DE69023637T2

DE69023637T2 - Bakterien transformiert mit Expressionsplasmiden, die für den menschlichen NEUROTHROPHEN WIMPER FAKTOR (h-CNTF) kodieren, ihre Verwendung in der Herstellung von h-CNTF, Antikörper gegen h-CNTF und die Anwendung von h-CNTF in medizischer Behandlung.

Info

Publication number: DE69023637T2
Application number: DE69023637T
Authority: DE
Inventors: Yoshihiro D-8000 Muenchen 71 Arakawa; Patrick Desmond D-8000 Muenchen 2 Carroll; Mark E. Pelham Ny 10803 Furth; Rudolf Georg D-8000 Muenchen 60 Gotz; Nancy Stamford Ct 06902 Ip; Georg W. D-8000 Muenchen 60 Kreutzberg; Dan B. D-8000 Muenchen 60 Lindholm; Friedrich D-8021 Neuried Lottspeich; Piotr Tarrytown Ny 01591 Masiakowski; Nikos Orangeburg Ny 10962 Panayotatos; Michael D-8000 Muenchen 21 Sendtner; Kurt A. D-8000 Muenchen 70 Stockli-Rippstein; Hans Friedrich Erwin D-8000 Muenchen 40 Thoenen; Vivien Ardsley Ny 10502 Wong
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-09-15
Filing date: 1990-09-14
Publication date: 1996-10-17
Anticipated expiration: 2010-09-15
Also published as: EP0448707B1; WO1991004316A2; US6602687B1; ES2084045T3; AU705371B2; WO1991004316A3; DE69023637D1; CA2040404A1; LV10308A; AU6740290A; ATE130365T1; EP0448707A4; EP0448707A1; JPH05199879A; IE903130A1; JP2001354697A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Bakterien, die Expressionsvektoren enthalten, welche einen menschlichen ziliaren neurotrophen Faktor (h- CNTF) codieren, ihre Verwendung zur Herstellung von h-CNTF, Antikörper gegen h-CNTF und die Verwendung von h-CNTF zur Behandlung von neurologischen Störungen.

2. STAND DER TECHNIK

2.1. BIOLOGIE DER NEUROTROPHEN FAKTOREN

Mehrere Faktoren wurden identifiziert, die das Wachstum und die Entwicklung im Nervensystem beeinflussen. Diese Faktoren spielen vermutlich eine wichtige Rolle dabei, das Überleben von Neuronen-Populationen sowohl im reifen als auch im unreifen Nervensystem zu fördern.
In der normalen Entwicklung vieler Neuronen-Populationen gibt es eine definierte Zelltod-Periode, in der viele Mitglieder der ursprünglichen Population absterben (Hamburger und Levi-Montalcini, J. Exp. Zool. III (1949), 457-501; Hamburger, Amer. J. Anat. 102 (1958), 365-410; Hamburger, J. Comp. Neurol. 160 (1975), 535-546; Cowan und Wenger, Z. Exp. Zool. 168 (1968), 105-124; Rogers und Cowan, J. Comp. Neurol. 147 (1973), 291-320; Clarke und Cowan, J. Comp. Neurol. 167 (1976), 143-164; Clarke et al., J. Comp. Neurol. 167 (1976), 125-142; Hollyday und Hamburger, J. Comp. Neurol. 170 (1976), 311-320; Varon und Bunge, Annu. Rev. Neurosci. 1 (1978), 327-362; Cowan et al., Science 225 (1984), 1258-1265). Es wurde gezeigt, daß das Überleben von Neuronen proportional zur Größe des innervierten Gebiets ist; je kleiner der Zielbereich einer bestimmten Neuronen- Population ist, desto kleiner ist die Anzahl von Neuronen, welche die Periode, in der die Zellen absterben, überlebt. Es wurde vorgeschlagen, daß die Menge des im Zielbereich vorliegenden neurotrophen Faktors mit dem Überleben der Neuronen im Zusammenhang stehen könnte.
Der Nervenwachstumsfaktor (NGF) ist der bei weitem am besten charakterisierte Vertreter dieser neurotrophen Moleküle, wobei gezeigt wurde, daß er sowohl in vitro als auch in vivo für das Überleben von sympathischen und aus der Neuralleiste hergeleiteten neuralen sensorischen Neuronen während der frühen Entwicklung von Hühnern und Ratten essentiell ist (Levi-Montalcini und Angeletti, Develop. Biol. 7 (1963), 653-659; Levi- Montalcini et al., Physiol. Rev. 48 (1968) 524-569). Es wurde gefunden, daß Injektionen von gereinigtem NGF in den sich entwickelnden Hühnerembryo eine massive Hyperplasie und Hypertrophie der spinalen sensorischen Neuronen und der sympathischen Neuronen bewirken (Levi-Montalcini und Booker, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 46 (1960), 373-384; Hamburger et al., J. Neurosci. 1 (1981), 60-71). Umgekehrt war die Entfernung oder Ausschaltung von endogenem NGF durch tägliche Injektion von Anti-NGF-Antikörpern bei neugeborenen Ratten mit einer tatsächlichen Zerstörung des sympathischen Nervensystems assoziiert (Levi-Montalcini und Booker, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46 (1960), 384-391; Levi-Montalcini und Angeletti, Pharmacol. Res. 18 (1966), 619-628). Es wurde gezeigt, daß die Exposition gegenüber NGF-Antikörpern sogar früher in der Entwicklung entweder durch Antikörper- Injektionen in utero oder durch passive transplacentale Übertragung von mütterlichen Antikörpern zu einem wesentlichen Verlust von aus der Neuralleiste hergeleiteten sensorischen Neuronen, wie z.B. spinalen und dorsomedialen trigeminalen sensorischen Neuronen, führt (Goedert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 1580-1584; Gorin und Johnson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 5382-5386). Bis vor kurzem konzentrierten sich fast alle Studien über NGF auf seine Rolle im peripheren Nervensystem, nun gibt es jedoch Hinweise, daß NGF auch die Entwicklung und Erhaltung spezifischer Populationen von Neuronen im zentralen Nervensystem beeinflußt (Thoenen et al., Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 109 (1987), 145-178; Whittemore und Seiger, Brain Res. Rev. 12 (1987), 439-464).
Neurotrophe Faktoren, die noch nicht so gut charakterisiert wurden wie NGF, umfassen den aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF) und den ziliaren neurotrophen Faktor (CNTF).

2.2. ZILIARER NEUROTROPHER FAKTOR

Die ziliaren neurotrophen Faktoren (CNTFs) sind Proteine, die in vitro spezifisch für das Überleben von Ziliarganglion-Neuronen von Hühnerembryos nötig sind (Manthorpe et al., J. Neurochem. 34 (1980), 69-75). Das Ziliarganglion ist anatomisch in der Augenhöhle lokalisiert, wobei es zwischen dem M. rectus lateralis und der Scheide des Sehnerv liegt; es nimmt parasympathische Nervenfasern aus dem okulomotorischen Nerv entgegen, die den Ziliarmuskel und den Sphinkter pupillae und außerdem den glatten Muskel, der in der Choroidea-Schicht des Auges vorliegt, innervieren.
Es wurde gefunden, daß die Neuronen des Ziliarganglions zu den Neuronen-Populationen zählen, bei denen das Absterben von Zellen in bestimmten Perioden auftritt. Im Ziliarganglion des Huhnes wurde beobachtet, daß die Hälfte der Neuronen, die am embryonalen Tag 8 (E8) vorliegen, vor E14 absterben (Landmesser und Pilar, J. Physiol. 241 (1974), 737-749). In der gleichen Zeit bilden die Neuronen des Ziliarganglions Verbindungen mit ihren Zielgeweben, nämlich dem Ziliarkörper und der Choroidea-Schicht des Auges. Landmesser und Pilar (J. Physiol. 241 (1974), 715-736) beobachteten, daß die Entfernung eines Auges vor der Periode, in der die Zellen absterben, zu einem fast vollständigen Verlust von Neuronen des Ziliarganglions im ipsilateralen Ganglion führt. Umgekehrt beobachteten Narayanan und Narayanan (J. Embryol. Ex. Morphol. 44 (1978), 53-70), daß durch die Implantation einer weiteren embryonalen Augenanlage und durch die auf diese Weise erhaltene Vergrößerung der Menge des verfügbaren Zielgewebes, das Absterben von Neuronen des Ziliarganglions vermindert werden kann. Diese Ergebnisse sind mit dem Vorliegen eines neurotrophen Faktors vereinbar, der auf die Neuronen des Ziliarganglions einwirkt.
Bei der Züchtung von Neuronen des Ziliarganglions (CG) wurde gefunden, daß sie fürs Überleben einen Faktor oder Faktoren benötigen. Die Aktivität von ziliaren neutrophilen Faktor(en) (CNTF) wurde in durch Hühnermuskelzellen konditionierten Medien identifiziert (Bennett und Nurcombe, Brain Res. 173 (1979), 543-548; Nishi und Berg, Nature 277 (1979), 232- 234; Varon et al., Brain Res. 173 (1979), 29-45), in Muskelextrakten (McLennan und Hendry, Neurosci. Lett. 10 (1978), 269-273; Bonhady et al., Neurosci. Lett. 18 (1980), 197-201), in Extrakt aus Hühnerembryos (Varon et al., Brain Res. 173 (1979), 29-45; Tuttle et al., Brain Res. 183 (1980), 161-180) und in durch Herzzellen konditioniertem Medium (Helfand et al., Dev. Biol. 50 (1976), 541-547; Helfand et al., Exp. Cell Res. 113 (1978), 39-45; zur Diskussion, vgl. auch Adler et al., Science 204 (1979), 1434-1436, und Barbin et al., J. Neurochem. 43 (1984), 1468-1478).
Adler et al. (Science 204 (1979), 1434-1436) verwendeten ein Testsystem, das auf Kulturen von CG-Neuronen in Mikrovertiefungen beruhte, wobei gezeigt wurde, daß eine sehr reiche Quelle von CNTF in den intraokularen Zielgeweben, die die CG-Neuronen innervieren, gefunden wurde. Von den 8000 trophischen Einheiten (TU), die in einem Zwölf-Tage-Embryo vorlagen, wurden 2500 TU im Augengewebe gefunden; die Aktivität schien in einer Fraktion lokalisiert zu sein, die den Ziliarkörper und die Choroidea-Schicht enthielt, wobei eine spezifische Aktivität vorlag, die um etwa das Zwanzigfache höher war als die Aktivität, die in Extrakten des gesamten Embryos gefunden wurde.
Anschließend beschrieben Barbin et al. (J. Neurochem. 43 (1984), 1468-1478) ein Verfahren zur Reinigung von CNTF aus Augengewebe des Hühnerembryos. Es wurde außerdem gefunden, daß die CNTF-Aktivität mit Nicht- CG-Geweben, einschließlich Ischiasnerven der Ratte, assoziiert ist (Williams et al., Int. J. Develop. Neurosci. 218 (1984), 460-470). Manthorpe et al. (Brain Res. 367 (1986), 282-286) berichteten über die Reinigung von Säuger-CNTF-Aktivität aus Extrakten von Ischiasnerven erwachsener Ratten unter Verwendung eines Fraktionierungsverfahrens, das dem Verfahren ähnlich ist, das für die Isolierung der CNTF-Aktivität aus dem Hühnerauge verwendet wurde. Außerdem haben Watters und Hendry (J. Neurochem. 49 (1987), 705-713) ein Verfahren zur Reinigung der CNTF-Aktivität um das etwa 20 000-fache aus Herzgewebe des Rindes unter nicht-denaturierenden Bedingungen unter Verwendung von Heparin-Affinitätschromatographie beschrieben. Außerdem wurde die CNTF-Aktivität in geschädigtem Hirngewebe identifiziert (Manthorpe et al., Brain Res. 267 (1983), 47-56; Nieto- Sampedro et al., J. Neurosci. 3 (1983), 2219-2229).
Carnow et al. (J. Neurosci. 5 (1985), 1965-1971) und Rudge et al. (Develop. Brain Res. 32 (1987), 103-110) beschreiben Verfahren zur Bestimmung der CNTF-Aktivität in Gewebeextrakten, wobei die elektrophoretisch aufgetrennten Zellextrakte zuerst auf Nitrocellulosepapier geblottet wurden (Western-Blotting) und anschließend die CNTF-Aktivität enthaltenden Proteinbanden identifiziert wurden, indem die Nitrocellulose mit CG-Neuronen angeimpft wurde und sodann die Bereiche, in denen die Zellen überlebten, unter Verwendung von Vitalfarbstoffen identifiziert wurden. Diese Verfahren wurden eingesetzt, um die offensichtlichen Molekulargewichte der aktiven Polypeptide in Rohextrakten zu bestimmen. Unter Verwendung dieses Verfahrens beobachteten Carnow et al. (J. Neurosci. 5 (1985), 1965-1971), daß die CNTF-Aktivität vom Ischiasnerv der erwachsenen Ratte und die aus dem Gehirn stammende CNTF-Aktivität eine andere Größe (24 kD) zeigten als der Hühner-CNTF (20,4 kD).

2.3. FUNKTIONSEIGENSCHAFTEN DES ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTORS

Dem CNTF wurden mehrere biologische Wirkungen zugeschrieben, wobei jedoch noch unklar war, wie diese Aktivitäten auf molekularer Ebene abhefen. Wie vorstehend diskutiert, wurde der CNTF ursprünglich als eine Aktivität beschrieben, die das Überleben von Neuronen des Ziliarganglions von E8-Hühnern fördert, das ein Bestandteil des parasympathischen Nervensysterns ist. Hier folgt nun eine Beschreibung anderer biologischer Eigenschaften von Präparaten, die bekanntermaßen die CNTF-Aktivität enthielten:
Saadat et al. (J. Cell Biol. 108 (1989), 1807-1816) beobachteten, daß ihr höchst-gereinigtes Präparat von CNTF aus Ischiasnerven der Ratte eine cholinerge Differenzierung von Neuronen des Ganglion cervicale supenus von neugeborenen Ratten in Kultur induzierte Außerdem fanden Hoffman (Neurochem. 51 (1988), 109-113), daß die aus dem Hühnerauge stammende CNTF-Aktivität in einschichtigen Retina-Zellkulturen den Spiegel der Cholin-O-Acetyltransferase-Aktivität steigerte.
Hughes et al. (Nature 335 (1988), 70-73) untersuchten eine Population von bipotentiellen Glia-Vorläuferzellen im Sehnerv und Gehirn von perinatalen Ratten; diese Zellpopulation bringt vermutlich erstens Oligodendrocyten und dann zweitens Typ-2-Astrocyten hervor. Untersuchungen haben darauf hingewiesen, daß die Differenzierung von Oligodendrocyten aus einer Oligodendrocyten-artigen 2-Astrocyten(O-2A)-Vorläuferzelle in Abwesenheit eines bestimmten Wachstumsfaktors vor sich geht, wohingegen die Differenzierung von Typ-2-Astrocyten anscheinend die Gegenwart eines spezifischen induzierenden Proteins voraussetzt. Hughes et al. beobachteten, daß das Protein zur Induktion von Typ-2-Astrocyten dem CNTF ähnlich oder gleich ist (vgl. auch Anderson, Trends Neurosci. 12 (1989), 83-85).
Heymanns und Unsicker (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7758- 7762) beobachteten, daß Hochgeschwindigkeits-Überstände von Neuroblastom- Zellextrakten Effekte erzeugten, die denjenigen ähnlich waren, die mit der CNTF-Aktivität aus dem Hühnerauge oder aus dem Ischiasnerv der Ratte assoziiert waren; das Vorliegen eines Proteins, das ähnlich aber nicht gleich wie CNTF ist (im Molekulargewicht), wurde gezeigt.
Ebendal (J. Neurosci. Res. 17 (1987), 19-24) untersuchte die CNTF- Aktivität in verschiedensten Ratten- und Hühnergeweben. Sie beobachteten eine ziemlich große Auswahl von das Überleben von ziliaren Neuronen fördernden Aktivitäten in Ratten-, nicht jedoch in Hühnergeweben; es wurde gefunden, daß Rattenleber, -Milz-T-Zellen und -Unterkieferdrüsenzellen mit einer geringen, das CG-Überleben fördernden Aktivität assoziiert waren, während Herz-, Gehirn- und Skelettmuskelgewebe mit einer höheren Aktivität zur Förderung des Überlebens assoziiert waren. Es zeigte sich, daß die höchste CNTF-Aktivität von den getesteten Geweben mit der Rattenniere assoziiert war.
Die vorstehenden Untersuchungen zeigten, daß viele Gewebe- und Zellextrakte Aktivitäten enthalten, die ähnliche Eigenschaften wie CNTF aufweisen (d.h., sie fördern das Überleben von Ziliarganglion-Neuronen von E8-Hühnern in einem Gewebekultur-Biotest), jedoch kann man nicht davon ausgehen, daß ein einziges oder identisches Protein für diese Aktivitäten verantwortlich ist. Wie für die Familie von Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) gezeigt wurde, können z.B. mehrere verschiedene Polypeptide oder Proteine in ein und demselben Biotest identische biologische Aktivitäten aufweisen.
Zuerst wurde gefunden, daß sich die Neuronen-Spezifität des CNTF aus dem Hühnerauge und aus dem Ischiasnerv der Ratte mit den auf NGF ansprechenden Neuronen-Populationen überschneidet. Als jedoch die jeweilige Rolle von CNTF und NGF in der Entwicklung von Neuronen-Populationen untersucht wurde, wurden die unterschiedlichen Merkmale von CNTF und NGF sehr deutlich. Skaper und Varon (Brain Res. 389 (1986), 39-46) untersuchten die Erfordernisse zum Überleben von Neuronen des dorsalen Rückenmarkwurzel- Ganglions des Huhnes (DRG) zwischen dem embryonalen Tag 6,5 (E6.5) und E15. Bei diesen DRG-Neuronen, die anfangs nur auf NGF ansprachen, wurde beobachtet, daß sie später genauso auch auf CNTF ansprachen, und daß sie schließlich auf beide Faktoren immer weniger ansprachen. Der CNTF kann vom NGF, zusätzlich zu ihren unterschiedlichen Rollen in der Entwicklung, auch durch das Molekulargewicht, den isoelektrischen Punkt, die Unfähigkeit, durch Antikörper gegen NGF inaktiviert zu werden, und die Fähigkeit von CNTF, das in vitro-Überleben von auf NGF nicht ansprechenden CG-Neuronen zu fördern, unterschieden werden (Barbin et al., J. Neurochem. 43 (1984), 1468-1478).

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Verfahren zur Herstellung eines chemisch reinen menschlichen ziliaren neurotrophen Faktors (h-CNTF), bakterielle Expressionsvektoren, die h-CNTF codieren, und Bakterien, die mit solchen Vektoren transfiziert sind. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung kann das erfindungsgemäße rekombinante Protein zur Behandlung von verschiedensten neurologischen Erkrankungen und Störungen, umfassend degenerative Erkrankungen und Störungen sowie Erkrankungen und Störungen des Nervensystems, z.B. die Alzheimer-Krankheit und die Parkinson-Krankheit, verwendet werden.
In weiteren Ausführungsformen kann das erfindungsgemäße h-CNTF-Protein zur Behandlung von Erkrankungen, Störungen oder Schädigungen von Motoneuronen (deren Zellkörper sich im zentralen Nervensystem befinden), umfassend, jedoch nicht beschränkt auf amyotrophe Lateralsklerose "Lou Gehrig's Krankheit), verwendet werden. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann der CNTF zur Wiederherstellung der Funktion des Gesichtsnervs bei Bell-Lähmung verwendet werden. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann der CNTF verwendet werden, um das Wachstum von Rückenmark-Neuronen zu fördern, wodurch ein Verfahren zur Behandlung von Schädigungen des Rückenmarks, verursacht durch Trauma, Infarkt, Infektion, Mangelernährung oder toxische Mittel, bereitgestellt wird.
Die Erfindung betrifft außerdem Arzneimittel, umfassend einen rekombinanten h-CNTF, die zur Diagnose und Behandlung von verschiedensten neurologischen Erkrankungen und Störungen verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Clonierung, Sequenzierung und Expression von h-CNTF und stellt erstmalig ein Mittel zur Herstellung von menschlichem CNTF durch einen bakteriellen Wirt unter Verwendung von Nucleinsäuresequenzen bereit, die den menschlichen CNTF codieren. In weiteren spezifischen Ausführungsformen der Erfindung wurde ein Antikörper gegen h-CNTF hergestellt, der die CNTF-Aktivität neutralisiert.

3.1. ABKÜRZUNGEN

BrCN Bromcyan
CG Ziliarganglion
CNTF ziliarer neurotropher Faktor
DRG dorsales Rückenmarkwurzel-Ganglion
E8, E9 usw. embryonaler Tag 8 oder 9 usw.
GFAP gliafibrilläres saures Protein
NGF Nervenwachstumsfaktor
TU Trophische Einheit. Eine trophische Einheit pro ml bedeutet die Menge der CNTF-Aktivität, die den halbmaximalen Wert des Neuronen-Uberlebens pro ml Kulturmedium bewirkt.

4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN

FIG. 1. cDNA-Clonierung (a), Nucleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von Ratten-CNTF (b). Die als Primer eingesetzten Oligonucleotide werden in (c) und ihre entsprechenden Positionen in (b) gezeigt. Die unterstrichenen Aminosäuren in (b) entsprechen den Peptidsequenzen, die aus tryptischen (T1-T8) und BrCN-(CB1-4)-Fragmenten von CNTF erhalten wurden. Auf der Nucleotidebene sind die dem codierenden Bereich entsprechenden Sequenzen fett gedruckt, die Polyadenylierungs-Signalsequenz ist unterstrichen. Die Aminosäurezusammensetzung von CNTF, wie von gereinigtem CNTF hergeleitet und von CNTF-cDNA vorausgesagt (d).
FIG. 2. Zweidimensionale Gelelektrophorese von CNTF, der (a) unter Verwendung von DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie und präparativer SDS- Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese; und (b) unter Verwendung von DEAE-Ionenaustausch-Chromatograhie, präparativer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese gereinigt und sodann durch Chromatographie unter Verwendung einer "Bakerbond Gold C4 Widepore"-Säule weiter gereinigt wurde.
FIG. 3. Überleben von gezüchteten Ziliarneuronen von EB-Hühnern in Gegenwart von Überständen und Extrakten von transfizierten HeLa-Zellen: Ziliarneuronen vom embryonalen Tag 8 wurden in Gegenwart von Überständen (a) und Extrakten (b) von HeLa-Zellen gezüchtet, die mit Plasmid ohne Insertion (Δ) und mit Plasmid, enthaltend Ratten-CNTF-cDNA-Clon E in Sense(o)- und in Antisense( )-Orientierung, transfiziert waren.
FIG. 4. Northern-Blot-Analyse von CNTF-mRNA in Geweben erwachsener Ratten (die verwendeten Abkürzungen sind: BR, Gehirn; LIV, Leber; KID, Niere; MC, Muskel; SK, Haut; SCI, Ischiasnerv; SP, Rückenmark); (b) RNA, die aus dem Ischiasnerv von neugeborenen (P0), vier Tage alten (P4) und 13 Tage alten Rattenjungen stammte.
FIG. 5. Rekombinanter rCNTF in drei verschiedenen E. coli-Stämmen. Bahn M = Standard-Proteinmarker; die Molekulargewichte von drei Proteinen sind angegeben. Bahnen 1 bis 3: Gesamtprotein, extrahiert aus E coli W3110qF-, E. coli HB101 und E. coli MC1061, die jeweils als Wirt für pCP- rCNTF-C-1 dienten. Die Extrakte wurden zubereitet und auf einem 8 bis 25 % Polyacrylamid-Gradientengel analysiert, wie früher beschrieben (Panayotatos, N., und Fontaine, A., J. Biol. Chem. 260 (1988), 3173-3177).
FIG. 6. (a) Durch PCR erzeugte menschliche CNTF-Sonde in der Southern-Blot-Hybridisierung mit EcoRI-Spaltprodukten von genomischer DNA vom Menschen und von der Ratte. (b) Radioaktive Ratten-CNTF-Sonde in der Southern-Blot-Hybridisierung mit EcoRI-Spaltprodukten von genomischer DNA vom Menschen und genomischer DNA von der Ratte.
FIG. 7. Partielle CNTF-codierende Sequenz aus menschlcher genomischer DNA, amplifiziert durch PCR; Vergleich mit der bekannten CNTF-codierenden Sequenz der Ratte. Unterschiede in der abgeleiteten Aminosäuresequenz zwischen dem Menschen und der Ratte sind mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet. Unterschiede in der DNA-Sequenz sind mit einem Un-Gleichheitszeichen (≠) gekennzeichnet.
FIG. 8. Sequenz von menschlichem CNTF. (a) Menschliche Nucleinsäure- und Aminosäuresequenz; (b) Vergleich von menschlichen und Ratten-Aminosäuresequenzen; (c) Vergleich von menschlichen und Ratten-Nucleotidsequenzen; und (d) ganze Restriktionskarte der menschlichen genomischen CNTF-Sequenz.
FIG. 9. Antikörper gegen ein synthetisches Peptid (14 Aminosäuren - I S A L E S H Y G A K D K Q), das auf der Sequenz von CNTF (C-terminale Region) basiert, sind befähigt, die biologische Aktivität von gereinigtem Ratten-CNTF nach Immunfällung zu hemmen.
FIG. 10. Demonstration der neurotrophen Aktivtät eines aus 28 Aminosäuren bestehenden synthetischen CNTF-Peptidfragmentes.
FIG. 11. Indirekte Immunfluoreszenz-Untersuchungen unter Verwendung von Kaninchen-Antikörpern gegen ein aus 28 Aminosäuren bestehendes biologisch aktives CNTF-Peptid, gebunden an fixierte Ratten-Ischiasnerv-Teile und anschließend umgesetzt mit Rhodamin-markiertem Anti-Kaninchen-IgG. Der große Pfeil weist auf die periaxonale Färbung hin; der kleine Pfeil deutet auf markierte Axon-Strukturen.
FIG. 12. Aufnahmen mit dem Phasenkontrastmikroskop von dissoziierten Kulturen von mediodorsalen Rückenmark-Zellen von E14-Ratten, die 72 Stunden auf einem Polyornithin-Substrat in Gegenwart der folgenden Substanzen gezüchtet wurden:
A. Kontrollmedium;
B. Medium, angereichert mit Nervenwachstumsfaktor (NGF) der Maus oder;
C. Medium, angereichert mit einem rekombinanten ziliaren neurotrophen Faktor (CNTF) der Ratte, hergestellt in E. coli.
Zu beachten ist das deutliche Überleben von Neuronen und das Auswachsen von Neuriten in Gegenwart von CNTF, Maßstab-Balken = 100 µm.
FIG. 13. Veränderungen der Motoneuronen und Gliazellen in Facialiskernen von neugeborenen Ratten mit unilateralen Gesichtnerv-Verletzungen.
Die unilaterale Nervenverletzung, die ein BSA-enthaltendes Gelfoam-Implantat umfaßte, (A) Nissl-gefärbte Motoneuronen im Facialiskern auf der verletzten Seite; (B) Nissl-gefärbte Motoneuronen im Facialiskern auf der unverletzten Seite (Kontrolle) ; (C) Facialiskern auf der verletzten Seite, gefärbt mit Anti-GFAP-Antikörper; und (D) Facialiskern auf der unverletzten Seite, gefärbt mit Anti-GFAP-Antikörper.
FIG. 14. Veränderungen der Motoneuronen und Gliazellen in Facialiskernen von neugeborenen Ratten mit unilateralen Gesichtnerv-Verletzungen. Die unilaterale Nervenverletzung, die ein CNTF-enthaltendes Gelfoam-Implantat umfaßte, (A) Nissl-gefärbte Motoneuronen im Facialiskern auf der verletzten Seite; (B) Nissl-gefärbte Motoneuronen im Facialiskern auf der unverletzten Seite (Kontrolle); (C) Facialiskern auf der verletzten Seite, gefärbt mit Anti-GFAP-Antikörper; und (D) Facialiskern auf der unverletzten Seite, gefärbt mit Anti-GFAP-Antikörper.
FIG. 15. Vom Computer erstellte Diagramme von Hydrophihe, Oberflächeneigenschaften, Flexibilität, antigenem Index, amphiphiler Helix-Struktur, amphiphiler Faltblatt-Struktur und Sekundärstruktur von (a) Ratten- CNTF und (b) menschlichem CNTF.
FIG. 16. Wichtigste Eigenschaften der Expressionsplasmide. Der Promotor (lacUV5), die Ribosomenbindungsstelle (rbs1), die CNTF-, ampR- und kanR-Gene, außerdem die cop1(0)- und kan1(0)-Mutationen sind bezeichnet. Die Restriktionsstellen AseI, EagI, NdeI und PvuI wurden bei der Konstruktion der Plasmide verwendet, wie im Text beschrieben.
FIG. 17. Die Sequenz von menschlichem CNTF und der bei der Clonierung verwendeten PCR-Primer. Die DNA-Sequenz des Protein-codierenden Bereiches ist in Fettdruck wiedergegeben, wobei die abgeleitete Proteinsequenz jeweils darüber steht. Ausgefüllte Pfeilspitzen bezeichnen das letzte Nucleotid von Exon 1 und das erste Nucleotid von Exon 2; die 5ma - und 3'terminalen Intronsequenzen sind in Klammern }ber den Pfeilspitzen dargestellt. Die Lage und die 5' zu 3'Polarität der ausgewählten Oligodesoxynucleotid-Primer ist durch Pfeile angegeben. Die Sternchen bezeichnen Fehlpaarungen. Die Oligonucleotidsequenzen der Primer (5' zu 3') sehen folgendermaßen aus:
FIG. 18. Vergleich der Expression von menschlichem CNTF und von Ratten-CNTF unter Verwendung verschiedener Vektoren. Das Gesamtprotein aus den angegebenen Stämmen wurde auf 8 bis 25 % Polyacrylamidgelen, gefärbt mit Coomassie, analysiert. Die Molekulargewichte der Marker (in Hunderten) sind angegeben (M), außerdem die Positionen der Banden, die dem menschlichen CNTF, Ratten-CNTF, ampR- und kanR-Proteinen entsprechen.
FIG. 19. Reinigung von CNTF. (A): Ratten-CNTF; (B): menschlicher CNTF. Lysat: gesamtes zelluläres Protein; 8 M GuHCl: dialysierter Extrakt; 0,5, 5, 10 und 50: Menge an Protein in µg, aufgetragen auf jede Bahn nach DEAE-Sephacel oder Fast-S.
FIG. 20. Dosisabhängige Antwort von ziliaren Neuronen auf nativen und rekombinanten Ratten-CNTF. Das Überleben von dissoziierten ziliaren Neuronen von E8-Hühnern in Gegenwart von steigenden Mengen von Ratten-CNTF wurde gemessen, wie in Abschnitt 12.7. beschrieben.
FIG. 21. Mikroskopische Aufnahmen von Explantat-Kulturen (A, B) von Rückenmarkwurzel-Ganglien (DRG) von E10-Hühnerembryos und von dissoziierten, Neuron-angereicherten Kulturen (C, D, E) von Ziliarganglien (CG) von E8-Hühnerembryos. A, B sind Aufnahmen vom Dunkelfeld-Mikroskop der Kontrolle (A) und der mit CNTF behandelten (B; 5 ng/ml) Explantaten von DRG nach 48 Stunden in Kultur. C, D, E sind Aufnahmen vom Phasenkontrastmikroskop der Kontrolle (C) und der mit CNTF behandelten (D, 100 pg/ml; E, 5 ng/ml) dissozuerten Kulturen von Ziliarganglion-Neuronen. Der Maßstab- Balken = 400 µm (A, B) und 50 µm (C, D, E).
FIG. 22. (Nicht verwendet)
FIG. 23. Aufnahme vom Phasenkontrastmikroskop von ventralen Rückenmarkzellen nach 6 Tagen in Kultur. Die Zellen wurden mit 0,5 x 10&sup6; Zellen pro 35 mm-Schale plattiert und in F12MEMHS&sub5;FCS&sub5; gehalten. 20 x.
FIG. 24. Neurofilament(NF)-Spiegel in Kulturen von ventralen Rückenmark-Neuronen. Kulturen wurden am Tag der Plattierung mit CNTF (10 ng/ml) oder NGF (50 ng/ml) behandelt und am Tag 7 auf NF-Spiegel getestet. Das NF-Protein wurde mit dem NF-Antikörper (RT97) nachgewiesen, die Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung von OPD als Substrat sichtbar gemacht, und die OD (Mittelwert ± SEM) wurde bei 490 nm gemessen. n = 3.
FIG. 25. Effekte von CNTF auf das Überleben von AchE-enthaltenden Neuronen. Ventrale Rückenmark-Neuronen wurden 7 Tage in Kultur gezüchtet und anschließend für eine AchE-Histochemie zubereitet. Gefärbte Zellen wurden unter 32 x gezählt und als Gesamtzahl pro 35 mm-Schale angegeben. n = 3.
FIG. 26. A. Effekte von Wachstumsfaktoren auf die CAT-Aktivitiät in der ventralen Rückenmark-Kultur. Die Kulturen wurden am Tag der Plattierung mit FGF (50 ng/ml), CNTF (10 ng/ml), NGF (50 ng/ml) oder PBS/BSA (0,5 mg/ml) versetzt. Anschließend wurden sie am Tag 7 geerntet und auf CAT- Spiegel getestet. CAT wird in CPM pro 35 mm-Schale ausgedrückt (Mittelwert ± SEM). n = 3. B. Effekte von steigenden Dosen von CNTF auf die CAT-Aktivität. Vorderhorn-Zellen wurden am Tag der Plattierung mit verschiedenen Dosen von CNTF (ng/ml) versetzt. Am Tag 7 wurden die Kulturen für die Messung der CAT-Aktivität geerntet (ausgedrückt in pMol pro Stunde pro 35 mm- Platte; Mittelwert ± SEM). n = 3 für jede Dosis.
FIG. 27. Effekte von CNTF auf die CAT-Aktivität nach verzögerter Zugabe. CNTF (10 ng/ml) wurde zu den Kulturen am Tag 0, 2 oder 6 zugegeben, sie wurden am Tag 7, 9 bzw. 13 zur Messung der CAT-Aktivität geerntet. CAT ist als CPM pro µg Protein pro 35 mm-Platte angegeben (Mittelwert ± SEM). n = 3.
FIG. 28. Effekte von CNTF (10 ng/ml) auf die CAT-Aktivität in ventralen Rückenmark-Kulturen mit reduziertem Glia. Ara C (0,5 µM) wurde am Tag 2 zu den Kulturen zugegeben. Am Tag 7 wurden die Zellen geerntet und auf CAT-Aktivität getestet (ausgedrückt in CPM pro 35 mm-Schale; Mittelwert ± SEM). n = 3.
FIG. 29. Effekte von CNTF (10 ng/ml) und NGF (50 ng/ml) auf die CAT- Aktivität in ventralen Rückenmark-Neuronen, die im Metrizamid-Gradienten gereinigt wurden. CAT (Mittelwert ± SEM) ist in pMol pro Stunde pro 16 mm- Vertiefung angegeben. n = 3.
FIG. 30. Zeitverlauf der Zunahme in der Hochaffinitäts-GABA-Aufnahme in mit CNTF behandelten Hippokampus-Kulturen. Die Hippokampus-Neuronen wurden in Kultur genommen und verschiedene Zeitspannen in Gegenwart oder in Abwesenheit von CNTF (10 ng/ml) gehalten, anschließend wurden die GABE- Aufnahme (A) und die Neurofilamentprotein-Spiegel (B) gemessen. Die Ergebnisse zeigen den prozentualen Wert der Aktivität in behandelten Kulturen im Vergleich zu nichtbehandelten Kontrollkulturen.
FIG. 31. Kurven der dosisabhängigen Antwort von Hippokampus-Neuronen auf CNTF. Die Hippokampus-Neuronen wurden in Gegenwart und in Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von CNTF (0,001 bis 10 ng/ml) 8 Tage gezüchtet. Am Ende der Züchtung wurden die Hochaffinitäts-GABA-Aufnahme (A), die Neurofilamentprotein-Spiegel (B) und die Enzymaktivität von GAD (C) gemessen.
FIG. 32. Effekt von CNTF auf die Zahl von NSE-, GAB- und Calbindinpositiven Zellen. Die Hippokampus-Neuronen wurden in Gegenwart oder in Abwesenheit von CNTF (10 ng/ml) 8 Tage in Kultur gehalten. Die Immunfärbung auf NSE, GAD und Calbindin wurde durchgeführt, wie in A und B gezeigt.
FIG. 33. Dosisabhängige Antwort von CNTF auf die Zahl der GABA- und AchE-immunopositiven Neuronen. Die Hippokampus-Neuronen wurden in Kultur in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von CNTF (0,001 bis 10 ng/ml) gezüchtet. Die Immunfärbung auf GABA und AchE wurde durchgeführt, wie in A und B gezeigt.
FIG. 34. Effekte der verzögerten Zugabe von CNTF auf die CNTF-induzierte Steigerung der Hochaffinitäts-GABA-Aufnahme. A. CNTF (10 ng/ml) wurde nach einer Verzögerung von 0, 1, 2, 3 oder 4 Tagen, nachdem die Hippokampus-Zellen in Kultur genommen wurden, zugegeben. Die Hochaffinitäts- GABA-Aufnahme wurde am achten Tag in Kultur bestimmt. B. CNTF (10 ng/ml) wurde zu den Hippokampus-Zellen nach einer Verzögerung von 0 oder 3 Tagen zugegeben, die Hochaffinitäts-GABA-Aufnahme wurde am elften Tag in Kultur bestimmt.
FIG. 35. Effekte der Verzögerung der Zugabe von CNTF auf die CNTF- induzierte Steigerung der Neurofilamentprotein-Spiegel. A. CNTF (10 ng/ml) wurde zu verschiedenen Zeiten (0, 1, 2 oder 3 Tage), nachdem die Hippokampus-Zellen in Kultur genommen wurden, zugegeben. Die Neurofilamentprotein- Spiegel wurden am achten Tag gemessen. B. CNTF (10 ng/ml) wurde zu den Hippokampus-Zellen nach einer Verzögerung von 0 oder 3 Tagen zugegeben, die Neurofilamentprotein-Spiegel wurden am elften Tag bestimmt.
FIG. 36. Effekt von CNTF in Neuron-angereicherten Kulturen. Die Hippokampus-Kulturen wurden 8 Tage in Gegenwart oder in Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von CNTF (0,001 bis 10 ng/ml) gehalten. Cytosinarabinosid (0,3 µM) wurde zu den Hippokampus-Kulturen für 24 Stunden zugegeben, um die Zahl der Gliazellen zu reduzieren. Die Hochaffinitäts- GABA-Aufnahme wurde am achten Tag in Kultur gemessen.
FIG. 37. Dichte-Abhängigkeit einer CNTF-induzierten Steigerung der GABA-Aufnahme und der Neurofilamentprotein-Spiegel. Die Hippokampus-Zellen wurden mit einer Dichte von 71, 400 Zellen pro cm² plattiert. Die Zellen wurden 8 Tage in Gegenwart oder in Abwesenheit von CNTF (10 ng/ml) gehalten, anschließend wurden die GABA-Aufnahme und die Neurofilamentprotein- Spiegel gemessen.
FIG. 38. Schutzwirkung von CNTF auf die Glutamat-induzierte Toxizität in Hippokampus-Kulturen. Die Hippokampus-Neuronen wurden 7 Tage in Gegenwart oder in Abwesenheit von CNTF (10 ng/ml) in Kultur gehalten. Sodann wurde Glutamat in verschiedenen Konzentrationen (100 bis 1000 µM) für 15 Minuten zugegeben, danach wurden die Zellen in Abwesenheit von Glutamat oder CNTF 20 Stunden gezüchtet. Das Überleben von Zellen am Ende des Züchtungszeitraums wurde durch den MTT-Test bestimmt, der auf der Umwandlung von MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) in ein purpurfarbenes Produkt durch lebende Zellen beruht. Der MTT-Farbstoff wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zugegeben. Farbstoffe, die von lebenden Zellen aufgenommen wurden, wurden durch Zusatz von 0,08 N HCl in Isopropanol 5 Stunden später solubilisiert und die O.D. (570 bis 650 nm) gemessen.
FIG. 39. Wirkung von steigenden Konzentrationen von Ratten-CNTF auf den Mitose-Index von Hippokampus-Astrocyten der Ratte. Die Astrocyten wurden mit Konzentrationen von CNTF, wie angegeben, für 24 Stunden in Kontakt gebracht und die letzten zwei Stunden der Inkubation mit ³H-Thymidin (1 mc pro Vertiefung pro 150 µl) markiert.
FIG. 40. Zwei-Antikörper-Sandwich-Test auf CNTF.
ELISA-Platten (Falcon 3915 Probind) wurden mit 50 µl pro Vertiefung von 4 µg/ml Ziegen-Anti-Maus-IgG2b (GaMIgG2b, Caltag) beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei 4º inkubiert, gewaschen und zwei Stunden bei Raumtemperatur in 50 mM Bicarbonatpuffer, pH 9, blockiert. b. Nach Waschen wurden 50 µl pro Vertiefung des Fang-Antikörpers RP3-12 (1:5-Verdünnung von Hybridomkultur-Überstand) zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurden serielle Verdünnungen eines menschlichen CNTF-Standards (Bereich 10 ng/ml bis 7 pg/ml) oder serielle Verdünnungen einer Testprobe zugegeben. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur und anschließendem Waschen wurden 50 µl pro Vertiefung eines Reporter-Antikörpers RP12-2 (1:5-Verdünnung von Kulturüberstand) zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurden 50 µl pro Vertiefung einer 1:1000-Verdünnung eines mit alkalischer Phosphatase markierten Ziegen- Anti-Maus-IgG1 (GaMIgG1, Caltag)-Reagens zugegeben. Die Platte wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend gewaschen, mit pNPP entwickelt und bei 405 nm in einem ELISA-Ablesegerät abgelesen (Molecular Devices Thermo Max).
FIG. 41. Ergebnisse des Zwei-Antikörper-Sandwich-Tests auf menschlichen CNTF. Steigende Mengen von rekombinantem menschlichem CNTF wurden unter Verwendung der zwei monoclonalen Antikörper RP3-12 und RP12-2 in der in FIG. 40 beschriebenen Umsetzung getestet.
FIG. 42. Motoneuronen aus dem Rückenmark des Hühnerembryos, retrograd markiert mit Rhodamin-Isothiocyanat. Die Zellen wurden nach 5 Stunden in Kultur mit 4 % Formaldehyd fixiert. (A) Phasenkontrast- und (B) Fluoreszenz-Bilder des gleichen Feldes. Maßstab-Balken = 25 µm. Beachten Sie, daß die kleinere Zelle rechts nicht markiert ist.
FIG. 43. Zeitverlauf des Überlebens von Motoneuronen aus dem Rückenmark von Hühnerembryos in Gegenwart (ausgefüllte Kreise) oder in Abwesenheit (leere Kreise) von rekombinantem Ratten-CNTF, 5 ng/ml.
FIG. 44. Motoneuronen aus dem Rückenmark von Hühnerembryos nach 6 Tagen in Kultur in Abwesenheit (A) oder in Gegenwart (B) von rekombinantem Ratten-CNTF, 1 ng/ml. Maßstab-Balken = 100 µm.
FIG. 45. Die das Überleben fördernde Aktivtät von rekombinantem Ratten-CNTF auf Motoneuronen aus dem Rückenmark von Hühnerembryos in Kultur (A) und Kurven der konzentrationsabhängigen Antwort auf CNTF (B) und FGFs (C). Die das Überleben fördernden Aktivitäten wurden nach drei Tagen in Kultur getestet. a in B, Heparin (1 µg/ml) wurde zu der Kultur nur die ersten 24 Stunden zugegeben, um eine durch überschüssiges Heparin induzierte Ablösung zu verhindern, während saurer FGF drei Tage vorlag.

5. GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven menschlichen ziliaren neurotrophen Faktors in Bakterien bereit, umfassend die Züchtung einer Bakterienzelle, die mit einem bakteriellen Expressionsvektor transfiziert ist, der die DNA umfaßt, die den menschlichen CNTF codiert. Die Erfindung betrifft ferner bakterielle Expressionsvektoren, umfassend die den menschlichen CNTF codierende DNA, und Bakterienzellen, die mit solchen Vektoren transfiziert sind.
Die Erfindung stellt ferner einen menschlichen CNTF bereit, der unter Verwendung der vorstehend erwähnten Verfahren zur Herstellung von menschlichem CNTF in Bakterien erhalten wird, und sie stellt Arzneimittel bereit, die einen solchen CNTF zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel enthalten.
Die Erfindung stellt außerdem monoclonale Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon gegen menschlichen CNTF bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner menschlichen CNTF für die Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen oder der Degeneration oder Schädigung von Motoneuronen (deren Zellkörper sich im zentralen Nervensystem befinden) oder zur Behandlung von degenerativen Erkrankungen oder Störungen, wie z.B. periphere Neuropathie, Parkinson-Krankheit oder Chorea Huntington, oder zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen des Nervensystems bereit.
Die vorliegende Erfindung wird in den vier hier anschließend folgenden Abschnitten zusammengefaßt und nachstehend genauer beschrieben. Um eine ausführliche Beschreibung der vorliegenden Erfindung bereitzustellen und das Verständnis zu erleichtern, beziehen sich bestimmte Abschnitte der folgenden Beschreibung und der beiliegenden Zeichnungen auf Ratten-CNTF. Ratten-CNTF, seine Herstellung und Verwendung sind jedoch nicht Teil der vorliegenden Erfindung.
Um die Beschreibung besonders deutlich zu machen, wobei die Erfindung jedoch in keiner Weise eingeschränkt werden soll, wird die Erfindung in den folgenden Abschnitten beschrieben.
5.1. Reinigung von CNTF
5.2. CNTF-Biotests
5.3. Sequenzierung von CNTF
5.4. Clonierung von CNTF-codierender DNA
5.5. Expression eines CNTF-Gens
5.6. CNTF-Gene und -Proteine
5.7. Erzeugung von Anti-CNTF-Antikörpern
5.8. Nutzen der Erfindung

5.1. REINIGUNG EINES ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTORS

CNTF kann aus einer beliebigen verfügbaren Quelle, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Hühnerembryoaugen, Ischiasnerven und Herzmuskel, unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt werden.
Z.B., nicht jedoch darauf beschränkt, kann CNTF aus Augen von Hühnerembryos gemäß dem Verfahren hergestellt werden, das in Barbin et al. (J. Neurochem. 43 (1984), 1468-1478, durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit hier enthalten) beschrieben wird. In Kürze, Choroidea, Iris-Ziliarkörper und daran hängendes Pigmentepithelium, zusammen mit CIPE bezeichnet, können aus den Augen von 15-Tage-Hühnerembryos seziert, wie in Manthorpe et al. (J. Neurochem. 34 (1980), 69-75) beschrieben, und in eingestellter Salzlösung gesammelt werden. Vorzugsweise stammen die Extrakte aus etwa dreihundert Embryoaugen, die in etwa 76 ml kaltem Wasser unter Verwendung eines Teflon-Glas-Homogenisators homogenisiert und anschließend eine Stunde bei 4ºC und 10&sup5; x g zentrifugiert werden. Sodann kann der Überstand gesammelt, auf 0,01 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7, gebracht und anschließend auf eine Ionenaustausch-Säule (d.h., Whatman DE52 Cellulose, äquilibriert in Phosphatpuffer) aufgetragen werden. Die Säule kann mit einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 30 ml pro Stunde mit jeweils 20 ml von 0,07, 0,25 und 0,5 M NaCl in Phosphatpuffer eluiert werden. Das 0,25 M NaCl-Eluat kann sodann durch Ultrafiltration auf ein Volumen von etwa 2 ml eingeengt werden (z.B. unter Verwendung einer 50 ml-Amicon-Zelle und der Ultrafiltrationsmembran PM10 (10 000 Dalton Ausschluß)). Der Rückstand kann sodann gesammelt, mit zwei Waschlösungen zu je 0,5 ml der Zelle mit 0,25 M NaCl- Puffer vereinigt und weiter auf 0,4 ml eingeengt werden (z.B unter Verwendung einer 3 ml-Amicon-Zelle und eines PM 10-Filters). Der gereinigte Extrakt kann anschließend auf Saccharosegradienten geschichtet werden (z.B. 200 µl Extrakt auf 4,6 ml 5 bis 20 % lineare Saccharosegradienten) und sodann zentrifugiert werden (z.B. unter Verwendung eines SW 65-Rotors bei 65 000 UpM, 15 Stunden bei 4ºC). Die 4,8 ml-Gradienten können sodann in fünf Fraktionen geerntet werden; Fraktion I (2 ml), Fraktion II (0,3 ml), Fraktion III (1,2 ml), Fraktion IV (0,3 ml) und Fraktion V (1,0 ml). Fraktion III kann anschließend mit Triton X-100 auf 0,1 % gebracht werden und sodann unter Verwendung einer Ultrafiltration, wie vorstehend, auf 0,2 ml eingeengt werden.
Für die analytische Gelelektrophorese kann gereinigter CNTF analysiert werden, wobei ein 15 % Trenn- und ein 4,5 % Sammel-SDS-Polyacrylamidgel in Plattenform verwendet wird. Gereinigter CNTF oder Molekulargewicht-Standards können einer Elektrophorese unterworfen und das Gel sodann ausgeschnitten und folgendermaßen verarbeitet werden: Die Polypeptide können ohne Fixierung sichtbar gemacht werden, indem das Protein-assoziierte SDS während einer Inkubation auf dem Gel in 0,25 M KCl ausgefällt wird und die Positionen der Standard- und CNTF-Banden registriert werden. Anschließend können die Bahnen fixiert und mit Coomassie-Blau angefärbt werden. Andere Bahnen können dann in Scheiben geschnitten, durch Inkubation mit Triton X-100 eluiert und die Eluate sodann auf CNTF-Aktivität getestet werden.
Extrakt aus Ischiasnerv kann durch die gleichen Schritte (DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie, Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation und präparative SDS-PAGE) fraktioniert werden, die auch für die Reingung von CNTF aus Hühneraugen verwendet wurden (vgl. vorstehend), mit der Ausnahme, daß vorzugeweise die folgenden drei Modifikationen im Verfahren gemacht werden: (i) Nach Auftragen des Nervenextaktes kann die DEAB-Ionenaustausch-Säule direkt im Ganzen mit 0,15 M NaCl eluiert werden (anstatt sie mit 0,07 M NaCl zu waschen und mit 0,25 M NaCl zu eluieren); (ii) Scheiben werden aus dem 24 kD-Bereich (anstatt aus dem 20 kD-Bereich) des präparierten SDS-Gels ausgeschnitten; und (iii) die CNTF-Aktivität kann aus einzelnen Gelscheiben eluiert werden, indem sie in 0,1 % Triton X-100- Detergens homogenisiert und anschließend über Nacht bei 4ºC inkubiert werden (anstatt einer elektrophoretischen Elution über Nacht durch Harnstoff- Gele). Das Triton X-100-Detergens kann sodann entfernt werden, indem der Überstand mit 100 µl einer Suspension von Extractagel-Perlen (Pierce Chemicals, Rockford, IL) 2 Stunden bei 4ºC inkubiert wird. Anschließend kann die Proteinkonzentration gemäß einem beliebigen Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, bestimmt werden.
Vorzugsweise können die vorstehenden Verfahren folgendermaßen weiter modifiziert werden: Nach der Elution aus einem präparativen SDS-PAGE-Gel kann der CNTF zur Homogenität gereinigt und durch Reversed-Phase-Chromatographie von SDS befreit werden, wobei eine FPLC- oder HPLC-Säule verwendet wird, die aus einem biokompatiblen Flüssigkeitssystem besteht, das in einer inerten Säule enthalten ist; in einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist die FPLC-Säule eine "Bakerbond Gold C4 Widepore"-Säule (eine Säule von 7,75 mm x 10 cm, mit Gold ausgekleidet und dazu geeignet, bei einem Staudruck von 200 bis 250 Psi mit 1,0 ml/min in einer wäßrigen mobilen Phase zu laufen), eluiert mit einem 0 bis 60 % Acetonitril-Gradienten. Es wurde beobachtet, daß CNTF als einzener Peak bei 50 bis 55 % Acetonitril eluierte (vgl. Abschnitt 6, nachstehend). Der einzelne Peak, der CNTF enthielt, kann in einer "Speed Vac"-Apparatur eingeengt werden, in der die Luft durch ein inertes Gas, wie z.B. Argon, herausgeblasen wurde. Das inerte Gas scheint wichtig zu sein, um den Verlust der Aktivität von CNTF zu verhindern, der durch die Oxidation eines oder mehrerer Methioninreste auftritt. CNTF scheint für eine Oxidation besonders anfällig zu sein, wenn es nicht mehr in Lösung vorliegt.
Gleichermaßen kann eine das Überleben von Ziliarneuronen fördernde Aktivität aus Herzgewebe hergestellt werden, wobei Heparin-Affinitäts- Chromatographie verwendet wird, wie in Watters und Hendry (J. Neurochem. 49 (1987), 705-713, durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit hier enthalten) beschrieben.

5.2. BIOTESTS DES ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTORS

Die Aktivität des ziliaren neurotrophen Faktors kann nachgewiesen werden, indem ein beliebiges CNTF-sensitives in vivo- oder in vitro-System verwendet wird, das dem Fachmann bekannt ist. Z.B., nicht jedoch darauf beschränkt, wurden in vitro-Systeme entwickelt, die die CNTF-Aktivität messen, indem sie das 24-Stunden-Überleben von Ziliarganglion(CG)-Neuronen von Hühnerembryos (E8) in Kulturen mit einschichtigem Zellrasen quantifizieren.
Z.B. können Ziliarganglien aus E8-Hühnerembryos gesammelt, dissoziiert (wobei etwa 20 000 Zellen pro Ganglion erhalten werden) und anschließend in HEBM-Medium, enthaltend 20 % Pferdeserum, verdünnt werden, wie in Varon et al. (Brain Res. 173 (1979), 29-45) beschrieben. Etwa 50 µl der Zellsuspension, die etwa 1000 Neuronen (2000 Zellen) enthält, kann sodann in Mikrotiterplatten gesät und die vermutliche CNTF-Aktivität zugegeben werden. Die Kulturplatten können anschließend in 5 % CO&sub2; 24 Stunden bei 37ºC gehalten werden, danach können die Kulturen durch Zusatz von 200 µl 2 % Glutaraldehyd in HEBM-Medium fixiert und die Zahl der überlebenden Neuronen durch direkte Zählung unter einem Phasenkontrastmikroskop visuell bestimmt werden.

5.3. PROTEIN-SEQUENZIERUNG DES ZILIAREN NEUROTORPHEN FAKTORS

Das CNTF-Protein kann direkt sequenziert werden oder es kann zuerst mit einer beliebigen Protease oder einer anderen Verbindung, die dem Fachmann bekannt ist, gespalten werden, umfassend, aber nicht beschränkt auf, Staphylococcus aureus V8, Trypsin und Bromcyan. Peptide können durch automatischen Edman-Abbau auf einem Gasphasen-Mikrosequenzer gemäß dem Verfahren von Hewick et al. (J. Biol. Chem. 256 (1981), 7990-7997) und Hunkapillar et al. (Methods Enzymol. 91 (1983), 399-417) sequenziert werden. Der Nachweis von Phenylthiohydantoin-Aminosäuren kann dann gemäß Lottspeich (Chromatography 326 (1985), 321-327) durchgeführt werden. Überlappende Fragmente der Aminosäuresequenz können bestimmt und dann verwendet werden, um längere Strecken der aufeinanderfolgenden Sequenz herzuleiten.

5.4. CLONIERUNG VON DNA, DIE DEN ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTOR CODIERT

Die Reinigung von geeigneten Mengen des CNTF-Proteins aus dem Ischiasnerv der Ratte, um eine Mikrosequenzierung zu erlauben, machte die Clonierung einer CNTF-cDNA möglich. Eine Stadardstrategie für eine solche Clonierung könnte darin bestehen, aufgrund eines Segmentes mit bekannter Aminosäuresequenz eine komplementäre Oligonucleotidsonde zu erzeugen und diese Sonde zum Absuchen von cDNA-Genbanken zu verwenden, die aus Gewebe hergestellt wurden, das vermutlich CNTF-codierende mRNA synthetisiert. Diese Strategie erwies sich jedoch als problematisch, da mRNA nur in relativ kleiner Menge vorliegt und da die durch Mikrosequenzierung bestimmte tatsächliche Sequenz der CNTF-Peptide (Figur 1) in jedem Fall in den Oligonucleotidsonden einen unvorteilhaft hohen Grad an Degeneration erfordert hätte, um alle möglichen Codons, die für bestimmte Aminosäurereste gewählt werden können, unterzubringen. Eine erfolgreiche Strategie umfaßt die Clonierung des Gens durch Synthese von cDNA, die Ableitung eines Paars von degenerierten Oligonucleotid-Primern, aufgrund der Mikrosequenzierung von CNTF-Peptiden, die Verwendung dieser Primer zur Amplifikation eines Segmentes der CNTF-codierenden Sequenz, die Verwendung eines dritten degenerierten Oligonucleotids, um die Identität des amplifizierten Segmentes zu bestätigen, die Bestimmung der exakten Nucleotidsequenz dieses Segmentes und die Synthese und Verwendung von exakten Oligonucleotid-Primern zur Amplifikation des Restes des CNTF-Gens. In diesem Verfahren wird als bevorzugtes Vorgehen zur Amplifikation die Amplifikation von Gewebe-Nucleinsäuresequenzen durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Saiki et al., Science 230 (1985), 1350-1354) eingesetzt. Es folgt eine genaue Beschreibung des bevorzugten Verfahrens:
Zuerst kann die vom gereinigten CNTF-Protein stammende Amiosäuresequenz verwendet werden, um die Oligonucleotid-Primer für den Einsatz in der PCR herzuleiten. Wegen der Degeneration des genetischen Codes, wobei mehrere Tripletts die gleiche Aminosäure spezifizieren können, sollten für eine bestimmte Aminosäuresequenz verschiedene Oligonucleotide synthetisiert werden, um mehrere potentielle Nucleotidsequenz-Kombinationen bereitzustellen; die resultierenden Oligonucleotide werden als degenerierte Primer bezeichnet.
Die PCR benötigt sowohl Sense-Strang- als auch Antisense-Strang-Primer. Demgemäß kann ein degenerierter Oligonucleotid-Primer, der einem Segment der CNTF-Aminosäuresequenz entspricht, als Primer für den einen DNA- Strang (z.B. Sense) verwendet werden, und ein anderer degenerierter Oligonucleotid-Primer, der zu einem zweiten Segment der CNTF-Aminosäuresequenz homolog ist, kann als Primer für den zweiten DNA-Strang (z.B. Antisense) verwendet werden. Vorzugsweise sollten diese Primer aufgrund eines angrenzenden Abschnitts mit bekannter Aminosäuresequenz so ausgewählt werden, daß das entprechende DNA-Reaktionsprodukt, das durch Verwendung dieser Primer in der PCR erhalten wird, eine vorhersagbare Größe hat (d.h., die Länge des Produktes sollte in der Anzahl der Basenpaare gleich sein wie die Summe der Längen der zwei Primer plus dreimal die Anzahl der Aminosäurereste in dem Proteinsegment, das durch die den zwei Primern entsprechenden Segmente begrenzt wird) . Sodann können diese Primer in der PCR zusammen mit einer Nucleinsäure-Matrize eingesetzt werden, die vermutlich CNTF- codierende Sequenzen enthält, wie z.B. genomische DNA oder vorzugsweise cDNA, hergestellt aus mRNA, gewonnen aus Gewebe oder Zellen, die vermutlich CNTF synthetisieren. Die DNA-Reaktionsprodukte können sodann durch Elektrophorese analysiert werden, um festzustellen, ob ein DNA-Reaktionsprodukt eine der vorhergesagten Größe ähnliche Molekülgröße aufweist. Die DNA-Reaktionsprodukte können ferner durch Hybridisierung mit einer markierten Sonde analysiert werden, die aus einem degenerierten Oligonucleotid hergestellt wurde, das den Aminosäuresequenzen zwischen den Segmenten der zwei in der PCR eingesetzten Primer entspricht. Die Sequenzanalyse des DNA-Reaktionsproduktes der vorhergesagten Größe kann mit der ermittelten Aminosäuresequenz verglichen werden, um zu bestätigen, daß die amplifizierte Nucleinsäuresequenz tatsächlich das CNTF-Peptidfragment codieren kann. Jedes beliebige Verfahren zur Nucleinsäuresequenzierung, das dem Fachmann bekannt ist, kann verwendet werden, vorzugsweise wird jedoch das Didesoxynucleotid-Kettenabbruch-Verfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1979), 3918-3921) eingesetzt. Die Sequenzierung kann durchgeführt werden, indem ein über ein Gel gereinigtes oder vorzugsweise ein doniertes DNA-Reaktionsprodukt verwendet wird. Ein "Schwanz", der bekannte Zielsequenzen für ausgewählte Restriktionsendonucleasen enthält, kann am 5'Ende jedes in der PCR eingesetzten Oligonucleotid-Primers eingebaut werden, um die Clonierung der DNA-Reaktionsprodukte zu erleichtern.
Die Sequenz des DNA-Reaktionsproduktes kann sodann verwendet werden, um einen Oligonucleotid-Primer zu entwerfen, der der exakten CNTF-codierenden Sequenz entspricht. Dieser Primer kann dann zusammen mit einem zweiten Primer in der PCR eingesetzt werden, um die Strecke der CNTF-codierenden Sequenz über diejenige zu verlängern, die durch das anfangs bestimmte Fragment mit der exakten Sequenz dargestellt wird. Z.B., nicht jedoch darauf beschränkt, kann die Vorschrift für die schnelle Amplifikation von cDNA-Enden ("Rapid Amplification of cDNA Ends", RACE) (M. A. Frohman, M. K. Dush, G. R. Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8998-9002) verwendet werden, um Segmente von innerhalb des Bereiches der bekannten exakten Sequenz bis zu den 5' bzw. 3'Enden der cDNA-Moleküle zu clonieren. Um einen bis zum 3'Ende verlängerten Clon zu erhalten, kann somit der Sense-Strang-Primer der exakten CNTF-Nucleotidsequenz entsprechen, wohingegen der Antisense-Strang-Primer zu einem Segment mit bekannter Sequenz homolog sein kann, die stromabwärts des sequenzierten Fragmentes liegen sollte, z.B. dem 3'Polyadenosin-Schwanz von mRNA, revers transkribiert in cDNA; der Primer würde in diesem Fall einen Abschnitt mit Oligo- dT umfassen. Anschließend kann es erforderlich sein, ein ähnliches Verfahren zu verwenden, um die Sequenz stromaufwärts des sequenzierten Fragmentes zu erhalten; z.B. kann der Antisense-Strang-Primer der exakten CNTF- Nucleotidsequenz entsprechen und der Sense-Strang-Primer kann zu einem Bereich stromaufwärts des sequenzierten Fragmentes homolog sein, z.B. einem 5'Polyguanosin-Schwanz, der am 5'Ende der cDNA unter Verwendung der terminalen Desoxynucleotid-Transferase angefügt wurde (der Primer würde in diesem Fall einen Abschnitt mit Oligo-dC umfassen).
Die amplifizierten Fragmente können anschließend sequenziert oder vorzugsweise erst cloniert und dann sequenziert werden. Sobald die exakten Oligonucleotide der 5' und 3'Enden der cDNA bestimmt wurden, können anschließend die exakten Nucleotide in der PCR-Reaktion verwendet werden, um die dazwischenliegenden Nucleinsäuresequenzen zu erhalten, sodann können die Produkte der PCR-Reaktion cloniert werden.
Die DNA-Reaktionsprodukte können unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens, das dem Fachmann bekannt ist, cloniert werden. Eine große Zahl von Vektor-Wirt-Systemen, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden. Mögliche Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren, jedoch muß das Vektorsystem mit der eingesetzten Wirtszelle kompatibel sein. Solche Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Bakteriophagen, wie z.B. Lambda-Derivate, oder Plasmide, wie z.B. pBR322, pUC oder BLUESCRIPT (Stratagene)-Plasmidderivate. Rekombinante Moleküle können in Wirtszellen mittels Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation usw. eingeführt werden.
Das CNTF-Gen wird in einen Clonierungsvektor eingefügt, der zur Transformation, Transfektion oder Infektion geeigneter Wirtszellen verwendet werden kann, wodurch viele Kopien der Gensequenzen erzeugt werden. Dies kann erreicht werden, indem das DNA-Fragment in einen Clonierungsvektor ligiert wird, der komplementäre kohäsive Enden aufweist. Wenn jedoch die komplementären Restriktionsstellen, die zur Fragmentierung der DNA verwendet werden, im Clonierungsvektor nicht vorliegen, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Es kann sich als vorteilhaft erweisen, Restriktionsendonuclease-Spaltstellen in die bei der Polymerase-Kettenreaktion verwendeten Oligonucleotid-Primer einzubauen, um die Insertion in Vektoren zu erleichtern. In einer anderen Ausführungsform kann eine beliebige gewünschte Stelle hergestellt werden, indem Nucleotidsequenzen (Linker) an die DNA-Termini ligiert werden; diese ligierten Linker können spezifische, chemisch synthetisierte Oligonucleotide umfassen, die Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenzen codieren. In einem anderen Verfahren kann der gespaltene Vektor und das CNTF-Gen durch Homopolymer-Tailing modifiziert werden.
In spezifischen Ausführungsformen ermöglicht es die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, die ein isoliertes CNTF- Gen, cDNA oder eine synthetisierte DNA-Sequenz einbauen, viele Kopien des Gens zu erzeugen. Auf diese Weise kann das Gen in großen Mengen erhalten werden, indem die Transformanten gezüchtet, die rekombinanten DNA-Moleküle aus den Transformanten isoliert und, falls nötig, das eingefügte Gen aus der isolierten rekombinanten DNA gewonnen wird.
Nachdem ein von cDNA hergeleiteter Clon, der CNTF codiert, erzeugt wurde, kann ein CNTF codierender genomischer Clon isoliert werden, wobei Standardverfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Z.B. kann eine markierte Nucleinsäuresonde vom CNTF-Clon hergeleitet und zum Absuchen von genomischen DNA-Genbanken durch Nucleinsäure-Hybridisierung verwendet werden, wobei z.B. das Verfahren von Benton und Davis (Science 196 (1977), 180) für Bakteriophagen-Genbanken und das von Grunstein und Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975), 3961-3965) für Plasmid-Genbanken verwendet wird. Gewonnene Clone können sodann durch Restriktionsfragment-Kartierungs- und Sequenzierungstechniken gemäß Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, analysiert werden.
Außerdem können weitere cDNA-Clone unter Verwendung der erhaltenen Sequenzen aus einer cDNA-Genbank identifiziert werden.

5.5. EXPRESSION EINES GENS EINES ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTORS

Die Nucleotidsequenz, die ein CNTF-Protein codiert, oder ein Teil davon, kann in einen geeigneten bakteriellen Expressionsvektor eingefügt werden, d.h., einen Vektor, der die erforderlichen Elemente für die Transkription und Translation der eingefügten Protein-codierenden Sequenz in einer Bakterienzelle enthält. Die erforderlichen Transkriptions- und Translations-Signale können auch vom nativen CNTF-Gen und/oder seinen benachbarten Bereichen bereitgestellt werden. Für die Expression der Protein-codierenden Sequenz können verschiedenste Wirt-Vektor-Systeme verwendet werden. Diese umfassen Bakterien, die mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid- DNA oder Cosmid-DNA transformiert sind. Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren jeweils in ihrer Stärke und Spezifität. Abhängig von dem verwendeten Wirt-Vektor-System kann eines von mehreren geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden.
Ein beliebiges Verfahren der früher für die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor beschriebenen Verfahren kann verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die ein chimäres Gen enthalten, das aus den geeigneten Transkriptions-/Translations-Kontrollsignalen und den Protein-codierenden Sequenzen besteht. Diese Verfahren umfassen in vitro DNA-Rekombinations- und Synthesetechniken und in vivo-Rekombinationen (genetische Rekombination). Die Expression einer Nucleinsäuresequenz, die ein CNTF-Protein oder -Peptidfragment codiert, kann durch eine zweite Nucleinsäuresequenz reguliert werden, so daß das CNTF-Protein oder -Peptid in einem mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierten Wirt exprimiert wird. Z.B. kann die Expression von CNTF durch ein beliebiges Promotor-/Enhancer-Element, das dem Fachmann bekannt ist, kontrolliert werden. Promotoren, die zur Kontrolle der Expression von CNTF in Bakterien verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, prokaryotische Expressionsvektoren, wie z.B. den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 3727-3731), oder den tac-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25), vgl. auch "Useful Proteins from recombinant Bacteria" in Scientific American 242 (1980), 74-94.
Bakterielle Expressionsvektoren, die CNTF-Gen-Insertionen enthalten, können durch drei allgemeine Vorgehensweisen identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Vorliegen oder Abwesenheit von "Marker"-Gen- Funktionen und (c) Expression von eingefügten Sequenzen. In der ersten Vorgehensweise kann das Vorliegen eines fremden Gens, eingefügt in einen Expressionsvektor, durch DNA-DNA-Hybridisierung nachgewiesen werden, wobei Sonden verwendet werden, die Sequenzen umfassen, welche zu einem eingefügten CNTF-Gen homolog sind. In der zweiten Vorgehensweise kann das rekombinante Vektor-Wirt-System aufgrund des Vorliegens oder der Abwesenheit bestimmter "Marker"-Gen-Funktionen identifiziert und selektiert werden (z.B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegenüber Antibiotika, Transformations-Phänotyp, Bildung von Occlusionskörpern in Baculovirus usw.), welche durch die Insertion von fremden Genen in den Vektor verursacht werden. Wenn z. B. das CNTF-Gen innerhalb der Marker-Gensequenz des Vektors eingefügt ist, können Rekombinante, die die CNTF-Insertion enthalten, durch die Abwesenheit der Funktion des Marker-Gens identifiziert werden. In der dritten Vorgehensweise können rekombinante Expressionsvektoren identifiziert werden, indem das fremde Genprodukt nachgewiesen wird, das durch die Rekombinante exprimiert wird. Solche Tests können z.B. auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des CNTF-Genproduktes in Biotest- Systemen beruhen, wie vorstehend in Abschnitt 5.2. beschrieben.
Nachdem ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül identifiziert und isoliert wurde, können zu seiner Vermehrung mehrere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden. Nachdem ein geeignetes Wirtssystern und geeignete Wachstumsbedingungen festgelegt wurden, können rekombinante Expressionsvektoren vermehrt und in großen Mengen hergestellt werden. Wie vorstehend erklärt, können die Expressionsvektoren Bakteriophagen-Vektoren (z.B. Lambda) und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige zu nennen, umfassen, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Außerdem kann ein bakterieller Wirtszellenstamm gewählt werden, der die Expression der eingefügten Sequenzen moduliert oder der das Genprodukt in der gewünschten spezifischen Art und Weise modifiziert und prozessiert. Die Expression von bestimmten Promotoren aus kann in Gegenwart bestimmter Induktoren angeregt werden; auf diese Weise kann die Expression des gentechnisch hergestellten CNTF-Proteins kontrolliert werden. Ferner weisen verschiedene Wirtszellen charakteristische und spezifische Mechanismen zur translationalen und post-translationalen Prozessierung und Modifikation (z.B. Glykosylierung, Spaltung) von Proteinen auf. Geeignete Zellinien oder Wirtssysteme können ausgewählt werden, wodurch die gewünschte Modifikation und Prozessierung des exprimierten fremden Proteins sichergestellt werden kann. Z.B. kann die Expression in einem bakteriellen System dazu verwendet werden, um ein unglykosyliertes "Core"-Proteinprodukt herzustellen. Ferner können verschiedene Vektor-Wirt-Expressionssysteme Prozessierungsreaktionen bewirken, wie z.B. proteolytische Spaltungen in unterschiedlichem Ausmaß.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann DNA, die h- CNTF codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut und zur Transformation von E. coli verwendet werden, wodurch ein biologisch aktiver CNTF erhalten wird (vgl. Beispiel-Abschnitt 7, nachstehend).
In besonderen Ausführungsformen der Erfindung wird die Expression von h-CNTF in E. coli vorzugsweise unter Verwendung von Vektoren durchgeführt, die einen der folgenden Punkte umfassen: einen lac UV5-Promotor, der durch den Lactose-Operon-Repressor kontrolliert werden kann; eine starke Ribosomenbindungsstelle, z.B. die Ribosomenbindungsstelle des Bakteriophagen T7; eine Mutation in der Replikations-Kontrollregion des Plasmides, die die Kopienzahl steigern kann; oder eine Mutation, die die Expression des Antibiotikaresistenz-Proteins einschränkt. In einer bevorzugten spezifischen Ausführungsform der Erfindung wird die Expression von h- CNTF unter Verwendung des Vektors pRPN12 durchgeführt, dies kann zu einer 30- bis 50-fachen Zunahme der Expression von h-CNTF, verglichen mit anderen Vektoren, führen (Abschnitt 12, nachstehend). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der Expressionsvektor pRPN38 zur Herstellung von h-CNTF in E. coli verwendet werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann menschlicher CNTF in E. coli unter Verwendung des Vektors pRPN40 exprimiert werden. Die Erfindung betrifft außerdem Moleküle, die funktionell äquivalent sind mit den Plasmiden pRPN12, pRPN38, pRPN39 und pRPN40, die äquivalente Elemente umfassen (Promotor, Ribosomenbindestelle usw.), die bei der Expression von CNTF zu vergleichbaren Spiegeln führen.

5.5.1. IDENTIFIZIERUNG UND REINIGUNG DES EXPRIMIERTEN GENPRODUKTES

Nachdem eine Rekombinante, die das CNTF-Gen exprimiert, identifiziert wurde, sollte das Genprodukt analysiert werden. Dies kann mit Hilfe von Tests durchgeführt werden, die auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des Produktes beruhen.
Wenn das CNTF-Protein identifiziert ist, kann es isoliert und gereinigt werden, wobei Standardverfahren verwendet werden, umfassend Chromatographie (z.B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und Größenverteilungs-Säulenchromatographie), Zentrifugation, differentielle Löslichkeit oder eine beliebige andere Standardtechnik zur Reinigung von Proteinen. Die funktionellen Eigenschaften können getestet werden, indem ein beliebiger bekannter CNTF-Test verwendet wird, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Ziliarganglion-Neuronen des Hühnerembryos.
Wichtig ist, daß bei bisher zur Herstellung von CNTF aus Ischiasnervengewebe verwendeten Verfahren aufgrund der Tatsache, daß als letzter Schritt eine präparative Gelelektrophorese nötig war, CNTF erzeugt wurde, der möglicherweise nicht vollständig aktiv war, da noch restliches SDS vorlag. Im Gegensatz dazu stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von CNTF mit optimaler biologischer Aktivität bereit, dieser ist ferner zur Proteinsequenzierung unter Verwendung einer FPLC-Säule geeignet; die vorliegende Erfindung erlaubt außerdem die Isolierung von rekombinantem CNTF, der mittels rekombinanten Nucleinsäuremolekülen produziert oder chemisch synthetisiert wird und der deshalb frei von SDS und vollständig aktiv ist.

5.6. GENE UND PROTEINE EINES ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTORS

Unter Verwendung der vorstehend und im nachstehenden Beispiel-Abschnitte 6 und 8, beschriebenen Verfahren wurden die folgenden Nucleinsäuresequenzen bestimmt und ihre entsprechenden Aminosäuresequenzen hergeleitet. Die cDNA-Sequenz des Ratten-CNTF wurde bestimmt und ist in FIG. 1 dargestellt. Die genomische Sequenz eines menschlichen CNTF wurde bestimmt und ist in FIG. 8 dargestellt.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen, die rekombinanten CNTF codieren, gentechnisch so bearbeitet werden, daß die Prozessierung oder Expression von h-CNTF modifiziert wird. Z.B., nicht jedoch darauf beschränkt, kann eine Signalsequenz stromaufwärts der CNTF-codierenden Sequenzen eingefügt werden, wodurch die Sekretion von CNTF ermöglicht und auf diese Weise die Ernte oder die biologische Verfügbarkeit erleichtert wird.

5.7. ERZEUGUNG VON ANITKÖRPERN GEGEN DEN ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTOR

Gemäß der Erfindung können h-CNTF oder Fragmente davon als Immunogen zur Erzeugung von Anti-h-CNTF-Antkörpern verwendet werden. Da nun die Herstellung von relativ großen Mengen von h-CNTF unter Verwendung von Rekombinationstechniken für die Proteinsynthese (aufgrund der h-CNTF-Nucleinsäuresequenzen) bereitgestellt wurde, wurde das Problem der begrenzten Mengen von CNTF beseitigt.
Zur weiteren Verbesserung der Wahrscheinlichkeit, eine Immunantwort gegen h-CNTF zu erzeugen, kann die Aminosäuresequenz von CNTF analysiert werden, um Teile des Moleküls zu identifizieren, die möglicherweise mit einer gesteigerten Immunogenität assoziiert sind. Z.B. kann die Aminosäuresequenz einer Computeranalyse unterworfen werden, um die Oberflächenepitope zu identifizieren, wie durch die FIG. 15 (a) und (b) erläutert, die durch Computer erstellte Diagramme von Hydrophilie, Oberflächeneigenschaften, Flexibilität, antigenem Index, amphiphiler Helix-Struktur, amphiphiler Faltblatt-Struktur und Sekundärstruktur von Ratten-CNTF bzw. menschlichem CNTF zeigen. Alternativ könnten die hergeleiteten Aminosäuresequenzen von CNTF aus verschiedenen Arten miteinander verglichen und relativ nicht-homologe Bereiche identifiziert werden; diese nicht-homologen Bereiche wären mit größerer Wahrscheinlichkeit bei den verschiedenen Arten immunogen.
Zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern, die gegen h-CNTF gerichtet sind, kann jede beliebige Technik verwendet werden, mit der Antikörpermoleküle durch kontinuierliche Zellinien in Kultur hergestellt werden können. Im Umfang der Erfindung liegen z.B. die Hybridom-Technik, die ursprünglich von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495-497) entwickelt wurde, außerdem die Trioma-Technik, die menschliche B-Zellen-Hybridom-Technik (Kozbor et al., Immunology Today 4 (1983), 72) und die EBV- Hybridom-Technik zur Herstellung menschlicher monoclonaler Antikörper (Cole et al., in "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., (1985), S. 77-96) und dergleichen.
Die monoclonalen Antikörper für die therapeutische Verwendung können menschliche monoclonale Antikörper oder chimäre monoclonale Antikörper von Mensch-Maus (oder anderen Arten) sein. Menschliche monoclonale Antikörper können durch eine beliebige Techniken hergestellt werden, wobei dem Fachmann zahlreiche Techniken bekannt sind (z.B. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 7308-7312; Kozbor et al., Immunology Today 4 (1983), 72-79; Olsson et al., Meth. Enzymol. 92 (1982), 3-16). Chimäre Antikörpermoleküle können so hergestellt werden, daß sie eine Maus-Antigen- bindende Domäne mit menschlichen konstanten Regionen aufweisen (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 6851; Takeda et al., Nature 314 (1985), 452).
Zur Herstellung von polydonalen Antikörpern gegen Epitope von h- CNTF können verschiedene Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Zur Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirt-Tiere durch Injektion mit CNTF-Protein oder einem Fragment oder Derivat davon immunisiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Kaninchen, Mäuse, Ratten usw.. Zur Steigerung der Immunantwort können verschiedene Adjuvantien, abhängig von der Art des Wirtes, eingesetzt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Freund-Adjuvans (komplettes oder inkomplettes), Mineralgele, wie z.B. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie z.B. Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, "Keyhole Limpet"-Hämocyanine, Dinitrophenol und möglicherweise nützliche menschliche Adjuvantien, wie z.B. BCG (Bacillus Calmette- Guerin) und Corynebacterium parvum.
Ein Moleküldon eines Antikörpers gegen ein CNTF-Epitop kann durch bekannte Techniken hergestellt werden. DNA-Rekombinations-Technologie (vgl., z.B. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) kann verwendet werden, um Nucleinsäuresequenzen, die ein monoclonales Antikörpermolekül oder die Antigen-bindende Region davon codieren, zu konstruieren.
Antikörpermoleküle können nach bekannten Techniken gereinigt werden, z.B. Immunabsorption oder Immunaffinitätschromatographie, chromatographische Verfahren, wie z.B. HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatogaphie) oder eine Kombination davon usw.
Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Solche Fragmente umfassen z.B., sind jedoch nicht beschränkt auf: das F(ab')&sub2;-Fragment, das durch Pepsinspaltung des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann, die Fab'Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')&sub2;-Fragmentes erzeugt werden können, und die 2-Fab- oder Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel hergestellt werden können.
Der Beispiel-Abschnitt 9 beschreibt die Herstellung von polyclonalen Antiseren, die gegen ein 14 Aminosäuren großes Peptidfragment des CNTF- Proteins gerichtet sind.
Der Beispiel-Abschnitt 17 beschreibt vier gegen CNTF gerichtete monoclonale Antikörper, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, nämlich RP3-12, RP12-1, RP12-2 und RP12-9.

5.8. NUTZEN DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft u.a. einen im wesentlichen reinen h-CNTF. Der h-CNTF und gegen h-CNTF gerichtete Antikörper können für diagnostische und therapeutische Anwendungen eingesetzt werden.

5.8.1. DIAGNOSTISCHE ANWENDUNGEN

Die vorliegende Erfindung, die u.a. h-CNTF und gegen h-CNTF gerichtete Antikörper betrifft, kann zur Diagnose von Erkrankungen und Störungen des Nervensystems verwendet werden, die vermutlich mit Veränderungen im Muster der Expression von CNTF assoziiert sind.
h-CNTF-Gene und verwandte Nucleinsäuresequenzen und Subsequenzen, umfassend komplementäre Sequenzen, können in diagnostischen Hybridisierungstests eingesetzt werden. Die CNTF-Nucleinsäuresequenzen oder Subsequenzen davon, die mindestens etwa 10 Nucleotide umfassen, können als Hybridisierungssonden eingesetzt werden. Die Hybridisierungstests können zum Nachweis, zur Prognose, zur Diagnose oder zur Überwachung von Leiden, Störungen oder Krankheitszuständen verwendet werden, die mit Veränderungen in der Expression von CNTF einhergehen, einschließlich insbesondere Zuständen, die zu einer Schädigung und Degeneration von Neuronen führen, die bekanntermaßen auf h-CNTF ansprechen, wie z.B. parasympathische Neuronen, cholinerge Neuronen, Neuronen des Rückenmarks, Neuroblastom-Zellen und Zellen des Nebennierenmarks. Solche Erkrankungen und Zustände umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf ZNS-Trauma, Infarkt, Infektion, degenerative Nervenerkrankung, Malignität oder postoperative Veränderungen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Alzheimer-Krankheit, Parkinson- Krankheit, Chorea Huntington und amyotrophe Lateralsklerose. Z.B. kann die Gesamt-RNA einer Gewebeprobe eines Patienten auf das Vorliegen von CNTF- mRNA getestet werden, wobei die Verminderung der Menge von CNTF-mRNA eine neuronale Degeneration anzeigt.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung können gegen h-CNTF gerichtete Antikörper zur Diagnose von Erkrankungen und Störungen des Nervensystems verwendet werden, umfassend insbesondere derjenigen Neuronen- Populationen und die klinischen Störungen und Erkrankungen, die nachstehend aufgeführt sind. Antikörper, die gegen den h-CNTF der vorliegenden Erfindung gerichtet sind, können z.B. zum immunhistochemischen Nachweis einer CNTF-Aktivität in einem Gewebeschnitt oder einer Biospie von einem Patienten, der eine solche Untersuchung benötigt, eingesetzt werden. In einem weiteren Beispiel können die erfindungsgemäßen Antikörper in ELISA- Verfahren verwendet werden, um die in Gewebe- oder Flüssigkeitsproben vorliegenden CNTF-Mengen nachzuweisen und/oder zu messen; genauso können die erfindungsgemäßen Antikörper in einer Western-Blot-Analyse eingesetzt werden, um den in Gewebe- oder Flüssigkeitsproben vorliegenden CNTF nachzuweisen und/oder zu messen.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann h-CNTF zur Diagnose von Erkrankungen und Störungen des Nervensystems verwendet werden. In einer bestimmten Ausführungsform, nicht jedoch darauf beschränkt, können markiertes CNTF-Protein oder -Peptidfragmente verwendet werden, um Gewebe oder Zellen zu identifizieren, die den CNTF-Rezeptor exprimieren, wodurch Abweichungen der Expression des CNTF-Rezeptors und folglich mögliche Anomalien in der Antwort des Gewebes oder der Zellen auf CNTF aufgedeckt werden können.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können verwendet werden, um die Menge von h-CNTF in einer flüssigen Probe mittels eines immunologischen Tests zu messen, der ein Zwei-Antikörper-Sandwich-Verfahren ist, umfassend die Bindung eines ersten Anti-CNTF-Antikörpers an einen festen Träger, die Exposition des gebundenen ersten Antikörpers gegenüber einer CNTF enthaltenden Lösung unter Bedingungen, welche die Bindung des ersten Antikörpers an CNTF erlauben, und sodann die Exposition des an den ersten Antikörper gebundenen CNTF gegenüber einem zweiten Anti-CNTF-Antikörper, der vorzugsweise gegen ein anderes CNTF-Epitop gerichtet ist als der erste Anti-CNTF- Antikörper, unter Bedingungen, welche die Bindung von CNTF an den zweiten Antikörper erlauben, und anschließend den Nachweis der Bindung des zweiten Antikörpers an CNTF unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, umfassend, nicht jedoch beschränkt auf, die Bindung des sekundären Antikörpers an einen Anti-Immunglobulin-Antikörper, der an eine Indikatorsubstanz gebunden ist, wie z.B. eine fluoreszierende Verbindung, oder eine Verbindung, die ein Radioisotop enthält, oder ein Enzym, oder eine Substanz, die in einem kolorimetrischen Test ein Signal erzeugen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die monoclonalen Antikörper RP3-12 und RP12-2 in einem solchen Zwei-Antikörper- Sandwich-Test auf menschlichen CNTF verwendet werden (vgl. Abschnitt 17, nachstehend). Eine solche Technik kann als empfindlicher Test zur Messung der CNTF-Spiegel eingesetzt werden, er kann in der Diagnose von neurologischen Störungen, die mit Anomalien in der Expression von CNTF assoziiert sind, verwendet werden.

5.8.2. THERAPEUTISCHE ANWENDUNGEN

Die vorliegende Erfindung, die u.a. h-CNTF und gegen h-CNTF gerichtete Antikörper betrifft, kann zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen des Nervensystems verwendet werden, die möglicherweise mit Veränderungen im Muster der Expression von CNTF assoziiert sind oder die von der Exposition gegenüber CNTF oder gegenüber Anti-CNTF-Antikörpern profitieren können.
In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung kann h-CNTF an Patienten verabreicht werden, bei denen das Nervensystem durch Trauma, Operation, Ischämie, Infektion (z.B. Polio oder AIDS), Stoffwechselerkrankung, Mangelernährung, Malignität, toxische Mittel oder degenerative Erkrankung von bisher unbekanntem Ursprung geschädigt wurde. In verschiedenen spezifischen Ausführungsformen der Erfindung kann CNTF auf Rückenmark- Neuronen angewendet werden, die z.B. durch Trauma, Infarkt, Infektion, degenerative Erkrankung oder operative Verletzung geschädigt wurden; im Beispiel-Abschnitt 10 wird die Verwendung von CNTF für die Förderung des Überlebens von Rückenmark-Neuronen erläutert.
Der h-CNTF der vorliegenden Erfindung kann eingesetzt werden, um Störungen von Motoneuronen zu behandeln. Im nachstehenden Abschnitt 11 wird die Wirksamkeit von Ratten-CNTF auf die Förderung des Überlebens von Motoneuronen im verletzten Gesichtsnerv erläutert. In besonderen Ausführungsformen der Erfindung kann h-CNTF eingesetzt werden, um die Bell-Lähmung oder andere Lähmungen (Lähmungen, die den Gesichtsnerv betreffen) und außerdem andere Erkrankungen des motorischen Systems (Erkrankungen der Motoneuronen), umfassend, jedoch nicht beschränkt auf amyotrophe Lateralsklerose, progressive spinale Muskelatrophie, progressive Bulbärparalyse, primäre Lateralsklerose und spinale Muskelatrophien (Werdning-Hoffman- Krankheit und Kugelberg-Welander-Krankheit) sowie Post-Polio-Syndrom, zu behandeln.
Die Degeneration oder das Absterben von Motoneuronen im Vorderhorn des Rückenmarks ist ein Hauptaspekt des pathophysiologischen Prozesses bei der amyotrophen Lateralsklerose (ALS; Lou-Gehrig-Krankheit), bei der Verletzung des Rückenmarks und damit zusammenhängenden Erkrankungen. Die Ergebnisse der nachstehenden Abschnitte 10 und 14 zeigen, daß CNTF bei der Behandlung dieser Erkrankungen dazu verwendet werden kann, das Überleben zu steigern und die cholinerge Expression in Motoneuronen des Rückenmarks zu fördern.
Außerdem werden im nachstehenden Beispiel-Abschnitt 18 Daten gezeigt, daß Arzneimittel, die basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder, vorzugsweise CNTF und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor umfassen, zur Förderung des Überlebens von Motoneuronen und zur Behandlung der vorstehend erwähnten Motoneuronen-Erkrankungen eingesetzt werden können.
Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um z.B. die Genesung von Patienten zu beschleunigen, die an diabetischen Neuropathien, z.B. Mononeuropathie multiplex, oder Impotenz leiden. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann h-CNTF zur Behandlung von angeborenen Leiden oder neurodegenerativen Störungen eingesetzt werden, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Alzheimer-Krankheit, Altersleiden, periphere Neuropathien, Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington und Erkrankungen und Störungen von Motoneuronen; insbesondere kann die Erfindung zur Behandlung angeborener oder neurodegenerativer Störungen verwendet werden, die mit einer cholinergen Neuronen-Dysfunktion assoziiert sind. Es wurde gezeigt, daß die Alzheimer-Krankheit mit einem selektiven Verlust von cholinergen Neuronen im basalen Vorhirn einhergeht, außerdem wurde gezeigt, daß etwa 35 % der Patienten mit Parkinson-Krankheit an einer Demenz vom Alzheimer- Typ leiden; der erfindungsgemäß hergestellte h-CNTF könnte sich bei diesem Krankheitskomplex für eine Monotherapie eignen. Genauso kann der erfindungsgemäß hergestellte h-CNTF therapeutisch eingesetzt werden, um die Alzheimer-Krankheit in Zusammenhang mit dem Down-Syndrom zu behandeln. Der erfindungsgemäß hergestellte h-CNTF kann zur Behandlung verschiedener Demenz-Erkrankungen und angeborener Lemstörungen verwendet werden.
Wie in den nachstehenden Abschnitten 15 und 16 dargestellt, wurde beobachtet, daß Ratten-CNTF verschiedene Wirkungen auf Hippokampus-Zellen zeigt, umfassend erhöhte GABA-Aufnahme, gesteigerte Expression von Neurofilament-Protein und GAD-Enzym, gesteigertes Überleben von GABA-ergen Neuronen, gesteigertes Überleben von Hippokampus-Neuronen und gesteigertes Überleben von Hippokampus-Astrocyten. Demgemäß kann h-CNTF in verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung eingesetzt werden, um diese Wirkungen auf Hippokampus-Zellen in vitro oder in vivo auszuüben, er kann zur Behandlung von neurologischen Störungen, die Hippokampus-Zellen betreffen, eingesetzt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Alzheimer- Krankheit, Infarkt und Schädigung durch toxische Substanzen.
Der erfindungsgemäße h-CNTF und Antikörper dagegen können auch zur Behandlung von Tumoren verwendet werden, die aus Gewebe des Nervensystems hervorgehen, umfassend Glioblastom und Melanom, das aus Melanocyten entsteht, die von der Neuralleiste abstammen.
Es kann wünschenswert sein, die CNTF-betreffenden Peptide oder das CNTF-Protein für die Verabreichung an eine Membran, z.B. eine "Silastic"- Membran, ein Gel oder einen Schaum, zu adsorbieren, die sodann nahe dem verletzten Nerv implantiert werden könnten. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann die Verabreichung von h-CNTF zusammen mit einer operativen Implantation von Gewebe oder anderen Mitteln mit Langzeitwirkung, umfassend Mikrokügelchen, Mikrokapseln oder synthetische Implantate, bei der Behandlung von Alzheimer-Krankheit, amyotropher Lateralsklerose und anderen Motoneuronen-Erkrankungen (umfassend, z.B. Werdnig-Hoffman-Krankheit) und Parkinson-Krankheit durchgeführt werden.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung kann h-CNTF zusammen mit anderen Cytokinen eingesetzt werden, um die gewünschte neurotrophe Wirkung zu erzielen. Z.B., nicht jedoch darauf beschränkt, kann h-CNTF gemäß der Erfindung zusammen mit NGF verwendet werden, um eine stimulierende Wirkung auf das Wachstum und das Überleben von Neuronen zu erzielen. Es ist abzusehen, daß h-CNTF zusammen mit anderen, aus dem ZNS stammenden Peptidfaktoren, die noch nicht vollständig charakterisiert sind, auf das Wachstum, die Entwicklung und das Überleben eines großen Spektrums von Neuronen-Subpopulationen im zentralen und peripheren Nervensystem synergistisch wirken könnte.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können gegen h-CNTF gerichtete Antikörper an Patienten verabreicht werden, die an verschiedenen neurologischen Störungen und Erkrankungen leiden und die eine solche Behandlung benötigen. Z.B. könnten Patienten, die an einer exzessiven Produktion von CNTF leiden, eine solche Behandlung benötigen. Anti-h-CNTF-Antikörper können zur Verhinderung einer abartigen Regeneration von sensonschen Nerven (z.B. postoperativ) oder zur Behandlung von chronischen Schmerzsyndromen eingesetzt werden.

5.8.3. ARZNEIMITTEL

Die Arzneimittel der Erfindung, die h-CNTF oder eine Kombination von h-CNTF und einem zweiten Mittel, wie z.B. NGF, umfassen, können in einem beliebigen biokompatiblen pharmazeutischen Träger, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser, verabreicht werden.
Die Menge von h-CNTF, die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustandes wirksam ist, hängt von der Art der Störung oder dem Zustand ab und kann durch herkömmliche klinische Techniken bestimmt werden. Sofern es möglich ist, wäre es wünschenswert, die Dosis-Antwort-Kurve und die erfindungsgemäßen Arzneimittel zuerst in vitro, z.B. in dem nachstehend beschriebenen CNTF-Biotest-System, und sodann in geeigneten Tiermodell-Systemen zu bestimmen und erst dann bei Menschen zu testen. Aufgrund von In vitro-Daten kann gesagt werden, daß ein Arzneimittel, das wirksam das Überleben von Ziliarganglion-Neuronen fördert, in einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung eine örtliche h-CNTF-Konzentration von etwa 2 µg/ml bereitstellen kann. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann ein Arzneimittel, das wirksam das Wachstum und Überleben von cholinergen Neuronen fördert, eine örtliche h- CNTF-Konzentration von etwa 40 trophischen Einheiten pro ml bereitstellen.
Die Einführung kann folgendermaßen erfolgen, ist jedoch nicht darauf beschränkt; intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan, oral und intranasal. Außerdem kann es wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen Arzneimittel ins zentrale Nervensystem über einen beliebigen geeigneten Weg, umfassend intraventrikuläre und intrathekale Injektion, einzuführen; die intraventrikuläre Injektion kann durch ein intraventrikuläres Katheter erleichtert werden, das z.B. an einen Vorratsbehälter, z.B. ein Ommaya-Reservoir, angeschlossen ist.
Ferner kann es wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen Arzneimittel direkt in den Bereich zu verabreichen, wo die Behandlung benötigt wird; dies kann z.B., nicht jedoch darauf beschränkt, durch lokale Infusion während der Operation, durch Injektion, mittels eines Katheters oder mittels eines Implantats erreicht werden, wobei das Implantat ein poröser, nicht-poröser oder gelatineartiger Stoff ist, einschließlich Membranen, wie z.B. "Silastic"-Membranen, oder Fasern.
Die Erfindung stellt außerdem h-CNTF-umfassende Arzneimittel bereit, die via Liposomen, Mikropartikel oder Mikrokapseln verabreicht werden. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung kann die Verwendung solcher Mittel nützlich sein, um eine Langzeitwirkung von h-CNTF zu erreichen.
Es ist abzusehen, daß es möglich sein wird, Zellen, die aktiv h-CNTF oder Anti-h-CNTF-Antikörper produzieren, in die Bereiche einzuführen, die gesteigerte oder verminderte Konzentration von h-CNTF benötigen.

5.8.4. ERFINDUNGSGEMÄßE MOLEKÜLSONDEN KÖNNEN ZUR IDENTIFIZIERUNG NEUER CNTF-HOMOLOGER MOLEKÜLE VERWENDET WERDEN

Moleküle, die eine CNTF-ähnliche Wirkung zeigten, die sich jedoch in ihren Molekulargewichten unterschieden, wurden in verschiedenen Arten und Geweben identifiziert, umfassend Augen von Hühnerembryos, Ischiasnerven von Ratten, geschädigtes Hirngewebe, Herzzellen, Überstände von Neurobla- stomzellen (Heymanns und Unsicker, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7758-7762) und Zellen des Nebennierenmarks (Unsicker et al., Neurosci. Lett. 60 (1985), 127-132). Es ist nicht bekannt, wie viele dieser Faktoren mit dem hier beschriebenen h-CNTF identisch sind oder von ihm verschieden sind; wahrscheinlich wird man in Zukunft noch weitere Quellen und Arten von CNTF finden. Die rekombinanten DNA-Moleküle oder die gegen h-CNTF gerichteten Antikörper der Erfindung können zur Charakterisierung neuer CNTF-homologer Moleküle verwendet werden.
Anti-h-CNTF-Antikörper könnten zur Fällung von Polysomen, die CNTF- homologe Proteine synthetisieren, eingesetzt werden; die auf diese Weise gewonnene RNA könnte sodann einer PCR-Amplifikation unter Verwendung der erfindungsgemäßen Oligonucleotid-Primer unterworfen werden. Mit dieser Technik könnten vermutlich noch einige Moleküle, die dem CNTF entsprechen, identifiziert und cloniert werden.

6. BEISPIEL: MOLEKULARE CLONIERUNG, EXPRESSION UND REGIONALE VERTEILUNG DES ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTORS (CNTF) DER RATTE

6.1. MATERIAL UND METHODEN

6.1.1 REINIGUNG UND SPALTUNG VON CNTF

CNTF wurde gereinigt, wie beschrieben (Saadat et al., J. Cell Biol. 108 (1989), 1807-1816): Zusätzlich wurde der CNTF nach der Elektroelution aus den präparativen Polyacrylamidgelen auf eine 7,75 x 100 mm große "Bakerbond Gold C4 Widepore"-Säule aufgetragen und mit 0,1 % Trifluoressigsäure und einem Gradienten von 0 bis 60 % Acetonitril eluiert. Das biologisch aktive Protein wurde in einem einzelnen Peak bei 50 bis 55 % Acetonitril eluiert. Eine 2D-Gel-Analyse von 4 µg des gereinigten CNTF, wobei die erste Dimension aus einer isoelektrischen Fokussierung auf einem Gradienten mit einem pH-Wert von 3,5 bis 10,0 und die zweite Dimension aus einer 12 % SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestand, zeigte, daß dieses Protein als einzelner Punkt wanderte (Saadat et al, J. Cell Biol. 108 (1989), 1807-1816) (FIG. 2). Parallel wurde die 2D-Gel-Analyse des CNTF durchgeführt, der dem zusätzlichen Reinigungsschritt auf der "Bakerbond Gold C4 Widepore"-Säule nicht mehr unterworfen wurde.
Der einzelne Peak, der CNTF enthielt, wurde in einer "Speed-Vac" eingeengt, in der die Luft durch Argon ausgeblasen worden war. Es wurde gefunden, daß Argon wichtig ist, um den Verlust der Aktivität von CNTF zu verhindern, der durch die Oxidation eines oder mehrerer Methioninreste auftritt. Für die BrCN-Spaltung wurden Ameisensäure (Endkonzentration 70 % (Vol./Vol.)) und BrCN (10 % (Vol./Vol.)) zu 30 µg des gereinigten CNTF zugegeben. Nach drei Stunden bei Raumtemperatur wurden 500 µl H&sub2;O zugegeben und das Material auf 50 µl eingeengt und unmittelbar darauf auf die "Bakerbond Gold C4 Widepore"-Säule aufgetragen. Für die Trypsin-Spaltung wurden 30 µg des durch Chromatographie gereinigten CNTF getrocknet, in 50 µl 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), enthaltend 10 mM CaCl&sub2; und 3 µg TPK-behandeltes Trypsin (Sigma), wieder gelöst und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die resultierenden Fragmente wurden auf die "Bakerbond Gold C4 Widepore"-Säule aufgetragen und unter Einsatz der gleichen Bedingungen (Durchflußgeschwindigkeit 1 ml pro Minute, Gradient 0 bis 60 % Acetonitril in 60 Minuten, überwacht bei 214 nm) eluiert. Die Peaks wurden von Hand gesammelt. Die Aminosäuresequenzen der Peptide wurden unter Verwendung eines automatischen Sequenzers von Applied Biosystems bestimmt (Eckerskorn et al., Electrophoresis 9 (1988), 830-838).
Die Aminosäurezusammensetzung des gereinigten CNTF wurde durch Hydrolyse von 5 µg CNTF und Derivatisierung mit Ninhydrin bestimmt (Tsugita et al., Biochem. 102 (1987), 1593-1597).

6.1.2. ERZEUGUNG VON CNTF-cDNA-CLONEN

Die cDNA wurde aus der Gesamt-RNA von gezüchteten Ratten-Astrocyten synthetisiert (Okayama et al., Methods Enzymol. 154 (1987), 3-29), wobei Oligo-Primer 5 (die Oligonucleotid-Primer werden in FIG. 1 C gezeigt) und reverse Transkriptase (Bethesda Research Laboratories) eingesetzt wurden. Der erste Strang der cDNA diente als Matrize für die Amplifikation von spezifischen Segmenten von CNTF unter Verwendung der PCR (Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491). Clon A wurde unter Verwendung der degenerierten Primer-Oligos 1 und 2 erzeugt, das PCR-Produkt wurde mit Oligo 11 identifiziert, subcloniert und sequenziert. Die Sequenz dieses partiellen Clons wurde verwendet, um die Primer 3 und 4 für die Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) zu synthetisieren, gemäß den beschriebenen Verfahren (Frohmann et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8998-9002). Die erhaltenen cDNAs wurden in den BLUESCRIPT SK+-Vektor subcloniert und sequenziert (Clone B und C). Das Oligonucleotid 7 wurde aus der Sequenz eines genomischen Clons hergeleitet (Carroll, unveröffentlichte Ergebnisse). Dieser Primer wurde für die Herstellung von Clon D unter Verwendung der gleichen RACE-Vorschrift wie bei Clon C eingesetzt. Ein Clon der cDNA in voller Länge (E) für die Expression in eukaryotischen Zellen wurde erhalten, indem die Primer 9 und 10 in der PCR eingesetzt wurden.

6.1.3. NORTHERN BLOT-ANALYSE

Die RNA wurde aus verschiedenen Rattengeweben extrahiert, wobei das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren (Chomczynski, P., und Sacchi, N., Anal. Biochem. 162 (1987), 156-159) eingesetzt wurde. Eine gleiche Menge Gesamt-RNA (30 µg RNA, außer mRNA aus Muskel, die 50 µg betrug) wurde glyoxyliert und einer Elektrophorese durch ein 1,2 % Agarosegel unterworfen (Lindholm et al., Biol. Chem. 263 (1988), 16348-16351). Um die während der Entwicklung stattfindende Expression von CNTF-mRNA im Ischiasnerv der Ratte zu untersuchen, wurden 25 µg der aus dem Ischiasnerv stammenden Gesamt-RNA einer Elektrophorese unterworfen, wie vorstehend beschrieben; P0, P4 und P13 in FIG. 4 (b) beziehen sich auf RNA, hergeleitet aus dem Ischiasnerv von neugeborenen, 4 Tage alten bzw. 13 Tage alten Ratten. Außerdem wurden gleichzeitig bekannte Mengen eines 847 bp-großen CNTF-Transkriptes (synthetisiert in vitro unter Verwendung von "Riboprobe- System", PROMEGA) in separaten Bahnen der Elektrophorese unterworfen, um eine Quantifizierung von CNTF-mRNA in den Proben zu ermöglichen. Nach der Elektrophorese wurde RNA auf Nylon-Filter (Hybond-N, Amersham) vakuumgeblottet und die Filter sodann bei 50ºC in 50 % Formamid hybridisiert (Lindholm et al., a.a.O.), wobei eine doppelsträngige ³²P-markierte cDNA- Sonde für die codierende Region von CNTF (600 bp) eingesetzt wurde. Anschließend wurden die Filter gewaschen, 60 Stunden gegenüber Röntgenfilmen exponiert und die Autoradiogramme photographiert.

6.1.4. EXPRESSION EINES REKOMBINANTEN CNTF

Ein Expressionsvektor mit dem Cytomegalie-Virus-Promotor (Geschenk von David Russell) wurde eingesetzt, um das Vorliegen eines CNTF-Clons in voller Länge zu verifizieren Für die Transfektionen wurden HeLa-Zellen verwendet, da in diesen Zellen keine basale Expression einer das Überleben von embryonalen Hühner-Ziliarneuronen fördernden Aktivität nachgewiesen werden konnte. Jede Kulturschale (100 mm Durchmesser) wurde mit 10 µg des Vektors nach dem DEAE-Dextran-Verfahren transfiziert (Spandidos, D. A., und Wilhie, N. M., 1984, Transcription and Translation -- A Practical Approach, 1-48). Nach 48 Stunden in Kultur wurden die Überstände entfernt, die Zellen dreimal mit kalter PBS gewaschen und in einem 5 mM Phosphatpuffer, enthaltend 30 mM NaCl (pH 7,0), lysiert. Nach der Ultrazentrifugation (100 000 x g, 30 Minuten) des Lysates wurden die Proteinkonzentrationen bestimmt und verschiedene Konzentrationen der Überstände zu gezüchteten EB-Ziliarneuronen zugegeben. Nach 24 Stunden wurden die überlebenden Neuronen in der Kultur gezählt, wie früher beschrieben (Hughes et al., Nature 335 (1988), 70-73). Jeder Punkt in FIG. 3 stellt den Mittelwert aus drei Bestimmungen dar; die Balken geben jeweils die Standardabweichungen wieder.

6.2. ERGEBNISSE

6.2.1. BESTIMMUNG DER AMINOSÄURESEOUENZ VON CNTF

CNTF wurde aus Ratten-Ischiasnerven gereinigt, wie vorstehend beschrieben. Für die Mengenbestimmung der Aminosäuren, für die Produktion von Bromcyan (BrCN) - und tryptischen Fragmenten (der N-Terminus war blockiert), war der zusätzliche "Bakerbond Gold"-Reinigungsschritt erforderlich. Die durch Gasphasen-Mikrosequenzierung bestimmte Aminosäuresequenz der verschiedenen Fragmente stellte mehr als 50 % der Gesamtsequenz dar, diese stimmte perfekt mit der aus der cDNA hergeleiteten Sequenz überein und wird zusammen mit der in FIG. 1 dargestellten Nucleotidsequenz gezeigt. Die Aminosäurezusammensetzung des gereinigten CNTF ist in FIG. 1 (d) dargestellt.

6.2.2. ERZEUGUNG VON CNTF-cDNA-CLONEN UND SEQUENZANALYSE

Kulturen von Astrogliazellen aus Rattengehirn wurden als RNA-Quelle für die molekulare Clonierung verwendet; früher wurde bereits gezeigt, daß diese Zellen wesentliche Mengen von CNTF produzieren (Lillien et al., Neuron 1 (1988), 485-494). Nach verschiedenen PCR-Schritten (unter Verwendung von Primern, synthetischen Oligonucleotiden, hergeleitet aus den Aminosäuresequenz-Daten, die erhalten wurden, wie in 6.2.1. vorstehend beschrieben> zeigten die Nucleotidsequenzen der Clone A, B, C einen kurzen 5' untranslatierten Bereich von 77 bp und einen offenen Leseraster von 600 bp, wodurch ein Protein mit einer Länge von 200 Aminosäuren vorausgesagt wurde, mit einem 3'untranslatierten Bereich von 436 bp, der in einem Poly(A)-Schwanz endet (FIG. 1). Eine im Raster gelegene Initiationsstelle für die Translation wurde in Position 78 bis 80 der Nucleotidsequenz festgestellt. Ein Stopp-Codon lag 5' zu dieser Initiationsstelle an Position 72 bis 74 und Gs in den Positionen 75 und 81 erfüllen die Erfordernisse für eine passende Translations-Initiationsstelle gemäß Kozak, M. J., (J. Cell Biol. 108 (1989), 229-241). Ein Stopp-Codon in Position 678 bis 680 folgt auf eine Sequenz, die Peptid CB2 codiert. Die letzte durch Mikrosequenzierung bestimmte Aminosäure war Homoserin, dies zeigt, daß das gemäß der Nucleotidsequenz erwartete Methionin posttranslational modifiziert worden war und den C-Terminus darstellt.
Obwohl die dibasische (Arg-Arg)-Sequenz in den Positionen 13 und 14 der vorhergesagten Sequenz eine potentielle posttranslationale Spaltstelle darstellt, spricht die Aminosäurezusammensetzung des gereinigten CNTF (FIG. 1 (d)) gegen eine solche Spaltung: Die im N-terminalen Bereich vorliegenden Aminosäuren Phenylalanin, Arginin und Alanin sind im Vergleich zu anderen Aminosäuren, die in diesem Bereich fehlen (z.B. Isoleucin), nicht vermindert. Außerdem stimmt das vorausgesagte Molekulargewicht für die aus 200 Aminosäuren bestehende Sequenz (22,8 kD) vollständig mit dem aus der PAGE-Analyse ermittelten Molekulargewicht (22,5 kD) überein (Saadat et al., a.a.O.). Somit weist die Aminosäuresequenz von CNTF die Eigenschaften eines Cytosol-Proteins auf, d.h. kein Signalpeptid, keine Consensus-Sequenzen für die Glykosylierung und nur ein Cysteinrest an Position 17. Der Vergleich der ermittelten CNTF-Sequenz mit den Sequenzen der FIR- und EMBL-Datenbanken zeigte keine signifikanten Ähnlichkeiten mit irgendeinem anderen bekannten Protein. Insbesondere lag keine Homologie zu dem Nervenwachstumsfaktor (NGF), dem aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF) oder dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und Purpurin vor, die jeweils mit Überlebens-Aktivitäten in Zusammenhang gebracht werden, die denjenigen von CNTF ähnlich sind (Unsicker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5459-5463; Schubert et al., J. Cell Biol. 102 (1986), 2295-2301).

6.2.3. EXPRESSION EINES REKOMBINANTEN CNTF

Die Wahrscheinlichkeit, daß CNTF ein cytoplasmatisches Protein ist, wurde durch die Beobachtung unterstützt, daß die Expression eines Clons von cDNA in voller Länge in HeLa-Zellen zu einem aktiven CNTF führte, der exprimiert wird, der jedoch nicht ins Kulturmedium freigesetzt wird (FIG. 3). Der CNTF scheint deshalb ein Molekül zu sein, das dem FGF und leukin-1 (IL-1) ähnlich ist, die deutliche Effekte auf Zellen ausüben, die jedoch Cytosol-Proteine sind. Für FGF wurde noch kein Freisetzungsmechanismus nachgewiesen (Abraham et al., Science 233 (1986), 545-548). Im Gegensatz dazu wurde für IL-1 gezeigt, daß es aus stimulierten Makrophagen über einen ungewöhnlichen Mechanismus nach Spaltung durch ein spezifisches Enzym (Convertase) freigesetzt wird (Kostura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 5227-5231). Von besonderem Interesse ist die vor kurzem gemachte Entdeckung, daß Makromoleküle durch Träger, die strukturelle Homologien zum Mehrfachresistenz-Glykoprotein in Säugerzellen zeigen, aus dem Hefe-Cytosol ausgeschleust werden können (McGrath und Varshasky, Nature 340 (1989), 400-404). Ob dieses Glykoprotein auch in Säugerzellen als Proteinträger dienen kann, bleibt bisher noch unbewiesen.

6.2.4. NORTHERN BLOT-ANALYSE

Die NORTHERN BLOT-ANALYSE (FIG. 4) der Verteilung von CNTF-mRNA in Geweben von erwachsenen Ratten zeigte eine einzelne Bande mit einer Größe von etwa 1,2 kb. Das bei weitem stärkste Signal lag in Northern-Blots des Ischiasnerv vor, eine schwache Bande lag in Extrakten der Rückenmarks vor. Jedoch war kein nachweisbares Signal in mRNA von Muskel und Haut vorhanden, d.h. < 2 pg CNTF-mRNA in 50 µg Gesamt-RNA. Die niedrigen Spiegel der CNTF-mRNA in Muskel und Haut zeigen, daß die im Ischiasnerv vorliegende große Menge von CNTF nicht einen CNTF darstellt, der aus der Peripherie retrograd transportiert wird, wie das beim NGF der Fall ist, sondern daß sie einen vor Ort synthetisierten CNTF verkörpert.
Darüber hinaus unterscheidet sich der Zeitverlauf der Expression von CNTF-mRNA während der Entwicklung vom Zeitverlauf der Expression von NGF (Thoenen et al., Biochem. Pharmacol. 109 (1987), 145-178). Die CNTF-mRNA war in Ischiasnerven von neugeborenen Ratten nicht nachweisbar, wobei sie erst am Tag 4 zum Vorschein kam (FIG. 4 (b)). Der Zeitverlauf der Expression von CNTF-mRNA während der Entwicklung legt nahe, daß CNTF nicht an der Regulation des Überlebens von Neuronen in der perinatalen Periode beteiligt ist, da das durch das Ziel regulierte Absterben von Neuronenzellen zu der Zeit bereits vorbei ist, wenn die Zunahme der CNTF-Synthese beginnt (Oppenheim, J. Comp. Neurol. 246 (1986), 281-286; Johnson et al., Science 210 (1980), 916-918).

6.3. DISKUSSION

Die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Reinigung von CNTF stellen erstmalig eine Möglichkeit zur Herstellung von CNTF bereit, geeignet für eine Aminosäuresequenzierung. Ohne den letzten Schritt der Reinigung auf der "Bakerbond Gold C4 Widepore"-Säule lagen im CNTF-Präparat mehrere Proteine als Verunreinigung vor, wie in FIG. 2 (a) gezeigt. Dagegen wurde nach der Reinigung über die "Bakerbond Gold C4 Widepore"-FPLC/HPLC-Säule durch die 2D-Gelelektrophorese nur noch ein einzelner Punkt identifiziert (FIG. 2 (b)), wodurch tatsächlich die vollständige Reinigung gezeigt wurde. Es sollte beachtet werden, daß in nicht-erfolgreichen Versuchen zur Reinigung von CNTF erst mehrere HPLC-Säulen eingesetzt worden waren, bevor herausgefunden wurde, daß die "Bakerbond Gold C4 Widepore"-Säule effektiv ist. Eine Hypothese dafür ist, daß der inerte Charakter der Goldauflage die Reinigung von CNTF erleichtert.
Ursprünglich wurde die CNTF-Aktivität als ein Überlebens-Faktor für Ziliarneuronen von Hühnern in vitro charakterisiert (Adler et al., Science 204 (1979), 1434-15362), kürzlich wurde jedoch gezeigt, daß die als CNTF beschriebenen Aktivitäten, die aus Hühner- oder Rattengewebe stammten, auch das Uberleben von verschiedenen anderen Typen von Neuronenzellen fördern (Barbin et al., J. Neurochem. 43 (1984), 1468-1478; Manthorpe et al., Brain Res. 367 (1986), 282-286), und außerdem wurde gezeigt, daß der CNTF aus Ratten-Ischiasnerv die Differenzierung von sympathischen Neuronen von E7-Hühnern bewirkt, indem er ihre Replikation blockiert und indem er die Vasointestinal-Peptid (VIP)-Immunreaktivität und die Aktivität der Cholin- Acetyltransferase (ChAT) induziert (Ernsberger et al., Neuron 2 (1989), 1275-1284), und in sympathischen Ganglion-Neuronen von neugeborenen Ratten (Saadat et al., J. Cell Biol. 108 (1989), 1807-1816). Außerdem förderte der gereinigte CNTF aus Ratten-Ischiasnerven in vitro die Differenzierung von bipotentiellen O2A-Vorläuferzellen zu Typ-2-Astrocyten (Hughes, Nature 335 (1988), 70-73). Um festzustellen, welche dieser Funktionen der CNTF in vivo ausübt, oder ob er sie überhaupt in vivo ausübt, muß seine Primärstruktur, seine zelluläre Expression, seine Regulation während der Entwicklung und seine Lage bestimmt werden. Die aus der cDNA hergeleitete Aminosäuresequenz und die folgende Expression von Clonen von cDNA in voller Länge in HeLa-Zellen zeigen nun, daß der CNTF ein Cytosol-Protein ist. Dies legt zusammen mit seiner regionalen Verteilung und seiner Expression während der Entwicklung nahe, daß der CNTF kein vom Ziel stammender neurotropher Faktor ist. Der CNTF scheint neurotrophe Eigenschaften und Differenzierungs-Eigenschaften nur dann aufzuweisen, wenn er entweder durch Zellläsion oder durch einen Freisetzungs-Mechanismus (Mechanismen), der bisher unbekannt ist, verfügbar gemacht wurde.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß sich der CNTF von den bekannten neurotrophen Faktoren NGF und BDNF durch das Fehlen eines bekannten konstitutiven Freisetzungsmechanismus, durch den Zeitverlauf seiner Expression während der Entwicklung und durch seine regionale Verteilung unterscheidet. Es könnte sein, daß der CNTF als Differenzierungsfaktor eine physiologische Rolle spielt, wobei seine neurotrophe Funktion möglicherweise nur unter pathophysiologischen Bedingungen, nicht aber während der Embryonalentwicklung auftritt.

7. BEISPIEL: EXPRESSION VON CNTF IN ESCHERICHIA COLI

7.1. MATERIAL UND METHODEN

7.1.1. KONSTRUKTION EINES CNTF-EXPRESSIONSVEKTORS

Das Gen des Ratten-CNTF (RCNTF) wurde in den Expressionsvektor pCP93 eingefügt, wobei ein synthetischer Oligodesoxyribonucleotid-Primer, der zu der das 5'Ende des Gens überspannenden Sequenz komplementär ist, und ein zweiter Primer, der zu der das 3'Ende des Gens überspannenden Sequenz auf dem gegenüberliegenden DNA-Strang komplementär ist, verwendet wurden. Beide Primer wurden so entworfen, daß sie die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym BspMI enthielten, ihre Sequenzen werden nachstehend gezeigt.
Diese Primer produzierten in einer Standard-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von pCMV-rCNTF-C-1-DNA als Matrize und eines handelsüblichen Kits einige wenige Mikrogramm eines 637 bp-großen Fragmentes, das durch Elektrophorese auf einem 6 % Polyacrylamidgel und anschließende Elektroelution gereinigt wurde. Das eluierte Fragment wurde sodann mit BspMI gespalten und das resultierende 619 bp-große Fragment wieder nach dem gleichen Verfahren gereinigt. Nachdem die überstehenden BspMI-Enden in einer Standardumsetzung unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase in glatte Enden überführt worden waren, wurde das Fragment in die einzige SalI-Restriktionsstelle des Vektors pCP93 ligiert, der durch Behandlung mit S1-Nuclease in einer Standardumsetzung mit glatten Enden ausgestattet worden war.

7.1.2. IDENTIFIZIERUNG VON BAKTERIEN, DIE DEN CNTF-EXPRESSIONSVEKTOR ENTHALTEN

Kompetente E. coli W3110iqF-Zellen wurden mit dieser ligierten DNA transformiert und auf die Plasmidgröße abgesucht und anschließend durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Stadardverfahren charakterisiert (Panayotatos, N., 1987, in Plamids: A Practical Approach, Hardy, K. G., Hrsg., IRL Press, Oxford).

7.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Es wurde gefunden, daß eines der Plasmide (PCP-RCNTF-C-1) das vollständige RCNTF-Gen trug, das in der richtigen Richtung und im translationalen Leseraster mit dem Ribosomenbindungs-Signal des Vektors verknüpft war. Die Kopienzahl dieses Plasmids war dreimal höher als beim Elter, dies beruhte auf der Deletion von 1400 bp der Vektor-DNA.
E. coli W3110iqF-/rCNTF-C-1-Zellen wurden in Flüssigkultur in Gegenwart von Lactose (so daß die aktive Transkription und Translation über das rCNTF-Gen stattfindet) gezüchtet, es wurde gefunden, daß sie signifikante Mengen (2 bis 5 % des gesamten zellulären Proteins) eines biologisch aktiven rCNTF enthielten. Dies wurde durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen mit einem Gradienten von 8 bis 25 % und durch anschließende Coomassie- Färbung gezeigt, wie in FIG. 4 dargestellt. Außerdem wurden aus den gleichen Zellen Proteinextrakte hergestellt, indem die Zellen durch Behandlung mit Lysozym und sodann durch drei Cyclen Einfrieren und Auftauen lysiert wurden. Es wurde gezeigt, daß das durch dieses Verfahren aus wenigen Mikrolitern Kultur extrahierte Protein nach 24 und 48 Stunden in vitro das Überleben und das Auswachsen von Neuriten von bis zu 50 % der Ziliarganglion-Neuronen von E10-Ratten und von etwa 30 % der Neuronen des dorsalen Rückenmarksganglions von E8-Tieren förderte. Die maximale Aktivität wurde bei weniger als 1 ng rCNTF gesehen. Keine solche Aktivität konnte in Kontrollextrakten aus den gleichen Wirtszellen nachgewiesen werden, die den Plasmidvektor ohne das rCNTF-Gen trugen.
Die menschliche CNTF-Sequenz, die gentechnisch so hergestellt wurde, daß Intron-Sequenzen fehlten, wurde in den Vektor pCP93 eingefügt und zur Transformation von kompetenten E. coli-Zellen verwendet. Es wurde gefunden, daß die transformierten Bakterien, die die rekombinanten menschlichen CNTF-Sequenzen trugen, ein Protein mit einem Molekulargewicht exprimierten, das dem menschlichen CNTF entsprach; im DRG-Test wurde gefunden, daß die Proteinextrakte dieser Kulturen CNTF-Aktivität besaßen.

8. BEISPIEL: CLONIERUNG DES MENSCHLICHEN CNTF-GENS

8.1. MATERIAL UND METHODEN

8.1.1. DNA-, PLASMID- UND PHAGENVEKTOREN

Menschliche genomische DNA wurde aus menschlicher Plazenta-DNA (Clontech) erhalten. Der Plasmidvektor pBLUESCRIPT wurde von Stratagene erhalten. Der Bakteriophagenvektor EMBL-3 SP6/T7 wurden von Clontech erhalten.

8.1.2. POLYMERASE-KETTENREAKTION

Die PCR wurde unter Standardbedingungen, wie vom Hersteller eines Reagens-Kits angegeben (Perkins-Elmer/Cetus), in 40 Cyclen durchgeführt, wobei jeder Cyclus jeweils aus einer Inkubation von 1 Minute bei 94ºC, 2 Minuten bei entweder 40ºC oder 50ºC und 2 Minuten bei 72ºC bestand.

8.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION

8.2.1. BEWEIS FÜR DAS VORLIEGEN EINES MENSCHLICHEN CNTF-GENS

Die Southern-Blot-Hybridisierung unter stringenten Bedingungen von menschlicher genomischer DNA, gespalten mit der Restriktionsendonuclease EcoRI, zeigte, daß ein einziges DNA-Fragment mit etwa 10 kb eine schwache Homologie zu einer Ratten-CNTF-Sonde aufwies (FIG. 6, Abb. b). Um das mutmaßliche menschliche CNTF-Gen molekular zu donieren, wurden Versuche unternommen, Segmente eines solchen Gens durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren, wobei Paare von Oligonucleotid-Primern verwendet wurden, die exakt den Sequenzen des Ratten-CNTF-Gens entsprachen. Damit dieses Vorgehen erfolgreich sein kann, sollten zwei kurze Segmente des Ratten-CNTF-Gens und des menschlichen CNTF-Gens vorliegen, deren DNA-Sequenzen identisch oder fast identisch sind.
Fünf Paare von Oligonucleotiden, jedes 17 bis 21 Basen lang, wurden auf die Fähigkeit getestet, für die amplifizierte Synthese von DNA-Fragmenten durch PCR als Primer zu dienen, wobei die gesamte menschliche genomische DNA als Matrize eingesetzt wurde. Alle fünf Oligonucleotid-Paare waren aus dem Bereich innerhalb des zweiten Exons des Ratten-CNTF-Gens ausgewählt. Man stellte die Hypothese auf, daß ein menschliches CNTF-Gen eine ähnliche Intron-Exon-Struktur aufweist wie das Ratten-Gen. Nur ein einziges Paar von Primern, mit CNTF.10 und CNTF.11 bezeichnet, ergab die Amplifikation eines DNA-Fragmentes der menschlichen genomischen DNA, das etwa die gleiche Größe aufwies wie ein Fragment, das mit den gleichen Primern unter Verwendung einer Ratten-DNA-Matrize erhalten wurde (270 bp) Ein höherer Grad an Amplifikation und weniger Hintergrund wurden beobachtet, wenn die PCR mit einer bei der höheren (stringenteren) Temperatur (50ºC) stattfindenden DNA-Synthese durchgeführt wurde. Die Sequenzen von CNTF.10 und CNTF.11 sehen folgendermaßen aus:
CNTF.10 (36 Nucleotide, Antisense für Aminosäuren EADGMPA; jeweils zwei Basen für terminale Aminosäure; Schwanz mit "Multiple Cloning Sites" (Polylinkern)).
CNTF.11 (34 Nucleotide, Sense für Aminosäuren EMTEAE; zwei Basen für terminale Aminosäure, letzte A; "Multiple Cloning Site" am 5'Ende des Oligonucleotids).
(Die Sequenzen, die dem Ratten-CNTF entsprechen, sind unterstrichen; außerdem wurden weitere Nucleotide zugegeben, um für die anschließenden Clonierungsschritte "Multiple Cloning Sites" bereitzustellen.)
Die Produkte der PCR-Reaktion wurden durch Elektrophorese auf einem 2 % Agarosegel aufgetrennt (niedrige Schmelztemperatur; Nusieve). Die positive Bande von etwa 270 bp wurde ausgeschnitten und erneut durch PCR unter Verwendung des gleichen Primer-Paars in 35 Cyclen amplifiziert (30 Sekunden bei 93ºC, 1 Minute bei 50ºC, 1 Minute bei 72ºC). Das wieder-amplifizierte DNA-Fragment wurde erneut durch Elektrophorese auf 2 % Agarose gereinigt und als Matrize für die DNA-Sequenzierung durch das Didesoxynucleotid-Kettenabbruch-Verfahren unter Verwendung eines handelsüblichen Kits ("FASTaq"-Kit von IBI) eingesetzt. Die für die Sequenzierung verwendeten Primer waren CNTF.10 und CNTF.11, außerdem zwei interne Primer, die aufgrund der anfänglichen Sequenzdaten, die mit den terminalen Primern erhalten wurden, ausgewählt wurden. Die komplette Sequenz des amplifizierten Segmentes der menschlichen DNA ist in FIG. 6 dargestellt. Die Sequenz umfaßte einen offenen Leseraster für ein Segment eines Polypeptides, das dem Ratten-CNTF sehr ähnlich war, das jedoch nicht damit identisch war.

8.2.2. CLONIERUNG EINES FRAGMENTES DES MENSCHLICHEN CNTF-GENS, AMPLIFIZIERT DURCH PCR

Das amplifizierte menschliche CNTF-Gen-Fragment wurde in den Plasmidvektor pBLUESCRIPT subcloniert, indem es mit EcoRI und XhoI gespalten und mit der mit den gleichen zwei Enzymen gespaltenen Vektor-DNA verknüpft wurde. Die DNA wurde in kompetente Zellen von E. coli Stamm XL1-Blue (Strategene) eingeführt, sodann wurden Transformanten auf Ampicillinresistenz selektiert. Die Plasmid-DNA wurde nach Standardverfahren gereinigt, das insertierte menschliche DNA-Fragment wurde mit EcoRI und XhoI ausgeschnitten, isoliert und für die Verwendung als Hybridisierungssonde markiert. Die Markierung wurde unter Verwendung von PCR mit etwa 20 ng DNA als Matrize und den Oligonucleotiden CNTF.10 und CNTF.11 als Primer in einem Reaktionsgemisch, das Taq-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer/Cetus), dATP, dGTP, dTTP und ³²P-dCTP enthielt, in sechs Cyclen von 1 Minute bei 94ºC, 2 Minuten bei 50ºC und 3 Minuten bei 72ºC durchgeführt. Das markierte Fragment wurde vom nicht eingebauten dCTP durch herkömmliche chromatographische Verfahren abgetrennt.
Um zu bestimmen, ob das DNA-Fragment, das mit einer Ratten-CNTF-Sonde in der menschlichen genomischen DNA nachgewiesen worden war, die Sequenzen enthielt, die durch PCR mit den Primern CNTF.10 und CNTF.11 amplifiziert werden konnten, wurde das radioaktiv markierte menschliche Fragment als Sonde in einer Southern-Blot-Hybridisierung auf genomische DNA vom Menschen und von der Ratte verwendet, die mit EcoRI gespalten war (FIG. 6, Abbildung a). Die Sonde hybridisierte stark mit einer Bande von etwa 10 kb, sie war nicht zu unterscheiden von der Bande, die schwach mit einer Ratten-CNTF-Sonde hybridisierte. Im Gegensatz dazu hybridisierte die menschliche Sonde schwach mit einer Bande von etwa 4 kb in der genomischen DNA der Ratte, sie war nicht zu unterscheiden von der Bande, die stark mit der Ratten-CNTF-Sonde hybridisierte. Diese Ergebnisse wiesen, ergänzend zu den Sequenzdaten, deutlich darauf hin, daß die menschliche DNA ein Homologon des Ratten-CNTF-Gens enthält.

8.2.3. CLONIERUNG DES MENSCHLICHEN CNTF-GENS AUS EINER GENOMISCHEN GENBANK

Die vorstehend beschriebene radioaktiv markierte menschliche CNTF- Sonde wurde eingesetzt, um eine genomische Genbank von menschlicher DNA im Bakteriophagenvektor EMBL-3 SP6/T7 abzusuchen. Die Genbank enthielt Fragmente von menschlicher Plazenta-DNA, erhalten durch partielle Spaltung mit der Restriktionsendonuclease Sau3a, die in den Vektor an einer BamHI- Stelle eingefügt worden waren. Der Bakteriophage wurde auf den E. coli- Stamm LE392 plattiert, und etwa 750 000 Plaques wurden in zweifacher Ausführung durch Hybridisierung mit der Sonde abgesucht, wobei im wesentlichen die Verfahren verwendet wurden, die von Benton und Davis (Science 196 (1977), 180-182) und Mahmoudi und Lin (Mahmoudi, M., und Lin, V. K., Bio- Techniques 1 (1989), 331-333) beschrieben werden. Ein positiver Plaque wurde identifiziert und der rekombinante Phage mittels drei Runden einer Single-Plaque-Isolierung gereinigt, wobei zur Identifizierung von positiven Phagen eine Hybridisierung mit der menschlichen CNTF-Sonde eingesetzt wurde. Der rekombinante Bakteriophage, der das menschliche CNTF-Gen trug, wurde mit λhCNTF-G-1 bezeichnet. Durch Züchtung in Flüssigmedium unter Verwendung des Bakteriums LE392 als Wirt wurden Vorräte für die weitere Analyse hergestellt.
Die in λhCNTF-G-1 vorliegenden menschlichen CNTF-Sequenzen wurden durch PCR-Amplifikation und durch DNA-Sequenzierung weiter analysiert. Die Amplifikation mit einem Paar von Primern, die innerhalb des ursprünglich sequenzierten 270 bp großen menschlichen Fragmentes lagen (vgl. vorstehend), wurde eingesetzt, um zu bestätigen, daß in dem gereinigten Phagenclon das korrekte Fragment vorlag. Die Oligonucleotide wurden mit CNTF.13 und CNTF.16 bezeichnet (Sequenzen nachstehend). Wie erwartet, wurde in einer PCR-Reaktion, in der λhCNTF-G-1 als Matrize und diese Primer verwendet wurden, eine Produktbande von etwa 128 bp amplifiziert. Die PCR wurde wie vorstehend durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 35 Inkubationscyclen durchlaufen wurden, die aus 1 Minute bei 94ºC, 2 Minuten bei 50ºC, 2 Minuten bei 72ºC bestanden. Antisense Sense
(Dieser Primer enthielt außerdem einen 5'"Schwanz", umfassend Sequenzen für eine "Multiple Cloning Site" -- hier ist nur der CNTF-Teil der Sequenz dargestellt.)
Um festzustellen, ob der λhCNTF-G-1-Clon die 5' und 3'Enden der CNTF-codierenden Sequenz enthielt, wurden PCR-Reaktionen durchgeführt, wobei Primer mit der exakten Sequenz (d.h. nicht degeneriert) , entsprechend den Enden der Ratten-CNTF-codierenden Sequenz, verwendet wurden. Es sollte beachtet werden, daß die Fähigkeit, DNA aus dem menschlichen genomischen Clon zu amplifizieren, auf das Vorliegen des entsprechenden Bereiches des menschlichen Gens hinweisen würde, daß jedoch das Unvermögen, DNA zu amplifizieren, entweder durch das Fehlen des Endes der codierenden Sequenz im Clon oder durch Sequenzabweichung zwischen Ratte und Mensch verursacht sein könnte.
Die Primer, die zum Test auf das Vorliegen des wahrscheinlichen 5' Endes der menschlichen CNTF-codierenden Sequenz eingesetzt wurden, waren CNTF.13 (vorstehend) und CNTF.14. Das letztere Oligonucleotid enthielt 22 Basen, entsprechend dem 5'Ende der codierenden Sequenz von Ratten-CNTF (Sense-Strang), und wies außerdem weitere, nicht damit zusammenhängende Sequenzen am 5'Ende auf (nicht gezeigt), die mehrere Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen enthielten, um eine mögliche Clonierung der amplifizierten Fragmente zu erleichtern.
Mit dem Oligonucleotid-Paar CNTF.13 und CNTF.14 wurde aus der λhCNTF-G-1- Matrize ein Fragment mit etwa 1,4 kb amplifiziert. Dies ist die Größe, die erwartet werden kann, sofern das menschliche CNTF-Gen ein Intron von etwa der gleichen Größe (ungefähr 1 kb) enthält, wie das Intron, welches im Ratten-CNTF-Gen gefunden wurde.
Ein ähnlicher Versuch, einen Bereich zwischen einer bekannten internen Sequenz des menschlichen CNTF-Gens und dem 3'Ende der codierenden Sequenz zu amplifizieren, war nicht erfolgreich. Die Primer waren CNTF.16 (vorstehend) und CNTF.15, der die Sequenz des 3'Endes der codierenden Sequenz der Ratte (Antisense) enthält:
Die Sequenzanalyse wurde mit Teilen des clonierten menschlichen CNTF-Gens durchgeführt, sie bestätigte die Ähnlichkeit mit dem Ratten- CNTF-Gen, sie deckte jedoch in dem codierten Protein auch eine Anzahl von Aminosäure-Substitutionen auf. Die Ergebnisse der DNA-Sequenzanalyse von Bereichen innerhalb der Region, die den menschlichen CNTF codiert, und Vergleiche mit der Rattensequenz sind in FIG. 8 dargestellt. Die Daten stimmen mit dem menschlichen Gen darin überein, daß es ein einziges Intron an der gleichen Position aufweist wie das Ratten-CNTF-Gen; die Aminosäuresequenz ist in einer langen Strecke identisch (ESYVKHQGLNKN), welche die Intron-Exon-Verknüpfung überspannt. Innerhalb des Introns unterscheiden sich die menschlichen Sequenzen deutlich von der Ratte, dies steht in deutlichem Kontrast zu der im wesentlichen Konservierung des codierenden Bereiches. Es gibt eine Strecke, in der sich fünf oder sechs Aminosäuren zwischen dem menschlichen CNTF und dem Ratten-CNTF unterscheiden (Mensch: HVLLAR; Ratte: QGMLTK) und zwei weitere Strecken, in denen sich drei von vier Aminosäuren voneinander unterscheiden (Mensch: TEHS; Ratte: AEQT, in den Positionen 4 bis 7; und Mensch: NNKK; Ratte: KDKQ in den Positionen 196 bis 199; FIG. 8 (b)).

9. BEISPIEL: NUTZEN DER VOM CNTF STAMMENDEN PEPTIDFRAGMENTE

9.1. MATERIAL UND METHODEN

9.1.1. SYNTHESE VON PEPTIDEN

Die Peptide wurden auf einem Festphasen-Peptidsynthesizer von Applied Biosystems unter Einsatz der f-moc-Chemie synthetisiert.

9.1.2. ZELLKULTUR

Ziliarganglionkulturen aus Hühnerembryos wurden hergestellt und gemäß dem in Hughes et al. (Nature 335 (1988), 70-73) beschriebenen Verfahren gehalten.

9.1.3. IMMUNISIERUNGS-VORSCHRIFT

Antikörper gegen das 14 Aminosäuren große CNTF-Peptid (SALESHYGAKDKQ) wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit dem Peptid, konjugiert an KLH ("Keyhole Limpet"-Haemocyanin), hergestellt. Um die Kupplung an KLH zu ermöglichen, wurde das 14 Aminosäuren große Peptid am C-Terminus um einen Cys-Rest verlängert. Die Verknüpfung von KLH und dem Peptid wurde erreicht, indem ein 100-facher Überschuß des Peptides und MBS (m-Maleinimidobenzoyl-n-Hydroxysuccinimidyl-Ester) als Kupplungsmittel eingesetzt wurden.
Ein Kaninchen wurde mit 1 mg Konjugat (Peptid-KLH) in komplettem Freundschem Adjuvans geboostet. Nach drei Wochen wurde das Kaninchen mit einem weiteren 1 mg Konjugat in inkomplettem Freundschem Adjuvans geboostet. Zwei Wochen später wurde das Tier erneut geboostet. Weitere zwei Wochen später wurde dem Tier Blut entnommen und Serum hergestellt. Es wurde gefunden, daß dieses Serum sowohl das Immunogen als auch gereinigten Ratten-Ischiasnerv-CNTF immunfällte.

9.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION

9.2.1. FAHIGKEIT VON ANTIKÖRPERN, DIE GEGEN EIN SYNTHETISCHES PEPTID GERICHTET SIND, DIE CNTF-AKTIVITÄT ZU NEUTRALISIEREN

Sättigende Mengen von CNTF wurden mit an Protein-A-Sepharose gebundenen Antikörpern aus entweder Präimmunserum oder Immunserum aus einem Kaninchen inkubiert, das mit dem 14 Aminosäuren großen synthetischen Peptid (I S A L E S H Y G A K D K Q) immunisiert worden war. Nach Inkubation und Zentrifugation wurden die Überstände auf ihre Fähigkeit zur Förderung des Wachstums von Ziliarganglion-Neuronen aus E8-Hühnern getestet. Eine normale CNTF-Dosis-abhängige Antwort ist in den Kontrollüberständen zu sehen. Im wesentlichen keine CNTF-Aktivität wurde nach Immunfällung mit Antikörpern gegen das CNTF-Peptidfragment nachgewiesen (FIG. 9).

9.2.2. NEUROTROPHE AKTIVITÄT EINES SYNTHETISCHEN CNTF-PEPTIDFRAGMENTES

Ziliarganglion-Neuronen aus E8-Hühnerembryos wurden zwei Tage in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen eines 28 Aminosäuren großen Peptidfragmentes, hergeleitet aus den primären CNTF-Sequenzdaten, gezüchtet und das Überleben der Neuronen bestimmt. Eine dosisabhängige Antwort wurde bei dem Verhältnis von Peptidkonzentration zu neurotropher Aktivität beobachtet (FIG. 10). Die verwendete Peptidsequenz war M V L L E Q K I P E N E A D G M P A T V G D G G L F E K.

9.2.3. FAHIGKEIT VON ANTIKÖRPERN, DIE GEGEN EIN SYNTHETISCHES PEPTID GERICHTET SIND, CNTF-ENTHALTENDE ZELLEN ZU IDENTIFIZIEREN

Antikörper, die gegen das 28 Aminosäuren große Peptid gerichtet sind, wurden in Immunfluoreszenz-Untersuchungen von Ischiasnervengewebe aus Ratten eingesetzt. Kaninchen-Antikörper, die gegen das 28 Aminosäuren große Peptid gerichtet waren, wurden mit fixierten Schnitten von Ratten- Ischiasnerv inkubiert, anschließend wurden die Nervenpräparate mit Rhodamin-markierten Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern umgesetzt. Wie in FIG. 11 dargestellt, wurde eine periaxonale Färbung beobachtet, dies legt nahe, daß CNTF vermutlich durch Schwann-Zellen synthetisiert wird. Außerdem wurden Strukturen sichtbar gemacht, die im Axon-Cytoplasma lagen (FIG. 11, kleiner Pfeil), dies wäre entweder mit einer Synthese in den Axons oder mit dem Transport von CNTF in die Axons vereinbar. Die Markierung konnte durch den Zusatz von überschüssigem CNTF-Peptid (M V L L E Q K I P E N E A D G M P A T V G D G G L F E K) blockiert werden.

10. BEISPIEL: ZILIARER NEUROTROPHER FAKTOR FÖRDERT DAS ÜBERLEBEN VON RÜCKENMARK-NEURONEN

10.1. MATERIAL UND METHODEN

10.1.1 VERSUCHSTIERE

Für alle Experimente wurden Sprague-Dawley-Ratten (HSD) verwendet. Trächtige Ratten wurden durch Ersticken mit Kohlendioxid getötet, die Embryos wurden rasch entnommen und für die weitere Sektion in eiskalte Puck- Kochsalzlösung G ("Puck's Saline G") überführt.

10.1.2. GEWEBEKULTUR-TECHNIKEN

Rückenmark wurde aus den Rattenembryos am 14. Tag der Trächtigkeit aseptisch entnommen. Das Rückenmark wurde vom Schwanzende zum Bulbus herausgetrennt und von sensorischen Ganglien und Meningen befreit. Anschließend wurde das Rückenmark für gesonderte Kulturen in ventrale und mediodorsale Segmente aufgetrennt. Die Rückenmarkgewebe wurden in kleine Stücke zerkleinert und mittels Digerierung durch eine Pasteur-Pipette in definiertem Kulturmedium mechanisch dissoziiert, wobei das Kulturmedium aus 50 % Basalmedium Eagle (BME; GIBCO) und 50 % Ham-Nährmischung-F12 (GIBCO), angereichert mit Glucose (33 mM), Glutamin (2 mM), NaHCO&sub3; (15 mM), HEPES (10 mM), Insulin (25 µg/ml), Transferrin (100 µg/ml), Putrescin (60 µM), Progesteron (20 nM), Na-Selenit (30 nM), Penicillin G (0,5 µg/ml), Streptomycin (0,5 µg/ml) und Rinderserumalbumin (2,5 µg/ml), bestand. Die Digerierung wurde zweimal wiederholt, sodann die Überstände vereinigt und durch ein Nylonfilter (Nitex, Tetko) (40 µm) filtriert. Die erhaltene Gesamtzellzahl wurde durch Zählung im Hämocytometer in Gegenwart von Trypanblau bestimmt. Anschließend wurden die dissoziierten ventralen Zellen mit einer Dichte von 0,5 Millionen Zellen pro 35 mm-Schale, die mit Poly-D-Lysin (10 µg/ml) beschichtet war, plattiert. Die dissoziierten mediodorsalen Zellen wurden mit einer Dichte von 1,5 Millionen Zellen pro 35 mm-Schale, die mit Poly-D-Lysin (10 µg/ml), Poly-L-Ornithin (10 µg/ml) oder Poly-L-Ornithin mit Laminin (5 µg/ml) beschichtet war, plattiert. Die Behandlungen dieser Kulturen erfolgten jeweils zur Zeit der Plattierung. Die Kulturen wurden bei 37ºC in einer Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % CO&sub2; bei fast 100 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten. Das Kulturmedium wurde alle drei bis vier Tage ausgetauscht. Nach einer Woche enthielten diese Kulturen hauptsächlich Neuronen (gefärbt mit dem monoclonalen Antikörper gegen Neurofilament, RT97; Wood und Anderton, Biosci. Rep. 1 (1981), 263- 268) mit nur wenigen Astrocyten (gefärbt mit Antikörpern gegen das gliafibrilläre saure Protein; Bignami und Dahl, Brain Res. 49 (1973), 393-402), wie durch immuncytochemische Verfahren gezeigt wurde.

10.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION

10.2.1. EFFEKTE DES ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTORS (CNTF) AUF MEDIODORSALE (MD) RÜCKENMARKNEURONEN

Mediodorsale (MD) Kulturen überlebten in definiertem Medium die ersten 48 bis 72 Stunden nicht. Die Zellen begannen Klumpen zu bilden und lösten sich schließlich vom Substrat. Nach einer Behandlung mit CNTF (20 ng rekombinanter Ratten-CNTF in 2 µl E. coli-Extrakt pro ml Kultur) zur Zeit der Plattierung zeigten die MD-Neuronen nach 48 Stunden ein gesteigertes Überleben; sie waren gut am Substrat angeheftet und bildeten Neurite aus (FIG. 12). Es ist unwahrscheinlich, daß der Unterschied durch den Grad der zellulären Anheftung zustande kommt, da sowohl die Kontrollzellen als auch die mit CNTF behandelten Zellen drei Stunden nach der Plattierung gut angeheftet waren. Außerdem erhielt man bei Verwendung verschiedener Substrate die gleichen Ergebnisse. Dies deutet darauf hin, daß CNTF befähigt war, das Überleben der MD-Neuronen in diesen Kulturen zu steigern. Außerdem wurde der Proteinspiegel bestimmt. Die mit CNTF behandelten Kulturen enthielten sechsmal mehr Protein pro Schale als die unbehandelten Kontrollen und die mit NGF behandelten (50 ng/ml) Kulturen (Tabelle I). Da die Kulturen hauptsächlich Neuronen enthielten, legt die Erhöhung der Proteinspiegel außerdem eine Zunahme des Überlebens von Neuronen nahe.

10.2.2. EFFEKTE DES CNTF AUF VENTRALE RÜCKENMARKNEURONEN

Kulturen des ventralen Rückenmark-Segmentes sind mit somatischen Motoneuronen angereichert, wie in der Arbeit über Motoneuronen aus Hühnerembryos genau dokumentiert wurde (Dohrman et al., Dev. Biol. 118 (1986), 209-221, und vgl. Beispiel 18, nachstehend), und wie in der vorliegenden Studie über Motoneuronen aus Rattenembryos durch immuncytochemische Verfahren unter Verwendung von Cholin-Acetyltransferase (CAT)-Antikörpern bestätigt wurde. In definiertem Medium überlebten ventrale Neuronen ziemlich gut, nach einer Woche verfielen sie jedoch schließlich, möglicherweise aufgrund des Fehlens von Faktoren, die durch Gliazellen sezerniert werden (da diese Kulturen relativ wenig Glia enthielten). In Gegenwart von CNTF (2 µg/ml) konnten die ventralen Neuronen länger als eine Woche überleben, wobei eine kleine Steigerung der Protein- und CAT-Enzym-Spiegel im Vergleich zur Kontrolle auftrat (Tabelle II). TABELLE I Mediodorsale Neuronen wurden zur Zeit der Plattierung mit CNTF (2 µl/ml) oder NGF (50 ng/ml) behandelt, oder sie blieben unbehandelt. Am Tag 7 wurden die Kulturen geerntet und die Proteinbestimmungen unter Verwendung des Bradford-Verfahrens (Bradford, Anal. Biochem. 72 (1976), 248-254) durchgeführt. Kontrolle µg Protein pro Schale TABELLE II Ventrale Neuronen wurden zur Zeit der Plattierung mit CNTF (2 µl/ml) oder NGF (50 ng/ml) behandelt, oder sie blieben unbehandelt. Am Tag 7 wurden die Kulturen geerntet und die CAT-Enzym-Spiegel bestimmt (Hartika und Hefti, J. Neurosci. 8 (1988), 2967-2985) und die Proteinmessungen durchgeführt. Protein µg/Schale CAT-Aktivität CPM/Schale Kontrolle

11. BEISPIEL: GEREINIGTER RATTEN-ISCHIASNERV-CNTF VERHINDERT DEN DURCH VERLETZUNG INDUZIERTEN ZELLTOD VON MOTONEURONEN IM GESICHTSNERV (VII. HIRNNERV) DER NEUGEBORENEN RATTE

11.1. MATERIAL UND METHODEN

Die Gesichtsnerven von neugeborenen Rattenjungen wurden unilateral durchtrennt und kleine Gelfoam-Implantate, die entweder 5 µg Rinderserumalbumin oder 5 µg CNTF enthielten, an den Stellen der Verletzung eingebracht. Eine Gruppe von verletzten Tieren, die keine Gelfoam-Implantate erhielten, wurde als Kontrolle verwendet. Nach einer Woche wurden die Tiere getötet und Schnitte ihres Hirnstammes hergestellt, die einen Gesichtsnerv-Nucleus auf der gleichen Seite wie der verletzte Nerv (ipsilateral zur Verletzung) und einen Gesichtsnerv-Nucleus auf der zur Verletzung gegenüberliegenden Seite (kontralateral zur Verletzung) umfaßten. Der kontralaterale Gesichtsnerv-Nucleus diente als interne Kontrolle. Die Präparate des Gesichtsnerv-Nucleus wurden entweder mit Nissl-Färbung (um Motoneuronen anzufärben) oder mit Antikörper gegen Gliafibrillen-Saures-Protein (um die Antwort von Gliazellen auf die Verletzung nachzuweisen) angefärbt.

11.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Wie in FIG. 13 A und B dargestellt, führte die Verletzung des Gesichtsnervs und das Einbringen eines BSA-enthaltenden Gelfoam-Implantates zu einer Abnahme der Zahl der Motoneuronen; außerdem sahen die verbliebenen Motoneuronen zusammengedrängt und geschrumpft aus. Dagegen schien die Verletzung des Gesichtsnervs und das Einbringen eines CNTF-enthaltenden Gelfoam-Implantates mit einem wesentlich größeren Überleben von Motoneuronen assoziiert zu sein (FIG. 14 A und B); die Motoneuronen in FIG. 14 A schienen den gesunden Motoneuronen der unverletzten Seite (FIG. 14 B) ähnlicher zu sein als die geschrumpften, degenerierten Motoneuronen von FIG. 13 A. Ferner wurde beobachtet, daß die Wirkung von CNTF hauptsächlich auf die Förderung des Überlebens von Motoneuronen und nicht so sehr auf die Verhinderung von Gliose gerichtet war; in mit BSA und in mit CNTF behandelten Ratten wurde in den ipsilateral zur Gesichtnerv-Verletzung gelegenen Gesichtsnerv-Nuclei ein vergleichbares Ausmaß an Gliose beobachtet (FIG. 13 C und 14 C).
Die Zahl der Motoneuronen in Gesichtsnerv-Nuclei von unbehandelten, mit BSA-Gelfoam und mit CNTF-Gelfoam behandelten Ratten wurden gezählt; die Daten werden in Tabelle III gezeigt.
Bei den verletzten Tieren, die unbehandelt blieben oder die mit Gelfoam + BSA behandelt wurden, wurde ipsilateral zur Verletzung ein Verlust an Motoneuronen von 90 % beobachtet. Bei Tieren, die mit einem mit CNTF getränkten Gelfoam-Implantat behandelt wurden, machte das ipsilateral zur Verletzung gelegene Motoneuronen-Pool 70 % des Normalwertes aus (ein Verlust von etwa 30 %).
Zusammenfassend wurde gefunden, daß nach einer Verletzung des Gesichtsnervs der neugeborenen Ratte 90 % der Motoneuronen des Gesichtsnerv- Nucleus innerhalb einer Woche degenerierten. Das Einbringen von CNTF am abgeschnittenen Stumpf des Gesichtsnervs der neugeborenen Ratte reduzierte den aufgrund der Nervensektion auftretenden Zellverlust dramatisch, wie in FIG. 14 A und Tabelle III gezeigt; es wurde gefunden, daß CNTF mindestens 60 % der Gesichtsnerv-Motoneuronen am Leben erhält, die nach der Axotomie normalerweise abgestorben wären. Somit wurde gezeigt, daß CNTF in vivo ein Überlebens-Faktor für Motoneuronen ist. TABELLE III CNTF verhindert das durch Axotomie induzierte Absterben von Gesichtsnerv-Motoneuronen bei der neugeborenen Ratte Behandlung Anzahl der Motoneuronen in den Gesichtsnerv-Nuclei Seite der Verletzung Kontralateral (Kontroll-Seite) KONTROLLE (Kein Gelfoam) GEL-FOAM + BSA ( µg) GEL-FOAM + CNTF ( µg)

12. BEISPIEL: EXPRESSION AUF HOHEM NIVEAU VON REKOMBINANTEN ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTOREN VON MENSCH UND RATTE IN ESCHERICHIA COLI UND REINIGUNG

12.1. MATERIAL UND METHODEN

12.1.1. BAKTERIENSTÄMME UND PLASMIDE

E. coli W3110lacIqf-, ein Stamm, der den Lactose-Operon-Repressor im Übermaß produziert, und die parentalen Plasmidvektoren pCP93, pCP110, pb1k0 und pb1k1 wurden in früheren Studien verwendet (Panayotatos, N., Gene 74 (1988), 357-363; Panayotatos et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 15066-15069). Vektoren, die für die Expression von CNTF entworfen wurden, wurden folgendermaßen hergestellt, ihre wichtigsten Eigenschaften sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

12.1.1.1. RATTEN-CNTF-VEKTOREN

Ein 622 bp großes DNA-Fragment, welches das vollständige CNTF-Protein der Ratte codierte, wurde aus einem cDNA-Clon (Stockli et al., Nature 342, 920-923) durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erhalten. Die zum Erhalt dieses Fragmentes eingesetzten synthetischen Oligodesoxyribonucleotid-Primer wurden so entworfen, daß sie ein 5'Ende erzeugten, das den Alaninrest am Aminoterminus des Proteins codierte, und daß sie 19 bp hinter dem Terminations-Codon TAG am 3'Ende zu Ende waren. Der Expressionsvektor pCP93 wurde mit SalI linearisiert, durch Behandlung mit S1-Nuclease mit glatten Enden versehen und das resultierende 3920 bp große Fragment durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Der Vektor und die PCR-Fragmente, die auf diese Weise hergestellt wurden, wurden ligiert und in E. coli W3110lacIqf- transformiert. Transformanten wurden nach der Größe und mittels Restriktionskartierung auf das gewünschte Plasmid abgesucht (FIG. 16), bei einem positiven Kandidat (pRPN11) wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt, daß er das erwartete Gen in voller Länge, verknüpft mit dem Translations-Initiations-Signal in dem korrekten Leseraster trägt. Jedoch wurde, wie nachstehend diskutiert, im CNTF-Gen in pRPN11 im Vergleich zur ursprünglichen Ratten-cDNA eine Mutation eines einzigen Basenpaares gefunden, die in Position 193 der Proteinsequenz zum Einbau von Asparagin anstelle von Tyrosin führte. Diese Mutation, die während der PCR-Amplifikation entstanden sein muß, wurde auch in alle anderen Vektoren übertragen, die das Ratten-CNTF-Gen enthalten.

12.1.1.1.2. pRPN12

Dieses Plasmid ist identisch zu pRPN11, mit der Ausnahme, daß eine Mutation eines einzigen Basenpaares in der Copy-Kontroll-Region (cop1) vorliegt, welche die Kopienzahl in den Wirtszellen um etwa das Fünffache steigert. Es wurde konstruiert, indem die DNA zwischen der EagI- und der PvuI-Stelle (im Uhrzeigersinn) durch die gleiche Sequenz aus pCP110 ersetzt wurde (Panayotatos et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 15066-15069).

12.1.1.1.3. pRPN37

Der DNA-Bereich zwischen den zwei AseI-Restriktionsstellen, der das β-Lactamase-Gen in pRG12 überspannt (FIG. 16), wurde durch ein DNA-Segment ersetzt, das die Resistenz gegenüber Kanamycin bewirkt (kanR). In diesem Vektor steht das kanR-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle seines nativen Promotors.

12.1.1.1.4. pRPN38

Dieses Plasmid ist mit pRPN37 identisch, mit Ausnahme einer gezielten Mutation von vier Basenpaaren, die die Stärke des kanR-Promotors auf ein Minimum reduziert (Panayotatos, N., Gene 74 (1988), 357-363).

12.1.1.2. MENSCH-CNTF-VEKTOREN

12.1.1.2.1. pRPN32

Dieses Plasmid ist analog zu pRPN11, mit der Ausnahme&sub1; daß es das menschliche Gen anstelle des Ratten-Gens trägt. Zur Expression des menschlichen CNTF-Proteins in Bakterien war es erforderlich, das Intron zu entfernen, das die Protein-codierenden Sequenzen trennt. Dies wurde durchgeführt, indem die PCR zur Amplifikation und Verknüpfung der das Intron flankierenden Regionen verwendet wurde, wie folgt. Zwei Umsetzungen, jeweils mit 100 ng genC.1-DNA als Matrize, wurden eingesetzt (FIG. 17): die eine enthielt 1 M CNTF.23-Primer und 10 nm CNTF.21-Primer, die andere 1 µM CNTF.24-Primer und 10 nM CNTF.22-Primer. Nach zehn PCR-Cyclen (jeder Cyclus bestand aus einer Inkubation von 1 Minute bei 94ºC, 2 Minuten bei 50ºC, 2 Minuten bei 72ºC) wurden die zwei Proben kombiniert und weiteren Cyclen im DNA-Thermal-Cycler unterworfen. Da die internen Primer CNTF.21 und CNTF.22 zueinander vollständig komplementär sind, können sich die Produkte der PCR-Reaktionen des ersten Durchgangs anschließend aneinanderlagern. Außerdem bewirkt das Vorliegen von wesentlich höheren Konzentrationen der externen Primer CNTF.23 und CNTF.24 die Synthese von großen Mengen des gewünschten Produktes in voller Länge in der Umsetzung des zweiten Durchgangs. Die internen Primer wurden gewählt, um die zwei Segmente der codierenden Region zu überbrücken, dies führte zur Deletion des Introns. Die Produkte der letzten PCR-Reaktion wurden durch Agarosegel- Elektrophorese analysiert, wobei nur eine einzige Hauptbande durch Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen wurde. Die Größe, etwa 600 bp, und eine partielle Nucleotidsequenz zeigten, daß diese Bande eine genau gespleißte codierende Region des menschlichen CNTF darstellte.
Der 5'externe Primer CNTF.23 (FIG. 17) wurde entworfen, um am Aminoterminus des Proteins ein für Alanin codierendes glattes Ende zu erzeugen. Der 3'externe Primer CNTF.24 (FIG. 17) stellte eine EagI-Restriktionsstelle 12 bp hinter dem Ende der CNTF-codierenden Sequenz bereit. Dieser Primer wurde auch so entworfen, daß das in der Natur vorkommende Terrninations-Codon TAG durch TAA ersetzt wurde, das in E. coli bei der Translation weniger leicht überlesen wird. Das PCR-Fragment wurde mit EagI gespalten und das resultierende 612 bp große Fragment durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt. Der Expressionsvektor pCP93, der das Initiations-Codon ATG bereitstellt, wurde mit SalI linearisiert, durch Behandlung mit 5'Nuclease mit glatten Enden versehen, mit EagI gespalten und das resultierende 3636 bp große Fragment durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Der Vektor und die PCR-Fragmente, die auf diese Weise hergestellt wurden, wurden ligiert und in E. coli W3110lacIqf- transformiert. Transformanten, die die gewünschten Moleküle trugen, wurden durch Restriktionskartierung identifiziert und nach der Induktion auf das Vorliegen eines Proteins der erwarteten Größe getestet.
Die Analyse der Proteinsynthese durch Gelelektrophorese in induzierten Kulturen von E. coli W3110lacIqf-, die eines der in Frage kommenden Plasmide (pRPN32) trugen, zeigte das Vorliegen einer Proteinbande von etwa 27 000 MW, die in induzierten Kontrollkulturen von Bakterien, die den Plasmidvektor pCP93 trugen, fehlte. Durch schnelle Proteinextraktion hergestellte Extrakte aus diesen Kulturen zeigten das Vorliegen eines biologisch aktiven CNTF.

12.1.1.2.2. pRPN33, pRPN39 UND pRPN40

Mit der Ausnahme, daß das menschliche CNTF-Gen anstelle des Ratten- CNTF-Gens vorliegt, sind diese Plasmide zu pRPN12, pRPN37 bzw. pRPN38 analog und wurden in der gleichen Art und Weise unter Verwendung von pRPN32 als parentales Plasmid hergestellt. Die Copy-Kontroll-Region zwischen der EagI- und der PvuI-Stelle (im Uhrzeigersinn) in pRPN32 wurde durch die gleiche Sequenz aus pCP110 ersetzt, um pRPN33 herzustellen. Anschließend wurde die β-Lactamase-codierende Region zwischen den Asei-Restriktionsstellen in pRPN33 durch die mutierte kanR-Region von pblk1 (Panayotatos, N., Gene 74 (1988), 357-363) ersetzt, wodurch pRPN40 hergestellt wurde. Schließlich wurde der Bereich zwischen der NdeI- und der BglII-Restriktionsstelle von pRPN40 und pblk0 (Panayotatos, N., Gene 74 (1988), 357-363) ausgetauscht, wodurch pRPN39 erzeugt wurde, in welchem das kanR-Gen unter seinem Wildtyp-Promotor steht.

12.1.2. INDUKTION DER PROTEINSYNTHESE

Die Zellen wurden in LB-Brühe bei 37ºC bis zu einer OD&sub5;&sub9;&sub0; = 1 geschüttelt. Lactose wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 % zugegeben und die Inkubation 16 bis 20 Stunden fortgesetzt.

12.1.3. "SCHNELLE" PROTEINEXTRAKTION

Proben für die Gelelektrophorese wurden hergestellt, indem die Zellpellets aus 0,5 ml Kultur, OD&sub5;&sub9;&sub0; = 2, in 0,16 ml Lyse-Puffer (100 mM Tris-HCl, 10 % Glycerin, 4 % Natriumdodecylsulfat, 1 mM Dithiothreit, 0,5 mg/ml Bromphenolblau, pH 6,8) resuspendiert und 5 Minuten gekocht wurden.
Selektive Extraktion/Solubilisierung -- Dieses Verfahren, das erstmals für rekombinantes menschliches Leukocyten-Interferon-α2 beschrieben wurde (Thatcher, D., und Panayotatos, N., Methods Enzymol. 119 (1986), 166-177), wurde folgendermaßen modifiziert eingesetzt. Die Zellen aus induzierten Kulturen wurden resuspendiert und unter -20ºC gelagert. Nach der Lysozym-Behandlung wurde die viskose Suspension durch eine French-Press (SLM-Aminco) bei 8 000 Psi geschickt, sodann bei 11 000 x g zentrifugiert und das Pellet verarbeitet (Thatcher, D., und Panayotatos, N., Methods Enzymol. 119 (1986), 166-177). Nach vollständiger Dialyse des durch 8 M Guanidiniumchlorid solubilisierten Materials gegen Puffer D (10 mM Tris- HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 0,1 mM Dithiothreit) und Zentrifugation bei 11 000 x g wurde der klare Überstand aseptisch durch ein Millipore Sterifil D-GV- Filter laufengelassen.

12.1.4. CHROMATOGRAPHIE

Das Filtrat wurde auf 25 mM NaCl eingestellt und mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min auf eine 5 x 10 cm DEAE-Sephacel-Säule (Pharmacia) aufgetragen, äquilibriert mit Puffer E (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM Dithiothreit, 25 mM NaCl). Die Säule wurde mit einem Bettvolumen des gleichen Puffers gewaschen und mit drei Bettvolumina eines linearen Gradienten von 25 bis 500 mM NaCl im gleichen Puffer eluiert. Der rekombinante Ratten-CNTF wurde bei 250 bis 350 mM NaCl eluiert, wohingegen der menschliche CNTF bei 50 bis 100 mM eluiert wurde.
Beim Ratten-CNTF wurden die vereinigten Peak-Fraktionen gegen Puffer E dialysiert, sterilfiltriert und bei -70ºC gelagert.
Beim menschlichen CNTF wurden die vereinigten Peak-Fraktionen aus der DEAB-Sephacel-Säule auf 40 mM MES (Boehringer), pH 6,0, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM Dithiothreit (Puffer G), eingestellt, durch ein 0,22 µm Millex GF- Filter laufengelassen und durch eine 5 x 10 cm Fast-S-Säule (Pharmacia) mit 1 ml pro Stunde laufengelassen. Nach dem Waschen mit zwei Bettvolumina von Puffer G, enthaltend 250 mM NaCl, wurde ein drei Bettvolumina großer Gradient von 250 bis 1000 mM NaCl in Puffer G aufgetragen. Der menschliche CNTF wurde bei etwa 600 mM NaCl eluiert. Die Peak-Fraktionen wurden gegen Puffer E dialysiert, sterilfiltriert und bei -70ºC gelagert.

12.1.5. PEPTIDANALYSE

12.1.5.1. RATTEN-CNTF

Rekombinanter Ratten-CNTF (50 µg) wurde einer Spaltung mit BrCN unterworfen, wie beschrieben (Stockli et al., Nature 342, 920-923). Die resultierenden Peptide wurden durch Reversed-Phase-HPLC unter Verwendung von RP C4 aufgetrennt und das chromatographische Muster mit dem des BrCN-gespaltenen CNTF aus Ratten-Ischiasnerv verglichen. Das Peptid, das vorher als das am weitesten C-terminal gelegene Peptid identifiziert wurde, wurde einer Aminosäureanalyse unterworfen. Außerdem wurde das N-terminale Peptid identifiziert und einer Aminosäureanalyse unterworfen.

12.1.5.2. MENSCHLICHER CNTF

Rekombinanter menschlicher CNTF (400 pMol) in 1,5 ml 0,1 % TFA/50 % Acetonitril wurde in einer Speed-Vac auf ein Endvolumen von 300 ul eingeengt. Die Probe wurde auf eine Minisäule (Vydac C-4, 214 TPB, 300 A, 10 µm) aufgetragen, zweimal mit 0,1 % TFA/10 % Acetonitril gewaschen und mit 0,1 % TFA/70 % Acetonitril eluiert. Das Eluat wurde in einer Speed-Vac auf etwa 10 µl eingeengt. Eine C-terminale Spaltung wurde mit 2 % Carboxypeptidase Y und P (Boehringer Mannheim, Sequenzierungs-Qualität) in einem Gesamtvolumen von 20 µl bei 33ºC und bei pH-Werten von 3,79, 5,0 und 6,12, eingestellt durch Zugabe von Natriumcitrat (Endkonzentration von 0,025 bis 0,05 M), durchgeführt. In Abständen zwischen 10 und 65 Minuten der Inkubation wurden 3 µl einer 99%igen Ameisensäure und 200 pMol Aminoethanol (als interner Standard verwendet) zugegeben und die Probe auf die Minisäule aufgetragen, wie vorstehend beschrieben. Abgespaltene Aminosäuren wurden eluiert und die Säule zweimal mit 0,1 % TFA/10 % Acetonitril gewaschen. Die Aminosäuren wurden getrocknet und nach Derivatisierung mit o-Phthaldialdehyd analysiert. Der CNTF wurde von der Säule mit 0,1 % TFA/70 % Acetonitril eluiert, auf 10 µl eingeengt und sodann die Spaltung wiederholt.

12.1.6. BIOLOGISCHE AKTIVITÄT

Die biologische Aktivität des rekombinanten CNTF wurde auf Explantaten von Rückenmarkwurzel-Ganglien (DRG) von Hühnerembryos und dissozuerten Kulturen von Neuronen des Ziliarganglions (CG) getestet, wie in Lindsay und Rohrer (Devel. Biol. 112 (1985), 30-48) beschrieben. Kurz gesagt, DRG wurden aus Hühnerembryos nach 10-tägiger Inkubation (E10) entnommen und fünf bis sechs Ganglien in 1 ml einer Kollagen-Gel-Matrix in 35 mm-Gewebekultur-Schalen explantiert. Nachdem das Gel sich gesetzt hatte, wurde 1 ml Gewebekultur-Wachstumsmedium F14 (Imperial Labs., U.K.), angereichert mit 5 % hitzeinaktiviertem Pferdeserurn (GIBCO), zugegeben, anschließend wurde der menschliche CNTF (1 bis 20 l) bis zu einer Endkonzentration von 100 pg bis 100 ng/ml zugefügt. Die CG wurden aus E8-Hühnerembryos entnommen und 30 Minuten in 0,25 % Trypsin (Worthington) in Calcium- und Magnesium-freier Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Anschließend wurden die Ganglien dreimal in F14-Medium gewaschen, das 5 % Pferdeserum enthielt, sodann wurden sie zu einer Einzelzellsuspension dissoziiert, indem sie durch die Öffnung einer Pasteur-Pipette digeriert wurden. Die Anreicherung auf CG-Neuronen wurde durch Plattierung der Zellsuspension für 3,5 Stunden in einer 60 mm-Schale erreicht, während dieser Zeit hefteten sich Nicht-Neuronen-Zellen (Fibroblasten und Schwann-Zellen) fest an den Kunststoff an, während Phasen-helle Neuronen in Suspension verblieben. Die gereinigten Neuronen wurden auf Polyornithin-Laminin-beschichtete 35 mm-Kulturschalen mit 8 000 bis 10 000 Neuronen pro Schale plattiert. Die CNTF-Aktivität wurde in den Explantat-Kulturen bestimmt, indem das Ausmaß des Faser-Auswuchses in den behandelten Kulturen im Vergleich zu den Kontrollen festgestellt wurde. Der Faser-Auswuchs wurde auf einer Skala von 0 bis 5+ eingeteilt, indem die Kulturen mit Photographien einer dosisabhängigen Antwort von explantierten DRG auf NGF verglichen wurden. In Kulturen von dissoziierten CG-Neuronen wurde die CNTF-Aktivität bestimmt, indem nach 48 Stunden der prozentuale Anteil von Ausläufer-tragenden Neuronen in den Kontrollkulturen und in den mit CNTF behandelten Kulturen gezählt wurde. In allen Fällen wurden die Ergebnisse aus dreifach angelegten Kulturen erhalten.

12.1.7. ANDERE VERFAHREN

Bedingungen für enzymatische Umsetzungen, DNA-Elektrophorese und andere Techniken, die in diesen Untersuchungen verwendet wurden, wurden ausführlich beschrieben (Panayotatos, N., 1987, in K. G. Hardy (Hrsg.), Plasmids: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, U.K., S. 63-176). Die DNA- Sequenzierung wurde mit einem "Sequenase Version 2,0 Kit" (USB Corporation) durchgeführt, wobei 4 mg eines Superhelix-Plasmides als Matrize verwendet wurden.

12.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Bei früheren Untersuchungen zur Expression fremder Proteine in E. coli wurden mehrere Parameter gefunden, die zu einer Expression auf hohem Niveau beitragen und die Gewinnung eines biologisch aktiven Produktes erleichtern können. Wir haben Expressionsvektoren eingesetzt, die mehrere wichtige Eigenschaften aufweisen, umfassend: Regulation des lacUV5-Promotors durch den Lactose-Operon-Repressor; eine starke Ribosomenbindungsstelle aus dem Bakteriophagen T7; eine Mutation in der Replikations-Kontroll-Region des Plasmides, welche die Kopienzahl erhöht; und eine Mutation, welche die Expression des Antibiotikaresistenz-Proteins einschränkt. Wir haben insbesondere die Wirkung der beiden letzteren Eigenschaften auf die Produktion von CNTF in E. coli untersucht.

12.2.1. EXPRESSION VON RATTEN-CNTF

12.2.1.1. WIRKUNG AUF DIE KOPIENZAHL

Die Analyse der Proteinsynthese in Lactose-induzierten Kulturen von E. coli W3110lacIqf-/pRPN11 durch Gelelektrophorese zeigte die relativ schwache Expression eines Polypeptids mit etwa 24 000 kD, dies entspricht der für den Ratten-CNTF vorausgesagten Größe, das in induzierten Kontrollkulturen von Bakterien, die den Vektor pCP93 trugen, fehlte (FIG. 18). Auch Extrakte von Zellen, die pRPN11 trugen, enthielten signifikante Spiegel einer CNTF-Aktivität. Es ist zu beachten, daß in induzierten Zellen von E. coli W3110lacIqf-/RPN12, die sich von pRPN11 nur durch das Vorliegen der Kopienzahl-Mutation cop1 unterschieden, die Produktion von CNTF auf etwa 30 bis 50 % des gesamten zellulären Proteins gesteigert war (FIG. 18). Somit führte die fünffache Steigerung der Kopienzahl von pRPN12, verglichen mit pRPN11, zu einer 30- bis 50-fachen Steigerung der Spiegel des rekombinanten Proteins (Tabelle IV). Dieser Effekt der cop1-Mutation wurde schon in Zusammenhang mit anderen rekombinanten Proteinen dokumentiert (Buell, G., und Panayotatos, N., 1987, in "From Gene to Protein: Steps Dictating the Maximal Levels of Gene Expression", Reznikoff, W. S., und Gold, L., Hrsg., Butterworths, Stoneham, Mass.).

12.2.1.2. WIRKUNG EINER ANTIBIOTIKARESISTENZ

In früheren Studien über die Expression von rekombinanten Proteinen in E. coli wurde beobachtet, daß die Synthese des durch den Vektor codierten Antibiotikaresistenz-Proteins störend auf eine optimale Produktion des rekombinanten Proteins wirkte. Diese Störung wurde dem Wettstreit der zwei Gene um die begrenzte Synthesemaschinene der Zelle zugeschrieben (Panayotatos, N., Gene 74 (1988), 357-363). Um diese Hypothese weiter zu untersuchen und die Werte der CNTF-Produktion möglicherweise noch weiter zu erhöhen, wurde das β-Lactamase-Gen in pRPN12 durch das Kanamycinresistenz (kanR)-Gen, entweder unter der transkriptionalen Kontrolle seines nativen Prornotors (pRPN37) oder unter der Kontrolle eines schwächeren mutierten Promotors (pRPN38), ersetzt.
Die Analyse der Proteinspiegel in induzierten Zellen, die pRPN37 enthielten, zeigte, daß der Ratten-CNTF 10 bis 20 % des gesamten zellulären Proteins ausmachte und daß das kanR-Protein etwa zur Hälfte dieses Spiegels synthetisiert wurde. Im Gegensatz dazu machte der CNTF in Zellen, die pRPN38 enthielten, welches den mutierten kanR-Promotor trägt, 50 bis 70 % des gesamten zellulären Proteins aus, wohingegen das kanR-Protein nicht nachweisbar war (FIG. 18 und Tabelle IV). Die signifikant höhere Expression von CNTF, die mit pRPN38 beobachtet wurde, kommt vermutlich direkt durch die Verminderung des Spiegels der Expression des Antibiotikaresistenz-Gens zustande. Wie im Zusammenhang mit anderen rekombinanten Proteinen, die mit diesen Vektoren in hohen Spiegeln exprimiert wurden, bereits beobachtet und diskutiert wurde (Panayotatos, N., Gene 74 (1988), 357-363), führt die Abschwächung des kanR-Promotors auf ein Minimum dazu, daß der Wettstreit um die offensichtlich begrenzten Synthesekapazitäten der Zelle auf ein Minimum herabgesetzt wird.

12.2.2. EXPRESSION DES MENSCHLICHEN CNTF

Die relativen Spiegel der Expression des menschlichen CNTF, die mit verschiedenen Vektoren erhalten wurden, sind in FIG. 18 dargestellt und in Tabelle IV zusammengefaßt. Diese maximalen Spiegel, die mit den jeweiligen Vektoren erhalten wurden, waren niedriger als die Spiegel, die mit den analogen Vektoren, die das Rattengen trugen, beobachtet wurden, das Muster war jedoch insgesamt gleich; wieder wurde mit den Plasmiden mit höherer Kopienzahl (cop1) eine 30- bis 50-fache Steigerung beobachtet, und wieder wurden die maximalen Spiegel mit der Kombination von hoher Kopienzahl und niedriger Expression der Kanamycinresistenz erhalten. Bei der Expression des menschlichen CNTF ist der Effekt des reduzierten kanR-Gens (pRPN39 verglichen mit pRPN40) jedoch etwas weniger deutlich als bei der Expression des Ratten-CNTF (pRPN37 verglichen mit pRPN38). Dies wurde erwartet, da der Wettstreit der zwei Transkriptionseinheiten nur zu Tage tritt, wenn die Synthesemaschinene der Zelle an ihre Grenzen stößt, d.h. bei extrem hohen Spiegeln des rekombinanten Proteins.
Der hier beschriebene Spiegel der Produktion von Ratten-CNTF in E. coli ist außergewöhnlich hoch. Dies kommt offensichtlich durch eine günstige Kombination mehrerer Faktoren zustande, umfassend die Verwendung eines mäßig starken Promotors, eines starken Ribosomen-Translations-Initiations-Signals, eines Plasmidvektors, der bei einer relativ hohen Kopienzahl stabil gehalten wird, und die minimale Synthese des selektiven Antibiotikaresistenz-Proteins. Außerdem wird die Produktion des rekombinanten Proteins durch die physikalischen Eigenschaften des Proteins selbst und durch seine Stabilität im Wirt bestimmt. In dieser Hinsicht scheint der Ratten-CNTF für die Expression in E. coli besonders geeignet zu sein. Der menschliche CNTF wird auch sehr effizient exprimiert, jedoch mit etwas niedrigeren Spiegeln.

12.2.3. REINIGUNG DES RATTEN-CNTF UND DES MENSCHLICHEN CNTF

Wie andere rekombinante Proteine, die in hohen Spiegeln in E. coli exprimiert werden, wurde der CNTF größtenteils in unlöslichen Einschlußkörpern gefunden; 85 bis 90 % des Ratten-Proteins und 60 bis 70 % des menschlichen Proteins widerstanden einer Extraktion durch einen neutralen Puffer. Die Extraktion und Solubilisierung von CNTF und anderen (im wesentlichen hydrophoben) Proteinen, die in Einschlußkörper eingeschlossen waren, wurde mit 8 M Guanidiniumchlorid durchgeführt. Die anschließende langsame Entfernung von Guanidinium durch Dialyse führte zur Ausfällung der hydrophoben Wirtsproteine und ließ den Ratten-CNTF mit einer Reinheit von mehr als 95 % und den menschlichen CNTF mit einer Reinheit von mehr als 90 % in Lösung (FIG. 19). An dieser Stelle war ein einziger Chromatographieschritt (DEAE-Sephacel) ausreichend, um den rekombinanten Ratten- CNTF auf eine Reinheit von mehr als 99 % zu reinigen, dies wurde aus den relativen Intensitäten in bewußt überladenen Polyacrylamidgelen ersehen (FIG. 19 A) oder durch HPLC-Analyse ermittelt. Teilweise aufgrund der schwächeren Affinität des menschlichen Proteins für DEAE-Sephacel war es hier nötig, einen zweiten Chromatographieschritt (Fast S) anzuschließen, um eine Reinheit von mehr als 99 % zu erhalten (FIG. 19 B).

12.2.3.1. AUSBEUTE

Wenn man die erwarteten Expressionsspiegel voraussetzt und annimmt, daß der Gesamtproteingehalt des feuchten Zellpellets 5 bis 15 % Protein pro Gesamtgewicht beträgt, dann läge die theoretische Ausbeute bei 30 bis 90 mg Ratten-CNTF und 15 bis 45 mg menschlichem CNTF pro Gramm fechtes Zellpellet. Die tatsächliche Ausbeute betrug beim Ratten-CNTF etwa 20 mg und beim menschlichen CNTF etwa 6 mg. Der Verlust beruht im Fall des menschlichen Proteins größtenteils auf "löslichem" CNTF, der während der Präparation der Einschlußkörper extrahiert und verworfen wird.

12.2.3.2. CHARAKTERISIERUNG

Rekombinanter CNTF, sowohl Ratten-CNTF als auch menschlicher CNTF, der durch die vorstehenden Verfahren hergestellt wurde, war zu mehr als 99 % rein. Die Proteine zeigten im Limulus-Amöbocyten-Lysat-Test (Associates of Cape Cod) eine sehr niedrige Pyrogenität (! 5 ng/mg Protein). Außerdem wurde gefunden, wie nachstehend diskutiert, daß sie im Picomol-Bereich biologisch aktiv waren.
Die rekombinanten Ratten- und menschlichen CNTF-Proteine wurden mit BrCN behandelt, sodann wurden die N-terminalen und C-terminalen Peptide identifiziert und Analysen der Aminosäurezusammensetzung und/oder -Sequenz unterworfen. Die Analysen der N-terminalen Peptide zeigten, daß sowohl im Ratten- als auch im menschlichen Protein die N-terminale Aminosäure quantitativ als Alanin gewonnen wurde. Dies bedeutet, daß das am Anfang stehende Methionin quantitativ entfernt worden war, wie es im allgemeinen bei E. coli der Fall ist, wenn der zweite Rest die nicht-voluminöse Aminosäure Alanin ist. Im Gegensatz dazu ist der N-Terminus von CNTF, der aus Ratten Ischiasnerv gereinigt wurde, blockiert, und der terminale Methioninrest bleibt vermutlich erhalten.
Am Carboxylende wurde beim rekombinanten menschlichen CNTF die erwartete Sequenz des terminalen BrCN-Peptids erhalten. Im Gegensatz dazu zeigte die Analyse der Aminosäurezusammensetzung des C-terminalen Peptids des Ratten-CNTF, daß es zwar die erwartete Zusammensetzung aufwies, daß aber ein erwarteter Tyrosinrest fehlte und ein zusätzlicher Asparaginrest vorlag. Die DNA-Sequenzanalyse deckte eine Punktmutation auf, die im Codon 193 eine Substitution von Tyrosin zu Asparagin bewirkte; dies war offensichtlich bei der Konstruktion des ursprünglichen Expressionsvektors pRPN11 passiert, während des Kopierens einer donierten Ratten-CNTF-cDNA durch PCR. Wir haben festgestellt, daß die Mutation in einem Bereich des CNTF liegt, der für die biologische Aktivität nicht essentiell ist.
Ratten-CNTF und menschlicher CNTF haben die gleiche Anzahl von Aminosäuren (berechnetes Molekulargewicht 22 780 bzw. 22 700 nach Entfernung des N-terminalen Methioninrestes), und sie haben große Teile ihrer Sequenzen gemeinsam. Dennoch läuft der menschliche CNTF sowohl auf reduzierenden als auch auf nicht-reduzierenden SDS-Polyacrylamidgelen etwas langsamer als der Ratten-CNTF (FIG. 19). Dieser Unterschied in der Mobilität zwischen zwei Molekülen, die in der Struktur ähnlich und in der Länge identisch sind, spiegelt möglicherweise irgendeine ungewöhnliche strukturelle Einschränkung im menschlichen Protein wieder.

12.2.4. BIOLOGISCHE AKTIVITÄT

Der durch das vorstehende Verfahren gereinigte Ratten-CNTF war vollständig aktiv. FIG. 20 zeigt Dosis-Antwort-Kurven, die bei Behandlung von dissoziierten, Neuronen-angereicherten Kulturen von Ziliarganglien aus E8- Hühnerembryos mit CNTF, der aus dem Ischiasnerv der Ratte gereinigt wurde (Stockli et al., Nature 342, 920-923), und mit rekombinantern Ratten-CNTF erhalten wurden. Die Aktivität des aus dem Ischiasnerv gereinigten Proteins war bei 5 pg/ml nachweisbar, ein maximales Überleben von Neuronen wurde bei 1 bis 2 ng/ml (EC&sub5;&sub0; = 80 pg/ml) beobachtet. Im gleichen Test zeigte der gereinigte rekombinante Ratten-CNTF bei 2 pg/ml eine Aktivität, die Sättigung wurde bei 0,5 bis 1,0 ng/ml (EC&sub5;&sub0; = 35 pg/ml oder 1,5 pM) beobachtet. Somit war der gereinigte rekombinante Ratten-CNTF mindestens so aktiv wie das native, aus dem Ischiasnerv gereinigte Protein.
In entsprechenden Experimenten wurde der gereinigte rekombinante menschliche CNTF auf biologische Aktivität getestet. Anfangs wurden Explantate aus Hühner-DRG vom Tag 10 der Embryonalentwicklung (E10) für einen schnellen und halbquantitativen Nachweis der CNTF-Aktivität in E. coli-Lysaten verwendet. In Gegenwart von CNTF wurde ein Auswuchs von Fasern beobachtet, während in Abwesenheit eines exogenen neurotrophen Faktors nur wenig oder gar kein Auswuchs aus den Kontrollganglien stattfand (FIG. 21 A, B). Der maximale Faser-Auswuchs bei sättigenden Spiegeln von CNTF betrug etwa 50 bis 70 % des mit sättigenden Spiegeln von NGF beobachteten Wertes.
Ein spezifischerer Test mißt das Überleben von Neuronen in dissoziierten, Neuronen-angereicherten Kulturen von Ziliarganglien aus E8-Hühnern. Nach 48 Stunden waren in den Kontrollkulturen fast alle Neuronen degeneriert (FIG. 21 C), wohingegen mindestens 60 bis 70 % der Neuronen, die in Gegenwart von sättigenden CNTF-Spiegeln plattiert wurden, überlebten und lange Neunte ausbildeten (FIG. 21 D, E). Diese spezifischen Effekte auf Ziliarneuronen wurden mit rohen bakteriellen Zellysaten in Mengen unter dem Nanogramm-Niveau und mit einem gereinigten rekombinanten Protein beobachtet. Aus solchen Experimenten, die mit steigenden Mengen des reinen Proteins durchgeführt wurden, wurde bestimmt, daß der rekombinante menschliche CNTF gegenüber Hühner-Ziliarneuronen genauso aktiv war wie der Ratten-CNTF.
Die hier beschriebene Expression und Reinigung von CNTF könnte für die pharmazeutische Produktion einfach in einen größeren Maßstab übertragen werden. Dies kann hinsichtlich der kürzlich vorgestellten Befunde von Bedeutung sein, daß CNTF das Überleben von verletzten Motoneuronen in Versuchstieren fördern kann (Sendtner et al., Nature 345 (1990), 440-441). TABELLE IV Plasmid allgemeine Mermale* spezielle Merkmale* Amp oder kanR** * lac: lacUV5-Promotor; rbs1: Ribosomenbindungsstelle; ratCNTF, humCNTF: Ratten- oder menschliches CNTF-Gen; amp: Ampicillinresistenz-Gen; kanO, kan1: Wildtyp- oder mutiertes kanR-Gen; cop+, cop1: Plasmid mit normaler oder hoher Kopienzahl. ** Als prozentualer Anteil des gesamten zellulären Proteins angegeben.

13. BEISPIEL: WEITERE EFFEKTE VON CNTF AUF VENTRALE RÜCKENMARKNEURONEN

13.1. MATERIAL UND METHODEN

13.1.1. VERSUCHSTIERE

Für alle Experimente wurden Sprague-Dawley-Ratten (HSD oder Zivic- Miller) verwendet. Trächtige Ratten (E14) wurden getötet, wie in 10.1.1. beschrieben.

13.1.2. GEWEBEKULTUR-TECHNIKEN

Rückenmark wurde aus den Rattenembryos aseptisch entfernt, wie in 10.1.2. beschrieben. Die Rückenmarkgewebe wurden in kleine Stücke zerkleinert und in 0,1 % Trypsin (GIBCO) und 0,01 % Desoxyribonudease Typ I (Sigma) 20 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurde die Trypsin-Lösung entfernt, gespült und durch Medium ersetzt, das aus 45 % Eagle-Minimum-Essentiell-Medium (MEM), 45 % Ham-Nährmischung-F12 (F12), 5 % fetalem Kälberserum (GIBCO), 5 % Pferdeserum (GIBCO), Glutamin (2 mM), Penicillin G (0,5 U/ml) und Streptomycin (0,5 µg/ml) bestand. Das Ganze wurde sodann zweimal mechanisch dissoziiert, indem es im gleichen Medium durch eine Pasteur-Pipette sanft digeriert wurde, anschließend wurden die Überstände vereinigt und durch ein Nylonfilter (Nitex, Tetko; 40 µm) filtriert. Die erhaltene Gesamtzellzahl wurde durch Zählung in einem Hämocytometer in Gegenwart von Trypanblau bestimmt. Anschließend wurden die dissoziierten ventralen Zellen mit einer Dichte von etwa 50 000 Zellen/cm² auf Schalen plattiert, die mit Poly-L-Ornithin (10 µg/ml) und Laminin (5 µg/ml) beschichtet waren. Die Behandlungen wurden jeweils am Tag der Plattierung durchgeführt, außer bei den Experimenten mit verzögerter Zugabe, bei denen die Behandlungen an den Tagen 2 oder 6 erfolgten. Die Kulturen wurden bei 37ºC in einer Atmosphäre von 95 % Luft/5 % CO&sub2; bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von fast 100 % gehalten. Das Kulturmedium wurde alle drei bis vier Tage ausgetauscht. Ein Mitose-Inhibitor, Cytosinarabinosid (AraC; 0,5 µM), wurde am Tag 2 zugegeben, um die Zahl der Nicht-Neuronen-Zellen zu reduzieren. Am Tag 7 wurden die Zellen geerntet und sodann die Spiegel von Cholin-Acetyltransferase (CAT; Fonnum, J. Neurochem. 24 (1975), 407-409) und Protein (Bradford, Annal. Biochem. 72 (1976), 248-254) bestimmt, oder sie wurden in 4 % Paraformaldehyd für den NF-Test (Doherty et al., J. Neurochem. 42 (1984), 1116-1122) und für immuncytochemische Tests fixiert. Einige Kulturen wurden in definiertem Medium gezüchtet, das aus 50 % F12 und 50 % MEM, Glutamin (2 mM), Insulin (5 µg/ml), Transferrin (100 µg/ml), Progesteron (20 nM), Putrescin (100 µM) und Natriumselenit (30 nM) bestand (Bottenstein und Sato, PNAS 76 (1979), 514-517). In diesen Kulturen wurde das Sera-enthaltende Medium am Tag 1 durch definiertes Medium ersetzt.

13.1.3. TEST AUF NEUROFILAMENT (NF)

Nach der Fixierung der Zellen in 4 % Paraformaldehyd, 2 Stunden bei 4ºC, wurden die Kulturen durchlässig gemacht und blockiert, wobei die in Doherty et al. (J. Neurochem. 42 (1984), 1116-1122) beschriebenen Verfahren verwendet wurden. Das Neurofilament-Protein wurde unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers RT97 (Wood und Anderton, Biosci. Rep. 1 (1981), 263-268) bei einer Verdünnung von 1:1000 nachgewiesen. Das Reaktionsprodukt wurde unter Einsatz von o-Phenylendiamin (OPD) als Substrat sichtbar gemacht und die optische Dichte bei 490 nm gemessen.

13.1.4. TEST AUF CHOLIN-ACETYLTRANSFERASE (CAT)

Die Kulturen wurden geerntet, indem die Zellen in einer 20 mM Tris- HCl-Lösung (pH 8,6), enthaltend 0,1 % Triton X-100, lysiert wurden. 2 µl des Zellysates wurden entnommen und auf CAT-Aktivität getestet, wobei das Mikro-Fonnum-Verfahren (Fonnum, J. Neurochem. 24 (1975), 407-409) verwendet wurde. Die endgültige Substratzusammensetzung bestand aus 0,2 mM [1- 14C] Acetyl-CoA (NEN, 54,4 mCi/mMol), 300 mM NaCl, 8 mM Cholinbromid, 20 mM EDTA und 0,1 mM Neostigmin in 50 mM NaH&sub2;PO&sub4;-Puffer (pH 7,4). Bei diesen Enzym- und Substratkonzentrationen war die Enzymreaktion 90 bis 120 Minuten lang linear. Die Spezifität der Induktion für CAT wurde getestet, indem während des Tests ein spezifischer Inhibitor der CAT-Aktivität, N-Hydroxyethyl-4-(1-naphthylvinyl)pyridium (HNP) zugesetzt wurde (White und Cavallito, J. Neurochem. 17 (1970), 1579-1589).

13.1.5. HISTOCHEMISCHE FARBUNG AUF ACETYLCHOLINESTERASE (AchE)

Cholinerge Zellen wurden durch histochemische Färbung auf AchE identifiziert, wobei das Färbeverfahren von Geneser-Jensen und Blackstadt (Z. Zellforsch. 114 (1971), 460-481) modifiziert wurde. Nach der Fixierung der Kulturen in 4 % Paraformaldehyd wurden die Zellen 5 bis 6 Tage bei 4ºC in Gegenwart der AchE-Substrat-Lösung inkubiert, die folgendermaßen zusammengesetzt war. 4 mM Acetylthiocholiniodid, 2 mM Kupfersulfat, 10 mM Glycin und 10 µg/ml Gelatine in 50 mM Acetatpuffer (pH 5,0). Das Reaktionsprodukt wurde sichtbar gemacht, wie bereits beschrieben (Hartikka und Hefti, J. Neurosci. 8 (1988), 2967-2985).

13.1.6. FRAKTIONIERUNG VON VORDERHORN-ZELLEN DURCH METRIZAMID- DICHTEGRADIENT

Das Fraktionierungsverfahren (Dohrman et al., Dev. Biol. 118 (1986), 209-221) war eine Modifikation des von Schnaar und Schaffner (J. Neurosci. 1 (1981), 204-207) beschriebenen Verfahrens. Metrizamid wurde in einem Medium von F12:MEM (1:1) gelöst und ein Stufengradient hergestellt, der aus 3 ml 17 % Metrizamid, 3 ml 12 % Metrizamid und 3 ml 8 % Metrizamid bestand. Die folgenden Schritte wurden alle bei 4ºC durchgeführt. Die Vorderhornzellen-Suspension (2,5 ml), die wie früher beschrieben erhalten wurde, wurde auf den Stufengradienten aufgetragen, anschließend wurde das Röhrchen 20 Minuten bei 2500 x g unter Verwendung eines Schwingrotors zentrifugiert. Die Zentrifugation ergab drei Schichten von Zellen an den Grenzflächen von 0 bis 8 % (Fraktion I), von 8 bis 12 % (Fraktion II) und 12 bis 17 % (Fraktion III). Die Zellen aus jeder Grenzfläche wurden in einem kleinen Volumen (etwa 1 ml) gesammelt, plattiert, behandelt und getestet, wie beschrieben. Die Neuronen aus Fraktion I wurden in konditioniertem Medium gehalten, das von gezüchteten Rückenmarkzellen stammte.

13.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION

13.2.1. ALLGEMEINE MORPHOLOGIEN DER KULTUREN

Vorderhornzellen, die in Sera-enthaltendem Medium gezüchtet wurden, ergaben gemischte Neuronen-Gliazellen-Kulturen. Nach 24 Stunden breitete sich Glia aus und vermehrte sich, während nur wenige Neuronen begannen, Neunten auszubilden. Nach 48 Stunden jedoch brachten viele Neuronen Neurite hervor und zeigten einen charakteristischen Phasen-hellen Zellkörper (FIG. 23). Nach Zusatz von AraC am Tag 2 begannen die Nicht-Neuronen-Zellen abzusterben und wegzutreiben, wobei sie eine Neuronen-angereicherte Kultur hinterließen, die etwa 5 % Glia enthielt. Im definierten Medium enthielten die Kulturen auch etwa 5 % Glia, das durch Behandlung mit AraC noch weiter reduziert werden konnte. In den durch Metrizamid-Gradienten gereinigten Motoneuron-Horn-Kulturen (Fraktion I) lag tatsächlich kein Glia vor, und über 90 % der Neuronen waren große cholinerge Neuronen.

13.2.2. EFFEKTE VON CNTF AUF DIE SPIEGEL VON NEUROFILAMENT (NF)

Um die Effekte von CNTF auf Neuronen zu bestimmen, wurden die NF- Spiegel gemessen. Eine 2,0-fache Erhöhung des NF-Gehaltes wurde in den mit CNTF behandelten (10 ng/ml) Vorderhornkulturen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen gefunden. NGF zeigte keine signfikante Wirkung (FIG. 24). Dies legt nahe, daß CNTF das Überleben und/oder den Auswuchs von Neunten in gezüchteten ventralen Neuronen fördert.

13.2.3. EFFEKTE VON CNTF AUF DAS ÜBERLEBEN VON AchE-ENTHALTENDEN NEURONEN

Um zu bestimmen, ob die Erhöhung der NF-Spiegel eine Steigerung des Überlebens von Neuronen oder des Auswuchses von Neunten wiederspiegelt, wurde eine histochemische Färbung auf AchE durchgeführt, da die meisten Neuronen in Vorderhornkulturen cholinerge Motoneuronen sind. Eine 2,5-fache Steigerung der Ache-positiven Neuronen wurde in CNTF-behandelten Kulturen (10 ng/ml) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen gefunden. NGF schien nur eine geringe Wirkung zu haben. Diese Ergebnisse legen nahe, daß CNTF das Überleben von Neuronen steigert, das vermutlich für die Erhöhung der NF-Spiegel verantwortlich ist.

13.2.4. EFFEKTE VON CNTF AUF DIE CAT-AKTIVITÄT

Um den Einfluß von CNTF auf die Phänotyp-Expression des Transmitters zu untersuchen, wurden die Spiegel der CAT-Aktivität bestimmt. CAT ist bei der Ach-Synthese das Geschwindigkeits-begrenzende Enzym. Wie in FIG. 26 dargestellt, erzeugt der Zusatz von CNTF (10 ng/ml) nach 7 Tagen in Kultur im Durchschnitt eine vierfache Steigerung der CAT-Aktivität, während der Zusatz von anderen Wachstumsfaktoren, wie z.B. NGF (50 ng/ml) und FGF (50 ng/ml), keine Wirkung hatte. Diese Steigerung der cholinergen Aktivität war dosisabhängig und erreichte den maximalen Wert bei CNTF-Konzentrationen von 1 ng/ml (FIG. 26 B). Diese Steigerung trat bereits drei Tage nach der Behandlung auf und schien durch die Dichte der Kulturen nicht beeinträchtigt zu werden. Diese Ergebnisse legen nahe, daß CNTF auch die Expression des cholinergen Transmitters stimuliert, da die Zunahme der CAT- Aktivität um das 1,6-fache über der Zunahme der Zellzahl der cholinergen Neuronen liegt; das heißt, die überlebenden cholinergen Neuronen exprimieren mehr Ach pro Neuron.

13.2.5. EXPERIMENT MIT VERZÖGERTER ZUGABE

Vorderhornzellen wurden in drei Gruppen aufgeteilt, wie in FIG. 27 gezeigt. In FIG. 27 A wurde CNTF (10 ng/ml) zur Zeit der Plattierung zu den Zellen zugegeben, und die Zellen wurden 7 Tage in Gegenwart von CNTF gehalten. In den FIG. 27 B und C wurden die Kulturen zuerst entweder 2 oder 6 Tage ohne CNTF gehalten und anschließend für weitere 7 Tage mit CNTF (10 ng/ml) behandelt. Die vorzögerte Zugabe von CNTF am Tag 2 führte zu einer geringeren Steigerung der CAT-Aktivität auf das 1,2-fache. Nach 6 Tagen Verzögerung kann der CNTF die CAT-Aktivität jedoch nicht mehr beeinflussen (FIG. 27). Dies legt nahe, daß es eine Population von CNTF-sensitiven Neuronen gibt, die normalerweise in Abwesenheit von CNTF innerhalb von wenigen Tagen nach der Plattierung abstirbt. In Gegenwart von CNTF überleben diese Zellen und exprimieren eine gesteigerte Menge von Ach.

13.2.6. EFFEKTE VON CNTF AUF VORDERHORNKULTUREN IN ABWESENHEIT VON GLIA

Die in Vorderhornkulturen vorliegenden Gliazellen wurden durch zwei Verfahren reduziert: a) Behandlung mit Anti-Mitose-Mittel (AraC; 0,5 µM), und (b) Verwendung von Serum-freiem Wachstumsmedium. In beiden Fällen wurden die Gliapopulationen auf etwa 5 % der Gesamtzellen reduziert, die Effekte von CNTF auf die CAT-Aktivität blieben jedoch unverändert (FIG. 28). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Wirkung von CNTF auf die CAT-Aktivität vermutlich nicht über Glia vermittelt wird, sondern eine direkte Antwort aus den Neuronen ist.

13.2.7. EFFEKTE VON CNTF AUF METRIZAMID-GRADIENT-GEREINIGTE MOTONEURONEN

Die Vorderhornkulturen waren bereits mit cholinergen Neuronen angereichert. Um die Homogenität der Kulturen sicherzustellen, wurden die Motoneuronen aus den Vorderhorn-Rückenmark-Kulturen weiter durch einen Dichtegradienten gereinigt. Ein Metrizamid-Stufengradient ermöglicht die Selektion von Motoneuronen aufgrund ihrer leichteren Schwimm-Dichten. Die resultierenden Kulturen enthielten mehr als 90 % Motoneuronen, wie bereits von Schnaar und Schaffner (J. Neurosci. 1 (1981), 204-207) gezeigt. In den gereinigten Motoneuron-Kulturen stimulierte CNTF (10 ng/ml) im Vergleich zu unbehandelten Kulturen eine 10-fache Steigerung der CAT-Aktivität (FIG. 29). Mit Hilfe des Metrizamid-Gradienten kann eine möglicherweise als Verunreinigung vorliegende Gruppe von kleinen cholinergen Präganglion-Sympathikus-Neuronen von den großen Motoneuronen abgetrennt werden. Die Ergebnisse zeigen, daß CNTF das Überleben fördert und die cholinerge Expression in den Motoneuronen stimuliert.

14. BEISPIEL: EFFEKT DES ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTORS AUF HIPPOKAMPUS-KULTUREN

14.1. MATERIAL UND METHODEN

14.1.1. HIPPOKAMPUS-ZELLKULTUREN

Hippokampi wurden aus E18- bis E19-Rattenembryos von Sprague-Dawley- Ratten entnommen und in F10-Medium gesammelt. Die Gewebe wurden zerkleinert, zweimal mit F10-Medium (GIBCO) gespült und 20 Minuten bei 37ºC mit 0,25 % Trypsin (GIBCO) behandelt. Anschließend wurde das Trypsin durch Zusatz eines Serum-enthaltenden Mediums inaktiviert, zusammengesetzt aus Minimal-Essentiell-Medium (MEM), angereichert mit fetalem Kälberserum (FCS, 10 %), Glutamin (2 mM), Penicillin (25 U/ml) und Streptomcyin (25 µg/ml) Die durch sanftes Digerieren erhaltenen Zellen wurden gesammelt und bei niedriger Geschwindigkeit (500 UpM) 30 Sekunden zentrifugiert. Die Zentrifugation wurde zweimal wiederholt und die Zellpellets sodann in Serum-enthaltendem Medium suspendiert. Anschließend wurden die Zellen auf 6 mm-Vertiefungen oder 35 mm-Schalen plattiert, die mit Polyornithin (10 µg/ml) und Laminin (10 µg/ml) beschichtet waren. In den meisten Experimenten wurden die Zellen mit einer sehr geringen Dichte von etwa 71 000 Zellen/cm² plattiert. Fünf bis sechs Stunden nach der Plattierung der Zellen wurde das Medium durch ein Serum-freies Medium ausgetauscht, das 1 % N3 und Penicillin-Streptomycin (25 U/ml bzw. 25 µg/ml) enthielt, gleichzeitig wurde CNTF zugefügt. Das Medium wurde alle drei bis vier Tage ausgetauscht, wobei der Faktor jeweils wieder zugesetzt wurde.
Um Neuronen-angereicherte Kulturen zu erhalten, wurde Cytosinarabinosid (AraC, 0,3 µM) für einen Zeitraum von 24 Stunden zugesetzt. Unter solchen Bedingungen enthielten die Hippokampus-Kulturen etwa 5 bis 10 % Gliazellen, dies wurde durch GFAP-Immunhistochemie-Verfahren festgestellt.

14.1.2. TEST AUF GAD-ENZYMAKTIVITÄT

Die GAD-Enzymaktivität wurde gemäß dem Verfahren von Kimura und Kuriyama (Jpn. J. Pharm. 25 (1975), 189-195) bestimmt, indem die Freisetzung von ¹&sup4;CO&sub2; aus L-[1-¹&sup4;C]-Glutaminsäure bestimmt wurde. Die Zellen auf 35 mm-Schalen wurden mit 30 µl einer Lösung lysiert, die 50 mM KH&sub2;PO&sub4; (pH 7,2) und 0,25 % Triton X-100 enthielt, sodann abgeschabt und gesammelt. 5 µl des Zellysates wurden auf GAD-Enzymaktivität getestet. In einem typischen Ansatz enthielt das Reaktionsgemisch 0,57 mM L-[1-¹&sup4;C]-Glutaminsäure (NEN, NEC-715, 52,6 mCi/mMol), Glutaminsäure (3 mM), Pyridoxalphosphat (0,2 mM) und AET (1 mM) in einem KH&sub2;PO&sub4;-Puffer (50 mM, pH 7,2). Unter die sen Reaktionsbedingungen verlief die Enzymreaktion bis zu 2,5 Stunden linear. Die Inkubation erfolgte zwei Stunden bei 37ºC und wurde durch Injektion von 25 µl von 8 N H&sub2;SO&sub4; ins Reaktionsgemisch beendet. Anschließend wurde die Inkubation weitere 60 Minuten fortgesetzt. Das freigesetzte ¹&sup4;CO&sub2; wurde in Hyamin-Basenlösung aufgefangen und gezählt.

14.1.3. MESSUNG VON NEUROFILAMENT-PROTEIN

Die Menge des Neurofilament-Proteins wurde gemäß dem Verfahren von Doherty et al. (Neurochem. 42 (1984), 1115-1122) bestimmt, wie in Abschnitt 14.1.3. beschrieben.

14.1.4. MESSUNG DER HOCHAFFINITÄTS-GABA-AUFNAHME

Die Hochaffinitäts-GABA-Aufnahme wurde unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens von Tomozawa und Appel (Brain Res. 399 (1986), 111- 124) gemessen. Die Zellen wurden im GABA-Aufnahme-Puffer gewaschen, der 140 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1 mM KH&sub2;PO&sub4;, 1 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 6 mg/ml Glucose, 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM CaCl&sub2;, 0,1 % BSA enthielt. Nach dem Waschen wurden die Zellen 5 Minuten bei 37ºC mit dem GABA-Aufnahme-Puffer inkubiert. Anschließend wurde ³H-GABA (NEN, NET-191X, 111,4 Ci/mMol) bis zu einer Endkonzentration von 12 nM zugefügt und die Inkubation 10 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Sodann wurden die Zellen auf Eis gehalten und dreimal mit dem Aufnahme- Puffer gewaschen. Die Zellen wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 0,14 N NaOH inkubiert und ³H-GABA im Extrakt gezählt. Es wurde gefunden, daß die Aufnahme von ³H-GABA mindestens bis zu 30 Minuten linear war. Die Aufnahme von GABA in Nicht-Neuronen-Zellen wurde durch die Zugabe von 2 mM β- Alanin gehemmt, wohingegen die für Neuronen spezifische Aufnahme durch Hemmung mit Nipecotinsäure bei 1 mM bestätigt wurde.

14.1.5. IMMUNHISTOCHEMISCHE FÄRBUNG AUF GAD ODER GABA

Die Zellen wurden mit 4 % Paraformaldehyd 30 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und mit PBS gewaschen. Für die GAB-Färbung wurden die Zellen permeabel gemacht, indem sie nacheinander mit 50 %, 70 % und 50 % Ethanol gespült wurden. Sodann wurden die Kulturen durch Spülung mit PBS, enthaltend 5 % normales Kaninchenserum, eine Stunde blockiert und mit Schaf- Anti-GAB-Antikörper 1440 (bei einer Verdünnung von 1:6000) über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach dreimaligem Spülen mit PBS wurden die Zellen sodann mit biotinyliertem Kaninchen-Anti-Schaf-Antikörper bei einer Verdünnung von 1:400 mindestens 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Für die GABA-Färbung wurden die Zellen mit Triton X-100 (0,25 %) in Tris-HCl (0,1 M, pH 7,3) permeabel gemacht und mit 10%igem normalem Ziegen-Serum 90 Minuten blockiert, anschließend folgte die Inkubation mit Kaninchen-Anti- GABA-Antikörper (1:5000) über Nacht bei 4ºC. Nach drei Spülungen mit PBS wurden die Zellen mit biotinyliertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper bei einer Verdünnung von 1:200 mindestens 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. GAG- oder GABA-immunreaktive Zellen wurden unter Verwendung des "Vectastain ABC Kit" (Vector Labs) sichtbar gemacht.

14.1.6. IMMUNHISTOCHEMISCHE FÄRBUNG AUF NEURONEN-SPEZIFISCHE ENOLASE (NSE)

Nach der Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd wurden die Zellen mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) in PBS, enthaltend 0,1 % Triton X-100, blockiert. Anschließend wurden die Zellen mit dem Primär-Antikörper (Kaninchen-Anti-NSE, 1:5000) über Nacht bei 4ºC inkubiert. Sodann wurden die Zellen mit dem Sekundär-Antikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen, 1:200 Verdünnung) mindestens 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die NES-immunpositiven Zellen wurden unter Verwendung des "Vectastain ABC Kit" (Vector Labs) sichtbar gemacht.

14.1.7. HISTOCHEMISCHE FÄRBUNG AUF CALBINDIN

Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd 30 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Nach dem Waschen mit 1 % normalem Pferdeserum (NES) und Blockierung mit 5 % NHS in PBS eine Stunde bei Raumtemperatur wurden die Zellen mit einem Maus-Anti-Calbindin-Antikörper (1:1000 Verdünnung) in 1 % NHS über Nacht bei 4ºC inkubiert. Sodann wurden die Zellen dreimal mit 1 % NHS gespült und mit dem Sekundär-Antikörper (Pferd-Anti-Maus bei 1:400-Verdünnung) 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die bzgl. Calbindin immunreaktiven Zellen wurden unter Verwendung des "Vectastain ABC Kit" (Vector Labs) sichtbar gemacht.

14.1.8. HISTOCHEMISCHE FÄRBUNG AUF ACETYLCHOLINESTERASE

Die histochemische Färbung auf Acetylcholinesterase wurde gemäß den Verfahren von Geneser-Jensen und Blackstadt (Z. Zellforsch. 114 (1971), 460-481) durchgeführt. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd 30 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Anschließend wurden die fixierten Zellen mit einem Reaktionsgemisch inkubiert, das 50 mM Acetatpuffer (pH 5,0), 4 mM Acetylthiocholiniodid, 2 mM Kupfersulfat, 10 mM Glycin und 10 µg/ml Gelatine enthielt. Unspezifische Cholinesterasen wurden gehemmt, indem zum Inkubationsmedium 0,2 mM Ethopropazin zugesetzt wurde. Die Spezifität der Cholinesterase-Färbung wurde durch die Zugabe von Neostigmin mit 5 mM bestätigt. Am Ende einer 7-tägigen Inkubation wurde Gelatine durch kurze Inkubation bei 37ºC gelöst. Die Zellen wurden mit Wasser gewaschen, eine Minute mit 1,25 % Na&sub2;S behandelt und erneut mit Wasser gewaschen. Anschließend wurden sie eine Minute mit 1 % AgNO&sub3; behandelt, mit Wasser und mit PBS gewaschen.

14.1.9. ZILIARAR NEUROTROPHER FAKTOR

Der in allen Tests verwendete CNTF war ein rekombinanter Ratten- CNTF, der exprimiert und gereinigt wurde, wie vorstehend in Beispiel-Abschnitt 12 beschrieben.

14.2. ERGEBNISSE

Wenn die Hippokampi bei einem Entwicklungs-Alter von E18 entnommen und in Kultur gebracht wurden, bestand der größte Teil der Neuronen-Population aus postmitotischen pyramidalen Neuronen. Fünf bis sechs Stunden nach der Plattierung bildeten die Neuronen bereits Neunte, nach einem Tag in Kultur wurde ein Kontakt von Zelle zu Zelle deutlich. Phasen-helle Zellen mit langen Fortsätzen lagen vor.
Die Hippokampus-Neuronen wurden mit einer sehr geringen Dichte (etwa 71 000 Zellen/cm²) in Gegenwart oder in Abwesenheit von CNTF verschiedene Zeitspannen gezüchtet. Die fortgesetzte Behandlung von Hippokampus-Kulturen mit CNTF (10 ng/ml) steigerte die Fähigkeit der Zellen, ³H-GABA aufzunehmen (FIG. 30). Der Zeitverlauf der CNTF-induzierten Steigerung der spezifischen neuronalen GABA-Aufnahme war langsam, wie in FIG. 30 A dargestellt. Die Behandlung mit CNTF (10 ng/ml) erzeugte am Tag 6 der Züchtung nur eine geringe Steigerung, eine maximale Steigerung um etwa das Vierfache im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen wurde 8 Tage nach Zugabe von CNTF beobachtet. Eine längere Züchtung von bis zu 11 Tagen bewirkte keine weitere Steigerung. Um die Wirkung von CNTF auf Hippokampus-Neuronen in Kultur weiter zu untersuchen, wurde die Menge des Neurofilament-Proteins bestimmt, wobei ein Antikörper gegen das Neurofilament-Protein (RT97) und ein anschließender ELISA-Test eingesetzt wurden. Dabei wurde bestimmt, daß das Neurofilament am Tag 6 der Züchtung nur gering erhöht war, die maximale Steigerung um etwa das Fünffache wurde am 8 Tage beobachtet (FIG 30 B). Ein ähnlicher Zeitverlauf sowohl für die GABA-Aufnahme als auch für das Neurofilament-Protein wurde auch mit 1 ng/ml CNTF festgestellt.
Es zeigte sich, daß die Wirkung von CNTF dosisabhängig war, wie in FIG. 31 dargestellt. Die spezifische neuronale GABA-Aufnahme wurde durch 0,01 ng/ml gesteigert, die maximale Steigerung auf das etwa Dreifache wurde in Zellen erhalten, die acht Tage mit 0,1 ng/ml CNTF behandelt wurden (FIG. 31 A). Höhere Konzentrationen von bis zu 50 ng/ml CNTF führten zu keiner weiteren Steigerung der GABA-Aufnahme. In ähnlicher Weise war auch das Neurofilament-Protein in den mit CNTF behandelten Kulturen in einer dosisabhängigen Art und Weise erhöht, wobei ein Plateau bei 0,1 ng/ml CNTF erreicht wurde (FIG. 31 B). Höhere Konzentrationen von bis zu 50 ng/ml CNTF ergaben keine weitere Steigerung der Menge des Neurofilament- Proteins.
Als weiterer Weg, die Wirkung von CNTF auf GABA-erge Neuronen zu untersuchen, wurde die GAB-Enzymaktivität in Kulturen gemessen, die 8 Tage in Gegenwart von CNTF inkubiert wurden Es wurde gefunden, daß CNTF in Hippokampus-Neuronen eine Steigerung der GAB-Enzymaktivität in dosisabhängiger Art und Weise erzeugte (FIG. 31 C). Die Form der erhaltenen Dosis- Antwort-Kurve ist ähnlich wie bei der Kurve, die bei der GABA-Aufnahme und beim Neurofilament-Protein beobachtet wurde. Eine maximale Steigerung der GAB-Enzymaktivität um das 3,8-fache wurde mit 0,1 ng/ml CNTF beobachtet.
Um zu untersuchen, ob die Wirkung von CNTF auf die GAB-Enzymaktivität entweder auf einer Induktion der Enzymaktivität oder auf einer Wirkung auf das Überleben von GABA-ergen Neuronen beruhte, wurde die Anzahl der GAB-immunreaktiven Neuronen in Zellen bestimmt, die in Gegenwart oder in Abwesenheit von CNTF gezüchtet wurden. Bei einer Konzentration von 10 ng/ml steigerte der CNTF die Zahl der NSE- und GAB-positiven Neuronen um das 2,2- bzw. 2,3-fache (FIG. 32 A). Eine immunhistochemische Färbung unter Verwendung eines Antikörpers gegen GABA ergab ähnliche Ergebnisse (FIG. 33 A). Calbindin wurde in einer Subpopulation von Hippokampus-Neuronen lokalisiert, umfassend Dentat-Gyrus, CA1-pyramidale Neuronen und einige Interneuronen (Balmbridge und Miller, Brain Res. 245 (1982), 223- 229). Die Behandlung mit CNTF (10 ng/ml) von Hippokampus-Kulturen mit geringer Dichte führte zu einer dreifachen Steigerung der Calbindin-immunpositiven Zellen (FIG. 32 B). Nach 8 Tagen in Kultur war auch die Zahl der Acetylcholinesterase-positiven Zellen in CNTF-behandelten Kulturen im Vergleich zu den Kontrollen um etwa das 17-fache erhöht (FIG. 33 B).
Um weitere Beweise bereitzustellen, daß CNTF als ein Überlebensfaktor zur Erhaltung von GABA-ergen Neuronen in Kultur wirkt, und daß er nicht mittels Induktion der Eigenschaften des GABA-ergen Phänotyps wirkt, wurden Experimente mit einer vorzögerten Zugabe durchgeführt. CNTF (10 ng/ml) wurde zu verschiedenen Zeiten nach der Plattierung zugegeben und die GABA-Aufnahme und die Neurofilament-Protein-Spiegel am achten Tag in Kultur bestimmt. Wie in FIG. 34 A dargestellt, wenn die Zugabe von CNTF um einen Tag verzögert wurde, fiel die 7 Tage später gemessene, durch CNTF induzierte Steigerung der GABA-Aufnahme geringer aus. Wenn die Zugabe von CNTF am dritten Tag nach der Plattierung erfolgte, bewirkte CNTF keine Steigerung der GABA-Aufnahme mehr. Die durch CNTF induzierte Erhöhung des Neurofilament-Proteins nahm ähnlich ab, wenn die Zugabe von CNTF um drei Tage verzögert wurde (FIG. 35 A). Um die Möglichkeit auszuschließen, daß diese Beobachtung auf einer nicht ausreichend langen Exposition gegenüber dem Faktor beruhte, wurde das folgende Experiment durchgeführt. CNTF (10 ng/ml) wurde am dritten Tag der Kultur zu den Zellen zugegeben und die Zellen wurden 8 Tage mit dem Faktor behandelt, bevor die Messung der GABA- Aufnahme und des Neurofilament-Proteins durchgeführt wurde. Unter solchen Bedingungen induzierte der CNTF keine Steigerung der GABA-Aufnahme und die Wirkung auf das Neurofilament-Protein war stark reduziert (FIG. 34 B, 35 B).
Es wurde gezeigt, daß Astrocyten eine reiche Quelle mehrerer neurotropher Faktoren sind, umfassend NGF. Um zu untersuchen, ob die Wirkung von CNTF möglicherweise über die Freisetzung solcher Faktoren aus den Gliazellen, anstatt über eine direkte Wirkung auf die Neuronen erfolgte, wurde die durch CNTF induzierte Steigerung der GABA-Aufnahme in Neuronenangereicherten Kulturen untersucht. Wie in FIG. 36 dargestellt, erzeugte der CNTF in AraC-behandelten Kulturen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen eine 2,4-fache Steigerung der GABA-Aufnahme. Die Stimulierung der GABA-Aufnahme war in gemischten Neuronen-Gliakulturen (- AraC) oder in Neuronen-angereicherten Kulturen (+ AraC) ähnlich. Außerdem war die Dosis- Antwort-Kurve für CNTF in AraC-behandelten Kulturen leicht nach links verschoben, was dadurch zustande kam, daß die Konzentration von CNTF, die für eine maximale Antwort erforderlich war, niedriger war (0,03 ng/ml, verglichen mit 0,1 ng/ml).
Die Wirkung von CNTF auf GABA-erge Neuronen war von der Dichte abhängig, mit der die Zellen plattiert wurden. Bei einer geringen Dichte von 71 000 Zellen/cm² erzeugte CNTF (10 ng/ml) eine etwa 2,6-fache Steigerung der GABA-Aufnahme (FIG. 37 A). Bei einer höheren Plattierungsdichte (143 000 Zellen/cm²) zeigte der CNTF bei einer sättigenden Konzentration (10 ng/ml) keine Induktion einer signifikanten Steigerung der GABA-Aufnahme. Die Wirkung von CNTF auf den Spiegel des Neurofilament-Proteins war in ähnlicher Weise von der Zelldichte abhängig (FIG. 37 B). Dies könnte darauf beruhen, daß neurotrophe Faktoren in Kulturen mit hoher Dichte in einem erhöhten Spiegel vorliegen. Kürzlich wurde gezeigt, daß Hippokampus- Neuronen in Kultur gegenüber einer Glutamat-Neurotoxizität empfindlich waren (Mattson, M. P., et al., J. Neurosu. 8 (1988), 2087-2100). Wir haben die neurotoxischen Effekte von verschiedenen Konzentrationen von Glutamat (10 bis 1000 µM) mittels eines kolorimetrischen MTT-Tests bestimmt, wie in FIG. 38 dargestellt. Glutamat reduzierte in einer Konzentration von 1 mM das Überleben der Zellen auf etwa 10 %. In Gegenwart von CNTF (10 ng/ml) war das Überleben der Zellen nach Exposition gegenüber Glutamat erhöht.

14.3. DISKUSSION

Es wurde gezeigt, daß CNTF das Überleben und das Wachstum mehrerer Neuronenpopulationen in Kultur steigert. Außerdem wurde gezeigt, daß eine CNTF-ähnliche Aktivität die Differenzierung von Typ-2-Astrocyten aus Glia- Vorläuferzellen in Kultur induziert (Hughes et al., Nature 335 (1988), 70- 73; Lillien et al., Neuron 1 (1988), 485-494). Wir haben Beweismaterial für eine neue Wirkung von CNTF im ZNS bereitgestellt, d.h., CNTF fördert in vitro das Überleben von Neuronen, die aus E18-Hippokampus isoliert wurden. Die Behandlung von Hippokampus-Neuronen mit CNTF führt zu einer Steigerung der GABA-Aufnahme, begleitet von einer Zunahme der GAB-Enzymaktivität. Die Neurofilament-Protein-Spiegel der Hippokampus-Kulturen waren in Gegenwart von CNTF ähnlich erhöht. Dosis-Antwort-Studien zeigen eine Wechselbeziehung zwischen diesen verschiedenen Markern und eine maximale Wirkung von CNTF, die bei 0,1 ng/ml CNTF erreicht wurde. Höhere Konzentrationen von CNTF erzeugten keine größere Wirkung.
Die Wirkung von CNTF könnte durch eine selektive Induktion von GABA- ergen Phänotyp-Markern erklärt werden. Die Ergebnisse der verzögerten Zugabe sind jedoch ein starkes Argument für eine Wirkung von CNTF auf das Überleben. Wir haben gefunden, daß CNTF seine Wirkung auf GABA-erge Zellen bei einer um drei Tage verzögerten Zugabe nicht mehr ausüben konnte. Obwohl die Neurofilament-Protein-Spiegel noch signifikant erhöht waren, ist die Wirkung viel geringer als bei der Zugabe von CNTF am Tag 0.
Dichte-abhängige Effekte von CNTF zeigen, daß die Zellen bei einer hohen Dichte den CNTF scheinbar nicht fürs Überleben benötigten. Dies könnte auf eine lokale Freisetzung von endogenen neurotrophen Faktoren aus Neuronen oder Astrocyten zurückzuführen sein, oder es könnte auf Zell- Zell-Wechselwirkungen beruhen. Es wurde gezeigt, daß das Überleben von Hippokampus-Neuronen in Gegenwart von Astrocyten gesteigert ist (Banker und Cowan, Brain Res. 126 (1977), 397-425). Es ist möglich, daß der daran beteiligte Faktor der CNTF oder ein Mitglied der Neurotrophin-Familie ist. In Neuronen-angereicherten Kulturen wurde die Wirkung von CNTF auf die GABA-Aufnahme und das Neurofilament-Protein nicht beeinträchtigt. Diese Ergebnisse sprechen deutlich gegen eine Rolle von Astrocyten bei der Wirkung von CNTF und legen nahe, daß der Effekt über eine direkte Wirkung auf die Neuronen erzielt wird. Unter Verwendung eines myc-markierten CNTF-Liganden und eines Antikörpers gegen myc haben wir Beweise erhalten, daß auf den Neuronen Rezeptoren für CNTF vorliegen.
Die das Überleben fördernde Aktivität von CNTF auf Hippokampus-Neuronen schien nicht auf GABA-erge Neuronen beschränkt zu sein. Wir haben die Beweise, daß auch die Zahl der Acetylcholinesterase-immunpositiven Zellen in Gegenwart von CNTF erhöht ist. Die Intensität der histochemischen Färbung auf AchE war in den mit CNTF behandelten Kulturen viel stärker. Dies kann wichtige Folgerungen für eine mögliche Rolle des CNTF als ein retrograder Überlebens- und Differenzierungsfaktor für die cholinergen Neuronen im medialen Septum beinhalten.
Die Expression von zwei allgemeinen Markern des Neuronen-Phänotyps, NSE und NF, war in Gegenwart von CNTF erhöht. Die Akkumulation von NF-Protein wurde unter Verwendung eines Enzymimmuntests (Enzyme-linked immunosorbent assay) gemessen. Der verwendete monoclonale Antikörper (RT97) erkannte vorwiegend die 200 kD-Form des NF-Protein-Tripletts und nur in geringerem Ausmaß die 150 kD-Untereinheit. Früher wurde bereits gezeigt, daß das Ausmaß der Bindung von RT97 als Index zur Bewertung des Neunten-Auswuchses, insbesondere des Axon-Auswuchses, bei gezüchteten Neuronen dienen könnte (Doherty et al., Neurosci. Lett. 51 (1984), 55-60). Acht Tage alte Hippokampus-Kulturen, die mit CNTF gehalten wurden, zeigten ein dichteres und komplexeres Netzwerk von Fortsätzen. Diese Zunahme der relativen Menge des NF-Proteins könnte einfach eine Folge des gesteigerten Überlebens der Neuronen sein. Alternativ könnte der CNTF eine selektive Wirkung auf die Induktion des Neuriten-Auswuchses haben.
Die Spezifität der das Überleben fördernden Aktivität von CNTF wurde erforscht, indem die Wirkungen der anderen neurotrophen Faktoren, die bekanntermaßen in Hippokampus vorliegen, untersucht wurden (Maisonpierre et al., Science 247 (1990), 1446-1451). Übereinstimmend mit der früheren Beobachtung, daß NGF kein Überlebensfaktor für Hippokampus-Neuronen ist, konnten wir keine Wirkung von NGF auf GAGA-erge Neuronen nachweisen. Ein anderes Mitglied der Neurotrophin-Familie, BDNF, scheint auch das Überleben von GABA-ergen Neuronen in Kultur nicht zu fördern. Andererseits wurde für bFGF gezeigt, daß er ein wichtiger Überlebensfaktor im Hippokampus ist (Wallicke et al., PNAS USA 83 (1986), 3012-3016) und daß er im ZNS als neurotropher Faktor funktionieren könnte (Morrison et al., PNAS USA 83 (1986), 7537-7541; Anderson et al., Nature 332 (1988), 360-361). Ähnlich wie bFGF ist CNTF bei sehr niedrigen Konzentrationen aktiv.
Es wurde gezeigt, daß Hippokampus bei mehreren neurodegenerativen Störungen betroffen ist, umfassend die Alzheimer-Krankheit. Die zugrundeliegenden Mechanismen, die zu einer selektiven Degeneration der Hippokampus-Formation führen, sind bisher noch unklar. Man hat die Hypothese aufgestellt, daß der anregende Neurotransmitter, die Aminosäure Glutamat, im Krankheitsprozeß eine Rolle spielen könnte. Der Befund, daß CNTF in vitro das Überleben von Hippokampus-Neuronen fördern kann, könnte ein wichtiger Hinweis für die Entwicklung therapeutischer Vorgehensweisen bei neurodegenerativen Erkrankungen sein. Es wird wichtig sein, zu bestimmen, ob CNTF die Hippokampus-Neuronen vor der Glutamat-Neurotoxizität schützen kann, wie das für FGF beobachtet wurde (Mattson et al., PNAS 83 (1986), 7537- 7541). Kürzlich wurde in Hippokampus durch Northern-Blot-Analyse mRNA für CNTF nachgewiesen (Masiakowski, persönliche Mitteilung). Welche Zelltyp- Spezifität die CNTF-Synthese in vivo aufwies, wurde bisher noch nicht bestimmt. Die physiologische Rolle von CNTF im Hippokampus während der Entwicklung in vivo muß noch untersucht werden, aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann man jedoch sagen, daß der CNTF vermutlich ein endogener neurotropher Faktor ist, der eine mögliche Rolle bei der Regulation des Überlebens von Neuronen im Hippokampus spielt.

15. BEISPIEL: RATTEN-CNTF STEIGERT DIE PROLIFERATIONSRATE VON RATTEN- HIPPOKAMPUS-ASTROCYTEN IN KULTUR

15.1. MATERIAL UND METHODEN

15.1.1. HERSTELLUNG VON RATTEN-HIPPOKAMPUS-ASTROCYTEN

Die Hippokampi wurden aus E18-Rattenembryos entnommen und in F10-Medium (GIBCO), enthaltend 24 mM HEPES, gesammelt. Die Gewebe wurden in kleine Stücke zerkleinert und mit 0,25 % Trypsin 20 Minuten bei 37ºC behandelt (13 Hippokampi pro 5 ml 0,25 % Trypsin). DNAase wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml für weitere 10 Minuten zugegeben. Die Reaktion wurde mit einem gleichen Volumen von DME, angereichert mit 10 % fetalem Kälberserum, gestoppt und die Gewebe zweimal gewaschen. Die durch sanftes Digerieren erhaltenen dissoziierten Zellen wurden in DME/FCS gesammelt und die Suspension durch ein 20 mm Nitex-Sieb (Tetko) passiert, um die Materialstückchen zu entfernen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde bestimmt, indem der Trypanblau-Ausschluß verwendet wurde. Anschließend wurden die Zellen in Gewebekultur-Flaschen T75 aus Kunststoff mit 4,82 x 10&sup6; Zellen pro Flasche plattiert. Das Medium wurde an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 nach der Plattierung gegen DME-FCS (10 ml) ausgetauscht. An den Tagen 7 und 9 wurden die Flaschen von Hand geschüttelt, um Oligodendrocyten und überlebende Neuronen zu entfernen. Am Tag 10 wurden Astrocyten mit 0,25 % Trypsin entfernt und für den Test in Platten mit 96 Vertiefungen plattiert.

15.1.2. CNTF-MITOSE-TESTS AUF RATTEN-HIPPOKAMPUS-ASTROCYTEN

Für die Mitosetests wurden die Astrocyten mit einer Dichte von 16 000 Zellen pro Vertiefung in Medium (DMEM), enthaltend 10 % fetales Kälberserum, 4 Stunden plattiert, so daß die Anlagerung stattfinden konnte. Anschließend wurden die Zellen gespült und sodann 150 µl definiertes Medium (DMEM, 0,5 % BSA) zugesetzt. Der rekombinante Ratten-CNTF, hergestellt wie in Beispiel-Abschnitt 7, vorstehend, wurde für 24 Stunden zugefügt. Die Markierung der Zellen wurde in den letzten zwei Stunden des 24- stündigen Inkubationszeitraums durchgeführt, wobei 1 µC pro Vertiefung von ³H-Thymidin (NEN, 20 Ci/mM) verwendet wurde. Nach der Inkubation wurden die Zellen folgendermaßen verarbeitet: Die Vertiefungen wurden zweimal mit PBS gewaschen und über Nacht bei 4ºC in 50 ml 10 % Trichloressigsäure (TCA) inkubiert. Nach Entfernung der TCA wurden die Zellen in kaltem Wasser gewaschen, in 100 µl 1 N NaOH solubilisiert und in einem Flüssigkeits- Szintillationszähler in 10 ml Aquasol gezählt.

15.1.3. (¹²&sup5;I)-CNTF-BINDUNGS-TEST

Hippokampus-Astrocyten wurden in 37 mm²-Schalen bis zu einer Konfluenz von etwa 80 bis 90 % gezüchtet. Die einzelligen Astrocyten-Schichten wurden zuerst zweimal in Ham-F-12-Medium gespült (2 ml). Sodann wurde Ham- F-12-Medium (1 ml) zugefügt und die Zellen 15 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurde das Medium durch ein gleiches Volumen von kaltem Ham- Medium ersetzt. In die Vertiefungen, die für die Bestimmung der nicht-kompetitiven Bindung dienen sollten, wurde unmarkierter CNTF (100 x Überschuß des unmarkierten CNTF) zugegeben und die Kulturen weitere 60 Minuten bei 4ºC inkubiert. ¹²&sup5;I-CNTF (hergestellt unter Verwendung von Bolton-Hunter- Reagens, 10 µl, enthaltend etwa 280 000 dpm mit 112 µCi pro nMol) wurde zu jeder Kultur zugesetzt und die Inkubation bei 4ºC verschiedene Zeiten bis zu 60 Minuten fortgesetzt. Der nicht-gebundene CNTF wurde durch dreimaliges Waschen der Zellen (jeweils 2 ml) mit kalter PBS, enthaltend 10 mg/ml BSA, entfernt. Anschließend wurden die Zellen solubilisiert, indem die Kulturen mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur in 0,5 ml 20 mM Tris- HCl, pH 7,2, 0,15 M NaCl, 1 % Triton, 0,1 % SDS, 1 % Desoxycholat, inkubiert wurden. Die Zellysate wurden entfernt und die Kulturen zweimal mit PBS, enthaltend 10 µg/ml BSA, gespült (jeweils 250 µl). Die Spüllösungen wurden mit den Zellysaten vereinigt und in einem Gammazähler gezählt.

15.2. ERGEBNISSE

Die Ergebnisse des Proliferationstests, dargestellt in FIG. 39, zeigen bei der Wirkung von steigenden Konzentrationen von CNTF auf Ratten- Hippokampus-Astrocyten eine biphasische Dosis-Antwort-Kurve. CNTF bewirkt bis zu einer Dosis von 0,01 ng/ml eine Steigerung des ³H-Thymidin-Einbaus. Bei Konzentrationen über 0,1 ng/ml verliert CNTF seine Fähigkeit, die Zellproliferation zu stimulieren.
Die biologische Antwort von Astrocyten auf CNTF zeigt, daß diese Zellen funktionelle CNTF-Rezeptoren tragen. Zwei weitere Beweisstücke stützen das ursprüngliche Ergebnis, daß Typ-1-Astrocyten auf ihrer Zelloberfläche CNTF-Rezeptoren exprimieren. Bindungsexperimente mit (¹²&sup5;I)- CNTF auf einschichtigen Zellrasen machten kompetierbare Ligand-Rezeptor- Stellen deutlich; das festgestellte Maximum der spezifischen Bindung von ¹²&sup5;I-CNTF machte etwa 1 % des gesamten, zu jeder Kultur zugegebenen CNTF dar. Außerdem zeigte eine Northern-Blot-Analyse, daß CNTF stark die Expression des unmittelbaren frühen Gens c-fos induzierte. Die maximale mRNA-Induktion wurde nach einer Stunde beobachtet und kehrte nach 2 Stunden auf die normalen Basiswerte zurück.

16. BEISPIEL: NEUE MONOCLONALE ANTIKÖRPER GEGEN DEN ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTOR UND EIN ZWEI-ANTIKÖRPER-SANDWICH-TEST FÜR DEN MENSCHLICHEN ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTOR

16.1. MATERIAL UND METHODEN

16.1.1. ERZEUGUNG VON MONOCLONALEN ANTIKÖRPERN GEGEN DEN ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTOR

16.1.1.1. IMMUNISIERUNGS-VORSCHRIFT

Weibliche CB6F1/J-Mäuse wurden mit 10 bis 40 µg des rekombinanten menschlichen CNTF (hergestellt wie in Beispiel 12 beschrieben) in komplettem Freundschem Adjuvans geimpft und anschließend alle drei Wochen bis zu etwa 6 Monaten mit rCNTF in komplettem Freundschem Adjuvans wiedergeimpft.

16.1.1.2. ERZEUGUNG DER HYBRIDOME

Milzzellen aus immunisierten Mäusen wurden mit SP2/0-Myelomzellen in einem Verhältnis von 2 : 1 (Lymphocyten : Myelomzellen) unter Verwendung von PEG 4000 fusioniert und anschließend in komplettem RPMI mit 2 % HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) bei einer Zelldichte von etwa 10&sup5; Lymphocyten pro Vertiefung gezüchtet, um Hybridome zu selektieren.

16.1.1.3. ABSUCHEN DER HYBRIDOME AUF CNTF-REAKTIVITÄT

Antikörper, die mit menschlichem CNTF (h-CNTF) reagieren konnten, wurden zuerst durch einen Enzymimmuntest (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) mit dem rekombinanten h-CNTF identifiziert, der an Testschalen aus Kunststoff gebunden war. Die Antikörper wurden durch ELISA und Western-Immunblotting weiter auf ihre Fähigkeit untersucht, mit dem rekombinanten h-CNTF, dem rekombinanten Ratten-CNTF (RCNTF) und veränderten Formen des HCNTF, wie nachstehend beschrieben, zu reagieren.

16.1.2. HERSTELLUNG VON VARIANTEN DES MENSCHLICHEN CNTF

Varianten des menschlichen CNTF wurden durch die Expression geeigneter Vektoren erzeugt. Kurz gesagt, dem Variantenprotein #112 des menschlichen CNTF fehlen 55 Aminosäurereste am carboxylterminalen Ende des menschlichen CNTF. Dem Protein #49 fehlen die 15 carboxyterminalen Aminosäuren des menschlichen CNTF. Das Protein #82 ist ein Fusionsprotein, in welchem die ersten 66 Aminosäuren des menschlichen CNTF deletiert sind und das restliche Molekül mit einem nicht-identifizierten menschlichen Protein verknüpft ist.

16.1.3. METHODEN FÜR DEN ZWEI-STELLEN-IMMUNTEST

Für die Bestimmung der CNTF-Menge in biologischen Proben wäre es vorteilhaft, für dieses Protein einen immunologischen Test zu entwickeln. Ein empfindlicher und einfacher Immuntest ist das Zwei-Antikörper-Sandwich-Verfahren [vgl., z.B., E. Harlow und D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sping Harbor, NY, Seiten 578-583]. In diesem Verfahren wird ein erster Antikörper an einen festen Träger gebunden, den man sodann mit einer Lösung reagieren läßt, die das betreffende Antigen enthält; einen zweiten Antikörper, der üblicherweise gegen ein anderes Epitop auf dem Antigen gerichtet ist, läßt man sodann mit dem an den ersten Antikörper gebundenen Antigen reagieren, und die Menge des gebundenen zweiten Antikörpers (die zu der Menge des gebundenen Antigens direkt proportional sein sollte) wird bestimmt. In einer Ausführungsform dieses Verfahrens sind sowohl die ersten als auch die zweiten Antikörper monoclonale Antikörper.
Der für den menschlichen CNTF entwickelte Zwei-Stellen-Test ist in FIG. 40 schematisch dargestellt. Im wesentlichen wurde ein Affinitäts-gereinigter sekundärer Antikörper, der für eine Unterklasse von Maus-Immunglobulin G (im gezeigten Fall IgG2b) spezifisch ist, an eine Testplatte adsorbiert und verwendet, um den ersten monoclonalen Antikörper (RP3-12, ein murines IgG2b) aus einem verbrauchten Kulturüberstand der Hybridomzellen einzufangen. Anschließend wurde der menschliche CNTF zugesetzt und an den ersten monoclonalen Antikörper binden gelassen. Der zweite Anti-CNTF- monoclonale-Antikörper einer anderen Unterklasse als der erste (RP12-2, ein murines IgG1) wurde sodann zugefügt, wieder stammte er aus unfraktionierten Hybridomkulturüberständen, und an den durch den ersten monoclonalen Antikörper eingefangenen CNTF binden gelassen. Alle gebundenen RP12-2- Moleküle wurden sodann nachgewiesen, wobei der Affinitäts-gereinigte sekundäre Antikörper verwendet wurde, der für murines IgG1 spezifisch ist, gebunden an alkalische Phosphatase, gefolgt von einer Inkubation mit dem Phosphatase-Substrat Para-Nitrophenylphosphat, dessen Spaltung ein gefärbtes Reaktionsprodukt erzeugt (gemessen durch Absorption bei 405 nm).

16.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Monoclonale Antikörper der durch RP3-12 und RP3-17 dargestellten Klasse wurden aus dem gleichen Fusionsexperiment erhalten, wobei Splenocyten aus einer einzigen immunisierten Maus eingesetzt wurden. Weder RP3-12 noch RP3-17 reagierten mit einer der zwei getesteten carboxyterminalen h- CNTF-Deletionen, und sie binden auch nicht an Ratten-CNTF, wie in Tabelle V gezeigt. Jedoch reagieren sie mit dem Fusionsprotein #82, in welchem der Carboxylterminus von h-CNTF erhalten geblieben ist. Somit erkennen diese Antikörper ein Epitop (oder nahe dabei liegende Epitope), die in der Nähe des carboxyterminalen Endes von h-CNTF gelegen sind, innerhalb des Segmentes oder überlappend mit dem Segment der 15 carboxyterminalen Aminosäurereste, die im h-CNTF-Protein #59 deletiert sind. Im Gegensatz dazu reagieren die monoclonalen Antikörper RP12-2 und RP12-9 sowohl mit dem h-CNTF- Protein #59 als auch mit dem h-CNTF-Protein #112, außerdem mit dem Fusionsprotein #82. Somit müssen diese beiden Antikörper Epitope erkennen, die etwa zwischen den Aminosäuren 66 und 145 von h-CNTF liegen. Die Kartierungsdaten zeigen also, daß die Epitope, die von RP12-2 und RP12-9 erkannt werden, mindestens etwa 40 Aminosäurereste stromaufwärts der Aminosäurereste liegen müssen, die von RP3-12 und RP3-17 erkannt werden (FIG. 22). Die Antikörper RP12-2 und RP12-9 unterscheiden sich voneinander in ihrer Fähigkeit, Ratten-CNTF zu erkennen (Tabelle V), die bedeutet, daß sie bestimmte Epitope erkennen, von denen eines (das durch RP12-9 erkannt wird) zwischen Nagern und Primaten vermutlich gut konserviert ist. Die Fähigkeit dieser monoclonalen Antikörper, in einem Western-Immunblotting-Test an einen denaturierten CNTF zu binden, legt nahe, daß sie einfache Epitope erkennen, die aus angrenzenden oder mit sehr geringem Abstand beieinander liegenden Aminosäureresten bestehen und daß die Epitope keine besondere Konfiguration aufweisen.
Zuerst wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob Paare der gegen h-CNTF gerichteten monoclonalen Antikörper für die Entwicklung eines Zwei-Antikörper-Sandwichs auf diesen Liganden geeignet waren. Ein Test wurde entwickelt, mit dem man die Antikörper in einem frühen Stadium prüfen konnte, ohne sie im großen Maßstab produzieren oder die Reagenzien reinigen zu müssen, indem man Unterklasse-spezifische Anti-Maus-Immunglobulin-Reagenzien nutzte, um einen monoclonalen Antikörper an einen festen Träger zu immobilisieren und um den zweiten monoclonalen "Reporter"-Antikörper differenziert nachzuweisen. Aufgrund der Notwendigkeit, daß die zwei monoclonalen Antikörper zu verschiedenen Subklassen zählen, konnten auf diese Weise nur bestimmte Paare der monoclonalen Antikörper geprüft werden. Sehr gute Ergebnisse im beschriebenen Zwei-Stellen-Immuntest wurden mit dem Paar RP3-12 und RP12-2 erhalten. FIG. 41 zeigt die Ergebnisse des Zwei-Antikörper-Sandwich-Tests bei einer Titration mit steigenden Mengen (jeweils um den Faktor zwei) des rekombinanten menschlichen CNTF von 7,8 pg pro Test (50 µl bei 0,156 ng/ml) bis zu 500 pg pro Test (50 µl bei 10,0 ng/ml). Ein deutliches Signal, das sich vom Hintergrund abhob (0,044 ± 0,010 Absorptions-Einheiten), war mit 15,6 pg des menschlichen CNTF nachweisbar, der Test war bis zu den höchsten getesteten Spiegeln linear. Wenn man jeweils einen der beiden monoclonalen Antikörper durch nicht dazu gehörige Maus-Myelom-Proteine der passenden Unterklasse ersetzte (MOPC- 141, ein IgG2b, anstelle von RP3-12; oder MOPC-21, ein IgG1, anstelle von RP12-2), fiel das Signal so stark ab, daß es vom Hintergrund nicht mehr zu unterscheiden war.
Auf diese Weise, wobei sogar ungereinigte Kulturüberstände verwendet wurden, konnte ein sehr gut geeigneter Zwei-Antikörper-Sandwich-Test auf den menschlichen CNTF mit den monoclonalen Antikörpern RP3-12 und RP12-2 gefunden werden. Diese monoclonalen Antikörper können aus den Überständen von Hybridomzellen, die in Serum-freiem Medium gezüchtet wurden, durch herkömmliche Verfahren gereinigt werden. Hieraus kann dann in Zukunft direkt ein einfacherer Sandwich-Test entwickelt werden, bei dem der erste monoclonale Antikörper direkt an einen festen Träger gebunden werden kann, während der zweite monoclonale Antikörper direkt mit einem Reporter verknüpft sein kann (z.B. einem Radioisotop, wie z.B. ¹²&sup5;Iod; oder einem Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase oder β-Galactosidase; oder einem Hapten, wie z.B Biotin, das unter Einsatz von markiertem Avidin oder Streptavidin nachgewiesen werden kann) , wodurch keine Typ-spezifischen sekundären Antikörper mehr nötig sind.
Der hier beschriebene hochspezifische, empfindliche Antikörper-Sandwich-Test wird in vielen Situationen Anwendung finden, in denen es wünschenswert ist, das Vorliegen des menschlichen CNTF quantitativ zu bestimmen. Z.B. kann er verwendet werden, um den menschlichen CNTF während Reinigungsverfahren zu überwachen. Genauso kann der Test eingesetzt werden, um den CNTF nach der Injektion in Versuchstiere zu überwachen, wobei die Gewebe bestimmt werden, in denen er auftritt. Schließlich kann der Test verwendet werden, um die Spiegel von CNTF in menschlichen Geweben und/oder Körperflüssigkeiten (z.B. Serum oder Cerebrospinal-Flüssigkeit) bei gesunden und kranken Individuen zu bestimmen. Der CNTF wird intrazellulär in Nerven gefunden und besitzt neurotrophe Aktivität, daher wurde vorgeschlagen, daß das Protein als Reaktion auf verschiedene Arten von neuronalen Verletzungen oder Erkrankungen freigesetzt werden könnte. Somit könnte der Spiegel von CNTF in geeigneten extrazellulären Flüssigkeiten eine quantitative, diagnostische Maßeinheit für Zustände wie Neuropathie und Neuronen-Degeneration bereitstellen. TABELLE V REAKTIVITÄT VON MONOCLONALEN ANTIKÖRPERN MIT MENSCHLICHEM CNTF, DELETIONSMUTANTEN DES MENSCHLICHEM CNTF UND RATTEN-CNTF ELISA Western-Blotting Clon Unterklasse

17. ZILIARER NEUROTROPHER FAKTOR FÖRDERT DAS ÜBERLEBEN VON RÜCKENMARKNEURONEN IN KULTUR

17.1. MATERIAL UND METHODEN

17.1.1. GEWEBEKULTUR-TECHNIKEN

Motoneuronen-Säulen wurden aus dem Lumbalbereich des Rückenmarks von Hühnerembryos am 6. Tag der Embryonalentwicklung entnommen und in kalter Calcium- und Magnesium-freier Hanks-eingestellter-Salzlösung ("Hanks balanced salt solution", angereichert mit Glucose (4 g/l) (HBSS), gelagert. Die Gewebe wurden mit HBSS gewaschen und mit 0,03 % Trypsin in HBSS 20 Minuten bei 37ºC unter leichtem Schütteln behandelt, mit kalter HBSS gespült und in drei Schritten sanft digeriert, wobei jeweils eine 8-Passage-Agitation in 1 ml kaltem 0,1 % Soja-Trypsin-Inhibitor (Sigma) in HBSS durch eine feuerpolierte, silikonisierte Pasteur-Pipette durchgeführt wurde. Jede im Überstand befindliche Zellsuspension wurde durch 50 µm- Nylonfilter filtriert, vereinigt und auf 4 ml kaltes 6,8 % Metrizamid (Fluka) in HBSS-25 mM HEPES (pH 7,4) in einem silikonisierten konischen 12 ml-Glasröhrchen aufgetragen. Das Röhrchen wurde 15 Minuten bei 400 x g bei 4ºC zentrifugiert und die Zwischenschicht (0,5 ml) in ein anderes silikonisiertes Röhrchen gesammelt, das 6,5 ml kaltes Kulturmedium enthielt (ein Gemisch aus mit Glucose (4 g/l) angereichertem Leibovitz-L15-Medium (GIBCO), 0,15 M Natriumbicarbonat, hitzeinaktiviertem und filtriertem Pferdeserum und Penicillin G (10&sup5; Einheiten/ml) im Verhältnis von 75 : 15 : 10 : 0,1, frisch hergestellt und gepuffert mit 5 % CO&sub2;). Nach einer Zentrifugation bei 100 x g, 7 Minuten, bei 4ºC, wurde der Überstand entfernt und die Zellen in Kulturmedium sanft suspendiert und in Greiner-Kulturplatten mit vier Vertiefungen (Durchmesser der Vertiefungen 10 mm; C. A. Greiner und Söhne GmbH, Nürtingen, BRD) mit 1000 bis 2000 Zellen pro Vertiefung plattiert. Die Platten waren vorher mit Poly-DL-Ornithin (Sigma) 0,5 mg in 0,15 M Natriumboratpuffer (pH 8,3) über Nacht bei 4ºC beschichtet, zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und anschließend mit Laminin (GIBCO; 10 µg/ml in Serum-freiem Kulturmedium) beschichtet und in einen 5 % CO&sub2;-Inkubator gestellt worden, bis die Zellen plattiert wurden (5 bis 6 Stunden). Die Zellen wurden bei 37ºC in einem Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre aus 5 % CO&sub2; und 95 % Luft inkubiert. Die Proben wurden eine Stunde nach der Plattierung zugegeben und das Kulturmedium nach 24 und 72 Stunden ausgetauscht. Die ursprünglich vorhandenen Zellen wurden drei Stunden nach der Plattierung gezählt.

17.1.2. RETROGRADE MARKIERUNG VON MOTONEURONEN UND BEWERTUNG DER REINHEIT DER MOTONEURONEN-KULTUR

In einigen Experimenten wurden Motoneuronen vor der Zellpräpraration in vivo mit einem fluoreszierenden Farbstoff retrograd angefärbt (U. Dohrman et al., Dev. Biol. 118 (1986), 209-221), um die Motoneuron-Zellpopulation zu identifizieren. Hierfür wurde jeweils in die Schalen von 5 Tage inkubierten Eiern ein kleines Loch gebohrt. Kleine Stücke von Rhodamin- Isothiocyanat-Kristallen (Sigma) wurden an zwei oder drei Stellen in jeden Hinterbein-Schenkel eingebracht und das Loch im Ei mit einem Zellophan- Klebeband wieder verschlossen. Sodann wurden die Eier weitere 24 Stunden inkubiert. Anschließend wurden einige der operierten Embryos nach der Fixierung mit Formaldehyd für die Herstellung gefrorener Schnitte zubereitet. Es zeigte sich, daß im Rückenmark nur laterale Motoneuronen-Säulen markiert wurden. Die anderen Embryos wurden für die Zellpräparation unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens (17.1.1.) eingesetzt. Nach 5 Stunden in Kultur wurden die Zellen mit warmer HBSS gespült, mit 4 % Formaldehyd in PBS 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert, mit PBS gespült und anschließend auf Glycerin-PBS (1 : 1) mit Glas-Deckgläschen aufgetragen. Von den gesamten Zellen waren etwa 83 % markiert und wurden als Motoneuronen identifiziert, FIG. 42. Die meisten dieser markierten Motoneuronen waren große Zellen, der Rest waren mittelgroße Zellen. Kleine Zellen wurden nicht markiert. Andererseits waren in Experimenten, in denen die Zellen nicht mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert wurden, etwa 70 % der gesamten Zellen Phasen-helle Zellen mit runden Zellkörpern, etwa 20 % waren mittelgroße Neuronen (von denen die meisten vermutlich Motoneuronen sind> und etwa 10 % waren kleine unreife Neuronen (sie haben Neuronen-ähnliche Fortsätze mit Wachstumskegeln, sie haben jedoch Phasendunkle halbflache Zellkörper). Nicht-Neuronen-Zellen lagen entweder nicht vor oder sie machten weniger als 2 % aus. Zusammenfassend kann man daraus schließen, daß mindestens 83 % der Zellen Motoneuronen sind, während der Rest aus nichtmarkierten Motoneuronen, einer kleinen Zahl von nicht-identifizierten mittelgroßen Neuronen und etwa 10 % unreifen kleinen Neuronen besteht. Wir haben außerdem gefunden, daß, wenn markierte Zellen mit Extrakt aus embryonalem Hühnermuskel gezüchtet wurden (U. Dohrman et al., Dev. Biol. 118 (1986), 209-211), die Zahl der Fluoreszenz-positiven Zellen innerhalb weniger Tage abnahm. Da die Anzahl der gesamten Zellen oder der großen Zellen jeweils viel langsamer abnahm, weist dies eher auf einen Verlust und/oder ein Verschwinden der Fluoreszenz als auf ein Absterben der Zellen hin. Deshalb wurden in Routineexperimenten zur Bestimmung der Überlebensaktivitäten der Proben die großen Phasen-hellen Zellen und nicht die Fluoreszenz-positiven Zellen als Motoneuronen gezählt.

17.2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION

17.2.1. EFFEKT DES ZILIAREN NEUROTROPHEN FAKTORS (CNTF) AUF HÜBNEREMBRYORÜCKENMARKNEURONEN IN KULTUR

Die meisten Motoneuronen in den Blind-Kontrollen starben innerhalb von drei Tagen in Kultur. In Gegenwart des rekombinanten Ratten-CNTF waren nach drei Tagen in Kultur noch etwa 70 % und nach 6 Tagen in Kultur etwa 60 % am Leben (FIG. 43 und FIG. 44). Da in den Blind-Kontrollen die meisten Motoneuronen innerhalb von drei Tagen abstarben, wurden die Überlebens-Aktivitäten am Tag 3 bestimmt. Die Konzentration-Antwort-Kurve von CNTF (FIG. 45) zeigte, daß der EC&sub5;&sub0; (die Konzentration, die für ein Überleben von 50 % erforderlich ist) von CNTF sehr niedrig war und etwa 20 pg/ml (1 pM) betrug, dies ist fast der gleiche Wert wie bei den Ziliarneuronen. Die signifikante Überlebens-Aktivität von CNTF mit einem sehr niedrigen EC&sub5;&sub0; weist stark darauf hin, daß CNTF bei dem Überleben von Motoneuronen in vivo eine kritische Rolle spielt, wie bereits gezeigt wurde (vgl. Beispiel 11, vorstehend; Sendtner et al., Nature 345 (1990), 440-441).

17.2.2. ÜBERLEBENSEFFEKTE VON SPEZIFISCHEN NEUROTROPHEN MOLEKÜLEN UND CYTOKINEN

Von allen getesteten Molekülen erwiesen sich der CNTF und der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) als die wirksamsten Moleküle (Tabelle VI). Die Überlebensaktivität des sauren FGF konnte erhöht werden, indem die Kulturen mit Heparin angereichert wurden, das die proteolytische Spaltung des sauren FGF störte. Der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor (IGF) I und II und Insulin zeigten nur geringe Effekte. Die Konzentration-Antwort-Kurven für diese drei aktiven Moleküle (FIG. 46) zeigten, daß die größten Überlebenseffekte durch die folgenden Substanzen erhalten werden konnten: (a) CNTF = 64 % Überleben bei 1 ng/ml; (b) basischer FGF = 51 % bei 30 ng/ml; (c) saurer FGF = 18 % bei 300 ng/ml; (d) saurer FGF in Gegenwart von 1 µg/ml Heparin = 35 % bei 100 ng/ml; (e) IGF-I = 15 % bei 100 ng/ml; (f) IGF-II = 15 % bei 300 ng/ml; (g) Insulin = 16 % bei 25 µg/ml. Die EC&sub5;&sub0;-Werte waren 0,023 ng/ml für CNTF und 0,26 ng/ml für basischen FGF. Für IGF I und II und auch für Insulin konnten keine zuverlässigen EC&sub5;&sub0;-Werte bestimmt werden, da die maximalen Effekte im Vergleich zu den Kontrollen sehr klein waren.
Die Konzentration von Heparin war für die Steigerung der Aktvität des sauren FGF kritisch. Die in den vorliegenden Experimenten eingesetzten Konzentrationen (1 µg/ml) schienen hinsichtlich der Steigerung der Überlebensaktivität von saurem FGF nicht maximal zu sein. Höhere Konzentrationen von Heparin führten jedoch zu einer Ablösung der Neuronen von den Kulturschalen. Bereits bei einer Konzentration von 1 µg/ml Heparin begann die Ablösung der Neuronen nach drei Tagen Inkubation. βNGF, BDNF, PDGF, EGF, TGFA, TFGβ1, IL-1β, IL-3 oder IL-6 oder IFNc hatte keine erkennbare Wirkung, auch nicht, wenn supramaximale Konzentrationen eingesetzt wurden (hinsichtlich der biologischen Effekte auf andere Zelltypen). Auch NT-3, ein neues neurotrophes Molekül der NGF-BDNF-Gen-Familie, wurde in diesen Experimenten eingesetzt. Die Konzentrationen eines durch transfizierte Cos-Zellen hergestellten NT-3-Proteins, welche das Überleben von embryonalen Ganglionneuronen in Kultur förderten, hatten keine Wirkung auf das Überleben von Motoneuronen.

17.2.3. KOMBINATION VON CNTF, BASISCHEM FGF UND IGF-I

Die Kombination von CNTF und basischem FGF bei optimalen Konzentrationen führte in einem Zeitraum von einer Woche zu einem 100%igen Überleben der Motoneuronen (Tabelle VII). Das Gleiche traf auf die Kombination von CNTF, basischem FGF und IGF-I zu. Die Wirkung von IGF-I selbst war gering (Tabelle VI), sie wurde jedoch deutlicher, wenn die Substanz entweder mit CNTF und/oder mit basischem FGF kombiniert wurde (Tabelle VII). TABELLE VI Aktivitäten bekannter Moleküle auf das Überleben von Motoneuronen Molekül Konzentration Überlebena Kontrolle bNGF (Maus) BDNF (Schwein) CNTF (Ratte, rek.) Basisch. FGF (Mensch, rek.) Saurer FGF (Mensch, rek.) Saurer FGF + Heparin EGF (Maus) TGFA (Mensch, rek.) TGFβ1 (Schwein, rek.) IL-1β (Mensch, rek.) IL- (Maus, rek.) IFNc (Ratte, rek.) IGF- (Mensch, rek.) Insulin (Rind) Transferrin (Mensch) a: Die Überlebens-Aktivitäten wurden nach drei Tagen in Kultur getestet und mit - bis +++ bewertet: -, nicht signifikant verschieden von der Kontrolle (Überleben: 8,3 ± 3,8 %, Mittelwert ± SD, n = 18); ±, etwa 15 bis 20 % (statistisch signifikant verschieden von jeder Blind-Kontrolle, p < 0,01); ++, etwa 35 bis 55 %; +++, etwa 55 bis 75 %. Die Ergebnisse wurden aus verschiedenen Experimenten zusammengestellt. rek., rekombinant. TABELLE VII Weitere Effekte von CNTF, basischem FGF und IGF-II Faktoren Überleben von Motoneuronen (%)a Kontrolle Basisch. a: Das Überleben von Motoneuronen wurde nach drei Tagen in Kultur getestet, indem die Zellen in einem Bereich, der 23 % jedes Vertiefungsbodens entsprach, gezählt wurden. Mittelwert ± SEM (n = 4). *, p < 0,05; **, p < 0,01; NS, nicht signifikant. Die Ergebnisse des Tests wurden nur zum Vergleich zwischen den Werten mit und ohne IGF-I angegeben, da die Wirkung von IGF-I relativ gering ist. Die Unterschiede in beliebigen anderen wichtigen Vergleichen sind signifikant (p < 0,01).

18. HINTERLEGUNG DER MIKRORGANSIMEN

Die folgenden rekombinanten Bakteriophagen- und rekombinanten Plasmid-DNA wurden bei der "American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, hinterlegt: ATCC-Hinterlegungsnummer Datum der Hinterleg. Plasmid Bakteriophage Hybridom
Das Plasmid pRPN40 wurde am 16. August 1990 unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags als NRRL B-18701 bei der "Agriculture Research Culture Collection" (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815, North University Street, Peoria, Illinois, 61604, hinterlegt.
Die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sollen den Umfang der Patentansprüche in keiner Weise einschränken. Tatsächlich sind zusätzlich zu den hier beschriebenen Ausführungsformen verschiedene Modifikationen der Erfindung möglich, die der Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung und den beiliegenden Figuren ersehen kann. Solche Modifikationen sollen im Umfang der Patentansprüche liegen.
Hier werden verschiedene Publikationen zitiert, deren Beschreibungen durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven menschlichen ziliaren neurotrophen Faktors in Bakterien, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Züchten einer mit einem bakteriellen Expressionsvektor transfizierten Bakterienzelle, der die DNA

umfaßt, wobei der bakterielle Expressionsvektor in der Bakterienzelle repliziert werden kann und die Expression der DNA in der Bakterienzelle zur Herstellung eines menschlichen ziliaren neurotrophen Faktors steuern kann;

(b) Veranlassung der Herstellung eines menschlichen ziliaren neurotrophen Faktors in der Bakterienzelle; und

(c) Gewinnung des biologisch aktiven menschlichen ziliaren neurotrophen Faktors aus der Bakterienzelle.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bakterienzelle E. coli ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der bakterielle Expressionsvektor pRPN40 ist, der bei der NRRL unter der Hinterlegungsnummer B-18701 hinterlegt wurde.

4. Bakterieller Expressionsvektor, umfassend die DNA

wobei der bakterielle Expressionsvektor in einer bakteneuen Zelle repliziert werden kann und die Expression der DNA in der bakteriellen Zelle zur Herstellung eines menschlichen ziliaren neurotrophen Faktors steuern kann.

5. Bakterieller Expressionsvektor nach Anspruch 4 mit der Bezeichnung pRPN40, der bei der NRRL unter der Hinterlegungsnummer B-18701 hinterlegt wurde.

6. Bakterielle Zelle, transfiziert mit einem bakteriellen Expressionsvektor nach Anspruch 4.

7. Bakterielle Zelle, transfiziert mit einem bakteriellen Expressionsvektor nach Anspruch 5.

8. Bakterielle Zelle nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Bakterium E. coli ist.

9. Ziliarer neurotropher Faktor (CNTF) mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen der Aminosäuresequenz in Figur 8A entspricht, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers bei einer Erkrankung von Motoneuronen oder bei einer Störung der Motoneuronen, wobei die Zellkörper der Motoneuronen sich im zentralen Nervensystem befinden.

10. CNTF nach Anspruch 9, wobei der CNTF durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhalten wird.

11. CNTF nach Anspruch 9 oder 10 zur Verwendung in einem Verfahren, wobei die Erkrankung oder Störung das Rückenmark umfaßt.

12. CNTF nach Anspruch 9 oder 10 zur Verwendung in einem Verfahren, wobei die Erkrankung oder Störung Motoneuronen des Gesichtsnervs umfaßt.

13. CNTF nach Anspruch 9 oder 10 zur Verwendung in einem Verfahren, wobei die Erkrankung oder Störung amyotrophe Lateralsklerose ist.

14. CNTF nach Anspruch 9 oder 10 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung primärer Lateralsklerose, progressiver Bulbärparalyse, spinaler Muskelatrophie oder eines Post-Poliosyndroms.

15. Menschlicher ziliarer neurotropher Faktor (CNTF) mit einer in Figur 8A gezeigten Aminosäuresequenz zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers bei einer Verletzung von Motoneuronen, wobei die Zellkörper der Neuronen sich im zentralen Nervensystem befinden.

16. CNTF nach Anspruch 15, wobei der CNTF durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhalten wird.

17. CNTF nach Anspruch 15 oder 16 zur Verwendung in einem Verfahren, wobei die Verletzung durch ein Trauma, eine Operation, einen Infarkt, eine Infektion oder Malignität verursacht ist.

18. CNTF nach Anspruch 15 oder 16 zur Verwendung in einem Verfahren, wobei die Schädigung durch eine Exposition gegenüber einem toxischen Mittel verursacht ist.

19. CNTF nach Anspruch 15 oder 16 zur Verwendung in einem Verfahren, wobei die Schädigung durch eine Mangelernährung verursacht ist.

20. CNTF nach Anspruch 15 oder 16 zur Verwendung in einem Verfahren, wobei die Schädigungen das Rückenmark umfassen.

21. Ziliarer neurotropher Faktor (CNTF) mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen der in Figur 8A dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers zur Verminderung der Degeneration von Motoneuronen, wobei die Zellkörper der Motoneuronen sich im zentralen Nervensystem befinden.

22. CNTF nach Anspruch 21, wobei der CNTF durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhalten wird.

23. CNTF nach einem der Ansprüche 9 bis 22, wobei der CNTF durch Einführung von aktiv CNTF produzierenden Zellen verabreicht wird.

24. Menschlicher ziliarer neurotropher Faktor (h-CNTF) mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen der in Figur 8A dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer degenerativen Erkrankung oder einer degenerativen Störung im menschlichen oder tierischen Körper.

25. CNTF nach Anspruch 24, wobei der CNTF durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhalten wird.

26. CNTF nach Anspruch 24 oder 25, wobei die degenerative Erkrankung periphere Neuropathie, Parkinson'sche Erkrankung oder Chorea Huntington ist.

27. Arzneimittel, umfassend einen durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhaltenen h-CNTF zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel.

28. Monoclonaler Antikörper gegen einen h-CNTF, erhalten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

29. Monoclonaler Antikörper gegen h-CNTF, hergestellt von dem unter der Hinterlegungsnummer ATCC-CRL-10531 hinterlegten Hybridom RP3-12, oder ein Fragment oder ein Derivat des Antikörpers.

30. Monoclonaler Antikörper gegen h-CNTF, hergestellt von dem unter der Hinterlegungsnummer ATCC-CRL-10532 hinterlegten Hybridom RP12-2, oder ein Fragment oder ein Derivat des Antikörpers.

31. Monoclonaler Antikörper, der die Bindung des Antikörpers nach Anspruch 29 oder 30 kompetitiv hemmt.

32. Menschlicher ziliarer neurotropher Faktor (h-CNTF) mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen der in Figur 8A gezeigten Aminosäuresequenz entspricht, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers bei einer Erkrankung oder störung des Nervensystems.

33. CNTF nach Anspruch 32, wobei der CNTF durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhalten wird.

34. CNTF nach Anspruch 32 oder 33, wobei die Erkrankung oder Störung des Nervensystems eine Schädigung des Nervensystems umfaßt.

35. CNTF nach einem der Ansprüche 32 bis 34, wobei die Erkrankung die Alzheimer-Krankheit ist.

36. CNTF nach einem der Ansprüche 32 bis 35 zur Verwendung bei der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers in Kombination mit einem zweiten therapeutischen Mittel.

37. CNTF nach Anspruch 36, wobei das zweite Mittel ein Nervenwachstumsfaktor oder ein vom Hirn stammender neurotropher Faktor ist.