DD284048A5

DD284048A5 - Verfahren zur herstellung einer pflanzenzelle bzw. eines pflanzenteils oder einer pflanze mit einer derartigen pflanzenzelle

Info

Publication number: DD284048A5
Application number: DD88330727A
Authority: DD
Inventors: David M Stalker
Original assignee: ��`��@��k��
Priority date: 1987-07-08
Filing date: 1988-07-08
Publication date: 1990-10-31
Also published as: IL87001A0; ES2010763A6; US4810648A; WO1989000193A1; ZA884894B; IL87001A; DD285922A5; DK2890A; GR880100421A; DK2890D0; CN1031252A; CA1339683C; KR890701735A; BR8807609A; PL273589A1; EP0373173A1; AU2071988A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanzenzelle bzw. eines Pflanzenteils oder einer Pflanze mit einer derartigen Pflanzenzelle, die 3,5-dihalogenierte p-Hydroxybenzonitrile hydrolysieren. Dadurch wird es moeglich, die herbizide Wirkung der Nitrile zu verhindern. Die erfindungsgemaesz hergestellte Pflanzenzelle ist gekennzeichnet durch eine funktionelle Expressionskassette mit in Transkriptionsrichtung einer Transkriptions- und Translations-Start-Regulatorregion und einem Gen, das eine Nitrilase aus Bakterien mit etwa 34 kDal codiert, die im wesentlichen fuer 3,5-dihalogeniertes p-hydroxybenzonitril spezifisch ist und eine spezifische Aktivitaet von mindestens etwa 0,1 mmol NH3/min/mg Protein mit Bromoxynil als Substrat aufweist und durch mindestens eine Substitution, Abspaltung oder Extension von insgesamt nicht mehr als 50 Aminosaeuren modifiziert worden ist.{Verfahren; Herstellung; Pflanzenzelle; 3,5-dihalogenierte p-Hydroxybenzonitrile; hydrolysieren; funktionell Expressionskassette; Gen; Nitrilase; Bakterien; Bromoxynitril}

Description

18 104 55 -Ί-

Verfahren zur Herstellung einer Pflanzenzelle bzw. eines Pflcinzenteils oder einer Pflanze mit einer derartigen Pflanzenzelle

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanzenzelle bzv/. eines Pflanzenteiles oder einer Pflanze mit einer derartigen Pflanzenzelle.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Bromoxynil- und/oder Ioxynil-spezifischen Witrala3e können zur Entgiftung von mit Bromoxynil und verwandten Herbiziden verunreinigten Stellen und zum Schutz von Wirtzellen vor der zytotoxischen Wirkung dieser Herbizide verwendet werden. Die Konstruktionen können zur Unterscheidung von diesen Strukturen enthaltenden Wirtzellen und Wirtzellen, die diese Konstruktionen nicht enthalten, verwendet werden.

Die Möglichkeit, Mikroorganismen und Zellen höherer Organismen neue genetische Fähigkeiten zu verleihen, hat eine Vielzahl von neuen Anwendungsgebieten eröffnet. Eines dieser Gebiete betrifft verschiedene Mittel, die wegen ihrer zytotoxischen Wirkung verwendet werden, wie beispielsweise viel'·: Verbindungen, die in der Landwirtschaft zur Schädlingsbekämpfung und/oder Unkrautvernichtung eingesetzt werden. In vielen Fällen haben diese Verbindungen eine relativ lange Verweilzeit oder hinterlassen einen beträchtlichen Rückstand.

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In vielen Fällen 1st es erwünscht, zv/ischen zu erhaltenden Arten und aolchen, die vertilgt werden müssen, zu unterscheiden. So ist es oft erwünscht, Unkraut selektiv zu vernichten, wobei die Ernte möglichst wenig beeinträchtigt worden sollte. In den meisten Fällen haben viele der Breitband-Herbizide einen sehr nachteiligen Einfluß auf die Ernte, so daß ihre Verwendung auf eine Vorernergenz- oder vorsichtige Postemergenz-Anwendung begrenzt ist.

Es bestand daher großes Interesse, lebende Zellen so verändern zu können, daß sie gegenüber Beanspruchungen, wie durch zytotoxische Mittel, widerstandsfähig sind.

In der US-PS 4 535 060 wird die Verwendung eines bakteriellen aroA-Gens beschrieben, das glyphoeatempfindlichen Zellen GIyphosat-Resistenz verleiht. Hsu und Camper, "Can. -J. LÜcrobiol.", 22, S. 537-543 (1976) beschreiben die Isolierung von Ioxynil-"Abbauern" aus mit Erde angereicherten Kulturen. Hsu und Clemson, "Dissert. Ab3tr. Intrn.", B36, I;r. 8, S. 3708 (1976) beschreiben den mikrobiellen Abbau einer Familie von 3,5-Dihalogen~4-hydroxybenzonitril-Herbiziden. Ingram und Pullin, "Pestic. Sei.", 5, S. 287-291 (1974) beschreiben den längeren Verbleib von Bromoxynil in drei Bodenarten. Smith, "Abstr. Meeting Wood Soc. Am." (1971), S. 16-17 beschreibt den Abbau von Bromoxynil in schwerem Torr (Regina heavy clay). Smith und Flether, "Hort. Res.", 4, S. 60-62 (1964) berichten von 3,5-Dihalogen-4-hydroxybenzonitrilen und Bodenorganismen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung neuer Pflanzenzellen bzv/. von diese Zellen enthaltenden Pflanzenteilen oder Pflanzen bereitzustellen, die 3,5-dihalogenierte p_Hydroxybenzonitrile und insbesondere 3j5-Dibrom~ oder 3,5-Dijod-4-hydroxybenzonitril hydrolisieren. Dadurch, wird es im Endeffekt möglich, die herbizide Wirkung des Nitrils zu verhindern. Die erfindungsgemäß hergestellten Pflanzenteile

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oder -wellen sollen also gegenüber dem Herbicid geschützt sein.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß ist das Verfahren gekennzeichnet durch Einführen eines Gen3 in die Pflanzenzelle, den Pflanze.iteil oder die Pflanze, wobei das Gen eine l-fitrilase aus Bakterien mit etwa 34 kDal codiert, die im wesentlichen für 3,5-dihalogeniertes p-Hydroxybenzonitril spezifisch ist und eine spezifische Aktivität von mindestens etwa 0,1 ,umol IfflL/min/rng Protein mit Bromoxynil als Substrat aufweist und durch mindestens eine Substitution, Abspaltung oder Extension von insgesamt nicht mehr als 50 Aminosäuren modifiziert worden ist,

wobei das Gen ferner Teil einer funktioneilen Expression3-kassette mit in Transkriptionsrichtung einer Transkriptions- und Translations-Start-Kegulatorregion ist»

Zweckmäßig wird eine Expressionskassette verv/endet, die außerdem den rechten Rand der T-DWA enthält.

Weiterhin ist es vorteilhaft, eine Expressionskassette, in der die Transkriptions- und Translations-otart-Regulatorregion die Regulatorregion für die Transkription eines Opins ist, zu verwenden.

Bei den Bakterien sind Enterobakterien von Interesse und insbesondere die Art Klebsieila. Kle.bsiel a pneumonias und insbesondere die Art ocaenae kann eingesetzt v/erden. Besser als 3xe aus dem Boden zu isolieren, werden die Organismen im Boden oder anderen Medien mit höher werdenden Konzentrationen an 3> 5-dilialogeniertem p-Hydroxybenzonitril und vermindsrten Mengen an anderen Stickstoff-

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quellen gesüchtot, bia überlebende Organiomen erhalten wer- den, die Benzonitril als einzige Stickstoffquelle verwenden.

Unabhängig von den die Hitrilase enthaltenden Bakterien muß selektioniert werden, um au gewährleisten, daß die Nitrilase bei der Entgiftung dea 3,5-dihalogeniertem p-Hydroxy~ benzonitrila wirksam ist. Zusätzlich sollte die IJitrilase für dieses Hydroxybenzonitril eher als für analoge Verbindungen, denen die Ilalügen- oder andere Substituenten fehlen, apezifiech sein. Die erfindungsgemäße Nitrilase ist daher für die erwähnten Hydroxybenzonitrile, wie angegeben, spezifisch, und relativ inaktiv oder wesentlich weniger aktiv für analoge Verbindungen,

Zweckmäßigerweise sollte bei Kultivierung mit 3.« 5-dihalogeniertera p-Hydroxybenzonitril als Stickstoffquelle bei vergleichbaren Konsentrationen die Proliferationsgeschwindigkeit nicht deutlich niedriger sein, d.h. nicht mehr als 10 # vermindert, als die Proliferationsgeschwindigkeit des Bakteriums in Gegenwart einer

normalen Stickstoffquelle, wie beispielsweise Ammoniak. Dieses Ergebnis wird mit nichtspezifischen Benzonitrilen nicht beobachtet.

Sind der oder die Wirtstamm oder Wirtstämme einmal identifiziert, so können verschiedene Verfahren zur Identifizierung der Codiersequenz der Nitrilase eingesetzt werden. Das Gen kann auf einem Chromosom oder einem Plasmid vorhanden sein. Das Genom wird fragmentiert, insbesondere mit einer Restriktionsendonuklease, wobei eine oder mehrere Endonukleasen eingesetzt werden können, um Fragmente von etwa 5 bis 50 KB herzustellen. Diese Fragmente können auf entspre-

chenden Vektoren in einem geeigneten Bakterium, wie E. coli, kloniert werden, die entstandenen Transformanden werden auf Nitrilaseaktivität selektioniert, wobei der Wirtorganismus einen negativen Hintergrund abgibt.

Steht fest, daß ein oder mehrere Klone Nitrilaseaktivitiit aufweisen, so können die das gewünschte DNA-Fragment enthaltende extrachromosomalen Elemente, · Plasmide oder Viren in herkömmlicher Weise isoliert werden, z.B. durch Lyse des Wirts, Ausfällen der DNA und Abtrennen der Vektor-DNA, Plasmid- oder Virus-DNA von der chromosomalen DNA. Die extrachromosomalen Elemente können durch Restriktionsendonukleasan gespalten werden, die gewünschten Fragmente können durch verschiedene Verfahren zur Trennung und Identifizierung der Fragmente verschiedener Größe, wie Elektrophorese oder Dichtegradienten-Zentrifugieren, isoliert werden.

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Das Fragment wird je nach Größe weiter manipuliert, um es an die Größe des Gens und seiner flankierenden Regulatorregionen anzupassen. Es gibt verschiedene Verfahren zur Manipulation des Fragments, das die für das Enzym codierende Sequenz und ihre flankierenden Regulatorsequenzen enthält, beispielsweise Teilspaltung mit verschiedenen Restriktionsenzymen in verschiedenen Reaktionsgemischen und anschließendes Klonen der Fragmente zur Bestimmung, in welchen Fragmenten die Fähigkeit zur Expression der Nitrilase zurückbleibt.

Das Enzym kann aber auch isoliert und teilsequenziert v/erden. Auf der Basis der Aminosäuresequenz können Sonden hergestellt werden, die zur Identifizierung der das Gen enthaltenden Fz'agmente verwendet werden können. Durch Kombinieren dieser Annäherung mit der Spaltung mit Restriktionsenzyinen können Fragmente geklont und auf die Anwesenheit des gewünschten Gens selektioniert werden. Außerdem können Exonukleasen, wie Bal31, verwendet wex-den, um die Nukleotide an einem oder beiden Enden des Fragments zu entfernen und die Anzahl der überflüssigen Nukleotide weiter zu verringern.

Alternativ kann das Gen in einem geeigneten Wirt geklont und die Boten-RNA (mRNA) durch Selektionieren mit einer Sonde, Identifizieren in einem entsprechenden in vitro- oder in vivo-Translationssystem, beispielsweise Xenopus oocytes oder Reticulolysat, isoliert werden. Die isolierte mRNA kann dann zur Herstellung von cDNA unter Einsatz herkömmlicher Verfahren, wie reverse Transkriptase und

Bildung der Komplementarkette mit DNA-Polymerase, verwendet werden. In diesem Fall fehlen dem entstandenen Strukturgen die an die Transkription gebundenen Regulatorregionen.

Das Nitrilasegen kann auf verschiedene Weise modifiziert werden, entweder durch Verkürzen oder Verlängern eines oder beide der 5¹- und/oder 3'-Enden. Im allgemeinen sind nicht mehr als 25, insbesondere nicht über etwa 20 Codons an der natürlich vorkommenden Nitrilase beteiligt. Die Nitrilase kann um bis zu 50 Aminosäuren, im allgemeinen nicht über etwa 30 Aminosäuren, verlängert werden. Kombinationen von Substitution, Abspaltung und Extension können eingesetzt werden. D.h., das Gen kann auf verschiedene Weisen manipulier¹: werden, um beispielsweise die Eigenschaften des Enzyms zu ändern oder es für Manipulationen der Plasmide geeigneter· zu machen.

Die DNA-Sequenz, die das die Nitrilase exprimierende Strukturgen enthält, kann an viele andere DNA-Sequenzen zur Einführung in eine entsprechende Wirt-zelle gebunden werden. Die Begleitsequenz hängt von der Art des Wirts, der Einführungsweise der DNA-Sequenz in den Wirt und davon ab, ob episomale Aufrechterhaltung oder Integration erwünscht ist.

Für prokaryontische Wirte gibt es viele Vektoren, die zur Einführung durch Transformation, Konjugation, Transduktion oder Transfektion der DNA-Sequenz in einen prokaryontischen Wirt verwendet werden können. DNA-Sequenzen umfassen eine Vielzahl von Plasmiden, wie pBR322, pACYC184, pMB9 oder pRK290, Cosmide, wie pVKIOO oder Viren, wie P22.

Für eukaryontische Zellen können verschiedene Verfahren zur Einführung der DNA in den Wirt eingesetzt werden, wie Transformation mit Ca⁺⁺-ausgefällter DNA, wobei eine nichtreplikative DNA-Sequenz, ein Plasmid oder ein Minichromosom beteiligt sind, Transformation mit einer T-DNA enthaltenden Sequenz in Agrobakterium, Mikroinjektion mit einer Mikropipette oder Elektroporation. Es hängt davon ab, ob ein kompetentes Replikationssystem in der DNA-Konstruktion vorhanden ist, ob die DNA als episomales Element repliziert oder in das Wirtgenom integriert und das Strukturgen im Wirt exprimiert wird. Es können episomale Elemente, wie tumorinduzierende Plasmide, beispielsweise Ti dder Ri, oder ihre Fragmente, oder Viren, wie CaMV oder TMV, oder ihre Fragmente verwendet werden, die für den Wirt nicht tödlich sind und in denen das Strukturgen in solchen episomalen Elementen vorhanden ist, daß es die Expression des Strukturgens ermöglicht. Von besonderem Interesse sind Fragmente mit Replikationsfunktion, denen andere Funktionen, wie Onkogenese oder Virulenz fehlen.

Die aus der Nitrilase erhaltenen Fragmente können unter Verwendung eines geeigneten Klonierungsvektor geklont werden. Das Klonen kann in einem geeigneten einzelligen Mikroorganismus, beispielsweise einem Bakterium, wie E. coli, durchgeführt werden. Zweckmäßigerweise wird ein Cosmid verwendet, wobei durch Teil- oder Vollspaltung Fragmente mit der gewünschten Größe entstehen. Beispielsweise kann das Cosmid pVK100 mit einem geeigneten Restriktionsenzym teilgespalten und an Fragmente gebunden werden, die entwe-

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der durch Teil- oder Vollspaltung eines Plasmids, Chromosoms oder deren Fragment entstanden sind. Durch Verpackung wird gewährleirhet, daß nur Fragmente der gewünschten Größe verpackt und in den Wirt-Organismus transduziert werden.

Der Wirt-Organismus wird anhand der Benzonitril-Resistenz ausgewählt. Die aufnehmenden Stämme können so verändert werden, daß sie geeignete genetische Merkmale aufweisen, die die Selektion von Transduktanten ermöglichen. Bei Mikroorganismen können die Transduktanten iur Konjugation mit anderen Mikroorganismen unter Verwendung, bei Bedarf, eines mobilisierenden Plasmids eingesetzt werden. Zur weiteren Verminderung der Größe des das Strukturgen für die Nitrilase enthaltenden Fragments können verschiedene Verfahren eingesetzt werden. So kann beispielsweise der Cosmidvektor isoliert, mit einer Vielzahl von Restriktionsendonukleasen, wie EcoRI, BgIII oder Smal, gespalten werden und die entstandenen Fragmente in einen entsprechenden Vektor, zweckmäßigerweise in den vorher verwendeten Cosmidvektorj geklont werden. Anstelle eines-Ccsmidvektors stehen viele Klonierungsvektoren geringer Größe, wie pACYC177 und PACYC184, zur Verfügung. D.h., Fragmente \ron vorzugsweise unter etwa 5 KB, im allgemeinen unter etwa 4 KB und insbesondere unter etwa 2 KB, können geklont werden und gewähren Benzonitrilresistenz.

Zweckmaßigerwaise enthält das Fragment etwa 1 KB und unter etwa 5 KB, vorzugsweise unter etwa 4 KB, insbesondere mindestens etwa Ί047 Basenpaare (BP). insbesondere einschließlich der flankierenden Regionen mindestens etwa 11

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BP, vorzugsweise unter etwa 1,5 KB. Von besonderem Interesse <, ist ein Bglll-Smal-Fragment aus Klebsiella ozaen^e und insbesondere ein Pstl-HincII-Fragment mit etwa 1210 BP.

Von besonderem Interesse ist eine Verkürzung des Nitrilase-· gens bis zu etwa 5 Codons am 5'-Ende und bis et va 10 Codons am 3'-Ende oder das Zufügen bis zu etwa 50, im allgemeinen nicht über etwa 30 und vorzugsweise nicht über 20 Codons am 5'- und/oder 3'-Ende. D.h., das entstandene Enzym kann vom natürlich vorkommenden Enzym durch bis zu 50 Aminosäuren, im allgemeinen nicht über etwa 30 Aminosäuren und vorzugsweise nicht über etwa 25 Aminosäuren verschieden sein, wobsi eine Kombination von Substitution, Extension und Abspaltung durchgeführt wird.

Die Nitrilase kann χλ jeder geeigneten Quelle, entweder in prokaryontisehen oder eukaryontischen Zellen, wie Bakterien, Hefe, Schlauchpilzen oder Pflanzenzellen, exprimiert werden. Wo keine Sekretion erhalten wird, kann das Enzym durch Lyse der Zellen in bekannter Welse isoliert werden. Geeignet sind beispielsweise die Chromatographie, Elektrophorese oder Affinitätschromatographie. Zweckmäßigerweise wird Bromoxynil über eine entsprechende funktionelle Gruppe, wie die Carboxyl-Gruppe, an einen unlöslichen Träger gebunden und als Verpackung für die Isolierung der Nitrilase verwendet.

Die spezifische Nitrilaseaktivität !.eträgt mindestens etwa 0,1 μπιοί Ammoniak/min/mg Protein, im allgemeinen mindestens etwa 0,5 oder mehr μπιοί Ammoniak/min/mg Protein

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unter Bedingungen, wie sie von Harper, "Biochem. J.", 167, G. 685-692 (1^77) beschrieben werden.

Das gereinigte Enzym kann in vielerlei Weisen verwendet werden: es kann beispielsweise direkt in Untersuchungen auf Brombxynil, loxynil oder andere verwandte Benzonitrile verwendet werden. Ss kann aber auch als Nachweis in diagnostischen Versuchen dienen, z.3 dadurch, daß es an eine zu untersuchende Substanz, wie ein Hapten oder Antigen, oder einen Antikörper, gebunden wird. Diese Versuche sind in den US-PS 3 654 090, 3 817 837 und 3 850 752 beschrieben, in denen die Konjugation sowia die Bestimmung der Konzentration der zu untersuchenden Substanz eingehend erläutert sind (die entsprechenden Teile dieser Easchreibungen sind hier miteinbezogen).

Die die Nitrilase codierende DNA-Sequenz kann in verschiedenen Weisen verwendet werden, beispielsweise zur Isolierung des Wildtyps oder von Nitrilase-Mutanten.

Sie kann aber auch zur Integration durch Rekombination in einen Wirt eingesetzt werden, wobei dem Wirt Benzonitrilresistenz verliehen wird.

Bei Pflanzenzellen kann das Strukturgen als Teil einer Konstruktion in einen Pflanzenzellkern durch Mikropipetteninjektion zur Integration durch Rekombination in das Wirtgenom eingeführt werden. Alternativ kann auch die Elektroporation zur Einführung des Strukturgens in eine Pflanzenwirtzelle verwendet werden. Wurde das Strukturgen aus einer

Quelle mit Regulatorsignalen erhalten, die von dem Pflanzenwirt nicht erkannt werden, so müssen die entsprechenden Regulatorsignale für die Expression eingeführt werden. Wird ein Virus oder Plasmid, beispielsweise ein tumorinduzierendes Plasmid, verwendet, das kartiert worden ist, so kann eine "Schnittstelle gewählt werden, die stromabwärts von einem Promotor liegt und in die das Strukturgen in einer entsprechenden Entfernung vom Promotor eingefügt werden kann. Weisen die DNA-Sequenzen keine geeignete Schnittstelle auf, so können sie mehrmals mit einer Exonuklease, wie Bal31, gespalten und eine synthetische Endonukleaseschnittstelle (Linker) eingeführt werden.

Von besonderem Interesse ist die Verwendung eines tumorinduzierenden Plasmids, z.B. Ti oder Ri, mit dem das Nitrilasegen in Pflanzenzellchromosomen eingeführt werden kann. Die Verwendung von Ti- und Ri-Plasmiden ist in PCT-A-WO84/02913, 02919 und 02920 sowie EP-A-O 116 718 sowie bei Matzke und Chilton "J. Mol. App. Genetics", 1, S. 39-49 (1981) beschrieben.

Durch Verwendung des rechten Rands oder beider Ränder der T-DNA, d.h. der Ränder, die eine Expressionskassette flankieren, die das Nitrilase-Strukt irgen und-die Transcriptions- und Translations-Regulat-. csignale für den Start (Initiation) und das Ende (Temination) umfassen und die vom Pflanzenwirt erkannt werden, kann die Expressionskassette in das Pflanzengenom integriert werden und die Expression der Nitrilase in der Pflanzenzelle bei verschiedenen Differenzierungsstufen ermöglicht werden.

Verschiedene Konstruktionen können für die Expression in Pflanzenzellen hergestellt werden. Dabei wird eine Expressionskassette zur Verfügung gestellt, die in Pflanzen zur Expression der Nitrilase im Pflanzenwirt funktionell ist.

Für die Transkription können viele Transkriptionsstartregionen (Promotorregionen), entweder konstitutive oder induzierbare, eingesetzt werden.

Die Transkriptionsstartregion ist an das die Nitrilase codierende Strukturgen gebunden und gewährleistet die Transkriptionsinitiation stromaufwärts vom Initiationscodon, normalerweise innerhalb etwa 200 Basen des Initiationscodons, dort, wo der nicht übersetzten (nicht translatierten) 5'-Region ein ATG fehlt.

Das 3'-Ende des Strukturgens hat ein oder mehrere Stopcodons, die an eine Transkriptionsendregion, die in einem Pflanzenwirt funktionell ist, gebunden sind, wobei die Endregion mit dem gleichen oder verschiedenen Strukturgenen wie die Startregion verbunden ist.

Die Expressionskassette ist dadurch gekennzeichnet, daß sie in Richtung der Transkription der Startregion das Strukturgen unter der Transkriptionskontrolle der Startregion und der Endregion für die Beendigung der Transkription und die Herstellung der m-RNA, wenn es angebracht ist, enthält.

Als Transkriptions- und Translations-Regulatorregionen kön-

nen zweckmäßigerweise Opin-Promotor- und Terminator-Regionen verwendet werden, die eine konstitutive Expression des Nitrilasegens gewährleisten. Es können aber auch andere Promotoren und/oder Terminatoren eingesetzt werden, insbesondere Promotoren, die eine induzierbare Expression oder regulierte Expression in einem Pflanzenwirt ermöglichen

Geeignete Promotorregionen aus Ti-Plasmid sind Opinpromotoren, wie beispielsweise der Octopin-Synthase-Promotor, Nopalin-Synthase-Promotor, Agropin-Synthase-Promotor oder Mannopin-Synthase-Promotor. Andere Promotoren sind Virus-Promotoren, wie CaMV-Region VI-Promotor oder der Promotor mit der Gesamtlänge (35S), Promotoren, die mit Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylat-Genen verbunden sind, beispielsweise die kleine Untereinheit, oder Gene, die mit Phaseolin, Proteinspeicherung, B-Conglycinin oder Zellulosebildung verbunden sind.

Die verschiedenen Sequenzen können in herkömmlicher Weise aneinander gebunden werden. Die Promotorregion kann durch die Region am 5'-Ende des Strukturgens, z.B. das Opingen, und durch Restriktionskartierung und Sequenzierung identifiziert werden; sie kann selektioniert und isoliert werden. Entsprechend kann die Terminatorregion als 3'-Region aus dem Strukturgen isoliert werden. Die Sequenzen können geklont und in der richtigen Orientierung aneinandergebunden werden, sie ermöglichen die konstitutive Expression des Nitrilasegens in einem Pflanzenwirt.

Durch Einführen eines funktioneilen, die Nitrilase exprimierenden Gens in Kulturpflanzenzellen können Bromoxynil,

Ioxynil und analoge Herbizide bei einer Vielzahl von Srtragspflanzen bei Konzentrationen verwendet v/erden, die die vollständige oder praktisch vollständige Unkrautvernichtung gewährleisten, ohne die Ernte wesentlich zu beeinträchtigen,, Auf diese V/eise können wirtschaftliche Vorteile erreicht werden, da Düngemittel und V/asser wirkungsvoller eingesetzt und die auf der Anwesenheit von Unkraut beruhenden Nachteile vermieden werden.

Die die Nitrilase exprimierende Expreasionskassette kann in eine Vielzahl von Pflanzen eingeführt werden, sowohl einkeimblättrige wie auch zweikeimblättrige, einschließlich Mais, Y/eizen, Sojabohnen, Tabak, Baumwolle, Tomaten, Kartoffeln, Drassica-Arten, Reis· Erdnüsse, Petunien, Sonnenblumen, Zuckerrüben oder Rasen. Die Gene können in Zellen oder Pflanzenteilen vorhanden sein, wie Callus, Gewebe, V/urzeln, Knollen, Schöi31inge, Stecklinge, Samen, Blätter, Keimlinge oder Pollen,

Um den Pflanzen Resistenz gegen 3,5-dihalogeniertes p-Hydroxybenznitril zu verleihen, können verschiedene Formulierungen zum Schutz der Ertrag3pflanzen vor Unkraut und folglich zur Erhöhung der Ernte und zur Verminderung des Wettbewerbs um Nährstoffe verwendet werden. Beispielsweise kann Broinoxynil als solches für die Postemergenzkontrolle des Unkrauts bei "sicheren" Kulturpflanzen, wie Sonnenblumen, Sojabohnen, Getreide oder Baumwolle, oder alternativ in Kombinationen mit anderen Produkten eingesetzt werden,,

Ss können übliche Mengen an Pestiziden auf Feldern verwen-

det werden in Formulierungen, die etwa 0,05 bis 1,98 kg/O,4 ha (0,1 bia 4 Pfund/a), vorzugsweiae 0,09 bia 0,9 kg/0,4 ba (0,2 bia 2 Pfund/a) Bromoxynil abgeben, und daa andere Herbizid in aolchen Mengen enthalten, daß 3ie etwa 0,05 bia 1,98 kg/O,4 ha (0,1 bio 4 Pfund/a) Wirkstoff abgeben. Die Formulierungen können andere Hilfastoffe, wie Reinigungsmittel, Hilfsmittel, SprUhhilfamittel, Haftmittel oder Stabiliaierungamittel enthalten. Die Formulierungen können entweder naß oder trocken angewendet werden, beispielaweiae ala fließfähige Pulver, emulgierbare oder flüssige Konsentrate, wie aie an aich bekannt aind.

Herbizidlösungen können in herkömmlicher V/eiae angewendet werden, beiapielsweiae durch Beapriihen, Begießen oder Zeratäuben₀

Die Erfindung wird durch die folgenden Beiapiele näher erläutert,

Auoführunflabeispiele: Experimentelles Material und Methoden

Reatriktionaenzyme und T4~Ligasen für Verknüpfungen wurden gemäß den Empfehlungen der Herateller verwendet. Standardmethoden beim Klonen und der Molckularanalyse wurden gemäß LIaniatia et al. "Molecular Olonin: Λ Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982) durchgeführt. Die Klonanalyse wurde gemäß Iah-Horowitz et al. "Iiucl. Acids Res.", 9 S. 2939 bia 2993 (1931) durchgeführt.

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Für alle Klonierungsversuche wurde der Stamm E. coli MM294 verwendet (Hanahan ,"Mol. Biol.", 166, S. 557 bis 580 (1983)).

Folgende Antibiotikamengen wurden eingesetzt: Chloramphenicol (¹Cm): 25 pg/ml; Tetracyclin (Tc): 10 pg/ml; Penicillin (Ap): 300 μq/ml.

Die Plasmid-DNA-Transformationen in E. coli wurden gemäß Mandel und Higa,"J. Mol. Biol.", 53, S. 159 bis 162 (1970) durchgeführt.

Bakterien aus einem mit Bromoxynil verseuchten Boden wurden isoliert und selektioniert. Einer dieser Organismen wurde als Klebsiella pneumoniae Unterart ozaenae identifiziert.

Die Teilreinigung und Charakterisierung der bromoxynilspezifischen Nitrilase aus diesem Organismus ergab ein aktives Enzym mit einer Scheinmolekularmasse von 34 kDal.

Nach wiederholter Kultivierung von K. ozaenae auf festem L-Agar wurde eine Variante isoliert, die nicht mehr fähig war, Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle zu verwenden, wenn sie in einem definierten flüssigen Medium gezüchtet wurde, das je Liter 1,5 g KH₂PO₄, 3,5 g K₂HPO₄, 0,1 g MgSO₄'7H₂O, 50 mg Hefeextrakt, je 0,1 % Citrat, Glycerin und Succinat und Spurenelemente enthielt (vgl. Barnett und Ingraham,"J. Appl. Bacteriol.", 18, S. 131 bis 143 (1975)). Dieses Medium wird im folgenden als YETE-Mehrfachkohlenstoffmedium bezeichnet. Dieses YETE-Mehrfachkohlenstoff-

medium enthielt 0,05 % Bromoxynil. Obwohl dieser Organismus Bromoxynil nicht als einzige Stickstoffquelle verwendet, wächst er in 0,05 % Bromoxynil enthaltender L-Brühe zur vollen Dichte. Eine Kolonie der K. ozaenae-Variante wurde ausgewählt und in 10 ml L-Brühe gezüchtet. Drei unabhängige K. ozaenae-Kolonien wurden von einer Bromoxynil enthaltenden LB-Platte ausgewählt und unter den gleichen Bedingungen gezüchtet. Diese vier gleichen K. ozaenae-Kolonien wurden gleichzeitig in 1 0 ml 0,05 % Bromoxynil enthaltender L-Brühe gezüchtet. Die Kulturen wurden bei 30° bis zur vollen Dichte gezüchtet, aus jeder Kultur wurde gemäß Ish-Horowitz et al. "Nucl. Acids Res.", 9, S. 2989 (1981) Plasmid-DNA im Minimaßstab hergestellt. Nicht verdaute Plasmid-DNA wurde auf 0,5 % Agarosegel der Elektrophorese unterworfen, die Plasmid-Streifen wurden durch Färben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

Die K. ozaenae-Variante zeigte eine einzige Plasmidart (mit einer Größe von 68 KB), die entweder in Anwesenheit oder Abwesenheit von Bromoxynil entstand. Die drei K. ozaenae-Kolonien zeigten eine größere Plasmidart (90 KB) wenn sie in Gegenwart von 0,05 % Bromoxynil gezüchtet wurden. In Abwesenheit von Bromoxynil sind beide Plasmidformen in zwei der drei K. ozaenae-Kolonien vorhanden.

Diese Ergebnisse deuten auf die Umwandlung der größeren Plasmidart in eine kleinere Form, wobei gleichzeitig eine Plasmid-DNA mit etwa 22 KB verlorengeht, wenn die Bromoxynil-Selektion aufgehoben wird.

Alle vier Kolonien wurden in 200 ml 0,05 % Bromoxynil enthaltender L-Brühe gezüchtet. Die Zellen wurden mit einer französischen Presse aufgebrochen, die Hochgeschwindigkeits-Überstände wurden gegen einen Puffer, der 0,05 mol/1 K₂HPO₄, pH 7,5 und 2,5 mmol/1 Dithiothreit (DTT) enthielt, dialysiert. Die einzelnen Rohextrakte wurden auf Bromoxynil-spezifische Nitrilaseaktivität untersucht. Ein Rohextrakt aus der K. ozaenae-Variante enthielt keine nachweisbare Nitrilaseaktivität, während die anderen K. ozaenae-Rohextrakte spezifische Nitrilaseaktivitäten von 0,124, 0,105 bzw. 0,143 μπιοί NH₃/min/mg Protein aufwiesen. 200 ml Zellen wurden bei 30 ⁰C bis zur mittleren Log-Phase in M9-Medium, das 0,1 % Glucose und 0,04 % Bromoxynil enthielt, gezüchtet (Miller "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory (1972)). Durch Aufbrechen der Zellen, Ultrazentrifugieren und Dialyse des Überstands in Puffer mit 0,05 mol/1 K₉HPO₄, pH 7,5, und 2,5 mmol/1 DTT wurden Rohextrakte hergestellt. Die Substratkonzentration betrug in allen Versuchen 3 mmol/1 Bromoxynil. Die Freisetzung von NHo wurde gemäß Harper "Bi.ochem. J.", 1 67, S. 685-692 (1977) überwacht. Die Fähigkeit der K. ozaenae-Variante, in Bromoxynil enthaltender L-Brühe zu wachsen, kann auf einer erworbenen Undurchlässigkeit des Organismus für die Verbindung beruhen. Der Organismus kann jedoch in bestimmten Medien unter Verwendung von Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle rieht wachsen.

Zusammenfassend scheint die K. ozaenae-Ni.trilase im Plasmid codiert zu sein. Das (die) das Enzym codierende Gen(e) scheint (scheinen) auf einem 22 KB-Plasmid-DNA-Segment zu

liegen, das spontan aus dem K. ozaenae-Plasmid in Abwesenheit der Bromoxynil-Selektion verlorengeht.

Die Bromoxynil-spezifische Nitrilase aus K. ozaenae wird in E«, coil exprimiert.

Es wurde Plasmid-DNA aus K. ozaenae,, die unter 0,05 % Bromoxynil-Selektion gezüchtet wurden, hergestellt und in E. coli MM294 (thi, gyrA96, endl", hsdR17) transformiert.

Die Transformanten wurden auf stickstoff-freiem (N") festem Agarose-Minimalmedium, das je Liter 1,5 g KH₂PO₄, 3,5 g K₂HPO₄, 0,1 g MgSO₄'7H₂O und 0_f1 % Glucose sowie 0,05 % Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle enthielt, selektioniert. Nach 5-tägiger Inkubation erschienen 10 Kolonien auf den Selektionsplatten. Diese Kolonien wurden auf 0,05 % Bromoxynil enthaltenden L-Agarplatten ausgestrichen und auf die Anwesenheit des auxothrophen Thiamin-Markers in MM294 untersucht. Keine der Kolonien wuchs in Minimalmedia in Abwesenheit von Thiamin, das angibt,.daß der Stamm E. coli MM294 ist. Alle Kolonien wuchsen im M9-Medium, das mit Thiamin und 0,05 % Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle versetzt wurde. Kein Wachstum wurde in diesem Medium in Abwesenheit von Bromoxynil beobachtet. Zwei der Kolonien wurden für weitere Analysen ausgewählt. Wurden Rohextrakte von E. coli MM294, das das 90 KB-Plasmid enthielt, auf Bromoxynil-spezifische Nitrilaseaktivitat untersucht, so wurde eine spezifische Aktivität von 0,216 μπιοί freigesetztem NH3/min/mg festgestellt. In E. coli MM294, das die kleinere Plasmidart enthielt, konnte keine Nitrilaseaktivi

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tat nachgewiesen werden. Das größere 90 KB Plasmid in E. coli wurde mit pBrxi, das kleinere Plasmid (68 KB) mit pBrxiΔ bezeichnet.

Zur Bestätigung, daß der E. coli-Stamm MM294, der das Plasmid pBrxi enthält, den richtigen Metaboliten als Ergebnis einer Bromoxynil-spezifischen Nitrilasereaktion produziert, wurde eine 2 ml-MM294-Kultur (pBrxi ) 24 h bei 30 ⁰C in 0,05 % Bromoxynil enthaltendem M9-Medium gezüchtet. Eine Probe des Kulturfiltrats wurde auf einer C^g-Hochdruck-Flüssigchromatographiesäile chromatographiert. Die Gesamtmenge an im Kulturfiltrat vorhandenem Bromoxynil wurde zu einem neuen Metabolitg.i pfel umgewandelt. Der Metabolitgipfel wurde durch Spektralanalysa als 3',5'-Dibrom-4-hydroxybenzoesäure (DBHB) identifiziert. D.h., das Produkt der Bromoxynil-spezifischen, plasmidcodierten Nitrilaseexpression in E. coli ist das gleiche wie das von K. ozaenae.

Das Bromoxynil-spezifische Nifcrilasegen wird in E. coli kloniert.

Um festzustellen·, ob das das Bromoxynil-spezifische Ensym codierende DNA-Segment in E. coli klonierbar ist, wurde das Plasmid pBrxi mit BamHI gespalten, wobei zwei Streifen mit 53 KB bzw. 37 KB erhalten wurden. Die BamHI-Fragmente wurden in die BamHI-Stelle des E. coli-Plasmidvektors PACYC184 eingebunden (Chang und Cohen, "J. Bacteriol." 134, S. 1141 (1978)) und in E. coli MM294 transformiert. Das Kienen von pACYC184 in der BamHI-Stelle führt zu einer

Einschub-Inaktivierung des Tetracyclin-Resistenzgens. 10 chloramphenicolresistente, tetracyclinempfindliche MM294-Kolonien wurden ausgewählt, im Minimaßstab eine Klonanalyse-DNA hergestellt und mit BamHI gespalten. Vier Klone enthielten das 37 KB-BamHI-Fragment, während ein Klon das größere 53 KB-BamHI-DNA-Fragment von. pBrxi aufwies. Fünf Klone enthielten ein geklöntes BamHI-Fragment, das auch im Plasmid pBrxiΔ gefunden wurde und dem DNA-Segment entspricht, das nach der spontanen Deletion des 22 KB-Segments der Plasmid-DNA aus pBrxi zurückbleibt. Alle 10 Klone wurden in 2CO ml L-Brühe in Anwesenheit von 20 pg/ml Chloramphenicol (zur Selektion des Plasmids) gezüchtet, die erhaltenen Rohextrakte wurden auf Bromoxynil-spezifische Nitrilaseaktivität untersucht. Vier Klone, die das 37 KB-BamHI-Fragment enthielten, zeigten spezifische Nitrilaseaktivitäten im Bereich von 0,140 μΐηοΐ freigesetztem NH₃/min/mg Protein, wogegen in den anderen sechs Klonen keine Nitrilaseaktivität nachweisbar war. Diese Ergebnisse zeigen, daß sich das eine Bromoxynil-spezifische Nitrilaseaktivität codierende Gen auf einem 37-KB-BamHI-Fragment befindet, das aus dem Plasmid pBrxi geklont wird, und daß das 22 KB-DNA-Segment, des spontan in Abwesenheit der Bromoxynilselektion verlorengeht, zu dem 37 KB-BamHI-Fragment gehört.

Um die Orientierung der BamHI-Fragmente in bezug auf den Vektor pACYC184 zu bestätigen, wurde die DNA aus den oben angegebenen vier Klonen mit EcoRI gespalten und der Elektrophorese auf einem 0,07 %-igen Agarosegel unterworfen. Ein kombiniertes EcoRI-Abb.iüprodukt der Plasmide pBrxi und

pBrx1Δ wurde ebenfalls untersucht.

Beide Orientierungen des 37 KB-BamHI-Fraginents in bezug auf den Vektor pAOYC184 wurden bestimmt und als Plasmide pBrx2 und pBrx3 bezeichnet. Es wurde auch festgestellt, daß die drei EcoRI-Fragmente zu dem 22 KB-DNA-Segment gehören, das spontan aus ^en Plasmiden pBrx2 und pBrx3 abgespalten wird. Diese EcoRI-Fragmente haben eine Größe von 18 KB, 3 KB bzw. 1,9 KB. Das die Bromoxynil-spezifische Nitrilase codierende Gen sollte sich innerhalb eines dieser drei EcoRI-Fragmente befinden, wenn das Nitrilase-Strukturge \ nicht durch eine EcoRI-Restriktionsstelle geteilt ist.

Die Lokalisierung der Bromoxynil-spezifischen Nitrilase von E. coli (pBrx3) wurde untersucht, es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Tabelle 1

Die Bromoxynil-spezifische Nitrilase ist ein periplasmisches Enzym in E. coli.

Spezifische

Kulturbedingungen^a Nitrilaseaktivität"

mit Toluol behandelte Zellen η o_0Q

(L-Brühva) °'⁸²⁹

mit Lysozym behandelte Zellen _n _1Q(-

(L-Brühe) °'⁷⁹⁶

Gesamtzellen (L-Brühe) 0,770

Gesamtzellen (L-Brühe + Brx1) 1,25

Gesamtzellen (M9) 0,950

Gesamtzellen (M9 + Brx1) 1,45

Gesamtzelien/pACYC184 (M9) 0

E. coli (MM294)-Zellen, die das Plasmid pBrx3 enthielten, wurden in 5 ml-Kulturen bei 37 ⁰C in dem angegebenen Medium bis zur stationären Phase gezüchtet. Die Kulturen enthielten, wo angegeben, 20 Mg/ml Chloramphenicol und 0,04 % Bromoxynil (Brx1). 1 ml jeder Kultur wurde gesammelt, einmal mit Nitrilasepuffer (0,1 mol/1 K2HPO4, pH 7,5) gewaschen. Die Zellen wurden in 0,1 ml dieses Puffers wieder suspendiert. 50 μΙ-Proben wurden gtmäß Harper "Biochem. J.¹', 167, S. 685 bis 692 (1977) mit und ohne 3 mmol/1 Bromoxynil als Substrat auf Nitrilaseaktivität untersucht.

μπιοί ΝΗτ/min/mg. Das Protein wurde als OD^_0n = 1,4 = 10" Zellen/ml = 150 Mg bestimmt. . ^ouu

Diese Ergebnisse zeigen, daß sich die Nitrilase im periplasmatischen Raum der Zelle befindet. Eine zweite Beobachtung ist, daß das Enzym in Abwesenheit von Bromoxynil im Medium exprimiert wird, was darauf hindeutet, daß die Brom-

oxynil-Induktion für die Enzymexpression nicht notwendig ist.

Weitere Reinigung der Bromoxynil-spezifischen Niv.rilase

Die weitere Reinigung der K. ozaenae-Nitrilase wurde mit folgenden Ergebnissen durchgeführt:

Tabelle 2

Reinigung der Bromoxynil-spezifischen Nitrilase

von E. coli (Ausgangsmaterial: 6 g Zellen)

Fraktion Volumen Protein μπιοί NH₃/min S.A.^b

Roh^a	100	ml	210	mg	18,	15	,086
35-50 % NH₄SO₄	6	ml	83	mg	26,	77	,250
DEAE- Sephadex	56	ml	19	mg	15,	52	,820

Die Zellen wurden bei 30 ⁰C bis zur mittleren Log-Phase in M9-Medium, das 0,04 % Bromoxynil und Glucose enthielt, gezüchtet. Die Rohextrakte wurden durch Aufbrechen der Zellen, Ültrazentrifugieren und Dialyse in einem Puffer, der 0,05 mol/1 K₂HPO₄, pH 7,5, und 2,5 mmol/1 DTT enthielt, hergestellt. ITie Substratkonzentration betrug bei allen Nitrilaseversuchen 3 mmol/1.

μπιοί NH

Eine 2,5 cm^a χ 1 0 cm große Säule wurde mit Puffer, der 0,05 % K₂HPO₄/ pH 7,5, 2,5 mmol/1 DTT und 1 mmol/1 EDTA enthielt, equilibriert. Die Probe wurde aufgebracht, die Säule wurde

mit 300 ml eines linearen Gradienten von 0,02 bis 0,40 mol/1 NaCl im oben angegebenen Säulenpuffer entwickelt. 1 mol/1 NaCl enthaltender Puffer wurde am Ende des Gradienten aufgegeben. Es wurden 5 ml-Fraktionen gesammelt, 0,075 ml-Proben verschiedener Fraktionen wurden auf Nitrilaseaktivität untersucht. Ein einziger Gipfel mit Enzymaktivität wurde bei 0,22 1""1/I Salz eluiert. Etwa 75 % der aufgegebenen Nitrilaseaktivität wurden in den aktiven Fraktionen wiedergewonnen.

Die Fraktionen, die dem Nitrilasegipfel aus der DEAE-Säule entsprachen, wurden gegen 0,02 mol/1 K2HPO4, pH ,5 dialysiert; 50 μΐ (6 pg Protein) jeder Fraktion wurden auf 11,25 %-iges denaturiertes Laemmli-Gel aufgegeben. Die mit Protein angereicherte Bande, die dem Aktivitätsgipfel aus der DEAE-Säule entspricht, ist ein Polypeptid mit einer Molekülmasse von 34.000. Es wurden keine anderen Polypeptide in den aktiven Säulenfraktionen angereichert. Diese Ergebnisse bestätigen, daß die Bromoxynil-spezifische Nitrilase ein Polypeptid mit einer Molekülmasse von etwa 34.000 ist, das vermutlich das Produkt eines einzigen Gens ist.

Der pBrx2-Klon wurde vollständig mit EcoRI gespalten, dabei wurde ein Fragment von etwa 1 9 KB isoliert. Das Fragment wurde in den EooRI-abgebauten pACYCI84-Vektor (3,9 KB) zu dem Plasmid pBrx5 eingebaut, das wie oben beschrieben in E. coli transformiert wurde. Das Plasmid wurde in herkömmlicher Weise isoliert und mit BgIII zu einem Fragment mit etwa 6,7 KB abgebaut, das in dem Vektor pACYC184 bleibt.

Das isolierte Plasmid pBrx7 wurde mit Smal und BgIII zu einem Fragment mit etwa 3,9 KB verdaut, das in Smal-BamHI-abgebautes pACYC177 (3,7 KB) eingebaut wurde (Chang und Cohen,"J. Bacteriol.", 134, S. 1141 bis 1156 (1978)). Das entstandene Plasmid, das Penicillinresistenz verleiht, wurde in E. coli wie oben beschrieben transformiert; die Transformanten wurden auf einem penicillinselektiven Medium zu einem Plasmid pBrx8 selektioniert, das das Nitrilasegen auf einem 3,9 KB-Fragment trägt.

pBrx8 wurde mit Pstl teilabgebaut, die Fragmente wurden in Pstl-verdautem pUC18 eingebaut (Yanisch-Perron et al.. "Gene", 33, S. 103-119 (1985)). Die entstandenen Plasmide wurden in E. coli kloniert und auf Nitrilaseaktivitat untersucht. Ein Klon wies ein 5,3 KB-Plasmid pBrx9 auf, das isoliert und mit Pstl und HincII vveitergespalten wurde, wobei ein Fragment mit 1210 BP entstand, das in Richtung von Pstl zu HincII, CIaI-, Sail-, Seal- und Sphl-Restriktionsstellen in relativ gleichmäßigen Abständen hat. Das Pstl-HincII-Fragment wurde gemäß Sanger et" al., "Proc. Natlj Acad. Sei. USA", 74, S. 5463-5468 (1977) sequenziert. Die Sequenz (mit den entsprechenden codierten Aminosäuren) ist im folgenden angegeben:

2 84 04 6

65 CTGCAGGATAGTAGGGGCTTGAAGAGGATACGCTGTTTGGCGAGCCATCAAAATAAGGGGATTTTC

95 125

ATG GAC ACC ACT TTC AAA GCA GCC GCT GTT CAG GCC GAA CCG GTA TGG ATG GAT GCC GCT Met Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala VaI Gin Ala GIu Pro VaI Trp Met Asp Ala Ala

155 185

GCA ACA GCC GAT AAG ACC GTG ACG CTA GTA GCT AAA GCC GCA GCG GCT GGC GCG CAG CTC Ala Thr Ala Asp Lys Thr VaI Thr Leu VaI Ala Lys Ala Ala Ala Ala GIy Ala Gin Leu

215 2A5

GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TTC ATG CTC ACG CAC AAC CAA VaI Ala Phe Pro GIu Leu Trp He Pro GIy Try Pro GIy Phe Met Leu Thr His Asn Gin

275 305

ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT AAA TAC CGC AAG CAG GCA ATC GCC GCC GAT GGA CCA Thr GIu Thr Leu Pro Phe He He Lys Try Arg Lys Gin Ala He Ala Ala Asp GIy Pro

335 ' 365

GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG GAG CAT AAC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TAC GIu He GIu Lys He Arg Cys Ala Ala Gin GIu His Asn lie Ala Leu Ser Phe GIy Tyr

395 425

AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACT CTC TAC ATG TCA CAA ATG CTT ATC GAT GCC GAT GGC ATC Ser GIu Arg Ala GIy Arg Thr Leu Tyr Met Ser GIn Met Leu He Asp Ala Asp GIy He

455 * . 485

ACC AAA ATT CGT CGT CGA AAG CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAA Thr Lys He Arg Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr Arg Phe GIu Arg GIu Lev. Phe GIy GIu

515 545

GGT GAC GGA TCG GAC TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC GIy Asp GIy Ser Asp Leu Gin VaI Ala GIn Thr Ser VaI GIy Arg VaI GIy AIa Leu Asn

575 605

TGC GCG GAG AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAC TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA ys Ala GIu Asn Leu GIn Ser Leu Asn Lys Phe AIa Leu Ala Ala GIu GIy GIu Gin He

635 665

CAT ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC ATC GGC

His He Ser Ala Trp Pro Phe Thr Leu GIy Ser Pro VaI Leu VaI GIy Asp Ser He GIy

695 725

GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG TCG ACG CAG GTG

Ala He Asn Gin VaI Tyr Ala Ala GIu Thr GIy Thr Phe VaI Leu Met Ser Thr Gin VaI

755 785

GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GAA GAC AGG TAC AAC CCG AAT CAG TAT

VaI GIy Pro Thr GIy He Ala Ala Phe GIu He GIu Asp Arg Tyr Asn Pro Asn Gin Tyr

815 845

CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC ATG CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG

Leu GIy GIy GIy Tyr Ala Arg He Tyr GIy Pro Asp Met Gin Leu Lys Ser Lys Ser Leu

875 905

TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC GAG ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA

Ser Pro Thr GIu GIu GIy He VaI Tyr Ala GIu lie Asp Leu Ser Met Leu GIu Ala. Ala

935 965

AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATT

Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr GIy His Tyr Ser Arg Pro Asp VaI Phe Ser VaI Ser He

995 1025

AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCG

Asn Arg Gin Arg Gin Pro Ala VaI Ser GIu VaI lie Asp Ser Asn GIy Asp GIu Asp Pro

1055 1085

AGA GCA GCA TGC GAG CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGG

Arg Ala Ala Cys GIu Pro Asp GIu GIy Asp Arg GIu VaI VaI He Ser Thr Ala He GIy

1115 1155

GTT CTA CCC CGT TAT TGC GGA CAT TCC TAATAAAAAGAGACACGTGGTACCAAAGGGGTGTTCATGTCCA VaI Leu Pro Arg Tyr Cys GIy His Ser

1200 GACGCAGAAAATATAGCCCAGAGTTAAAACGCGAAGCCATCGCTTTAACCCGTCAAC

Das von den nicht codierenden flankierenden Regionen am 5'~ und 3'- Ende praktisch freie Pstl-HincII-Fragment kann mit EcoRI-Linkern verknüpft und mit EcoRI gespalten werden und ist dann fertig, um in eine Pflanzenexpressionskassette durch Einschub in die EcoRI-Stelle von pCGN451 eingeführt zu werden.

pCGN451 umfaßt eine Octopin-Kassette, die etwa 1566 BP der 5'-nichtcodierenden Region, die über einen EcoRI-Linker an das 3'-Ende des Gens gebunden ist, und etwa 1349 BP der 3'-nichtcodierenden DNA enthält. Die pTi-Koordinaten sind 11.207 bis 12.823 für die 3'-Region und 13.643 bis 15.208 für die 5'-Region (definiert gemäß Barker et al. "Plant Molecular Biology", 2, S. 335 (1983)).

Das 5'-Fragment wurde wie folgt erhalten: ein kleines unterkloniertes Fragment, das das 5'-Ende der codierenden Region als BamHI-EcoRi-Fragment enthält, wurde in pBR322 als Plasmid pCGN407 geklont. Das BamHI-EcoRI-Fragment hatte eine Xmnl-Stelle in der codierenden Region, während pBR322 zwei Xmnl-Stellen aufwies. pCGN407 wurde mit Xmnl abgebaut, mit Bal31-Nuklease gespalten. Den Fragmenten wurden EcoRI-Linker zugegeben. Nach dem Abbau mit EcoRI und BamHI wurden die Fragmente nach Größe fraktioniert, die Fraktionen geklont und sequenziert. In einem Fall wurde die ganze codierende Region und 10BP der 5'-nichtübersetzten Sequenzen entfernt, wobei die 5'-nichttranskribierte Region, die mRNA-Kappenstelle und 16BP der 5'-nichtübersetzten Region (zu einer BamHI-Stelle) intakt zurückblieben. Dieses kleine Fragment wurde durch Größenfraktionierung auf einem 7 %-

igen Acrylamidgel erhalten, etwa 130 BP lange Fragmente wurden eluiert. Diese nach Größe fraktionierte DNA wurde in M13mp9 eingebunden; verschiedene Klone wurden sequenziert, die Sequenz wurde mit der bekannten Sequenz des Octopin-Synthase-Gens verglichen. Die M1 3-Konstruktion wurde mit pI4 bezeichnet, dieses Plasmid wurde mit BamHI und EcoRI zu einem kleinen Fragment gespalten, das an ein XhoI-BamHI-Fragment, das stromaufwärts 5'-Sequenzen von pTiA6 (Garfinkel und Nester, "J. Bacteriol.", 144, S. 732 (1980)) enthielt, und an ein EcoRI-XhoI-Fragment, das 3'-Sequenzen enthielt, gebunden. Das entstandene Xhol-Fragment wurde in die Xhol-Stelle eines pUC8-Derivats mit der Bezeichnung pCGN426 geklont. Dieses Plasmid unterscheidet sich von pUC8 dadurch, daß die einzige EcoRI-Stelle mit DNA-Polymerase I gefüllt ist und dadurch, daß es die Pstl- und Hindlll-Stelle durch Nukleaseverunreinigung der HincII-Restriktionsendonuklease verloren hat, wenn ein Xhol-Linker in die einzige HincII-Stelle von pUC8 eingebaut wird. Das entstandene Plasmid pCGN451 hat eine einzige EcoRI-Stelle für den Einbau von Protein-codierenden Sequenzen zwischen der 5¹-nichtcodierenden Region (die 1.550 BP der 5'-nichttranskribierten Sequenz einschließlich des rechten Randes von T--DNA, die mRNA-Kappenstelle und 16 BP der 5'-nichtübersetzten Sequenz enthält) und der 3'-Region (die 267 BP der codierenden Region, das Stopcodon, 196 BP der 3'-nichtübersetzten DNA, die PolyA-Stelle und 1.153 BP der 3'-nichttranskribierten Sequenz enthält).

Das Xhol-Fragment, das die Octopin-Synthase (ocs)-Kassette enthält, wurde in das Plasmid pCGN517 eingebaut, das Tetra-

cyclin- und Kanamycin-Resistenzgene aufweist.

PCGN517 wurde aus pHC79 (Hohn, "Gene", 1 1 , S. 291 (1980)) durch Einführung in die einzige Pstl-Stelle des Kan^r-Gens aus pUC4K (Vieira^'Gene"; 19, S„ 259 (1982)) hergestellt. pCGN517 wurde mit Sail abgebaut, das Xhol-Fragment wurde in die einzige Sall-Stelle eingebaut.

Das Xhol-Fragment wurde auch in ein zweites Plasmid pCGN529 eingebaut. pCGN529 wurde aus pACYC184 durch Einbau des Kan^r-Gens aus Tn5 hergestellt (Rothstein et al., "Movable Genetic Elements", S.99, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1981). Ein Bglll-Fragment mit einer Größe von 2,4 KB aus pRiA4-T_L-DNA (White und Nester, "J. Bacteriol", 144, S. 710 (1980)), das in die BamHI-Stelle eingeführt wurde, blieb nach der Substitution des Hindl.TI-BamHI-Fragments von pACYCI 84 mit dem Kan^r-Gen von Tn5 zurück.

Das Xhol-Fragment, das die ocs-Kassette enthielt, in die das EcoRI-Nitrilasegen an der einzigen EcoRI-Stelle der ocs-Kassette eingebaut ist, wurde in pCGN517 und pCGN529 eingebaut. Dabei-wurden zwei Plas.nide pNi bzw. pN2 erhalten, die für die Einführung in A. tumefaciens oder A. rhizogenes zur Integration der T-DNA der Ti- oder Ri-Plasmide verwendet wurden. Die Integration in die entsprechenden Plasmide kann in einem 3-Stufen-Verfahren gemäß Comai et al., "Plasmid", 10, S. 21-30 (1983) durchgeführt wurden. Übernacht-Kulturen eines E. coli-Wirts, der die Plasmide pRK2073, pN1 oder pN2 und A. tumefaciens A722 (Garfinkel,

264 0 4

J. Bacteriol", 144, S. 732 (1980)) oder A. rhizogenes A4T (White.ibid., 144, S. 710 (1980)) enthielten, wurden über Nacht gezüchtet. Die Kulturen wurden vermischt und auf AB-Platten, die 150 Mg/ml Kanamycin enthielten, ausgestrichen. Einzelne Kolonien wurden zweimal ausgestrichen. Die richtige Integration wurde durch die Southern-Analyse der Gesamt-Agrobacterium-DNA nachgeprüft. Endonuklease-abgebaute DNA wurde mit kerben-übe.vsetztem (nick-translated) pLrx8 untersucht.

Das Bromoxynil-spezifische Nitrilase^en wird in Gallengewebe exprimiert.

Das Plasmid pBrx9, das das Nitrilasegen auf einem 2,6 KB-Fragment trägt, wurde mit BamHI abgebaut und mit Bal31 zur Entfernung eines Teils der 5'-flankierenden Region behandelt. Es wurden BamHX-Linker zugegeben und der Ring wieder geschlossen. Die entstandenen Plasmide, die Ampici.llinresistenz verleihen, wurden wie oben beschrieben in E. coli transformiert. Die Transformanten wurden auf einem Ampicilliji-selektiven Medium zu den 5,2 KB-Plasmiden pBrxi 6 bzw. pBrxi 7 selektioniert, die das Nitrilasegen auf einem 2,6 KB-Fragment tragen. pBrxi6 wurde mit BamHI gespalten und mit Hindi teilabgebaut, wobei ein 1,2 KB-Nitrilasegen-Fragment entstand.

Das BamHI-HincII-Fragment wurde in mit BamHI-Smal abgebautem pCGN46 eingebaut, wobei das 6,6 KB-Plasmid pBrx22 entstand, das das Nitrilasegen-Fragment enthält.

2b404

pCGN46 (Comai et al., "Nature", 317, S. 741-744 (1985)) ist eine Mannopin-Synthase (MAS)-Expressionskassette und enthält einen MAS-Promotor und eine ocs-3'-Region. pCGN46 wurde wie folgt hergestellt: ein EcoRI-Fragment (Eco13 oder EcoC) mit etwa 5.500 BP, das einen Teil der T_R-DNA (Barker et al., "Plant Mol. Biol.", 2, S. 325 (1983)) einschließlich der Mannopin-Synthase-Promotorregiort (P^as^ trägt, wurde in einem mit pVK2."2 gezeichneten Vektor geklont. Nach Abbau von ρ'·ΓΚ232 mit EcoRI wurde Eco13 in die EcoRI-Stelle von pACYC184 zu einem Plasmid pCGN14 eingebaut. pCGNi4 wurde mit Syhl und CIaI (jeweils an Pos. 21562 und 20128 der Barker-Sequenz, w.o.) gespalten, um die P_MAg-Region zu entfernen, die in pUC19 (Pharmacia Inc.), das mit Sphl und Accl abgebaut wurde, eingebaut. Es entstand pCGN40. Die Pj^g-Region umfaßt eine Clal-Erkennungsstelle, die methyliert ist, um sie gegen den Abbau resistent zu machen.

pCGN40 wurde mit EcoRV und EcoRI gespalten, dort wo sich die EcoRV-Stelle in der T-DNA befindet, während die EcoRI-Stelle in de^i Polylinker von pUC19 ist; dabei entsteht, ein Fragment mit der P_MAS-Region. pCGN451, das die Ociopin-Synthase-Kassette enthält, wurde mit Smal und EcoRI abgebaut, das größere Fragment, aus dem die Octopin-Synthase-5'-Region entfernt worden ist, wurd.v isoliert. Die EcoRV-EcoRI-Pj^g-Region wurde in pCGN451 anstelle der Octopin-Synthase-5'-Region eingebaut, dort wo die Transkriptions-Startregion unc die -Endregion durch einen Polylinker getrennt sind; es entsteht pCGN46.

Das Plasmid pBrx22, das das 1,2 KB-Nitrilasegen-Fragment

28

enthielt, wurde, wie oben beschrieben, in E. coli transformiert. Das Plasmid wurde in herkömmlicher Weise isoliert und mit Xhol zu einem 4,1 KB-Fragment abgebaut, das den MAS-Promotor, das Bromoxynilgen mit 25 BP der bakteriellen 5'-nicht-übersetzten Sequenz und die ocs-3'-Region enthielt. Das 4,1 KB-Fragment wurde in das mit Sail abgebaute Plasmid pCGN783 eingeführt, dabei entstand das Plasmid pBrx28 mit etwa 31 KB.

Herstellung von pCGN783 Herstellung von pCGNI67

Zar Herstellung von pCGNI 67 wurde das Alul-Fragment von CaMV (7144 bis 7735 BP, Gardner et al., "Nucl. Acids Res.", 9, S. 2871-2888 (1981)) durch Abbau mit AIuI erhalten und in die Hincll-Stelle von M13mp7 (Vieira, "Gene", 19, S. (1982)) zu C614 geklont. Durch EcoRI-Abbau von C614 wurde das EcoRI-Fragnient von C614 erhalten, das den 35S-Promotor enthielt, der in die EcoRI-Ste.lle von .pUC8 (Vieira et al., "Gene", 1?, S. 259 (1982)) zu pCGNi46 geklont wurde.

Um die Promotorregion zu trimmen, wurde die BgIII-Steile (7670 BP) mir. BgIII und Bal31 behandelt; dann wurde ein Bglll-Linker an die mit Pal31 behandelte DNA zur Herstellung von pCGNI47 gebunden^

pCGNi48a, das eine Promotorregion, einen selektionierbaren Marker (KAN mit 2 ATG) und eine 3'-Region enthielt, wurde durch Abbau vor. pCGN528 (s.u.) mit BgIII und Einführen des

BamHI-Bglll-Promotor-Fragments aus pCGNi47 hergestellt. Dieses Fragment wurde in die Bglll-Stelle von pCGN528 geklont, so daß die Bglll-Stelle in der Nähe des Kanamycingens von pCGN528 ist.

Der für diese Konstruktion verwendete Pendelvekcor (shuttle vector) pCGN528, wurde wie folgt hergestellt: pCGN525 wurde durch Abbau eines PlasmidS/ r'.as Tn5 mit einem Kanamycingen (Jorgenson et al., "Mol. Gen.", 177, S. 65 (1979)) enthält, mit Hindlll-BamHI und Einführen des Hindlll-BamHI-Fragments, das das Kanamycingen enthält, in die Hindlll-BamHl-Stellen des Tetracyclingens von pACYC184 (Chang und Cohen, "J.Bacteriol", 134, S. 1141-1156 (1978)) hergestellt.

pCGN526 wurde durch Einführen des BamHI-Fragments 19 von pTiA6 (Thomashow et al., "Cell", 19, S. 729-739 (1980)) in die BamHI-Stelle von pCGN525 hergestellt.

pCGN528 wurde durch Entfernen des kleinen Xhol-Fragments aus pCGN526 durch Abbau mit Xhol und Wiederverknüpfen erhalten.

pCGN149a wurde durch Klonen des BamHI-Kanamycingen-Fragments aus pMB9KanXXI in die BamHI-Stelle von pCGNi48a hergestellt.

pMB9KanXXI ist eine pUC4K-Variante (Vieira und Messing, "Gene", 19, S. 259-268 (1982)), der die Xhol-Stelle fehlt, die jedoch eiu funktionelles Kanamycingen aus Tn903 enthält, das eine wirkungsvolle Selektion in Agrobakterium ermöglicht.

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pCGN149a wurde mit BgIII und Sphl abgebaut. Dieses kleine Bglll-Sphl-Fragment von pCGN'l 49a wurde durch das BamHI-Sphl-Fragment aus M1 (siehe unten) ersetzt, das durcn Abbau mit BamHI und Sphl isoliert wurde. Dabei entsteht pCGNi67, eine Konstruktion, die einen CaMV-Promotor mit voller Länge, T-ATG-Kanamycingen, das 3'-Ende und das bakterielle Tn903-Kanamycingen enthält.

M1 ist ein EcoF;I-Fragment aus pCGN550 (siehe Herstellung von pCGN587), das in die EcoRI-Klonierstelle von M13mp9 so geklont wurde, daß die Pstl-ötelle in dem 1-ATG-Kanamycingen in der Nähe der Polylinkerregion von M13mp9 ist.

Herstellung der 709 (1-ATG-Kanamycin - 3'-Region)

pCGN566 enthält den EcoRI-Hindlll-Linker von pUC18 (Yanisch-Perron, ibid), der in die EcoRI-Hindlll-Stellen von pUC13-cm eingeführt wurde (K. Buckley, Dissertation, UC-San Diego, 1985). Das Hindlll-Bglll-Fragment von pNW31c-8, 29-1 (Thomashow et al., "Cell", 19, S. 729 U980)), das ORF1 und 2 enthält (Barker et al., siehe oben (1983))₍wurde in die Hindlll-BamHI-Stelle von pCGN566 zu pCGN703 subkloniert.

Das Sau3A-Fragment von pCGN703, das die 3'-Region des Transkripts 7 von pTiA6 enthält (entsprechend den Basen 2396-2920 von pT115955 (Barker et al., siehe oben (1983)), wurde in die BamHI-Stelle von püC18 (Yanisch-Perron et al., siehe oben (1985)) zu pCGN709 subkloniert.

Herstellung von pCGN766c (35S-Promotor - 3'-Region)

Das Hindlll-BamHI-Fragment von pCGMi67 (Herstellung siehe unten), das den CaMV-35S-Promotor, das 1-ATG-Kanamycingen und das BamHI-Fragment 19 von pTiA6 enthält, wurde in die BamHI-Hindlll-Stellen von püCI9 geklcnt (Norrander et al., siehe oben C983); Yanisch-Perron et al., siehe oben (1985)); es entstand pCGN976.

Der 35S-Promotor und die 3'-Region aus dem Transkript 7 wurden durch Einführen eines 0,7 KB-HindIII-EcoRI-Fragments von pCGN976 (35S-Promotor) und des 0,5 KB-EcoRI-Sall-Fragments von pCGN709 (Transkript 7:3', Herstellung siehe oben) in die Hindlll-Sall-Stellen von pCGN566 hergestellt; es entstand pCGN766c.

Endaufbau von pCGN783

Das 0,7 KB-HindIII-EcoRI-Fragment von pCGN766c (CaMV-35S-Promotor) wurde an das 1,5 KB-EcoRI-Sail-Fragment von . pCGN726c (1-ATG-KAN-3¹-Region) in die Hindlll-Sall-Stellen von pUC119 (J. Vieira, Rutgers University, N.J.) gebunden; es entstand pCGN778.

Die 2,2 KB-Region von pCGN778, das Lindlll-Sall-Fragment, das die CaMV-35S-Promotor (1 -ATG-KAN-3'-Region) enthält, ersetzte die Hindlll-Sall-Polylinkerregion von pCGN739; es entstand pCGN783.

pBrx17wurde mit BamHI abgebaut und mit HincII teil^bge-

baut, wodurch das 1,2 KB-Nitrilasegen-Fragment entstand. Das BamHI-HincII-Fragment wurde in mit BamHI-Smal abgebautes pCGN566 eingebaut, es entstand das 3,7 KB-Plasmid pBrx25, das das Nitrilasegen-Fragment enthielt.

pCGN"566 wurde wie folgt hergestellt: pUC13 (Cm^R) (Ken Buckley, Dissertation, U.C, San Diego) wurde mit EcoRI und Hindlll abgebaut, Polylinker aus pUC18 und püC19 wurden jeweils in das lineargemachte pUC13 eingebaut, wobei pCGN566 entstand, das einen Chloramphenicolresistenzmarker trägt.

Das Plasmid pBrx25, das das 1,2 KB-Nitrilasegen-Fragment enthält, wurde wie oben beschrieben in E. coli transformiert. Das Plasmid wurde in herkömmlicher Weise isoliert und mit BamHI und EcoRI wiederum zum 1,2 KB-Nitrilasegen-Fragment abgebaut. Das BamHI- und EcoRI-Fragment wurde in mit BamHI und EcoRI abgebautes pCGN46 eingebaut, es entstand das 6,6 KB-Plasmid pBrx27, das das Nitrilasegen-Fragment enthält.

pBrx27 wurde wie oben beschrieben in E. coli transformiert. Das Plasmid wurde in herkömmlicher Weise isoliert und mit Xhol abgebaut, es entstand ein 4,1 KB-Fragment, das den MAS-Promotor, das Bromoxynilgen mit 11 BP der bakteriellen 5'-Region in der übersetzten Sequenz und die ocs-3'-Region enthält. Das 4,1 KB-Fragment wurde in mit Sail abgebautes pCGN783 eingebaut, es entstand das Plasmid pBrx29 mit etwa 31 KB.

Nachweis der Nitrilaseexpression

Die Plasmide pBrx28 und pBrx29 wurden in den Stamm Agrobacterium tumefaciens K1 2 transformiert (Nester, "Ann. Rev

Micro.", 35, S. 531 (1981); Hoekema et al., "Nature", 303, S. 179 (1983)). K1 2 (pBrx28) und K1 2 (pBrx29) wurden zur Bildung von Gallen auf Kalanchöe verwendet (Garfinkel, "J

Bacteriol.¹¹, 144, S. 732 (1980)).

Etwa 1 g (Prischgewicht) Gallengewebe wurden in flüssigem Stickstoff und einem Puffer, der 0,1 mol/1 Tris, pH 7,5, 10 mmol/1 EDTA, 0,15 molΊ NaCl, 0,05 % NP-40 (Netzmittel), 25 mg/ml BSA (Rinderseruinalbumin), 1 mmol/1 DTT und 0,13 pg/ml Leupeptin enthält, gemahlen. Die Proben wurden nach der Zugabe von 0,05 g Polyvinylpyrrolidon (Sigma) homogenisiert, dann bei 15.000 g 15 min bei 4 ⁰C zentrifugiert. 25 μΐ Antiserum, das durch Injektion von gereinigter Nitrilase in Kaninchen hergestellt wurde, und 250 μΐ 10 %-ige (Masse/Volumen) Suspension von S. aureus (Calbiochem) wurden zu jedem Überstand zugegeben und 16 h bei 4 ⁰C inkubiert. Die Proben wurden dann zentrifugiert, der Niederschlag wurde zweimal mit 20 mmol/1 Tris, pH 7,5, ^ mmol/1 EDTA, 150 mmol/1 NaCl und 0,05 % NP-40 gewaschen. Die Niederschläge wurden in 100 μΐ 0,125 mol/1 Tris, pH 6,8, 4 % SDS (Natriumdodecylsulfat), 20 % Glycerin und 10 % BMe (ß-Mercaptoethanol) wieder suspendiert und 2 min auf 90 ⁰C erhitzt. Alle Proben wurden auf 10 %-igem Acrylamidgel der Elektrophorese unterworfen (V.K. Laemmli "Nature", 227, S. 680-685 (1970)). Die wiederaufgelösten Polypeptide wurden auf Nitrozellulosefilter (Schleicher & Schuell) transferiert

2 Ö4 04

(vgl. Burnette, "Anal. Biochem.", 112, S. 195-203 1981)). Die Nitrozellulosefilter (Schleicher r, Sohuell) wurden dann in BLOTTO (Johnson et al., "Gen. Anal. Technol.", 1, S. 38-42 (1983)) 1 bis 3 h bei 42 ⁰C inkubiert, dann über Nacht bei Raumtemperatur in BLOTTO, das eine 1:50-Lösung des Anti-Nitrilaseserums enthielt, inkubiert. Die Filter wurden 10 min in 20 mmol/l Tris, pH 7,5 und 150 mmol/l NaCl, dann 20 min in dem gleichen Puffer, der jedoch 0,05 % Tween-20 enthielt und weitere 10 min in dem Puffer ohne Tween-20 gewaschen. Es wurde dann BLOTTO, das 10⁶ cpm/ml ¹²⁵I-markiertes Protein A (9 μ Ci/mg; NEN) enthielt, zu den Filtern zugegeben, die 2 h bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die Filter wurden über Nacht in 50 mmol/l Tris, pH 7,5, 1 mol/1 NaCl und 0,4 % Sarkosyi gewaschen. Nach dem Spülen und dem Trocknen wurden die Filter einem Kodak AR-Röntgenfilm bei - 70 ⁰C unter Verwendung eines DuPont-Cronex-Intensivierungsserum ausgesetzt.

Transformation und Regenerierung von Tabakblätter-Scheiben, die mit A. tumefaciens cokultiviert wurden

Tabakpflanzen wurden unter sterilen Bedingungen (25 ⁰C, 16 h weißes Licht, MS-Medium (1 mg/1 IAA (Indolessigsäure), 0,15 mg/1 Kinetin) kultiviert. 3 Wochen alte Pflanzen, die durch Verpflanzen des Haupttriebs erhalten wurden, werden als Gewebespender verwendet. Junge Blätter (bis zum vierten Blatt von oben) wurden ausgewählt, Blattscheiben mit einem Durchmesser von 2 mm wurden ausgestanzt und in Petrischalen (3 cm Durchmesser) in 1 ml MS-Medium mit 1 mg/1 IAA eingebracht. Nachdem die Scheiben über Nacht in völliger Dunkel-

2 84 04

heit gehalten wurden, wurde Agrobacterium (A772xpN1 oder pN2)-bellen (10⁸ - 10⁹/ml in Pflanzenkulturmedium) diesen Kulturon zugegeben. Die Cokultivierung wurde 13 bis 24 h in der Dunkelheit durchgeführt. Durch dreimaliges Waschen mit MS-Medium ohne Hormone, das jedoch 350 mg/1 Cefotaxin (Boehringer, Mannheim) enthielt, wurden die Blattscheiben von Agrobcxcterium befreit. Die Blattscheiben wurden in Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm in 1 0 ml MS-Medium ohne Hormone eingebracht. Petrischalen mit Phytagar (0,6 % Gibco, 350 mg/1 Cefotaxin) wurden mit Paraffin verschlossen und unter den gleichen Bedingungen als Gewebespenderpflanzen gehalten. Die Regenerationskeime wurden in den folgenden 2 bis 5 Wochen sichtbar.

Die Pflanzen mit 6 Blättern wurden mit einem direkten Strahl einer Bromoxynillösung auf die eingetopfte Pflanze besprüht. Jeder 10 cm Topf enthielt eine Pflanze und erhielt 2,5 ml Spray. Die Pflanzen wurden in einem Gewächshaus bei 25 ⁰C, 70 % relativer Feuchtigkeit und einer Lichtperiode von 60 h gezüchtet. Das Wachstum wurde 9 .Tage nach dem Besprühen durcn Zählen der neuen Blätter, die länger als 0,5 cm waren, bestimmt.

Herstellung einer kleinen Untereinheit einer Promotor-Bromoxynilgen-Chimäre von Tabak zur Expression der Bromoxynil-spezifischen Nitrilase in Tabak

Herstellung einer Tabak-ssu-Proraotorkassette

Genom-Klone, die die kleine Tabakgen-Untereinheit enthiel-

ten, wurden aus einer EcoRI-Teilgenombibliothek, die aus Nicotiana tabacum (Samsum)-DNA hergestellt wurde, isoliert. Die Klone wurden unter Verwendung eines Pstl-DNA-Segments mit 740 BP eines Klons einer kleinen Erbsen-cDNA-Untereinheit ausgewählt (Broglie et al., "Proc. Natl. Acad. Sei. USA", 78, S. 7304-7308 (1981)). Ein 3,4-KB-EcoRI-Fragment, das eine Tabak-codierende Region und eine 5'-flankierende Sequenz enthielt, wurde aus einem Charon-32-Lambda-Phasenklon (3-8) in M13mp18 geklont (Yanisch-Perron et al., "Gene", 33, S. 103-119 (1985)). Dieser Unterklon wurde mit NSUE2018 bezeichnet. Die Lokalisierung der TATA-Box (Promotor) und des mutmaßlichen ATcJ-Startcodons für ,das Protein der kleinen Untereinheit, wurde durch DNA-Sequenzierung bestimmt. Eine einstrangige DNA-Schablone wurde aus NSUE2018 hergestellt und zu einem Ring eines 25-basigen einstrangigen synthetischen Oligomers ( 5'TGTTAATTACACTTTAAGACAGAAAS') geschlossen. Dieses Sequenz ist zu den 25 Basen unmittelbar am 5'-Ende des mutmaßlichen ATG der kleinen Tabakgen-Untereinheit komplementär. Der Primer wurde zur Herstellung von doppelstrangiger DNA unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I erweitert, mit Hindlll zu einem doppelstrangigen DNA-Fragment mit einem stumpfen Ende an einem Ende des Primers und dem Hindlll-Überhang am anderen Ende abgebaut. pUC18 wurde mit Smal und Hindlll abgebaut, das oben hergestellte doppelstrangige DNA-Fragment wurde in den Polylinker eingebaut, wobei ein 4,1 KB-Plasmid mit der Bezeichnung pCGN625 entstand. pCGN625 wurde mit Hindlll abgebaut, mir. dem Klenow-' Fragment am stumpfen Ende verbunden, mit HcoRI abgebaut und in mit EcoRI-Smal gespaltenes pUC18 eingebaut; es entstand

ein 4,1 KB-Plasmid pCGN627. Ein 6,3 KB-DNA-Segment wurde erhalten, das ein BamHI-Pstl-Fragment aus pACYC177 (Chang und Cohen, "J. Bacteriol", 134, S. 1141-1156 (1978)) enthielt, das an der Pstl-Stelle an ein Pstl-EcoRI-Fragment gebunden ist, das die ocs-3'-Rtigion, 12823 BP (EcoKI) bis 10069 BP (Pstl) umfaßt (Barker e*·. al., "Plant Molec. Biol.", 2, S. 335-350 (1984)). Das 6,3 KB-DNA-Segment wurde in mit BamHI und EcoRI abgebautes pCGN627 eingeführt, so daß die ocs-3'-Region zu dem Tabak-ssu-Fragment benachbart ist; es entstand ein 7,7 KB-Plasmid pCGN630.

Das pCGN630-Plasmid wurde durch Abbau mt BamHI, Verknüpfen am stumpfen Ende mit dem Klenow-Fragment, Ringschluß, Abbau mit Kpnl, Verbinden am stumpfen Ende mit T4-Polymerase und Einbau von BamHI-Linkern, um eine BamHI-Stelle zur Verfugung zu stellen, manipuliert. Das entstandene Plasmid pCGNi509 wurde mit BgIII gespalten, am stumpfen Ende mit Klenow-Polymerase verbunden und mit Hindlll-Linkern verknüpft. Das entstandene Plasmid pCGN1510 hat eine Hindlll-Stelle in der ocs-3'-Region und eine Hindlll-Stelle, die benachbart und außerhalb der Tabak-ssu-Region ist. pCGN1510 wurde dann mib BamHI und Sstl abgebaut, wobei die Region zwischen der ssu-Region und der ocs-3'-Region zerschnitten wird, und ein BamHI-Sstl-Fragment aus pBrx25 so eingebaut, so daß es zwischen und in der richtigen Orientierung der ssu-Promotorregion und der ocs-3'-Endregion ist. Das entstandene 8,9 KB-Plasmid wurde mit pBrx36 bezeichnet.

pBrx36 wurde mit Hindlll abgebaut und in mit Hindlll gespaltenes PCGN783 zu pBrx39 und pBrx40 eingebaut, wobei das

I 84 04 Ö

Nitrilasegen in entgegengesetzter bzw. gleicher Transkriptionsrichtung wie das Kanamycingen ist.

Die Plasmide wurden in A. tumefaciens LBA4404 transformiert und dann mit zweikeimblattrigen Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. "Xanthi") cokultiviert. Die kanamycinresistenten Schößlinge wurden in herkömmlicher Weise in Tabakpflanzen regeneriert.

Phenotyp von transgenen Tabakpflanzen, die das Bromoxynilspezifische Nitrilasegen exprimieren.

Blattgewebe aus transformierten Tabakpflanzen (5 bis 6 Blätter) exprimierten das Nitrilasegen (bestimrat nach herkömmlicher Western-Analyse). Ein 5 mm großes Blattstück aus oberflächensterilisierten (10 % Hypochlorit, mit Wasser gewaschen) Blättern wurden in einem Bromoxynil enthaltenden Medium unter photoautotrophen Bedingungen suspendiert. Die verwendeten Medien waren MS-Salze, die 0,93 mg/1 Naphthylessigsäure und 0,11 mg/1 Benzylaminopurin und unterschiedliche Mengen an Bromoxynil enthielten. Die Bromoxynil-Konzentration schwankte von 10"*"* bis 10"^ mol/.l bei 0,1 Verdünnungen. Die photoautotrophen Bedingungen waren 5 % CO₂, 10 » O₂ und 85 % N₂. Kontroll-Tabakblattabschnitte, die nicht transformiert worden sind, wurden mit 10~⁶ mol/1 Bromoxynil gebleicht (gehemmt). Im Gegensatz dazu waren transformierte Blattabschnitte, die die Bromoxynil-'spezif ische Nitrilase aus d=n Plasmiden pBrx39 und pBrx4C exprimierten, gegenüber 10~⁵ bzw. 10~⁴ mol/1 Bromoxynil resistent.

Phenotyp von transgenen Tomatenpflanzen, die das Bromoxynil-spezifische Nitrilasegen exprimieren.

Die Cokultivierung von zweikeimblattrigen Tomatenpflänzchen (Lycopersicon esculentum cv. UC828) wurde, wie für Tabak beschrieben, durchgeführt, Kanamycin-Schößlinge wurden regeneriert. Das Blattgewebe aus transformierten Tomatenpflanzen (7 bis 10 Blätter) exprimierten das Nitrilaseprotein (bestimmt durch Standard-Western-Analyse). Etwa 5 mm große Blattabschnitte aus oberflächensterilisierten (10 % Hypochlorit, mit Wasser gewaschen) Blättern wurden in einem Bromoxynil enthaltenden Medium bei verschiedenen Konzentrationen unter photoautotrophen Bedingungen suspendiert. Die Medien waren MS-Salze, die 2 mg/1 2,4-Dichloressigsäure, 1 mg/1 Isopentyladenin, 100 mg/1 Myoinosit und 10~⁵ oder 10'⁶ mol/1 Bromoxynil enthielten. Es wurden die gleichen photoautotrophen Bedingungen, wie oben für Tabak beschrieben, verwendet. Kontrollblattabschnitte, die nicht transformiert worden sind, wurden mit 10~⁶ mol/1 Bromoxynil gebleicht, während transformierte Pflanzen, die das Bromoxynil-spezifische Nitrilasegen aus pBrx29 exprimierten, gegenüber 10~⁵ mol/1 Bromoxynil resistent waren. Transgene Tomatenpflanzen (10 bis 20 Blätter) wurden mit einem handelsüblichen Bromoxynilpräparat (BUCTRIL) besprüht und waren bei einer Konzentration von 0,22 kg/0,4 ha (0,5 lb/acre) resistent.

Herstellung einer modifizierten Nibriiase mit einem substituierten C-Ende

Das Plasmid pBrx9 wurde mit Sphl abgebaut und wieder zum Ring geschlossen, so daß eine Deletion in der Codierregion am C-Ende des Nitrilasegens entstand. Die DNA-Sequenz aus PUC18 ist im Leseraster mit der 3'-CphI-Stelle der Nitrilase-Codierregion, wobei etwa 10 Codons zu einem TGA-Codcn aus pUC18 zugefügt werden.

Die Anwesenheit der zusätzlichen 10 Codons ist zufällig und bestätigt die Tatsache, daß diese Codons entfernt werden können, ohne daß die Nitrilaseaktivität wesentlich beeinflußt wird, wobei eine verkürzte Nitrilase entsteht.

Im folgenden wird die Sequenz mit den vorausgesagten Aminosäuren der am C-Ende modifizierten Nitrilase (nit-11) angegeben:

92 119

ATG GAC ACC ACi TTC AAA GCA GCC GCT GTT CAG GCC GAA CCG GTA TGG ATG GAT MET Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala VaI Gin Ala GIu Pro VaI Trp MET Asp

146 173

GCC GCT GCA ACA GCC GAT AAG ACC GTG ACG CTA GTA GCT AAA GCC GCA GCG GCT Ala Ala Ala Thr Ala Asp Lys Thr VaI Thr Leu VaI Ala Lys Ala Ala Ala Ala

200 227

GGC GCG CAG CTC GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TCC GIy Ala Gin Leu VaI Ala Phe Pro GIu Leu Trp lie Pro GIy Tyr Pro GIy Phe

254 281

ATG CTC ACG CAC AAC CAA ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT ΑΛΑ TAC CGC AAG MET Leu Thr His Asn Gin Thr GIu Thr Leu Pro Phe He He Lys Tyr Arg Lys

308 335

CAG GCA ATC GCC GCC GAT GGA CCA GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG Gin Ala He Ala Ala Asp GIy Pro GIu He GIu Lys He Arg Cys Ala Ala GIn

362 ' 389

GAG CAT AAC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TAC AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACG CTC GIu His Asn He AIa Leu Ser Phe GIy Tyr Ser GIu Arg Ala GIy Arg Thr Leu

416 443

TAC ATG TCA CAA ATG CTT ATC GAT GCC GAT GGC ATC ACC AAA ATT CGT CGT CGA Tyr MET Ser GIn MET Leu He Asp Ala Asp GIy He Thr Lys He Arg Arg Arg

470 497

AAG CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAA GGT GAC GGA TCG Lys Leu Lys Pro Thr Arg Phe GIu Arg GIu Leu Phe GIy GIu GIy Asp GIy Ser

524 551

GAC TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC TGC GCG Asp Leu Gin VaI Ala GIn Thr Ser VaI GIy Arg VaI GIy AIa Leu Asn Cys AIa

578 605

GAG AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAG TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA GIu Asn Leu GIn Ser Leu Asn Lys Phe AIa Leu Ala Ala GIu GIy GIu Gin He

632 ' 659

CAT ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC His He Ser ALa Trp Pro Phe Thr Leu GIy Ser Pro VaI Leu VaI GIy Asp Ser

686 713

ATC GGC GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG He GIy Ala He Asn Gin VaI Try Ala Ala GIu Thr GIy Thr Phe VaI Leu MET

740 767

TCG ACG CAG GTG GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GGA GAC AGG Ser Thr Gin VaI VaI GIy Pro Thr GIy He Ala AIa Phe GIu He GIu Asp Arg

794 821

TCA AAC CCG AAT CAG TAT CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC Tyr Asn Pro Asn GIn Tyr Leu GIy GIy GIy Tyr AIa Arg He Tyr GIy Pro Asp

848 875

ATG CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC MET Gin Leu Lys Ser Lys Ser Leu Ser Pro Thr GIu GIu GIy lie VaI Tyr Ala

902 929

GAG ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC GIu He Asp Leu Ser MET Leu GIu Ala AIa Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr GIy

956 983

CAC TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATT AAC CGG CAA CGG CAG CCT His Tyr Ser Arg Pro Asp VaI Phe Ser VaI Ser He Asn Arg GIn Arg GIn Pro

1010 1037

GCG GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCG AGA GCA GCA TGC Ala VaI Ser GIu VaI He Asp Ser Asn GIy Asp GIu Asp Pro Arg Ala AIa Gys

1064 1091

AAG CTT GGC ACT GGC CGT TTT ACA ACG TCG TGA CTG GGA AAA CCC TGG CGT TAC Lys Leu GIy Thr GIy Arg Phe Thr Thr Ser . Leu GIy Lys Pro Trp Arg Tyr

513 . 540

TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC TGC GCG GAG Leu Gin VaI Ala GIn Thr Ser VaI GIy Arg VaI GIy AIa Leu Asn Cys Ala GIu

567 594

AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAG TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA CAT Asn Leu GIn Ser Leu Asn Lys Phe AIa Leu Ala Ala GIu GIy GIu Gin He His

621 648

ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC ATC lie Ser AIa Trp Pro Phe Thr Leu GIy Ser Pro VaI Leu VaI GIy Asp Ser He

675 702

GGC GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG 5GG ACC TTC GTT CTC ATG TCG GIy Ala He Asn Gin VaI Tyr Ala Ala GIu Thr CIy Thr Phe VaI Leu MET Ser

729 756

ACG CAG GTG GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GAA GAC AGG TAC Thr Gin VaI VaI GIy Pro Thr GIy He Ala AIa Phe GIu He GIu Asp Arg Tyr

783 · 810

AAC CCG AAT CAG TAT CTT GGT GGT GGG TAG GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC ATG Asn Pro Asn GIn Tyr Leu GIy GIy GIy Tyr AIa Arg He Tyr GIy Pro Asp MET

837 864

CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC GAG GIn Leu Lys Ser Lys Ser Leu Ser Pro Thy GIu GIu GIy He VaI Tyr Ala GIu

891 918

ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC He Asp Leu Ser MET Leu GIu Ala AIa Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr GIy His

945 972

TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATT AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG Tyr Ser Arg Pro Asp VaI Phe Ser VaI Ser He Asn Arg Gin Arg Gin Pro AIa

999 1026

GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCG AGA GCA GCA TGC GAG VaI Ser GIu VaI He Asp Ser Asn GIy Asp GIu Asp Pro Arg Ala Ala Cys GIu

1053 . 1080

CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGG GTT CTA CCC Pro Asp GIu GIy Asp Arg GIu VaI VaI He Ser Thr Ala lie GIy VaI Leu Pro

1107 1134

CGT TAT TGC GGA CAT TCC TAA TAA AAA GAG ACA CGT TGT ACC AAA GGG GTG TTC Arg Tyr Cys GIy His Ser . . Lys GIu Thr Arg Cys Thr Lys GIy VaI Phe

1161 1188

ATG TCC AGA CGC AGA AAA TAT AGC CCA GAG TTA AAA CGC GAA GCC ATC GCT TTA MET Ser Arg Arg Arg Lys Try Ser Pro GIu Leu Lys Arg GIu Ala lie Ala Leu

1215

CGT C Thr Arg His

28404 β

Herstellung einer modifizierten Nitrilase mit einem substituierten N-Ende

Das Plasmid pBrx9 wurde mit BamH1 abgebaut und anschließend mit BalJI etwa 5 min zur Entfernung von etwa 51 Nukleotiden zerschnitten. Das Enzym wurde inaktiviert, die zerschnittene lineare DNA-Sequenz wurde mit BamH1-Linkern verbunden, mit BamH1 abgebaut und unter Verknüpfungsbedinguncjen zum Ring geschlossen. Das entstandene Plasmid pBrxi5 enthielt etwa 5,1 KB und eine geringere Anzahl an Codons am 5'-Ende. pBrxi 5 wurde mit Hincl teilabgebaut, so daß es an der Hinc-Stelle stromabwärts von der Codierregion für die Nitrilase zerschnitten wurde, und mit BamH1 vollständig abgebaut, wobei ein Fragment entstand, in dem die Codierregion für die Nitrilase am 5'-Ende verkürzt war. Dieses Fragment wurde in pCGN566 eingebaut, das vollständig mit BamH1 und Smal abgebaut worden war; dabei entstand das Plasmid pBrx23 mit 3,7 KB. Das Plasmid pCGN566 ist eir. Derivat von püC13 mit Polylinkern aus pUC18 und pUC19 und einem Chloramphenicol-Resistenzgen. Das Fragment aus pBrxi5 wird in das Leseraster mit einem stromaufwärts gerichteten Anfangscodon eingebaut, dabei ersetzen 17 von der püC19-Sequenz codierte Aminosäuren die Aminosäuren der natürlich vorkommenden Nitrilase.

Aufgrund dieser Sequenz behält die Nitrilase ihre Aktivität sowohl mit einer längeren Aminosäuresequenz am N-Ende als auch nach Verkürzung dieser N-terminalen Sequenz oder Substitution der natürlich vorkommenden Aminosäure der N-terminalen Sequenz mit anderen Aminosäuren.

Im folgenden wird die Sequenz der N-terminal-modifizierten Nitrilase (nit-23) angegeben:

27 54

ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA GAG GAT CCG MET Thr MET lie Thr Pro Ser Leu His Ala Cys Arg Ser Thr Leu GIu Asp Pro

81 108

GAC ACC ACT TTC AAA GCA GCC GCT GTT CAG GCC GAA CCG GTA TGG ATG GAT GCC Asp Thr Thr Phs Lys Ala Ala Ala VaI Gin Ala GIu Pro VaI Trp MET Asp Ala

135 162

GCT GCA ACA GCC GAT AAG ACC GTG ACG CTA GTA GCT AAA GCC GCA GCG GCT GGC Ala· Ala Thr Ala Asp Lys Thr VaI Thr Leu VaI Ala Lys Ala Ala Ala Ala GIy

189 216

GCG CAG CTC GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TTC ATG Ala Gin Leu VaI Ala Phe Pro GIu Leu Trp lie Pro GIy Tyr Pro GIy Phe MET

243 270

CTC ACG CAC AAC CAA ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT AAA TAC CGC AAG CAG Leu Thr His Asn Gin Thr GIu Thr Leu Pro Phe lie He Lys Tyr Arg Lys Gin

297 324

GCA ATC GCC GCC GAT GGA CCA GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG GAG Ala He Ala Ala Asp GIy Pro GIu He GIu Lys He Arg Cys Ala Ala Gin GIu

351 378

CAT MC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TAC AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACG CTC TAC His Asn He AIa Leu Ser Phe GIy Tyr Ser GIu \rg Ala GIy Arg Thr Leu Tyr

405 432

ATG TCA CAA ATG CTT ATC GAT GCC GAT GCC ATC ACC AAA ATT CGT CGT CGA AAG MET Ser GIn MET Leu He Asp Ala Asp GIy He Thr Lys lie Arg Arg Arg Lys

459 486

CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAA GGT GAC GGA TCG (5AC Leu Lys Pro Thr Arg Phe GIu Arg GIu Leu Phe GIy GIu GIy Asp GIy Ser Asp

513 540

TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC TGG GCG GAG Leu Gin VaI AIa Gin Thr Ser VaI GIy Arg VaI GIy AIa Leu Asn Cys Ala GIu

567 594

AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAG TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA CAT Asn Leu GIn Ser Leu Asn Lys Phe AIa Leu Ala Ala· GIu GIy GIu Gin He His

621 648

675 702

GGC GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG TCG GIy Ala He Asn Gin VaI Tyr Ala Ala GIu Thr GIy Thr Phe VaI Leu MET Ber

729 756

783 810

AAC CCG AAT CAG TAT CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC ATG Asn Pro Asn GIn Tyr Leu GIy GIy GLy Tyr AIa Arg He Tyr GIy Pro Asp MET

2 640 4

837 864

CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC GAG

Gin Leu Lys Ser Lye Ser Leu Ser Pro Thr GIu GIu GIy He VaI Tyr Ala GIu

891 918

ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC

He Asp Leu Ser MET Leu GIu Ala AIa Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr GIy His

945 972

TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATT AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG

Tyr Ser Arg Pro Asp VaI Phe Ser VaI Ser He Asn Arg GIn Arg Gin Pro AIa

999 1026

GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCG AGA GCA GCA TGC GAG

VaI Ser GIu VaI He Asp Ser Asn GIy Asp GIu Asp Pro Arg Ala Ala Cys GIu

1053 1080

CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGG GTT GTA CCC

Pro Asp GIu GIy Asp Arg GIu VaI VaI He Ser Thr Ala He GIy VaI Leu Pro

1107 1134

CGT TAT TGC GGA CAT TCC TAA TAA AAA GAG ACA CGT TGT ACC AAA GGG GTG TTC

Arg Tyr Cys GIy His Ser Lys GIu Thr Arg Cys Thr Lys GIy VaI Phe

1161

1188

ATG TCC AGA CGC AGA AAA TAT AGC CCA GAG TTA AAA CGC GAA GCC ATC GCT TTA MET Ser Arg Arg Arg Lys Tyr Ser Pro GIu Seu Lys Arg GIu Ala He AIa Leu

1215

ACC CGT C Thr Arg His

? 8 4 O 4

Reinigung des Wildtyps und der modifizierten Nitrilase

Nitrilase wurde aus E. coli MM 294-Zellen in der stationären Phase, die pBrx9, pBrxi 1 oder pBrx28-Plasmide enthielten, erhalten. Die Kulturen wurden unter Amp: :illin-Selektion gezüchtet, bis die Bestimmung auf Nitrilase in den Gesamtzellen einen ODg^Q-Wert von etwa 2,0 zeigten. Die Kulturen wurden bei 8000 g 15 min bei 4 ⁰C zentrifugiert. Die Zellen wurden in 0,1 mol/1 Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 gewaschen, zu Kügelchen geformt, getrocknet und bei - 20 ⁰C gefroren. Die Kügelchen wurden bei 4 ⁹C aufgetaut und in ml 50 mol/1 Kaliumphosphatpuffer, 1 mmol/1 Dithiothreit und 0,1 mmol/1 EDTA (KDE) wieder suspendiert. Die Zellsuspension wurde durch eine französische Presse geleitet und bei 60.000 g 40 min bei 4 ⁰C zentrifugiert. Der Überstand (Rohextrakt) wurde mit KDE-Puffer auf eine Proteinkonzentration von 12 mg/ml (Fraktion I) verdünnt. Der Rohextrakt wurde mit Ammoniumsulfat fraktioniert, die 25 bis 35 %-Fraktion (Fraktion II) enthielt 85 % der Nitrilaseaktivität. Diese Fraktion wurde in 10 ml KDE-Puffer suspendiert und ausgiebig gegen diesen Puffer

Die Fraktion II wurde weiter in einer DEAE-Sephadex A-50-Säule (4,9 cm^a χ 40 cm), die in KDE-Puffer equilibriert worden ist, gereinigt. Der Nitrilasegipfel wurde mit einem NaCl-Gradienten von 0,1 bis 0,4 mol/1 in KDE-Puffer eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt (Fraktion III), mit Ammoniumsulfat ausgefällt und in 25 mmol/1 Histidin, pH 6,2, dialysiert. Eine Pharmacia-Chromatofokussier-Säule (Ί ,75 cm^a χ 20 cm) wurde mit Polypuf fer 94 Austausch-

haiz (PBE 94), das mit 25 mmol/1 Histidin, pH 6,2, equilibriert worden ist, hergestellt. Die Säule wurde zuerst mit Polypuffer 74, pH 4,0 zur Herstellung eines pH-Gradienten von 6 bis 4 gewaschen, dan ι wurde das Enzym mit 1 mmol/1 NaCl eluiert. Der die aktiven Enzymfraktionen enthaltende Gipfel wurde mit Ammoniumsulfat ausgefällt und in KDE (Fraktion IV) dialysiert. SDS-PAGE auf einem 1Ί ,25 %-igen Gel zeigte eine starke Bande bei einer Molekülmasse von etwa 37.000 und eine schwache Verunreinigung bei einer Molekülmasse von etwa 70.000.

Die Überprüfung mit dem Densitometer zeigt, daß das Nitrilasepräparat der Fraktion IV zu 99 % homogen ist.

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse der Reinigung und die Eigenschaften der gereinigten Nibrilaseprodukte angegeben.

Ί84048

Vergleich der Reinigung und der Eigenschaften des Wildtyps und der modifizierten Bromoxynil-spezifischen

Nitrilasen

nit-wt

nit-11

nit-23

Ammoniumsulfat-Fraktion	25-35 %	10-25 %	20-35 's
DEAE-Sephadex-Elution	270 mmol/1	150 mmol/1	290 mmol/1
Chromatofokussierende Elution,pH6-4-Gra- dient, mit 1 mol/1 NaCl aewaschen	1 mol/1 NaCl	pH 4,6	1 mol/1 NaCl
Spezifische Aktivität	25,7	55	19,7
Reinigung (x)	10,3	16,4	35,8
Km (mol/1)	0,31	0,05	0,11
Vmax vpmol/min/mg)	15	36	9
Aktive Enzymform	dimer	multimer	dimer

Nach den oben angegebenen Verfahren können Pflanzen erhalten werden, die Bromoxynil-resistent sind und im Feld in Gegenwart von Bromoxynil verwendet werden können, ohne daß ihr Wachstum beeinträchtigt wird.

Erfindungsgemäß ist es nun möglich, die Pflanzen dadurch zu verbessern, daß sie gegenüber Herbiziden und insbesondere gegenüber spezifischen Benzonitril-Herbiziden resistent gemacht werden. D.h., das die Nitrilase codierende Gen kann in einen Pflanzenwirt eingeführt werden, wodurch das Gen exprimiert wird und der Pflanze Benzonitril-Resistenz verleiht. Zusätzlich kann das Enzym durch Klonen des Gens in einem geeigneten bakteriellen Wirt,in dem das Enzym expri-

miert wird, produziert werden. Enzyme mit einer zu überprüfenden Aktivität finden vielerlei Anwendungen, z.B. in Versuchen zum Nachweis bestimmter Substanzen oder des Benzonitrilsubstrats. Außerdem können die Enzyme und die die Enzyme exprimierenden Bakterien zur Entfernung der Benzonitril-Herbizide aus verunreinigten Böden eingesetzt werden.

Obwohl die Erfindung eingehend erläutere und die Beispiele zum Verständnis angeceben worden sind, können gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der Ansprüche erfolgen.

E. coli MM294 (pBrx5) wurde bei A.T.C.C. am 22. Januar 1986 unter der Hinterlegungsnummer 5342 3 hinterlegt.

E. coli MM294 (pBrx11) wurde bei A.T.C.C. am 18. Juni 1987 unter der Hinterlegungsnummer 67441 hinterlegt.

E. coli MM294 (pBrx23) wurde bei A.T.C.C. am 18. Juni 1987 unter der Hinterlegungsnummer 67442 hinterlegt.

Claims

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Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer Pflanzenzelle bzw. eines Pflanzenteils oder einer Pflanze mit einer derartigen Pflanzenzelle, gekennzeichnet durch Einführen in die Pflanzenzelle, den Pflanzenteil oder die Pflanze eines Gens, das eine Nitrilase aus Bakterien mit etwa 34 kDal codiert, die im wesentlichen für 3,5-dihalogeniertes p-Hydroxybenzonitril spezifisch ist und eine spezifische Aktivität von mindestens etwa 0,1 ,umol NH^/min/mg Protein mit Bromoxynil als Substrat aufweist und durch mindestens eine Substitution, Abspaltung oder Extension von insgesamt nicht mehr als 50 Aminosäuren modifiziert worden ist, wobei das Gen Teil einer funktioneilen Expressionskassette mit in Transkriptionsrichtung einer Transkriptions- und Translations-Start-Regulatorregion ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch. Verwendung einer Expressionskassette, die außerdem den rechten Rand der T-DNA enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,"gekennzeichnet durch Verwendung einer Expressionskassette, in der die Transkriptions- und Translations-Start-Regulatorregion die Regulatorregion für die Transkription eines Opins ist.

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