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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Plättchen-Faktoren
(Bestandteile von Granula der Thrombozyten) sowie eine Vorrichtung, welche die
Aktivierung von Thrombozyten menschlichen oder tierischen Ursprungs gestattet, die auf
oder in einem polymeren Gewebe eingelagert sind, zum Zweck des Erhalts in kurzer Zeit
und ohne das Risiko äußerer Verunreinigung von löslichen Molekülen, welche
biologische Aktivität aufweisen.
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Die Lösung der von den aktivierten Thrombozyten (auch "Plättchen" genannt)
freigesetzten Plättchen-Faktoren wird im folgenden mit dem Ausdruck "Überstand der aktivierten
Thrombozyten" bezeichnet.
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Bis heute wird der Überstand von aktivierten Thrombozyten herkömmlicherweise als
Ausgangsmaterial zur Reinigung von biologischen Molekülen verwendet wie
beispielsweise dem "platelet-derived growth factor" (PDGF), dem "Transforming growth factor
β" (TGFß), dem "basic fibroblast growth factor" (basischer FGF), dem Plättchen-Faktor
4, dem "platelet-derived endothelial growth factor" (PD-EGF), dem "Insulin-like growth
factor" (IGF), dem "connective tissue activating peptide III" (bindegewebsaktivierendes
Peptid III), dem β-Thromboglobulin, dem "epidermal growth factor" (EGF), dem
Plasminogen, dem Von-Willebrand-Faktor, dem Fibrinogen, dem Serotonin, dem
Histamin, dem Adenosindi- und -triphosphat, dem Fibronectin, dem Vitronectin, dem
Faktor XIII, proteolytischen oder glykolytischen Enzymen, Arachidonsäuremetaboliten
(siehe für eine Zusammenfassung: Inflammation and Repair, H. L. Wong & S. M.
Wahl, in: "Peptide Growth Factors and their Receptors", S. 510, Hrsg.: Sporn &
Roberts, Springer-Verlag, Berlin; Platelets and Response to Injury, R. A. Terkeltaub &
M. H. Ginsberg, in: "The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair", S. 38,
Hrsg.: Clark & Henson, Plenum Press, New York).
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Bestimmte Reinigungsverfahren sind bekannt und stellen Gegenstände von Patenten dar.
Hierzu sind inbesondere zu nennen: die EP-A-0 323 842, welche die Reinigung von
"Transforming growth factor β" (TGFß) betrifft, und die US-A-4 479 896, welche die
Reinigung des "platelet-derived growth factor" (PDGF) betrifft.
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Die Überstände von aktivierten Thrombozyten (oder eine Fraktion dieser Überstände)
kann therapeutisch verwendet werden beispielsweise aufgrund ihrer narbenbildenenden
Wirkung (D. Knighton et al., Ann Surg (1982) 196, 379-388; D. M. Carter et al., in:
"Growth factors and other aspects in Wound Healing, S. 303-317, Hrsg.: Barbul, Pines,
Cadwell, Hunt, Alan R. Liss Inc., New York 1988; US-A-4 760 131; WO 88/03 409;
WO 86/03 122; WO 89/05 656)oder auch in der Kosmetik, beispielsweise wegen ihrer
vorteilhaften Wirkung zur Bekämpfung der Alopezie (WO 90/07 931).
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Die in den Überständen aktivierter Thrombozyten enthaltenden Plättchen-Faktoren
können außerdem insbesondere bei der Behandlung von Geschwüren (Ulcera) verwendet
werden.
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Die bis heute beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Thrombozytenüberständen
sind langwierig (minimale Dauer von etwa 1h 30 min), mühsam (denn sie erfordern
Transfers von Röhrchen zu Röhrchen, die Zwischenschaltung von Zentrifugationen und
Pepitierungen) sowie praktisch unmöglich zu automatisieren; sie weisen außerdem das
Risiko von Kontaminationen des Produkts durch seine Umgebung (offener Transfer von
Flüssigkeiten) oder durch den Handhabenden des gehandhabten Produkts auf, wodurch
es potentiell mit übertragbaren Keimen verunreinigt wird.
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In der Tat gehen die Herstellungsverfahren von der Isolierung von Thrombozyten mittels
Trennung des Blutes mit Hilfe successiver Zentrifugationen aus. Diese werden dann
mittels Zentrifugation zum Entfernen von Plasma gewaschen (Isolation of platelets, in:
"Methods in Enzymology", Sektion I, S. 3-27, Bd. 169, Hrsg.: Hawiger, Academic
Press London, 1989; WO 86/03 122, US-A-4 760 131). Die gereinigten Thrombozyten
werden wiederum in Anwesenheit eines Aktivators suspendiert. Zahlreiche Aktivatoren
sind bekannt ("Platelets and Response to Injury", R. A. Terkeltaub & M. H. Ginsberg,
in: "The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair", S. 35-55, Hrsg.: Clark &
Henson, Plenum Press, New York). Man unterscheidet drei Typen von Aktivatoren:
starke Aktivatoren, die die Sekretion aller Granula induzieren können (Thrombin,
Collagen, der Calciumionophor A23187), intermediäre Aktivatoren wie Thromboxan A2,
ADP in Anwesenheit von Calciumionen, Adrenalin und schwache Aktivatoren, die die
granuläre Sekretion nicht induzieren können (Serotonin). Der am besten geeignete
Aktivator ist das Thrombin. Andere Aktivierungsverfahren nutzen physische Methoden
der Thrombozytenlyse mittels aufeinanderfolgender Frier- und Tauschritte oder mittels
Ultraschall. Der Thrombozytenüberstand wird mittels Zentrifugation und/oder Filtration
zum Entfernen von Thrombozytenmembranen und anderen unlöslichen Elementen
geklärt.
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Darüber hinaus sind bei den klassischen Verfahren Kontaminanten plasmatischen
Ursprungs schwierig zu entfernen und die aufeinanderfolgenden Waschschritte zielen auf
das Entfernen dieser plasmatischen Kontaminanten ab, haben jedoch eine Verringerung
der Ausbeute an Thrombozytenmolekülen zur Folge, sei es durch Verlust an
Thrombozyten oder durch partielle Aktivierung derselben. Schließlich ist das Plasma, in dem die
Thrombozyten suspendiert sind, schwierig für eine andere Verwendung
wiederzugewinnen.
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Die vorliegende Erfindung gestattet die Lösung der Probleme, die für die aktuellen
Verfahren der Herstellung von Plättchenüberständen dargestellt wurden, und diesen
inherent sind, wie das Risiko von Kontaminationen, die Verringerung der Ausbeute, die
Notwendigkeit von länglichen und schwierigen Manipulationen.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalt einer Lösung von Plättchen-Faktoren,
das einen Schritt der Aktivierung von Thrombozyten durch In-Kontakt-Bringen mit einer
Thrombozytenaktivator-Lösung umfaßt und in dem man eine Lösung von Plättchen-
Faktoren, die von den Thrombozyten während des Aktivierungsschritts freigesetzt
werden, gewinnt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Flüssigkeit, die eine Suspension
von Thrombozyten enthält, durch einen Filter laufen läßt, der die Thrombozyten
zurückhalten kann, den auf dem zurückgehaltenen Thrombozyten eine Aktivator-Lösung zusetzt,
und durch Filtration ein Filtrat abtrennt, das die Plättchen-Faktoren in Lösung enthält,
während die Thrombozyten auf dem Filter zurückbleiben.
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Es sei passend angemerkt, daß der Versuch, die Aktivierung der Thrombozyten zu
beherrschen, in dem man auf einem Filter arbeitet, nicht offensichtlich ist, da man
normalerweise eine spontane Aktivierung der Thrombozyten auf dem Filter erwarten
würde (siehe beispielsweise J. N. Lindon et al., Methods in Enzymology, Bd. 169, 104-
107 (1989)).
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Tatsächlich hat der frühere Stand der Technik das Ersetzen der klassischen
Zentrifugationsverfahren durch eine einfache Filtration nicht nahegelegt und man kann davon
ausgehen, daß dieses mit der Existenz eines Vorurteils gegen die Filtration in Beziehung
steht, weil man fürchtete, daß dieses eine frühzeitige spontane Aktivierung der
Thrombozyten hervorruft, die die Reinigung der Plättchen-Faktoren verhindert, daß heißt, deren
Abtrennung von einem wesentlichen Teil der plasmatischen Bestandteile. Tatsächlich
verbleiben im Falle der Spontanaktivierung die erzeugten Plättchen-Faktoren, die löslich
sind, bei den anderen plasmatischen Produkten, die durch den Filter durchtreten oder
zusammen mit dem Waschwasser durch den Filter durchtreten, das gegebenenfalls in
einem Reinigungsschritt nach dem Schritt der Aktivierung, der von einem Aktivator
eingeleitet wird, und in diesem Fall wäre der Aktivierungsschritt unwirksam, denn er
wäre sehr langsam oder würde den Erhalt der Plättchen-Faktoren mit sehr vorteilhafter
Ausbeute nicht gestatten.
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Man hat nunmehr entdeckt, daß es in oben genannter Form möglich ist, mit zahlreichen
bekannten Filtern, welche die im Handel erhältlichen Filter einschließen, die
Thrombozyten auf dem Filter zurückzuhalten, ohne daß eine spontane Aktivierung beobachtet wird,
die einen wesentlichen Verlust an Plättchen-Faktoren zur Folge haben kann. Die
passenden Filter können mittels einfacher Routineexperimente bestimmt werden. Man hat
entdeckt, daß es gleichermaßen möglich ist, nachdem man die Thrombozyten auf einem
Filter zurückgehalten hat, eine vorläufige Waschung durchzuführen, wonach die
Aktivierung mit Hilfe eines Aktivators provoziert wird, ohne hemmenden Verlust an
Plättchen-Faktoren. So kann man außerdem Preparationen von gereinigten Plättchen-Faktoren
erhalten, die geringe Mengen an plasmatischen Bestandteilen enthalten.
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Die Erfindung betrifft gleichermaßen eine Vorrichtung, welche die einfache Umsetzung
in die Praxis des vorstehend beschriebenen Verfahrens gestattet. Diese Vorrichtung, die
in Form einer geschlossenen Anordnung vorliegt, gestattet die Aktivierung der
Thrombo
zyten und den Erhalt einer Lösung der Plättchen-Faktoren in steriler Form ausgehend
von einer Flüssigkeit, die eine Suspension von Thrombozyten enthält, dadurch
gekennzeichnet, daß sie Mittel zum Filtrieren aufweist, die ein Filter umfassen, das
Thrombozyten zurückhalten kann, wobei das Filter in einer Umhüllung angeordnet ist und in der
Umhüllung eine stromaufwärts von einer stromabwärts gelegenen Partie abgrenzt, wobei
die stromaufwärts gelegene Partie der Umhüllung mit einer Leitung in Kommunikation
steht, die mit geeigneten Hilfsmitteln zum Öffnen und Schließen ausgestattet ist, und die
stromaufwärts gelegene Partie mit einem Reservoir verbindet oder die Verbindung
gestattet, welches die Ausgangsflüssigkeit enthält, und wobei die stromabwärts gelegene
Partie der Umhüllung mit mindestens einer Leitung kommuniziert, welche mit geeigneten
Hilfsmitteln zum Öffnen und Schließen ausgestattet ist und welche die sukzessive
Gewinnung des Filtrats der Ausgangsflüssigkeit und der besagten Lösung der
Plättchen-Faktoren gestattet, sowie durch die Tatsache, daß sie außerdem ein Reservoir aufweist, welche
den Aktivator der Thrombozyten enthält, wobei dieses Reservoir mit der stromaufwärts
gelegenen Partie so verbunden ist oder so verbunden werden kann, daß sie die
Einführung des Aktivators in Form einer Lösung in die stromaufwärts gelegene Partie
gestattet.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung liegt vorzugsweise in Form eines gebrauchsfertigen
Testkitts vor, der den Aktivator, sei es in Form einer Lösung in einem geeigneten
Reservoir, sei es in Form eines Pulvers enthält insbesondere im Falle des Thrombins. In
letzterem Fall rekonstituiert man die Lösung des Aktivators durch Zugabe eines
geeigneten flüssigen Trägers zum Pulver. Bei dem flüssigen Träger kann es sich um einen
sterilen Träger handeln, der in einem Trabantenbeutel enthalten ist. Die Lösung des
Aktivators kann man gleichermaßen mit einem üblichen, flüssigen Träger rekonstituieren
oder während des Betriebs hergestellt werden, wobei die Sterilisierung sichergestellt
wird, indem man die Transportrohre oder -schläuche der Aktivatorlösung mit einem
Sterilfilter ausstattet. Auf gleiche Weise kann mit der Waschlösung verfahren werden.
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Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung, die den Erhalt eines
Überstands 12 von aktivierten Thrombozyten gestattet, welche dadurch gekennzeichnet
ist, daß sie aufgebaut ist aus einem Filter 5 der Natur, daß es Thrombozyten zurückhält,
wobei das Filter 5 mit einem Teil stromauf über ein erstes Transportmittel 2 für
Thrombozyten in Suspension in einer Flüssigkeit 15 und ein zweites Transportmittel 4 mit einer
Lösung von Aktivatoren der Thrombozyten 7 und einem weiteren Teil stromab mit einem
Hilfsmittel zur Evakuierung 8 der Flüssigkeit der Suspension 13 und einem Mittel zur
Gewinnung 9 des Überstands 12 verbunden ist, wobei die Mittel reversibel durch
geeignete Mittel 6 verschließbar sind.
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Die Vorrichtung wird vorzugsweise vervollständigt mit einer Anordnung, durch die sie
stromauf mit einem Mittel zum Transport 3 einer Waschflüssigkeit 14, insbesondere
einem Waschpuffer, der ein Hilfsmittel enthalten kann, und stromab mit einem Mittel
zum Abzug 10 der gebrauchten Waschflüssigkeit 16 verbunden ist.
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Bei der Vorrichtung stellen die Mittel zum Transport der Thrombozyten in Suspension
in einer Flüssigkeit und der Lösung der Thrombozytenaktivatoren sowie gegebenenfalls
der Waschflüssigkeit Röhren oder Schläuche dar, die mit einem Reservoir verbunden
sind, welches die besagte Thrombozytensuspension, die besagte Thrombozytenaktivator-
Lösung bzw. die Waschflüssigkeit enthalten soll, wobei die Mittel zum Evakuieren oder
Abziehen wiederum Röhren oder Schläuche darstellen, die mit einem Aufnahmebehälter
verbunden sind, der die Flüssigkeit der Thrombozytensuspension nach der Filtration bzw.
die Waschflüssigkeit enthalten soll, und wobei die Hilfsmittel zur Wiedergewinnung eine
Röhre oder einen Schlauch darstellen, der bzw. die mit einem Aufnahmebehälter
verbunden ist, der den Überstand der aktivierten Thrombozyten enthalten soll.
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Die Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, die im allgemeinen zum
Einmalgebrauch bestimmt ist, verwendet vorzugsweise Reservoirs und Aufnahmebehälter, die
jeweils einen oder mehrere Transportbeutel, gegebenenfalls einfach gegenüber
angeordnet, oder Spritzen darstellen, die ebenfalls wegwerfbar sind. Bei den Mitteln zum
Verschließen handelt es sich um Klemmen, welche sich auf einem Schlauch aus
deformierbaren Kunststoff medizinischer Qualität verschließen, beispielsweise aus
Polyethylen.
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Die Vorrichtung kann vervollständigt werden durch Mittel zum Umgehen des Filters zum
Vermeiden von Kontaminationen des Filters durch den Inhalt der Beutel; das Mittel zur
Wiedergewinnung des Überstands ist mit einem Hilfsmittel verbunden, welches die virale
Belastung des Überstands verringern soll.
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Die verschiedenen Flüssigkeiten werden vorzugsweise mit Hilfe der Schwerkraft
transportiert oder mit Hilfe eines Pumpensystems beispielsweise vom peristaltischen Typ, und
die Anordnung ist abgeschlossen und steril.
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Wie vorstehend angezeigt, handelt es sich bei der flüssigen Suspension, welche die
Thrombozyten enthält, vorzugsweise um Gesamtblut menschlichen oder tierischen
Ursprungs oder eine Blutfraktion, angereichert mit Thrombozyten, insbesondere ein
Plasma oder ein mit Plättchen angereichertes Plasma.
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Bei der Aktivatorlösung der Thrombozyten oder Thrombozytenaktivator-Lösung handelt
es sich vorzugsweise um eine wässrige Lösung.
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Die Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung gestattet den Erhalt von Überständen
aktivierter Thrombozyten unter perfekt sterilen Bedingungen und zu Kosten, die mit
einer autologen Anwendung kompatibel sind.
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Die anderen Eigenschaften und Vorzüge des Verfahrens und der Vorrichtung gemäß der
Erfindung ergeben sich aus der Lektüre der folgenden detaillierten Beschreibung, unter
Bezugnahme auf die verschiedenen Annexes, in denen:
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- Fig. 1 in schematischer Weise eine spezielle Ausführungsform der Vorrichtung
der Erfindung und
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- Fig. 2 in schematischer Form eine spezielle Ausführungsform des
Filtrierungssystems, wie sie in Beispiel 6 unten beschrieben ist, darstellt.
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Die Vorrichtung 1 der vorliegenden Erfindung gestattet den Erhalt eines Überstands von
aktivierten Thrombozyten, wie sie in Fig. 1 beschrieben ist.
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Ein Filter 5, das zum Zurückhalten der Thrombozyten bestimmt ist, stellt den zentralen
Teil der Vorrichtung dar. Das Filtrationssystem kann beispielsweise aus einem Tiefen-
Filter oder einem mikroporösen Filter bestehen. Die Filtration kann frontal oder
tangential verlaufen.
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Ein Tiefen-Filtrationssystem kann beispielsweise aus einem nicht gewebten Polyester zum
Abtrennen von Leukozyten aus globulären Konzentraten bestehen (die Filter Erypur
Optima G-0 und G-2 der Firma Organon-Teknika, Fresnes, Frankreich; die Filter Pall
RC100 und RC50, Pall Biomedical, Paris; die Filter Sepacell R500, Asahi Medical,
Frankfurt/Main, Deutschland). Als Funktion ihrer Eigenschaften und ihrer Verwendung
halten diese Systeme 50 bis 100% an Thrombozyten zurück. Andere Filtermedien, die
insbesondere zur Retention von Thrombozyten konzipiert wurden, sind bekannt (EP-A-0
315 022).
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Bei einem mikroporösen Filtersystem kann es sich beispielsweise um eine Kartusche 21
aus Hohlfasern 20 handeln (cartouches A/G Technology, Microgon, Gambro, Enka, EP-
A-0 116 626), wie in Fig. 2 beschrieben. Die Filtration auf mikroporösen Medien wird
beispielsweise auf tangentiale Weise realisiert. Zum Umsetzen der tangentialen Filtration
in die Praxis wird ein Rohr oder Schlauch 19 mit beiden Enden der Fasern 20
verbunden. Eine Pumpe, beispielsweise eine peristaltische Pumpe 18, ist mit dem Rohr bzw.
Schlauch verbunden, um die Zirkulation des Retentats in den filtrierenden Fasern
sicherzustellen. Ein Schlauch 22, der mit einer Pumpe wie beispielsweise einer
peristaltischen Pumpe 17 ausgestattet und mit den Röhren bzw. Schläuchen stromauf und mit
19 verbunden ist, gestattet den Transport der zu filtrierenden Lösungen über 19. Ein
Schlauch 23, der mit der Kartusche 21 verbunden ist, stellt den Austritt des Filtrats dar.
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Das Filter 5 ist stromauf über ein Transportmittel 2 mit einem Aufnahmebehältnis
verbunden, welches eine biologische Flüssigkeit 15, angereichert an einer Suspension
von Thrombozyten, enthält, wobei es sich um ein mit Plättchen angereichertes Plasma,
buffy-coat, standardisierte Plättchenkonzentrate oder einheitliche Plättchenkonzentrate
handeln kann.
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Das Filter 5 ist stromauf gleichermaßen über ein Transportmittel 3 mit einem
Aufnahmebehälter verbunden, der eine Thrombozytenaktivator-Lösung 7 enthält. Bei dem
Aktivator kann es sich um Thrombin, Adenosindiphosphat, Collagen oder den
Calciumionophor A 23187 handeln.
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Darüber hinaus ist das Filter 5 stromab über ein Mittel zum Evakuieren oder Abziehen
8 mit einem Aufnahmebehälter verbunden, der die biologische Flüssigkeit 13 empfängt,
welche die Ihrombozyten in Suspension enthielt. Es ist gleichermaßen über ein Mittel
zur Wiedergewinnung 9 mit einem Aufnahmebehälter verbunden, der den Überstand der
aktivierten Thrombozyten 12 empfängt.
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Bei dieser Vorrichtung kann man ein Transportmittel 3 einer Waschflüssigkeit 14 der
Thrombozyten hinzufügen, wobei man die gebrauchte Flüssigkeit 16 über ein Mittel zum
Evakuieren oder Abziehen 10 in einen zur Aufnahme bestimmten Behälter abzieht.
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Die Reservoire und Aufnahmebehälter, welche 15, 14, 7, 8, 13, 16 und 12 enthalten,
stellen beispielsweise Transportbeutel dar wie die weichen Transportbeutel, die
üblicherweise zum Sammeln von Blutprodukten verwendet werden. Jedes der Transportmittel und
Mittel zum Evakuieren oder Abziehen kann ein Schlauch oder ein Rohr sein. Jeder
Schlauch kann beispielsweise mit Hilfe einer Klammer verschlossen oder abgeklemmt
werden.
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Die Anordnung der Bestandteile dieser Vorrichtung bilden einen geschlossenen Kreislauf
(Beutel, Schläuche, Nadeln, Verbindungsstücke, Filter, Lösungen), der vor der
Verwendung mit Hilfe geeigneter Mittel sterilisiert werden kann.
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Ein Anwendungsverfahren der Vorrichtung ist das folgende:
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Die Schläuche 3, 4, 9 und 10 sind verschlossen. Der Behälter, welcher die
Thrombozyten in Suspension 15 enthält, wird mit Hilfe der Schwerkraft (oder mit Hilfe eines
Pumpsystems auf Basis des Prinzips der Druckausübung auf den Schlauch oder den zu
entleerenden Beutel, wobei dieses mit den Stempeln steriler Spritzen in die Praxis
umgesetzt wird) über das Filter 5 in den aufnehmenden Beutel 13 entleert. Die Schläuche
2 und 8 sind versperrt. Die Schläuche 3 und 10 sind offen. Die Waschlösung 14 wird
mittels Schwerkraft nach Durchtritt durch das Filter 5 in den Beutel, der zum Aufnehmen
der gebrauchten Waschlösung 16 bestimmt ist, abgezogen. Die Schläuche 3 und 10 sind
versperrt und die Schläuche 4 und 9 sind offen. Der Beutel 7 wird mittels Schwerkraft
entleert und der erhaltene Überstand 12 wird in einem Beutel gesammelt. Danach werden
alle Schläuche versperrt.
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Bei der Verwendung eines tangentiellen Filtersystems transportiert eine peristaltische
Pumpe 17 die Lösungen 15, 14 oder 7 über den Schlauch 19. Eine peristaltische Pumpe
18 auf 19 stellt die Rezirkulation des Retentats in den filtrierenden Fasern sicher. Die
peristaltischen Pumpen sind während der gesamten Dauer des im vorstehenden
Paragraphen beschriebenen Betriebs in Bewegung.
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Bestimmte Varianten der Vorrichtung sind möglich. Zu nennen sind als Beispiel
folgenden Varianten:
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a) Ein Schlauch zur Umgehung des Filters, der eine Vorrichtung zum Verschließen
11 umfaßt, kann zum Zweck der Reinigung des Filters oder zum Vermeiden der
Ansammlung auf dem Filter eines Teils von 15, 14 oder 7 zugefügt werden.
Beispielsweise kann Gesamtblut in einer Spritze zentrifugiert, die Öffnung der
Spritze anstelle des Beutels, der 15 enthält, angeschlossen, die in der Spritze
sedimentierten Erythrozyten in die Umleitung gedrückt und der Plasmaüberstand
durch den Filter gedrückt werden.
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b) Die Sammlung von 16 kann in den Sammelbeutel 13 erfolgen.
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c) Der Sammelbeutel des Überstands 12 kann ein Excipienz welcher Natur auch
immer enthalten, sei es zum Zweck der Anreicherung des Plättchen-Überstands,
beispielsweise Hilfsmittel der Cicatrisation (Vernarbung) oder der Stabilisierung
oder auch zum Zweck der Verdünnung des Überstands in vorgegebenen Mengen.
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d) Jeder Beutel kann mit verschiedenen Vorrichtungen ausgestattet sein, wie
Entnahmestellen.
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e) Der Beutel zur Wiedergewinnung des Überstands 12 kann mit Entnahmesonden
vervollständigt werden oder auch mit kleineren Beuteln derart verbunden sein,
daß ein geschlossener Kreislauf der Verteilung möglich sei, in einer Weise, die
mit einer Verwendung des Produkts bei einer lang andauernden Behandlung
kompatibel ist. Die Verbindungsstücke der Schläuche können auf sterile Weise
hergestellt werden mit Hilfe von Anschweißmitteln, die zur Umsetzung aller
Planungen steriler Aufbauten bekannt sind, die an dem Betrieb des Mischens, der
Trennung oder Wiedergewinnung angepaßt sind.
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f) Der Überstand 12 sollte einen Schritt der Aktivierung von Viren über sich
ergehen lassen, sei es durch Pasteurisierung durch Immersion in ein Wasserbad
unter geeigneten Bedingungen, sei über neutralisierende Antikörper, über
Filtration (System Virosolve, entwickelt von Millipore, Bedford, USA; System
Asahi; System Pall), sei es mittels anderer Verfahren, die die Verringerung der
viralen Belastung bewirken und gleichzeitig eine ausreichende Aktivität des
behandelten Produkts erhalten. Das System der Virusinaktivierung kann auf die
Weise in die Praxis umgesetzt werden, daß es in die vorstehend beschriebene
Vorrichtung integriert wird, wobei infolgedessen der geschlossene Charakter der
Vorrichtung erhalten bleibt.
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g) Eine Matrix, die spezifisch bestimmte Moleküle des Thrombozytenüberstands
zurückhält, kann stromauf oder stromab des Sammelbeutels des Überstands 12
angeordnet sein, zum Zweck der Ausführung eines direkten Reinigungsschrittes
der biologischen Moleküle.
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Allgemein kann die gesamte Vorrichtung in eine Meßvorrichtung eingebaut werden,
wobei diese den geschlossenen Charakter der Anordnung aufrechterhält.
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Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, in denen
die Nummern 1 bis 16 Bezugszeichen von Fig. 1 und die Nummern 17 bis 23
Bezugszeichen der Fig. 2 darstellen.
Beispiel 1:
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a) Ein 400 ml-Transportbeutel (Baxter Referenz R 2074) wird steril mit 350 ml
einer Lösung Tris 0,04 M, HCl, pH 7,4, NaCl 0,15 M (14) gefüllt;
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b) Ein gleicher Beutel wird mit 250 ml der gleichen Lösung gefüllt und mit 1250 U-
NIH Rinderthrombin (Roche, Referenz 07 2846 2) 7 angereichert.
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c) Nach Abklemmen aller Schläuche wird ein Optima G2-Filter (Organon Teknika,
Fresnes, Frankreich) unter steriler Atmosphäre mit seinem rotem
stromaufwärtigem Ende mit einem Gemisch von 5 Standarts Plättchenkonzentration 15
verbunden, die in einem Transportbeutel wie bei (a) enthalten sind;
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d) Das weiße Ende stromabwärts des Filters wird mit dem enthaltenden Beutel 7
verbunden. Das Filter trägt stromabwärts zwei mit 1 und 2 nummerierte
Transportbeutel, die zur Aufnahme von 12 bzw. 13 und 16 dienen.
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e) Der Beutel enthaltend 15 wird von 5 auf 50 cm angehoben, der Beutel 2 in Bezug
auf den Filter der gleichen Höhe abgesenkt;
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f) Die Schläuche 2 und 8 werden geöffnet. Das Plasma 15 fließt in den Beutel 2 in
10 ± 5 Minuten ab;
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g) Die Schläuche werden erneut geschlossen;
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h) Unter steriler Atmosphäre wird der Beutel mit dem Inhalt 15 entfernt. Der Beutel
enthaltend 14 wird anstelle des Beutels enthaltend 15 angeschlossen. Die
Arbeitsgänge (e), (f) und (g) werden wiederholt;
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i) Die Schläuche 4 und 9 werden geöffnet und die Arbeitsgänge (e), (f) und (g)
wiederholt;
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j) Der Schlauch 9 wird durch Schweissen geschlossen und abgetrennt. 15 enthält
anfangs 318 · 109 Thrombozyten in 243 ml Plasma. Nach der Manipulation
enthalten 15 und 16 13,65 · 109 Thrombozyten. Das Filter hat deshalb 95,7
Thrombozyten zurückgehalten.
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Die Analysenergebnisse von 12 sind in Tabelle I aufgeführt.
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Das Thrombin kann durch eine äquivalente Lösung ADP ersetzt werden.
Beispiel 2:
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Die Anordnung wird wie in Beispiel 1 hergerichtet und verwendet mit folgenden
Abänderungen: 14 hat ein Volumen von 400 ml Puffer, der Beutel enthaltend 15 ist ein 800
ml Transportbeutel (Fenwal Referenz R 053) gefüllt mit einem Gemisch von drei
plättchenreichen Plasmas. Der Inhalt des Beutels 2 (13) wird kontinuierlich während der
Filtration der Plasmen in einen anschließenden Beutel von 800 ml überführt, der mit
Beutel 2 verbunden ist. Nach der Filtration wird 14 über das Filter in den Beutel 2
entleert.
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15 enthält anfangs 198,6 · 109 Thrombozyten in 782 ml Plasma. Nach Durchführung
enthalten 13 und 16 14,4 · 109 Thrombozyten. Das Filter hat deshalb 96,5%
Thrombozyten zurückgehalten. Die für 12 erhaltenen Analysenergebnisse sind in Tabelle I
aufgeführt.
Beispiel 3:
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Die Vorrichtung wird wie in Beispiel 1 hergerichtet und verwendet mit folgenden
Abänderungen: 14 hat ein Volumen von 360 ml Puffer, der 15 enthaltende Beutel umfaßt
ein Gemisch von 3 Leukoplättchen-Konzentraten (buffy-coat) 15.
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15 enthält anfangs 125 · 109 Thrombozyten. Die Tasche 2 enthaltend 13 und 16 enthält
nach der Durchführung 4, 8 · 109 Thrombozyten. Das Filter hat deshalb 96,16% der
Thrombozyten zurückgehalten.
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Die für 12 erhaltenen Analysen sind in Tabelle I aufgeführt.
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Dieses Beispiel zeigt, daß es mit erfindungsgemmmäßen Verfahren möglich ist, einen
hohen Anteil von Plasmaproteinen zu eleminieren, auch wenn von einem Leukoplättchen-
Konzentrat ausgegangen wird. Bekanntlich enthält Plasma mindestens ungefähr 0,3 g
freie Proteine pro 1 Millarde Plättchen.
Beispiel 4:
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Die Vorrichtung wird wie in Beispiel 1 hergerichtet und verwendet, mit folgenden
Abänderungen: Der 14 enthaltende Beutel enthält 464 ml Hepes-Puffer (12 g/l), NaCl
(5,8 g/l), Glucose (5,4 g/l), KCl (0,25 g/l) 14, der 7 enthaltende Beutel enthält 221 ml
des gleichen Puffers, der mit 221 U Humanthrombin 7 angereichert ist.
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Die Gesamtdauer der Durchführung beträgt 36 Minuten, davon 7 Minuten für die
Filtration der Standard-Plättchenkonzentrate, 14 Minuten für das Auswaschen des Filters
(Abfluß von 14) und 10 Minuten für die Aktivierung der Thrombozyten (Abfluß von 7)
über das Filter S. 98% der Thrombozyten werden auf dem Filter zurückgehalten.
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Die Analysenergebnisse für 12 sind in Tabelle I aufgeführt.
Beispiel 5:
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Der Aufbau wird wie folgt durchgeführt: Ein Sepacell-Filter R-500BI (ASAHI) wird
stromauf und stromabwärts mit Hilfe eines Apparates SCD IIB (DU PONT) mit einem
3-fach Schlauch verbunden, der mit einem Verschluß und einer Perforation ausgerüstet
ist. Sechs Beutel mit 400 ml (Baxter Ref. R 2074) werden einzeln auf jeder Perforierung
in der Weise montiert, wie die in der Figur beschriebene Vorrichtung zeigt. Die
stromabwärts angebrachten Beutel sind dazu bestimmt, 12 aufzunehmen, 13 und 16 sind leer.
Der Inhalt 15 in einem der stromaufwärtigen Transportbeutel ist ein Gemisch von fünf
Standart-Plättchen-Konzentraten. 14, enthalten im zweiten Transportbeutel stromauf
wärts, besteht aus 447 ml Hepes-Puffer, beschrieben in der Anordnung 4. 7, enthalten
in dem dritten Transportbeutel stromaufwärts, besteht aus 245 ml des gleichen Puffers,
angereichert mit 245 U Humantrombin.
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Filtern, Waschen und Aktivierung werden wie in Beispiel 1 durchgeführt.
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Da die gesamte Anordnung vollständig geschlossen ist, erfolgt die Durchführung in
vollständig steriler Atmosphäre.
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Die Gesamtdauer der Durchführung beträgt 41 Minuten (7 Minuten für die Filtration, 11
Minuten für das Waschen und 12 Minuten für die Aktivierung).
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Der Filter hat 89% der Thrombozyten zurückgehalten.
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13 enthält 175 ml Plasma, das an Plättchen arm ist und 87,5% des Gesamtvolumens des
filtrierten Plasmas ausmacht.
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Die für 12 erhaltenen Analysenergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt.
Beispiel 6:
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Die Anordnung wird wie folgt montiert: eine Patrone oder Kartusche aus Hohlfasern PF
2000 (GAMBRO) wird an die Schläuche in der Weise angeschlossen, daß das in Fig. 2
beschriebene Filtersystem realisiert wird. 22 ist mit den Schläuchen 2, 3 und 4
verbunden. 23 ist mit den Schläuchen 8, 9 und 10 so verbunden, daß die in Fig. 1 beschriebene
Anordnung entsteht. 15, enthalten in einem der stromaufwärtigen Transportbeutel, ist ein
Gemisch von drei plättchenreichen Plasmas, 14 der Inhalt des zweiten Transportbeutels
stromaufwärts besteht aus 740 ml Hepes-Puffer, wie in Beispiel 4. Dieser zweite
stromaufwärtige Beutel enthält außerdem etwa 200 ml steriler Luft zur Reinigung des Systems
am Ende des Waschvorgangs. 7, enthalten im dritten stromaufwärtigen Transportbeutel,
besteht aus 450 ml des gleichen Puffers, der mit 2000 U Human-Thrombin angereichert
ist. Die peristaltische Pumpe 17 sichert einen kontinuierlichen Ausstoß von 22 ml/min
und die peristaltische Pume 18 einen kontinuierlichen Ausstoß von 80 ml/min.
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Die Arbeitsgänge des Filterns, Waschens und der Aktivierung werden auf ähnliche Weise
wie in Beispiel 1 durchgeführt.
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Da die gesamte Anordnung vollständig geschlossen ist, erfolgt die Durchführung
vollständig unter steriler Atmosphäre.
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Am Ende der Durchführung konnte in 12, 13 und 16 kein Plättchen gefunden werden,
weshalb das Filter die Gesamtheit der Plättchen zurückgehalten hat.
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Die Analysenergebnisse für 12 sind in Tabelle I aufgeführt.
Beispiel 7:
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Man verwendet eine Hohlfaserkartusche (A/G TECHNOLOGY): Porosität: 0,2 um;
innerer Faserdurchmesser: 0,75 mm; Gesamtoberfläche der Filtrierung: 0,009 m². Ein
solches Filter erlaubt eine sterile Filtration, da es die Bakterien zurückhält. Die Montage
wird wie in Fig. 2 durchgeführt, wobei die Pumpe 17 entfällt. Die Leistung der Pumpe
18 beträgt 130 ml/min. Das Ausgangsprodukt ist ein plättchenreiches Plasma mit einem
Volumen von 195 ml. Die anderen verwendeten Produkte sind die gleichen wie in
Beispiel 6.
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Man arbeitet auf analoge Weise wie vorstehend in Beispiel 6.
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Ergebnisse: pro Milliarde Thrombozyten: 50,3 ug β-Thromboglobulin
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Volumen des aufgenommenen Plättchenextrakts: 156 ml
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Volumen der verwendeten Waschlösung: 184 ml
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Die Waschlösung enthält weniger als 1% (0, 89%) der Gesamtmenge des im
Plättchenextrakt enthaltenen β-Thromboglobulins, was bedeutet, daß keine vorzeitige Aktivierung
der Thrombozyten während des Waschvorgangs stattgefunden hat.
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Man kann das Thrombin durch ADP ersetzen.
Vorteile der Erfindung gegenüber klassischen Methoden
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Die in den Beispielen gezeigten Resultate erlauben es, folgende Vorteile zu erzielen:
Zeitersparnis:
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Gesamtdauer 30 bis 45 Minuten ausgehend von der Erhaltung des thrombozytenreichen
Plasmas anstelle einer Mindestdauer von 60 Minuten mit den klassischen Methoden.
Sterilität:
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Das Produkt der Aktivierung der Thrombozyten wird im geschlossenen Kreis erhalten,
wodurch Risiken der Kontamination von außen ausgeschlossen sind.
Schutz der durchführenden Person:
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Blut und seine Derivate sind potentiell gefährlich. Die durchführende Person kann in
keinem Fall in direkten Kontakt mit den Blutprodukten kommen.
Leichte Ausführbarkeit:
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Die Zahl der Verfahrensschritte wird beträchtlich vermindert. Die Verfahrensschritte
beschränken sich auf die einfachen Vorgänge des Transports der Flüssigkeiten im
geschlossenen Kreis.
Geringer Materialaufwand:
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Schutzbehälter oder sterile Räume werden nicht benötigt (Einsparung von Abzügen,
Handschuhboxen), Einsparung einer Zentrifuge, Schläuchen und verschiedener
Einwegmaterialien.
Endprodukt von besserer Qualität:
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Die Thrombozyten werden wesentlich besser gewaschen, verglichen mit
aufeinanderfolgenden Zentrifugationen. Als Folge sind Plasmaproteine in wesentlich schwächeren
Konzentrationen vorhanden. Auf der anderen Seite verunreinigen die auf dem Filter
zurückgehaltenen Thrombozytenrückstände das Endprodukt nicht.
Erhöhte Ausbeute:
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Hauptsächlich an β-Thromglobulin und an "Transforming growth factor β" aufgrund
einer kürzeren Behandlungszeit und dem Fehlen von Zentrifugationen, die eine partielle
Degranulierung der Thrombozyten bewirken.
Bessere Gewinnung von Plasma:
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Mindestens 85% des Ausgangsplasmas kann steril wiedergewonnen und für andere
Zwecke verwendet werden.
Mögliche direkte Verwendung von Gesamtblut oder seiner Fraktionen
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Wie Leukoplättchen-Konzentraten, da die Filter die Thrombozyten spezifisch und keine
Erythrozyten zurückhalten.
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Alle diese Vorteile verleihen der Anordnung einen vorteilhaften Charakter bei der
Herstellung eines Überstandes aktivierter Thrombozyten.
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Die Anwendungsmöglichkeiten des erfindungsgemäß erhaltenen Produkts sind die eines
Plättchenüberstandes, wie zum Beispiel:
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- Reinigung von Molekülen, die aus Thrombozyten stammen ("Transforming
growth factor β", "platelet-derived growth factor", etc.) zu Forschungszwecken,
Herstellung von Reagentien, Herstellung aktiver Prinzipien zur therapeutischen
Verwendung, etc.
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- Herstellung von Präparaten zur therapeutischen oder kosmetischen Verwendung,
im besonderen Herstellung von Hilfsstoffen zur Heilung von Gewebeschädigung
z. B. Narbenbildung der Haut.
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- Durchführung eines analytischen Tests für diagnostische oder prognostische
Zwecke, um den Inhalt von Thrombozytengranulaten eines Individuums zu
bestimmen.
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Tabelle I
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Analysenresultate erhalten für Überstände aktivierter Thrombozyten, wie sie gemäß den
Beispielen 1 bis 6 erhalten wurden und Mittelwerte, für eine Reihe von zehn
Manipulationen, ausgeführt gemäß dem Protokoll der Patentanmeldung WO 86/03 122.
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* Thrombozyten
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(1) bestimmt nach der Methode von Bradford (Reagens Biorad Ref: 500-0006)
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(2) β-Thromboglobulin, bestimmt gemäß Dosierung ELISA (Stago Ref: 0419)
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(3) "platelet-derived growth factor", bestimmt gemäß Dosierung ELISA
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(4) "Transforming growth factor β", bestimmt nach Erwärmen auf 60ºC während
10 Stunden nach der Technik der Klonierung in Agar (Assoian et al., J. Biol.
Chem., 258, 7555 (1983))
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(5) Der mitogene Aktivitätswert entspricht der Verdünnung der Probe nach 24
Stunden Stimulierung die Hälfte der maximalen Inkorporation von tritiertem
Thymidin in 3T3-Zellen (Clon A31) bei Konfluenz induziert.