DE60304332T2

DE60304332T2 - Hydantoinracemase

Info

Publication number: DE60304332T2
Application number: DE60304332T
Authority: DE
Inventors: Hubertus Wilhelmus BOESTEN; Gerardus Joannes KIERKELS; Bernard Friso ASSEMA; Miguel Luis RUIZ PEREZ; Dolores Gonzalez Pacanowska; Jesús GONZALEZ LOPEZ; Santiago De La Escalera Hueso
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: Centrient Pharmaceuticals Netherlands BV
Priority date: 2002-05-23
Filing date: 2003-05-23
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2023-05-24
Also published as: JP2005526519A; AU2003245171A1; ES2261950T3; EP1506294B1; EP1506294A1; CN1656218A; US7713724B2; ATE321847T1; CN100482792C; US20060035321A1; WO2003100050A1; DE60304332D1

Description

Die Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit Hydantoinracemase-Aktivität. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Polypeptide.
Polypeptide mit Hydantoinracemase-Aktivität, auch Hydantoinracemasen genannt, sind im Stand der Technik bekannt. Sie sind in einer Reihe verschiedener Organismen aufgefunden worden, beispielsweise beschreibt WO 01/23582 eine Hydantoinracemase von Arthrobacter aurescens (DSM 3747) und JP 04271784 beschreibt eine Hydantoinracemase von Pseudomonas NS 671 (Watabe et al., J. Bact. 174; 3461-66 (1992)). Hydantoinracemasen sind auch in Sinorhizobium meliloti (Zugangsnummer CAC 47181, Capela et a., PNAS 98:9877-9882 (2001)), in Microbacterium liquefaciens (Zugangsnummer CAD 32593, EP 1 188 826 ) und im Agrobacterium tumefaciens-Stamm C58 (Zugangsnummer AAL 45498, AAK 88746 und AAK 90298, Las Heras-Vazquez et al., Biochem Biophys Res Communn 303:541-547 (2003), Wood et al., Science 2001, 294:2317-23 und Hinkle et al., NCBI Datenbase, Vollständige Genomsequenz von Agribacterium tumefaciens C58 (Rhizobium radiobacter C58), dem Causativmittel der Gallenkrankheit bei Pflanzen. Direkte Submission am 14. August 2001 vorgelegt) beschrieben.
Im Rahmen der Erfindung ist die Hydantoinracemase-Aktivität so zu verstehen, dass sie die Fähigkeit ist, die Racemisierung substituierter D- oder L-Hydantoine zu katalysieren.
Ein Nachteil der bekannten Hydantoinracemasen besteht darin, dass sie Substratinhibition, insbesondere L-5-Methylmercaptoethylhydantoin gegenüber, aufweisen. Wiese et al. beschreibt beispielsweise das Auftreten der Substratinhibition der Hydantoinracemase von Arthrobacter aurescens DSM 3747 bei einer L-5-Methylmercaptoethylhydantoin-Konzentration von 5 mM (J. Biotechn. 80; 217-230 (2000)). Auch zeigte die Hydantoinracemase von Pseudomonas NS671 eine Substratinhibition bei ähnlichen Konzentrationen (Watabe et al., J. Bact. 174; 3461-66 (1992)). Als Folge dieser Eigenschaft kann das Enzym nur bei niedrigen Substratkonzentrationen effizient verwendet werden.
Es wäre wünschenswert, eine Hydantoinracemase zur Hand zu haben, die nicht unter dem Phänomen der Substratinhibition leidet, da dies die Racemisierung von substituiertem D- oder L-Hydantoin bei höheren Substratkonzentrationen erlauben würde. Dies würde auf wirksame Weise zu einer Reduzierung der Kosten bei der Herstellung von Zwischen- und Endprodukten beitragen.
Es ist deshalb ein Ziel der Erfindung, Hydantoinracemasen bereitzustellen, die keine Substratinhibition aufweisen.
Erstaunlicherweise sind Hydantoinracemasen gefunden worden, die die Substratinhibition nicht aufweisen. Die Aufgabe der Erfindung wird deshalb durch Bereitstellen von Hydantoinracemasen erfüllt, die von Agrobacterium radiobacter oder funktionellen Äquivalenten desselben erhältlich sind. SEQ ID: NO. 2 und SEQ ID: NO. 4 gibt Aminosäuresequenzen von Hydantoinracemase von Agrobacterium radiobacter, SEQ ID:NO.4 weist 11 zusätzliche Aminosäuren am N-Terminus im Vergleich zu SEQ ID:NO. 2 auf. SEQ ID:NO.1 ergibt die Nukleinsäuresequenz von Agrobacterium radiobacter, die die in SEQ ID:NO. 2 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert, während SEQ ID:NO. 3 die Nukleinsäuresequenz von Agrobacterium radiobacter ergibt, die in SEQ ID:NO. 4 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert.
Im Rahmen der Erfindung sollte Substratinhibition so verstanden werden, dass es eine Reduzierung der anfäng lichen Aktivität auf eine Erhöhung der Substratkonzentration hin bedeutet.
Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung werden funktionelle Äquivalente von Hydantoinracemasen, die von Agrobacterium radiobacter erhältlich sind, hier als Polypeptide mit Hydantoinracemase-Aktivität definiert, die nicht unter einer Substratinhibition durch L-5-Methylmercaptoethylhydantoin leiden. Besonders nützliche Beispiele derartiger funktioneller Äquivalente sind Polypeptide, die mindestens 87%, noch bevorzugter mindestens 90%, wie beispielsweise mindestens 93%, 95%, 97%, 98% oder 99% Identität mit SEQ ID: NO. 2 oder mit SEQ ID:NO.4 aufweisen. Hydantoinracemasen, die von Agrobacterium radiobacter erhältlich sind, und funktionelle Äquivalente derselben werden hier als Sammelbegriff als erfindungsgemäße Hydantoinracemasen oder als erfindungsgemäße Polypeptide bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide mit Hydantoinracemase-Aktivität weisen mindestens 87 Identität mit SEQ ID:NO. 2 oder SEQ ID:NO. 4, bevorzugt mindestens 90% Identität mit SEQ ID:NO.2 oder SEQ ID:NO. 4, noch bevorzugter mindestens 95%, insbesondere mindestens 97%, noch spezifischer mindestens 98%, selbst noch spezifischer mindestens 99%, am Spezifischsten mindestens 99,5% Identität mit SEQ ID:NO. 2 oder SEQ ID:NO. 4 auf.
Im Rahmen der Erfindung wird der Prozentsatz der Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen mit Hilfe des Algorithmus des paarweisen BLAST-Alignments (NCBI) mit einer Identitätstabelle und folgenden Alignment-Parametern bestimmt: Fehlanpassung = –3, Strafe = –3, Abstandsspanne = 1, Matchbonus = 1, Gap x -droff = 50, zu erwartender Wert = 10, Wortgröße = 3.
Bei einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung isolierte Polypeptide mit Hydantoinracemase- Aktivität, die nicht unter einer Substratinhibition leiden, und die von Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die unter hohen Stringenz-Bedingungen, bevorzugt unter sehr hohen Stringenz-Bedingungen, mit der in SEQ ID:NO. 1 oder SEQ ID:NO. 3 gezeigten Nukleinsäure oder dem Komplementären davon hybridisiert.
Hybridisierversuche sind unter Anwendung verschiedener Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt worden. Allgemeine Richtlinien für die Auswahl, die zwischen verschiedenen Verfahren zu erfolgen hat, sind beispielsweise im Kapitel 9 von Sambrook, J., Fritsh, E.F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren: Ein Laborhandbuch), 2. Ausgabe, Verlag Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 angegeben.
Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ist so zu verstehen, dass es die Bedingungen sind, unter denen die Hybridisierung, die aus der eigentlichen Hybridisierung und Waschschritten besteht, durchgeführt wird. Waschschritte werden beispielsweise zum Entfernen von Nukleinsäuren angewendet, die nicht mit der Zielnukleingruppe hybridisieren, die beispielsweise auf einem Nitrocellulosefilter immobilisiert wird. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen kann beispielsweise durch Ändern der Salzkonzentration in der Waschlauge und/oder der Temperatur, bei der der Waschschritt ausgeführt wird (Waschtemperatur) geändert werden. Die Stringenz der Hybridisierung wird beispielsweise durch Reduzieren der Salzkonzentration in der Waschflotte oder durch Erhöhen der Waschtemperatur erhöht. Im Rahmen der Erfindung wird die Hybridisierung in 6X Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei einer Temperatur von etwa 45°C für etwa 12 Stunden durchgeführt. Beispiele von Hybridisierungsbedingungen sind zwei jeweils 30 Minuten lange Waschschritte in 1X SSC, 0,1% SDS bei 60°C (Hochstringenzhybridisierungsbedin gungen) oder bei 65°C (Hybridisierungsbedingungen sehr hoher Stringenz).
Bei noch einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung isolierte Polypeptide mit Hydantoinracemase-Aktivität, die nicht unter einer Substratinhibition leiden und die eine immunologische Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz von SEQ ID:NO. 2 oder SEQ ID:NO. 4 aufweisen.
Die immunologische Kreuzreaktivität kann durch Verwendung einer Antikörperzubereitung gegen oder reaktiv mit mindestens einem Epitop des isolierten erfindungsgemäßen Polypeptids mit Hydantoinracemase-Aktivität aufgezeigt werden. Die Antikörperzubereitung, die monoklonal sowie polyklonal sein kann, kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren aufgezeigt werden. Die Herstellung eines Antikörpers und das Aufzeigen einer immunologischen Kreuzreaktivität werden beispielsweise bei Hudson et al., Practical Immunology (praktische Immunologie), Dritte Ausgabe (1989), Blackwell Scientific Publications, beschrieben.
Die Erfindung betrifft auch Fusionsproteine, die durch Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz erhalten werden können, die mindestens einen Teil eines erfindungsgemäßen Polypeptids kodiert, das funktionsfähig mit einer (oder mehreren) Nukleinsäuresequenz(en) verknüpft ist, die ein Markerpolypeptid kodieren. „Funktionsfähig verknüpft" sollte so verstanden werden, dass es bedeutet, dass die beiden Nukleinsäuresequenzen derart verknüpft sind, dass beim Exprimieren das erfindungsgemäße Polypeptid mit dem bzw. den Markerpolypeptid(en) an seinem N- oder C-Termins oder an beiden Termini erzeugt werden. Das Markerpeptid kann für viele Zwecke angewendet werden; es kann beispielsweise zum Verbessern der Stabilität oder Löslichkeit des Fusionsproteins, als Sekretionssignal (eine- Signal, das das Fusionsprotein zu einem spezifischen Kompartiment in der Zelle leitet) oder zum Erleichtern der Reinigung von Fusionsproteinen verwendet werden. Ein Beispiel eines Markerpolypeptids, das zum Erleichtern der Reinigung von Fusionsproteinen verwendet wird, ist das Hexahistidinpeptid. Die Reinigung eines Fusionsproteins mit einem Hexahistidinlabel ist beispielsweise bei Gentz et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 86, Seiten 821-824 beschrieben. Ein Fusionsprotein mit einem Hexahistidinlabel kann beispielsweise in einem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) dem Protokoll des Lieferanten gemäß hergestellt werden.
Die Erfindung umfasst auch Mutanten von Polypeptiden mit Hydantoinracemase-Aktivität, die eine oder mehrere Mutationen im Vergleich mit der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz aufweisen. Verfahren zum Herstellen von Mutationen sind dem mit dem Stand der Technik vertrauten Fachmann bekannt, wobei die Zufallsmutagenese (beispielsweise mit Hilfe von PCR oder durch UV-Strahlung), stellenspezifisch dirigierte PCR usw. Beispiele sind.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuresequenzen, kodierend erfindungsgemäße Polypeptide mit Hydantoinracemase-Aktivität.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert, kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und nach Einführen in eine geeignete Wirtszelle kann die Nukleinsäuresequenz so exprimiert werden, dass ein erfindungsgemäßes Polypeptid erzeugt wird. Das Klonieren und die Expression einer Nukleinsäuresequenz sind Standardtechniken, die im Stand der Technik bekannt sind und beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsh, E.F. und Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren, ein Laborhandbuch), 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, beschrieben sind.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann auch durch Integrieren der dieses Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz in das Genom einer Wirtszelle oder durch (Über-) Exprimieren derselben hergestellt werden. Das Integrieren der Nukleinsäuresequenz und das (Über-) Exprimieren dieser Sequenz kann mit Hilfe von Verfahren durchgeführt werden, die den mit dem Stand der Technik vertrauten Fachleuten bekannt sind. Es ist auch möglich, ein erfindungsgemäßes Polypeptid in dem Mikroorganismus, in dem es natürlich vorkommt, beispielsweise durch Positionieren eines geeigneten Promotors vor die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz im Genom des Mikroorganismus durch Integrieren einer oder mehrerer Kopien einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in das Genom des Mikroorganismus oder durch Überexprimieren der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in einen geeigneten Vektor in dessen natürlichem Wirt zu überexprimieren.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz. Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert. Bevorzugt betrifft die Erfindung eine Wirtszelle enthaltend einen Vektor mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz. Die Erfindung betrifft auch das Überexprimieren einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz.
Beispiele von Vektoren, die zum Exprimieren einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure geeignet sind, sind Vektoren, die normalerweise zum Klonieren und Exprimieren verwendet werden. Diese Vektoren sind dem mit dem Stand der Technik vertrauten durchschnittlichen Fachmann bekannt. Beispiele geeigneter Vektoren für das Exprimieren in Escherichia coli sind beispielsweise in Tabelle 1 bei Makrides, S.C., Microbiological reviews (1996), 512-538 aufgeführt. Bevorzugt besitzt der Vektor eine Klonierstelle, die der Kontrolle eines induzierbaren Promotors untersteht. Beispiele induzierbarer Promotoren sind: der lac-Promotor, der araBAD-Promotor, der T7-Promotor, der trc-Promotor, der tac-Promotor und der trp-Promotor. Geeignete Wirtszellen sind Wirtszellen, die normalerweise zum Klonieren und Exprimieren verwendet werden und dem mit dem Stand der Technik vertrauten durchschnittlichen Fachmann vertraut sind. Beispiele geeigneter E. coli-Wirtszellstämme sind: TOP10F', TOP10, DH10B, DH5a, HB101, W3110, BL21(DE3) und BL21(DE3)pLysS, BL21Star(DE3).
Die Wahl eines Vektors hängt manchmal von der Wahl einer Wirtszelle (oder umgekehrt) ab; falls beispielsweise ein Vektor mit dem araBAD-Promotor verwendet wird, so wird bevorzugt ein E. coli-Wirtszellenstamm verwendet, der nicht in der Lage ist, den Arabinoseinduzierer (E. coli ara-Wirtszelle) abzubauen.
Nukleinsäuresequenzen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodieren, können in anderen Organismen unter Anwendung von molekularbiologischen Standardtechniken und der im vorliegenden Dokument angegebenen Sequenzinformation aufgefunden werden. Beispielsweise ermöglicht die Anwendung der vollständigen Sequenz oder eines Teils der in SEQ ID:No. 1 oder SEQ ID:NO. 3 beschriebenen Nukleinsäuresequenz als Hybridisierungssonde die Isolierung von Nukleinsäuresequenzen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodieren (beispielsweise wie in Sambrook, J., Fritsh, E.F. und Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren, ein Laborhandbuch), 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, beschrieben).
Eine Nukleinsäuresequenz, die SEQ ID:NO. 1 oder SEQ ID:NO. 3 teilweise oder vollständig umfasst, kann auch durch Polymerasekettenreaktion (PKR) durch Anwendung (synthetischer) Oligonukleotidprimer aufgefunden werden, die auf der Sequenzinformation in SEQ ID:NO. 1, SEQ ID:NO. 2, SEQ ID:No. 3 und/oder SEQ ID:NO. 4 basieren.
Eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz kann durch Anwendung beispielsweise von cDNA, mRNA, genomischer DNA als Matrize und der geeigneten Oligonukleotidprimer durch Standard-PKR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäuresequenz kann in einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden.
Es ist auch möglich, Oligonukleotide zuzubereiten, die der Hybridisierung mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen unter Anwendung von Standardsynthesetechniken, beispielsweise durch Anwenden eines automatisierten DNA-Synthetisators, entsprechen oder dazu fähig sind.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können nach dem Isolieren in einen geeigneten Vektor kloniert und in einer geeigneten Wirtszelle durch Anwendung von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, für das Herstellen eines erfindungsgemäßen Polypeptids exprimiert werden.
Falls es bestätigt werden muss, dass eine klonierte Sequenz tatsächlich ein erfindungsgemäßes Protein, z.B. eine Hydantoinracemase, die nicht unter Substratinhibition leidet, kodiert, kann die Vorgehensweise wie in Beispiel 3 skizziert angewendet werden.
Da es hier nun nachgewiesen worden ist, dass es Hydantoinracemasen gibt, die nicht unter Substratinhibition leiden, kann die Racemisierung von D- oder L-Hydantoin von nun an bei höheren Substratkonzentrationen durchgeführt werden. Bei einer Aus führungsform betrifft die Erfindung daher ein Verfahren für die Racemisierung einer Enantiomer-angereicherten Hydantoinverbindung umfassend den Schritt des Kontaktierens der Enantiomer-angereicherten Hydantoinverbindung mit einem Polypeptid mit Hydantoinracemase-Aktivität, wobei das Polypeptid mit der Hydantoinracemase nicht unter Substratinhibition leidet. Ein derartiges Verfahren wird im Folgenden als erfindungsgemäßes Verfahren bezeichnet.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Hydantoinracemase in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, noch bevorzugter wird eine von Agrobacterium radiobacter erhältliche Hydantoinracemase bei einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, selbst noch bevorzugter wird eine Hydantoinracemase SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 gemäß in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.
Beispiele von D- oder L-Hydantoinen, die durch erfindungsgemäße Hydantoinracemasen racematisiert werden können, sind: D- oder L-Hydantoine der Formel 1
wobei R eine Aminosäurerestgruppe, beispielsweise eine wahlweise substituierte (Hetero)alkylgruppe mit beispielsweise 1-20 C-Atomen oder eine wahlweise substituierte (Hetero)arylgruppe mit beispielsweise 1-20 C-Atomen darstellt. Beispiele von Substituenten an der (Hetero)arylgruppe oder an der (Hetero)alkylgruppe sind: Hydroxyl, Alkoxy, Mercapto, Thioalkyl, Alkyl, Carboxyl, Amino, Nitro, Halogene, Carbamoyl, Nitril und Acyl. Beispiele von R-Gruppen sind: Methyl, Propyl, i-Butyl, 2-Methylthioethylen, 4-Aminobutylen, Hydroxymethylen, Methoxymethylen, Carboxymethylen, Carboxyethylen, Phenyl, p-Hydroxyphenyl, m-Hydroxyphenyl, o-Hydroxyphenyl, p-Chlorphenyl, m-Chlorphenyl, 2,4-Dichlorphenyl, p-Methoxyphenyl, Benzyl, p-Hydroxybenzyl, 3,4-Dihydroxybenzyl, 3,4-Dimethoxybenzyl, Benzyloxymethylen, 3,4-Methylendioxybenzyl, Indolylmethylen.
Die Racemisierung von D- oder L-Hydantoin bei einem erfindungsgemäßen Verfahren kann in ein anderes Verfahren integriert werden sowie extern erfolgen. In ein Verfahren integriert sollte so verstanden werden, dass es bedeutet, dass ein D- (oder L-) Hydantoin racemisiert wird und dass L- (oder D-) Hydantoin des dabei gebildeten Racemats sofort in situ noch weiter umgewandelt wird, so dass die Racemisierung von D- (oder L-) Hydantoin tatsächlich kontinuierlich stattfindet. Extern sollte so verstanden werden, dass es bedeutet, dass D- (oder L-) Hydantoin in einem getrennten Reaktionsschritt racemisiert wird.
Dementsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Enantiomer-angereicherten α-Aminosäuren in Gegenwart von

1) einer Hydantoinracemase, die nicht unter Substratinhibition leidet
2) einer Hydantoinase und/oder
3) einer Enantiomer-selektiven Carbamoylase.

Der Vorteil der Verwendung von Hydantoinracemasen bei derartigen Verfahren besteht darin, dass es eine schnellere und/oder höhere Umwandlung des substituierten Hydantoins in die entsprechende α-Aminosäure im Vergleich mit einem Verfahren erlaubt, bei dem eine herkömmliche Hydantoinracemase oder überhaupt keine Hydantoinracemase verwendet wird. Ein zusätzlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Hydantoinracemasen besteht darin, dass sie eine breite Substratspezifizität aufweisen, wodurch sie bei der Herstellung vieler verschiedener Enantiomer-angereicherter α-Aminosäuren verwendet werden können.
Eine Hydantoinracemase, die nicht unter Substratinhibition leidet, wird vorteilhafterweise bei einem Verfahren verwendet, bei dem eine Enantiomerangereicherte Hydantoinverbindung mit der Hydantoinracemase kontaktiert wird und wobei die Konzentration der Enantiomer-angereicherten Hydantoinverbindung mehr als 5 mM, bevorzugt mehr als 7,5 oder 10 mM, selbst noch bevorzugter mehr als 15 oder 20 und am Bevorzugtesten mehr als 25 mM beträgt.
Alpha-Aminosäuren mit einer Aminosäurerestgruppe R, wobei R wie oben definiert ist, sind Beispiele von Enantiomer-angereicherten α-Aminosäuren, die geeigneterweise bei einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden können, wobei eine erfindungsgemäße Hydantoinracemase zusammen mit einer Enantiomerselektiven Carbamoylase und einer Hydantoinase verwendet wird. Beispiele von α-Aminosäuren sind: Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Methionin, Cystein, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Histidin, Lysin, Arginin, Citrullin, Phenylalanin, 3-Fluorphenylalanin.
Bei einem derartigen Verfahren für die Herstellung einer Enantiomer-angereicherten D- oder L-α-Aminosäure wird bevorzugt Gebrauch gemacht von einer Enantiomerselektiven Carbamoylase, die eine Enantiomer-Selektivität von mindestens 90%, noch bevorzugter eine Enantiomer-Selektivität von mindestens 95%, insbesondere mindestens 98%, am Spezifischsten eine Enantiomer-Selektivität von mindestens 99% aufweist. Im Rahmen der Erfindung ist eine Enantiomer-Selektivität der Carbamoylase (beispielsweise D-Carbamoylase) von beispielsweise 90% so zu verstehen, dass es bedeutet, dass die Carbamoylase eine racemische Mischung von N-Carbamoyl-D-α-Aminosäure und N-Carbamoyl-L-α-Aminosäure zu 90% eines der Enantiomere (beispielsweise D-α-Aminosäure) und 10 des anderen Enantiomers (beispielsweise L-α-Aminosäure) bei einer Gesamtumwandlung von 50% der racemischen Mischung von N-Carbamoyl-D-α-Aminosäure und N-Carbamoyl-L-α-Aminosäure umwandelt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer D- oder L-Aminosäure aus der entsprechenden N-Carbamoyl-L-Aminosäure oder N-Carbamoyl-D-Aminosäure oder irgendeiner Mischung von N-Carbamoyl-L-Aminosäure und N-Carbamoyl-D-Aminosäure. Bei einem derartigen Verfahren kann eine Hydantoinracemase, die nicht unter Substratinhibition leidet, vorteilhafterweise zusammen mit einer D- oder L-Carbamoylase und einer Hydantoinase beispielsweise in einer Eintopfreaktion verwendet werden.
Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung von Hydantoinracemasen zusammen mit einer Enantiomerselektiven Carbamoylase und einer Hydantoinase bei der Herstellung jeweils einer D- oder L-α-Aminosäure jeweils aus der entsprechenden L-α-Aminosäure oder der entsprechenden D-α-Aminosäure oder irgendeiner Mischung der entsprechenden D- und L-α-Aminosäuren. Bei einem Beispiel eines derartigen Verfahrens, bei dem eine L-α-Aminosäure in eine D-α-Aminosäure umgewandelt wird, kann die L-α-Aminosäure zuerst nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in die entsprechende N-Carbamoyl-L-α-Aminosäure umgewandelt werden. Die N-Carbamoyl-L-α-Aminosäure kann dann enzymatisch in Gegenwart einer Enantiomer-selektiven D-Carbamoylase, einer Hydantoinase und einer Hydantoinracemase in eine D-α-Aminosäure umgewandelt werden.
Die Temperatur und der pH-Wert bei einer Reaktion, bei der Hydantoinracemase eine Rolle spielt, werden bevorzugt so gewählt, dass eine optimale Stabilität und Aktivität der Hydantoinracemase erreicht wird. Wenn ein anderes Enzym neben der Hydantoinracemase bei der Reaktion eine Rolle spielt, so werden die Temperatur und der pH-Wert ebenfalls so gewählt, dass die Stabilität und Aktivität sowohl der Hydantoinracemase als auch die Aktivität, Stabilität und, falls erwünscht, Enantiomer-Selektivität des anderen Enzyms so gut wie möglich sind. Die Umwandlung von N-Carbamoyl-L-α-Aminosäure oder N-Carbamoyl-D-α-Aminosäure oder von L- oder D-Hydantoin jeweils in die entsprechende D-α-Aminosäure oder L-α-Aminosäure jeweils in Gegenwart einer erfindungsgemäßen Hydantoinracemase, einer D- oder L-Carbamoylase und einer Hydantoinase wird bevorzugt bei einem pH-Wert zwischen 5 und 10 durchgeführt. Insbesondere kann die Umwandlung bei einem pH-wert zwischen 6,0 und 7,5 durchgeführt werden. Die Umwandlungstemperatur wird bevorzugt zwischen 0 und 80°C, insbesondere zwischen 10 und 50°C, noch spezifischer zwischen 35 und 45°C gewählt.
Die chemische Zubereitung von N-Carbamoyl-α-Aminosäure aus der entsprechenden α-Aminosäure kann beispielsweise durch Kontaktieren der α-Aminosäure mit MOCN stattfinden, wobei M Alkalimetall, bevorzugt Kalium oder Natrium darstellt. Die angewendete Temperatur ist nicht kritisch: bevorzugt findet die Reaktion bei Temperaturen zwischen etwa –5 und 100°C, insbesondere bei Temperaturen zwischen 0 und 80°C statt; der pH-Wert der chemischen Reaktion wird bevorzugt zwischen 8 und 11, noch spezifischer zwischen 9 und 10 gewählt.
Bevorzugt wird die Herstellung von D-α-Aminosäure aus der entsprechenden L-α-Aminosäure (oder umgekehrt) über die entsprechende N-Carbamoyl-L-α-Aminosäure (oder die entsprechende N-Carbamoyl-D-α-Aminosäure) in einem einzigen Topf durchgeführt.
Wenn Gebrauch gemacht wird von Hydantoinracemasen in gereinigter Form oder in zellfreiem Extrakt vorliegend, kann ein Zusatzmittel zum Verbessern der Stabilität und/oder Aktivität der Hydantoinracemase zugesetzt werden (wie beispielsweise bei Watabe et al. 1992, J. Bact., Seite 7989-7995 und in Wiese et al. 2000, J. Bact, Seite 217-230 beschrieben). Beispiele von Zusatzmitteln dieses Typs sind zweiwertiger Schwefel enthaltend Verbindungen wie L-Methionin, D-Methionin, L-Cystein, N-Carbomyl-L-methionin, N-Acetyl-D,L-methionin, 2-Keto-4-(methylthio)buttersäure, D,L-2-Hydroxy-4-(methylthio)buttersäure, L-Methioninmethylester, D,L-Methioninhydroxamsäure, S-Methyl-L-cystein, D-Biotin, β-Mercaptoethanol, Dithiotreitol (DTT), Glutathion.
Die Erfindung wird unten noch weiter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erklärt, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Legende für die Figur
1: Relative anfängliche Aktivität von Hydantoinracemasen von A. Radiobacter, Pseudomonasstamm NS671 und Arthrobacter aurescens DSM 3747 im Vergleich mit der anfänglichen Konzentration von L-5-Methylmercaptoethylhydantoin
BEISPIELE
Allgemeine Vorgehensweisen
Molekularbiologische Standardtechniken wie Plasmid-DNA-Isolierung, Agarosegelelektrophorese, enzymatische Restriktionsmodifikation von Nukleinsäuren, E. coli-Transformation usw. wurden wie von Sambrook et al., 1989, „Molecular cloning: a laboratory manual (Molekularklonieren: ein Laborhandbuch)" Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, beschrie ben oder den von den verschiedenen Lieferanten bereitgestellten Anwendungsanleitungen gemäß durchgeführt.
Synthetische Oligodesoxynukleotide wurden von Invitrogen (Groningen, Niederlande) erworben.
Die DNA-Sequenzanalyse wurde durch BaseClear (Leiden, Niederlande) unter Anwendung des Kettenabbruchverfahrens mit durch Färbemittel gelabelten Didesoxyterminatoren durchgeführt.
Die Proteinkonzentrationen in rohen Zellextrakten wurden mit Hilfe von Bradford-Reagenz bei 595 nm bestimmt.
Beispiel 1 Konstruktion von pET-Hrac-5 und pET-Hrac-L-Plasmiden.
Ein Agrobacterium radiobacter-Stamm wurde bei 30°C in LB-Medium vorgezüchtet, das aus 10 g/l Trypton (Difco Laboratories, Becton Dickinson microbiology systems, Sparks, USA), 5 g/l Hefeextrakt (Difco) und 5 g/l Natriumchlorid bestand. Nach dem Inkubieren über Nacht wurde die Vorkultur in frischem LB-Medium bis auf eine OD₆₀₀ von 0, 2 beimpft. Die Kultur wurde noch weiter bei 30°C gezüchtet und bei einer OD₆₀₀ von 1,7 geerntet.
Die genomische DNA dieser A. radiobacter-Kultur wurde durch das von Qiagen beschriebene Verfahren (Qiagen genomic DNA Handbook – Genomisches DNA-Handbuch von Qiagen -, 1998, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.
Die Hydantoinracemasegene von A. radiobacter wurden in den Expressionsvektor pET101/D-TOPO (Invitrogen) hineinkloniert. Die Gene wurden durch eine Translationsstart-(ATG-) Fusion und mit den Originalstopkodons, dem von Invitrogen beschriebenen Verfahren entsprechend kloniert.
Ein Fragment, das 721 Basenpaare umfasste, wobei die Sequenz von SEQ ID: NO. 1 auf der 5'-Seite durch die durch den Primer 1 eingeführte CACC-Sequenz verlängert war, wurde durch PKR von der chromosomalen DNA von A. radiobacter mit folgenden Primern amplifiziert:
5'-CACCATGCATATTCGTCTGATCAACCCG-3' [Primer 1; SEQ ID: No. 5]
(wobei die CACC-Sequenz für das direktionelle TOPO-Klonieren fettgedruckt und der Startkodon unterstrichen ist) und
5'-TCAGGCGACGAGCTTGGTTTC-3' [Primer 2; SEQ ID:NO. 6) (wobei der Stopkodon unterstrichen ist).
Ein Fragment, das 754 Basenpaare umfasste, wobei die Sequenz von SEQ ID: NO. 3 auf der 5'-Seite durch die durch den Primer 3 eingeführte CACC-Sequenz verlängert war, wurde durch PKR von der chromosomalen DNA von A. radiobacter mit folgendem Primärer amplifiziert:
5'-CACCATGGCAAATGAGCGTCCTGAAAG-3' [Primer 3; SEQ ID: No. 7]
(wobei die CACC-Sequenz für das direktionelle TOPO-Klonieren fettgedruckt und der Startkodon unterstrichen ist) und Primer 2 als reverser Primer.
Die richtige Länge der amplifizierten Fragmente wurde durch Agarosegelelektrophorese bestätigt und die Fragmente wurden direkt in den Expressionsvektor pET101/D-TOPO dem Protokoll des Lieferanten gemäß einkloniert und in chemisch kompetente E. coli TOP10-Zellen (Invitrogen) transformiert. Die Transformanten wurden auf LB-Agarplatten ausgewählt, die 100 mg/l Carbenicillin enthielten. Plasmide mit der richtigen Insertion (mit Hilfe der bidirektionellen Sequenzbestimmung überprüft) wurden pET-Hrac-S und pET-Hrac-L genannt, wobei Hrac-S für die Insertion mit der Sequenz von SEQ ID:NO. 1 und Hrac-L für die Insertion mit der Sequenz von SEQ ID:NO. 3 steht. Die Plasmide wurden zu E. coli TOP10 transformiert. E. coli TOP10 (pET-Hrac-S) und E. coli TOP10 (pET-Hrac-L) wurden dem Vertrag von Budapest gemäß unter Nr. 41131 und Nr. 41130 bei der National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB, Großbritannien) registriert.
Beispiel 2 Expression der Hydantoinracemasen von A. radiobacter in E. coli BL21Star(DE3)
Es wurde Plasmid-DNA des pET-Hrac-S oder pET-Hrac-L, E. coli TOP10-Stämme enthaltend, unter Anwendung des von Qiagen beschriebenen Verfahrens (Plasmid-Minikit, Protokoll vom October 2001) isoliert und daraufhin in chemisch kompetente E. coli BL21 Star (DE3) Zellen (Invitrogen) transformiert.
Einzelne Kolonien von E. coli BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-S) und E. coli BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-L) wurden über Nacht bei 28°C in 25 ml LB-Medium mit 100 mg/l Carbenicillin auf eine OD_620nm von 2,5 gezüchtet. Die gesamten Kulturen (25 ml) wurden in 250 ml frisches LB-Medium mit 100 mg/l Carbenicillin eingeimpft und bei 28°C noch weiter gezüchtet. Nach 1 Stunde bei einer OD_620nm von 0,45 wurden die Kulturen durch Zusatz von 1 mM (Endkonzentration) IPTG induziert und noch weitere 4, 5 Stunden bei 28°C auf eine OD_620nm von 1, 7 gezüchtet. Die Zellen wurden daraufhin geerntet und mit 100 mM Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,0, wahlweise mit 1 mM DTT gewaschen und daraufhin einer Schallbehandlung unterworfen, so dass zellfreies Extrakt erhalten wurde.
Es wurden Portionen von 30 mg Zellen (Nassgewicht) bei –20°C zur späteren Verwendung eingefroren.
Beispiel 3 Racemisierungsversuche unter Anwendung von überexprimierten Hydantoinracemasegenen von A. radiobacter.
3.1 Allgemeine Vorgehensweisen
Die 10 ml Reaktionsmischungen bestanden aus den unten angegebenen Endkonzentrationen von D-5-Benzylhydantoin, L-5-Isopropylhydantoin oder L-5-Methylmercaptoethylhydantoin in 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0. Die Reaktionen wurden durch Zusetzen der unten aufgeführten Mengen ganzer Zellen von E. coli BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-S) oder E. coli BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-L) oder von zellfreien Extrakten mit oder ohne zugesetztes Dithiotreitol (DTT, Endkonzenetration 1 mM) ausgelöst und dann bei Raumtemperatur inkubiert.
Die zellfreien Extrakte wurden durch erneutes Suspendieren von 60 mg Zellen in 1 ml 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, oder 1 ml 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, mit 1 mM DTT, gefolgt von der Schallbehandlung, hergestellt.
Es wurden Proben (500 μl) genommen und die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 μl 85%-iger Phosphorsäure abgebrochen. Die Proben wurden durch HPLC analysiert. D,L-5-Isopropylhydantoin und D,L-5-Benzylhydantoin wurden durch eine chirobiotische T-Säule (250 mm × 4,6 mm, Innendurchmesser 5 μm) von Astec (Whippany, USA), getrennt, D,L-5-Methylmercaptoethylhydantoin wurde durch eine chirobiotische T-Säule (250 mm × 4,6 mm, Innendurchmesser 5 μm) von Astec in Kombination mit einer Nucleosil 120-5 C18-Säule von Machery-Nagel (Düren, Deutschland) getrennt. In allen Fällen bestand das Elutionsmittel aus 80% 15 mM Ammoniumacetat, pH-Wert 4,1, und 20% Methanol. Die Fließrate des Elutionsmittels betrug 1 ml/min bei einer Säulentemperatur von 22°C. Die Erfassung erfolgte durch UV-Licht bei einer Wellenlänge von 220 nm. Unter diesen Bedingungen betrugen die Retentionszeiten 5,3 und 6,3 Minuten bei D- bzw. L-5-Isopropylhydantoin, 6,3 bzw. 8,3 Minuten bei D- und L-5-Benzylhydantoin und 9,1 bzw. 12,2 Minuten bei D- und L-5-Methylmercaptoethylhydantoin.
3.2 Racemisierung von D-5-Benzylhydantoin
Auf die gleiche Weise wie unter 3.1 beschrieben wurden 2 mM D-5-Benzylhydantoin mit einer E.E. von 96% mit zellfreiem Extrakt inkubiert (Proteinendkonzentration: 0,11 mg/ml). Zellfreies Extrak von E. coli BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-S) ergab einen E.E. von 52% nach 4,5 Stunden. Zellfreier Extrakt von E. coli BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-S) ergab einen E.E. von 80% nach 4,5 Stunden.
Eine chemische Blindprobe ergab einen E.E. von 90 nach 4,5 Stunden.
3.3 Racemisierung von L-5-Isopropylhydantoin
Bei einer Reihe von Reaktionen, wie in 3.1. beschrieben, wurden 40 mM L-5-Isopropylhydantoin mit einem E.E. von 99% mit ganzen Zellen (120 mg) und zellfreiem Extrakt mit DTT (Proteinendkonzentration: 0,44 mg/ml) von E. coli BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-S) und E. coli BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-L) inkubiert.
Mit ganzen Zellen und zellfreiem Extrakt mit DTT von E. coli BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-S) wurde nach 5 Stunden ein E.E. von 0% erreicht. Mit ganzen Zellen von E. coli BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-L) wurde ein E.E. von 28% nach 19 Stunden erreicht. Mit zellfreiem Extrakt mit DTT von E. coli BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-L) wurde ein E.E. von 9% nach 19 Stunden erreicht.
Die chemische Blindprobe ergab einen E.E. von 99% nach 19 Stunden.
3.4 Racemisierung von L-5-Methylmercaptoethylhydantoin
Bei einer Reihe von Reaktionen, wie in 3.1 beschrieben, wurden verschiedene Konzentrationen von L-5-Methylmercaptoethylhydantoin mit einem E.E. von 89 mit ganzen Zellen von E. coli BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-S) und E. coli BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-L) inkubiert. Die Konzentrationen von L-5-Methylmercaptoethylhydantoin betrugen 1, 5, 10, 50 und 80 mM. Die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten wurden während der Zeitspanne bestimmt, während der die Produktkonzentration (D-5-Methylmercaptoethylhydantoin) sich mit der Zeit linear erhöhte und sind in mM pro Stunde ausgedrückt. In 1 sind die anfänglichen Aktivitäten in Abhängigkeit von den anfänglichen Substratkonzentrationen aufgezeichnet.
Wie in 1 zu sehen ist, erhöht sich die anfängliche Racemase-Aktivität sowohl von E. coli BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-S) als auch E. coli BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-L) mit einer steigenden anfänglichen Substratkonzentration, was bedeutet, dass die Hydantoinracemasen mit SEQ ID:NO. 2 und NO. 4 keine Substratinhibition L-5-Methylmercaptoethylhydantoin gegenüber aufweisen. Die Hydantoinracemasen des Pseudomonas-Stamms NS671 und von Arthrobacter aurescens DSM 3747 zeigen andererseits klar, dass die relative anfängliche Aktivität bei Konzentrationen von L-5-Methylmercaptoethylhydantoin von mehr als 2,5 bzw. 5 mM abfällt. Aus diesem Grund wird der Schluss gezogen, dass die klonierten Hydantoinracemasen von A. radiobacter durch L-5-Methylmercaptoethylhydantoin nicht inhibiert werden. Km- und Vmax-Werte von L-5-Methylmercaptoethylhydantoin wurden durch Aufzeichnen von 1/V in Abhängigkeit von 1/S in einem Lineweaver-Burk-Diagramm bestimmt. Der zellfreie Extrakt von E. coli BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-S) weist einen Km-Wert von 1 mM und einen Vmax-Wert von 0,4 mM/Stunde auf. Der zellfreie Extrakt von E. coli BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-L) weist einen Km-Wert von 20 mM und einen Vmax-Wert von 0,2 mM/Stunde auf.
Sequenzliste

Claims

Isoliertes Polypeptid mit Hydantoinracemase-Aktivität, das nicht unter einer Inhibition durch L-5-Methylmercaptoethyl-hydantoin leidet, wobei das Peptid mindestens 87% Identität mit SEQ ID: Nr. 2 oder SEQ ID: Nr. 4 aufweist.
Isoliertes Polypeptid mit Hydantoinracemase-Aktivität, das nicht unter einer Inhibition durch L-5-Methylmercaptoethyl-hydantoin leidet, wobei das Peptid von einer Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die unter hohen oder sehr hohen Stringenz-Bedingungen mit SEQ ID: Nr. 1 und/oder mit SEQ ID: Nr. 3 oder den Komplementären davon hybridisiert.
Isoliertes Polypeptid nach Ansprüchen 1 und 2 mit einer immunologischen Kreuzreaktivität mit einer Antikörper-Zubereitung gegen mindestens einen Teil der Aminosäureseguenz nach SEQ ID: Nr. 2 oder SEQ ID: Nr. 4.
Nukleinsäuresequenz, kodierend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Vektor, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 4.
Wirtszelle, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 4 oder einen Vektor nach Anspruch 5.
Verfahren zur Racemisierung einer Enantiomerangereicherten Hydantoinverbindung, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens der Enantiomerangereicherten Hydantoinverbindung mit einem Polypeptid nach Ansprüchen 1 bis 3.
Verfahren zur Herstellung von Enantiomer angereicherten D- oder L-α-Aminosäuren in der Gegenwart von a. einem Polypeptid nach Ansprüchen 1 bis 3 und b. einer Hydantoinase und/oder c. einer Enantiomer-selektiven Carbamoylase.