DE68929521T2

DE68929521T2 - Nicht-nukleare chromosomale Transformation

Info

Publication number: DE68929521T2
Application number: DE68929521T
Authority: DE
Inventors: Lawrence K. Grill; Robert L. Erwin; David L. Berliner; Ernest T. Hubbard, Jr.; Thomas H. Turpen
Original assignee: Large Scale Biology Corp
Current assignee: Large Scale Biology Corp
Priority date: 1988-02-26
Filing date: 1989-02-24
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2009-02-25
Also published as: EP0999281A1; EP1013771A1; CA1340378C; AU638411B2; EP1013771B1; DE68929521D1; WO1989008145A1; JPH03502886A; EP0406267A1; ATE278791T1; AU4072589A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft virale Vektoren, die nicht infektiös sind (hier ebenfalls als biologisch eingedämmt (contained) bezeichnet), die allerdings selbstreplizierend und zur nicht-nuklearen chromosomalen Transformation eines Wirts in der Lage sind. Die viralen Vektoren können eine heterologe kodierende Sequenz angrenzend an einen viralen Promotor erhalten. Die Erfindung betrifft ferner Viren, welche die viralen Vektoren enthalten, die übertragbar sind. Ein Wirt wird durch die Viren der Erfindung infiziert. Es werden Produktionszellen offenbart, die zur Produktion der Viren oder von Teilen davon imstande sind.
Viren sind eine einzigartige Klasse infektiöser Agenzien, deren unverwechselbare Merkmale ihre einfache Organisation und ihr Replikationsmechanismus sind. In der Tat kann ein vollständiges virales Partikel oder Virion prinzipiell als ein Block genetischen Materials (entweder DNA oder RNA) bezeichnet werden, das zur autonomen Replikation in der Lage ist, umgeben von einer Proteinhülle und manchmal von einer zusätzlichen membranartigen Hülle, wie zum Beispiel im Fall von Alphaviren. Die Hülle schützt das Virus vor der Umgebung und dient als ein Vehikel zur Übertragung von einer Wirtszelle zur anderen.
Anders als Zellen wachsen Viren nicht in der Größe und teilen sich dann, da sie innerhalb ihrer Hüllen wenige oder keine der biosynthetischen Enzyme und anderen für ihre Replikation erforderlichen Maschinerie enthalten. Vielmehr vervielfältigen sich Viren in Zellen durch Synthese ihrer einzelnen Komponenten, gefolgt von deren Zusammenbau. Folglich kommt die virale Nukleinsäure, nach Abwerfen ihrer Hülle, in Kontakt mit der entsprechenden Zellmaschinerie, wo sie die Synthese der für die virale Vermehrung notwendigen Proteine spezifiziert. Anschließend wird die virale Nukleinsäure mit Hilfe sowohl viraler als auch zellulärer Enzyme selbst repliziert. Die Bestandteile der viralen Hülle werden gebildet, und die Nukleinsäure und die Hüllkomponenten werden schließlich zusammengebaut. Bei einigen Viren wird die Replikation durch Enzyme initiiert, die in den Virionen vorhanden sind.
Viren werden in drei Hauptklassen unterteilt – tierische Viren, Pflanzenviren und bakterielle Viren. Innerhalb jeder Klasse ist jedes Virus in der Lage, nur bestimmte Spezies von Zellen zu infizieren. Bei tierischen und bakteriellen Viren wird der Wirtsbereich durch die Spezifität der Anheftung an die Zellen bestimmt, welcher von den Eigenschaften sowohl der Hülle der Virions als auch spezifischer Rezeptoren auf der Zelloberfläche abhängt. Diese Beschränkungen verschwinden, wenn eine Transfektion erfolgt, d.h. wenn die Infektion mit der nackten viralen Nukleinsäure durchgeführt wird, deren Eintritt nicht von virus-spezifischen Rezeptoren abhängt.
Ein bestimmtes Virus kann entweder DNA oder RNA enthalten, welche entweder einzel- oder doppelsträngig sein können. Der Anteil der Nukleinsäure in einem Virion variiert zwischen etwa 1% und etwa 50%. Die Menge an genetischer Information pro Virion variiert von etwa 3 bis 300 kb pro Strang. Die Diversität der virusspezifischen Proteine variiert entsprechend. Beispiel für doppelsträngige DNA enthaltende Viren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Hepatitis B Virus, Papovaviren, wie zum Beispiel Polyoma und Papilloma, Adenovirus, Poxviren, wie zum Beispiel Vaccinia, Caulimoviren, wie zum Beispiel der Cauliflower Mosaic Virus (CaMV), Pseudomonas Phage PMS2, Herpesvirus, Bacillus subtilis Phage SP8 und die T-Bakteriophagen. Repräsentative Viren mit einzelsträngiger DNA sind die Parvoviren und die Bakteriophagen ΦX174, f1 und M13. Reoviren, der Cytoplasmic Polyhedrosis Virus der Seidenraupe, der Rice Dwarf Virus und der Wound Tumor Virus sind Beispiele für doppelsträngige RNA-Viren. Einzelsträngige RNA-Viren umfassen den Tobacco Mosaic Virus (TMV), den Turnip Yellow Mosaic Virus (TYMV), Picornaviren, Myxoviren, Paramyxoviren und Rhabdoviren. Die RNA in einzelsträngigen RNA-Viren kann entweder ein plus (+) oder ein minus (–) Strang sein. Für allgemeine Informationen betreffend Viren siehe Grierson, D. et al., Plant Molecular Biology, Blackie, London, pp. 126–146 (1984); Dulbecco, R. et al., Virology, Harper & Row, Philadelphia (1980); White, A. et al., Principles of Biochemestry, 6th Ed., McGraw-Hill, New York, pp. 882–900 (1978).
Ein Weg zur Klassifikation von Pflanzenviren basiert auf der Genomorganisation. Obwohl viele Pflanzenviren RNA-Genome aufweisen, unterscheidet sich die Organisation der genetischen Information zwischen den Gruppen. Das Genom der meisten einteiligen (monopartite) Pflanzen RNA-Viren ist ein einzelsträngiges Molekühl in (+)-Orientierung. Es gibt zumindest 11 größere Virengruppen mit diesem Genomtyp. Ein Beispiel für diesen Typ von Virus ist TMV. Zumindest sechs größere Gruppen an Pflanzen RNA-Viren weisen ein zweiteiliges (bipartite) Genom auf. In diesen besteht das Genom üblicherweise aus zwei verschiedenen (+)-orientierten einzelsträngigen RNA-Molekühlen, die in separaten Partikeln verpackt sind. Beide RNAs sind für die Infektivität erforderlich. Das Cowpea Mosaic Virus (CPMW) ist ein Beispiel eines zweiteiligen Pflanzenvirus. Der dritte Haupttyp, der mindestens sechs größere Gruppen an Pflanzenviren umfasst, weist drei (+)-orientierte einzelsträngige RNA-Molekühle auf, d. h. ist dreiteilig (tripartite). Jeder Strang ist separat verpackt, und alle drei sind für die Infektivität erforderlich. Ein Beispiel eines dreiteiligen Pflanzenvirus ist das Alfalfa Mosaic Virus (AMV). Viele Pflanzenviren weisen ferner kleinere subgenomische mRNAs auf, die zur Amplifikation eines spezifischen Genprodukts synthetisiert werden. Eine Gruppe an Pflanzenviren, die ein einzelsträngiges DNA-Genom aufweist, sind die Geminiviren, wie zum Beispiel das Cassava Latent Virus und das Maize Streak Virus.
Es wurden Techniken entwickelt, die zur Transformation vieler Arten von Organismen verwendet werden können. Wirte, die mit diesen Techniken transformiert werden können, umfassen Bakterien, Hefen, Pilze, tierische Zellen und Pflanzenzellen oder Gewebe. Die Transformation wird durch Verwendung eines Vektors bewerkstelligt, der selbstrepliziernd ist, und der mit dem gewünschten Wirt kompatibel ist. Die Vektoren basieren im allgemeinen entweder auf einem Plasmid oder einem Virus. Fremde DNA wird in den Vektor inseriert, welcher im Anschluss verwendet wird, um den entsprechenden Wirt zu transformieren. Der transformierte Wirt wird anschließend durch Selektion oder Screening identifiziert. Für weitere Informationen betreffend die Transformation dieser Wirte siehe Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1982); DNA Cloning, Ed. Glover, D.M., IRL Press, Oxford (1985); Grierson, D. et al., supra; and Methods in Enzymology, Volumen 68, 100, 101, 118 and 152–155 (1979, 1983, 1983, 1986, and 1987).
Viren, deren Zweckmäßigkeit für die Transformation entsprechender Wirte gezeigt wurde, umfassen Bakteriophagen, tierische Viren, wie zum Beispiel den Adenovirus Typ 2 und den Vaccinia Virus, sowie Pflanzenviren, wie zum Beispiel CaMV und den Brome Mosaic Virus (BMV). Ein Beispiel für die Verwendung eines Bakteriophagen-Vektors wird im U.S. Patent 4,508,826 gezeigt. Das U.S. Patent 4,593,002 zeigt die Verwendung des Adenovirus Typ 2 sowie eines Bakteriphagen zur Transformation des entsprechenden Wirts. Die Verwendung eines Vaccinia Virus wird im U.S. Patent 4,603,112 gezeigt. Die Transformation von Pflanzen unter Verwendung von Pflanzenviren wird Beschrieben in EP-A 67,553 (TMV), EP-A 194,809 (BMV) and Brisson, N. et al., Methods in Enzymology 118, 659 (1986) (CaMV).
Die Europäische Patentanmeldung EP 0194809 offenbart einen RNA-Transformationsvektor, der ein cis-aktives Replikationselement umfasst, das von einem (+)-Strang RNA-Virus abstammt, wie zum Beispiel dem Brome Mosaic Virus, sowie eine heterologe Nukleinsäuresequenz, die in eine Region des viralen Genoms inseriert ist, welche eine derartige Insertion zu tolerieren vermag, ohne die virale Replikation zu zerstören. Somit kann die modifizierte RNA, welche die exogene Sequenz kodiert, in der Empfängerzelle exprimiert werden.
Die Internationale Patentanmeldung WO 87/00551 offenbart einen retroviralen Vektor zur Übertragung heterologen genetischen Materials in das Genom von Pflanzen. Der Vektor umfasst 5'- und 3'-retrovirale Long Terminal Repeat (LTR) Sequenzen, welche die Insertion retroviraler Sequenzen in ein Pflanzenzellgenom ermöglichen, eine Promotorsequenz und eine Nukleinsäuresequenz unter der transkriptionellen Kontrolle des Promotors, die ein Protein von Interesse kodiert, das der Pflanze eine neue Eigenschaft verleiht.
Schließlich berichten Takamatsu et al. (EMBO J. 6,307-311, 1987) über die Konstruktion von Tobacco Mosaic Virus (TMV) cDNA-Derivaten, wobei das virale Hüllprotein-Gen durch das bakterielle Chloramphenicolacetytransferase-Gen (CAT) ersetzt wurde. Wenn in vitro-Transkripte dieser TMV-CAT Chimären in Tabakpflanzen inokuliert wurden, wurden TMV-spezifische Läsionen erzeugt. Northern Blot-Analysen von RNA-Extrakten der Pflanze zeigten die Replikation der genomischen RNAs der Derivate in den infizierten Pflanzenzellen und die Produktion von subgenomischen RNAs.
Wenn das Virus ein DNA-Virus ist, können die Konstruktionen am Virus selbst durchgeführt werden. Alternativ kann das Virus auch zuerst in ein bakterielles Plasmid kloniert werden, um die Konstruktion des gewünschten viralen Vektors mit der fremden DNA zu erleichtern. Das Virus kann im Anschluss aus dem Plasmid ausgeschnitten werden. Falls das Virus ein DNA-Virus ist, kann ein bakterieller Replikationsursprung (origin of replication) an die virale DNA angeheftet werden, welche im Anschluss durch die Bakterien repliziert wird. Die Transkription und Translation dieser DNA erzeugen das Hüllprotein, das die virale DNA umhüllt. Falls das Virus ein RNA-Virus ist, wird das Virus im allgemeinen als cDNA kloniert und in ein Plasmid inseriert. Das Plasmid wird anschließend zur Herstellung all dieser Konstrukte verwendet. Anschließend wird das RNA-Virus erzeugt durch Transkribieren der viralen Sequenzen des Plasmids und Translation der viralen Gene, um das Hüllprotein (die Hüllproteine) zu erzeugen, das (die) die virale RNA umhüllt (umhüllen).
Tyrosinase ist eine Kupfer-enthaltende Monooxygenase, welche die ortho-Hydroxylierung von Monophenolen einschließlich Tyrosin und die Oxidation von o-Diphenolen zu o-Quinonen katalysiert. Mason, H.S., Ann. Rev. Biochem. 34, 595 (1965). Derartige Reaktionen umfassen die Umsetzung von Tyrosin zu Dihydroxyphenylalanin (Dopa) und die Umsetzung von Dopa zu Dopaquinon. Diese Reaktionen können von der spontanen Bildung von Melanin gefolgt werden. Tyrosinase kommt in der Natur weit verbreitet vor und ist für die Bildung von Melaninpigmenten verantwortlich. Lerch, K., Met. Ions Biol. Syst. 13, 143 (1981).
Tyrosinase ist eine Phenoloxidase, die spezifisch in Quellen aus Säugetieren gefunden wird. Andere Phenoloxidasen oder Polyphenoloxidasen können auch in Quellen aus Pflanzen oder Pilzen gefunden werden. Phenoloxidasen katalysieren die Oxidation phenolischer Verbindungen (zum Beispiel 3,4-Dihydroxyphenylalanin (Dopa)), um Melanin zu erzeugen (Wheeler, M.H. et al., Can. J. Microbiol. 24, 289 (1978)). Eine gut definierte Phenoloxidase ist diejenige, die im Pilz Cryptococcus neoformans gefunden wurde, wie beschrieben von Polachec, I. et al., J. Bacteriol. 150, 1212 (1982). Eine andere gut definierte Phenoloxidase ist die Drosophila Phenoloxidase, die von Rizki, T.M. et al., Mol. Gen Genet. 201, 7 (1985) beschrieben wurde.
Cyclodextrin-Glucanotransferase ist ein Enzym, das die Umsetzung von Stärke in Cyclodextrin katalysiert. Cyclodextrin besitzt mehrere Verwendungsmöglichkeiten einschließlich der Verwendung als Süßstoff, der Verwendung als Ersatz für Gummiarabikum und andere Verwendungen in Arzneimitteln, Nahrungsmitteln und Kosmetika.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung basiert auf viralen Vektoren wie in Anspruch 1 definiert, die biologisch eingedämmt, selbstreplizierend und zur nicht-nuklearen chromosomalen Transformation eines Wirts imstande sind. Die viralen Vektoren können eine heterologe codierende Sequenz angrenzend an einem viralen Promotor enthalten.
Die Erfindung betrifft Produktionszellen wie in Anspruch 1 definiert, die zur Herstellung von Viren oder von Teilen davon in der Lage sind. Wirtszellen werden mit den in der Erfindung verwendeten Viren infiziert. Ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Produkts durch Anzucht einer infizierten Pflanzenzelle liegt ebenfalls im Schutzbereich der Erfindung.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung umfasst (a) virale Vektoren, die nicht infektiös sind, die allerdings selbstreplizierend und zur nicht-nuklearen chromosomalen Transformation eines Wirts imstande sind, (b) virale Vektoren, die eine heterologe kodierende Sequenz angrenzend an einen viralen Promotor enthalten, (c) Viren, welche die viralen Vektoren enthalten, die infektiös sind, (d) Produktionszellen, die zur Herstellung der Viren oder von Teilen davon in der Lage sind, (e) eine Pflanzenzelle, die mit den in der Erfindung verwendeten Viren infiziert wurde, und (f) ein Verfahren für die Herstellung eines gewünschten Produkts durch Anzucht einer infizierten Pflanzenzelle.
Die nachfolgenden Definitionen sind vorgesehen, um für ein klares und konsistentes Verständnis der Patentschrift und der Ansprüche einschließlich des so angegebenen Schutzbereichs zu sorgen:

Angrenzend: Eine Produktion innerhalb einer Nukleotidsequenz unmittelbar 5' oder 3' zu einer definierten Sequenz.
Anti-Sense Mechanismus: Ein Typus von Gen-Regulation, basierend auf der Kontrolle der Rate der Translation von mRNA in Protein aufgrund der Gegenwart eines RNA-Moleküls in einer Zelle, welches zumindest zu einem Teil der translatierten mRNA komplementär ist.
Biologisch eingedämmt (contained): Die virale Nukleinsäure ist nicht imstande, natürlicherweise einen Wirt zu infizieren, da sie nicht in der Lage ist, ein biologisch funktionelles Hüllprotein zu exprimieren.
Biologisch funktionell: Die Fähigkeit, eine erwartete biologische Funktion in einer Zelle oder einem Organismus auszuüben. Zum Beispiel besteht die biologische Funktion eines viralen Hüllproteins in der Umhüllung der viralen Nukleinsäure. Ein biologisch nicht funktionelles Hüllprotein ist nicht imstande, die virale Nukleinsäure zu umhüllen. Eine Nukleotidsequenz, der eine biologisch funktionelle proteinkodierende Sequenz fehlt, erzeugt entweder kein Protein oder erzeugt ein Protein, das die erwartete Funktion nicht ausübt. Falls die gesamte kodierende Sequenz für ein Protein entfernt wird, wird kein Protein erzeugt. Falls ein signifikanter Anteil der Proteinsequenz für ein Protein entfernt wird, dann wird jedes Protein, das erzeugt wird, nicht funktionieren wie das gesamte Protein funktionieren würde. Falls die kodierende Sequenz für ein Protein mutiert wird, wie zum Beispiel durch eine Punktmutation, könnte das Protein nicht funktionieren wie ein normales Protein funktionieren würde. Zum Beispiel ist eine Nukleotidsequenz, der eine kodierende Sequenz für ein biologisch funktionelles Hüllprotein fehlt, eine Nukleotidsequenz, die nicht für ein Hüllprotein kodiert, welches zur Umhüllung der viralen Nukleinsäure imstande ist. Diese Bezeichnung soll auch die vollständige Deletion der Hüllproteinsequenz umfassen.
Zellkultur: Eine sich vermehrende Menge an Zellen, die in undifferenziertem oder differenziertem Zustand sein können.
Chimäre Sequenz oder Gen: Eine Nukeotidsequenz, die von zumindest zwei heterologen Teilen abstammt. Die Sequenz kann DNA oder RNA umfassen.
Kodierende Sequenz: Eine Deoxyribonukleotidsequenz, die, wenn sie transkribiert und translatiert ist, die Bildung eines zellulären Polypeptids zur Folge hat, oder eine Ribonukleotidsequenz, die, wenn sie translatiert ist, die Bildung eines zellulären Polypeptids zur Folge hat.
Kompatibel: Die Fähigkeit, mit anderen Komponenten eines Systems zu operieren. Ein Vektor, der mit einem Wirt kompatibel ist, ist einer, der zur Replikation in diesem Wirt imstande ist. Ein Hüllprotein, das kompatibel mit einer viralen Nukleotidsequenz ist, ist eine, die zur Umhüllung der viralen Sequenz imstande ist.
Gen: Eine diskrete chromosomale Region, die für ein diskretes zelluläres Produkt verantwortlich ist.
Wirt: Eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organismus, der zur Replikation eines viralen Vektors in der Lage ist, und der durch ein Virus, welches den viralen Vektor enthält, infiziert werden kann. Diese Bezeichnung soll eukaryontische Zellen, Organe, Gewebe oder Organismen umfassen, wie zum Beispiel Pflanzengewebe.
Infektion: Die Fähigkeit eines Virus, seine Nukleinsäure an einen Wirt zu transferieren, wobei die virale Nukleinsäure repliziert wird, virale Proteine synthetisiert werden und neue virale Partikel zusammengesetzt werden. Die Bezeichnungen übertragbar und infektiös werden hier untereinander austauschbar verwendet. Die Bezeichnung nicht infektiös, wie hier verwendet, bedeutet nicht infektiös durch natürliche biologische Verfahren.
Phänotypisches Merkmal: Eine beobachtbare Eigenschaft, die das Ergebnis der Expression eines Gens ist.
Pflanzenzelle: Die strukturelle und physiologische Einheit von Pflanzen, bestehend aus einem Protoplasten und der Zellwand.
Pflanzenorgan: Ein ausgeprägter und sichtbar differenzierter Teil einer Pflanze, wie zum Beispiel Wurzel, Stamm, Blatt oder Embryo.
Pflanzengewebe: Jedes Gewebe einer Pflanze innerhalb der Pflanze (in planta) oder in Kultur. Diese Bezeichnung soll eine gesamte Pflanze, Pflanzenzelle, Pflanzenorgan, Protoplast, Zellkultur oder eine beliebige Gruppe von Pflanzenzellen, welche in einer strukturellen und funktionellen Einheit organisiert sind, umfassen.
Produktionszelle: Eine Zelle, ein Gewebe oder Organismus, der zur Replikation eines Vektors oder eines viralen Vektors in der Lage ist, der aber nicht notwendigerweise ein Wirt dieses Virus ist. Diese Bezeichnung soll prokaryontische und eukaryontische Zellen, Organe, Gewebe oder Organismen umfassen, wie zum Beispiel Bakterien, Hefen, Pilze, tierische Zellen und Pflanzengewebe.
Promotor: Die 5'-flankierende, nicht-kodierende Sequenz angrenzend an eine kodierende Sequenz, welche an der Initiation der Transkription der kodierenden Sequenz beteiligt ist.
Protoplast: Eine isolierte Pflanzenzelle ohne Zellwände, die das Potential zur Regeneration in eine Zellkultur oder eine gesamte Pflanze aufweist.
Substantielle Sequenzhomologie: Bezeichnet Nukleotidsequenzen, die im wesentlichen zueinander äquivalent sind. Nukleotidunterschiede zwischen derartigen Sequenzen, die eine substantielle Sequenzhomologie aufweisen, sind minimal bezüglich der Beeinflussung der Funktion der Genprodukte oder einer RNA, die von einer solchen Sequenz kodiert wird.
Transkription: Die Herstellung eines RNA-Moleküls mit Hilfe der RNA-Polymerase als eine komplementäre Kopie einer DNA-Sequenz.
Vektor: Ein selbstreplizierendes DNA-Molekül, das ein DNA-Segment zwischen Zellen transferiert.
Viraler Vektor: Ein Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz eines Virus umfasst, welche derart modifiziert wurde, dass ein biologisch nicht funktionelles Hüllprotein erzeugt wird. Dies kann durch Entfernen zumindest eines Teils der kodierenden Sequenz oder durch Mutieren der kodierenden Sequenz erreicht werden. Falls das Virus für einen oder mehr Virustransmissionsfaktoren kodiert, kann die Nukleinsäuresequenz des Virus ebenso modifiziert werden, um diese biologisch nicht funktionell zu machen.
Virus: Ein infektiöses Agens, das aus einer Nukleinsäure besteht, welche in ein Protein eingehüllt ist. Ein Virus kann ein mono-, di-, tri- oder vielteiliges Virus sein, wie oben beschrieben.

Die Erfindung sieht die Infektion eines Wirts, wie zum Beispiel eines eukaryontischen Organismus, einer Zelle oder eines Gewebes, mittels eines Virus wie in Anspruch 1 definiert vor, der derart modifiziert wurde, dass das Virus übertragbar ist, aber die virale Nukleinsäure nicht infektiös ist. Natürlich vorkommende mutierte Viren können ebenfalls die selben Eigenschaften aufweisen, nämlich übertragbar zu sein, aber eine virale Nukleinsäure aufzuweisen, welche nicht infektiös ist. Die Nicht-Infektiosität der viralen Nukleinsäure wird durch Modifizieren der Nukleinsäure bewerkstelligt, sodass ein biologisch nicht funktionelles virales Hüllprotein (Capsidprotein) und beliebige andere virale Transemissionsfaktoren erzeugt werden, wie hier beschrieben.
Die Erfindung weist eine Reihe von Vorteilen auf, wovon einer ist, dass die Transformation und Regeneration der Zielorganismen nicht notwendig sind. Ein anderer Vorteil ist, dass es nicht notwendig ist, Vektoren zu entwickeln, welche die gewünschte kodierende Sequenz in das Genom des Zielorganismus integrieren. Existierende Organismen können ohne das Erfordernis, über eine Keimzelle zu gehen, mit einer neuen kodierenden Sequenz verändert werden. Ferner bietet die Erfindung die Option, die kodierende Sequenz an den gewünschten Organismus, das Gewebe, das Organ oder die Zelle zu applizieren.
Die chimären Gene und Vektoren der Erfindung werden mit Hilfe von im Stand der Technik gut bekannter Verfahren konstruiert. Geeignete Techniken wurden beschrieben in Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982); Methods in Enzymology, Vols. 68, 100, 101, 118, and 152–155, Academic Press, New York (1979, 1983, 1983, 1986 and 1987); und DNA-cloning, Vols. I, II, III, Glover, D.M. Ed., IRL Press, Oxford (1985 and 1987). Medienzusammensetzungen wurden beschrieben in Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972), sowie in den oben erwähnten Referenzen. DNA-Manipulationen und Enzymbehandlungen werden entsprechend der von den Herstellern empfohlenen Verfahren durchgeführt.
Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist die Herstellung von Nukleotidsequenzen, die zur Replikation in einem kompatiblen Wirt imstande sind, die aber selbst zur Infektion des Wirts nicht in der Lage sind. Die Nukleotidsequenz hat eine substantielle Sequenzhomologie mit einer viralen Nukleotidsequenz. Geeignete virale Nukleotidsequenzen sind diejenigen der Tobamoviren, die Pflanzen infizieren. Eine partielle Liste geeigneter Viren wurde oben beschrieben. Die Nukleotidsequenz kann eine RNA, DNA, cDNA oder eine chemisch synthetisierte RNA oder DNA sein.
Der erste Schritt zum Erhalt eines jedweden Merkmals der Erfindung ist es, die Nukleotidsequenzen, welche für das Capsidprotein und beliebiger Transmissionsfaktoren innerhalb der viralen Nukleotidsequenz kodieren, mit Hilfe herkömmlicher bekannter Verfahren derart zu modifizieren, dass durch das modifizierte Virus biologisch nicht funktionelle Proteine erzeugt werden. Deshalb kann ein beliebiges Virus wie in Anspruch 1 definiert, für das die Nukleotidsequenz für das Capsid-Protein und die Nukleotidsequenzen für beliebige Transmissionsfaktoren identifiziert wurden, für die Verwendung in der Erfindung geeignet sein. Andere Viren können verwendet werden, nachdem die Nukleinsäure sequenziert wurde.
Die Viren, welche dieses Erfordernis erfüllen, und daher geeignet sind, sind die Viren der Tobacco Mosaic Virus-Gruppe, wie zum Beispiel der Tobacco Mosaic Virus (TMV), der Cowpea Mosaic Virus (CMV), der Alfalfa Mosaic Virus (AmV), der Cucumber Green Mottle Mosaic Virus Watermelon Strain (CGMMV-W) und der Oat Mosaic Virus (OMV).
Tobacco Mosaic Virus-Gruppe
Der Tobacco Mosaic Virus (TMV) ist ein Typus-Vertreter der Tobamoviren. Das TMV Virion ist ein tubuläres Filament und umfasst Hüllproteinuntereinheiten, die in einer einzelnen rechtsdrehenden Helix angeordnet sind, wobei die einzelsträngige RNA zwischen den Drehungen der Helix interkaliert ist. TMV infiziert Tabak sowie andere Pflanzen. TMV wird mechanisch übertragen und kann für ein Jahr oder länger im Boden oder im Gewebe trockener Blätter infektiös bleiben.
Die TMV Virionen können durch eine Umgebung mit einem pH kleiner als 3 oder größer als 8 oder durch Formaldehyd oder Jod inaktiviert werden. Präparationen von TMV können aus Pflanzengeweben durch Ammoniumsulfat-Präzipitation gefolgt von differenzieller Zentrifugation erhalten werden.
Das einzelsträngige RNA Genom von TMV ist etwa 6400 Nukleotide lang und ist an 5'-Ende mit einem Cap versehen (capped), ist aber nicht polyadenyliert. Die genomische RNA kann als mRNA für ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 130,000 (130 K) dienen sowie für ein weiteres mit einem Molekulargewicht von etwa 180,000 (180 K), das mittels "readthrough" erzeugt wird. Sie kann jedoch nicht als "Messenger" für die Synthese des Hüllproteins fungieren. Andere Gene werden während der Infektion durch die Bildung monocistronischer, 3'-coterminaler subgenomischer mRNAs exprimiert, einschließlich eines Gens (LMC), welches das 17.5 K Hüllprotein kodiert, und ein weiteres (I₂), das ein 30 K Protein kodiert. Das 30 K Protein wurde in infizierten Protoplasten detektiert (Virology 132, 71 (1984)) und ist am Zell-zu-Zell Transport des Virus in einer infizierte Pflanze beteiligt (Deom, C.M. et al., Science 237, 389 (1987)). Die Funktionen der beiden großen Proteine sind unbekannt.
Mehrere doppelsträngige RNA-Moleküle einschließlich doppelsträngiger RNAs, die den genomischen, I₂ und LMC RNAs entsprechen, wurden in Pflanzengeweben detektiert, die mit TMV infiziert waren. Diese RNA-Moleküle sind vorzugsweise Intermediate in der Genomreplikation und/oder mRNA-Syntheseprozessen, die mittels unterschiedlicher Mechanismen zu erfolgen scheinen.
Der TMV Zusammenbau erfolgt anscheinend im Cytoplasma der Pflanzenzelle, obwohl vorgeschlagen wurde, dass ein Teil des TMV Zusammenbaus in den Chloroplasten erfolgen kann, da Transkripte der ctDNA in gereinigten TMV Virionen detektiert wurden. Die Initiation des TMV Zusammenbaus erfolgt durch Interaktion zwischen ringförmigen Aggregaten ("Discs") des Hüllproteins (jede "Disc" besteht aus zwei Schichten aus 17 Untereinheiten) und einer einzigen internen Nukleationsstelle in der RNA, einer Hairpin-Region etwa 900 Nukleotide vom 3' Ende im gewöhnlichen TMV-Stamm. Jede RNA einschließlich der subgenomischen RNAs, welche diese Stelle enthält, kann in Virionen verpackt werden. Die "Discs" nehmen anscheinend bei Interaktion mit der RNA eine helikale Forma an, und der Zusammenbau (Elongation) geht im Anschluss in beide Richtungen weiter (allerdings schneller in der 3' nach 5' Richtung von der Nukleationsstelle aus).
Ein weiterer Vertreter der Tobamoviren, der Cucumber Green Mottle Mosaic Virus Watermelon Strain (CGMMV-W) ist mit dem Cucumber Virus verwandt. Noru, Y., et al., Virology 45, 577 (1971). Das Hüllprotein von CGMMV-W interagiert mit der RNA sowohl von TMV als CGMMV, um in vitro virale Partikel zusammenzubauen. Kurisu et al., Virology 70, 214 (1976).
Mehrere Stämme der Tobamovirus-Gruppe werden auf der Basis des Ortes des Ursprungs des Zusammenbaus (origin of assembly) in zwei Subgruppen eingeteilt. Fukuda, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 4231 (1981). Die Subgruppe I welche die vulgare-, OM- und tomato-Stämme einschließt, weist einen "Origin of Assembly" bei etwa 800–1000 Nukleotiden vom 3'-Ende des RNA-Genoms und außerhalb des Hüllprotein-Cistrons auf. Lebeurier, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1914 (1977); und Funkuda, M. et al., Virology 101, 493 (1980). Die Subgruppe II, welche die CGMMV-W- und cornpea(Cc)-Stämme einschließt, weist einen "Origin of Assembly" bei etwa 300–500 Nukleotiden vom 3'-Ende des RNA Genoms und innerhalb des Hüllprotein-Cistrons auf. Fukada, M. et al., supra. Das Hüllprotein-Cistron von CGMMV-W liegt an den Nukleotiden 176-661 vom 3'-Ende. Die 3'-nichtkodierende Region ist 175 Nukleotide lang. Der "Origin of Assembly" liegt innerhalb des Hüllprotein-Cistrons. Meshi, T. et al., Virology 127, 52 (1983).
Die Nukleotidsequenz eines beliebigen geeigneten Virus wie in Anspruch 1 definiert kann von einer viralen Nukleinsäure durch Modifizieren der kodierenden Sequenz des Hüllproteins abgeleitet werden. Die Modifikation kann die Entfernung einer kodierenden Sequenz für zumindest einen Teil des viralen Hüllproteins sein. Alternativ kann die Nukleotidsequenz derart synthetisiert werden, dass ihr zumindest ein Teil der kodierenden Sequenz für das virale Hüllprotein fehlt. Ein ausreichender Anteil der kodierenden Sequenz wird entfernt, sodass jedes Hüllprotein, das durch das Virus produziert werden kann, zur Verpackung der viralen Nukleinsäure nicht in der Lage ist. Zusätzlich kann die kodierende Sequenz des Hüllproteins durch Mutation derart modifiziert werden, dass das Hüllprotein, welches produziert wird, zur Umhüllung der viralen Nukleinsäure nicht in der Lage ist. In jedem Fall wird ein biologisch nicht funktionelles Protein erzeugt. In einigen Fällen kann ein Teil des Gens für eine hohe Aktivität des Promoters notwendig sein. Falls das so ist, sollte nicht das gesamte Gen delektiert werden. Um einfach auf andere Pflanzen übertragbar zu sein, muss die Nukleotidsequenz in einem kompatiblen Hüllprotein verpackt sein, wie weiter unten beschrieben. Die virale Nukleinsäure kann ferner modifiziert werden, um die kodierende Sequenz eines beliebigen viralen Transmissionsfaktors zu verändern. Die Veränderung der kodierenden Sequenzen für diese Faktoren stellt sicher, dass die Nukleotidsequenz nicht durch andere Vektoren, zum Beispiel durch Insekten, übertragen werden kann.
Die Nukleotidsequenz wird durch Klonieren der viralen Nukleinsäure in eine geeignete Produktionszelle hergestellt. Falls die virale Nukleinsäure DNA ist, kann sie durch die Verwendung herkömmlicher Verfahren direkt in einen geeigneten Vektor kloniert werden. Eine Technik ist es, einen Replikationsursprung, der mit der Produktionszelle kompatibel ist, an die virale DNA anzuheften. Falls die virale Nukleinsäure RNA ist, wird zunächst durch etablierte Verfahren eine vollständige (full-length) DNA Kopie des viralen Genoms hergestellt. Die virale RNA wird beispielsweise mit Hilfe von Reverser Transkriptase in DNA transkribiert, um subgenomische DNA-Fragmente zu erzeugen, und eine doppelsträngige DNA mit Hilfe von DNA-Polymerasen erzeugt. Im Anschluss wird die DNA in geeignete Vektoren kloniert und in eine Produktionszelle kloniert. Die DNA-Fragmente werden kartiert und in korrekter Sequenz kombiniert, um eine vollständige DNA Kopie des viralen RNA-Genoms zu erzeugen. Die kodierenden Sequenzen für das virale Hüllprotein und die viralen Transmissionsfaktor werden identifiziert und verändert. Die erhaltene Nukleotidsequenz ist selbstreplizierend, aber zur Infektion des Wirts selber nicht imstande. Jede Art und Weise, die kodierenden Sequenzen für das virale Hüllprotein und die kodierenden Sequenzen für die viralen Transmissionsfaktoren vom Rest der viralen Nukleotidsequenz zu trennen oder die Nukleotidsequenzen dieser Proteine zu verändern, um biologisch nicht funktionelle Proteine zu erzeugen, ist für die Erfindung geeignet.
Im Fall von Alphaviren können die E1- und E2-Glycoproteine eine Rolle in der Übertragbarkeit des Virus spielen (Garaff, H. et al., Nature 288, 236 (1980)). Diese Glycoproteine werden in eine Flüssigumhüllung (liquid envelope), welche das Hüllprotein umgibt, eingefügt. Die Nukleotidsequenz, die für die E1- und E2-Glycoproteine kodiert, grenzt an die kodierende Sequenz für das Hüllprotein in der Alphavirus-RNA an. Daher können die kodierenden Sequenzen für die E1- und E2-Glycoproteine zusammen mit der kodierenden Sequenz für das Hüllprotein durch bekannte konventionelle Verfahren entfernt werden.
Ein zweites Merkmal der Erfindung ist eine chimäre Nukleotidsequenz, die eine erste Nukleotidsequenz und eine zweite Nukleotidsequenz umfasst. Die erste Sequenz ist zur Selbstreplikation in der Lage, ist jedoch nicht zur Transmission imstande und weist eine substanzielle Sequenzhomologie mit einer viralen Nukleotidsequenz auf, wie oben beschrieben. Die zweite Sequenz kann in einem Wirt transkribiert werden. Die zweite Sequenz ist vorzugsweise angrenzend an einen viralen Promoter angeordnet, obwohl ein Fusionsprotein erzeugt werden kann, das ebenso biologische Aktivität aufweist. Jeder virale Promoter kann verwendet werden, aber es wird bevorzugt, einen Promoter für ein virales Hüllproteingen zu verwendet, von dem zumindest ein Teil der kodierenden Sequenz deletiert wurde. In den Fällen, in denen die kodierende Sequenz des Hüllproteins verändert, aber nicht deletiert wurde, kann der virale Promoter mit Hilfe herkömmlicher Verfahren an die zweite Sequenz angeheftet werden oder die zweite Sequenz kann in oder angrenzend an die kodierende Sequenz des Hüllproteins inseriert werden, sodass ein Fusionsprotein erzeugt wird. Die zweite Sequenz, die transkribiert wird, kann als eine RNA transkribiert werden, die zur Regulation der Expression eines phänotypischen Merkmals mit Hilfe eines Antisense-Mechanismus in der Lage ist. Alternativ kann die zweite Sequenz in der chimären Nukleotidsequenz im Wirt, zum Beispiel in Pflanzengewebe, transkribiert und translatiert werden, um ein phänotypisches Merkmal zu erzeugen. Die zweite Nukleotidsequenz kann ferner für die Expression von mehr als einem phänotypischen Merkmal kodieren. Die chimäre Nukleotidsequenz wird unter Verwendung konventioneller Verfahren derart konstruiert, dass sich die zweite Nukleotidsequenz in korrekter Orientierung zum viralen Promoter befindet.
Zweckmäßige phenotypische Merkmale in Pflanzenzellen umfassen eine verbesserte Toleranz gegenüber Herbiziden, verbesserte Toleranz gegenüber extremer Hitze oder Kälte, Trockenheit, Salzhaltigkeit oder osmotischem Stress, verbesserte Resistenz gegenüber Pflanzenschädlingen (Insekten, Nematoden oder Spinnentiere) oder Erkrankungen (fungal, bakteriell oder viral), Produktion von Enzymen oder sekundären Metaboliten, männliche oder weibliche Sterilität, Zwergwuchs, Frühreife, verbesserter Ertrag, Vitalität, Heterosis, Nährstoffqualität, Geschmack oder Verarbeitungseigenschaften oder ähnliches. Weitere Beispiele umfassen die Produktion wichtiger Proteine oder anderer kommerziell verwendbarer Produkte, wie zum Beispiel Lipase, Melanin, Pigmente, Antibiotika oder ähnliches. Ein weiteres zweckmäßiges phenotypisches Merkmal ist die Produktion abbauender oder inhibitorischer Enzyme, wie zum Beispiel diejenigen, die verwendet werden, um die Wurzelentwicklung in Braugerste zu verhindern oder zu hemmen. Das phenotypische Merkmal kann ebenfalls ein sekundärer Metabolit sein, dessen Produktion in einem Bioreaktor erwünscht wird.
Ein Beispiel für eine chimäre Nukleotidsequenz ist eine Sequenz, die eine erste Nukleotidsequenz enthält, welche eine substanzielle Sequenzhomologie mit TMV aufweist, und eine zweite Nukleotidsequenz, die eine kodierende Sequenz für Tyrosinase ist. In einem zweiten Beispiel ist das Virus das Oat Mosaic Virus (OMV). OMV ist zur Infektion der meisten monokotylen Spezies einschließlich Gerste und Mais in der Lage. In einem dritten Beispiel ist die zweite Nukleotidsequenz die kodierende Sequenz für Cyclodextrin-Glucanotransferase.
Die zweite Nukleotidsequenz kann in die erste Nukleotidsequenz inseriert werden, welche oben derart hergestellt wurde, dass sie an einen viralen Promoter angrenzt. Da die Lokalisation des Promoters für das virale Hüllprotein-Gen in diese Sequenz als Ergebnis der Deletion des Gens bekannt ist, kann die zweite Nukleotidsequenz angrenzend an diesen Promoter angeordnet werden. Alternativ kann zunächst ein geeigneter viraler Promoter an die zweite Nukleotidsequenz angeheftet werde, und dieses Konstrukt kann im Anschluss entweder in oder angrenzend an die erste Nukleotidsequenz inseriert werden. Zusätzlich kann die zweite Nucleotidsequenz in oder angrenzend an eine veränderte kodierende Sequenz für ein verändertes Hüllprotein inseriert werden.
Eine doppelsträngige DNA der chimären Nukleotidsquenz oder einer komplementären Kopie der chimären Nukletidsequenz wird in eine Produktionszelle kloniert. Falls die virale Nukleinsäure ein RNA-Molekül ist, wird die chimäre Nukleotidsequenz zunächst an einen Promotor angeheftet, der mit der Produktionszelle kompatibel ist. Die chimäre Nukleotidsequenz kann dann in jeden geeigneten Vektor kloniert werden, der mit der Produktionszelle kompatibel ist. Auf diese Weise werden nur RNA-Kopien der chimären Nukleotidsequenz in der Produktionszelle erzeugt. Falls die Produktionszelle zum Beispiel E. coli ist, kann der lac-Promotor verwendet werden. Falls die Produktionszelle eine Pflanzenzelle ist, kann der CaMV-Promotor verwendet werden. Die Produktionszelle ist eine eukaryontische Zelle, wie beispielsweise Hefe, eine Pflanze oder ein Tier, falls die virale RNA für die biologische Aktivität mit einem Cap versehen (capped) werden muss. Die chimäre Nukleotidsequenz kann im Anschluss in jeden geeigneten Vektor kloniert werden, der mit der Produktionszelle kompatibel ist. Alternativ wird die chimäre Nukleotidsequenz in einen Vektor angrenzend an einen Promotor inseriert, welcher mit der Produktionszelle kompatibel ist. Falls die virale Nukleinsäure ein DNA-Molekül ist, kann es direkt in eine Produktionszelle kloniert werden, in dem es an einen "Origin of Replication" angeheftet wird, der mit der Produktionszelle kompatibel ist. Auf diese Weise werden in der Produktionszelle DNA-Kopien in der chimären Nukleotidsequenz erzeugt.
Ein Promotor ist eine DNA-Sequenz, welche die RNA-Polymerase steuert, um an DNA zu binden und die RNA-Synthese zu initiieren. Es gibt starke Promotoren und schwache Promotoren. Unter den starken Promotoren finden sich lacUV5, trp, tac, trp-lacUV5, λP_L, ompF und bla. Ein zweckmäßiger Promotor zur Expression fremder Gene in E. coli ist sowohl stark als auch reguliert. Der λP_L Promotor des Bakteriophagen λ ist ein starker, gut regulierter Promotor. Hedgpeth, J.M. et al. Mol. Gen. Genet. 163, 197 (1978); Bernard, H.M. et al. Gene 5, 59 (1979); Remaut, E.P. et al., Gene 15, 81 (1981).
In einen Klonierungsvektor kann ein Gen eingeschlossen werden, das einen temperatur-sensitiven λ-Repressor, wie zum Beispiel λcIts 857, kodiert. Bernard et al., supra. Bei geringer Temperatur (31°C) wird der P_L-Promotor durch das cI-Gen Produkt in einem reprimierten Zustand gehalten. Ein Anheben der Temperatur zerstört die Aktivität des Repressors. Der P_L-Promotor steuert dann die Synthese großer Mengen an mRNA. Auf diese Weise können die E. coli Produktionszellen zur gewünschten Konzentration heranwachsen, bevor sie die Produkte erzeugen, welche innerhalb der Vektoren kodiert sind. Auf ähnliche Weise kann ein temperatur-sensitiver Promotor durch Anpassen der Temperatur der Kultur zu einem gewünschten Zeitpunkt aktiviert werden.
Es kann vorteilhaft sein, ein Plasmid zu konstruieren, das konditional sehr hohe Kopienzahlen erreichen kann. Beispielsweise kann das Plasmid pAS2, das einen lac- oder tac-Promotor enthält, bei 42°C sehr hohe Kopienzahlen erreichen. Der lac-Repressor, der im Plasmid pAS2 vorhanden ist, wird im Anschluss durch Isopropyl-β-D-Thiogalactosid inaktiviert, um die Synthese der mRNA zu ermöglichen.
Eine weitere Alternative bei der Erzeugung der chimären Nukleotidsequenzen ist es, mehr als eine Nukleotidsequenz herzustellen (d.h. die Nukleotidsequenzen zu erzeugen, die für ein vielteiliges virales Vektorkonstrukt erforderlich sind). In diesem Fall würde jede Nukleotidsequenz ihren eigenen "Origin of Assembly" benötigen. Jede Nukleotidsequenz könnte chimär sein (d.h. jede Nukleotidsequenz hat eine fremde kodierende Sequenz inseriert) oder nur eine der Nukleotidsequenzen könnte chimär sein.
Wenn man herausfindet, dass ein vielteiliges Virus die kodierende Sequenz für sein Hüllprotein auf einem Strang der Nukleinsäure trägt und die kodierende Sequenz für einen Transmissionsfaktor auf einem anderen Strang, würden entsprechend der Erfindung zwei chimere Nukleotidstränge erzeugt werden. Eine fremde kodierende Sequenz würde anstelle des Hüllprotein-Gens auf einem Strang der Nukleinsäure inseriert werden (oder nahe dem veränderten Hüllprotein inseriert werden), und eine weitere fremde kodierende Sequenz würde anstelle des Gens für den Transmissionsfaktor auf dem anderen Strang der Nukleinsäure inseriert werden (oder nahe dem veränderten Gen für den Transmissionsfaktor inseriert werden).
Alternativ kann die Insertion einer fremden kodierenden Sequenz in die Nukleotidsequenz eines einteiligen Virus die Erzeugung zweier Nukleotidsequenzen zur Folge haben (d.h. die Nukleinsäure, die für die Erzeugung eines zweiteiligen viralen Vektors erforderlich ist). Dies würde eine vorteilhafte Situation darstellen, wenn es wünschenswert ist, die Replikation und Translation der fremden kodierenden Sequenz von der Replikation und Translation von einigen der kodierenden Sequenzen der ursprünglichen Nukleotidsequenz getrennt zu halten. Jede Nukleotidsequenz müsste ihren eigenen "Origin of Assembly" besitzen.
Ein drittes Merkmal der Erfindung ist ein Virus oder ein virales Partikel. Das Virus umfasst eine chimäre Nukleotidsequenz wie oben beschrieben, die verpackt wurde. Das erhaltene Produkt ist dann zur Infektion eines geeigneten Wirts imstande, aber die chimäre Nukleotidsequenz ist für eine weitere Infektion nicht in der Lage, da ihr der Mechanismus fehlt, zusätzliche Viren oder virale Partikel zu produzieren. Die chimere Nukleotidsequenz ist jedoch zur Replikation im Wirt imstande. Die chimäre Nukleotidsequenz wird im Wirt transkribiert und/oder translatiert, um das gewünschte Produkt zu erzeugen.
Die meisten Viren werden entweder in einem icosahedrischen Capsid, einem sphärischen Capsid oder einem stäbchenförmigen Capsid verpackt. Pflanzenviren, wie zum Beispiel der Tobacco Mosaic Virus, werden üblicherweise in einem stäbchenförmigen Capsid verpackt.
Die icosahedrischen Capside und die sphärischen Capside sind geometrisch eingeschränkter als ein stäbchenförmiges Capsid, und daher hinsichtlich der Größe der Nukleinsäure beschränkt, die verpackt werden kann. Im Gegensatz dazu ist ein stäbchenförmiges Capsid erweiterbar, sodass es eine beliebig große Nukleinsäure verpacken kann, wie in der europäischen Patentanmeldung 0 278 667 erläutert.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die chimäre Nukleotidsequenz in einem heterologen Capsid verpackt. Üblicherweise macht sich diese Ausführungsform ein stäbchenförmiges Capsid zunutze, da dieses in der Lage ist, eine längere chimäre Nukleotidsequenz zu verpacken als das geometrisch eingeschränktere icosahedrische Capsid oder das sphärische Capsid. Die Verwendung eines stäbchenförmigen Capsids erlaubt den Einbau einer längeren fremden proteinkodierenden Sequenz, um die chimäre Nukleotidsequenz zu bilden. Solch ein stäbchenförmiges Capsid ist am vorteilhaftesten, wenn mehr als eine fremde kodierende Sequenz in der chimeren Nukleotidsequenz vorhanden ist.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist ein Vektor, der die chimäre Nukleotidsequenz enthält, wie oben beschrieben. Die chimäre Nukleotidsequenz liegt angrenzend an eine Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus einem Promotor für eine Produktionszelle oder einem Replikationsursprung besteht, die mit der Produktionszelle kompatibel sind. Der Vektor wird zur Transformation einer Produktionszelle verwendet, die im Anschluss die chimäre Nukleotidsequenz in großer Menge produziert. Die Produktionszelle kann eine beliebige Zelle sein, die mit dem Vektor kompatibel ist. Die Produktionszelle kann prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Falls die virale RNA (chimäre Nukleotidsequenz) jedoch mit einem Cap versehen werden muss, um aktiv zu sein, dann muss die Produktionszelle in der Lage sein, die virale RNA mit einem Cap zu versehen, wie zum Beispiel eine eukaryontische Produktionszelle. Die Produktionszelle kann nur den Vektor enthalten, der die chimäre Nukleotidsequenz enthält. In diesem Fall erzeugt die Produktionszelle nur die chimäre Nukleotidsequenz, welche im Anschluss in vitro verpackt werden muss, um ein infektiöses Virus zu erzeugen. Die Verpackung wird entsprechend herkömmlicher Verfahren durch Zugabe eines kompatiblen viralen Hüllproteins zur chimären Nukleotidsequenz erreicht. In diesem Szenario würde das virale Hüllprotein in einer zweiten Produktionszelle erzeugt werden. Ein Vektor, der eine kodierende Sequenz für ein kompatibles virales Hüllprotein angrenzend an einen Promotor umfasst, welcher mit der Produktionszelle kompatibel ist, wird zur Transformation der zweiten Produktionszelle verwendet. Die zweite Produktionszelle erzeugt im Anschluss das virale Hüllprotein in großer Menge.
Wie oben ausgeführt, kann das virale Hülllprotein, das von der zweiten Produktionszelle erzeugt wird, homolog oder heterolog zur viralen Nukleotidsequenz sein. Das virale Hüllprotein muss mit der chimären Nukleotidsequenz kompatibel und von ausreichender Größe sein, um die chimäre Nukleotidsequenz vollständig zu verpacken.
Alternativ weist die Produktionszelle stabil in ihr Genom integriert eine kodierende Sequenz für ein kompatibles virales Hüllprotein angrenzend an einen Promotor auf, der mit der Produktionszelle kompatibel ist. Wiederum kann diese kodierende Sequenz für das virale Hüllprotein homolog oder heterolog zur viralen Nukleotidsequenz sein. In diesem Fall erzeugt die Produktionszelle im Anschluss das Hüllprotein und die chimäre Nukleotidsequenz. Die chimäre Nukleotidsequenz wird dann vom viralen Hüllprotein verpackt, um ein übertragbares Virus zu erzeugen.
Bei den meisten Vektoren ist nicht bekannt, ob die Transmissionsfaktoren alleine für die Infektiosität eines Virions essentiell sind, oder ob die Transmissionsfaktoren lediglich als ein Anhängsel an das Capsid dienen, und daher die Infektiosität des Virions steigern, aber eine Infektion nicht verhindern, falls sie nicht auf dem Virion vorhanden sind. Zum Zwecke dieser Erfindung (d.h. um die Nicht-Infektionsität des viralen Vektors sicherzustellen) wurde angenommen, dass die Transmissionsfaktoren alleine einen viralen Vektor infektiös machen können, und daher enthält der Vektor, der die chimäre Nukleotidsequenz umfasst, weder eine Nukleotidsequenz für das Capsidprotein noch eine Nukleotidsequenz für einen beliebigen Transmissionsfaktor.
Dieser Vektor, der die chimäre Nukleotidsequenz umfasst, muss jedoch einen Promotor und einen Replikationsursprung enthalten, und vorzugsweise enthält er einen "Origin of Assembly". Wie oben ausgeführt, wird dieser Vektor zur Transformation einer Produktionszelle verwendet. Der Replikationsursprung muss mit der Produktionszelle kompatibel sein.
Alle Promotoren, die mit dem Vektor assoziiert sind, müssen mit der Produktionszelle kompatibel sein, in welcher der Vektor verwendet wird.
Die prokaryontische Produktionszelle oder eine eukaryontische Produktionszelle wird so transformiert, das die kodierenden Sequenzen für das Hüllprotein und die Transmissionsfaktoren (falls erforderlich) stabil in das Genom der Zelle integriert sind. Mehrere konventionelle Verfahren können verwendet werden, um diese Ausgestaltung zu erreichen. Beispielsweise können entsprechende kodierende Sequenzen durch Transformation mit Agrobacterium in Pflanzenzellen eingebracht werden, wie zum Beispiel beschrieben von Schell, J. et al., Bio/Technology 1, 175 (1983); Fillatti, J. et al., Bio/Technology 5, 726 (1987); Everett, N.P. et al., Bio/Technology 5, 1201 (1987); Pua, E-C., Bio/Technology 5, 815 (1987); Hinchee, M.A. et al., Bio/Technology 6, 915 (1988) und Meth. Enzymol., Vol. 118, supra. Agrobacterium wurde ferner verwendet, um Viren in Pflanzen, und zwar sowohl dikotyle als auch monokotyle, in einem Verfahren einzubringen, das als Agro-Infektion bezeichnet wird. Diese Technik wurde beschrieben von Grimsley, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3282 (1986); Elmer, J.S. et al., Plant Mol. Biol. 10, 225 (1988); Grimsley, N. et al., Nature 325, 177 (1987); und Hayes, R.J. et al., Nature 334, 180 (1988).
Alternativ kann die entsprechende kodierende Sequenz durch direkten Gentransfer einschließlich Elektroporation, Calciumchlorid- oder Polyethylenglykol-vermittelte Transformation, Liposomenfusion-Mikroinjektion oder Beschuss mit Mikroprojektilen in eukaryontische Zellen inseriert werden. Diese Techniken wurden beschrieben von Fromm, M.E., Meth. Enzymol. 153, 307 (1987); Shillito, R.D. et al., Meth. Enzymol. 153, 283 (1987); Dehayes, A., et al., EMBO J. 4, 2731 (1985); Negrutin, R. et al., Plant Mol. Biol. 8, 363 (1987); Reich, T.J. et al., Bio/Technology 4, 1001 (1986); Klein, T.M. et al., Bio/Technology 6, 559 (1988); und McCabe, D.E. et al., Bio/Technology 6, 923 (1988).
Eine Produktionszelle, die transformiert wurde, enthält die kodierenden Sequenz(en) für das Hüllprotein und/oder die Transmissionsfaktoren stabil in das Genom integriert. Der Vektor, der die chimäre Nukleotidsequenz enthält, wird anschließend in die Produktionszelle eingebracht, wie vorher diskutiert.
Sobald die chimäre Nukleotidsequenz repliziert ist und das Capsidprotein und die Transmissionsfaktoren von dem entsprechenden Produktionszellen erzeugt wurden, können intakte Virione in vitro zusammengebaut werden. Die replizierte chimäre Nukleotidsequenz wird entsprechend bekannter üblicher Verfahren vom Capsidprotein verpackt. Die Transmissionsfaktoren können getrennt zum Zusammenbau des Virions hinzugefügt werden.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist ein Wirt, der mit dem Virus infiziert wurde. Nach Einbringen in einen Wirt enthält der Wirt die chimäre Nukleotidsequenz, die zur Selbstreplikation in der Lage ist, die aber nicht imstande ist, zusätzliche übertragbare Viren oder virale Partikel zu erzeugen. Der Wirt kann mit dem Virus mit Hilfe herkömmlicher Verfahren infiziert werden. Geeignete Techniken umfassen die Blattabrasion, Abrasion in Lösung, Hochgeschwindigkeitsbesprühung mit Wasser und andere Verletzungen eines Wirts sowie ein Absorbieren des Saatguts des Wirts mit Wasser, das die chimere Nukleotidsequenz alleine oder das verpackte Virus enthält. Obwohl die chimäre Nukleotidsequenz zur Herstellung infektiöser Agenzien nicht imstande ist, ist sie zur Selbstreplikation und zur Ausbreitung innerhalb des pflanzlichen Wirts in der Lage.
Ein alternatives Verfahren zum Einbringen einer chimären Nukleotidsequenz in einen pflanzlichen Wirt ist eine Technik, die als Agroinfektion oder Agrobacterium-vermittelte Transformation (manchmal als Agro-Infektion bezeichnet) bekannt ist, wie beschrieben von Grimsley, N. et al., Nature 325, 177 (1987). Diese Technik macht sich ein gemeinsames Merkmal von Agrobacterium zunutze, welches Pflanzen durch Transfer eines Teils seiner DNA (die T-DNA) in eine Wirtszelle kolonialisiert, in der sie in die nukleare DNA integriert wird. Die T-DNA ist durch Grenzsequenzen definiert, die 25 Basenpaare lang sind, und eine beliebige DNA zwischen diesen Grenzsequenzen wird ebenfalls in die Pflanzenzellen transferiert. Die Insertion einer chimären viralen Nukleotidsequenz zwischen die Grenzsequenzen der T-DNA hat einen Transfer der chimären Sequenz in die Pflanzenzelle zur Folge, wo die chimäre Sequenz repliziert wird, und sich im Anschluss systematisch durch die Pflanze ausbreitet. Agro-Infektion wurde bewerkstelligt mit Potato Spindle Tuber Viroid (PSTV) (Gardner, R.C. et al., Plant Mol. Biol. 6, 221 (1986), Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) (Grimsley, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3282 (1986)), Maize Streak Virus (Grimsley, N. et al., Nature 325, 177 (1987) und Lazarowitz, S.G., Nucl. Acids Res. 16, 229 (1988)), Digitaria Streak Virus (Donson, J. et al., Virology 162, 248 (1988)), Wheat Dwarf Virus (Hayes, R.J. et al., J. Gen. Virol. 69, 891 (1988)) und Tornato Golden Mosaic Virus (TGMV) (Elmer, J.S. et al., Plant Mol. Biol. 10, 225 (1988) und Gardiner, W.E. et al., EMBO J. 7, 899 (1988)). Daher könnte die Agro-Infektion einer empfänglichen Pflanze mit einem Virion erreicht werden, das eine chimäre Nukleotidsequenz enthält, die auf der Nukleotidsequenz eines beliebigen der oben erwähnten Viren basiert.
Mehrere virale Produkte sind dienlich, um die Produktion und Ausbreitung der viralen Nukleinsäuren sicherzustellen. Ein Faktor ist eine Replicase, die an der Replikation der viralen Nukleinsäure beteiligt ist. Ein zweiter Faktor, der vorhanden sein kann, wird hier als ein Transportprotein bezeichnet.
Dieses Protein (diese Proteine) ist (sind) an der Bewegung der viralen Nukleinsäure von infizierten Zellen zu benachbarten Zellen und somit an der Ausbreitung der viralen Nukleinsäure durch die Produktions- oder Wirtszelle, das Gewebe oder den Organismus beteiligt. Um eine angemessene Replikation und Ausbreitung des viralen Vektors sicherzustellen, umfasst eine zusätzliche Ausführungsform der Erfindung die stabile Transformation der Wirts- oder Produktionszelle, des Gewebes oder des Organismus mit einer kodierenden Sequenz für eine virale Replicase, ein virales Transportprotein oder für beides. Die Transformation einschließlich der stabilen Integration in das Genom der Produktionszelle oder des Wirts wird wie oben für das Hüllprotein-Gen beschrieben bewerkstelligt.
In einer zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung wird der Wirtsbereich eines Virus derart erweitert, das ein virales Konstrukt, d.h. die chimäre Nukleinsäure, welches verschiedene fremde Gene enthält, in vielen verschiedenen Wirten verwendet werden kann. Der Wirtsbereich des Virus wird durch Transformieren des Wirts (oder der Produktionszelle, da diese in diesem Zusammenhang ebenfalls funktionieren wird) vergrößert, um Teile des viralen Materials zu enthalten, die bei der Ermöglichung der Infektion des Wirts durch das virale Konstrukt zweckdienlich sind. Bei pflanzlichen Wirtsorganismen werden die Wirte transformiert, um das virale Replicase-Gen oder das Gen für das Transportprotein zu enthalten. Alternativ kann das Virus erzeugt werden, um die kodierenden Sequenzen für die Transportproteine zu enthalten, die in dem Wirt funktionell sind. Zusätzlich ist es möglich, Protoplasten der Wirtspflanze zu transformieren, um die virale Nukleinsäure oder Teile davon zu erhalten, sodass alle Zellen der regenerierten Pflanze zur Infektion in der Lage sind. Diese Transformation wird mit Hilfe einer beliebigen der oben beschriebenen Techniken durchgeführt.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist ein Verfahren für die Herstellung eines spezifizierten Produkts, wie zum Beispiel einer anti-sense RNA, eines Ribozyms, eines Proteins, eines Enzyms oder eines komplexen Biomoleküls. Solche Produkte umfassen die oben diskutierten. Die zweite Nukleotidsequenz der chimären Nukleotidsequenz umfasst die transkribierbare Sequenz, die zur Herstellung des gewünschten Produkts führt. Dieses Verfahren beinhaltet die Infektion des geeigneten Wirts mit dem Virus, wie zum Beispiel den oben beschriebenen, die Anzucht des infizierten Wirts, um das gewünschte Produkt zu erzeugen, und die Isolierung des gewünschten Produkts, falls notwendig. Die Anzucht des infizierten Wirts wie auch die Isolierung des resultierenden Produkts erfolgt entsprechend konventioneller Techniken.
In einem Beispiel wird eine für eine Tyrosinase kodierende Sequenz, wie beispielsweise die aus Streptomyces antibioticus isolierte, angrenzend an den Promotor des viralen Hüllproteins inseriert, welche von einer Nukleotidsequenz von TMV oder dem Oat Mosaic Virus (OMV) abgeleitet ist, aus der die kodierende Sequenz für das Hüllprotein entfernt wurde. Ein Virus wird unter Verwendung der erhaltenen chimären Nukleotidsequenz wie oben beschrieben hergestellt. Tabak oder keimende Gerste wird mit dem entsprechenden Virus infiziert. Die chimäre Nukleotidsequenz repliziert sich selbst im Pflanzengewebe, um das Enzym Tyrosinase zu erzeugen. Alternativ wird die für Tyrosinase kodierende Sequenz in eine andere, geeignet modifizierte virale Nukleinsäure inseriert.
Das daraus resultierende Virus wird zur Infektion des entsprechenden Wirts verwendet, und Tyrosinase wird produziert. Die Aktivität dieses Enzyms führt zur Produktion von Melanin. Siehe zum Beispiel Huber, M. et al., Biochemistry 24, 6038 (1985).
In einem zweiten Beispiel wird eine für Cyclodextrin-Glucanotransferase kodierende Sequenz, wie etwa die aus Bacillus sp. Nr. 17–1 (siehe U.S. Patent 4,135,977) isolierte, angrenzend an den Promotor des viralen Hüllprotein einer Nukleotidsequenz inseriert, welche von OMV abstammt, aus der die kodierende Sequenz für das Hüllprotein entfernt wurde. Ein Virus wird unter Verwendung der chimären Nukleotidsequenz wie oben beschrieben hergestellt. Mais oder Kartoffeln werden mit dem entsprechenden Virus infiziert. Die chimäre Nukleotidsequenz repliziert. sich selbst im Pflanzengewebe, um das Enzym Cyclodextrin-Glucanotransferase zu erzeugen. Die Aktivität dieses Enzyms führt zur Produktion von Cyclodextrin, das als Aromastoff oder zur Arzneimittelabgabe verwendet wird.
Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung zusätzlich. In diesen Beispielen wurden Enzymreaktionen entsprechend der von den Herstellern empfohlenen Verfahren durchgeführt, außer es ist anders angegeben. Standardverfahren wie die in Maniatis, T. et al., supra; Meth. Enzymol. Vol. 68, 100, 101, 118, 152–155, supra; und DNA Cloning, Vol. I, II, III, supra beschriebenen wurden für die Vektorkonstruktionen und die Transformation verwendet, außer es ist anders angegeben.
Beispiel 1
Herstellung einer chimären TMV DNA, die das Tyrosinase-Gen anstelle des Hüllprotein-Gens umfasst.
Das 1.2 kb Tyrosinase Gen wurde aus dem Streptomyces Plasmid pIJ702 (allgemein verfügbar) unter Verwendung eines SacI/PvuII Schnitts erhalten. Es wurde in die SacI/EcoRV Schnittstellen des Bluescript Vektors (KS) von Stratagene inseriert, der 2.9 kb groß ist. Das erhaltene Plasmid wurde als pBG110 (4.1 kb) bezeichnet. Das Tyrosinase-Gen wurde durch einen SacI/HindIII Schnitt aus pBG110 entfernt und in pUC19 (2.7 kb) inseriert, was pBG115 (3.9 kb) ergab. Das Tyrosinase-Gen wurde durch einen EcoRI/HindIII Schnitt aus pBG115 entfernt und in den Bluescript Vektor (KS+; 2.9 kb) von Stratagene inseriert, was pBG120 (4.1 kb) ergab. Das Tyrosynase-Gen wurde mit einem XhoI/SmaI Schnitt aus pBG120 entfernt, und es wurden XhoI-Linker an das SmaI-Ende angefügt. Dieses Tyrosinase-Gen mit den XhoI-Enden wurde in die XhoI Schnittstelle des Bluescript Vektors (Ks+; 2.9 kb) von Stratagene inseriert, um pBG130 (4.1 kb) zu ergeben. Da eine nicht erwünschte PstI Schnittstelle in eine Polylinker-Region überführt wurde, wurde pBG130 durch Entfernen einiger nichtkodierender Basen und der Polylinker-Region modifiziert. Dies wurde mit Hilfe eines HindIII/SacI Verdaus durchgeführt, um die Tyrosinase aus pBG130 freizusetzen, und im Anschluss wurde das 1.2 kb Fragment mit ExoIII behandelt, um ungefähr 200 Basen vom HindIII 3'-Ende zu verdauen. Nach Erzeugung glatter Enden mit T₄ DNA-Polymerase wurden XhoI-Linker eingefügt, und das 1.0 kb Fragment wurde in den Bluescript Vektor (KS+; 2.9 kb) von Stratagene inseriert, was pBG132 ergab. Das 1.0 kb Tyrosinase-Gen wurde in p803 (6.3 kb) inseriert, welches ein 3.6 kb Subklon des TMV Plasmids pS3–28 (verfügbar von W.O. Dawson, University of California, Riverside) in pUC19 ist, was die Plasmide pBG21 und pBG22 ergab (abhängig von der Richtung des Tyrosinase-Gens; jedes 7–3 kb). Das Plasmid pS3–28 (11.1 kb) ist ein Klon von TMV, aus dem das Hüllprotein-Gen mit einer XhoI Schnittstelle an dieser Position entfernt wurde. Dawson, W. 0. et al., Phytopathology 78, 783 (1988). Ein NcoI/EcoRV Schnitt von pBG21 und pBG22 setzte ein 2.4 kb Fragment frei, welches das Tyrosinase-Gen enthält. Dieses Fragment ersetzte ein 1.4 kb Fragment in pS3–28, das entfernt wurde. Die erhaltenen Plasmide pBG23 und pBG24 (abhängig von der Richtung des Tyrosinase-Gens; jedes 12.1 kb) waren die finalen DNA-Konstruktionen, die zur Herstellung infektiöser RNA verwendet wurden, welche in Tabakpflanzen eingebracht wurde, um eine mRNA für Tyrosinase einzuführen. Diese mRNA kann mit Hilfe von Northern Blot-Verfahren detektiert werden.
Beispiel 2
Herstellung einer chimären TMV DNA, die das GUS-Gen anstelle des Hüllprotein-Gens umfasst.
Das 1.8 kb GUS Gen wurde aus dem Plasmid pRAJ275 (4.5 kb; Clontech Laboratories) unter Verwendung eines EcoRI/NcoI Schnitts erhalten. Die überhängenden Enden (sticky ends) wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments aufgefüllt. Es wurden XhoI-Linker angehängt, und das Fragment wurde in den Bluescript Vektor (KS+) von Stratagene inseriert, der 2.9 kb groß ist. Das erhaltene Plasmid wurde als pBG150 (4.7 kb) bezeichnet. Unter Verwendung der Techniken aus Beispiel 1 wurde dieses GUS-Gen mit den XhoI-Linkern in p803 kloniert, was pBG25 und pBG26 ergab (abhängig von der Richtung des GUS-Gens; jedes 8.1 kb). Ein SalI/NcoI Schnitt von pBG25 und pBG26 setzte ein 3.8 kb Fragment frei, welches das GUS-Gen enthält. Diese Fragmente ersetzten ein 2.0 kb Fragment in pS3–28, das entfernt wurde. Die erhaltenen Plasmide pBG27 und pBG28 (abhängig von der Richtung des GUS-Gens; jedes 12.9 kb) waren die finalen DNA-Konstruktionen, die zur Herstellung infektiöser RNA verwendet wurden, welche in Tabakpflanzen eingeführt wurde, um eine mRNA für das GUS-Gen einzubringen. Diese mRNA kann mit Hilfe von Northern Blot-Verfahren detektiert werden. Die Aktivität des GUS-Enzyms ist ebenfalls detektierbar.
Beispiel 3
Herstellung einer chimären TMV DNA, die das GUS/Hüllprotein-Gen anstelle des TMV Hüllprotein-Gens umfasst.
Das 1.8 kb GUS-Gen aus pBG150 (4.7 kb), beschrieben im obigen Beispiel 2, wurde für diese Konstruktion verwendet. Ein PstI/NcoI Schnitt von p35-5 setzte ein 0.7 kb Fragment frei, das einen Teil des 3'-Endes und einen Teil 5'-Endes des TMV Hüllprotein-Gens enthält. Das Plasmid p35-5 (11.3 kb) ist ein Klon von TMV, aus dem ein Großteil des Hüllprotein-Gens entfernt wurde, und das eine XhoI Schnittstelle an der Stelle enthält, an welcher der interne Teil des Hüllprotein-Gens entfernt wurde. Dawson, W.O. et al., Phytopathology 78, 783 (1988). Dieses 0.7 kb Fragment ersetzte ein 0.5 kb Fragment in p803, das entfernt wurde, was pBG29 (6.5 kb) ergab. Das 1.8 kb GUS-Gen wurde in die XhoI Schnittstelle von pBG29 inseriert, was pBG31 und pBG32 ergab (abhängig von der Richtung des GUS/Hüllprotein-Fusionsgens; jedes 8.3 kb). Ein SalI/NcoI Schnitt von pBG31 und pBG32 setzte ein 4.0 kb Fragment frei, welches das GUS/Hüllprotein-Fusionsgen enthält. Diese Fragmente ersetzen an 2.0 kb Fragment in pS3-28, das entfernt wurde. Die erhaltenen Plasmide pBG33 und pBG34 (abhängig von der Richtung des GUS/Hüllproteins-Fusionsgen; jedes 13.1 kb) waren die finalen DNA-Konstruktionen, die zur Herstellung infektiöser RNA verwendet wurden. pBG33, pBG34 und pS3-28 (als Kontrolle) werden in RNA transkribiert, die verwendet wird, um mittels Reiben der Pflanzen mit der RNA, einem Abrasionsmittel und einem RNAse-Inhibitor Tabakpflanzen zu infizieren. Auf den Pflanzen werden Flecken (spots) beobachtet, die eine erfolgreiche Infektion anzeigen. Das infizierte Pflanzengewebe wird mazeriert, und die Fluoreszenz wird untersucht. Das mit pS3-28 infizierte Gewebe zeigte keine Fluoreszenz, während das entweder mit pBG33 oder pBG34 infizierte Gewebe Fluoreszenz zeigte.
Beispiel 4
Herstellung einer nicht übertragbaren TMV Nukleotidsequenz.
Eine vollständige (full-length) DNA-Kopie des TMV Genoms wird hergestellt und in die PstI Schnittstelle von pBR322 inseriert, wie von Dawson, W. O. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83, 1832 (1986) beschrieben. Das virale Hüllprotein-Gen liegt an Position 5711 des TMV Genoms angrenzend an das 30 K Protein-Gen. Der Vektor, welcher die DNA-Kopie des TMV Genoms enthält, wird mit den entsprechenden Restriktionsenzymen und Exonukleasen verdaut, um die kodierende Sequenz für das Hüllprotein zu deletieren. Die kodierende Sequenz des Hüllproteins wird zum Beispiel mit einem Partialverdau mit ClaI und NsiI entfernt, gefolgt von einer Religation, um den 3'-Schwanz des Virus wieder anzuheften. Alternativ wird der Vektor am 3'-Ende der viralen Nukleinsäure geschnitten. Die virale DNA wird durch Verdau mit Bal31 oder Exonuklease III bis zum Start-Codon der kodierenden Sequenz des Hüllproteins entfernt. Eine synthetische DNA-Sequenz, welche die Sequenz des viralen 3'-Schwanzes enthält, wird im Anschluss an das verbliebene 5'-Ende ligiert. Die Deletion der kodierenden Sequenz für das virale Hüllprotein wird durch Isolation der TMV RNA und Verwendung derselben zur Infektion von Tabakpflanzen bestätigt. Es wurde gefunden, dass die isolierte TMV RNA unter natürlichen Bedingungen nicht infektiös ist, d.h. biologisch eingedämmt.
Beispiel 5
Herstellung einer nicht übertragbaren OMV Nukleotidsequenz.
Eine vollständige DNA-Kopie des OMV Genoms wird wie von Dawson, W.O. et al. (1986), supra beschrieben, hergestellt. Der Vektor, welcher die DNA-Kopie des OMV Genoms enthält, wird mit den entsprechenden Restriktionsenzymen oder geeigneten Exonukleasen verdaut, wie etwa in Beispiel 4 beschrieben, um die kodierende Sequenz des Hüllproteins zu deletieren. Die Deletion der kodierenden Sequenz für das virale Hüllprotein wird durch Isolation der OMV RNA und Verwendung derselben zur Infektion keimender Gerstenpflanzen bestätigt. Es wurde gefunden, dass die isolierte OMV RNA unter natürlichen Bedingungen biologisch eingedämmt ist.
Beispiel 6 (gehört nicht zur Erfindung)
Herstellung einer nicht übertragbaren RNV Nukleotidsequenz.
Eine vollständige DNA-Kopie des RNV Genoms wird wie von Dawson, W.O. et al. (1986), supra beschrieben, hergestellt. Der Vektor, welcher die DNA des RNV Genoms enthält, wird mit den entsprechenden Restriktionsenzymen oder geeigneten Exonukleasen verdaut, wie etwa in Beispiel 4 beschrieben, um die kodierende Sequenz für das Hüllprotein zu deletieren. Die Deletion der kodierenden Sequenz für das virale Hüllprotein wird durch Isolieren der RNV RNA und Verwendung derselben zur Infektion keimender Gerstenpflanzen bestätigt. Es wurde gefunden, dass die isolierte RNV RNA unter natürlichen Bedingungen nicht infektiös ist.
Beispiel 7 (gehört nicht zur Erfindung)
Herstellung einer nicht übertragbaren PVY oder PVX Nukleotidsequenz.
Eine vollständige DNA-Kopie des PVY oder PVX Genoms wird wie von Dawson, W.O. et al. (1986), supra beschrieben, hergestellt. Der Vektor, welcher die DNA Kopie des PVY oder PVX Genoms enthält, wird mit den entsprechenden Restriktionsenzymen oder geeigneten Exonukleasen verdaut, wie etwa in Beispiel 4 beschrieben, um die kodierende Sequenz des Hüllproteins zu deletieren. Die Deletion der kodierenden Sequenz für das virale Hüllprotein wird durch Isolation der PVY oder PVX RNA unter Verwendung der selben zur Infektion von Kartoffelpflanzen bestätigt. Es wurde gefunden, dass die isolierte PVY oder PVX RNA unter natürlichen Bedingungen biologisch eingedämmt ist.
Beispiel 8
Herstellung einer chimären Nukleotidsequenz, welche die kodierende Sequenz für Tyrosinase enthält.
Die kodierende Sequenz für Tyrosinase wird aus Streptococccus antibioticus durch Verdau mit BclI, gefolgt von 5'-Exonuklease-Verdau bis zum Start-Codon isoliert. Alternativ wird durch ortsgerichtete (site-directed) Oligonukleotid-Mutagenese eine Restriktionsschnittstelle angrenzend an das Start-Codon der kodierenden Sequenz für Tyrosinase konstruiert. Verdau mit entsprechenden Restriktionsenzymen ergibt die kodierende Sequenz für Tyrosinase. Das Fragment, das die kodierende Sequenz für die Tyrosinase enthält, wird isoliert und angrenzend an den Promotor des viralen Hüllprotein-Gens in die Vektoren kloniert, welche in den Beispielen 4, 5 und 6 hergestellt wurden.
Beispiel 9 (gehört nicht zur Erfindung)
Herstellung eines Virus, das Tyrosinase enthält.
Ein Lambda P_R-Promotor wird an die chimäre Nukleotidsequenz aus Beispiel 8 entsprechend der von Dawson, W.O. et al. (1986), supra beschriebenen Technik angehängt. Der erhaltene Vektor wird zur Transformation von E. coli verwendet, der Produktionszelle in diesem Fall.
Ein zweiter Vektor wird durch Insertion der kodierenden Sequenz für das virale Hüllprotein, isoliert in den Beispielen 4, 5 oder 6, angrenzend an den lac-Promotor in den Vektor pBR322 hergestellt. Dieser Vektor wird zur Transformation der Produktionszellen verwendet, die einen Vektor mit der korrespondierenden kompatiblen chimären Nukleotidsequenz aufweisen. Die Produktionszellen werden angezogen, und die erhaltenen Viren werden isoliert. Alternativ wird der zweite Vektor zur Transformation eines zweiten Stammes von E. coli verwendet, der das Hüllprotein erzeugt. Das Hüllprotein und der virale Vektor werden im Anschluss kombiniert, um das Virus zu bilden.
Beispiel 10 (gehört nicht zur Erfindung)
Produktion von Melanin.
Die in Beispiel 9 isolierten Viren werden zur Infektion von Tabakpflanzen (Viren basierend auf TMV) oder keimenden Gerstenpflanzen (Viren basierend auf OMV oder RNV) verwendet. Die infizierten Pflanzen werden unter normalen Wachstumsbedingungen angezogen. Die Pflanzen produzieren Tyrosinase, die mit den im Pflanzengewebe vorhandenen Komponenten reagieren, um Intermediate zu erzeugen, die innerhalb des Pflanzengewebes oder nach Lyse des Pflanzengewebes zu Melanin umgesetzt werden. Das Melanin wird mit Hilfe konventioneller Verfahren isoliert.
Beispiel 11
Herstellung einer chimären Nukleotidsequenz, welche die kodierende Sequenz für eine β-Cyclodextrin-Glucanotransferase enthält.
Die kodierende Sequenz ist für die β-Cyclodextrin-Glucanotransferase wird aus dem alkalophilen Bacillus sp. Stamm Nr. 38–2 auf die folgende Art isoliert.
Die chromosomale DNA aus Stamm Nr. 38–2 (Hanamoto, T. et al., Agric. Biol. Chem. 51, 2019 (1987)) wird partiell mit Sau3AI verdaut, und die Fragmente werden in pBR322 ligiert, das mit BamHI verdaut wurde. Ein Transformant, der das Plasmid pCS115 trägt, welches ein 3.2 kb DNA Fragment aus dem Genom des produzierenden Stammes enthält, weist CGT-Aktivität auf. Die CGT, die von diesem Transformanten erzeugt wird, ergibt eine Präzipitationslinie, die in einem Ouchterlony Doppel-Diffusionstest vollständig mit der für die CGT aus Nr. 38–2 fusioniert. Die Nukleotidsequenz des Fragments wurde mit Hilfe der Dideoxy-Kettenabbruchreaktion (Banger, F. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)) unter Verwendung von pUC19 und der Exonuklease-Deletionsmethode (Henikoff, S., Gene 28, 351 (1984)) aufgeklärt. Die Nukleotidsequenz des Fragments zeigt einen einzelnen offenen Leserahmen, der dem CGT-Gen entspricht. Ein Protein mit einer molekularen Masse von 66 kDal könnte von diesem offenen Leserahmen mit 1758 Basenpaaren translatiert werden. Für die detaillierte Nukleotidsequenz siehe Hamamoto, T. et al., supra.
Die Sequenz der N-terminalen Aminosäuren der extrazellulären Form von CGT wurde mit Hilfe eines Peptid-Sequenziergeräts aufgeklärt. NH₂-Ala-Pro-Asp-Thr-Ser-Val-Ser-Asn-Lys-Gln-Asn-Phe-Ser-Thr-Asp-Val-Ile ist identisch zu der Sequenz, die aus der DNA-Sequenz (Reste 1 bis 17) abgeleitet wurde. Dieses Ergebnis zeigt, dass 27 Aminosäurereste (Rest –27 bis –1) ein Signalpeptid darstellen, das während der Sekretion von CGT entfernt wird. Das ausgehend von der DNA-Sequenz kalkulierte Molekulargewicht der reifen CGT beträgt 63,318.
Basierend auf einem Teil der Aminosäuresequenz der Cyclodextrin-Glucanotransferase wird eine Sonde hergestellt und zur Isolation der kodierenden Sequenz für dieses Enzym verwendet. Alternativ wird die kodierende Sequenz der β-Cyclodextrin-Glucanotransferase nach reverser Transkription isoliert. Das Fragment, dass die kodierende Sequenz enthält, wird isoliert und angrenzend an den Promotor des viralen Hüllprotein-Gens in die Vektoren kloniert, die in den Beispielen 5, 6 oder 7 hergestellt wurden.
Beispiel 12 (gehört nicht zur Erfindung)
Herstellung eines Virus, das die kodierende Sequenz für eine Cyclodextrin-Glucanotransferase enthält.
Ein Lambda PR-Promoter wird an die chimäre Nukleotidsequenz aus Beispiel 8 entsprechend der in Dawson, W.O. et al. (1986), supra beschriebenen Technik angeheftet. Der erhaltene Vektor wird zur Transformation von E. coli verwendet, der Produktionszelle in diesem Fall.
Ein zweiter Vektor wird durch Insertion der kodierenden Sequenz des viralen Hüllproteins, isoliert in den Beispielen 5, 6 oder 7, angrenzend an den lac-Promoter in den Vektor pBR322 hergestellt. Dieser Vektor wird zur Transformation der Produktionszellen verwendet, die einen Vektor mit der korrespondierenden kompatiblen chimären Nukleotidsequenz aufweisen. Die Produktionszellen werden angezogen und die erhaltenden Viren werden isoliert.
Beispiel 13 (die gehört nicht zur Erfindung)
Produktion von Cyclodextrin
Die in Beispiel 12 isolierten Vieren werden zur Infektion von Maispflanzen (Viren basierend auf OMV oder RNV) oder Kartoffelpflanzen (Viren basierend auf PVY oder PVX) verwendet. Die Infizierten Pflanzen werden unter normalen Wachstumsbedingungen angezogen. Die Pflanzen produzieren Cyclodextrin-Glucanotransferase, welche die Umsetzung von Stärke in Cyclodextrin im Pflanzengewebe katalysiert. Das Cyclodextrin wird mit Hilfe herkömmlicher Verfahren isoliert.
Beispiel 14
Herstellung einer chimären Nukleotidsequenz aus TMV und Chloramphenicol-Acetyltransferase.
Eine nicht übertragbare TMV Nukleotidsequenz (pTMVS3-28) wird hergestellt, wie in Beispiel 4 beschrieben. Im Anschluss wird eine chimäre Nukleotidsequenz (S3-CAT-28) hergestellt, welche das Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gen anstelle des zuvor entfernten Hüllprotein-Gens enthält.
Das CAT-Gen wird aus pCM1 (Pharmacia) mit SalI entfernt und in die Nukleotidsequenz aus Beispiel 4 ligiert, welche mit XhoI gespalten wurde. Diese Konstruktion erzeugt pTMVS3-CAT-28, von dem die Mutante cp S3-CAT-28 transkribiert wird. Die korrekte Sequenz und Orientierung wird mit Hilfe einer Sequenzierung, wie von Sagursky, R.J. et al., Gene Anal. Technol. 2, 89 (1985) beschrieben, bestätigt.
Diese chimäre DNA-Sequenz wird im Anschluss unter Verwendung des PM-Promoters (Ahlquist, P. et al., Mol. Cell Biol. 4, 2876 (1984)) und der RNA-Polymerase aus E. coli (Dawson, W.O. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83, 1832 (1986)) transkribiert, um infektiöse chimäre RNA zu erzeugen. Die Infektiosität wird durch Zermahlen der Blätter in kaltem 1% Natriumpyrophosphat-Puffer, pH 9.0 mit 1% Bentonit und 1% Celite bei unmittelbarer Inokulation untersucht. Alternativ kann die Infektiosität unter Verwendung Phenol-extrahierter RNA im selben Puffer untersucht werden (Dawson, W. O., Virology 73, 319 (1976)).
Es wurde gefunden, dass die chimäre RNA in Tabakblättern effizient repliziert. Die RNA kann seriell von Pflanze zu Pflanze propagiert werden oder kann nach Phenol-Extraktion gelagert werden. Es können jedoch in den infizierten Pflanzen kein Virione erzeugt werden.
Die chimäre RNA erzeugt während einer SDS-PAGE keine Bande, die positiv als Chloramphenicol-Acetyltransferase identifiziert werden kann. In Pflanzenextrakten kann jedoch funktionelle Enzymaktivität detektiert werden, die ¹⁴C-Chloramphenicol mit Acetyl-CoA acetyliert.
Beispiel 15 (gehört nicht zur Erfindung)
Herstellung eines Virus, das Chloramphenicol-Acetyltransferase enthält.
Ein Lambda PR-Promoter wird an die chimäre Nukleotidsequenz aus Beispiel 14 entsprechend der von Dawson, W.O. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83, 1832 (1986) beschriebenen Technik angehängt. Der erhaltene Vektor wird zur Transformation der Produktionszelle, E. coli, verwendet.
Ein zweiter Vektor wird durch Insertion der kodierenden Sequenz des viralen Hüllproteins (isoliert in Beispiel 4) angrenzend an den Iac-Promoter in dem Vektor pBR322 hergestellt. Dieser Vektor wird zu Transformation der E. coli Produktionszellen verwendet, die einen ersten Vektor der chimären Nukleotidsequenz aufweisen. Die Produktionszellen werden angezogen, und die erhaltenen Viren werden isoliert. Alternativ wird der zweite Vektor zur Transformation eines zweiten Stammes von E. coli verwendet, der das Hüllprotein erzeugt. Das Hüllprotein und die viralen Vektoren werden im Anschluss kombiniert, um das Virus zu bilden.
Beispiel 16 (gehört nicht zur Erfindung)
Produktion von Chloramphenicol-Acetyltransferase.
Die in Beispiel 15 isolierten Viren werden zur Infektion von Tabakpflanzen verwendet. Die infizierten Pflanzen werden unter normalen Wachstumsbedingungen angezogen. Die Pflanzen produzieren das Enzym Chloramphenicol-Acetyltransferase, das aus den Pflanzen mit Hilfe konventioneller Verfahren isoliert wird.
Beispiel 17
Transformation von Nicotiana tabacum mit Kapsidprotein-Gen.
Das Kapsidprotein des Tobacco Mosaic Virus (TMV) wird von einer Nukleotidsequenz zwischen 5712 und 6190 kodiert. Eine 3'-untranslatierte Region des RNA-Genoms erstreckt sich bis zu Nukleotid 6395. Eine doppelsträngige (ds) komplementäre DNA (cDNA) des Cistrons, das die Nukleotide 5701 bis 6395 enthält und für das Kapsidprotein kodiert, wird mit Hilfe der Reversen Transkriptase von der TMV RNA generiert. Die Transkriptase enthält einen Oligonukleotidprimer, der komplementär zu einer Oligonukleotidsequenz am 3'-Ende der viralen RNA ist und eine BamHI Schnittstelle enthält.
Das Klenowfragment der DNA-Polymerase wird verwendet, um den zweiten DNA-Strang zu synthetisieren. Das HindIII-BamHI Fragment der cDNA wird in das Plasmid pUC9 (Vieira, J. et al., Gene 19, 259 (1982)) kloniert. Das erhaltene Plasmid wird mit AlaIII an Nukleotid 5707 (Goelet, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5818 (1982)) und mit BamHI verdaut, um die Sequenz für das Kapsidprotein zu entfernen. Dieses Fragment wird in den Vektor pMON237 ligiert.
pMON237 ist ein Derivat von pMON200 (Horsch, R.B. et al., Science 227, 1229 (1985)). Dieser Vektor enthält einen 19S CaMV Promotor, eine Polylinker-Sequenz und die Sequenz für Nopalinsynthase (NOS) am 3'-Ende. Die Ligation erfolgt an der XbaI Schnittstelle, die zu einem glatten Ende aufgefüllt wurde (made blunt), und an der BamHI Schnittstelle. Die kodierende Sequenz für das Kapsidprotein wurde durch Verdau mit XbaI und BamHI aus dem Plasmid entfernt und durch Transfer in ein geeignetes Plasmid mit einer BglII Schnittstelle am 5'-Ende und einer EcoRI Schnittstelle am 3'-Ende versehen.
Das BglII-EcoRI Fragment wird in den Expressionskassettenvektor pMON316 zwischen den CaMV 35S Promoter und die NOS 3'-untranslatierte Region transferiert (Rogers, S.G. et al., in: BioTechnology in Plant Science: Relevance to Agriculture in the Nineteen Eighties, M. Zaitlin, P. Day, A. Hollaender, Eds., Academic Press, N.Y., p. 219 (1986)). Das erhaltene chimäre Gen enthält den 35S Promoter von CaMV und ein Polyadenylierungssignal des NOS-Gens. Das erhaltene Plasmid wird in den Agrobacterium tumefaciens Stamm GV 3111 eingebracht, welcher das abgeschwächte (disarmed) Plasmid pTi BG53-SE trägt (Fraley, R.T. et al., Bio/Technology 3, 629 (1985)). Ein kointegriertes Plasmid entsteht durch Rekombination zwischen den LIH-Regionen.
Transformierte A. tumefaciens werden auf Antibiotikaresistenz selektiert. Selektierte Kolonien werden zur Transformation von N. tabacum Blattscheiben ("leaf discs") verwendet, welche im Anschluss zu ganzen Pflanzen regeneriert werden (Horsch, R.B. et al., supra; Abel, P.P. et al., Science 232, 738 (1986)).
A. tumefaciens transformiert mit der Sequenz für das TMV Kapsidprotein wird als Produktionszelle verwendet. Gleichermaßen werden Tabakzellen, die mit der Sequenz für das TMV Kapsidprotein transformiert wurden, als Produktionszellen für die Herstellung von Monomeren oder Multimeren des Kapsidproteins verwendet. Die Zahl der Kapsidproteine und der Zeitpunkt der Produktion können durch Verfahren kontrolliert werden, die im Stand der Technik bekannt sind (Maniatis, T. et al., supra). Die richtige Auswahl eines temperatur-sensitiven Repressors und ein starker Promoter haben hohe Kopienzahlen der Plasmide und hohe Translationsraten, nur wenn gewünscht, zur Folge.
Beispiel 18
Produktion von verpackten Viruspartikeln.
Protoplasten von transformierten Tabakzellen, die in Beispiel 17 erhalten wurden, werden in einer 0.5 M Mannitol-Lösung resuspendiert, die 12–30 nM MgCl₂ enthält. Ein Hitzeschock von 45°C für 5 Minuten wird ausgeübt. Für die Transformation werden die Protoplasten in Aliquots in Zentrifugenröhrchen verteilt, und zwar 0.3 ml der suspendierten Protoplasten pro Röhrchen. Während der nächsten 10 Minuten wird Folgendes hinzugegeben: Die in Beispiel 1 erhaltenen Plasmide, welche die cDNA enthalten, die für das TMV Genom kodiert, der aber das Gen für das Kapsidprotein fehlt, und die ein chimäres Genkonstrukt enthält; und Polyethylenglycol (PEG)-Lösung (MW 6000, 40% (w/v), die 0.1 M Ca(NO₃)₂ und 0.4 M Mannitol enthält; pH 8–9 mit KOH), um eine finale Konzentration von 20% PEG zu ergeben. Die Aliquots werden 30 Minuten unter gelegentlichem sanftem Schütteln inkubiert, und im Anschluss werden die Protoplasten in Petri-Schalen gegeben (0.3 ml originale Protoplastensupension pro Schale mit 6 cm Durchmesser) und kultiviert. Verpackte Viruspartikel werden aus den Protoplasten unter Verwendung herkömmlicher Techniken isoliert.
Alternativ werden die in Beispiel 17 erzeugten transformierten Pflanzen mit Virusnukleinsäure infiziert, zum Beispiel einer chimären Nukleotidsequenz aus Beispiel 3. Die Nukleinsäure wird repliziert, und das Hüllprotein, welches die Nukleinsäure verpackt, wird produziert. Die verpackten Viruspartikel werden mit Hilfe konventioneller Verfahren isoliert.
Beispiel 19
Transformation von Nicotiana tabacum mit Replicase-Gen.
Zwei Replicase-Untereinheiten des Tobacco Mosaic Virus (TMV) werden von der Nucleotidsequenz zwischen Position 70 und 4919 kodiert. Die Nukleotidsequenz für das 130 kD Protein endet an einem Amber-Codon, das supprimiert werden kann, um ein 180 kD Protein zu erzeugen. Eine doppelsträngige (ds) komplementäre DNA (cDNA) des Cistrons, welches die Nukleotide 70 bis 4919 enthält und für Replicase kodiert, wird unter Verwendung von Reverser Transkriptase aus der TMV-RNA generiert.
Die Transkriptase enthält einen Oligonukleotidprimer, der komplementär zu einer Oligonukleotidsequenz am 3'-Ende der viralen RNA ist und eine BamHI-Schnittstelle enthält. Das Klenowfragment der DNA-Polymerase wird verwendet, um den zweiten DNA-Strang zu synthetisieren. Das HindIII-BamHI Fragment der cDNA wird in das Plasmid pUC9 kloniert (Viera, J. et al., Gene 19, 259 (1982)). Das erhaltene Plasmid wird mit AlaIII an Nukleotid 4919 (Goelet, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5818 (1982)) und mit BamHI verdaut, um die Sequenz für das Kapsidprotein zu entfernen.
Dieses Fragment wird in den Vektor pMON237 ligiert. pMON237 ist ein Derivat von pMON200 (Horsch, R.B. et al., Science 227, 1229 (1985)). Dieser Vektor enthält einen 19S CaMV-Promoter, eine Polylinker-Sequenz und die Sequenz für Nopalinsynthase (NOS) am 3'-Ende. Die Ligation erfolgt an der XbaI Schnittstelle, die zu einem glatten Ende aufgefüllt wurde, und an der BamHI Schnittstelle. Die kodierende Sequenz für das Kapsidprotein wurde durch Verdau mit XbaI und BamHI aus dem Plasmid entfernt und durch Transfer in ein geeignetes Plasmid mit einer BglII Schnittstelle am 5'-Ende und einer EcoRI Schnittstelle am 3'-Ende versehen. Das BglII-EcoRI Fragment wird in den Expessionskassettenvektor pMON316 zwischen den CaMV 35S-Promoter und die NOS 3'-untranslatierte Region transferiert (Rogers, S.G. et al., in: BioTechnology in Plant Science: Relevance to Agriculture in the Nineteen Eighties, M. Zaitlin, P. Day, A. Hollaender, Eds., Academic Press, N.Y., p. 219, 1986). Das erhaltene chimäre Gen enthält den 35S-Promotor von CaMV und ein Polyadenelierungssignal des NOS-Gens. Das erhaltene Plasmid wird in den Agrobacterium tumefaciens Stamm GV 3111 eingebracht, der das abgeschwächte (disarmed) Plasmid pTI BGS3-SE trägt (Fraley, R.T. et al., BioTechnology 3, 629 (1985)). Ein cointegriertes Plasmid wird durch Rekombination zwischen den LIH-Regionen erhalten.
Transformierte A. tumefaciens werden auf Antibiotikaresistenz selektiert. Selektierte Kolonien werden zur Transformation von N. tabacum Blattscheiben ("leaf discs") verwendet, welche im Anschluss zu ganzen Pflanzen regeneriert werden (Horsch, R.B. et al., supra; Abel, P.P. et al., Science 232, 738 (1986)). Die transformierten Wirte können als Produktionszellen oder als Wirte für die Infektion mit auf TMV basierenden Viren verwendet werden. Die stabil inkorporierte Replicase agiert, um die Replikation der viralen Nukleinsäure zu steigern.
Beispiel 20
Transformation von Tabakzellen mit Transportprotein.
Eine Nukleotidsequenz von TMV von Nukleotid 4903 bis 5709 kodiert ein 30 kD Protein, das an der Erleichterung der Zell-zu-Zell-Bewegung des Virus beteiligt ist. Zellen aus Blattscheiben ("leaf discs") aus N. tabacum werden mit Agrobacterium transformiert, das ein kointegriertes Plasmid trägt, das nach dem Verfahren aus Beispiel 17 hergestellt wurde. So transformierte N. tabacum Zellen werden als Wirtszellen für verpackte defekte Viruspartikel verwendet.

Claims

Produktionszelle, die ein übertragbares und infektiöses Virus produziert, die umfasst: (1) einen ersten Vektor, der eine chimäre Nukleotidsequenz aufweist, welche umfasst: (a) eine erste Nukleotidsequenz, die eine substantielle Sequenzhomologie mit der Nukleotidsequenz eines Pflanzenvirus aufweist, welche von einem Tobamovirus abstammt, die zur Replikation imstande ist und biologisch eingedämmt ist, wobei der viralen Nukleotidsequenz eine kodierende Sequenz für ein biologisch funktionelles virales Hüllprotein fehlt; und (b) eine zweite Nukleotidsequenz, die an einen viralen Promotor angrenzt, und die eine kodierende Sequenz von Interesse darstellt, welche zur Transkription in der Produktionszelle imstande ist; und (2) eine dritte Nukleotidsequenz, die für ein biologisch funktionelles virales Hüllprotein kodiert, wobei das virale Hüllprotein mit der ersten Nukleotidsequenz kompatibel ist, und wobei die dritte Nukleotidsequenz stabil in das Genom der Produktionszelle integriert ist.
Produktionszelle nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz von Interesse für die Expression von einem oder mehr phänotypischen Merkmalen kodiert.
Produktionszelle nach Anspruch 2, wobei die phänotypischen Merkmale verbesserte Toleranz gegenüber Herbiziden, verbesserte Toleranz gegenüber extremer Hitze oder Kälte, Trockenheit, Salzhaltigkeit oder osmotischem Stress, verbesserte Resistenz gegenüber Pflanzenschädlingen oder Krankheiten, Produktion von Enzymen oder sekundären Metaboliten, männliche oder weibliche Sterilität, Zwergwuchs, Frühreife, verbesserter Ertrag, Vitalität, Heterosis, Nährstoffqualität, Geschmack oder Verarbeitungseigenschaften, Produktion wichtiger Proteine oder von Produkten zur kommerziellen Verwendung und Produktion abbauender oder inhibitorischer Enzyme einschließen.
Produktionszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der viralen Nukleotidsequenz zusätzlich eine kodierende Sequenz für einen funktionellen viralen Transmissionsfaktor fehlt.
Produktionszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der virale Promotor ein Promotor für ein virales Hüllprotein ist.
Verfahren zur Herstellung eines Produkts in einer Pflanzenzelle, das umfasst: (a) Infizieren einer Pflanzenzelle mit dem ersten Vektor wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert, wobei die Pflanzenzelle zuvor dergestalt transformiert wurde, dass die kodierende Sequenz für das biologisch funktionelle virale Hüllprotein stabil in das Genom der Pflanzenzelle integriert ist; (b) Anzucht der infizierten Pflanzenzelle, um das Produkt der zweiten Nukleotidsequenz zu produzieren, welche im ersten Vektor enthalten ist; und (c) Isolieren des Produkts der zweiten Nukleotidsequenz, wobei die Pflanzenzelle Teil einer ganzen Pflanze ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Produkt eine antisense RNA, ein Ribozym, ein Protein, ein Enzym oder ein komplexes Biomolekül ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Biomolekül Melanin oder Cyclodextrin ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Enzym Tyrosinase, Cyclodextrin-Gluconotransferase oder humaner Gewebe-Plasminogenaktivator ist.
Pflanzenzelle, die mit dem ersten Vektor wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert infiziert wurde, wobei die Pflanzenzelle zuvor dergestalt transformiert wurde, dass die kodierende Sequenz für das biologisch funktionelle virale Hüllprotein stabil in das Genom der Pflanzenzelle integriert ist, und wobei die Pflanzenzelle Teil einer ganzen Pflanze ist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 10, wobei die Nukleotidsequenz von Interesse für die Expression von einem oder mehr phänotypischen Merkmalen kodiert.
Pflanzenzelle nach Anspruch 11, wobei die phänotypischen Merkmale verbesserte Toleranz gegenüber Herbiziden, verbesserte Toleranz gegenüber extremer Hitze oder Kälte, Trockenheit, Salzhaltigkeit oder osmotischem Stress, verbesserte Resistenz gegenüber Pflanzenschädlingen oder Krankheiten, Produktion von Enzymen oder sekundären Metaboliten, männliche oder weibliche Sterilität, Zwergwuchs, Frühreife, verbesserter Ertrag, Vitalität, Heterosis, Nährstoffqualität, Geschmack oder Verarbeitungseigenschaften, Produktion wichtiger Proteine oder von Produkten zur kommerziellen Verwendung und Produktion abbauender oder inhibitorischer Enzyme einschließen.
Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei der viralen Nukleotidsequenz zusätzlich eine kodierende Sequenz für einen funktionellen viralen Transmissionsfaktor fehlt.
Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei der vitale Promotor ein Promotor für ein vitales Hüllprotein ist.