DE69006014T2

DE69006014T2 - Verfahren zum einfrieren von roten blutkörperchen.

Info

Publication number: DE69006014T2
Application number: DE90902326T
Authority: DE
Inventors: Susan Helen Bell; Stuart Graham Nash; Ernest Sidney Parry; Michael John Glynn Thomas
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 1989-02-08
Filing date: 1990-01-31
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2010-02-01
Also published as: CN1049103A; PT93099B; GR1000381B; NO179435C; NO913070D0; BR9007103A; ES2062509T3; DK0457782T3; HUT59609A; FI100382B; PT93099A; AU638229B2; NO913070L; ATE99948T1; NZ232347A; GB2245144B; JP2747114B2; GR900100082A; RU2073972C1; GB2245144A

Description

Die Erfindung betrifft das Einfrieren roter Blutkörperchen (Erythrocyten) zur Langzeitlagerung in einer solchen Weise, daß sie für Bluttransfusionen geeignet bleiben.
Die Lagerung von Blut zur Verwendung für Transfusionen ist allgemein bekannt. Blut wird gewöhnlich in gekühltem Zustand bei einer Temperatur von 4 ºC gelagert, bei der es eine maximal nutzbare Lebensdauer von ungefähr 5 Wochen hat. Die Aufrechterhaltung angemessener Vorräte erfordert daher eine kontinuierliche Zusammenarbeit mit Spendern. Bedauerlicherweise gibt es Zeiten, wie beispielsweise um die Weihnachtszeit, in denen die Vorräte knapp werden können. Es gibt auch Situationen, in denen aufgrund schwerwiegender Unglücke in bestimmten Gebieten die Vorräte knapp werden. Ferner wünscht eine steigende Anzahl von Menschen das eigene Blut zu lagern, beispielsweise vor geplanten Operationen. Es besteht deshalb ein Bedarf nach einem Verfahren zur Langzeitlagerung von Blutvorräten.
Eine Langzeitlagerung von Blut wird durch Einfrieren des Blutes bis zu sehr tiefen Temperaturen möglich, bei denen es dann gelagert wird. Unglücklicherweise hat es sich herausgestellt, daß es unmöglich ist, das Blut, so wie es gespendet wird, einzufrieren. Es ist üblich, Blut in Standardeinheiten von ungefähr 450 ml zu lagern, was dem Volumen entspricht, das von einem Spender bei einer einzelnen Spende abgegeben wird. Patienten, die Transfusionen erhalten, bekommen gewöhnlich ganzzahlige Vielfache solcher Einheiten. Das Einfrieren eines derartigen Blutvolumens führt zur Hämolyse der roten Blutkörperchen, wodurch das Blut für eine zukünftige Verwendung bei Transfusionen unbrauchbar wird. Die Hämolyse führt zur Freisetzung von Kalium, das cardiotoxisch ist, und von Stroma (Zellbruchstücken), die ein Nierenversagen verursachen können. Es wird allgemein angenommen, daß, um für Bluttransfusionen verwendbar zu sein, die roten Blutkörperchen nicht wesentlich mehr als 1 % hämolysierte Bestandteile aufweisen dürfen. In einem Verfahren, mit dessen Hilfe Blut durch Einfrieren gelagert werden kann, wird das Blut zentrifugiert, um Plasma und Blutplättchen von den roten Blutkörperchen abzutrennen, die roten Blutkörperchen werden mit einem Gefrierschutzmittel gemischt, worauf das Gemisch, normalerweise unter Verwendung von Stickstoff, auf eine sehr tiefe Temperatur abgekühlt wird. Allgemein wird Glycerin als Gefrierschutzmittel verwendet. Leider ist Glycerin toxisch, und die Vorbereitung der roten Blutkörperchen zur Verwendung bei Transfusionen erfordert mehrere Waschvorgänge, um das Glycerin zu entfernen. Das ist ein Verfahren, das eine teure Ausrüstung, einen hohen Ausbildungsstand, Erfahrung und ständige Praxis auf Seiten des eingesetzten Personals sowie einen hochsterilen Bereich erfordert. Der Waschvorgang dauert etwa 20 Minuten pro Einheit und führt zu einem Verlust an Blutkörperchen von 15 bis 20 %. Ein geeigneteres Gefrierschutzmittel ist Hydroxyethylstärke (HES) (Laevosan)
US-PS-3 758 382 beschreibt, wie 55 ml Vollblutproben, die ein Anticoagulans (angesäuerte Citrat-Dextrose) enthielten, mit HES einer Konzentration von 40 % (G/V) eines mittleren Molekulargewichtes von 40.000 bis 70.000 derart gemischt wurden, daß die endgültige Konzentration der HES 12 : 14 % (G/V) betrug. Das Gemisch wurde bei -190 ºC in flüssigen Stickstoff eingetaucht und mit 200 Umdrehungen pro Minute bis zum Einfrieren gerührt. Nach einer Lagerung von bis zu einer Woche bei einer Temperatur von -140 ºC wurde das Gemisch zum Auftauen 60 Sekunden lang in ein Wasserbad einer Temperatur von 47 ºC eingetaucht und mit 160 Umdrehungen pro Minute gerührt. Es wurde eine Wiedergewinnungsausbeute von bis zu 99 % (mittlere Ausbeute 97,4 %) erzielt. Die zum Einfrieren verwendeten Volumina, nämlich 55 %, sind lediglich Fraktionen von Standardeinheiten und würden unerwünschte Komplikationen hervorrufen, wenn sie bei den herkömmlichen Transfusionsverfahren eingesetzt würden.
Als eine Weiterentwicklung dieses Verfahrens, die das Einfrieren von Standardeinheiten Blut erlaubt, beschreibt US-PS-4 018 911 ein Verfahren zum Einfrieren von Blut unter Verwendung von HES eines mittleren Molekulargewichts von 150.000. Das Blut wird zur Abtrennung des Plasmas und der Blutplättchen von den roten Blutkörperchen zentrifugiert, ein Teil des Plasmas wird mit HES gemischt. Der Grund für den Zusatz von Plasma ist, daß angenomnen wurde, das Plasma sei zum Schutz der roten Blutkörperchen notwendig. Das Gemisch aus Plasma und HES wird dann mit dem annähernd gleichen Volumen an Blutkörperchen gemischt, so daß der Anteil der HES im sich ergebenden Gemisch ungefähr 14 % beträgt. Eine Standard-Spendereinheit von 450 ml ist zu diesem Zeitpunkt auf etwa 405 ml reduziert worden.
Das Gemisch aus Plasma und HES wird zu den roten Blutkörperchen in einen Gefrierbeutel gegeben, und der Beutel wird nach einem weiteren Mischen in einer Halterung angebracht, die an einer Pendelschüttelmaschine befestigt ist. Die Halterung besteht aus zwei gelochten Metallseitenplatten, die schwenkbar miteinander verschraubt sind, zwischen denen der Blutbeutel mit einer von den Seitenplatten aus rostfreier Stahl verliehenen dynamischen Elastizität derart gehalten wird, daß ein im wesentlichen gleicher Querschnitt während des Einfrierens aufrechterhalten wird. Der im wesentlichen gleichbleibende Querschnitt ermöglicht das rascheste Einfrieren, wobei die Stahlplatten den Beutel während des Schüttelns im wesentlichen starr halten. Der Beutel und die Halterung werden senkrecht in flüssigen Stickstoff eingetaucht und während des Einfrierens des Inhalts geschüttelt. Das Schütteln ist beim Einfrieren einer Einheit von 405 ml wegen des Volumens der Einheit notwendig, und weil ein rasches Einfrieren aus dem Grunde erforderlich ist, um eine Hämolyse der roten Blutkörperchen auf ein Minimum zu beschränken. Zum Zweck einer Transfusion wird das Blut durch Eintauchen in ein Wasserbad einer Temperatur von im wesentlichen 54 ºC unter mechanischem Schütteln, das im wesentlichen 1 Minute dauert, aufgetaut. Nach dieser Behandlung kann das Blut sofort für Transfusionen eingesetzt werden (vorausgesetzt, daß der Hämolysegrad annehmbar ist) , was der Hauptvorteil dieses Verfahrens im Vergleich zu mit Glycerin eingefrorenen Einheitsmengen Blut ist. Das beruht darauf, daß das extrazelluläre Gefrierschutzmittel HES nicht toxisch und nicht immunogen ist, und, da es dem körpereigenen Glycogen ähnlich ist, muß es nicht entfernt werden.
US-PS-4 018 911 beschreibt ein Testverfahren für unter Anwendung dieses Verfahrens gefrorene Proben eines Volumens von nur 25 ml, in dem ein Mittelwert von 99,2 % der roten Blutkörperchen im Zustand nach dem Auftauen wiedergewonnen wurde und 87,3 % in einer isotonischen Salzlösung nach einem halben Stunde stabil waren. Für Standardeinheiten in voller Größe waren die Ergebnisse jedoch viel schlechter und wiesen eine Wiedergewinnungsausbeute der Blutkörperchen von 97,2 % und eine Salzstabilität von 75,7 % auf.
Die Verwendung von HES als Gefrierschutzmittel zur Gefrierkonservierung von Erythrocyten, Thrombocyten, Leukocyten, Knochenmarkszellen und Zellen anderer Organe ist in GB-A-2 046 772 beschrieben. Die Zellen werden beispielsweise durch Zentrifugieren, Zellseparieren, Filtrieren oder Adsorbieren voneinander getrennt. Eine kurze Beschreibung eines Gefrierverfahrens für Erythrocyten betrifft das Abtrennen von Zellen durch Zellseparation (im Unterschied zum Zentrifugieren, vermutlich, um etwas Plasma bei den Zellen zu belassen) und den Zusatz von HES in Form einer 10-prozentigen Lösung in einem Verhältnis von 2:3 (HES : Erythrocytenkonzentration) . Es werden Wiedergewinnungsausbeuten von 95 bis 98 % angegeben.
Diese Dokumente vom Stand der Technik zeigen, daß es möglich sein könnte, durch Verwendung von HES als Gefrierschutzmittel rote Blutkörperchen in sehr kleinen Packungen (25 ml in US-PS-4 018 911) und mit annehmbaren Hämolysepegeln zu lagern und wiederzugewinnen. Es ist jedoch bisher nicht möglich gewesen, rote Blutkörperchen in solchen Mengen zu lagern und wiederzugewinnen, die mit den Transfusionstechniken kompatibel sind. Weiterhin ist die Streuung der Ausbeuten für nominell identische Proben unannehmbar hoch. Folglich hat es sich bisher als unmöglich erwiesen, ein Verfahren anzugeben, das annehmbar niedrige Hämolysegrade nach der Wiedergewinnung bei annehmbaren Abweichungen innerhalb der verschiedenen Grade ergibt, obwohl der potentielle Wert eines Transfusionsverfahrens, das mit dem Gefrierschutzmittel HES eingefrorene rote Blutkörperchen umfaßt seit langem bekannt ist.
Erfindungsgemäß umfaßt ein Verfahren zum Einfrieren roter Blutkörperchen unter Verwendung von HES als Gefrierschutzmittel Zentrifugieren einer Einheitsmenge Blut zur Abtrennung von Plasma und Blutplättchen von den roten Blutkörperchen, Mischen der roten Blutkörperchen mit HES und Einfrieren des Gemischs, dadurch gekennzeichnet, daß die roten Blutkörperchen vor dem Mischen ein gepacktes Zellvolumen von nicht weniger als 90 % aufweisen und die HES im Gemisch in einer Menge von nicht mehr als 7 % (G/V) , bezogen auf das Volumen der roten Blutkörperchen, vorliegt.
Das gepackte Zellvolumen oder Hämokrit ist eine auf diesem Gebiet allgemein bekannte Größe und ist, beispielsweise in John V. Davie und S.M. Lewis, Practical Haemotology, 6. Ausgabe, S. 32, Churchill Livingstone 1984, ISBN 044301981-9, definiert. Es sei angemerkt daß im Gegensatz zum Stand der Technik, beim erfindungsgemäßen Verfahren praktisch kein Plasma im Gemisch vorhanden ist. Auch werden, trotz des Verlustes jeglicher schützenden Wirkung, die durch das Plasma bewirkt werden könnte, beim erfindungsgemäßen Verfahren wesentlich geringere Prozentsätze der HES (G/V) bezogen auf das Volumen der roten Blutkörperchen, verwendet.
Neben dem Erzielen annehmbarer Hämolysegrade ergibt sich ein weiterer Vorteil des Verfahrens daraus, daß kein Plasma vorhanden ist und daß der Anteil der HES reduziert wird. Plasma enthält viele unterschiedliche Proteine, einschließlich der für die Blutgerinnung verantwortlichen Faktoren, von denen einer Faktor VIII ist. Es wurde festgestellt, daß wenn HES mit Plasma gemischt wird, bei einigen Proteinen, und speziell bei Gerinnungsfaktoren, Ergänzungskomponenten, Immunoglobulinen und Fibronectin Eine progessive Neigung besteht, unlöslich zu werden, wenn die Menge an HES zunimmt (S. Bell, Magisterarbeit (Technical Science), Bibliothek der Brunel University)
Diese Proteine bilden Aggregate, die das Plasma veranlassen, eine milchige Farbe anzunehmen. Wenn diese Aggregate in vivo oder in vitro auf unbehandeltes Plasma treffen, können sie als Keime für eine weitere Proteinaggreagation dienen, während HES gleichzeitig mit mehr Proteinen im frischen Plasma in Wechselwirkung treten kann. Die sich ergebende Zersetzung wird durch Makrophagen beseitigt und kcnnte zeitweilig die Immunabwehr des Patienten herabsetzen. Da Gerinnungsfaktoren und Fibronectin betroffen sind, könnte die Blutungszeit proportional zur Dosis der HES verlängert werden. Die HES liegt vorzugsweise in Form einer Lösung einer Konzentration von 40 % (G/V) vor und kann ein mittleres Molekulargewicht von 150.000 bis 200.000 aufweisen.
Eine bevorzugte Einheitsmenge basiert auf einer Standard-Spendereinheit von 450 ml und weist im wesentlichen 200 ml rote Blutkörperchen auf, die mit m wesentlichen 35 ml einer HES-Lösung einer Konzentration von 40 % gemischt werden, so daß sich eine Gesamteinheitsmenge zum Einfrieren von etwa 235 ml ergibt.
Die roten Blutkörperchen können vor dem Mischen mit HES vorzugsweise mit einem Anticoagulans und Aufbewahrungsmittel (wie beispielsweise Citrat-Phosphat-Dextrose-Adenin \,CPDA), Citrat-Phosphat-Dextrose (CPD) oder Heparin) behandelt werden.
Das Einfrieren findet vorzugsweise in flüssigem Stickstoff statt, wobei die Mischung in einem Gefrierbeutel enthalten ist, der von einem Rahmen gehalten wird, der zwei parallele gelochte Platten aufweist, zwischen denen sich der Gefrierbeutel befindet, wobei die Platten so ausgebildet sind, daß sie sich unter Beibehaltung ihrer Parallelität senkrecht zueinander etwas bewegen können.
Ein bevorzugter Rahmen weist Aluminiumplatten einer gekrümmten Form auf, wobei die Biegung ein Abschnitt mit entweder einer zylindrischen oder, vorzugsweise, sphärischen Form ist.
Es hat sich herausgestellt, daß das Gemisch im Gefrierbeutel während des Einfrierens sehr leicht zu örtlichen Verdickungen des Beutels neigt. Das Gemisch neigt dazu, sich beim Einfrieren auszudehnen, und die Gefrierrahmen vom Stand der Technik verbiegen sich entweder und es entstehen örtliche Ausbauchungen, um sich an diese Ausdehnung anzupassen, oder sie verhindern eine entsprechende Ausdehnung, was zu einem Druckschaden führt. Dadurch, daß eine senkrechte Bewegung der parallelen Platten möglich ist, wird eine örtliche Verdickung des gefrorenen Gemisches vermieden.
Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Volumen einer für das Einfrieren vorbereiteten Standardeinheit (235 ml) derart, daß es möglich ist, das Gemisch mit einer angemessenen Geschwindigkeit einzufrieren, ohne daß der Gefrierbeutel, wie das bei früheren Verfahren der Fall war, geschüttelt wird. Im Ergebnis wird wesentlich weniger Ausrüstung gebraucht und der Betrieb wird wesentlich vereinfacht, und es wird ebenfalls eine potentielle Ursache für eine Hämolyse (durch Schütteln verursachte physische Schäden an den Zellen) vermieden.
Nach dem Zentrifugieren werden die roten Blutkörperchen vorzugsweise direkt in einen Gefrierbeutel gegeben, in dem die HES aufbewahrt wird.
Das nach dem obigen Verfahren eingefrorene Blut wird vorzugsweise durch etwa zehnminütiges Eintauchen in warmes Wasser einer Temperatur von etwa 43,5 ºC ohne Schütteln für eine Transfusion vorbereitet (wodurch eine weitere Ursache für eine mögliche Hämolyse vermieden wird) , bis etwa die Temperatur des menschlichen Körpers erreicht ist.
Es hat sich herausgestellt, daß bei Anwendung des obigen Verfahrens zum Einfrieren und Auftauen einer auf einer Standard-Spendereinheit beruhenden Einheitsmenge Blut eine Ausbeute von 91 %, Standardabweichung + 0,75 %, und eine mittlere Wiedergewinnungsausbeute nach dem Auftauen von 99,1 %, Standardabweichung + 0,12 %, erzielt werden kann, die eine halbe Stunde lang gegen Salz stabil bleibt. Das Blut kann elf Minuten nach Entnahme aus der Lagerung in flüssigem Stickstoff bereit zur Transfusion sein.
Ein Verfahren zur Durchführung der Erfindung und eine Vorrichtung zur Verwendung mit der Erfindung wird im folgenden lediglich beispielhaft unter Bezug auf die beigefügten schematischen Darstellungen beschrieben. Es zeigen:
Fig. 1 schematische Darstellung des Arbeitsablaufs vom Empfang einer Standard-Spendereinheit bis zum Mischen der HES und der roten Blutkörperchen in einem Gefrierbeutel;
Fig. 2 Draufsicht auf eine Platte, die erfindungsgemäß in einem Gefrierrahmen verwendet wird;
Fig. 3 Draufsicht gemäß Fig. 1, die einen an der Platte angeordneten Gefrierbeutel zeigt, und
Fig. 4 Seitenansicht eines Abschnitts eines Gefrierrahmens mit einem darin angeordneten Gefrierbeutel.
Eine Standardeinheit Blut (450 ml) von einem Spender (nicht gezeigt) wurde durch einen Schlauch 10 (Fig. 1) in einen Lagerbeutel 11 gespendet, der ein Anticoagulans und ein Aufbewahrungsmittel (CPDA) enthält, der versiegelt und in einer Zentrifuge (nicht gezeigt) angeordnet wird. Durch das Zentrifugieren des Beutels 11 werden Plasma und Blutplättchen voneinander getrennt, sie werden herausgepreßt und fließen in einen Beutel 12.
Die roten Blutkörperchen (im wesentlichen 200 ml) die ein gepacktes Zellvolumen von nicht weniger als 90 % aufweisen, gelangen in einen Gefrierbeutel l3, der im wesentlichen 35 ml Hydroxyethy1stärke (HES) , vorzugsweise 40 % (G/V) , eines Molekulargewichts von 150.000 bis 200.000 enthält. Daraus ergeben sich etwa 25,5 % HES im die roten Blutkörperchen umgebenden und diese einbettenden Fluid, so daß die HES im Gemisch in einer Menge von nicht mehr als 7 % (G/V), bezogen auf das Volumen der roten Blutkörperchen, (vorzugsweise 6 % (G/V) bezogen auf das Volumen der roten Blutkörperchen) vorliegt.
Der Gefrierbeutel 13 hat eine flache, dünne, quadratische Form. Der Gefrierbeutel 13 wird dann entfernt, nach dem Ablassen der gesamten Luft eingesiegelt, und die HES und die roten Blutkörperchen werden beispielsweise durch manuelles Umdrehen und Drehen, das einige Minuten dauert, gemischt.
Das Verfahren von der Blutspende bis zum Einsiegeln des Beutels 13 hat unter sterilen Bedinungen zu erfolgen, vorzugsweise ist die Anordnung derart, daß die Verbindungen vom Schlauch 10 zum Gefrierbeutel 13 durchgängig und nicht unterbrochen sind und daß jedes Ablösen durch gleichzeitiges Ablösen und Abdichten aller Verbindungen erfolgen kann. Die generellen Verfahren des Zentrifugierens und Mischens der roten Blutkörperchen mit dem Lösungsmittel (HES) sind auf diesem Gebiet allgemein bekannt und in US-PS-4 018 911 beschrieben und brauchen daher hier nicht eingehend beschrieben werden.
Ein Gefrierrahmen (Fig. 2, 3, 4) weist 2 Platten 20, 21 auf, die beide jeweils im wesentlichen quadratisch und so gekrümmt sind, daß sie einen Abschnitt der Fläche einer Kugel bilden, wobei die Kugeln konzentrisch sind und die äußere einen etwa 3 mm größeren Radius als die innere aufweist. Die sphärische Form ist beispielsweise derart, daß in der Mitte einer Rahmensehne von 33 cm Länge die Versetzung 2 cm beträgt (es hat sich herausgestellt, daß diese Rahmengröße angemessen zum Einfrieren einer Standardeinheit Blut ist). Die Kanten der Platten 20, 21 weisen Flansche 22 auf, die es ermöglichen, die Platten relativ zueinander zu positionieren.
Jede Platte ist aus einem gut wärmeleitenden Material, vorzugsweise Aluminium, hergestellt und weist mehrere Löcher 23 (Fig. 2) auf, die im wesentlichen 50 % der Fläche einnehmen. Der Gefrierbeutel 13 wird auf der Platte 21 derart angeordnet, daß er vollständig von den gelochten Teilen der Platten umschlossen wird (s. Fig. 3) . Die zweite Platte 20 wird sodann über der ersten Platte 21 und dem Beutel 13 angebracht und durch eine Anzahl von Klemmen in Position gehalten, wie durch die Bezugsziffer 24 in Fig. 4 angegeben. Greifarme 25 jeder Klemme 24 weisen einen geringen Grad an Flexibilität auf und sind derart angeordnet, daß sie die Kanten der Rahmen 20, 21 an den Stellen ergreifen, die nicht über dem Gefrierbeutel 13 liegen.
Der Rahmen 20, 21 und der Gefrierbeutel 13 werden dann senkrecht in ein Gefäß (nicht gezeigt) mit flüssigem Stickstoff eingetaucht und das Gemisch aus HES und roten Blutkörperchen wird rasch innerhalb von etwa 30 Sekunden eingefroren. Es besteht bei dem Gemisch die Neigung, sich während den Einfrieren auszudehen, die Flexibilität der Greifarme 25 der Klemmen 24 ermöglicht es aber, daß sich die Platten 20, 21 leicht auseinanderbewegen, so daß die Ausdehnung wieder ausgeglichen wird. Die Krümmung der Platten 20, 21 verhindert jedoch, daß diese sich verbiegen, so daß ihre Parallelität zueinander an jedem Ort erhalten und die Dicke des Gefrierbeutels über seine gesamte Fläche konstant bleibt. Das hat sich als wesentlich herausgestellt, denn es hatte sich gezeigt daß die lokale Ausdehnung des Gefrierbeutels zu einer erhöhten lokalen Hämolyse führt.
Blut, das, wie oben beschrieben, eingefroren wird, kann bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs über einen beträchtlichen Zeitraum hinweg gelagert werden. Es wird für eine Transfusion nach der Entnahme aus dem Gefrierschrank, bevor es zur Transfusion verwendet wird, vorzugsweise durch zehnminütiges Eintauchen in warmes Wasser einer Temperatur von etwa 43,5 ºC ohne Schütteln vorbereitet, wobei während dieser Zeit die Temperatur vorzugsweise bis auf die Temperatur des menschlichen Blutes ansteigen darf.
Es hat sich herausgestellt, daß bei der Anwendung dieses Verfahrens Hämolysegrade erreicht werden, die nicht schlechter als 1 % sind, was eine wesentlich bessere Ausbeute roter Blutkörperchen bedeutet, als mit früheren Gefrier- und Vorbereitungsverfahren erreicht werden konnte.
Die folgende Tabelle 1 enthält Daten zu 10 Proben, die mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens eingefroren und wiedergewonnen wurden. Der verwendete Gefrierrahmen weist gelochte Flächen der Platten 20, 21, die eine Dicke von 0,9 mm haben, und nicht gelochte Kanten der Platten mit einer Dicke von 1,2 mm auf. TABELLE 1 QUALITÄTSKONTROLLE NACH DEM AUFTAUEN: 10 PACKUNGEN EINES GEMISCHES AUS HES (LAEVOSAN) UND BLUT SALZSTABILITÄT % 30 MIN. 2 STUNDEN MITTLERE SALZSTABILITÄT, 30 MIN.: STANDARDABWEICHUNG: WIEDERGEWINNUNG % MITTLERE WIEDERGEWINNUNG Die mittlere Plasmastabilität ist um 4 % höher als die Salzstabilität.
In der folgende Tabelle 2 finden sich wichtige Kennwerte, die zeigen, daß die Wirksamkeit der Sauerstoffzufuhr und das Überleben der roten Blutkörperchen unverändert sind oder durch das oben beschriebene Verfahren nicht signifikant beeinträchtigt werden. TABELLE 2 P50- UND DPG-ERGEBNISSE (P50 bedeutet Sauerstoffpartialdruck, DPG bedeutet Di(oder Bis-)Phosphoglycerat) Packung Nr. Frisches Vollblut in CPDA, < 24 h alt Mischung vor dem Einfrieren; rote Blutkörperchen Mischung nach dem Auftauen; rote Blutkörperchen Mittelwert Standardabweichung Einheiten
Aus den obigen Angaben geht somit hervor, daß ein Verfahren angegeben ist, mit dessen Hilfe Standardeinheiten roter Blutkörperchen mit einem reproduzierbaren Hämolysegrad aufbewahrt und wiedergewonnen werden können, der für Transfusionszwecke geeignet ist. Die Tatsache, daß das Standardvolumen auf etwa 235 ml reduziert ist, ist ein zusätzlicher Vorteil, denn er erlaubt es, daß einem Patienten während einer Transfusion mehr Einheitsmengen (das heißt, mehr rote Blutkörperchen) auf einmal zugeführt werden können.
Das Transfusionsgemisch ist im wesentlichen frei von Verunreinigungen, die äem Patienten schaden könnten, und die HES-Menge ist im Vergleich mit den in den Verfahren zum Einfrieren gemäß dem Stand der Technik eingesetzten Mengen reduziert.
Des weiteren ist das gesamte Verfahren wesentlich einfacher als es die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren sind, da keine Vorrichtungen benötigt werden, die den Gefrierrahmen und den Gefrierbeutel während des Einfrierens schütteln. Tatsächlich kann eine Bedienungsperson Blut einfrieren und braucht dafür nicht mehr Ausrüstung als ein Paar Schutzhandschuhe und eine Zange. Ebenso können das Auftauen nicht ausgebildete Volontäre durchführen, sie benötigen dafür nichts weiter als ein Eimer mit - nach ihrem Dafürhalten -handwarmem Wasser und - von ihnen geschätzte - zehn Minuten, und immer noch lassen sich ausgezeichnete Ergebnisse erzielen.
Es ist vorstellbar, daß der Umfang der Erfindung verschiedene Modifizierungen des oben beschriebenen Verfahrens und der Vorrichtung zuläßt. Die Platten 20, 21 dieser Beschreibung weisen eine sphärische Form auf, was natürlich ideal ist, sie können aber auch nur eine zylindrische Krümmung aufweisen oder es könnte irgendeine Winkelform ausreichend sein, wodurch die Parallelität der Platten beibehalten wird, während sie sich beim Einfrieren senkrecht zueinander etwas bewegen können. Außer Aluminiun könnten auch andere Materialien verwendet werden.
Es ist ebenfalls vorstellbar, daß das Verfahren, das, um mit den herkömmlichen Spende- und Transfusionspraktiken kompatibel zu sein, zur Verwendung mit Standardeinheiten Blut vorgesehen ist, auch für kleinere Einheiten verwendet wird. Beispielsweise kann es für die Vorbereitung von Faltbeutelchen, sehr kleinen BeuteIn mit, beispielsweise, 5 cm Kantenlänge, zur Lagerung für experimentielle Zwecke oder für Proben mit seltenen Blutgruppen angewendet werden.

Claims

1. Verfahren zum Einfrieren roter Blutkörperchen unter Verwendung von Hydroxyethylstärke (HES) als Gefrierschutzmittel durch Zentrifugieren einer Einheitsmenge Blut zur Abtrennung von Plasma und Blutplättchen von den roten Blutkörperchen, Mischen der roten Blutkörperchen mit HES und Einfrieren des Gemischs, dadurch gekennzeichnet,

daß die roten Blutkörperchen vor dem Mischen ein gepacktes Zellvolumen von nicht weniger als 90 % aufweisen und die HES im Gemisch in einer Menge von nicht mehr als 7 % (G/V), bezogen auf das Volumen der roten Blutkörperchen, vorliegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die HES in einer Menge von 6 % (G/V), bezogen auf das Volumen der roten Blutkörperchen, vorliegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die HES in Form einer Lösung einer Konzentration von 40 % (G/V) eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die HES ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von 150 000 bis 200 000 aufweist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Einheitsmenge Blut auf einer 450-ml-Standard-Spendereinheit basiert.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die roten Blutkörperchen vor dem Mischen mit HES mit einem Anticoagulans behandelt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Einfrieren in flüssigem Stickstoff erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Gemisch in einem Gefrierbeutel (13) befindet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Gefrierbeutel (13) während des Einfrierens in einem Rahmen gehalten wird, der zwei parallele Lochplatten (20, 21) aufweist, die gebogen sind und durch eine Einrichtung (24, 25) relativ zueinander positioniert werden, die eine geringe gegenseitige senkrechte Bewegung der Platten zueinander unter Beibehaltung ihrer Parallelität erlaubt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Platten (20, 21) sphärisch gekrümmt sind.

11. Verfahren na&h Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Platten (20, 21) zylindrisch gekrümmt sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Rahmen aus Aluminium hergestellt ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die gelochten Bereiche der Platten (20, 21) 0,9 mm dick sind.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht gelochten Ränder der Platten (20, 21) 1,2 mm dick sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Rahmen während des Einfrierens nicht geschüttelt wird.

16. Verfahren zum Einfrieren von roten Blutkörperchen, gekennzeichnet durch Zentrifugieren einer 450-ml-Standard-Spendereinheit Blut zur Entfernung von Plasma und Blutplättchen und Erzielung eines gepackten Zellvolumens an roten Blutkörperchen von nicht weniger als 90 %, das ein Volumen von im wesentlichen 200 ml einnimmt, Eindringen der roten Blutkörperchen in einen Gefrierbeutel (13), der im wesentlichen 35 ml einer HES-Lösung einer Konzentration von 40 % (G/V) enthält, wobei die HES ein mittleres Molekulargerwicht im Bereich von 150 000 bis 200 000 besitzt, Positionieren des Gefrierbeutels (13) in einem Rahmen, der zwei parallel gekrümmte Platten (20, 21) aufweist, die so ausgebildet sind, daß sie sich unter Beibehaltung ihrer Parallelität senkrecht zueinander etwas bewegen können, und Einsetzen des Einfrierrahmens in flüssigen Stickstoff und Belassen darin, bis das Gemisch aus HES und roten Blutkörperchen gefroren ist.

17. Verfahren zur Vorbereitung von roten Blutkörperchen, die nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 eingefroren wurden, zur Transfusion, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus HES und roten Blutkörperchen etwa 10 Minuten ohne Schütteln in warmes Wasser von etwa 43,5 ºC eingetaucht wird.