisierten Antikörper weniger Nebenwirkungen haben und dass ihre therapeutischen Wirkungen über einen längeren Zeitraum anhalten als bei Antikörpern, die von nicht-menschlichen Tieren stammen.
  • Außerdem, da der menschliche CDR-transplantierte Antikörper mit Hilfe der Gentechnik erzeugt wird, können Moleküle in verschiedenen Formen hergestellt werden. Wenn zum Beispiel die Subklasse 1 als eine H-Ketten-C-Region (CH) eines menschlichen Antikörpers verwendet wird, kann ein humanisierter Antikörper mit einer starken Effektorfunktion wie zum Beispiel einer Antikörper-abhängigen zellvermittelten cytotoxischen Aktivität hergestellt werden [Cancer Res. 56 (1996), 1118]. Ein humanisierter Antikörper mit einer starken Effektorfunktion ist besonders wirksam, wenn ein Antigen auf der Oberfläche von Zellen wie Krebszellen vorhanden ist und die Zerstörung der Zielzelle gewünscht wird. Andererseits, falls nur eine Funktion erforderlich ist, wodurch das Zielmolekül neutralisiert wird, oder falls Nebenwirkungen durch die Zerstörung der Zielzelle hervorgerufen werden könnten, wird erwartet, dass diese Nebenwirkungen vermieden werden können und eine längere Halbwertszeit im Blutserum im Vergleich zu einem Mausantikörper erhalten werden kann, wenn die Subklasse 4 als die CH-Region des menschlichen Antikörpers verwendet wird [Immunol. 85 (1995), 668], da die Subklasse 4 üblicherweise eine geringe Effektorfunktion hat [J. Exp. Med. 166 (1987), 1351; J. Exp. Med. 168 (1998), 1351]. Außerdem können im Einklang mit den jüngsten Fortschritten im Hinblick auf die Proteinkonstruktion und die Genkonstruktion Antikörperfragmente mit einem geringeren Molekulargewicht wie Fab, Fab', F(ab')2, scFv [Science 242 (1988), 423], ein Diabody [Nature Biotechnol. 15 (1997), 629], dsFv [Molecular Immunol. 32 (1995), 249] und ein Peptid, umfassend eine CDR-Region [J. Biol. Chem. 271 (1996), 2966], als humanisierte Antikörper hergestellt werden. Die Antikörperfragmente zeigen eine überragende vorübergehende Aktivität in dem Zielgewebe, verglichen mit den vollständigen Antikörpermolekülen [Cancer Res. 52 (1992), 3402].
  • Es wird davon ausgegangen, dass die humanisierten Antikörper im Hinblick auf die klinische Anwendung beim Menschen wünschenswerter sind als Antikörper, welche von nicht-menschlichen Tieren stammen, wie Maus-Antikörper.
  • Wie vorstehend besprochen, wird erwartet, dass, wenn humanisierte Antikörper, welche mit FGF-8 spezifisch reagieren und die Funktion von FGF-8 inhibieren, oder Antikörperfragmente davon hergestellt werden, diese Antikörper und Antikörperfragmente als wirksame diagnostische Mittel oder therapeutische Mittel für Erkrankungen, welche mit FGF-8 in Beziehung stehen, wie Krebs, verwendet werden können. Jedoch sind solche Antikörper oder Antikörperfragmente bis jetzt noch nicht hergestellt worden.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung der humanisierten Antikörper oder deren Fragmente, wie in den Ansprüchen gekennzeichnet, welche mit FGF-8, von dem angenommen wird, dass er ein Wachstumsfaktor von Prostatakrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs und dergleichen ist, spezifisch reagieren und welche weiterhin die biologische Funktion von FGF-8 inhibieren.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung, welche die cDNA der H-Kette und die cDNA der L-Kette des Antikörpers aus dem Hybridom KM1334 (FERM BP-5451), das einen Mausantikörper gegen FGF-8, welcher der IgG1-Subklasse angehört, produziert, gewonnen haben, stellten fest, dass die V-Regionen und die CDR-Regionen neue Aminosäuresequenzen sind, und exprimierten und reinigten einen menschlichen chimären Anti-FGF-8-Antikörper und einen menschlichen CDR-transplantierten Anti-FGF-8-Antikörper durch das Clonieren der cDNAs, welche die neuen V-Regionen oder die VH-Region und die VL-Region, umfassend die CDRs, codieren, in einen Expressionsvektor für eine tierische Zelle, der die cDNAs umfasst, welche die CH-Region eines menschlichen Antikörpers und die L-Ketten-C-Region (CL) eines menschlichen Antikörpers codieren, um auf diese Weise einen Vektor für die Expression eines humanisierten Antikörpers zu konstruieren, und dann durch das Einbringen des Vektors für die Expression des Antikörpers in eine tierische Zelle. Auf diese Weise ist die vorliegende Erfindung durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen vollendet worden.
  • Folglich betrifft die vorliegende Erfindung humanisierte Antikörper, die mit FGF-8 spezifisch reagieren und welche die biologische Funktion von FGF-8 inhibieren, oder Antikörperfragmente davon.
  • Die biologische Funktion von FGF-8 beinhaltet eine Geschlechtshormonabhängige und -unabhängige Aktivität bei der Wachstumsbeschleunigung von verschiedenen Krebszellen wie Prostatakrebs, Brustkrebs und Eierstockkrebs [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 8928], eine Funktion bei der Vaskularisierung [Oncogene 20 (2001), 2791] und eine Funktion bei der Entstehung von Arthrose [Development 127 (2000), 2471; Nature Genet. 26 (2000), 460].
  • Ein menschlicher chimärer Antikörper ist ein Antikörper, der die VH-Region und die VL-Region eines Antikörpers, welcher von einem nicht-menschlichen Tier stammt, und die CH-Region und die CL-Region eines menschlichen Antikörpers umfasst. Das nicht-menschliche Tier kann ein beliebiges Tier wie eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Kaninchen und dergleichen sein, solange wie daraus ein Hybridom erzeugt werden kann.
  • Der menschliche chimäre Antikörper der vorliegenden Erfindung kann durch das Erhalten der cDNAs, welche die VH-Region und die VL-Region codieren, aus einem Hybridom, das einen monoclonalen Antikörper herstellt, welcher mit FGF-8 spezifisch reagiert, das Inserieren der cDNAs in einen Expressionsvektor für eine tierische Zelle, enthaltend die Gene, welche die CH-Region eines menschlichen Antikörpers und die CL-Region eines menschlichen Antikörpers codieren, um einen Vektor für die Expression des menschlichen chimären Antikörpers zu konstruieren, und das Einbringen des Vektors in eine tierische Zelle, um den Antikörper zu exprimieren, hergestellt werden.
  • Es kann irgendeine CH-Region eines menschlichen chimären Antikörpers verwendet werden, solange wie sie von einem menschlichen Immunglobulin (hlg) stammt, wobei solche der hlgG-Klasse bevorzugt werden, und weiterhin kann irgendeine der Subklassen von hlgG wie γ1, γ2, γ3 und γ4 verwendet werden. Ebenso kann irgendeine CL-Region eines menschlichen chimären Antikörpers verwendet werden, solange wie sie von einem hlg stammt, wobei solche der κ-Kiasse oder λ-Klasse verwendet werden können.
  • Der menschliche chimäre Antikörper, welcher mit FGF-8 spezifisch reagiert (chimärer Anti-FGF-8-Antikörper), umfasst einen menschlichen chimären Antikörper, welcher die komplementaritätsbestimmende Region (nachstehend bezeichnet als "CDR") 1, CDR2 und CDR3 der variablen Region (V-Region) der schweren Kette (H-Kette) eines Antikörpers, umfassend die in SEQ ID NO: 5, 6 bzw. 7 dargestellte Aminosäuresequenzen, umfasst und/oder CDR1, CDR2 und CDR3 der variablen Region (V-Region) der leichten Kette (L-Kette) eines Antikörpers, umfassend die in SEQ ID NO: 8, 9 bzw. 10 dargestellte Aminosäuresequenzen, umfasst, und vorzugsweise einen menschlichen chimären Antikörper, wobei die VH-Region die in SEQ ID NO: 40 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst und/oder die VL-Region die in SEQ ID NO: 41 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst. Beispiele schließen den Antikörper KM3034 ein, wobei die VH-Region des Antikörpers die in SEQ ID NO: 40 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, die CH-Region des menschlichen Antikörpers eine Aminosäuresequenz der Subklasse 71 umfasst, die VL-Region des Antikörpers die in SEQ ID NO: 41 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, und die CL-Region des menschlichen Antikörpers eine Aminosäuresequenz der κ-Klasse umfasst.
  • Ein menschlicher CDR-transplantierter Antikörper ist ein Antikörper, wobei die CDR-Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region eines Antikörpers, welcher von einem nicht-menschlichen Tier stammt, in geeignete Positionen der VH-Region und der VL-Region eines menschlichen Antikörpers transplantiert sind.
  • Der menschliche CDR-transplantierte Antikörper der vorliegenden Erfindung kann durch das Transplantieren der CDR-Sequenzen der VH-Region und der VL-Region eines Antikörpers, welcher mit FGF-8 spezifisch reagiert, eines nicht-menschlichen Tiers in FR-Fragmente der VH-Region und der VL-Region eines beliebigen menschlichen Antikörpers, um cDNAs zu konstruieren, die die erhaltenen V-Regionen codieren, das Inserieren der cDNAs in einen Expressionsvektor für eine tierische Zelle, enthaltend die DNAs, welche die CH-Region und die CL-Region eines menschlichen Antikörpers codieren, um einen Vektor für die Expression des menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers zu konstruieren, und dann das Einbringen davon in eine tierische Zelle, um den Antikörper zu exprimieren, hergestellt werden.
  • Es kann irgendeine CH-Region eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers verwendet werden, solange wie sie von einem hIg stammt, wobei solche der hIgG-Klasse bevorzugt werden, und irgendeine der Subklassen von hIgG wie 71, γ2, γ3 und γ4 kann verwendet werden. Ebenso kann irgendeine CL-Region eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers verwendet werden, solange wie sie von einem hIg stammt, wobei solche der κ-Klasse oder λ-Klasse verwendet werden können.
  • Der menschliche CDR-transplantierte Antikörper, welcher mit FGF-8 spezifisch reagiert (Anti-FGF-8-CDR-transplantierter Antikörper) schließt einen menschlichen CDR-transplantierten Antikörper ein, welcher CDR1, CDR2 und CDR3 der VH-Region eines Antikörpers, umfassend die in SEQ ID NO: 5, 6 bzw. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen, umfasst, und/oder CDR1, CDR2 und CDR3 der VL-Region eines Antikörpers, umfassend die in SEQ ID NO: 8, 9 bzw. 10 dargestellten Aminosäuresequenzen, umfasst; vorzugsweise einen menschlichen CDR-transplantierten Antikörper, wobei die VH-Region die in SEQ ID NO: 16 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst und/oder die VL-Region die in SEQ ID NO: 17 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst; und mehr bevorzugt einen menschlichen CDR-transplantierten Antikörper, wobei die VH-Region des Antikörpers eine Aminosäuresequenz umfasst, worin mindestens ein Aminosäurerest, ausgewählt aus Lys in Position 12, Lys in Position 13, Ala in Position 40, Pro in Position 41, Met in Position 48, Val in Position 68, Ile in Position 70, Thr in Position 74, Thr in Position 76, Glu in Position 82, Ser in Position 84, Arg in Position 87 und Tyr in Position 95, in der in SEQ ID NO: 16 dargestellten Aminosäuresequenz durch einen anderen Aminosäurerest substituiert ist; sowie einen menschlichen CDR-transplantierten Antikörper, wobei die VL-Region des Antikörpers eine Aminosäuresequenz umfasst, worin mindestens ein Aminosäurerest, ausgewählt aus Ile in Position 2, Val in Position 3, Thr in Position 14, Pro in Position 15, Gln in Position 50, Leu in Position 51 und Tyr in Position 92, in der in SEQ ID NO: 17 dargestellten Aminosäuresequenz durch einen anderen Aminosäurerest substituiert ist; und einen menschlichen CDR-transplantierten Antikörper, wobei die VH-Region des Antikörpers eine Aminosäuresequenz umfasst, worin mindestens ein Aminosäurerest, ausgewählt aus Lys in Position 12, Lys in Position 13, Ala in Position 40, Pro in Position 41, Met in Position 48, Val in Position 68, Ile in Position 70, Thr in Position 74, Thr in Position 76, Glu in Position 82, Ser in Position 84, Arg in Position 87 und Tyr in Position 95, in der in SEQ ID NO: 16 dargestellten Aminosäuresequenz durch einen anderen Aminosäurerest substituiert ist, und wobei die VL-Region des Antikörpers eine Aminosäuresequenz umfasst, worin mindestens ein Aminosäurerest, ausgewählt aus Ile in Position 2, Val in Position 3, Thr in Position 14, Pro in Position 15, Gln in Position 50, Leu in Position 51 und Tyr in Position 92, in der in SEQ ID NO: 17 dargestellten Aminosäuresequenz durch eine andere Aminosäure substituiert ist. Beispiele für die VH-Region schließen die in SEQ ID NO: 18 dargestellte Aminosäuresequenz ein, wobei sechs Reste, umfassend Lys in Position 12, Lys in Position 13, Ala in Position 40, Pro in Position 41, Met in Position 48 und Tyr in Position 95, in der in SEQ ID NO: 16 dargestellten Aminosäuresequenz durch Ala, Arg, Arg, Ser, Ile bzw. Phe modifiziert sind. Beispiele für die VL-Region schließen die in SEQ ID NO: 19 dargestellte Aminosäuresequenz ein, wobei sechs Reste, umfassend Ile in Position 2, Thr in Position 14, Pro in Position 15, Gln in Position 50, Leu in Position 51 und Tyr in Position 92, in der in SEQ ID NO: 17 dargestellten Aminosäuresequenz durch Val, Ser, Leu, Lys, Val bzw. Phe modifiziert sind; sowie die in SEQ ID NO: 38 dargestellte Aminosäuresequenz, wobei vier Reste, umfassend Thr in Position 14, Pro in Position 15, Leu in Position 51 und Tyr in Position 92, durch Ser, Leu, Val bzw. Phe modifiziert sind; und die in SEQ ID NO: 39 dargestellte Aminosäuresequenz, wobei drei Reste, umfassend Ile in Position 2, Leu in Position 51 und Tyr in Position 92, durch Val, Val bzw. Phe modifiziert sind.
  • Beispiele umfassen einen menschlichen CDR-transplantierten Antikörper, wobei die VH-Region des Antikörpers die in SEQ ID NO: 16 oder 18 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst; einen menschlichen CDR-transplantierten Antikörper, wobei die VL-Region des Antikörpers die in SEQ ID NO: 17, 19, 38 oder 39 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst; einen menschlichen CDR-transplantierten Antikörper, wobei die VH-Region und die VL-Region des Antikörpers die in SEQ ID NO: 16 oder 18 bzw. in SEQ ID NO: 17, 19, 38 oder 39 dargestellten Aminosäuresequenzen umfassen; und ähnliche und vorzugsweise einen menschlichen CDR-transplantierten Antikörper, wobei die VH-Region und die VL-Region des Antikörpers die in SEQ ID NO: 16 bzw. in SEQ ID NO: 19 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen; einen menschlichen CDR-transplantierten Antikörper, wobei die VH-Region und die VL-Region des Antikörpers die in SEQ ID NO: 16 bzw. in SEQ ID NO: 38 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen; und einen menschlichen CDR-transpiantierten Antikörper, wobei die VH-Region und die VL-Region des Antikörpers die in SEQ ID NO: 16 bzw. in SEQ ID NO: 39 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen.
  • Das Antikörperfragment der vorliegenden Erfindung schließt Fab, Fab', F(ab')2, scFv, einen Diabody, dsFv, ein Peptid, das eine CDR-Region umfasst, und dergleichen ein.
  • Ein Fab-Fragment ist ein Antikörperfragment mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000 und einer Antigenbindungsaktivität, wobei die Fragmente, welche durch die Behandlung von IgG mit der Protease Papain (die an dem Aminosäurerest in Position 224 in der H-Kette schneidet) erhalten werden, umfassend ungefähr die Hälfte der N-terminalen Seite der H-Kette und die gesamte L-Kette, über eine Disulfidbrücke (S-S-Bindung) miteinander verbunden sind.
  • Das Fab-Fragment der vorliegenden Erfindung kann durch das Behandeln eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung, welcher mit FGF-8 spezifisch reagiert, mit der Protease Papain erhalten werden. Das Fab-Fragment kann auch durch die Insertion einer DNA, welche das Fab-Fragment des Antikörpers codiert, in einen Expressionsvektor für einen Prokaryonten oder einen Expressionsvektor für einen Eukaryonten und das Einbringen des Vektors in einen Prokaryonten oder einen Eukaryonten, um das Fab-Fragment zu exprimieren, hergestellt werden.
  • Ein F(ab')2-Fragment ist ein Antikörperfragment mit einem Molekulargewicht von etwa 100.000 und einer Antigenbindungsaktivität, welches etwas größer als das Fab-Fragment ist, wobei die Fragmente, welche durch die Behandlung von IgG mit der Protease Pepsin (welche an dem Aminosäurerest in Position 234 in der H-Kette schneidet) erhalten werden, über eine S-S-Bindung in der Gelenkregion miteinander verbunden sind.
  • Das F(ab')2-Fragment der vorliegenden Erfindung kann durch das Behandeln eines Antikörpers, welcher mit FGF-8 spezifisch reagiert, mit der Protease Pepsin erhalten werden. Das F(ab')2-Fragment kann auch durch die Verknüpfung von Fab'-Fragmenten, welche nachstehend beschrieben werden, über eine Thioetherbindung oder eine S-S-Bindung erzeugt werden.
  • Ein Fab'-Fragment ist ein Antikörperfragment mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000 und einer Antigenbindungsaktivität, welches durch die Spaltung einer S-S-Bindung in der Gelenkregion des vorstehenden F(ab')2-Fragments erhalten wird.
  • Das Fab'-Fragment der vorliegenden Erfindung kann durch die Behandlung des F(ab')2-Fragments, welches mit FGF-8 spezifisch reagiert, mit dem Reduktionsmittel Dithiothreit erhalten werden. Das Fab'-Fragment kann auch durch die Insertion einer DNA, welche das Fab'-Fragment des Antikörpers codiert, in einen Expressionsvektor für einen Prokaryonten oder einen Expressionsvektor für einen Eukaryonten und das Einbringen des Vektors in einen Prokaryonten oder einen Eukaryonten, um das Fab'-Fragment zu exprimieren, hergestellt werden.
  • Ein scFv-Fragment ist ein VH-P-VL- oder VL-P-VH-Polypeptid, worin eine VH-Kette und eine VL-Kette unter Verwendung eines geeigneten Peptidlinkers (P) aus 12 oder mehr Resten miteinander verbunden sind, welches eine Antigenbindungsaktivität besitzt.
  • Das scFv-Fragment der vorliegenden Erfindung kann durch Erhalten der cDNAs, codierend die VH-Region und die VL-Region eines Antikörpers, der mit FGF-8 spezifisch reagiert, das Konstruieren einer DNA, welche das scFv-Fragment codiert, die Insertion der DNA in einen Expressionsvektor für einen Prokaryonten oder einen Expressionsvektor für einen Eukaryonten und dann das Einbringen des Expressionsvektors in einen Prokaryonten oder einen Eukaryonten, um das scFv-Fragment zu exprimieren, hergestellt werden.
  • Ein Diabody ist ein Antikörperfragment, worin scFv-Fragmente, welche die gleiche oder eine unterschiedliche Antigenbindungsspezifität haben, ein Dimer bilden, wobei das Fragment eine divalente Antigenbindungsaktivität gegen das gleiche Antigen oder zwei spezifische Antigenbindungsaktivitäten gegen verschiedene Antigene besitzt.
  • Der Diabody der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel ein divalenter Diabody, welcher mit FGF-8 spezifisch reagiert, kann durch Erhalten der cDNAs, codierend die VH-Region und die VL-Region eines Antikörpers, das Konstruieren einer DNA, welche ein scFv-Fragment mit einem Polypeptidlinker aus 3 bis 10 Resten codiert, die Insertion der DNA in einen Expressionsvektor für einen Prokaryonten oder einen Expressionsvektor für einen Eukaryonten und dann das Einbringen des Expressionsvektors in einen Prokaryonten oder einen Eukaryonten, um den Diabody zu exprimieren, hergestellt werden.
  • Ein dsFv-Fragment wird durch die Verknüpfung von Polypeptiden, worin jeweils ein Aminosäurerest in der VH-Region und der VL-Region durch einen Cysteinrest substituiert ist, über eine S-S-Bindung zwischen den Cysteinresten erhalten. Der Aminosäurerest, welcher durch einen Cysteinrest substituiert wird, kann basierend auf einer dreidimensionalen Strukturannahme des Antikörpers gemäß der durch Reiter et al. [Protein Engineering 7 (1994), 697] vorgestellten Methode ausgewählt werden.
  • Das dsFv-Fragment der vorliegenden Erfindung kann durch Erhalten der cDNAs, codierend die VH-Region und die VL-Region eines Antikörpers, der mit FGF-8 spezifisch reagiert, das Konstruieren einer DNA, welche das dsFv-Fragment codiert, die Insertion der DNA in einen Expressionsvektor für einen Prokaryonten oder einen Expressionsvektor für einen Eukaryonten und dann das Einbringen des Expressionsvektors in einen Prokaryonten oder einen Eukaryonten, um das dsFv-Fragment zu exprimieren, hergestellt werden.
  • Ein Peptid, das eine CDR-Region umfasst, umfasst mindestens eine CDR-Region aus der VH-Region oder der VL-Region. Ein Peptid, das mehrere CDR-Regionen umfasst, kann hergestellt werden, indem die CDR-Regionen direkt oder über einen geeigneten Peptidlinker miteinander verknüpft werden.
  • Das Peptid, das eine CDR-Region umfasst, der vorliegenden Erfindung kann durch die Konstruktion der cDNAs, codierend die CDRs der VH-Region und der VL-Region eines Antikörpers, der mit FGF-8 spezifisch reagiert, die Insertion der cDNAs in einen Expressionsvektor für einen Prokaryonten oder einen Expressionsvektor für einen Eukaryonten und dann das Einbringen des Expressionsvektors in einen Prokaryonten oder einen Eukaryonten, um das Peptid zu exprimieren, hergestellt werden. Das Peptid, das eine CDR-Region umfasst, kann auch durch ein chemisches Syntheseverfahren wie die Fmoc-Methode (Fluorenylmethoxycarbonyl-Methode), die tBoc-Methode (t-Butyloxycarbonyl-Methode) oder dergleichen hergestellt werden.
  • Ein Verfahren zur Herstellung des menschlichen chimären Antikörpers, des menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers und des Antikörperfragments davon, welche mit FGF-8 spezifisch reagieren und die Funktion von FGF-8 inhibieren, sowie eine Methode zur Beurteilung der Aktivität und ein Verfahren zur Verwendung davon werden nachstehend erläutert.
  • 1. Herstellung eines menschlichen chimären Antikörpers und eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers
  • (1) Konstruktion eines Vektors für die Expression eines humanisierten Antikörpers
  • Ein Vektor für die Expression eines humanisierten Antikörpers ist ein Expressionsvektor für eine tierische Zelle, in den die DNAs, welche die CH-Region und die CL-Region eines menschlichen Antikörpers codieren, inseriert worden sind, und welcher durch die Clonierung der jeweiligen DNAs, welche die CH-Region und die CL-Region eines menschlichen Antikörpers codieren, in einen Expressionsvektor für eine tierische Zelle konstruiert wird.
  • Die C-Region eines menschlichen Antikörpers kann die CH-Region und die CL-Region eines beliebigen menschlichen Antikörpers umfassen. Beispiele schließen die CH-Region der Subklasse γ1 und die CL-Region der κ-Klasse eines menschlichen Antikörpers und dergleichen ein. Was die DNAs anbetrifft, welche die CH-Region und die CL-Region eines menschlichen Antikörpers codieren, kann eine chromosomale DNA, umfassend ein Exon und ein Intron, oder eine cDNA verwendet werden. Was den Expressionsvektor für eine tierische Zelle anbetrifft, kann ein beliebiger Expressionsvektor verwendet werden, solange wie die C-Region eines menschlichen Antikörpers darin inseriert und exprimiert werden kann. Beispiele schließen pAGE107 [Cytotechnology 3 (1990), 133], pAGE103 [J. Biochem. 101 (1987), 1307], pHSG274 [Gene 27 (1984), 223], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527], pSGIβd2-4 [Cytotechnology 4 (1990), 173], pSE1 UK1Sed1-3 [Cytotechnology 13 (1993), 79] und dergleichen ein. Beispiele eines Promotors und eines Enhancers, welche in einem Expressionsvektor für eine tierische Zelle verwendet werden, schließen den frühen SV40-Promotor und -Enhancer [J. Biochem. 101 (1987), 1307], den Moloney-Maus-Leukämievirus-LTR-Promotor und -Enhancer [Biochem. Biophys. Res. Commun. 149 (1987), 960], den Promotor [Cell 41 (1985), 479] und den Enhancer [Cell 33 (1983), 717] der H-Kette eines Immunglobulins und dergleichen ein.
  • Der Vektor für die Expression eines humanisierten Antikörpers kann entweder dem Typ entsprechen, worin die H-Kette und die L-Kette des Antikörpers auf separaten Vektoren vorliegen, oder dem Typ, worin beide Ketten auf dem gleichen Vektor vorliegen (Tandem-Typ). Im Hinblick auf die Einfachheit der Konstruktion eines Vektors für die Expression eines humanisierten Antikörpers, die Einfachheit der Einschleusung in tierische Zellen und der Ausgeglichenheit zwischen den Expressionsmengen der H-Kette und der L-Kette des Antikörpers in tierischen Zellen wird ein Tandem-Typ des Vektors für die Expression eines humanisierten Antikörpers bevorzugt [J. Immunol. Methods 167 (1994), 271]. Beispiele für den Tandem-Typ des Vektors für die Expression eines humanisierten Antikörpers schließen pKANTEX93 ( WO 97/10354 ), pEE18 [Hybridoma 17 (1998), 559] und dergleichen ein.
  • Der konstruierte Vektor für die Expression eines humanisierten Antikörpers kann zur Expression eines menschlichen chimären Antikörpers und eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers in tierischen Zellen verwendet werden.
  • (2) Herstellung einer cDNA, codierend die V-Region eines Antikörpers, der von einem nicht-menschlichen Tier stammt, und Analyse der Aminosäuresequenz
  • Die cDNAs, codierend die VH-Region und die VL-Region eines Antikörpers, der von einem nicht-menschlichen Tier stammt, wie eines Mausantikörpers, werden wie folgt erhalten.
  • Aus Hybridomzellen, die einen Mausantikörper oder dergleichen herstellen, wird die mRNA extrahiert. Anschließend wird unter Verwendung der mRNA eine cDNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA wird in einen Vektor wie einen Phagen oder ein Plasmid inseriert, um eine cDNA-Bank herzustellen. Unter Verwendung eines Teils der C-Region oder der V-Region eines Mausantikörpers als Sonde werden jeweils ein rekombinanter Phage oder ein rekombinantes Plasmid, enthaltend die cDNA, welche die VH-Region codiert, und ein rekombinanter Phage oder ein rekombinantes Plasmid, enthaltend die cDNA, welche die VL-Region codiert, aus der Bank isoliert. Die vollständigen Nucleotidsequenzen der VH-Region und der VL-Region des Mausantikörpers von Interesse auf dem rekombinanten Phagen oder dem rekombinanten Plasmid werden bestimmt, und die vollständigen Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region werden aus den Nucleotidsequenzen abgeleitet.
  • Das nicht-menschliche Tier kann irgendein Tier wie eine Maus, eine Ratte, ein Hamster oder ein Kaninchen sein, solange wie ein Hybridom davon erzeugt werden kann.
  • Das Verfahren zur Präparation der Gesamt-RNA aus einem Hybridom schließt die Guanidin-Thiocyanat-Cäsiumtrifluoracetat-Methode [Methods in Enzymol. 154 (1987), 3] und dergleichen ein. Das Verfahren zur Präparation der mRNA aus der Gesamt-RNA schließt eine Methode unter Verwendung von Oligo(dT), immobilisiert an eine Cellulosesäule [Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)] und dergleichen ein. Ein Kit für die Präparation der mRNA aus einer Hybridomzelle schließt den Fast Track mRNA-lsolationskit (hergestellt von Invitrogen), den Quick Prep mRNA-Reinigungskit (hergestellt von Pharmacia) und dergleichen ein.
  • Das Verfahren zur Synthese einer cDNA und zur Herstellung einer cDNA-Bank schließt herkömmliche Verfahren [Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Anhang 1–34], ein Verfahren unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits wie des Super ScriptTM Plasmid-Systems für die cDNA-Synthese und der Plasmidclonierung (hergestellt von Gibco-BRL) oder des ZAP-cDNA-Kits (hergestellt von Stratagene), und dergleichen ein.
  • Jeder beliebiger Vektor, in den die cDNA inseriert werden kann, welche unter Verwendung der mRNA, die aus einem Hybridom extrahiert wurde, als Matrize synthetisiert wurde, um eine cDNA-Bank herzustellen, kann verwendet werden, solange wie die cDNA inseriert werden kann. Beispiele schließen ZAP-Express [Strategies 5 (1992), 58], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research 17 (1989), 9494], λzapII (hergestellt von Stratagene), λgt10 und λgt11 [DNA Cloning: A Practical Approach 1 (1985), 49], Lambda BlueMid (hergestellt von Clontech), λExCell und pP7T3-18U (hergestellt von Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 280], pUC18 [Gene 33 (1985), 103] und dergleichen ein.
  • Es kann ein beliebiges E. coli-Bakterium verwendet werden, um die cDNA-Bank, welche unter Verwendung eines Phagen- oder Plasmidvektors konstruiert wurde, einzuschleusen, solange wie die cDNA-Bank eingeschleust, exprimiert und aufrechterhalten werden kann. Beispiele schließen XL1-Blue MRF' [Strategies 5 (1992), 81], C600 [Genetics 39 (1954), 440], Y1088 und Y1090 [Science 222 (1983), 778], NM522 [J. Mol. Biol. 166 (1983), 1], K802 [J. Mol. Biol. 16 (1966), 118], JM105 [Gene 38 (1985), 275] und dergleichen ein.
  • Ein Koloniehybridisierungs- oder Plaquehybridisierungsverfahren unter Verwendung einer Isotop- oder Fluoreszenz-markierten Sonde kann verwendet werden, um die cDNA-Clone, codierend die VH-Region und die VL-Region eines Antikörpers, welcher von einem nicht-menschlichen Tier stammt, in der cDNA-Bank zu selektieren [Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)]. Die cDNAs, welche die VH-Region und die VL-Region codieren, können auch durch eine Polymerasekettenreaktion [PCR; Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Anhang 1–34] mittels der Konstruktion von Primern und unter Verwendung einer cDNA, welche aus der mRNA hergestellt wurde oder aus einer cDNA-Bank isoliert wurde, als Matrize hergestellt werden.
  • Die Nucleotidsequenz der cDNA kann durch das Spalten der cDNA, welche durch das vorstehende Verfahren selektiert wurde, mit geeigneten Restriktionsenzymen und dergleichen, das Clonieren der Fragmente in ein Plasmid wie pBluescript SK(–) (hergestellt von Stratagene), das Durchführen einer Umsetzung mittels eines herkömmlicherweise angewendeten Nucleotid-Analyseverfahren wie der Didesoxy-Methode nach Sanger F. et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463] und dann das Analysieren der Sequenz unter Verwendung eines automatischen Nucleotidsequenzanalysengerätes wie ABI377 (hergestellt von Applied Biosystems) oder dergleichen bestimmt werden.
  • Ob die erhaltenen cDNAs die vollständigen Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region des Antikörpers codieren, welche eine sekretorische Signalsequenz enthalten, kann durch die Ableitung der vollständigen Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region aus der bestimmten Nucleotidsequenz und den Vergleich davon mit den vollständigen Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region von bekannten Antikörpern [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] bestätigt werden. Die Länge der sekretorischen Signalsequenz und der N-terminalen Aminosäuresequenz kann durch den Vergleich der vollständigen Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region des Antikörpers, umfassend eine sekretorische Signalsequenz, mit den vollständigen Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region von bekannten Antikörpern [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], wobei die Untergruppe, denen sie angehören, bekannt sein kann, abgeleitet werden. Außerdem kann die Aminosäuresequenz aller CDR-Regionen in der VH-Region und der VL-Region identifiziert werden.
  • Ferner kann die Neuartigkeit der Sequenz durch das Durchführen einer Homologiesuche zu Sequenzen in einer beliebigen Datenbank, zum Beispiel SWISS-PROT, PIR-Protein oder dergleichen, unter Verwendung der vollständigen Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region zum Beispiel nach der BLAST-Methode [J. Mol. Biol. 215 (1990), 403] oder dergleichen untersucht werden.
  • (3) Konstruktion eines Vektors für die Expression des menschlichen chimären Antikörpers
  • Ein Vektor für die Expression des menschlichen chimären Antikörpers kann durch die Clonierung der cDNAs, codierend die VH-Region und die VL-Region eines Antikörpers, welcher von einem nicht-menschlichen Tier stammt, stromaufwärts der DNAs, welche die CH-Region und die CL-Region eines menschlichen Antikörpers codieren, auf dem Vektor für die Expression eines humanisierten Antikörpers, wie unter Punkt 1(1) beschrieben, konstruiert werden. Zum Beispiel werden unter Verwendung eines Plasmids, umfassend die cDNAs, welche die VH-Region und die VL-Region eines Antikörpers codieren, welcher von einem nicht-menschlichen Tier stammt, als Matrize die VH-Region und die VL-Region des Antikörpers mittels PCR unter Verwendung von Primern an dem 5'-terminalen Ende und dem 3'-terminalen Ende, umfassend die Erkennungssequenz eines geeigneten Restriktionsenzyms und eine Nucleotidsequenz, welche die V-Region codiert, amplifiziert. Das jeweilige amplifizierte Produkt wird in ein Plasmid wie pBluescript SK(–) (hergestellt von Stratagene) cloniert, und die Nucleotidsequenz wird gemäß dem unter Punkt 1(2) beschriebenen Verfahren bestimmt. Auf diese Weise wird ein Plasmid erhalten, das die DNA-Sequenzen umfasst, welche die Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region des gewünschten Antikörpers codieren. Die cDNAs, welche die Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region des Antikörpers codieren, werden aus dem Plasmid isoliert und zur Expression davon in einer geeigneten Form stromaufwärts der Gene, welche die C-Regionen der H-Kette und der L-Kette des menschlichen Antikörpers codieren, in den Vektor für die Expression eines humanisierten Antikörpers, wie unter Punkt 1(1) beschrieben, cloniert, um auf diese Weise einen Vektor für die Expression des menschlichen chimären Antikörpers zu konstruieren.
  • (4) Konstruktion einer cDNA, welche die V-Region eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers codiert
  • Die cDNAs, welche die VH-Region und die VL-Region eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers codieren, können wie folgt erhalten werden. Zuerst werden die Aminosäuresequenzen von FR-Regionen in der VH-Region und der VL-Region eines menschlichen Antikörpers, in welche die Aminosäuresequenzen von CDR-Regionen in der VH-Region und der VL-Region eines Antikörpers transplantiert werden, welche von einem Antikörper abgeleitet sind, der von einem nicht-menschlichen Tier stammt, ausgewählt. Es können beliebige Aminosäuresequenzen von FR-Regionen in der VH-Region und der VL-Region eines menschlichen Antikörpers verwendet werden, solange wie sie von einem menschlichen Antikörper stammen. Beispiele schließen Aminosäuresequenzen von FR-Fragmenten in der VH-Region und der VL-Region von menschlichen Antikörpern, welche in einer Datenbank wie der Proteindatenbank erfasst sind, sowie Aminosäuresequenzen, welche in den Untergruppen von FR-Regionen in der VH-Region und der VL-Region von menschlichen Antikörpern häufig vorkommen [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], und dergleichen ein. Von diesen Sequenzen werden für die Herstellung eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers mit einer wirksamen Aktivität vorzugsweise Aminosäuresequenzen mit einer hohen Homologie (mindestens 60% oder mehr) mit den Aminosäuresequenzen von FR-Regionen in der VH-Region und der VL-Region eines Zielantikörpers, welcher von einem nicht-menschlichen Tier stammt, ausgewählt.
  • Anschließend werden die Aminosäuresequenzen von CDR-Regionen in der VH-Region und der VL-Region des Antikörpers, welcher von einem nicht-menschlichen Tier stammt, in die ausgewählten Aminosäuresequenzen von FR-Regionen in der VH-Region und der VL-Region eines menschlichen Antikörpers transplantiert, um die Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers zu konstruieren. Die konstruierten Aminosäure sequenzen werden unter Berücksichtigung der Frequenz des Codongebrauchs, welche für Nucleotidsequenzen von Genen, codierend Antikörper, ermittelt wurde [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], in Nucleotidsequenzen translatiert, und anschließend werden die DNA-Sequenzen, welche die Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers codieren, konstruiert. Hierzu werden mehrere synthetische DNAs mit einer Länge von etwa 100 Nucleotiden basierend auf den entworfenen Nucleotidsequenzen synthetisiert. Im Anschluss daran wird unter Verwendung dieser DNAs eine PCR durchgeführt. In diesem Fall wird bevorzugt, dass im Hinblick auf die Reaktionseffizienz der PCR und die Längen der DNAs, welche synthetisiert werden können, jeweils 6 synthetische DNAs für die VH-Region und die VL-Region entworfen werden. Ferner können diese DNAs ohne weiteres in den Vektor für die Expression eines humanisierten Antikörpers, welcher unter Punkt 1(1) konstruiert wurde, cloniert werden, indem die Erkennungssequenz eines geeigneten Restriktionsenzyms in das an beiden Enden vorhandene 5'-Ende der synthetischen DNAs eingeführt wird. Im Anschluss an die PCR wird das amplifizierte Produkt in ein Plasmid wie pBluescript SK(–) (hergestellt von Stratagene) cloniert, und die Nucleotidsequenzen werden gemäß dem Verfahren, welches unter Punkt 1(2) beschrieben ist, bestimmt, um ein Plasmid zu erhalten, das die Nucleotidsequenzen enthält, welche die VH-Region und die VL-Region des konstruierten menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers codieren.
  • (5) Modifikation der Aminosäuresequenz der V-Region des menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers
  • Es ist bekannt, dass, wenn ein menschlicher CDR-transplantierter Antikörper dadurch hergestellt wird, dass lediglich nur CDRs aus der VH-Region und der VL-Region eines Antikörpers, welcher von einem nicht-menschlichen Tier stammt, in die FR-Regionen in der VH-Region und der VL-Region eines menschlichen Antikörpers transplantiert werden, die Antigenbindungsaktivität geringer ist als diejenige des ursprünglichen Antikörpers, welcher von einem nicht-menschlichen Tier stammt [Bio/Technology 9 (1991), 266]. Als Grund hierfür wird in Betracht gezogen, dass mehrere Aminosäurereste nicht nur in den CDR-Regionen, sondern auch in den FR-Regionen direkt oder indirekt mit der Antigenbindungsaktivität in der VH-Region und der VL-Region des ursprünglichen Antikörpers, der von einem nicht-menschlichen Tier stammt, in Beziehung stehen, und dass sie durch andere Aminosäurereste anderer FR-Regionen in der VH-Region und der VL-Region eines menschlichen Antikörpers ersetzt werden. Um dieses Problem zu lösen, wird bei menschlichen CDR-transplantierten Antikörpern in den Aminosäuresequenzen der FR-Regionen in der VH-Region und der VL-Region eines menschlichen Antikörpers ein Aminosäurerest, welcher direkt mit der Bindung an ein Antigen in Beziehung steht, oder ein Aminosäurerest, welcher indirekt mit der Bindung an ein Antigen in Beziehung steht, durch die Wechselwirkung mit einem Aminosäurerest in der CDR-Region oder durch die Beibehaltung der dreidimensionalen Struktur eines Antikörpers identifiziert und zu einem Aminosäurerest modifiziert, der in dem ursprünglichen Antikörper, welcher von einem nicht-menschlichen Tier stammt, vorhanden ist, wodurch die Antigenbindungsaktivität, die vermindert worden ist, erhöht wird [Bio/Technology 9 (1991), 266]. Bei der Herstellung eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers ist die effiziente Identifizierung der Aminosäurereste, welche mit der Antigenbindungsaktivität in der FR-Region in Beziehung stehen, besonders wichtig, wobei die dreidimensionale Struktur eines Antikörpers konstruiert und durch Röntgenkristallographie [J. Mol. Biol. 112 (1977), 535], computergestützte Modellerstellung [Protein Engineering 7 (1991), 1501] oder dergleichen analysiert wird. Obwohl die Information der dreidimensionalen Struktur von Antikörpern bei der Herstellung eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers nützlich gewesen ist, ist bisher noch kein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers entwickelt worden, welches auf alle Antikörper angewendet werden kann. Daher müssen gegenwärtig verschiedene Versuche durchgeführt werden, wobei zum Beispiel mehrere modifizierte Antikörper des jeweiligen Antikörpers hergestellt werden, um die Beziehung zwischen jedem der modifizierten Antikörper und dessen Antigenbindungsaktivität zu untersuchen.
  • Die Modifikation der ausgewählten Aminosäuresequenz einer FR-Region in der VH-Region und der VL-Region eines menschlichen Antikörpers kann durch eine PCR unter Verwendung von verschiedenen synthetischen DNAs für die Modifikation erfolgen. Die Nucleotidsequenz des amplifizierten Produkts, welches durch die PCR erhalten wurde, wird gemäß dem Verfahren, das vorstehend unter Punkt 1(2) be schrieben wurde, bestimmt, um zu überprüfen, ob die gewünschte Modifikation eingeführt worden ist.
  • (6) Konstruktion eines Vektors für die Expression des menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers
  • Der Vektor für die Expression des menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers kann durch die Clonierung der cDNAs, codierend die VH-Region und die VL-Region des menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers, welche unter Punkt 1(4) und 1(5) konstruiert wurden, stromaufwärts der DNAs, welche die CH-Region und die CL-Region des menschlichen Antikörpers codieren, in den Vektor für die Expression eines humanisierten Antikörpers, wie unter Punkt 1(1) beschrieben, konstruiert werden. Wenn zum Beispiel Erkennungsstellen für geeignete Restriktionsenzyme in das 5'-Ende der synthetischen DNAs an beiden Enden in die synthetischen DNAs eingeführt werden, welche bei der Konstruktion der VH-Region und der VL-Region des menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers unter Punkt 1(4) und 1(5) verwendet wurden, kann die Clonierung derart erfolgen, dass die DNAs in einer geeigneten Form stromaufwärts der DNAs, welche die CH-Region und die CL-Region des menschlichen Antikörpers codieren, in dem Vektor für die Expression eines humanisierten Antikörpers, wie unter Punkt 1(1) beschrieben, exprimiert werden.
  • (7) Transiente Expression der humanisierten Antikörper
  • Um die Antigenbindungsaktivität der verschiedenen hergestellten humanisierten Antikörper wirksam zu beurteilen, können die humanisierten Antikörper unter Verwendung des Expressionsvektors für den humanisierten Antikörper, wie unter Punkt 1(3) und 1(6) beschrieben, oder eines modifizierten Expressionsvektors davon transient exprimiert werden. Jede beliebige Zelle kann als eine Wirtszelle verwendet werden, solange wie die Wirtszelle einen humanisierten Antikörper exprimieren kann. Im Allgemeinen werden COS-7-Zellen (ATCC CRL-1651) im Hinblick auf ihre hohe Expressionsmenge verwendet [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, S. 283 (1991)]. Das Verfahren für die Einschleusung des Expressionsvektors in COS-7-Zellen schließt die DEAE-Dextran-Methode [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, S. 283 (1991)], die Lipofektion-Methode [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7413] und dergleichen ein.
  • Nach der Einschleusung des Vektors in die Zelle kann die Expressionsmenge und die Antigenbindungsaktivität des humanisierten Antikörpers in dem Kulturüberstand durch einen Enzymimmuntest [ELISA; Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Kapitel 14 (1988); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)] und dergleichen bestimmt werden.
  • (8) Stabile Expression des humanisierten Antikörpers
  • Eine Transformante, welche einen humanisierten Antikörper stabil produziert, kann dadurch erhalten werden, dass der Expressionsvektor für einen humanisierten Antikörper, beschrieben unter Punkt 1(3) und 1(6), in eine geeignete Wirtszelle eingeschleust wird.
  • Das Verfahren für die Einschleusung des Expressionsvektors in eine Wirtszelle schließt eine Elektroporation [ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 257891/90 ; Cytotechnology 3 (1990), 133] und dergleichen ein.
  • Jede beliebige Zelle kann als die Wirtszelle, in welche der Vektor für die Expression eines humanisierten Antikörpers eingebracht werden soll, verwendet werden, solange wie sie einen humanisierten Antikörper exprimieren kann. Beispiele schließen Maus-SP2/0-Ag14-Zellen (ATCC CRL-1581), Maus-P3X63-Ag8.653-Zellen (ATCC CRL-1580), CHO-Zellen, worin das Dihydrofolatreduktase-Gen (dhfr) nachweisbar ist [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 4216], Ratten-YB2/3HL.P2.-G11.16Ag.20-Zellen (YB2/0-Zellen, ATCC CRL-1662] und dergleichen ein.
  • Nach der Einschleusung des Expressionsvektors in die Zelle werden die Transformanten, welche einen humanisierten Antikörper stabil exprimieren, durch die Züchtung in einem Medium für die Kultur von tierischen Zellen, umfassend ein Mittel wie G418-Sulfat (G418, hergestellt von Sigma) oder dergleichen, selektiert [J. Immunol. Methods 167 (1994), 271]. Das Medium für die Kultur von tierischen Zellen schließt PRMI-1640-Medium (hergestellt von Nissui Pharmaceuticals), GIT-Medium (hergestellt von Nissui Pharmaceuticals), EX-CELL302-Medium (hergestellt von JRH), IMDM-Medium (hergestellt von Gibco-BRL), Hybridoma-SFM-Medium (hergestellt von Gibco-BRL) sowie Medien, welche durch die Zugabe von verschiedenen Zusätzen wie FBS zu diesen Medien erhalten werden, und dergleichen ein. Der humanisierte Antikörper kann durch Züchtung der ausgewählten Transformanten in einem Medium in dem Kulturmedium hergestellt und angereichert werden. Die Menge und die Antigenbindungsaktivität des in dem Kulturmedium exprimierten humanisierten Antikörpers kann durch einen ELISA oder dergleichen gemessen werden. Die Produktionsmenge des humanisierten Antikörpers kann durch eine Transformation unter Verwendung des dhfr-Amplifikationssystems oder dergleichen erhöht werden [J. Immunol. Methods 167 (1994), 271].
  • Der humanisierte Antikörper kann aus dem Medium, in dem die Transformante gezüchtet wird, unter Verwendung einer Protein A-Säule gereinigt werden [Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Kapitel 8 (1988); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)]. Irgendwelche anderen herkömmliche Verfahren für die Proteinreinigung können ebenfalls angewendet werden. Zum Beispiel kann der humanisierte Antikörper durch eine Kombination von Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Ultrafiltration und dergleichen gereinigt werden. Das Molekulargewicht der H-Kette oder der L-Kette des gereinigten humanisierten Antikörpers oder des Antikörpermoleküls insgesamt wird durch eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese [SDS-PAGE; Nature 227 (1970), 680], ein Western-Blot-Verfahren [Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Kapitel 12 (1988); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)] und dergleichen bestimmt.
  • 2. Herstellung eines Antikörperfragments
  • Das Antikörperfragment kann basierend auf dem unter Punkt 1 beschriebenen humanisierten Antikörper genetisch oder proteinchemisch hergestellt werden. Das Antikörperfragment schließt Fab, F(ab')2, Fab', scFv, ein Diabody, dsFv, ein Peptid, das eine CDR-Region umfasst, und dergleichen ein.
  • (1) Herstellung eines Fab-Fragments
  • Das Fab-Fragment kann durch die Behandlung von IgG mit dem proteolytischen Enzym Papain hergestellt werden. Wenn der ursprüngliche Antikörper einer IgG-Subklasse angehört, welche eine Protein A-Bindungsaktivität besitzt, können im Anschluss an die Papainbehandlung einheitliche Fab-Fragmente gewonnen werden, indem das Reaktionsgemisch über eine Protein A-Säule geleitet wird, wobei IgG-Moleküle und Fc-Fragmente abgetrennt werden [Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, dritte Auflage (1995)]. Wenn der ursprüngliche Antikörper einer IgG-Subklasse angehört, welche keine Protein A-Bindungsaktivität besitzt, können die Fab-Fragmente durch eine Ionenaustauschchromatographie in einer Fraktion, die bei einer niedrigen Salzkonzentration eluiert, gewonnen werden [Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, dritte Auflage (1995)]. Ferner kann das Fab-Fragment auch unter Verwendung von Escherichia coli genetisch hergestellt werden. Zum Beispiel kann ein Fab-Expressionsvektor dadurch hergestellt werden, dass die DNA, welche die V-Region des Antikörpers codiert, beschrieben unter Punkt 1(2), 1(3) und 1(5), in einen Vektor für die Expression von Fab cloniert wird. Als Vektor für die Expression von Fab kann ein beliebiger Vektor verwendet werden, solange wie eine DNA, welche das Fab-Fragment codiert, inseriert und exprimiert werden kann. Beispiele schließen pIT106 [Science 240 (1988), 1041] und dergleichen ein. Das Fab-Fragment kann in einem Einschlusskörper oder im periplasmatischen Raum gebildet und angereichert werden, indem der Fab-Expressionsvektor in ein geeignetes Escherichia coli-Bakterium eingebracht wird. Das Fab-Fragment mit einer Bindungsaktivität kann durch einen Umfaltungsprozess, der im Allgemeinen bei der Herstellung eines Proteins verwendet wird, aus dem Einschlusskörper gewonnen werden. Wenn das Fab-Fragment im periplasmatischen Raum exprimiert wird, entweicht das Fab-Fragment mit einer Bindungsaktivität in den Kulturüberstand. Die einheitlichen Fab-Fragmente können nach der Umfaltung oder unter Verwendung einer Antigen bindenden Säule aus dem Kulturmedium gereinigt werden [Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company (1992)].
  • (2) Herstellung eines F(ab')2-Fragments
  • Das F(ab')2-Fragment kann durch die Behandlung von IgG mit der Protease Pepsin hergestellt werden. Im Anschluss an die Pepsinbehandlung können die einheitlichen F(ab')2-Fragmente mittels eines ähnlichen Reinigungsverfahrens wie im Falle des Fab-Fragments gewonnen werden [Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, dritte Auflage, Academic Press (1995)]. Ferner kann das F(ab')2-Fragment auch durch das Verfahren, welches unter Punkt 2(3) beschrieben wird, wobei ein Fab'-Fragment mit einem Maleimid wie o-PDM oder Bismaleimidhexan unter Bildung einer Thioetherbindung behandelt wird, oder ein Verfahren, wobei das Fab'-Fragment mit DTNB unter Bildung einer S-S-Bindung behandelt wird, hergestellt werden [Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press (1996)].
  • (3) Herstellung eines Fab'-Fragments
  • Das Fab'-Fragment kann durch die Behandlung des unter Punkt 2(2) beschriebenen F(ab')2-Fragments mit einem Reduktionsmittel wie Dithiothreit hergestellt werden. Ferner kann das Fab'-Fragment unter Verwendung von Escherichia coli genetisch hergestellt werden. Zum Beispiel kann ein Fab'-Expressionsvektor durch die Clonierung der DNA, welche die V-Region des Antikörpers codiert, wie unter Punkt 1(2), 1(4) und 1(5) beschrieben, in einen Vektor für die Expression von Fab' konstruiert werden. Als Vektor für die Expression von Fab' kann ein beliebiger Vektor verwendet werden, solange wie eine DNA, welche Fab' codiert, inseriert und exprimiert werden kann. Beispiele schließen pAK19 [Bio/Technology 10 (1992), 163] und dergleichen ein. Das Fab'-Fragment kann gebildet und in einem Einschlusskörper oder im periplasmatischen Raum angereichert werden, indem der Fab'-Expressionsvektor in ein geeignetes Escherichia coli-Bakterium eingebracht wird. Das Fab'-Fragment mit einer Bindungsaktivität kann durch einen Umfaltungsprozess, der im Allgemeinen bei der Herstellung eines Proteins verwendet wird, aus dem Einschlusskörper gewonnen werden. Wenn das Fab'-Fragment im periplasmatischen Raum exprimiert wird, kann es extrazellulär gewonnen werden, indem die Zellen durch eine Behandlung wie einen partiellen Verdau mit Lysozym, einen osmotischen Schock oder Beschallen aufgebrochen werden. Die einheitlichen Fab'-Fragmente können nach der Umfaltung oder unter Verwendung einer Protein G-Säule oder dergleichen aus der Suspension der aufgebrochenen Zellen gereinigt werden [Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press (1996)].
  • (4) Herstellung eines scFv-Fragments
  • Das scFv-Fragment kann unter Verwendung eines Phagens oder eines Escherichia coli-Bakteriums genetisch hergestellt werden. Zum Beispiel wird eine DNA, codierend das scFv-Fragment, durch die Ligierung der DNAs, welche die VH-Region und die VL-Region des Antikörpers codieren, beschrieben unter Punkt 1(2), 1(4) und 1(5), über eine DNA, codierend einen Polypeptidlinker, welcher eine Aminosäuresequenz von 12 oder mehr Resten umfasst, hergestellt. Durch die Clonierung der DNA in einen Vektor für die Expression des scFv-Fragments kann ein scFv-Expressionsvektor konstruiert werden. Als Vektor für die Expression von scFv kann ein beliebiger Vektor verwendet werden, solange wie die DNA, welche scFv codiert, inseriert und exprimiert werden kann. Beispiele schließen pCANTAB5E (hergestellt von Pharmacia), Phfa [Hum. Antibody Hybridoma 5 (1994), 48] und dergleichen ein. Der scFv-Expressionsvektor wird in ein geeignetes Escherichia coli-Bakterium eingebracht, welches mit einem Helferphagen infiziert wird, wodurch ein Phage erhalten wird, welcher das scFv-Fragment in Verknüpfung mit dem Phagen-Oberflächenprotein auf der Phagenoberfläche exprimiert. Das scFv-Fragment kann auch gebildet und in einem Einschlusskörper oder im periplasmatischen Raum eines Escherichia coli-Bakterium, in welches der scFv-Expressionsvektor eingeschleust wird, angereichert werden. Das scFv-Fragment, welches eine Bindungsaktivität hat, kann durch einen Umfaltungsprozess, welcher im Allgemeinen bei der Herstellung eines Proteins verwendet wird, aus dem Einschlusskörper gewonnen werden. Wenn das scFv-Fragment im periplasmatischen Raum exprimiert wird, kann es extrazellulär gewonnen werden, indem die Zellen durch eine Behandlung wie einen partiellen Verdau mit Lysozym, einen osmotischen Schock, Beschallen oder dergleichen aufgebrochen werden. Die einheitlichen scFv-Fragmente können nach der Umfaltung oder aus der aufgebrochenen Zellsuspension durch eine Kationenaustauschchromatographie oder dergleichen gereinigt werden [Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press (1996)].
  • (5) Herstellung eines Diabody-Fragments
  • Ein Diabody kann dadurch hergestellt werden, dass der Polypeptidlinker, welcher verwendet wurde, um das vorstehende scFv-Fragment herzustellen, durch amen Polypeptidlinker von etwa 3 bis 10 Resten ersetzt wird. Ein divalenter Diabody kann hergestellt werden, wenn die VH-Region und die VL-Region einer Antikörperspezies verwendet werden. Ein Diabody mit zwei unterschiedlichen Spezifitäten kann hergestellt werden, wenn die VH-Region und die VL-Region zweier Antikörperspezies verwendet werden [FEBS Letters 453 (1999), 164; Int. J. Cancer 77 (1998), 763].
  • (6) Herstellung eines dsFv-Fragments
  • Das dsFv-Fragment kann unter Verwendung von Escherichia coli genetisch hergestellt werden. Zuerst werden DNAs hergestellt, in denen ein codierter Aminosäurerest durch einen Cysteinrest ersetzt ist, indem eine Mutation in geeignete Positionen in die DNAs, welche die VH-Region und die VL-Region des Antikörpers codieren, wie unter Punkt 1(2), 1(4) und 1(5) beschrieben, eingeführt wird. Die Expressionsvektoren für die VH-Region und die VL-Region können durch die Clonierung der jeweiligen DNAs in einen Vektor für die Expression von dsFv hergestellt werden. Als Vektor für die Expression von dsFv kann ein beliebiger Vektor verwendet werden, solange wie die DNA, welche das dsFv-Fragment codiert, inseriert und exprimiert werden kann. Beispiele schließen pULI9 [Protein Engineering 7 (1994), 697] und dergleichen ein. Die Expressionsvektoren für die VH-Region und die VL-Region werden in ein geeignetes Escherichia coli-Bakterium eingeschleust, wodurch die VH-Region und die VL-Region gebildet und in einem Einschlusskörper oder im periplasmatischen Raum angereichert werden. Die VH-Region und die VL-Region werden aus dem Einschlusskörper oder dem periplasmatischen Raum gewonnen und gemischt, wobei durch einen Umfaltungsprozess, welcher im Allgemeinen bei der Herstellung eines Proteins verwendet wird, ein dsFv-Fragment mit einer Bindungsaktivität erhalten werden kann. Nach der Umfaltung kann das Fragment durch Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration oder dergleichen weiter gereinigt werden [Protein Engineering 7 (1994), 697].
  • (7) Herstellung eines Peptids, das eine CDR-Region umfasst
  • Das Peptid, welches eine CDR-Region umfasst, kann durch ein chemisches Syntheseverfahren wie Fmoc oder tBoc hergestellt werden. Auch kann eine DNA, codierend ein Peptid, das eine CDR-Region umfasst, hergestellt werden, wobei die erhaltene DNA in einen geeigneten Expressionsvektor cloniert wird, um das Peptid, welches eine CDR-Region umfasst, herzustellen. Als Vektor für die Expression kann ein beliebiger Vektor verwendet werden, solange wie eine DNA, codierend ein Peptid, das eine CDR-Region umfasst, inseriert und exprimiert werden kann. Beispiele schließen pLEX (hergestellt von Invitrogen), pAX4a+ (hergestellt von Invitrogen) und dergleichen ein. Der Expressionsvektor wird in ein geeignetes Escherichia coli-Bakterium eingeschleust, so dass das Peptid, welches eine CDR-Region umfasst, in einem Einschlusskörper oder im periplasmatischen Raum gebildet und angereichert werden kann. Das Peptid, welches eine CDR-Region umfasst, kann aus dem Einschlusskörper oder dem periplasmatischen Raum gewonnen und durch Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration oder dergleichen weiter gereinigt werden [Protein Engineering 7 (1994), 697].
  • 3. Beurteilung der Aktivität des humanisierten Antikörpers oder des Antikörperfragments
  • (1) Antigenbindungsaktivität
  • Die FGF-8-Bindungsaktivität des hergestellten humanisierten Antikörpers oder des Antikörperfragments kann durch einen ELISA oder mittels Oberflächenplasmonresonanz [J. Immunol. Methods 145 (1991), 229] oder dergleichen gemessen werden.
  • (2) Inhibitionsaktivität gegenüber der Funktion von FGF-8
  • Die Inhibitionsaktivität des hergestellten humanisierten Antikörpers oder des Antikörperfragments gegenüber der Funktion von FGF-8 kann z. B. durch einen Zellwachstumstest unter Verwendung einer Zelllinie gemessen werden. Zum Beispiel kann die Inhibitionsaktivität des hergestellten humanisierten Antikörpers oder des Antikörperfragments gegenüber der Funktion von FGF-8 durch die Züchtung der Maus-Brustkrebszelllinie SC-3 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 8928], der Maus-Fibroblastenzelllinie NIH3T3 oder einer menschlichen Prostatakrebs-, Brustkrebs- oder Eierstockkrebszelllinie als Zielzellen unter Verwendung eines Mediums, enthaltend 1 bis 100 ng/ml FGF-8 oder Testosteron, für einen Zeitraum von 24 bis 72 Stunden nach der Zugabe des humanisierten Antikörpers oder des Antikörperfragments nach serieller Verdünnung auf eine Endkonzentration von 0,001 bis 100 μg/ml in dem Medium, und im Anschluss daran die Messung der Anzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung einer MTT [3-(4,5-Dimethyl-2-thiazonyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid]-Lösung, eines Zellzählungskits, eines WST-Kits oder dergleichen gemessen werden. Die Aktivität des humanisierten Antikörpers oder des Antikörperfragments im Hinblick auf die Inhibition der Bindung von FGF-8 an den Zelloberflächenrezeptor kann durch die Bolton-Hunter-Methode unter Verwendung von FGF-8, markiert mit 125I [Biochem. J. 133 (1973), 527], oder dergleichen bei den vorstehenden Zelllinien gemessen werden.
  • (3) In-vivo-Antitumorwirkung
  • Die In-vivo-Antitumorwirkung des hergestellten humanisierten Antikörpers oder des Antikörperfragments kann zum Beispiel unter Verwendung des nachstehend veranschaulichten Krebszellen-Transplantationssystem für Nacktmäuse beurteilt werden.
  • a. Beurteilung der Antitumorwirkung für ein frühes Krebsmodell
  • Die Maus-Brustkrebszelllinie SC-3 wird in einer Dichte von 1 × 107 Zellen/ml in PBS suspendiert und in einer Dosis von 0,1 ml/Tier (1 × 106 Zellen/Tier) in 6 bis 8 Wochen alte, männliche Nacktmäuse subkutan transplantiert. Unmittelbar nach der Transplantation wird der humanisierte Antikörper oder das Antikörperfragment in einer Dosis von 10 μg bis 400 μg/Tier in die Bauchhöhle oder die Schwanzvene der Maus verabreicht. Der Antikörper wird in einer Häufigkeit von 1- bis 7mal pro Woche insgesamt 1- bis 10mal verabreicht. Die Antitumorwirkung kann durch das regelmäßige Messen des Tumorvolumens für 14 bis 60 Tage nach der Tumortransplantation und das Vergleichen des Tumorvolumens mit demjenigen der Gruppe, an die der negative Kontrollantikörper verabreicht wurde, oder der Gruppe, an die das Lösungsmittel verabreicht wurde, beurteilt werden. Das Tumorvolumen (V) kann auch basierend auf der folgenden Gleichung durch Messung der Länge (L), der Breite (W) und der Höhe (H) des Tumors unter Verwendung eines Messschiebers berechnet werden: V (mm3) = (L) × (W) × (H) × 0,5236
  • b. Beurteilung der Antitumorwirkung für ein fortgeschrittenes Krebsmodell
  • SC-3-Zellen werden in einer Dichte von 1 × 107 Zellen/ml in PBS suspendiert und in einer Dosis von 0,1 ml/Tier (1 × 106 Zellen/Tier) in 6 bis 8 Wochen alte, männliche Nacktmäuse subkutan transplantiert. Wenn das Tumorvolumen etwa 100 bis 300 mm3 erreicht (ungefähr am 14. Tag nach der Tumortransplantation), wird mit der Verabreichung des humanisierten Antikörpers oder des Antikörperfragments in einer Dosis von 10 μg bis 400 μg/Tier in die Bauchhöhle oder die Schwanzvene der Maus begonnen. Der Antikörper wird in einer Häufigkeit von 1- bis 7mal pro Woche insgesamt 1- bis 10mal verabreicht. Die Antitumorwirkung kann in der gleichen Weise wie für das frühe Krebsmodell von a. beurteilt werden.
  • (4) Verfahren zur Verwendung des humanisierten Antikörpers oder des Antikörperfragments davon
  • Da der humanisierte Antikörper oder das Antikörperfragment davon der vorliegenden Erfindung spezifisch an FGF-8 bindet, von welchem angenommen wird, dass er ein Wachstumsfaktor für menschliche Krebszellen ist, die ein Geschlechtshormon-abhängiges Wachstum zeigen, und die Funktion von FGF-8 inhibiert, ist der humanisierte Antikörper oder das Antikörperfragment davon bei der Behandlung und der Diagnose von Krebserkrankungen beim Menschen wie Prostatakrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs und Hodenkrebs nützlich. Da der Anteil der Aminosäuresequenzen, welche von menschlichen Antikörpern stammen, in dem humanisierten Antikörper oder dem Antikörperfragment davon höher ist als in Antikörpern, welche von einem nicht-menschlichen Tier stammen, wird erwartet, dass der humanisierte Antikörper oder das Antikörperfragment davon eine starke cytotoxische Aktivität im menschlichen Körper zeigt, keine Immunogenität hervorruft und eine lang anhaltende Wirkung hat.
  • Der humanisierte Antikörper oder das Antikörperfragment davon der vorliegenden Erfindung kann allein verabreicht werden, wobei aber im Allgemeinen bevorzugt wird, dass der humanisierte Antikörper oder das Antikörperfragment in Form einer pharmazeutischen Zubereitung bereitgestellt wird, welche durch das Mischen des humanisierten Antikörpers oder des Antikörperfragments mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger gemäß einem Verfahren, welches auf dem technischen Gebiet der Pharmazie gut bekannt ist, hergestellt wird.
  • Es wird bevorzugt, einen Verabreichungsweg zu verwenden, der im Hinblick auf die Durchführung der beabsichtigten Behandlung am wirksamsten ist, wie eine orale Verabreichung oder parenterale Verabreichung, z. B. eine intraorale Verabreichung, tracheale Verabreichung, rektale Verabreichung, subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion, intravenöse Injektion und dergleichen. Die intravenöse Injektion wird für eine Antikörper- oder eine Peptidformulierung bevorzugt.
  • Die Dosierungsform schließt Sprays, Kapseln, Tabletten, Granula, Sirupe, Emulsionen, Zäpfchen, Injektionen, Salben, Pflaster und dergleichen ein.
  • Für die orale Verabreichung geeignete Formulierungen schließen Emulsionen, Sirupe, Kapsein, Tabletten, Pulver, Granula und dergleichen ein.
  • Flüssige Zubereitungen wie Emulsionen und Sirupe können unter Verwendung von Zusätzen wie zum Beispiel Wasser; Sacchariden wie Saccharose, Sorbit oder Fructose; Glykolen wie Polyethylenglykol oder Propylenglykol; Ölen wie Sesamöl, Olivenöl oder Sojaöl; Antiseptika wie p-Hydroxybenzoat; und Geschmacksstoffen wie Erdbeergeschmack oder Pfefferminze hergestellt werden.
  • Kapseln, Tabletten, Pulver, Granula und dergleichen können unter Verwendung von Zusätzen wie zum Beispiel Füllstoffen wie Lactose, Glucose, Saccharose oder Mannit; Sprengmitteln wie Stärke oder Natriumalginat; Gleitmitteln wie Magnesiumstearat oder Talkum; Bindemitteln wie Polyvinylalkohol, Hydroxypropylcellulose oder Gelatine; Tensiden wie Fettsäureestern; und Weichmachern wie Glycerin hergestellt werden.
  • Für die parenterale Verabreichung geeignete Formulierungen schließen Injektionen, Zäpfchen, Sprays und dergleichen ein.
  • Injektionen können unter Verwendung eines Trägers wie einer Salzlösung, einer Glucoselösung oder eines Gemisches davon hergestellt werden.
  • Zäpfchen können unter Verwendung eines Trägers wie Kakaobutter, gehärtetem Fett oder einer Carbonsäure hergestellt werden.
  • Sprays können auch aus dem Antikörper selbst oder unter Verwendung eines Trägers oder dergleichen, welcher die Mund- und Atemwegsschleimhaut der Patienten nicht reizt und die Absorption des Antikörpers oder des Antikörperfragments davon durch das Dispergieren davon in Form von mikrofeinen Partikeln erleichtern kann, hergestellt werden.
  • Der Träger schließt Lactose, Glycerin und dergleichen ein. Abhängig von den Eigenschaften des Antikörpers oder des Antikörperfragments und dem zu verwendenden Träger können Aerosole, trockene Pulver und dergleichen hergestellt werden. Die für die oralen Zubereitungen veranschaulichten Zusätze können auch zu den parenteralen Zubereitungen zugegeben werden.
  • Die Dosis und die Häufigkeit der Verabreichung variieren abhängig von der gewünschten therapeutischen Wirkung, der Verabreichungsmethode, dem Behandlungszeitraum, dem Alter, dem Körpergewicht und dergleichen, wobei die Dosis im Allgemeinen für einen Erwachsenen im Bereich von 0,01 mg/kg bis 20 mg/kg pro Tag liegt.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Konstruktionsschritte für Plasmid pKM1334CH-H5.
  • 2 zeigt die Konstruktionsschritte für Plasmid pKM1334CH-L4.
  • 3 zeigt die Konstruktionsschritte für Plasmid pKANTEX1334.
  • 4 zeigt die Neutralisierungsaktivitäten für den Anti-FGF-8-Mausanti körper KM1334 und die chimären Anti-FGF-8-Antikörper KM3034 und KM3334 auf das FGF-8-abhängige Wachstum von Zellen der Maus-Brustkrebszelllinie SC-3. Die x-Achse und die y-Achse zeigen die Antikörperkonzentration (μg/ml) bzw. das relative Wachstum (%), wenn für das Wachstum durch die Zugabe von FGF-8 allein ein Wert von 100% definiert wird. "O", "☐", "Δ" und "x" zeigen die Aktivitäten von KM1334, KM3034, KM3334 bzw. KM2760 als eine negative Kontrolle.
  • 5 zeigt die Konstruktionsschritte für Plasmid pKM1334HV0.
  • 6 zeigt die Konstruktionsschritte für Plasmid pKANTEX1334HV0LV0.
  • 7 zeigt die Ergebnisse der ELISA-Messung der FGF-8-Bindungsaktivitäten des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers KM3334 und der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper HV0LV0, HV0LV6 und HV6LV6. Die x-Achse und die y-Achse zeigen die Antikörperkonzentration (μg/ml) bzw. die Bindungsaktivität (OD415). "O", "☐", "Δ" und "x" zeigen die Aktivitäten von KM3334, HV0LV0, HV0LV6 bzw. HV6LV6.
  • 8 zeigt die Ergebnisse der BIAcore-2000-Messung der FGF-8-Bindungsaktivitäten des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers KM3334 und der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper HV0LV0, HV0LV6 und HV6LV6. Die x-Achse und die y-Achse zeigen die Zeit (Sekunden) bzw. das Resonanzsignal (RU).
  • 9 zeigt die Konstruktionsschritte für Plasmid pKM1334LV3-1.
  • 10 zeigt die Konstruktionsschritte für Plasmid pKM1334LV4-2.
  • 11 zeigt die Konstruktionsschritte für Plasmid pKM1334LV3-2.
  • 12 zeigt die Ergebnisse der BIAcore-2000-Messung der FGF-8-Bindungsaktivitäten des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers KM3034 und der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper HV0LV0/CHO, HV0LV2-1/CHO, HV0LV2-2/CHO, HV0LV3-1/CHO, HV0LV3-2/CHO, HV0LV4-1/CHO, HV0LV4-2/CHO und HV0LV6/CHO. Die x-Achse und die y-Achse zeigen die Zeit (Sekunden) bzw. das Resonanzsignal (RU).
  • 13 zeigt die Neutralisierungsaktivitäten für den chimären Anti-FGF-8-Antikörper KM3034 und die Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper HV0LV2-1/CHO, HV0LV3-1/CHO, HV0LV4-1/CHO und HV0LV6/CHO auf das FGF-8-abhängige Wachstum von Zellen der Maus-Brustkrebszelllinie SC-3. Die x-Achse und die y-Achse zeigen die Antikörperkonzentration (μg/ml) bzw. das relative Wachstum (%), wenn für das Wachstum durch die Zugabe von FGF-8 allein ein Wert von 100% definiert wird. "O", "☐", "Δ", "♢", "
    Figure 00330001
    " und "x" zeigen die Aktivitäten von KM3034, HV0LV2-1/CHO, HV0LV3-1/CHO, HV0LV4-1/CHO, HV0LV6/CHO bzw. KM2760 als eine negative Kontrolle.
  • 14 zeigt die Konstruktionsschritte für Plasmid pKM1334LV3-3.
  • 15 zeigt die Ergebnisse der BIAcore-2000-Messung der FGF-8-Bindungsaktivitäten des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers KM3034 und der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper HV0LV3-1/CHO, HV0LV3-3/CHO, HV0LV4-3/CHO und HV0LV6/CHO. Die x-Achse und die y-Achse zeigen die Zeit (Sekunden) bzw. das Resonanzsignal (RU).
  • 16 zeigt die Reutralisierungsaktivitäten für den chimären Anti-FGF-8-Antikörper KM3034 und die Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper HV0LV3-1/CHO, HV0LV3-3/CHO, HV0LV4-3/CHO und HV0LV6/CHO auf das FGF-8-abhängige Wachstum von Zellen der Maus-Brustkrebszelllinie SC-3. Die x-Achse und die y-Achse zeigen die Antikörperkonzentration (μg/ml) bzw. das relative Wachstum (%), wenn für das Wachstum durch die Zugabe von FGF-8 allein ein Wert von 100% definiert wird. "O", "Δ", "∎",
    Figure 00330002
    und "x" zeigen die Aktivitäten von KM3034, HV0LV3-1/CHO, HV0LV3-3/CHO, HV0LV4-3/CHO, HV0LV6/CHO bzw. KM2760 als eine negative Kontrolle.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert, jedoch ist der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht darauf begrenzt.
  • Beste Art der Durchführung der Erfindung
  • Beispiel 1
  • Herstellung eines chimären Anti-FGF-8-Antikörpers:
  • 1. Isolierung und Analyse der cDNA, codierend die V-Region eines Anti-FGF-8-Mausantikörpers
  • (1) Präparation der mRNA aus Hybridomzellen, die einen Anti-FGF-8-Mausantikörper herstellen
  • Aus 1 × 107 Zellen des Hybridoms KM1334 (FERM BP-5451), das in der Lage ist, einen Mausantikörper gegen FGF-8 herzustellen (nachstehend bezeichnet als "Anti-FGF-8-Mausantikörper"), wurden unter Verwendung des mRNA-Präparationskits Fast Track mRNA-Isolationskits (hergestellt von Invitrogen) gemäß den beiliegenden Anweisungen des Herstellers etwa 8 μg mRNA präpariert.
  • (2) Herstellung von cDNA-Banken der H-Kette und der L-Kette des Anti-FGF-8-Mausantikörpers
  • Aus 5 μg der mRNA von KM1334, welche unter Punkt 1(1) in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde unter Verwendung des Time Saver cDNA-Synthesekits (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) gemäß den beiliegenden Anweisungen des Herstellers eine cDNA mit einem EcoRI-NotI-Adapter an beiden Enden synthetisiert. Anschließend wurden die cDNA-Banken unter Verwendung des λZAPII-Clonierungskits (hergestellt von Stratagene) hergestellt. Zuerst wurde die Gesamtmenge der cDNA in 20 μl sterilem Wasser gelöst und dann durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei jeweils etwa 0,1 μg eines cDNA-Fragments von etwa 1,5 kb, entsprechend der H-Kette eines Antikörpers der IgG-Klasse, und eines cDNA-Fragments von etwa 1,0 kb, entsprechend der L-Kette der κ-Klasse, gewonnen wurden. Anschließend wurden jeweils 0,1 μg des cDNA-Fragments von etwa 1,5 kb und 0,1 μg des cDNA-Fragments von etwa 1,0 kb mit 1 μg des λZAPII-Vektors, dessen Enden nach der Spaltung mit dem Restriktionsenzym EcoRI mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert worden waren, gemäß den beiliegenden Anweisungen des Herstellers ligiert.
  • Unter Verwendung von Gigapack II Packaging Extracts Gold (hergestellt von Stratagene) wurden gemäß den beiliegenden Anweisungen des Herstellers 4 μl jeder Reaktionslösung nach der Ligierung in einem λ-Phagen verpackt, und eine geeignete Menge davon wurde mittels Infektion in Zellen von Escherichia coli XL1-Blue [Biotechniques 5 (1987), 376] eingebracht, wobei etwa 8,1 × 104 und 5,5 × 104 Phagen-Clone als cDNA-Bank für die H-Kette bzw. cDNA-Bank für die L-Kette von KM1334 erhalten wurden. Anschließend wurde jeder Phage gemäß dem üblichen Verfahren [Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)] auf einer Nylonmembran fixiert.
  • (3) Clonierung der cDNA für die H-Kette und die L-Kette des Anti-FGF-8-Mausantikörpers
  • Unter Verwendung von ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) wurden gemäß den beiliegenden Anweisungen des Herstellers die Clone der cDNA-Bank für die H-Kette und der cDNA-Bank für die L-Kette von KM1334 auf der unter Punkt 1(2) in Beispiel 1 hergestellten Nylonmembran unter Verwendung einer cDNA für die C-Region des Mausantikörpers [wobei die H-Kette ein DNA-Fragment ist, das die Maus-Cγ1-cDNA enthält [J. Immunol. 146 (1991), 2010], und wobei die L-Kette ein DNA-Fragment ist, das die Maus-Cκ-cDNA enthält [Cell 22 (1980), 197]) als Sonde nachgewiesen, wobei jeweils 10 Phagen-Clone als Clone für die H-Kette und die L-Kette erhalten wurden, die eine starke Reaktion mit der Sonde zeigten. Anschließend wurde gemäß den beiliegenden Anweisungen des Herstellers des λZAPII-Clonierungskits (hergestellt von Stratagene) jeder Phagen-Clon durch ein in-vivo-Exzisionsverfahren in ein Plasmid überführt. Die Nucleotidsequenz der cDNA, die in jedem der auf diese Weise erhaltenen Plasmide enthalten war, wurde mittels der Didesoxy-Methode [Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)] unter Verwendung des Big Dye Terminator-Kits, Ver. 2 (hergestellt von Applied Biosystems) bestimmt. Als Ergebnis wurde das Plasmid pKM1334H7-1, enthaltend die vollständige cDNA der funktionellen H-Kette, und das Plasmid pKM1334L7-1, enthaltend die vollständige cDNA der funktionellen L-Kette erhalten, wobei die cDNA am 5'-Ende die Sequenz ATG enthält, welche als ein Initiationscodon angesehen wird.
  • (4) Analyse der Aminosäuresequenz der V-Region des Anti-FGF-8-Mausantikörpers
  • Die in dem Plasmid pKM1334H7-1 enthaltene vollständige Nucleotidsequenz der VH-Region ist in SEQ ID NO 1 dargestellt, und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO 2 dargestellt. Die in dem Plasmid pKM1334-L7-1 enthaltene vollständige Nucleotidsequenz der VL-Region ist in SEQ ID NO 3 dargestellt, und die davon abgeleitete vollständige Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO 4 dargestellt. Basierend auf einem Vergleich mit Sequenzdaten von bekannten Mausantikörpern [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] und einem Vergleich mit den Ergebnissen der Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenzen der H-Kette und der L-Kette des gereinigten Anti-FGF-8-Mausantikörpers KM1334, welche mit Hilfe eines automatischen Edman-Abbaus unter Verwendung des Protein-Sequenzierungsautomats PPSQ-10 (hergestellt von Shimadzu Corporation) durchgeführt wurde, wurde festgestellt, dass jede der auf diese Weise isolierten cDNA eine cDNA vollständiger Länge ist, welche den Anti-FGF-8-Mausantikörper KM1334, enthaltend eine sekretorische Signalsequenz, codiert, wobei die Aminosäuresequenz von Position 1 bis 19 in der H-Kette, dargestellt in SEQ ID NO 2, und die Aminosäuresequenz von Position 1 bis 19 in der L-Kette, dargestellt in SEQ ID NO 4, die sekretorischen Signalsequenzen darstellen. Die Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region, mit Ausnahme der sekretorischen Signalsequenz, sind in SEQ ID NO 40 bzw. SEQ ID NO 41 dargestellt.
  • Anschließend wurde die Neuheit der Aminosäuresequenzen der VH-Region und der VL-Region des Anti-FGF-8-Mausantikörpers KM1334 untersucht. Mit Hilfe des GCG-Pakets (Version 9.1, entwickelt von der Genetics Computer Group) als Sequenzanalyseprogramm wurde eine Aminosäuresequenz-Datenbank von bekannten Proteinen [PIR-Protein (Release 56.0)] nach der BLAST-Methode [J. Mol. Biol. 215 (1990), 403] abgefragt. Als Ergebnis wurden im Hinblick auf sowohl die H-Kette als auch die L-Kette keine vollständig identischen Sequenzen gefunden, wodurch bestätigt wurde, dass die VH-Region und die VL-Region des Anti-FGF-8-Mausantikörpers KM1334 neue Aminosäuresequenzen sind.
  • Ferner wurden die CDR-Regionen der VH-Region und der VL-Region des Anti-FGF-8-Mausantikörpers KM1334 durch einen Vergleich mit den Aminosäuresequenzen von bekannten Antikörpern identifiziert. Die Aminosäuresequenzen von CDR1, -2 und -3 der VH-Region des Anti-FGF-8-Mausantikörpers KM1334 sind in SEQ ID NO 5, 6 bzw. 7 dargestellt, und die Aminosäuresequenzen von CDR1, -2 und -3 der VL-Region sind in SEQ ID NO 8, 9 bzw. 10 dargestellt.
  • 2. Stabile Expression eines chimären Anti-FGF-8-Antikörpers unter Verwendung von tierischen Zellen
  • (1) Konstruktion eines Plasmids, enthaltend die cDNA für die VH-Region des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers
  • Unter Verwendung von 50 ng des Plasmids pKM1334H7-1, das unter Punkt 1(3) von Beispiel 1 erhalten wurde, als Matrize und synthetischen DNA-Fragmenten mit den in SEQ ID NO 11 und 12 dargestellten Nucleotidsequenzen (hergestellt von GENSET), welche in einer Endkonzentration von 0,3 μMol/l als Primer zugegeben wurden, wurde eine PCR, umfassend zunächst das Erhitzen eines Gesamtvolumens von 50 μl des Gemisches bei 94°C für 2 Minuten und dann 30 Reaktionszyklen bei 94°C für 15 Sekunden, 57°C für 30 Sekunden und 68°C für 1 Minute für einen Zyklus, gemäß den Anweisungen des Herstellers, welche der KOD Plus-Polymerase (hergestellt von TOYOBO) beiliegen, durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde gereinigt, in sterilem Wasser gelöst und dann mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 0,3 μg eines EcoRI-Fragments von etwa 0,48 kb (wobei das 5'-Ende ein EcoRI-Ende ist und das 3'-Ende ein glattes Ende ist) gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pBluescript SK(–) mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRV (hergestellt von Takara Shuzo) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 2 μg eines EcoRI-EcoRV-Fragments von etwa 2,95 kb gewonnen wurden.
  • Im Anschluss daran wurden 0,1 μg des EcoRI-Fragments der cDNA für die VH-Region und 0,1 μg des EcoRI-EcoRV-Fragments des Plasmids pBluescript SK(–), welches vorstehend erhalten wurde, zu einem Gesamtvolumen von 10 μl sterilem Wasser zugegeben und unter Verwendung von Ligation High (hergestellt von TOYOBO) ligiert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA- Lösung wurden Zellen von E. coli XL-1 Blue transformiert, wobei das in 1 dargestellte Plasmid pKM1334CH-H5 erhalten wurde, welches die cDNA der VH-Region des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers enthält.
  • (2) Konstruktion eines Plasmids, enthaltend die cDNA für die VL-Region des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers
  • Unter Verwendung von 50 ng des Plasmids pKM1334L7-1, das unter Punkt 1(3) von Beispiel 1 erhalten wurde, als Matrize und synthetischen DNA-Fragmenten mit den in SEQ ID NO 13 und 14 dargestellten Nucleotidsequenzen (hergestellt von GENSET), welche in einer Endkonzentration von 0,3 μMol/l als Primer zugegeben wurden, wurde eine PCR, umfassend zunächst das Erhitzen eines Gesamtvolumens von 50 μl des Gemisches bei 94°C für 2 Minuten und dann 30 Reaktionszyklen bei 94°C für 15 Sekunden, 57°C für 30 Sekunden und 68°C für 1 Minute für einen Zyklus, gemäß den Anweisungen des Herstellers, welche der KOD Plus-Polymerase (hergestellt von TOYOBO) beiliegen, durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde gereinigt, in sterilem Wasser gelöst und dann mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 0,3 μg eines EcoRI-Fragments von etwa 0,45 kb (wobei das 5'-Ende das EcoRI-Ende ist und das 3'-Ende ein glattes Ende ist) gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 0,1 μg des EcoRI-Fragments der cDNA für die VL-Region und 0,1 μg des EcoRI-EcoRV-Fragments des Plasmids pBluescript SK(–), welche jeweils vorstehend erhalten wurden, zu einem Gesamtvolumen von 10 μl sterilem Wasser zugegeben und unter Verwendung von Ligation High (hergestellt von TOYOBO) ligiert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurden Zellen von E. coli XL-1 Blue transformiert, wobei das in 2 dargestellte Plasmid pKM1334CH-L4 erhalten wurde, das die cDNA der VL-Region des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers enthält.
  • (3) Konstruktion des Expressionsvektors pKANTEX1334 für den chimären Anti-FGF-8-Antikörper
  • Unter Verwendung des Expressionsvektors pKANTEX93 für einen humanisierten Antikörper, beschrieben in WO 97/10354 , und der Plasmide pKM1334CH-H5 und pKM1334CH-L4, die unter Punkt 2(1) und 2(2) von Beispiel 1 erhalten wurden, wurde der Expressionsvektor pKANTEX1334 für einen chimären Anti-FGF-8-Antikörper wie folgt konstruiert.
  • Zunächst wurden 3 μg des Plasmids pKM1334CH-H5, das unter Punkt 2(1) von Beispiel 1 erhalten wurde, mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (hergestellt von New England Biolabs) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) gemischt und dann bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 0,2 μg eines NotI-Apal-Fragments von etwa 0,48 kb gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Expressionsvektors pKANTEX93 für einen humanisierten Antikörper mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (hergestellt von New England Biolabs) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 2 μg eines ApaI-Notl-Fragments von etwa 12,8 kb gewonnen wurden.
  • Im Anschluss daran wurden 0,1 μg des NotI-ApaI-Fragments des Plasmids pKM1334CH-H5 und 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments des Plasmids pKANTEX93 zu einem Gesamtvolumen von 10 μl sterilem Wasser zugegeben und unter Verwendung von Ligation High (hergestellt von TOYOBO) ligiert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurden Zellen von E. coli XL-1 Blue transformiert, wobei das in 3 dargestellte Plasmid pKANTEX1334H erhalten wurde.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pKM1334CH-L4, das unter Punkt 2(2) von Beispiel 1 erhalten wurde, mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BsiWI (hergestellt von New England Biolabs) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 0,2 μg eines EcoRI-BsiWI-Fragments von etwa 0,45 kb gewonnen wurden.
  • Im Anschluss daran wurden 3 μg des Plasmids pKANTEX1334H, welches vorstehend erhalten wurde, mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BsiWI (hergestellt von New England Biolabs) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 2 μg eines EcoRI-BsiWI-Fragments von etwa 13,30 kb gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 0,1 μg des EcoRI-BsiWI-Fragments des Plasmids pKM1334CH-L4 und 0,1 μg des EcoRI-BsiWI-Fragments des Plasmids pKANTEX-1334H zu einem Gesamtvolumen von 10 μl sterilem Wasser zugegeben und unter Verwendung von Ligation High (hergestellt von TOYOBO) ligiert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurden Zellen von E. coli XL-1 Blue transformiert, wobei das in 3 dargestellte Plasmid pKANTEX1334 erhalten wurde.
  • Unter Verwendung von 400 ng des auf diese Weise erhaltenen Plasmids wurde eine Analyse der Nucleotidsequenz des Plasmids durch die Didesoxy-Methode [Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)] unter Verwendung des Big Dye Terminator-Kits, Ver. 2 (hergestellt von Applied Biosystems) durchgeführt, wodurch bestätigt wurde, dass ein Plasmid erhalten wurde, in welches die DNA von Interesse cloniert worden war.
  • (4) Stabile Expression des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers unter Verwendung von CHO/DG44-Zellen
  • Unter Verwendung des Expressionsvektors pKANTEX1334 für den chimären Anti-FGF-8-Antikörper, welcher unter Punkt (2(3) in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde die Expression des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers in CHO/DG44-Zellen [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 4216] wie folgt bewirkt.
  • Nach dem Einbringen von 10 μg des Plasmids pKANTEX1334 in 1,6 × 106 Zellen von CHO/DG44-Zellen durch Elektroporation [Cytotechnology 3 (1990), 133] wurden die Zellen in 10 bis 30 ml IMDM-1xHT-Ergänzungslösung-dFBS(10) [IMDM-Medium, enthaltend 10% dialysiertes fötales Rinderserum (dFBS) und 1xHT-Ergänzungslösung (jeweils hergestellt von Gibco)] suspendiert und zu 100 μl/Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (hergestellt von IWAKI) dispensiert. Nach Züchten bei 37°C für 24 Stunden in einem Brutschrank mit 5% CO2 wurde das Kulturmedium durch IMDM-dFBS(10), welches dadurch hergestellt wurde, dass das 1xHT-Ergänzungslösung allein weggelassen wurde, ausgetauscht, gefolgt von einem Züchtungszeitraum von 1 bis 2 Wochen. Die Kulturüberstände wurden aus Vertiefungen gewonnen, in denen resistente Kolonien wuchsen und konfluent wurden, und die Antigenbindungsaktivität der chimären Anti-FGF-8-Antikörper in den Überständen wurde durch den ELISA gemessen, welcher unter Punkt 2(6) von Beispiel 1 erläutert wird.
  • Zur Erhöhung der Expressionsmenge des Antikörpers unter Verwendung des dhfr-Genamplifikationssystems wurden die Transformanten aus Vertiefungen, für die eine Expression von chimären Anti-FGF-8-Antikörpern in den Kulturüberständen nachgewiesen wurde, auf eine Platte mit 24 Vertiefungen überimpft und während 2 Wochen in IMDM-dFBS(10)-Medium, enthaltend 50 nMol/l Methotrexat (MTX; hergestellt von Sigma), welches ein Inhibitor des dhfr-Genprodukts Dihydrofolatreduktase ist, gezüchtet. Die MTX-Konzentration wurde auf 200 nMol/l und dann auf 500 nMol/l weiter erhöht, gefolgt von einem Züchtungszeitraum von 2 Wochen für jeden Erhöhungsschritt, um Transformanten zu induzieren, welche eine Resistenz gegen 500 nMol/l MTX zeigen. Wenn die Transformanten in den Vertiefungen konfluent wurden, wurde die Antigenbindungsaktivität der chimären Anti-FGF-8-Antikörper in den Überständen durch den ELISA gemessen, welcher unter Punkt 2(6) von Beispiel 1 erläutert wird. Schließlich wurden Transformanten erhalten, welche in der Lage sind, in dem IMDM-dFBS(10)-Medium, enthaltend 500 nMol/l MTX, zu wachsen und eine starke Expression der chimären Anti-FGF-8-Antikörper zeigen. Unter Verwendung der so erhaltenen Transformanten wurde mit Hilfe des Grenzverdünnungsverfahrens eine Einzelzellisolierung (Clonierung) durchgeführt, und ein transformierter Zellclon, welche die höchste Expression des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers zeigte, wurde als KM3034 bezeichnet. KM3034 wurde am 26. Dezember 2001 auch als FERM BP-7836 bei der International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1–1, Higashi 1-Chorre Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305–8566, Japan), hinterlegt.
  • (5) Stabile Expression des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers unter Verwendung von YB2/0-Zellen
  • Unter Verwendung des Expressionsvektors pKANTEX1334 für den chimären Anti-FGF-8-Antikörper, welcher unter Punkt 2(3) von Beispiel 1 erhalten wurde, wurde die Expression des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers in YB2/0-Zellen (ATCC CRL-1662) wie folgt bewirkt.
  • Nach dem Einbringen von 10 μg des Plasmids pKANTEX1334 in 4 × 106 Zellen von YB2/0-Zellen (ATCC CRL-1662) durch Elektroporation [Cytotechnology 3 (1990), 133] wurden die Zellen in 40 ml Hybridoma-SFM-FBS(5) [Hybridoma-SFM-Medium (hergestellt von Gibco), enthaltend 5% fötales Rinderserum (FBS; hergestellt von PAA Laborstories)] suspendiert und zu 200 μl/Vertiefung in einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen (hergestellt von Sumitomo Bakelite) dispensiert. Nach Züchten bei 37°C für 24 Stunden in einem Brutschrank mit 5% CO2 wurde G418 in einer Konzentration von 1 mg/ml zugegeben, gefolgt von einem Züchtungszeitraum von 1 bis 2 Wochen. Die Kulturüberstände wurden aus Vertiefungen gewonnen, in denen Kolonien von Transformanten mit einer G418-Resistenz wuchsen, und deren Vermehrung wurde bestätigt, und die Antigenbindungsaktivität der chimären Anti-FGF-8-Antikörper in den Überständen wurde durch den ELISA gemessen, welcher unter Punkt 2(6) von Beispiel 1 erläutert wird.
  • Zur Erhöhung der Expressionsmenge des Antikörpers unter Verwendung des dhfr-Genamplifikationssystems wurden die Transformanten aus Vertiefungen, für die eine Expression von chimären Anti-FGF-8-Antikörpern in den Kulturüberständen nachgewiesen wurde, in Hybridoma-SFM-FBS(5)-Medium, enthaltend 1 mg/ml G418 und 50 nMol/l MTX (hergestellt von Sigma) in einer Dichte von 1–2 × 105 Zellen/ml suspendiert und zu 1 ml in einer Platte mit 24 Vertiefungen (hergestellt von Greiner) dispensiert. Durch Züchtung bei 37°C für 1 bis 2 Wochen in einem Brutschrank mit 5% CO2 wurden Transformanten induziert, welche eine Resistenz gegen 50 nMol/l MTX zeigen. Die Antigenbindungsaktivität der chimären Anti-FGF-8-Antikörper in den Kulturüberständen aus Vertiefungen, in denen eine Vermehrung der Transformanten beobachtet wurde, wurde durch den ELISA gemessen, welcher unter Punkt 2(6) von Beispiel 1 erläutert wird.
  • Im Hinblick auf die Transformanten aus Vertiefungen, für die eine Expression der chimären Anti-FGF-8-Antikörper in den Kulturüberständen nachgewiesen wurde, wurde die MTX-Konzentration nach der gleichen Methode erhöht, wie vorstehend beschrieben, wobei die Transformante 5-D erhalten wurde, welche in der Lage ist, in dem Hybridoma-SFM-FBS(5)-Medium, enthaltend Endkonzentrationen von 1 mg/ml G418 und 200 nMol/l MTX, zu wachsen und eine starke Expression des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers zeigt. Die so erhaltene Transformante wurde mit Hilfe des Grenzverdünnungsverfahrens einer Clonierung unterzogen, wobei eine transformierte Zelllinie erhalten wurde, welche die höchste Expression des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers zeigte. Die so erhaltene transformierte Zelle wurde als KM3334 bezeichnet.
  • (6) Bindungsaktivität des Antikörpers gegenüber dem FGF-8-Peptid (ELISA)
  • Verbindung 1 (SEQ ID NO: 15) wurde als das menschliche FGF-8-Peptid ausgewählt, welches mit dem Anti-FGF-8-Antikörper reagieren kann. Für die Verwendung bei einer Aktivitätsmessung durch einen ELISA wird ein Konjugat davon mit Rinderserumalbumin (BSA; hergestellt von Nacalai Tesque) hergestellt und als Antigen verwendet. Hierfür wurden 100 μl einer Lösung von 25 mg/ml SMCC [4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure-N-Hydroxysuccinimidester] (hergestellt von Sigma) und DMSO unter Rühren zu 900 μl einer PBS-Lösung, enthaltend 10 mg BSA, zugetropft, gefolgt von langsamem Rühren für 30 Minuten. Nach dem Aufgeben von 1 ml der Reaktionslösung auf eine Gelfiltrationssäule wie eine NAP-10-Säule, welche mit 25 ml PBS äquilibriert worden war, wurde das Eluat, welches mit 1,5 ml PBS eluierte, als BSA-SMCC-Lösung verwendet. Die BSA-Konzentration einer jeden Fraktion wurde bezogen auf die Absorption bei 280 nm gemessen. Anschließend wurden 200 μl DMSO zu 1,0 mg der Verbindung 1 zugegeben, welche dann durch Zugabe von 800 μl PBS vollständig gelöst wurde. Im Anschluss daran wurde die vorstehende BSA-SMCC-Lösung (2,5 mg BSA) unter Rühren zugegeben, gefolgt von langsamen Rühren bei Raumtemperatur für 3 Stunden. Die Reaktionslösung wurde über Nacht bei 4°C gegen PBS dialysiert. Anschließend wurde Natriumazid in einer Endkonzentration von 0,05% zugegeben. Das Gemisch wurde durch einen 0,22 μm-Filter gefiltert, und das Filtrat wurde als BSA-Verbindung 1-Lösung verwendet.
  • Das vorstehend hergestellte Konjugat wurde in 50 μ/Vertiefung in einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen (hergestellt von Greiner) in einer Konzentration von 0,5 bis 1,0 μg/ml dispensiert und über Nacht bei 4°C stehen gelassen, um eine Adsorption zu ermöglichen. Nach dem Waschen mit PBS wurde eine PBS-Lösung, enthaltend 1% BSA (BSA-PBS) in 100 μ/Vertiefung zugegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunde reagieren gelassen, um verbleibende aktive Gruppen zu blockieren. Nach dem Waschen einer jeden Vertiefung mit einer PBS-Lösung, enthaltend 0,05% Tween (Tween-PBS), wurden die Kulturüberstände von Transformanten oder gereinigte Antikörper in 50 μ/Vertiefung zugegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunde reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde jede Vertiefung mit Tween-PBS gewaschen. Anschließend wurde die Lösung eines Peroxidase-markierten Ziege-anti-Mensch-IgG (H & L)-Antikörpers (hergestellt von American Qualex), der mit BSA-PBS um das 3000- bis 6000fache verdünnt wurde, als eine Sekundärantikörperlösung in 50 μ/Vertiefung zugegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunde reagieren gelassen. Nach der Reaktion und dem anschließenden Waschen mit Tween-PBS wurde eine ABTS-Substratlösung [eine Lösung hergestellt durch Lösen von 0,55 g 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)ammonium in 1 l 0,1 M Citratpuffer (pH 4,2) und Zugeben von 1 μl/ml Wasserstoffperoxid unmittelbar vor der Verwendung) in 50 μ/Vertiefung für eine Farbentwicklung zugegeben, und die Reaktion wurde durch Zugabe einer 5%igen SDS-Lösung in 50 μ/Vertiefung gestoppt. Anschließend wurde die Absorption bei 415 nm (OD415) gemessen.
  • 3. Reinigung des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers
  • (1) Züchtung der von CHO/DG44-Zellen abstammenden Expressionszellen und Reinigung des Antikörpers
  • Die den chimären Anti-FGF-8-Antikörper exprimierende transformierte Zelllinie KM3034, welche unter Punkt 2(4) von Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in IMDM-dFBS(10)-Medium, enthaltend 500 nMol/MTX, in einer Dichte von 1–2 × 105 Zellen/ml suspendiert und in 40 ml in einer 175 cm2-Flasche (hergestellt von Greiner) dispensiert. Wenn die Zellen durch das Züchten in einem Brutschrank mit 5% 002 bei 37°C für 5 bis 7 Tage konfluent wurden, wurde der Kulturüberstand verworfen, und die Zellen wurden mit 20 ml PBS gewaschen. Nach dem Verwerfen der PBS-Lösung und der anschließenden Zugabe von 40 ml EXCELL301-Medium (hergestellt von JRH) wurden die Zellen in einem Brutschrank mit 5% CO2 bei 37°C für 7 bis 14 Tage gezüchtet, und anschließend wurde der Kulturüberstand gewonnen. Unter Verwendung einer Prosep-A-Säule (hergestellt von Millipore) wurde der chimäre Anti-FGF-8-Antikörper gemäß den beiliegenden Anweisungen des Herstellers aus dem Kulturüberstand gereinigt. Der so erhaltene chimäre Anti-FGF-8-Antikörper wurde als KM3034 bezeichnet.
  • (2) Züchtung der von YB2/0-Zellen abstammenden Expressionszellen und Reinigung des Antikörpers
  • Die den chimären Anti-FGF-8-Antikörper exprimierende transformierte Zelllinie KM3334, welche unter Punkt 2(5) von Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in Hybridoma-SFM-Medium (hergestellt von Gibco), enthaltend 200 nMol/ MTX und Daigo's GF21 (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) in einer Konzentration von 5%, bei 37°C in einem Brutschrank mit 5% CO2 unter Verwendung einer 175 cm2-Flasche (hergestellt von Greiner) gezüchtet. Unter Verwendung einer Prosep-A-Säule (hergestellt von Millipore) wurde der chimäre Anti-FGF-8-Antikörper gemäß den beiliegenden Anweisungen des Herstellers aus dem Kulturüberstand gereinigt, welcher nach einem Züchtungszeitraum von 8 bis 10 Tagen gewonnen worden war. Der so erhaltene chimäre Anti-FGF-8-Antikörper wurde als KM3334 bezeichnet.
  • (4) Analyse des gereinigten chimären Anti-FGF-8-Antikörpers
  • Jeweils etwa 4 μg der in den jeweiligen tierischen Zellen exprimierten chimären Anti-FGF-8-Antikörper KM3034 und KM3334, die unter Punkt 3 von Beispiel 1 gereinigt und erhalten wurden, wurden einer SDS-PAGE nach der bekannten Methode [Nature 227 (1970), 680] unterzogen, um deren Molekulargewicht und Reinheit zu untersuchen. Bei jedem der gereinigten chimären Anti-FGF-8-Antikörper wurde unter nichtreduzierenden Bedingungen eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 150 kD identifiziert und wurden unter reduzierenden Bedingungen zwei Banden von etwa 50 kD und etwa 25 kD beobachtet. Diese Molekulargewichte entsprachen nahezu den Molekulargewichten, welche aus den Nucleotidsequenzen der cDNA für die H-Kette und die L-Kette des Antikörpers abgeleitet wurden (H-Kette: etwa 49 kD, L-Kette: etwa 23 kD, gesamtes Molekül: etwa 144 kD), und stimmten auch mit den Berichten überein, denen zufolge ein Antikörper vom IgG-Typ unter nichtreduzierenden Bedingungen ein Molekulargewicht von etwa 150 kD aufweist und unter reduzierenden Bedingungen aufgrund der Spaltung einer S-S-Bindung in dem Molekül in H-Ketten mit einem Molekulargewicht von etwa 50 kD und in L-Ketten mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kD abgebaut wird [Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Kapitel 14 (1988); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)], wodurch bestätigt wurde, dass jeder chimäre Anti-FGF-8-Antikörper als ein Antikörpermolekül in der richtigen Struktur exprimiert und gereinigt wurde.
  • (5) Aktivitätsbeurteilung der gereinigten chimären Anti-FGF-8-Antikörper
  • Die FGF-8 neutralisierende Aktivität der gereinigten chimären Anti-FGF-8-Antikörper wurde durch die Messung der nachfolgenden Hemmwirkung gegenüber dem FGF-8-abhängigen Wachstum der Maus-Brustkrebszelllinie SC-3 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 8928] beurteilt. Hierfür wurden die SC-3-Zellen in einer Dichte von 3,0 × 104 Zellen/ml in DMEM-Ham's F12 (1:1)-Medium (hergestellt von Gibco), enthaltend 2% mit Aktivkohlenstoff behandeltes FBS, suspendiert und in 150 μl (4,5 × 103 Zellen/ml) in eine Platte mit 96 Vertiefungen überimpft. Nach Züchten bei 37°C für 18 Stunden in einem Brutschrank mit 5% CO2 wurde das Medium unter Verwendung von 100 μl/Vertiefung eines Testmediums ausgetauscht. Das Testmedium wurde durch das Lösen von 50 ng/ml FGF-8 (hergestellt von R&D) und des chimären Anti-FGF-8-Antikörpers in der jeweiligen verdünnten Konzentration in DMEM-Ham's F12 (1:1)-Medium, enthaltend 0,1% BSA, hergestellt. Der chimäre Antikörper KM2760 gegen den menschlichen Chemokin-Rezeptor CCR4, beschrieben in WO 01/64754 , wurde als ein negativer Kontrollantikörper verwendet. Nach Züchten bei 37°C für 48 Stunden in einem Brutschrank mit 5% CO2 wurde das Medium durch ein frisch hergestelltes Testmedium ausgetauscht, gefolgt von einem Züchtungszeitraum von 48 Stunden. Anschließend wurde WST-1-Reagens (hergestellt von Roche) in 10 μ/Vertiefung zugegeben, gefolgt von leichtem Rühren, und nach Züchtung bei 37°C für 1 Stunde in einem Brutschrank mit 5% CO2 wurde der OD450/650-Wert gemessen. In 4 entsprechen die x-Achse und die y-Achse der Konzentration des zugegebenen Antikörpers bzw. dem relativen Wachstum (%) bezogen auf das Wachstum nach der Zugabe von 50 ng/ml FGF-8 allein. Das relative Wachstum (%), bezogen auf das Wachstum nach der Zugabe von 50 ng/ml FGF-8 allein, wurde durch die folgende Gleichung berechnet:
    (Gleichung)
    Relatives Wachstum (%), bezogen auf das Wachstum nach Zugabe von FGF-8 = [(OD-Wert nach der Zugabe von FGF-8 und des Antikörpers) – (OD-Wert vor der Zugabe von FGF-8 und des Antikörpers)]/[(OD-Wert nach der Zugabe von FGF-8 allein) – [(OD-Wert vor der Zugabe von FGF-8 und des Antikörpers)] × 100
  • Wie in 4 gezeigt, wurde für den Anti-FGF-8-Mausantikörper KM1334 und die chimären Anti-FGF-8-Antikörper KM3034 und KM3334 jeweils eine vergleichbare Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum von SC-3-Zellen beobachtet, so dass keine Verminderung der Aktivität durch die Erzeugung eines chimären Antikörpers festgestellt wurde.
  • Beispiel 2
  • Herstellung eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers gegen FGF-8:
  • 1. Konstruktion einer cDNA, codierend die VH-Region und die VL-Region eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers gegen FGF-8
  • (1) Konstruktion von Aminosäuresequenzen für die VH-Region und die VL-Region eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers gegen FGF-8
  • Zuerst wurde die Aminosäuresequenz der VH-Region eines menschlichen CDR-transplantierten Antikörpers gegen FGF-8 (Anti-FGF-8-CDR-transplantierter Antikörper) wie folgt konstruiert. Für die Transplantation der Aminosäuresequenz einer CDR-Region aus der VH-Region des Anti-FGF-8-Mausantikörpers KM1334, welche unter Punkt 1(4) von Beispiel 1 identifiziert wurde, wurde die Aminosäuresequenz einer FR-Region in der VH-Region eines menschlichen Antikörpers ausgewählt. Kabat et al. haben die VH-Region von verschiedenen bekannten menschlichen Antikörpern basierend auf der Homologie der Aminosäuresequenzen in drei Untergruppen (HSG I bis III) eingeteilt und dann die Konsensussequenzen in den jeweiligen Untergruppen beschrieben [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. Da diese Konsensussequenzen möglicherweise die Immunogenität beim Menschen verringern, wurde beschlossen, die Aminosäuresequenz für die VH-Region eines Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers basierend auf diesen Konsensussequenzen zu entwerfen. Um einen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper herzustellen, welcher eine höhere Aktivität besitzt, wurde im Hinblick auf die Konstruktion davon beschlossen, die Aminosäuresequenz einer FR-Region auszuwählen, welche die größte Homologie zu der Aminosäuresequenz einer FR-Region in der VH-Region von KM1334 unter den Aminosäuresequenzen von FR-Regionen in den Konsensussequenzen der drei Untergruppen für die VH-Region von menschlichen Antikörpern hat. Die Ergebnisse der Homologiesuche sind in Tabelle 1 angegeben. Wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigte die Aminosäuresequenz einer FR-Region in der VH-Region von KM1334 die größte Homologie zu der Untergruppe I.
  • Tabelle 1
  • Homologie zwischen der Aminosäuresequenz einer FR-Region in der Konsensussequenz jeder Untergruppe der VH-Region eines menschlichen Antikörpers und der Aminosäuresequenz einer FR-Region in der VH-Region von KM1334
    HSG I HSG II HSG III
    79,3% 51,7% 59,8%
  • Basierend auf den vorstehenden Ergebnissen wurde die Aminosäuresequenz HV.0 für die VH-Region des Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers, welche in SEQ ID NO: 16 dargestellt ist, durch die Transplantation der Aminosäuresequenz einer CDR-Region aus der VH-Region des Anti-FGF-8-Mausantikörpers KM1334 in eine geeignete Position der Aminosäuresequenz einer FR-Region in der Konsensussequenz der Untergruppe I der VH-Region eines menschlichen Antikörpers konstruiert.
  • Anschließend wurde die Aminosäuresequenz für die VL-Region eines Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers wie folgt konstruiert. Für die Transplantation der Aminosäuresequenz einer CDR-Region aus der VL-Region des Anti-FGF-8-Mausantikörpers KM1334, welche unter Punkt 1(4) von Beispiel 1 identifiziert wurde, wurde die Aminosäuresequenz einer FR-Region in der VL-Region eines menschlichen Antikörpers ausgewählt. Kabat et al haben die VL-Region von verschiedenen bekannten menschlichen Antikörpern basierend auf der Homologie der Aminosäuresequenzen in vier Untergruppen (HSG I bis IV) eingeteilt und dann die Konsensussequenzen in den jeweiligen Untergruppen beschrieben [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. Entsprechend wurde ähnlich wie im Falle der VH-Region die Aminosäuresequenz einer FR-Region mit der größten Homologie zu der Aminosäuresequenz der FR-Region in der VL-Region von KM1334 aus den Aminosäuresequenzen für die FR-Regionen in den Konsensussequenzen der vier Untergruppen der VL-Region von menschlichen Antikörpern ausgewählt.
  • Die Ergebnisse der Homologiesuche sind in Tabelle 2 angegeben. Wie in Tabelle 2 angegeben, zeigte die Aminosäuresequenz einer FR-Region in der VL-Region von KM1334 die größte Homologie zu der Untergruppe II.
  • Tabelle 2
  • Homologie zwischen der Aminosäuresequenz einer FR-Region in der Konsensussequenz jeder Untergruppe der VL-Region eines menschlichen Antikörpers und der Aminosäuresequenz einer FR-Region in der VL-Region von KM1334
    HSG I HSG II HSG III HSG IV
    66,3% 83,8% 66,2% 73,8%
  • Basierend auf den vorstehenden Ergebnissen wurde die Aminosäuresequenz LV.0 für die VL-Region des Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers, welche in SEQ ID NO: 17 dargestellt ist, durch die Transplantation der Aminosäuresequenz einer CDR-Region aus der VL-Region des Anti-FGF-8-Mausantikörpers KM1334 in eine geeignete Position der Aminosäuresequenz einer FR-Region in der Konsensussequenz der Untergruppe II der VL-Region eines menschlichen Antikörpers konstruiert.
  • Die Aminosäuresequenz HV.0 für die VH-Region und die Aminosäuresequenz LV.0 für die VL-Region des Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers, welche auf diese Weise konstruiert wurden, sind Sequenzen, wobei nur die CDR-Aminosäuresequenz des Anti-FGF-8-Mausantikörpers KM1334 in die Aminosäuresequenz einer FR-Region in dem ausgewählten menschlichen Antikörper transplantiert wird. In vielen Fällen, wie im Falle von menschlichen CDR-transplantierten Antikörpern, wird die Bindungsaktivität durch die Transplantation der Aminosäuresequenz einer CDR-Region aus dem Mausantikörper allein vermindert. Um eine solche Verminderung zu vermeiden, werden von den Aminosäureresten in der FR-Region, welche sich zwischen einem menschlichen Antikörper und einem Mausantikörper unterscheiden, diejenigen Aminosäurereste, von denen angenommen wird, dass sie die Bindungsaktivität beeinflussen, zusammen mit der Aminosäuresequenz der CDR-Region transplantiert. Entsprechend wurde in diesem Beispiel auch der Versuch unternommen, die Aminosäurereste in der FR-Region zu identifizieren, welche wahrscheinlich die Bindungsaktivität beeinflussen.
  • Zuerst wurde eine dreidimensionale Struktur der V-Region eines Antikörpers, der die vorstehend konstruierte Aminosäuresequenz HV.0 für die VH-Region und Aminosäuresequenz LV.0 für die VL-Region des Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers umfasst (HV0LV0), mit Hilfe von computergestützten Modellerstellungstechniken entworfen. Die Festlegung der Koordinaten der dreidimensionalen Struktur erfolgte mit Hilfe der AbM-Software (entwickelt von Oxford Molecular), und die Darstellung der dreidimensionalen Struktur erfolgte unter Verwendung der Software Pro-Explore (entwickelt von Oxford Molecular) oder RasMol (entwickelt von Glaxo) gemäß der jeweiligen beiliegenden Anweisungen des Herstellers. Ein Computermodell der dreidimensionalen Struktur der V-Region des Anti-FGF-8-Mausantikörpers KM1334 wurde ebenfalls in der gleichen Weise konstruiert. Außerdem wurde ein Modell der dreidimensionalen Struktur eines modifizierten Antikörpers, umfassend eine Aminosäuresequenz, worin die Aminosäurereste, welche sich von dem Anti-FGF-8-Mausantikörper KM1334 hinsichtlich der Aminosäuresequenzen der FR-Regionen in der VH-Region und der VL-Region von HV0LV0 unterscheiden, durch die Aminosäurereste in Positionen, welche dem Anti-FGF-8-Mausantikörper KM1334 entsprechen, substituiert wurden, konstruiert, und die dreidimensionalen Strukturen der V-Regionen von dem Anti-FGF-8-Mausantikörper KM1334, HV0LV0 und der modifizierten Struktur wurden miteinander verglichen. Als Ergebnis wurden als Reste unter den Aminosäureresten der FR-Regionen in HV0LV0, welche wahrscheinlich die Antikörperaktivität durch Veränderung der dreidimensionalen Struktur der Antigenbindungsregion beeinflussen, Lys in Position 12, Lys in Position 13, Ala in Position 40, Pro in Position 41, Met in Position 48, Val in Position 68, Ile in Position 70, Thr in Position 74, Thr in Position 76, Glu in Position 82, Arg in Position 87 und Tyr in Position 95 für HV.0 und Ile in Position 2, Val in Position 3, Thr in Position 14, Pro in Position 15, Gln in Position 50, Leu in Position 51 und Tyr in Position 92 für LV.0 ausgewählt und für die Modifikation von Aminosäureresten verwendet. Durch den Austausch von mindestens einem oder mehreren dieser ausgewählten Aminosäurereste durch die Aminosäurereste, welche in dem Mausantikörper KM1334 zu finden sind, wurden die VH-Region und die VL-Region von menschlichen CDR-transplantierten Antikörpern mit verschiedenen Modifikationen wie folgt konstruiert.
  • Genauer wurde die in SEQ ID NO: 18 dargestellte Aminosäuresequenz, worin 6 Reste, umfassend Lys in Position 12, Lys in Position 13, Ala in Position 40, Pro in Position 41, Met in Position 48 und Tyr in Position 95, durch die Reste Ala, Arg, Arg, Ser, Ile bzw. Phe, welche in dem Mausantikörper KM1334 vorhanden sind, ersetzt wurden, für die VH-Region konstruiert. Die in SEQ ID NO: 19 dargestellte Aminosäuresequenz, worin 6 Reste, umfassend Ile in Position 2, Thr in Position 14, Pro in Position 15, Gln in Position 50, Leu in Position 51 und Tyr in Position 92, durch die Reste Val, Ser, Leu, Lys, Val bzw. Phe, welche in dem Mausantikörper KM1334 vorhanden sind, ersetzt wurden, für die VL-Region konstruiert.
  • (2) Konstruktion einer cDNA, codierend die VH-Region des Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers
  • Die cDNA, codierend die Aminosäuresequenz HV.0 für die VH-Region des Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers, welche unter Punkt 1(1) von Beispiel 2 konstruiert wurde, wurde mittels der PCR-Methode wie folgt konstruiert.
  • Zuerst wurde die konstruierte Aminosäuresequenz durch die Ligierung der sekretorischen Signalsequenz für die H-Kette des Anti-FGF-8-Mausantikörpers KM1334, welche in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, zu der vollständigen Aminosäuresequenz eines Antikörpers ergänzt. Anschließend wurde die Aminosäuresequenz in die genetischen Codons translatiert. Wenn zwei oder mehrere genetische Codons für einen Aminosäurerest vorhanden waren, wurde das entsprechende genetische Codon unter Berücksichtigung des Codongebrauchs, der für die Nucleotidsequenzen von Antikörpergenen ermittelt wurde, festgelegt [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. Die Nucleotidsequenz der cDNA, codierend die vollständige Aminosäuresequenz der V-Region des Antikörpers, wurde konstruiert, indem die auf diese Weise bestimmten genetischen Codons miteinander ligiert wurden, wobei anschließend komplementäre Nucleotidsequenzen von Primern für die Verwendung bei einer PCR-Amplifikation (enthaltend Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen für die Clonierung in einen Expressionsvektor für einen humanisierten Antikörper) an das 5'-Ende und das 3'-Ende angehängt wurden. Die auf diese Weise konstruierte Nucleotidsequenz wurde in Sequenzen von jeweils 141 Basen beginnend von dem 5'-terminalen Ende unterteilt, wobei die angrenzenden Nucleotidsequenzen derart konstruiert wurden, dass die Enden eine überlappende Sequenz von etwa 20 Basen aufweisen. Diese Sequenzen wurden in einer abwechselnden Reihenfolge von Sense-Sequenz und Antisense-Sequenz synthetisiert. Insbesondere wurden 4 synthetische Oligonucleotide mit der SEQ ID NO: 20 bis 23 synthetisiert (hergestellt von GENSET).
  • Jedes Oligonucleotid wurde zu 50 μl einer Reaktionslösung zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,1 μMol/l zu erhalten. Die PCR wurde unter Verwendung von 0,5 μMol/l des M13-Primers RV (hergestellt von Takara Shuzo), 0,5 μMol/l des M13-Primers M4 (hergestellt von Takara Shuzo) und 2,5 Einheiten der KOD-Polymerase (hergestellt von TOYOBO) gemäß den Anweisungen des Herstellers, die der KOD-Polymerase beigefügt waren, durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen beinhalteten das Erhitzen der Reaktionslösung bei 94°C für 5 Minuten und anschließend 25 Reaktionszyklen bei 94°C für 30 Sekunden, bei 50°C für 30 Sekunden und bei 74°C für 60 Sekunden für einen Zyklus, und weiterhin das Erhitzen bei 74°C für 5 Minuten. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt. Das Präzipitat wurde in sterilem Wasser gelöst und mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SpeI (hergestellt von Takara Shuzo) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 0,3 μg eines EcoRI-Spel-Fragments von etwa 0,47 kb gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pBluescript II SK(–) (hergestellt von Stratagene) mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SpeI (hergestellt von Takara Shuzo) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 2,9 μg eines EcoRI-SpeI-Fragments von etwa 2,95 kb gewonnen wurden.
  • Im Anschluss daran wurden 0,1 μg des EcoRI-SpeI-Fragments des PCR-Produkts der VH-Region des Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers und 0,1 μg des EcoRI-SpeI-Fragments des Plasmids pBluescript II SK(–), welche beide vorstehend erhalten wurden, zu einem Gesamtvolumen von 10 μl sterilem Wasser zugegeben und unter Verwendung von Ligation High (hergestellt von TOYOBO) ligiert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurden Zellen von E. coli DH5α (hergestellt von TOYOBO) transformiert. Aus jeweils 10 Clonen der Transformanten wurde die Plasmid-DNA präpariert, und anschließend wurde eine Nucleotidsequenzanalyse nach der Didesoxy-Methode [Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)] unter Verwendung des Big Dye Terminator-Kits, Ver. 2 (hergestellt von Applied Biosystems) durchgeführt. Als Ergebnis der Nucleotidsequenzanalyse wurde das in 5 gezeigte Plasmid pKM1334HV0 erhalten, welches die Nucleotidsequenz von Interesse enthält.
  • In der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben, wurde auch eine cDNA, codierend die Aminosäuresequenz HV.6 der VH-Region des Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers, welche unter Punkt 1(1) von Beispiel 2 entworfen wurde, mittels PCR unter Verwendung von 4 synthetischen Oligonucleotiden mit der SEQ ID NO: 24 bis 27 (hergestellt von GENSET) als synthetische DNAs konstruiert. Als Ergebnis wurde das Plasmid pKM1334HV6 erhalten, welches die HV.6 codierende cDNA enthält.
  • (3) Konstruktion einer cDNA, codierend die VL-Region des Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers
  • Die cDNA, codierend die Aminosäuresequenz LV.0 für die VL-Region des Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers, welche unter Punkt 1(1) von Beispiel 2 entworfen wurde, wurde in der gleichen Weise wie im Falle der VH-Region mittels PCR konstruiert. In diesem Fall jedoch wurde die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Sequenz der L-Kette des Anti-FGF-8-Mausantikörpers als sekretorische Signalsequenz verwendet und wurden die 4 synthetischen Oligonucleotide mit SEQ ID NO: 28 bis 31 (hergestellt von GENSET) als synthetische DNAs verwendet. Als Ergebnis wurde das Plasmid pKM1334LV0 erhalten, welches die LV.0 codierende cDNA enthält.
  • In der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben, wurde auch eine cDNA, codierend die Aminosäuresequenz LV.6 der VL-Region des Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers, welche unter Punkt 1(1) von Beispiel 2 konstruiert wurde, mittels PCR unter Verwendung von 4 synthetischen Oligonucleotiden mit der SEQ ID NO: 32 bis 35 (hergestellt von GENSET) als synthetische DNAs konstruiert. Als Ergebnis wurde das Plasmid pKM1334LV6 erhalten, welches die LV.6 codierende cDNA enthält.
  • 2. Konstruktion eines Expressionsvektors für den Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper
  • Unter Verwendung des Vektors pKANTEX93 für die Expression eines humanisierten Antikörpers, beschrieben in WO 97/10354 , und der Plasmide pKM1334HV0 und pKM1334LV4, welche unter Punkt 1(2) und 1(3) von Beispiel 2 erhalten wurden, wurde der Expressionsvektor pKANTEX1334HV0LV0 für den Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper wie folgt konstruiert.
  • Zuerst wurden 3 μg des Plasmids pKM1334HV0, welches unter Punkt 1(2) von Beispiel 2 erhalten wurde, mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (hergestellt von Takara Shuzo) gemischt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 0,3 μg eines ApaI-NotI-Fragments von etwa 0,47 kb gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Expressionsvektors pKANTEX93 für einen humanisierten Antikörper mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (hergestellt von Takara Shuzo) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 2 μg eines ApaI-NotI-Fragments von etwa 12,8 kb gewonnen wurden.
  • Im Anschluss daran wurden 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments des Plasmids pKM1334HV0 und 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments des Plasmids pKANTEX93 zu einem Gesamtvolumen von 10 μl sterilem Wasser zugegeben und unter Verwendung von Ligation High (hergestellt von TOYOBO) ligiert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurden Zellen von E. coli DH5α transformiert, wobei das in 6 gezeigte Plasmid pKANTEX1334HV0 erhalten wurde.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pKM1334LV0, welches unter Punkt 1(3) von Beispiel 2 erhalten wurde, mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BsiWI (hergestellt von New England Biolabs) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 0,3 μg eines EcoRI-BsiWI-Fragments von etwa 0,45 kb gewonnen wurden.
  • Im Anschluss daran wurden 3 μg des Plasmids pKM1334HV0, das vorstehend erhalten wurde, mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BsiWI (hergestellt von New England Biolabs) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 2 μg eines EcoRI-BsiWI-Fragments von etwa 13,30 kb gewonnen wurden.
  • Als nächstes wurden 0,1 μg des EcoRI-BsiWI-Fragments. des Plasmids pKM1334LV0 und 0,1 μg des EcoRI-BsiWI-Fragments des Plasmids pKANTEX1334-HV0 zu einem Gesamtvolumen von 10 μl sterilem Wasser zugegeben und unter Verwendung von Ligation High (hergestellt von TOYOBO) ligiert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurden Zellen des E. coli-Stamms DH5α transformiert, wobei das in 6 gezeigte Plasmid pKANTEX1334-HV0LV0 erhalten wurde.
  • Unter Verwendung von 400 ng des so erhaltenen Plasmids wurde die Nucleotidsequenz hiervon mit Hilfe der Didesoxy-Methode [Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)] unter Verwendung des Big Dye Terminator-Kits, Ver. 2 (hergestellt von Applied Biosystems) bestimmt, wodurch bestätigt wurde, dass ein Plasmid erhalten wurde, in welches die DNA von Interesse cloniert worden war.
  • In der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben, wurde auch der Expressionsvektor pKANTEX1334HV0LV6 unter Verwendung des Plasmids pKM1334HV0, welches unter Punkt 1(2) von Beispiel 2 erhalten wurde, und des Plasmids pKANTEX1334LV6, welches unter Punkt 1(3) von Beispiel 2 erhalten wurde, konstruiert.
  • In der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben, wurde außerdem der Expressionsvektor pKANTEX1334HV6LV6 unter Verwendung des Plasmids pKM-1334HV6, welches unter Punkt 1(2) von Beispiel 2 erhalten wurde, und des Plasmids pKANTEX1334LV6, welches unter Punkt 1(3) von Beispiel 2 erhalten wurde, konstruiert.
  • 3. Stabile Expression des Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers unter Verwendung von YB2/0-Zellen
  • Unter Verwendung der Expressionsvektoren pKANTEX1334HV0LV0, pKANTEX1334HV0LV6 und pKANTEX1334HV6LV6 für den Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper, welche unter Punkt 2 von Beispiel 2 erhalten wurden, wurde die stabile Expression der verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper in YB2/0-Zellen gemäß dem unter Punkt 2(5) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bewirkt.
  • 4. Reinigung der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper
  • Die Züchtung der Transformanten, erhalten unter Punkt 3 von Beispiel 2, welche von den YB2/0-Zellen erhalten wurden und welche die verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper exprimieren, sowie die Reinigung der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper aus den Kulturüberständen wurden gemäß dem unter Punkt 3(2) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Der Antikörper von einer Transformante, in die pKANTEX1334HV0LV0 eingeführt wurde, wurde als HV0LV0 bezeichnet; der Antikörper von einer Transformante, in die pKANTEX1334HV0LV6 eingeführt wurde, wurde als HV0LV6 bezeichnet; und der Antikörper von einer Transformante, in die pKANTEX1334HV6LV6 eingeführt wurde, wurde als HV6LV6 bezeichnet.
  • 5. Analyse der gereinigten Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper
  • Die SDS-PAGE unter Verwendung der verschiedenen Anti-FGF-8-CDRtransplantierten Antikörper, welche unter Punkt 4 von Beispiel 2 erhalten wurden, wurde gemäß dem unter Punkt 4 von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass jeder Antikörper als ein Antikörpermolekül in der richtigen Struktur exprimiert und gereinigt wurde.
  • 6. Messung der Bindungsaktivität der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper gegenüber FGF-8 (ELISA)
  • Die Aktivität der verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper, welche unter Punkt 4 von Beispiel 2 erhalten wurden, im Hinblick auf die Bindung an FGF-8 wurde durch den ELISA, welcher unter Punkt 2(6) von Beispiel 1 beschrieben wurde, gemessen. Der chimäre Anti-FGF-8-Antikörper KM3334, welcher unter Punkt 3(2) von Beispiel 1 aus YB2/0-Zellen erhalten wurde, wurde als eine positive Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Wie in 7 dargestellt, zeigte jeder der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper eine FGF-8-Bindungsaktivität, welche mit derjenigen von KM3334 vergleichbar war, so dass keine wesentliche Verringerung der Bindungsaktivität durch die CDR-Transplantation beobachtet wurde.
  • 7. Messung der Bindungsaktivität der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper gegenüber FGF-8
  • Um die Aktivität der verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper, welche unter Punkt 4 von Beispiel 2 erhalten wurden, im Hinblick auf die Bindung an FGF-8 genauer zu untersuchen, wurden die Aktivitäten der verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpern hinsichtlich der Bindung an FGF-8 gemessen und unter Verwendung des BIAcore-Systems 2000 (hergestellt von BIACORE) wie folgt verglichen. Der chimäre Anti-FGF-8-Antikörper KM3334, welcher unter Punkt 3(2) von Beispiel 1 aus YB2/0-Zellen erhalten wurde, wurde als eine positive Kontrolle verwendet.
  • Im Folgenden wurde HBS-EP (hergestellt von BIACORE) als Puffer für die Verdünnung der Proben und während der Messung verwendet. Zuerst wurde die Sensorspitze CM5 (hergestellt von BIACORE) justiert, und anschließend wurde FGF-8 (hergestellt von R&D), gelöst in einer Konzentration von 31,25 μg/ml in 10 mMol/l Acetatpuffer (pH 4,0), durch ein Amin-Kopplungsverfahren auf der Oberfläche der Sensorspitze immobilisiert. Die immobilisierte Menge entsprach 4,498 RU.
  • Jeweils 60 μl der Antikörperlösung wurden in einer Durchflussrate von 20 μl/Minute in die den immobilisierten FGF-8 enthaltende Durchflusszelle eingebracht, und anschließend wurde die Dissoziationsreaktion während 3 Minuten überwacht. Im Anschluss an die Dissoziationsreaktion wurde die Spitzenoberfläche durch die kontinuierliche Zugabe von zweimal 20 μl 10 mMol/l Glycin-HCl-Puffer (pH 1,5) zu der Durchflusszelle regeneriert. Dieser Zyklus wurde für Antikörperlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (50 bis 0,068 μg/ml) durchgeführt, wobei für jede Konzentration ein Sensorgramm erhalten wurde. Das Sensorgramm für jeden Antikörper wurde durch Subtraktion des Sensorgramms, welches unter Verwendung des chimären Antikörpers KM871 gegen CD3 [Cancer Immunol. Immunother. 36 (1993), 373] als eine negative Kontrolle erhalten wurde, in ein Sensorgramm für die spezifische Reaktion umgewandelt. Das Sensorgramm für 50 μg/ml jedes Antikörpers ist in 8 dargestellt. Wie aus dem Sensorgramm ersichtlich ist, wurde zum Zeitpunkt der Dissoziationsreaktion jedes Antikörpers praktisch keine Dissoziation beobachtet, so dass es schwierig war, eine exakte Dissoziationskonstante zu erhalten. Demgemäß erfolgte der Vergleich der Bindungsaktivität der verschiedenen Antikörper durch den Vergleich der Stärke der Bindung [Resonanzsignal (RU)] zum Zeitpunkt der Bindungsreaktion. Als Ergebnis, wie in 8 gezeigt, zeigte der chimäre Antikörper KM3334 die stärkste Bindungsreaktion, und der CDR-transplantierte Antikörper HV0LV6 zeigte eine starke Bindungsreaktion, welche mit derjenigen von KM3334 vergleichbar war. Dagegen zeigten die CDR-transplantierten Antikörper HV0LV0 und HV6LV6 eine etwas geringere Bindungsreaktion als KM3334 und HV0LV6. Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass ein Vergleich der Bindungsaktivitäten zwischen Antikörpern, welcher durch einen ELISA nicht möglich ist, unter Verwendung des BIAcore-Systems durchgeführt kann und dass die Bindungsaktivität des CDR-transplantierten Antikörpers durch die Modifikation der 6 Aminosäurereste in der FR-Region der VL-Region wieder das gleiche Niveau wie die Bindungsaktivität des chimären Antikörpers erreicht. Ferner wurde gezeigt, dass die Modifikation der 6 Aminosäurereste in der FR-Region der VH-Region keinen Einfluss auf die Erhöhung der Bindungsaktivität hatte.
  • Der aus YB2/0-Zellen erhaltene CDR-transplantierte Antikörper HV0LV6, der eine starke Bindungsreaktion zeigte, welche mit derjenigen des chimären Antikörpers KM3334 vergleichbar war, wurde als KM8037 bezeichnet; und die von YB2/0-Zellen abgeleitete transformierte Zelllinie, welche eine hohe Expression von KM8037 zeigt, wurde ebenfalls als KM8037 bezeichnet. Die transformierte Zelllinie KM8037 ist auch am 20. Juni 2002 als FERM BP-8084 bei der International Patent Organism Depositary, National institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1–1, Higashi 1-Chorre Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305–8566, Japan), hinterlegt worden.
  • Beispiel 3
  • Herstellung eines Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers mit einer geringeren Immunogenität (1)
  • Anhand der Ergebnisse von Beispiel 2 wurde gezeigt, dass der Anti-FGF-8-CDR-transplantierte Antikörper, der die Modifikation der 6 Aminosäurereste, welche von dem Mausantikörper KM1334 stammen, in der FR-Region der VL-Region enthält, eine Bindungsaktivität zeigt, welche mit derjenigen des entsprechenden chimären Antikörpers vergleichbar ist. Demgemäß wurde der Einfluss dieser sechs Reste auf die Wiederherstellung der Aktivität weiter untersucht, wobei wie folgt Anti-FGF-8-CDR-transplantierte Antikörper hergestellt wurden, welche eine ausreichende Aktivität aufweisen und die eine geringere Anzahl an Aminosäureresten enthalten, welche von dem Mausantikörper stammen, wobei erwartet wird, dass diese Antikörper eine weiter verminderte Immunogenität haben.
  • 1. Konstruktion einer Aminosäuresequenz für die VL-Region
  • Im Hinblick auf die vorstehenden 6 Aminosäurereste wurden Aminosäuresequenzen für 6 VL-Regionen mit den folgenden Modifikationen konstruiert.
  • In LV.4-1 wurden 4 Reste, umfassend Ile in Position 2, Gln in Position 50, Leu in Position 51 und Tyr in Position 92, durch die Reste Val, Lys, Val bzw. Phe, welche den Aminosäureresten entsprechen, die in dem Mausantikörper KM1334 vorhanden sind, ersetzt.
  • In LV.4-2 wurden 4 Reste, umfassend Ile in Position 2, Thr in Position 14, Pro in Position 15 und Tyr in Position 92, durch die Reste Val, Ser, Leu bzw. Phe, welche den Aminosäureresten entsprechen, die in dem Mausantikörper KM1334 vorhanden sind, ersetzt.
  • In LV.3-1 wurden 3 Reste, umfassend Ile in Position 2, Leu in Position 51 und Tyr in Position 92, durch die Reste Val, Val bzw. Phe, welche den Aminosäureresten entsprechen, die in dem Mausantikörper KM1334 vorhanden sind, ersetzt.
  • In LV.3-2 wurden 3 Reste, umfassend Thr in Position 14, Pro in Position 15 und Tyr in Position 92, durch die Reste Ser, Leu bzw. Phe, welche den Aminosäureresten entsprechen, die in dem Mausantikörper KM1334 vorhanden sind, ersetzt.
  • In LV.2-1 wurden 2 Reste, umfassend Leu in Position 51 und Tyr in Position 92, durch die Reste Val bzw. Phe, welche den Aminosäureresten entsprechen, die in dem Mausantikörper KM1334 vorhanden sind, ersetzt.
  • In LV.2-2 wurden 2 Reste, umfassend Ile in Position 2 und Tyr in Position 92, durch die Reste Val bzw. Phe, welche den Aminosäureresten entsprechen, die in dem Mausantikörper KM1334 vorhanden sind, ersetzt.
  • 2. Konstruktion einer cDNA, codierend die VL-Region
  • Die cDNAs, codierend die Aminosäuresequenzen für die VL-Region des jeweiligen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers, welche unter Punkt 1 von Beispiel 3 entworfen wurden, wurden wie folgt konstruiert.
  • (1) Konstruktion einer cDNA, codierend LV.4-1
  • Die LV.4-1 codierende cDNA wurde gemäß dem Verfahren, welches unter Punkt 1(3) von Beispiel 2 beschrieben wurde, unter Verwendung von vier synthetischen Oligonucleotiden mit der SEQ ID NO: 29, 32, 34 und 35 als synthetische DNA-Fragmente (hergestellt von GENSET) konstruiert. Als Ergebnis wurde das Plasmid pKM1334LV4-1 erhalten, welches die LV.4-1 codierende cDNA enthält.
  • (2) Konstruktion einer cDNA, codierend LV.3-1
  • Unter Verwendung von 50 ng des Plasmids pKM1334LV6, welches unter Punkt 1(3) von Beispiel 2 erhalten wurde, als Matrize, des M13-Primers RV (hergestellt von Takara Shuzo) und der synthetischen DNA mit der in SEQ ID NO: 38 dargestellten Nucleotidsequenz (hergestellt von GENSET), welche als Primer in einer Endkonzentration von 0,3 μMol/l zugegeben wurden, wurde eine PCR, umfassend zuerst das Erhitzen bei 94°C für 2 Minuten und dann 35 Reaktionszyklen bei 94°C für 15 Sekunden, bei 50°C für 30 Sekunden und bei 68°C für 1 Minuten für einen Zyklus, gemäß den Anweisungen des Herstellers, welche der KOD-Polymerase (hergestellt von TOYOBO) beigefügt waren, durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde gereinigt, und das Produkt wurde in sterilem Wasser gelöst. Anschließend wurde das Produkt mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SpeI (hergestellt von Takara Shuzo) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektro phorese fraktioniert, wobei etwa 0,3 μg eines KpnI-SpeI-Fragments von etwa 0,22 kb gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pKM1334LV4-1, welches unter Punkt 2(1) von Beispiel 3 erhalten wurde, mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 0,2 μg eines KpnI-KpnI-Fragments von etwa 0,21 kb gewonnen wurden.
  • Im Anschluss daran wurden 3 μg des Plasmids pBluescript II SK(–) mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SpeI (hergestellt von Takara Shuzo) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 2 μg eines KpnI-SpeI-Fragments von etwa 2,95 kb gewonnen wurden.
  • Zu einem Gesamtvolumen von 10 μl sterilen Wasser wurden 0,1 μg des Kpnl-Spei-Fragments der VL-cDNA, 0,1 μg des KpnI-KpnI-Fragments des Plasmids pKM1334LV4-1 und 0,1 μg des KpnI-Spei-Fragments des Plasmids pBluescript 11 SK(–), welche jeweils vorstehend erhalten wurden, zugegeben und unter Verwendung von Ligation High (hergestellt von TOYOBO) ligiert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurden Zellen von E. coli DH5α transformiert, wobei das in 9 dargestellte Plasmid pKM1334LV3-1 erhalten wurde, welches die LV.3-1 codierende cDNA enthält.
  • (3) Konstruktion einer cDNA, codierend LV.2-1
  • Das Plasmid pKM1334LV2-1, enthaltend eine cDNA, codierend LV.2-1, wurde durch ein ähnliches Verfahren erhalten, wie unter Punkt 2(1) von Beispiel 2 beschrieben wurde, außer dass das Plasmid pKM1334LV0, welches unter Punkt 1(3) von Beispiel 2 erhalten wurde, anstelle des Plasmids pKM1334LV4-1 verwendet wurde.
  • (4) Konstruktion einer cDNA, codierend LV.2-2
  • Das Plasmid pKM1334LV2-2, enthaltend eine cDNA, codierend LV.2-2, wurde durch ein ähnliches Verfahren erhalten, wie unter Punkt 2(1) von Beispiel 2 beschrieben wurde, außer dass die in SEQ ID NO: 37 dargestellte synthetische DNA anstelle der in SEQ ID NO: 36 dargestellten synthetischen DNA als Primer verwendet wurde.
  • (5) Konstruktion einer cDNA, codierend LV.4-2
  • Zuerst wurden 3 μg des Plasmids pKM1334LV2-2, welches unter Punkt 2(4) von Beispiel 3 erhalten wurde, mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) gemischt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 2 μg eines KpnI-KpnI-Fragments von etwa 3,16 kb gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pKM1334LV6, welches unter Punkt 1(3) von Beispiel 2 erhalten wurde, mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 0,2 μg eines KpnI-KpnI-Fragments von etwa 0,21 kb gewonnen wurden.
  • Zu einem Gesamtvolumen von 10 μl sterilem Wasser wurden 0,1 μg des KpnI-KpnI-Fragments des Plasmids pKM1334LV2-2 und 0,1 μg des KpnI-KpnI-Fragments des Plasmids pKM1334LV6, welche jeweils vorstehend erhalten wurden, zugegeben und unter Verwendung von Ligation High (hergestellt von TOYOBO) ligiert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurden Zellen von E. coli DH5α transformiert, wobei das in 10 dargestellte Plasmid pKM1334LV4-2 erhalten wurde, welches die LV.4-2 codierende cDNA enthält.
  • (6) Konstruktion einer cDNA, codierend LV.3-2
  • Zunächst wurden 3 μg des Plasmids pKM1334LV4-2, welches unter Punkt 2(5) von Beispiel 3 erhalten wurde, mit 10 Einheiten der Restriktionsenzyme Tth111I (hergestellt von Takara Shuzo) und XmnI (hergestellt von New England Biolabs) gemischt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 2 μg eines Tth111I-XmnI-Fragments von etwa 2,24 kb gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pKM1334LV0, welches unter Punkt 1(3) von Beispiel 2 erhalten wurde, mit 10 Einheiten der Restriktionsenzyme Tth111I (hergestellt von Takara Shuzo) und XmnI (hergestellt von New England Biolabs) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 1 μg eines Tth111I-XmnI-Fragments von etwa 1,11 kb gewonnen wurden.
  • Zu einem Gesamtvolumen von 10 μl sterilem Wasser wurden 0,1 μg des Tth111I-XmnI-Fragments des Plasmids pKM1334LV4-2 und 0,1 μg des Tth111I-XmnI-Fragments des Plasmids pKM1334LV0, welche jeweils vorstehend erhalten wurden, zugegeben und unter Verwendung von Ligation High (hergestellt von TOYOBO) ligiert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurden Zellen von E. coli DH5α transformiert, wobei das in 11 dargestellte Plasmid pKM1334LV3-2 erhalten wurde, welches die LV.3-2 codierende cDNA enthält.
  • 3. Konstruktion eines Expressionsvektors für einen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper
  • Verschiedene Expressionsvektoren für einen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper, welche eine VL-cDNA enthalten, wurden durch das Ersetzen des EcoRI-BsiWI-Fragments, welches die VL-cDNA des Expressionsvektors pKANTEX1334HV0LV6 enthält, erhalten unter Punkt 2 von Beispiel 2, durch die jeweiligen verschiedenen EwRI-BsiWI-Fragmente, enthaltend eine VL-cDNA, welche unter Punkt 2 von Beispiel 3 erhalten wurden, konstruiert. Insbesondere wurden die 6 Vektoren pKANTEX1334HV0LV4-1, pKANTEX1334HV0LV4-2, pKANTEX1334HV0LV3-1, pKANTEX1334HV0LV3-2, pKANTEX1334HV0LV2-1 und pKANTEX1334HV0LV2-2, konstruiert.
  • 4. Stabile Expression der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper unter Verwendung von CHO/DG44-Zellen
  • Die stabile Expression der verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper in CHO/DG44-Zellen wurde gemäß dem unter Punkt 2(4) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der Expressionsvektoren pKANTEX1334HV0LV0 und pKANTEX1334HV0LV6, welche unter Punkt 2 von Beispiel 2 erhalten wurden, und der verschiedenen Expressionsvektoren für einen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper, welche unter Punkt 3 von Beispiel 3 erhalten wurden, bewirkt.
  • 5. Reinigung der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper
  • Die Züchtung der Transformanten, erhalten unter Punkt 4 von Beispiel 3, welche von den CHO/DG44-Zellen erhalten wurden und welche die verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper exprimieren, sowie die Reinigung der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper aus den Kulturüberständen wurden gemäß dem unter Punkt 3(1) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Der Antikörper von einer Transformante, in die pKANTEX1334HV0LV0 eingeführt wurde, wurde als HV0LV0/CHO bezeichnet; der Antikörper von einer Transformante, in die pKANTEX1334HV0LV6 eingeführt wurde, wurde als HV0LV6/CHO bezeichnet; der Antikörper von einer Transformante, in welche pKANTEX1334HV0LV4-1 eingeführt wurde, wurde als HV0LV4-1/CHO bezeichnet; der Antikörper von einer Transformante, in welche pKANTEX1334HV0LV4-2 eingeführt wurde, wurde als HV0LV4-2/CHO bezeichnet; der Antikörper von einer Transformante, in welche pKANTEX1334HV0LV3-1 eingeführt wurde, wurde als HV0LV3-1/CHO bezeichnet; der Antikörper von einer Transformante, in die pKANTEX1334HV0LV3-2 eingeführt wurde, wurde als HV0LV3-2/CHO bezeichnet; der Antikörper von einer Transformante, in die pKANTEX1334HV0LV2-1 eingeführt wurde, wurde als HV0LV2-1/CHO bezeichnet; und der Antikörper von einer Transformante, in die pKANTEX1334HV0LV2-2 eingeführt wurde, wurde als HV0LV2-2/CHO bezeichnet.
  • 6. Analyse der gereinigten Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper
  • Die SDS-PAGE unter Verwendung der verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transpiantierten Antikörper, welche unter Punkt 5 von Beispiel 3 erhalten wurden, wurde gemäß dem unter Punkt 4 von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass jeder Antikörper als ein Antikörpermolekül in der richtigen Struktur exprimiert und gereinigt wurde.
  • 7. Messung der Bindungsaktivität der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper gegenüber FGF-8 (BIAcore-Biosensor)
  • Um die Aktivität der verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper, welche unter Punkt 5 von Beispiel 3 erhalten wurden, im Hinblick auf die Bindung an FGF-8 genauer zu untersuchen, wurden die Aktivitäten der verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper hinsichtlich der Bindung an FGF-8 gemessen und unter Verwendung des BIAcore-Systems 2000 (hergestellt von BIACORE) wie folgt verglichen. Der chimäre Anti-FGF-8-Antikörper KM3034, welcher unter Punkt 3(1) von Beispiel 1 aus CHO/DG44-Zellen erhalten wurde, wurde als eine positive Kontrolle verwendet.
  • Im Folgenden wurde HBS-EP (hergestellt von Pharmacia) als Pufferlösung für die Verdünnung der Proben und während der Messung verwendet. Zuerst wurde die Sensorspitze SA (hergestellt von BIACORE) justiert, und anschließend wurden 5 μl einer am C-Terminus mit Biotin markierten Verbindung 1 (ein N-terminales Peptid von FGF-8; SEQ ID NO: 15), zubereitet in Form einer Lösung von 0,05 μg/ml, in einer Durchflussrate von 20 μl/Minute zugegeben. Im Anschluss daran wurde die Spitzenoberfläche durch die kontinuierliche Zugabe von zweimal 5 μl 10 mMol/l Glycin-HCl-Puffer (pH 1,5) gewaschen. Die immobilisierte Menge des FGF-8-Peptids entsprach 35 RU.
  • Jeweils 60 μl der Antikörperlösung wurden in einer Durchflussrate von 20 μl/Minute in die das immobilisierte FGF-8-Peptid enthaltende Durchflusszelle eingebracht, und anschließend wurde die Dissoziationsreaktion während 3 Minuten überwacht. Im Anschluss an die Dissoziationsreaktion wurde die Spitzenoberfläche durch die kontinuierliche Zugabe von zweimal 20 μl 10 mMol/l Glycin-HCl-Puffer (pH 1,5) regeneriert. Dieser Zyklus wurde für Antikörperlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (50 bis 1,85 μg/ml) durchgeführt, wobei für jede Konzentration ein Sensorgramm erhalten wurde. Das Sensorgramm jedes Antikörpers wurde durch Subtraktion des Sensorgramms, welches unter Verwendung des chimären Antikörpers KM871 gegen CD3 [Cancer Immunol. Immunother. 36 (1993), 373], als eine negative Kontrolle erhalten wurde, in ein Sensorgramm für die spezifische Reaktion überführt.
  • Das Sensorgramm für 16,7 μg/ml jedes Antikörpers ist in 12 gezeigt. Wie aus dem Sensorgramm ersichtlich ist, wurde zum Zeitpunkt der Dissoziationsreaktion jedes Antikörpers praktisch keine Dissoziation beobachtet, so dass es schwierig war, eine exakte Dissoziationskonstante zu erhalten. Demgemäß wurde die Bindungsaktivität der verschiedenen Antikörper durch den Vergleich der Stärke der Bindung [Resonanzsignal (RU)] zum Zeitpunkt der Bindungsreaktion durchgeführt.
  • Als Ergebnis, wie in 12 gezeigt, zeigten die chimären Antikörper KM3034 und HV0LV6/CHO die stärkste Bindungsreaktion, gefolgt der Reihe nach von HV0LV3-1/CHO, HV0LV4-1/CHO und HV0LV2-1/CHO. Dagegen zeigten HV0LV3-2/CHO, HV0LV2-2/CHO und HV0LV4-2/CHO eine geringe Bindungsreaktion, und HV0LV0/CHO zeigte die geringste Bindungsreaktion. Diese Ergebnisse stimmten mit den Ergebnissen unter Verwendung der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper von YB2/0-Zellen, welche unter Punkt 7 von Beispiel 2 beschrieben wurden, überein.
  • 8. Messung der Neutralisierungsaktivität der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper gegenüber FGF-8
  • Die Beurteilung der Neutralisierungsaktivität der vier Anti-FGF-8-CDRtransplantierten Antikörper HV0LV6/CHO, HV0LV3-1/CHO, HV0LV4-1/CHO und HV0LV2-1/CHO, deren starke Bindungsreaktion gegenüber FGF-8 unter Punkt 7 von Beispiel 3 bestätigt wurde, erfolgte gemäß dem unter Punkt 5 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren. Der chimäre Anti-FGF-8-Antikörper KM3034 aus CHO/DG44-Zellen, welcher unter Punkt 3(1) von Beispiel 1 erhalten wurde, wurde als eine positive Kontrolle verwendet, und der chimäre Antikörper KM2760 gegen das menschliche Chemokin CCR4, beschrieben in WO 01/64754 , wurde als eine negative Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. Wie in 13 gezeigt, zeigte HV0LV6/CHO eine FGF-8-Neutralisierungsaktivität, welche mit derjenigen des chimären Antikörpers. KM3034 vergleichbar war; und HV0LV3-1/CHO zeigte die nächst höhere FGF-8-Neutralisierungsaktivität. HV0LV4-1/CHO zeigte eine etwas geringere FGF-8-Neutralisierungsaktivität als HV0LV3-1/CHO; und HV0LV2-1/CHO zeigte die geringste Neutralisierungsaktivität.
  • Beispiel 4
  • Herstellung eines Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörpers mit einer geringeren Immunogenität (2)
  • Anhand der Ergebnisse von Beispiel 4 wurde gezeigt, dass von den Modifikationen der 6 Aminosäurereste von LV6 die Modifikation an Position 51 für die Wiederherstellung der Aktivität essentiell ist. Die Ergebnisse deuteten auch darauf hin, dass die Modifikation an Position 2 einen geringen Einfluss auf die Wiederher stellung der Aktivität durch die alleinige Modifikation hat, aber dass sie zusammenwirkend zu der Wiederherstellung der Aktivität durch die Kombination davon mit der Modifikation an Position 51 beiträgt. Im Hinblick auf die Modifikationen an den Positionen 14 und 15 wurde deutlich, dass sie ebenfalls zusammenwirkend zu der Wiederherstellung der Aktivität durch die Kombination davon mit der Modifikation an Position 51 beitragen. Dagegen wurde deutlich, dass der Einfluss der Modifikation an Position 50 gering ist. Um zu untersuchen, ob die Modifikation an Position 2 oder die Modifikation an Position 14 oder 15 einen größeren Einfluss auf die Wiederherstellung der Aktivität hat, und um den Einfluss der Modifikation an Position 92 zu untersuchen, wurden daher noch einmal Anti-.FGF-8-CDR-transplantierte Antikörper hergestellt.
  • 1. Erneute Konstruktion von Aminosäuresequenzen für die VL-Region
  • Es wurden Aminosäuresequenzen für zwei VL-Regionen mit den folgenden Modifikationen, welche sich jeweils von den Aminosäureresten von LV.0 unterscheiden, konstruiert.
  • In LV.4-3 wurden 4 Reste, umfassend Thr in Position 14, Pro in Position 15, Leu in Position 51 und Tyr in Position 92, durch die Reste Ser, Leu, Val bzw. Phe, welche den Aminosäureresten entsprechen, die in dem Mausantikörper KM1334 vorhanden sind, ersetzt.
  • In LV.3-3 wurden 3 Reste, umfassend Thr in Position 14, Pro in Position 15 und Leu in Position 51, durch die Reste Ser, Leu bzw. Val, welche den Aminosäureresten entsprechen, die in dem Mausantikörper KM1334 vorhanden sind, ersetzt.
  • 2. Konstruktion einer cDNA, codierend die VL-Region
  • Die cDNAs, welche die jeweiligen unter Punkt 1 von Beispiel 4 konstruierten Aminosäuresequenzen für die VL-Region der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper codieren, wurden wie folgt konstruiert.
  • (1) Konstruktion einer cDNA, codierend LV.4-3
  • Diese cDNA wurde gemäß dem unter Punkt 2(5) von Beispiel 3 beschriebenen Verfahren konstruiert. Jedoch wurde das Plasmid pKM1334LV2-1, welches unter Punkt 2(3) von Beispiel 3 erhalten wurde, anstelle des Plasmids pKM1334LV2-2 verwendet, und das Plasmid pKM1334LV3-2, welches unter Punkt 2(6) von Beispiel 3 erhalten wurde, wurde anstelle des Plasmids pKM1334LV6 verwendet. Als Ergebnis wurde das Plasmid pKM1334LV4-3 erhalten, welches die LV.4-3 codierende cDNA enthält.
  • (2) Konstruktion einer cDNA, codierend LV.3-3
  • Zunächst wurden 3 μg des Plasmids pKM1334LV4-3, welches unter Punkt 2(1) von Beispiel 4 erhalten wurde, mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SpeI (hergestellt von Takara Shuzo) gemischt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 2,5 μg eines BamHI-SpeI-Fragments von etwa 3,23 kb gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pKM1334LV0, welches unter Punkt 1(3) von Beispiel 2 erhalten wurde, mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SpeI (hergestellt von Takara Shuzo) bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert, wobei etwa 0,15 μg eines BamHI-SpeI-Fragments von etwa 0,13 kb gewonnen wurden.
  • Zu einem Gesamtvolumen von 10 μl sterilem Wasser wurden 0,1, μg des BamHI-SpeI-Fragments des Plasmids pKM1334LV4-3 und 0,1 μg des BamHI-SpeI-Fragments des Plasmids pKM1334LV0, welche jeweils vorstehend erhalten wurden, zugegeben und unter Verwendung von Ligation High (hergestellt von TOYOBO) ligiert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurden Zellen von E. coli DH5α transformiert, wobei das in 14 dargestellte Plasmid pKM1334LV3-3 erhalten wurde, welches die LV.3-3 codierende cDNA enthält.
  • 3. Konstruktion von Expressionsvektoren für einen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper
  • Die Expressionsvektoren für einen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper, welche die verschiedenen VL-cDNAs enthalten, wurden durch das Ersetzen des EcoRI-BsiWI-Fragments, das die VL-cDNA des Expressionsvektors pKANTEX1334HV0LV6 enthält, erhalten unter Punkt 2 von Beispiel 2, durch die EcoRI-BsiWI- Fragmente, enthaltend die verschiedenen VL-cDNAs, welche unter Punkt 2 von Beispiel 4 konstruiert wurden, konstruiert. Genauer wurden die zwei Vektoren pKANTEX1334HV0LV4-3 und pKANTEX1334HV0LV3-3 konstruiert.
  • 4. Stabile Expression der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper unter Verwendung von CHO/DG44-Zellen
  • Die stabile Expression der verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper in CHO/DG44-Zellen wurde gemäß dem unter Punkt 2(4) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der Expressionsvektoren für die verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper, welche unter Punkt 3 von Beispiel 4 erhalten wurden, bewirkt.
  • 5. Reinigung der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper
  • Die Züchtung der Transformanten, erhalten unter Punkt 4 von Beispiel 4, welche von den CHO/DG44-Zellen erhalten wurden und welche die verschiedenen Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper exprimieren, sowie die Reinigung der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper aus den Kulturüberständen wurden gemäß dem unter Punkt 3(1) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Der Antikörper von einer Transformante, in die pKANTEX1334HV0LV4-3 eingeführt wurde, wurde als HV0LV4-3/CHO bezeichnet; und der Antikörper von einer Transformante, in die pKANTEX1334HV0LV3-3 eingeführt wurde, wurde als HV0LV3-3/CHO bezeichnet.
  • 6. Analyse der gereinigten Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper
  • Die SDS-PAGE unter Verwendung der verschiedenen Anti-FGF-8-CDRtransplantierten Antikörper, welche unter Punkt 5 von Beispiel 4 erhalten wurden, wurde gemäß dem unter Punkt 4 von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass jeder Antikörper als ein Antikörpermolekül in der richtigen Struktur exprimiert und gereinigt wurde.
  • 7. Messung der Bindungsaktivität der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper gegenüber FGF-8
  • Die FGF-8-Bindungsaktivitäten der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper HV0LV6/CHO und HV0LV3-1/CHO, welche unter Punkt 5 von Beispiel 3 erhalten wurden, und der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper HV0LV4-3/CHO und HV0LV3-3/CHO, welche unter Punkt 5 von Beispiel 4 erhalten wurden, wurden gemäß dem unter Punkt 7 von Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gemessen. Der chimäre Anti-FGF-8-Antikörper KM3034 aus CHO/DG44-Zellen, welcher unter Punkt 3(1) von Beispiel 1 erhalten wurde, wurde als eine positive Kontrolle verwendet.
  • Das Sensorgramm für 16,7 μg/ml jedes Antikörpers ist in 15 gezeigt. Wie aus dem Sensorgramm ersichtlich ist, wurde zum Zeitpunkt der Dissoziationsreaktion jedes Antikörpers praktisch keine Dissoziation beobachtet, so dass es schwierig war, eine exakte Dissoziationskonstante zu erhalten. Demgemäß wurde die Bindungsaktivität der jeweiligen Antikörper durch den Vergleich der Stärke der Bindung [Resonanzsignal (RU)] zum Zeitpunkt der Bindungsreaktion durchgeführt. Als Ergebnis, wie in 15 gezeigt, zeigte der chimäre Antikörper KM3034 die stärkste Bindungsreaktion; und HV0LV4-3/CHO zeigte eine Bindungsreaktion, welche stärker als diejenige von HV0LV3-1/CHO war und welche mit derjenigen von HV0LV3-3/CHO vergleichbar war. Die Bindungsreaktion von HV0LV3-3/CHO war geringer als diejenige von HV0LV3-1. Anhand der vorstehenden Ergebnisse wurde deutlich, dass im Hinblick auf die Stärke der Bindungsreaktion die Modifikation an Position 14 oder 15 stärker kooperativ wirksam ist als die Modifikation an Position 2 und dass die Modifikation an Position 92 für die Wiederherstellung der Aktivität essentiell ist.
  • 8. Messung der Neutralisierungsaktivität der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper gegenüber FGF-8
  • Die Beurteilung der Neutralisierungsaktivität für die Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper HV0LV6/CHO und HV0LV3-1/CHO, welche unter Punkt 5 von Beispiel 3 erhalten wurden, und der Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper HV0LV4-3/CHO und HV0LV3-3/CHO, welche unter Punkt 5 von Beispiel 4 erhalten wurden, wurde gemäß dem unter Punkt 5 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Der chimäre Anti-FGF-8-Antikörper KM3034 aus CHO/DG44-Zellen, welcher unter Punkt 3(1) von Beispiel 1 erhalten wurde, wurde als eine positive Kontrolle verwendet, und der chimäre Antikörper KM2760 gegen das menschliche Chemokin CCR4, beschrieben in WO 01/64754 , wurde als eine negative Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt. Wie in 16 dargestellt, zeigten HV0LV6/CHO und HV0LV3-1/CHO eine FGF-8-Neutralisierungsaktivität, welche mit derjenigen des chimären Antikörpers KM3034 vergleichbar war. Dagegen zeigten HV0LV4-3/CHO und HV0LV3-3/CHO nahezu die gleiche Neutralisierungsaktivität, wobei die Aktivität etwa der Hälfte der Aktivität des chimären Antikörpers KM3034 entsprach. Die Neutralisierungsaktivität von HV0LV3-1/CHO und HV0LV4-3/CHO zeigte keine Korrelation zu der Stärke der Bindungsreaktion unter Verwendung des BIAcore-Systems, wobei deutlich wurde, dass der Aminosäurerest in Position 2 und die Aminosäurereste in den Positionen 14 und 15 unabhängig voneinander die Bindungsaktivität gegenüber FGF-8 und die FGF-8-Neutralisierungsaktivität gegenüber Zellen beeinflussen.
  • Basierend auf den vorstehenden Ergebnissen der jeweiligen Beurteilungen wurde der aus CHO/DG44-Zellen erhaltene CDR-transplantierte Antikörper HV0LV6/CHO, welcher eine starke Bindungsreaktion zeigte und welcher eine mit dem chimären Antikörper KM3034 vergleichbare FGF-8-Neutralisierungsaktivität aufwies, als KM8034 bezeichnet; und in gleicher Weise wurde der von CHO/DG44-Zellen erhaltene transformierte Zellclon, welcher eine starke Expression von KM8034 zeigt, als KM8034 bezeichnet. Der aus CHO/DG44-Zellen erhaltene CDR-transplantierte Antikörper HV0LV4-3/CHO, der eine starke Bindungsreaktion zeigte, welche mit derjenigen von KM8034 vergleichbar war, wurde als KM8035 bezeichnet; und in gleicher Weise wurde die von CHO/DG44-Zellen abgeleitete transformierte Zelllinie, welcher eine starke Expression von KM8035 zeigt, als KM8035 bezeichnet. Die VL-Aminosäuresequenz LV.4-3 von KM8035 ist in SEQ ID NO: 38 dargestellt. Ferner ist die transformierte Zelllinie KM8035 am 20. Juni 2002 als FERM BP-8082 bei der International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1–1, Higashi 1-Chorre Tsukubashi, Ibaraki-ken 305–8566, Japan), hinterlegt worden. Weiterhin wurde der aus CHO/DG44-Zellen erhaltene CDR-transplantierte Antikörper HV0LV3-1/CHO, der eine starke Bindungsreaktion zeigte, welche mit derjenigen von KM8034 vergleichbar war, als KM8036 bezeichnet; und in gleicher Weise wurde die von CHO/DG44-Zellen abgeleitete transformierte Zelllinie, welcher eine starke Expression von KM8036 zeigt, als KM8036 bezeichnet. Die VL-Aminosäuresequenz LV.3-1 von KM8036 ist in SEQ ID NO: 39 dargestellt. Die transformierte Zelllinie KM8036 ist am 20. Juni 2002 als FERM BP-8083 bei der International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AST Tsukuba Central 6, 1–1, Higashi 1-Chorre Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305–8566, Japan), hinterlegt worden.
  • Da der Anti-FGF-8-CDR-transplantierte Antikörper KM8034 eine starke Bindungsreaktion und eine mit dem chimären Antikörper KM3034 vergleichbare FGF-8-Neutralisierungsaktivität zeigt, und der Antikörper eine geringere Immunogenität bei Menschen als der chimäre Antikörper aufweist, wird erwartet, dass der Antikörper eine bessere therapeutische Wirkung als der chimäre Antikörper zeigt. Obwohl die Möglichkeit besteht, dass die Anti-FGF-8-CDR-transplantierten Antikörper KM8035 und KM8036 im Vergleich zu KM8034 eine etwas geringere Bindungsaktivität und FGF-8-Neutralisierungsaktivität aufweisen, wird eine geringere Immunogenität als bei KM8034 erwartet, da die Aminosäurereste in der FR-Region der V-Region, welche von dem Mausantikörper KM1334 stammen, 3 Reste bzw. 4 Reste umfassen.
  • Gewerbliche Anwendbarkeit
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen humanisierten Antikörper oder ein Antikörperfragmente davon bereit, wobei der humanisierte Antikörper oder das Antikörperfragmente davon spezifisch mit FGF-8 reagiert, welcher wahrscheinlich ein Wachstumsfaktor für Prostatakrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs und dergleichen ist, und die Funktion von FGF-8 inhibiert.
  • Freier Text der Sequenzprotokolle:
    • SEQ ID NO: 11 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 12 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 13 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 14 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 20 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 21 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 22 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 23 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 24 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 25 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 26 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 27 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 28 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 29 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 30 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 31 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 32 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 33 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 34 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 35 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 36 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 37 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: Synthetische DNA
    SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00740001
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Claims (9)

  1. Humanisierter neutralisierender Anti-Fibroblastenwachstumsfaktor-8 (FGF-8)-Antikörper oder ein Antikörperfragment davon, wobei die variable Region (V-Region) der schweren Kette (H-Kette) des Antikörpers die in SEQ ID NO: 16 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, und wobei die V-Region der leichten Kette (L-Kette) des Antikörpers die in SEQ ID NO: 19 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst.
  2. Humanisierter neutralisierender Anti-Fibroblastenwachstumsfaktor-8 (FGF-8)-Antikörper oder ein Antikörperfragment davon, wobei die variable Region (V-Region) der schweren Kette (H-Kette) des Antikörpers die in SEQ ID NO: 16 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, und wobei die V-Region der leichten Kette (L-Kette) des Antikörpers die in SEQ ID NO: 38 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst.
  3. Humanisierter neutralisierender Anti-Fibroblastenwachstumsfaktor-8 (FGF-8)-Antikörper oder ein Antikörperfragment davon, wobei die variable Region (V-Region) der schweren Kette (H-Kette) des Antikörpers die in SEQ ID NO: 16 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, und wobei die V-Region der leichten Kette (L-Kette) des Antikörpers die in SEQ ID NO: 39 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst.
  4. Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Antikörperfragment ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fab, Fab', F(ab')2, einem Einzelketten-Antikörper (scFv), einem dimerisierten variablen Region-(V-Region)-Fragment (Diabody), einem Disulfid-stabilisierten V-Region-Fragment (dsFv) und einem Peptid, das eine komplementaritätsbestimmende Region umfasst.
  5. DNA, die den humanisierten Antikörper oder das Antikörperfragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
  6. Rekombinanter Vektor, der die DNA nach Anspruch 5 umfasst.
  7. Transformante, erhalten durch Einbringen des rekombinanten Vektors nach Anspruch 6 in eine Wirtszelle.
  8. Verfahren zum Herstellen eines Antikörpers oder des Antikörperfragments davon, umfassend das Züchten der Transformante nach Anspruch 7 in einem Medium, um den Antikörper oder das Antikörperfragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bereitzustellen und in der Kultur anzureichern, und das Gewinnen des Antikörpers oder des Antikörperfragments davon aus der Kultur.
  9. Arzneimittel, das als aktiven Bestandteil zumindest einen ausgewählt aus dem Antikörper und dem Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
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