DE69031803T2

DE69031803T2 - Verfahren und nukleinsäuresequenzen zur expression des zellulose-synthase-operons

Info

Publication number: DE69031803T2
Application number: DE69031803T
Authority: DE
Inventors: Arie Ben-Bassat; Moshe Bensiman; Roger Calhoon; Anna Fear; David Gelfand; James Meade; Rony Tal; Hing Wong
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1989-04-12
Filing date: 1990-04-04
Publication date: 1998-07-09
Anticipated expiration: 2010-04-05
Also published as: EP0471687A1; IL94053A0; JPH0773500B1; IL94053A; NZ233312A; EP0471687B1; WO1990012098A3; CA2014264C; DK0471687T3; JPH0773500B2; ATE161049T1; AU5437390A; CA2014264A1; ES2111536T3; DE69031803D1; WO1990012098A2

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNA-Techniken zur Produktion von Proteinen. Insbesondere betrifft die Erfindung die donierung des bakteriellen Cellulosesynthase-Operons, die Expression dieses Operons und Verfahren zur Verwendung dieses Operons zur Produktion von Cellulose in rekombinanten Mikroorganismen.

Hintergrund der Erfindung

Acetobacter ist charakteristischerweise ein gramnegatives, stäbchenförmiges Bakterium mit den Ausmaßen 0,6-0,8 µm auf 1,0-4 µm. Er ist strikt aerob; dei Metabolismus ist respiratorisch, nie fermentativ. Er unterscheidet sich weiter durch die Fähigkeit, multiple Poly-β-(1-4)-Glucanketten zu produzieren, die chemisch der Cellulose identisch sind. Multiple Celluloseketten oder Mikrofibrillen werden an der bakteriellen Oberfläche an Stellen auf der Zeliwand synthetisiert. Die Celluloseproduktion durch Acetobacter ist seit mindestens den 1930iger Jahren Gegenstand intensiver Untersuchungen. Insbesondere wurde Acetobacter xylinum ausgiebig untersucht, um den Mechanismus der Cellulosesynthese in intakten Zellen aufzuklären zu versuchen [Schramm und Hestrin, (1954) J. Gen. Microbiol. 11:123-129].
Der enzymatische Stoffwechseiweg für die Cellulosesynthese in Acetobacter xvlinum wurde untersucht, und es wurden im wesentlichen vier enzymatische Schritte in zellfreien Extrakten von A. xylinum charakterisiert, die den vollständigen Stoffwechselweg von Glucose zu Cellulose zu umfassen scheinen. Diese sind die Phosphorylierung von Glucose durch Glucokinase [Benziman et al., (1972) J. Bacterial., 111:325-330], die Isomerisierung von Glucose-6-phosphat in Glucose-1-phosphat durch Phosphoglucomutase [Gromet et al., (1957) Biochem. J., 67:679-689; Frei-Roitmann, Factors affecting the activity of phosphoglucomutase and UDP-glucose pyrophosphorylase of Acetobacter xylinum, M.Sc. thesis, the Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem, Israel (1974)]; die Synthese von Uridin-5'-diphosphoglucose (UDP-Glc) durch UDPG- Pyrophosphorylase [Frei-Roitman, a.a.O.; Swisa, Biosynthesis of cellulose in Acetobacter xylinum, Ph.D. thesis, the Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem, Israel (1978)], und die Cellulosesynthase-Reaktion.
Versuche, Cellulosesynthase aus einem Stamm von A. xylinum unter Verwendung herkömmlicher chromatographischer Techniken zu reinigen, waren nicht besonders erfolgreich, aber jüngst wurde das Enzym wesentlich gereinigt (P. Ross und M. Benziman (1989) in Biosyntheses and Biodegradation of Cellulose and Cellulose Materials, Hrsg. Weimar und Higler, Marcel Dekker, Inc. NY, in Druck) und seine Eigenschaften und seine Struktur im gereinigten Zustand werden gegenwärtig untersucht.
Auf ähnliche Weise führten Versuche, Cellulosesynthase durch in vitro-Cellulose- Einfang und chromatographische Techniken zu reinigen, zu einem teilweise gereinigten 83 Kilodalton (kd) großen Polypeptid (Lin und Brown, The Tenth Cellulose Conference, 29. Mai - 2. Juni 1988, Abstract BG1, Seite 27).
Ein vollständigeres Wissen über die Biochemie der Cellulosesynthese würde eine größere Produktivität und Ausbeute an Cellulose aus Kulturen von Celluloseproduzierenden Mikroorganismen erleichtern. Es wird beobachtet, daß das Wachstum dei bakteriellen Zellen in Kultur anfänglich exponential ist, sich aber verlangsamt, wenn die Zellen in eine stationäre Wachstumsphase kommen. Der Hauptteil der Cellulose wird später bei der Fermentation produziert, wenn die Anzahl der Zellen am höchsten ist, jedoch nimmt die Menge an Cellulose, die pro Zelle pro Zeiteinheit produziert wird (spezifische Produktivität), mit fortschreitender Fermentation ab. Es wird angenommen, daß die Cellulosesynthase-Aktivität geschwindigkeitsbegrenzend ist, wenn die Zellen in der Kultur die stationäre Wachstumsphase erreichen. Eine Verbesserung der Celluloseproduktion würde in der Beseitigung eines geschwindigkeitsbegrenzenden Schritts bei der Cellulosesynthese liegen, wodurch die beobachtete Abnahme der spezifischen Celluloseproduktivität in Kultur verhindert wird.
Die Fähigkeit, rekombinante Cellulosesynthase zu produzieren, liefert ein wichtiges Werkzeug, das zur Erforschung der Mechanismen der Cellulosesynthese nützlich ist, wobei schließlich eine erhöhte Celluloseproduktion aus der bakteriellen Kultur erhalten wird.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte, native, clonierte rekombinante oder synthetische Polynucleotidsequenz bereit, die ein bakterielles Cellulosesynthase-Operon codiert, wobei unter Bezugnahme auf Figur 1 das Polynucleotid vier benachbarte Gene umfaßt, wobei das erste Gen im wesentlichen den Nucleotiden 328 bis 2589, das zweite Gen im wesentlichen den Nucleotiden 2594 bis 4999, das dritte Gen im wesentlichen den Nucleotiden 5005 bis 8961 und das vierte Gen im wesentlichen den Nucleotiden 8964 bis 9431 entspricht.
Die Polynucleotidsequenz kann eine Sequenz sein, die sich von dem Genom von Acetobacter ableitet. Ebenso kann die Polynucleotidsequenz weiter einen zu dem Operon benachbarten und stromaufwärts davon liegenden Promotor umfassen.
Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein isoliertes, natives, cloniertes rekombinantes oder synthetisches Polynucleotid bereit, das im wesentlichen der Nucleotidsequenz für die Cellulosesynthase A, Cellulosesynthase B, Cellulosesynthase C oder Cellulosesynthase D entspricht, in jedem Fall wie in Figur 1 gezeigt. Dieses Polynucleotid ist bevorzugt funktionell mit einer Kontrollsequenz für die Expression verbunden und kann weiter einen Promotor, der benachbart zu und stromaufwärts des Polynucleotids liegt, das der Nucleotidsequenz für die Cellulosesynthase A, B, C oder D entspricht, umfassen.
Gemäß einem dritten Gesichtspunkt stellt die Erfindung rekombinante Wirtszellen bereit, die mit einem erfindungsgemäßen Polynucleotid transformiert sind.
Gemäß einem vierten Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer bakteriellen Cellulosesynthase bereit, umfassend die Züchtung der mit einem erfindungsgemäßen Polynucleotid transformierten Zellen unter Bedingungen, die für die Expression der bakteriellen Cellulosesynthase geeignet sind, und die Gewinnung der exprimierten bakteriellen Cellulosesynthase aus der Kultur. Folglich wird das isolierte rekombinante Protein, das von einem erfindungsgemäßen Polynucleotid codiert ist, als fünfter Gesichtspunkt bereitgestellt.
Erfindungsgemäße Expressionsvektor-Konstruktionen können entweder unabhängig replizieren oder können so entwickelt werden, daß sie einen heterologen Promotor in das Acetobacter-Chromosom einschleusen, wodurch der native Cellulosesynthase-Operon- Promotor ersetzt wird.
Gemäß einem sechsten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung der Celluloseproduktion in einem rekombinanten Mikroorganismus bereitgestellt, welches umfaßt:
(a) Transformation eines geeigneten Mikroorganismus mit einem Vektor, der mindestens ein Gen umfaßt, das im wesentlichen der Nucleotidsequenz für Cellulosesynthase A, Cellulosesynthase B, Cellulosesynthase C oder Cellulosesynthase D entspricht, in jedem Fall wie in Figur 1 gezeigt, und
(b) Züchtung des transformierten Mikroorganismus unter für die Produktion von Cellulose günstigen Bedingungen.
Wie vorstehend diskutiert, kann der chromosomale Cellulosesynthase-Promotor durch den heterologen Promotor ersetzt werden, um das Cellulosesynthase-Operon auf chromosomaler Ebene zu überexprimieren.
Das isolierte rekombinante Cellulosesynthase-B-Protein kann β-(1-4)-Glucan-Polymere aus Uridin-5'-diphosphoglucose synthetisieren, wogegen das von Gen A codierte Protein Cellulose-negative Acetobacter-Zellen, die sowohl in ihrer Cellulosesynthase- als auch Diguanylat-Cyclase-Aktivität defekt sind, komplementieren kann. Das von entweder Gen C oder D codierte Protein kann β-(1-4)-Glucan-Polymere aus Uridin-5'-diphosphoglucose synthetisieren und das Produkt aus den Zellen in vivo sezernieren, wenn das jeweilige Protein in geeigneten Anteilen mit den anderen drei Proteinen des Cellulosesynthase- Operons kombiniert wird.
Gemäß einem siebten Gesichtspunkt der Ertindung wird ein rekombinanter DNA-Vektor bereitgestellt, der umfaßt:
(a) mindestens ein Gen, das von dem Cellulosesynthase-Operon stammt und eine Sequenz umfaßt, die im wesentlichen der Nucleotidsequenz für Cellulosesynthase A, Cellulosesynthase B, Cellulosesynthase C oder Cellulosesynthase D entspricht, in jedem Fall wie in Figur 1 gezeigt,
(b) ein flinktionelles, den Acetobacter-Replikationsursprung enthaltendes Fragment der Plasmid-DNA von 3,5 kb Länge, das durch eine SacI-Spaltung aus ATCC 67925 oder ATCC 67926 erhältlich ist, und
(c) eine oder mehrere DNA-Segmente, die gegenüber mindestens einem Antibiotikum Resistenz verleihen, wenn sie in eine sensitive, einer Transformation, Zellteilung und Züchtung zugängliche Wirtszelle transformiert werden.
Der rekombinante DNA-Vektor ist bevorzugt der Vektor, der aus ATCC 67925 oder ATCC 67926 erhältlich ist, oder der Vektor kann mit dem bevorzugten Vektor identisch sein, ausgenommen, daß das clonierte 8,3 kb-SmaI-Restriktionsfragment in der umgekehrten Orientierung vorliegt. Die Vektoren können in Schaukelvektoren zur Verwendung zur Clonierung von DNA in bakterielle Wirtszellen wie E. coli entwickelt werden.
Die Figur 1 ist die Nucleinsäuresequenz und die davon abgeleitete Aminosauresequenz des Cellulosesynthase-Operons. Das Cellulosesynthase-Operon besitzt eine Länge von etwa 9217 bp und besteht aus vier Genen, einer 2261-Nucleotidsequenz mit der Bezeichnung A (Nucleotide 328-2589), einer 2405-Nucleotidsequenz mit der Bezeichnung B (Nucleotide 2594-4999), einer 3956-Nucleotidsequenz mit der Bezeichnung C (Nucleotide 5005 bis 8961) und einer 467-Nucleotidsequenz mit der Bezeichnung D (Nucleotide 8964 bis 9431). Die Nucleotidsequenzen jedes hier bereitgestellten Gens können Signalsequenzen umfassen. Das von seinem jeweiligen Gen codierte reife Protein kann eine Prozessierung durchlaufen haben und sofern dies der Fall ist, ist die entsprechende Gensequenz kürzer als die vorstehend bereitgestellte. Beispielsweise ist das Alanin-Codon, das der ersten Aminosäure des gereinigten Cellulosesynthase-B-Proteins entspricht, von zwei aufwärts gerichteten Pfeilen II flankiert. Die Transkriptionsinitiationsstelle wird mit einem nach unten gerichteten Pfeil O bezeichnet, der über dem A in Nucleotid 235 angebracht ist. Die unterstrichene Nucleotidsequenz nach Gen D bezeichnet die Transkriptionsterininatorregion und umfaßt eine umgekehrte Wiederholungssequenz, die für Stamm- und Schleifenstrukturen charakteristisch ist. Die Sequenz des Oligonucleotids MK 170 ist über den Nucleotiden 2190 bis 2210 angegeben und die von MK172 ist über den Nucleotiden 4564 bis 4583 angegeben.
Die Figur 2 zeigt die Konstruktion des Cosmidvektors pKT230cos5.
Die Figur 3 ist eine Erläuterung der Konstruktion von TRT18-1, das das Cellulosesynthase-B-Gen in voller Länge enthält.
Die Figur 4 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pUC18-824.
Die Figur 5 ist eine Restriktionskarte des 8,3 kb SmaI-Fragments und des 7,2 kb BamHI-Fragments aus dem Cosmid T5A1.
Die Figur 6 ist eine Restriktions- und Funktionskarte des Plasmids pUC18-824 FS6; pUC18-824 FS1 ist zu pUC18-824 FS6 homolog, außer daß die Orientierung des SmaI-Restriktionsfragment, das das Cellulosesynthase-Gen enthält, umgekehrt ist.
Die Figur 7 ist eine Restriktions- und Funktionskarte des Plasmids pUG19-824.
Die Figur 8 erläutert schematisch die Konstruktion des Plasmids pABCD.
Die Figur 9 ist ein Fließdiagramm, das die Konstruktion von Expressionsvektoren beschreibt, die heterologe Promotoren zur Transkription der Gene des Cellulosesynthase- Operons enthalten.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Damit die hier beschriebene Erfindung besser verstanden wird, wird die folgende ausführliche Beschreibung gegeben.

A. Definitionen

Wie hier verwendet bezieht sich der Ausdruck "Cellulosesynthase" auf ein oder mehrere Polypeptide in Zusammenhang mit der biochemischen in vivo-Umwandlung von Uridin-5'-diphosphoglucose in bakterielle Cellulose und Sekretion außerhalb der Zelle. Eine einzelne Transkriptionseinheit, die vier Gene, die mit der Synthese der Cellulosesynthase im Zusammenhang stehen, enthält, wird von der in Figur 1 bereitgestellten Nucleinsäuresequenz codiert.
Der Ausdruck "Cellulosesynthase-Gen" ist als eine Nucleinsäuresequenz definiert, die ein Polypeptidprodukt codiert, das mit dem Cellulosesynthase-Operon in Zusammenhang steht. Der Ausdruck ist nicht auf irgendwelche bakterielle Stämme oder Arten von Acetobacter beschränkt.
Wie hier verwendet bezieht sich der Ausdruck "Cellulosesynthase-Operon" auf einen Abschnitt einer DNA-Sequenz, der eine Gruppe von Proteinprodukten codiert, die im Zusammenhang mit der Cellulosesynthese und Sekretion aus der Zelle stehen. Gegebenenfalls kann das Operon Transkriptionselemente wie eine Promotorregion und eine Transkriptionsterminatorregion umfassen, die die Expression der die Proteine codierenden Gene regulieren.
"Cellulosesynthase-Aktivität" wird durch die Fähigkeit, Cellulose [β-(1-4)-Glucan] aus UDP-Glc zu synthetisieren, definiert. Diese Aktivität wird in vitro durch Einbau von UDP-(¹&sup4;C)-Glucose in Cellulose (unlösliche Base) gemessen und wird in nmol (Nanomol) der in Cellulose pro Minute eingebauten Glucose gemessen.
Die "spezifische Cellulosesynthase-Aktivität" ist als nmol-Glucose, die in Cellulose/min/mg Protein eingebaut wird, definiert. Die spezifische Cellulosesynthase- Aktivität in Acetobacter-Zellen liegt normalerweise im Bereich von 0,2 bis 4,0 nmol Glc/min/mg Zellprotein.
Wie hier verwendet bezieht sich der Ausdruck "Acetobacter" auf eine Gattung von Mikroorganismen und insbesondere Mitglieder der Gattung, die Cellulose produzieren.
"Geeigneter Mikroorganismus" bezieht sich auf einen Mikroorganismus, der Cellulose bei Transformation mit einem oder mehreren der Gene im Zusammenhang mit dem Cellulosesynthase-Operon produzieren kann. Geeignete Mikroorganismen umfassen diejenigen Wirtszellen, die zur Celluloseproduktion in Abwesenheit der Transformation befähigt sind,oder diejenigen Wirtszellen, denen eines oder mehrere der Gene fehlen, deren Aktivität durch mindestens ein Gen des Cellulosesynthase-Operons ersetzt werden kann.
"Funktionell verknüpft" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, so daß die normale Funktion der Komponenten ausgeführt werden kann. So bezieht sich auf eine codierende Sequenz, die "funktionell verknüpft" ist mit Kontrollsequenzen, eine Konfiguration, bei der die codierenden Sequenzen unter der Kontrolle dieser Sequenzen exprimiert werden können. Eine solche Kontrolle kann direkt sein, d.h. ein einzelnes Gen ist mit einem einzelnen Promotor assoziiert oder indirekt, wie es der Fall ist, wenn ein polycistronisches Transkript von einem einzelnen Promotor exprimiert wird.
"Kontrollsequenz" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz oder DNA-Sequenzen, die für die Expression einer funktionell verknüpften codierenden Sequenz in einem speziellen Wirtsorganismus notwendig ist/sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryonten geeignet sind, umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle, einen Transkriptionsterminator und möglicherweise andere noch wenig verstandene Sequenzen. Eukaryontische Zellen benötigen bekanntlich Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer.
"Zellen" oder "rekombinante Wirtszellen" oder "Wirtszellen" werden oft austauschbar verwendet und jede diese Bezeichnungen umfaßt die Nachkommenschaft. So umfassen "Transformanten" oder "transformierte Zellen" die primär der Transformation ausgesetzte Zelle und Kulturen, die davon abgeleitet sind, ohne daß die Anzahl der Transfers berücksichtigt wird. Es ist auch selbstverständlich, daß die gesamte Nachkommenschaft bezüglich des DNA-Gehalts infolge von absichtlichen und unbeabsichtigten Mutationen nicht genau identisch sein können. Eine mutierte Nachkommenschaft, die die gleiche Funktionalität besitzt, nach der in der ursprünglichen transformierten Zelle durchgemustert wurde, wird umfaßt. Sofern unterschiedliche Bezeichnungen beabsichtigt sind, geht dies aus dem Kontext hervor.
Wie hier verwendet bezieht sich Ausdruck Polynucleotid "abgeleitet von" einer bezeichneten Sequenz, beispielsweise der DNA von dem Cellulosesynthase-B-Gen auf eine Polynucleotidsequenz, die aus einer Sequenz von mindestens 6-20 Nucleotiden, stärker bevorzugt von mindestens 15 bis 20 Nucleotiden besteht, die einer Region der bezeichneten Nucleotidsequenz entspricht, d.h. identisch oder komplementär ist. Die Entsprechung zu der Nucleinsäuresequenz beträgt etwa 70% oder mehr, bevorzugt mindestens 80% und noch stärker bevorzugt mindestens 90%.
Die Entsprechung oder Nichtentsprechung der abgeleiteten Sequenz mit anderen Sequenzen kann durch Hybridisierung unter geeigneten Stringenzbedingungen bestimmt werden, wobei Standard-DNA-Hybridisierungstechnologien in Flüssigphasen oder auf festen Trägern verwendet werden. Hybridisierungstechniken zur Bestimmung der Komplementarität von Nucleinsäuresequenzen sind auf dem Fachgebiet bekannt (vergleiche beispielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Zusätzlich können Fehlpaarungen von Duplex-Polynucleotiden, die durch Hybridisierung gebildet werden, durch bekannte Techniken bestimmt werden, welche die Spaltung mit einer Nuclease wie S1, die spezifisch einzelsträngige Sequenzen in Duplex-Polynucleotiden spaltet, umfassen.
Das abgeleitete Polynucleotid leitet sich nicht notwendigerweise physikalisch von der gezeigten Nucleotidsequenz ab, sondern kann auf beliebige Weise erzeugt werden, einschließlich beispielsweise der chemischen Synthese, DNA-Replikation oder reversen Transkription, wobei die Verfahren auf der Information basieren, die durch die Basensequenz in der Region bzw. in den Regionen bereitgestellt wird, von der bzw. denen das Polynucleotid abgeleitet ist.
Auf ähnliche Weise bezieht sich ein Polypeptid "abgeleitet von" einer bezeichneten Sequenz, beispielsweise von Cellulosesynthase B, auf ein Polypeptid mit einer Aminosauresequenz, die mit der eines Polypeptids, das innerhalb der Sequenz codiert wird, oder einem Protein davon identisch ist, wobei der Anteil aus mindestens 5-10 Aminosäuren und stärker bevorzugt aus mindestens 10-15 Aminosäuren besteht, der immunologisch mit einem Polypeptid, das von der Sequenz codiert wird, identifizierbar ist oder eine ähnliche biologische Aktivität wie das Referenzprotein, in den hier beschriebenen in vitro- oder in vivo-Tests zeigt.
Wie hier verwendet bezieht sich der Ausdruck "wesentliche Entsprechung" unter Bezugnahme auf eine Aminosäuresequenz auf eine Sequenz, die sich üblicherweise um weniger als 10 Aminosäuren, noch üblicher um weniger als 5 Aminosäuren unterscheidet. Das rekombinante Protein, sei es "A", "B", "C" oder "D", zeigt im wesentlichen die gleichen biologischen Eigenschaften wie das natürlich vorkommende Protein. Die biologischen Eigenschaften umfassen immunologische Eigenschaften, wobei Antikörper, die gegen das authentische Protein erzeugt wurden, mit dem rekombinanten Protein kreuzreagieren.
Der Ausdruck "rekombinantes Polypeptid", wie er hier verwendet wird, um ein Polypeptid zu kennzeichnen, das für die Produktion von Cellulosesynthase nützlich ist, bezieht sich auf ein Polypeptid, das von einer genomischen, cDNA, semisynthetischen oder synthetischen Nucleinsäuresequenz codiert wird, die durch ihre Herkunft oder Manipulation: (1) mit der Gesamtheit oder einem Teil des Polynucleotids, mit dem sie natürlicherweise oder in Form einer Genbank assoziiert sind, nicht assoziiert sind und/ oder (2) an ein Polynucleotid gebunden sind, das sich von dem unterscheidet, an das es natürlicherweise gebunden ist.
Der Ausdruck "Expressionssystem" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die eine gewünschte codierende Sequenz und Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung enthalten, so daß mit diesen Sequenzen transformierte Wirte die codierten Proteine produzieren können. Um die Transformation zu bewirken, kann des Expressionssystem in einem Vektor vorhanden sein; jedoch kann die relevante DNA auch in das Wirtschromosom integriert sein.
Der Ausdruck "sensitive Wirtszelle" bezieht sich auf eine Wirtszelle, die in Gegenwart eines gegebenen Antibiotikums ohne ein DNA-Segment, das ein Gen, das dagegen Resistenz verleiht, nicht wachsen kann.
Wie hier verwendet bezieht sich der Ausdruck "Vektor" auf ein Polynucleotid, das zur Überführung von Nucleinsäuresequenzen in eine Wirtszelle geeignet ist. Der Ausdruck kann Plasmid, Mini-Chromosomen, Phagen, nackte DNA und dergleichen umfassen.

B. Allgemeine Beschreibung

Die nachstehend erläuterten Verfahren zum Erhalt einer oder mehrerer DNA- Sequenzen, die Gene des bakteriellen Cellulosesynthase-Operons codieren, dienen nur der Erläuterung und sind für diejenigen, die verwendet werden können, typisch. Jedoch können, sobald die Gene identifiziert wurden, andere Verfahren ebenfalls verwendet werden, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist.

Erhalt der codierenden Sequenzen für das bakterielle Cellulosesynthase-Operon

Das Polynucleotid, das das bakterielle Cellulosesynthase-Operon codiert, wurde aus einer Acetobacter-DNA-Bank, wie in den Beispielen dargelegt, erhalten und genetische Komplementation wurde zur Identifizierung der Gene verwendet.
Die Verfahren zum Erhalt der Nucleotidsequenz, die das bakterielle Cellulosesynthase-Operon codiert, verwenden eine Reihe von einzelnen Schritten, die eine Anpassung für Acetobacter-DNA benötigten und umfassen (1) die Herstellung und Charakterisierung mutierter Cellulose-negativer (cel) Stämme von Acetobacter; (2) die Konstruktion geeigneter Vektoren zur Clonierung; (3) die Konstruktion einer Acetobacter- DNA-Bank; (4) die Identifikation und Isolation der DNA-Insertionssequenzen, die die Cellulosesynthase-Aktivität der Cel&supmin;-Acetobacter-Mutanten wiederherstellen können; (5) die Kartierung und Subclonierung der Nucleotidsequenzen, die das bakterielle Cellulosesynthase-Operon codieren, sowohl für die Sequenzanalyse als auch die Lokalisierung der die Cellulosesynthase codierenden Sequenzen; und (6) die Clonierung und Expression der DNA, die die Produkte des Cellulosesynthase-Operons codiert.
Komplementationsstudien zeigen, daß Stämme, die in der Cellulosesynthase- Aktivität defekt sind, durch das Gen B komplementiert werden können, und daß Cellulosenegative Mutanten, die sowohl in der Cellulosesynthase- als auch der Diguanylatcyclase- Aktivität defekt waren, durch das Gen A komplementiert werden. Cellulose-negative Mutanten der Klasse III werden durch ein DNA-Fragment komplementiert, das die Gene C und D codiert. Die Mutanten in dieser Gruppe erzeugen Cellulose in vitro und besitzen alle enzymatischen Aktivitäten, die zur Celluloseproduktion notwendig sind. Das Gen D codiert ein Protein, das mit der Cellulosesynthese im Zusammenhang steht. Eine Unterbrechung dieses Gens verringert die Cellulosesynthese deutlich.
Die Gene A, C und D können regulatorische, strukturelle, membrangebundene oder Prozessierungsproteine codieren, die bei der in vivo-Cellulosesynthese benötigt werden. Die Verfügbarkeit der codierenden Sequenzen für ihr jeweiliges Genprodukt erlaubt die Synthese großer Mengen jedes Proteins für Untersuchungen, um den Mechanismus der Cellulosesynthese weiter aufzuklären.

Expression bakterieller Cellulosesynthase

Gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Polynucleotid, das das Cellulosesynthase-Operon codiert, in einen geeigneten Vektor cloniert werden, dieser in einen geeigneten Mikroorganismenwirt transformiert werden und dieser unter Bedingungen gezüchtet werden, die die Expression der Cellulosesynthase erlauben. In einer anderen Ausführungsform kann angesichts der Sequenzindividualität jedes Gens in diesem Operon jedes Gen unabhängig cloniert und exprimiert werden, um das gewünschte Genprodukt zu produzieren.
Die Transkription der Polynucleotidsequenzen, die die Cellulosesynthase-Operon- Genprodukte codieren, kann unter Verwendung des endogenen Acetobacter-Promotors durchgeführt werden oder in einer anderen Ausführungsform durch heterologe bakterielle Promotoren gesteuert werden, darunter diejenigen, die von E. coli oder B. subtilis abgeleitet sind. Viele der hier beschriebenen heterologen Promotoren wie lac, trp und tac sind regulierte Promotoren und sind daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich um die Expression des bakteriellen Cellulosesynthase-Operons zu kontrollieren. Jedoch würden Promotoren wie die PL-Promotoren, die durch temperatursensitive Repressoren d.h. funktionell über 37ºC reguliert werden, in vielen Acetobacter-Stämmen nicht funktionell sein, da diese Stämme normalerweise bei 35ºC oder darunter gezüchtet werden und oberhalb dieses Temperaturbereichs nicht wachsen würden.
Ein noch weiteres Mittel zur Kontrolle der Expression des Cellulosesynthase- Operons kann einen heterologen Transkriptionsterminator verwenden, um das mRNA- Transkript zu stabilisieren; beispielsweise den Transkriptionsterminator, der aus dem Kristallprotein von B. thuringiensis isoliert wurde.
Die so erhaltenen Konstruktionen können in einen geeigneten Cellulose produzierenden Mikroorganismus insertiert werden und entweder unabhängig repliziert werden, wobei ein geeigneter Expressionsvektor verwendet wird, oder, wenn Plasmidinstabilität als ein Problem gilt, kann das Promotor-Gen-Konstrukt direkt in das Chromosom des Wirtsmikroorganismus integriert werden. Der Cellulose-produzierende Wirtsmikroorganismus kann entweder ein Cellulosesynthase-negativer Stamm oder ein Cellulosesynthase-positiver Stamm sein. In dem zuerst genannten Beispiel stellen ein oder mehrere Gene des Cellulosesynthase-Operons die Cellulose-produzierende Fähigkeit des Wirtsmikroorganismus wieder her. In dem zuletzt genannten Beispiel wird angenommen, daß die Einschleusung des rekombinanten Cellulosesynthase-Operons sowohl die Cellulosesynthase-Aktivität als auch die Celluloseproduktion des rekombinanten Stamms erhöht.
Die Nucleotidsequenz, die die Gene des erfindungsgemäßen bakteriellen Cellulosesynthase-Operons codiert, kann in einer Vielzahl von prokaryontischen Systemen exprimiert werden, darunter E. coli, Streptomyces, Acetobacter, Agrobacteria, Rhizobium, Pseudomonas, Alcaligenes, Zymomonas, Zoogloea, blaugrüne Algen und Sarcina ventriculi, wobei E. coli und Acetobacter bevorzugt sind.
Da die Cellulosesynthase bakteriellen Ursprungs ist, sind Vektoren, die für die Expression der Cellulosesynthase geeignet sind, auf dem Fachgebiet bekannt und können Hybridschaukelvektoren zur Entwicklung von Wirt-Vektor-Systemen für Essigsäurebakterien wie Acetobacter umfassen. Fukaya et al., (1985) Agric. Biol. Chem. 49:2083-2090 beschreiben mehrere Schaukelvektoren relativ geringer Größe mit selektierbaren Antibiotika-Genmarkern und mit der Fähigkeit, in E. coli und Acetobacter zu replizieren. Fukaya et al., (1989) App. Env. Microbiol. 55:171-176 beschreiben den Schaukelvektor pmv24 für E. coli- und Acetobacter-Arten, der die Translation einer clonierten Sequenz als Fusionsprotein mit β-Galactosidase erlaubt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen endogenen Acetobacter-Vektor zur Verwendung zur donierung und Expression der Cellulosesynthase-Gene bereit. Dieser Vektor mit der Bezeichnung p824 ist klein und ihm fehlt die große Mobilisierungsregion. die auf dem hier beschriebenen Konjugationsvektor pKT230cos5 vorhanden ist. Die kleine Größe von p824 erleichtert die Manipulation als Clonierungsvektor. Die Analyse der DNA-Insertion in diesem Vektor sollte infolge seiner kleinen Größe auch sehr erleichtert werden. Der p824-Vektor kann zur direkten Clonierung von Genen aus einem Acetobacter-Wirt in einen anderen verwendet werden, wodurch die Wirtsrestriktionsbarriere und damit verbundene Umordnungen/Deletionen beseitigt werden, die während der Konjugation von pKT230cos5-Cosmiden aus E. coli in Acetobacter auftreten.
Das endogene Plasmid kann zum direkten Acetobacter-Acetobacter-Transfer verwendet werden und kann auch zur Entwicklung von Schaukelvektoren verwendet werden. So stellt die vorliegende Erfindung sowohl Clonierungs- als auch Expressionsvektoren (f r E. coli- und Acetobacter-Arten) bereit, wobei geeignete Kontrollsequenzen verwendet werden, die die direkte Transkription und Translation einer gewunschten Sequenz erlauben, wobei beispielsweise der E. coli lac-Promotor und sein Translationsinitiationssignal verwendet werden. Die Transformation von Acetobacter mit diesen Vektoren führt zu Transformationseffizienzen, die für verschiedenen Typen von Clonierungs- und Expressionsexperimenten nützlich sind.

Einschleusung einer DNA in Acetobacter

A. Koniugationen

Konjugation ist eine Technik, die zum Transfer von Fremd-DNA in eine Wirtszielzelle nützlich ist. Die in der vorliegenden Erfindung konstruierten Cosmidvektoren werden nicht leicht aus E. coli zur Replikation in einen anderen bakteriellen Wirt wie Acetobacter überführt. In solchen Fällen kann ein Helferplasmid wie pRK2013 (Figurski und Helinski (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1648-1652) verwendet werden, um den Transfer des Cosmidvektors, der die gewünschte DNA- Insertion enthält, aus Donorzellen in Empfängerzellen zu unterstützen. Zur Konjugation werden die Donor-, Mobilisierungs- und Empfängerzellen vermischt und auf Platten verpaart. Zellen, die den Donor erwerben, werden durch ihr Wachstum auf Platten, die ein Antibiotikum enthalten, gegen das die transformierten Empfängerzellen resistent sind, selektiert. Miller, a.a.O. beschreibt auch ein Konjugationsverfahren, bei dem Nährstoffmarker verwendet werden, um Empfängerzellen zu selektieren. Ein anderes Konjugationsverfahren, das zu einer Massen-Durchmusterung geeignet ist, ist das "multiple spot conjugation"-Verfahren, wie es ausführlich in dem nachstehenden Beispiel V dargelegt ist.

B. Transformationen

Zwei grundlegende Parameter beeinflussen die Effizienz der Elektroporation. Einer ist die Feldstärke und der andere ist die Zeitspanne (Pulsdauer), im Verlauf derer die Feldstärke abfällt.
Die optimale Feldstärke für Acetobacter-Stämme, die erfindungsgemäß verwendet werden, variiert zwischen 9 und 9,5 kV/cm. Eine Untersuchung der Pulsdauer (RC-Werte) unter Verwendung von 25-100 µF (Reihe) gegen 200-1200 Ohm zeigte, daß 25 µF/750 Ohm (=18,75 msec) für den Acetobacter-Stamm 1306-24 optimal ist. Das so erhaltene Transformationsausmaß (etwa 10&sup7; Transformanten/µg) ist etwa 10² mal höher als die, die bei chemischer Behandlung erhalten wird (Fukaya et al., (1985) Agri. Biol. Chem. 49:2091-2097).
Es wurde auch bestimmt, daß die Transformationsfrequenz der aus Acetobacter hergestellten DNA 10³-fach höher ist als bei Herstellung der DNA aus E. coli.
Damit die hier beschriebene Erfindung besser verstanden wird, werden die folgenden Beispiele nur zur Erläuterung angeführt und sollen den Umfang der Erfindung in keinerlei Weise beschränken.

Beispiel I

Herstellung von Cellulose-negativen Acetobacter-Stämmen

In den folgenden Beispielen wurde eine Reihe von Kulturmedien verwendet. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Medien wie folgt formuliert:
Das R20-2-Medium besitzt die folgende Zusammensetzung:
Das Minimalmedium R70 (auch als Acetobacter-Minimalmedium oder "AMM" bezeichnet) besitzt die folgende Zusammensetzung:
Für alle Untersuchungen, bei denen R-70-Medium und Modifikationen davon verwendet wurden, wurde das folgende Vitamingemisch dem Minimalmedium in einer 100-fachen Verdünnung zugesetzt:
Das R70-2-Medium ist eine modifizierte Form von R70. R70-2 besitzt die folgende Zusammensetzung:

Erzeugung mutierter Acetobacter-Stämme

Drei Gewebekulturkolben, die 100 ml R70 + 2% Glucose, 2% Maisquellwasser E804E (CSL, Corn Products, NJ) als Medium enthielten, wurden mit dem Acetobacter- Stamm 1306-21 (ATCC Nr. 53524) (ein geftorenes 2 ml-Fläschchen pro Kolben) inokuliert. Die Kolben wurden feststehend 23 h bei 30ºC inkubiert.
Die durch die Acetobacter-Zellen in Kultur gebildeten Häutchen wurden aseptisch mit einer Pinzette entfernt, etwa 15 Sekunden vermischt und durch 4 Schichtem aus sterilem Preßtuch filtriert. Die Zellen wurden zweimal mit 0,9% NaCl durch 10minutige Zentrifugation mit 7500 UpM bei 4ºC gewaschen. Die Zellen wurden in 20 ml 0,9% NaCl resuspendiert und nochmals durch 4 Schichten Preßtuch filtriert, um eventuell verbleibende Klumpen zu entfernen.
Die Mutagenesebedingungen wurden so gewählt, daß eine Zellabtötung von 95% bis 99,9% erhalten wurde. Die Kulturen wurden bei 30ºC inkubiert. Das Mutagen war Ethylmethansulfonat (EMS, Sigma, St. Louis, MO). Die EMS-Konzentrationen lagen im Bereich von 1% bis 2% (Vol./Vol.) und die Inkubationszeiten lagen im Bereich von 60 min bis 210 min Ähnliche Bedingungen wurden mit den Acetobacter-Stämmen 1306-3 und 1306-11 (ATCC Nr. 53264 bzw. 53263) verwendet.
Zwei Verfahren wurden verwendet, um die Cel&supmin;-Acetobacter-Stämme zu isolieren, 1) Mutagenese ohne Expression und 2) Mutagenese mit Expression.

Mutierte Acetobacter-Stämme aus EMS-Mutagenese ohne Expression

Der Acetobacter-Stamm 1306-21 wurde mit EMS behandelt und dann direkt auf R20-2-Medium plattiert, um die prozentuale Überlebensrate zu bestimmen. Die Platten aus der EMS-Mutagenese von 1306-21 wurden auf potentielle Cel&supmin;-Kolonien wie folgt untersucht. Die mutagenisierte Kultur wurde plattiert und nach sieben (7) Tagen wurden mutmaßliche Cel&supmin;-Kolonien abgenommen. Cel&supmin;-Mutanten können auf Platten als flache und durchscheinende Kolonien identifiziert werden, wohingegen Wildtypkolonien ein rauhes, trockenes Aussehen haben. In einer bewegten Kultur bilden Cel&spplus;-Stämme Pellets, während Cel&supmin;-Kulturen eine Suspension aus einzelnen Zellen produzieren. Es wurde bestimmt, daß die Häufigkeit der Cel&supmin;-Kolornen im Bereich von 0,05% bis 2,0% liegt. Eine ähnliche Technik wurde verwendet, um Cel&supmin;-Stämme aus den Acetobacter-Stämmen 1306-3 und 1306-11 zu isolieren, und ähnliche Mutationshäufigkeiten wurden beobachtet.

Mutierte Acetobacter-Stämme aus EMS-Mutagenese und Expression

Proben (etwa 0,05 ml) von EMS-behandelten Acetobacter-Zellen (Stamm 1306-21) wurden in Röhrchen (2 ml 20-2-Brühe) inokuliert, und man ließ sie als Standkulturen wachsen, um die Expression der mutierten Gene zu erlauben. Die Kulturproben wurden reihenverdünnt und auf R20-2-Platten plattiert. Nach der Inkubation wurden die Kolonien auf potentielle Cel&supmin;-Typen unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Protokolls durchmustert, und es wurden ähnliche Mutationshäufigkeiten erhalten. Eine ähnliche Technik wurde verwendet, um Cel&supmin;-Stämme aus den Acetobacter-Stämmen 1306-3 und 1306-11 zu isolieren.

Beispiel II

Charakterisierung von Cellulose-negativen Acetobacter-Stämmen Cellulosesynthase-Aktivitätstest

Der Cellulosesynthase-Test, der verwendet wurde, um die In-vitro- Cellulosesynthase-Aktivität von Cel&supmin;-Acetobacter-Mutantenstämmen nachzuweisen, war eine Modifikation des von Aloni et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6448-6452 beschriebenen Verfahrens, bei dem die Produktion eines alkaliunlöslichen Polymers (Cellulose) aus Uridin-5'-diphospho-(¹&sup4;C)-glucose (UDPG) gemessen wird. Dieser Test wurde dem Absuchen nach Acetobacter-Cel&supmin;-Mutanten angepaßt. Nach der Inkubation (10 min bei 30ºC) wurde nicht umgesetzte UDPG in jedem Reaktionsgemisch von der Cellulose durch Erhitzen mit NaOH (ih bei 95ºC) und Futrieren abgetrennt. Die radioaktivmarkierte (¹&sup4;C)-Cellulose, die auf dem Filter zurückgehalten wurde, wurde dann durch Szintillationszählung quantitativ bestimmt.
Die Menge des Gesamtproteins, die bei dem Test verwendet wurde, hängt von dem Reinigungszustand der Cellulosesynthase ab. Zwei oder drei verschiedene Probenverdünnungen wurden getestet, um mindestens ein Ergebnis im linearen Bereich des Tests zu erhalten (< 20% des gesamten UDPG-Verbrauchs).
Das 0,2 ml-Testgemisch enthielt als Endkonzentrationen 0,2 mM (¹&sup4;C)-UDPG (7,5 CpM/pmol), 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM EDTA, 2 mM CaCl&sub2; und die zu testende Probe. Cyclisches Diguanosinmonophosphat (c-di-GMP) wurde in einer Konzentration von 5 µM zu einigen der Teströhrchen gegeben (c-di-GMP aktiviert die Cellulosesynthase). Die Kontrollen umfaßten ein Röhrchen, das keine zugesetzte Probe enthielt, und ein Röhrchen, das die Probe enthielt, die vor der Inkubation durch Zugabe von 4 ml 0,5 M NaOH denaturiert worden war.
Die zeitlich festgelegten Reaktionen wurden durch Zugabe von Enzym, Behandlung des Gemisches mit dem Vortexgerät und Stellen der Röhrchen in ein 30ºC- Wasserbad gestartet. Aufeinanderfolgende Röhrchen wurden zu festgesetzten Intervallen gestartet. Nach 10 min wurde jede Reaktion durch Entfernen des Röhrchens aus dem Wasserbad, Zugabe von 4 ml 0,5 M NaOH und Behandlung mit dem Vortexgerät beendet. Wenn alle Reaktionen gestoppt waren, wurden etwa 20 mg Cellulose jedem Röhrchen als Träger für die (¹&sup4;C)-Cellulose zugesetzt. Die Röhrchen wurden dann in einem 95ºC warmen Wasserbad eine Stunde erhitzt, um die Zellen abzuschließen.
Unter Verwendung eines Vakuumsammelrohres wurde der Inhalt jedes Teströhrchens durch ein Whatman GF/A-Filter filtriert, um das Celluloseprodukt zu isolieren (wobei jede nicht umgesetzte ¹&sup4;C-UDPG entfernt wurde), wobei das Reaktionsgemisch durch das Filter geleitet wurde und das Teströhrchen 3x mit entionisiertem Wasser gewaschen wurde, das Spülwasser durchgeleitet wurde und das Filter 2x mit 20 ml entionisiertem Wasser, dann mit 20 ml 0.5 M HCl, gefolgt von 20 ml entionisiertem Wasser und 20 ml Methanol gewaschen wurde.
Die Celluloseproduktion wurde durch Szintillationszählung quantitativ bestimmt. Jedes Filter wurde in ein Szintillationsgefäß mit 10 ml Szintillationsflüssigkeit (NEN Atomlight, Boston, MA) gegeben und die quantitative Celluloseproduktion wurde durch (¹&sup4;C)-UDPG-Einbau in ein basenunlösliches Material durch Szintillationszählung bestimmt. Um die spezifische Aktivität der (¹&sup4;C)-UDPG zu erhalten, wurde ein Aliquot der 2 mM (¹&sup4;C)-UDPG-Stammlösung ausgezählt.
Die möglichen Gesamtcounts pro Minute des Tests wurden aus dem Stammlösungsaliquot bestimmt und der Anteil der Gesamt-UDPG, der aus jedem Teströhrchen verbraucht wurde, wurde wie folgt berechnet:
Anteil der gesamten verbrauchten UDPG =

((CpM-Filter) - (CpM-Leerwert))

(Gesamtcounts) - (CpM-Leerwert)

Die nmol UDPG, die pro Minute verbraucht wurden, wurden wie folgt berechnet:
nmol-UDPG/min = (Anteil der gesamten verbrauchten UDPG x (40.000 pmol) x (1/20 min)
Die Aktivität wurde auf der Basis von nmol pro Minute pro ml Probe oder nmol pro Minute pro mg Protein ausgedrückt.

Test auf Diguanylatcyclase-Aktivität

Der Diguanylatcyclase-Test wurde verwendet, um Acetobacter-Wirte zu identifizieren, denen zwei oder mehrere spezifische Aktivitäten fehlen, wie z.B. ein Mangel in der Cellulosesynthase-Aktivität und der Diguanylatcyclase-Aktivität. Das Enzym Diguanylatcyclase katalysiert die Produktion von c-di-GMP, einem Cellulosesynthase-Aktivator aus Guanosintriphosphat (GTP).
Die Zellen wurden, wie nachstehend für den Durchmusterungstest beschrieben, gezüchtet, gewaschen und beschallt. Die Diguanylatcylase-Aktivität wurde unter Verwendung eines Tests, der dem ähnlich ist, der in Ross et al. (1987) Nature 325:279- 281 beschrieben ist, gemessen. Beschaute Zellen (1 mg/ Teströhrchen) wurden 10 min bei 30ºC in einem 0,1 ml-Reaktionsgemisch aus 0,2 mM [alpha³²-P]-GTP, 50 mM Tris HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM EDTA, 5 ml CaCl&sub2;, 2 mM Phosphocreatin und 24 Einheiten/ml Kreatinphosphokinase inkubiert. Die Reaktion wurde durch 10 ml (Gew./Vol.) 100% Trichloressigsäure beendet. Nach Zentrifugation zur Entfernung des Präzipitats wurden 10 ml jedes Reaktionsgemisches auf eine Dünnschicht- Chromatographie (TLC)-Platte (Polygram Cel 300 PEI, Macherey-Nagel, Düren, West- Deutschland, U.S. Distributor Sybron/Brinkman, Westbury, NY) getüpfelt Die TLC- Platte wurde in 1,5 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 3,65 etwa 2 Stunden entwickelt, einer Autoradiographie unterzogen, und die Flächen der TLC-Platte, die GTP und Cyclo-di- GMP entsprachen, wurden ausgeschnitten und in einem Szintillationszähler ausgezählt.

Durchmusterungstest

Um die Wiederherstellung der Cellulosesynthase-Aktivität zu beobachten, muß ein Stamm isoliert werden, der Cellulosesynthase-negativ und Diguanylatcyclase-positiv ist. Der folgende Durchmusterungstest ist eine Modifikation des vorstehend beschriebenen Cellulosesynthase-Aktivitätstests und kann zur Bestimmung von Mutationen unter Beteiligung von zwei verschiedenen Enzymen durch Vergleich der Cellulosesynthase- Aktivitat in Gegenwart oder Abwesenheit von GTP oder c-di-GMP verwendet werden. Der Test mißt die Celluloseproduktion von suspendierten, beschallten Zellen.
Mutierte Acetobacter-Stämme wurden durch Testen von beschallten Zellen unter mehreren verschiedenen Bedingungen klassifiziert. Drei Klassen von Acetobacter- Mutationen wurden identifiziert. Klasse I-Stämme (Cellulosesynthase-negativ) produzierten unter allen Testbedingungen keine Cellulose. Klasse II-Stämme (Diguanylatcyclase-negativ) produzierten Cellulose in Gegenwart von c-di-GMP, aber nicht in Gegenwart von GTP. Klasse III-Mutanten produzierten Cellulose nach der Aktivierung durch entweder GTP oder c-di-GMP. Mutanten in Klasse II und III enthalten Cellulosesynthase und zeigen in vitro eine Aktivität, aber produzieren in vivo wenig oder keine Cellulose. Der Mangel bei den Klasse III-Mutanten wurde biochemisch nicht definiert.
Der Durchmusterungstest wurde wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 1) kein Zusatz von Nucleotid; 2) Zusatz von 0,4 mM GTP; und 3) Zusatz von 5 µM c-di-GMP.
Außer der Quelle des Enzyms und des verwendeten Puffers waren das Testverfahren und die Kontrollen, wie vorstehend bei dem Cellulosesynthase-Aktivitätstest beschrieben.
Sechs mutierte Acetobacter-Stämme wurden in einem einzelnen Durchmusterungstest getestet. Jedesmal wurde ein Acetobacter-Stamm mit sowohl Cellulosesynthase-Aktivität als auch Diguanylatcyclase-Aktivität eingeschlossen, um eine Übereinstimmung zwischen den Tests zu überwachen.
Die ausgewählten Acetobacter-Stämme wurden etwa 24 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Das Wachstumsmedium enthielt R70-2, 1% Ambrex 1003 (TYE, Universal Foods, Milwaukee, WI), 4% Fructose, 0,01% Vol./Vol. Dow Corning Antifoam B und 50 mM 3,3-Dimethylglutarsäure (DMG), pH 5,0 und 25 ml Medium wurden in 125 ml Schüttelkolben mit Schikanen mit den Zellen aus den gefrorenen Impffläschchen inokuliert. Vor der Gewinnung der Zellen wurden R70-2 + 0,5 % TYE- und 1 % Glucose- Agarplatten ausgestrichen, um auf Kontamination zu kontrollieren. Die Platten wurden bei 30ºC etwa 3 Tage inkubiert.
Vor der Gewinnung der Zellen wurden 5 ml 0,6 M EDTA dem Medium zugesetzt, um ein Verklumpen zu verhindern. Die Zellen wurden zentrifugiert (5000 UpM, 10 min, JA21-Rotor)) und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 26 ml 50 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 6,0 suspendiert, und 5 ml 5 M NaCl wurden zugesetzt, um das Verklumpen zu verringern.
Die Zelldichte wurde mit einem Klett-Meter (10 Klett-Einheiten "KU" = etwa 40 mg Zellen/ml) gemessen. Die Zellen wurden erneut zentrifugiert (5 K UpM, 10 min, JA21-Rotor), und der Überstand wurde verworfen. Die Pellets wurden mit 20 mg Zellen/ml in 50 mM N-(2-Hydroxyethyl)piperazin, N'-3-Propansulfonsäure (EPPS, Sigma)-Puffer, pH 7,5 suspendiert.
Um die Zellen zu beschallen, wurden 0,5 ml jeder Zellsuspension in ein 1,5 ml- Eppendorf-Zentrifugenröhrchen überführt. Jedes Röhrchen wurde in einem Cup- Beschallungsgerät (Branson Sonic Power Co., Modell 350, Plainview, NY) 1 min mit 80% Arbeitszyklus und einer Einstellung von 7 beschallt. Der Test wurde, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, wobei 50 µl beschallte Zellsuspension für jedes Teströhrchen verwendet wurden, 50 mM EPPS, pH 9,0 statt 50 mM Tris verwendet wurden, das 1 mM EDTA weggelassen wurde und statt 10 mM MgCl&sub2; 20 mM MgCl&sub2; zugesetzt wurde. Alle Testbedingungen wurden verdoppelt und die doppelten Ansätze wurden bei den Rechnungen als Durchschnittswerte genommen.
Mehrere Cel&supmin;-Stämme wurden biochemisch charakterisiert. Es wurde gefunden, daß der Stamm 1306-24 (abgeleitet von 1306-3) eine normale Diguanylatcyclase-Aktivität hatte, aber in der Cellulosesynthase-Aktivität defekt war. Die Stämme 1306-42 (abgeleitet von 1306-21) und C90-1 (abgeleitet von 1306-21) waren sowohl in der Diguanylatcyclaseals auch der Cellulosesynthase-Aktivität defekt. Diese Stämme wurden für die anschließenden Untersuchungen abgenommen.

Beispiel III

Konstruktion eines Cosmidvektors und Konjugationsverfahren

Ein neuer Cosmidvektor, pKT230cos5 wurde, wie in Figur 2 zusammengefaßt, für die Clonierung eines Cellulosesynthase-Gens konstruiert. Der Vektor enthält ein Streptomycin-Resistenzgen (Sm), das cos-Fragment des Phagen Lambda und Clonierungsstellen zur Insertion von Fremd-DNA.
Ein 1,85 kb DNA-Fragment, das die Lambda cos-Stelle enthielt, wurde aus dem Plasmid pVK100 (Knauf und Nester (1982) Plasmid 8:45-55) durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym BglII herausgeschnitten und in die BamHI-Spaltstelle in dem Plasmid pUC19 (New England Biolabs Catalog) cloniert. Das neue Plasmid pUC19cos2 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und XmaI gespalten, und das HindIII-XmaI-Fragment, das das 1,85 kb cos-enthaltende Fragment enthielt, wurde in das XmaI- und HindIII- gespaltene Plasmid pKT230 cloniert, wodurch das Kanamycin-Resistenzgen inaktiviert wurde. Der so erhaltene Vektor, das Cosmid pKT230cos5 ist von E. coli in Acetobacter nicht selbst übertragbar. Daher ist ein Helferplasmid, pRK2013, notwendig, um den Transfer von pKT230cos5 von den Donorzellen in die Empfängerzellen des Acetobacter- Stammes 1306-24 zu mobilisieren. Der E. coli-Stamm MM294, der mit pKT230cos5 transformiert worden war, wurde bei 37ºC in R2-Medium (20,0 g Trypton, 10,0 g Hefeextrakt, 10,0 g NaCl, 1,0 l destilliertes H&sub2;O, pH 6,9 plus g/l Glucose (R2-4) und gegebenenfalls 15 g/l Bacto-Agar), das 100 µg/ml Sm enthielt, bis zu einem Klettwert von 150 KU gezüchtet. Der E. coli-Stamm HB101, der das Mobilisierungsplasmid pRK2013 enthielt, wurde bei 37ºC in R2-4-Medium, das 50 µg/ml Km enthielt, bis zu einem Klettwert von 150 KU gezüchtet. Die Acetobacter-Empfängerzellen 1306-24 wurden bei 30ºC in R20-2-Medium bis zu einem Klettwert von 200 KU gezüchtet. Ein mi jeweils der Donor-, Mobilisierungszellen und 2 ml Empfängerzellen wurden vermischt und durch ein 0,2 Micron-Einwegfilter von Gelman (Gelman, Ann Arbor, MI) filtriert und zweimal mit 10 ml R2-Medium ohne Antibiotika gewaschen. Das Filter wurde auf Agarplatten, die R2- 4-Medium enthielten, gelegt. Die Platten wurden bei 30ºC 3 Stunden inkubiert, um das Eintreten einer Verpaarung zu erlauben. Nach der Verpaarung zwischen den drei Stämmen wurde das Konjugationsgemisch in 2 ml 0,9% Natriumchlorid resuspendiert. 0,1 ml dieser Lösung wurden auf Agarplatten aus R20-2-Medium, die 50 µg/ml Sm und 20 µg/ml Cm enthielten, plattiert. Die Platten wurden 5 Tage bei 30ºC inkubiert. Der Acetobacter- Stamm 1306-24 ist natürlicherweise resistent dagegen 20 µg/ml Cm, während E. coli- Stämme dagegen empfindlich sind. Daher wuchsen nur Acetobacter-Kolonien, die das Donorplasmid erworben hatten, auf diesen Selektionsplatten. Die anschließende Restriktionsanalyse zeigte, daß das Cosmid pKT203cos5 keine Umordnungen in dem Acetobacter-Stamm 1306-24 erhalten hatte.

Beispiel IV

Konstruktion einer Acetobacter-DNA-Bank

Der Lambda-Phage verpackt DNA mit einer Länge von 38 bis 52 kb, sofern cos- Stellen an beiden Enden vorhanden sind. Da der Vektor pKT230cos5 relativ klein war (13,5 kb), konnte eine große Menge Acetobacter-DNA (28 bis 37 kb) insertiert und in Lambda-Phagen-Teilchen verpackt werden. Unter der Annahme, daß die Genomgröße von Acetobacter der von E. coli äquivalent ist, gelten nur 700 bis 1000 Clone als für eine vollständige Genbank notwendig. Die DNA-Banken wurden aus dem Acetobacter-Stamm 1306-3 wie folgt konstruiert.
Etwa 26 mg Nucleinsäure wurden aus den Rasen von Acetobacter 1306-3 auf R20- 2 Agarplatten isoliert. Diese Nucleinsäure wurde mit Rnase A und Rnase T1 behandelt, um die RNA in der Probe abzubauen. Eine Gesamtmenge von 560 µg DNA wurde gewonnen. Diese DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A mit vier verschiedenen Enzymkonzentrationen teilweise gespalten. Die DNA wurde in einem 10-40% Saccharosegradienten größenfraktioniert. Der Anteil, der die größte Anzahl an DNA- Molekulen zwischen 27-38 kb enthielt, wurde ausgewählt (etwa 2 µg DNA).
Etwa 1 µg dieser DNA wurde in BamHI-gespaltene und dephosphorylierte pKT230cos5-DNA ligiert, und das Ligierungsgemisch wurde in Lambda-Phagen-Teilchen verpackt. Die Phagenteilchen wurden dann verwendet, um den E. coli-Stamm K802 recA&supmin;zu infizieren. Die Cosmid-DNA, die aus sechs zufälligen E. coli-Isolaten isoliert wurde, wurde verwendet, um die Größen der insertierten DNA-Fragmente zu bestimmen. Die sechs Clone hatten DNA-Insertionen im Bereich von 8 bis 40 kb mit einer Durchschnittsgröße von 28 kb. Etwa 2000 Clone wurde abgenommen, einzeln in Mikrotiterplatten gezüchtet und tur weitere Durchmusterungstests aufbewahrt. Die Bank wurde als pKT230cos5:1306-3M bezeichnet.

Beispiel V

Identifizierung und Isolierung von clonierter DNA, die die Cellulosesynthase-Aktivität in Cellulose-negativen Acetobacter-Stämmen wiederherstellte

Ein genetischer Komplementationstest zur Wiederherstellung der Cellulosesynthase-Aktivität wurde verwendet, um Cosmid-DNA zu isolieren, die Cellulosesynthase-Aktivität in den Cel&supmin;-Acetobacter-Mutanten wiederherstellen kann.

Durchmustern der Acetobacter-Genbank mittels Konjugationen

Cosmide aus der Genbank pKT230cos5:1306-3A2 (erhalten,wie in Beispiel IV beschrieben) wurden in den mutierten Acetobacter-Empfängerstamm 1306-24 zum Durchmustern unter Verwendung des Mobilisierungsplasmids pRK2013 in einem Mehrfach ("multiple spot")-Konjugationsverfahren, wie nachstehend beschrieben, überführt.
Der Acetobacter-Stamm 1306-24 wurde in einem 20-2-Medium bei 30ºC unter Schütteln etwa 28 Stunden bis zu einem Klettwert von 100-150 KU gezüchtet. E. coli HB101/pRK2013 wurde in R2-4-Medium mit 50 µg/ml Kanamycin (Km) bei 37ºC unter Schütteln bis zu einem Klettwert von 100-150 KU gezüchtet. E. coli K802 recA&supmin;(pKT230cos5:13060-3A2)-Kulturen wurden aus gefrorenen Mikrotiterplatten mit einer abgeflammten Öse in Mikrotiterplatten, die 100 µl R2-4-Medium plus 50 µg/ml SM enthielten inokuliert und bei 37ºC ohne Schütteln etwa 18 Stunden inkubiert. Die E. coli HB101/RK2013-Kultur wurde herunterzentrifugiert, mit einem gleichen Volumen von 0,9% Salzlösung gewaschen, um das Km zu entfernen, erneut herunterzentrifugiert und durch Suspendieren in einem Zehntel des Ursprungsvolumens der Salzlösung konzentriert. Ein 10µl-Volumen dieses E. coli HB101/pRK2013-Konzentrats wurde jeder Mikrotiter- Vertiefung, die 100 µl an 18stündiger E. coli K802 recA&supmin;pUT230cos5:1306-3-A2-Kultur enthielt, zugesetzt. 10 µl-Volumina der vermischten HB101/pRK2013- und K802 recS&supmin;pUT230cos5:1306-3-A2-Kulturen wurden auf trockene 150 mm-R2-4-Platten unter Verwendung einer 8-Kanal-Pipette und in einer Anordnung entsprechend dem Muster von Mikrotiter-Vertiefungen getüpfelt, so daß der Donor jedes Transkonjuganten bis zu seiner Lokalisation in der E. coli-Cosmidbank zurückverfolgt werden konnten. Sobald die Flecken trocken waren, wurden weitere 10 µl jeder Mischkultur über den ursprünglichen Fleck geschichtet, und man ließ sie trocknen. Dies wurde wiederholt, bis 50 µl jeder Mischkultur aufgebracht waren. Die Acetobacter 1306-24-Kultur wurde herunterzentrifugiert und in einem Zehntel des Ausgangsvolumens an 0,9%iger Salzlösung resuspendiert. Eine 10 µl-Menge dieser konzentrierten Kultur wurde über jeden HB101/pRK2013- und E. coli K802 recA&supmin;-Fleck auf den R2-4-Platten mit der 8-Kanal- Pipette geschichtet. Man ließ die Flecken trocknen, und dann wurden die Konjugationsgemische bei 30ºC auf der R2-4-Platte 3 Stunden inkubiert.
Um zu bestimmen, welche Transkonjuganten Cellulose produzierten, wurde jedes der Paarungsgemische von den Paarungsplatten mit einem sterilen Zahnstocher abgekratzt und direkt in 2 ml R70-2-Medium, das 0,5% TYE, 3% Glucose, 25 mM DMG, 20 µg/ml Cm und 50 µg/ml Sm enthielt, in 13 x 100 mm-Röhrchen inokuliert ("Teströhrchenauswahl-Durchmusterung"). Das Antibiotikum Cm hemmt das Wachstum von E. coli Donor- und Helferstammzellen. Das Antibiotikum Sm hemmt das Wachstum des Acetobacter-Stammes 1306-24, der kein Cosmid erhalten hatte. Die Röhrchen wurden bei 30ºC inkubiert und auf Hautbildung am Tag 7 und Tag 14 überprüft. Dieses Verfahren erlaubte die Sichtbarmachung jeder Cellulose, die die Transkonjuganten produziert hatten.
Unter Verwendung des Mehrfachspot-Konjugationsverfahrens, das vorstehend für den Cosmidtransfer und die Teströhrchenauswahl-Durchmusterung auf Celluloseproduktion beschrieben worden war, wurden 487 Cosmide aus der Bank pKT230cos5:1306-3A2 für die Paarungen mit der Acetobacter-Cellulosesynthase-Mutante 1306-24 verwendet. Von diesen Konjugationen zeigten 386 einen erfolgreichen Cosmidtransfer. Drei dieser Paarungsgemische bildeten ein Häutchen bei der Standteströhrchen-Durchmusterung nach 14tägiger Inkubation bei 30ºC. Diese drei Cosmid-Donorkulturen wurden als T19G9, T20A1 und T20B6 bezeichnet.
Keine der Transkonjuganten-Kolonien, die sich bildeten, als diese Konjugationsgemische direkt plattiert wurden, zeigten einen Cel&spplus;-Phänotyp. Nur wenn Konjugationsgemische in Standteströhrchen inokuliert wurden, konnte Celluloseproduktion nachgewiesen werden. In späteren Untersuchungen wurde beobachtet, daß die Wiederherstellung der Cel&spplus;-Aktivitat eine Folge der Rekombination und nicht der echten Komplementation war. Dies könnte die Notwendigkeit nach einem Durchmustern unter Verwendung der Teströhrchenauswahl statt nur auf das Plattierungsprotokoll zu vertrauen, erklären.

Bestatigung der Wiederherstellung der Cellulosesynthase-Aktivität in Filterpaarungen

Die Cosmide T19G9, T20Al und T20B6, deren 1306-24-Transkonjuganten ein Häutchen bei der Teströhrchenauswahl-Durchmusterung, wie vorstehend beschrieben, produzierten, wurden weiter in Transfers getestet, die durch das Filterkonjugationsverfahren mit Acetobacter 1306-24 (Empfänger), E. coli HB101pRK2013 (Helferplasmidstamm) und E. coli pKT203cos5:1306-3A2 T19G9, -T20A1 und -T20B6 (Donorstämme) gemäß dem Verfahren in Beispiel III durchgeführt wurden.
100 µl der Paarungsgemische wurden für eine Teströhrchenauswahl- Durchmusterung inokuliert. Die Konjugationshäufigkeit dieser Konjugationen wurde durch Plattieren von Reihenverdünnungen der Paarungsgemische direkt nach der Konjugation auf R20-2-Platten, die 20 µg/ml Cm und 40 µg/ml Sm enthielten, bestimmt. Als negative Kontrolle wurde der Vektor pKT203cos5, der parallel mit diesen Konjugationen in 1306- 24 transferiert worden war, plattiert und in Teströhrchen inokuliert. Diese 1306-24 pKT230cos5-Transkonjuganten bildeten bei der Standteströhrchen-Durchmusterung keine Häutchen und dienten als Kontrolle, um zwischen Cel&supmin;-Wachstum und Häutchenbildung in Standteströhrchen zu unterscheiden. Von diesen drei vorstehend angegebenen Cosmiden ergab nur das Cosmid PKT230cos5:1306-3A2-T19G9 positive Ergebnisse, i.e. wandelte den Stamm 1306-24 von Cel&supmin; in Cel&spplus; bei der Standteströhrchen-Durchmusterung um. Die Häufigkeit der Konjugation des Cosmids T19G9 betrug 7,0 x 10&supmin;&sup8; pro Empfängerzellen.

Beispiel VI

Konstruktion von Cosmiden die das Cellulosesynthase-Gen B in verkürzter Form und in voller Länge enthalten

Die Konjugation zwischen E. coli, der pKT230cos5T19G9 enthielt, und Acetobacter 1306-24 wurde auf einem Filter durchgeführt. 100 µl des Konjugationsgemisches wurde für eine Teströhrchenauswahl-Durchmusterung) wie vorstehend beschrieben) inokuliert. Nach 7 Tagen bildete sich in dem Teströhrchen ein Häutchen, das in einem Mischgerät mit 25 ml 0,9% NaCl vermischt wurde. Die so erhaltene Suspension wurde für Einzelkolonien auf einer R20-2-Platte, die 20 µg/ml Cm und 40 µg/ml Sm enthielt, ausgestrichen. Eine Cel&spplus;-Kolonie wurde abgenommen und als 1306-24 T19G9#106 bezeichnet. Das aus 1306-24 T19G9#106 isolierte Cosmid hatte eine Länge von 16,6 kb. Wenn E. coli-Stämme K802 recA&supmin;, die T19G9#106 enthielten, als Cosmiddonor in Konjugation mit 1306-24 als Empfänger verwendet wurden, zeigten Acetobacter-Transkonjuganten einen Cel&spplus;-Phänotyp in 100% der Teströhrchen in der Testauswahl-Durchmusterung. Daher konnten die 16,6 kb-Cosmide die Cellulosesynthase- Aktivität in den Cel&supmin;-Mutanten von 1306-24 wiederherstellen. Die Restriktionsanalyse zeigte, daß T1969#106 ein Deletionsprodukt von T19G9 war. Die Nucleotidsequenzanalyse nach Clonierung des intakten Gens bestätigte, daß das Cosmid T1G9#106 ein verkürztes Cellulosesynthase-B-Gen enthielt, bei dem die Deletionsstelle 142 bp 3' von der einzigartigen BamHI-Spaltstelle in der Codierungsregion des Gens lokalisiert war.
Bei einer Southern-Hybridisierung hybridisierte ein 1,8 kb-BamHI-SmaI-Fragment aus dem Cosmid T19G9 stark mit Oligosonde MK172 (dessen Sequenz erstreckt sich von dem Nucleotid 4564 bis 4582 in Figur 1). Wenn das Molekulargewicht der Cellulosesynthase nicht größer als 120 kd ist, sollte das 1,8 kb-BamHI-SmaI-Fragment das 3'-Ende des Gens enthalten. Um diese Hypothese zu bestätigen, wurde ein Plasmid, das ein Cellulosesynthase-Gen in voller Länge enthielt, in einer dreistückigen Ligierung wie folgt konstruiert.
Der Cosmidvektor pKT230cos5 wurde zuerst mit BamHI gespalten, und die Enden wurden mit dem Klenow-Enzym in Gegenwart aller vier Desoxyribonucleotidtriphosphate repariert. Die DNA wurde weiter mit HindIII gespalten. Ein 3,5 kb-BamHI-SmaI- Fragment aus T19G9, das das 3'-Ende des Cellulosesynthase-Gens enthielt, und das HindIII-BamHI-Fragment aus T19G9#106, das das 5'-Ende des Cellulosesynthase-Gens enthielt, wurden in den HindIII-BamHI-behandelten, reparierten Vektor pKT230cos5 ligiert, um TRT18-1 zu konstruieren. Die Konstruktion für TRT18-1 ist in Figur 3 gezeigt.

Beispiel VII

In vitro-Cellulosesynthase-Aktivität in Cellulose-positiven Transkonjuganten

Eine 3kb-Region der genomischen Acetobacter-DNA (Cosmid T19G9#106) konnte einen Cel&spplus;-Phänotyp in dem Acetobacter-Stamm 1306-24 wiederherstellen (Beispiel VI). Das vorliegende Beispiel beschreibt den Erhalt der Cellulosesynthase- Aktivität in dem transkonjugierten Acetobacter-Stamm 1306-24. Der verwendete Test wurde als der Durchinusterungstest in Beispiel II beschrieben.
Die Kontrollen bestanden aus dem Acetobacter-Stamm 1306-3 (Cel&spplus;) und dem Stamm 1036-24 (Cel&supmin;), die jeweils den Vektor pKT230cos5 enthielten. Der Cel&spplus;-Stamm 1306-24 T19G9#106 ("der Transkonjugant") enthielt ein 3 kb-Fragment der genomischen Acetobacter-DNA in dem Vektor pKT230cos5. Die Zellen wurden, wie in Beispiel II beschrieben, gezüchtet, wobei 50 mg/l Sm und 20 mg/l Cm zugesetzt wurden. Die Zellen wurden gewonnen, von der Cellulose abgetrennt, gewaschen, konzentriert und, wie vorstehend beschrieben, beschallt. Die in vitro-Cellulosesynthase-Aktivität wurde gemessen, und ein von Pierce (Chemical Company, Rockford, IL) entwickelter BCA (Bicinchoninsäure)-Proteintest wurde verwendet, um die Proteinkonzentration der beschauten Zellpräparate zu messen. Die Stämme wurden in einer Konzentration von 2 mg Zellen/ml getestet. Die Stämme 1306-24 pKT230cos5 und 1306-24 T19G9#106 wurden ebenfalls in einer Konzentration von 5 mg Zellen/ml gemessen, um einen möglichen Konzentrationseffekt zu überprüfen.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurden die Cellulosesynthase-Aktivitäten der Stämme 1306-24 pKT230cos5 und des Transkonjuganten 1306-24 von der Zellkonzentration des Tests nicht beeinflußt. Die Aktivität von 1306-3 pKT230cos5 war ähnlich der Aktivität des Stamms 1306-21 (nicht gezeigt). So scheint der VektorpKT230cos5 die Cellulosesynthase-Aktivität nicht zu beeinträchtigen. Der Stamm 1306-24 zeigte einen niedrigen Gehalt an Cellulosesynthase-Aktivität nach Aktivierung durch c-di-GMP. Dies trifft auf die meisten Klasse 1 (Cellulosesynthase-negativ)-Acetobacter-Mutanten zu. Obwohl die Mutation in der Cellulosesynthase-Aktivität in vitro etwas durchlässig zu sein scheint, scheinen die Zellen sehr wenig Cellulose in vivo (in Schüttelkolben) zu produzieren. Die 3 kb-Insertion erhöhte die Cellulosesynthase-Aktivität des Stamms 1306- 24 etwa 10fach (0,4 bis 4,1 nmol/min mg) bei einer Konzentration von 5 mg Zellen/ml in dem Teströhrchen Dies korrelierte mit dem Auftreten des Cellulose-positiven Phänotyps.
Der Transkonjugantenstamm 1306-24 hatte die gleiche c-di-GMP-stimulierte Aktivität wie der Cellulose-positive Stamm 1306-3.
Die Ergebnisse für TRT18-1, die in einem separaten Experiment unter Verwendung geeigneter Kontrollen bestimmt wurden, bestätigten, daß dieses Plasmid einen Cel&supmin;-Phänotyp in Cel&spplus; umwandeln konnte und zweitens, daß bei den in vitro-Tests die Aktivität des Enzyms vergleichbar mit derjenigen war, die für die pKT230cos5- Vektoren beobachtet wurde, die die T1969#106 DNA-Insertion von 3 kb von Acetobacter wie in Tabelle 1 gezeigt, enthielten. Tabelle 1

Beispiel X

Clonierung eines endogenen 3,5 kb- Plasmids aus dem Acetobacter-Stamm

Der im Besitz von Cetus Corporation befindliche Stamm Acetobacter CMCC824, der ein celluloseproduzierender Stamm ist und aus einer Essigkultur (CMCC824) isoliert wurde, enthält ein 3,5 kb-Plasmid. Um dieses Plasmid zu isolieren, wurde eine einzelne Kolonie von einer R20-2-Platte in 50 ml R20-2 inokuliert und ohne Schütteln bei 30ºC 48 Stunden gezüchtet. Das Häutchen wurde zweimal in 100 ml 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8,0 gewaschen, in einem Beckman-Mischgerät homogenisiert und durch ein Preßtuch filtriert. Die Zellen wurde pelletiert, und die Plasmid-DNA wurde nach einem modifizierten SDS-Lyseverfahren gemäß Guerry et al. (1973) J. Bacteriol. 116:1064-1066 hergestellt. Von den getesteten Restriktionsenzymen konnte nur SacI dieses Plasmid linearisieren.
Das SacI-gespaltene Plasmid wurde in das Sad-gespaltene Plasmid pUC18 (New England Biolabs) zur Clonierung in E. coli ligiert. Dieser Schaukelvektor wurde als pUC 18-824 bezeichnet. Um pUC18-824 physikalisch zu kartieren, wurde das Plasmid mit einer Vielzahl von Restriktionsendonucleasen gespalten. Eine Restriktionskarte von pUC18-824 ist in Figur 4 gezeigt.

Beispiel XII

Konstruktion von pUC 18-824, das das Cellulosesynthase-B-Gen enthält

Das Cellulosesynthase-B-Gen kann aus dem Plasmid TRT181 isoliert werden, dessen Konstruktion in Beispiel VI gelehrt wird oder in einer anderen Ausführungsform, da die Nucleotidsequenz dieses Gens hier angegeben ist, kann das Gen in voller Länge direkt chemisch synthetisiert werden oder aus der konstruierten Genbank unter Verwendung eines Primers erhalten werden. Beispielsweise wurde das Primer- Oligonucleotid MK170 (TGCCCTGGCCAGATGTCAGCA) verwendet, um die 1760 einzelnen Kulturen aus der konstruierten Genbank zu durchmustern und sechs Clone wurden zur weiteren Charakterisierung isoliert. Drei Cosmide, die aus drei dieser Clone isoliert wurden, wurden als T5A1, TIC2 und T5D2 bezeichnet.
Das 8,3 kb-SmaI-Fragment, das das Cellulosesynthase-B-Gen und etwa 3 kb stromaufwärtige Sequenz (vergleiche Restriktionskarte in Figur 5) enthielt, wurde in die SmaI-Spaltstelle von pUC18-824 cloniert. Die erhaltenen Plasmide, die das 8,3 kb SmaI-Restriktionsfragment in entgegengesetzten Orientierungen enthielten, wurden als pUC18-824 FS-1 bzw. pUC18-824 FS-6 bezeichnet. Eine Restriktionskarte von FS-6 wird in Figur 6 bereitgestellt. Wenn ein solches Plasmid in 1306-24 (ein Cellulosesynthasedefizienter Stamm), 1306-42 und C90-1 (beide sind bezüglich der Diguanylatcyclase und Cellulosesynthase-Aktivitäten defizient) transformiert wurde, zeigten die Transformanten den Cel&spplus;-Kolonie-Phänotyp auf den Platten. Daher wurde im Gegensatz zu den "Rekombinationsereignissen", die bei den früheren Experimenten beobachtet wurden, gefolgert, daß das von der 8,3 kb-Acetobacter-DNA-Insertion codierte Protein direkt die Cellulosesynthase-Mutationen in den Mutanten komplementieren kann.
In vitro-Tests bestätigen die Fähigkeit der Plasmide pUC 18-824 FS-1 und pUC18- 824 FS-6, die Cellulosesynthase-Aktivität in dem Cellulosesynthase-negativen Mutantenstamm 1306-24 wiederherzustellen. Der in vitro-Cellulosesynthase-Test der Transformanten und der Kontrollstämme wurde, wie in Beispiel VII beschrieben, durchgeführt. Wie in Tabelle 3 gezeigt, zeigten die Transformanten 1306-24 pUC 18-825 FS-1 und 1306-24 pUC18-824 FS-6 spezifische Cellulosesynthase-Aktivitäten, die höher als die des ursprünglichen Cel&spplus;-Ausgangsstamms 1306-3 (1,3x bzw. 1,8x) waren. Tabelle 3

Beispiel XIII

Konstruktion eines Expressionsvektors in Acetobacter

Das Plasmid pUC19 (New England Biolabs) wurde mit dem Restriktionsenzym Sad gespalten. Das linearisierte Plasmid wurde mit dem SacI-gespaltenen Acetobacter- Plasmid 824 ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pUC19-824 bezeichnet. Das Cellulosesynthase-Gen aus dem 8,3 kb SmaI-Fragment wurde als HindIII-SmaI-Fragment (i.e. 4,9 kb) in die HindIII-SmaI-Spaltstellen in der Linker-Region des pUC19-Plasmids cloniert (siehe Figur 8), so daß dessen Transkriptionsrichtung identisch mit der des lac- Promotors war. Diese Konstruktion stellte das Gen unter die Kontrolle des lac-Promotors in Acetobacter. Dieses Plasmid wurde als pall bezeichnet.
Das Plasmid pAL1 wurde zur Transformation des Acetobacter-Stamms 1306-24 verwendet, und es wurde gezeigt, daß es den Cellulosesynthase-defizienten Phänotyp komplementiert, wobei das Ergebnis ein Cel&spplus;-Phänotyp auf den Platten ist.

Beispiel XIV

Identifikation des Cellulosesynthase-Operons

A. Lokalisation der Transkriptionsinitiationsstelle

Primer-Extension: Das Oligodesoxyribonucleotid GE13 (5'- TGCGGCGATAAGTGCACA-3') wurde mit Gamma-³²P-ATP und T4 Polynucleotidkinase markiert. Das nicht eingebaute Nucleotid wurde durch Ethanolfällung entfernt. Das markierte Oligodesoxyribonucleotid wurde in 100 µl 0,3 M NaOAc-Lösung resuspendiert. Die spezifische Aktivität des Primers betrug etwa 4 x 10&sup6; CpM/pmol. Der markierte Primer (0,02 und 0,2 pmol) wurde zur Primer-Extensionsanalyse verwendet.
Die Primer-Extensionsanalyse zeigte, daß die Transkriptionsinitiationsstelle in der Region 5' des ersten Gens in dem Cellulosesynthase-Operon lokalisiert war. Die Transkriptionsinitiationsstelle des Operons ist mit einem abwärts gerichteten Pfeil über dem Nucleotid 235 in Figur 1 markiert.

B. Clonierung der Gene C und D

Die Konstruktion von pABCD ist in Figur 8 dargestellt.

C. Sequenz und Struktur des Cellulosesynthase-Operons

Die Nucleotidsequenz der Region von pABCD ist in Figur 1 gezeigt. Das Cellulosesynthase-Operon besitzt eine Länge von 9217 bp und besteht aus vier Genen. Die Gene A, B, C und D besitzen eine Länge von 2262 hp, 2406 bp, 3957 bp bzw. 468 bp. Die Molekulargewichte, die bestimmt wurden, und die vorgeschlagenen Rollen der Genprodukte sind wie folgt:
Eine Computeranalyse der DNA-Sequenzen am 3'-Ende des D-Gens zeigte eine Region mit dem Potential zur Bildung einer stabilen Stamm- und Schleifenstruktur. Wie in Figur 1 durch den unterstrichenen Abschnitt gezeigt, ist diese Region 26 bp 3' des Terminationscodons des D-Gens positioniert und entspricht einer Transkriptionsterminatorregion des Operons.

Beispiel XV

Zellwachstum, Celluloseproduktion und Cellulosesynthase-Aktivität in rekombinanten Stämmen

A. Untersuchungen mit 1306-21 pUC 18-824 pABCD

Bei dieser Untersuchung wurde die Überexpression von Cellulosesynthase- Aktivität in 1306-21 pABCD in Schüttelkolben-Experimenten getestet. Die Konstruktion von 1306-21 pABCD war der Konstruktion von 1306-3 pABCD ähnlich (vergleiche Beispiel XIV). Das Kulturmedium für alle Stadien des Experiments war R70-2 mit 10 µM FeCl&sub3;, 1% TYE, 25 mM DMG und 4% Glucose (1306-21) oder 4% Fructose (1306-3). Das Anzuchtmedium enthielt 0,1% Cellulase. Ampicillin wurde in einer Konzentration von 50 µg/ml dem zur Züchtung von plasmidhaltigen Kulturen verwendeten Medium zugesetzt. Das Medium wurde in 125 ml-Kolben mit Schikanen verteilt, wobei pro Kolben 25 ml zugeteilt wurden. Die Stämme 1306-21, 1306-21 pUC 18-824 (der Wirtsstamm plus der Schaukelvektor), 1306-21 pUC18-824 pABCD (normal -- Phänotyp wie Ausgangszelle) und 1306-21 pUC18-824 pABCD (spitz -- sein Wachstum auf Platten war erhöht und spitzer zulaufend als das der Ausgangszellen) wurden individuell getestet. Jede Kultur wurde auf eine Konzentration von 0,72 g/l (Trübheit 1,8 OD&sub6;&sub8;&sub0;) unter Verwendung steriler Salzlösung eingestellt. Die Testkolben wurden in 0,2 ml Anzuchtkultur (2% Vol./Vol. Inokulum) inokuliert. Sechs Kolben jedes Stammes wurden inokuliert und bei 30ºC, 125 UpM, 2-Inch-Ausschlag inkubiert. Die Kolben wurden nach eins, zwei und fünf Tagen abgeerntet. Die Duplikatkolben wurden zu jedem Zeitpunkt zu Zellmasse- und Cellulosemessungen abgeerntet. Zusätzlich wurden die Kulturen aus den Fünf-Tages- Kolben auf Plasmidretention durch Beobachtung der Antibiotikaresistenz auf den Platten (Patchtest) überprüft. Dreißig Kolonien wurden für jeden Stamm getestet.
Um die Celluloseproduktion und die Zellkonzentration zu messen, wurde der Kolbeninhalt jeder Probe in einen 100 ml-Becher überführt. Die Suspension wurde dann eine Minute mit einer großen Tekmar-Sonde mit 50% der vollen Leistung aufgeschlossen. Danach wurde die Suspension mit 5000 UpM 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 15 ml Salzlösung resuspendiert und 15 Minuten unter gelegentlichem Rühren inkubiert. Die Probe wurde erneut zentrifugiert, und der vorstehende Waschschritt wurde wiederholt.
Das Pellet aus dem zweiten Waschschritt wurde in 15 ml 0,1 N NaOH resuspendiert und bei 60ºC unter leichtem Schütteln 60 Minuten inkubiert. Die Suspension wurde zentrifugiert und der NaOH-Überstand wurde verwendet, um die Zellkonzentration zu analysieren, während das Pellet zur Analyse der Cellulosekonzentration verwendet wurde.
Das Pellet wurde in 15 ml entionisiertem Wasser resuspendiert und bei Raumtemperatur 15 Minuten unter gelegentlichem Rühren stehengelassen. Dann wurde die Probe zentrifugiert und das vorstehende Waschverfahren wurde insgesamt dreimal wiederholt. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde das Cellulosepräzipitat bei 60ºC über Nacht in einem Vakuumofen getrocknet und dann gewogen.
Der Überstand wurde mit HCl (etwa 0,05 ml HCl auf 0,5 ml Probe) neutralisiert und die Proteinkonzentration wurde nach dem Lowry-Verfahren bestimmt. Zellkonzentration = Proteinkonzentration x 1,54.
Das Zellwachstum und die Celluloseproduktion sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4
Das Cellulose-Zell-Verhältnis ist ein Indikator für die spezifische Celluloseproduktivität. In den ersten zwei Wachstumstagen ist das Cellulose-Zell- Verhältnis in den pABCD 1306-21-Stämmen signifikant höher als in den 1306-21- Kontrollstämmen. Der pABCD(spitz)-Stamm scheint mehr Cellulose zu produzieren als die pABCD(nonnal)-Stämme. Beide rekombinanten Stämme produzieren mehr Cellulose als die Kontrollstämme am Ende des Wachstums.
In den Stämmen mit dem Ampicillinmarker wurde gezeigt, daß die Plasmidstabilität der Kultur vom Tag 5 100% war. Die Retention des Markers scheint den Grad der Umordnung nicht zu beeinflussen, die bei den Cellulosesynthase-Genen auf dem Plasmid eintreten kann. Es ist möglich, daß die Stämme am Tag 5 Cellulose nicht in der gleichen Rate produzieren, die sie am Tag 1 und 2 produzierten. Den Beweis, der diese Hypothese stützt, sieht man an den Kolonie-Phänotypen aus der Plattierung von Tag 5. Der spitze Stamm von pABCD zeigte die unübliche Koloniemorphologie auf diesen Platten nicht.
Die Celluloseproduktion bei 1306-3 pUC18-824 pABCD war höher als die bei den 1306-3- und 1306-3 pUC19-824-Kontrollstämmen. Dies korrelierte mit einer Erhöhung der In vitro-Aktivität der Cellulosesynthase (vergleiche nachstehend). Das Zellwachstum war bei den beiden Stämmen ähnlich. Folglich war auch das Cellulose-Zell-Verhältnis bei 1306-3 pUC18-824 pABCD signifikant höher als bei 1306-3 allein.
Der rekombinante Stamm 1306-21 pABCD wurde ebenfalls in einem Chemap- Fermenter auf Zellwachstum und Celluloseproduktion getestet. Im Gegensatz zu der Leistungsfähigkeit, die in den Kolben beobachtet wurde, war die Leistungsfähigkeit dieses Stammes ähnlich der des Ausgangsstamms. Es wird angenommen, daß die Instabilität des rekombinanten Stamms für das Fehlen einer erhöhten Celluloseproduktion verantwortlich sein könnte. Die Überexpression der chromosomalen Cellulosesynthase-Operon-Gene würde die Instabilität des rekombinanten Stammes beseitigen.

B. Untersuchungen mit pUC18-824 FS6 (AB)

Fünfzehn Isolate von 1306-3 (Cel&spplus;), die pUC 18-824 FS6 enthielten (das den Cellulosesynthase-Promotor und die Gene A und B enthält), wurden verwendet, um sie nach einer Überexpression von Cellulosesynthase-Aktivität zu durchmustern. Die Zellen wurden gewonnen, gewaschen, suspendiert und aufgebrochen, und der Standard-In vitro- Cellulosesynthase-Test wurde, wie in Beispiel II beschrieben, durchgeführt.
Alle 15 Isolate zeigten eine In vitro-Cellulosesynthase-Aktivität, die signifikant über der des Kontrollstamms (1306-3 pUC18:824) lag. Die Aktivitäten lagen im Bereich von 1,5 bis 2,4x höher als der Kontrollstamm. Zwei der 15 durchmusterten Stämme (#302 und #303) wurden in den exponentiellen und stationären Phasen untersucht. Die Bedingungen waren denen ähnlich, die in Beispiel XV beschrieben sind, außgenommen daß Glucose durch Fructose ersetzt wurde. Wie in Tabelle 5 gezeigt, behielten am Tag 2 die Aktivitäten der Kontrollstämme 1306-3 und 1306-3 pUC 18-824 30% und 40% der Aktivität vom Tag 1 zurück, wobei die Aktivitat im Verlauf der Zeit abnahm. Am Tag 2 zeigten die Isolate #302 und #303 eine Abnahme auf 45% und 50% der Aktivität vom Tag 1, wobei ebenfalls die Aktivität im Verlauf der Zeit abnahm. Jedoch zeigten diese zuletzt genannten Stämme beide eine etwa 2x höhere Aktivität als 1306-3 am Tag 1, während die Aktivitäten etwa 3x höher am Tag 2 waren. Tabelle 5
Die Celluloseproduktion in diesen rekombinanten Stämmen war ähnlich der, wie sie für die Ausgangsstämme beobachtet wurde.
Es wurde auch beobachtet, daß die Cellulosesynthase-Aktivität in Stämmen, die ein unterbrochenes Cellulosesynthase-B-Gen enthielten, supprimiert war. Dieses Gen wurde durch die Insertion eines 1,1 kb-BamHI-Fragments, das das Streptomycin-Resistenzgen codierte, in die interne BamHI-Spaltstelle des Cellulosesynthase-B-Gens unterbrochen. Die Insertion des Streptomycin-Resistenzgens unterbrach das Cellulosesynthase-B-Gen in der Nähe seines 5'-Endes.

Beispiel XVI

Ersatz des chromosomalen Promotors

Acetobacter scheint ein sehr effizientes Rekombinationssystem zu haben, das Instabilitätsprobleme mit jeglichem Plasmid, das ein großes Segment autonomer DNA enthält, verursachen kann. Um dieses potentielle Problem zu überwinden, kann das Operon auf der chromosomalen Ebene unter Verwendung heterologer Kontrollelemente überexprimiert werden, um die Transkription des chromosomalen Cellulosesynthase-Operons zu steuern. Die Konstruktion der Plasmide pTac25-1 und pLac21-7, die heterologe Promotoren enthalten, und der intermediären Vektoren, die zu ihrer Konstruktion verwendet wurden, ist im folgenden beschrieben und schematisch in Figur 9 gezeigt.

A. Konstruktion von MP11:Pcs:LFO1

Es wurden 15 Mikrogramm pFS-1 DNA mit HindIII gespalten, wobei ein 2,5 kb- Fragment, das den Cellulosesynthase-Operon-Promotor enthielt, freigesetzt wurde. Man ließ das Spaltprodukt in einem 0,8% GTG-Agarose-Gel laufen, das 2,5 kb- Fragment, das den Promotor enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten, elektroeluiert und mit doppelsträngiger M13 MP-Phagen DNA ligiert, die zuvor mit HindIII gespalten worden war. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation des E. coli-Stamms DG98 verwendet. Die transformierten Zellen wurden auf R17-3-Platten mit Rasen von E. coli JM103 plattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Elf der so erhaltenen Phagenplaques wurden abgenommen und in 3 ml einer log-Phasen-JM103-Kultur, die 1:100 mit R2-6- Medium (5,0 g Trypton, 5,0 g Hefeextrakt, 5,0 g NaCl und 1,0 l destilliertes H&sub2;O, pH 6,9) verdünnt war, inokuliert. Diese Kulturen wurden bei 37ºC für sechs Stunden inkubiert und in Eppendoff-Röhrchen herunterzentrifugiert. Der Uberstand, der freie Phagen enthielt, wurde bei 4ºC gelagert, während Mini-Screen-DNA aus den Zellpellets durch das alkalische Lyseverfahren präpariert wurde. Die Mini-Screen-DNA wurde durch Restriktionsspaltung mit den Enzymen HindIII und BglII analysiert. Ein Clon wurde ausgewählt und als MP11 :Pcs bezeichnet. Der Überstand von diesem Clon wurde zur Infektion von JM103 verwendet. Eine 15 ml-Kultur von JM103 MP11 :Pcs wurde sechs Stunden gezüchtet, herunterzentrifugiert und einzelsträngige Phagen-DNA wurde aus dem Überstand isoliert.
Die Phagen-DNA MP11 :Pcs wurde mit dem Oligonucleotid LFO1 (5'- GAATATATAACGGAGCTCCCGGGATCCACCTGTTTTACC-3') mutagenisiert, das die Restriktionsspaltsequenzen für die Enzyme SstI SmaI und BamHI, flankiert von 12 bp Cellulosesynthase-Operon-Promotorsequenz auf jeder Seite, enthiet. Es wurde 1 pmol der einzelsträngigen Phagen-DNA MP11 :Pcs mit 10 pmol LFO1 bei 68ºC 5 min inkubiert und man ließ sie dann mit den Promotorsequenzen 30 min bei 37ºC anelieren. Die anelierten Moleküle wurden dann unter Bildung vollständiger doppelsträngiger DNAs durch Zugabe von 0,5 mM dNTPs und von 0,25 Einheitenl/µl Klenow-Fragment der DNA- Polymerase 1 verlängert. Die Extension lief bei 4ºC 30 min ab und dann bei 37ºC eine Stunde; der Ansatz wurde dann 10 min auf 68ºC erhitzt, und das Gemisch wurde zur Transformation von kompetenten JM103-Zellen verwendet.
Das Transformationsgemisch wurde mit JM103-Riesenzellen aufR2-4-Platten mit 3 ml R-17 (10,0 g n-Z-Amin, Typ A, 5,0 g NaCl, 0,04 g X-Gal in 2,0 ml DMF), 10 mM MgCl&sub2;, 0,7% Top-Agarose plattiert. Phagenplaques wurden von diesen Platten auf Nitrocellulosefilter abgezogen, und die Platten wurden bei 4ºC gelagert. Die Filter wurden bei 80ºC zwei Stunden gebacken und mit der ³²P-markierten Oligonucleotidsonde LF02 hybridisiert. LF02 enthält eine Unteranordnung der Sequenz des Oligonucleotids LFO1, das zur Mutagenese verwendet wurde; die drei Restriktionsspaltsequenzen mit nur 2 bp Cellulosesynthase von LF02 lauten 5'-GGGAGCTCCCGGGATCCAC-3'. Die Hybridisierung wurde bei 58ºC durchgeführt. Die Filter wurden bei 58ºC mit aufeinanderfolgenden 5minütigen Waschungen von 5x SSC, 2x SSC und 2x SSC mit 0,1% SDS durchgeführt. Ein Kodak X-OMAT AR-Film wurde 60 Stunden den Filtern exponiert. Nach 60 Stunden erschienen auf dem entwickelten Film dunkle Flecken, die den noch auf den Platten vorhandenen abgezogenen Plaques entsprachen. Es wurden 16 Plaques, die den dunklen Flecken auf dem Film entsprachen, isoliert, und die RF-DNAs wurden durch Restriktionsspaltung mit den Enzymen HindIII, BamHI und SstI analysiert. MP11 :Pcs:LFO1 entsprach der in Figur 9 gezeigten Karte. Die eingeschleusten Restriktionsspaltstellen in MP11:Pcs:LFO1 dienen der Substitution der heterologen Promotoren. Die flankierenden Regionen dienen als Stelle für homologe Rekombination zwischen dem Plasmid und dem Acetobacter-Chromosom beim Genersatz.
Der Phagenüberstand aus der Kultur MP11 :Pcs:LFO1 wurde plaquegereinigt, erneut auf das geeignete Restriktionsmuster überprüft, dann zur Infektion und Herstellung einer doppelsträngigen, durch einen Cäsium-Chlorid-Gradienten gereinigten DNA verwendet.

B. Konstruktion von pACYC184:Pcs

Es wurden 20 Mikrogramm MP11:pcs:LFO1-DNA wurden mit 200 Einheiten HindIII gespalten,und das 2,5 kb-Fragment, das die Cellulosesynthase-Promotorregion enthielt, wurde über ein Gel gereinigt. Dieses Fragment wurde mit HindIII-gespaltenem pACY184 (New England Biolabs) ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in kompetente MM294-Zellen transformiert und auf R2-4-Platten, die Cm in einer Konzentration von 20 µg/ml enthielten, plattiert. Die Platten wurden bei 37ºC über Nacht inkubiert, und es erschienen mehr als 15000 Cm -Kolonien. Um auf Inaktivierung des Tetracyclin- Resistenzgens von pACYC184 durch die Insertion des Pcs-Fragments zu testen, wurden 66 dieser Kolonien auf R2-4-Platten mit Ampicillin in einer Konzentration von 50 µg/ml und R2-4-Platten mit Tetracyclin in einer Konzentration von 15 µg/ml fleckenförmig aufgebracht ("patched") und bei 37ºC über Nacht inkubiert. Sechs der 66 Cm -Amp - Kolonien zeigten in dem Patchtest Empfindlichkeit gegenüber Tetracyclin. Mini- Präparations-DNA wurde aus diesen sechs Clonen, die mit HindIII gespalten wurden, isoliert. Drei der Plasmide zeigten eine 2,5 kb-HindIII-Insertion, während die anderen drei zwei oder mehr davon zeigten. Das Plasmid mit der Bezeichnung pACYC184:Pcs zeigte eine einzelne 2 5 kb-HindIII-Insertion.
Es wurden 40 µg pACYC184:Pcs-DNA mit 4 Einheiten BamHI teilgespalten und über ein Gel gereinigt. Das etwa 6,7 kb große Fragment, das die linearisierten Plasmidmoleküle, die an einer der zwei BamHI-Spaltstellen gespalten waren, enthielt, wurde isoliert, und dann vollständig mit SstI gespalten. Die Fragmente wurden über ein Gel gereinigt,und das 6,7 kb-BamHI-SstI-Fragment wurde aus dem Gel herausgeschnitten, in 0,1x TEA elektroeluiert, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Natriumacetet in Ethanol gefällt und in Tris-EDTA-Puffer resuspendiert.

C. Einschleusung einer einzigartigen SstI-Spaltstelle in pBR322

Es wurden 10 Mikrogramm pBR322-DNA vollständig mit der Restriktionsendonuclease AlwNI gespalten, und die Enden wurden in glatte Enden überführt. SstI (SacI)-Linker-Oligonucleotide von New England Biolabs wurden mit T4- Ligase mit einem glattendigen gespaltenen pBR322-Fragment unter Standardbedingungen ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde direkt mit 5 Einheiten SstI gespalten, über ein Gel gereinigt und dann mit sich selbst mit T4-DNA-Ligase unter Standardbedingungen ligiert. Dieses Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von kompetenten MM294-Zellen verwendet. Die Kultur MM294 pALF20 ergab DNA, die mit SstI linearisiert wurde und eine Länge von etwa 4,4 kb hatte. Dieses Plasmid wurde dann zum Einbau der lac- und tac-Promotoren verwendet.

D. Anelierung der Oligonucleotide

Die Oligonucleotide wurden synthetisiert, um die tac- und lac-UV5-Promotoren zu erzeugen. Jedes Oligonucleotid enthält die Sequenz für einen Strang des Promotors, wobei ein Strang eine halbe EcoRI-Spaltstelle an einem Ende und ein Strang eine halbe HindIII- Spaltstelle am anderen Ende aufweist. Die synthetisierten Oligonucleotide wurden in H&sub2;O bis zu einer Konzentration von 100 pmol/µl suspendiert. Es wurden 200 pmol jedes Oligonucleotids mit 9 Einheiten Polynucleotidkinase in einem 20 µl-Reaktionsansatz, der 1 mM ATP enthielt, bei 37ºC 30 min behandelt. Sobald die Kinasebehandlung abgeschlossen war, wurden die Oligonucleotide in Paaren zusammengemischt und dann 15 min auf 68ºC erhitzt, um jegliche Sekundärstruktur aufzulösen. Man ließ die Oligonucleotide dann durch Abkühlen auf 37ºC und 30minütige Inkubation aneinander anelieren. Nach 30 min wurden die anelierten Oligonucleotide in Ligierungsreaktionen mit dem pALF20-EcoRI/HindIII-Fragment, das, wie nachstehend beschrieben, isoliert wurde, eingeschlossen.

E. Herstellung des Vektors

Es wurden 20 µg des Plasmids pALF20 mit 100 Einheiten EcoRI und 100 Einheiten HindIII bei 37ºC 1,5 Stunden gespalten. Man ließ den Reaktionsansatz auf einem 0,8%igen GTG-Agarose-Gel laufen und dann wurde das etwa 4,4 kb große Fragment, das der linearisierten DNA entsprach, aus dem Gel ausgeschnitten. Das Fragment wurde elektroeluiert.

F. Ligierungen

Jedes Paar der anelierten Oligonucleotide wurde mit der HindIII/EcoRI- gespaltenen pALF20-DNA in einem Reaktionsansatz, der 0,1 mM ATP enthielt, in einem Verhältnis von Insertion zu Vektor von 3:1 bei 16ºC 3,5 Stunden ligiert. Als Kontrolle wurde der EcoRI/ HindIII-gesaltene pALF20-Vektor unter den gleichen Bedingungen mit sich selbst ligiert.

G. Transformationen

Jedes Ligierungsgemisch wurde in kompetente DG101-Zellen transformiert und auf R24-Platten, die Tetracyclin in einer Konzentration von 15 µg/ml enthielten, plattiert. Die Transformation mit dem Vektor, der mit sich selbst ligiert war, ergab sechs tetracyclinresistente Kolonien. pALF20:lacUV5 ergab 30 tetracyclinresistente Kolonien, pALF20:tac ergab 99. Über einen Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten gereinigte DNA wurde aus drei Klonen aus der pALF20:lacUV5-Transformation mit der Bezeichnung pLAC19, pLac20 und pLac21 und aus zwei Clonen aus der pALF20:tac-Transformation mit der Bezeichnung pTac24 und pTac25 hergestellt. Diese Plasmide wurden sequenziert, um die Anwesenheit einer anelierten Oligonucleotid-Promotor-Insertion zu bestimmen:
pLac21: Enthielt die lacUV5-Sequenz ohne Fehler.
pTAc25: Enthielt die tac-Promotorsequenz mit einer 1 bp-Fehlpaarung von G nach A and der Position -47 des Promotors.
Die Plasmide pTAc25 und pLac21 wurden ausgewählt, um die Konstruktion fortzusetzen. Es wurden 10 µg jedes Plasmids vollständig mit SstI und dann mit BamHI gespalten. Die etwa 1,5 kb langen Fragmente, die das Ampicillin-Resistenzgen in Bindung an einen heterologen Promotor (tac oder lac) enthielten, wurden aus den Gelen ausgeschnitten und elektroeluiert.

H. Ligierungen

Das etwa 6,7 kb große BamHI-teilgespaltene, SstI-gespaltene pACY-C184:Pcs- Vektorfragment (isoliert in Abschnitt B) wurde mit den heterologen BamHI/SstI- Ampicillinresistenz-Promotorfragmenten aus pLac21 und pTac25 in zwei separaten Ligierungsreaktionen mit Insertion-Vektor-Verhältnissen von 7:1 und einer ATP- Konzentration von 0,2 mM bei 16ºC 24 h ligiert. Diese zwei Ligierungsgemische wurden zur Transformation von kompetenten DG101-Zellen verwendet. Die Transformationen ergaben 786 ampicillinresistente Transformanten für pACYC184:Pcs:Lac21 und 803 Ampicillinresistenz-Transformanten für pACY184:Pcs:Tac25. Die Kulturen wurden in R2 mit Ampicillin in einer Konzentration von 50 µg/ml aus neun Kolonien aus jeder Transformation gezüchtet. Mini-Präparations-DNA, erhalten mittels alkalischer Lyse, wurde aus diesen Kulturen isoliert und durch Restriktionsspaltung mit den Enzymen
BamHI, HindIII und SstI analysiert. DNAs, die der Restriktionskarte für die Plasmide mit der Bezeichnung pLac21-7 und pTac25-1 in Figur 9 entsprachen, wurden identifiziert. Diese Plasmide wurden zur Transformation der elektrokompetenten Ausgangszellen 1306- 21 verwendet. Die so erhaltenen Stämme wurden einer Southern Blot-Analyse unterworfen, um die chromosomale Konfiguration dieser Stämme zu bestätigen und dann in Fermentationsexperimenten verwendet, um den Grad der Cellulosesynthase-Aktivität und Celluloseproduktion zu erhöhen.
Diese zwei Stämme, zusammen mit dem nicht transformierten Wirtsstamm 1306- 21, wurden unter Verwendung von Standardprotokollen getestet. Die Stämme wurden in doppelten Ansätzen auf Zellwachstum, Celluloseproduktion und In vitro-Celluloseaktivität an den Tagen 1, 2 und 5 getestet. Es wurden 125 ml-Kolben mit Schikanen mit 2% Cellulose-enthaltendem Anzuchtmedium inokuliert. Standardkolbenmedien, die R70-2 mit 10 µM FeCl&sub3;, 25 mM DMG, 1% TYE und 3% Glucose enthielten, wurden verwendet.
Die Kulturen für die Enzymtests wurden geerntet, die Zellen wurden durch Preßtuch geleitet, und die Zellen wurden unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Protokolle gewaschen. Die Pellets wurden nach Gewinnung der Proben eingefroren. Die Zellen wurden beschallt und dann auf Cellulosesynthase-Aktivität, Celluloseproduktion und Zellwachstum getestet.
Die Ergebnisse dieses Versuches zeigen, daß man den chromosomalen Acetobacter-Promotor des Cellulosesynthase-Operons durch einen E. coli-Promotor ersetzen kann und immer noch eine In vitro-Cellulosesynthase-Aktivität und - Celluloseproduktion erhalten kann. Die spezifische In vitro-Cellulosesynthase-Aktivität des tac-Promotorkonstrukts war der der Wildtypzellen während der Fermentation ähnlich, sowohl bezüglich der Aktivität der einen Tag alten Kulturen als auch der Aktivitätsabnahme in den zwei und fünf Tage alten Kulturen, während die Aktivität des lac-Promotorkonstrukts niedriger als die des Wildtypstammes war. Dessen Aktivität nahm auch zwischen dem ersten und zweiten Tag ab.
Das Zellwachstum und die Celluloseproduktion des tac-Promotorkonstrukts waren experimentell denen der Kontrolle identisch. Das lac-Promotorkonstrukt war bezüglich der Celluloseproduktion beträchtlich niedriger, aber nicht bezüglich des Zellwachstums, verglichen mit der Kontrolle. Diese Daten legen nahe, daß die Produktion an Cellulose in dem lac-Promotorstamm durch die In vivo-Aktivität der Cellulosesynthase beschränkt war.
So führen, wie hier gezeigt, Promotoren verschiedener Länge zu verschiedenen Enzymaktivitäten und Cellulose-Zell-Verhältnissen.

Beispiel XVII

Experimente mit dem Cellulose-Synthase-D-Gen

A. Clonierung eines 3,7 kb-Fragments. das die Sequenz von Gen C und D enthält in pACYC184

Es wurden 20 µg pACYC184-DNA mit 200 Einheiten EcoRV und 200 Einheiten BamHI in einem Gesamtvolumen von 300 µl bei 37ºC 2 Stunden gespalten. Die DNA wurde mit 14 Einheiten alkalischer Kälberdarm-Phosphatase bei 37ºC 30 min behandelt, und man ließ sie auf einem 1%igen GTG-Agarose-Gel laufen. Das etwa 4 kb große EcoRV/BamIII-Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten und elektroeluiert.
Es wurden 50 µg pBR322:5.5 T19G9-DNA vollständig mit SmaI gespalten und dann mit BamHI gespalten. (Das 5,5 kb große BamHI-Fragment aus TRT11-4 (Beispiel XIV.C) wurde in die BamHI-Spaltstelle von pBR322 zur Konstruktion von pBR322.5.5 T19G9 cloniert). Man ließ die gespaltene DNA auf einem 1%igen GTG-Agarose-Gel laufen, dann wurde das etwa 3,7 kb große Fragment (Figur 1, Nucleotide 6341-10164), das den 3'-Teil des Gens C und das vollständige Gen D enthielt, aus dem Gel ausgeschnitten und in ein kleines Volumen an 0,1x TEA elektroeluiert.
Etwa 2 µg Äquivalente des pACYC184-BamHI/EcoRV-Fragments wurden mit etwa 25 µg Äquivalenten des 3,7 kb-BamHI/SmaI-Fragments mit einem Insertion-Vektor- Verhältnis von etwa 3:1 ligiert.
Dieses Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von kompetenten MM294- Zellen unter Standardbedingungen verwendet. Die transformierten Zellen wurden auf R2- 4-Platten, die 20 µg/ml Cm enthielten, selektiert und bei 37ºC über Nacht inkubiert. Cm - Transformanten wurden erhalten und ein oder mehrere Clone wurden zur Herstellung von Mini-Screen-DNA, erhalten mittels alkalischer Lyse, abgenommen. Es wurde gezeigt, daß der Clon pACYC184:3.7 eine 3,7 kb-SmaI-BamHI-Insertion, die das 3'-Ende des Gens C und das gesamte Gen D einschließlich der Stamm- und Schleifen- Terminatorstruktur am Ende des Operons enthielt, trug.

B. Unterbrechung der Gen-D-Sequenz

Es wurden 20 µg pACYC184:3.7-DNA vollständig mit EcoRV gespalten, mit Phenol/Chloroform extrahiert, ausgefällt und dann in 20 µl Tris-EDTA resuspendiert. Fünf µg pBR22-DNA wurden vollständig mit EcoRI und AlwNI gespalten. Die DNA wurde ausgefällt, und überhängende Enden wurden mit Klenow in Gegenwart aller vier dNTPs aufgefüllt.
Die 5 µg-Äquivalente der DNA des pBR322-Amp -Fragments wurden an 1 µg Äquivalent der EcoRV-gespaltenen pACYC184:3.7-DNA ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von kompetenten MM294-Zellen unter Standardbedingungen verwendet. Der Transformationsansatz wurde auf R2-4 Ampso-Platten plattiert. Amp - Kolonien wurden erhalten und gezüchtet. Die Zeilen wurden von jeder Kultur geerntet, und Mini-Präparations-DNA, erhalten mittels alkalischer Lyse, wurde aus den Kulturen isoliert. Eine der Kulturen mit der Bezeichnung pDI-2 wurde zur Transformation von 1306-21 verwendet. pDI2 enthielt das Amp-Resistenzfragment aus pB322, insertiert in die EcoRV-Spaltstelle von pACYC184:3.7, wodurch das Gen D unterbrochen wird. PDI- 2-DNA aus einem Cäsiumchlorid-/Ethidiumbromid-Gradienten wurde hergestellt Es wurden 10µg dieser DNA vollständig mit XbaI gespalten. Es wurden 40 µl elektrokompetenter 1306-21-Zellen der gespaltenen DNA zugesetzt,und die Zellen wurden unter Standardbedingungen einer Elektroporation unterzogen. Ein mi R20-2 wurde den einer Elektroporation unterzogenen Zellen zugesetzt, und das Gemisch wurde sofort auf R20-2 Amp 100 Cm 20-Platten plattiert.
Nach viertägiger Inkubation bei 30ºC erschienen etwa 100000 Amp -Kolonien auf den Platten. Diese Transformanten erschienen als schwache Celluloseproduzenten Ahnliche Ergebnisse wurden für die Transformanten erhalten, bei denen das vollständige Cellulosesynthase-D-Gen deletiert war. Diese Befunde legen nahe, daß das Cellulosesynthase-D-Gen eine Rolle bei der Cellulosesynthese spielt.

Beispiel XVIII

Reinigung der Cellulosesynthase

Der Stamm 1306-27 wurde auf 400 ml eines Mediums aus 4% Fructose, 1% Hefeextrakt, 0,5% Bactopepton und 0,3% NaH&sub2;PO&sub4; bei pH 5,0 in 1000 ml-Kolben mit Schikanen 24 Stunden gezüchtet. Das Wachstumsmedium wurde von den Zellen durch zweimaliges Waschen mit Puffer (50 mM K&sub2;HPO&sub4;, pH 6,0) entfernt. Etwa 14 g trockene Zellen wurden hergestellt.

Zellmembranen

Die Zellen (25 mg Zellen/ml) wurden in einem French-press-Gerät in Gegenwart von Polyethylenglycol (PEG) und TME-Puffer, 20% PEG (Gew./Vol.) aufgebrochen. Die aufgebrochenen Zellen wurden zentrifugiert (10 min, bei 12000 g), und das Pellet wurde in TME-Puffer auf das gleiche Volumen resuspendiert. Diese Suspension wurde homogenisiert (Potter Elevehjem Homogenisator), und die Suspension wurde zentrifugiert (120009, 10 min). Das so erhaltene Pellet enthielt die Cellulosesynthase- Aktivität. Diese Probe (P-PEG) wurde in TME-Puffer zu einer Konzentration entsprechend 50 mg Zellgewicht pro ml resuspendiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80ºC gelagert.

Trypsin-Behandlung

P-PEG wurde zentrifugiert (10 min bei 12000 g) und das Pellet wurde in 0,1 M Tris, pH 8,3, 20% Saccharose in einer Konzentration von 10 mg Zellen Trockengewicht/ml suspendiert. 1% Volumen aus 8 mg(ml Trypsin (Sigma) wurde zugesetzt, und das Präparat wurde unter sanftem Schütteln 1 h bei 4ºC inkubiert. 1%Volumen aus 2 mg/ml Trypsin-Inhibitor wurde zugesetzt und das Präparat wurde 15 min auf Eis inkubiert. Nach der Zentrifugation (10000g, 30 min) wurde das Pellet (TT-P- PEG) gefroren bei -80ºC gelagert.

Solubilisation

Eine 10%ige Digitonin (Serva, Westbury, NY)-Lösung in TME-Puffer wurde durch 5- bis 10minütiges Erhitzen in einem siedenden Bad hergestellt, und das Präparat wurde dann auf 4ºC abgekühlt. Das TT-P-PEG-Pellet wurde auf 1/10 seines Ausgangsvolumens in TME-Puffer, der 2% Digitonin enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde 2 min bei 4ºC beschallt, wobei das Beschallungsgerät MSE-Modell 140 verwendet wurde. Die Beschallung wurde mit 30 ml-Aliquoten mit Beschallungspulsen von 30 unter dazwischengeschalteter Kühlung durchgeführt. Die Suspension wurde geschüttelt und 90 min sanft vermischt und dann bei 200000 g 60 min zentrifugiert. Der Überstand enthielt etwa 50% der ursprünglichen Cellulosesynthase-Aktivität. Bei Einfrieren und Lagern wie vorstehend wurde die Aktivität mehrere Monate beibehalten.

Enzymkonzentration

Das solubilisierte Enzym wurde 5-7fach unter Verwendung von Amicon-Cones (Filter 100K) auf eine Aktivität von 10-16 Enzymeinheiten/ml (Einheit = 1 Nanomol/min) konzentriert. Das konzentrierte Enzym wurde über Nacht bei 4ºC oder wie vorstehend gefroren gelagert.

Enzymprodukt-Einfang

In den Boden jedes von sechs 40 ml-Zentrifugenröhrchen für Contron TST-28 (Ausschwing)-Rotor wurden 26 ml eines glycerinhaltigen Kissens (TME-Puffer (pH 8,5), der 12-13% Glycerin, 1 mM UDPG und 15 µmol c-di-GMP enthielt) gegeben und 10 ml Reaktionsgemisch (50 ml solubilisiertes Enzym, 6,25 mmol Tris-HCl-Puffer, pH 9,6, 340 µmol CaCl&sub2;, 1 mmol MgCl&sub2;, 0,6 µmol c-di-GMP und 60 µmol UDPG bis zu einem Endvolumen von 61 ml) wurden vorsichtig darübergeschichtet. Die Röhrchen wurden 15 min bei 30ºC inkubiert, dann 2,5 h auf Eis gegeben und schließlich in einem TST-28 Contron- Rotor 30 min. bei 20.000 UpM zentrifugiert. (Die Zentrifuge wurde so eingestellt, daß sie ihre Geschwindigkeit innerhalb von 3-4 min auf 350 UpM herabsetzte). Die Überstände wurden sorgfältig dekantiert. Die Pellets wurden vereinigt, in 15 ml TME mit einem manuellen Homogenisator suspendiert und erneut zentrifugiert. Das endgültige Pellet wurde in 5 ml TME suspendiert. Vor der SDS-PAGE wurde das eingefangene Enzym einmal durch Zentrifugation gewaschen. Das eingefangene Enzym war mehrere Wochen stabil, wenn es wie vorstehend gefroren und gelagert wurde. Die Aktivitätsausbeute des eingefangenen Enzyms betrug etwa 45%.

Abtrennung der Proteine mittles SDS-PAGE

Das einfangene Enzym, das 12-15% der ursprünglichen Cellulosesynthase-Aktivität enthielt, wurde in Laemmli's Probenpuffer (der DTT enthielt) gelöst und einer SDS-PAGE in 10%igen Acrylamid-Stabgelen unterworfen. Die Peptidbanden wurden durch Coomassie-Blaufärbung sichtbar gemacht und ausgeschnitten. Vier Hauptbanden wurden beobachtet, Bande A 90-95 kd, Bande B 65-68 kd, Bande C 58-60 kd und Bande D 54-56 kd.

Gewinnung des Proteins aus den SDS-PAGE-Gelstückchen

Die Proteine wurden aus den SDS-PAGE-Gelstückchen durch Elektroelution unter Verwendung eines nach Hunkapiller et al. (Methods in Enzymology, 1983, 91:227-247) modifizierten Verfahrens abgetrennt. Das Verfahren wurde so angepaßt, daß es zur einer niedrigeren Endkonzentration an SDS führte. Die Modifikationen waren: 1) Ersatz des Einweichpuffers (2% SDS in 0,05 M NH&sub4;HCO&sub3;) durch Elutionspuffer (0,1% SDS in 0,05 M NH&sub4;HCO&sub3;) und 2) bei Ersatz des Elutionspuffers (0,1% SDS in 0,05 M NH&sub4;HCO&sub3;) in der Vorrichtung durch Dialyse-Puffer (0,02% SDS in 0,01 M NH&sub4;HCO&sub3;) wurde der Hauptteil des Puffers in der Probenzelle ebenfalls ersetzt, wobei vorsichtig ein Aufwirbeln der Probe vermieden wurde.

Beispiel XIX

N-terminale Aminosäuresequenz der Polvpeptid-Proteine die aus der Cellulosesynthase-Präparation isoliert wurden

Die ersten 18 Aminosäuren des 90-95 kd-Proteins und die ersten 16 Aminosäuren des 65-68 kd-Proteins, die aus dem Acetobacter-Stamm 1306-27 gereinigt wurden, wurden durch automatischen Edman-Abbau mittels eines Applied Biosystems Modell 470A Protein-Sequenators unter Verwendung der vom Hersteller gelieferten Reagenzien und Protokolle sequenziert. Die 18 Aminosäuren des 90-95 kd-Proteins stimmen mit einer Aminosäuresequenz überein, die aus der DNA-Sequenz der Cellulosesynthase vorhergesagt wurde, die, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen wurde. Die Übereinstimmung beginnt mit dem Alaninrest, der in Figur 1 angegeben ist. Das aminoterminale Ende, das nach der Reinigung erhalten wurde, ist vermutlich nicht das tatsächliche N-terminale Ende in vivo, aber könnte die Proteolyse an dem Lysin, das diesem Alanin vorausgeht, widerspiegeln. Die abgeleitete Sequenz des clonierten Gens codiert ein Protein von 83 kd. Einige zusätzliche Peaks für die frühen Aminosauren neben dem N-Terminus waren vorhanden, möglicherweise infolge einer Verunreinigung.
Die Qualität der für das 65-68 kd-Protein erhaltenen Sequenz war nicht so wie die, die für das 90-95 kd-Protein erhalten wurde, aber eine gute Übereinstimmung konnte zwischen der N-terminalen Sequenz des 65-68 kd-Proteins und den Aminosäuren (in Klammern angegeben) von der in Figur 1 vorhergesagten Sequenz erzielt werden. So scheint das 65-68 kd-Protein ein proteolytisches Fragment des 90-95 kd-Proteins zu sein.
Die folgenden Kulturen wurden bei der American Type Gulture Collection (ATCC) Rockville, MD, USA, gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung bezüglich der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den entsprechenden Vorschriften (Budapester Vertrag) hinterlegt und werden so gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags aufrechterhalten und verftigbar gemacht. Die Verfügbarkeit solcher Stämme gilt nicht als Lizenz, die Erfindung entgegen den Rechten, die gemäß jeder Regierung in Übereinstimmung mit den Patentgesetzen gewährt werden, zu praktizieren.
Den hinterlegten Kulturen wurden die angegebenen ATCC-Hinterlegungsnummern zugeteilt. Die Kulturen wurden ebenfalls bei der Master Culture Collection (CMCC) der Cetus Corporation, Emeryville, CA, USA, dem Rechtsnachfolger der vorliegenden Anmeldung, hinterlegt, und es wurden ihnen die angegebenen CMCC- Hinterlegungsnummern zugeteilt:
Während die vorliegende Erfindung vorstehend anhand bestimmter, spezifischer Ausführungsformen erläutert wurde, sollen diese spezifischen Beispiele den Umfang der Erfindung, wie in den beigef gten Patentansprüchen beschrieben, nicht beschränken.

Claims

1. Isolierte, native, clonierte rekombinante oder synthetische Polynucleotidsequenz, die ein bakterielles Cellulosesynthase-Operon codiert, wobei unter Bezugnahme auf Figur 1 das Polynucleotid vier benachbarte Gene umfaßt, wobei das erste Gen im wesentlichen den Nucleotiden 328 bis 2589, das zweite Gen im wesentlichen den Nucleotiden 2594 bis 4999, das dritte Gen im wesentlichen den Nucleotiden 5005 bis 8961 und das vierte Gen im wesentlichen den Nucleotiden 8964 bis 9431 entspricht.

2. Polynucleotid nach Anspruch 1, das aus dem Genom von Acetobacter stammt.

3. Polynucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das wei ter einen zu dem Operon benachbarten und davon stromaufwärts liegenden Promotor umfaßt.

4. Isoliertes, natives, cloniertes rekombinantes oder synthetisches Polynucleotid, das im wesentlichen der Nucleotidsequenz für die Cellulosesynthase A, Cellulosesynthase B, Cellulosesynthase C oder Cellulosesynthase D entspricht, in jedem Fall wie in Figur 1 gezeigt.

5. Polynucleotid nach Anspruch 4, das funktionell mit einer Kontrollsequenz für die Expression verbunden ist.

6. Polynucleotid nach Anspruch 5, das weiter einen Promotor umfaßt, der benachbart zu und stromaufwärts des Polynucleotids liegt, das der Nucleotidsequenz für die Cellulosesynthase A, B, C oder D entspricht.

7. Rekombinante Wirtszellen, die mit dem Polynucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche transformiert sind.

8. Verfahren zur Herstellung einer bakteriellen Cellulosesynthase, umfassend die Züchtung der transformierten Zellen nach Anspruch 7 unter Bedingungen, die für die Expression der bakteriellen Cellulosesynthase geeignet sind, und Gewinnung der exprimierten bakteriellen Cellulosesynthase aus der Kultur.

9. Isoliertes rekombinantes Protein, das von einem Polynucleotid gemäß der Definition in Anspruch 4 oder einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert wird.

10. Verfahren zur Erhöhung der Celluloseproduktion in einem rekombinanten Mikroorganismus, umfassend:

(a) Transformation eines geeigneten Mikroorganismus mit einem Vektor, der mindestens ein Gen umfaßt, das im wesentlichen der Nucleotidsequenz für Cellulosesynthase A, Cellulosesynthase B, Cellulosesynthase C oder Cellulosesynthase D entspricht, in jedem Fall wie in Figur 1 gezeigt, und

(b) Züchtung des transformierten Mikroorganismus unter für die Produktion von Cellulose günstigen Bedingungen.

11. Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend:

(a) mindestens ein Gen, das von dem Cellulosesynthase- Operon stammt und eine Sequenz umfaßt, die im wesentlichen der Nucleotidsequenz für Cellulosesynthase A, Cellulosesynthase B, Cellulosesynthase C oder Cellulosesynthase D entspricht, in jedem Fall wie in Figur 1 gezeigt;

(b) ein funktionelles, den Acetobacter-Replikationsursprung enthaltendes Fragment der Plasmid-DNA von 3,5 kb Länge, das durch eine SacI-Spaltung aus ATCC 67925 oder ATCC 67926 erhältlich ist, und

(c) eine oder mehrere DNA-Segmente, die gegenüber mindestens einem Antibiotikum Resistenz verleihen, wenn sie in eine sensitive, einer Transformation, Zellteilung und Züchtung zugängliche Wirtszelle transformiert werden.

12. Rekombinanter DNA-Vektor nach Anspruch 11, der entweder der Vektor ist, der aus ATCC 67925 oder ATCC 67926 erhältlich ist, oder der mit diesem Vektor identisch ist, ausgenommen daß das clonierte SmaI-Restriktionsfragment von 8,3 kb Länge in der umgekehrten Orientierung vorliegt.