DE60306355T2

DE60306355T2 - Mikromatrixprobenausleser mittels elektrospraymassenspektrometrie

Info

Publication number: DE60306355T2
Application number: DE60306355T
Authority: DE
Inventors: J. Gary Clinton VAN BERKEL
Original assignee: UT Battelle LLC
Current assignee: UT Battelle LLC
Priority date: 2002-04-16
Filing date: 2003-04-09
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2023-04-10
Also published as: JP2009133868A; JP2005523456A; AU2003228472A8; EP1497847A2; CA2482546A1; AU2003228472A1; CA2482546C; WO2003090249A3; ATE331297T1; EP1497847B1; US20030193020A1; JP4607223B2; DE60306355D1; WO2003090249A2; JP4308026B2; MXPA04010136A; US6803566B2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren und Vorrichtungen zur Beförderung, Ionisierung und darauf folgenden Analyse von zu bestimmenden Stoffen, und insbesondere auf Verfahren und Vorrichtungen zum Analysieren einer Vielzahl von Probenbereichen auf einer Anordnung bzw. einem Array unter Einsatz von Elektronensprüh-Massenspektrometrie.
Hintergrund der Erfindung
Die Untersuchung von Proteinkomplementen von Zellen, Geweben oder ganzen Organismen wird als Proteomik bezeichnet. An Proteomik besteht ein starkes Interesse, und aufgrund von analytischen Verfahren, die neue Möglichkeiten erschließen, hat in den letzten Jahren in weiten Bereichen ein großer Fortschritt stattgefunden. Ein Thema in der Proteomik ist die Überwachung der Expression von Proteinen in einem biologischen System, wenn das System auf einen Reiz antwortet. Gegenwärtig ist die zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE) das am häufigsten verwendete und leistungsfähigste Mittel zur Erfassung solcher Proteinkomplemente. Dieser Lösungsansatz kann die Expressionsdarstellung von mehreren Tausend Proteinen in einer Vielzahl von Proben unterstützen.
Bei 2-DE bestehen aber mehrere erhebliche Einschränkungen. Diese Einschränkungen umfassen beispielsweise die Schwierigkeit bei der Handhabung von Membranproteinen, eine komplizierte Gelbildanalyse und die manuelle Herstellung und Verarbeitung der Gele. Außerdem ist bei 2-DE ein sauberes Herausgreifen und Säubern von Bereichen notwendig, um die eingesetzten, hochgradig spezifischen und sehr empfindlichen, auf Massenspektrometrie beruhenden Protein-Bestimmungsverfahren nutzen zu können. Deshalb erforscht man gerade alternative Erfassungsverfahren zur Proteinexpressionsdarstellung an komplexen Proben.
Protein-"Arrays" oder "-Bausteine" sind eine mögliche Alternative. Zusätzlich zur Proteinexpressionsdarstellung hat diese Technologie potenzielle Einsatzzwecke bei der Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen, von Proteinsubstraten oder in Frage kommenden Stoffen bei Entwicklungsverfahren für Arzneimittel. Dieser Lösungsansatz zum Scree nen der Proteinaktivität genießt dieselben Vorteile wie die handelsüblichen DNA-Mikroarrays für die mRNA-Expressionsanalyse, nämlich eine mit hohem Durchsatz und parallel arbeitende, im Mikromaßstab ablaufende quantitative Analyse. Sie hat auch Vorteile gegenüber DNA-Mikroarrays.
Genaue bzw. getreue Expressionsanalysen müssen auf Proteinebene stattfinden, weil das sich schließlich ergebende, aktive Produkt der meisten Gene das Protein ist und die Proteinexpression und mRNA-Expression nicht notwendigerweise quantitativ miteinander verbunden sind. Darüber hinaus können Proteine sowohl in aktiven als auch inaktiven Formen synthetisiert werden. Um die biologische Funktion eines Gens zu verstehen, muss im Allgemeinen der Anteil des aktiven Genprodukts bestimmt werden.
Die Analyse von Nukleinsäurebausteinen wird üblicherweise durchgeführt, indem ein fluoreszierender Sondenreporter verwendet wird, der sich an den zu bestimmenden Stoff anhängt. Mit dem Einsatz dieses Lösungsansatzes zum Auslesen bzw. zur Bestimmung eines Proteinarrays sind eine ganze Reihe von Problemen verbunden. Zuallererst ist bei diesem auf Fluoreszenz beruhenden Lösungsansatz erforderlich, dass sich nur die zu bestimmenden Stoffe mit dem Einfangmolekül verbinden und das Zustandekommen von unspezifischen Bindungen minimal ist. Dies ist bei Proteinen üblicherweise nicht der Fall, insbesondere wenn die Bindungsbedingungen nicht für jede spezifische Wechselwirkung optimiert werden können. Ein zweites Problem besteht darin, dass die Kennzeichnung der Proteine mit einer fluoreszierenden Sonde deren Bindungseigenschaften verändern kann und auch Proteinkomplexe, die sich in Lösung befinden, zerstören kann. Schließlich kann der auf Fluoreszenz basierende Lösungsansatz nicht unter den verschiedenen Formen eines bestimmten Proteins unterscheiden. Dies schließt Situationen ein, wo die aktive und die inaktive Form des Proteins eingefangen werden und äquivalente Signale ergeben. Diese beiden Probleme beeinträchtigen den gegenwärtigen parallelen Standard zur Proteinerfassung und -mengenbestimmung, den Enzym-Immunoassay (ELISA), der mit einem Einfang/Erfassungs-Schema arbeitet.
Massenspektrometrieverfahren (MS-Verfahren) bieten Vorteile sowohl für die Erfassung als auch die Bestimmung von Proteinen. Zurzeit gibt es keine andere Technologie, die der Kombination aus Analysegeschwindigkeit, Sensitivität und hochgenauer Messung der Molekülmasse, wie sie durch die Massenspektrometrie bei der Proteinanalyse geleistet wird, gleichkommen kann. Eine genaue Massenbestimmung mit hoher Auflösung ermöglicht die Erfassung einer posttranslationalen bzw. nach dem Versetzungsvorgang stattfindenden Modifikation der Proteine, und dies sogar in Proteingemischen, was mit anderen verfügbaren Technologien schwierig zu beurteilen ist. Enzymatisch erzeugte Peptidfragmente von Proteinen, die mittels Massenspektrometrie analysiert werden, werden nun routinemäßig dazu verwendet, das Gesamtmolekül über eine Online-Proteindatenbanksuche zu bestimmen (Peptidabbildung).
Alternativ dazu gestatten neue Verfahren die Bestimmung eines Proteins aus den Fragmenten, die aus intakten Proteinen in der Gasphase mittels Tandem-Massenspektrometrie erzeugt wurden, womit die Notwendigkeit enzymatischer Aufschlussvorgänge aus der Welt geschafft ist. Die Tandem-Massenspektrometrie verwendet zwei Stufen der Massenanalyse, eine Stufe zur Vorauswahl eines Ions, und die zweite Stufe zur Analysierung von Fragmenten, die zum Beispiel durch Kollision mit einem Inertgas wie etwa Argon oder Helium zustande gekommen sind. Diese Doppelanalyse kann zeitlich gesehen in zwei Stufen ablaufen, oder, was gebräuchlicher ist, räumlich gesehen hintereinander durchgeführt werden. Eine räumliche Tandem-Massenspektrometrie läuft mittels zweier Massenspektrometer ab, die hintereinander geschaltet sind.
Die Massenspektrometrie wird jetzt als ein Verfahren angesehen, das ein großes Potenzial für das Auslesen eines Proteinmikroarrays hat. Gegenwärtig gibt es zwei Ionisierungsverfahren, die häufig zur Erzeugung von in der Gasphase befindlichen Ionen aus Proteinen verwendet werden, die zur Analyse durch die Massenspektrometrie bestimmt sind. Diese Verfahren sind die matrixunterstützte Laserdesorptionsionisierung (MALDI = matrix-assisted laser desorption ionization) und die Elektronensprüh-Ionisierung (ES = electrospray). Von diesen beiden Verfahren wird zum Auslesen eines Proteinarrays sehr häufig die MALDI-Massenspektrometrie (MALDI-MS) verwendet, was eine Oberflächenanalysetechnik ist.
Auf MALDI-MS beruhende Lösungsansätze zum Auslesen von Proteinbausteinen werden derzeit von zwei verschiedenen Unternehmen verwertet, und zwar von Ciphergen Biosystems Inc. (Fremont, CA) und Intrinsic Bioprobes Inc. (Tucson, AZ). Sie bieten jeweils Proteinbausteine für MALDI-MS an, die vier bis acht Wechselwirkungsstellen enthalten. Diese handelsüblichen Produkte lassen sich mit bestimmten allgemeinen Affinitäten bezüglich eines Proteineinfangs/Proteineinbaus erhalten, z.B. mit hydrophober oder hydrophiler Wechselwirkung, Anionenaustausch, Kationenaustausch, und mit immobilisierten Substraten mit einer Affinität zu Metallen, um metallische Bindungsproteine einzufangen. Alternativ dazu kann man nach Sonderauftrag angefertigte Bausteine bekommen, die immobilisierte Rezeptorarten nach Wunsch des Forschers tragen. Die immobilisierten Substrate können zum Beispiel in Form eines bestimmten Antikörpers vorliegen. Während die handelsüblichen Produkte keine wirklichen Arrays sind, haben Labordemonstrationen auf dem Gebiet der Herstellung und MALDI-MS-Analyse von Protein-Wechselwirkungsarrays stattgefunden, die eine Größe von zehn auf zehn hatten (100 Bereiche bzw. Spots).
Dass MALDI-MS-Proteinbausteinprodukte nun im Handel erhältlich sind, ist ein Hinweis für ihre Nützlichkeit. Nichtsdestoweniger stellt aber der Einsatz von MALDI-MS zum Auslesen von Bausteinen erhebliche Beschränkungen in Bezug auf die Analyse dar. Es besteht eine geringe Dichte des zu bestimmenden Stoffs an irgendeinem kleinen Punkt auf einem bestimmten Anordnungs- bzw. Arraybereich, wo der Laserstrahl zur Erzeugung von Ionen in Wechselwirkung tritt. Dies wirkt sich negativ auf die Erfassungsgrade aus. Bei Molekülmassen von über ca. 15 kDa fallen die Erfassungsgrade bei MALDI-MS steil ab. Dies kann die Auswahl von Proteinen, die direkt analysiert werden können, stark einschränken. Wenn größere Proteine analysiert werden, sind auch zeitraubende enzymatische Aufschlussverfahren vonnöten, um Peptide mit geringerer Masse zu erzeugen, die einer Erfassung besser zugänglich sind. Diese Aufschlussvorgänge sind auch notwendig, um Peptide für die Proteinbestimmung durch die Peptidabbildung zu erzeugen. Massengenauigkeiten bei MALDI-MS liegen üblicherweise unter ca. 0,01% (z.B. +6 Da für Rinder-Albumin, ca. 66.000 Da). Schließlich erfordert die Analyse der Arrays das Entfernen des zu bestimmenden Stoffes aus dem ursprünglichen, flüssigen Medium, in dem die Wechselwirkungen stattfanden, und die Anwendung einer chemischen Matrix, um die Desorption und Ionisation zu ermöglichen, gefolgt von einem Trocknungsschritt.
Ein Elektronensprühverfahren ist eine Alternative zu MALDI und beruht allgemein auf dem Einströmen einer Probenflüssigkeit in eine Elektronensprühionenquelle, die ein Röhrchen oder eine Kapillare umfasst, das/die in Bezug auf eine nahe gelegene Oberfläche auf Hochspannung gehalten wird, wobei hier von Absolutwerten gesprochen wird. Die nahe gelegene Oberfläche (z.B. 1 cm Abstand) wird häufig als Gegenelektrode bezeichnet. Bei herkömmlichen ES-Systemen zur Massenspektrometrie wird die Emitterelektrode mit Hochspannung beaufschlagt (in Bezug auf ein Massepotenzial), während die Gegenelektrode auf einer niedrigeren Spannung gehalten wird, die nahe am Massepotenzial liegt. Für die Betriebsart mit positiven Ionen ist die Spannung am Emitter stark positiv, während für die Betriebsart mit negativen Ionen die Emitterspannung stark negativ ist.
Die in das Rohr oder die Kapillare eingeführte Flüssigkeit wird verteilt und in Form von feinen, elektrisch geladenen Tröpfchen (Sprühstrahl) ausgestoßen, und zwar durch das angelegte elektrische Feld, das zwischen dem bzw. der auf Hochspannung gehaltenen und als Arbeitselektrode bezeichneten Rohr oder Kapillare und der nahe gelegenen Oberfläche erzeugt wird.
Der Ionisierungsvorgang beruht allgemein auf der bei Atmosphärendruck stattfindenden Desorption von Ionen aus den feinen, elektrisch geladenen Partikeln. Die durch den Elektronensprühprozess erzeugten Ionen können dann für eine ganze Reihe von Anwendungen hergenommen werden, zum Beispiel als Masse, die in einem Massenspektrometer analysiert wird.
In einem typischen ES-MS-Prozess wird eine Lösung, die relevante, zu bestimmende Stoffe enthält, auf den auf Hochspannung gehaltenen ES-Emitter gerichtet, was einen geladenen Solvens-Tröpfchenstrahl oder Sprühstrahl ergibt. Unter dem Einfluss des elektrischen Felds wandern die Tröpfchen zur Gegenelektrode ab. Bei der Bewegung der Tröpfchen werden aus ihnen Gasphasenionen freigesetzt. Dieser Prozess bringt einen quasi kontinuierlichen, stationären Strom hervor, wobei die geladenen Tröpfchen und Ionen den Strom bilden und die Reihenschaltung vervollständigen.
Obwohl ES-MS bekannt ist, ist der Einsatz von ES-MS zum automatischen Auslesen einer Vielzahl von Spots bzw. Bereichen, wie etwa von einem Proteinbausteinarray, noch nicht nachgewiesen worden. Dies ist wahrscheinlich auf die technischen Herausforderungen zurückzuführen, die bei der automatisierten Probenentnahme von zu bestimmenden Stoffen aus kleinen Bereichen an einer Probenoberfläche mit einem Fluidströmungssystem bestehen. Genauer gesagt arbeitet ein Elektronensprühverfahren normalerweise so, dass man eine in Lösung befindliche Probe durch ein Transferrohr zur Ionenquelle des Massenspektrometers strömen lässt. Bei dem Versuch, eine Oberfläche mit einem Elektronenstrahl zu analysieren, besteht eine große Herausforderung dahingehend, eine Sonde herzustellen, die dazu geeignet ist, eine normalerweise mit einer festen Oberfläche behaftete Probe in Lösung zu überführen und diese dann in die Transferleitung einzubringen. Zusätzlich benötigt man eine technisch ausgefeilte Konstruktion, um die Ausrichtung der Sonde mit der Oberfläche zu steuern, wobei durch die Konstruktion allgemein eine feine Auflösung der Sondenbewegung relativ zur Oberfläche bereitgestellt wird.
Zhang B. et al. (Anal. Chem. 2001, 73, 2675–2681) offenbart ein System für eine für hohen Durchsatz gedachte, in Mikrobauweise verwirklichte Kapillarelektrophorese/Elektronensprühmassenspektrometrie (CE/ESI/MS) mit einer automatischen Probenentnahme aus einer Mikro-Napfplatte. In diesem System werden eine zwischengeschaltete Mikrovorrichtung mit Kapillarelektrophorese-Separationsfähigkeit, die eine Probeneinbringungsschleife enthält, ein Separationskanal und eine Fluidverbindung mit ESI-Schnittstelle und einem Magazin mit Elektrodenbehältern verwendet. Im US-Patent Nr. 2002/0011562 ist eine Vorrichtung und ein Verfahren offenbart, um einen Beschickungsvorgang einer großen Anzahl von Proben, die für die Massenspektrometrieanalyse gedacht sind, automatisch auszuführen, wobei bei der Analyse eine matrixunterstützte Desorption durch Laserbeschuss (MALDI) und Ionisierungsverfahren bei Atmosphärendruck (API-Verfahren) wie zum Beispiel ein Elektronensprühverfahren verwendet werden. Bei diesem Verfahren werden unter Einsatz von MALDI zur Lieferung von Ionen an ein Massenspektrometer Ionen über eine Kapillare automatisiert von einer bei erhöhtem Druck arbeitenden Ionisierungsquelle zu einem Vakuumbereich eines Massenanalysesystems transportiert. Die Kapillare besteht aus mindestens zwei Teilstücken, die endseitig miteinander verbunden sind, so dass Gas und im Gas vorhandenes Probenmaterial durch die Kapillare durch ein Druckgefälle befördert werden können.
ZUSAMMENFASSUNG
Es wird ein gemäß Anspruch 1 ausgelegtes Verfahren zur Bestimmung von zu bestimmenden Stoffen bereitgestellt, die sich auf oder in Flächenarrays befinden. Die zu bestimmenden Stoffe können intakte Proteine, Proteinfragmente, Arzneimittel und Antikörper umfassen.
Das Verfahren umfasst den Schritt, automatisch zu wenigstens einem der anderen Bereiche vorzurücken und die Schritte des Einleitens, Ionisierens und Analysierens zu wiederholen. Die Begriffe "Vorrücken" und "Abtasten" werden hier synonym verwendet und beziehen sich auf die Bewegung von einem Arraybereich zum nächsten.
Der Schritt des Analysierens kann eine Massenspektrometrie beinhalten. Die Massenspektrometrie kann eine Massenspektrometrie in Tandemanordnung sein.
Der Schritt des Einleitens kann den Schritt umfassen, vor dem Einleiten einer Elutionslösung eine Waschlösung einzuleiten. Das Verfahren kann auch den Schritt umfassen, vor dem Einleiten der Elutionslösung zumindest ein Reagens in den Bereich einzuleiten.
Die Sonde kann eine mehrachsige Fluidverbindungssonde sein, die mit dem Bereich mittels einer Fluidbrücke in Verbindung steht. Die Sonde kann eine mehrachsige Oberflächenkontaktsonde sein, die dazu ausgelegt ist, um den Umfang des Bereichs herum eine dichte Umschließung zu bilden. Die Oberflächenkontaktsonde kann zur Bildung der dichten Umschließung eine O-Ring-Dichtung umfassen. Für den Schritt des Einleitens kann in der Oberflächenkontaktsonde ein Überdruck verwendet werden, wobei die Elutionslösung und der zu bestimmende Stoff unter dem Einfluss des aufgebrachten Überdrucks durch die Sonde geleitet werden.
In der Ausführungsform, die ein erfindungsgemäßes, automatisches Vorrücken beinhaltet, kann die Positionierungsvorrichtung an einer im Wesentlichen flachen Oberfläche eine Positionssteuerung in der x-, y- und z-Achse bereitstellen, und zwar mit einer Auflösung von mindestens 1 nm für jede der Achsen x, y und z. Bei dem Positionierungssystem kann es sich um eine piezoelektrische Positionierungsvorrichtung und eine Steuer einheit eines elektrochemischen Mikroskops mit Tastsonde (SECM = scanning probe electrochemical microscope) handeln.
Das Verfahren ist dazu ausgelegt, an Bereichsflächen von kleiner als ca. 0,04 mm² Proben zu nehmen. Die flächige Anordnung bzw. der Flächenarray kann als Proteinarray, in Form von Dünnschichtchromatographieplatten, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), isoelektrischen Fokussierungsgelen oder Feststoffextraktionsmaterialien vorliegen.
Ein automatisiertes, erfindungsgemäßes Probenentnahmesystem dient zum Erhalt von Proben von Flächenarrays mit einer Vielzahl von zur Analyse vorgesehenen Bereichen bzw. Spots. Wenigstens ein zu bestimmender Stoff befindet sich auf den Bereichen oder ist in diesen enthalten. Das System umfasst mindestens eine Sonde. Die Sonde umfasst einen Einlass zum Einleiten wenigstens einer Elutionslösung in die Bereiche und umfasst darüber hinaus einen Auslass, um den zu bestimmenden Stoff von einem Bereich wegzuführen. Es wird ein automatisches Positionierungssystem vorgesehen, um die Sonde relativ zu den Bereichen zu versetzen, um eine Probenentnahme an einem beliebigen Bereich zu gestatten.
Es ist eine Elektronensprühionenquelle mit einem Einlass bereitgestellt, der mit der Sonde in Fluidverbindung steht, um den zu bestimmenden Stoff aufzunehmen und aus dem zu bestimmenden Stoff Ionen zu erzeugen. Das System umfasst einen Analyseaufbau für die erzeugten Ionen, wobei der Analyseaufbau die Ionen für die Elektronensprühionenquelle aufnimmt. Der Analyseaufbau kann ein Massenspektrometer oder ein Tandem-Massenspektrometer beinhalten.
Die Sonde kann eine mehrachsige Fluidverbindungssonde sein, die mit den Bereichen mittels einer Fluidbrücke in Berührung steht. Die Sonde kann auch eine mehrachsige Oberflächenkontaktsonde sein, die dazu ausgelegt ist, um einen Umfang der Bereiche herum eine dichte Umschließung zu bilden.
Das automatische Positionierungssystem kann die Fähigkeit bereitstellen, von einem Bereich zum nächsten vorzurücken. Für diesen Zweck kann zum Beispiel eine piezoelektrische Positionierungsvorrichtung und eine Steuereinheit eines elektrochemischen Mikroskops mit Tastsonde (SECM) verwendet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Ein umfassenderes Verständnis der vorliegenden Erfindung und deren Merkmale und Vorteile ergibt sich bei Betrachtung der nun folgenden ausführlichen Beschreibung in Zusammenschau mit den begleitenden Zeichnungen. In diesen zeigen:
1 eine Probenentnahmesonde/ES-MS zum Auslesen eines Flächenarrays, gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
2(a) eine Oberflächenkontaktsonde gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
2(b) eine Fluidverbindungssonde gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
3 ein Foto einer als Prototyp gebauten Fluidverbindungssonde und eines zugehörigen Systems zum Auslesen eines Mikroarrays über ES-MS.
4 Signalspitzenverläufe, die von einem ES-MS-System erzeugt werden, und zwar unter Einsatz der Probenentnahmesonde und des Probenentnahmesystems von 3, für 0,5 pmol Apomyoglobin (16.951 Da) pro Bereich, aus 4 aufeinander folgenden Arraybereichen auf einem Glasobjektträger.
5 ein Massenspektrum, das die Erzeugung einer Vielzahl von Aminosäuren-"Sequenzmarkern" aus einem Komplettprotein unter Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ein System zum Erfassen wenigstens eines zu bestimmenden Stoffes, der sich in irgendeinem aus einer Vielzahl von Bereichen in einem Flächenarray befindet, umfasst wenigstens eine Probenentnahmesonde. Zum Ausrichten der Probenentnahmesonde relativ zu den Arraybereichen und zum Vorrücken zu anderen Arraybereichen wird vorzugsweise eine automatische Positionierungsvorrichtung bereitgestellt, so dass der Erfassungsprozess automatisch wiederholt werden kann. Die Sonde umfasst einen Einlass zum Einleiten wenigstens einer Elutionslösung in einen beliebigen der Arraybereiche, zur Beförderung des zu bestimmenden Stoffs, und einen Auslass, um den zu bestimmenden Stoff von dem Bereich ab- und zu einer Elektronensprühionenquelle hinzuführen, um den zu bestimmenden Stoff zu ionisieren. Ein Aufbau zum Analysieren von Ionen, bei dem es sich vorzugsweise um ein Massenspektrometer handelt, bestimmt den zu bestimmenden Stoff mittels einer Analyse der von der ES-Quelle erzeugten Ionen. Demzufolge braucht die Erfindung für die Analyse keine komplizierten und oftmals unzuverlässigen, von außen wirkenden Kennzeichnungsverfahren, die bei bisherigen Verfahren zur Probenentnahme an Arrays allgemein erforderlich waren.
Die Erfindung kann dazu verwendet werden, an nahezu jeder relevanten Oberfläche Proben zu nehmen. Dementsprechend verfügt die Erfindung über ein breites Feld potenzieller Anwendungsmöglichkeiten. Eine solche Anwendung findet sich bei Protein-Mikroarrays. Die Protein-Mikroarraytechnologie ist ein schnell wachsender Markt mit einer vorhergesagt starken Zuwachsrate. Einige allgemeine Verwendungszwecke der Erfindung umfassen die Reinigung von Proteinen, die Darstellung von Proteinexpressionen und Proteinwechselwirkungen (einschließlich Wechselwirkungen zwischen Proteinen) und die Entwicklung von Arzneimitteln. Ein Wachstumshindernis auf diesem Gebiet war bisher die Entwicklung von empfindlichen molekularspezifischen Erfassungsverfahren für Arrays, bei denen keine komplizierten und oftmals unzuverlässigen, von außen einwirkenden Kennzeichnungsverfahren benötigt wurden. Bezeichnenderweise bedarf es bei der Erfindung keiner Kennzeichnung zur Erfassung eines zu bestimmenden Stoffs.
Mit Bezug auf Proteinarrays können Substratoberflächen überzogen sein, wobei sich auf einem oder mehreren Bereichen ein immobilisiertes Einfangmaterial befindet. So können Proteinarrays zum Beispiel Antikörper enthalten, die kovalent fest an die Arrayoberfläche gebunden sind, um aus einem komplexen Gemisch entsprechende Antigene einzufangen. Verschiedene Bereiche können mit verschiedenem Einfangmaterial versehen sein. An Arraysubstrate können viele verschiedene Arten von Ein fangmaterialsubstanzen gebunden sein, einschließlich Antikörper, Rezeptoren, Liganden, Nukleinsäuren (z.B. DNA), Kohlenhydrate, Gele (z.B. isoelektrische Fokussierungsgele), und chromatographische Oberflächen wie kationische, anionische, hydrophobe und hydrophile Oberflächen. Als Einfangmaterial können auch speziell geprägte Molekularsubstanzen verwendet werden. Einige Oberflächen können so ausgelegt sein, dass sie eine breite spezifische Wirksamkeit haben und ganze Klassen von Proteinen binden, während andere so konzipiert sein können, dass sie hochgradig spezifisch wirken und nur ein Protein oder wenige Proteine aus einer komplexen Probe binden.
Nach dem Einfangschritt wird der zu bestimmende Stoff an das Einfangmaterial gebunden und auf dem Array angeordnet. Zur Reduzierung nichtspezifischer Bindungen wird der Array dann vorzugsweise mit einer geeigneten Waschlösung gewaschen. Im Gegensatz zur Verwendung eines Trocknungsschritts, gefolgt von kurzen Impulsstößen mit Hochleistungs-Laserlicht, um die festgehaltenen Proteine von einem Abschnitt der Arrayoberfläche loszulösen, wie es bei MALDI geschieht, werden bei der Erfindung ein oder mehrere Lösungsmittel verwendet, um festgehaltene Proteine oder andere gebundene, zu bestimmende Stoffe allgemein von der gesamten Bereichsfläche freizusetzen, und zwar ohne die Notwendigkeit der Anwendung einer Matrix und des dazugehörigen Trocknungsschritts. Mittels Elektronensprühionisierung wird der zu bestimmende Stoff dann ionisiert, und die erzeugten Ionen werden unter Einsatz irgendeines geeigneten Analyseverfahrens, wie etwa der Massenspektrometrie, analysiert. Obwohl die Massenspektrometrie allgemein bevorzugt ist, könnte auch die Ionenmobilität oder eine Kombination aus Ionenmobilität und Massenspektrometrie hergenommen werden. Für die Analyse können auch Lichtstreuungsdetektoren verwendet werden, wie etwa das Gerät DUSTRAK, Modell 8520 (ITI-044), das von TSI Incorporated, St. Paul, Minnesota, zur Verfügung gestellt wird.
1 zeigt ein ES-MS-Probenentnahmesystem 100 zum Auslesen eines Flächenarrays gemäß einer Ausführungsform der Erfindung. Ein Flächenarray 120 ist an einem Substrat (nicht gezeigt) angeordnet, das sich auf einem Tisch 105 befindet. Der Flächenarray 120 umfasst eine Vielzahl von einzelnen Array-Wechselwirkungsbereichen (nicht gezeigt). Jeder Bereich verfügt über eine Fläche, die im Allgemeinen kleiner als ca. 1 mm² ist. Das System 100 ist dazu ausgelegt, an Bereichsflächen Proben zu nehmen, die nur ca. 0,04 mm² groß sind, bevorzugter an Bereichsflächen Proben zu nehmen, die gerade einmal ca. 0,01 mm² groß sind.
Der Array 120 ist vorzugsweise ein Proteinarray mit einem darauf befindlichen Einfangmaterial, kann aber in Form eines beliebigen Flächenarrays vorliegen, wie etwa als Dünnschichtchromatographieplatten, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), isoelektrische Fokussierungsgele und Festphasenextraktionsmaterialien. Die Bereiche können zum Beispiel eine oder mehrere Zonen enthalten, auf denen sich immobilisiertes Einfangmaterial wie etwa Nukleinsäuren oder Antikörper befinden.
Das Arraysubstrat (nicht gezeigt) ist typischerweise ein inertes, nicht poröses Material. So können beispielsweise Glas, eine Oberflächenschicht aus SiO₂, die auf einem Material wie Silizium abgeschieden ist, verschiedene Kunststoffe oder Aluminiumoxid allgemein als Substratmaterialien verwendet werden.
Obwohl das System 100 mit einer Probenentnahmesonde 130 gezeigt ist und allgemein als serielles Auslesesystem beschrieben werden wird, kann das System als paralleles Multiplexsystem konfiguriert sein. Mit einem Multiplex-Probenentnahmesystem lässt sich der Probendurchsatz erhöhen. Handelsübliche ES-Systeme bieten zum Beispiel bis zu 8 definiert verfahrbare Sprüheinrichtungen. Die Sprüheinrichtungen können parallel arbeiten, indem jede Sprüheinrichtung von ihrer Probenreihe zyklisch Proben entnimmt. Unter der Annahme, dass ein einzelnes Massenspektrometrie-Analysesystem verwendet wird, wird der Zeitbetrag, den der Sprühstrahl aus irgendeinem Emitter zur Probenentnahme benötigt, um ein Vielfaches des Kehrwerts der Anzahl der Sprüheinrichtungen verringert.
In einer alternativen Ausführungsform können einzelne Arraypositionen des Flächenarrays 120 mit ihren eigenen zweckbestimmten Sprüheinrichtungen versehen werden. Dies lässt sich erzielen mit in Kürze in den Handel zu bringenden, in Mikrobauweise ausgeführten Arrays aus ES-Düsen, die ein schnelleres serielles Auslesen von Flächenarrays mit höherem Automatisierungsgrad bieten.
Um die Probenentnahmesonde 130 in Bezug auf einen beliebigen der im Array 120 enthaltenen Arraybereiche auszurichten und von einem Bereich zum nächsten vorzurücken, ist eine Verfahreinrichtung/Steuereinheit 125 vorgesehen, wobei es sich vorzugsweise um eine piezoelektrische Verfahreinrichtung und eine Steuereinheit handelt, die in ein elektrochemisches Abtastmikroskop (SECM) 165 integriert sind. Ein SECM 165 ist eine Art Tastsondenmikroskop (SPM = scanned probe microscope), das der Raster-Tunnelmikroskopie und Raster-Kraftmikroskopen zuzuordnen ist. SPMs arbeiten so, dass die abzubildende Oberfläche mit einer kleinen Sondenspitze abgetastet oder "abgerastert" wird. Bei einem SECM erfolgt die Bildgebung in einer Elektrolytlösung mit einer elektrochemisch aktiven Spitze.
Im Handel sind SECM-Systeme erhältlich, die an einer im Wesentlichen flachen Oberfläche eine reproduzierbare Positionssteuerung in x-, y- und z-Richtung mit einer Auflösung von unter 1 nm und einem x- und y-Verfahrweg von 5 cm bieten. Diese Systeme werden von CH Instruments Inc., Austin, TX, bereitgestellt. Diese Positionsauflösung und Verfahrwege sind für nahezu alle derzeit verwendeten Oberflächeneinrichtungen ausreichend und gestatten eine präzise und vollständige Probennahme von großen, dicht bepackten Flächenarrays mit Wechselwirkungsstellen mit linearen Abmessungen im Bereich von hinunter bis zu ca. 100 μm. Anstelle des SECM könnte auch eine andere Positionierungsvorrichtung mit ähnlichen Leistungsdaten verwendet werden.
Das SECM 165 umfasst vorzugsweise ein Videomikroskop 162 und einen Videomonitor 160, eine piezoelektrische Verfahreinrichtung/Steuereinheit 125, und einen SECM-Computer 135. DER SECM-Computer 135 überwacht die Wechselwirkung zwischen der Probenentnahmesonde 130 und dem Bausteinarray 120, um die Probenentnahmesonde 130 relativ zur Arrayoberfläche räumlich zu positionieren, um Einfangmaterial zu gewinnen und dieses an die ES-Ionenquelle 145 zu liefern. Es kann die Probenentnahmesonde 130 relativ zum Bausteinarray 120 bewegt werden, oder der Bausteinarray 120 kann relativ zur Probenentnahmesonde 130 bewegt werden, um einen Kontakt zwischen diesen bereitzustellen.
Ein Lösungsmittelzufuhrsystem 115 ist dazu ausgelegt, Fluide bereitzustellen, die Elutionslösungen umfassen. Die Fluide werden durch einen Druckunterschied weiterbefördert. In einer Ausführungsform kann ein Überdruck dazu verwendet werden, die Fluide weiterzubefördern. Bei Abwesenheit eines Überdrucks kann aber auch ein an den Auslass an gelegtes Vakuum verwendet werden. So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck "Überdruck" auf einen Druck über Atmosphärendruck, der notwendig ist, um die Fluide mit dem gewünschten Durchsatz durch das System zu befördern.
Es können eine Spritzenpumpe, Gasdruck oder andere Pumpsysteme verwendet werden. Wie oben angemerkt ist, kann auch ein Vakuum verwendet werden. In einer ein Vakuum verwendenden Ausführungsform kann die druckinduzierte Strömung so angepasst werden, dass sie die Flüssigkeit durch einen Venturi-Vakuumeffekt ansaugt.
Durch das Zufuhrsystem 115 werden Fluide durch einen geeigneten Fluidkanal einem Einlass der Probenentnahmesonde 130 zugeführt, die die Elutionslösung auf Bereiche des Flächenarrays leitet, um den eingefangenen, zu bestimmenden Stoff freizusetzen. Durch die Probenentnahmesonde 130 wird dann der zu bestimmende Stoff zusammen mit der Elutionslösung von dem Bereich abgezogen, zu einem Auslass der Probe und zu einer Elektronensprühionenquelle geleitet, um den zu bestimmenden Stoff zu ionisieren.
Obwohl das Substrat (nicht gezeigt) typischerweise aus einem nichtporösen Material gebildet ist, kann das Arraysubstrat auch aus porösen Materialien gebildet sein, so dass die Position jedes Wechselwirkungsbereichs auf einem porösen Medium liegt. Wenn somit die Oberfläche, wo der Bereich angeordnet ist, im Wesentlichen von poröser Natur ist, kann Lösungsmittel durch das Lösungsmittelzufuhrsystem 115 alternativ auch durch den Array gedrückt werden, um den zu bestimmenden Stoff in eine geeignete Sonde zu befördern.
Die ES-Ionenquelle 145 erzeugt Ionen und stellt diese dem Massenspektrometer 150 zur Verfügung, wobei die Ionen dem zu bestimmenden Stoff entstammen, der von der Probenentnahmesonde 130 geliefert wird. Das Massenspektrometer umfasst eine Elektronensprühvorrichtungsschnittstelle 148. Das Massenspektrometer 150 wird vorzugsweise basierend auf geforderten Leistungskennzahlen ausgewählt, wie zum Beispiel Abtastgeschwindigkeit, Massengenauigkeit, und der Ion/Ion-Chemie für den jeweils beabsichtigten Einsatz. Das Massenspektrometer 150 ist vorzugsweise ein Tandem-Massenspektrometer.
Die ES-Ionenquelle 145 und das Massenspektrometer 150 sind vorzugsweise computergesteuert, zum Beispiel von einem ES-MS-Computer 155. Der ES-MS-Computer 155 kann vom SECM-Computer 135 getrennt sein oder mit diesem eine Einheit bilden.
Verglichen mit MALDI-MS bietet die bei der Erfindung verwendete ES-MS-Probenentnahme mehrere entscheidende Vorteile. Bei ES-MS wird die Probe in das Massenspektrometer 150 in flüssiger Lösung eingeleitet, und von daher besteht die Möglichkeit, an jedem Punkt auf einem Array von den in Wechselwirkung stehenden Komponenten Proben zu nehmen, während der Flächenarray 120 in einer flüssigen Umgebung verbleibt. Bei MALDI-MS erfordert die Analyse von Arraybereichen das Herausnehmen aus der nativen flüssigen Umgebung, in welcher die Wechselwirkungen stattfinden, die Anwendung einer chemischen Matrix, um die Desorption und Ionisierung zu ermöglichen, gefolgt von einem Trocknungsschritt.
Unter Einsatz der Erfindung lässt sich potenziell das gesamte, auf dem Wechselwirkungsbereich vorhandene Material sammeln und zum Massenspektrometer 150 leiten, und nicht nur der kleine Anteil, der bei MALDI-MS mit dem Laserstrahl in Wechselwirkung tritt. Bei zunehmenden Molekülmassen findet sich bei ES-MS außerdem auch nicht derselbe Abfall des Erfassungsgrads, wie es bei MALDI-MS der Fall ist. Darüber hinaus können bis zu einer Masse von ca. 60 kDa sogar Massenanalysatoren von eher mittlerer Leistung mit einer nominalen Masseauflösung Massegenauigkeiten von +0,002% oder darüber erreichen (z.B. +1,3 Da für Rinder-Albumin). Noch bessere Massenbestimmungen können durch die Auswahl von Massenanalysatoren höherer Leistungsfähigkeit bereitgestellt werden, zum Beispiel mit einem ES-System, das mit einem orthogonalen Ioneninjektions-Laufzeit-(O-TOF) oder Fourier-Transformations-Massenspektrometer (FTMS) ausgestattet ist.
Mit der Erfindung lassen sich Proteine folglich auf zwei grundlegende Arten bestimmen. Der erste Fall beruht auf hochgenauen Bestimmungen der Molekülmasse, was sich sogar dann durchführen lässt, wenn Proteingemische vorhanden sind. Geeignete Instrumente umfassen die FTMS- und O-TOF-Spektrometer. Die Ion/Ion-Chemie und Geräteausstattung können auch dazu verwendet werden, relativ komplizierte Proteingemische zu analysieren. Die Analyse eines Gemischs wird als Vorteil des MALDI-MS-Verfahrens angesehen. Im zweiten Fall werden Proteine auf der Basis von Sequenzmarkern bestimmt, die durch Tandem-Massenspektrometrie aus dem Gesamtprotein erzeugt wurden. Zur Erzeugung der Sequenzmarkern könnten auch die FMTS-, O-TOF- oder die Ion/Ion-Geräteausstattung verwendet werden. Dieser "top-down"-Lösungsansatz zur Proteinbestimmung schafft die Notwendigkeit zeitraubender enzymatischer Aufschlussverfahren aus der Welt, die zur Proteinbestimmung bei dem Auslesen von Bausteinen durch MALDI-MS notwendig sind.
Die Probenentnahmesonde 130, die den freigesetzten, eingefangenen und zu bestimmenden Stoff (z.B. ein Protein) vom Flächenarray zur Bestimmung abführt, ist vorzugsweise eine Mehrkanalsonde in Miniaturausführung, wie zum Beispiel eine Koaxialkapillarsonde. Die Sonde umfasst zumindest einen Fluidkanal, um die Fluidströmung einer Elutionslösung oder andere Fluide aufzunehmen. Wenigstens ein anderer Fluidkanal stellt den Fluidauslass aus der Sonde 130 bereit, wobei das austretende Fluid den zu bestimmenden Stoff und ein oder mehrere andere Fluide umfasst. Wird zur Weiterbeförderung von Fluiden Überdruck verwendet, so hängen die für einen Überdruck typischen Bereiche vom Durchsatz und dem Rohrdurchmesser und der Rohrlänge ab. Im Allgemeinen ist ein Druck von mindestens einigen psi erforderlich, und 2000 bis 3000 psi stellen allgemein einen Höchstwert dar (1 psi = 6,895·10³ Pa).
In 2(a) und 2(b) sind zwei grundlegende Arten von Konstruktionen einer Probenentnahmesonde gezeigt, die für ES-MS ausgelegt sind, wobei es sich um eine Oberflächenkontaktsonde bzw. eine Fluidverbindungssonde handelt. Vorteilhafterweise können bei der Oberflächenkontaktsonde die Bereiche in einer flüssigen Umgebung verbleiben, was für die meisten biologischen Wechselwirkungen eine bevorzugte, naturgemäße Einstellung ist. Da bei ES-MS die Probe in flüssiger Lösung in das Massenspektrometer gelangt, besteht die Möglichkeit, an jedem Punkt auf einem Array die in Wechselwirkung stehenden Komponenten abzutasten, während der Flächenarray 120 in einer flüssigen Umgebung bleibt. Durch die Oberflächenkontaktsonde ist auch der Bereich von Elutionslösungen erweitert, die im Vergleich zu anderen Sondenkonstruktionen eingesetzt werden können, wie etwa verglichen mit der hier beschriebenen Fluidverbindungssonde. Zum Beispiel erfordert die Fluidverbindungssonde im Allgemeinen eine Flüssigkeit mit höherer Oberflächenspannung, um den Meniskus an der Oberfläche aufrecht zu erhalten. Für die Oberflächenkontaktsonde besteht keine solche Erfordernis.
Um die Fluide zum Auslass der Sonde 200 zu treiben, kann ein geeigneter Druckunterschied verwendet werden. Der Einlass der Sonde kann beispielsweise auf Umgebungsdruck gehalten werden, während am Auslass der Sonde ein Vakuum wirkt. Alternativ dazu kann am Einlass der Sonde ein Überdruck verwendet werden.
In 2(a) ist eine in Position 1 bzw. Position 2 befindliche Oberflächenkontaktsonde 200 für einen einzelnen Flächenarraybereich 210 abgebildet, wobei Position 1 für eine "obere" Position und Position 2 für eine "untere" Position steht. Der gezeigte Bereich 210 umfasst eingefangene Proteine 208, die an immobilisierte Einfangproteine 206 gebunden sind, wobei die immobilisierten Proteine auf einem Mikroarray-Substratmaterial 215, wie etwa einem Glassubstrat, angeordnet sind. Das Auslesen wird durchgeführt, während sich die Sonde 200 in Position 2 befindet. Nach dem Auslesen wird die Sonde 200 vom Bereich 210 getrennt (z.B. angehoben), um in die Position 1 zu gelangen, dann vollführt eine geeignete automatische Positioniervorrichtung eine seitliche Versetzung, um die Probenentnahmesonde 200 mit einem anderen Arraybereich wieder auszurichten. Die Sonde 200 wird wieder in die Position 2 abgesenkt und dann wird am nächsten Bereich eine Probe entnommen.
Die Sonde 200 ist vorzugsweise so bemessen, dass sie über eine ausreichend große Fläche verfügt, um einen einzelnen Arraybereich vollständig zu umgeben, ist aber auch klein genug, um zu vermeiden, dass sie bis zu angrenzenden Bereichen am Flächenarray reicht. Beim Auslesen (Position 2) isoliert somit die Oberflächenkontaktsonde 200 den Bereich, an dem gerade eine Probe entnommen wird, von dem Rest der Arraybereiche am Flächenarray. Es kann ein O-Ring 222 oder eine ähnliche Dichtungsvorrichtung verwendet werden, damit die Sonde 200 während der Probenentnahme nur an einem einzigen Bereich eine Probe entnimmt, indem die Fluidströmung auf diesen einzigen Bereich begrenzt wird.
Die Oberflächenprobenentnahmesonde 200 ist als Koaxialsonde gezeigt, wobei der äußere Kanal 212 zum Einströmen von Fluiden wie zum Beispiel Reagenzien, Waschlösungen und Elutionslösungen dient, die von einer geeigneten Schaltsystem zur Lösungsmittelzufuhr kommen, wie zum Beispiel dem System 115 in 1. Es können mehr als zwei Kanäle verwendet werden, zum Beispiel drei (3), wobei einer für ein Reagens, einer für eine Waschlösung und einer für eine Elutionslösung vorgesehen ist, mit einem (1) oder mehreren Fluidkanälen zum Ausleiten des Fluids aus der Sonde 200. Die Kanäle können in nahezu beliebiger Form vorliegen.
Vorzugsweise gelangen aus dem Inneren der Probenentnahmesonde eine Waschlösung und dann eine Elutionslösung nacheinander auf den Bereich, indem man diese Fluide durch einen äußeren Koaxialkanal 212 fließen lässt. Bei dieser Ausführung strömt die Elutionslösung auf und über die Arraybereichsfläche, um die Affinität oder andere Bindungswechselwirkungen aufzulösen, wobei die in Wechselwirkung stehenden Komponenten durch den inneren Kanal 214 der Probenentnahmesonde 200 herausgespült werden, um zu einer Elektronensprühionenquelle (nicht gezeigt) zu gelangen. Die Elektronensprühionenquelle (nicht gezeigt) steht vorzugsweise über eine Schnittstelle mit einem Massenspektrometer (nicht gezeigt) in Verbindung, um den zu bestimmenden Stoff zu bestimmen.
Die Oberflächenprobenentnahmesonde 200 hat entscheidende Vorteile gegenüber anderen Sondenkonstruktionen. Weil sich mit der Oberflächenkontaktsonde 200 vor dem Herausspülen einzelne Bereiche auf dem Flächenarray gegenüber der Außenumgebung isolieren lassen, kann das Auslesen des Arrays durchgeführt werden, während sich der Flächenarray in der Lösung befindet. Wegen Vermischungs- und Verdünnungsproblemen ist dieses Merkmal bei anderen Sondenkonstruktionen im Allgemeinen nicht vorhanden. Auch ist bei dieser Konstruktion, während ein bestimmter Bereich auf der Anordnung analysiert wird, der Eintrag von Fremdlösungsmitteln in benachbarte Arraybereiche so gut wie ausgeschlossen.
2(b) zeigt eine zweite Sondenausführung, die als Fluidverbindungssonde 250 bezeichnet wird. Bei dieser Sonde 250 wird ein ähnliches, auf Überdruck basierendes Konzept zur Zufuhr des Lösungsmittels wie bei der Oberflächenkontaktsonde 200 verwendet, wobei der Kontakt mit einer Bereichsoberfläche 210 wie in 2(b) gezeigt über eine Flüssigkeitsbrücke 255 bzw. eine Flüssigkeitsverbindung erfolgt. Die Bereichsoberfläche 210 umfasst eingefangene Proteine 208, die an immobilisierte Einfangproteine 206 gebunden sind, wobei sich die immobilisierten Proteine auf einem Mikroarray-Substratmaterial 215, wie etwa einem Glassubstrat, befinden.
Genau wie die Sonde 200 ist auch die Fluidverbindungssonde 250 vorzugsweise so bemessen, dass sie eine ausreichende Größe hat (einschließlich der Flüssigkeitsbrücke 255), um so positioniert werden zu können, dass sie einen einzelnen Arraybereich umgibt, aber auch klein genug ist, um zu vermeiden, dass sie während der Probenentnahme bis an benachbarte Bereiche auf dem Flächenarray heranreicht. Der Ausgleich zwischen dem Zustrom des Lösungsmittels in die Sonde 250 und der pneumatisch erfolgenden Zerstäubung des Elektronensprühstrahls ES stellt eine selbstansaugende Sonde bereit, durch die kontinuierlich Lösungsmittel strömen kann, wenn dies gewünscht ist. Bei Einsatz der Fluidverbindungssonde 250 kann es erforderlich sein, dass die Analyse durchgeführt wird, wenn sich der Array außerhalb der flüssigen Lösung befindet, weil der Eintrag von Fremdlösungsmitteln während der Analyse eines Bereichs die Ergebnisse beeinträchtigen kann, die für die anderen Bereiche erhalten werden, wenn diese analysiert werden. Außerdem kann bei der in der Lösung stattfindenden Analyse die Elutionslösung mit dem Lösungsmittel verdünnt werden, in das der Array eingetaucht ist.
Die Probenentnahmesonde 250 ist als Koaxialsonde gezeigt, mit einem äußeren Kanal 262 zum Einleiten von Fluiden wie zum Beispiel Reagenzien, Waschlösungen und Elutionslösungen, die von einem geeigneten Schaltsystem zur Lösungsmittelzufuhr kommen, wie etwa dem in 1 gezeigten System 115. Die Sonde 250 umfasst einen inneren Kanal 264, um den zu bestimmenden Stoff einer Elektronensprühionenquelle (nicht gezeigt) zuzuführen. Wie bei der Sonde 200 können mehr als zwei Kanäle verwendet werden; diese Kanäle können nahezu jede Form annehmen. Die Elektronensprühionenquelle (nicht gezeigt) ist vorzugsweise über eine Schnittstelle mit einem Massenspektrometer (nicht gezeigt) zur Bestimmung des zu bestimmenden Stoffs verbunden. Nach dem Auslesen eines Bereichs (z.B. einer individuellen Wechselwirkung) kann die Probenentnahmesonde 200 oder 250 von der Arrayfläche gelöst und unter Steuerung eines Computers (z.B. 135 und 155 in 1) zum nächsten Bereich vorrücken, wo sich der Prozess wiederholt. Bei einer geeigneten Abtastrate kann die Verbindung zwischen Fluid und Oberfläche aufrechterhalten werden und mit der Sonde 200 mitwandern. Dies erleichtert das Auslesen einer Dünnschichtchromatographieplatte (TLC = thin layer chromatography).
Bei jeder Sonde 200 oder 250 können die Wechselwirkungen der Proteine, die Schritte des Waschens, und die Schritte der Unterbrechung der Wechselwirkung bzw. der Elution jeweils an einem bestimmten Arraybereich stattfinden, indem die jeweiligen Reagenzien nacheinander durch die Probenentnahmesonde zum Bereich befördert werden. So können zum Beispiel zur Immobilisierung Proteine zuerst auf ein auf dem Array befindliches Einfangmaterial übertragen werden, gefolgt von einem Waschzyklus, an den sich der Schritt mit dem Herausspülen mittels der Elutionslösung anschließt.
Jeder Bereich könnte mehr als einmal getestet werden, und zwar mit demselben Agens oder mit verschiedenen, miteinander in Wechselwirkung stehenden Agenzien. Außerdem könnte die Analyse auch auf einem "trockenen" Array stattfinden, während sie aber in einer flüssigen Umgebung über dem Baustein leicht zu bewerkstelligen ist.
Mit erneutem Bezug zu 1 wird ein Massenspektrometer 150, das eine Elektronensprühvorrichtungsschnittstelle 148 umfasst, vorzugsweise dazu verwendet, die interagierenden Arten zu bestimmen, die es von der ES-Ionenquelle 145 erhält. Dies lässt sich anhand der Molekülmasse allein bewerkstelligen, oder durch eine Tandem-Massenspektrometrieanalyse. Die Tandem-Massenspektrometrie von ganzen Proteinen, die durch eine hohe Auflösung, genaue Massenbestimmungen oder durch Technologien aus der Ion/Ion-Chemie begünstigt werden kann, kann zur Erzeugung von Sequenzmarkern verwendet werden, die der Proteinbestimmung über eine online stattfindende Datenbanksuche dient.
Die Peptidbestimmung aus einem eiweißspaltenden Aufschlussvorgang kann in Kombination mit einer nachfolgenden Protein-Datenbanksuche ein leistungsfähiges Werkzeug für die Bestimmung einzelner Proteine aus komplexen Mischungen sein. Dies ist die typische Vorgehensweise, die für eine positive Proteinbestimmung mit einem über MALDI-MS erfolgenden Auslesevorgang eines Bausteins verwendet wird. Dieser Vorgang kann jedoch eine bis mehrere Stunden in Anspruch nehmen. Der hier beschriebene Lösungsansatz bietet schnelle (Analysezeit < 1 sec), über die Gasphase arbeitende Mittel zur Erlangung der Proteinbestimmungsdaten.
Eine Mehrfachladung der Proteine bei ES-MS erleichtert die Dissoziation von Ionen großer Masse und gestattet die Bestimmung von Strukturdaten über die Analyse der Dissoziationsprodukte. Somit werden keine enzymatischen Aufschlussvorgänge benötigt. Produkt-Ionen, die einer Fragmentierung von intakten Proteinen entstammen und aussagefähig bezüglich der Sequenz sind, können in den Produkt-Ionenspektren bestimmt werden, die analog zu den "Sequenzmarkern" sind, die von Mann et al [1] beschrieben wurden, und aus der kollisionsbedingten Aktivierung von proteolytischen Aufschlussfragmenten heraus entstehen. Bei MALDI-MS tragen Protein-Ionen fast ausschließlich eine Einfachladung. Von daher sind dieselben Verfahrensweisen nicht uneingeschränkt möglich.
Die Mehrfachladung der Stammprotein-Ionen verkompliziert das durch die Tandem-Massenspektrometrie erhaltene Produkt-Ionenspektrum, weil sich Ladungszustände des Produkt-Ions von eins bis hin zum Zustand des Stammproteins ändern können. Das Produkt-Ionenspektrum setzt sich deshalb typischerweise aus Ionen unterschiedlicher Masse und Ladung zusammen. Die Fähigkeit zur Überwindung dieser Komplikation liegt in der Messung der Masse-Ladungs-Abstände zwischen zwei oder mehr Ionen. Dies lässt sich beispielsweise durch eine bei hoher Auflösung präzise arbeitende Geräteausstattung zur Feststellung der Masse bewerkstelligen, wie dies bei der FTMS-Instrumentierung geleistet wird, oder über eine Ion/Ion-Protonen-Transferchemie. Im letzteren Fall wird die Gesamtheit der Produkt-Ionen Ion/Ion-Reaktionen unterworfen, was zu einem Produkt-Ionenspektrum führt, bei dem einfach geladene Ionen dominieren und sich der m/z-Abstand zwischen Scheitelwerten leichter messen lässt.
Es wurde eine als Prototyp ausgeführte Probenentnahmesonde gebaut und getestet, bei der das Konzept der Fluidverbindung 250 verwendet wurde. Bilder des eigentlichen Versuchsaufbaus sind in 3 gezeigt. Als grundsätzlicher Beweis für die Wirksamkeit wurde das Protein Apomyoglobin erfolgreich von der Oberfläche eines Glas-Mikroskopobjektträgers als Probe entnommen. Eine Probe von 0,5 pmol des in Lösung befindlichen Proteins wurde punktweise auf quadratische Flächen (1 mm × 1 mm) eines Objektträgers aufgetragen, der mit einem Gitternetz aus Polytetrafluorethylen überzogen war, worauf man sie trocknen ließ. Die durch Herausspülen zum Massenspektrometer beförderte Proteinprobe erzeugte einen Einzelimpuls. Am Ende des Einzelimpulses wurde die Son de von der Oberfläche abgehoben, zum nächsten Bereich verfahren, und der Spül- bzw. Elutionsvorgang wurde wiederholt.
4 zeigt Einzelimpulsverläufe, die für das Herausspülen des Proteins aus 4 verschiedenen Bereichen auf dem Objektträger aufgezeichnet wurden. Das zur Erzeugung dieses Signals überwachte Signal war dasjenige des mehrfach geladenen Proteins, das eine Ladung von 15 Protonen trug, d.h. (M + 15H)⁺ bei m/z 1131,2.
Es ist vorauszuschicken, dass bei Einsatz des beschriebenen Systems 100 das Auslesen einer einzelnen Arrayposition mit einem typischen Massenspektrometer ca. 30 sec. benötigt, oder ca. 50 Minuten für einen Baustein-Array in der Größe 10 × 10 (100 Bereiche). Dies entspricht ungefähr dem Zeitrahmen für die in 4 gezeigte Elution. Im Vergleich zur theoretischen Zeit zum Auslesen eines Arrays mittels MALDI-MS (8,3 min. oder ca. 5 sec./Bereich) ist diese Auslesezeit relativ lang. Betrachtet man jedoch die Zeit, die der bei MALDI-MS erforderliche enzymatische Aufschluss benötigt und im Bereich von einer bis hin zu mehreren Stunden liegt, dann ist diese Auslesezeit sehr konkurrenzfähig. Die Auslesezeit variiert je nach der elektrischen Verschaltung der ES-Ionenquelle. Ein Großteil der Auslesezeit entsteht aus der Notwendigkeit heraus, die Probe durch Spülvorgänge durch die Transportleitungen von der Probenoberfläche zum Massenspektrometer zu führen, und die Leitungen zu waschen, um einen Materialübertrag zwischen Analysepositionen auf dem Array zu verhindern. Der minimale probenbezogene Durchsatz beim Auslesen liegt wahrscheinlich bei ca. 1,0 μl/min.
Um ein Beispiel zu geben, kann zur Optimierung der in 2(b) gezeigten Fluidverbindungssonde 200 eine 10 cm lange Kapillare mit einem Innendurchmesser von 50 μm verwendet werden, was ein geringes Volumen von ca. 0,2 μl ergibt. Bei 1,0 μl/min braucht es nur 12 sec., um das Volumen zu spülen. Im Allgemeinen werden mehrere Elutionsvolumina vonnöten sein, um die Probe durch Elution vollständig herauszubekommen und die Probenentnahmekapillare zu säubern. Die Reinigungszeit und somit auch die Auslesezeit kann verkürzt werden, indem der Lösungsmitteldurchsatz erhöht wird, sobald die Proteine herausgespült sind.
Wie zuvor angemerkt, wird bei der Ion/Ion-Protonen-Transferchemie der Gesamtbestand an Produkt-Ionen Ion/Ion-Reaktionen unterworfen, wobei ein Produkt-Ionenspektrum entsteht, in dem einzeln gela dene Ionen allgemein dominieren und die m/z-Abstände zwischen Scheitelwerten leichter zu messen sind. Der Beweis für die Machbarkeit des auf der Ion/Ion-Protonen-Transferchemie beruhenden Lösungsansatzes zur Proteinbestimmung wurde kürzlich bei der Bestimmung von Bakteriophagen MS2 in einem Lysat mit Escherichia coli erbracht [2]. Der Einsatz von Sequenzmarkern, die durch die kollisionsbedingte Aktivierung der mehrfach geladenen Ionen des intakten, viralen Hüllproteins in einer komplexen Matrix erzeugt wurden (mit darauf folgenden Ion/Ion-Protonen-Transferreaktionen zur Erzeugung von leicht zu interpretierenden Massenspektren einfach geladener Produkt-Ionen), konnte das Vorhandensein des MS2-Virus leicht über eine Datenbanksuche bestätigt werden. Dies ist mittels der Daten in 5 dargestellt. Wie in 5 zu sehen ist, ist eine Vielzahl von zerlegbaren Sequenzmarkern in Form von Aminosäurefragmenten mit verschiedenen m/z-Abständen gezeigt. Mittels der Erfindung lässt sich dieselbe Datenqualität mit einem von einem Protein stammenden Signalverlauf erhalten, der sich aus dem Transport der Proteine von der Bausteinoberfläche zum Massenspektrometer erzeugen lässt.
Die zusammen mit einer Probenentnahmesonde arbeitende ES-MS-Technologie sollte mit nahezu jeder Art von Protein-Einfangarrays kompatibel sein, etwa mit denen, die kurze Peptide verwenden, intakte Proteine oder Proteinfragmente, in Frage kommende Stoffe für Arzneimittel, DNA oder Antikörper. Diese könnten auf handelsüblichem Wege erhalten oder unter Einsatz dieser Probenentnahmetechnologie unternehmensintern hergestellt werden.
Während die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung dargestellt und beschrieben wurden, sollte klar sein, dass die Erfindung nicht darauf beschränkt ist. Dem Fachmann werden sich zahlreiche Modifikationen, Änderungen, Abweichungen, Ersetzungen und äquivalente Lösungen ergeben, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen, wie er in den Ansprüchen beschrieben ist.
LITERATURHINWEISE:

1. Mann, M.; Wilm, M. "Error-Tolerant Identification of Peptides in Sequence Databases by Peptide Sequence Tags", Anal. Chem. 1994, 66, 4390–4399.
2. Cargile, B. J.; McLuckey, S. A.; Stephenson, Jr. J. L. "Identification of Bacteriophage MS2 Coat Protein from E. Coli Lysates via Ion Trap Collisional Activation of Intact Protein Ions", Anal. Chem. 2001, 73, 1277–1285.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von zu bestimmenden Stoffen, die sich auf oder in flächigen Anordnungen befinden, folgende Schritte umfassend: Bereitstellen einer flächigen Anordnung (120) mit einer Vielzahl von Anordnungsbereichen (120), wobei die Bereiche wenigstens einen zu bestimmenden Stoff enthalten, und Bereitstellen wenigstens einer Probenentnahmesonde (130, 200, 250) mit einem Einlass und einem Auslass; Einleiten wenigstens einer Elutionslösung in einen jeweiligen der Bereiche (210) durch den Einlass der Probenentnahmesonde (130, 200, 250), wobei die Lösung zumindest einen Teil des zu bestimmenden Stoffes von dem Bereich (210) weg und durch den Auslass der Sonde (130) mitführt; Ionisieren wenigstens eines Teils des mitgeführten, zu bestimmenden Stoffes zu einer Vielzahl von Ionenfragmenten mittels einer Elektrosprühionenquelle (145); Analysieren der Vielzahl von Ionenfragmenten zur Bestimmung des zu bestimmenden Stoffes; und automatisches Vorrücken zu wenigstens einem weiteren aus der Vielzahl von Bereichen (210) und Wiederholen der Schritte des Einleitens, Ionisierens und Analysierens.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Analysierens eine Massenspektrometrie beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Massenspektrometrie eine Massenspektrometrie in Tandemanordnung beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Einleitens darüber hinaus umfasst, vor dem Einleiten der Elutionslösung eine Waschlösung einzuleiten.
Verfahren nach Anspruch 1, darüber hinaus den Schritt umfassend, vor dem Einleiten der Elutionslösung zumindest ein Reagens in den Bereich (210) einzuleiten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Elutionslösung und der zu bestimmende Stoff unter dem Einfluss von Überdruck durch die Sonde (130, 200, 250) geleitet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sonde eine mehrachsige Fluidverbindungssonde (250) umfasst, die mit dem Bereich (210) mittels einer Fluidbrücke (255) in Berührung steht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sonde eine mehrachsige Oberflächenkontaktsonde (200) umfasst, die dazu ausgelegt ist, um einen Umfang des Bereichs (210) herum eine dichte Umschließung zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Oberflächenkontaktsonde (200) zur Bildung der dichten Umschließung eine O-Ring-Dichtung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zu bestimmenden Stoffe wenigstens einen umfassen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus intakten Proteinen, Proteinfragmenten, Arzneimitteln und Antikörpern besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei für den Schritt des automatischen Vorrückens eine Positionierungsvorrichtung (125) verwendet wird, die an einer im Wesentlichen flachen Oberfläche eine Positionssteuerung in der x-, y- und z-Achse bereitstellt, und zwar mit einer Auflösung von mindestens 1 nm für jede der Achsen x, y und z.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Positionierungsvorrichtung (125) eine piezoelektrische Positionierungsvorrichtung und eine Steuereinheit eines elektrochemischen Mikroskops mit Tastsonde (SECM) (165) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren dazu ausgelegt ist, an Bereichsflächen von kleiner als ca. 0,04 mm² Proben zu nehmen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die flächige Anordnung (120) wenigstens eine umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Protein-Array, Dünnschichtchromatographieplatten, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (wird als SDS PAGE bezeichnet), isoelektrischen Fokussierungsgelen und Feststoffextraktionsmaterialien besteht.
Automatisiertes Probenentnahmesystem zum Erhalt von Proben von flächigen Anordnungen (120) zur Analyse, wobei die flächige Anordnung (120) eine Vielzahl von Bereichen (210) aufweist, Folgendes umfassend: wenigstens eine Sonde (130, 200, 250), die einen Einlass hat, um in jeweilige Bereiche (210) wenigstens eine Elutionslösung einzuleiten, wobei die Bereiche wenigstens einen zu bestimmenden Stoff enthalten, und die Sonde darüber hinaus einen Auslass hat, um den zu bestimmenden Stoff von den Bereichen wegzuführen, ein automatisches Positionierungssystem (125) zum Versetzen der Sonde relativ zu den Bereichen, um eine Probenentnahme an einem beliebigen Bereich zu gestatten; eine Elektrosprühionenquelle (145) mit einem Eingang, der mit der Sonde in Fluidverbindung steht, um den zu bestimmenden Stoff aufzunehmen und aus dem zu bestimmenden Stoff Ionen zu erzeugen; und einen Analyseaufbau für die Ionen, wobei der Analyseaufbau die Ionen für die Elektrosprühionenquelle (145) aufnimmt.
System nach Anspruch 15, wobei der Analyseaufbau ein Massenspektrometer (150) beinhaltet.
System nach Anspruch 15, wobei der Analyseaufbau ein Massenspektrometer (150) in Tandemanordnung beinhaltet.
System nach Anspruch 15, wobei die Elutionslösung und der zu bestimmende Stoff unter dem Einfluss von Überdruck durch die Sonde (130, 200, 250) geleitet werden.
System nach Anspruch 15, wobei die Sonde eine mehrachsige Fluidverbindungssonde (250) umfasst, die mit den Bereichen (210) mittels einer Fluidbrücke (255) in Berührung steht.
System nach Anspruch 15, wobei die Sonde eine mehrachsige Oberflächenkontaktsonde (200) umfasst, die dazu ausgelegt ist, um einen Umfang der Bereiche (210) herum eine dichte Umschließung zu bilden.
System nach Anspruch 20, wobei die Oberflächenkontaktsonde (200) zur Bildung der dichten Umschließung eine O-Ring-Dichtung umfasst.
System nach Anspruch 15, wobei die zu bestimmenden Stoffe wenigstens einen umfassen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus intakten Proteinen, Proteinfragmenten, Arzneimitteln und Antikörpern besteht.
System nach Anspruch 15, wobei das automatische Positionierungssystem (125) an einer im Wesentlichen flachen Oberfläche eine Positionssteuerung in der x-, y- und z-Achse bereitstellt, und zwar mit einer Auflösung von mindestens 1 nm für jede der Achsen x, y und z.
System nach Anspruch 23, wobei das automatische Positionierungssystem (125) eine piezoelektrische Positionierungsvorrichtung und eine Steuereinheit eines elektrochemischen Mikroskops mit Tastsonde (SECM) (165) umfasst.
System nach Anspruch 15, wobei die flächige Anordnung (120) wenigstens eine umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Protein-Array, Dünnschichtchromatographieplatten, SDS-PAGE, isoelektrischen Fokussierungsgelen und Feststoffextraktionsmaterialien besteht.
System nach Anspruch 15, wobei das System dazu ausgelegt ist, an Bereichsflächen von kleiner als ca. 0,04 mm² Proben zu nehmen.
System nach Anspruch 15, wobei das System dazu ausgelegt ist, an Bereichsflächen von kleiner als ca. 0,01 mm² Proben zu nehmen.
Mehrachsiger Probenentnahmesonde (200) zum Erhalt von Proben von einer flächigen Anordnung aus zur Analyse vorgesehenen Bereichen, Folgendes umfassend: einen Einlass zum Einleiten wenigstens einer Elutionslösung in jeweilige Bereiche aus einer Vielzahl von Bereichen, wobei die Bereiche wenigstens einen zu bestimmenden Stoff enthalten, und einen Auslass, um den zu bestimmenden Stoff von den Bereichen wegzuführen, wobei die Sonde eine Oberflächenkontaktsonde (200) zur Bildung einer dichten Umschließung um einen Umfang der Bereiche ist.
Sonde nach Anspruch 28, wobei die Sonde (200) dazu ausgelegt ist, den zu analysierenden Stoff und die Elutionslösung unter dem Einfluss von Überdruck durch die Sonde strömen zu lassen.
Sonde nach Anspruch 28, wobei die Sonde (200) zur Bildung der dichten Umschließung eine O-Ring-Dichtung umfasst.