DE69014100T2

DE69014100T2 - Cdns des orsv-virus gens.

Info

Publication number: DE69014100T2
Application number: DE69014100T
Authority: DE
Inventors: Masaaki Chatani; Masato Ikegami; Keisuke Isomura; Yoshinori Matsumoto
Original assignee: Nippon Oil Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1989-11-28
Filing date: 1990-11-28
Publication date: 1995-06-14
Anticipated expiration: 2010-11-29
Also published as: EP0460217A1; EP0460217A4; DE69014100D1; WO1991008296A1; JPH04144685A; EP0460217B1

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA, die einem Gen des Odontoglossum Ringspot Virus (ORSV) entspricht, sowie ein Fragment oder komplementären Strang derselben.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine isolierte oder klonierte, cyclische oder lineare DNA, die dem Gen des ORSV und einem Fragment oder komplementären Strang derselben entspricht.
Die erfindungsgemäße DNA, das Fragment oder der komplementäre Strang des ORSV- Gens sind als Ausgangsmaterial für die Konstruktion von nützlichen Vektoren für Pflanzen geeignet. Sie sind außerdem für die Herstellung virusresistenter Orchideen geeignet.
Weiterhin sind die erfindungsgemäße DNA, das Fragment oder der komplementäre Strang des ORSV-Gens als Testreagenzien zum Nachweis von Virusgenen geeignet.
Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße DNA, das Fragment oder der komplementäre Strang des ORSV-Gens mit einem geeigneten Expressionsvektor zum Erhalt eines Virusproteins oder -peptids durch Expression in einer Wirtszelle ligiert werden. Solchermäßen hergestellte Virusproteine oder -peptide sind auch nützlich als Ausgangsmaterial bei der Herstellung von Testreagenzien zum Nachweis von Virusgenen.
ORSV gehört zu den cyclischen RNA-Viren, die hauptsächlich für Orchideen wie Cattleya, Cymbium, Dendrobium, Odontoglossum usw. ansteckend sind. Die Viruspartikel selbst sind schon isoliert worden (Nugaku Kenkyu, Vol. 60, Nov. 2, 53-67, 1983); dessen Gen als solches ist bisher jedoch noch nicht erhalten worden. Somit ist noch keine Information betreffend die genomische Struktur oder die Basensequenz des Genes veröffenflicht worden. Bislang war es nicht möglich, das Gen des ORSV zu nutzen.
Im allgemeinen wird von Viren stammende genomische DNA weitverbreitet entwickelt und in der Technik der rekombinanten DNA als Vektor nicht nur für tierische Zellen, sondern auch für andere Wirtszellen genutzt. Im Falle von Pflanzen ist es jedoch technisch schwierig, von Pflanzenviren stammende genomische RNA für die DNA-Rekombination zu nutzen, da die meisten Pflanzenviren RNA-Gene haben. Deshalb ist es notwendig, unter Verwendung eines Templates aus viraler RNA eine komplementäre DNA (cDNA) herzustellen.
Beispielsweise ist bisher gefünden worden, daß das Ti-Plasmid, welches von Agrobakterium tumefaciens getragen wird und in der Lage ist, in dicotylen Pflanzen wie Tomate oder Tabak Tumoren zu bilden, und die aus dem Blumenkohlmosaikvirus stammende DNA, der bei Kohl, Brassica campestris, Krankheiten verursacht, potentielle Vektoren für die DNA-Rekombination von Pflanzengenen sind. Nahezu alle Pflanzenviren fallen in die Klasse der RNA-Viren. Darüber hinaus sind ihre Aktivitäten zur Weiterverbreitung außerordenflich hoch. Aus dieser Beobachtung kann gefolgert werden, daß Pflanzenzellen einige für die Replikation von RNA geeignete physiologische Bedingungen beibehalten haben könnten.
In Anbetracht dieser Umstände wird erwartet, daß solche RNA-Vektorsysteme, welche von Pflanzenviren stammende Vektoren nutzen, für die DNA-Manipulation an Pflanzen sehr nützlich wären. Mit Ausnahme des Ti-Plasmids gibt es im Stand der Technik bislang jedoch noch keinen geeigneten Vektor, der in ein Chromosom einer Pflanzenzelle, in welcher der Expressionsgrad gering ist, eingebaut wird.
Es wird außerdem angenommen, daß unter Verwendung von RNA-Viren konstruierte RNA-Vektoren aufgrund der vom Chromosom unabhängigen Autosynthese stärker exprimiert werden als das Ti-Plasmid.
Aus oben genannten Gründen hat sich die Einführung von fremden Genen mit Hilfe des Ti-Plasmids im wesentlichen auf die Pflanzenzucht konzentriert und der Hauptzweck war die Einführung von Herbizidresistenzgenen. In Zukunft wird sich die Einführung neuer, selbstreplizierender RNA-Vektoren bei Pflanzen entwickeln und die Vorzüge der Pflanzenzelle oder gesamten Pflanze für die Produktion von wertvollen Proteinen wie tiereischen Hormonen wiederherstellen.
Darüber hinaus ist die Herstellung von wertvollen Proteinen in E. Coli im praktischen Einsatz mit einer großen Anzahl an Schwierigkeiten konfrontiert worden. Eine davon ist die, daß im Falle verstärkter Expression die fremden, exprimierten Proteine in Form von Inclusionbodies angelagert werden. Da E. Coli ein autotropher Einzeller ist, hat die Überschußproduktion von Fremdprotein nachteilige Auswirkungen auf den Mikroorganismus. Daher ist die Bildung von Inclusionbodies sinnvoll. Dies ist ein nicht zu vermeidender Nachteil bei der Herstellung wertvoller Proteine in E. Coli als Wirt.
Andererseits sind Pflanzenkörper sehr tolerant. Falls einige Blätter absterben, stört dies beispielsweise den gesamten Pflanzenkörper wenig. Aus der Natur der Pflanze heraus treten starke Exklusionsmechanismen einschließlich der Denaturierung und des Unlöslichwerdens sogar bei Überschußproduktion von fremden Proteinen selten auf.
Dementsprechend ist es nützlich, als RNA-Vektor eine cDNA zu entwickeln, die dem ORSV-Gen entspricht. Da die cDNA Gene für das virale Hüllprotein enthält, ist anzunehmen, daß die cDNA mit dem Ti-Plasmid ligiert werden kann, um durch den Einbau des resultierenden Vektors in ein Chromosom der Pflanzenzelle virusresistente Pflanzen zu erzeugen.
PNAS, USA, Bd. 79, 5.5818-5322, 1982, beschreibt die Nukleotidsequenz des TMV und EP-A-0 223 452 offenbart die Expression von TMV-Proteinen in Bakterien.
The Plant Viruses, Bd. 2, S.233-247, 1986, beschreibt die Eigenschaften von ORSV, gibt aber keine Informationen über seine genetische Natur. Beim Vergleich von ORSV mit anderen Viren ist anzumerken, daß einige der sogenannten "TMV-O"-Isolate als mit ORSV synonym angesehen werden können, daß aber der ORSV als von den anderen Tobamoviren wie U2-TMV, Tomatenmosaikvirus und TMV verschieden angesehen werden sollte.
Die Erfinder waren erfolgreich bei der Isolierung eines ORSV-Gens, bei der Herstellung einer cDNA desselben, indem sie das isolierte Virus RNA-Gen als Template einsetzten, bei der Klonierung der cDNA und bei der Expression des viralen Gens auf der klonierten cDNA in einer Wirtszelle. Die Erfinder haben herausgefunden, daß die cDNA geeignete Schnittstellen aufweist.
Die Erfinder waren darüber hinaus erfolgreich bei der Bestimmung der Basensequenz der dem ORSV-Gen entsprechenden cDNA. Im Ergebnis haben die Erfinder gefunden, daß auf Basis der veröffenflichten Basensequenzen mittels DNA-Rekombination neue Vektoren und Transformanden hergestellt werden können und daß der Virus mittels Einsatz der isolierten cDNA nachgewiesen werden kann.
Die Erfindung betrifft eine DNA, die den Odontoglossum Ringspot Virus (ORSV-) Genen entspricht, insbesondere dem aus Orchideen wie Cattleya, Cymbium, Dendrobium, Odontoglossum usw. isolierten, und ein Fragment oder komplementären Strang derselben.
Die in der Erfindung anvisierten Odontoglossum Ringspot Viren sind nicht auf die aus Orchideen isolierten beschiikt, sondern schließen diejenigen mit identischen Eigenschaften wie der im folgenden beschriebene Virus ein.
Die ORS-Viren, auf die in der Erfindung abgestellt wird, können auf naturliche oder künsfliche Weise durch Behandlung mit Mutagenen wie Nitroharnstoff, UV-Licht und Bestrahlung mutiert werden, ohne ihre Infektiösität ernsthaft zu beeinträchtigen.
Ein Teil des ORSV-Gens kann auf Grundlage seiner offenbarten Basensequenz durch Substitutionen, Deletionen oder Einfügungen modifiziert werden.
Es kann ergänzt werden durch Gene, die aus anderen Viren, Mikroorganismen, Tieren und Pflanzen stammen.
Die erfindungsgemäße DNA, die dem ORSV-Gen entspricht, meint gegebenenfalls ein Fragment oder eine Doppelstrang-DNA der vollen Länge, welche die in Fig. 1 dargestellte Basensequenz umfaßt. In Abbildung 1 stellt die obere Basensequenz eine cDNA dar, die einem (+)-RNA-Strang des ORSV-Genoms entspricht. Diese DNA umfaßt entweder die für das 33K-Protein oder die für das Hüllprotein kodierende DNA oder beide DNAs des ORSV-Genoms.
Die Erfindung betrifft nicht nur den zur viralen RNA komplementären DNA-Strang, sondern auch einen weiteren Strang.
Die Erfindung betrifft somit ein mögliches Fragment der in Abbildung 1 gegebenen Basensequenz. Solche Fragmente können von der Desoxynukleotidsequenz in Abb. 1 mit Hilfe einer geeigneten bekannten Restriktionsendonuklease allein oder im Zusammenspiel mehrerer solcher abgeleitet werden.
Beispiele solcher Restriktionsenzyme umfassen beispielsweise die in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Bd.30, Nr.13, S. 1429-1445 (1985), beschriebenen. Beispiele solcher DNA-Fragmente schließen Fragmente von etwa 3,87 kBp, etwa 1,58 kBp und ungefähr 1,58 kBp ein, die von der Basensequenz aus Abbildung 1 umfassenden DNA abgeleitet sind, welche an zwei Schnittstellen durch Behandlung mit Cla I geschnitten wird. Weitere Beispiele für DNA-Fragmente umfassen jene, die durch Behandlung mit jedem der in Abb. 2 gezeigten Restriktionsenzyme abgeleitet werden können.
Es ist offensichtlich, daß die Basensequenz der durch Abdauen der DNA aus Abb. 1 mit dem besagten Restriktionsenzym erhaltenen DNA-Fragmente über die Erkennungsspezifität jedes geeigneten Restriktionsenzyms und der in Abb. 1 dargestellten Desoxynukleotidsequenz bestimmt werden kann.
Die erfindungsgemäße cDNA kann modifiziert werden. Solche Modifikationen können Spaltungen, Deletionen, Insertionen, Additionen, Substitutionen und Ligationen der DNA-Kette einschließen.
Die so erhaltene, erfindungsgemäße DNA kann mit einer Exonuklease abgedaut oder mit einem Oligonukleotid oder Polynukleotid ligiert werden.
Die Erfindung betrifft außerdem eine DNA, die in der Lage ist, mit jedem möglichen Fragment sowie der gesamten Sequenz der in Abbildung 1 dargestellten Basen zu hybridisieren.
Beispiele für eine solche DNA umfassen diejenigen DNAs, die im wesentlichen mit jedem Teil oder dem gesamten Genom des ORSV identische oder ähnliche Funktionen aufweisen, und können auch eine dem Gen entsprechende cDNA, ein Fragment oder ein komplementärer Strang derselben sein.
Die erfindungsgemäße, dem ORSV entsprechende DNA kann durch ein Verfahren hergestellt werden, bei dem man aus mit dem betreffenden Virus infizierten Pflanzen Viruspartikel isoliert, die virale RNA von den Viruspartikeln abtrennt und mit Hilfe der reversen Transkriptase und unter Verwendung der viralen RNA als Template eine Synthese ausführt.
Die so erhaltene DNA wird mit einem zum Klonen geeigneten Vektor ligiert, in eine geeignete Wirtszelle eingebracht und geklont. Die geklonte DNA kann mit einem geeigneten Restiktionsenzym geschnitten und nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert, dem Kettenabbruchverfahren usw. sequenziert werden.
Die daraus offensichtliche DNA-Sequenz kann auf Basis der Information eingesetzt werden. Beispielsweise kann die DNA-Sequenz als Probe zur Untersuchung von Gendatenbanken, die aus natürlich auftretenden Genen oder über das Schrotschußverfahren erstellt sind, eingesetzt werden, um RNA und/oder die ihr entsprechende cDNA abzutrennen, welche im wesentlichen mit dem ORSV identische Funktionen hat.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Testverfahren zum Nachweis von ORSV- Genen, deren korrespondierender cDNA und Nukleinsäurefragmenten.
Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf ein Klonierungsverfahren für DNA, welche dem nachgewiesenen ORSV-Gen, einem Fragment oder komplementären Strang derselben oder deren Produkten entspricht.
Die Erfindung betrifft einen rekombinanten Vektor, der eine dem ORSV-Gen entsprechende DNA, ein Fragment oder einen komplementären Strang derselben trägt.
Insbesondere betrifft die Erfindung einen rekombinanten Vektor, der jedes mögliche Fragment und die gesamte Doppelstrang-DNA mit der in Abb. 1 gegebenen Basensequenz, ein Fragment oder einen komplementären Strang derselben trägt.
Der rekombinante Vektor kann eine Hybrid-DNA sein, die hergestellt wird, in dem man erfindungsgemäß die dem ORSV-Gen entsprechende DNA, ein Fragment oder einen komplementären Strang derselben in einen bekannten, vielseitig einsetzbaren oder im Handel erhältlichen Vektor aus dem Stand der Technik oder in einen aus einem anderen Vektor allein oder in Verbindung demselben geeigneter Weise hergestellten Vektor insertiert.
Beispiele für solche Gene umfassen E. Coli-Plasmid-, Cosmid oder Phagenvektoren, Plasmidvektoren für Bacillus, von Staphylococcus abgeleitete Plasmidvektoren, Hefevektoren, in verschiedenen Wirtszellen selbstreplizierende Shuttlevektoren und dergleichen. Diese Vektoren tragen üblicherweise einen geeigneten Promotor, Schnittstellen und Selektionsmarker. Vorzugsweise wird jedoch, abhängig vom Bedarf, in den Vektor eine weitere benötigte Funktion eingebaut.
Beispiele für solche E. Coli-Plasmidvektoren umfassen pBR322, pBR32s, pBR328, pUC 19, pUC 118, pUC 119, pMB9, pKC7 usw.. Beispiele für Cosmidvektoren umfassen pKY2662, pHC79, pJC720 usw.. Beispiele für Phagenvektoren umfassen λgt11, λgt.λC, λgt.λB', λ1059, EMBL3.4, λWES.λB', Charon 28, Charon 4A, λL 47-1, Charon 8, Charon 17, Charon 20, Charon 3A, Charon 16A, Charon 13A, Charon 14A, Charon 17A und dergleichen. Beispiele der Plasmidvektoren für Bacillus umfassen pUB110, pUB112, pHy300PKL, pTA1060, pTA1015, pTA1020, pTA1050, pTP4, pTPs, usw.. Beispiele für von Staphylococcus abgeleitete Plasmidvektoren umfassen pSA0501, pC194, pC221, pC223, pUB110, pUB112 und dergleichen. Beispiele für Hefevektoren sind Vektoren der Typen YRp, YEp sowie YRp-Vektoren, YEp-Typ-Vektoren, YRMp-Typ-Vektoren wie YRp7, Y1p32, YEp13, pYC1, pYC2, YIp1, pJDB248, pJDB219, pJDB248, pDB248, pGK-1,2, pLC544, pFYM2 und pFYM225. Beispiele für Shutflevektoren schließen pFYM22s, YRp7, von Y1p5 abgeleitete Plasmide, pTA1302 und die in verschiedenen Wittszellen replizierbaren Vektoren ein. Der Shuttlevektor kann diejenigen einschließen, in denen ein geeigneter Promotor oder eine geeignete Regulationssequenz eingebaut ist sowie auch die durch Kombination der Vektoren untereinander abgeleitet sind.
Hybridvektoren können durch Schneiden der die in Abb. 1 dargestellte Basensequenz enthaltenden doppelsträngigen DNA mit einem Restriktionsenzym, welches eine oder mehrere geeignete Schnittstellen spalten kann, und Ligation des erhaltenen Fragments an einen geschnittenen Vektor, der mit derselben Art Restriktionsenzym behandelt wurde, hergestellt werden.
Der erfindungsgemäße Hybridvektor kann wie folgt hergestellt werden:
Aus dem betreffenden Virus isolierte RNA wird als Template für die Synthese von cDNA verwendet, die dann mit einer DNA-Ligase wie T4-DNA-Ligase behandelt wird, um EcoRI-Adapter an beide Seiten des cDNA-Fragmentes zu binden. Die erhaltene DNA wird mit dem Produkt gemischt, welches aus dem oben erwahnten Vektor, z.B. pUC118, durch Abdauen mit EcoRI, gefolgt von einer Behandlung mit alkaliner Phosphatase, erhalten wird. Das resultierende Gemisch wird zum Binden und Zyklisieren mit einer DNA-Ligase wie der T4-DNA-Ligase behandelt.
Die Behandlung mit alkaliner Phosphatase kann durch eine andere Dephosphorylierungsbehandlung ersetzt werden. Eine Dephosphorylierungsbehandlung wird vorzugsweise durchgeführt, um die Selbstzyklisierung zu verhindern.
Beispiele für die in diesen Verfahren eingesetzten Restriktionsenzyme umfassen EcoRI, AccI, PstI, Hind III, MluI, XbaI, EcoRV, ApaI und dergleichen. Die Restiktionsenzyme können beispielsweise die in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Bd.30, Nr.13, S.1429-1445 (1985), beschriebenen oder andere bekannte Enzyme einschließen.
Die so erhaltene Hybrid-DNA kann in eine geeignete Wirtszelle eingebracht werden. Die Hybrid-DNA von E. Coli-Plasmidvektoren, Bacillus-Plasmidvektoren, von Staphylococcus abgeleiteten Plasmidvektoren, Hefevektoren und Shuttlevektoren kann in E. Coli, Bacillus, Staphylococcus bzw. Hefe sowie in geeignete Wirtszellen mittels üblicher Verfahren eingeführt werden.
Im Falle von E. Coli und Bacillus wird die geeignete Wirtszelle zunächst durch eine CaCl&sub2;-Behandlung in eine kompetente Zelle umgewandelt, die anschließend mit der so erhaltenen Hybrid-DNA gemäß üblicher Verfahren transformiert wird.
Im Falle von Hefe wird die Wirtszelle mit einem die Zellwand auflösenden Enzym wie Glusulase, Helicase und Zymolase behandelt und der gebildete Protoplast dann transformiert, beispielsweise in Anwesenheit von PEG und CA&spplus;&spplus; oder durch Behandlung mit einem Alkalimetallion wie Li&spplus; oder einem Reduktionsmittel wie 2-Mercaptoethanol.
Der so erhaltene Transformand kann über Wirkstoffresistenzen, Nährstoffanforderungen oder Koloniehybridisierung selektioniert werden.
Die Hybrid-DNA kann durch Insertion weitere fremde Gene enthalten. Fremde Gene können aus Viren, Pflanzen, Tieren, Bakterien, Pilzen usw. erhalten oder chemisch synthetisiert sein.
Das verwendete fremde Gen schließt vorzugsweise solche ein, die für die Transformation von Pflanzen geeignet sind. Beispiele solcher fremder Gene umfassen resistenzvermittelnde Gene gegen Schädlinge, Parasiten, Pathogene, Faktoren, welche die Resistenz oder Toleranz gegen Herbizide betreffen, Wachstumsregnlatoren, Gene zur Produktion industriell verwendbarer oder wertvoller Proteine oder Peptide oder anderer Substanzen und dergleichen.
Beispiele für resistenzvermittelnde Gene gegen Schädlinge oder Parasiten schließen insektizide Gifte erzeugende Gene gegen Insekten oder Nematoden, Gene zur Induktion von Proteinaseinhibitoren, zur Produktion von Ribosomen inaktivierenden Proteinen usw. ein.
Beispiele für die Resistenz oder Toleranz gegen Herbizide betreffende Faktoren umfassen Paraquat-, Sulfuron-, Sulfonamid- und Glyphosatresistenz vermittelnde Gene.
Beispiele für Resistenzvermittlung gegen Pathogene schließen Virus resistenzvermittelnde Gene und andere resistenzvermittelnde Gene gegen verschiedene Bakterientoxine, Kanamycin betreffende Resistenzfaktoren und dergleichen ein.
Beispiele für Wachstumregulatoren umfassen Gene, welche eine verbesserte Resistenz gegenüber hohen oder niedrigen Temperaturen, Wassermangel, Düngemitteln oder Nährstoffen verleihen usw.. Die Wachstumregulatoren umfassen außerdem Gene für die Regulation natürlicher Enzyme, Speicherproteine und dergleichen in Pflanzen sowie industriell verwertbare und wertvolle Proteine, Peptide und andere Substanzen und ähnliches.
Fremde Gene können auch andere Gene umfassen, die nützlich oder wertvoll sind, wenn sie in Pflanzen eingeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Transformation unten näher erläutert.
EcoRI-Adapter werden an beiden Seiten der in Abbildung 1 gezeigten DNA mit Hilfe der T4-DNA-Ligase ligiert und das Fragment in ein EcoRI-Fragment des E. Coli- Plasmidvektors pUC118 mit der T4-DNA-Ligase zum Erhalt einer Hybrid-DNA einligiert. E. Coli JM109 wird mit der Hybrid-DNA transformiert und der resultierende Transformand in einem 50 µg/ml Ampicillin enthaltenden Agarmedium inkubiert (100 mM IPTG und 2 % Gal auf der Oberfläche von 2 x TY). Die Kolonien werden dem blue-white-Selektionverfahren (Selektion über die Expression des lac-Z-Genes) unterworfen und die weißen Kolonien selektioniert.
Die Kolonien sind transformierte E. Coli JM109-Zellen, welche die Hybrid-DNA tragen, in der die DNA-Sequenz aus Fig. 1 an der EcoRI-Schnittstelle des Plasmids pUC118 insertiert ist. Die Hybrid-DNA kann über bekannte Verfahren aus dem Transformand isoliert werden.
Die Basensequenz der der gesamten Länge des ORSV-Genes entsprechenden cDNA kann auf diese Weise Schritt für Schritt durch Wiederholung des obigen Verfahrens bestimmt werden.
Die Hybrid-DNA kann, wie unten beschrieben, ohne Schneiden oder im Anschluß daran in den Vektor insertiert werden. Alternativ dazu kann die Hybrid-DNA zum Erhalt einer neuen Hybrid-DNA in geeigneter Weise behandelt und die resultierende Hybrid- DNA wieder in eine Wirtszelle eingeführt werden. Der so erhaltene Transformand kann weiterhin kultiviert werden.
Massenproduktion der betreffenden Hybrid-DNA kann durch Vermehrung der die Hybrid-DNA enthaltenden Transformanden, z.B. E. Coli JM109, erreicht werden, indem man bei Bedarf eine Behandlung anwendet, durch die ausschließlich die Hybrid- DNA vermehrt, die Zellen lysiert und die Hybrid-DNA aus einer diese enthaltenden, wäßrigen Lösung mittels Ultrazentrifugation, Elektrophorese usw. isoliert werden.
Im Falle der von dem E.Coli-Plasmid pUC118 stammmenden Hybrid-DNA wird der die Hybrid-DNA enthaltende E.Coli-Transformand der Vermehrung der Hybrid-DNA gemäß bekannter Verfahren unterworfen und anschließend lysiert. Die erhaltene DNA- Löung wird der Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation unterworfen, um kovalent geschlossene ringförmige Hybrid-DNA zu liefern.
Die isolierte Hybrid-DNA wird mit demselben Restriktionsenzym, welches zum Klonieren verwendet wurde, behandelt, so daß die dem ORSV-Gen entsprechende DNA oder ein Fragment derselben (insbesondere ein auszuwählender Teil oder die gesamte Länge der Basensequenz aus Abbildung 1) von dem Fragment der Vektor-DNA abgetrennt werden kann.
Das erhaltene DNA-Fragment wird zur Auftrennung der Agarose- oder Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen. Das die Bande des gewünschten DNA-Fragments tragende Gel wird ausgeschnitten, das gereinigte DNA-Fragment extrahiert und gemäß bekannter Verfahren von dem abgetrennten Gel isoliert.
Das so erhaltene DNA-Fragment kann in eine Expressionshybrid-DNA insertiert werden und die resultierende, rekombinante DNA in eine für die Expression geeignete Wirtszelle eingebracht werden.
Erfindungsgemäß können das 33K-Protein und das Hüllprotein des ORS-Virus über die Expression in der Wirtszelle erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Proteine können durch DNA-Rekombination modifiziert werden. Solche Modifikationen umfassen Spaltungen, Deletionen, Insertionen, Additionen, Substitutionen und Ligationen.
Die 33K-Proteine und Hüllproteine des ORS-Virus sowie deren Peptidfragmente umfassen jedes dieser modifizierten Produkte.
Das oben genannte 33K-Protein des ORS-Virus hat dem 33K-Protein des Tabakmosaikvirus (TMV) analoge Funktionen.
Die rekombinanten Vektoren der Erfindung können diejenigen Hybrid-DNAs einschließen, welche über die Insertion der dem ORSV-Gen entsprechenden DNA, einem Fragment oder einem komplementären Strang derselben in einen zur Transformation von Pflanzenzellen befähigten Vektor hergestellt werden.
Die zur Transformation von Pflanzenzellen oder -geweben befahigten Vektoren sind die dem Stand der Technik verbreitet bekannten, vielseitig verwendbaren oder im Handel erhältlichen Vektoren.
Beispiele für solche zur Transformation von Pflanzenzellen oder -geweben befähigten Vektoren können Ti-Plasmide oder deren Derivate, Ri-Plasmide oder deren Derivate, vom Blumenkohlmosaikvirus oder vom Geminivirus stammende Vektoren sowie als Hefevektoren identifizierte Shuttlevektoren und dergleichen sein. Das Ti- und das Ri- Plasmid werden von der gramnegativen Bakterienfamilie der Rhizobiaceae getragen, welche die Agrobacteria wie Agrobacterium tumefaciens und Agrobacterium rhizogenes umfaßt. Das Ti- bzw. das Ri-Plasmid induziert Krongallen oder Rhizogenie. Die zur Transformation von Pflanzenzellen oder -geweben befähigten Vektoren schließen außerdem diejenigen Vektoren ein, die sich autonom in Pflanzenzellen replizieren oder Pflanzenzellen transformieren können.
Beispiele für Ti-Plasmide oder deren Derivate umfassen die durch jedes Opin, z.B. Octopin, Nopalin, Agropin, klassifizierten, die T-DNA besitzenden und diejenigen, die durch Kombination von Genen betreffend den Abbau anderer Opine, Onkogene und Agrosinsensitivität sowie von die Replikation betreffenden Genen konstruiert wurden.
Beispiele für solche Plasmide umfassen Vektoren vom pMON-Typ, Plasmide vom unschädlich gemachten Typ wie pGV3850, binäre Vektoren usw..
Repräsentative Beispiele für solche Vektoren schließen pMON200, pMON505, pMON237 usw ein, wie in S.G.Rogers et al., Recombinant DNA Methodology, Hrsg.: Ray Wu et al., Academic Press, S.387-410 (1989) beschrieben.
Die Hybrid-DNA für Pflanzen ist für die Transformation von Pflanzen geeignet. Wenn ein Ti-Plasmid oder ein Derivat desselben eingesetzt wird, kann die Transformation das Einbringen der Hybrid-DNA in Agrobacterium tumefaciens mittels direkten Transfers autonom beweglicher Vektoren durch Hybridisierung zweier oder dreier Eltern, mittels direktem Einbaus, Sphäroblastenfusion mit anderen Hybrid-DNA enthaltenden Zellen, Liposomenverfahren oder mittels Transfektion nach der Verpackung, gefolgt von der Infektion mit Agrobacterium tumefaciens, umfassen. Im Falle des Ri-Plasmids oder dessen Derivaten wird Agrobacterium rhizogenes auf dieselbe Art und Weise wie Agrobacterium tumefaciens verwendet.
Alle von Fachleuten verbreitet verwendeten Verfahren können zur Infektion der Pflanzen mit Agrobacteria benutzt werden. Solche Verfahren können die Zugabe von Agrobakterien zu kultivierten Pflanzenzellen oder Geweben, gefolgt von Inkubation, die direkte Infektion kultivierter Pflanzen oder Protoplasten sowie die Zellfusion von Pflanzenprotoplasten und Bakteriensphärobiasten einschließen.
Die erfindungsgemäße Hybrid-DNA ist für die Transformation von Pflanzenzellen oder Geweben durch direkten Einbau geeignet. Solche Verfahren umfassen beispielsweise die Einführung von Pflanzenprotoplasten zusammen mit Träger-DNA in Pflanzenzellen in Anwesenheit von Polyethylenglykol usw., die Insertion der Hybrid-DNA in Liposomen aus Phosphatidylserin und Cholesterin, gefolgt von einer Behandlung der Pflanzenprotoplasten mit einer Lösung mit hohem pH-Wert, welche eine hohe Calciumkonzentration enthält, in Anwesenheit von Polyethylenglykol, die Mikroinjektion und die Elektroporation.
Die auf diese Weise transformierten Pflanzenzellen und Gewebe können mit üblichen Verfahren zum Erhalt von Pflanzen regeneriert werden.
Solche Pflanzen können sogar auf dem Feld oder im Gewächshaus kultiviert werden.
Die Erfindung betrifft die Transformanden, die über die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten, die dem ORSV-Gen entsprechende DNA, Fragmente oder komplementäre Strange derselben tragende Vektoren hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Transformanden.
Die Erfindung betrifft weiterhin Hybridisierungsverfahren unter Verwendung der dem ORSV-Gen entsprechenden DNA, eines Fragments oder eines komplementären Strangs derselben.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Hybridisierungsverfahren unter Verwendung jedes auszuwahlenden Fragments oder der gesamten Sequenz der doppelsträngigen DNA mit der in Abbildung 1 gezeigten Basensequenz.
Die Hybridisierung wird gemäß verschiedener bekannter Verfahren durchgeführt. Beispiele für die Hybridisierung werden im folgenden gegeben.
Virale DNA wird auf einem Nitrocellulosefilter fixiert und der Filter bei 37 - 42 ºC für eine Zeitdauer zwischen 3 Stunden bis über Nacht in einem Puffer äquilibriert, wobei der Puffer beispielsweise 25 mM KPO&sub4; (pH 7,4), 5 x SSC, 5 x Deuhard'sche Lösung [enthaltend 0,2 % Phykol (Molekulargewicht: 40000), 0,2 % Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht: 30000 - 40000) und 0,2 % Rinderserumalbumin (Fraktion V)], 50 µg/ml Lachsspermien-DNA und 50 % Formaldehyd enthält.
Der so behandelte Nitrocellulosefilter wird in einem Puffer bei 37 ºC bis 42 ºC für eine Zeit zwischen 6 Stunden bis über Nacht hybridisiert, wobei der Puffer eine aus einem Segment der entsprechenden, erfindungsgemäßen DNA zusammengesetzte Probe zusammen mit beispielsweise 25 mM KPO&sub4; (pH 7,4), 5 x SSC, 5 x Deuhard'sche Lösung, 50 µg/ml Lachsspermien-DNA, 50 % Formaldehyd und 10 % Dextransulfat enthält und anschließend der Filter im Hinblick auf hybridisierte, virale DNA getestet wird.
Die allgemeinen und üblichen, erfindungsgemäß verwendeten Verfahren zur DNA-Rekombination sind weitergehend beschrieben in T.Manniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); R.Wu et al., Methods in Enzymology, Bd.68 (1979), Bd.100 (1983) und Bd. 101 (1983), Academic Press; usw..
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung detaillierter erläutern und diese in keiner Weise beschränken.

Beispiel 1 Isolierung der Virus-RNA

Mit dem Odontoglossum Ringspot-Virus infizierte Blätter von Cymbidium wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, pulverisiert, in 0,1 % Thiogylkol enthaltendem Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert und anschließend durch Gaze filtriert.
Dann wurde die Suspension mit Tetrachlorkohlenstoff behandelt und Polyethylenglykol 6000, NaCl und Triton-X-100 zugegeben, um 6 % Polyethylenglykol 6000, 0,1 M NaCl und 1 % Triton-X-100 zu erhalten. Diese Lösung wurde 2 Stunden auf Eis stehengelassen. Dann wurde die Lösung zum Erhalt einer Viruspartikel enthaltenden Fraktion zentrifügiert (3000 UpM, 15 min, 4 ºC, TOMY-RS 20HB, Japan). Zu der Fraktion wurde Phosphatpuffer hinzugegeben und eine Suspension gebildet. Diese Suspension wurde zum Erhalt eines Niederschlags aus Viruspartikeln zentrifugiert (30000 UpM, 1 unStde, 4 ºC, Beckmann L8-70M 70.1 Ti-Rotor, USA).
Die erhaltenen Viruspartikel wurden anschließend der Zentrifugation in einem Sucrosedichtegradienten von 10 % - 40 % unterworfen (25700 UpM, 2 Stunden, 4 ºC, Beckmann SW 40 Ti, USA).
Der Virus wurde über die Fraktionierung durch den Boden des Zentrifugenröhrchens gereinigt.
Die Virus-RNA wurde gemäß herkömmlicher Methoden nach dem SDS-Phenol-Verfahren aus den gereinigten Viruspartikeln extrahiert.

Beispiel 2 Herstellung der cDNA aus der Virus-RNA

An das 3'-Ende der gereinigten, aus Beispiel 1 erhaltenen Virus-RNA wurde durch Behandlung mit Poly(A)-Polymerase ein Poly(A) anligiert.
Der erste zur Virus-RNA komplementäre DNA-Strang wurde gemäß üblicher Methoden unter Verwendung der AMV-reversen-Transkriptase und einem Oligo d(T) als Primer hergestellt.
Anstelle des obigen Oligo d(T) Primers kann auch ein synthetischer Primer eingesetzt werden, der unter Bezugnahme auf die Information über die virale Basensequenz Synthetisiert wurde. Die so erhaltene, aus viraler RNA-DNA bestehende Hybrid-DNA wurde mit RNase H behandelt, so daß die RNA in Stücke zerlegt wurde. Der zweite, zu dem ersten DNA-Strang komplementäre DNA-Strang wurde mit Hilfe der DNA- Polymerase I in Anwesenheit der zerstückelten RNA als Primer synthetisiert. Beide Enden der cDNA wurden mit dem Klenow-Fragment behandelt, um die überstehenden Enden zu entfernen und glatte Enden zu erzeugen.
Zur Durchführung der obigen Behandlungen können verschiedene Kits und darin enthaltene Reagenzien verwendet werden, die von Amasham, Japan, Pharmacia, Schweden, Cosmo Bio, Japan, Seikagagaku Kougyo K.K., Daiichi Chemical Co Ltd., Takara Shuzou K.K., Wako Pure Chemical K.K. usw. bezogen werden können.

Beispiel 3 Klonieren der viralen cDNA

Die in Beispiel 2 hergestellte DNA wurde mit T4-DNA-Ligase entsprechend den üblichen Verfahren behandelt, um an beiden Enden Eco RI-Adapter anzufügen.
Obwohl die so erhaltene DNA mittel Insertion in verschiedenste Vektoren gemäß üblicher Verfahren kloniert werden kann, illustriert das hier gegebene Beispiel die Klonierung unter Einsatz des Escherichia Coli-Plasmids pUC118. Die nach Beispiel 2 oben hergestellte DNA, in der an beiden Seiten der DNA der Eco RI-Adapter angefügt war, wurde mit Polynukleotidkinase entsprechend dem üblichen Vorgehen behandelt, um den Anteil des Eco RI-Adapters zu phosphorylieren.
Das Plasmid pUC118 wurde für 2 Stunden bei 37 ºC mit dem Restriktionsenzym Eco RI geschnitten. Das linare pUC118 wurde zur Inaktivierung des Restriktionsenzyms mit Phenol behandelt und auf übliche Weise mit alkaliner Phosphatase dephosphoryliert.
Jede so erhaltene DNA wurde durch Ethanolfällung wiedergewonnen und im Ligationspuffer gelöst (66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DDT und 0,1 mM ATP). Dann wurde die Lösung gemischt und T4-DNA-Ligase der gerührten Lösung zugesetzt, gefolgt von Inkubation für 2 Stunden bei 16 ºC zur Ligation entsprechend den üblichen Verfahren.
Die Transformation kompetenter E. Coli JM109 mit dem Reaktionsgemisch wurde auf übliche Weise mittels eines Calciumchloridverfahrens durchgeführt. Die transformierten E. Coli JM109-Zellen wurden nach dem Indiz selektioniert, daß sie ampicillinresistent und unfähig waren, das Lac-Z-Gen zu exprimieren, wodurch letztlich E. Coli-Kolonien erhalten wurden, die das Plasmid tragen, m dem die dem ORSV-Gen entsprechende DNA oder ihr Fragment an der Eco RI Schnittstelle von pUC118 insertiert war. Vier kolonien wurden aus den so erhaltenen E. Coli-Kolonien selektioniert. Aus diesen Kolonien wurde das Plasmid, in welches die dem ORSV-Gen entsprechende DNA oder ihr Fragment insertiert war, isoliert.
Die so erhaltenen Plasmide werden mit pORE5-25, pORE6-45, pORE1033 und pORS24 bezeichnet. Die von jedem Plasmid kodierte Region ist in Abb. 2 angegeben.
Zur Durchführung der obigen Verfahrensschritte können verschiedenste, käuflich erhältliche Kits und Reagenzien, wie in Beispiel 2 erwähnt, verwendet werden.

Beispiel 4 Bestimmung der Basensequenz der viralen cDNA

Die Basensequenz der DNA wurde unter Verwendung des in Beispiel 3 erhaltenen Plasmids entsprechend dem in Abbildung 2 illustrierten Sequenzierungsplanes bestimmt.
Die Sequenzierung der DNA wurde über die Fraktionierung mit einem geeigneten Restriktionsenzym, die Klonierung der zu bestimmenden DNA-Fragmente mit dem von J. Messing et al. entwickelten Phagenvektor M13 oder mit dem Plasmidvektor pUC181/119 und anschließend über das von P. Sauger et al. (Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Bd.29, Nr.4, S.294-306 (1984)) entwickelte Dideoxyverfahren ausgeführt.
Jedes Fragment wird in die Klonierungsstelle von pUC118 oder pUC119 zum Analysieren der Basensequenz, ausgehend von den Schnittstellen jeweils von Eco RI, AccI, Psfl, Hind III, MluI, XbaI, Eco RV und ApaI, wie in Abbildung 2 gezeigt, insertiert; falls es jedoch unmöglich ist, die DNA in Fragmente geeigneter Größe zu zerlegen, wird die Sequenzierung erreicht, nachdem die DNA mit Exonuklease III zur Erstellung verschiedener Fragmente geeigneter Größe behandelt wurde. Die dem ORSV-Gen entsprechende DNA-Basensequenz ist, wie sie nach obiger Vorgehensweise festgelegt wurde, in Abb. 1 dargestellt.
Obwohl die in Abbildung 1 dargestellte DNA-Basensequenz nicht mit der gesamten Länge des ORSV-Gens identisch ist, enthält sie die für das 33K Protein und ein Hüllprotein des ORS-Virus kodierenden Regionen.
In der in Abbildung 1 dargestellten Sequenz repräsentiert die obere Sequenz die dem (+)-Strang des ORSV-Genoms entsprechende cDNA.
Wenn die Basenregion zwischen den Basen 5107 und 5538 der Basensequenz gemäß Abb. 1 exprimiert wurden, wurden Expressionsprodukte erhalten, die eine Aktivität als virales Hüllprotein aufwiesen. In Abbildung 1 steht die obere Sequenz zwischen beiden Ketten für eine Sequenz mit einer Richtung vom 5'-Terminus zum 3'-Terminus und die untere Sequenz repräsentiert eine zur oberen Sequenz komplementäre Sequenz, in 3'-5'- Richtung von links gelesen.

Beispiel 5 Expression von Virusprotein

Die folgenden Beispiele illustrieren die Abtrennung eines für ein virales Protein kodierenden Gens aus den in Abbildung 1 gegebenen Basensequenz, die Konstruktion eines Expressionsvektors aus diesem Gen, anschließende Transformation einer Wirtszelle mit diesem Vektor und Kultivierung der Wirtszelle, um ein als Virusprotein definiertes Protein herzustellen.

(1) Abtrennung des Gens für virales Hüllprotein

Die in Abb. 1 gezeigte Basensequenz wurde auf offene Leserahmen (ORF) hin untersucht.
Unter den gefundenen ORFs wurde durch Vergleich mit der genomischen Struktur des TMV ein Leserahmen ausgewahlt, welcher eine vergleichbare Größe und Lage hat und in der Lage ist, für ein Protein mit ähnlichem Molekulargewicht wie das Hüllprotein des Tabakmosaikvirus (TMV) zu kodieren. Von den Basen 5107 bis 5583 der in Abb.1 dargestellten Basensequenz wird angenommen, daß sie das Gen für das ORSV-Hüllprotein kodieren.
Anschließend wurde das DNA-Fragment mit Hilfe von Restriktionsenzymen ausgeschnitten. Zunächst wurden die DNA-Fragmente mit dem Genabschnitt, von dem angenommen wurde, daß er für das Hüllprotein kodiert, beispielsweise pORE5-25, pORE1033 und pORE6-45, mit den Restriktionsenzymen XbaI (bei 4950) und NsiI (bei 5639) entsprechend den in Beispiel 3 beschriebenen üblichen Vorgehensweisen zum Erhalt eines XbaI-NsiI-Fragmentes behandelt. Aus diesem Fragment wurde, wie in Abb. 3 dargestellt, ein Expressionsvektor gebildet. Das XbaI-NsiI-Fragment wurde an die Xbal und PstI-Schnittstelle des Plasmidvektors pUC119 mittels üblicher Verfahren, wie in Beispiel 3 beschrieben, ligiert. Die so erhaltene Hybrid-DNA wurde, entsprechend Beispiel 3, auf übliche Weise in E. Coli JM1009 eingebracht und subkloniert. Die transformierten E. Coli-Kolonien wurde selektioniert.
Die betreffende, subklonierte Hybridplasmid-DNA wurde aus den transformierten E. Coli-Kolonien wiedergewonnen. Das Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und Smal gemäß den Standardverfahren, wie im Beispiel beschrieben, zur Linearisierung behandelt. Das lineare Plasmid wurde wie üblich mit Exonuklease III deletiert. Diese Deletierung wurde solange fortgesetzt, bis nur noch vier Basen vor der Initiationstelle, ATG, der Translation des Leserahmengens, welches für das virale Hüllprotein kodiert, verblieben.
An das glatte 5'-Ende wurde ein Eco RI-Linker ligiert und das Plasmid wie üblich mit Hnd II behandelt, um ein das Leserahmengen für das virale Hüllprotein tragendes Eco RI-Hind II-Fragment zu erzeugen.

(2) Expression des Gens für das virale Hüllprotein

Das virale Hüllproteingen tragende DNA-Fragment wurde in die Eco RI-Hind II- Schnittstelle des Expressionsvektors pKK223-3 für E. Coli gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Standardverfahren eingebaut. Die kompetenten E. Coli JM109- Zellen wurde gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Standardverfahren transformiert.
Die so erhaltenen E.Coli-Transformanden wurden in Ampicillin enthaltendem (50 µg) 2 X TY-Medium (5 ml) über Nacht inkubiert. Ein Aliquot der Kultur (509 µl) wurde weiterhin in frischem Medium (2 X TY-Medium, 5 ml) kultiviert (37 ºC, 2,5 Std.). Zu der Kultur wurden 5 µl 500 mM IPTG (Endkonzentration 0,1 mM) zugefügt, gefolgt von Inkubation bei 40 ºC für 1,5 Stunden. Die so erhaltene Kultur wurde 5 Minuten mit Eis geküült. Aus 2 ml der Kultur wurden über übliche Verfahren die E. Coli-Zellen wiedergewonnen, mit TE-Puffer gewaschen und in 100 µl NaKPO&sub4; (pH 7,0) suspendiert. Diese Suspension zur Solubilisierung der Proteine aus E. Coli wurde mittels Ultraschall (ein Zyklus umfassend 1 Minute Beschallung in einem Abstand von 30 Sekunden, 6-mal wiederholt) aufgebrochen. Die solubilisierten Proteine wurden der Elektrophorese auf einem 15 %igen SDS-Polyacrylamidgel unterworfen und anschließend von dem Gel mittels Elektroblotting auf Nitrocellulosefilter überführt. Die Filter wurden gemäß der üblichen Verfahren unter Einsatz eines Immunoblotting-Tests (Westernblot) auf die Anwesenheit eines Proteins hin untersucht, welches mit einem Antiserum gegen das Odontoglossum Ringspot Virus reagieren kann.
Wie in Abb. 3 dargestellt, reagierte das aus den transformierten E. Coli JM109-Zellen (bezeichnet als pORCP-D83) Protein mit dem Antiserum gegen ORSV. Dieses isolierte Protein wurde als das Hüllprotein des ORS-Virus identifiziert.
Der obige Transformand E.Coli JM109 (hier als pORCP-D83 bezeichnet) wurde am 27. November 1989 im Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, MITI, Japan, hinterlegt und erhielt das Zeichen FERM P-11134.
(3) Durch Wiederholung vergleichbarer Verfahrensschritte wird das virale 33K-Protein erhalten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Abbildung 1 stellt die Polynukleotidbasensequenz des ORSV-Gens dar. Die obere Basensequenz stellt eine einem (+)-Strang des viralen Genoms entsprechende cDNA dar.
Abbildung 2 zeigt eine Anleitung zu DNA-Sequenzierung und die wesenflichen verwendeten Schnittstellen. Jeder Pfeil gibt die Sequenzierrichtung der Basen zusammen mit der Länge des DNA-Fragments an.
Abbildung 3 enthält die Konstruktion eines Expressionvektors für das ORSV-Hüllprotein.
Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse des Immunoblotting-Tests zur Identifizierung des rekombinanten ORSV-Hüllproteins. Spuren A, B und C repräsentieren jeweils ORS- Viruspartikel, aus E. Coli extrahierte Proteine bzw. aus den transformierten E. Coli JM109-Zellen (pORCP-D83) extrahierte Proteine dar.

Claims

1. Isolierte DNA-Sequenz, entsprechend (1) einem Genom des Odontoglossum Ringspot Virus (ORSV) oder einem Fragment derselben, welches durch Spaltung mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen ausgewählt aus EcoRI, AccI, PstI, HindIII, HpaI, MluI, XbaI und ApaI erzeugt wird, oder entsprechend (2) einer zu (1) komplementären Sequenz.

2. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, bei der das ORSV-Genom die Sequenz hat:

3. DNA-Sequenz, welche mit einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 unter den folgenden Bedingungen hybridisieren kann:

(i) wird die DNA-Sequenz auf einem Nitrocellulosefilter fixiert und der Filter bei 37 - 42 ºC für eine Zeitdauer von 3 Stunden bis über Nacht in einem Puffer äquilibriert, der 25 mM KPO&sub4; (pH 7,4), 5 x SSC, 5 x Deuhard'sche Lösung [enthaltend 0,2 % Phycol (Molekulargewicht 40000), 0,2 % Polyvinylpyrrolidin (Molekulargewicht: 30000 - 40000) sowie 0,2 % Rinderserumalbumin (Fraktion V)], 50 µg/ml Lachsspermien-DNA und 50 % Formaldehyd enthält,

(ii) wird der Filter anschließend bei 37 - 42 ºC für eine Zeitdauer von 6 Stunden bis über Nacht in demselben Puffer äquilibriert, wobei der Puffer dahingehend modifiziert ist, daß er zusätzlich 10 % Dextransulfat und eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 enthält, und

(iii) wird der Filter danach auf die Hybridisierung zwischen der fixierten DNA und der DNA gemäß Anspruch 1 und 2 getestet.

4. Verfahren zur Herstellung der DNA gemäß einem der Ansprüche 1 - 3, welches die Isolierung eine RNA-Gens eines Odontoglossum Ringspot Virus und die Herstellung einer zu der isolierten, viralen RNA komplementären cDNA umfaßt.

5. Verfahren zur Herstellung der DNA gemäß Anspruch 4, welches außerdem die Klonierung der erhaltenen cDNA umfaßt.

6. Rekombinanter Vektor, der eine gemäß einem der Ansprüche 1 - 3 isolierte DNA umfaßt.

7. Transformand, welcher einen rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 6 umfaßt.

8. Transformand gemäß Anspruch 7, bei dem die Wirtszelle aus der aus E. Coli, Bacillus, Hefe, Agrobacterium und Pflanzenzellen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Transformanden, welches die Transformation einer Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 6 umfaßt.

10. Verfahren zum Nachweis eines mit dem Odontoglossum Ringspot Virus verwandten Genes, welches die Hybridisierung einer Nukleinsäure, die aus der aus RNA-Genen des Odontoglossum Ringspot Virus und der durch reverser Transkription des Virus- RNA-Genes oder Klonierung erhaltenen cDNA bestehenden Gruppe ausgewählt ist, mit einer Probe, bestehend aus der isolierten DNA gemäß einem der Ansprüche 1 - 3, und den Nachweis des hybridisierten Produktes umfaßt.

11. 33K-Protein oder Hüllprotein, hergestellt durch Expression der rekombinanten DNA des ORSV.

12. Peptidfragment zur Verwendung als Testreagenz zum Nachweis von ORSV-Genen, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptidfragment durch Expression einer rekombinanten DNA mit einer Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 3 erhalten wird.