BRPI0314258B1

BRPI0314258B1 - Sequência de ácido nucleico, fragmento de dna, molécula de dna recombinante, vetor, célula hospedeira microbiana, uso dos mesmos, vacina para combater infecção por ostertagia ostertagi, método para a preparação de uma vacina, e, kit diagnóstico

Info

Publication number: BRPI0314258B1
Application number: BRPI0314258-2A
Authority: BR
Inventors: Peter Geldhof; Isabel Vercauteren; Edwin Claerebout; Jozef Vercruysse; Veerle De Maere
Original assignee: Universiteit Gent
Priority date: 2002-09-13
Filing date: 2003-09-11
Publication date: 2019-07-09
Also published as: WO2004024769A2; DE60320425T2; US20040052817A1; AU2003270190A1; CA2498249A1; WO2004024769A3; US20100209446A1; US8227584B2; DE60320425D1; EP1539820B1; US7264812B2; CA2498249C; US7718179B2; ES2304526T3; EP1539820A2; US20090028892A1; AR041243A1; NZ542733A; BR0314258A; ATE392435T1

Abstract

"sequência de ácido nucleico fragmento de dna, molécula de dna recombinante, veículo recombinante vivo, célula hospedeira, proteína de ostertagia ostertagi ou um fragmento imunogênico da dita proteína uso vacina para combater a infecção por ostertagia ostertagi, método para a preparação de uma vacina e kit de diagnóstico". a presente invenção diz respeito a seqüências de ácido nucleico que codificam proteínas do ostertagia ostertagi e às partes de tais seqüências de ácido nucleico que codificam um fragmento imunogênico de tais proteínas, e aos fragmentos de dna, moléculas de dna recombinantes, portadores recombinantes vivos e células hospedeiras que compreendem tais seqüências de ácido nucleico ou tais partes destes. a invenção também diz respeito às proteínas de ostertagia ostertagi e partes imunogênicas destas codificadas por tais seqüências. além disso, a presente invenção diz respeito às vacinas que compreendem tais sequências de ácido nucleico e partes destas, fragmentos de dna, moléculas de dna recombinantes, portadores recombinantes vivos e células hospedeiras que compreendem tais seqüências de ácido nucleico ou tais partes destas, proteínas ou partes imunogênicas destas e anticorpos contra tais proteínas ou partes imunogênicas destas. também, a invenção diz respeito ao uso das ditas proteínas em vacinas e para a fabricação de vacinas. além disso, a invenção diz respeito ao uso de seqüências de ácido nucleico, proteínas ou anticorpos auxiliares com os propósitos de diagnóstico ou vacinação. finalmente a invenção diz respeito a kits de diagnóstico que compreendem tais ácidos nucleicos, proteínas ou anticorpos contra tais proteínas.

Description

“SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, FRAGMENTO DE DNA, MOLÉCULA DE DNA RECOMBINANTE, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA, USO DOS MESMOS, VACINA PARA COMBATER INFECÇÃO POR OSTERTAGIA OSTERTAGI, MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA VACINA, E, KIT DIAGNÓSTICO”

A presente invenção diz respeito às sequencias de ácido nucleico que codificam as proteínas de Ostertagia ostertagi, às partes de tais sequencias de ácido nucleico que codificam um fragmento imunogênico de tais proteínas, aos fragmentos de DNA, moléculas recombinantes de DNA, carregadores recombinantes vivos e célula hospedeiras que compreendem tais sequencias de ácido nucleico ou tais partes destas. A invenção também diz respeito às proteínas de Ostertagia ostertagi e partes imunogênicas destas codificadas por tais sequencias. Além disso, a presente invenção diz respeito às vacinas que compreendem tais sequencias de ácido nucleico e partes destas, fragmentos de DNA, moléculas recombinantes de DNA, carregadores recombinantes vivos e célula hospedeiras que compreendem tais sequencias de ácido nucleico ou tais partes destas, proteínas ou partes imunogênicas destas e anticorpos contra tais proteínas ou partes imunogênicas destas. Também, a invenção diz respeito ao uso das ditas proteínas em vacinas e quanto à fabricação de vacinas. Além disso, a invenção diz respeito ao uso das ditas sequencias de ácido nucleico, proteínas ou anticorpos para os propósitos de diagnóstico ou vacinação. Finalmente a invenção diz respeito aos kits de diagnóstico que compreendem tais ácidos nucleicos, proteínas ou anticorpos contra tais proteínas.

Existem cerca de 82 milhões de cabeças de gado na UE e cerca de 97 milhões nos EUA a maior parte das quais está exposta à infecção com nematóides gastrointestinais no pasto, com eficiência de produção resultante,

	2 ' freqüentemente substancial, prejudicada. O mais comum e o mais patogênico destes nematóides é Ostertagia ostertagi, que infecta o abomaso do gado. A síndrome da doença causada pelos nematóides gastro-intestinais, habitualmente aludidos como gastro-enterite parasítica (PGE), drasticamente
5	diminui a viabilidade econômica de unidades de produção de gado (Kloosterman, A. et al., Parasitology Today 8, 330 a 335 (1992); Vercruysse,
«	J. e Claerebout, E., Veterinary Parasitology 98, 195 a 214 (2001)). Os animais mais em risco à PGE são bezerros durante a sua primeira estação de pastoreação. A PGE clínica em bezerros no pastoreio é caracterizada pela
•	diarréia (aquosa), perda de peso, um revestimento piloso sem brilho, anorexia, uma perda geral de condição e eventualmente morte (Anderson, N. et al., Veterinary Record 41, 196 a 204 (1965); Hilderson, H. et al., Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 56, 269-29 (1987)). Entretanto, as perdas de produção são principalmente devido às infecções sub-clínicas, sem nenhum
15	sinal manifesto de doença. As reduções substanciais no ganho de peso diário são observadas em bezerros na primeira estação de pastoreação não tratados com infecções sub-clínicas (Shaw D. J., et al., Veterinary Parasitology 75, 115 a 131 (1998). Vacas adultas podem ainda abrigar grandes quantidades de O. ostertagi (por exemplo, Borgsteede, F. Η. M., et al., Veterinary
®ο	Parasitology 89, 287 a 296 (2000); Agneessens, J. et al., Veterinary Parasitology 90, 83 a 92 (2000)). Embora as infecções por nematóide gastrointestinais em vacas adultas sejam usualmente sub clínicas, elas estão associadas com os níveis diminuídos de produção de leite (Gross, S. J. et al., Veterinary Record 144, 581 a 587 (1999)). A qualidade da carcassa também é
25	afetada pelas infecções por nematóides gastrointestinais, com peso de carcassa reduzido, porcentagem de animais abatidos e medidas de carcassa relacionadas (Entrocasso, C. M. et al., Research in Veterinary Science 40, 76 a 85 (1986)). O controle de PGE na Europa está fundamentado com base quase exclusivamente no uso de medicamentos antielmínticos (Vercruysse, J.

e Domy, P., Intemational Joumal for Parasitology 29, 165 a 175 (1999)). Entretanto, o uso aumentado de antielmínticos no gado nas duas décadas passadas (Borgsteede, F. Η. M. et al., Veterinary Parasitology 78, 23 a 36 (1998); Schnieder, T. et al., Veterinary Record 145, 704 a 706 (1999); Claerebout, E. et al., Waams Dierigeneaskundig rodschrfft 69, 108 a 115 (2000)) tem diversas desvantagens. O alto custo dos tratamentos antielmínticos, o efeito negativo de tratamentos antielmínticos preventivos sobre o desenvolvimento da imunidade natural contra nematóides gastrointestinais (Vercruysse, J. et al., Parasitology Today 10, 129 a 132 (1994); Claerebout, E. e Vercruysse J., Le Point Vétérinaire (Número especial) 26, 175 a 179 (1997)), os conceitos de consumo com respeito aos resíduos de medicamento em produtos alimentícios e no ambiente (Wall, R. e Strong, L., Nature 327, 418 a 421 (1987); Steel, J. W. Em: NRA Special Review of Macrocyclic Lactones, National Registration Authority for Agricultural and Veterinary Chemicals, Canberra. (1998); Strong, L., Veterinary Parasitology 48, 3 a 17 (1993)) e, o último, mas não o menos importante, a incidência aumentada de resistência dos parasitas aos antielmínticos disponíveis (Vermunt, J. J., et al., Veterinary Record 137, 43 a 45 (1995); Vermunt, J. J. et al., New Zealand Veterinary Joumal 44, 188 a 193 (1996); Coles, G. C. et al., Veterinary Record 142, 255 e 256 (1998); Gil, J. H. e Lacey, E., Intemational Joumal for Parasitology 28, 863 a 877 (1998); e Fiel, C. A. et al., Revista de Medicina Veterinária (Buenos Aires) 81, 310 a 315 (2000)) são incentivos fortes para que o produtor adote sistemas de controle alternativos (Vercruysse & Domy (1999), supra). A vacinação está sendo considerada como a solução mais praticável (Knox, D. P., Parasitology 120, S43 a S61 (2000)). Entretanto, a despeito da evolução na biotecnologia que permite o desenvolvimento de vacinas de ‘nova geração’ com base na tecnologia de DNA recombinante, nenhuma vacina contra parasitas nematóides gastrointestinais são disponíveis até agora. Os problemas

principais que dificultam o desenvolvimento de vacinas contra nematóide em ruminantes são (1) a maior parte dos antígenos parasíticos que foram selecionados para o desenvolvimento de vacina são ‘antígenos escondidos’, isto é antígenos que não são reconhecidos pelo hospedeiro durante uma infecção natural. Consequentemente, a resposta imune que é gerada pela vacinação com estes antígenos não é reforçada por uma re-infecção natural; (2) as proteínas nematóides recombinantes que induzem uma resposta imune protetiva não foram até agora encontradas.

É um objetivo da presente invenção fornecer polipeptídeos que

são capazes de contribuir para a proteção contra os efeitos patogênicos da infecção pelo Ostertagia ostertagi no gado.

Foi agora surpreendentemente descoberto que 7 polipeptídeos diferentes podem ser especificamente identificados e isolados, cada um destes polipeptídeos diferentes sendo capazes de induzir uma resposta imune contra parasitas de Ostertagia. Os inventores descobriram que estes polipeptídeos podem ser usado, sozinhos ou em combinação entre si, como componentes de vacina para fornecer uma vacina, que de fato contribua para a proteção contra a infecção pelo Ostertagia ostertagi no gado e ajude a diminuir o dano

causado pelo Ostertagia ostertagi.

Três métodos diferentes foram usados para a detecção dos genes que codificam os componentes de vacina de acordo com a invenção.

Um método, apresentado em detalhes no Exemplo 1, usa antissoro de coelho anti-proteína excretora-secretora especificamente preparado para a detecção de genes que codificam proteínas de Ostertagia ostertagi imunorreativas. Este método tem levado à descoberta de cinco novas proteínas imunogênicas para as quais as seqüências codificadoras são representadas na SEQ ID NO: 1, 3, 5, e 9 como dado abaixo.

O gene que codifica uma tal proteína foi agora clonado e seqüenciado e uma sequência de ácido nucleico do gene que compreende

	determinantes imunogênicos é representado na SEQ ID NO: 7. O gene de tamanho natural codifica uma proteína de cerca de 1600 aminoácidos (como parcialmente representado na SEQ ID NO: 8) com uma massa molecular de > 200 kD.
5	É bem conhecido na técnica, que muitas seqüências de ácido
• ♦	nucleico diferentes podem codificar uma e a mesma proteína. Este fenômeno
	é habitualmente conhecidos como oscilação na segunda e especialmente na terceira base de cada tripleto que codifica um aminoácido. Este fenômeno pode resultar em uma heterologia para duas seqüências de ácido nucleico
r	codificando ainda a mesma proteína. Portanto, em princípio, duas seqüências de ácido nucleico tendo uma homologia de seqüência tão baixa quanto 70 % pode ainda codificar uma e a mesma proteína. Assim, uma forma de uma primeira forma de realização da presente invenção diz respeito a uma seqüência de ácido nucleico que codifica
15	uma proteína do Ostertagia ostertagi ou uma parte da dita seqüência de ácido nucleico que codifica um fragmento imunogênico da dita proteína em que a dita seqüência de ácido nucleico ou a dita parte desta tem pelo menos 85 % de homologia com a seqüência de ácido nucleico do gene da proteína de
·>	Ostertagia ostertagi como representado na SEQ ID NO: 7. O conceito de fragmentos imunogênicos é definido abaixo. O comprimento de uma seqüência de ácido nucleico que codifica um fragmento imunogênico é usualmente de pelo menos 21 nucleotídeos, mas preferivelmente 24, 27, 30, 33 ou mesmo 36 nucleotídeos. O peso molecular de todas as proteínas de acordo com a
25	invenção é determinado na eletroforese em gel em um gel de poliacrilamida. Devido à pouca variabilidade da determinação de peso molecular ffeqüentemente encontrada na técnica, o peso molecular pode variar. Portanto o peso molecular das proteínas de acordo com a invenção deve ser interpretado como sendo o seu peso molecular teórico ± 5 kD.

1»

Preferivelmente, uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção que codifica esta proteína de Ostertagia ostertagi ou uma parte desta seqüência de ácido nucleico que codifica um fragmento imunogênico desta proteína tem pelo menos 90 %, preferivelmente 93 %, 5 mais preferivelmente 95 % de homologia com a seqüência de ácido nucleico do gene da proteína de Ostertagia ostertagi como representado na SEQ ID NO: 7.

Ainda mais preferido é um nível de homologia de 98 %, 99 % ou mesmo 100 %.

O nível de homologia de nucleotídeo pode ser determinado com o programa de computador “BLAST 2 SEQUENCES” selecionando-se o sub-programa: “BLASTN” que pode ser encontrado em www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html.

Uma referência para este programa é Tatiana A. Tatusova,

Thomas L. Madden, FEMS MicroBiol. Letters 174, 247 a 250 (1999). Os parâmetros usado são os parâmetros de default:

Premiação para um emparelhamento: +1.

Penalidade para um desemparelhamento: -2.

Intervalo de abertura: 5.

Intervalo de extensão: 2.

X_queda de Intervalo: 50.

As seqüências de nucleotídeo que são complementares à seqüência representada na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ou 13, aqui descrita ou as seqüências de nucleotídeos que compreendem séries em tandem das 25 seqüências de acordo com a invenção, também estão dentro do escopo da invenção.

Uma outra forma desta forma de realização diz respeito a uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína de 28 kD de Ostertagia ostertagi ou um parte da dita seqüência de ácido nucleico que codifica um fragmento imunogênico da dita proteína em que a dita seqüência de ácido nucleico ou a dita parte desta tem pelo menos 85 % de homologia com a seqüência de ácido nucleico do gene da proteína Ostertagia ostertagi como representada na SEQ ID NO: 3.

Preferivelmente, uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção que codifica esta proteína de Ostertagia ostertagi ou uma parte desta seqüência de ácido nucleico que codifica um fragmento imunogênico desta proteína tem pelo menos 90 %, preferivelmente 93 %, mais preferivelmente 95 % de homologia com a seqüência de ácido nucleico do gene da proteína de Ostertagia ostertagi como representado na SEQ ID NO: 3.

Ainda mais preferido é um nível de homologia de 98 %, 99 % ou mesmo 100 %.

Ainda em uma outra forma desta forma de realização diz respeito a uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína de 25 kD de Ostertagia ostertagi ou uma parte da dita seqüência de ácido nucleico que codifica um fragmento imunogênico da dita proteína em que a dita seqüência de ácido nucleico ou a dita parte desta tem pelo menos 85 % de homologia com a seqüência de ácido nucleico do gene da proteína de Ostertagia ostertagi como representada na SEQ ID NO: 5.

Preferivelmente, uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção que codifica esta proteína de Ostertagia ostertagi ou uma parte desta seqüência de ácido nucleico que codifica um fragmento imunogênico desta proteína tem pelo menos 90 %, preferivelmente 93 %, mais preferivelmente 95 % de homologia com a seqüência de ácido nucleico do gene da proteína de Ostertagia ostertagi como representada na SEQ ID NO: 5.

Ainda mais preferido é um nível de homologia de 98 %, 99 % ou mesmo 100%.

	Novamente uma outra forma desta forma de realização diz respeito a uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína de 31 kD de Ostertagia ostertagi ou uma parte da dita seqüência de ácido nucleico que codifica um fragmento imunogênico da dita proteína em que a dita
5 • «I	seqüência de ácido nucleico ou a dita parte desta tem pelo menos 85 % de homologia com a seqüência de ácido nucleico do gene da proteína de
*	Ostertagia ostertagi como representada na SEQ ID NO: 1. Preferivelmente, uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção que codifica esta proteína de 31 kD de Ostertagia ostertagi
e°	ou uma parte desta seqüência de ácido nucleico que codifica um fragmento imunogênico desta proteína tem pelo menos 90 %, preferivelmente 93 %,
ϊ I	mais preferivelmente a mesma tem pelo menos 85 % de homologia com a seqüência de ácido nucleico do gene da proteína de Ostertagia ostertagi como representada na SEQ ID NO: 13.
15	Preferivelmente, uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção que codifica esta proteína de Ostertagia ostertagi ou uma parte desta seqüência de ácido nucleico que codifica um fragmento imunogênico desta proteína tem pelo menos 90 %, preferivelmente 93 %, mais preferivelmente 95 % de homologia com a seqüência de ácido nucleico
•ο	do gene da proteína de Ostertagia ostertagi como representada na SEQ ID NO: 13. Ainda mais preferido é um nível de homologia de 98 %, 99 % ou mesmo 100 %. Visto que a presente invenção divulga seqüências de ácido
25	nucleico que codificam novas proteínas de Ostertagia ostertagi, é agora pela primeira vez possível obter estas proteínas em quantidades suficientes. Isto por exemplo, pode ser feito usando-se sistemas de expressão para expressar o todo ou partes dos genes que codificam a proteínas ou fragmento imunogênicos destas de acordo com a invenção.

	Portanto, em uma forma mais preferida desta forma de realização a invenção diz respeito a fragmentos de DNA que compreendem uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção. Um fragmento de DNA é um trecho de nucleotídeos que funciona como um carregador para
5	uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção. Tais fragmentos
«	de DNA podem ser, por exemplo, plasmídeos, nos quais uma seqüência de
F	ácido nucleico de acordo com a invenção é clonada. Tais fragmentos de DNA são por exemplo, úteis para realçar a quantidade de DNA para o uso como um iniciador e para a expressão de uma seqüência de ácido nucleico de acordo
	com a invenção, como descrito abaixo. Uma exigência essencial para a expressão da seqüência de ácido nucleico é um promotor adequado funcionalmente ligado à seqüência de ácido nucleico, de modo que a seqüência de ácido nucleico esteja sob o controle do promotor. É óbvio para aqueles habilitados na técnica que a
15	escolha de um promotor estenda-se a qualquer promotor eucariótico, procariótico ou viral capaz de direcionar a transcrição do gene nas células usadas como células hospedeiras para a expressão da proteína. Portanto, uma forma ainda mais preferida desta forma de realização diz respeito a uma
	molécula de DNA recombinante que compreende um fragmento de DNA e/ou uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção em que a seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção é colocada sob o controle de um promotor fúncionalmente ligado. Isto pode ser obtido por exemplo, por meio de técnicas da biologia molecular padrão, por exemplo, Sambrook & Russell: “Molecular cloning: a laboratory manual” (2001), Cold
25	Spring Harbor Laboratory Press; ISBN: 0879695773. Os promotores funcionalmente ligados são promotores que são capazes de controlar a transcrição das seqüências de ácido nucleico aos quais eles estão ligados. Um tal promotor pode ser o promotor nativo de um novo gene de acordo com a invenção ou um outro promotor de Ostertagia

ostertagi, contanto que este promotor seja funcional nas células usadas para a expressão. Ele também pode ser um promotor heterólogo. Quando as células hospedeiras são bactérias, seqüências de controle de expressão úteis, que pode ser usadas, incluem o promotor e operador Trp (Goeddel, et al., Nucl. Acids 5 Res., 8, 4057 (1980)); o promotor e operador iac (Chang, et al., Nature, 275,

615 (1978)); o promotor da proteína da membrana externa (Nakamura, K. e Inouge, Μ., EMBO J., 1, 771 a 775 (1982)); os promotores e operadores de bacteriofago lambda (Remaut, E. et al., Nucl. Acids Res., 11, 4677 a 4688 (1983)); o promotor e operador da ot-amilase (B. subtilis'), seqüências de jO terminação e outras seqüências de realce e controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira selecionada.

Quando a célula hospedeira é de levedura, as seqüências de controle de expressão úteis incluem, por exemplo, o fator de emparelhamento

a. Para as células de inseto os promotores da poliedrina ou plO de baculovírus podem ser usados (Smith, G. E. et al., Mol. Cell Biol. 3, 2156 a

2165 (1983)). Quando a célula hospedeira é de origem vertebrada as seqüências de controle de expressão úteis ilustrativas incluem o promotor inicial imediato de citomegalovírus (humano) (Seed, B. et al., Nature 329,

840 a 842 (1987); Fynan, E. F. et al., PNAS USA 90, 11478 a 11482 (1993); •o Ulmer, J. B. et al., Science 259, 1745 a 1748 (1993)), LTR do vírus do sarcoma de Rous (RSV), Gorman, C. M. et al., PNAS USA 79, 6777 a 6781 (1982); Fynan et al., supra; Ulmer et al., supra), o LTR de MPSV (Stacey et al., J. Virology 50, 725 a 732 (1984)), o promotor inicial imediato de SV40 (Sprague J. et al., J. Virology 45, 773 (1983)), o promotor de SV-40 (Berman,

P. W. et al., Science 222, 524 a 527 (1983)), o promotor de metalotioneína (Brinster, R. L. et al., Nature 296, 39 a 42 (1982)), o promotor de choque térmico (Voellmy et al., PNAS USA 82, 4949 a 4953 (1985)), o promotor tardio principal de Ad2 e o promotor de β-actina (Tang et al., Nature 356, 152 a 154 (1992)). As seqüências reguladoras também podem incluir seqüências

terminadoras e de poli-adenilação. Entre as seqüências que podem ser usadas são a seqüência do hormônio do crescimento bovino, a seqüência de poliadenilação de SV40, as seqüências de terminador e poli-adenilação de citomegalovírus humano bem conhecidas.

Os sistemas de expressão de célula bacteriana, de levedura, fungica, de inseto e vertebrada são sistemas muito freqüentemente usados. Tais sistemas são bem conhecidos na técnica e no geral disponíveis, por exemplo, comercialmente através da Clontech Laboratories Inc. (4030 Fabian

Way, Paio Alto, Califórnia 94303-4607, USA). A seguir destes sistemas de

expressão, os sistemas de expressão com base em parasita são sistemas de expressão atraentes. Tais sistemas são por exemplo, descritos no Pedido de

Patente Francesa com número de Publicação 2 714 074 e na Publicação US NTIS N² US 081043109 (Hoffman, S. e Rogers, W.: Data de Publicação 1 de dezembro de 1993).

Um sistema de expressão muito atraente para a expressão de gene de nematóide heterólogo é um sistema de expressão de nematóide com base no verme Caenorrhabditis elegans. Um sistema de expressão heterólogo para este nematóide foi descrito por Redmond, D. L. et al., em Molecular and Biochemistry Parasitology 112, 125 a 131 (2001). Ver também Hashmi, S, et ^0 al., Em Trends in Parasitology 17, 387 a 393 (2001). Os genes de acordo com a presente invenção podem ser fundidos imediatamente a jusante de um promotor da cisteína protease de C. elegans, cpr-5, que foi mostrado recentemente direcionar a expressão no intestino de C. elegans (Redmond et al., 2001) e clonado no vetor pGEX. A cepa mutante de C. elegans DR96 25 unc76(e911) de crescimento lento pode ser transformada pela micro-injeção de DNA plasmídico no ramo distai das gônadas hermafroditas. O DNA plasmídico, por exemplo, pode ser preparado usando o método Qiagen. Os genes de Ostertagia de acordo com a invenção podem ser co-injetado com o plasmídeo p76-16B de reparo. O plasmídeo p76-16B resgata o fenótipo unc76

e permite que os transformantes sejam identificados através da reversão de volta ao fenótipo do tipo selvagem. As linhas transformadas em que a segunda e as gerações subsequentes apresentam o fenótipo do tipo selvagem serão mantidas. A presença da construção injetado nos vermes transgênicos pode ser facilmente verificada pela análise de PCR de vermes únicos com iniciadores desenvolvidos especificamente para o DNA de interesse (Kwa et al., Joumal of Molecular Biology 246, 500 a 510. (1995)). Os vermes transgênicos, resgatados pelo p76-1613, crescem mais rapidamente do que os mutantes unc76(e911) e permitem o acúmulo rápido de material de verme |0 transgênico. Por causa do seu ciclo de vida rápido, os transformantes podem ser cultivados in vitro em quantidades grandes. Os extratos somáticos de vermes transgênicos podem ser preparados triturando-se os nematóides em um almofariz sob nitrogênio líquido e recolocando-os em suspensão em PBS 0,05 M contendo 2 % de TritonX-100®. As proteínas de fusão serão 15 purificadas pelas cromatografia de afinidade usando uma coluna de Glutationa Sepharose.

Uma forma ainda mais preferida desta forma de realização da invenção diz respeito a Carregadores Recombinantes Vivos (LRCs) que

compreendem uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína de Ostertagia ostertagi ou um fragmento imunogênico desta de acordo com a invenção, um fragmento de DNA de acordo com a invenção ou uma molécula de DNA recombinante de acordo com a invenção. Estes LRCs são microorganismos ou vírus em que a informação genética adicional, neste caso uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína de Ostertagia ostertagi ou um fragmento imunogênico deste de acordo com a invenção foi clonado. O gado infectado com tais LRCs produzirão uma resposta imunológica não apenas contra os imunógenos do carregador, mas também contra as partes imunogênicas da(s) proteína(s) para a(s) qual(is) o código genético é adicionalmente clonado no LRC, tais como por exemplo, um ou

mais dos novos gene de proteína de Ostertagia ostertagi de acordo com a invenção.

Como um exemplo de LRCs bacterianas, cepas de Salmonella atenuadas conhecidas na técnica podem muito atraentemente serem usadas.

Também, parasitas carregadores recombinantes vivos foram descritos i.a. por Vermeulen, A, N. (Int J Parasitol. 28, 1121 a 1130 (1998)).

Além disso, os vírus LRC podem ser usados como um modo de transportar a seqüência de ácido nucleico em uma célula alvo, vírus carregadores recombinantes vivos também são chamados vírus de vetor. Os

vírus ffeqüentemente usados como vetores são os vírus da Vacínia (Panicali et al.·, PNAS USA 79, 4927 (1982), vírus do herpes (E. P. A. 0473210A2) e

Retrovírus (Valedo, D. et al.·, em Baum, S. J., Dicke, K. A., Lotzova, E. e

Pluznik, D. H. (Eds.), Experimental Haematology today - 1988. Springer Verlag, Nova Iorque: pp. 92 a 99 (1989)).

A técnica de recombinação homóloga in vivo, bem conhecida na técnica, pode ser usada para introduzir uma seqüência de ácido nucleico recombinante no genoma de uma bactéria, parasita ou vírus de escolha, capaz de induzir a expressão da seqüência de ácido nucleico inserida de acordo com a invenção no animal hospedeiro.

Finalmente uma outra forma desta forma de realização da invenção diz respeito a uma célula hospedeira que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína de acordo com a invenção, um fragmento de DNA que compreende uma tal seqüência de ácido nucleico ou uma molécula de DNA recombinante que compreende uma tal seqüência de 25 ácido nucleico sob o controle de um promotor funcionalmente ligado. Esta forma também diz respeito a uma célula hospedeira contendo um carregador recombinante vivo que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de Ostertagia ostertagi ou um fragmento imunogênico desta de acordo com a invenção.

Uma célula hospedeira pode ser uma célula de origem bacteriana, por exemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis e espécies de Lactobacillus, em combinação com plasmídeos com base em bactérias como pBR322 ou vetores de expressão bacteriana como as séries pEX, pET, pGEX 5 ou com bacteriofagos. A célula hospedeira também pode ser de origem eucariótica, por exemplo, células de levedura em combinação com moléculas de vetor específicas de levedura ou células eucarióticas superiores como células de inseto (Luckow et al.', Biotechnology 6, 47 a 55 (1988)) em combinação com vetores ou baculovírus recombinantes, células vegetais em ,0 combinação por exemplo, com vetores com base me plasmídeos Ti ou vetores virais vegetais (Barton, K. A. et al.', Cell 32, 1033 (1983), células de mamífero como células Hela, células do ovário de hamster chinês (CHO) ou células renais de felino de Crandell-Rees, também com vetores ou vírus recombinantes apropriados.

Também, o hospedeiro pode ser um nematóide tal como C.

elegans, como explicado acima.

Uma outra forma de realização da invenção diz respeito às novas proteínas de Ostertagia ostertagi e aos fragmentos imunogênicos destas de acordo com a invenção.

bo O conceito de fragmento imunogênicos será definido abaixo.

Uma forma desta forma de realização diz respeito a uma proteína de Ostertagia ostertagi e aos seus fragmentos imunogênicos, em que a proteína ou fragmentos imunogênicos têm uma homologia de seqüência de pelo menos 90 %, preferivelmente entretanto 92 %, mais preferivelmente 94 25 %, 95 % ou mesmo 96 % de homologia, nesta ordem ou de preferência, com a seqüência de aminoácido como representada na SEQ ID NO: 8.

Ainda mais preferido é um nível de homologia de 97 %, 98 %, % ou mesmo 100 % nesta ordem de preferência.

Os fragmentos imunogênicos da proteína de Ostertagia ostertagi como representados nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 14 de acordo com a invenção como aqui descritas, preferivelmente têm um comprimento de pelo menos 7, mais preferivelmente 10, 15, 20, 30 ou mesmo 40 aminoácidos, nesta ordem de preferência.

Uma forma ainda mais preferida desta forma de realização diz respeito a esta proteína de Ostertagia ostertagi e fragmento imunogênicos da dita proteína, codificados por uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

Uma outra forma desta forma de realização diz respeito a uma ^0 proteína de Ostertagia ostertagi de 28 kD e aos seus fragmentos imunogênicos, em que a proteína ou fragmentos imunogênicos têm seqüência homologia de pelo menos 90 %, preferivelmente entretanto 92 %, mais preferivelmente 94 %, 95 % ou mesmo 96 % de homologia, nesta ordem ou preferência, com a seqüência de aminoácido como representada na SEQ ID 15 NO: 4.

Ainda mais preferido é um nível de homologia de 97 %, 98 %, 99 % ou mesmo 100 % nesta ordem de preferência.

Uma forma ainda mais preferida desta forma de realização diz respeito a uma proteína de Ostertagia ostertagi de 28 kD e fragmentos ^.'0 imunogênicos da dita proteína, codificados por uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

Ainda em uma outra forma desta forma de realização diz respeito a uma proteína de Ostertagia ostertagi de 25 kD e aos seus fragmentos imunogênicos, em que a proteína ou fragmentos imunogênicos 25 têm uma homologia de seqüência de pelo menos 90 %, preferivelmente entretanto 92 %, mais preferivelmente 94 %, 95 % ou mesmo 96 % de homologia, nesta ordem ou preferência, com a seqüência de aminoácido como representada na SEQ ID NO: 6.

Uma forma ainda mais preferida desta forma de realização diz respeito a uma proteína de Ostertagia ostertagi de 25 kD e fragmentos imunogênicos da dita proteína, codificados por uma seqüência de ácido 5 nucleico de acordo com a presente invenção.

Novamente uma outra forma desta forma de realização diz respeito a uma proteína de Ostertagia ostertagi de 31 kD e aos seus fragmento imunogênicos, em que a proteína ou fragmentos imunogênicos têm uma homologia de seqüência de pelo menos 90 %. Preferivelmente entretanto

%, mais preferivelmente 94 %, 95 % ou mesmo 96 % de homologia, nesta ordem ou preferência, com a seqüência de aminoácido como representada na

SEQ ID NO: 2.

Uma forma ainda mais preferida desta forma de realização diz respeito a uma proteína de Ostertagia ostertagi de 31 kD e fragmentos imunogênicos da dita proteína, codificados por uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

Um outra forma desta forma de realização diz respeito a uma proteína de Ostertagia ostertagi de 30 kD e aos seus fragmentos imunogênicos, em que a proteína ou fragmentos imunogênicos têm uma homologia de seqüência de pelo menos 90 %, preferivelmente entretanto 92 %, mais preferivelmente 94 %, 95 % ou mesmo 96 % de homologia, nesta ordem ou preferência, com a seqüência de aminoácido como representada na

SEQ ID NO: 10.

Uma forma ainda mais preferida desta forma de realização diz respeito a uma proteína de Ostertagia ostertagi de 30 kD e fragmentos imunogênicos da dita proteína, codificados por uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

Novamente uma outra forma desta forma de realização diz respeito a uma proteína de Ostertagia ostertagi de 24 kD e aos seus 5 fragmentos imunogênicos, em que a proteína ou fragmentos imunogênicos têm uma homologia de seqüência de pelo menos 90 %, preferivelmente entretanto 92 %, mais preferivelmente 94 %, 95 % ou mesmo 96 % de homologia, nesta ordem de preferência, com a seqüência de aminoácido como representada na SEQ ID NO: 12.

Ainda mais preferido é um nível de homologia de 97 %, 98 %.

% ou mesmo 100 % nesta ordem de preferência.

Uma forma ainda mais preferida desta forma de realização diz respeito a uma proteína de Ostertagia ostertagi de 24 kD e fragmentos imunogênicos da dita proteína, codificados por uma seqüência de ácido 15 nucleico de acordo com a presente invenção.

Novamente uma outra forma desta forma de realização diz respeito a uma proteína de Ostertagia ostertagi de 65 kD e aos seus fragmentos imunogênicos, em que a proteína ou fragmentos imunogênicos

têm uma homologia de seqüência de pelo menos 90 %, preferivelmente entretanto 92 %, mais preferivelmente 94 %, 95 % ou mesmo 96 % de homologia, nesta ordem ou preferência, com a seqüência de aminoácido como representada na SEQ ID NO: 14.

Uma forma ainda mais preferida desta forma de realização diz respeito a uma proteína de Ostertagia ostertagi de 65 kD e fragmentos imunogênicos da dita proteína, codificados por uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

O nível de homologia de proteína pode ser determinado com o programa de computador “BLAST 2 SEQUENCES” selecionando-se o subprograma: “BLASTP”, que pode ser encontrado em www.ncbi.nlm.nlh.gov/blast/bl2seg/bl2.html.

Uma referência para este programa é Tatiana A. Tatusova, 5 Thomas L. Madden, FEMS MicroBiol. Letters 174, 247 a 250 (1999). Matriz usada: “blosum62”. Os parâmetros usado são os parâmetros de default: Intervalo aberto: 11. Intervalo de extensão: 1. X_queda de Intervalo 50.

Será entendido que para as proteínas particulares aqui abrangidas, as variações naturais podem existir entre cepas de Ostertagia |0 ostertagi individuais. Estas variações podem ser demonstradas por (uma) diferença(s) de aminoácido na seqüência global ou pelas supressões, substituições, inserções, inversões ou adições de (um) aminoácido(s) na dita seqüência. As substituições de aminoácido que não alteram essencialmente as atividades biológicas e imunológicas, foram descritas, por exemplo, por 15 Neurath et al. em The Proteins, Academic Press Nova Iorque (1979). As substituições de aminoácido entre os aminoácidos ou substituições que têm ocorrido ffeqüentemente na evolução são, inter alia, Ser/Ala, Ser/Gly,

Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (ver Dayhof, M. D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C. (1978), vol. 5, supemento 3). Outras substituições de aminoácido incluem Asp/Glu, Thr/Ser,

Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val e Ala/Glu. Com base nesta informação, Upman e Pearson desenvolveram um método para a comparação de proteína rápida e sensível (Science 227, 1435 a 1441 (1985)) e determinaram a similaridade funcional entre as proteínas homólogas. Tais substituições de aminoácido das formas de realização exemplares desta invenção, assim como as variações tendo supressões e/ou inserções estão dentro do escopo da invenção contanto que as proteínas resultantes retenham a sua reatividade imune. Isto explica o porque as proteínas de Ostertagia ostertagi de acordo com a invenção, quando

isolados de isolados de campos diferentes, podem ter níveis de homologia de cerca de 70 %, enquanto ainda representam a mesma proteína com as mesmas características imunológicas. Estas variações na seqüência de aminoácido de uma certa proteína de acordo com a invenção que ainda fornece uma proteína 5 capaz de induzir uma resposta imune contra a infecção com Ostertagia ostertagi ou pelo menos contra as manifestações clínicas da infecção são consideradas como ‘essencialmente não influenciadoras da imunogenicidade”.

Quando uma proteína é usada por exemplo, para propósitos de

vacinação ou para incitar anticorpos, não é entretanto necessários usar a proteína inteira. Também é possível usar um fragmento desta proteína que seja capaz, como tal ou ligado a um carregador tal como por exemplo, KLH, de induzir uma resposta imune contra esta proteína, um chamado fragmento imunogênico. Um “fragmento imunogênico” é entendido ser um fragmento da proteína de tamanho natural que ainda reteve a sua capacidade para induzir uma resposta imune em um hospedeiro vertebrado, por exemplo, compreende um epítopo de célula B ou T. Em resumo, um fragmento imunogênico é um fragmento que é capaz de induzir uma resposta antigênica contra uma

proteína de Ostertagia ostertagi de acordo com a invenção. Neste momento, uma variedade de técnicas são disponíveis para identificar facilmente fragmentos de DNA que codificam fragmentos antigênicos (determinantes). O método descrito por Geysen et al. (Pedido de Patente WO 84/03564, Pedido de Patente WO 86/06487, Patente U.S. 4.833.092, PNAS USA 81, 3998 a

4002 (1984), J. Imm. Meth. 102, 259 a 274 (1987), o chamado método 25 PEPSCAN é um método fácil de executar, rápido e bem estabelecido para a detecção de epítopos; as regiões imunologicamente importantes da proteína. O método é usado mundialmente e como tal bem conhecido pelo técnico habilitado no ramo. Este método (empírico) é especialmente adequado para a detecção de epítopos de célula B. Também, dada a seqüência do gene que

codifica qualquer proteína, os algoritmos de computador são capazes de designar fragmentos de proteína específicos como os epítopos imunologicamente importantes com base na sua conformidade seqüencial e/ou estrutural com epítopos que são agora conhecidos. A determinação 5 destas regiões está fundamentada em uma combinação dos critérios de hidrofilicidade de acordo com Hopp e Woods. (PNAS USA 78, 38248-3828 (1981)) e os aspectos de estrutura secundária de acordo com Chou e Fasman (Advances in Enzymology 47, 45 a 148 (1987) e Patente US 4.554.101). Os epítopos de célula T podem se igualmente prognosticados a partir da |P seqüência pelo computador com a ajuda do critério de anfifilicidade de

Berzofskys (Science 235, 11059 a 11062 (1987) e Patente US pedido NTIS US 07/005.885). Uma revisão condensada é encontrada em: Shan Lu, em princípios comuns: Tibtech 9, 238 a 242 (1991); Good et al., em Malaria epitopes: Science 235, 1059 a 1062 (1987); Lu, para uma revisão. Vaccine 10, 15 3 a 7 (1992); e Berzofsky, para epítopos do HIV: The FASEB Joumal 5, 2412 a 2418 (1991). Um fragmento imunogênico usualmente tem um comprimento mínimo de 6, mais habitualmente de 7 a 8 aminoácidos, preferivelmente mais do que 8, tal como 9, 10, 12, 15 ou mesmo 20 ou mais aminoácidos. As seqüências de ácido nucleico que codifica um tal fragmento portanto têm um

I) comprimento de pelo menos 18, mais habitualmente 24 e preferivelmente 27, 30, 36, 45 ou mesmo 60 ácidos nucleicos.

Portanto, uma forma de uma outra forma de realização da invenção diz respeito às vacinas para combater a infecção pelo Ostertagia ostertagi, que compreende pelo menos uma proteína de Ostertagia ostartagi 25 ou seus fragmentos imunogênicos, de acordo com a invenção como descrito acima junto com um carregador farmaceuticamente aceitável.

Ainda uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito às proteínas de Ostertagia ostertagi de acordo com a invenção ou seus fragmentos imunogênicos para o uso em uma vacina.

Novamente uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito ao uso de uma seqüência de ácido nucleico, um fragmento de DNA, uma molécula de DNA recombinante, um carregador recombinante vivo, uma célula hospedeira ou uma proteína ou um fragmento 5 imunogênico destas de acordo com a invenção para a fabricação de uma vacina, mais especificamente uma vacina para combater a infecção pelo Ostertagia ostertagi.

Um modo de fabricar uma vacina de acordo com a invenção é cultivando-se o nematóide, seguido pela purificação bioquímica de uma I» proteína de Ostertagia ostertagi ou seus fragmentos imunogênicos, do nematóide ou do sobrenadante. Isto é entretanto um modo muito consumidor de tempo de fabricar a vacina.

r

E portanto muito mais conveniente usar os produtos de expressão de um gene que codifica uma proteína de Ostertagia ostertagi ou 15 seus fragmentos imunogênicos, de acordo com a invenção em vacinas. Isto é possível agora pela primeira vez porque as seqüências de ácido nucleico de genes que codificam 7 novas proteínas de Ostertagia ostertagi adequadas como componentes de vacina é fornecido na presente invenção.

As vacinas com base nos produtos de expressão destes genes podem ser facilmente fabricadas misturando-se a proteína de acordo com a invenção ou seus fragmentos imunogênicos de acordo com a invenção com um carregador farmaceuticamente aceitável como descrito abaixo.

Altemativamente, uma vacina de acordo com a invenção pode compreender carregadores recombinantes vivos como descritos acima, 25 capazes de expressar a proteína de acordo com a invenção ou seus fragmentos imunogênicos. Tais vacinas, por exemplo, com base em um carregador de Salmonella ou um carregador viral por exemplo, um vetor do vírus do herpes têm a vantagem sobre as vacinas de subunidade de que eles imitam melhor o modo natural de infecção pelo Ostertagia ostertagi. Além disso, a sua auto

propagação é uma vantagem visto que apenas quantidades baixas do carregador recombinante são necessários para a imunização.

As vacinas também podem estar fundamentadas em células hospedeiras como descrito acima que compreendem a proteína ou seus 5 fragmentos imunogênicos de acordo com a invenção.

Todas as vacinas descritas acima contribuem para a vacinação ativa, isto é elas deflagram o sistema de defesa do hospedeiro. Altemativamente, os anticorpos podem ser incitados por exemplo, em coelhos ou podem ser obtidos a partir de linhagens de célula que produzem anticorpo |^0 como descrito abaixo. Tais anticorpos podem ser depois administrados às vacas. Estes métodos de vacinação, a vacinação passiva, é a vacinação de escolha quando um animal já está infectado e não há tempo para permitir a resposta imune natural para ser deflagrado. Também é o método preferido para animais vacinados que estão propensos à pressão de infecção 15 subitamente alta. Os anticorpos administrados contra a proteína de acordo com a invenção ou seus fragmentos imunogênicos podem nestes casos interferem com o Ostertagia ostertagi. Este método tem a vantagem de diminuir ou parar o desenvolvimento de Ostertagia ostertagi. Portanto, uma outra forma desta forma de realização da invenção diz respeito a uma vacina h() para combater a infecção por Ostertagia ostertagi que compreende anticorpos contra uma proteína de Ostertagia ostertagi de acordo com a invenção ou um fragmento imunogênico desta proteína, e um carregador farmaceuticamente aceitável.

Ainda uma outra forma de realização desta invenção diz 25 respeito aos anticorpos contra uma proteína de Ostertagia ostertagi de acordo com a invenção ou um fragmento imunogênico desta proteína.

Os métodos para a produção de anticorpos em grande escala de acordo com a invenção também são conhecidos na técnica. Tais métodos contam com a clonagem da (fragmentos de) informação genética que codifica a proteína de acordo com a invenção em um fago filamentoso para a demonstração de fago. Tais técnicas são descritas i.a. no “Antibody Engineering Page” sob “filamentous phage display” no http://axlmtl.imt.unimarburg.de/~rek/aepphage.html. e nos documentos de revisão por Cortese, R. et al., (1994) em Trends in Biotechn. 12, 262 a 267, por Clackson, T. & Wells, J. A. (1994) em Trends in Biotechn. 12, 173 a 183, por Marks, J. D. et al., (1992) em J. Biol. Chem. 267, 16007 a 16010, por Winter, G. et al., (1994) Em Annu. Rev. Immunol. 12, 433 a 455 e por Little, M. et al., (1994) Biotechn. Adv. 12, 539 a 555. Os fagos são subsequentemente usados para triar as bibliotecas de expressão camelídeo que expressam anticorpos de cadeia pesada. (Muyldermans, S. e Lauwereys, M., Joum. Molec. Recogn. 12, 131 a 140 (1999) e Ghahroudi, M.A. et al., FEBS Letters 414, 512 a 526 (1997)). As células da biblioteca que expressam os anticorpos desejados podem ser replicados e ser subsequentemente usados para a expressão de anticorpos de larga escala.

Ainda em uma outra forma de realização diz respeito a um método para a preparação de uma vacina de acordo com a invenção que compreende a mistura de anticorpos de acordo com a invenção e um carregador farmaceuticamente aceitável.

Um modo alternativo e eficiente de vacinação é a vacinação direta com o DNA que codifica o antígeno relevante. A vacinação direta com DNA que codifica proteínas foi bem sucedida para muitas proteínas diferentes. (Como revisto por exemplo, em Donnelly et al., The Immunologist 2, 20 a 26 (1993)). No campo das vacinas anti-parasita, a proteção contra por exemplo, Plasmodium yoelil foi obtida com a vacinação com o gene de circunsporozóite de Plasmodium yoelil (Vaccine 12, 1529 a 1533 (1994)). A proteção contra Leishmania major foi obtida com a vacinação de DNA com o gene gp63 da glicoproteína de superfície de Leishmania major (Vaccine 12, 1534 a 1536 (1994)).

Este modo de vacinação também é atraente para a vacinação de gado contra a infecção pelo Ostertagia ostertagi. Portanto, ainda outras formas desta forma de realização da invenção dizem respeito às vacinas que compreendem seqüências de ácido nucleico que codificam uma proteína de 5 acordo com a invenção ou seus fragmentos imunogênicos, vacinas que compreendem fragmentos de DNA que compreendem tais seqüências de ácido nucleico ou vacinas que compreendem as moléculas recombinantes de DNA de acordo com a invenção e um carregador farmaceuticamente aceitável.

Os exemplos de plasmídeos de DNA que são adequados para o uso em uma vacina de DNA de acordo com a invenção são plasmídeos de clonagem ou de expressão convencionais para células hospedeiras bacterianas, eucarióticas e de levedura, muitos dos ditos plasmídeos sendo comercialmente disponíveis. Exemplos bem conhecidos de tais plasmídeos são pBR322 e pcDNA3 (Invitrogen). Os fragmentos de DNA ou moléculas de

DNA recombinantes de acordo com a invenção devem ser capazes de induzir a expressão da proteína das seqüências de nucleotídeo. Os fragmentos de

DNA ou moléculas de DNA recombinantes podem compreender uma ou mais seqüências de nucleotídeo de acordo com a invenção. Além disso, os fragmentos de DNA ou moléculas recombinantes de DNA podem compreender outras seqüências de nucleotídeo tais como oligonucleotídeos imunoestimuladores tendo di-nucleotídeos de CpG não metilados ou seqüências de nucleotídeo que codificam outras proteínas antigênicas ou citocinas adjuvantes.

A seqüência de nucleotídeo de acordo com a presente invenção ou o plasmídeo de DNA que compreende uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a presente invenção, preferivelmente operavelmente ligados a uma seqüência reguladora transcricional, para serem usados na vacina de acordo com a invenção podem ser nus ou podem ser empacotados em um

V sistema de liberação. Os sistemas de liberação adequados são vesículas lipídicas, ISCOMs®, dendrômeros, niossomas, micropartículas, especialmente micropartículas com base em quitosano, matrizes de polissacarídeo e outros, (ver mais abaixo) todos bem conhecidos na técnica. Também muito 5 adequadas como sistema de liberação são as bactérias vivas atenuadas tais como a espécie Salmonella e vírus vivos atenuados tais como vetores do vírus do herpes, como mencionado acima.

Ainda outras formas desta forma de realização dizem respeito a vacinas que compreendem moléculas recombinantes de DNA de acordo ► com a invenção.

As vacinas de DNA por exemplo, podem ser facilmente administradas através da aplicação intradérmica tal como pelo uso de um injetor sem agulha. Este modo de administração libera o DNA diretamente nas células do animal a ser vacinado. As quantidades de DNA na faixa entre 15 10 pg e 1000 pg fornece bons resultados. Especialmente se o DNA é autoreplicativo, quantidades menores serão suficientes. Preferivelmente, quantidades na faixa de micrograma entre 1 e 100 pg são usadas.

Em uma outra forma de realização, a vacina de acordo com a

presente invenção adicionalmente compreende um ou mais antígenos derivados de organismos e vírus patogênicos do gado, anticorpos contra estes antígenos ou informação genética que codifica tais antígenos e/ou um componente farmacêutico tal como um antibiótico.

Naturalmente, tais antígenos, anticorpos contra tais antígenos ou informação genética pode ser de origem de Ostertagia ostertagi, tal como 25 por exemplo, um outro antígeno de Ostertagia ostertagi. Também podem ser um antígeno, anticorpos ou informação genética selecionados de um outro organismo ou vírus patogênicos de vaca. Tais organismos e vírus são preferivelmente selecionados do grupo de Herpesvírus Bovino, vírus da Diarréia viral Bovina, vírus da parainfluenza tipo 3, Paramyxovírus Bovino,

vírus da Doença do pé e da mão, Pasteurella haemolytica, Vírus Sincicial Respiratório Bovino, Thelleria sp., Babesla sp., Trypanosoma sp., Anaplasma sp., Noospora caninum, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Cryptospofidium, 5 Salmonella e Streptococcus dysgalactiae,

As vacinas com base em uma ou mais das proteínas de Ostertagia ostertagi de acordo com a invenção também são muito adequadas como vacinas marcadoras. Uma vacina marcadora é uma vacina que permite descriminar entre vacas vacinadas e infectadas no campo por exemplo, com φθ base em um painel de anticorpo característico, diferente do painel de anticorpo induzido pela infecção do tipo selvagem. Um painel de anticorpo diferente é induzido por exemplo, quando uma proteína imunogênica presente em um Ostertagia do tipo selvagem não está presente em uma vacina: o hospedeiro depois não fabricará anticorpos contra aquela proteína depois da 15 vacinação. Assim, uma vacina com base em qualquer uma das proteínas de Ostertagia ostertagi de acordo com a invenção apenas induziríam anticorpos contra aquela proteína específica, ao passo que uma vacina com base em um Ostertagia ostertagi do tipo selvagem vivo, atenuado vivo ou integral inativado induziría anticorpos contra todas ou quase todas as proteínas de ^20 nematóide.

Um teste de ELISA simples, tendo reservatórios que compreendem qualquer outra proteína de Ostertagia exceto para as proteínas de Ostertagia ostertagi de acordo com a presente invenção e reservatórios que compreendem apenas uma ou mais das proteínas de Ostertagia ostertagi 25 purificadas de acordo com a invenção é suficiente para testar soro de vacas e para dizer se as vacas são vacinadas com a vacina de proteína de acordo com a invenção ou passaram pela infecção de campo de Ostertagia ostertagi.

Todas as vacinas de acordo com a presente invenção compreendem um carregador farmaceuticamente aceitável. Um carregador farmaceuticamente aceitável pode ser por exemplo, água estéril ou uma solução salina fisiológica estéril. Em uma forma mais complexa o carregador pode ser por exemplo, um tampão.

Os métodos para a preparação de uma vacina compreendem a mistura de uma proteína ou um fragmento imunogênico desta, de acordo com a invenção e/ou anticorpos contra esta proteína ou um fragmento imunogênico desta e/ou uma seqüência de ácido nucleico e/ou um fragmento de DNA, uma molécula de DNA recombinante, um carregador recombinante vivo ou célula hospedeira de acordo com a invenção e um carregador farmaceuticamente • aceitável.

As vacinas de acordo com a presente invenção podem em uma apresentação preferida também conter uma substância imunoestimuladora, um chamado adjuvante. Os adjuvantes no geral compreendem substâncias que reforçam a resposta imune do hospedeiro em uma maneira não específica.

Vários adjuvantes diferentes são conhecidos na técnica. Os exemplos de adjuvantes freqüentemente usados em vacinas de vaca são muramildipeptídeos, lipopolissacarídeos, diversos glucanos e glicanos e Carbopol® (um homopolímero). A vacina também pode compreender um chamado “veículo”. Um veículo é um composto ao qual a proteína adere, sem estar covalentemente ligada a ele. Tais veículos são i.a. biomicrocápsulas, micro-alginatos, lipossomas e macrossóis, todos conhecidos na técnica. As micropartículas, mais especificamente aquelas com base em quitosano, especialmente para o uso na vacinação oral são muito adequadas como veículos de vacina. Uma forma especial de um tal veículo, em que o antígeno é parcialmente embutido no veículo, é o chamado ISCOM (EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380) Além disso, a vacina pode compreender um ou mais compostos ou emulsificadores ativos na superfície adequados, por exemplo, Span® ou Tween®.

Os antígenos serão preferivelmente combinados com adjuvantes que são facilmente disponíveis e que são registrados para o uso em animais domésticos, por exemplo, hidróxido de alumínio, um adjuvante modulador como Th2.

Dois métodos alternativos para a liberação de antígeno são especialmente adequados para a aplicação das vacinas de acordo com a presente invenção:

a. a imunização sistêmica com a inclusão de adjuvantes que

modulam respostas imunes voltados para a mucosa, tais como vitamina D3 (Van der Stede, Y., et al., Vaccine 19, 1870 a 1878 (2001)) ou QuilA® e

b. a liberação direta à mucosa respiratória pela inalação de DNA nu (plasmídeo) (Vanrompay, D., et al., Imunology 103, 106 a 112 (2001)).

A adição de oligosseqüências de nucleotídeo CpG dentro ou fora do plasmídeo também é preferido para melhorar a proteção (Van der 15 Stede, Y., et al., Vet. Imunol. Imunopathol., 86, 31 a 41 (2002).

Freqüentemente, a vacina é misturada com estabilizadores, por exemplo, para proteger as proteínas propensas à degradação de serem degradadas, para realçar a vida de prateleira da vacina ou para melhorar a

eficiência da secagem por congelamento. Os estabilizadores úteis são i.a.

SPGA (Bovamik et al.·, J. Bacteriology 59, 509 (1950)), carboidratos por exemplo, sorbitol, manitol, trealose, amido, sacarose, dextrano ou glicose, proteínas tais como albumina ou caseína ou produtos da degradação destes e tampões, tais como fosfatos de metal alcalino. Além disso, a vacina pode ser colocada em suspensão em um diluente fisiologicamente aceitável. É lógico que outros modos de usar adjuvantes, adicionar compostos de veículo ou diluentes, emulsificar ou estabilizar uma proteína também são incorporados na presente invenção.

As vacinas de acordo com a invenção que estão fundamentadas na proteína de acordo com a invenção ou seus fragmentos

	imunogênicos podem ser muito adequadamente administradas em quantidades que variam entre 1 e 100 microgramas de proteína por animal, embora doses menores em princípio possam ser usadas. Uma dose que exceda 100 microgramas, embora imunologicamente muito adequada, será menos
5 Λ	atraente por razões comerciais. As vacinas com base em carregadores recombinantes atenuados vivos, tais como os vírus de LRC, parasitas e bactérias descritas acima podem ser administradas em doses muito mais baixas, porque elas se multiplicam entre si durante a infecção. Portanto, as quantidades muito
·'	adequadas podem variar entre 10³ e 10⁹ CFU/PFU tanto para as bactérias quanto para os vírus. As vacinas de acordo com a invenção podem ser administradas por exemplo, intradermicamente, subcutaneamente. Intramuscularmente, intraperitonealmente, intravenosamente ou nas superfícies mucósicas tais
15	como oral ou intranasalmente. Para a proteção eficiente contra doença, um diagnóstico rápido e correto de infecção por Ostertagia ostertagi é importante. Portanto é um outro objetivo desta invenção fornecer ferramentas de diagnóstico adequadas
%	para a detecção de infecção pelo Ostertagia ostertagi. As seqüências de ácido nucleico, as proteínas e os anticorpos de acordo com a invenção também são adequados para o uso em diagnósticos. Portanto, uma outra forma de realização da invenção diz respeito às seqüências de ácido nucleico, proteínas e anticorpos de acordo com a invenção para o uso em diagnósticos.
25	As seqüências de ácido nucleico ou seus fragmentos de acordo com a invenção podem ser usados para detectar a presença de Ostertagia ostertagi em vacas. Uma amostra coletada dos abomasos de vacas infectadas com Ostertagia ostertagi compreenderão material de ácido nucleico derivado do dito parasita, que inclui seqüências de ácido nucleico que codificam a

proteína de acordo com a invenção. Estas seqüências de ácido nucleico hibridizarão com uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção. Os métodos adequados para a detecção das seqüências de ácido nucleico que são reativas com as seqüências de ácido nucleico da presente invenção _t 5 incluem as técnicas de hibridização que incluem mas não são limitadas às técnicas de PCR e/ou NASBA. Assim as seqüências de ácido nucleico de « acordo com a invenção podem ser usadas para preparar sondas e iniciadores para o uso nas técnicas de PCR e/ou NASBA. Um kit de teste de diagnóstico para a detecção de Ostertagia ostertagi pode compreender por exemplo |üO ferramentas para permitir a reação de isolados de ácido nucleico de

Ostertagia das vacas a serem testadas com estas ferramentas. Tais ferramentas são por exemplo, sondas específicas ou iniciadores (de PCR), também aludidos como fragmentos iniciadores, com base nas seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção. Se material genético de Ostertagia 15 ostertagi estiver presente no animal, este por exemplo, ligar-se-á especificamente aos iniciadores de PCR específicos e, por exemplo, depois da síntese de cDNA, subsequentemente tomar-se-á amplificado na reação de PCR. O produto da reação de PCR pode ser depois facilmente detectado na eletroforese em gel de DNA. Os livros texto de PCR padrão dão métodos para zO determinar o comprimento dos iniciadores para as reações de PCR seletivas com DNA de Ostertagia ostertagi. Os fragmentos iniciadores com uma seqüência de nucleotídeo de pelo menos 12 nucleotídeos são freqüentemente usados, mas iniciadores de mais do que 15, mais preferivelmente 18 nucleotídeos são um pouco mais seletivos. Especialmente iniciadores com um 25 comprimento de pelo menos 20, preferivelmente pelo menos 30 nucleotídeos no geral são muito aplicáveis. As técnicas de PCR são extensivamente descritas em C. Dieffenbach & G. Dveksler: PCR primers: a laboratory manual, CSHL Press, ISBN 879694473 (1995)). As seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção ou iniciadores daquelas seqüências de

	' ’³¹ φ ácido nucleico tendo um comprimento de pelo menos 12, preferivelmente 15, mais preferivelmente 18, ainda mais preferivelmente 20, 22, 25, 30, 35 ou 40 nucleotídeos nesta ordem de preferência, em que as seqüências de ácido nucleico ou partes destas têm pelo menos 70 % de homologia com a
5 /	seqüência de ácido nucleico como representada na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9,
	11 ou 13 são também portanto parte da invenção. Os iniciadores são entendidos ter um comprimento de pelo menos 12 nucleotídeos e uma homologia de pelo menos 70 %, mais preferivelmente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mesmo 100 %, nesta ordem de preferência, com a
•	seqüência de ácido nucleico como representada na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ou 13. Tais seqüências de ácido nucleico podem ser usadas como fragmentos iniciadores nas reações de PCR de modo a realçar a quantidade de DNA que elas codificam ou em reações de hibridização. Isto permite a amplificação ou detecção rápida em manchas de seqüências de nucleotídeo
15	específicas para o uso como uma ferramenta de diagnóstico por exemplo, para a detecção de Ostertagia ostertagi como indicado acima. Um outro teste no material genético está fundamentado no material de Ostertagia obtido a partir por exemplo, de um cotonete, seguido
	pela purificação de DNA clássica seguida pela hibridização clássica com fragmentos de iniciador radioativamente rotulados ou rotulados por cor. Os fragmentos rotulados por cor e radioativamente rotulados são no geral chamados de meio de detecção. Tanto as reações de PCR quanto as reações de hibridização são bem conhecidas na técnica e são i.a. descritas em Sambrook & Russell, supra.
25	Assim, uma forma de realização da invenção diz respeito a um kit de teste de diagnóstico para a detecção de seqüências de ácido nucleico de Ostertagia ostertagi. Um tal teste compreende uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção ou um fragmento iniciador desta. Um kit de teste de diagnóstico com base na detecção de

	material antigênico das proteínas de Ostertagia ostertagi específicas de acordo com a invenção e portanto adequado para a detecção de infecção pelo Ostertagia ostertagi pode i.a. compreender um teste de ELISA padrão. Em um exemplo de um tal teste as paredes dos reservatórios de uma placa de
. 5	ELISA são revestidas com anticorpos direcionados contra qualquer uma das
Α	proteínas de acordo com a invenção. Depois da incubação com o material a ser testado, anticorpos anti-Ostertagia ostertagi rotulados são adicionados aos reservatórios. Uma reação de cor depois revela a presença de material
•	antigênico de Ostertagia ostertagi. Portanto, ainda uma outra forma de realização da presente Invenção diz respeito aos kits de teste de diagnóstico para a detecção de material antigênico de Ostertagia ostertagi. Tais kits de teste compreendem anticorpos contra uma proteína de acordo com a invenção ou um fragmento desta de acordo com a invenção. Um kit de teste de diagnóstico com base na detecção em soro
15	de anticorpos contra uma proteína de Ostertagia ostertagi de acordo com a invenção e portanto adequada para a detecção de infecção pelo Ostertagia
	ostertagi pode i.a. compreender um teste de ELISA padrão. Em um tal teste as paredes dos reservatórios de uma placa de ELISA por exemplo, pode ser
Wo	revestida com uma proteína de Ostertagia ostertagi de acordo com a invenção. Depois da incubação com o material a ser testado, anticorpos rotulados contra aquela proteína são adicionados aos reservatórios. Uma reação de cor depois revela a presença de anticorpos contra Ostertagia ostertagi. Portanto, ainda uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito ao kit de testes de diagnóstico para a detecção de anticorpos
25	contra Ostertagia ostertagi. Tais kits de teste compreendem uma proteína de Ostertagia ostertagi de acordo com a invenção ou um fragmento desta de acordo com a invenção. O planejamento do imunoensaio pode variar. Por exemplo, o imunoensaio pode ser com base na competição ou reação direta. Além disso,

^/sV protocolos podem usar suportes sólidos ou pode usar material celular. A detecção do complexo anticorpo-antígeno pode envolver o uso de anticorpos rotulados; os rótulos podem ser, por exemplo, enzimas, moléculas fluorescentes, quimioluminescentes, radioativas ou corante. Os métodos adequados para a detecção de anticorpos reativos com uma proteína de acordo com a presente invenção na amostra incluem o ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), o teste de imunofluorescência (IFT) e as análises de Western blot.

As proteínas ou seus fragmentos imunogênicos de acordo com a invenção por exemplo, expressadas como indicado acima podem ser usadas para produzir anticorpos, que podem ser policlonais, monoespecíficos ou monoclonais (ou derivados destes). Se anticorpos policlonais são desejados, as técnicas para produzir e processar soros policlonais são bem conhecidas no ramo (por exemplo, Mayer e Walter, eds. Immunochemical Methods in Cell 15 and Molecular Biology, Academic Press, Londres (1987)). Os anticorpos monoclonais, reativos contra a proteína de acordo com a invenção ou um fragmento imunogênico desta de acordo com a presente invenção, podem ser preparados imunizando-se camundongos congênitos pelas técnicas também conhecidas no ramo (Kohler e Milstein, Nature, 253, 495 a 497 (1975)).

EXEMPLOS

Exemplo 1

1.1. Preparação de produtos ES, produtos EX e soro de coelho anti-ES de parasita

Os produtos EX foram preparados como descrito em Geldhof, 25 P., et al., Parasite Imunology 24, 263 a 270 (2002). EX usado neste exemplo é comparável ao SI como descrito nesta publicação. Produtos excretoressecretores foram preparados como descrito por Geldhof P, et al., Parasitology 121, 639 a 647 (2000). Os coelhos foram imunizados três vezes, com um intervalo de uma semana, com 100 pg das proteínas ES no estado L₃, L₄ e adulto obtidas em combinação com adjuvante de Freund e sangrados três semanas depois da última imunização. Os soros policlonais destes coelhos foram usados para a imunotriagem de bibliotecas de cDNA de Ostertagia ostertagi.

1.2 Construção de biblioteca de cDNA de O. ostertagi

O RNA total de parasitas L₃, L₄ e Adulto foi preparado usando Reagente TRIZOL® (GibcoBRL, Life Technologies). O RNA PoliA⁺ foi purificado usando o Kit mRNA Separator® (Clontech Laboratories, Inc.). Três pg de mRNA foram convertidos em cDNA de primeiro filamento com iniciadores hexaméricos aleatórios (SuperScript® Choice System for cDNA Syntesis, GibcoBRL, Life Technologies). O cDNA de filamento duplo foi modificado com adaptadores EcoRI-Notl e clonados no vetor lambda gtll (Stratagene). Os fagos lambda recombinantes foram empacotados (Gigapack®III Gold Packaging Extract, Stratagene) e a reação de 15 empacotamento foi titulada. A biblioteca de cDNA L₃ foi estimada conter o zr

1,15 x 10' clones independentes; a biblioteca de cDNA L₄ 9,6 x 10' e a biblioteca de cDNA de Adulto conteve 3,41 x 10⁸ unidades formadoras de placa. Na amplificação, estas bibliotecas de cDNA foram imunotriadas com os soros de coelho anti-ES.

zO 1.3. Imunotriagem de biblioteca de cDNA

Aproximadamente 100.000 placas foram plaqueadas em Caldo Luria ágar (8.000 placas por placa) e as réplicas foram feitas em filtros de nitrocelulose embebidos em 10 mM de isopropiltio-3-D-galactosídeo. No bloqueio do fundo (5 % de pó de leite em PBST, Nestlé Gloria) os filtros 25 foram incubados durante a noite com soro de coelho, diluído (1:200) em tampão de bloqueio. Soro anti-coelho de cabra ligado à rábano peroxidase (diluição 1:1000) foi usado como um conjugado e os complexos antígenoanticorpo foram detectados com diaminobenzidina. As placas de reação foram re-triadas até que uma população homogênea de fagos recombinantes r

imunopositivos foi obtida. As placas purificadas foram recolocadas em suspensão em tampão SM estéril (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 10 mM de MgSO₄) e armazenadas a 4°C.

1.4. Clonagem e análise de seqüência de insertos de cDNA

Os insertos de fago foram amplificados por PCR com iniciadores lambda gtl 1:

Xgtl 1F 5- GGTGGCGAGGACTCCTGGAGCCCG -3’ (SEQ ID NO: 15)

kgtl IR 5’- TTGACACCAGACCAACTGGTAATG -3’ (SEQ ID NO: 16), e clonados em um vetor plasmídicos (pGEM-T®, Promega).

Transformantes E coli DH5a contendo o plasmídeo recombinante foram selecionados em placas de Caldo Luria ágar suplementado com 0,1 mg/ml de 10 ampicilina, 0,1 mM de isopropiltio-3-D-galactosídeo e 40 pg/ml de 5-bromo4-cloro-3-indolil-3-D-galactose e os insertos CEM foram amplificados pela

PCR com iniciadores de vetor:

SP6 5’- ATTTAGGTGACACTATAGAA -3’ (SEQ ID NO: 17)

T7 5’- GTAATACGACTCACTATAGGGC -3’ (SEQ ID NO: 18).

A seqüência de nucleotídeo dos clones de cDNA foi determinada pelo método de terminador de cadeia de didesóxi usando 15 terminadores BigDye® fluorescentes em um seqüenciador de DNA 377 automatizado (PE Biosystems). Os dados de seqüência de DNA foram montados (DNASTAR®, Inc.) e comparado com seqüências de ácido nucleico (Blast+Beauty) e aminoácido (BlastX+Beauty) em várias bases de dados (EMBL, GenBank, WU-Blast2 e Swiss-Prot).

Resultados do Exemplo 1:

O método de triagem usando antissoro de coelho anti-excretorsecretor especificamente preparado para a detecção de genes que codificam Ostertagia ostertagi imunorreativo levou à detecção de cinco novos genes que

codificam componentes de vacina. Todos os cinco genes foram descobertos estar presentes na biblioteca de cDNA de estágio adulto de Ostertagia ostertagi.

1) um gene que codifica uma nova proteína imunogênica foi encontrado, do qual a seqüência de nucleotídeo que codifica determinantes imunogênicos importantes é dado na SEQ ID NO: 7. O gene codifica uma proteína com um comprimento de cerca de 1600 aminoácidos e um peso molecular de > 200 kD. A seqüência de aminoácido de uma parte imunorreativa importante desta proteína é dada na SEQ ID NO: 8. Como pode |θ ser observado na Figura 1, diversos clones, um dos quais é indicado por uma seta, compreendem pelo menos partes do gene que codifica uma parte imunogênica desta proteína. Pode ser clinicamente observado que esta proteína é fortemente reconhecida pelos anticorpos contra esta proteína.

2) um gene que codifica uma nova proteína imunogênica de 28 kD foi encontrada. A maior parte das seqüências de nucleotídeo deste gene é dada na SEQ ID NO: 3. A seqüência de aminoácido da proteína é dada na SEQ ID NO: 4. Como pode ser observado na Figura 2B, na linha denominada ES e EX (ver sob 1.1. para explicação) a faixa clara de cerca de 28 kD que

representa esta proteína é fortemente reconhecida pelo antissoro monoespecífico purificado nas linhas de placa de clones imunopositivos puros que codificam a proteína.

3. um gene que codifica uma nova proteína imunogênica de 25 kD foi encontrado. A seqüência de nucleotídeo deste gene é dada na SEQ ID NO: 5. A seqüência de aminoácido da proteína é dada na SEQ ID NO: 6.

Como pode ser observado na Figura 2C, na linha denominada EX (ver sob

1.1. para explicação) a faixa clara de cerca de 25 kD que representa esta proteína é de modo forte e alto especificamente reconhecida pelos antissoros monoespecíficos purificados nas linhas de placa de clones imunopositivos puros que codificam esta proteína.

I

4) um gene que codifica uma nova proteína imunogênica de 31 kD foi encontrado. A seqüência de nucleotídeo deste gene é dada na SEQ ID NO: 1. A seqüência de aminoácido da proteína é dada na SEQ ID NO: 2. Na Figura 3B, na região de caixa, as quatro proteínas à direita são formas desta j 5 proteína. (Ver também sob os resultados do Exemplo 2). A partir da Figura * 3A segue que a proteína é fortemente reconhecida pelos antissoros

- ( * monoespecíficos purificados nas linhas de placa de clones imunopositivos puros que codificam esta proteína.

5) um gene que codifica uma nova proteína imunogênica de 30 kD foi encontrado. A seqüência de nucleotídeo deste gene é dada na SEQ ID NO: 9. A seqüência de aminoácido da proteína é dada na SEQ ID NO: 10. Na Figura 3B na região de caixa, as duas proteínas à esquerda são formas desta proteína. (Ver também sob os resultados do Exemplo 2). A partir da Figura 3A segue que a proteína é fortemente reconhecida pelos antissoros 15 monoespecíficos purificados nas linhas de placas de clones imunopositivos puros que codificam esta proteína.

* Exemplo 2

- 2.1. Preparação de antígenos

Parasitas de O. ostertagi adultos e produtos ES adultos foram obtidos como descrito por Geldhof et al. (2000, Parasitology, 121, 639 a 647).

2.2. Cromatografia em Tiol-sefarose

A ES total foi pré incubada com uma concentração final de 2,5 mM de ditiotreitol (DTT) durante 30 minutos a 37°C antes da cromatografia.

DTT em excesso foi removido pela passagem através de uma coluna 25 Sephadex® G-25 de 10 x 2,6 cm (Pharmacia) e eluída com 10 mM de Tris, 0,5

M de NaCl, pH 7,4 a 5 ml/minuto. Uma coluna de Tiol-Sepharose 4B (Sigma) ativada, 5 ml de volume de leito, foi equilibrada em 10 mM de Tris, 0,5 M de

NaCl, pH 7,4. As amostras de proteína (10 mg/rodada) foram aplicadas à coluna de Tiol-Sepharose 4B a uma razão de fluxo de 5 ml/hora. O material

não ligado foi eluído lavando-se a coluna com tampão de equilíbrio (10 mM de Tris, 0,5 M de NaCl, pH 7,4) até que a OD₂8o retomou a uma linha de base constante, o material ligado foi eluído com tampão de equilíbrio contendo 50 mM de DTT a uma razão de fluxo de 5 ml/hora. As frações de pico foram reunidas. DTT foi removido das proteínas eluídas pela passagem, a 5 ml/minuto, através de uma coluna Sephadex® G-25 (Pharmacia) em 10 mM de Tris pH 7,4. As frações de pico foram mais uma vez reunidas e o teor de proteína determinado pelo método SCA (Rerce). Ambas as purificações, S3- e ES-tiol, tiveram um rendimento entre 10 e 15 %. As alíquotas das frações de fc) ES-tiol foram removidas para SDS-PAGE e análise em gel de substrato. O resto dos eluídos foi depois armazenado a -70°C até necessário.

2.3. Eletroforese em Gel 1D e 2D

Os componentes peptídicos de ES-tiol foram visualizados pelo tingimento com Azul de Coomassie (0,1 % de Azul de Coomassie R-250 em 15 40 % de metanol e 10 % de ácido acético) a seguir do fracionamento de amostra de 10 pg de proteína pela 10 % SDS-PAGE sob condições redutoras. A ele^OÍb^ese em gel 2D foi executada usando o sistema de 1 PG-SDS/PAGE de acordo com Bjellqvist et al. (Electrophoresis 14, 1357 a 1365 (1993)). As amostras de proteína foram precipitadas adicionado-se 10 volumes de acetona 70 gelada e deixadas durante 2 horas a -20°C. A acetona foi descartada depois da centrifugação. A pelota foi redissolvida durante 2 horas em solução de reidratação contendo 9 M de uréia, 4 % de CHAPS (Pharmacia), Azul de Bromofenol, 18 mM de ditiotreitol e 2 % de tampão IPG (Pharmacia). Esta amostra, aproximadamente 100 pg de proteína, foi carregada em tiras de 7 cm 25 de Immobiline (pH 3 a 10, Pharmacia) para realizar a focalização isoelétrica.

A tira foi subsequentemente lavada durante 30 minutos em 50 mM de Tris-Cl pH 8,8 contendo Uréia 6 M, 30 % de glicerol (v/v), 2 % de SOS (p/v), 64 mM de ditiotreitol e um traço de azul de bromofenol. A segunda dimensão foi carregada em 12 % SDS-PAGE. Os géis foram tingidos pelo tingimento com

Coomassie Coloidal (Sigma).

2,4. Western blotting

As respostas de anticorpo séricas dos bezerros às imunizações com ES-tiol foram avaliadas pela Western blotting usando soros colhidos uma semana depois da segunda imunização. Cinco pg de ES-tiol foram fracionados usando 10 % de SDS-PAGE sob condições redutoras e depois a mancha transferida em uma membrana de PVDF. A seções de mancha foram cortadas em tiras e bloqueadas durante a noite em 10 % de soro de cavalo em

PBST. Depois de 2 horas de sondagem com soros reunidos (diluídos 1:400 em 2 % de soro de cavalo em PBST) a partir dos grupos diferentes o conjugado (HPRO anti-bovino de coelho, Sigma, 1:8000 em 2 % de soro de cavalo em PBST) foi adicionado por uma hora. Os antígenos reconhecidos foram visualizados adicionado-se 0,05 % de tetracloreto de 3,3-diaminobenzidina em PBS contendo 0,01 % de H2O2 (v/v).

2.5. Análise espectrométrica de massa

A análise espectrométrica de massa foi executada essencialmente como anteriormente revisado por Jensen et al. (Proteins, Suppl 2, 74 a 89 (1998)). Em resumo, as manchas de proteína foram digeridas

em gel usando tripsina e os peptídeos foram subsequentemente purificados com a tecnologia AnchorChip®. As amostras de peptídeo foram analisadas pela espectrometria de massa MALDI-TOF. O material remanescente foi usado para a análise de LC-MS/MS para determinar a seqüência de aminoácido dos peptídeos diferentes.

Resultados do Exemplo 2:

O perfil de peptídeo de ES-tiol e ES completo

A análise da fração de proteína ES-tiol na eletroforese em gel

ID e 2D é mostrada na Figura 4. ES-tiol compreendeu uma faixa proeminente a ~30 kD assim como 3 faixas moleculares mais baixas e em tomo de 6 peptídeos na faixa de tamanho variando de 45 a 92 kD (Figura 3A). A análise

	desta fração de proteína em gel 2D é mostrada na Figura 3B. A faixa de 30 kD proeminente visível no gel 1D migra em aproximadamente 6 manchas entre pl 5-7 no gel 2D. Outras 13 manchas mais tênues com valores de pl variando de 4 a 8 com massas moleculares entre 53 e 15 kD foram visíveis em
5	ES-tiol no gel 2D (Figura 3B). Respostas de anticorpo de bezerros imunizados Os animais de controle apresentaram algum reconhecimento de fundo menor de uns poucos peptídeos no ES-tiol (Figura 4). O grupo EStiol fortemente reconheceu o antígeno de 30 e o de 31 kD (Figura 4).
•θ	Resultados de espectrometria de massa As 6 manchas abundantes a 30 kD foram excisadas a partir do gel e usadas em uma análise de impressão digital de massa de MALDIpeptídeo (em caixa na Figura 3B). Duas proteínas diferentes foram detectadas nestas manchas. A análise de impressão digital de massa de peptídeo indicou
15	que as manchas número 3-6 contiveram a mesma proteína de 31 kD, como descrito acima sob 4) e as manchas 1 e 2 contiveram a proteína de 30 kD, como descrito acima sob 5). O material remanescente foi usado na análise de LC-MS/MS, que resultou nas seqüências de peptídeo das manchas 1-6. Estas
%	apresentaram 100 % de homologia com o antígeno excretor-secretor anteriormente caracterizado como codificado pelos genes que codificam uma proteína de Ostertagia ostertagi de 31 kD e 30 kD, como descrito no Exemplo 1, sob 4) e 5). Exemplo 3 3.1. Animais
25	Um total de 17 bezerros, machos e fêmeas cruzamento Holstein, entre 6 e 12 meses de idade de 3 fazendas diferentes receberam uma infecção natural com nematóides gastrointestinais durante uma primeira estação de pastoreio de pelo menos 6 meses. Para confirmar a situação imune dos bezerros, reduções nas cargas de verme foram medidas depois do

tratamento no alojamento com benzimidazóis e infecção por inoculação subsequente. Os bezerros da fazenda 1 (n = 4) receberam uma inoculação natural durante um mês na segunda estação de pastoreio (Claerebout et al., Veterinary Parasitology 75, 153 a 167 (1998)). Os bezerros das fazendas 2 (n = 6) e 3 (n = 7) receberam uma inoculação experimental com 50.000 larvas LS de O. ostertagi, uma semana depois do tratamento. A contagens de vermes de O. ostertagi destes animais (animais imunizados) foram comparadas com aquelas dos bezerros livres de helminto (n = 6 para cada fazenda), que receberam uma inoculação similar (animais ‘Primariamente infectados’). As reduções nas contagens de vermes foram 48 %, 45 % e 24 % para os bezerros das fazendas 1, 2 e 3 respectivamente.

Coleta de Amostra

3.2. Coleta de muco

O muco do abomaso de todos os 17 animais ‘imunizados’ das «Io fazendas diferentes e dos 13 animais ‘primariamente infectados’ foi coletado raspando-se suavemente a superfície mucósica com uma lâmina de microscópio de vidro. As raspagens de muco foram homogeneizadas com um peso igual de solução salina tamponada com fosfato (PBS 0,05 M, pH 7,3, 3 mM de Na-azida) usando um homogeneizador Ultra-turrax (13.000 RPM, 3 x 1 min). Os homogeneizados foram centrifugados a 20.000g durante 30 minutos. O sobrenadante foi removido e armazenado a -70°C. Para isolar as imunoglobulinas, o sobrenadante foi tratado com proteína pérolas de Gagarose (Roche). O muco (1 ml) foi centrifugado (14.000 g, 4°C, 30 min) para remover os fragmentos. 200 μΐ de tampão de partida (20 mM de NaH₂PO₄, pH 7,0) foram adicionados ao sobrenadante para garantir que o pH da amostra permanecesse neutro. Depois de equilibrar a amostra (2 lavagens com tampão de partida) 100 μΐ de pérolas de Proteína G-agarose foram adicionados. A amostra foi colocada em um rotor durante 2 horas a 4°C para permitir a ligação das partes Fc das Ig’s às pérolas. O sobrenadante foi coletado e salvo junto com as primeiras 5 lavagens (400 μΐ de tampão de lavagem/lavagem, 20 mM de NaH₂PO₄, 150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, pH 7,0). As Ig’s ligadas foram eluídas com 400 μΐ de tampão de elução (100 mM de glicina, pEl 2,7) até que a OD das eluções fosse 0. As frações foram imediatamente 5 neutralizadas com 20 % de tampão de neutralização (1 M de TrisHCl, pH

9,0). A fração de sobrenadante/lavagem foi mais uma vez tratada com pérolas de proteína G-agarose para garantir que todos os anticorpos presentes na amostra de muco fossem coletadas. As amostras de muco tratadas foram reunidas em 2 grupos para cada fazenda: o grupo ‘imunizado’ e o grupo >0 ‘primariamente infectado’.

3.3. Coleta de sondas de célula que secretam anticorpo (ASC-sondas)

ACS-sondas foram coletadas a partir de animais da fazenda 3 (n = 13). As sondas de célula que secretam anticorpo (ASC-sondas) designam o sobrenadante de uma cultura de célula de linfônodo que foi preparada com a 15 técnica originalmente descrita por Meeusen e Brandon (J. Imunol. Methods 172, 71 a 76 (1994a); Eur. J. Imunol. 24, 469 a 474 (1994b)). Em resumo, linfônodos de abomasos foram coletados na necrópsia e transportados em PBS frio + 1 % de penicilina-estreptomicina. Os linfócitos foram colhidos cortando-se e fragmentando os nódulos em 5 ml de meio RPMI (Gibco BRL), 20 lavados em meio RPMI e centrifugados (1.000 g, 10 min, 4°C). As células sangüíneas vermelhas foram lisadas adicionado-se 20 ml de solução de lise (2 % de Tris, pH 7,65, 0,8 % de NH₄C1), durante 10 min com agitação suave. Vinte ml de RPMI contendo 1 % de penicilina-estreptomicina e 2 % de soro de cavalo foram usados para lavar as células 3 vezes. As células foram 25 recolocadas em suspensão a uma concentração final de 5 x 10⁶ células/ml em meio de cultura (RPMI suplementado com 20 % de soro de cavalo, 11 % de penicilina-estreptomicina, 1 % de piruvato de sódio, 1 % de aminoácidos não essenciais, 1 % de canamicina, 0,1 % de gentamicina e 0,035 % de βmercaptoetanol). Os frascos de cultura contendo 50 ml de suspensão celular foram incubados a 37°C em uma atmosfera de 5 % de CO₂ em ar sem estímulo. Depois de 3 dias, as células foram removidas pela centrifugação (1000 g, 10 min) e 400 ml de sobrenadante por animal foram coletados. O sobrenadante (ASC-sondas) foi concentrado 10 vezes em um SpeedVac® e as reuniões de um anticorpos tanto dos animais ‘imunizados’ quanto dos animais ‘primariamente infectados’ foram feitas para triar Western Blots e bibliotecas de cDNA.

3.4. triagem de bibliotecas de cDNA

Bibliotecas de cDNA de L₃, L₄ e Adulto de O. ostertagi foram construídas em fago Zgtll, propagadas em células Y1090r- e plaqueadas pelos métodos padrão (Sambrook & Russell, supra). Aproximadamente 100.000 placas de todas as 3 bibliotecas foram triadas com ASC-sondas e anticorpos de muco. Todas as placas foram primeiro triadas com uma reunião de anticorpos de animais ‘imunizados’ de todas as três fazendas. Todas as placas positivas foram retriadas até que uma única placa pôde ser isolada. Estas placas positivas foram retriadas com a reunião de anticorpo a partir de animais ‘primariamente Infectadas’ de todas as três fazendas. As placas que foram exclusivamente reconhecidas pelos anticorpos dos animais ‘imune’ foram retidas, recolocadas em suspensão em 200 μΐ de tampão SM estéril (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 10 mM de MgSO₄) e armazenados a 4°C com uma gota de clorofórmio. Os outros foram designados falso positivos devido ao reconhecimento cruzado dos anticorpos dos animais ‘primariamente infectados’. Os insertos foram amplificados pela reação de PCR com iniciadores Àgtl 1 universal e o amplicon foi purificado em gel com um kit de purificação em gel (Qiagen). O fragmento de cDNA foi subclonado no vetor pGEM-T (Promega) e transformada em células DH5a de E. coli. A seguir da triagem azul-branco (IPTG/X-gal) e PCR com iniciadores de vetor SP6 e T7, os clones recombinantes foram selecionados e o DNA plasmídico foi isolado usando o kit de isolação de plasmídeo Qiagen. A seqüência de nucleotídeo dos clones de cDNA foi determinada pelo método de terminador de cadeia de didesóxi usando terminadores BigDye® fluorescentes em um seqüenciador de DNA 377 automatizado (PE Biosystems). A montagem e a análise de nucleotídeo e as seqüências de 5 aminoácido deduzidas foram executadas usando o programa de software DNASTAR®.

Resultados do Exemplo 3

O método de triagem usando anticorpos locais obtidos a partir de muco e sobrenadante da cultura de célula que secreta anticorpo (ASC) tomou possível que dois novos genes adicionais que codificam componentes de vacina fossem encontrados:

1) um gene de 900 nucleotídeos foi encontrado na biblioteca de cDNA tanto no estágio L₄ larval quanto no estágio Adulto. A seqüência de nucleotídeo deste gene é dada na SEQ ID NO: 11. O gene codifica uma proteína com um comprimento de 300 aminoácidos e um peso molecular de cerca de 24 kD. A proteína tem um ponto isoelétrico de pl 6,6. A seqüência de aminoácido da proteína é dada na SEQ ID NO: 12. As setas na Figura 5, imagem da esquerda, mostra como as bactérias que expressam esta proteína são especificamente reconhecidas pelos anticorpos encontrados no 20 sobrenadante de linfônodos isolados a partir de animais imunes. A importância desta descoberta está sublinhada pelo fato de que os anticorpos isolados a partir de animais primariamente infectados não reagem completamente com estes clones. Isto claramente indica a importância desta proteína na indução da imunidade. Outras caracterizações desta proteína está 25 resumida no Exemplo 4.

2) um gene de 1238 nucleotídeos foi encontrado na biblioteca de cDNA de estágio L₃ larval e no estágio Adulto. A seqüência de nucleotídeo deste gene é dada na SEQ ID NO: 13.0 gene codifica uma proteína de 65 kD. A seqüência de aminoácido da proteína é dada na SEQ ID NO: 14. As setas

I

·) na Figura 6, imagem da esquerda, mostra como as bactérias que expressam esta proteína são especificamente reconhecidas pelos anticorpos isolados do muco de animais imunes. Mais uma vez, a importância desta descoberta é realçada pelo fato de que os anticorpos isolados a partir de animais primariamente infectados não reagem de modo algum com estes clones. Isto claramente indica a importância desta proteína na indução da imunidade.

Os detalhes na identificação do gene de tamanho natural estão resumidos no Exemplo 5.

Exemplo 4

4.1 Clonagem do gene para a proteína de 24 kD

Um fragmento de 853 pares de base foi amplificado a partir do clone de gene que codifica a proteína de 24 kD (De Maere et al., Parasitoloy, 125, 383 a 391 (2002)) pela PCR usando iniciadores que também incorporam sítios de endonuclease de restrição (realçada). Os iniciadores usados foram: 24kForw 5’- GAATTCATGAAGTTGGTCGTG -3’ (SEQ ID NO: 19)

24-kRev 5’- CTCGAGTCAATAGATCCTTGTG -3’ (SEQ ID NO: 20).

O produto de PCR foi digerido com enzimas de restrição EcoRI e Xhol, purificados em gel (kit Qiagen) e clonado na matriz no vetor pET21a alvejado com T7-/6xHistidina (Novagen). A matriz de leitura correta foi confirmada pelo seqüenciamento e a construção foi transformada na cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli. A expressão da proteína recombinante foi induzida pela adição de isopropil-β tio galactosidase durante 2 horas a 37°C.

As células foram centrifugadas, recolocadas em suspensão em PBS e lisadas adicionado-se 0,1 volume de lisozima. Depois de um ciclo de congelamento (-70°C) e descongelamento, os fragmentos celulares foram girados e o sobrenadante foi coletado. Os fragmentos celulares foram recolocados em suspensão no T7- BindBuffer® (+ 6M Ureum) durante 1 hora em gelo para recolocar em suspensão as proteínas insolúveis.

As proteínas recombinantes foram purificadas em uma coluna de afinidade de rótulo T7 e em seguida por uma coluna de resina de ligação de His.

4.2 Anticorpos Policlonais

100 pg de proteína recombinante foram injetados 3 vezes intramuscularmente com intervalo de 3 semanas em um coelho. O sangue pré imune foi coletado exatamente antes da primeira imunização e a sangria final foi feita 3 semanas depois da última imunização.

4.3 Coleta de Amostra •ο

A coleta de muco e a coleta da sonda de célula que secreta anticorpo estão descritas no Exemplo 3 acima (seções 3.3 e 3.4) e em De Maere et al. (2002, supra).

4.4 Western Blotting

O reconhecimento da proteína de 24 kD nativa ou recombinante pelas sondas ASC, anticorpos de muco ou soro anti-proteína de 24 kD de coelho foi avaliado pelo Western blotting. Dez pg de extrato de Ostertagia ou produto de Excreção-Secreção foram fracionados usando 10 % de SDS-PAGE sob condições redutoras e depois transferido em uma membrana PVDF. As seções manchadas foram cortadas em tiras, bloqueadas durante 2 horas em soro de cavalo normal a 10 % em PBST e sondadas durante a noite com sondas ASC. Os anticorpos de muco ou soro anti-proteína de 24 kD de coelho e conjugado foram depois adicionados: anti-bovinoHPRO de coelho (H+L) (Jackson Imunoresearch Laboratories Inc.) a 1:8000 ou anti-coelho de cabra conjugado a HRPO (Sigma) a 1:6000 em soro de cavalo normal a 2 % em PBST. As tiras foram incubadas por uma hora. Os antígenos reconhecidos foram visualizados adicionado-se 0,05 % de tetracloreto de 3,3 diaminobenzidina em PBS contendo 0,01 % de H₂O₂ (v/v).

4.5 RT PCR Quantitativa

A RT-PCR foi usada para investigar transcritos do gene que

I codifica a proteína de 24 kD nos estágios de vida parasíticos de O. ostertagi. Três microgramas de RNA total de cada estágio de vida (L₃, L^-exsheathed, L₄ e Adulto) foi usado para a síntese de cDNA usando um iniciador oligo(dT) (Superscript®, Life technologies). Os iniciadores de oligonucleotídeo usados 5 para a detecção de transcritos do gene que codifica a proteína de 24 kD foram planejados para amplificar um cDNA de aproximadamente 300 pares de base de comprimento. Actina (Oo-act), descrita por Vercauteren et al. (Molecular and Biochemistry Parasitology, 126, 201 a 208 (2003)), foi usado como um controle de gene de ‘administração interna’ constitutivamente expressado para b determinar a uniformidade das reações de transcrição reversa.

O cDNA do gene que codifica a proteína de 24 kD foi amplificado e quantificado usando o Light Cycler® e o kit lightcycler-faststart DNA master SYBR green I (Roche, Mannheim, Alemanha). A mistura de reação consiste de uma mistura mestra contendo Taq DNA polimerase, 15 mistura de dNTP e SYBR verde 1, 2 mM de MgCb, 5 pM de cada iniciador e 2 μΐ de cDNA padrão em total de 20 μΐ. A confirmação da especificidade dos produtos de PCR foi executada submetendo-se estes produtos a uma análise de curva de fusão, eletroforese em gel de agarose subsequente e seqüenciamento. A análise de PCR foi executada em triplicata e a 20 quantificação ocorreu usando padrões externos de proteína de 24 kD e cDNA de Oo-act. O cálculo foi executado com o software de análise Lightcycler. A quantidade relativa de expressão da proteína de 24 kD foi plotada como uma relação ((número de cópia de proteína de 24 kD / número de cópia de gene de administração interna) x 10).

Resultados do Exemplo 4:

A proteína de 24 kD recombinante (Figura. 7A) foi reconhecida pelas ASC-sondas e anticorpos de muco de animais imunes (Figura 7B-C). Isto indica que os epítopos da proteína recombinante se parece com aquela da proteína nativa e que a proteína recombinante tem as mesmas capacidades protetivas como a proteína nativa. Os anticorpos incitados contra a proteína recombinante em coelhos, portanto também reconhece a proteína nativa em gel ID (Figura 7B) e gel 2D (Figura 8A)

Os anticorpos para a proteína de 24 kD recombinante foram usados para especificar a expressão específica de estágio da proteína no Western Blot (Figura 8B).

A RT-PCR apresentou a expressão da proteína em todos os estágios de vida, especialmente no L₃ com revestimento e no estágio L₄

(Figura 9A).

Visto que a proteína de 24 kD é expressada predominantemente nas larvas dos estágios L₃ e L₄, uma vacina com base nesta proteína interfere com o desenvolvimento dos estágios parasíticos larvais L₃ (o estágio infeccioso) e no L₄. Reduzindo ou prevenindo deste modo o estabelecimento de uma infecção pelo Ostertagia. Isto por sua vez leva a uma carga de verme reduzida no animal com todas as conseqüências benéficas aqui apresentadas.

Exemplo 5

Obtenção do gene de tamanho natural que codifica a proteína de 65 kD

A utilização do clone Ad (De Maere et al., Parasitoloy, 125, 383 a 391 (2002)) como a base para o planejamento de iniciador específico, a seqüência completa do gene como representada na SEQ ID NO: 13 foi obtida pela técnica de 5 73’-Amplificação rápida de Extremidades de cDNA Ends (RACE). O kit 5’-RACE da GibcoBRL foi utilizado para identificar a extremidade 5’ do gene para a proteína de 65 kD. O cDNA de primeiro filamento foi produzido em uma reação de transcrição reversa usando o iniciador específico 65Revl (ver abaixo) em 2 pg de RNA de Adulto. Este cDNA foi poli caudado em C na sua extremidade 3’ com desoxitransferase

Λ terminal e usado como um padrão em uma PCR com o Iniciador Ancora Abreviado (AAP, GibcoBRL):

ΑΑΡ: 5’- GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG -3’ (SEQ

ID NO: 21) e iniciador específico de gene 65Rev2 (ver abaixo). O produto de 5’ RACE PCR foi clonado e seqüenciado.

O kit 3’-RACE da GibcoBRL foi utilizado para identificar a extremidade 3’ do gene para a proteína de 65 kD. Em resumo, o cDNA de 5 primeiro filamento foi produzido em uma reação de transcrição reversa usando um Iniciador Adaptador contendo oligo(dT) (AP) em 2 pg de RNA Adulto. Este cDNA foi usado como um padrão em uma PCR com um ) iniciador específico de gene 65kForw (ver abaixo) e o Iniciador de Amplificação Universal (UAP, GibcoBRL):

UAP 5’- CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTAC -3’ (SEQ ID NO: 22)

O produto 3’ RACE PCR foi clonado e seqüenciado.

O alinhamento de todos os dados de seqüência tomaram possível planejar novos iniciadores específicos de gene que compreendem os códons de partida e parada, For65 e Rev65 (ver abaixo). O sistema de Pré amplificação SUPERSCRIPT® para a Síntese de cDNA do Primeiro

Filamento (GibcoBRL) foi usado para criar padrão para uma PCR com estes iniciadores para se obter o cDNA de tamanho natural.

Os iniciadores específicos de gene utilizados para identificar a seqüência codificadora de tamanho natural do cDNA para a proteína de 65 kD são:

65Revl: 5’- CAGCAATGGATACCGAATGAC -3’ (SEQ ID NO: 23) 65Rev2: 5’- AGTGACTTCATCATTGCTGGTG -3’ (SEQ ID NO: 24) 65kForw: 5’- TGATGATGAAGAACGAGAGGA -3’ (SEQ ID NO: 25) For65: 5’- GGATCCATGAGGCTGATATTGCTCATTTTA -3’ (SEQ ID NO: 26)

Rev65: 5’-CTCGAGGCAGAGTCCACACGACTTTGG-3’ (SEQ ID NO: 27)

RT-PCR Quantitativa

A RT-PCR foi usada para investigar transcritos do gene para a proteína de 65 kD nos estágios de vida de O. ostertagi parasítico. Três microgramas de RNA total de cada estágio de vida (L₃, l^-exsheathed, L₄ e 5 Adulto) foram usados para a síntese de cDNA usando um iniciador oligo(dT) (Superscript, Life technologies). Os iniciadores de oligonucleotídeos usados para a detecção do transcrito para a proteína de 65 kD foram planejados para amplificar um cDNA de aproximadamente 300 a 500 pares de base de comprimento. Actina (Ooact), descrita por Vercauteren et al. (2003, supra), foi usado como um controle de gene de ‘administração interna’ constitutivamente expressado para determinar a uniformidade das reações de transcrição reversa.

O cDNA para a proteína de 65 kD foi amplificado e quantificado como descrito no Exemplo 4, seção 4.5.

Resultados do Exemplo 5.

A seqüência codificadora completa do gene que codifica a proteína de 65 kD, como representada na SEQ ID NO: 13 tem 1722 pares de base de comprimento e codifica uma proteína com um peso molecular de 65 kD (SEQ ID NO: 14). A seqüência de aa de terminal N contém uma 70 seqüência de sinal putativa que é provavelmente clivada entre aa 16 e 17 (Glicina-Glicina). A seqüência de proteína codificada contém 5 sítios de Nglicosilação, uma região de ligação de zinco (cd00203: HEXXHALGFXHEXXRXDR) e um domínio pfam01400 (HEXXHXXG) isto a coloca na família das Astacinas (Família de peptidase M12A).

A RT-PCR revelou a expressão específica de estágio do gene para a proteína de 65kD pela Ostertagia ostertagi. Os transcritos foram detectados nos estágios L₃ e Adulto com nível de expressão mais alto particular no estágio de vida Adulto (Figura 9B). Isto está em conformidade com a triagem da biblioteca de cDNA (De Maere et al., 2002, supra).

Como a proteína de 65 kD é expressada predominantemente nos estágios Adulto, uma vacina com base nesta proteína interfere com o desenvolvimento do parasita Adulto. Isto leva à produção reduzida de ovos, que por sua vez reduz a contaminação dos campos. Isto reduz a carga de verme e os níveis de contaminação mais tarde na estação.

Exemplo 6

Expressão no sistema expressão-vetor de baculovírus

As regiões codificadoras para as proteínas de 65, 28, 31 e 24 kD da invenção foram subclonadas quanto aos seus respectivos vetores em um plasmídeo pFastBac® (Invitrogen) usando técnicas padrão. Estas construções FastBac foram transfectadas em células de inseto Sf9, para produzir baculovírus recombinantes, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Em seguida as culturas de expressão foram conduzidas, usando células de inseto Sf9 e Sfl58, que foram cultivadas em frascos giratórios microcarregadores de 100 e 250 ml. os meios de cultura isentos de soro usados foram CCM3® (Hyclone) e SF900-II® (Invitrogen). As células foram infectadas em um m.o.i. de 0,1 a 0,5 e cultivadas durante 3 a 4 dias. Depois que as culturas foram centrifugadas, o sobrenadante da cultura foi colhido e as pelotas de célula foram recolocadas em suspensão 10 x concentrada em PBS. Triton X-1000 foi adicionado a todas as amostras a uma concentração de 0,2 % v/v. As amostras foram extraídas durante a noite na temperatura ambiente, centrifugadas e os sobrenadantes foram armazenados a -20°C até o uso.

Os extratos-sobrenadantes foram conduzidos em géis SDS/PAGE padrão ao lado de marcadores apropriados, manchados em membrana de transferência Immobilon-P® (Millipore), as membranas foram tingidas com anticorpo monoclonal de rótulo anti His (Sigma) e visualizadas.

A Figura 10 mostra os resultados destas expressões de baculovírus na Western blot; as proteínas da invenção foram mais abundantes 'ψ nas amostras de pelota de célula de inseto. Estas foram usadas para formular vacinas para vacinações.

LEGENDA DAS FIGURAS

Figura 1: Dot-blot de bactérias lisadas que compreendem uma seqüência de nucleotídeo que codifica (pelo menos uma parte imunogênica) a proteína como representada na SEQ ID NO: 8. A triagem foi feita com antissoro de coelho anti-excretor-secretor especificamente preparado (Ver Exemplo 1). Uma seta indica um dos clones positivos.

Figura 2: Westem-blots; no painel 2B da proteína de 28 kD com antissoro de coelho anti-ES e anti-EX (ver Exemplo 1) e no painel 2C da proteína de 25 kD com antissoro de coelho anti-ES e anti-EX (ver Exemplo 1).

Figura 3: Análise da fração de proteína ES-tiol (ver também Exemplo 2); no painel 3A uma eletroforese em gel ID e no painel 3B uma 15 eletroforese em gel 2D. O gel 2D mostra a proteína de 31 kD (as quatro manchas mais à direita na área de caixa) e a proteína de 30 kD (as duas manchas mais à esquerda na área de caixa).

Figura 4: A resposta de anticorpo de bezerros imunizados com ES-tiol contra as proteínas da fração ES.

5b Figura 5: Dot-blot de bactérias lisadas que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína de 24 kD como representada na SEQ ID NO: 12. A triagem foi feita com anticorpos especificamente preparados a partir do sobrenadante de linfônodo de animais imunes (imagem da esquerda). (Ver também Exemplos 3 e 4). As setas indicam alguns dos 25 clones positivos. A imagem da direita mostra um dot-blot comparável, agora incubado com anticorpos de animais primariamente infectados. Com estes anticorpos nenhum clone positive foi reconhecido.

Figura 6: Dot-blot de bactérias lisadas que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína de 65 kD como representada na SEQ ID NO: 14. A triagem foi feita com anticorpos especificamente preparados a partir do muco de animais imunes (imagem da esquerda). (Ver também Exemplos 3 e 5). As setas indicam alguns dos clones positivos. A imagem da direita mostra um dot-blot comparável agora incubado com 5 anticorpos de animais primariamente infectados. Com estes anticorpos nenhum clone positivo foi reconhecido.

Figura 7: Caracterização eletroforética da proteína de 24 kD; no painel 7A resultado da expressão da proteína de 24 kD recombinante na E. coli, painel 7B: um Western blot de proteína de 24 kD rec desenvolvida com anticorpos de sonda ASC a partir de animais imunes. No painel 7C Western blot de proteína de 24 kD rec desenvolvida com anticorpos de Muco a partir de animais imunes e o painel 7D: Western Blot de extrato L₄ desenvolvido com anticorpos anti-proteína 24 kD de coelho.

Figura 8: Caracterização da proteína de 24 kD; no painel 8A:

eletroforese em gel 2D e Western Blotting de extrato de Adulto de Ostertagia ostertagi, desenvolvido com anticorpos específicos contra a proteína de 24 kD recombinantemente expressada na E. coli, incitada em coelhos e painel 8B: expressão específica de estágio de proteína de 24 kD, desenvolvida com anticorpos anti-proteína 24 kD rec.

Figura 9: Resultados de RT-PCRs quantitativas para detectar a expressão específica de estágio; no painel 9A para a proteína de 24 kD (ver Exemplo 4) e no painel 9B para a proteína de 65 kD (ver Exemplo 5).

Figura 10: Western blot de proteínas de Ostertagia expressadas no sistema expressão-vetor de baculovírus (ver Exemplo 6), o 25 tingimento foi com anticorpo anti-His

Linhas 1 e 11: BioRad Protein Precision Marker®

Linha 2: proteína de 65 kD, sobrenadante + 0,2 % de TX-100

Linha 3: proteína de 65 kD, pelota de célula em PBS + 0,2 %

TX-100 (5x conc.)

Linha 4: proteína de 28 kD, sobrenadante + 0,2 % de TX-100

Linha 5: proteína de 28 kD, pelota de célula em PBS + 0,2 % de TX-100 (5x conc.)

Linha 6: proteína de 31 kD, sobrenadante + 0,2 % de TX-100

Linha 7: proteína de 31 kD, pelota de célula em PBS + 0,2 % de TX-100 (5x conc.)

Linha 8: proteína de 24 kD, sobrenadante + 0,2 % de TX-100

Linha 9: proteína 24 kD, pelota de célula em PBS + 0,2 % de TX-100 (5x conc.)

Linha 10: vazia

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína de Ostertagia ostertagi de 30 kD, a sequência de ácido nucleico sendo como apresentada na SEQ ID NO: 9.

2. Fragmento de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.

3. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 ou um fragmento de DNA como definido na reivindicação 2, sob o controle de um promotor ligado funcionalmente.

4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, o dito ácido nucleico ligado a um promotor heterólogo.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser um vírus.

6. Célula hospedeira microbiana, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, um fragmento de DNA como definido na reivindicação 2, uma molécula de DNA recombinante como definida na reivindicação 3 ou um vetor como definido na reivindicação 4.

7. Célula hospedeira microbiana de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira é bacteriana, de levedura, fúngica ou célula de parasita.

8. Uso de uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, um fragmento de DNA como definido na reivindicação 2, uma molécula de DNA recombinante como definida na reivindicação 3, um vetor como definido na reivindicação 4, uma célula hospedeira como definida na reivindicação 6, ou de uma proteína como apresentada na SEQ ID NO:10, a dita proteína sendo capaz de induzir uma resposta imune contra Ostertagia

Petição 870190023506, de 12/03/2019, pág. 9/11 ostertagi, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma vacina para combater infecção por Ostertagia ostertagi.

9. Vacina para combater infecção por Ostertagia ostertagi, caracterizada pelo fato de que dita vacina compreende pelo menos uma 5 proteína como apresentada na SEQ ID NO:10, a dita proteína sendo capaz de induzir uma resposta imune contra Ostertagia ostertagi, um carreador farmaceuticamente aceitável, o qual coloca o(s) componente(s) ativo(s) em uma forma que permite a administração para o animal, e um adjuvante, veículo, emulsificante ou composto ativo na superfície.

10 10. Método para a preparação de uma vacina como definida na reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende misturar uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, um fragmento de DNA como definido na reivindicação 2, uma molécula de DNA recombinante como definida na reivindicação 3, um vetor como definido na reivindicação 4, 15 uma célula hospedeira como definida na reivindicação 6, uma proteína como apresentada na SEQ ID NO:10, a dita proteína sendo capaz de induzir uma resposta imune contra Ostertagia ostertagi, ou anticorpos contra a dita proteína, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

11. Kit diagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende 20 um suporte sólido ou material celular e uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, ou iniciador com uma sequência de ácido nucleico como apresentada nas SEQ ID NOs:15, 16, 17 ou 18, ou uma proteína como apresentada na SEQ ID NO:10, capaz de induzir uma resposta imune contra Ostertagia ostertagi, ou anticorpos que são reativos com a dita 25 proteína.

12. Vacina de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de o dito adjuvante ser selecionado do grupo que consiste em muramildipeptídeos, lipopolissacarídeos, glucanos, glicanos, Carbopol®, hidróxido de alumínio e um adjuvante modulador como Th2.

Petição 870190023506, de 12/03/2019, pág. 10/11

13. Vacina de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de o dito veículo ser selecionado do grupo que consiste em biomicrocápsulas, micro-alginatos, lipossomas, macrossóis, micropartículas e ISCOMs.

5 14. Vacina de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de o dito emulsificador ou composto ativo na superfície ser selecionado dentre Span® ou Tween®.