JPH04218367A - 新規コレステロール・オキシダーゼ - Google Patents
新規コレステロール・オキシダーゼInfo
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- JPH04218367A JPH04218367A JP3076143A JP7614391A JPH04218367A JP H04218367 A JPH04218367 A JP H04218367A JP 3076143 A JP3076143 A JP 3076143A JP 7614391 A JP7614391 A JP 7614391A JP H04218367 A JPH04218367 A JP H04218367A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高い基質親和性と酸性
側に作用至適ｐＨを有する新規なコレステロール・オキ
シダーゼおよびその製造法に関する。コレステロール・
オキシダーゼは、コレステロール（５−ｃｈｏｌｅｓｔ
ｅｎ−３−β−ｏｌ）を基質として、酸化反応により４
−コレステン−３−オン（４−ｃｈｏｌｅｓｔｅｎ −
３−ｏｎｅ） と過酸化水素を生ずる反応を触媒する酵
素であり、臨床検査薬として、血中コレステロールの定
量などに用いられる。 【０００２】 【従来の技術】コレステロール・オキシダーゼは、シゾ
フィラム属、ストレプトベルティシリウム属、ブレビバ
クテリウム属およびストレプトマイセス属などに属する
微生物によって生産されることが知られており、既にこ
れらの微生物を用いて、工業的規模での発酵生産が行わ
れている。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】従来、血中コレステロ
ールの定量などに用いられているコレステロール・オキ
シダーゼは、基質親和性が低く、含有するコレステロー
ルの濃度が低い試料の分析や、試料を希釈した後に測定
を行う場合の反応の定量性に問題点があることが指摘さ
れていた。また、作用至適ｐＨ域が比較的狭いので、試
料中の他の成分、例えばビリルビンなどの影響を回避す
るために反応ｐＨを酸性側に設定したとき、反応性の低
下の問題があるとされていた。さらに、上記のコレステ
ロール・オキシダーゼ生産菌として知られる微生物のコ
レステロール・オキシダーゼ生産量はきわめて低く、ま
た精製の段階において、夾雑タンパク質を除去するため
に、多段階にわたる精製操作が必要であった。 【０００４】従って、高い基質親和性と広い作用至適ｐ
Ｈを有するコレステロール・オキシダーゼ、および夾雑
タンパク質などの併産が少なく、コレステロール・オキ
シダーゼ生産量が高い微生物の開発が望まれている。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明者は、基質である
コレステロールに対する親和性が高く、酸性域において
も効率よく作用する性質をもったコレステロール・オキ
シダーゼを、工業的に安価に、しかも高純度に製造する
方法について種々検討した。その結果、ブレビバクテリ
ウム属に属する菌株より、既知のコレステロール・オキ
シダーゼとは異なる基質親和性、作用ｐＨ域および等電
点を有する、コレステロール・オキシダーゼのイソ酵素
の産生に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを単離し、この
コレステロール・オキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片
を組み込んだ組換え体ＤＮＡをエッシェリヒア属菌種に
導入することによって得られた微生物を用いることによ
り、高い基質親和性と広い作用至適ｐＨを有する新規コ
レステロール・オキシダーゼを収率よく製造できること
を見出し、本発明を完成した。 【０００６】本発明は、配列番号１で表わされるＤＮＡ
配列を有し、かつ下記の理化学的性質を有する新規コレ
ステロール・オキシダーゼ（以下、コレステロール・オ
キシダーゼＩＩと称す）およびその製造法を提供する。 （ａ）作用：酸素の存在下コレステロールを酸化し、過
酸化水素と４−コレステン−３−オンを生成する反応を
触媒する。 （ｂ）等電点：ｐＨ４．７ （ｃ）基質特異性：コレステロール、β−シトステロー
ル、スチグマステロール、プレグネノロン、デヒドロイ
ソアンドロステロン、エストラジオールに作用し、ビタ
ミンＤ３ 、コール酸、アンドロステロン、コレステロ
ールリノレート、ラノステロールは基質としない。 （ｄ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは５．０
〜７．５であり、５０℃、６０分間の加熱条件下では、
ｐＨ５．３〜７．５の範囲内で安定である。 （ｅ）作用適温：５０℃付近に至適作用温度を有する。 （ｆ）ｐＨおよび温度による失活の条件：５０℃、１時
間の加熱条件下では、ｐＨ１０．０以上またはｐＨ４．
０以下で失活する。また、ｐＨ７．０、６０℃、１時間
の熱処理で約８３％失活する。 （ｇ）阻害および安定化：ｐ−クロロマーキュリベンゼ
ンスルホネート、硝酸銀、ｏ−ヒドロキシキノリンによ
り阻害を受ける。また、牛血清アルブミンを共存させる
ことにより、耐熱性および保存安定性が向上する。 （ｈ）コレステロールに対するミハエリス定数（ｋｍ値
）：３．０×１０−５Ｍ以下に、本発明を詳細に説明す
る。 【０００７】コレステロール・オキシダーゼＩＩは、従
来コレステロール・オキシダーゼ生産菌として知られて
いるブレビバクテリウム・ステロリカムＡＴＣＣ２１３
８７株（特公昭４８−１１９０）より新たに分離された
酵素であり、従来のＡＴＣＣ２１３８７ 株由来のコレ
ステロール・オキシダーゼ （以下コレステロール・オ
キシダーゼＩと称す） とは、以下のような点で性質の
異なる新規酵素である。 （１）等電点：コレステロール・オキシダーゼＩＩがｐ
Ｈ４．７であるのに対し、コレステロール・オキシダー
ゼＩはｐＨ８．９である。 （２）基質特異性：コレステロール・オキシダーゼＩお
よびＩＩの基質特異性を第１表に示す。 【０００８】 【表１】 【０００９】（３）作用至適ｐＨ：コレステロール・オ
キシダーゼＩＩがｐＨ５．０〜７．５であるのに対し、
コレステロール・オキシダーゼＩはｐＨ６．０〜７．５
である。 （４）コレステロールに対するミハエリス定数（ｋｍ値
）：コレステロール・オキシダーゼＩＩが ３．０×１
０−５Ｍ であるのに対し、コレステロール・オキシダ
ーゼＩは１．１×１０−３Ｍである。 （５）阻害剤の影響： 阻害剤（１ｍＭ） を添加し
たときのコレステロール・オキシダーゼＩおよびＩＩの
酵素活性を阻害剤無添加時の酵素活性を１００ とし、
第２表に示す。 【００１０】 【表２】 【００１１】（６）分子量：東洋曹達社製ＴＳＫ Ｇ
３０００ＳＷ塔を用いて分析したところ、その溶出パタ
ーンから ４３，０００ と推定される。ＤＮＡ配列か
ら分子量は５５，２０６である。これに対し、コレステ
ロール・オキシダーゼＩの場合は、ファルマシア社製セ
ファデックスゲルろ過担体を用いた分析により３３，０
００と推定されている。 【００１２】コレステロール・オキシダーゼＩＩの生産
は、コレステロール・オキシダーゼＩＩ生産能を有する
微生物を培養することにより行うことができる。コレス
テロール・オキシダーゼＩＩは、ブレビバクテリウム・
ステロリカム由来の新規酵素であるが、その活性発現量
はごく微量であり、ブレビバクテリウム・ステロリカム
菌種を通常培養して得られる培養液からは、分離精製が
困難である。従って、ブレビバクテリウム・ステロリカ
ム菌種の染色体ＤＮＡよりコレステロール・オキシダー
ゼＩＩをコードする遺伝子を単離し、適当な宿主・ベク
ター系を用いて該遺伝子を増幅することにより、コレス
テロール・オキシダーゼＩＩ生産菌を得ることができる
。 【００１３】以下に、コレステロール・オキシダーゼＩ
Ｉ生産菌の造成について説明する。ブレビバクテリウム
属に属する菌株からのコレステロール・オキシダーゼＩ
Ｉ遺伝子のショットガン・クローニングは、大腸菌を宿
主として直接活性発現を指標とした検索により行うこと
ができる。直接活性発現を指標とした検索については例
えば、形質転換体の菌体を直接酵素源として用いるか、
リゾチームなどで溶菌し、得られた細胞内容物を用いて
酵素活性を測定する方法や、培地中にコレステロールを
混合しておき、菌体外に微量漏出する酵素活性によるコ
レステロールの酸化にともなう清澄なハロー形成を観察
することによって行うことができる。 【００１４】ブレビバクテリウム属に属する菌株からの
コレステロール・オキシダーゼＩＩ遺伝子を含む染色体
ＤＮＡの単離は常法に従って、例えば、分子生物学実験
マニュアル（Ｒ．Ｆ．シュライフ、Ｐ．Ｃ．ウエンシン
ク著、川上正也、山崎達美訳、講談社サイエンティフィ
ク、１９８３年発行）に記載された方法によって行うこ
とができる。 【００１５】ついで、上記で得られた染色体ＤＮＡをベ
クターＤＮＡに組み込んで、組換え体ＤＮＡを調製する
。染色体ＤＮＡの組み込みは、常法に従って、例えば染
色体ＤＮＡおよびベクターＤＮＡを適当な制限酵素で切
断して染色体ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡ断片を調
製した後、両者の混合物をＤＮＡリガーゼで処理するこ
とによって行うことができる。ここで用いられるベクタ
ーＤＮＡとしては、大腸菌を宿主とすることが可能なプ
ラスミドであればすべて可能であり、とりわけｐＵＣ１
３やｐＰＲＯＫ−Ｃなどが好適に用いられる。また、制
限酵素としては、例えば、ＢａｍＨＩ、Ｓａｕ３ＡＩな
どが挙げられる。Ｓａｕ３ＡＩの切断部位は、ＢａｍＨ
Ｉでの切断部位と同じ構造の突出末端を生じるため、組
換えのためのライゲーションが可能であり、染色体ＤＮ
ＡをＳａｕ３ＡＩで限定分解して得られるＤＮＡ断片を
、ＢａｍＨＩで切断したベクターＤＮＡ断片と連結する
ことができる。ＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ４ファージ
感染大腸菌由来のＴ４ＤＮＡリガーゼが好適に用いられ
る。 【００１６】ついで、上記方法で得られた組換え体ＤＮ
Ａは、常法に従って、例えば、モレキュラー・クローニ
ング（Ｔ．マニアチス、Ｅ．Ｆ．フリッチ、Ｊ．サムブ
ルック著、コールドスプリングハーバー出版社、１９８
２年）に記載の方法によって大腸菌に導入することがで
きる。組換え体ＤＮＡ（すなわちコレステロール・オキ
シダーゼＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んだベク
ターＤＮＡ）を保有する菌株の選択方法は、次のように
して行うことができる。すなわち、菌株を０．１％コレ
ステロール、０．１％トリトンＸ−１００、０．００２
５％アンピシリンを含むＬＢ固体培地で培養し、生じた
コロニーのうちコロニー周辺に清澄なハローを形成して
いるものを選択する。ついで、それらのコロニーをマイ
クロタイタープレートに植菌し、コレステロールオキシ
ダーゼ活性の有無を検定する。このようにして得られる
組換え体プラスミドの一例が、ｐｎＨ１０である。得ら
れたプラスミドｐｎＨ１０を保有する微生物として、エ
ッシェリヒア・コリｎＨ１０が挙げられる。該菌株は、
平成２年４月５日付で、工業技術院微生物工業技術研究
所にエッシェリヒア・コリｎＨ１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−
２８５０）として、ブダペスト条約に基づいて寄託され
ている。 【００１７】上記のようにして得られたコレステロール
・オキシダーゼＩＩ生産菌は、栄養培地で培養すること
により、培養菌体および培養上清中に著量のコレステロ
ール・オキシダーゼＩＩを蓄積する。コレステロール・
オキシダーゼＩＩ生産菌の培養に用いられる培地として
は、炭素源、窒素源、無機物などを含有する合成培地ま
たは天然培地のいずれも使用できる。炭素源としては、
例えば乳酸、グリセロール、糖蜜など種々の炭水化物が
用いられ、その使用量は５〜７０ｇ／ｌ程度が好ましい
。また、窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、あるいはペプトン、酵母エキス、コーン・スティー
プ・リカー、カゼイン加水分解物、肉エキスなどの窒素
含有有機物などが用いられ、その使用量は、５〜２０ｇ
／ｌ程度が好ましい。さらに、無機物としては、例えば
、塩化ナトリウム、リン酸第一水素カリウム、リン酸第
二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなど
が用いられ、その使用量は０．０５〜５ｇ／ｌ程度が好
ましい。培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好
気的条件下に行われる。培養温度は３０〜３７℃が好適
であり、培養期間は通常１６〜４０時間程度である。 【００１８】培養を終了した培養液から、コレステロー
ル・オキシダーゼＩＩを採取するには、上記培養液から
遠心分離などの方法で菌体を集め、得られた菌体を超音
波処理、ガラスビーズを用いる磨砕処理、フレンチプレ
ス処理などによって破砕し、酵素を抽出する。抽出液は
、これを硫安塩析法、イオン交換樹脂を用いるクロマト
グラフィー、ゲル濾過法、ヒドロキシアパタイト吸着樹
脂を用いるクロマトグラフィーなどの常法により処理し
て、精製コレステロール・オキシダーゼＩＩを得ること
ができる。菌体外に蓄積する酵素については、菌体破砕
の操作を省略する以外は上記と同様に行い、コレステロ
ール・オキシダーゼＩＩを取得できる。 【００１９】このようにして得られたコレステロール・
オキシダーゼＩＩの理化学的性質について、以下に詳述
する（なおコレステロール・オキシダーゼＩＩは、実施
例２で得られた精製標品を用いた）。Ｉ．作用酸素の存
在下コレステロールを酸化して、過酸化水素と４−コレ
ステン−３−オンを生成する反応を触媒する。（イ）過
酸化水素の生成の確認酸素の存在下コレステロールにコ
レステロール・オキシダーゼＩＩを作用させ、ついで該
酵素系にパーオキシダーゼ、フェノール、４−アミノア
ンチピリンを加えて反応させると、反応系にキノンイミ
ン色素が生成する。反応組成 １．０ ｍｌ ３ｍＭ コレステロール、１．０
％トリトンＸ−１００水溶液 ０．３ ｍｌ ５０
ｍＭコール酸ナトリウム水溶液 ０．３ ｍｌ ０
．５Ｍ Ｎａ−Ｋ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．５ ｍｌ ４２ｍＭ フェノール水溶液 ０
．５ ｍｌ ２．４ｍＭ ４−アミノアンチピリン水
溶液 ０．２ ｍｌ ２ｍｇ／ｍｌパーオキシダー
ゼ （東洋紡社製、比活性 １１５単位／ｍｇ 蛋白）
０．２ ｍｌ コレステロール・オキシダ
ーゼＩＩ水溶液（０．５ 単位）反応組成に示した各試
薬を混ぜ、３７℃で攪拌下、発生する過酸化水素量を生
成したキノンイミン系色素の比色定量によって求めた。 即ち、上記の系において生成した過酸化水素を、クリニ
カルケミストリー第２０巻、４７０頁（１９７４年）に
記載の方法で定量した結果、０．１５μｍｏｌｅのコレ
ステロールから０．１９１ｍｏｌｅの過酸化水素の生成
が確認された。（ロ）酸素消費の確認酸素の存在下、コ
レステロールにコレステロール・オキシダーゼＩＩを作
用させ、消費される酸素の量をワールブルグ検圧計によ
って測定した。反応組成 １．０ ｍｌ ３ｍＭ
コレステロール、１．５％トリトンＸ−１００水溶液
０．３ ｍｌ ５０ｍＭコール酸ナトリウム水溶液
０．３ ｍｌ ０．５Ｍ Ｎａ−Ｋ リン酸緩衝
液（ｐＨ ６．０） ０．５ ｍｌ ４２ｍＭフェ
ノール水溶液 ０．５ ｍｌ ２．４ｍＭ ４−ア
ミノアンチピリン水溶液 ０．２ ｍｌ ２ ｍｇ
／ｍｌ パーオキシダーゼ （東洋紡社製、比活性１１
５ 単位／ｍｇ蛋白） ０．２ ｍｌ コレス
テロール・オキシダーゼＩＩ水溶液（０．５ 単位）反
応組成に示した各試薬を混ぜ、３７℃で攪拌下、酸素吸
収により生ずる反応容器内外の気体の圧力差を、一端を
容器に連結し他端を外気と連結した円筒中のマノメータ
ー液の異動によって解消させ、その際のマノメーター液
の移動量を測定した。該マノメーター液の移動量は次式
（ウムブレイト・ブリス・スタウファー著：マノメトリ
ック・アンド・ビオケミカル・テクニックス、第５版、
第５章）によって、標準状態の理想気体の消費量に換算
される。 【００２０】 【数１】 【００２１】ここで、標準状態における理想気体の消費
量：Ｖ（単位μｌ ）、測定時の大気圧：Ｐ（単位ｍｍ
Ｈｇ） 、測定時の反応温度における水蒸気圧：Ｐｗ（
単位ｍｍＨｇ） 、測定時の反応温度：Ｔ（単位Ｋ゜）
、マノメーター液の移動量：ΔＶｇ（単位μｌ）である
。また標準状態において１μｌ の気体は０．０４４６
μｍｏｌｅに相当する。 測定結果より、１．５μｍｏｌｅのコレステロールとコ
レステロール・オキシダーゼＩＩを反応させると、１．
４３μｍｏｌｅの酸素が消費されることが確認された。 （ハ）４−コレステン−３−オンの生成の確認酸素の存
在下、コレステロールにコレステロール・オキシダーゼ
ＩＩを作用させ、反応生成物を４−コレステン−３−オ
ンと同定した。同定の手順 １）反応液 ６．０ ｍｌ ５０ｍＭコレステロール、エタノ
ール溶液 ５．０ ｍｌ ５０ｍＭコール酸ナトリ
ウム水溶液 １．５ ｍｌ トリトンＸ−１００
５．０ ｍｌ ０．５Ｍ Ｎａ−Ｋ リン酸緩
衝液（ｐＨ ７．５） １３．０ｍｌ コレステロ
ール・オキシダーゼＩＩ水溶液（１９単位） １９．
５ｍｌ 水 ２）反応操作 上記反応液を３７℃で振盪下に反応させ、３０分後、３
時間後、１６時間後に５０μｌずつ試料採取を行い、５
０μｌのヘキサンと混合した後、上清を５μｌ取り、３
）の同定操作を行った。 ３）同定 この反応液中の生成物は以下に示す薄層クロマトグラフ
ィー（以下ＴＬＣと略す）の結果、４−コレステン−３
−オンであると同定した。 【００２２】使用した薄層プレートはシリカゲル・Ｇ−
６０Ｆ−２５４（商品名、Ｅメルク社製）で、展開溶剤
は溶剤系〔ヘキサン：酢酸エチル＝３：２（容量比）〕
である。展開後、プレートを紫外線（波長２５４ｎｍ）
照射下、蛍光発色を観測した後、リンモリブデン酸反応
を行って、反応生成物のＲｆ値が標品のそれらと一致す
ることを確認した。結果を第３表に示す。 【００２３】 【表３】 【００２４】第３表に示したように、生成物と４−コレ
ステン−３−オン標品のＲｆ値が完全に一致することか
ら両者の同一性が確認された。即ち酸素の存在下、コレ
ステロールにコレステロール・オキシダーゼＩＩを作用
させて得られる生成物が、４−コレステン−３−オンで
あることが確認された。（ニ） 上記の（イ）、（ロ
）、（ハ）に記載された方法によって求められた過酸化
水素生成量、酸素の消費量、反応生成物の同定結果によ
り、下式に従って、本酵素がコレステロールを特異的に
酸化すること、過酸化水素を発生させること、コレステ
ロールを酸化して４−コレステン−３−オンを生成する
こと、即ち、本酵素がコレステロールオキシダーゼ活性
を持つことが確認された。 【００２５】 【化１】 【００２６】ＩＩ．至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲作用至
適ｐＨ域は、ｐＨ５．０〜７．５の範囲にある。測定は
、各ｐＨ（リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸ナト
リウム緩衝液）において、３７℃で５分間反応後の活性
を測定することにより行った。このとき、コレステロー
ル・オキシダーゼＩについても同様に測定を行った。 結果を第１図に示す。第１図に示したように、コレステ
ロール・オキシダーゼＩＩとコレステロール・オキシダ
ーゼＩの作用至適ｐＨ域は、明らかに異なる。 【００２７】安定ｐＨ範囲はｐＨ５．３〜７．５である
。測定は、５０℃で、６０分間、各ｐＨ（リン酸緩衝液
、トリス塩酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）で処理後
、残存活性を測定した。結果を第２図に示す。 【００２８】ＩＩＩ． 力価の測定法酸素の存在下、
３７℃で１分間にコレステロールを１μｍｏｌｅ分解す
る反応を触媒する酵素量を１単位（ユニット、ｕｎｉｔ
）とする。力価の測定は、コレステロールに酵素を振盪
しながら作用させ、生成する過酸化水素に、パーオキシ
ダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンとフェノール
を作用させ、キノンイミン色素に導く。この生成したキ
ノンイミン色素の可視部の吸収を測定して、発生した過
酸化水素量を求めることによって酵素の力価を測定する
。なお、以下比活性は蛋白／ｍｇあたりの活性（ｕｎｉ
ｔ／ｍｇ ）で表示した。また、酵素蛋白量は２８０ｎ
ｍの吸光度（吸光度１のとき、１ｍｇ／ｍｌ）によって
測定した。 イ）原理 酵素活性の測定は、酵素によって発生する過酸化水素を
、パーオキシダーゼの存在下に、４−アミノアンチピリ
ンとフェノールを反応させ、生成したキノンイミン色素
を定量することによって行う。反応式は次式（１）、（
２）で示される。 【００２９】 【化２】 【００３０】 【化３】 【００３１】（ロ）操作 細型試験管に３ｍＭコレステロール溶液（５０ｍＭのコ
レステロールのエタノール溶液６ｍｌを、９４ｍｌの１
．０５％トリトンＸ−１００溶液中に攪拌しながら加え
、湯煎中で１０分間加熱した後、水中で冷却し、蒸留水
を用いて１００ｍｌとし、１．０％トリトンＸ−１００
溶液とする。調製後３０分以内に使用する）１．０ｍｌ
、５０ｍＭ 胆汁酸ナトリウム溶液０．３ｍｌ、０．
５Ｍリン酸カリウム−ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）
０．３ｍｌ、４２ｍＭフェノール０．５ｍｌ、２．４ｍ
Ｍ４−アミノアンチピリン０．５ｍｌ、１１５単位／ｍ
ｌ西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ０．２ｍｌを入れ、
混合する。ついでこれを３７℃で３分間保温した後、酵
素溶液０．２ｍｌを添加する。 振盪しながら３７℃で５分間ないし１０分間反応を行っ
た後、５００ｎｍの吸光度（以下ＯＤ５００ｎｍ）を測
定した。 （ハ）力価の計算法 コレステロール・オキシダーゼの１単位は、３７℃で１
分間にコレステロールを１μｍｏｌｅ分解する酵素量で
ある。一方、１ｍＭのキノンイミンの吸光係数は５．３
３と報告されている〔クリニカルケミストリー，第２０
巻，４７０頁（１９７４）〕から、求める酵素溶液１ｍ
ｌあたりの力価（Ａ）は、前記操作で求められた反応液
３ｍｌのＯＤ５００ｎｍ を下記ａ）によって規定し、
ｂ）を用いて算出する。ａ）〔（酵素・基質を共に含む
反応液のＯＤ５００ｎｍ）より（基質を除いた反応液の
ＯＤ５００ｎｍ）を差し引いたもの〕から〔（試薬ブラ
ンクのＯＤ５００ｎｍ）より（試薬ブランクから基質を
除いた溶液のＯＤ５００ｎｍ）〕を差し引いたものを△
Ｅと規定する。ｂ）△Ｅ ÷ ５．３３ ÷時間（ｍｉ
ｎ）×３×希釈率＝Ａ酵素溶液の力価（単位／ｍｌ）注
１：試薬ブランクとは反応液中から酵素溶液を除いた溶
液をいう。 【００３２】ＩＶ． 作用適温の範囲 ｐＨ６．６、反応時間３分間における至適温度を検討し
た結果を第３図に示す。至適温度は５０℃付近に存在し
た。 【００３３】Ｖ．ｐＨおよび温度による失活についてコ
レステロール・オキシダーゼＩＩは、ｐＨ８．５以上で
失活する。また、０．０５Ｍリン酸緩衝液中、ｐＨ７．
０で６０分間加熱処理して、残存活性を測定したところ
、第４図に結果を示したように、５０℃で約１０％、６
０℃で約８３％失活する。 【００３４】ＶＩ．基質親和性 コレステロール・オキシダーゼＩＩの基質コレステロー
ルに対するミハエリス定数（Ｋｍ値）は ３．０×１
０−５Ｍであった。一方、コレステロール・オキシダー
ゼＩのＫｍ値は実測の結果、１．１×１０−３Ｍであっ
た。両酵素の種々のコレステロール濃度における反応速
度を計測した結果を、第５図に示す。コレステロール・
オキシダーゼＩに対し、コレステロール・オキシダーゼ
ＩＩのＫｍ値は、約百分の１であった。従って、コレス
テロール・オキシダーゼＩＩのコレステロールに対する
親和性は極めて高く、コレステロールの定量により適し
ていることが判明した。さらに、第５図に示したように
、コレステロール・オキシダーゼＩＩの示すコレステロ
ール飽和曲線は、いわゆるミハエリス・メンテン型であ
り、コレステロール・オキシダーゼＩの示す見かけ上の
コレステロールによる活性化現象を示さない。このこと
は、コレステロール・オキシダーゼＩＩが低濃度域での
血清コレステロールの定量において、コレステロール・
オキシダーゼＩに優る良好な反応性を有することを示し
ている。 【００３５】なお、ミハエリス定数の求め方は、Ｈ．ラ
インウィーバーら、ジャーナル オブ アメリカン
ケミカル ソサイエティー、第５６巻、６５８頁
（１９３４）の記載に従った。 【００３６】ＶＩＩ． コレステロール・オキシダー
ゼＩＩのアミノ酸配列および塩基配列の決定コレステロ
ール・オキシダーゼＩＩの標品はさらに、逆層高速液体
クロマトグラフィーを用いて、２つのサブユニットに分
離、精製することができる。各サブユニットをプロテア
ーゼ、例えば、トリプシンにより消化し、消化物を高速
液体クロマトグラフィーを用いて分画することによって
、プロテアーゼ消化断片が得られる。各消化断片のアミ
ノ酸配列は、アミノ酸シーケンサーを用いる通常の手法
によって分析できる。 【００３７】塩基配列はシーケナーゼＶｅｒ ２．０を
用いるサンガーの方法によって分析できる〔Ｆ．サンガ
ー著：サイエンス、２１４ ，１２０５（１９８１）
〕。以下、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する
。 【００３８】 【実施例】実施例１ コレステロール・オキシダーゼ
ＩＩ遺伝子のクローニング １）コレステロール・オキシダーゼＩＩ遺伝子を含む染
色体ＤＮＡの調製ブレビバクテリウム・ステロリカムＡ
ＴＣＣ ２１３８７株をＬＢ培地〔バクトトリプトン
１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト（以上、デ
ィフコ社製）８ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ（ｐＨ７
．２）〕３０ｍｌ中、３０℃で３日間振盪培養して得ら
れた菌体を、日立製冷却遠心機（ＲＰＲ２０−２ロータ
ー）を用いて４℃で１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心
して集菌し、１０．３％ショ糖溶液で洗浄後再び遠心し
て菌体を集め、カレント・トピックス・イン・マイクロ
バイオロジー・アンド・イムノロジー 第９６巻（１
９８２）に記載されている方法で全染色体ＤＮＡを抽出
し、約１ｍｇの染色体ＤＮＡを得た。 【００３９】２）染色体ＤＮＡ断片のベクターＤＮＡへ
の導入 上記１）で得られた全染色体ＤＮＡ７２μｇをとり、Ｍ
緩衝液〔トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＭ、
ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ、ＮａＣｌ５０ｍＭ、ＤＴＴ（ジ
チオスレイトール）１ｍＭ〕１，０００μｌに溶解して
、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）
３．６単位を添加し、３７℃で３０分間限定分解を行っ
た。ついで、これをモレキュラー・クローニングに記載
されている方法に従って、１０〜４０％ショ糖密度勾配
遠心法により分画を行った。遠心は、日立製超遠心機（
ＳＲＰ２８ローター）を用い、２０℃で２６，０００ｒ
ｐｍ、１６時間行った。遠心後、分画を行い、各分画の
一部をモレキュラー・クローニングに記載されている方
法に従ってアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡ断片
の大きさを測定した。さらに、３〜６ｋｂのＤＮＡ断片
を含む分画のみを集めてエタノール沈澱を行った後、ラ
イゲーション緩衝液〔トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６
） ６６ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、ＤＴＴ ５ｍＭ
、ＡＴＰ １ｍＭ）６０μｌに溶解して約５μｇのＤ
ＮＡ断片を含む染色体ＤＮＡ溶液を得た。また、ベクタ
ーとして使用するｐＰＲＯＫ−Ｃ（クローンテック社製
）１０μｇを、Ｍ緩衝液３００μｌに溶解して、制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ （宝酒造社製） ４０単
位を添加し、３７℃で３時間反応を行って完全分解した
後、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）２０μｌと
仔牛小腸由来アルカリ性ホスファターゼ４単位を添加し
、３７℃で１時間反応を行い、脱リン酸化を行った。さ
らに６５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、エタノ
ール沈澱を行った後、８０μｌのライゲーション緩衝液
に溶解した。ついで、Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した染色
体ＤＮＡ溶液３２μｌとＢａｍＨＩで分解したｐＰＲＯ
Ｋ−Ｃ溶液５μｌを混合し、ライゲーション緩衝液で全
量７５μｌにした後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製
）２単位を添加し、１６℃で１６時間、連結反応を行い
、組換え体ＤＮＡ混成物を得た。 【００４０】３）大腸菌の形質転換 上記２）で得られた組換え体ＤＮＡ混成物を用いて、大
腸菌を形質転換した。形質転換に用いるＤＮＡ感受性菌
の調製法は、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー 第１６６巻 ５７７頁に記載されているハ
ナハンらの方法に準じた。大腸菌ＭＭ２９４株を、ＬＢ
培地で一晩培養後、得られた培養液０．２ｍｌを２０ｍ
ｌのＳＯＢ培地〔バクトトリプトン２０ｇ／ｌ，バクト
イーストエキストラクト０．５０ｇ／ｌ（以上ディフコ
社製）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４ （
ｐＨ７．０）〕に植菌し、３時間培養後、ファルコン２
０７０試験管に移し、氷中に１５分間おき、４℃で遠心
し菌体を集めた。７ｍｌのＴＦＢ〔１０ｍＭ グッド
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２０）、１００ｍＭ ＲｂＣ
ｌ、４５ｍＭ ＭｎＣｌ２ 、１０ｍＭ ＣａＣｌ
２、３ｍＭ ヘキサミン コバルト クロライド
〕に懸濁し、氷中で１５分間静置した。菌体を遠心分離
によって集め、１．６ｍｌのＴＦＢに再び懸濁した。得
られた懸濁液に５６μｌのジメチルスルホキシドを加え
、氷中で５分間緩やかに攪拌した後、５６μｌのβ−メ
ルカプトエタノールを加え、氷中で１０分間緩やかに攪
拌した。５６μｌのジメチルスルホキシドを加え、氷中
で５分間緩やかに攪拌して得られた菌体を、ＤＮＡ感受
性菌として形質転換に使用した。得られたＤＮＡ感受性
菌液２１０μｌをファルコン２０５９試験管に入れ、２
）で作製した組換え体ＤＮＡ混成物１０μｌを加え、緩
やかに攪拌した後、氷中で３０分間静置した。４２℃の
恒温槽中で９０秒間加熱し、氷中に移して２分間保った
。これに８００μｌのＳＯＣ培地（ＳＯＢ培地に２０ｍ
Ｍグルコースを加えたもの）を加え、３７℃で１時間振
盪培養した。得られた培養液を、０．１％コレステロー
ル、０．１％トリトンＸ−１００、０．００２５％アン
ピシリンを含むＬＢ固体培地に接種し、３７℃で一晩培
養し、生育してきたコロニーを形質転換株として取得し
た。 【００４１】４）コレステロール・オキシダーゼＩＩ遺
伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有する形質転換株の選択
上記３）で得られた形質転換株よりコレステロールオキ
シダーゼＩＩ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを、以下の方
法に従って取得した。上記ＬＢ固体培地上に生育した周
辺に清澄なハローを形成しているコロニーを選択し、そ
れらのコロニーをマイクロタイタープレートに植菌し、
コレステロールオキシダーゼ活性の有無を検定した。活
性を検出した形質転換株は、０．００５％のアンピシリ
ンを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩培養した。培
養終了後集菌し、得られた菌体を、１０ｍｌの０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁後、超音波破砕機
（セルディスラプターモデル２００、ブランソン社製）
により菌体を破砕し（出力４０％、１０分間）、遠心後
得られた上清について前記の方法でコレステロール・オ
キシダーゼ活性を測定した。このようにして高いコレス
テロール・オキシダーゼ活性を有する形質転換株エッシ
ェリヒア・コリｎＨ１０株を得た。形質転換株ｎＨ１０
より保有する組換え体プラスミドＤＮＡを回収し、ｐｎ
Ｈ１０を得た。ｐｎＨ１０の構造を、ＨｉｎｄＩＩＩ
，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ，ＡｐａＩ
，ＢａｍＨＩ，ＭｌｕＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳｍａＩ，Ｓｃ
ａＩで切断して、アガロースゲル電気泳動法にて確認し
た結果、ベクターであるｐＰＲＯＫ−Ｃに、挿入遺伝子
である約３．０ｋｂのＤＮＡ断片が組み込まれた構造を
有していた（第６図参照）。 【００４２】５）クローン化したコレステロール・オキ
シダーゼ遺伝子の解析 ｐｎＨ１０が、ブレビバクテリウム・ステロリカムＡＴ
ＣＣ２１３８７の生産する既知のコレステロール・オキ
シダーゼＩとは異なるイソ酵素をコードする遺伝子を含
む組換え体プラスミドであることは、以下の方法により
確認した。すなわち、モレキュラー・クローニング（Ｔ
．マニアチス、Ｅ．Ｆ．フリッチ、Ｊ．サムブルック著
、コールドスプリングハーバー出版社、１９８２年）に
記されている方法に従って、ｎＨ１０株より組換え体プ
ラスミドｐｎＨ１０を調製し、アガロースゲル電気泳動
後、ｐｎＨ１０を含むゲルを１．５Ｍ ＮａＣｌおよ
び０．５Ｍ ＮａＯＨを含む溶液に室温で３０分間漬
け、２本鎖ＤＮＡを変性させた。さらに、ナイロンフィ
ルター上に密着させ、フィルターの下面より１．５Ｍ
ＮａＣｌおよび０．２５Ｍ ＮａＯＨを含む溶液を
浸透させ、変性後のＤＮＡをフィルター上に転写後固定
した。 このようにして調製したフィルターを、ブレビバクテリ
ウム・ステロリカムＡＴＣＣ２１３８７株の産生するコ
レステロール・オキシダーゼＩのアミノ酸の部分配列か
ら推定されるＤＮＡ塩基配列の合成一本鎖ＤＮＡ、すな
わち、配列番号２で表わされるプローブＮｏ．１（６番
目の塩基はＴ，Ｃのいずれか、９番目の塩基はＴ，Ｃの
いずれか、１２番目の塩基はＡ，Ｇ， Ｔのいずれか、
１５番目の塩基はＡ，Ｇのいずれかであり、組み合わせ
て２４通りの合成ＤＮＡの混合物となる。）または、配
列番号３で表わされるプローブＮｏ．２（３番目の塩基
はＡ，Ｇのいずれか、９番目の塩基はＡ，Ｇのいずれか
、１２番目の塩基はＣ，Ｔのいずれか、１５番目の塩基
はＴ，Ａ，Ｇのいずれかであり、組み合わせて２４通り
の合成ＤＮＡの混合物となる。）をγ−３２Ｐ−ＡＴＰ
で標識して得られたＤＮＡプローブを含むハイブリダイ
ゼーションバッファー（ＮａＣｌ ５３．０ｇ／ｌ、
コハク酸ナトリウム２６．５ｇ／ｌ、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、５倍濃度デンハート溶液、０．５％ ＳＤＳ、
０．１ｍｇ／ｍｌ熱変性牛胸腺ＤＮＡ、ｐＨ７．０）と
４５℃で１６時間反応させた後、プローブを含む溶液を
捨て、３倍濃度のＳＳＣ中で６５℃で十分洗浄した。フ
ィルターとＸ線撮影用フィルムを密着させ、−７０℃に
おいて１昼夜感光させ、いわゆるオートラジオグラフィ
ー法によってｐｎＨ１０との反応性を検討した。プロー
ブＮｏ． １はコレステロール・オキシダーゼＩの中央
部分のポリペプチド鎖のアミノ酸部分配列に、プローブ
Ｎｏ． ２はＣ末端部分のアミノ酸配列に対応する。オ
ートラジオグラフィーの解析の結果、ｐｎＨ１０はプロ
ーブＮｏ． １、Ｎｏ．２と全く反応しなかった。この
結果より、プラスミドｐｎＨ１０に含まれるコレステロ
ール・オキシダーゼＩＩ遺伝子は、既知のコレステロー
ル・オキシダーゼＩをコードする遺伝子とは異なること
が明らかになった。 【００４３】実施例２．エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｎＨ１０株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２８５０）をＬＢ培地にアンピシリン０．０
０５％を含有する種培地（殺菌前ｐＨ７．２）３ｍｌに
植菌し、３０℃で１８時間振盪培養した。この種培養液
３ｍｌを、上記種培地と同じ培地を各々５００ｍｌ仕込
んだ ２リットル三角フラスコ（バッフル付き）５本
にそれぞれ加え、３０℃で１６時間振盪培養した。培養
後、培養液を冷却遠心機にて１０，０００×ｇで２０分
間遠心し、約１８．６ｇ（湿菌体重量）の菌体を得た。 得られた湿菌体に１８６ｍｌの０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０、以下バッファーと略称する）を加えて懸
濁した後、超音波菌体破砕機（セルディスラプターモデ
ル２００、ブランソン社製）により３０分間超音波破砕
した（出力７５％、パルス保持時間７０％、フラットチ
ップ装着）。破砕した後、冷却遠心機にて２０，０００
×ｇで１５分間遠心分離し、上清液を無細胞抽出液とし
て得た。得られた無細胞抽出液１９４ｍｌに６０％飽和
になるまで固形硫酸アンモニウムを加え、１Ｎ Ｎａ
ＯＨ溶液でｐＨ７に保ちながら、緩やかに攪拌し、硫酸
アンモニウムが完全に溶解してから、さらに３０分間攪
拌した。その後、冷却遠心機にて２０，０００×ｇで１
５分間遠心し、上清を得た。得られた上清はセロファン
チューブを透析膜として、１リットルのバッファーに対
し１２時間透析し、その後バッファーを交換して、さら
に１２時間透析を行い脱塩した。透析後の粗酵素液９８
．５ｍｌを、予めバッファーで平衡化しておいたＤＥＡ
Ｅ−セルロファイン（生化学工業社製）のカラム（φ７
．５×１５ｃｍ）に通塔した。流速４８０ｍｌ／ｈｒで
バッファー３リットルにて洗浄し、未吸着の蛋白を洗い
出した。次に、ＮａＣｌ濃度を０から０．５Ｍまで直線
的に濃度勾配溶出し、酵素を溶出した。溶出画分のうち
、比活性が１０単位／ｍｇ以上の画分を集めた。溶出パ
ターンを第７図に示した。 【００４４】得られた活性画分を硫酸アンモニウムを６
０％飽和になるまで添加して濃縮し、生成した沈澱をバ
ッファーにて溶解後、前記と同様に透析を行って脱塩し
た。さらに、限外ろ過により濃縮し約２ｍｌとした。こ
れを、予め０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に０
．３ＭのＮａＣｌを加えたもので平衡化しておいたスー
パーロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）ｐｒｅｐ１２ ＨＲ
１６／５０（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）
カラム（φ１．３×５０ｃｍ）に通塔し、８８０ＰＵポ
ンプ（日本分光）に接続し、３０ｍｌ／ｈｒの流速で溶
出を行った。溶出画分のうち比活性１５単位／ｍｇ以上
の画分を集めて、１リットルのバッファーに対し透析し
た。溶出パターンを第８図に示した。得られた活性画分
を、予めバッファーで平衡化しておいたヒドロキシアパ
タイト（生化学工業社製）のカラム（φ３．２×４．０
ｃｍ）に通塔し、流速１００ｍｌ／ｈｒでバッファーで
洗浄したところ、活性はすべて洗液中に回収されていた
。洗液を限外ろ過により濃縮後、本酵素の精製標品とし
た。以上の精製過程を第４表にまとめた。 【００４５】 【表４】 【００４６】さらに、精製酵素標品の純度を検定するた
めに、上記のようにして得られた未変性状態のサンプル
を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。方法は
、デービスらの方法〔Ｂ．Ｊ．デービスら、アナルス・
オブ・ニューヨーク・アカデミイ・オブ・サイエンス、
第 １２１巻、 ４０４頁（１９６４） 〕に従った。 その結果本標品は均一であることがわかった。 【００４７】 【発明の効果】本発明によれば、血清コレステロールを
測定するにあたり、高度の希釈操作などの原因により試
料中のコレステロール濃度が低濃度であったり、ビリル
ビンなどの妨害物質による影響を回避するため、測定ｐ
Ｈを６前後に下げて測定しなければならないような場合
に、既知のコレステロール・オキシダーゼに代わり、よ
り高感度で定量性の高い新規なコレステロール・オキシ
ダーゼを、工業的に安価に提供することができる。 【００４８】 【配列表】 【００４９】配列番号：１ 配列の長さ：１５４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセテ
ィカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源： 生物名：ブレビバクテリウム ステロリカム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔｅｒｏｌｉｃｕｍ ）株名
：ＡＴＣＣ２１３８７ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 特徴を決定した方法：Ｅ その他の情報：コレステロール・オキシダーゼＩＩ構造
遺伝子 配列 ＡＴＧ ＡＣＧ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＣ ＧＡＧ Ｃ
ＡＧ ＴＴＡ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＧＧ ＣＧ
Ａ ＧＧＡ ＴＴＣ ＣＴＣ ４８Ｍｅｔ Ｔ
ｈｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅ
ｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ １
５ １０
１５ ＡＣ
Ｃ ＧＣＧ ＧＧＣ ＧＣＴ ＧＣＧ ＧＧＣ ＧＣＣ
ＧＧＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＡ ＧＣＣ ＧＧＣ
ＧＣＡ ＣＴＣ ＧＧＣ ９６Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ ２０
２５
３０ ＧＧＣ
ＴＧＧ ＡＣＣ ＣＣＧ ＧＣＣ ＴＴＣ ＧＣＣ Ｇ
ＴＣ ＣＣＴ ＧＣＣ ＧＧＴ ＴＣＣ ＧＣＣ ＧＧ
Ｃ ＴＣＣ ＣＴＣ １４４Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｔ
ｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒ
ｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ ３５
４０
４５ ＧＧＡ ＴＣ
Ｇ ＣＴＣ ＧＧＡ ＴＣＧ ＡＣＣ ＧＧＧ ＣＣＧ
ＧＴＣ ＧＣＧ ＣＣＧ ＣＴＴ ＣＣＧ ＡＣＧ
ＣＣＧ ＣＣＧ １９２Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐ
ｒｏ ５０
５５ ６０
ＡＡＣ ＴＴＣ
ＣＣＧ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＧＣＧ ＣＴＧ Ｔ
ＴＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＧＣＧ ＴＡＣ ＣＡＧ ＡＡ
Ｃ ＴＧＧ ２４０Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａ
ｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｔｒｐ
６５ ７０
７５
８０ ＴＣＣ ＡＡＧ ＧＡ
Ｇ ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＣＣ ＡＣＴ
ＴＧＧ ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＣＧ ＣＣＣ ＡＡＧ
ＡＣＧ ２８８Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｉｌｅ
Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｒｐ
Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
８５
９０
９５ ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＡＴ
ＧＴＣ ＧＴＴ ＣＧＣ ＣＴＴ ＧＣＣ ＡＡＣ Ｔ
ＧＧ ＧＣＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＣ ＴＡ
Ｃ ３３６Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖ
ａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ａｌ
ａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ
１００
１０５ １
１０ ＡＡＧ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＣ
Ｇ ＣＧＣ ＧＧＣ ＧＣＧ ＡＴＧ ＣＡＣ ＧＧＣ
ＴＧＧ ＡＣＣ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＣＣ ＧＴＧ
３８４Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｒｐ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ
１１５ １２
０ １２５
ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＧ ＧＣＣ
ＡＡＣ ＧＴＣ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＡＴＣ Ｃ
ＴＣ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＣＧ
４３２Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｔｈｒ １３０
１３５
１４０
ＣＡＴ ＣＴＧ ＡＡＣ ＧＧＣ ＡＴ
Ｃ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＡＣ ＡＣＧ ＧＧＣ ＧＧＣ
ＣＣＣ ＧＴＧ ＧＣＴ ＡＣＣ ＧＴＣ ４
８０Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ １４５
１５０
１５５
１６０ ＡＣＧ ＧＣＣ ＧＧＴ ＧＣＣ ＧＧＣ
ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＧＡＧ ＧＣＧ ＡＴＣ Ｇ
ＴＣ ＡＣＣ ＧＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ５２８
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
１６５
１７０ １７５
ＡＡＧ ＣＡＣ ＧＡＣ ＣＴＣ ＧＧＣ ＴＧ
Ｇ ＧＣＣ ＡＡＣ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＣＴ ＣＣＧ
ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＴＣＧ ５７６Ｌｙ
ｓ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ １
８０ １８５
１９０
ＡＴＣ ＧＧＴ ＧＧＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＣＧ
ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＣＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＧＣＧ Ｇ
ＣＧ ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ６２４Ｉｌｅ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａ
ｓｎ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ｐｒｏ Ａｌａ １９５
２００
２０５ Ｇ
ＴＣ ＧＧＣ ＣＡＧ ＡＣＣ ＡＣＧ ＣＴＧ ＣＣ
Ｃ ＧＧＴ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＡＣ ＧＧＴ ＴＣＧ
ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＡＣ ６７２Ｖａｌ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｓｎ ２１０
２１５
２２０ ＣＴＧ
ＧＴＣ ＡＣＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＧＣＧ
ＧＴＣ ＧＴＣ ＴＧＧ ＡＡＣ ＧＧＣ ＡＡＣ Ａ
ＣＣ ＴＡＣ ＧＣＡ ７２０Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖ
ａｌ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｙ
ｒ Ａｌａ ２２５
２３０ ２３５
２４０ ＣＴＣ Ｇ
ＡＧ ＡＣＧ ＴＡＣ ＣＡＧ ＣＧＣ ＡＡＣ ＧＡ
Ｔ ＣＣＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＡＣＣ ＣＣＡ ＣＴＧ
ＣＴＣ ＡＣＣ ７６８Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ ２４５
２５０
２５５ ＡＡＣ ＣＴＣ
ＧＧＧ ＣＧＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＣ
ＴＣＧ ＧＴＧ ＡＣＧ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＣＣ Ｇ
ＧＣ ＣＣＣ ８１６Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖ
ａｌ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒ
ｏ ２６０
２６５
２７０ ＡＡＣ ＴＴＣ Ｃ
ＧＴ ＣＡＧ ＣＧＧ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＧＣ ＴＡ
Ｃ ＡＣＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＣＣＧ ＴＧＧ ＣＧＧ
ＧＡＡ ８６４Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｇｌ
ｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｇｌｕ
２７５
２８０ ２８
５ ＣＴＧ ＴＴＣ ＧＣＧ
ＣＣＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＡＣ ＧＧＣ
ＣＧＣ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＡＧ ＴＴＣ Ｇ
ＴＣ ９１２Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔ
ｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｖａｌ
２９０ ２９５
３００
ＧＣＧ ＧＡＡ ＴＣＧ Ｇ
ＧＣ ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＡＧ ＧＣＧ ＡＴＣ ＴＧ
Ｇ ＴＡＣ ＣＣＧ ＴＴＣ ＡＣＣ ＧＡＧ ＡＡＧ
９６０Ａｌａ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ ３０５
３１０
３１５
３２０ ＣＣＧ ＴＧＧ ＡＴＧ ＡＡＧ
ＧＴＧ ＴＧＧ ＡＣＧ ＧＴＣ ＴＣＧ ＣＣＧ
ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＣＧ ＧＡＣ ＴＣＧ ＴＣＧ
１００８Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌ
ｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
３２５
３３０
３３５ ＡＡＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＧＡ Ａ
ＧＣ ＣＴＣ ＧＧＣ ＴＣＧ ＧＣＧ ＧＧＣ ＴＣ
Ｃ ＣＴＣ ＧＴＣ ＧＧＣ ＡＡＧ ＣＣＴ １
０５６Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
３４０ ３
４５ ３５０
ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＣＧ ＣＧＴ ＧＡＧ
ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＧＣ ＣＣＧ ＴＡＣ ＡＡＣ
ＴＡＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＣＣ ＧＡＣ １１０
４Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｉ
ｌｅ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ ３５
５ ３６０
３６５
ＡＡＣ ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＡＧ ＣＣＣ Ａ
ＴＣ ＡＣＣ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＴＣ ＧＧＣ ＧＣ
Ｃ ＡＴＣ ＡＡＣ ＧＣＣ ＧＧＡ １１５２Ａ
ｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ ３７０
３７５
３８０
ＡＡＣ ＣＣＣ ＧＧＡ ＡＴＣ ＧＣＡ ＣＣＧ
ＣＴＧ ＴＴＣ ＧＧＣ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＴＧ
ＴＡＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＡＣＣ １２００Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｇ
ｌｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ ３８５
３９０
３９５ ４００
ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＣＧ Ａ
ＣＧ ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＴＧ
Ｇ ＧＧＣ ＴＧＧ ＴＣＧ １２４８Ｌｙｓ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓ
ｎ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｙ
Ｔｒｐ Ｓｅｒ
４０５ ４１０
４１５ ＡＡ
Ｇ ＧＡＣ ＧＴＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＴＣ
ＡＡＧ ＧＣＣ ＡＣＧ ＡＣＧ ＴＴＧ ＣＧＡ
ＣＴＣ ＡＣＣ ＧＡＧ １２９６Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｕ ４２０
４２５
４３０ ＧＧＣ
ＧＧＣ ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＴＣ ＧＴＣ ＡＣＧ Ａ
ＧＣ ＣＧＣ ＧＣＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＧＣＧ ＡＣ
Ｃ ＧＴＧ ＡＴＣ １３４４Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒ
ｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ｉｌｅ ４３５
４４０
４４５ ＡＡＣ ＧＡ
Ｃ ＴＴＣ ＡＣＣ ＧＡＧ ＴＧＧ ＴＴＣ ＣＡＣ
ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＴＣ ＧＡＧ ＴＴＣ ＴＡＣ
ＣＧＣ ＧＣＧ １３９２Ａｓｎ Ａｓｐ Ｐｈｅ
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ
Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ａ
ｌａ ４５０
４５５ ４６０
ＡＡＧ ＧＧＣ
ＧＡＧ ＴＴＣ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＡＣ ＧＧＴ Ｃ
ＣＧ ＧＴＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＣ
Ｇ ＧＧＣ １４４０Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐ
ｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａ
ｌ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ
４６５ ４７０
４７５
４８０ ＴＣＧ ＡＴＣ ＡＧ
Ｇ ＣＡＧ ＣＣＧ ＡＣＧ ＴＣＡ ＡＧＧ ＴＧＣ
ＣＧＴ ＣＧＧ ＴＧＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＣＧＡ
ＣＣＡ １４８８Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｎ
Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ
４８５
４９０
４９５ ＴＣＴ ＣＧＧ ＣＧＡ
ＣＣＣ ＧＴＣ ＣＧＣ ＧＴＣ ＣＧＧ ＡＴＣ Ａ
ＴＣ ＣＧＧ ＡＣＴ ＧＧＧ ＡＣＧ ＴＣＧ ＣＧ
Ａ １５３６Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖ
ａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｒ
ｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
５００
５０５ ５
１０ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＧＡ
１５４５ Ｓｅｒ Ｇｌｙ ＊＊＊ ５１５ 【００５０】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡハイポセティ
カル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＹＥＳ 配列の特徴 他の情報：従来型コレステロール・オキシダーゼ（コレ
ステロール・オキシダーゼＩ）構造遺伝子にコードされ
たポリペプチド鎖の中央部分に対応した合成核酸プロー
ブ配列 ＴＣＲＴＣＤＡＴＹＴ ＧＹＴＣＣＡＴ １７
【００５１】配列番号：３ 配列の長さ：１７塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡハイポセティ
カル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＹＥＳ 配列の特徴 他の情報：従来型コレステロール・オキシダーゼ（コレ
ステロール・オキシダーゼＩ）構造遺伝子にコードされ
たポリペプチド鎖Ｃ末端部分に対応した合成核酸プロー
ブ 配列 ＡＴＤＡＴＹＴＴＲＴ ＣＣＡＴＲＴＴ １７
側に作用至適ｐＨを有する新規なコレステロール・オキ
シダーゼおよびその製造法に関する。コレステロール・
オキシダーゼは、コレステロール（５−ｃｈｏｌｅｓｔ
ｅｎ−３−β−ｏｌ）を基質として、酸化反応により４
−コレステン−３−オン（４−ｃｈｏｌｅｓｔｅｎ −
３−ｏｎｅ） と過酸化水素を生ずる反応を触媒する酵
素であり、臨床検査薬として、血中コレステロールの定
量などに用いられる。 【０００２】 【従来の技術】コレステロール・オキシダーゼは、シゾ
フィラム属、ストレプトベルティシリウム属、ブレビバ
クテリウム属およびストレプトマイセス属などに属する
微生物によって生産されることが知られており、既にこ
れらの微生物を用いて、工業的規模での発酵生産が行わ
れている。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】従来、血中コレステロ
ールの定量などに用いられているコレステロール・オキ
シダーゼは、基質親和性が低く、含有するコレステロー
ルの濃度が低い試料の分析や、試料を希釈した後に測定
を行う場合の反応の定量性に問題点があることが指摘さ
れていた。また、作用至適ｐＨ域が比較的狭いので、試
料中の他の成分、例えばビリルビンなどの影響を回避す
るために反応ｐＨを酸性側に設定したとき、反応性の低
下の問題があるとされていた。さらに、上記のコレステ
ロール・オキシダーゼ生産菌として知られる微生物のコ
レステロール・オキシダーゼ生産量はきわめて低く、ま
た精製の段階において、夾雑タンパク質を除去するため
に、多段階にわたる精製操作が必要であった。 【０００４】従って、高い基質親和性と広い作用至適ｐ
Ｈを有するコレステロール・オキシダーゼ、および夾雑
タンパク質などの併産が少なく、コレステロール・オキ
シダーゼ生産量が高い微生物の開発が望まれている。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明者は、基質である
コレステロールに対する親和性が高く、酸性域において
も効率よく作用する性質をもったコレステロール・オキ
シダーゼを、工業的に安価に、しかも高純度に製造する
方法について種々検討した。その結果、ブレビバクテリ
ウム属に属する菌株より、既知のコレステロール・オキ
シダーゼとは異なる基質親和性、作用ｐＨ域および等電
点を有する、コレステロール・オキシダーゼのイソ酵素
の産生に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを単離し、この
コレステロール・オキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片
を組み込んだ組換え体ＤＮＡをエッシェリヒア属菌種に
導入することによって得られた微生物を用いることによ
り、高い基質親和性と広い作用至適ｐＨを有する新規コ
レステロール・オキシダーゼを収率よく製造できること
を見出し、本発明を完成した。 【０００６】本発明は、配列番号１で表わされるＤＮＡ
配列を有し、かつ下記の理化学的性質を有する新規コレ
ステロール・オキシダーゼ（以下、コレステロール・オ
キシダーゼＩＩと称す）およびその製造法を提供する。 （ａ）作用：酸素の存在下コレステロールを酸化し、過
酸化水素と４−コレステン−３−オンを生成する反応を
触媒する。 （ｂ）等電点：ｐＨ４．７ （ｃ）基質特異性：コレステロール、β−シトステロー
ル、スチグマステロール、プレグネノロン、デヒドロイ
ソアンドロステロン、エストラジオールに作用し、ビタ
ミンＤ３ 、コール酸、アンドロステロン、コレステロ
ールリノレート、ラノステロールは基質としない。 （ｄ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは５．０
〜７．５であり、５０℃、６０分間の加熱条件下では、
ｐＨ５．３〜７．５の範囲内で安定である。 （ｅ）作用適温：５０℃付近に至適作用温度を有する。 （ｆ）ｐＨおよび温度による失活の条件：５０℃、１時
間の加熱条件下では、ｐＨ１０．０以上またはｐＨ４．
０以下で失活する。また、ｐＨ７．０、６０℃、１時間
の熱処理で約８３％失活する。 （ｇ）阻害および安定化：ｐ−クロロマーキュリベンゼ
ンスルホネート、硝酸銀、ｏ−ヒドロキシキノリンによ
り阻害を受ける。また、牛血清アルブミンを共存させる
ことにより、耐熱性および保存安定性が向上する。 （ｈ）コレステロールに対するミハエリス定数（ｋｍ値
）：３．０×１０−５Ｍ以下に、本発明を詳細に説明す
る。 【０００７】コレステロール・オキシダーゼＩＩは、従
来コレステロール・オキシダーゼ生産菌として知られて
いるブレビバクテリウム・ステロリカムＡＴＣＣ２１３
８７株（特公昭４８−１１９０）より新たに分離された
酵素であり、従来のＡＴＣＣ２１３８７ 株由来のコレ
ステロール・オキシダーゼ （以下コレステロール・オ
キシダーゼＩと称す） とは、以下のような点で性質の
異なる新規酵素である。 （１）等電点：コレステロール・オキシダーゼＩＩがｐ
Ｈ４．７であるのに対し、コレステロール・オキシダー
ゼＩはｐＨ８．９である。 （２）基質特異性：コレステロール・オキシダーゼＩお
よびＩＩの基質特異性を第１表に示す。 【０００８】 【表１】 【０００９】（３）作用至適ｐＨ：コレステロール・オ
キシダーゼＩＩがｐＨ５．０〜７．５であるのに対し、
コレステロール・オキシダーゼＩはｐＨ６．０〜７．５
である。 （４）コレステロールに対するミハエリス定数（ｋｍ値
）：コレステロール・オキシダーゼＩＩが ３．０×１
０−５Ｍ であるのに対し、コレステロール・オキシダ
ーゼＩは１．１×１０−３Ｍである。 （５）阻害剤の影響： 阻害剤（１ｍＭ） を添加し
たときのコレステロール・オキシダーゼＩおよびＩＩの
酵素活性を阻害剤無添加時の酵素活性を１００ とし、
第２表に示す。 【００１０】 【表２】 【００１１】（６）分子量：東洋曹達社製ＴＳＫ Ｇ
３０００ＳＷ塔を用いて分析したところ、その溶出パタ
ーンから ４３，０００ と推定される。ＤＮＡ配列か
ら分子量は５５，２０６である。これに対し、コレステ
ロール・オキシダーゼＩの場合は、ファルマシア社製セ
ファデックスゲルろ過担体を用いた分析により３３，０
００と推定されている。 【００１２】コレステロール・オキシダーゼＩＩの生産
は、コレステロール・オキシダーゼＩＩ生産能を有する
微生物を培養することにより行うことができる。コレス
テロール・オキシダーゼＩＩは、ブレビバクテリウム・
ステロリカム由来の新規酵素であるが、その活性発現量
はごく微量であり、ブレビバクテリウム・ステロリカム
菌種を通常培養して得られる培養液からは、分離精製が
困難である。従って、ブレビバクテリウム・ステロリカ
ム菌種の染色体ＤＮＡよりコレステロール・オキシダー
ゼＩＩをコードする遺伝子を単離し、適当な宿主・ベク
ター系を用いて該遺伝子を増幅することにより、コレス
テロール・オキシダーゼＩＩ生産菌を得ることができる
。 【００１３】以下に、コレステロール・オキシダーゼＩ
Ｉ生産菌の造成について説明する。ブレビバクテリウム
属に属する菌株からのコレステロール・オキシダーゼＩ
Ｉ遺伝子のショットガン・クローニングは、大腸菌を宿
主として直接活性発現を指標とした検索により行うこと
ができる。直接活性発現を指標とした検索については例
えば、形質転換体の菌体を直接酵素源として用いるか、
リゾチームなどで溶菌し、得られた細胞内容物を用いて
酵素活性を測定する方法や、培地中にコレステロールを
混合しておき、菌体外に微量漏出する酵素活性によるコ
レステロールの酸化にともなう清澄なハロー形成を観察
することによって行うことができる。 【００１４】ブレビバクテリウム属に属する菌株からの
コレステロール・オキシダーゼＩＩ遺伝子を含む染色体
ＤＮＡの単離は常法に従って、例えば、分子生物学実験
マニュアル（Ｒ．Ｆ．シュライフ、Ｐ．Ｃ．ウエンシン
ク著、川上正也、山崎達美訳、講談社サイエンティフィ
ク、１９８３年発行）に記載された方法によって行うこ
とができる。 【００１５】ついで、上記で得られた染色体ＤＮＡをベ
クターＤＮＡに組み込んで、組換え体ＤＮＡを調製する
。染色体ＤＮＡの組み込みは、常法に従って、例えば染
色体ＤＮＡおよびベクターＤＮＡを適当な制限酵素で切
断して染色体ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡ断片を調
製した後、両者の混合物をＤＮＡリガーゼで処理するこ
とによって行うことができる。ここで用いられるベクタ
ーＤＮＡとしては、大腸菌を宿主とすることが可能なプ
ラスミドであればすべて可能であり、とりわけｐＵＣ１
３やｐＰＲＯＫ−Ｃなどが好適に用いられる。また、制
限酵素としては、例えば、ＢａｍＨＩ、Ｓａｕ３ＡＩな
どが挙げられる。Ｓａｕ３ＡＩの切断部位は、ＢａｍＨ
Ｉでの切断部位と同じ構造の突出末端を生じるため、組
換えのためのライゲーションが可能であり、染色体ＤＮ
ＡをＳａｕ３ＡＩで限定分解して得られるＤＮＡ断片を
、ＢａｍＨＩで切断したベクターＤＮＡ断片と連結する
ことができる。ＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ４ファージ
感染大腸菌由来のＴ４ＤＮＡリガーゼが好適に用いられ
る。 【００１６】ついで、上記方法で得られた組換え体ＤＮ
Ａは、常法に従って、例えば、モレキュラー・クローニ
ング（Ｔ．マニアチス、Ｅ．Ｆ．フリッチ、Ｊ．サムブ
ルック著、コールドスプリングハーバー出版社、１９８
２年）に記載の方法によって大腸菌に導入することがで
きる。組換え体ＤＮＡ（すなわちコレステロール・オキ
シダーゼＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んだベク
ターＤＮＡ）を保有する菌株の選択方法は、次のように
して行うことができる。すなわち、菌株を０．１％コレ
ステロール、０．１％トリトンＸ−１００、０．００２
５％アンピシリンを含むＬＢ固体培地で培養し、生じた
コロニーのうちコロニー周辺に清澄なハローを形成して
いるものを選択する。ついで、それらのコロニーをマイ
クロタイタープレートに植菌し、コレステロールオキシ
ダーゼ活性の有無を検定する。このようにして得られる
組換え体プラスミドの一例が、ｐｎＨ１０である。得ら
れたプラスミドｐｎＨ１０を保有する微生物として、エ
ッシェリヒア・コリｎＨ１０が挙げられる。該菌株は、
平成２年４月５日付で、工業技術院微生物工業技術研究
所にエッシェリヒア・コリｎＨ１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−
２８５０）として、ブダペスト条約に基づいて寄託され
ている。 【００１７】上記のようにして得られたコレステロール
・オキシダーゼＩＩ生産菌は、栄養培地で培養すること
により、培養菌体および培養上清中に著量のコレステロ
ール・オキシダーゼＩＩを蓄積する。コレステロール・
オキシダーゼＩＩ生産菌の培養に用いられる培地として
は、炭素源、窒素源、無機物などを含有する合成培地ま
たは天然培地のいずれも使用できる。炭素源としては、
例えば乳酸、グリセロール、糖蜜など種々の炭水化物が
用いられ、その使用量は５〜７０ｇ／ｌ程度が好ましい
。また、窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、あるいはペプトン、酵母エキス、コーン・スティー
プ・リカー、カゼイン加水分解物、肉エキスなどの窒素
含有有機物などが用いられ、その使用量は、５〜２０ｇ
／ｌ程度が好ましい。さらに、無機物としては、例えば
、塩化ナトリウム、リン酸第一水素カリウム、リン酸第
二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなど
が用いられ、その使用量は０．０５〜５ｇ／ｌ程度が好
ましい。培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好
気的条件下に行われる。培養温度は３０〜３７℃が好適
であり、培養期間は通常１６〜４０時間程度である。 【００１８】培養を終了した培養液から、コレステロー
ル・オキシダーゼＩＩを採取するには、上記培養液から
遠心分離などの方法で菌体を集め、得られた菌体を超音
波処理、ガラスビーズを用いる磨砕処理、フレンチプレ
ス処理などによって破砕し、酵素を抽出する。抽出液は
、これを硫安塩析法、イオン交換樹脂を用いるクロマト
グラフィー、ゲル濾過法、ヒドロキシアパタイト吸着樹
脂を用いるクロマトグラフィーなどの常法により処理し
て、精製コレステロール・オキシダーゼＩＩを得ること
ができる。菌体外に蓄積する酵素については、菌体破砕
の操作を省略する以外は上記と同様に行い、コレステロ
ール・オキシダーゼＩＩを取得できる。 【００１９】このようにして得られたコレステロール・
オキシダーゼＩＩの理化学的性質について、以下に詳述
する（なおコレステロール・オキシダーゼＩＩは、実施
例２で得られた精製標品を用いた）。Ｉ．作用酸素の存
在下コレステロールを酸化して、過酸化水素と４−コレ
ステン−３−オンを生成する反応を触媒する。（イ）過
酸化水素の生成の確認酸素の存在下コレステロールにコ
レステロール・オキシダーゼＩＩを作用させ、ついで該
酵素系にパーオキシダーゼ、フェノール、４−アミノア
ンチピリンを加えて反応させると、反応系にキノンイミ
ン色素が生成する。反応組成 １．０ ｍｌ ３ｍＭ コレステロール、１．０
％トリトンＸ−１００水溶液 ０．３ ｍｌ ５０
ｍＭコール酸ナトリウム水溶液 ０．３ ｍｌ ０
．５Ｍ Ｎａ−Ｋ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．５ ｍｌ ４２ｍＭ フェノール水溶液 ０
．５ ｍｌ ２．４ｍＭ ４−アミノアンチピリン水
溶液 ０．２ ｍｌ ２ｍｇ／ｍｌパーオキシダー
ゼ （東洋紡社製、比活性 １１５単位／ｍｇ 蛋白）
０．２ ｍｌ コレステロール・オキシダ
ーゼＩＩ水溶液（０．５ 単位）反応組成に示した各試
薬を混ぜ、３７℃で攪拌下、発生する過酸化水素量を生
成したキノンイミン系色素の比色定量によって求めた。 即ち、上記の系において生成した過酸化水素を、クリニ
カルケミストリー第２０巻、４７０頁（１９７４年）に
記載の方法で定量した結果、０．１５μｍｏｌｅのコレ
ステロールから０．１９１ｍｏｌｅの過酸化水素の生成
が確認された。（ロ）酸素消費の確認酸素の存在下、コ
レステロールにコレステロール・オキシダーゼＩＩを作
用させ、消費される酸素の量をワールブルグ検圧計によ
って測定した。反応組成 １．０ ｍｌ ３ｍＭ
コレステロール、１．５％トリトンＸ−１００水溶液
０．３ ｍｌ ５０ｍＭコール酸ナトリウム水溶液
０．３ ｍｌ ０．５Ｍ Ｎａ−Ｋ リン酸緩衝
液（ｐＨ ６．０） ０．５ ｍｌ ４２ｍＭフェ
ノール水溶液 ０．５ ｍｌ ２．４ｍＭ ４−ア
ミノアンチピリン水溶液 ０．２ ｍｌ ２ ｍｇ
／ｍｌ パーオキシダーゼ （東洋紡社製、比活性１１
５ 単位／ｍｇ蛋白） ０．２ ｍｌ コレス
テロール・オキシダーゼＩＩ水溶液（０．５ 単位）反
応組成に示した各試薬を混ぜ、３７℃で攪拌下、酸素吸
収により生ずる反応容器内外の気体の圧力差を、一端を
容器に連結し他端を外気と連結した円筒中のマノメータ
ー液の異動によって解消させ、その際のマノメーター液
の移動量を測定した。該マノメーター液の移動量は次式
（ウムブレイト・ブリス・スタウファー著：マノメトリ
ック・アンド・ビオケミカル・テクニックス、第５版、
第５章）によって、標準状態の理想気体の消費量に換算
される。 【００２０】 【数１】 【００２１】ここで、標準状態における理想気体の消費
量：Ｖ（単位μｌ ）、測定時の大気圧：Ｐ（単位ｍｍ
Ｈｇ） 、測定時の反応温度における水蒸気圧：Ｐｗ（
単位ｍｍＨｇ） 、測定時の反応温度：Ｔ（単位Ｋ゜）
、マノメーター液の移動量：ΔＶｇ（単位μｌ）である
。また標準状態において１μｌ の気体は０．０４４６
μｍｏｌｅに相当する。 測定結果より、１．５μｍｏｌｅのコレステロールとコ
レステロール・オキシダーゼＩＩを反応させると、１．
４３μｍｏｌｅの酸素が消費されることが確認された。 （ハ）４−コレステン−３−オンの生成の確認酸素の存
在下、コレステロールにコレステロール・オキシダーゼ
ＩＩを作用させ、反応生成物を４−コレステン−３−オ
ンと同定した。同定の手順 １）反応液 ６．０ ｍｌ ５０ｍＭコレステロール、エタノ
ール溶液 ５．０ ｍｌ ５０ｍＭコール酸ナトリ
ウム水溶液 １．５ ｍｌ トリトンＸ−１００
５．０ ｍｌ ０．５Ｍ Ｎａ−Ｋ リン酸緩
衝液（ｐＨ ７．５） １３．０ｍｌ コレステロ
ール・オキシダーゼＩＩ水溶液（１９単位） １９．
５ｍｌ 水 ２）反応操作 上記反応液を３７℃で振盪下に反応させ、３０分後、３
時間後、１６時間後に５０μｌずつ試料採取を行い、５
０μｌのヘキサンと混合した後、上清を５μｌ取り、３
）の同定操作を行った。 ３）同定 この反応液中の生成物は以下に示す薄層クロマトグラフ
ィー（以下ＴＬＣと略す）の結果、４−コレステン−３
−オンであると同定した。 【００２２】使用した薄層プレートはシリカゲル・Ｇ−
６０Ｆ−２５４（商品名、Ｅメルク社製）で、展開溶剤
は溶剤系〔ヘキサン：酢酸エチル＝３：２（容量比）〕
である。展開後、プレートを紫外線（波長２５４ｎｍ）
照射下、蛍光発色を観測した後、リンモリブデン酸反応
を行って、反応生成物のＲｆ値が標品のそれらと一致す
ることを確認した。結果を第３表に示す。 【００２３】 【表３】 【００２４】第３表に示したように、生成物と４−コレ
ステン−３−オン標品のＲｆ値が完全に一致することか
ら両者の同一性が確認された。即ち酸素の存在下、コレ
ステロールにコレステロール・オキシダーゼＩＩを作用
させて得られる生成物が、４−コレステン−３−オンで
あることが確認された。（ニ） 上記の（イ）、（ロ
）、（ハ）に記載された方法によって求められた過酸化
水素生成量、酸素の消費量、反応生成物の同定結果によ
り、下式に従って、本酵素がコレステロールを特異的に
酸化すること、過酸化水素を発生させること、コレステ
ロールを酸化して４−コレステン−３−オンを生成する
こと、即ち、本酵素がコレステロールオキシダーゼ活性
を持つことが確認された。 【００２５】 【化１】 【００２６】ＩＩ．至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲作用至
適ｐＨ域は、ｐＨ５．０〜７．５の範囲にある。測定は
、各ｐＨ（リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸ナト
リウム緩衝液）において、３７℃で５分間反応後の活性
を測定することにより行った。このとき、コレステロー
ル・オキシダーゼＩについても同様に測定を行った。 結果を第１図に示す。第１図に示したように、コレステ
ロール・オキシダーゼＩＩとコレステロール・オキシダ
ーゼＩの作用至適ｐＨ域は、明らかに異なる。 【００２７】安定ｐＨ範囲はｐＨ５．３〜７．５である
。測定は、５０℃で、６０分間、各ｐＨ（リン酸緩衝液
、トリス塩酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）で処理後
、残存活性を測定した。結果を第２図に示す。 【００２８】ＩＩＩ． 力価の測定法酸素の存在下、
３７℃で１分間にコレステロールを１μｍｏｌｅ分解す
る反応を触媒する酵素量を１単位（ユニット、ｕｎｉｔ
）とする。力価の測定は、コレステロールに酵素を振盪
しながら作用させ、生成する過酸化水素に、パーオキシ
ダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンとフェノール
を作用させ、キノンイミン色素に導く。この生成したキ
ノンイミン色素の可視部の吸収を測定して、発生した過
酸化水素量を求めることによって酵素の力価を測定する
。なお、以下比活性は蛋白／ｍｇあたりの活性（ｕｎｉ
ｔ／ｍｇ ）で表示した。また、酵素蛋白量は２８０ｎ
ｍの吸光度（吸光度１のとき、１ｍｇ／ｍｌ）によって
測定した。 イ）原理 酵素活性の測定は、酵素によって発生する過酸化水素を
、パーオキシダーゼの存在下に、４−アミノアンチピリ
ンとフェノールを反応させ、生成したキノンイミン色素
を定量することによって行う。反応式は次式（１）、（
２）で示される。 【００２９】 【化２】 【００３０】 【化３】 【００３１】（ロ）操作 細型試験管に３ｍＭコレステロール溶液（５０ｍＭのコ
レステロールのエタノール溶液６ｍｌを、９４ｍｌの１
．０５％トリトンＸ−１００溶液中に攪拌しながら加え
、湯煎中で１０分間加熱した後、水中で冷却し、蒸留水
を用いて１００ｍｌとし、１．０％トリトンＸ−１００
溶液とする。調製後３０分以内に使用する）１．０ｍｌ
、５０ｍＭ 胆汁酸ナトリウム溶液０．３ｍｌ、０．
５Ｍリン酸カリウム−ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）
０．３ｍｌ、４２ｍＭフェノール０．５ｍｌ、２．４ｍ
Ｍ４−アミノアンチピリン０．５ｍｌ、１１５単位／ｍ
ｌ西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ０．２ｍｌを入れ、
混合する。ついでこれを３７℃で３分間保温した後、酵
素溶液０．２ｍｌを添加する。 振盪しながら３７℃で５分間ないし１０分間反応を行っ
た後、５００ｎｍの吸光度（以下ＯＤ５００ｎｍ）を測
定した。 （ハ）力価の計算法 コレステロール・オキシダーゼの１単位は、３７℃で１
分間にコレステロールを１μｍｏｌｅ分解する酵素量で
ある。一方、１ｍＭのキノンイミンの吸光係数は５．３
３と報告されている〔クリニカルケミストリー，第２０
巻，４７０頁（１９７４）〕から、求める酵素溶液１ｍ
ｌあたりの力価（Ａ）は、前記操作で求められた反応液
３ｍｌのＯＤ５００ｎｍ を下記ａ）によって規定し、
ｂ）を用いて算出する。ａ）〔（酵素・基質を共に含む
反応液のＯＤ５００ｎｍ）より（基質を除いた反応液の
ＯＤ５００ｎｍ）を差し引いたもの〕から〔（試薬ブラ
ンクのＯＤ５００ｎｍ）より（試薬ブランクから基質を
除いた溶液のＯＤ５００ｎｍ）〕を差し引いたものを△
Ｅと規定する。ｂ）△Ｅ ÷ ５．３３ ÷時間（ｍｉ
ｎ）×３×希釈率＝Ａ酵素溶液の力価（単位／ｍｌ）注
１：試薬ブランクとは反応液中から酵素溶液を除いた溶
液をいう。 【００３２】ＩＶ． 作用適温の範囲 ｐＨ６．６、反応時間３分間における至適温度を検討し
た結果を第３図に示す。至適温度は５０℃付近に存在し
た。 【００３３】Ｖ．ｐＨおよび温度による失活についてコ
レステロール・オキシダーゼＩＩは、ｐＨ８．５以上で
失活する。また、０．０５Ｍリン酸緩衝液中、ｐＨ７．
０で６０分間加熱処理して、残存活性を測定したところ
、第４図に結果を示したように、５０℃で約１０％、６
０℃で約８３％失活する。 【００３４】ＶＩ．基質親和性 コレステロール・オキシダーゼＩＩの基質コレステロー
ルに対するミハエリス定数（Ｋｍ値）は ３．０×１
０−５Ｍであった。一方、コレステロール・オキシダー
ゼＩのＫｍ値は実測の結果、１．１×１０−３Ｍであっ
た。両酵素の種々のコレステロール濃度における反応速
度を計測した結果を、第５図に示す。コレステロール・
オキシダーゼＩに対し、コレステロール・オキシダーゼ
ＩＩのＫｍ値は、約百分の１であった。従って、コレス
テロール・オキシダーゼＩＩのコレステロールに対する
親和性は極めて高く、コレステロールの定量により適し
ていることが判明した。さらに、第５図に示したように
、コレステロール・オキシダーゼＩＩの示すコレステロ
ール飽和曲線は、いわゆるミハエリス・メンテン型であ
り、コレステロール・オキシダーゼＩの示す見かけ上の
コレステロールによる活性化現象を示さない。このこと
は、コレステロール・オキシダーゼＩＩが低濃度域での
血清コレステロールの定量において、コレステロール・
オキシダーゼＩに優る良好な反応性を有することを示し
ている。 【００３５】なお、ミハエリス定数の求め方は、Ｈ．ラ
インウィーバーら、ジャーナル オブ アメリカン
ケミカル ソサイエティー、第５６巻、６５８頁
（１９３４）の記載に従った。 【００３６】ＶＩＩ． コレステロール・オキシダー
ゼＩＩのアミノ酸配列および塩基配列の決定コレステロ
ール・オキシダーゼＩＩの標品はさらに、逆層高速液体
クロマトグラフィーを用いて、２つのサブユニットに分
離、精製することができる。各サブユニットをプロテア
ーゼ、例えば、トリプシンにより消化し、消化物を高速
液体クロマトグラフィーを用いて分画することによって
、プロテアーゼ消化断片が得られる。各消化断片のアミ
ノ酸配列は、アミノ酸シーケンサーを用いる通常の手法
によって分析できる。 【００３７】塩基配列はシーケナーゼＶｅｒ ２．０を
用いるサンガーの方法によって分析できる〔Ｆ．サンガ
ー著：サイエンス、２１４ ，１２０５（１９８１）
〕。以下、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する
。 【００３８】 【実施例】実施例１ コレステロール・オキシダーゼ
ＩＩ遺伝子のクローニング １）コレステロール・オキシダーゼＩＩ遺伝子を含む染
色体ＤＮＡの調製ブレビバクテリウム・ステロリカムＡ
ＴＣＣ ２１３８７株をＬＢ培地〔バクトトリプトン
１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト（以上、デ
ィフコ社製）８ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ（ｐＨ７
．２）〕３０ｍｌ中、３０℃で３日間振盪培養して得ら
れた菌体を、日立製冷却遠心機（ＲＰＲ２０−２ロータ
ー）を用いて４℃で１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心
して集菌し、１０．３％ショ糖溶液で洗浄後再び遠心し
て菌体を集め、カレント・トピックス・イン・マイクロ
バイオロジー・アンド・イムノロジー 第９６巻（１
９８２）に記載されている方法で全染色体ＤＮＡを抽出
し、約１ｍｇの染色体ＤＮＡを得た。 【００３９】２）染色体ＤＮＡ断片のベクターＤＮＡへ
の導入 上記１）で得られた全染色体ＤＮＡ７２μｇをとり、Ｍ
緩衝液〔トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＭ、
ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ、ＮａＣｌ５０ｍＭ、ＤＴＴ（ジ
チオスレイトール）１ｍＭ〕１，０００μｌに溶解して
、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）
３．６単位を添加し、３７℃で３０分間限定分解を行っ
た。ついで、これをモレキュラー・クローニングに記載
されている方法に従って、１０〜４０％ショ糖密度勾配
遠心法により分画を行った。遠心は、日立製超遠心機（
ＳＲＰ２８ローター）を用い、２０℃で２６，０００ｒ
ｐｍ、１６時間行った。遠心後、分画を行い、各分画の
一部をモレキュラー・クローニングに記載されている方
法に従ってアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡ断片
の大きさを測定した。さらに、３〜６ｋｂのＤＮＡ断片
を含む分画のみを集めてエタノール沈澱を行った後、ラ
イゲーション緩衝液〔トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６
） ６６ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、ＤＴＴ ５ｍＭ
、ＡＴＰ １ｍＭ）６０μｌに溶解して約５μｇのＤ
ＮＡ断片を含む染色体ＤＮＡ溶液を得た。また、ベクタ
ーとして使用するｐＰＲＯＫ−Ｃ（クローンテック社製
）１０μｇを、Ｍ緩衝液３００μｌに溶解して、制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ （宝酒造社製） ４０単
位を添加し、３７℃で３時間反応を行って完全分解した
後、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）２０μｌと
仔牛小腸由来アルカリ性ホスファターゼ４単位を添加し
、３７℃で１時間反応を行い、脱リン酸化を行った。さ
らに６５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、エタノ
ール沈澱を行った後、８０μｌのライゲーション緩衝液
に溶解した。ついで、Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した染色
体ＤＮＡ溶液３２μｌとＢａｍＨＩで分解したｐＰＲＯ
Ｋ−Ｃ溶液５μｌを混合し、ライゲーション緩衝液で全
量７５μｌにした後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製
）２単位を添加し、１６℃で１６時間、連結反応を行い
、組換え体ＤＮＡ混成物を得た。 【００４０】３）大腸菌の形質転換 上記２）で得られた組換え体ＤＮＡ混成物を用いて、大
腸菌を形質転換した。形質転換に用いるＤＮＡ感受性菌
の調製法は、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー 第１６６巻 ５７７頁に記載されているハ
ナハンらの方法に準じた。大腸菌ＭＭ２９４株を、ＬＢ
培地で一晩培養後、得られた培養液０．２ｍｌを２０ｍ
ｌのＳＯＢ培地〔バクトトリプトン２０ｇ／ｌ，バクト
イーストエキストラクト０．５０ｇ／ｌ（以上ディフコ
社製）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４ （
ｐＨ７．０）〕に植菌し、３時間培養後、ファルコン２
０７０試験管に移し、氷中に１５分間おき、４℃で遠心
し菌体を集めた。７ｍｌのＴＦＢ〔１０ｍＭ グッド
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２０）、１００ｍＭ ＲｂＣ
ｌ、４５ｍＭ ＭｎＣｌ２ 、１０ｍＭ ＣａＣｌ
２、３ｍＭ ヘキサミン コバルト クロライド
〕に懸濁し、氷中で１５分間静置した。菌体を遠心分離
によって集め、１．６ｍｌのＴＦＢに再び懸濁した。得
られた懸濁液に５６μｌのジメチルスルホキシドを加え
、氷中で５分間緩やかに攪拌した後、５６μｌのβ−メ
ルカプトエタノールを加え、氷中で１０分間緩やかに攪
拌した。５６μｌのジメチルスルホキシドを加え、氷中
で５分間緩やかに攪拌して得られた菌体を、ＤＮＡ感受
性菌として形質転換に使用した。得られたＤＮＡ感受性
菌液２１０μｌをファルコン２０５９試験管に入れ、２
）で作製した組換え体ＤＮＡ混成物１０μｌを加え、緩
やかに攪拌した後、氷中で３０分間静置した。４２℃の
恒温槽中で９０秒間加熱し、氷中に移して２分間保った
。これに８００μｌのＳＯＣ培地（ＳＯＢ培地に２０ｍ
Ｍグルコースを加えたもの）を加え、３７℃で１時間振
盪培養した。得られた培養液を、０．１％コレステロー
ル、０．１％トリトンＸ−１００、０．００２５％アン
ピシリンを含むＬＢ固体培地に接種し、３７℃で一晩培
養し、生育してきたコロニーを形質転換株として取得し
た。 【００４１】４）コレステロール・オキシダーゼＩＩ遺
伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有する形質転換株の選択
上記３）で得られた形質転換株よりコレステロールオキ
シダーゼＩＩ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを、以下の方
法に従って取得した。上記ＬＢ固体培地上に生育した周
辺に清澄なハローを形成しているコロニーを選択し、そ
れらのコロニーをマイクロタイタープレートに植菌し、
コレステロールオキシダーゼ活性の有無を検定した。活
性を検出した形質転換株は、０．００５％のアンピシリ
ンを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩培養した。培
養終了後集菌し、得られた菌体を、１０ｍｌの０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁後、超音波破砕機
（セルディスラプターモデル２００、ブランソン社製）
により菌体を破砕し（出力４０％、１０分間）、遠心後
得られた上清について前記の方法でコレステロール・オ
キシダーゼ活性を測定した。このようにして高いコレス
テロール・オキシダーゼ活性を有する形質転換株エッシ
ェリヒア・コリｎＨ１０株を得た。形質転換株ｎＨ１０
より保有する組換え体プラスミドＤＮＡを回収し、ｐｎ
Ｈ１０を得た。ｐｎＨ１０の構造を、ＨｉｎｄＩＩＩ
，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ，ＡｐａＩ
，ＢａｍＨＩ，ＭｌｕＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳｍａＩ，Ｓｃ
ａＩで切断して、アガロースゲル電気泳動法にて確認し
た結果、ベクターであるｐＰＲＯＫ−Ｃに、挿入遺伝子
である約３．０ｋｂのＤＮＡ断片が組み込まれた構造を
有していた（第６図参照）。 【００４２】５）クローン化したコレステロール・オキ
シダーゼ遺伝子の解析 ｐｎＨ１０が、ブレビバクテリウム・ステロリカムＡＴ
ＣＣ２１３８７の生産する既知のコレステロール・オキ
シダーゼＩとは異なるイソ酵素をコードする遺伝子を含
む組換え体プラスミドであることは、以下の方法により
確認した。すなわち、モレキュラー・クローニング（Ｔ
．マニアチス、Ｅ．Ｆ．フリッチ、Ｊ．サムブルック著
、コールドスプリングハーバー出版社、１９８２年）に
記されている方法に従って、ｎＨ１０株より組換え体プ
ラスミドｐｎＨ１０を調製し、アガロースゲル電気泳動
後、ｐｎＨ１０を含むゲルを１．５Ｍ ＮａＣｌおよ
び０．５Ｍ ＮａＯＨを含む溶液に室温で３０分間漬
け、２本鎖ＤＮＡを変性させた。さらに、ナイロンフィ
ルター上に密着させ、フィルターの下面より１．５Ｍ
ＮａＣｌおよび０．２５Ｍ ＮａＯＨを含む溶液を
浸透させ、変性後のＤＮＡをフィルター上に転写後固定
した。 このようにして調製したフィルターを、ブレビバクテリ
ウム・ステロリカムＡＴＣＣ２１３８７株の産生するコ
レステロール・オキシダーゼＩのアミノ酸の部分配列か
ら推定されるＤＮＡ塩基配列の合成一本鎖ＤＮＡ、すな
わち、配列番号２で表わされるプローブＮｏ．１（６番
目の塩基はＴ，Ｃのいずれか、９番目の塩基はＴ，Ｃの
いずれか、１２番目の塩基はＡ，Ｇ， Ｔのいずれか、
１５番目の塩基はＡ，Ｇのいずれかであり、組み合わせ
て２４通りの合成ＤＮＡの混合物となる。）または、配
列番号３で表わされるプローブＮｏ．２（３番目の塩基
はＡ，Ｇのいずれか、９番目の塩基はＡ，Ｇのいずれか
、１２番目の塩基はＣ，Ｔのいずれか、１５番目の塩基
はＴ，Ａ，Ｇのいずれかであり、組み合わせて２４通り
の合成ＤＮＡの混合物となる。）をγ−３２Ｐ−ＡＴＰ
で標識して得られたＤＮＡプローブを含むハイブリダイ
ゼーションバッファー（ＮａＣｌ ５３．０ｇ／ｌ、
コハク酸ナトリウム２６．５ｇ／ｌ、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、５倍濃度デンハート溶液、０．５％ ＳＤＳ、
０．１ｍｇ／ｍｌ熱変性牛胸腺ＤＮＡ、ｐＨ７．０）と
４５℃で１６時間反応させた後、プローブを含む溶液を
捨て、３倍濃度のＳＳＣ中で６５℃で十分洗浄した。フ
ィルターとＸ線撮影用フィルムを密着させ、−７０℃に
おいて１昼夜感光させ、いわゆるオートラジオグラフィ
ー法によってｐｎＨ１０との反応性を検討した。プロー
ブＮｏ． １はコレステロール・オキシダーゼＩの中央
部分のポリペプチド鎖のアミノ酸部分配列に、プローブ
Ｎｏ． ２はＣ末端部分のアミノ酸配列に対応する。オ
ートラジオグラフィーの解析の結果、ｐｎＨ１０はプロ
ーブＮｏ． １、Ｎｏ．２と全く反応しなかった。この
結果より、プラスミドｐｎＨ１０に含まれるコレステロ
ール・オキシダーゼＩＩ遺伝子は、既知のコレステロー
ル・オキシダーゼＩをコードする遺伝子とは異なること
が明らかになった。 【００４３】実施例２．エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｎＨ１０株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２８５０）をＬＢ培地にアンピシリン０．０
０５％を含有する種培地（殺菌前ｐＨ７．２）３ｍｌに
植菌し、３０℃で１８時間振盪培養した。この種培養液
３ｍｌを、上記種培地と同じ培地を各々５００ｍｌ仕込
んだ ２リットル三角フラスコ（バッフル付き）５本
にそれぞれ加え、３０℃で１６時間振盪培養した。培養
後、培養液を冷却遠心機にて１０，０００×ｇで２０分
間遠心し、約１８．６ｇ（湿菌体重量）の菌体を得た。 得られた湿菌体に１８６ｍｌの０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０、以下バッファーと略称する）を加えて懸
濁した後、超音波菌体破砕機（セルディスラプターモデ
ル２００、ブランソン社製）により３０分間超音波破砕
した（出力７５％、パルス保持時間７０％、フラットチ
ップ装着）。破砕した後、冷却遠心機にて２０，０００
×ｇで１５分間遠心分離し、上清液を無細胞抽出液とし
て得た。得られた無細胞抽出液１９４ｍｌに６０％飽和
になるまで固形硫酸アンモニウムを加え、１Ｎ Ｎａ
ＯＨ溶液でｐＨ７に保ちながら、緩やかに攪拌し、硫酸
アンモニウムが完全に溶解してから、さらに３０分間攪
拌した。その後、冷却遠心機にて２０，０００×ｇで１
５分間遠心し、上清を得た。得られた上清はセロファン
チューブを透析膜として、１リットルのバッファーに対
し１２時間透析し、その後バッファーを交換して、さら
に１２時間透析を行い脱塩した。透析後の粗酵素液９８
．５ｍｌを、予めバッファーで平衡化しておいたＤＥＡ
Ｅ−セルロファイン（生化学工業社製）のカラム（φ７
．５×１５ｃｍ）に通塔した。流速４８０ｍｌ／ｈｒで
バッファー３リットルにて洗浄し、未吸着の蛋白を洗い
出した。次に、ＮａＣｌ濃度を０から０．５Ｍまで直線
的に濃度勾配溶出し、酵素を溶出した。溶出画分のうち
、比活性が１０単位／ｍｇ以上の画分を集めた。溶出パ
ターンを第７図に示した。 【００４４】得られた活性画分を硫酸アンモニウムを６
０％飽和になるまで添加して濃縮し、生成した沈澱をバ
ッファーにて溶解後、前記と同様に透析を行って脱塩し
た。さらに、限外ろ過により濃縮し約２ｍｌとした。こ
れを、予め０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に０
．３ＭのＮａＣｌを加えたもので平衡化しておいたスー
パーロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）ｐｒｅｐ１２ ＨＲ
１６／５０（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）
カラム（φ１．３×５０ｃｍ）に通塔し、８８０ＰＵポ
ンプ（日本分光）に接続し、３０ｍｌ／ｈｒの流速で溶
出を行った。溶出画分のうち比活性１５単位／ｍｇ以上
の画分を集めて、１リットルのバッファーに対し透析し
た。溶出パターンを第８図に示した。得られた活性画分
を、予めバッファーで平衡化しておいたヒドロキシアパ
タイト（生化学工業社製）のカラム（φ３．２×４．０
ｃｍ）に通塔し、流速１００ｍｌ／ｈｒでバッファーで
洗浄したところ、活性はすべて洗液中に回収されていた
。洗液を限外ろ過により濃縮後、本酵素の精製標品とし
た。以上の精製過程を第４表にまとめた。 【００４５】 【表４】 【００４６】さらに、精製酵素標品の純度を検定するた
めに、上記のようにして得られた未変性状態のサンプル
を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。方法は
、デービスらの方法〔Ｂ．Ｊ．デービスら、アナルス・
オブ・ニューヨーク・アカデミイ・オブ・サイエンス、
第 １２１巻、 ４０４頁（１９６４） 〕に従った。 その結果本標品は均一であることがわかった。 【００４７】 【発明の効果】本発明によれば、血清コレステロールを
測定するにあたり、高度の希釈操作などの原因により試
料中のコレステロール濃度が低濃度であったり、ビリル
ビンなどの妨害物質による影響を回避するため、測定ｐ
Ｈを６前後に下げて測定しなければならないような場合
に、既知のコレステロール・オキシダーゼに代わり、よ
り高感度で定量性の高い新規なコレステロール・オキシ
ダーゼを、工業的に安価に提供することができる。 【００４８】 【配列表】 【００４９】配列番号：１ 配列の長さ：１５４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセテ
ィカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源： 生物名：ブレビバクテリウム ステロリカム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔｅｒｏｌｉｃｕｍ ）株名
：ＡＴＣＣ２１３８７ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 特徴を決定した方法：Ｅ その他の情報：コレステロール・オキシダーゼＩＩ構造
遺伝子 配列 ＡＴＧ ＡＣＧ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＣ ＧＡＧ Ｃ
ＡＧ ＴＴＡ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＧＧ ＣＧ
Ａ ＧＧＡ ＴＴＣ ＣＴＣ ４８Ｍｅｔ Ｔ
ｈｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅ
ｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ １
５ １０
１５ ＡＣ
Ｃ ＧＣＧ ＧＧＣ ＧＣＴ ＧＣＧ ＧＧＣ ＧＣＣ
ＧＧＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＡ ＧＣＣ ＧＧＣ
ＧＣＡ ＣＴＣ ＧＧＣ ９６Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ ２０
２５
３０ ＧＧＣ
ＴＧＧ ＡＣＣ ＣＣＧ ＧＣＣ ＴＴＣ ＧＣＣ Ｇ
ＴＣ ＣＣＴ ＧＣＣ ＧＧＴ ＴＣＣ ＧＣＣ ＧＧ
Ｃ ＴＣＣ ＣＴＣ １４４Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｔ
ｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒ
ｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ ３５
４０
４５ ＧＧＡ ＴＣ
Ｇ ＣＴＣ ＧＧＡ ＴＣＧ ＡＣＣ ＧＧＧ ＣＣＧ
ＧＴＣ ＧＣＧ ＣＣＧ ＣＴＴ ＣＣＧ ＡＣＧ
ＣＣＧ ＣＣＧ １９２Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐ
ｒｏ ５０
５５ ６０
ＡＡＣ ＴＴＣ
ＣＣＧ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＧＣＧ ＣＴＧ Ｔ
ＴＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＧＣＧ ＴＡＣ ＣＡＧ ＡＡ
Ｃ ＴＧＧ ２４０Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａ
ｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｔｒｐ
６５ ７０
７５
８０ ＴＣＣ ＡＡＧ ＧＡ
Ｇ ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＣＣ ＡＣＴ
ＴＧＧ ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＣＧ ＣＣＣ ＡＡＧ
ＡＣＧ ２８８Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｉｌｅ
Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｒｐ
Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
８５
９０
９５ ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＡＴ
ＧＴＣ ＧＴＴ ＣＧＣ ＣＴＴ ＧＣＣ ＡＡＣ Ｔ
ＧＧ ＧＣＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＣ ＴＡ
Ｃ ３３６Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖ
ａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ａｌ
ａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ
１００
１０５ １
１０ ＡＡＧ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＣ
Ｇ ＣＧＣ ＧＧＣ ＧＣＧ ＡＴＧ ＣＡＣ ＧＧＣ
ＴＧＧ ＡＣＣ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＣＣ ＧＴＧ
３８４Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｒｐ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ
１１５ １２
０ １２５
ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＧ ＧＣＣ
ＡＡＣ ＧＴＣ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＡＴＣ Ｃ
ＴＣ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＣＧ
４３２Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｔｈｒ １３０
１３５
１４０
ＣＡＴ ＣＴＧ ＡＡＣ ＧＧＣ ＡＴ
Ｃ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＡＣ ＡＣＧ ＧＧＣ ＧＧＣ
ＣＣＣ ＧＴＧ ＧＣＴ ＡＣＣ ＧＴＣ ４
８０Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ １４５
１５０
１５５
１６０ ＡＣＧ ＧＣＣ ＧＧＴ ＧＣＣ ＧＧＣ
ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＧＡＧ ＧＣＧ ＡＴＣ Ｇ
ＴＣ ＡＣＣ ＧＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ５２８
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
１６５
１７０ １７５
ＡＡＧ ＣＡＣ ＧＡＣ ＣＴＣ ＧＧＣ ＴＧ
Ｇ ＧＣＣ ＡＡＣ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＣＴ ＣＣＧ
ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＴＣＧ ５７６Ｌｙ
ｓ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ １
８０ １８５
１９０
ＡＴＣ ＧＧＴ ＧＧＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＣＧ
ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＣＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＧＣＧ Ｇ
ＣＧ ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ６２４Ｉｌｅ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａ
ｓｎ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ｐｒｏ Ａｌａ １９５
２００
２０５ Ｇ
ＴＣ ＧＧＣ ＣＡＧ ＡＣＣ ＡＣＧ ＣＴＧ ＣＣ
Ｃ ＧＧＴ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＡＣ ＧＧＴ ＴＣＧ
ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＡＣ ６７２Ｖａｌ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｓｎ ２１０
２１５
２２０ ＣＴＧ
ＧＴＣ ＡＣＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＧＣＧ
ＧＴＣ ＧＴＣ ＴＧＧ ＡＡＣ ＧＧＣ ＡＡＣ Ａ
ＣＣ ＴＡＣ ＧＣＡ ７２０Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖ
ａｌ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｙ
ｒ Ａｌａ ２２５
２３０ ２３５
２４０ ＣＴＣ Ｇ
ＡＧ ＡＣＧ ＴＡＣ ＣＡＧ ＣＧＣ ＡＡＣ ＧＡ
Ｔ ＣＣＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＡＣＣ ＣＣＡ ＣＴＧ
ＣＴＣ ＡＣＣ ７６８Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ ２４５
２５０
２５５ ＡＡＣ ＣＴＣ
ＧＧＧ ＣＧＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＣ
ＴＣＧ ＧＴＧ ＡＣＧ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＣＣ Ｇ
ＧＣ ＣＣＣ ８１６Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖ
ａｌ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒ
ｏ ２６０
２６５
２７０ ＡＡＣ ＴＴＣ Ｃ
ＧＴ ＣＡＧ ＣＧＧ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＧＣ ＴＡ
Ｃ ＡＣＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＣＣＧ ＴＧＧ ＣＧＧ
ＧＡＡ ８６４Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｇｌ
ｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｇｌｕ
２７５
２８０ ２８
５ ＣＴＧ ＴＴＣ ＧＣＧ
ＣＣＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＡＣ ＧＧＣ
ＣＧＣ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＡＧ ＴＴＣ Ｇ
ＴＣ ９１２Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔ
ｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｖａｌ
２９０ ２９５
３００
ＧＣＧ ＧＡＡ ＴＣＧ Ｇ
ＧＣ ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＡＧ ＧＣＧ ＡＴＣ ＴＧ
Ｇ ＴＡＣ ＣＣＧ ＴＴＣ ＡＣＣ ＧＡＧ ＡＡＧ
９６０Ａｌａ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ ３０５
３１０
３１５
３２０ ＣＣＧ ＴＧＧ ＡＴＧ ＡＡＧ
ＧＴＧ ＴＧＧ ＡＣＧ ＧＴＣ ＴＣＧ ＣＣＧ
ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＣＧ ＧＡＣ ＴＣＧ ＴＣＧ
１００８Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌ
ｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
３２５
３３０
３３５ ＡＡＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＧＡ Ａ
ＧＣ ＣＴＣ ＧＧＣ ＴＣＧ ＧＣＧ ＧＧＣ ＴＣ
Ｃ ＣＴＣ ＧＴＣ ＧＧＣ ＡＡＧ ＣＣＴ １
０５６Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
３４０ ３
４５ ３５０
ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＣＧ ＣＧＴ ＧＡＧ
ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＧＣ ＣＣＧ ＴＡＣ ＡＡＣ
ＴＡＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＣＣ ＧＡＣ １１０
４Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｉ
ｌｅ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ ３５
５ ３６０
３６５
ＡＡＣ ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＡＧ ＣＣＣ Ａ
ＴＣ ＡＣＣ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＴＣ ＧＧＣ ＧＣ
Ｃ ＡＴＣ ＡＡＣ ＧＣＣ ＧＧＡ １１５２Ａ
ｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ ３７０
３７５
３８０
ＡＡＣ ＣＣＣ ＧＧＡ ＡＴＣ ＧＣＡ ＣＣＧ
ＣＴＧ ＴＴＣ ＧＧＣ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＴＧ
ＴＡＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＡＣＣ １２００Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｇ
ｌｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ ３８５
３９０
３９５ ４００
ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＣＧ Ａ
ＣＧ ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＴＧ
Ｇ ＧＧＣ ＴＧＧ ＴＣＧ １２４８Ｌｙｓ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓ
ｎ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｙ
Ｔｒｐ Ｓｅｒ
４０５ ４１０
４１５ ＡＡ
Ｇ ＧＡＣ ＧＴＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＴＣ
ＡＡＧ ＧＣＣ ＡＣＧ ＡＣＧ ＴＴＧ ＣＧＡ
ＣＴＣ ＡＣＣ ＧＡＧ １２９６Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｕ ４２０
４２５
４３０ ＧＧＣ
ＧＧＣ ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＴＣ ＧＴＣ ＡＣＧ Ａ
ＧＣ ＣＧＣ ＧＣＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＧＣＧ ＡＣ
Ｃ ＧＴＧ ＡＴＣ １３４４Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒ
ｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ｉｌｅ ４３５
４４０
４４５ ＡＡＣ ＧＡ
Ｃ ＴＴＣ ＡＣＣ ＧＡＧ ＴＧＧ ＴＴＣ ＣＡＣ
ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＴＣ ＧＡＧ ＴＴＣ ＴＡＣ
ＣＧＣ ＧＣＧ １３９２Ａｓｎ Ａｓｐ Ｐｈｅ
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ
Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ａ
ｌａ ４５０
４５５ ４６０
ＡＡＧ ＧＧＣ
ＧＡＧ ＴＴＣ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＡＣ ＧＧＴ Ｃ
ＣＧ ＧＴＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＣ
Ｇ ＧＧＣ １４４０Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐ
ｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａ
ｌ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ
４６５ ４７０
４７５
４８０ ＴＣＧ ＡＴＣ ＡＧ
Ｇ ＣＡＧ ＣＣＧ ＡＣＧ ＴＣＡ ＡＧＧ ＴＧＣ
ＣＧＴ ＣＧＧ ＴＧＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＣＧＡ
ＣＣＡ １４８８Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｎ
Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ
４８５
４９０
４９５ ＴＣＴ ＣＧＧ ＣＧＡ
ＣＣＣ ＧＴＣ ＣＧＣ ＧＴＣ ＣＧＧ ＡＴＣ Ａ
ＴＣ ＣＧＧ ＡＣＴ ＧＧＧ ＡＣＧ ＴＣＧ ＣＧ
Ａ １５３６Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖ
ａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｒ
ｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
５００
５０５ ５
１０ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＧＡ
１５４５ Ｓｅｒ Ｇｌｙ ＊＊＊ ５１５ 【００５０】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡハイポセティ
カル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＹＥＳ 配列の特徴 他の情報：従来型コレステロール・オキシダーゼ（コレ
ステロール・オキシダーゼＩ）構造遺伝子にコードされ
たポリペプチド鎖の中央部分に対応した合成核酸プロー
ブ配列 ＴＣＲＴＣＤＡＴＹＴ ＧＹＴＣＣＡＴ １７
【００５１】配列番号：３ 配列の長さ：１７塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡハイポセティ
カル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＹＥＳ 配列の特徴 他の情報：従来型コレステロール・オキシダーゼ（コレ
ステロール・オキシダーゼＩ）構造遺伝子にコードされ
たポリペプチド鎖Ｃ末端部分に対応した合成核酸プロー
ブ 配列 ＡＴＤＡＴＹＴＴＲＴ ＣＣＡＴＲＴＴ １７
【図１】第１図は、コレステロール・オキシダーゼＩお
よびＩＩの、３７℃で５分間処理した後の各ｐＨにおけ
る相対活性を示す。図中、○はコレステロール・オキシ
ダーゼＩＩ、●はコレステロール・オキシダーゼＩの活
性を示す。
よびＩＩの、３７℃で５分間処理した後の各ｐＨにおけ
る相対活性を示す。図中、○はコレステロール・オキシ
ダーゼＩＩ、●はコレステロール・オキシダーゼＩの活
性を示す。
【図２】第２図は、実施例２で得られたコレステロール
・オキシダーゼＩＩのｐＨ安定性を示す。
・オキシダーゼＩＩのｐＨ安定性を示す。
【図３】第３図は、実施例２で得られたコレステロール
・オキシダーゼＩＩの至適温度を示す。
・オキシダーゼＩＩの至適温度を示す。
【図４】第４図は、実施例２で得られたコレステロール
・オキシダーゼＩＩの熱安定性を示す。図中、○は５０
℃における、●は６０℃における熱安定性を示す。
・オキシダーゼＩＩの熱安定性を示す。図中、○は５０
℃における、●は６０℃における熱安定性を示す。
【図５】第５図は、コレステロール・オキシダーゼＩお
よびＩＩの、精製標品のコレステロールによる基質飽和
曲線を示す。図中、Ａはコレステロール・オキシダーゼ
ＩＩ、Ｂはコレステロール・オキシダーゼＩについての
結果を示す。
よびＩＩの、精製標品のコレステロールによる基質飽和
曲線を示す。図中、Ａはコレステロール・オキシダーゼ
ＩＩ、Ｂはコレステロール・オキシダーゼＩについての
結果を示す。
【図６】第６図は、組換え体プラスミドｐｎＨ１０の制
限酵素地図を示す。
限酵素地図を示す。
【図７】第７図は、ＤＥＡＥ−セルロファインによるコ
レステロール・オキシダーゼＩＩのイオン交換クロマト
グラフィーにおける溶出パターンを示す。図中、○は溶
出液の蛋白濃度（ＯＤ２８０ｎｍ、 ｍｇ／ｍｌ）を
、●は溶出液の酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を示す。
レステロール・オキシダーゼＩＩのイオン交換クロマト
グラフィーにおける溶出パターンを示す。図中、○は溶
出液の蛋白濃度（ＯＤ２８０ｎｍ、 ｍｇ／ｍｌ）を
、●は溶出液の酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を示す。
【図８】第８図はスーパーロースｐｒｅｐ１２ ＨＲ
１６／５０によるコレステロール・オキシダーゼＩＩの
ゲルろ過における溶出パターンを示す。図中、○は溶出
液の蛋白濃度（ＯＤ２８０ｎｍ、ｍｇ／ｍｌ）を、●は
溶出液の酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を示す。
１６／５０によるコレステロール・オキシダーゼＩＩの
ゲルろ過における溶出パターンを示す。図中、○は溶出
液の蛋白濃度（ＯＤ２８０ｎｍ、ｍｇ／ｍｌ）を、●は
溶出液の酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を示す。
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号１で表わされるＤＮＡ配列を
有し、かつ下記の理化学的性質を有する新規コレステロ
ール・オキシダーゼ。 （ａ）作用 酸素の存在下コレステロールを酸化し、過酸化水素と４
−コレステン−３−オンを生成する反応を触媒する。 （ｂ）等電点：ｐＨ４．７ （ｃ）基質特異性： コレステロール、β−シトステロール、スチグマステロ
ール、プレグネノロン、デヒドロイソアンドロステロン
、エストラジオールに作用し、ビタミンＤ３、コール酸
、アンドロステロン、コレステロールリノレート、ラノ
ステロールは基質としない。 （ｄ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは５．０〜７．５であり、５０℃、６０分間の
加熱条件下では、ｐＨ５．３〜７．５の範囲内で安定で
ある。 （ｅ）作用適温：５０℃付近に至適作用温度を有する。 （ｆ）ｐＨおよび温度などによる失活の条件：５０℃、
１時間の加熱条件下では、ｐＨ１０．０以上またはｐＨ
４．０以下で失活する。また、ｐＨ７．０、６０℃、１
時間の熱処理で約８３％失活する。 （ｇ）阻害および安定化： ｐ−クロロマーキュリベンゼンスルホネート、硝酸銀、
ｏ−ヒドロキシキノリンにより阻害を受ける。また、牛
血清アルブミンを共存させることにより、耐熱性および
保存安定性が向上する。 （ｈ）コレステロールに対するミハエリス定数（ｋｍ値
）：３．０×１０−５Ｍ （ｉ）分子量：約４３，０００（ゲル濾過法）５５，２
０６（ＤＮＡ配列） - 【請求項２】 該コレステロール・オキシダーゼが、
ブレビバクテリウム・ステロリカム由来である請求項１
記載のコレステロール・オキシダーゼ。 - 【請求項３】 エッシェリヒア属に属し、配列番号１
で表わされるＤＮＡ配列で特定されるＤＮＡおよび該Ｄ
ＮＡにハイブリダイズしかつコレステロール・オキシダ
ーゼをコードするＤＮＡから選ばれるＤＮＡを組み込ん
だ組換え体ＤＮＡを保有する微生物を培地に培養し、培
養物中にコレステロール・オキシダーゼを生成蓄積させ
、該培養物から該コレステロール・オキシダーゼを採取
することを特徴とする新規コレステロール・オキシダー
ゼの製造法。 - 【請求項４】 該配列番号１で表わされるＤＮＡ配列
で特定されるＤＮＡが、ブレビバクテリウム・ステロリ
カム由来である請求項３記載の製造法。 - 【請求項５】 エッシェリヒア属に属し、配列番号１
で表わされるＤＮＡ配列で特定されるＤＮＡおよび該Ｄ
ＮＡにハイブリダイズしかつコレステロール・オキシダ
ーゼをコードするＤＮＡから選ばれるＤＮＡを組み込ん
だ組換え体ＤＮＡを保有する微生物。 - 【請求項６】 該微生物が、エッシェリヒア・コリｎ
Ｈ１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８５０）である請求項５
記載の微生物。 - 【請求項７】 配列番号１で表わされるＤＮＡ配列で
特定されるＤＮＡおよび該ＤＮＡにハイブリダイズしか
つコレステロール・オキシダーゼをコードするＤＮＡか
ら選ばれるＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んだ組換え
体ＤＮＡ。 - 【請求項８】 該組換え体ＤＮＡが、エッシェリヒア
・コリｎＨ１０（ＦＥＲＭＢＰ−２８５０）が保有する
プラスミドｐｎＨ１０である請求項７記載の組換え体Ｄ
ＮＡ。 - 【請求項９】 配列番号１で表わされるＤＮＡ配列で
特定され、かつコレステロール・オキシダーゼをコード
するＤＮＡ。 - 【請求項１０】 該ＤＮＡがブレビバクテリウム・ス
テロリカム由来である請求項９記載の遺伝子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3076143A JPH04218367A (ja) | 1990-04-10 | 1991-04-09 | 新規コレステロール・オキシダーゼ |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9429690 | 1990-04-10 | ||
| JP2-94296 | 1990-04-10 | ||
| JP3076143A JPH04218367A (ja) | 1990-04-10 | 1991-04-09 | 新規コレステロール・オキシダーゼ |
| EP96200349A EP0730028A1 (en) | 1990-04-10 | 1991-10-09 | Novel cholesterol oxidase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04218367A true JPH04218367A (ja) | 1992-08-07 |
Family
ID=26142493
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3076143A Withdrawn JPH04218367A (ja) | 1990-04-10 | 1991-04-09 | 新規コレステロール・オキシダーゼ |
| JP03515990A Expired - Fee Related JP3117709B2 (ja) | 1990-04-10 | 1991-10-09 | 新規コレステロール・オキシダーゼ |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03515990A Expired - Fee Related JP3117709B2 (ja) | 1990-04-10 | 1991-10-09 | 新規コレステロール・オキシダーゼ |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP0452112A1 (ja) |
| JP (2) | JPH04218367A (ja) |
| AT (1) | ATE171470T1 (ja) |
| DE (2) | DE730028T1 (ja) |
| DK (1) | DK0560983T3 (ja) |
| ES (1) | ES2093596T2 (ja) |
| GR (1) | GR960300069T1 (ja) |
| WO (1) | WO1993007261A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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