DE68927802T2 - Expression einer für eine Cholesterin-Oxydase kodierende DNS-Sequenz eines Nocardioform-Mikroorganismus in einem Mikroorganismus der Sreptomyces-Gattung - Google Patents

Expression einer für eine Cholesterin-Oxydase kodierende DNS-Sequenz eines Nocardioform-Mikroorganismus in einem Mikroorganismus der Sreptomyces-Gattung

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf die Expression einer DNA-Sequenz, welche aus einem Nocardioformen-Mikroorganismus stammt und eine Cholesterinoxidase exprimiert, in einem Streptomvces-Mikroorganismus als Wirt.
  • Die Organismen, welche als Nocardioforme in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Williams and Wilkins, 1986, S. 1458-1481) klassifiziert wurden, umfassen 9 Genera, die phylogenetisch nahe mit den Corynebacte riln Athrobacterien und Mycobacterien verwandt sind. Vertreter der Nocardioformen, darunter die Genera Nocardia und Rhodococcus zeigen einen großen Bereich von nützlichen metabolischen Aktivitäten, u.a. die Assimilation von unüblichen Verbindungen, wie z.B. Alkanen und aromatischen Kohlenwasserstoffen, den Abbau von Lignin, Detergentien und Pestiziden, die Produktion von Enzymen, die in der xenobiotischen Transformation nützlich sind, und die Biosynthese von Antibiotika, Aminosäuren und biologischen oberflächenaktiven Verbindungen. Insbesondere wurde diese Gruppe von Bakterien für die Produktion von wichtigen steroid-modifizierenden Enzymen verwertet, darunter die Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase, die in diagnostischen Tests zur Bestimmung des Cholesterinspiegels im Blut und Serum verwendet werden.
  • Die Fähigkeit Cholesterin abzubauen ist bei anderen Mikroorganismen als den Nocardioformen weit verbreitet. Zum Beispiel wurde Cholesterinoxidase auch von Arten aus der Gruppe der Mycobacterien, Pseudomonaden und Streptomyceten isoliert. Aus der wissenschaftlichen Literatur und der Patentliteratur sowie aus der gewerblichen Anwendung ist bekannt, daß sich die Cholesterinoxidase des Nocardioformen-Typus von anderen mikrobiellen Cholesterinoxidasen unterscheidet.
  • Das Nocardioform-Enzym ist sehr stabil und über einen breiten pH-Bereich (pH 6,0 bis 8,0) aktiv, der Km-Wert für Cholesterin ist 1,4 x 10&supmin;&sup5; mol/liter bei 25ºC, und das Enzym is hochspezifisch für Δ&sup4;- oder Δ&sup5;-3β- Sterole. Die Cholesterinoxidase ist in der Form, in der sie von den Nocardioformen produziert wird, membranassoziiert. Zur Reinigung ist eine Extraktion mit Detergentien und eine Beseitigung der Lipide notwendig.
  • Singer, et al., J. Bacteriol., 1988, Bd. 170, S. 638-645 beschreiben die Expression von Genen in Rhodococcus sp. sowohl von E. coli als auch von Streptomyces sp. und die Entwicklung eines Shuttle-Plasmids, welches auf einem E. coli-Plasmid basiert und einen von einem Rhodococcus-Plasmid abgeleiteten Replikationsursprung enthält. Das Plasmid ist in der Lage in E. coli und in einigen, allerdings nicht allen, getesten Rhodococcus-Arten zu replizieren.
  • Murooka et al., Applied and Environmental Mikrobiology, Bd. 52, 1986, S. 1382-1385 beschreiben die Clonierung und Expression eines Streptomyces Cholesterinoxidase-Gens in Streptomyces lividans mit dem Plasmid PIJ702.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Wir haben entdeckt, daß rekombinante DNA-Sequenzen aus einem Nocardioformen-Mikroorganismus effizient in einem Wirtsmikroorganismus exprimiert werden können.
  • Die Erfindung betrifft gemäß einem Merkmal einen Klonierungsvektor, welcher eine DNA-Sequenz, die von einem Nocardioformen-Mikroorganismus stammt, enthält, wobei diese DNA-Sequenz eine Cholesterinoxidase codiert, und der betreffende Clonierungsvektor in der Lage ist, die genannte DNA- Sequenz in einem Streptomyces-Wirtsorganismus zu exprimieren. In einer bevorzugten Anwendungsform stammt die DNA-Sequenz aus Rhodococcus sp. NCIB 10554 (National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Scotland) und der Wirtsmikroorganismus ist S. lividans; und der Clonierungsvektor ist das Plasmid PSL81.
  • Entsprechend der Erfindung wird die Cholesterinoxidase dadurch hergestellt, daß man von einem Clonierungsvektor ausgeht, welcher eine für die Cholesterinoxidase codierende DNA-Sequenz aus einem Nocardioformen Mikroorganismus enthält, daß eine Streptomyces-Wirtszelle mit dem Clonierungsvektor transformiert wird, um eine rekombinante Wirtszelle zu erhalten, daß die rekombinante Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression der DNA-Sequenz erlauben, kultiviert wird und daß die Cholesterinoxidase isoliert wird. In einer bevorzugten Anwendungsform ist der Nocardioform- Organismus Rhodococcus sp. NCIB 10554; die Wirtszelle ist vorzugsweise S. lividans; und der Clonierungsvektor ist das Plasmid pSL81.
  • Cholesterinoxidase, die entsprechend der Erfindung produziert wird, kann dazu verwendet werden, Cholesterin in einer Probe zu bestimmen, und zwar dadurch, daß die Probe mit der rekombinanten Cholesterinoxidase in Kontakt gebracht wird, und das Ausmaß der Cholesterinoxidation bestimmt wird, insbesondere durch die Messung des Sauerstoffverbrauchs mit einer Sauerstoffelektrode oder durch die Messung der Produktion von Wasserstoffperoxid, oder durch die spektrometrische Bestimmung der Cholesterinkonversion zu Δ&sup4;-Cholestenon.
  • Die Erfindung ermöglicht die Expression von DNA-Sequenzen aus einem Nocardioform-Mikroorganismus in einem Wirtsmikroorganismus, der unter den Bedingungen einer gewerblichen Produktion einfacher zu manipulieren ist als der Ausgangsorganismus selbst, und für den Clonierungstechniken bekannt sind. Die rekombinante Cholesterinoxidase, die von einem Nocardioform-Mikroorganismus abgeleitet ist, wird als ein extrazelluläres Protein exprimiert, also unter Expressionsbedingungen, die zu einer wesentlich höheren Produktion des Enzyms führen können. Außerdem wird zur Expression die Zugabe eines Induktors nicht benötigt und das exprimierte Enzym ist frei von Lipiden der Nocardioform-Membran.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden von der folgenden Beschreibung der aus der Erfindung abgeleiteten bevorzugten Anwendungsform und von den Patentansprüchen offensichtlich werden.
    • Beschreibung der bevorzugten Anwendungsform
  • Zunächst werden die Zeichnungen beschrieben.
    • Zeichnungen
  • Abbildung 1 ist eine Restriktions-Endonuklease-Karte des Plasmids pSL81.
  • Abbildung 2 (2.1-2.12) ist eine Beschreibung der Sequenz des Rhodococcus 10554-Cholesterinoxidase-Gens und der entsprechenden Aminosäuresequenz Abbildung 3 ist eine Restriktions-Endonuklease-Karte des Plasmids pSL81, welche das 2,8 kb-BGlII-Fragment aus Abbildung 1 zeigt.
    • Isolation und Expression des Gens
  • Die Expression von DNA-Sequenzen aus einem Nocardioform-Mikroorganismus kann im allgemeinen dadurch durchgeführt werden, daß zuerst eine genomische Bank durch Einführen der DNA-Sequenzen in einen geeigneten Clonierungsvektor, welcher einen geeigneten Replikationsursprung, der mit dem gewünschten Wirtsorganismus kompatibel ist, konstruiert wird. Anschließend wird eine Wirtszelle einer Streptomyces-Art mit dem Vektor, welcher die DNA-Sequenz enthält, transformiert. Dann werden die Transformanten im Hinblick auf die Aktivität des gewünschten Genproduktes überprüft und die aktiven Clone werden isoliert und charakterisiert.
    • Konstruktion der Genbank
  • Das folgende zur Verdeutlichung gezeigte Protokoll beschreibt die Konstruktion einer Genbank von Rhodococcus sp. NCIB 10554 (Rhodococcus 10554)-DNA in einem Wirt, z.B. S. lividans, der in der Lage ist, die DNA des Ausgangsorganismuses zu exprimieren. In dem unten beschriebenen Beispiel wird eine Population von transformierten Zellen, die mit Hilfe dieser Genbank hergestellt wurden, auf die Expression des Cholesterinoxidase-Gens von Rhodococcus 10554 hin überprüft.
  • Im allgemeinen wurde eine genomische Genbank von Rhodococcus 10554-DNA, ausgehend von einer hochmolekularen DNA, die isoliert und mit Hilfe des Restriktionsenzyms Sau3A fragmentiert worden war, um Fragmente im Größenbereich von 4 bis 8 Kilobasenpaaren zu erhalten, konstruiert. Die größenfraktionierte DNA von Rhodococcus 10554 wurde dann mit dem Clonierungsplasmid PIJ702, welches mit BGlII gespalten worden war, ligiert. Das Plasmid PIJ702 ist über die American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) (ATCC No. 35287) kommerziell erhältlich. Die Hybridplasmide der Genbank wurden in S. lividans-Zellen transformiert, um die Genbank von Rhodococcus 10554-DNA im Wirtsmikroorganismus zu erzeugen.
  • Im folgenden einige Details des Verfahrens: Eine Einzelkolonie von Rhodococcus 10554 wurde verwendet, um 50 ml von NBYE-Medium (8 g/l Difco Nährmedium, 5 gil Difco Hefeextrakt) zu inokulieren. Andere Medien, die für das Wachstum von Rhodococcus sp. als geeignet beschrieben wurden, können ebenfalls verwendet werden. Die Kultur ließ man bei 30ºC für 48 Stunden wachsen, und die Zellen wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 10.000 U/min in einer Sorvall RC-58-Zentrifuge in einem SS-34-Rotor geerntet. Die Zellen wurden in 18 ml Tris-Glucose (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 25% Gew./Vol. Glucose) resuspendiert, und es wurden 2 ml einer Lysozym-Lösung (10 mg/ml Lysozyme (Sigma) in einer Tris-Glucoselösung) zugefügt. Diese Mischung wurde während 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden 2,4 ml 10% Gew./Vol. Natriumdodecylsulfat (Sigma) zugegeben, und die Mischung wurde heftig gerührt, um eine homogene Lösung der lysierten Zellen zu erhalten. Die lysierten Zellen wurden bei 55ºC 2 Stunden lang inkubiert und dann wurden 2,7 ml 5 M NaClO&sub4; (Sigma) zugegeben. Denaturierte Proteine und Zellbestandteile wurden durch zweimalige Extraktion der lysierten Zellösung mit 20 ml Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) mit anschließender Phasentrennung durch zehnminütige Zentrifugation bei 12.000 U/min in einem Sorvall SS-34-Rotor beseitigt. Die wäßrige Phase wurde abgezogen und zwei Volumenteile kaltes Ethanol zugegeben. Die Lösung wurde vorsichtig gemischt und die hochmolekulare DNA wurde mit Hilfe eines Glasstabes, wie in Marmur et al., 1961, J. Mol. Biol., Bd. 3, S. 203-218 beschrieben, isoliert. Die isolierte DNA wurde zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen und in 5 ml TE (10 mM Tris, 1 mM EOTA, pH 8,0) gelöst. Zu der DNA-Lösung wurde DNAse freie RNAse (Sigma) zu einer Endkonzentration von 100 mg/ml gegeben und für 30 Minuten bei 42ºC inkubiert. Anschließend wurden 0,6 ml 10% Gew./Vol. Natriumdodecylsulfat und 0,6 ml 5 M NaCl zugegeben und die Mischung einmal mit Phenol: Chloroform (1:1) und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Die DNA wurde mit 2 Volumenteilen Ethanol präzipitiert und wie zuvor mit Hilfe eines Glasstabes isoliert. Die DNA wurde einmal mit 70% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und zu einer Endkonzentration von etwa 1 mg/ml in TE resuspendiert.
  • Um die Bedingungen für die Isolierung partiell verdauter hochmolekularer Rhodococcus 10554-DNA zu ermitteln, wurden Testreaktionen mit verschiedenen Konzentrationen des Restriktionsenzyms Sau3A zum Verdau der DNA durchgeführt. Ein Reaktionsansatz enthielt 10 µl DNA, 15 µl 10 x Sau3A- Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM MgCl&sub2;, 500 mM KCl) und 125 µl Wasser. 15 µl-Aliquots wurden in Reaktionsgefäße, die mit 1-9 beschriftet wurden, gegeben und auf Eis gekühlt. Genau 4 Units des Enzyms Sau3A (10 Units/µl BRL) wurden zum Reaktionsgefäß 1 gegeben und gut gemischt. Zweifache Serienverdünnungen des Reaktionsgemisches aus Reaktionsgefäß 1 wurden sequenziell bis zum Reaktionsgefäß 8 durchgeführt, um Reaktionsgemische zu erhalten, die zweifach abnehmende Konzentrationen des Enzyms Sau3A enthalten. Das Reaktionsgefäß 9, welches kein Enzym enthielt, wurde als unverdaute Kontrollreaktion verwendet. Die Reaktionsgefäße wurden 1 Stunde bei 37ºC inkubiert und die Reaktion durch Gabe der Reaktionsgefäße auf Eis und Zugabe von EDTA (20 mM) gestoppt. Das Ausmaß des Verdaus in jedem Reaktionsgefäß wurde durch Agarosegel-Elektrophorese sichtbar gemacht, und der Reaktionsansatz, welcher DNA-Fragmente in dem geschätzten Größenbereich von 2-20 kb enthielt, wurde bis zu 200fach vergrößert und die Reaktion wiederholt. Die verdaute Rhodococcus 10554-DNA wurde durch Agarosegel-Elektrophorese unter Verwendung von Low Gelling Temperature- Agarose (Seaplaque, FMC) aufgetrennt. Der Gelbereich, welcher DNA-Fragmente des Größenbereiches von 4-8 kb enthielt, wurde mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten und die DNA durch Elektroelution zurückgewonnen. Die DNA wurde mit konventionellen Methoden gefällt, und das Präzipitat wurde in TE zu einer Endkonzentration von 0,025 mg/ml resuspendiert.
  • Eine Einzelkolonie von S. lividans/pIJ702 wurde verwendet, um 50 ml YEME (3 g/l Difco Hefeextrakt, 5 g/l Difco Pepton, 3 g/l Oxoid Malzextrakt, 10 g/l Glucose, 340 g/l Sucrose, 5 mM MgCl&sub2;, 0,4 % w/v Glycin) zu inokulieren, und wurde mit dem Plasmid selektiven Agens Thiostrepton (Cal- Biochem) zu einer Endkonzentration von 50 µg/ml supplementiert. Andere Medien, die für Streptomyces beschrieben wurden, können ebenfalls verwendet werden. Die Kultur wurde während 3 Tagen bei 30ºC inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation während 30 Minuten bei 10.000 U/min in einer Sorvall-Zentrifuge in einem SS-34-Rotor geerntet. Das Präzipitat wurde in 5 ml TSE-Puffer (25 mM Tris, pH 8,0, 0.3 M Sucrose; 25 mM EDTA), welcher 10 mg Lysozym enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. 3 ml einer alkalischen SDS-Lösung (0,3 M NaOH, 2 % Gew./Vol. Natriumdodecylsulfat) wurden zugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 10 Minuten und anschließend bei 70ºC während 10 Minuten inkubiert. Die lysierte Zellösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit einem Volumenteil Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert. Die wäßrige Phase wurde in ein sauberes Reaktionsgefäß gegeben und 0,3 M Natriumacetat, pH 4,8 und 1 Volumenteil Isopropanol zugegeben. Die DNA wurde für 30 Minuten bei -20ºC gefällt und durch Zentrifugation mit einem Sorvall SS-34-Rotor für 10 Minuten bei 10.000 U/min zurückgewonnen. Das Präzipitat wurde in 2 ml TE resuspendiert, und die Plasmid- DNA durch Gleichgewichts-Ultrazentrifugation in einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten, entsprechend bekannter Techniken, gereinigt.
  • Das auf diese Weise präparierte Plasmid PIJ702 wurde in TE zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml resuspendiert. Etwa 10 µl (10 µg) der DNA wurden zu 5 µl 10 x BGlII-Puffer (500 mM Tris HCl, pH 7,4; 50 mM MgCl&sub2;; 500 mM KCl), 32 µl destillierten Wassers und 3 µl des Restriktionsenzyms BglII (10 Units/µl BRL) gegeben und während 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch einmalige Extraktion mit Phenol:Chloroform (1:1) und einmalige Extraktion mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) beendet. Die DNA wurde durch die Zugabe eines halben Volumenteiles 7,5 M Ammoniumacetat und 2 Volumenteilen kalten Ethanols gefällt. Nach einer mindestens zweistündigen Inkubation bei -20ºC wurde die DNA in einem Eppendorf-Mikroreaktionsgefäß durch zehnminütige Zentrifugation gesammelt. Das DNA-Präzipitat wurde einmal mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 µl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 resuspendiert. Um die DNA zu dephosphorylieren, wurde 1 µl alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (2 U/µl, IBI) zugegeben und die Reaktion für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 150 µl Stopp-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA, pH 7,5; 200 mM NaCl; 0,5 % w/v Natriumdodecylsulphat) gestoppt und anschließend einmal mit Phenol:Chloroform (1:1) und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol gefällt, getrocknet und in TE zu einer Endkonzentration von 0,05 mg/ml resuspendiert und bei -20ºC gelagert.
  • Etwa 10 µl (0,5 µg) der dephosphorilierten BglII-verdauten PIJ702-DNA wurde zu etwa 20 µl (0,5 gg) der Sau3A-verdauten Rhodococcus-DNA gegeben. Ein 20 µl-Aliquot des 5 x Ligasepuffers (BRL), 0,5 µl Ligase (NEB) und 50 µl Wasser wurden zugefügt und der Ligationsansatz 20 Stunden bei 14ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch zehnminütiges Erhitzen auf 65ºC beendet, und die Probe wurde bei -20ºC gelagert.
  • Ein vegetatives Inokulum wurde durch die Kultur von S. lividans in 25 µl Kulturmedium hergestellt, wie es für die Präparation von S. lividans/pIJ702 beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß das Medium kein Thiostrepton enthielt. Die Zellen wurden in einer Laborbank-Zentrifuge bei 3.000 U/min während 10 Minuten geerntet und zweimal mit 10 ml einer 10,3 %igen (Gew./Vol.) Sucroselösung gewaschen. Das Zellpräzipitat wurde in 4 ml Lysozymmedium (L-Medium, Thompson et al., 1982, J. Bacteriol., Bd. 151, S. 668-677) resuspendiert und für 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Ein 5 ml-Aliquot des Protoplastenmediums (P-Medium, Okanishi, et al., 1974, J. Gen. Microbiol., Bd. 80, S. 389-400) wurde zugegeben und die Lösung durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Die Protoplasten wurden durch Glaswolle (welche Mycelien abtrennt, Protoplasten jedoch passieren läßt) gefiltert, durch Zentrifugation geerntet und in 2 ml P-Medium resuspendiert. Die Protoplasten wurden frisch verwendet oder in P-Medium bei -70ºC gefroren aufbewahrt.
  • Bis zu 3 pl der ligierten Plasmid-DNA in Ligations-Puffer wurde vorsichtig mit 50 µl S. lividans-Protoplasten in einem kleinen sterilen Reaktionsgefäß gemischt. Zu dieser Mixtur wurden 200 gl Transformations-Puffer (T-Puffer, Thomson, et al., 1982, J. Bacteriol, Bd. 151, S. 668-667) zugegeben und durch Pipettieren gemischt. Sofort anschließend wurden die Zellen vorsichtig auf R2YE-Medium (Thompson, et al., 1980, Nature (London), Bd. 286, S. 525-527) verteilt und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Auf die regenerierten Protoplasten wurde ein Filterpapier (Whatman 541, 9,0 cm), welches 100 µg/ml Thiostrepton enthielt, gelegt und für 3 Tage bei 30ºC inkubiert. Unter diesen Transformationsbedingungen wurden etwa 200-500 Transformanten pro Platte erhalten. Etwa 12.000 Thiostreptonresistente S. lividans-Transformanten wurden auf diese Art und Weise erhalten. Uber 70 % dieser Transformanten enthielten rekombinante PIJ702- Plasmide wie durch Miniprep-DNA-Analyse bestimmt wurde. Diese rekombinanten Plasmide repräsentieren die genomische Genbank von Rhodococcus 10554- DNA.
    • Suche nach Cholesterinoxidase-Aktivität
  • Als ein Beispiel, welches die Expression einer DNA-Sequenz aus einem Nocardioform-Mikroorganismus zeigt, wurden rekombinante S. lividans-Zellen, welche die genomische Genbank von Rhodococcus 10554-DNA enthalten, auf die Expression der Cholesterinoxidase-Aktivität hin gescreent. Cholesterinoxidase wurde mit Hilfe einer Methode, die nach Allain et al., 1974, Physical Chem., Bd. 20, S. 470-475 modifiziert wurde, untersucht. Runde Filterpapiere wurden mit einem Puffer, welcher 4-Aminoantipyrin, Phenol, Meerrettichperoxidase und Triton X-100 enthält, getränkt und auf Kolonien gelegt, welche auf Agarmedium, das Cholesterinsubstrat enthält, wachsen. Alternativ könnten diese Kolonien durch Halo-Erscheinungen in einem Agarmedium, welches Cholesterin enthält, untersucht werden, wobei die Hab-Bildung abhängig ist von der Konversion von Cholesterin zu Cholestenon durch lösliche Cholesterinoxidase. Rekombinante S. lividans-Kolonien, die die Cholesterinoxidase produzierten, wurden gereinigt und charakterisiert.
  • Die Details der Screening-Prozedur der genomischen Genbank nach Cholesterinoxidase-Aktivität waren wie folgt: Die Filterpapiere, die verwendet wurden, um Thiostrepton zu R2YE-Transformationsplatten zur Selektion von S. lividans-Transformanten zu geben, wurden abgehoben und auf Screening- Platten gegeben [das Medium enthält pro Liter: Agar, 15 g; Glycerol, 20 g; Hefeextrakt, 1 g; MgSO&sub4;, 0,66 g; Puffersalze, 66 µl (pro Liter: Na&sub2;HPO&sub4;; 28 g; NaH&sub2;PO&sub4;, 30 g; K&sub2;HPO&sub4;, 20 g; (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 127,5 g) und Spurensalze, 2 ml (pro Liter: konzentrierte HCl, 250 ml; CaCl&sub2;, 3,57 g; ZnSO&sub4;, 20 g; CuCl&sub2;, 0,85 g; NaMoO&sub4;, 4,8 g; MnCl&sub2;, 2,0 g; FeCl&sub3;, 5,4 g; Borsäure 0,3 g; CoCl&sub2;, 2,4 g)] mit Cholesterin (1,6 mM, Sigma) und Thiostrepton (50 µg/ml). Diese Replikaplatten wurden während 3 Tagen bei 30ºC inkubiert. Die Replikafilter wurden entfernt und durch sterile Filterpapiere, die mit Cholesterinoxidase-Testreagens (100 mM Zitronensäure-Puffer, pH 6,0; 0,2 mM 4-Aminoantipyrin (Aldrich); Meerrettichperoxidase I, 600 Einheiten pro Liter; 6,4 mM Cholsterin; 10 mM Phenol und 4 % Gew./Vol. Triton X-100) getränkt wurden, ersetzt. Die Platten wurden bei 30ºC inkubiert, und die Kolonien wurden während 4 Stunden auf die Entwicklung einer roten Zone, die auf eine Cholesterinoxidase-Aktivität, welche auf die weißen Filterpapiere diffundierte, hin untersucht. Nach einer vierstündigen Inkubation bei 30ºC wurden die Filterpapiere, welche das Testreagens enthielten, von den Screening-Platten entfernt, und die Platten wurden bei 30ºC über Nacht erneut inkubiert, um die Bildung von farblosen Halos, die mit dem Abbau von Cholesterin durch die Cholesterinoxidase assoziiert ist, zu ermöglichen. Von den etwa 8.000 untersuchten rekombinanten S. lividans-Kolonien zeigten 2 Cholesterinoxidase-Aktivität. Die Plasmid-DNA von einem dieser Isolate wurde mit pSL81 bezeichnet und wurde weiter analysiert.
  • Die Plasmid-DNA aus der S. lividans/pSL81-Rekombinante wurde isoliert und zurück in S. lividans transformiert, wobei die gleiche Prozedur, die für die Isolierung und Transformation von pIJ702 beschrieben wurde, angewandt wurde. Alle erhaltenen Thiostrepton-resistenten Transformanten enthielten das gleiche Plasmid pIJ702 mit etwa 6 kb inserierter DNA und zeigten die Cholesterinoxidase-Aktivität, die für die Originalrekombinante kennzeichnend war. Die Entfernung des Plasmids pSL81 aus den S. lividans-Zellen durch Wachsen in Abwesenheit des selektiven Druckes führte zum gleichzeitigen Verlust der Thiostrepton-Resistenz und der Cholesterinoxidase-Aktivität. Durch Southern-Hybridisierung wurde gezeigt, daß die Insert-DNA vom Rhodococcus 10554-Genom stammte. Unter Bezugnahme auf Abbildung 1 beinhaltet das rekombinante Plasmid, welches mit pSL81 bezeichnet wurde, den Clonierungsvektor pIJ702 12 und die Insert-DNA 14 aus Rhodococcus 10554 und besitzt die Restriktionsendonuklease-Spaltstellen wie angegeben.
  • Das wie oben präparierte Plasmid pSL81 wurde verwendet, um einen chromosomalen Verdau der Cholesterinoxidase-produzierenden Nocardioformen Rhodococcus NCIB 10554, R. erythropolis NCIB 9158, Nocardia erythropolis ATCC 17895 und Nocardia erythropolis ATCC 4277 zu untersuchen. Die Stämme zeigten alle kreuz-hybridisierende DNA-Banden, so daß davon ausgegangen werden kann, daß die Cholesterinoxidase-codierende Region in diesen Nocardioformen die gleiche ist. Das Plasmid pSL81 zeigte keine spezifische Kreuz-Hybridisierung mit DNA, welche von den Cholesterinoxidase-produzierenden Streptomyceten, insbesondere Streptomyces violascene NRRL B-2700, isoliert wurde.
    • DNA-Sequenzierung
  • Um die Sequenz des Cholesterinoxidase-Gens zu bestimmen, wurden Subclone von pSL81 konstruiert und eine Cholesterinoxidase-codierende Region auf ein 2,8 kb BglII-Fragment in dem Subclon pSL81Δ15 (Abbildung 3) eingegrenzt. Dieses Fragment wurde dann in E. coli auf Plasmid pBR322 eingefügt, und es wurde eine Reihe von Deletionskonstrukten hergestellt, wobei die verfügbaren Restriktionsseiten verwendet wurden. Die Sequenzierung erfolgte mit denaturierter doppelsträngiger Plasmid-DNA mit Hilfe der Didesoxy-Ketten-Abbruchmethode von Sanger et al., PNAS USA, Bd. 74, S. 5463-5467. Im besonderen wurde ein Sequenase-Version-2.0-Kit (United States Biochemical Corp.) entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet. Abhängig vom G+C-Gehalt einer sequenzierten DNA wurde die Kettenpolymerisations-Reaktion mit Desoxyguanidintriphosphat oder Desoxy-7-deazoguanidintriphosphat terminiert. Die Primer-verlängerten Oligonukleotide wurden auf einem denaturierendem 6 %igen Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, und die DNA-Sequenzen von benachbarten DNA-Fragmenten wurden zusammengesetzt, um eine komplette DNA-Sequenz des Cholesterinoxidase-Gens zu erhalten. Die Sequenz ist in Abbildung 2 gezeigt. Die Subclonierung des Rhodococcus-Cholesterinoxidase-Gens in pSL81Δ15 kann zu einem Anstieg der Expression des Cholesterinoxidase-Proteins führen. Rekombinante S. lividans-Zellen wurden auf RZYE-Agar mit 50 µg/ml Thiostrepton kultiviert. Nach einer zwei- bis dreitägigen Inkubation bei 30ºC wurden die Mycelien und Sporen von der Oberfläche des Agars abgekratzt und dazu verwendet 50 ml einer YEME 12,5 µg/ml Thiostrepton-Saatkultur zu inokulieren. Diese Kulturen wurden unter heftigem Schütteln bei 30ºC inkubiert und nach 48 Stunden wurden 2 l-Fermenter, welche YEME 12,5 µg/ml Thiostrepton enthielten, mit der Saatkultur inokuliert. Die kontrollierte Fermentation wurde bei 28ºC und dem pH 7,0 mit 0,5 l/min Luftzufuhr und einer Rührgeschwindigkeit von 1.000 U/min durchgeführt. Das Maximum der Cholesterinoxidaseaktivität wurde nach 48 Stunden erreicht und in einigen dieser Kulturen war die Expression in den S. lividans/pSL81Δ15-Fermentation wesentlich höher als in den S. lividans/pSL81-Fermentationen.
    • Proteincharakterisierung
  • Die rekombinante Cholesterinoxidase wurde aus drei Tage alten Kulturen von S. lividans/pSL81-Zellen, welche in YEME 25 ml-Medium mit 50 µg/ml Thiostrepton kultiviert wurden, isoliert. Nicht-rekombinante Cholesterinoxidase wurde von 48-Stunden Kulturen von Rhodococcus 10554-Kulturen, die in flüssigem Produktionsmedium wuchsen, isoliert. Bei diesem handelt es sich um dasselbe Medium wie das, welches für die Screening-Platten verwendet wurde, jedoch wurde es nicht mit Agar verfestigt. Induktionsexperimente wurden unter den gleichen Wachstumsbedingungen in der Anwesenheit von Sterol als Induktor durchgeführt. Die intrazellulären und extrazellulären Fraktionen wurden durch Zentrifugation gewonnen und mittels eines Cholesterinoxidase-spezifischen diagnostischen Testsystems auf Cholesterinoxidase-Aktivität hin untersucht. Die Spezifität der rekombinanten Cholesterinoxidase aus S. lividans und der gereinigten Cholesterinoxidase aus Rhodococcus 10554 wurde mit Hilfe verschiedener Sterolsubstrate verglichen. Beide Enzyme zeigten ein ähnliches Profil mit der Aktivitätsreihenfolge Cholesterin, Pregenolon, Dihydroxycholesterin, Stigmasterin und Ergosterin.
  • Die rekombinante Cholesterinoxidase aus S. lividans/pSL81 war in Standarddiagnose-Testverfahren zur Bestimmung von Cholesterin funktionell. Ein Aliquot des zellfreien Überstandes einer drei Tage alten Kultur von rekombinanten Zellen, die in YEME wuchsen, wurde mit dem Cholesterinoxidase-Testreagens (1,4 ml von 0,33 mg/ml 4-Aminophenazon in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, 0,05 % Triton X-100 (Gew./Vol.); 1,4 ml von 1 mg/ml Phenol in Phosphat Triton X-Puffer; 0,1 ml von 4 mM Cholesterin; und 0,01 ml von 10 mg/ml Peroxidase) gemischt und bei 30ºC inkubiert. Wasserstoffperoxid, das während der Oxidation des Cholesterins entstand und mit dem Aminoantipyrin der Testlösung einen Komplex bildet, wurde durch Messung der Absorption des roten Komplexes bei 505 nm gegen einen Leerwert, welcher Wasser enthielt, bestimmt. Die Rate des Cholesterinabbaus durch das rekombinante Enzym wurde außerdem direkt dadurch bestimmt, daß der Anstieg der Absorption bei 240 nm aufgrund einer Δ&sup4;-Cholesterin-Produktion verfolgt wurde. Zu 2,9 ml Natriumphosphat-Puffer (0,1 M, pH 7,0) in einer Kuvette wurden 100 µl 3 % Triton X-100 (Gew./Vol.) und 50 µl einer 6 mM Cholesterinlösung zugegeben. Das verdünnte Enzym wurde in einer Konzentration von etwa 0,2 U/ml in Puffer zugegeben, und die Absorption bei 240 nm wurde mit einem Beckman-Spektrophotometer bestimmt. Die Cholesterinoxidase-Aktivität wurde wie folgt berechnet:
  • wobei
  • RV = Reaktionsvolumen
  • DF = Verdünnungsfaktor
  • SV = Probenvolumen
  • PC = Proteinkonzentration
  • ist.
  • Die weitere Charakterisierung der rekombinanten Cholesterinoxidase aus S. lividans/pSL81 zeigte, daß das Enzym auch dazu verwendet werden konnte, um Cholesterin in Seren mit Hilfe der Peroxidase-gekoppelten Reaktion zu bestimmen.
  • Die rekombinante Cholesterinoxidase aus S. lividans/pSL81 und gereinigte Rhodococcus 10554-Cholesterinoxidase wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit einem 10 %igen Polyacrylamid-Gel und dem Puffersystem von Laemelli, 1970, Nature, Bd. 227, S. 680 et seq. analysiert. Nach Vergleich mit dem Biorad-Molekulargewichtsstandard wurde das Molekulargewicht beider Enzyme mit 55 kDa bestimmt.
    • Peptidsequenzierung
  • Die rekombinante Cholesterinoxidase aus S. lividans/pSL81 15 und die nicht-rekombinante Cholesterinoxidase aus R. rhodococcus wurden als einzelne Banden aus einem Polyacrylamid-Gel isoliert und die Amino-terminale Peptidsequenz wurde mit einem Proteinsequenzierungsgerät bestimmt. Beide Peptidsequenzen wurden aus der rekombinanten Proteinbande gewonnen:
  • NH&sub2;-Gly-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Leu-Thr-Pro-Pro-Pro-Ala-Phe- und
  • NH&sub2;-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Leu-Thr-Pro-Pro-Pro-Ala-Phe-.
  • Diese Peptidsequenzen sind identisch mit denen, die direkt von den DNA- Sequenzen zwischen den Positionen 280 und 320 bzw. Positionen 283 und 320 abgeleitet wurden. Die Entfernung eines Glycinrestes am N-Terminus einer rekombinanten Sequenz ist wahrscheinlich auf einen Unterschied im posttranslationellen Prozessieren durch die Wirtszelle zurückzuführen.
  • Die Amino-terminale Sequenzierung der Cholesterinoxidase von R. rhodococcus führte zur Identifikation der Sequenz
  • NH&sub2;-Thr-Pro-Pro-Pro-Ala-Phe-Pro-Glu-Gly-Ile-Ala-Leu-Tyr-Gln-Gln-,
  • die der Peptidsequenz, welche von der DNA-Sequenz zwischen Positionen 300 und 346 abgeleitet wird, entspricht. Deshalb ist das Enzym, welches im S. lividans/pSL81Δ15-Kulturmedium zu finden ist, entweder 6 oder 7 Aminosäuren länger als das Membran-gebundene Enzym, welches in R. rhodococcus gefunden wird.
  • Das Prozessieren von sekretierten Proteinen aus gram-Positiven beinhaltet oft die Spaltung einer Signalsequenz gefolgt von der Hydrolyse an einer sekundären Prozessierungsstelle. Im Falle von nativer Cholesterinoxidase ist diese sekundäre Seite am Threonin. Offensichtlich erfolgt eine solche sekundäre Spaltung nicht, wenn das Protein von S. lividans synthesiert und extrazellulär sekretiert wird.
    • Andere Anwendungsformen
  • Andere Anwendungsformen bleiben innerhalb der folgenden Patentansprüche Zum Beispiel könnten andere Arten eines jeglichen Genus der Nocardioformen beinhaltend Rhodococcus NCIB 10554, R. erythropolis NCIB 9158, Nocardia erythropolis ATCC 17895 und Nocardia erythropolis ATCC 4277, verwendet werden, um die genomische Genbank herzustellen; oder aber die Genbank könnte nach anderen nützlichen metabolischen Aktivitäten durchsucht werden, wie zum Beispiel der Assimilation von Alkanen und aromatischen Hydrocarbonen; der Degradation von Lignin, Detergentien und Pestiziden; der Produktion von Enzymen, welche in der xenobiotischen Transformation nützlich sind; der Biosynthese von Antibiotika, Aminosäuren und biologischen oberflächenaktiven Substanzen; und der Produktion von anderen Steroid-modifizierenden Enzymen, wie zum Beispiel Cholesterinesterase.
  • Da andere Streptomyceten und auch Bacillus-Arten die gleichen Vorteile wie S. lividans in bezug auf die Expression von heterologen Genen haben, könnten auch sie als geeignete Wirte für die Expression von DNA-Sequenzen aus Nocardioformen-Mikroorganismen dienen. Andere Bakterien, welche zu den gram-positiven Bakterien mit hohem G+C-Gehalt gehören - das beinhaltet jegliche Nocardioformen, Mycobacterium, Corynebacterium, und Athrobacter - wären geeignete Wirte für die Clonierung von DNA-Sequenzen aus Nocardioformen-Mikroorganismen.
  • S. lividans/pSL81 kann in einer oder mehreren Regionen außerhalb der Cholesterinoxidase-codierenden Region rearrangieren und kann Cholesterinoxidase-transformierende Aktivität erhalten. Ein solches rearrangiertes S. lividans/pSL81-Plasmid hat mindestens 3,6 kb der 6 kb Rhodococcus-DNA unverändert, wie durch Restriktionskartierung bestimmt wurde. In diesem rearrangierten S. lividans/pSL81-Plasmid fand eine DNA-Insertion von etwa 2,5 kb in der Region rechts der PvuII-Erkennungsstelle statt. Cholesterinoxidase konnte aus S. lividans-Kulturen, die mit diesem rearrangierten Plasmid transformiert waren, gewonnen werden, wenngleich in niedrigeren Mengen als S. lividans/pSL81-Kulturen.
  • In einer weiteren Anwendungsform könnte die Expression der Cholesterinoxidase durch weitere, dem Fachmann offensichtliche Manipulationen des pSL81Δ15-Clones gesteigert werden. Zum Beispiel könnte ein Vektor mit höherer Kopienzahl, wie zum Beispiel pIJ303, beschrieben in Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, verwendet werden.
  • Die Genexpression könnte außerdem durch das Ersetzen des Cholesterinoxidase-Promotors durch einen stärkeren exogenen Promotor, wie z.B. dem Erme-Promtor, beschrieben in Bibb et al., 1985, Gene, Bd. 38, S. 215- 226; dem aph-Promotor, beschrieben in Hopwood et al., 1985; oder einem tac-Promotor, beschrieben in Amman et al., 1984, Gene, Bd. 25, S. 167 et seq. erhöht werden.
    • Hinterlegungen
  • Entsprechend den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung für die Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck der Patenterteilung, wurde das Plasmid pSL81 bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, MD, USA hinterlegt.

Claims (25)

1. Klonierungsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die sich von einem Nocardioform-Mikroorganismus ableitet, wobei die DNA-Sequenz eine Cholesterinoxidase codiert und der Klonierungsvektor die DNA-Sequenz in einem Streptomyces-Mikroorganismus als Wirt exprimiert.
2. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Nocardioform-Mikroorganismus Rhodococcus sp. NCIB 10554 ist.
3. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtmikroorganismus S. lividans ist.
4. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine Aminosäuresequenz codiert, die die Sequenz Thr Pro Pro Pro Ala Phe Pro Glu Gly Ile Ala Leu Tyr Gln Gln umfaßt.
5. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine Aminosäuresequenz codiert, die die Sequenz Gly Pro Val Ser Thr Leu Thr Pro Pro Pro Ala Phe Pro Glu Gly Ile Ala Leu Tyr Gln Gln umfaßt.
6. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine Aminosäuresequenz codiert, die die Sequenz Gly Gly Pro Val Ser Thr Leu Thr Pro Pro Pro Ala Phe Pro Glu Gly Ile Ala Leu Tyr Gln Gln umfaßt.
7. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine Aminosäuresequenz codiert, die die Sequenz
umfaßt.
8. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz die Sequenz ACA CCG CCG CCC GCC TTC CCC GAA GGC ATC GCG CTG TAC CAG CAG umfaßt, welche die Aminosäuresequenz in Anspruch 4 codiert.
9. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz die Sequenz GGT CCT GTC TCC ACC CTC ACA CCG CCG CCC GCC TTC CCC GAA GGC ATC GCG CTG TAC CAG CAG umfaßt, die die Aminosäuresequenz nach Anspruch 5 codiert.
10. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz die Sequenz GGT GGT CCT GTC TCC ACC CTC ACA CCG CCG CCC GCC TTC CCC GAA GGC ATC GCG CTG TAC CAG CAG umfaßt, die die Aminosäuresequenz von Anspruch 6 codiert.
11. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz die Sequenz:
umfaßt.
12. Klonierungsvektor nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz die Sequenz
umfaßt.
13. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Nocardioform-Mikroorganismus R. erythropolis NCIB 9158 ist.
14. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Nocardioform-Mikroorganismus Nocardia erythropolis ATCC 17895 ist.
15. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß der Nocardioform-Mikroorganismus Nocardia erythropolis ATCC 4277 ist.
16. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er weiter einen Erme-Promtor umfaßt.
17. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er weiter einen aph-Promotor umfaßt.
18. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er weiter einen tac-Promotor umfaßt.
19. Plasmid pSL81, wie in Figur 2 dargestellt.
20. Zelle eines Spezies von Streptomyces, transformiert mit dem Klonierungsvektor von Anspruch 1.
21. Zelle des Spezies S. lividans, transformiert mit dem Klonierungsvektor von Anspruch 3.
22. Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase, umfassend Bereitstellung eines Klonierungsvektors, enthaltend eine DNA-Sequenz, die sich von einem Nocardioform-Mikroorganismus ableitet, wobei die DNA-Sequenz Cholesterinoxidase codiert, Transformierung einer Streptomyces-Wirtzelle mit dem Klonierungsvektor unter Bildung einer rekombinanten Wirtzelle,
Züchten der rekombinanten Wirtzelle bei Bedingungen, die die Exprimierung der DNA-Sequenz erlauben, und Gewinnung der Cholesterinoxidase.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Nocardioform-Organismus Rhodococcus sp. NCIB 10554 ist.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtzelle S. lividans ist.
25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Klonierungsvektor das Plasmid pSL81, wie in Figur 2 dargestellt, ist.
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