DE69006018T2

DE69006018T2 - Impfung und methoden gegen krankheiten, die von pathologischen reaktionen der spezifischen t-zellen abstammen.

Info

Publication number: DE69006018T2
Application number: DE90905821T
Authority: DE
Inventors: Steven Brostoff; Dennis Carlo; Mark Howell
Original assignee: Immune Response Corp
Current assignee: Immune Response Corp
Priority date: 1989-03-21
Filing date: 1990-03-21
Publication date: 1994-05-11
Anticipated expiration: 2010-03-22
Also published as: DK0463101T3; JP3472297B2; AU672313B2; WO1990011294A1; EP0463101B2; FI914432A0; ES2062519T5; AU5356790A; AU7650096A; CA2046909A1; RU2138512C1; FI914432A7; NO913722L; EP0463101A1; AU6892694A; BG95337A; ES2062519T3; DE69006018D1; KR920700674A; BG61164B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Immunsystem und insbesondere Verfahren der Modifikation pathologischer Immunreaktionen.
Höhere Organismen sind gekennzeichnet durch ein Immunsystem, welches sie gegen einen Befall durch potentiell schädliche Substanzen oder Mikroorganisinen schützt. Wenn eine als Antigen bezeichnete Substanz in den Körper eintritt und als Fremdsubstanz erkannt wird, spricht das Immunsystem sowohl in Form einer Antikörper-vermittelten als auch einer zellvermittelten Antwort an. Die als B-Lymphozyten oder B-Zellen bezeichneten Zellen des Immunsystems produzieren Antikörper, die in spezifischer Weise die Fremdsubstanz erkennen und an diese binden. Andere, als T- Lymphozyten oder T-Zellen bezeichnete Lymphozyten bewirken und regulieren die zellvermittelte Antwort, was schließlich zur Ausschaltung des Antigens führt.
Bei der zellvermittelten Antwort sind verschiedene T-Zellen beteiligt. Einige induzieren bestimmte B-Zellklone zur Proliferation und Produktion von Antikörpern, die für das Antigen spezifisch sind. Andere erkennen und zerstören Zellen, die auf ihrer Oberfläche Fremdantigene aufweisen. Bestimmte T-Zellen regulieren die Antwort entweder durch Stimulieren oder Unterdrücken anderer Zellen.
Obgleich das normale Immunsystem streng reguliert wird, sind Veränderungen in der Immunreaktion nicht ungewöhnlich. In einigen Fällen spricht das Immunsystem in unpassender Weise an und reagiert auf eine Komponente des Wirtes, als wenn diese tatsächlich fremden Ursprungs wäre. Eine derartige Reaktion führt zu einer Autoimmunkrankheit, bei der das Immunsystem des Wirtes das wirtseigene Gewebe angreift. Derartige Autoimmunpathologien werden direkt oder indirekt von T-Zellen als den primären Regulatoren des Immunsystems hervorgerufen.
Es wird davon ausgegangen, daß zahlreiche Krankheiten auf autoimmune Mechanismen zurückzuführen sind. Unter ihnen sind bekannte Krankheiten die rheumatoide Arthritis, die systemische Lupus erythematodes, die Multiple Sklerose, der Typ I Diabetes, die Myasthenia gravis und der Pemphigus vulgaris. Weltweit sind Millionen von Individuen von Autoimmunkrankheiten betroffen und die Kosten dieser Krankheiten in Bezug auf die Behandlung, den Aufwand und den Verlust an Produktivität belaufen sich jährlich auf mehrere Milliarden Dollar. Gegenwärtig sind keine wirksamen Behandlungsweisen für derartige Autoimmunkrankheiten bekannt. Gewöhnlich können lediglich die Symptome behandelt werden, während die Krankheit weiter voranschreitet und häufig zu schwerer Schwächung oder zum Tode führt.
In anderen Fällen replizieren sich die Lymphozyten in unpassender Weise und ohne Kontrolle. Eine derartige Replikation führt zu einem als Lymphom bezeichneten krebsartigen Zustand. Wenn die unregulierten Lymphozyten dem T-Zell-Typ angehören, werden die Tumore T-Zell-Lymphome genannt. Wie auch im Falle anderer Malignitäten ist es schwierig, T-Zell-Lymphome in wirksamer Weise zu behandeln.
Demgemäß besteht seit langem ein Bedarf an wirksamen Mitteln zur Heilung oder Verbesserung T-Zell-vermittelter Pathologien. Eine derartige Behandlung sollte in idealer Weise eher die unpassende T-Zell-Antwort kontrollieren als nur die Symptome reduzieren. Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf und stellt gleichermaßen damit zusammenhängende Vorteile bereit.

Zusammenfassung der Erfindung

Durch die vorliegende Erfindung werden Impfstoffe und ein Mittel zur Impfung eines Säugers bereitgestellt, sodaß spezifische T- Zell-vermittelte Pathologien verhindert oder kontrolliert oder die unregulierte klonale Replikation von T-Zellen behandelt werden können. Der Impfstoff ist zusammengesetzt aus einem T- Zell-Rezeptor (TCR) oder einem Fragment desselben, welches mit einem TCR korrespondiert, der auf der Oberfläche von T-Zellen vorhanden ist, die diese Pathologie vermitteln. Das Fragment des Impfstoffes kann ein Peptid sein, welches mit Sequenzen von TCRs korrespondiert, die für die diese Pathologie vermittelnden T- Zellen charakteristisch sind.
Wege zur Bestimmung geeigneter Aminosäuresequenzen für derartige Impfstoffe werden ebenfalls aufgezeigt. Der Impfstoff wird dem Säuger in einer Weise verabreicht, durch die eine direkte Immunreaktion gegen den TCR von T-Zellen induziert wird, die die-Regulation oder Deletion der pathogenen T-Zellen und damit zur Abschwächung der Krankheitspathogenese.
Durch die Erfindung wird zusätzlich eine mit Vβ17 bezeichnete spezifische variable Region der β-Kette des T-Zell-Rezeptors bereitgestellt, die bei der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis (RA) von zentraler Bedeutung ist. Ferner werden Mittel zum Nachweis, zur Prävention und zur Behandlung der RA bereitge stellt.
Durch die Erfindung wird ferner eine zur Behandlung der Multiplen Sklerose (MS) geeignete spezifische Region eines T-Zell- Rezeptors bereitgestellt. Ferner werden Mittel zum Nachweis, zur Prävention und zur Behandlung der MS zur Verfügung gestellt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft Impfstoffe und deren Verwendung zur Prävention oder Verbesserung T-Zell-vermittelter Pathologien, wie Autoimmunkrankheiten und T-Zell-Lymphomen. Die Impfung führt zu einer spezifischen und andauernden Behandlung, durch die Probleme vermieden werden, die mit anderen potentiellen Therapieformen in Zusammenhang stehen.
Der hier verwendete Begriff "T-Zell-vermittelte Pathologie bezieht sich auf jedweden Zustand, in dem eine unpassende T- Zell-Antwort ein Bestandteil der Pathologie ist. Mit diesem Begriff sollen sowohl direkt durch T-Zellen vermittelte Krankheiten wie auch solch wie die Myasthenia gravis, welche in erster Linie durch eine aus der Antikörperbindung resultierende Schädigung gekennzeichnet sind, und ferner Krankheiten eingeschlossen sein, bei denen eine unpassende T-Zell-Antwort zur Produktion jener Antikörper beiträgt. Der Begriff soll sowohl T- Zell-vermittelte Autoimmunkrankheiten als auch unregulierte klonale T-Zell-Replikationen umfassen.
Der hier unter Bezugnahme auf die Aminosäuresequenz verwendete Begriff "im wesentlichen die Sequenz" bezieht sich auf die beschriebene Sequenz oder andere Sequenzen, die Additionen, Deletionen oder Substitutionen aufweisen, welche die Fähigkeit der Sequenz, eine Immunreaktion gegen die gewünschte T-Zell-Rezep torsequenz auszulösen, im wesentlichen nicht beeinflussen. Demgemäß kann ein Bereich der beschriebenen immunisierenden Sequenz verwendet werden, solange sie in ausreichender Weise für den gewünschten T-Zell-Rezeptor charakteristisch ist, um eine wirksame Immunreaktion gegen gewünschte T-Zell-Rezeptoren, nicht jedoch gegen unerwünschte T-Zell-Rezeptoren herbeizuführen. Derartige Variationen in der Sequenz können beispielsweise durch Synthese einer alternativen Sequenz leicht durchgeführt und beispielsweise durch Immunisieren eines Säugers zum Nachweis der Wirksamkeit untersucht werden.
Der hier verwendete Begriff "Fragment" umfaßt derartige Fragmente in Konjugation mit oder kombiniert mit zusätzlichen Sequenzen oder Gruppen, wie z.B. in den Fällen, wo das Pepitid mit anderen Aminosäuresequenzen oder einem Träger gekoppelt ist. Die Begriffe "Fragment" und "Peptid" können daher wechselseitig verwendet werden, da ein Peptid das häufigste Fragment des T-Zell-Rezeptors sein wird. Jedes Fragment der Erfindung kann eine veränderte Sequenz aufweisen, wie es bereits für den Begriff "im wesentlichen die Sequenz" beschrieben wurde.
Die Bezugnahme auf ein "Fragment oder Bereich des T-Zell-Rezeptors" bedeutet nicht, daß sich die Zusammensetzung aus intakten T-Zell-Rezeptoren ableiten muß. Derartige "Fragmente oder Bereiche" können auf verschiedenen, im Stand der Technik gut bekannten Weisen hergestellt werden, wie z.B. durch manuelle oder automatisierte Peptidsynthese oder durch Verfahren der Klonierung.
Der hier unter Bezugnahme auf die Beziehung zwischen den erfindungsgemäßen Peptidfragmenten und den Sequenzen von TCRs verwendete Begriff "korrespondierend mit" bedeutet, daß das Peptidfragment eine Aminosäuresequenz aufweist, welche in ausreichender Weise homolog mit der TCR-Sequenz ist, um eine wirksame regulatorische Reaktion in dem Individuum zu stimulieren. Die Sequenz braucht jedoch nicht mit der TCR-Sequenz identisch zu sein, wie in den Beispielen II und III gezeigt wird.
Mit dem Begriff "in immunogener Hinsicht wirksam" ist eine Menge des T-Zell-Rezeptors oder Fragments desselben gemeint, die wirksam ist, um eine Immunreaktion zur Prävention oder Behandlung einer T-Zell-vermittelten Pathologie oder einer unregulierten klonalen T-Zell-Replikation in dem Individuum auszulösen. Es liegt auf der Hand, daß derartige Mengen in Abhängigkeit vieler Faktoren von Spezies zu Spezies und Individuum zu Individuum variieren. Beispielsweise werden für eine wirksame Immunreaktion in einem Menschen im Vergleich mit einer Maus im allgemeinen höhere Dosierungen erforderlich sein.
Der hier verwendete Begriff "Vβ17" bezieht sich auf eine spezifische variable Region der β-Kette eines T-Zell-Rezeptors (TCR). Vβ17 besitzt die Aminosäuresequenz MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS. Die hypervariablen und verknüpfenden Regionen sind für Impfstoffe am besten geeignet. Eine besonders geeignete hypervariable Region von Vβ17 ist die Region CDR2 mit der Aminosäuresequenz SQIVNDFQK. Definintionsgemäß sind Modifikationen dieser Sequenz, die die Fähigkeit des Rezeptors, als Immunogen zur Stimulierung der gewünschten Immunreaktion zu wirken, nicht beeinflussen, ebenfalls eingeschlossen. Die variable Region kann mit jedem D- und J-Segment des TCRs verknüpft werden. Ferner sind in immunogener Hinsicht repräsentative Fragmente von Vβ17 ebenfalls von der Definition für "Vβ17" umfaßt.
Der hier verwendete Begriff "Bindungspartner" bezieht sich auf eine Verbindung, die gegenüber einem TCR reaktiv ist. Im allgemeinen wird diese Verbindung ein Antigen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) sein, es kann aber auch jede Verbindung sein, solange es im Falle einer normalen Bindung des TCRs zu einer T-Zell-Aktivierung oder -Poliferation kommt.
Der hier verwendete Begriff "Ligand" bezieht sich auf jedes Molekül, das reagiert, um einen Komplex mit einem anderen Molekül zu bilden.
Der hier verwendete Begriff "bindet selektiv" bedeutet, daß ein Molekül sich an einen Typ eines Moleküls, im wesentlichen aber nicht an andere Typen von Molekülen bindet. In Beziehung auf Vβ17 weist "selektives Binden" auf das Binden an Vβ17 enthaltende TCRs, im wesentlichen aber nicht an andere TCRs hin, denen Vβ17 fehlt.
Das Immunsystem ist das primäre biologische Abwehrsystem des Wirtes (selbst) gegen potentiell perniziöse Agenzien (nichtselbst). Diese perniziösen Agenzien können Pathogene wie Baktierien oder Viren sowie modifizierte eigene Zellen einschließlich Virus-infizierte Zellen, Tumorzellen oder andere abnorme Zellen des Wirtes sein. Insgesamt werden diese Targetsubstanzen des Immunsystems als Antigene bezeichnet. Die Erkennung eines Antigens durch das Immunsystem führt zu einer schnellen Mobilisierung immunologischer Mechanismen zur Zerstörung des Antigens und damit zur Aufrechterhaltung des gesunden Wirtsmilieus.
Die hauptsächlichen Manifestationen einer Antigen-spezifischen Immunreaktion sind die humorale Immunität (Antikörper-vermittelt) und die zelluläre Immunität (zellvermittelt). Jeder dieser immunologischen Mechanismen wird durch die Aktivierung von Helfer (CD4+)-T-Zellen initiiert. Diese CD4+-T-Zellen wiederum stimulieren B-Zellen, geprimt zur Antikörpersynthese durch Antigenbindung, zur Proliferation und Sekretion von Antikörpern. Dieser sezernierte Antikörper bindet an das Antigen und erleichtert dessen Zerstörung durch andere Immunmechanismen. Auf ähnliche Weise senden CD4+-T-Zellen stimulierende Signale an zytotoxische (CD8+)-T-Zellen aus, welche zelluläre Zielsubstanzen (beispielsweise Virus-infizierte Zellen des Wirtes) erkennen und zerstören. Demnach ist die Aktivierung von CD4+-T-Zellen das unmittelbare Ergebnis bei der Stimulierung einer Immunreaktion. Demgemäß ist die Erforschung der der antigenspezifischen Aktivierung von CD4+-T-Zellen zugrundeliegenden Mechanismen bei jedem Versuch, die immunologische Funktion selektiv zu verändern, von entscheidender Bedeutung.
T-Zellen verdanken ihre Antigenspezifität dem T-Zell-Rezeptor (TCR), welcher auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Der TCR ist ein heterodimeres Glycoprotein, welches aus zwei Polypeptidketten zusammengesetzt ist, die jeweils ein Molekulargewicht von ungefähr 45 kD aufweisen. Zwei Formen des TCRs sind identifiziert worden. Der eine ist aus einer α-Kette und einer β-Kette zusammengesetzt, während der zweite aus einer γ-Kette und einer δ-Kette besteht. Jede dieser vier TCR-Polypeptidketten wird von einem verschiedenen Genlokus kodiert, welcher multiple diskontinuierliche Gensegmente enthält. Diese schließen Gensegmente der variablen (V) Region, Gensegmente der verknüpfenden (J) Region und Gensegmente der konstanten (C) Region ein. Die β- und δ-Ketten enthalten ein zusätzliches Element, welches als Gensegment für die Verschiedenheit (D) bezeichnet wird. (Da D-Segmente und -Elemente nur bei einigen der TCR-Genloci und Polypeptiden gefunden werden, werden weitere Bezugnahmen auf D-Segmente und -Elemente in Klammern angegeben, um den Einschluß dieser Regionen lediglich in den geeigneten TCR-Ketten anzuzeigen. Demgemäß bezieht sich V(D)J entweder auf VDJ-Sequenzen von Ketten mit einer D-Region oder auf VJ-Sequenzen von Ketten, die keine D- Regionen aufweisen.)
Während der Lymphozytenreifung werden einzelne V-, (D)- und J- Gensegmente umgruppiert, um ein funktionelles Gen zu bilden, welches die Aminosäuresequenz des von dieser Zelle exprimierten TCRs bestimmt. Da die Gesamtheit von V-, (D)- und J-Genen, die umgruppiert werden können, vielfältig ist, und da individuelle Vertreter dieser Gesamtheit in nahezu jeglicher Kombination umgruppiert werden können, ist das vollständige TCR-Repertoire in hohem Maße diversifiziert und in der Lage, die überaus große Bandbreite von auf einen Organismus eintreffenden Bindungspartnern in spezifischer Weise zu erkennen und zu binden. Eine bestimmte T-Zelle besitzt jedoch lediglich ein TCR-Molekül, und dieses TCR-Molekül begründet in einem großen Ausmaß, wenn nicht vollständig, die Spezifität dieser T-Zelle für ihren Bindungspartner.
Die WO-A-86/06413 beschreibt auf Seite 51 das Peptid M3V, welches mit einem Fragment der β-Kette des T-Zell-Antigenrezeptors des T-Zell-Lymphoms korrespondiert.
Tiermodelle haben in bedeutender Weise zum Verständnis der immunologischen Mechanismen der Autoimmunkrankheit beigetragen. Ein derartiges Tiermodell, die experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE) betrifft eine Autoimmunkrankheit des zentralen Nervensystems, die in Mäusen und Ratten durch Immunisierung mit dem basischen Myelin-Protein (MBP) induziert werden kann. Die Krankheit ist klinisch durch Paralyse und leichter Auszehrung und histologisch durch eine perivaskuläre mononukleäre Zellinfiltration des Parenchyms des zentralen Nervensystems gekennzeichnet. Die Krankheitspathogenese wird von T-Zellen mit einer Spezifität für MBP vermittelt. Aus an EAE erkrankten Tieren sind multiple Klone MBP-spezifischer T-Zellen isoliert und in kontinuierlicher Kultur propagiert worden. Nach einer in vitro Stimulierung mit MBP induzieren diese T-Zell-Klone im Falle der adoptiven Übertragung auf gesunde Wirte rasch EAE. Es ist wichtig, daß diese EAS-induzierenden T-Zellen spezifisch sind, und zwar nicht nur für dasselbe Antigen (MBP), sondern gewöhnlich auch für ein einziges Epitop dieses Antigens. Diese Beobachtungen zeigen, daß diskrete Populationen autoaggressiver T-Zellen für die Pathogenese von EAE verantwortlich sind.
Eine Analyse der TCRs von EAE-induzierenden T-Zellen hat eine beschränkte Heterogenität der Struktur dieser Krankheits-assoziierten Rezeptoren ergeben. Bei einer Analyse von 33 MBP-reaktiven T-Zellen wurden lediglich zwei Gensegmente für die V-Region der α-Kette und ein Gensegment für die J-Region der α-Kette verwendet. Eine ähnliche Beschränkung der Verwendung von Genen für die β-Kette des TCR wurde in dieser T-Zell-Population ebenfalls beobachtet. Es wurden lediglich zwei Segmente für die V-Region der β-Kette und zwei Gensegmente für die J-Region gefunden. Noch bedeutender ist der Umstand, daß ungefähr 80% der T-Zell-Klone im Bereich der Region der Verknüpfung von V-D-J der β-Kette identische Aminosäuresequenzen aufwiesen. Diese Befunde bestätigen die Vorstellung einer gemeinsamen TCR-Struktur der T-Zellen mit ähnlichen Antigenspezifitäten und zeigen, daß der TCR ein wirksames Ziel immuntherapeutischer Strategien zur Eliminierung der Pathogenese von EAE ist.
Verschiedene Versuche sind unternommen worden, um die Antigenspezifität autoaggressiver T-Zellen zur Entwicklung von Behandlungsstrategien für EAE auszunutzen. Beispielsweise ist das passive Verabreichen von monoklonalen Antikörpern angewendet worden, die für TCRs spezifisch sind, welche bei EAE-induzierenden T-Zellen vorhanden sind. Beim Maus-Modell für EAE führte die Infusion eines für Vβ8, das von MBP-spezifischen T-Zellen verwendete Gen für die hauptsächliche V-Region der β-Kette, spezifischen monoklonalen Antikörpers zu einer verminderten Empfänglichkeit von Mäusen für eine nachfolgende Induktion mit EAE (Acha-Orbea et al., Cell 54:263-273 (1988) und Urban et al., Cell 54:577-592 (1988)). Ein ähnlicher Schutz ist gegenüber EAE bei Ratten mit einem monoklonalen Antikörper gezeigt worden, der gegenüber einer unidentifizierten idiotypischen Determinante des TCR von MBP-spezifischen T-Zellen reaktiv ist (Burns et al., J. Exp. Med. 169:27-39 (1989)). Obgleich eine passive Antikörpertherapie einen gewissen verbessernden Effekt auf die Empfänglichkeit für EAE zu haben scheint, ist sie mit potentiellen Problemen belastet. Der gewährte Schutz ist vorübergehend, wodurch eine wiederholte Verabreichung des Antikörpers erforderlich wird. Multiple Infusionen des Antikörpers erhöhen die Wahrscheinlichkeit, daß der Wirt eine Immunreaktion gegenüber dem verabreichten Antikörper aufbauen wird, insbesondere, wenn er in einem xenogenen Tier gezogen worden ist. Ferner repräsentiert eine Antikörperreaktion gegen einen pathogenen T-Zell-Klon lediglich ein Element der vollständigen Immunantwort und läßt den möglichen Beitrag der zellvermittelten Immunität beim Auflösen der Autoreaktivität außer Acht.
Die Rolle der zellvermittelten Immunität bei der Verminderung der Aktivität autoaggressiver T-Zellen bei EAE ist untersucht worden und es sind mögliche Therapieformen vorgeschlagen worden. In einer der passiven Antikörpermethode ähnlichen Weise sind regulatorische T-Zellen ex vivo abgeleitet und wieder zur Immuntherapie verabreicht worden. Beispielsweise haben Sun et al., Nature, 332:843-845 (1988), kürzlich einen CD8+-T-Zell-Klon aus rekonvaleszierenden Ratten isoliert, bei denen EAE durch adoptiven Transfer einer MBP-spezifischen CD4+-T-Zellinie induziert worden war. Dieser CD8+-T-Zell-Klon zeigte zytolytische Aktivität in vitro für die zur Auslösung der Krankheit verwendeten CD4+-T-Zellen. Darüber hinaus führte der adoptive Transfer dieses CTL-Klons zu einer Verminderung der Empfindlichkeit von Empfängerratten gegenüber einer nachfolgenden Exposition mit MBP. Lider et al., Science, 239:181-183 (1988), haben ebenfalls einen CD8+-T-Zell-Klon mit einer unterdrückenden Aktivität gegenüber EAE-induzierenden T-Zellen isoliert. Dieser CD8+-Klon wurde aus Ratten isoliert, die mit abgeschwächten Krankheits- induzierenden T-Zell-Klonen geimpft worden waren, und er konnte die von MBP geförderte Proliferation von EAE-induzierenden T- Zellen unterdrücken, da er keine zytolytische Aktivität in vitro zeigte. Obgleich diese Studien darauf hinweisen, daß die CD8+-T- Zellen EAE herunterregulieren könnten, ist es nicht leicht, diesen ausgewählten CD8+-CTL's eine wesentliche Rolle bei der langfristigen Resistenz der so erhaltenen Ratten zuzuordnen, da Sedgwick et al., (Eur. J. Immunol., 18:495-502 (1988)) deutlich gezeigt haben, daß die Depletion von CD8+-Zellen mit monoklonalen Antikörpern den Erkrankungsprozeß oder die Erholung nicht beeinflußt.
In den oben beschriebenen Experimenten von Sun et al. und Lider et al. führt die Verabreichung von "extant" abgeleiteten regulatorischen T-Zellen zur Überwindung des hauptsächlichen Nachteils der passiven Antikörpertherapie; sie erlaubt eine regulatorische Antwort in vivo von verlängerter Dauer. Es ist jedoch eine Kultivierung in vitro mit abgeschwächten Krankheits-induzierenden T-Zellen erforderlich, um Klone derartiger regulatorischer T- Zellen zu entwickeln, was ein kosten- und arbeitsintensives Vorgehen bedeutet. Ferner führt dies bei einer ausgedehnten Population wie den Menschen aufgrund der Nicht-Identität bezüglich MHC zwischen Individuen zu einer in hohem Maße individualisierten therapeutischen Strategie. Die regulatorischen Klone müssen für jeden individuellen Patienten abgeleitet werden und anschließend lediglich diesem Patienten wieder verabreicht werden, um potentielle Abstoßungsreaktionen des Wirtes zu vermeiden.
Eine direkte Impfung mit abgeschwächten Krankheits-induzierenden T-Zell-Klonen ist ebenfalls als Therapie für EAE angewendet worden. MBP-spezifische T-Zellen, die in der Lage sind, Krankheiten zu übertragen, sind durch Behandlung mit γ-Strahlen oder chemische Fixierung abgeschwächt und zur Impfung naiver Ratten verwendet worden. In einigen Fällen zeigten die geimpften Tiere eine Resistenz gegenüber nachfolgenden Versuchen der Auslösung von EAE (Lider et al., a.a.O., vgl. Cohen und Weiner, Immunol. Today, 9:332-335 (1988) zur Durchsicht). Die Wirksamkeit einer derartigen Impfung ist jedoch unstimmig und das Ausmaß des Schutzes ist in hohem Maße variabel. T-Zellen enthalten eine Vielzahl verschiedener Antigene, die eine Immunreaktion auslösen, wenn die gesamte T-Zelle als Impfstoff verabreicht wird. Auf dieses Phänomen ist von Offner et al. (J. Neuroimmunol., 21:13-22 (1989)) hingewiesen worden, der durch Messung des Anschwellens des Ohres zeigte, daß eine Immunisierung mit vollständigen T-Zellen die Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ (DTH) gegenüber solchen T-Zellen mit steigender Zahl der Impfungen mit starkem Zuwachs verstärkte. Positive DTH-Reaktionen wurden jedoch sowohl in gschützten als auch nicht geschützten Tieren gefunden. Die Ratten sprachen sowohl auf die Impfung mit encephalitogenen T-Zellen als auch mit Kontroll-T-Zellen in ähnlicher Weise an. In umgekehrter Weise führte eine Impfung mit PPD-spezifischen T-Zellen einer PPD-spezifischen T-Zellinie zu einer Induktion der DTH der Impf zellen sowie zu einem encephalitogenen Klon, selbst wenn kein Schutz beobachtet wurde. Das ähnliche Ansprechen geimpfter Ratten auf sowohl Krankheits-induzierende als auch Kontrollzellen weist nach Quantifizierung durch die Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ (eine Messung der zellvermittelten Immunität) darauf hin, daß zahlreiche Antigene auf diesen T-Zellen Immunreaktionen auslösen. Daher mangelt es der Impfung mit abgeschwächten Krankheits-induzierenden T-Zellen an einer Spezifität für das schützende Antigen auf der Oberfläche dieser T-Zelle sowie an einer variablen Auslösung der Immunität gegenüber diesem Antigen. Für die Behandlung menschlicher Krankheiten wird die Eignung der Impfung mit abgeschwächten T-Zellen beeinträchtigt durch dieselbe Arbeitsintensität und das Erfordernis individualisierter Therapien, wie oben bereits im Zusammenhang mit der Infusion von CD8+-Zellen dargelegt wurde.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein wirksames Verfahren der Immuntherapie für T-Zell-vermittelte Pathologien einschließlich Autoimmunkrankheiten bereitgestellt, mit welchem viele der mit den zuvor vorgeschlagenen Behandlungsmethoden zusammenhängenden Probleme vermieden werden. Im Vergleich mit der passiven Verabreichung heterologer Antikörper wird das wirtseigene Immunsystem durch eine Impfung zur Unterdrückung der autoaggressiven T- Zellen mobilisiert. Damit ist die Unterdrückung persistierend, wobei zur Herbeiführung dieser Unterdrückung jeder und sämtliche immunologischen Mechanismen eingeschlossen sein können. Diese viele Facetten aufweisende Reaktion ist wirksamer als die eindimensionale Unterdrückung, wie sie durch passives Verabreichen monoklonaler Antikörper oder "extant" abgeleiteter regulatorischer T-Zell-Klone erreicht wird.
Da sie Autoimmunkrankheiten betreffen, umfassen die erfindungsgemäßen Impfstoffe TCRs von T-Zellen, die Autoimmunkrankheiten vermitteln. Die Impfstoffe können vollständige, im wesentlichen aus T-Zell-Klonen gereinigte TCRs, individuelle T-Zell-Rezeptorketten (z.B. alpha, beta, etc.) oder Bereiche derartiger Ketten entweder allein oder in Kombination sein. Der Impfstoff kann homogen sein, wie z.B. ein einzelnes Peptid, oder kann aus mehr als einem Peptidtyp zusammengesetzt sein, wobei jeder derselben mit einem verschiedenen Bereich des TCRs korrespondiert. Ferner können diese Peptide von verschiedenen TCRs stammen, wobei beide TCRs zu der T-Zell-vermittelten Pathologie beitragen.
Nach einer besonderen Ausführungsform kann das immunisierende Peptid die Aminosäuresequenz SGDQGGNE aufweisen, wenn das Subjekt Multiple Sklerose hat. Jeder immunogene Bereich dieses Peptids kann wirksam sein. Daher können Aminosäuresubstitutionen erfolgen, die die Immunogenität des Peptids nicht zerstören. Zusätzlich kann dieses Peptid mit einem Träger verknüpft werden, um seine Immunogenität weiter zu erhöhen.
Nach einer weiteren besonderen Ausführungsform können T-Zell- Rezeptoren oder Fragmente des TCRs, die Vβ17 enthalten, zur Immunisierung eines Individuums mit rheumatoider Arthritis zur Behandlung oder Prävention der Krankheit eingesetzt werden. Die in dem Individuum ausgelöste Immunreaktion kann T-Zellen mit Vβ17 neutralisieren oder abtöten und demgemäß die schädigenden Wirkungen von Vβ17 aufweisenden T-Zellen verhindern oder beeinflussen. Darüber hinaus können derartige Impfstoffe in dem Ausmaß, in dem Vβ17 den T-Zell-Rezeptoren auf pathogenen, die Autoimmunkrankheiten allgemein vermittelnden T-Zellen gemeinsam ist, ebenfalls wirksam sein bei der Verbesserung derartiger anderer Autoimmunkrankheiten.
Der Begriff "im wesentlichen rein" bedeutet, daß der TCR im wesentlichen frei von anderen biochemischen Gruppen ist, mit denen er in der Natur normalerweise assoziiert ist. Alternativ umfassen die Impfstoffe Peptide mit variierenden Längen, die mit dem TCR oder den Bereichen desselben korrespondieren. Die Peptide können synthetisch oder auf rekombinante Weise durch die dem Durchschnittsfachmann gut bekannten Methoden hergestellt werden. Vorzugsweise korrespondieren die Peptidimpfstoffe mit Regionen des TCRs, die diesen TCR von anderen nicht-pathogenen TCRs unterscheiden. Derartige spezifische Regionen können innerhalb der verschiedenen Region(en) der entsprechenden TCR-Polypeptidketten lokalisiert sein, insbesondere eine kurze, die V(D)J-Verknüpfung überspannende Sequenz, wodurch die Immunreaktion lediglich auf diejenigen T-Zellen beschränkt wird, die diese einzelne Determinante aufweisen.
Die Impfstoffe werden einem Wirt verabreicht, der eine Autoimmunreaktion oder ein diesbezügliches Risiko aufweist. Eine genaue klinische Diagnose einer bestimmten Autoimmunkrankheit rechtfertigt die Verabreichung der relevanten krankheitspezifischen TCR-Impfstoffe. Eine vorbeugende Anwendung ist bei Krankheiten berechtigt, bei denen die Autoimmunmechanismen dem Ausbruch einer manifesten klinischen Krankheit vorhergehen (z.B. Typ I Diabetes). Demgemäß könnten Individuen mit einer familiären Krankheitsgeschichte und einem durch verläßliche prognostische Indikatoren vorhergesagten Risiko vorbeugend behandelt werden, um Autoimmunmechnanismen vor ihrer Entstehung aus zuschließen.
Die TCR-Impfstoffe können in vielen möglichen Formulierungen in pharmakologisch verträglichen Medien verabreicht werden. Im Falle eines kurzen Peptids kann das Peptid mit einem Carrier wie KLH konjugiert werden, um dessen Immunogenität zu steigern. Der Impfstoff kann in Konjugation mit einem Adjuvans verabreicht werden, von denen eine Reihe bekannt sind. Nach anfänglicher Immunisierung mit dem Impfstoff kann ein Booster bereitgestellt werden. Die Impfstoffe werden durch übliche Verfahren in Dosierungen verabreicht, welche zur Auslösung einer immunologischen Reaktion ausreichend sind und von dem Durchschnittsfachmann leicht bestimmt werden können.
Für die Immunisierung geeignete Peptide können wie folgt bestimmt werden. Krankheits-induzierende T-Zell-Klone, die gegenüber den Zielantigenen reaktiv sind, werden aus erkrankten Individuen isoliert. Derartige T-Zellen werden bevorzugt aus dem Bereich der aktiven autoaggressiven Aktivität erhalten, wie aus einer Läsion im Falle des Pemphigus vulgaris, aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) im Falle der Multiplen Sklerose oder aus der Synovialflüssigkeit oder -gewebe im Falle der rheumatoiden Arthritis oder alternativ aus Blut von erkrankten Individuen. Die TCR-Gene dieser autoaggressiven T-Zellen werden anschließend sequenziert. Polypeptide, die mit TCRs oder Bereichen derselben, die selektiv unter den Krankheits-induzierenden T-Zellen (relativ zu nicht-pathogenen T-Zellen) repräsentiert sind, können anschließend als Impfstoffe ausgewählt sowie gemäß obiger Darlegung hergestellt und verwendet werden.
Alternativ können die Impfstoffe anti-idiotypische Antikörper umfassen, die innere Abbilder der oben beschriebenen Peptide sind. Die Verfahren zur Herstellung, Auswahl und Verabreichung derartiger anti-idiotypischer Impfstoffe sind im Stand der Technik gut bekannt. Vgl. z.B. Eichmann et al., CRC Critical Reviews in Immunology, 7:193-227 (1987), worauf Bezug genommen wird.

T-Zell-Pathologien mit maligner Ätiologie

Um die Eignung der TCR-Impfung zu veranschaulichen, ist die Autoimmunkrankheit diskutiert worden. Das T-Zell-Lymphom ist jedoch eine weitere T-Zell-Pathologie, die diesem Behandlungstyp zugänglich wäre. Die Anwendung dieser Technologie bei der Behandlung von T-Lymphomen würde tatsächlich in identischer Weise erfolgen. Einem Gesichtspunkt zufolge ist diese Technologie jedoch einfacher auf T-Zell proliferative Krankheiten anwendbar, da die Isolierung der pathogenen T-Zellen einfacher durchzuführen ist. Wenn die Klone erst einmal isoliert sind, wird die Technologie in oben beschriebener Weise angewendet. In spezifischer Weise werden die TCR-Gene der T-Lymphome sequenziert, wobei geeignete Regionen dieser TCRs identifiziert und als Impfstoffe verwendet werden. Die Impfstoffe können einzelne oder multiple Peptide umfassen und können in pharmazeutisch verträglichen Formulierungen mit oder ohne Adjuvantien auf üblichem Wege verabreicht werden.

Multiple Sklerose

Die die Multiple Sklerose (MS) verursachenden T-Zellen sind bisher nicht identifiziert worden, obgleich den MBP-reaktiven T- Zellen aufgrund der klinischen und histologischen Ähnlichkeiten zwischen MS und EAE eine Beteiligung zugeschrieben worden ist. In Ratten- und Mäusemodellen von EAE zeigen MBP-reaktive, encephalogene T-Zellen trotz bekannter Unterschiede in der MHC-Restriktions- und MBP-Peptid-Antigenspezifität eine bemerkenswerte Konservierung der Aminosöuresequenz von VDJ der β-Kette. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß eine gegenüber dem humanen basischen Myelinprotein (MBP) reaktive, aus einem MS-Patienten abgeleitete T-Zellinie eine TCR-13-Kette mit einer VDJ-Aminosäuresequenz aufweist, die mit derjenigen von β- Ketten aus MBP-reaktiven T-Zellen homolog ist, die die Pathogenese bei der experimentellen allergischen Encephalomyelitis (EAE), einem Tiermodell für MS, vermitteln. Diese Linie ist für ein weiteres Epitop von MBP spezifisch. Dieser Befund zeigt die Beteiligung MBP-reaktiver T-Zellen bei der Pathogenese von MS und zeigt, daß TCR-Peptide, die den zur Prävention von EAE hier beschriebenen ähnlich sind, bei der Behandlung von MS geeignet sein können.

Rheumotoide Arthritis

Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine T-Zell-vermittelte Autoimmunkrankheit. Die Erfindung beschreibt oligoklonale Infiltrate aktivierter Vβ17-T-Zellen in dem Synovium von Patienten mit rheumatoider Arthritis. Die Anwesenheit dieser T-Zellen in dem erkrankten Gewebe sämtlicher untersuchter Patienten sowie ihre Oligoklonalität und die zytotoxische Aktivität einer derartigen T-Zelle für synovial adherierende Zellen weist auf eine zentrale Rolle von Vβ17 tragenden T-Zellen in der Pathogenese von RA hin.
Aktivierte T-Zell-Populationen im Synovialgewebe von Patienten mit RA sind untersucht worden durch Analyse der T-Zell-Rezeptor (TCR)-mRNAs, die aus IL-2 Rezeptor-positiven (IL-2R+) synovialen T-Zellen isoliert wurden. Die TCR-mRNAs wurden unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach einem Protokoll amplifiziert, welches zur Amplifikation humaner TCR-β-Ketten-Gene, die tatsächlich jegliches Vβ-Genelement enthalten, erstellt worden ist. Durch diese Analyse wurde gefunden, daß oligoklonale Vβ17-Umgruppierungen in der IL2-R+-Population angereichert sind, was darauf hinweist, daß Vβ17-T-Zellen wahrscheinlich bei der Pathogenese von RA beteiligt sind. Ein CD4+, Vβ17 aufweisender T-Zell-Klon ist aus einer der synovialen Gewebeproben isoliert worden, und seine in vitro-Zytotoxizität für synoviale adherierende Zellen bekräftigt die direkte Beteiligung von Vβ17-T-Zellen bei der RA.
Wie bereits ausgeführt, liefert die Erfindung die extrem wichtige Entdeckung, daß eine spezifische variable Region der β-Kette des TCRs, bezeichnet mit Vβ17, sehr eng mit der rheumatoiden Arthritis von Menschen assoziiert ist. Diese Entdeckung ermöglicht den Nachweis, die Prävention und die Behandlung der rheumatoiden Arthritis unter Anwendung der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ausgeführten Methodik. Ähnliche therapeutische Ansätze, die oben für EAE ausgeführt worden sind, können von dem Durchschnittsfachmann auf rheumatoide Arthritis übertragen werden.
Mit der Erfindung wird insbesondere ein Verfahren bereitgestellt zur Diagnose oder Vorhersage einer Empfänglichkeit für rheumatoide Arthritis in einem Individuum, umfassend das Nachweisen von T-Zellen mit der als Vβ17 bezeichneten variablen Region der β-Kette in einer Probe aus dem Individuum, wobei das Vorhandensein eines abnormen Spiegels von Vβ17 enthaltenden T-Zellen eine rheumatoide Arthritis oder die Empfänglichkeit für rheumatoide Arthritis anzeigt. Die Vβ17 enthaltende T-Zelle kann qualitatitiv oder quantitativ mit derjenigen eines normalen Individuum verglichen werden. Eine derartige Diagnose kann erfolgen durch Nachweisen eines Bereichs von Vβ17, welcher bei der nicht mit rheumatoider Arthritis assoziierten variablen Region der β-Kette von T-Zell-Rezeptoren nicht auftaucht. Vβ17 kann beispielsweise nachgewiesen werden, in dem Vβ17 mit einem nachweisbaren Liganden kontaktiert wird, welcher in der Lage ist, spezifisch an Vβ17 zu binden. Viele derartige nachweisbare Liganden sind im Stand der Technik bekannt, wie z.B. ein Enzym-gekoppelter Antikörper. Alternativ können Nukleotidsonden, die komplementär zu den Vβ17-kodierenden Nukleinsäuresequenzen sind, eingesetzt werden, um Vβ17 enthaltende T-Zellen nachzuweisen, wie in Beispiel IX ausgeführt wird.
Durch die Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Prävention oder Behandlung von rheumatoider Arthritis bereitgestellt, welches die Prävention der Anheftung eines Vβ17 enthaltenden T- Zell-Rezeptors an seinen Bindungspartner umfaßt. Nach einer Ausführungsform wird die Anheftung durch Bindung eines Liganden an Vβ17 verhindert. Nach einer alternativen Ausführungform wird die Anheftung durch Bindung eines Liganden an den Bindungspartner von Vβ17 verhindert. Die Anheftung kann mittels bekannter Verfahren erfolgen, wie z.B. durch Binden eines Antikörpers an Vβ17 oder den bindenden Bereich, um die Anheftung physikalisch zu blockieren.
Mit der Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Prävention oder Behandlung der rheumatoiden Arthritis in einem Individuum bereitgestellt, welches eine zytotoxische oder zytostatische Behandlung von Vβ17 enthaltenden T-Zellen in dem Individuum umfaßt. Nach einer Ausführungsform werden die Vβ17 enthaltenden T- Zellen mit einem zytotoxischen oder zytostatischen Agens behandelt, welches Vβ17 selektiv bindet. Das Agens kann ein Antikörper sein, der an eine radioaktive oder chemotherapeutische Gruppe angeheftet ist. Eine derartige Anheftung und wirksame Agenzien sind im Stand der Technik gut bekannt. Vgl. z.B: E. Harlow und Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory , 1988, worauf hiermit Bezug genommen wird.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ferner die extrem wichtige Entdeckung bereitgestellt, daß eine spezifische TCR-Sequenz, SGDQGGNE, auf enge Weise mit Multipler Sklerose von Menschen assoziiert ist. Diese Entdeckung ermöglicht den Nachweis, die Prävention und die Behandlung von Multipler Sklerose unter Anwendung der im Rahmen der vorliegenden Erfindung ausgeführten Methodik. Ähnliche therapeutische Ansätze, die für EAE ausgeführt worden sind, können vom Durchschnittsfachmann auf Multiple Sklerose übertragen werden.
Durch die Erfindung wird insbesondere ein Verfahren zur Diagnose oder Vorhersage einer Empfänglichkeit für Multiple Sklerose in einem Individuum bereitgestellt, welches das Nachweisen von T- Zellen mit im wesentlichen der Sequenz SGDQGGNE in einer Probe aus dem Individuum umfaßt, wobei die Gegenwart der Sequenz eine Multiple Sklerose oder eine Empfänglichkeit für Multiple Sklerose anzeigt. Die Sequenz kann beispielsweise nachgewiesen werden, indem sie mit einem nachweisbaren Liganden kontaktiert wird. Viele derartige Liganden sind bekannt, wie z.B. ein Enzym-gekoppelter Antikörper. Alternativ können zum Nachweis von T-Zellen Nukleotidsonden eingesetzt werden, die komplementär zu der die Sequenz kodierenden Nukleinsäure sind, wie in Beispiel IX ausgeführt.
Mit der Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Prävention oder Behandlung der Multiplen Sklerose bereitgestellt, welches die Prävention der Anheftung eines im wesentlichen die Sequenz SGDQGGNE enthaltenden T-Zell-Rezeptors an seinen Bindungspartner umfaßt. Nach einer Ausführungsform wird die Anheftung durch Binden eines Liganden an die Sequenz verhindert. Nach einer alternativen Ausführungsform wird die Anheftung durch Binden eines Liganden an den Bindungspartner verhindert. Die Anheftung kann durch bekannte Verfahren verhindert werden, wie z.B. durch Binden eines Antikörpers an die Sequenz, um die Anheftung physikalisch zu blockieren.
Mit der Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Prävention oder Behandlung der Multiplen Sklerose in einem Individuum bereitgestellt, welches eine zytotoxische oder zytostatische Behandlung von T-Zellen in dem Individuum umfaßt, die im wesentlichen die Sequenz SGDQGGNE enthalten. Nach einer Ausführungsform werden T- Zellen mit einem zytotoxischen oder zytostatischen Agens behandelt, welches die Sequenz selektiv bindet. Das Agens kann ein Antikörper sein, der an eine radioaktive oder chemotherapeutische Gruppe angeheftet ist.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen aber nicht beschränken.

Beispiel I

Ratten-Modell der EAE

Jeder Fußballen des Hinterlaufs weiblicher Lewis-Ratten (Charles River Laboratories, Raleigh-Durham, NC) wurde mit 50 ug des basischen Myelinproteins des Meerschweinchens immunisiert, welches in vollständigem Freund's Adjuvans emulgiert war. Die ersten Anzeichen einer Krankheit wurden typischerweise 9 - 11 Tage nach der Immunisierung beobachtet. Die Schwere der Krankheit wird wie folgt auf einer 3-Punkte-Skala bewertet: 1 = hinteres Hinken; 2 = Schwäche des Hinterlaufs; 3 = Paralyse des Hinterlaufs. Nach einem Krankheitsverlauf von ungefähr 4 - 6 Tagen erholten sich die meisten Ratten spontan und wurden wieder einer nachfolgenden EAE-Induktion zugeführt.

Beispiel II

Auswahl und Zubereitung der Impfstoffe

Die Impf ungen erfolgten mit einem T-Zell-Rezeptorpeptid, dessen Sequenz aus der DNA-Sequenz eines Beta-Gens für den T-Zell-Rezeptor abgeleitet worden war, welches unter EAE-induzierenden T- Zellen von Bio.PL/L-Mäusen vorherrscht. Die DNA-Sequenz war die von Urban et al.; a.a.O., angegebene, worauf hiermit Bezug genommen wird. Durch bekannte Verfahren wurde ein Peptid aus neun Aminosäuren mit der Sequenz der VDJ-Verbindung der β-Kette des TCRs der Maus synthetisiert. Die Sequenz dieses Peptids ist SGDAGGGYE. (Die Aminosäuren sind durch die üblichen einzelnen Buchstaben repräsentiert.) Es ist berichten worden (Burns et al., J. Exp. Med., 169:27-39 (1989)), daß die äquivalente Sequenz der Ratte SSD-SSNTE ist. Das Peptid wurde mittels Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) Säulenchromatographie in 0,1 M Essigsäure entsalzt, und das Lösungsmittel wurde nachfolgend durch zweimalige Lyophilisierung entfernt. Eine Portion des Peptids wurde mit Glutaraldehyd an Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) konjugiert in einem Verhältnis von 7,5 mg pro mg KLH. Das resultierende Konjugat wurde gegen phosphatgepufferte Saline (PBS) dialysiert.

Beispiel III

Impfung gegen EAE

Die in diesen Studien eingesetzten Impfstoffe bestanden aus freiem VDJ-Peptid und auch aus VDJ-Peptid, konjugiert mit KLH. Diese wurden in PBS aufgelöst und mit gleichen Volumina von entweder (1) unvollständigem Freund's Adjuvans (IFA) oder (2) vollständigem Freund's Adjuvans (CFA) emulgiert, in dem 10 mg/ml durch Hitze abgetötete ausgetrocknete Mycobacterium tuberculosis H37ra (Difco Laboratories, Detroit, MI) in IFA suspendiert wurden. Die Emulsionen wurden 8 - 12 Wochen alten weiblichen Lewis- Ratten in einem Endvolumen von 100 ul pro Tier verabreicht (50 ul in jeden der hinter Fußballen). 5 ug unkonjugiertes VDJ- Peptid wurden pro Ratte verabreicht. Das KLH-VDJ-Konjugat wurde einer 10 ug KLH pro Ratte entsprechenden Dosis verabreicht. 29 Tage später erhielt jede Ratte 50 ug des basischen Myelinproteins des Meerschweinchens in vollständigem Freund's Adjuvans in die vorderen Fußballen. Beginnend mit Tag 9 wurden die Tiere täglich hinsichtlich klinischer Anzeichen der EAE überwacht und gemäß obiger Beschreibung bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt. Wie der Tabelle entnommen werden kann, gab es bei den geimpften Individuen nicht nur eine verminderte Inzidenz der Krankheit, sondern die Schwere der Erkrankung bei denjenigen Tieren, die die Krankheit hatten, wurde vermindert und/oder das Ausbrechen wurde verzögert. Das Ausmaß des Schutzes variierte mit der Impfstofformulierung, wobei diejenigen, die CFA als Adjuvans einschlossen, den größten Schutz aufwiesen. Tabelle I Tier Nr. Impfung (Adjuvans) Tage nach Exposition Keine Bewertung: - keine Anzeichen 1) hinteres Hinken 2) Schwäche des Hinterlaufs 3) Paralyse des Hinterlaufs

Beispiel IV

Impfung gegen EAE mit VDJ-Peptiden der Lewis-Ratte

Das in den vorhergehenden Beispielen verwendete VDJ-Peptid wurde entsprechend der Sequenz der auf EAE induzierenden T-Zellen von B10.PL-Mäusen gefundenen β-Ketten-Moleküle des TCR synthetisiert. Zusätzlich wurden Peptide synthetisiert und untersucht, die mit Sequenzen korrespondieren, die auf encephalitogenen T- Zellen in Lewis-Ratten gefunden wurden. Diese VDJ-Sequenzen sind homolog mit denjenigen von B10.PL-Mäusen, aber nicht identisch. Die Ratten-Peptide wurden entsprechend den von Burns et al. und Chluba et al., Eur. J. Immunol., 19:279-284 (1989) berichteten DNA-Sequenzen synthetisiert. Die Sequenzen dieser drei mit IR1, 2 und 3 bezeichneten Peptide sind nachfolgend dargestellt und der in den Beispielen 1 bis 3 verwendeten B10.PL-Maus-Sequenz (VDJ) gegenübergestellt.
Die Herstellung, Verabreichung und Bewertung dieser Impfstoffe erfolgte, wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben, mit den folgenden Abweichungen: 50 ug der individuellen VDJ-Peptide wurden in CFA enthaltende Impfstofformulierungen eingeschlossen; weder Impfungen in IFA noch Impfungen mit an KLH konjugierten Peptiden wurden durchgeführt. Die Kontrolltiere wurden vor der Exposition mit MBP gemäß Beispiel 3 nicht behandelt oder mit Emulsionen von PBS und CFA geimpft, um den schützenden Effekt des Adjuvans allein zu bewerten. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II dargestellt. Tabelle II Tier Nr. Impfung (Adjuvans ) Tage nach Exposition Keine Bewertung: - keine Anzeichen 1) hinteres Hinken 2) Schwäche des Hinterlaufs 3) Paralyse des Hinterlaufs
Wie in der Tabelle II dargestellt, wurde die Krankheit bei ungeimpften Kontrolltieren am Tag 10 beobachtet. Die Krankheit wurde charakterisiert durch schwere Paralyse und Auszehrung, wobei sie 4 - 6 Tage andauerte und spontan zurückging. Mit PBS-CFA geimpfte Ratten zeigten Krankheitsverläufe, die von denjenigen der nicht geimpften Kontrolltiere tatsächlich nicht unterscheidbar waren. Demgegenüber wurde eine Verzögerung des Ausbruchs bei einigen der mit IR1, 2 oder 3 geimpften Tiere beobachtet, und andere zeigten sowohl einen verzögerten Ausbruch als auch eine verminderte Schwere und/oder Dauer der Krankheit. Insgesamt gesehen waren die Impfungen mit den VDJ-Peptiden der Ratte (IR1- 3) jedoch etwas weniger effektiv als die mit dem VDJ-Peptid der Maus (Beispiel III) durchgeführten. Eine Impfung mit IR9b führte jedoch bei allen vier untersuchten Tieren zu einem vollständigen Schutz. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, daß für die Krankheit charakteristische histologische Läsionen bei keinem der vier Tiere gefunden wurden, die mit IR9b geimpft worden waren, was darauf hinweist, daß subklinische Krankheitsanzeichen ebenfalls aufgehoben wurden.

Beispiel V

Impfung mit V-Region-spezifischen Peptiden

Ein für die Vβ8-Genfamilie spezifisches Peptid wurde als Impfstoff gegen EAE untersucht. Vβ8 ist die bei encephalitogenen T- Zellen sowohl bei Ratten als auch bei Mäusen am häufigsten vorkommende Genfamilie der β-Kette. Ein Peptid wurde synthetisiert auf der Grundlage einer einmaligen DNA-Sequenz, die in dem Vβ8- Gen gefunden wurde und welche bei anderen Vβ-Genen der Ratte nicht gefunden wird, deren Sequenzen von Morris et al., Immunogenetics, 27:174-179 (1988) berichtet wurden. Die Sequenz dieses mit IR7 bezeichneten Vβ8-Peptids ist:
IR7 D M G H G L R L I H Y S Y D V N S T E K
Die Wirksamkeit dieses Vβ8-Peptids wurde gemäß Beschreibung der Beispiele II und III mit dem EAE-Modell der Lewis-Ratte (Beispiel I) untersucht. 50 ug des Peptids wurden in CFA untersucht. Die Impfungen in IFA oder mit Peptid-KLH-Konjugaten wurden nicht durchgeführt. Die Ergebisse dieser Untersuchungen sind in der Tabelle III dargestellt. Tabelle III Tier Nr. Impfung (Adjuvans) Tage nach Exposition Bewertung: - keine Anzeichen 1) hinteres Hinken 2) Schwäche des Hinterlaufs 3) Paralyse des Hinterlaufs
Die Ergebnisse der mit dem Vβ8-Peptid der Ratte durchgeführten Impfungen ähneln denjenigen, die mit den Peptiden IR1, 2 und 3 der Maus und Ratte erhalten wurden. Ein verzögerter Ausbruch sowie eine verminderte Schwere und Dauer der Krankheit wurde bei einem Tier beobachtet. Ein Tier verfügte über vollständigen Schutz.

Beispiel VI

Impfung mit Peptiden der J-Region

Es wurde ein Peptid synthetisiert, das mit dem J-α-Gensegment TA39 korrespondiert, welches sowohl bei encephalitogenen T-Zell- Rezeptoren der Ratte als auch der Maus gefunden wurde. Die Sequenz dieses mit IR5 bezeichneten Peptids ist:
IR5 R F G A G T R L T V K
Die Wirksamkeit des JαTA39-Peptids wurde mit dem EAE-Modell der Lewis-Ratte (Beispiel I) gemäß den Beschreibungen der Beispiele II und III untersucht. 50 ug des Peptids wurden in CFA untersucht. Impfungen in IFA oder mit Peptid-KLH-Konjugaten wurden nicht durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle IV dargestellt. Tabelle IV Tier Nr. Impfung (Adjuvans) Tage nach Exposition Bewertung: - keine Anzeichen 1) hinteres Hinken 2) Schwäche des Hinterlaufs 3) Paralyse des Hinterlaufs
Die Ergebnisse der mit dem JαTA39-Peptid der Ratte durchgeführten Impfungen sind wirksamer als diejenigen, die mit dem VDJ- Peptid oder dem Vβ8-Peptid der Maus beobachtet wurden. Zwei von drei Tieren waren vollständig geschützt und der Ausbruch der Krankheit war bei dem dritten Tier deutlich verzögert. Die Schwere wurde ebenfalls in diesem Tier vermindert, obgleich die Krankheit für einen normale Dauer von 5 Tagen andauerte. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, daß die zwei vollständig geschützten Tiere keinen histologischen Beweis einer Infiltration des ZNS mit T-Zellen zeigten. Dieses Ergebnis weist darauf hin, daß eine Impfung mit JαTA39 in sehr wirksamer Weise eine regulatorische Reaktion gegen encephalitogene T-Zellen induziert. Selbst subklinische Anzeichen der Krankheit wurden aufgehoben.

Beispiel VII

Impfung mit Mischungen von TCR-Peptiden

Die Impfungen wurden mit einer Mischung von TCR-Peptiden durchgeführt. Diese Mischung enthielt 50 ug von jedem der Peptide IR1, 2, 3 und 5 (die drei VDJ-Peptide der Ratte und das JαTA39- Peptid der Ratte).
Die Wirksamkeit dieser Peptidmischung wurde gemäß der Beschreibung in den Beispielen II und III mit dem Modell der Lewis-Ratte (Beispiel I) untersucht. Die Peptide wurden in CFA untersucht. Impfungen in IFA oder mit Peptid-KLH-Konjugaten wurden nicht durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der Tabelle V dargestellt. Tabelle V Tier Nr. Impfung (Adjuvans) Tage nach Exposition (jeweils 50 ug) Bewertung: - keine Anzeichen 1) hinteres Hinken 2) Schwäche des Hinterlaufs 3) Paralyse des Hinterlaufs
Die Ergebnisse der mit JαTA39 der Ratte und den drei VDJ-Peptiden der Ratte durchgeführten Impfungen zeigen eine nahezu gleiche Wirksamkeit, wie sie für IR9b in Tabelle II beschrieben ist. Sämtliche drei Tiere waren vollständig geschützt. Zusätzlich zur Abwesenheit jeglicher klinischer Anzeichen von EAE wiesen zwei dieser drei Tiere überhaupt keine histologischen Beweise einer Infiltration des ZNS mit T-Zellen auf, während das dritte lediglich zwei kleine Foci einer lymphozytären Infiltration an der Basis des Rückenmarks aufwies.

Beispiel VIII

Impfstoff gegen Multiple Sklerose

Humane MBP-reaktive T-Zellen

MBP-reaktive T-Zellinien wurden etabliert aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von neun chronisch progressiven MS-Patienten und zwei gesunden Kontrollpatienten. Die Zellen wurden in Kultur gehalten durch normale Stimulierung mit gereinigtem humanem MBP und bestrahltem autologem PBMC für eine Zeitdauer von 3 Tagen, gefolgt von 4 Tagen in IL2 enthaltendem Medium.

PCR-Amplifikation von Genen der TCR-β-Kette aus MBP-reaktiven T- Zellinien

T-Zellen wurden aus Kulturen der logarithmischen Phase geerntet, die RNA wurde präpariert und mit dem Vβ16mer Primer und den ineinander geschachtelten Cβ-Primern gemäß Beispiel IX über 55 Zyklen amplifiziert.

Sequenzen der TCR-β-Kette von humanen MBP-reaktiven T-Zellen

Die mit Vβ16mer amplifizierten Gene der TCR-β-Kette aus humanen MBP-reaktiven T-Zellinien wurden unter Anwendung des Primers Cβseq sequenziert. Die Amplifikationsprodukte wurden mittels eines Gels gereinigt, basisch denaturiert und vom Primer Cβseq sequenziert. Lesbare DNA-Sequenzen wurden aus fünf dieser Linien erhalten, was darauf hinweist, daß vorherrschende T-Zell-Klone durch die langfristige in vitro-Passage selektiert worden sind. Eine dieser Sequenzen von der Re-Zellinie (Tabelle VI) besaß eine Aminosäuresequenz von VDJ der β-Kette, die mit der unter MBP-reaktiven, encephalogenen T-Zellen im B10.PL-Maus-Modell von EAE konservierten Aminosäuresequenz von VDJ der β-Kette fünf der ersten sechs und sechs von insgesamt neun Resten gemeinsam hatte. Diese Sequenz war bei den vorherrschenden TCR-Umgruppierungen, die in den verbleibenden vier menschlichen MBP-reaktiven T- Zellinien gefunden wurden, nicht vorhanden.
Um zu ermitteln, ob ähnliche Sequenzen in dem β-Kettenrepertoire der MBP-reaktiven T-Zellinien aus anderen MS-Patienten vorhanden waren, wurden PCR-Amplifikationen durchgeführt mit einem degenerierten (n=1024), 21 Nukleotide umfassenden Primer (VβRe), welcher mit sieben Aminosäuren dieser Sequenz (Tabelle VI) korrespondiert. Die RNAs wurden reverse transkribiert und in 20 Reaktionszyklen der Stufe I mit den Primern Vβ16mer und Cβext amplifiziert. Aliquote von jeweils 1 ul dieser Stufe I-Reaktionen wurden über 35 Zyklen reamplifiziert mit den Primern VβRe und Cβint. Aliquote von jeweils 1 ul dieser Reaktionen wurden mittels Southern Blot-Hybridisierung mit einer ³²P-markierten humanen Cβ-Sonde analysiert. Diese Analyse ergab das 300 Bp amplifizierte Produkt in der Re-Zellinie und in einer der anderen MS- Patientenlinien, aber nicht in MBP-reaktiven T-Zellen von Kontrollpersonen oder in nicht-MBP-reaktiven humanen T-Zellinien und -klonen. Die Anwesenheit dieser Sequenz in zwei dieser neun untersuchten MS-Patientenlinien ist zwingend. Da von dieser Sequenz bekannt ist, daß sie unter encephalogenen T-Zellen bei EAE konserviert ist, weist ihr Nachweis unter MBP-reaktiven T- Zellen von MS-Patienten auf eine Beteiligung von diese Determinante aufweisenden T-Zellen bei der Pathogenese von MS hin.
Immunogene Peptide mit der Sequenz SGDQGGNE können gemäß Beispiel II synthetisiert und zur Immunisierung von menschlichen Patienten unter Anwendung der in Beispiel III gezeigten Verfahren verwendet werden. Derartige Impfungen können zu einer wirksamen Immunreaktion führen. Tabelle VI Probe

Beispiel IX

Isolierung von oligoklonalen Infiltraten mit 11. aktivierten Vβ17-T-Zellen im Synovium von Patienten mit rheumatoider Arthritis

Herstellung von T-Zellen aus Synovialgewebe

Die Synovialgewebeproben wurden von Patienten mit rheumatoider Arthritis erhalten, deren Erkrankung radiographisch bestätigt wurde und die eine Therapie des Gelenkersatzes durchliefen. Aktivierte T-Zellen wurden unter Verwendung von magnetischen Perlen und gegenüber dem humanen IL2-R (αIL2-R) reaktiven Antikörpern wie folgt ausgewählt. Das Synovialgewebe wurde 4 Stunden lang bei 37ºC in RPMI + 10% fötalem Rinderserum (FBS) enthaltend 4 mg/ml Collagenase (Worthington Biochemical, Freehold, NJ) und 0,15 mg/ml DNAse (Sigma, St. Louis, MO.) verdaut. Man ließ die Ansätze durch ein 80 Maschen-Sieb passieren und einzelne Zellen wurden mittels Ficcol-Dichtegradientenzentrifugation gesammelt. Die Zellen in der Zwischenphase wurden gewaschen und in einer Dichte von 10&sup6;/ml 30 Minuten lang bei 0ºC mit 5 ug/ml Kontrollmaus-IgG (Coulter Immunology, Hialeah, FL) in PBS enthaltend 2% FBS (PBS-FBS) inkubiert. Die Zellen wurden dreimal gewaschen und 30 Minuten lang bei 0ºC mit magnetischen Perlen inkubiert, die mit Anti-Maus-IgG der Ziege (Advanced Magnetics, Cambridge, MA) konjugiert waren. Die Perlen wurden magnetisch getrennt und dreimal mit PBS-FBS gewaschen. Diese Vorauswahl mit Maus-IgG (mIgG) und magnetischen Perlen wurde angewendet zur Kontrolle der nicht-spezifischen Adsorption von T-Zellen. Die in der ursprünglichen Suspension verbleibenden Zellen wurden für weitere 30 Minuten bei 0ºC mit 5 ug/ml monoklonalem Maus-IgG inkubiert, welches reaktiv gegenüber dem humanen T-Zell IL2-R war (Coulter Immunology, Hialeah, FL). Die Zellen wurden gewaschen und gemäß obiger Vorgehensweise mit magnetischen Perlen selektiert. Die Perlen von der IgG-Präadsorption und der IL2-R-Antikörperselektion wurden sofort in angesäuertem Guanidin-Phenol-Chloroform resuspendiert, und die RNA wurde hergestellt, wie von Chonezynski und Sacchi in Anal. Biochem., 162:156 (1987) beschrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird. Da die RNAs ohne in vitro Kultur der Zellen und die damit einhergehende Verzerrung, die induziert werden kann, hergestellt wurden, geht man davon aus, daß sie die Verteilung der T-Zellen in Synovialgewebe zum Zeitpunkt der chirurgischen Entfernung akkurat widerspiegeln. Lediglich die Hälfte der mIgG- und αIL2-R-Perlen des Patienten 1012 wurden sofort zur Aufbereitung der RNA behandelt. Der verbleibende Rest wurde 5 Tage lang kultiviert in RPMI 1640, 5% FBS, 20% HL-1 (Ventrex Laboratories Inc., Portland, ME), 25 mM HEPES, Glutamin, Antibiotika und 20% LAK-Überstand (Allegretta et al., Science, 247:718 (1990)), worauf hiermit Bezug genommen wird, als Quelle für IL-2. Die RNA wurde aus Kulturen der αIL2- R-Perlen (1012IL2.d5), nicht aber aus der 1012mIgG-Probe extrahiert, da zum Ende der 5-tägigen Kultivierung keine lebensfähigen Zellen vorhanden waren.
Ein T-Zell-Klon wurde aus dem Ficoll-Niederschlag des Patienten 1008 abgeleitet. Die Zellen in dem Sediment wurden mit einer Konzentration von 2 x 10&sup6;/ml in einem Medium ohne IL-2 für eine Zeitdauer von 2 Wochen kuliviert. Nicht-adherierende Zellen dieser Kultur wurden mittels Grenzverdünnung auf einlagigen Schichten von autologen Synovialzellen kloniert. Ein CD4+-T- Zell-Klon 1008.8 wurde erhalten und an die Kultur angepaßt durch normale Stimulierung mit autologen synovialen Einzellschichten für eine Zeitdauer von 3 Tagen in einem Medium ohne IL-2, gefolgt durch eine 4-tägige Kultur in einem Medium mit LAK-Überstand.

Lyse der synovialen adherenten Zellen durch 1008.8

Die Lyse der synovialen adherenten Zellen durch 1008.8 wurde wie folgt durchgeführt. Einlagige Schichten von Synovialzellen wurden gemäß Beschreibung von Stedman und Campbell, J. Immunol. Meth., 119:291 (1989), worauf hier Bezug genommen wird, mit ³&sup5;S zur Verwendung als Targetsubstanzen in CTL-Assays markiert. Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt, gewaschen und mit einer Dichte von 2000 Zellen pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden ausplattiert. Die 1008.8-Zellen, die vor dem Assay mit synovialen adherenten Zellen und LAK- Überstand enthaltendem Medium 3 Tage lang kultiviert worden waren, wurden den Targetsubstanzen in den angegebenen Verhältnissen von Effektor zu Targetsubstanz zugegeben. Die Kulturen wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert, 2 Minuten lang mit 300 xg zentrifugiert, und es wurde die Radioaktivität in 50 ul des Überstandes quantifiziert. Das Ausmaß der spezifischen Lyse in Prozent wurde in Relation zu Detergens-lysierten Targetsubstanzen unter Anwendung von Standardformeln berechnet. Dieser Klon ist für synoviale adherente Targetzellen in CTL-Assays zytotoxisch (Tabelle VII). Tabelle VII Verhältnis von Effektor zu Target % Spezifische Lyse

PCR-Amplifikation von TCR-β-Ketten-Genen

Die Gene für die β-Kette vom TCR wurden mit verschiedenen Kombinationen der in Tabelle VIII dargestellten Primer amplifiziert. Der Primer Vβ16mer ist ein degenerierter Vβ-Primer (n=256), welcher in der Lage sein soll, 85% der menschlichen Gene für die β-Kette vom TCR an allen 16 Resten und 95% an 15 Resten zu binden. Dieser Primer ist verwendet worden, um die β- Ketten vom TCR von mehr als 25 verschiedenen menschlichen T- Zell-Klonen, -linien oder primären Gewebeaufbereitungen zu amplifizieren. Aus diesen amplifizierten DNAs ist ein Spektrum von Vβ-Genen sequenziert worden, wobei die Ergebnisse gegen einen signifikanten Bias des Primers für bestimmte Vβ-Familien sprechen. Daher erleichtert eine PCR-Amplifikation mit dem Vβ16- Primer die Analyse von T-Zell-Populationen, bei denen eine Kenntnis der Verwendund des Vβ-Gens a priori nicht zur Verfügung steht.
Die Gene für die β-Kette des T-Zell-Rezeptors wurden in zweistufigen Amplifikationsreaktionen amplifiziert mit ineinangeschachtelten Paaren des in Tabelle VIII dargestellten Primers. Die RNAs wurden 1 Stunde lang bei 42ºC revers transkribiert mit 40 pmol des Cβext-Primers in einer 12 ul Reaktion unter Anwendung der Bedingungen, die von Hart et al., The Lancet, Seite 596 (1988), worauf hiermit Bezug genommen wird, beschrieben wurden. Die Reaktionen wurden verdünnt mit einem Mastermix enthaltend 40 pmol des Vβ16mer-Primers, Nukleotide und Reaktionspuffer wie oben, aber ohne MgCl&sub2;, um eine Endkonzentration an Mg&spplus;² von 3,6 mM zu ergeben. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei 95ºC denaturiert, und es wurde eine Einheit der hitzestabilen rekombinanten DNA-Polymerase (Cetus Corporation, Emeryville, CA, Amplitaq ) zugegeben und 20 Zyklen der PCR durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus einer einminütigen Denaturierung bei 95ºC, einer zweiminütigen Annellierungstufe und einer zweiminütigen Extension bei 72ºC. Die ersten beiden Zyklen wurden bei 37ºC bzw. 45ºC und der letzte bei 50ºC annelliert. Aliquote von jeweils 1 ul dieser Stufe I-Reaktionen wurden 100 ul umfassenden Stufe II- Amplifikationsreaktionen (Cetus, Gene-Amp Kit ) zugegeben, welche 100 pmol des Cβint-Primers und 100 pmol der Primer Vβ8, Vβ17 oder 5'Cβ oder 700 pmol des Vβ16mer-Primers enthielten. Die Stufe II-Amplifikationen wurden wie oben beschrieben mit einer Annellierungstemperatur von 50ºC und ohne die Temperaturen von 37ºC und 45ºC durchgeführt. Tabelle VIII
Die RNA-Proben aus den Kulturen 1012IL2.d5 und 1008.8 wurden mit den Primern Vβ16mer und Cβext in Stufe I-Reaktionen und mit den Primern Vβ16mer und Cβint in 35 Zyklen der Stufe II-Reaktionen amplifiziert. Die Reaktionsprodukte, die aus Streifen eines Schmelzagarosegels mit Hilfe von Gene Clean Glasperlen (Biolol, San Diego, CA) gereinigt wurden, wurden basisch denaturiert und mit T7-Pclymerase vom Cβseq-Primer sequenziert (Sequenase, United States Biochem. Cleveland, OH). Eine vorherrschende Vβ-Sequenz, die mit einer einzigen Vβ17-Umgruppierung gemäß Tabelle IX korrespondierte, war in der Probe 10121L2.d5 deutlich lesbar. Andere, weniger häufige Umgruppierungen wurden in den Sequenzgelen als schwache, nicht interpretierbare Hintergrundbanden nachgewiesen. Es wird nicht davon ausgegangen, daß eine Kultur dieser 1012.IL2-Kügelchen in IL2 enthaltendem Medium ohne zugegebene akzessorische Zellen oder Antigen eine de novo-Aktivierung von T-Zellen induzieren. Demgemäß reflektiert das Vorherrschen einer einzigen Vβ17-Umgruppierung in dieser Probe eine klonale in vivo-Expansion von Vβ17+-T-Zellen in diesem Patienten. Die Bestimmung der DNA-Sequenz der aus dem zytotoxischen T-Zellklon 1008.8 amplifizierten DNA für die β-Kette vom TCR ergab ebenfalls eine Vβ17-Umgruppierung (Tabelle IX). Das Vorhandensein von Vβ17-Umgruppierungen bei diesen beiden verschiedenen Typen von synovialen T-Zell-Proben, die von zwei verschiedenen RA- Patienten abgeleitet wurden, implizieren Vβ17 aufweisende T- Zellen bei der Pathogenese von RA. Tabelle IX Probe Tag 5
Das Vorhandensein von Vβ17-Umgruppierungen in den übrigen synovialen RNA-Proben wurde bewertet durch PCR-Amplifikation mit dem Vβ17-spezifischen Primer (Tabelle VIII). Die Vβ17-TCR-DNA wurde amplifiziert von aus jedem der sieben RA-Patienten abgeleiteten Proben von magnetischen Perlen. Eine Färbung der elektrophoretisch aufgetrennten Reaktionsprodukte mit Ethidiumbromid ergab verglichen mit den korrespondierenden mIgG-Kontrollen eine höhere Vβ17-Amplifikation bei vier der αIL2-R-Proben. Diese Anreicherung war kein Ergebnis des Isolierungsverfahrens, da die Amplifikation von Vβ8-TCRs zu keinen Unterschieden zwischen mIgG- und IL2-R-Proben führte.
Vβ17-Umgruppierungen von zwei der αIL2-R RNA-Präparationen wurden amplifiziert mit dem Primerpaar Vβ17 und Cβint, und die Reaktionsprodukte wurden mit dem Cβseq-Primer sequenziert. Die Proben 1014 und 1015 enthielten einzelne Seqeuenzen (Tabelle IX), die, ähnlich wie die Probe 1012IL2.d5, eine klonale Expansion von Vβ17-T-Zellen in vivo zeigen. Demgegenüber war ein direktes Sequenzieren der mit dem Vβ8-spezifischen Primer amplifizierten Umgruppierungen aufgrund der signifikanten Heterogenität in dem β-Kettenprodukt nicht möglich.
Vβ17 besitzt die Aminosäuresequenz MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS.

HLA-DR-Analyse bei Patienten mit rheumatoider Arthritis

Die HLA-DR-Analyse von Patienten mit rheumatoider Arthritis wurde wie folgt durchgeführt. Die DNA eines jeden Patienten wurde präpariert durch Kochen von 10&sup5; synovialen Zellen in 200 ul dH&sub2;O. 10 ul wurden über 35 Zyklen amplifiziert in einer 100 ul Reaktion (Cetus, Gene Amp Kit ) enthaltend 100 pmol von jedem der DRβ-PCR-Primer (Tabelle X). Ein Zehntel ul dieser Reaktion wurde reamplifiziert in 10 ul enthaltend lediglich den DRβ2- Primer und 17 pmol von α32P-dCTP als einzige Quelle für dCTP über 10 Zyklen. Die Reaktionen wurden mit 200 uM dCTP gestartet und über zwei Zyklen durchgeführt. Die resultierenden Minus- Strang-Sonden wurden mit 10 pmol der HLA-DR-Allel-spezifischen Oligos (Plusstränge) enthaltenden Slot-Blots hybridisiert unter Anwendung von Bedingungen, die zuvor von Amor et al., J Immunol., 138:1947 (1987), worauf hiermit Bezug genommen wird, beschrieben worden sind. Die Slots wurden zweimal 20 Minuten lang mit Tetramethylaminoniumchorid bei 65 - 68ºC gewaschen (Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1585 (1985)) und mit einem Röntgenfilm exponiert.
Jeder der Patienten dieser Studie besaß zumindest ein Allel der HLA-DR-Gene DR4w4, DR1, DR4W14 oder DR4w15, die für die Prädisposition von RA bekannt sind (Tabelle X). Tabelle X HLA-DR Allel-spezifische Oligonukleotide Gene Patient
T-Zell-Rezeptoren, die Vβ17 oder Fragmente davon enthalten, die immunogen sind oder immunogen gemacht werden können, können eingesetzt werden zur Immunisierung von menschlichen Individuen unter Anwendung der in Beispiel VII ausgeführten Verfahren. Derartige Impfungen können zu einer wirksamen Immunreaktion führen.
Obgleich die Erfindung unter Bezugnahme auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird darauf hingewiesen, daß vielfältige Modifikationen erfolgen können, ohne von dem Grundgedanken der Erfindung abzuweichen. Demgemäß wird die Erfindung lediglich durch die folgenden Ansprüche beschränkt.

Claims

1. Impfstoff zur Prävention oder Behandlung einer T-Zell-vermittelten Pathologie oder einer unregulierten klonalen T- Zell-Replikation in einem Säuger, umfassend eine in immunogener Hinsicht wirksame Menge eines T-Zell-Rezeptors oder Fragments desselben, welches mit einem T-Zell-Rezeptor korrespondiert, der auf der Oberfläche von T-Zellen vorhanden ist, die diese Pathologie vermitteln, und ein pharamzeutisch verträgliches Medium.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, bei dem die T-Zell-vermittelte Pathologie rheumatoide Arthritis ist, und bei dem der T- Zell-Rezeptor die Aminosäuresequenz MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS sowie Modifikationen, die die Fähigkeit des Rezeptors, als ein Immunogen zu wirken, nicht beeinflussen, und in immunogener Hinsicht repräsentative Fragmente desselben umfaßt.

3. Impfstoff nach Anspruch 1, bei dem das Fragment eine Sequenz der variablen Region des T-Zell-Rezeptors umfaßt.

4. Impfstoff nach Anspruch 3, bei dem die Sequenz der variablen Region die variable Region der β-Kette ist.

5. Impfstoff nach Anspruch 4, bei dem die T-Zell-vermittelte Pathologie rheumatoide Arthritis ist, und bei dem die variable Region der β-Kette im wesentlichen die Aminosäuresequenz MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS sowie Modifikationen, die die Fähigkeit des Rezeptors, als ein Immunogen zu wirken, nicht beeinflussen, und in immunogener Hinsicht repräsentative Fragmente desselben umfaßt.

6. Impfstoff nach Anspruch 5, bei dem die variable Region der β-Kette im wesentlichen die Sequenz SQIVNDFQK umfaßt.

7. Impfstoff nach Anspruch 1, bei dem das Fragment eine V(D)J- verknüpfende Sequenz umfaßt.

8. Impfstoff nach Anspruch 1, bei dem das Fragment eine Sequenz der verknüpfenden Region umfaßt.

9. Impfstoff nach Anspruch 1, ferner umfassend ein Adjuvans.

10. Impfstoff nach Anspruch 1, bei dem der Impfstoff mehr als einen Typ eines T-Zell-Rezeptors oder Fragments davon umfaßt.

11. Impfstoff nach Anspruch 1, bei dem der Impfstoff mehr als ein Fragment umfaßt, welches mit verschiedenen Sequenzen desselben T-Zell-Rezeptors korrespondiert.

12. Impfstoff nach Anspruch 1, bei dem das Fragment mit einem Träger konjugiert ist.

13. Impfstoff nach Anspruch 1, bei dem die T-Zell-vermittelte Pathologie Multiple Sklerose ist, und bei dem der Säuger ein Mensch ist, und bei dem das Fragment im wesentlichen die Sequenz SGDQGGNE in der Weise umfaßt, daß eine Immunantwort gegen T-Zell-Rezeptoren ausgelöst wird, die im wesentlichen die Sequenz SGDQGGNE aufweisen.

14. Impfstoff nach Anspruch 1, bei dem der T-Zell-Rezeptor die Sequenz SGDQGGNE umfaßt.

15. Verfahren zur Auswahl eines Impfstoffes zur Verwendung bei der Behandlung einer T-Zell-vermittelten Pathologie umfassend die Schritte:

a. Erhalt von T-Zell-Klonen, die diesen Zustand vermitteln,

b. Bestimmung der Aminosäuresequenz von T-Zell-Rezeptoren aus T-Zell-Klonen, die mit diesem Zustand assoziiert sind,

c. Auswahl von Segmenten derjenigen T-Zell-Rezeptoren, die für die assoziierten T-Zell-Rezeptoren, nicht aber für nicht-assoziierte T-Zell-Rezeptoren charakteristisch sind, und

d. Auswahl von Aminosäuresequenzen der ausgewählten Sequenzen, die in der Lage sind, eine immunogene Antwort auf den T-Zell-Rezeptor auszulösen, und dadurch Auswahl des Impfstoffes.

16. Verfahren zur Diagnose oder Vorhersage einer Empfänglichkeit für rheumatoide Arthritis in einem Individuum umfassend das Nachweisen von T-Zellen mit der variablen Region der β-Kette MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS oder eines Fragments derselben in einer Probe aus dem Individuum, wobei das Vorhandensein einer abnormen Expression von eine derartige Region enthaltenden T-Zellen eine rheumatoide Arthritis oder die Empfänglichkeit für rheumatoide Arthritis anzeigt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, welches das Nachweisen eines Bereichs der variablen Region der β-Kette umfaßt, welcher bei nicht mit rheumatoider Arthritis assoziierten T-Zell- Rezeptoren im wesentlichen nicht auftaucht.

18. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Probe dem Synovialgewebe entstammt.

19. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die variable Region der β-Kette durch Kontaktieren der Region mit einem nachweisbaren Liganden nachgewiesen wird.

20. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das Vorhandensein der variablen Region der β-Kette mit einer Nukleotidsonde nachgewiesen wird, welche komplementär zu der für diese Region kodierenden Nukleotidsequenz ist.

21. Impfstoff zur Prävention oder Behandlung einer T-Zell-vermittelten Pathologie oder einer unregulierten klonalen T- Zell-Replikation in einem Säuger, umfassend anti-idiotypische Antikörper, die innere Abbilder eines T-Zell-Rezeptors oder eines Fragments desselben sind, welches mit einem Zell- Rezeptor korrespondiert, der auf der Oberfläche einer T- Zelle vorhandenen ist, die diese Pathologie vermittelt, und ein pharmazeutisch verträgliches Medium.

22. Impfstoff nach Anspruch 21, bei dem das Fragment eine Sequenz der variablen Region des T-Zell-Rezeptors umfaßt.

23. Impfstoff nach Anspruch 21, bei dem das Fragment eine V(D)J- verknüpfende Sequenz umfaßt.

24. Impfstoff nach Anspruch 21, ferner umfassend ein Adjuvans.

25. Impfstoff nach Anspruch 21, bei dem der Impfstoff Anti-Idiotyp-Antikörper umfaßt, welche innere Abbilder von mehr als einem T-Zell-Rezeptor oder Fragment desselben sind.

26. Impfstoff nach Anspruch 21, bei dem das Fragment eine Sequenz der verknüpfenden Region umfaßt.

27. Verfahren zur Diagnose oder Vorhersage einer Empfänglichkeit für Multiple Sklerose in einem Individuum, umfassend das Nachweisen von T-Zellen mit im wesentlichen der Sequenz SGDQGGNE in einer Probe aus dem Individuum, wobei die Gegenwart derartiger T-Zellen eine Multiple Sklerose oder eine Empfänglichkeit für Multiple Sklerose anzeigt.

28. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem die Sequenz durch Kontaktieren der Sequenz mit einem nachweisbaren Liganden nachgewiesen wird.

29. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem das Vorhandensein der Sequenz mit einer Nukleotidsonde nachgewiesen wird, welche komplementär zu der für diese Sequenz kodierenden Nukleotid- Sequenz ist.

30. Peptid umfassend die Sequenz SGDQGGNE.