JPH0773500B2 - セルロースシンターゼオペロンの表現のための方法及び核酸配列 - Google Patents
セルロースシンターゼオペロンの表現のための方法及び核酸配列Info
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- JPH0773500B2 JPH0773500B2 JP2-506168A JP50616890A JPH0773500B2 JP H0773500 B2 JPH0773500 B2 JP H0773500B2 JP 50616890 A JP50616890 A JP 50616890A JP H0773500 B2 JPH0773500 B2 JP H0773500B2
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- cellulose
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- acetobacter
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
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- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明はタンパク質の製造についての組換DNA技術の分
野に関連する。更に詳しくは、本発明は細胞セルロース
シンターゼオペロン、このオペロンの表現型及び組換微
生物におけるセルロースの製造のためのこのオペロンの
利用方法に関する。
野に関連する。更に詳しくは、本発明は細胞セルロース
シンターゼオペロン、このオペロンの表現型及び組換微
生物におけるセルロースの製造のためのこのオペロンの
利用方法に関する。
発明の背景
セルロースは、紙の生産及び傷の手当用品を含む多数の
有用な製造のための原料として期待されている。セルロ
ースは植物及び培養物における種々の微生物、例えばア
セトバクター（Acetobacter）属のセルロース生産細菌
から得られうる。
有用な製造のための原料として期待されている。セルロ
ースは植物及び培養物における種々の微生物、例えばア
セトバクター（Acetobacter）属のセルロース生産細菌
から得られうる。
アセトバクターの特徴は、グラム陰性、即ち、0.6−0.8
μｍ×1.0−４μｍの桿状菌である。これらは厳密には
好気性、即ち、代謝が発酵性ではなく、呼気性である。
これは更に、化学的にセルロースと同一の複数のポリＢ
（１−４）−グルカン鎖を生産する能力により区別され
る。複数のセルロース鎖又はミクロフィブリルは細胞壁
上の細菌表層部位で合成される。アセトバクターによる
セルロースの生産は、少なくとも1930年代から熱烈なる
研究の課題であった。特に、アセトバクタージリナム
（Acetobacter zylinum）は、完全な細胞におけるセル
ロース合成構成の究明の達成のために広く研究されてい
る〔Schramm and Hestrin,（1954）J.Gen.Microbiol.1
1:123−129〕。
μｍ×1.0−４μｍの桿状菌である。これらは厳密には
好気性、即ち、代謝が発酵性ではなく、呼気性である。
これは更に、化学的にセルロースと同一の複数のポリＢ
（１−４）−グルカン鎖を生産する能力により区別され
る。複数のセルロース鎖又はミクロフィブリルは細胞壁
上の細菌表層部位で合成される。アセトバクターによる
セルロースの生産は、少なくとも1930年代から熱烈なる
研究の課題であった。特に、アセトバクタージリナム
（Acetobacter zylinum）は、完全な細胞におけるセル
ロース合成構成の究明の達成のために広く研究されてい
る〔Schramm and Hestrin,（1954）J.Gen.Microbiol.1
1:123−129〕。
アセトバクタージリナムにおけるセルロース合成につい
ての酵素経路は研究されており、そしてグルコースから
セルロース迄の全ての経路を含むものと見られる本質的
に４つの酵素的段階が、A.キシリナム（A.xylinum）の
細胞遊離抽出物において特徴付けられる。これらには、
グルコキナーゼによるグルコースのリン酸化〔Benzima
n,et al.,（1972）J.Bacterial.,111:325−330〕、ホス
ホゲルコムターゼによるグルコース−６−リン酸からグ
ルコース−１−リン酸への異性化〔Gromet,et al.,（19
57）Biochem,J.,67:679−689;Frei−Roitman,Factors a
ffecting the activity of phosphoglucomutase and UD
P−glucose pyrophosphorylase of Acetobacter xylinu
m,M.Sc.論文、the Hebrew University of Jerusalem,Je
rusalem,Israel（1974）〕;UDGP−ピロホスホリラーゼ
によるウリジン５′−ジホスホグルコース（UDP−glc）
の合成〔Frei−Roitman（記載）;Swisa,Biosynthesis o
f Cellulose in Acetobacter xylinum,Ph.D.論文;the H
ebrew University of Jerusalem,Jerusalem,Israel（19
78）〕、及びセルロースシンターゼ反応が挙げられる。
ての酵素経路は研究されており、そしてグルコースから
セルロース迄の全ての経路を含むものと見られる本質的
に４つの酵素的段階が、A.キシリナム（A.xylinum）の
細胞遊離抽出物において特徴付けられる。これらには、
グルコキナーゼによるグルコースのリン酸化〔Benzima
n,et al.,（1972）J.Bacterial.,111:325−330〕、ホス
ホゲルコムターゼによるグルコース−６−リン酸からグ
ルコース−１−リン酸への異性化〔Gromet,et al.,（19
57）Biochem,J.,67:679−689;Frei−Roitman,Factors a
ffecting the activity of phosphoglucomutase and UD
P−glucose pyrophosphorylase of Acetobacter xylinu
m,M.Sc.論文、the Hebrew University of Jerusalem,Je
rusalem,Israel（1974）〕;UDGP−ピロホスホリラーゼ
によるウリジン５′−ジホスホグルコース（UDP−glc）
の合成〔Frei−Roitman（記載）;Swisa,Biosynthesis o
f Cellulose in Acetobacter xylinum,Ph.D.論文;the H
ebrew University of Jerusalem,Jerusalem,Israel（19
78）〕、及びセルロースシンターゼ反応が挙げられる。
常用のクロマトグラフィー技術を利用するA.キシリナム
株由来のセルロースシンターゼの精製の試みは特に成功
していなかったが、しかし最近になってこの酵素は明ら
かに精製され（P.Ross and M.Benziman（1989）in Bios
ynthesis and Biodegradation of Cellulose and Cellu
lose Materials,（編）Weimar and Higler,Marcel Dekk
er,Inc.NY.版）、そして精製状態におけるその特性及び
製造が現在研究されている。
株由来のセルロースシンターゼの精製の試みは特に成功
していなかったが、しかし最近になってこの酵素は明ら
かに精製され（P.Ross and M.Benziman（1989）in Bios
ynthesis and Biodegradation of Cellulose and Cellu
lose Materials,（編）Weimar and Higler,Marcel Dekk
er,Inc.NY.版）、そして精製状態におけるその特性及び
製造が現在研究されている。
同様に、インビトロでのセルロース捕獲及びクロマトグ
ラフィー技術によるセルロースシンターゼの精製の試み
により、83キロダルトン（Kd）ポリペプチドの部分的精
製がもたらされた（Lin and Brown,第10回セルロース会
議（Cellulose Conference）1988年５月29日−６月２
日、要約BG1、27頁）。
ラフィー技術によるセルロースシンターゼの精製の試み
により、83キロダルトン（Kd）ポリペプチドの部分的精
製がもたらされた（Lin and Brown,第10回セルロース会
議（Cellulose Conference）1988年５月29日−６月２
日、要約BG1、27頁）。
この微生物におけるセルロース合成の生成学的機能は未
だ明確でないが、細胞のエネルギーバジェット（energy
budjet）の少なくとも10％が一時的に任意にセルロー
ス生成に提供されるものと考えるなら〔Weinhouse,Regu
lation of Carbohy drate metabolism in Acetobacter
xylinum,Ph.D.thesis,The Hebrew University of Jerus
alem,Jerusalem,Israel（1977）〕、生合成系が複雑な
制御システムにより支配されることは驚くことではな
い。
だ明確でないが、細胞のエネルギーバジェット（energy
budjet）の少なくとも10％が一時的に任意にセルロー
ス生成に提供されるものと考えるなら〔Weinhouse,Regu
lation of Carbohy drate metabolism in Acetobacter
xylinum,Ph.D.thesis,The Hebrew University of Jerus
alem,Jerusalem,Israel（1977）〕、生合成系が複雑な
制御システムにより支配されることは驚くことではな
い。
唯一のこの経路独特の酵素、セルロースシンターゼは、
セルロース形成において掛かり合う工程−炭素利用に関
連する代謝系の行き詰まり一を成し遂げ、それ故厳格な
制御コントロールのための第１の候補に必然的になるで
あろう。更に、細胞遊離抽出物において示される通り、
UDP−glcへと導く酵素のレベルはセルロースシンターゼ
の活性と大いに関連し、従ってこれらがセルロース生合
成における速度制御工程を含んで成る説を強く支持す
る。
セルロース形成において掛かり合う工程−炭素利用に関
連する代謝系の行き詰まり一を成し遂げ、それ故厳格な
制御コントロールのための第１の候補に必然的になるで
あろう。更に、細胞遊離抽出物において示される通り、
UDP−glcへと導く酵素のレベルはセルロースシンターゼ
の活性と大いに関連し、従ってこれらがセルロース生合
成における速度制御工程を含んで成る説を強く支持す
る。
更なるセルロース合成の生化学の完全なる理解は、セル
ロース生成微生物の培養物からのセルロースの、更に優
れた生産性及び収率を促進せしめうる。培養物における
細菌細胞の増殖は、初期は指数的に観察できるが、しか
しこの細胞は定状増殖期に入るに従い遅くなる。大多数
のセルロースは、細胞の数が最大時の発酵における後期
において生産されるが、しかしながら単位時間当りの一
細胞により作られるセルロースの量（比生産率）は発酵
が進むに従って減少する。セルロースシンターゼ活性
は、培養物における細胞が定状増殖期に到達するに従
い、反応速度は抑制されうるものと考えられる。セルロ
ース生産における１つの改良は、セルロース合成におけ
る速度制限段階を取り除くことでありうり、これにより
培養におけるセルロース比生産性において見られる低下
を防げる。
ロース生成微生物の培養物からのセルロースの、更に優
れた生産性及び収率を促進せしめうる。培養物における
細菌細胞の増殖は、初期は指数的に観察できるが、しか
しこの細胞は定状増殖期に入るに従い遅くなる。大多数
のセルロースは、細胞の数が最大時の発酵における後期
において生産されるが、しかしながら単位時間当りの一
細胞により作られるセルロースの量（比生産率）は発酵
が進むに従って減少する。セルロースシンターゼ活性
は、培養物における細胞が定状増殖期に到達するに従
い、反応速度は抑制されうるものと考えられる。セルロ
ース生産における１つの改良は、セルロース合成におけ
る速度制限段階を取り除くことでありうり、これにより
培養におけるセルロース比生産性において見られる低下
を防げる。
組換DNA技術は目的のタンパク質の生産のために、現在
日常的に利用されている。ところでこのような組換DNA
技術を利用するためには、所望のタンパク質、例えばセ
ルロースシンターゼについてコード化する遺伝子を最初
に単離しなくてはならない。この仕事は特にコード化タ
ンパク質の一次配列が未知の場合に困難であり、更にセ
ルロースシンターゼ活性を測定するための既知のアッセ
イも難しい。
日常的に利用されている。ところでこのような組換DNA
技術を利用するためには、所望のタンパク質、例えばセ
ルロースシンターゼについてコード化する遺伝子を最初
に単離しなくてはならない。この仕事は特にコード化タ
ンパク質の一次配列が未知の場合に困難であり、更にセ
ルロースシンターゼ活性を測定するための既知のアッセ
イも難しい。
組換セルロースシンターゼを生産する能力は、セルロー
スの合成の機能の探究において有用な重要なる手段を提
供し、究極的には高められた細菌培養物からのセルロー
ス生産を提供する。
スの合成の機能の探究において有用な重要なる手段を提
供し、究極的には高められた細菌培養物からのセルロー
ス生産を提供する。
発明の要約
本発明はセルロース生合成に関連するオペロン、細菌セ
ルロースシンターゼのタンパク質についてコード化す
る、１又は複数の近接に結合し合う遺伝子についてのコ
ードであるポリヌクレオチド、セルロースシンターゼの
生産のために適する表現ベクター、これらのベクターに
より形質転換された組換宿主細胞、細菌セルロースシン
ターゼを生産するための方法、及び組換微生物における
セルロースの生産を高める方法を提供する。
ルロースシンターゼのタンパク質についてコード化す
る、１又は複数の近接に結合し合う遺伝子についてのコ
ードであるポリヌクレオチド、セルロースシンターゼの
生産のために適する表現ベクター、これらのベクターに
より形質転換された組換宿主細胞、細菌セルロースシン
ターゼを生産するための方法、及び組換微生物における
セルロースの生産を高める方法を提供する。
更に詳しくは、本発明は、図１において示す多シストロ
ン性ヌクレオチド配列により特徴付けられる、細菌セル
ロースシンターゼオペロンをコード化する、単離され
た、自然のクローン化組換体又は合成のポリヌクレオチ
ドを提供する。このセルロースシンターゼオペロンは長
さにおいておよそ9217塩基対（bp）であり、そして４つ
の遺伝子（本明細書では「Ａ」，「Ｂ」，「Ｃ」及び
「Ｄ」で表わす）を含んで成る。
ン性ヌクレオチド配列により特徴付けられる、細菌セル
ロースシンターゼオペロンをコード化する、単離され
た、自然のクローン化組換体又は合成のポリヌクレオチ
ドを提供する。このセルロースシンターゼオペロンは長
さにおいておよそ9217塩基対（bp）であり、そして４つ
の遺伝子（本明細書では「Ａ」，「Ｂ」，「Ｃ」及び
「Ｄ」で表わす）を含んで成る。
本発明は更に、宿主細胞におけるセルロースシンターゼ
を表現するための方法であって、この宿主細胞を細菌セ
ルロースシンターゼオペロンと一体化している１又は複
数の遺伝子を含んで成る組換DNA表現型ベクターにより
形質転換せしめ（この遺伝子は細菌セルロースシンター
ゼの表現型のためのコントロール配列と作動連結してい
る）、そしてこの形質転換細胞をセルロースシンターゼ
の表現のために適する条件のもとで培養することを含ん
で成る方法を提供する。
を表現するための方法であって、この宿主細胞を細菌セ
ルロースシンターゼオペロンと一体化している１又は複
数の遺伝子を含んで成る組換DNA表現型ベクターにより
形質転換せしめ（この遺伝子は細菌セルロースシンター
ゼの表現型のためのコントロール配列と作動連結してい
る）、そしてこの形質転換細胞をセルロースシンターゼ
の表現のために適する条件のもとで培養することを含ん
で成る方法を提供する。
本発明の表現ベクターの作製は、独立して複製せしめる
か、又は異種のプロモーターをこのアセトバクター染色
体に導入するように計画して天然セルロースシンターゼ
オペロンプロモーターを置換せしめるかのいづれかにあ
る。
か、又は異種のプロモーターをこのアセトバクター染色
体に導入するように計画して天然セルロースシンターゼ
オペロンプロモーターを置換せしめるかのいづれかにあ
る。
更に、本発明の他の態様は、組換微生物におけるセルロ
ース生産を高めるための方法であって、適当な微生物を
セルロースシンターゼオペロン由来の少なくとも１種の
遺伝子を含んで成るベクターにより形質転換せしめ、そ
してこの形質転換微生物をセルロース生産のために適す
る条件下で培養せしめることを含んで成る方法を提供す
る。前に述べた通り、この染色体セルロースシンターゼ
プロモーターは、染色体レベルでのセルロースシンター
ゼオペロンを過剰表現せしめるための異種プロモーター
により置き代われうる。
ース生産を高めるための方法であって、適当な微生物を
セルロースシンターゼオペロン由来の少なくとも１種の
遺伝子を含んで成るベクターにより形質転換せしめ、そ
してこの形質転換微生物をセルロース生産のために適す
る条件下で培養せしめることを含んで成る方法を提供す
る。前に述べた通り、この染色体セルロースシンターゼ
プロモーターは、染色体レベルでのセルロースシンター
ゼオペロンを過剰表現せしめるための異種プロモーター
により置き代われうる。
本発明の更なる態様は、セルロースシンターゼオペロン
によりコード化される個々のタンパク質を提供する。単
離された組換セルロースシンターゼＢタンパク質はウリ
ジン５′−ジホスホグルコースからβ（１−４）−グル
カンポリマーを合成することができ、ここで、遺伝子Ａ
によりコード化されるこのタンパク質は、セルロースシ
ンターゼ及びジグアニレートサイクラーゼ活性の両方を
欠損するセルロース陰性アセトバクター細胞を補完する
ことができる。
によりコード化される個々のタンパク質を提供する。単
離された組換セルロースシンターゼＢタンパク質はウリ
ジン５′−ジホスホグルコースからβ（１−４）−グル
カンポリマーを合成することができ、ここで、遺伝子Ａ
によりコード化されるこのタンパク質は、セルロースシ
ンターゼ及びジグアニレートサイクラーゼ活性の両方を
欠損するセルロース陰性アセトバクター細胞を補完する
ことができる。
遺伝子Ｃ又はＤのいづれかによりコード化されるタンパ
ク質は、ウリジン５′−ジホスホグルコースからβ（１
−４）−グルカンポリマーを合成でき、そしてこのタン
パク質が適当な比率においてセルロースシンターゼオペ
ロンの他の３つのタンパク質と結合した際、インビボで
細胞から生成物を分泌せしめることができる。
ク質は、ウリジン５′−ジホスホグルコースからβ（１
−４）−グルカンポリマーを合成でき、そしてこのタン
パク質が適当な比率においてセルロースシンターゼオペ
ロンの他の３つのタンパク質と結合した際、インビボで
細胞から生成物を分泌せしめることができる。
更に、アセトバクターにおける異種遺伝子の表現のため
の新規の組換DNAベクターであって、複製を含むプラス
ミドp824のフラグメント機能的アセトバクター源、並び
に形質転換、細胞分裂及び培養に影響を受け易い感受性
細胞の中に形質転換せしめた際に、少なくとも１つの抗
生物質に対しての耐性を運び込む１もしくは複数のDNA
セグメント。これらのベクターは、細胞宿主細胞、例え
ばE.コリ（E.coli）におけるDNAのクローニングにおい
て利用するためのシャトルベクターへとすることもでき
る。
の新規の組換DNAベクターであって、複製を含むプラス
ミドp824のフラグメント機能的アセトバクター源、並び
に形質転換、細胞分裂及び培養に影響を受け易い感受性
細胞の中に形質転換せしめた際に、少なくとも１つの抗
生物質に対しての耐性を運び込む１もしくは複数のDNA
セグメント。これらのベクターは、細胞宿主細胞、例え
ばE.コリ（E.coli）におけるDNAのクローニングにおい
て利用するためのシャトルベクターへとすることもでき
る。
図面の簡単な説明
図１はセルロースシンターゼオペロンの核酸配列及び推
定されるアミノ酸配列である。このセルロースシンター
ゼオペロンはその長さにおいておよそ9217bpであり、４
つの遺伝子、Ａで示す2261のヌクレオチド配列（ヌクレ
オチド328−2589）、Ｂで示す2405のヌクレオチド配列
（ヌクレオチド2594−4999）、Ｃで示す3956のヌクレオ
チド配列（ヌクレオチド5005−8961）、及びＤで示す46
7のヌクレオチド配列（ヌクレオチド8964−9431）より
成る。本明細が提供する各遺伝子のヌクレオチド配列は
シグナル配列を含みうる。それぞれの遺伝子によりコー
ド化される成熟タンパク質はプロセッシングを受けるこ
とがあり、もしそうならば関連する遺伝子配列はここに
示したものよりも短いであろう。例えば、精製セルロー
スシンターゼＢタンパク質の第１アミノ酸に相当するア
ラニンコドンは二つの上向き矢印の間にある。
定されるアミノ酸配列である。このセルロースシンター
ゼオペロンはその長さにおいておよそ9217bpであり、４
つの遺伝子、Ａで示す2261のヌクレオチド配列（ヌクレ
オチド328−2589）、Ｂで示す2405のヌクレオチド配列
（ヌクレオチド2594−4999）、Ｃで示す3956のヌクレオ
チド配列（ヌクレオチド5005−8961）、及びＤで示す46
7のヌクレオチド配列（ヌクレオチド8964−9431）より
成る。本明細が提供する各遺伝子のヌクレオチド配列は
シグナル配列を含みうる。それぞれの遺伝子によりコー
ド化される成熟タンパク質はプロセッシングを受けるこ
とがあり、もしそうならば関連する遺伝子配列はここに
示したものよりも短いであろう。例えば、精製セルロー
スシンターゼＢタンパク質の第１アミノ酸に相当するア
ラニンコドンは二つの上向き矢印の間にある。
転写開始部位はヌクレオチド235のＡの上に位置する下
向き矢印により表示した。遺伝子Ｄの後の下線のヌクレ
オチド配列は、ステム及びループ（stem and loop）構
造の逆方向反復塩基配列を含んで成る転写ターミネータ
ー領域を示す。オリゴヌクレオチドMK 170の配列はヌク
レオチド2190から2210に示し、MK 172の配列はヌクレオ
チド4564から4583に示した。
向き矢印により表示した。遺伝子Ｄの後の下線のヌクレ
オチド配列は、ステム及びループ（stem and loop）構
造の逆方向反復塩基配列を含んで成る転写ターミネータ
ー領域を示す。オリゴヌクレオチドMK 170の配列はヌク
レオチド2190から2210に示し、MK 172の配列はヌクレオ
チド4564から4583に示した。
図２はコスミドベクターpKT 230cos5の構造を示す。
図３は全長セルロースシンターゼＢ遺伝子を含むTRT18
−１の作成を図示する。
−１の作成を図示する。
図４はプラスミドpUC18−824の制限地図である。
図５はコスミドT5A1由来の8.3KbSmaIフラグメント及び
7.2KbBamHIフラグメントの制限地図である。
7.2KbBamHIフラグメントの制限地図である。
図６はプラスミドpUC18−824FS6の制限及び機能地図で
ある;pU18−824FS1はセルロースシンターゼ遺伝子を有
するSmaI制限フラグメントの配向が逆向きである以外は
pUC18−824FS6と同一である。
ある;pU18−824FS1はセルロースシンターゼ遺伝子を有
するSmaI制限フラグメントの配向が逆向きである以外は
pUC18−824FS6と同一である。
図７はプラスミドpUC19−824の制限及び機能地図であ
る。
る。
図８はプラスミドpABCDの構造を図示する。
図９は、セルロースシンターゼオペロン遺伝子を転写す
るための異種プロモーターを含む表現ベクターの作製を
示すフローチャートである。
るための異種プロモーターを含む表現ベクターの作製を
示すフローチャートである。
発明の詳細な説明。
本明細書記載の発明をより完全に理解するため、以下の
詳細な説明を記載する。
詳細な説明を記載する。
A.定義
本明細書に用いる語「セルロースシンターゼ」は、生体
内でのウリジン５′ジホスホグルコースの細菌セルロー
スへの生化学的変換、及びその細胞外への分泌に関与す
る１又は複数のポリペプチドに関する。セルロースシン
ターゼの合成に関連する４つの遺伝子を含む単一の転写
ユニットは、図１に示す核酸配列によりコード化され
る。
内でのウリジン５′ジホスホグルコースの細菌セルロー
スへの生化学的変換、及びその細胞外への分泌に関与す
る１又は複数のポリペプチドに関する。セルロースシン
ターゼの合成に関連する４つの遺伝子を含む単一の転写
ユニットは、図１に示す核酸配列によりコード化され
る。
「セルロースシンターゼ遺伝子」なる語は、セルロース
シンターゼオペロンに関連するポリペプチド生成物をコ
ード化する核酸配列として定義する。この語は、いづれ
ものアセトバクター細菌株又は種に限定しない。
シンターゼオペロンに関連するポリペプチド生成物をコ
ード化する核酸配列として定義する。この語は、いづれ
ものアセトバクター細菌株又は種に限定しない。
本明細書に用いる「セルロースシンターゼオペロン」な
る語は、セルロースシンターゼに関連し、そして細胞外
に分泌されるタンパク質生成物のグループをコード化す
るDNA配列のストレッチに関する。
る語は、セルロースシンターゼに関連し、そして細胞外
に分泌されるタンパク質生成物のグループをコード化す
るDNA配列のストレッチに関する。
「セルロースシンターゼ活性」はUDP−glcからセルロー
ス〔β（１−４）−グルカン〕を合成する能力により定
義する。この活性は、UDP−（14C）グルコースをセルロ
ース（塩基に不溶性）に一体化せしめることにより、イ
ンビトロで測定され、そして１分間当りにセルロースに
組込まれるグルコースのn mol（ナノモル）として測定
する。
ス〔β（１−４）−グルカン〕を合成する能力により定
義する。この活性は、UDP−（14C）グルコースをセルロ
ース（塩基に不溶性）に一体化せしめることにより、イ
ンビトロで測定され、そして１分間当りにセルロースに
組込まれるグルコースのn mol（ナノモル）として測定
する。
「セルロースシンターゼ比活性」はセルロースに組込ま
れるn molグルコース／分／タンパク質mgとして定義さ
れる。アセトバクター細胞におけるセルロースシンター
ゼ比活性は、通常から0.2から0.4のn mol glc/分／細胞
タンパク質mgの範囲にある。
れるn molグルコース／分／タンパク質mgとして定義さ
れる。アセトバクター細胞におけるセルロースシンター
ゼ比活性は、通常から0.2から0.4のn mol glc/分／細胞
タンパク質mgの範囲にある。
本明細書に用いる語「アセトバクター」は微生物の属、
そして特にセルロースを生産する属の構成員に関する。
そして特にセルロースを生産する属の構成員に関する。
「適当な微生物」は、セルロースシンターゼオペロンに
関連する１又は複数の遺伝子により形質転換された際
に、セルロースを生産可能な微生物に関する。適当な微
生物には、形質転換を行なわないでセルロースを生産可
能なそれらの宿主細胞、又は１もしくは複数の遺伝子の
欠損するものであって、その活性がセルロースシンター
ゼオペロンの少なくとも１遺伝子により置換されうる宿
主細胞を含む。
関連する１又は複数の遺伝子により形質転換された際
に、セルロースを生産可能な微生物に関する。適当な微
生物には、形質転換を行なわないでセルロースを生産可
能なそれらの宿主細胞、又は１もしくは複数の遺伝子の
欠損するものであって、その活性がセルロースシンター
ゼオペロンの少なくとも１遺伝子により置換されうる宿
主細胞を含む。
「作動連結」は、構成要素の正常な機能が働くことがで
きる並列位置に関する。それ故、コード化配列のコント
ロール配列との「動作連結」は、このコード化配列がこ
れらの配列のコントロール下で表現されうる形態を意味
する。このようなコントロールは直接的、即ち、単一プ
ロモーターと連結した単一遺伝子、又は、多シストロニ
ク転写が単一プロモーターから表現される際のケースの
ような関接的なものでありうる。
きる並列位置に関する。それ故、コード化配列のコント
ロール配列との「動作連結」は、このコード化配列がこ
れらの配列のコントロール下で表現されうる形態を意味
する。このようなコントロールは直接的、即ち、単一プ
ロモーターと連結した単一遺伝子、又は、多シストロニ
ク転写が単一プロモーターから表現される際のケースの
ような関接的なものでありうる。
「コントロール配列」は、DNA配列又は特定の宿主生物
における作動連結したコード化配列の表現のために必要
な配列を称する。原核細胞のために適切なコントロール
配列は、例えばプロモーター、任意的にオペレーター配
列、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、及び未
だよく理解されていない可能性のあるその他のものも含
む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル
及びエンハンサーを利用することが知られる。
における作動連結したコード化配列の表現のために必要
な配列を称する。原核細胞のために適切なコントロール
配列は、例えばプロモーター、任意的にオペレーター配
列、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、及び未
だよく理解されていない可能性のあるその他のものも含
む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル
及びエンハンサーを利用することが知られる。
「細胞」又は「組換宿主細胞」もしくは「宿主細胞」は
しばしば相互交換的に用いられ、そしてこれら全ての呼
称はそれらの子孫を含む。それ故、「形質転換体」又は
「形質転換細胞」には、第一処理細胞、及び移し換えの
回数を無視したそれら由来の培養物を含む。全ての子孫
はDNA含有量において正確に同一でないことがありうる
ことも理解されており、これは誘発性の、又は偶然によ
る突然変異に奇因する。突然変異子孫であって、元来の
形質転換細胞におけるスクリーンにより同一の機能を有
するものは含まれる。異なる呼称を用いた際、それは前
後関係で明らかにされるであろう。
しばしば相互交換的に用いられ、そしてこれら全ての呼
称はそれらの子孫を含む。それ故、「形質転換体」又は
「形質転換細胞」には、第一処理細胞、及び移し換えの
回数を無視したそれら由来の培養物を含む。全ての子孫
はDNA含有量において正確に同一でないことがありうる
ことも理解されており、これは誘発性の、又は偶然によ
る突然変異に奇因する。突然変異子孫であって、元来の
形質転換細胞におけるスクリーンにより同一の機能を有
するものは含まれる。異なる呼称を用いた際、それは前
後関係で明らかにされるであろう。
本明細書で用いる、指定配列から「誘導される」ポリヌ
クレオチド、例えば、セルロースシンターゼＢ遺伝子由
来のDNAは、少なくとも６−20のヌクレオチドの配列、
より好ましくは少なくとも15から20のヌクレオチドの配
列であって、指定のヌクレオチド配列の領域に相当する
即ち、同一又は相補的な配列を称する。核酸配列との一
致は約70％又はそれ以上、好ましくは少なくとも80％、
そしてより好ましくは少なくとも90％のであろう。
クレオチド、例えば、セルロースシンターゼＢ遺伝子由
来のDNAは、少なくとも６−20のヌクレオチドの配列、
より好ましくは少なくとも15から20のヌクレオチドの配
列であって、指定のヌクレオチド配列の領域に相当する
即ち、同一又は相補的な配列を称する。核酸配列との一
致は約70％又はそれ以上、好ましくは少なくとも80％、
そしてより好ましくは少なくとも90％のであろう。
誘導配列の相応又は非相応性は、液相又は固体支持体に
おける標準的なDNAハイブリダイゼーション技術を利用
した、適切なる厳重な条件のもとでのハイブリダイゼー
ションにより検出されうる。核酸配列の相補性の検定の
ためのハイブリダイゼーション技術は当業界において知
られている（例えば、Sambrook el al（1989）Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual（第２版）,Cold Sprin
g Harbor Press,Cold Spring Harbor,NYを参照のこ
と）。更にハイブリダイゼーションにより形成される二
重らせんポリヌクレオチドの誤対合は、二重らせんポリ
ヌクレオチドにおける一本鎖配列を特異的に分解するよ
うS1のようなヌクレアーゼによる分解を含む既知の技術
により検定されうる。
おける標準的なDNAハイブリダイゼーション技術を利用
した、適切なる厳重な条件のもとでのハイブリダイゼー
ションにより検出されうる。核酸配列の相補性の検定の
ためのハイブリダイゼーション技術は当業界において知
られている（例えば、Sambrook el al（1989）Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual（第２版）,Cold Sprin
g Harbor Press,Cold Spring Harbor,NYを参照のこ
と）。更にハイブリダイゼーションにより形成される二
重らせんポリヌクレオチドの誤対合は、二重らせんポリ
ヌクレオチドにおける一本鎖配列を特異的に分解するよ
うS1のようなヌクレアーゼによる分解を含む既知の技術
により検定されうる。
誘導されるポリヌクレオチドは、示したヌクレオチド配
列から物理的に誘導される必要はないが、しかし、例え
ば化学合成、DNA複製又は逆転写を含む、ポリヌクレオ
チドが誘導される領域における塩基配列により提供され
る情報に基づいた任意の方法により作られうる。
列から物理的に誘導される必要はないが、しかし、例え
ば化学合成、DNA複製又は逆転写を含む、ポリヌクレオ
チドが誘導される領域における塩基配列により提供され
る情報に基づいた任意の方法により作られうる。
同様に、指定配列から「誘導される」ポリペプチド、例
えばセルロースシンターゼＢは、この配列においてコー
ド化されたポリペプチド又はそのタンパク質のアミノ酸
配列と同一の配列を有するポリペプチドを称し、そして
その一部はこの配列におけるコード化ポリペプチドと免
疫学的に同等であるか、又は本明細書に記載するインビ
トロもしくはインビボアッセイにおいて対照タンパク質
の生物学活性と同等の活性を示す少なくとも５−10のア
ミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも10−15のアミ
ノ酸より成る。
えばセルロースシンターゼＢは、この配列においてコー
ド化されたポリペプチド又はそのタンパク質のアミノ酸
配列と同一の配列を有するポリペプチドを称し、そして
その一部はこの配列におけるコード化ポリペプチドと免
疫学的に同等であるか、又は本明細書に記載するインビ
トロもしくはインビボアッセイにおいて対照タンパク質
の生物学活性と同等の活性を示す少なくとも５−10のア
ミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも10−15のアミ
ノ酸より成る。
アミノ酸配列に関して本明細書に用いる「実質的に相
応」は、通常10未満のアミノ酸による相違、より通常に
は５未満のアミノ酸による相違を称する。組換タンパク
質「Ａ」，「Ｂ」，「Ｃ」又は「Ｄ」のいづれも、天然
タンパク質と実質的に同等の生学的特性を示した。この
生物学的特性には免疫学的特性が含まれ、真のタンパク
質に対して得られる抗体はこの組換タンパク質と交叉反
応する。
応」は、通常10未満のアミノ酸による相違、より通常に
は５未満のアミノ酸による相違を称する。組換タンパク
質「Ａ」，「Ｂ」，「Ｃ」又は「Ｄ」のいづれも、天然
タンパク質と実質的に同等の生学的特性を示した。この
生物学的特性には免疫学的特性が含まれ、真のタンパク
質に対して得られる抗体はこの組換タンパク質と交叉反
応する。
セルロースシンターゼの生産のために有用なポリペプチ
ドを特徴付けるために本明細書で用いる語「組換ポリペ
プチド」は、ゲノミック、cDNA、半合成又は合成核酸配
列により、その起源又は操作によりコード化されたポリ
ペプチドを意図し、 （１）これらは天然又はライブラリーの形においてそれ
らが関連するポリヌクレオチドの全て又は一部に結合す
るのではなく；そして／又は （２）その天然の形において結合するそれら以外のポリ
ヌクレオチドと結合している。
ドを特徴付けるために本明細書で用いる語「組換ポリペ
プチド」は、ゲノミック、cDNA、半合成又は合成核酸配
列により、その起源又は操作によりコード化されたポリ
ペプチドを意図し、 （１）これらは天然又はライブラリーの形においてそれ
らが関連するポリヌクレオチドの全て又は一部に結合す
るのではなく；そして／又は （２）その天然の形において結合するそれら以外のポリ
ヌクレオチドと結合している。
「表現システム」は、作動連結している目的のコード化
配列及びコントロール配列を含むDNA配列を称し、これ
らの配列により形質転換された宿主はこのコード化タン
パク質を生産できる。形質転換を行うため、この表現シ
ステムはベクター上に含まれることができ；しかしなが
ら、この関連DNAは宿主染色体に一体化せしめることも
できる。
配列及びコントロール配列を含むDNA配列を称し、これ
らの配列により形質転換された宿主はこのコード化タン
パク質を生産できる。形質転換を行うため、この表現シ
ステムはベクター上に含まれることができ；しかしなが
ら、この関連DNAは宿主染色体に一体化せしめることも
できる。
「感受性宿主細胞」は、宿主細胞に耐性を授ける遺伝子
を含むDNAセグメントなしでは、与えられた抗生物質の
存在下において生育できない宿主細胞に関する。
を含むDNAセグメントなしでは、与えられた抗生物質の
存在下において生育できない宿主細胞に関する。
本明細書に用いる語「ベクター」は核酸を宿主細胞に移
し入れるのに適するポリヌクレオチドに関する。この語
はプラスミド、ミニ−クロモソーム、ファージ、むき出
しDNA等を含む。
し入れるのに適するポリヌクレオチドに関する。この語
はプラスミド、ミニ−クロモソーム、ファージ、むき出
しDNA等を含む。
B.一般的説明
細菌セルロースシンターゼオペロンの１又は複数のDNA
配列コード化遺伝子を得るための以下に示す方法は、単
に実例を示す目的であり、それらは典型的に利用されう
るものである。しかしながら、遺伝子が同定できたのな
ら、その他の当業界において理解される方法も用いられ
うる。
配列コード化遺伝子を得るための以下に示す方法は、単
に実例を示す目的であり、それらは典型的に利用されう
るものである。しかしながら、遺伝子が同定できたのな
ら、その他の当業界において理解される方法も用いられ
うる。
細菌セルロースシンターゼオペロンに対するコード化配
列の採取 細菌セルロースシンターゼオペロンをコード化するポリ
ヌクレオチドは、例に記載した通りアセトバクターDNA
ライブラリーから得られ、そしてこの遺伝子を同定する
ために遺伝的相補性を利用した。
列の採取 細菌セルロースシンターゼオペロンをコード化するポリ
ヌクレオチドは、例に記載した通りアセトバクターDNA
ライブラリーから得られ、そしてこの遺伝子を同定する
ために遺伝的相補性を利用した。
細菌セルロースシンターゼオペロンをコード化するヌク
レオチド配列を得るための方法は、アセトバクターDNA
についての適用化を必要とする多数の個々の段階を利用
し、そしてそれは（１）セルロース陰性（Cel）突然変
異アセトバクター株の準備及び特徴付け；（２）クロー
ニングのための適切なベクターの作成；（３）アセトバ
クターDNAライブラリー作製；（４）Cel−アセトバクタ
ー突然変異におけるセルロースシンターゼ活性を復帰せ
しめることができるDNA挿入配列の同定及び単離；
（５）配列分析及びセルロースシンターゼコード化配列
の局在の両者のための細菌セルロースシンターゼオペロ
ンをコード化するヌクレオチド配列の地図化及びサブク
ローニング；並びに（６）セルロースシンターゼオペロ
ンの生成物をコード化するDNAのクローニング及び表現
を含む。
レオチド配列を得るための方法は、アセトバクターDNA
についての適用化を必要とする多数の個々の段階を利用
し、そしてそれは（１）セルロース陰性（Cel）突然変
異アセトバクター株の準備及び特徴付け；（２）クロー
ニングのための適切なベクターの作成；（３）アセトバ
クターDNAライブラリー作製；（４）Cel−アセトバクタ
ー突然変異におけるセルロースシンターゼ活性を復帰せ
しめることができるDNA挿入配列の同定及び単離；
（５）配列分析及びセルロースシンターゼコード化配列
の局在の両者のための細菌セルロースシンターゼオペロ
ンをコード化するヌクレオチド配列の地図化及びサブク
ローニング；並びに（６）セルロースシンターゼオペロ
ンの生成物をコード化するDNAのクローニング及び表現
を含む。
クローン化配列の確認は、組換的に生成した細菌セルロ
ースシンターゼのＮ末端アミノ酸配列と天然のアセトバ
クター源から精製したものとを比較することにより行わ
れる。更に、クローン化ヌクレオチド配列から推定され
るアミノ酸配列を、天然のアセトバクター源から得ら
れ、且つ精製したタンパク質の一次配列と比較すること
がある。
ースシンターゼのＮ末端アミノ酸配列と天然のアセトバ
クター源から精製したものとを比較することにより行わ
れる。更に、クローン化ヌクレオチド配列から推定され
るアミノ酸配列を、天然のアセトバクター源から得ら
れ、且つ精製したタンパク質の一次配列と比較すること
がある。
セルロースシンターゼをコード化する遺伝子のクローン
化の試みは、Ｂ遺伝子の同定により最初に導かれる。セ
ルロースシンターゼＢ遺伝子がクローン化及びシーケン
ス化されても、この遺伝子の５′末端の解読は種々の理
由により困難である。例えば、アセトバクターにおける
転写及び翻訳シグナルは特徴付けられていなく、そし
て、E.コリコントロールシグナルについても知られてい
る同様の、又は類似のコントロールシグナルはアラニン
（精製した天然タンパク質のＮ末端残基）についてのコ
ドンの上流領域において存在していなかった。しかしな
がら、この遺伝子上流のオープンリーディングフレーム
の接近性は、この遺伝子の多シストロン情報の一部であ
ることを推定させる。それ故、この遺伝子の上流及び下
流両者のオープンリーディングフレームの配列の更なる
研究が本明細書に記載通りに行われた。これらの研究に
より、シングルプロモーター５′末端に、そして転写終
結領域の３′末端に連結する４つ密接にリンクした遺伝
子が同定された。
化の試みは、Ｂ遺伝子の同定により最初に導かれる。セ
ルロースシンターゼＢ遺伝子がクローン化及びシーケン
ス化されても、この遺伝子の５′末端の解読は種々の理
由により困難である。例えば、アセトバクターにおける
転写及び翻訳シグナルは特徴付けられていなく、そし
て、E.コリコントロールシグナルについても知られてい
る同様の、又は類似のコントロールシグナルはアラニン
（精製した天然タンパク質のＮ末端残基）についてのコ
ドンの上流領域において存在していなかった。しかしな
がら、この遺伝子上流のオープンリーディングフレーム
の接近性は、この遺伝子の多シストロン情報の一部であ
ることを推定させる。それ故、この遺伝子の上流及び下
流両者のオープンリーディングフレームの配列の更なる
研究が本明細書に記載通りに行われた。これらの研究に
より、シングルプロモーター５′末端に、そして転写終
結領域の３′末端に連結する４つ密接にリンクした遺伝
子が同定された。
これらの遺伝子生成物のそれぞれの正確な機能は確認さ
れていないが、相補性の研究が示すには、セルロースシ
ンターゼ活性において欠損する株は遺伝子Ｂにより補完
されることができ、そしてセルロースシンターゼ及びジ
グアニレートサイクラーゼ活性の両者において欠損する
このセルロース陰性突然変異は遺伝子Ａにより補完され
る。セルロース陰性クラスIII突然変異は、遺伝子Ｃ及
びＤについてのコード化するDNAフラグメントにより補
完される。このグループにおける突然変異はインビトロ
においてセルロースを作り、そしてセルロース生産に必
要に全ての酵素活性を有する。遺伝子Ｄはセルロース合
成に関連するタンパク質をコード化する。この遺伝子の
分解はセルロースの合成を明らかに低める。
れていないが、相補性の研究が示すには、セルロースシ
ンターゼ活性において欠損する株は遺伝子Ｂにより補完
されることができ、そしてセルロースシンターゼ及びジ
グアニレートサイクラーゼ活性の両者において欠損する
このセルロース陰性突然変異は遺伝子Ａにより補完され
る。セルロース陰性クラスIII突然変異は、遺伝子Ｃ及
びＤについてのコード化するDNAフラグメントにより補
完される。このグループにおける突然変異はインビトロ
においてセルロースを作り、そしてセルロース生産に必
要に全ての酵素活性を有する。遺伝子Ｄはセルロース合
成に関連するタンパク質をコード化する。この遺伝子の
分解はセルロースの合成を明らかに低める。
遺伝子A,C及びＤはイビトロでのセルロース合成に必要
な調節、構造、膜結合、又はプロセッシングタンパク質
をコード化しうる。それぞれの遺伝子生成物コード化配
列の有用性は、セルロース合成の機構の更なる解明のた
めの研究のための大量の各タンパク質の合成を可能にす
ることにある。
な調節、構造、膜結合、又はプロセッシングタンパク質
をコード化しうる。それぞれの遺伝子生成物コード化配
列の有用性は、セルロース合成の機構の更なる解明のた
めの研究のための大量の各タンパク質の合成を可能にす
ることにある。
細菌セルロースシンターゼの表現型
本発明の１方法により、セルロースシンターゼオペロン
をコード化するポリヌクレオチドを、適切なベクターの
中でクローン化せしめ、適切な微生物宿主の中に形質転
換せしめ、そしてセルロースシンターゼの表現を可能に
する条件のもとで培養せしめた。他方、このオペロンに
おける各遺伝子の配列同定ができたのなら、各遺伝子は
それぞれクローン化され、そして所望の遺伝子生成物を
生産するために表現されうる。
をコード化するポリヌクレオチドを、適切なベクターの
中でクローン化せしめ、適切な微生物宿主の中に形質転
換せしめ、そしてセルロースシンターゼの表現を可能に
する条件のもとで培養せしめた。他方、このオペロンに
おける各遺伝子の配列同定ができたのなら、各遺伝子は
それぞれクローン化され、そして所望の遺伝子生成物を
生産するために表現されうる。
セルロースシンターゼオペロン遺伝子生成物をコード化
するポリヌクレオチド配列の転写は、内因性アセトバク
タープロモーターを用いて行うか、又は択一的に、E.コ
リ又はB.スブチリス（B.subtilis）由来のものを含む異
種細菌プロモーターにより行われうる。本明細書に記載
の多種の異種プロモーター、例えばlac,trp及びtacは調
節プロモーターであり、そしてそれ故本発明の方法にお
いて細菌セルロースシンターゼオペロンの表現のコント
ロールのために有用である。しかしながら、プロモータ
ー、例えば温度感受性リプレッサー（即ち、37℃以上で
は非機能性）により調節されるPLプロモーターは、多数
のアセトバクター株において作動せず、なぜならこれら
の株は通常35℃又はそれ以下で培養され、そしてこの温
度範囲以上では生育しないからである。
するポリヌクレオチド配列の転写は、内因性アセトバク
タープロモーターを用いて行うか、又は択一的に、E.コ
リ又はB.スブチリス（B.subtilis）由来のものを含む異
種細菌プロモーターにより行われうる。本明細書に記載
の多種の異種プロモーター、例えばlac,trp及びtacは調
節プロモーターであり、そしてそれ故本発明の方法にお
いて細菌セルロースシンターゼオペロンの表現のコント
ロールのために有用である。しかしながら、プロモータ
ー、例えば温度感受性リプレッサー（即ち、37℃以上で
は非機能性）により調節されるPLプロモーターは、多数
のアセトバクター株において作動せず、なぜならこれら
の株は通常35℃又はそれ以下で培養され、そしてこの温
度範囲以上では生育しないからである。
異種プロモーターの制御は陽性又は陰性コントロール要
素のいづれも利用できる。例えば、異種プロモーターと
結合したオペレーターを認識するリプレッサー（例え
ば、lacIリプレッサー）をコード化する遺伝子を宿主系
に導入することがある。他方、生育培地に存在するトリ
プトファンのレベルは、trpプローモーターの制御を提
供することができる。
素のいづれも利用できる。例えば、異種プロモーターと
結合したオペレーターを認識するリプレッサー（例え
ば、lacIリプレッサー）をコード化する遺伝子を宿主系
に導入することがある。他方、生育培地に存在するトリ
プトファンのレベルは、trpプローモーターの制御を提
供することができる。
また、セルロースシンターゼオペロンのコントロール表
現のための他の手段は、mRNA転写物を安定化せしめるた
めの異種転写ターミネーターを利用しうる。例えば、B.
スリンジェネシス（B.thuringienesis）の結晶タンパク
質から単離された転写ターミネーターは、E.コリ及びB.
スブチリス（B.subtilis）における多くのタンパク質の
表現レベルを、それらのmRNAを安定化せしめることによ
り増大することが示されている。同様に、このターミネ
ーター又はその他のこのようなターミネーターは、アセ
トバクターにおけるセルロースシンターゼオペロンから
のmRNAのレベルを高めるために用いられうる。高められ
たmRNAのレベルは、組換アセトバクター株におけるセル
ロース合成を高めるものと予想できる。
現のための他の手段は、mRNA転写物を安定化せしめるた
めの異種転写ターミネーターを利用しうる。例えば、B.
スリンジェネシス（B.thuringienesis）の結晶タンパク
質から単離された転写ターミネーターは、E.コリ及びB.
スブチリス（B.subtilis）における多くのタンパク質の
表現レベルを、それらのmRNAを安定化せしめることによ
り増大することが示されている。同様に、このターミネ
ーター又はその他のこのようなターミネーターは、アセ
トバクターにおけるセルロースシンターゼオペロンから
のmRNAのレベルを高めるために用いられうる。高められ
たmRNAのレベルは、組換アセトバクター株におけるセル
ロース合成を高めるものと予想できる。
得られる作製物は、適切なセルロース生産微生物に挿入
せしめ、そして適当な表現ベクターを用いるか、又はも
しプラスミドの不安定性さが問題なら、このプロモータ
ー遺伝子構造を宿主微生物の染色体の中に直接組入れる
かのいづれかでそれぞれ複製せしめる。このセルロース
生産宿主微生物はセルロースシンターゼ陰性株か、又は
セルロースシンターゼ陽性株のいづれかでありうる。前
者の例において、１又は複数のセルロースシンターゼオ
ペロン遺伝子は宿主微生物のセルロース生産能力を復帰
せしめるであろう。後者の例において、組換セルロース
シンターゼオペロンの誘導が組換株のセルロースシンタ
ーゼ活性及びセルロース生産の両者を高めることが予想
できる。
せしめ、そして適当な表現ベクターを用いるか、又はも
しプラスミドの不安定性さが問題なら、このプロモータ
ー遺伝子構造を宿主微生物の染色体の中に直接組入れる
かのいづれかでそれぞれ複製せしめる。このセルロース
生産宿主微生物はセルロースシンターゼ陰性株か、又は
セルロースシンターゼ陽性株のいづれかでありうる。前
者の例において、１又は複数のセルロースシンターゼオ
ペロン遺伝子は宿主微生物のセルロース生産能力を復帰
せしめるであろう。後者の例において、組換セルロース
シンターゼオペロンの誘導が組換株のセルロースシンタ
ーゼ活性及びセルロース生産の両者を高めることが予想
できる。
染色体セルロースシンターゼオペロンプロモーターの異
種細菌プロモーターによる置換は、セルロースシンター
ゼを過剰表現せしめるために設計するプラスミドシステ
ムにおいて複数の利点を有す。染色体プロモーター置換
は、プラスミドの不安定さに起因しうるあらゆる潜在的
な問題を回避せしめる。これはまた、プラスミド選別を
支持する抗生物質の必要性を取り除く。最後に、染色体
プロモーター置換はアセトバクター由来のオペロンのコ
ントロールを取り除き、より強い構成プロモーター、又
は制御プロモーターを利用するコントロールの提供を可
能にする。
種細菌プロモーターによる置換は、セルロースシンター
ゼを過剰表現せしめるために設計するプラスミドシステ
ムにおいて複数の利点を有す。染色体プロモーター置換
は、プラスミドの不安定さに起因しうるあらゆる潜在的
な問題を回避せしめる。これはまた、プラスミド選別を
支持する抗生物質の必要性を取り除く。最後に、染色体
プロモーター置換はアセトバクター由来のオペロンのコ
ントロールを取り除き、より強い構成プロモーター、又
は制御プロモーターを利用するコントロールの提供を可
能にする。
本発明の細菌セルロースシンターゼオペロンの遺伝子を
コード化するヌクレオチド配列は、E.コリ、ストレプト
マイシス（Streptomyces）、アセトバクター、アグロバ
クター（Agrobacteria）、リゾビウム（Rhizobium）、
シュードモナス（Pseudomonas）、アルカリゲネス（Alc
aligenes）、チモモナス（Zymomonas）、ズーグロエア
（Zoogloea）、青緑藻類及びサルシナベントリキュリ
（Sarcina ventriculi）を含む種々の原核細胞系におい
て表現されることができ、その中でE.コリ及びアセトバ
クターが好ましい。
コード化するヌクレオチド配列は、E.コリ、ストレプト
マイシス（Streptomyces）、アセトバクター、アグロバ
クター（Agrobacteria）、リゾビウム（Rhizobium）、
シュードモナス（Pseudomonas）、アルカリゲネス（Alc
aligenes）、チモモナス（Zymomonas）、ズーグロエア
（Zoogloea）、青緑藻類及びサルシナベントリキュリ
（Sarcina ventriculi）を含む種々の原核細胞系におい
て表現されることができ、その中でE.コリ及びアセトバ
クターが好ましい。
セルロースシンターゼは細菌由来のため、セルロースシ
ンターゼの表現のために適するベクターは当業界におい
て知られ、そして酢酸細菌、例えばアセトバクターのた
めの宿主−ベクターシステムの発育のためのハイブリド
シャトルベクターを含みうる。Fukuya,et al,（1985）A
gric.Biol.Chem.49:2083−2093には、選択を可能にする
抗生物質遺伝子マーカーを有し、そして、E.コリ及びア
セトバクターにおいて複製の可能な、比較的小さいサイ
ズの複数のシャトルベクターが記載されている。Fukuy
a,et al,（1989）App.Env.Microbiol.55:171−176に
は、E.コリ及びアセトバクター種のためのシャトルベク
ター、pmv24であって、β−ガラクトシダーゼを有する
融合タンパク質としてのクローン配列の翻訳を行うもの
が記載されている。
ンターゼの表現のために適するベクターは当業界におい
て知られ、そして酢酸細菌、例えばアセトバクターのた
めの宿主−ベクターシステムの発育のためのハイブリド
シャトルベクターを含みうる。Fukuya,et al,（1985）A
gric.Biol.Chem.49:2083−2093には、選択を可能にする
抗生物質遺伝子マーカーを有し、そして、E.コリ及びア
セトバクターにおいて複製の可能な、比較的小さいサイ
ズの複数のシャトルベクターが記載されている。Fukuy
a,et al,（1989）App.Env.Microbiol.55:171−176に
は、E.コリ及びアセトバクター種のためのシャトルベク
ター、pmv24であって、β−ガラクトシダーゼを有する
融合タンパク質としてのクローン配列の翻訳を行うもの
が記載されている。
本発明はまた、セルロースシンターゼ遺伝子のクローニ
ング及び表現において用いるための内因性アセトバクタ
ーベクターを提供する。このp824と称されるベクターは
小さく、そして本明細書に記載のpKT230 cos5コンジュ
ゲーションベクター上に存在する大きな動員（mobiliza
tion）領域が欠落している。p824の小さいサイズは、ク
ローニングベクターとしての操作を容易にする。このベ
クターにおける挿入DNAの分析もその小さいサイズに奇
因して大いに促進されるであろう。このp824ベクター
は、１つのアセトバクター宿主からの遺伝子を別のもの
に直接的にクローンするのに利用でき、これにより宿主
限定障害、及びE.コリからアセトバクターへの、pKT230
cos5コスミドの接合にわたり起こる一連の再配列／欠
損を最小にする。
ング及び表現において用いるための内因性アセトバクタ
ーベクターを提供する。このp824と称されるベクターは
小さく、そして本明細書に記載のpKT230 cos5コンジュ
ゲーションベクター上に存在する大きな動員（mobiliza
tion）領域が欠落している。p824の小さいサイズは、ク
ローニングベクターとしての操作を容易にする。このベ
クターにおける挿入DNAの分析もその小さいサイズに奇
因して大いに促進されるであろう。このp824ベクター
は、１つのアセトバクター宿主からの遺伝子を別のもの
に直接的にクローンするのに利用でき、これにより宿主
限定障害、及びE.コリからアセトバクターへの、pKT230
cos5コスミドの接合にわたり起こる一連の再配列／欠
損を最小にする。
内因性プラスミドを直接的なアセトバクター−アセトバ
クター移動のために用いることができ、そして又シャト
ルベクターの増殖のためにも用いられうる。それ故、本
発明は又、例えばE.コリのlacプロモーター及びその翻
訳開始シグナルを利用する所望の配列の直接的な転写及
び翻訳を可能にする適当なコントロール配列を利用し
て、クローニング及び表現ベクター（E.コリ及びアセト
バクター種のため）の両方を提供する。これらのベクタ
ーによるアセトバクターの形質転換は、種々のタイプの
クローニング及び表現実験のために有用な形質転換効率
をもたらす。
クター移動のために用いることができ、そして又シャト
ルベクターの増殖のためにも用いられうる。それ故、本
発明は又、例えばE.コリのlacプロモーター及びその翻
訳開始シグナルを利用する所望の配列の直接的な転写及
び翻訳を可能にする適当なコントロール配列を利用し
て、クローニング及び表現ベクター（E.コリ及びアセト
バクター種のため）の両方を提供する。これらのベクタ
ーによるアセトバクターの形質転換は、種々のタイプの
クローニング及び表現実験のために有用な形質転換効率
をもたらす。
タンパク質の回収
組換セルロースシンターゼの精製は、天然物質の回収の
ために用いる方法と類似する方法により行われる。一般
に培養細胞は機械的又は酵素的手段、例えばフレンチプ
レス、超音波処理又はリゾチーム及びEDTAによる処理に
より破壊され、その後遠心してセルロースシンターゼ活
性を含むペレットを回収する。
ために用いる方法と類似する方法により行われる。一般
に培養細胞は機械的又は酵素的手段、例えばフレンチプ
レス、超音波処理又はリゾチーム及びEDTAによる処理に
より破壊され、その後遠心してセルロースシンターゼ活
性を含むペレットを回収する。
このペレットを再懸濁し、そして遠心して可溶性タンパ
ク質を除去し、そしてこの集めたペレットを清浄剤、例
えばジギトニン又は20％のグリセロールを有するトリト
ンＸ−100により溶解せしめる。任意的に、この所望の
活性を限外濾過又は遠心を利用して濃縮せしめる。
ク質を除去し、そしてこの集めたペレットを清浄剤、例
えばジギトニン又は20％のグリセロールを有するトリト
ンＸ−100により溶解せしめる。任意的に、この所望の
活性を限外濾過又は遠心を利用して濃縮せしめる。
この酵素は、その他の清浄剤溶解タンパク質から分離せ
しめるためにそれ自体の不溶性生成物、セルロースを利
用して捕獲される。この捕獲酵素はセルロースから、精
製セルラーゼによるセルロースの分解により回収されう
る。
しめるためにそれ自体の不溶性生成物、セルロースを利
用して捕獲される。この捕獲酵素はセルロースから、精
製セルラーゼによるセルロースの分解により回収されう
る。
標準方法
細胞の形質転換、ベクターの作製、相補の達成等のため
に利用されるほとんどの技術は当業界において広く実施
され、そしてほとんどの実施者は特定の条件及び方法の
記載する標準的な原料の資料について精通している（例
えば、Sambrookら（1989）を参照のこと）。
に利用されるほとんどの技術は当業界において広く実施
され、そしてほとんどの実施者は特定の条件及び方法の
記載する標準的な原料の資料について精通している（例
えば、Sambrookら（1989）を参照のこと）。
他に、Miller,J.M.（1972）Experiments in Molecular
Genetics,Cold Spring Harbor,NYは、細胞のコンジュゲ
ーション実験のために有用な一般的な方法を提供する。
しかしながら、便宜上以下の段落を説明文として提供す
る。
Genetics,Cold Spring Harbor,NYは、細胞のコンジュゲ
ーション実験のために有用な一般的な方法を提供する。
しかしながら、便宜上以下の段落を説明文として提供す
る。
コントロール配列及び関連宿主
原核細胞は種々のE.コリ株によく代表される。しかしな
がらその他の微生物株、例えばバチルススブチリス（Bu
tillus Subtilis）、いろいろな種のアセトバクター、
シュートモナス及びストレプトマイシスも利用されう
る。このような原核細胞系において、複製部位及びコン
トロール配列を有する、各宿主に適合する種由来のベク
ターが利用される。例えば、E.コリは、例えばpKT230で
あってアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATC
C）、Rockville,MD（ATCC.No.37294）から入手でき、そ
してBagdasarianら（1981）Gene 16:237−247に記載の
ベクター、又はpBR322の遊動体であってE.コリ種由来
の、そしてBolivarら（1977）Gene 2:95に記載のプラス
ミドを用いて形質転換されうる。
がらその他の微生物株、例えばバチルススブチリス（Bu
tillus Subtilis）、いろいろな種のアセトバクター、
シュートモナス及びストレプトマイシスも利用されう
る。このような原核細胞系において、複製部位及びコン
トロール配列を有する、各宿主に適合する種由来のベク
ターが利用される。例えば、E.コリは、例えばpKT230で
あってアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATC
C）、Rockville,MD（ATCC.No.37294）から入手でき、そ
してBagdasarianら（1981）Gene 16:237−247に記載の
ベクター、又はpBR322の遊動体であってE.コリ種由来
の、そしてBolivarら（1977）Gene 2:95に記載のプラス
ミドを用いて形質転換されうる。
プラスミドpKT230はレプリケーション由来のブロードホ
ストレンジ（brood host range）、レプリケーション由
来のE.コリ、コンジュゲーションに必要な遺伝子及びス
トレプトマインン耐性マーカーを有する。プラスミドpB
R322はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性について
の遺伝子を含み、それ故目的のベクターの作製において
保持されるか破壊されることができる付加マーカーを提
供する。本明細書で転写開始のためのプローモーターを
含むものと定義する、一般に利用される、任意的にオペ
レーターを有し、リボソーム結合部位配列を有する、通
常利用される原核細胞コントロール配列には、ベーター
−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）のような通常利用さ
れるプロモーター、並びにラクトース（lac）プローモ
ーターシステム（Changら（1977）Nature 198:1056）、
トリプトファン（trp）プロモーターシステム（Goeddel
ら（1980）Nucleic Acids.Res.8:4057）、ハイブリドta
cプロモーター（De Boerら、（1983）Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 80:21−25）、及びムダ誘導PLプロモーター（Sh
imatakeら（1981）Nature 292:128）、更にＮ遺伝子リ
ボソーム結合部位を含み、これはポータブルコントロー
ルカセットとして有用に作製されている。1987年12月８
日出願の米国特許4,711,845号にこのポータブルコント
ロール配列が記載され、これはPLプロモーターである第
1DNA配列を含んで成る。このプロモーターは第2DNA配列
と作動連結し、この第2DNA配列はNRBS配列の３′側の６
塩基対以内に切断を可能とする少なくとも１つの制限部
位を有する第３のDNA配列のNRBS上流に対応する、1987
年５月19日出願の米国特許第4,666,848号は細菌セルロ
ースシンターゼを表現するのに有用な高められた表現能
力を有する更なるベクターを開示する。更に有用なの
は、本明細書に参考文献として組入れている1986年10月
８日公開の欧州特許公開196,864号におけるChangらによ
り説明されたアルカリホスファターゼ（pho A）系であ
る。これらの公開物は有用な表現システムを提供する
が、原核細胞に適用できるあらゆる有用なプロモーター
システムが用いられうる。
ストレンジ（brood host range）、レプリケーション由
来のE.コリ、コンジュゲーションに必要な遺伝子及びス
トレプトマインン耐性マーカーを有する。プラスミドpB
R322はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性について
の遺伝子を含み、それ故目的のベクターの作製において
保持されるか破壊されることができる付加マーカーを提
供する。本明細書で転写開始のためのプローモーターを
含むものと定義する、一般に利用される、任意的にオペ
レーターを有し、リボソーム結合部位配列を有する、通
常利用される原核細胞コントロール配列には、ベーター
−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）のような通常利用さ
れるプロモーター、並びにラクトース（lac）プローモ
ーターシステム（Changら（1977）Nature 198:1056）、
トリプトファン（trp）プロモーターシステム（Goeddel
ら（1980）Nucleic Acids.Res.8:4057）、ハイブリドta
cプロモーター（De Boerら、（1983）Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 80:21−25）、及びムダ誘導PLプロモーター（Sh
imatakeら（1981）Nature 292:128）、更にＮ遺伝子リ
ボソーム結合部位を含み、これはポータブルコントロー
ルカセットとして有用に作製されている。1987年12月８
日出願の米国特許4,711,845号にこのポータブルコント
ロール配列が記載され、これはPLプロモーターである第
1DNA配列を含んで成る。このプロモーターは第2DNA配列
と作動連結し、この第2DNA配列はNRBS配列の３′側の６
塩基対以内に切断を可能とする少なくとも１つの制限部
位を有する第３のDNA配列のNRBS上流に対応する、1987
年５月19日出願の米国特許第4,666,848号は細菌セルロ
ースシンターゼを表現するのに有用な高められた表現能
力を有する更なるベクターを開示する。更に有用なの
は、本明細書に参考文献として組入れている1986年10月
８日公開の欧州特許公開196,864号におけるChangらによ
り説明されたアルカリホスファターゼ（pho A）系であ
る。これらの公開物は有用な表現システムを提供する
が、原核細胞に適用できるあらゆる有用なプロモーター
システムが用いられうる。
アセトバクターの中へのDNAの導入
A.コンジュゲーション
コンジュゲーションは異種のDNAを目的の宿主細胞に移
送するために有用な技術である。本発明において作製し
たコスミドベクターはE.コリから、異なる細菌宿主、例
えばアセトバクターにおける複製のために移送せしめる
ことは容易でない。このような場合において、ヘルパー
プラスミド、例えばpRK2013（Figursik and Helinski,
（1979）Proc.Natl.Acad.Sci USA 76:164801652）が、
目的のDNAインサートを含むコスミドベクターを、提供
細胞から受容細胞への移送においての補助に利用されう
る。提供物を受け取った細胞は、形質転換受容細胞が耐
性である抗生物質を含むプレート上において増殖せしめ
ることにより選別せしめた。ミラー（Miller、前述）
は、受容細胞の選別のために滋養マーカーを利用するコ
ンジュゲーション方法を開示している。他の、大まかな
スクリーニングのために適する方法は、例Ｖに詳細に記
載する「多スポットコンジュゲーション方法」である。
送するために有用な技術である。本発明において作製し
たコスミドベクターはE.コリから、異なる細菌宿主、例
えばアセトバクターにおける複製のために移送せしめる
ことは容易でない。このような場合において、ヘルパー
プラスミド、例えばpRK2013（Figursik and Helinski,
（1979）Proc.Natl.Acad.Sci USA 76:164801652）が、
目的のDNAインサートを含むコスミドベクターを、提供
細胞から受容細胞への移送においての補助に利用されう
る。提供物を受け取った細胞は、形質転換受容細胞が耐
性である抗生物質を含むプレート上において増殖せしめ
ることにより選別せしめた。ミラー（Miller、前述）
は、受容細胞の選別のために滋養マーカーを利用するコ
ンジュゲーション方法を開示している。他の、大まかな
スクリーニングのために適する方法は、例Ｖに詳細に記
載する「多スポットコンジュゲーション方法」である。
B.形質転換
用いた宿主細胞に依存して形質転換は、このような細胞
に適切な標準的化学的技術を用いて行うか、又はエレク
トロポレーションを用いうる。例えば、Cohen,S.N.,（1
972）Proc.Natl.Acad.Sic.USA 69:2110に記載の塩化カ
ルシウムを利用するカルシウム処理が、実質的に細胞壁
バリアーを含む原核細胞又はその他の細胞のために用い
られる。
に適切な標準的化学的技術を用いて行うか、又はエレク
トロポレーションを用いうる。例えば、Cohen,S.N.,（1
972）Proc.Natl.Acad.Sic.USA 69:2110に記載の塩化カ
ルシウムを利用するカルシウム処理が、実質的に細胞壁
バリアーを含む原核細胞又はその他の細胞のために用い
られる。
特徴付けされていない種の化学的方法の不利な点は、ど
のプロトコールによる成功の機会も小さいことであり、
それ故、有用なレベルの形質転換を得る条件の最適化の
ための実験が必要でありうる。最近、細菌を強力な電場
にさらすことがシュードモナス及びE.コリを含む広範囲
の細菌の形質転換に有用であることが示された。細菌に
適用するエレクトロポレーションは1983年から利用され
ている（Shivarovaら（1983）Z.Allg.Microbial 23:59
5）。Dowerら（（1988）Nuc.Acid.Res.16:6127）は、E.
コリにおけるエレクトロポレーションの効率は、化学的
手段により得られる最高のレベルよりも10から100倍で
あることを示している。
のプロトコールによる成功の機会も小さいことであり、
それ故、有用なレベルの形質転換を得る条件の最適化の
ための実験が必要でありうる。最近、細菌を強力な電場
にさらすことがシュードモナス及びE.コリを含む広範囲
の細菌の形質転換に有用であることが示された。細菌に
適用するエレクトロポレーションは1983年から利用され
ている（Shivarovaら（1983）Z.Allg.Microbial 23:59
5）。Dowerら（（1988）Nuc.Acid.Res.16:6127）は、E.
コリにおけるエレクトロポレーションの効率は、化学的
手段により得られる最高のレベルよりも10から100倍で
あることを示している。
２つの基本的なパラメーターがエレクトロポレーション
の効率に影響する。１つは電場の強さであり、そして他
方は電場の強さが衰退する時間（パルス持続時間）であ
る。任意的に、細胞は一定の電極距離（ｄ）を有するス
ペクトロフォトメーター型キュベロットにおいて電場
（Ｅ）を受ける。それ故、キュベロットに適用される電
圧（Ｖ）は電場力を決める（Ｅ＝V/d）。サンプルへの
正確な電圧の伝搬は、電荷を最初にコンデンサーに溜め
ることで行われる。パルス持続時間、電場の分散は一般
に指数式において導かれ、そして衰退の持続時間は一連
のコンデンサー及び並列抵抗の組合せにより決まる。
の効率に影響する。１つは電場の強さであり、そして他
方は電場の強さが衰退する時間（パルス持続時間）であ
る。任意的に、細胞は一定の電極距離（ｄ）を有するス
ペクトロフォトメーター型キュベロットにおいて電場
（Ｅ）を受ける。それ故、キュベロットに適用される電
圧（Ｖ）は電場力を決める（Ｅ＝V/d）。サンプルへの
正確な電圧の伝搬は、電荷を最初にコンデンサーに溜め
ることで行われる。パルス持続時間、電場の分散は一般
に指数式において導かれ、そして衰退の持続時間は一連
のコンデンサー及び並列抵抗の組合せにより決まる。
本明細書に示す通り、本明細書において用いるアセトバ
クター株のための最適な電場の強さは９〜9.5KVの間で
ある。25−100μＦ（シリーズ）対200−1200オームを利
用するパルス持続時間（RC値）の研究は、アセトバクタ
ー株1306−24のためには25μF/750オーム（＝18.75mse
c）が最適であることを示した。得られる形質転換のレ
ベル（約107の形質転換体／μｇ）は化学処理により得
られるものよりも約102倍高い（Fukuya,et al,（1985）
Agri.Biol.Chem.49:2091−2097）。
クター株のための最適な電場の強さは９〜9.5KVの間で
ある。25−100μＦ（シリーズ）対200−1200オームを利
用するパルス持続時間（RC値）の研究は、アセトバクタ
ー株1306−24のためには25μF/750オーム（＝18.75mse
c）が最適であることを示した。得られる形質転換のレ
ベル（約107の形質転換体／μｇ）は化学処理により得
られるものよりも約102倍高い（Fukuya,et al,（1985）
Agri.Biol.Chem.49:2091−2097）。
アセトバクターから調製したDNAの形質転換率は、E.コ
リから調製したDNAの場合よりも103倍高いことも分っ
た。
リから調製したDNAの場合よりも103倍高いことも分っ
た。
理論付けしようとは考えないが、この種の障害は非修
飾、おそらくは非メチル化E.コリDNAに基づくエンドヌ
クレアーゼ宿主制限活性に起因するであろう。このよう
な抑制障害を低める方法は本明細書に記載していない；
しかしながら、この制限障害は本明細書記載のアセトバ
クター−アセトバクターベクターを作り上げることによ
り回避できる。
飾、おそらくは非メチル化E.コリDNAに基づくエンドヌ
クレアーゼ宿主制限活性に起因するであろう。このよう
な抑制障害を低める方法は本明細書に記載していない；
しかしながら、この制限障害は本明細書記載のアセトバ
クター−アセトバクターベクターを作り上げることによ
り回避できる。
アセトバクターDNAライブラリーの作成
DNAライブラリーはアセトバクターから、アセトバクタ
ー細胞由来の核酸の単離及びサンプルにおけるRNAを分
解せしめることにより調製される。この回収したDNAを
適当な制限酵素、例えばSau3Aにより部分的に分解せし
め、そしてこのDNAを例えばスクロース勾配を利用して
逐次的にサイズ分画する。選ばれた大きさの範囲の分子
を含む画分をコスミドベクターの中にリゲートせしめ、
その後ラムダファージ粒子の中に便宜的にパッケージせ
しめる。次にこのファージ粒子を適当な宿主、例えばE.
コリに感染せしめるために用いる。挿入されたDNAの大
きさを決定するため、ランダムな数の単離体を選んでコ
スミドDNAを単離せしめ、その後このゲノムを表現すべ
き有用な数のクローンを拾い、増殖させ、そしてスクリ
ーンした。
ー細胞由来の核酸の単離及びサンプルにおけるRNAを分
解せしめることにより調製される。この回収したDNAを
適当な制限酵素、例えばSau3Aにより部分的に分解せし
め、そしてこのDNAを例えばスクロース勾配を利用して
逐次的にサイズ分画する。選ばれた大きさの範囲の分子
を含む画分をコスミドベクターの中にリゲートせしめ、
その後ラムダファージ粒子の中に便宜的にパッケージせ
しめる。次にこのファージ粒子を適当な宿主、例えばE.
コリに感染せしめるために用いる。挿入されたDNAの大
きさを決定するため、ランダムな数の単離体を選んでコ
スミドDNAを単離せしめ、その後このゲノムを表現すべ
き有用な数のクローンを拾い、増殖させ、そしてスクリ
ーンした。
ベクターの作製
目的のコード化配列及びコントロール配列を含む適当な
ベクターの作製は、当業態においてよく理解されている
リゲーション及び制限酵素技術を利用する。単離プラス
ミド、DNA配列又は合成オリゴヌクレオチドを切断せし
め、仕立て、そして目的の形に再リゲートせしめた。
ベクターの作製は、当業態においてよく理解されている
リゲーション及び制限酵素技術を利用する。単離プラス
ミド、DNA配列又は合成オリゴヌクレオチドを切断せし
め、仕立て、そして目的の形に再リゲートせしめた。
位置特異的DNA切断は、DNAを適切な制限エンドヌクレア
ーゼにより、当業界において知られる一般的な条件のも
とで行われ、その特異性はこれら商業的に入手できる制
限酵素の製造者により明確化されている。New Englang
Biolabs,Product Catalog（New Englang Biolabs,Bever
ly,MA）を参照のこと。一般に、約１μｇのDNAは、約20
μｌの緩衝溶液における１ユニットの酵素により分解さ
れる。制限酵素の過剰はDNA基質の完全な分解を確実に
するために用いられる；しかしながら、部分的分解であ
って、DNAにおける付与された制限酵素のいくつかであ
って全てでない部分が分解されることを行うことが望ま
しいことがある。このような部分分解は制限酵素の濃度
を変えること、又は制限分解の実施時間を変えることに
より達成される。約１時間から２時間で、約37℃でのイ
ンキュベーションが有用であるが、その変更も可能であ
る。それぞれのインキュベーション後、タンパク質はフ
ェノール／クロロホルムによる抽出により取り除かれ、
そしてその後エーテル抽出せしめることがあり、そして
この核酸はエタノール沈澱による水性画分から回収され
る。必要ならば、分解フラグメントのサイズ選別を標準
技術を利用するポリアクリルアミドゲル又はアガロース
ゲル電気泳動により行うことがある。サイズ選別の一般
的な説明は、Methods in Enzymology（1980）65:499−5
60;Lawn et al.,（1981）Nuc.Acids Res.9:6113−6114
及びGoeddel,et al.,（1980）Nuc.Acids Res.8:405に記
載されている。制限分解フラグメントはE.コリDNAポリ
メラーゼＩ（クレノウ）の大きなフラグメントによる、
４個のデオキシリボヌクレオキド３リン酸（dNTP）の存
在仕立において、20から25℃での約15から25分間でのイ
ンキュベーション時間を利用して50mMのトリスpH7.6、5
0mMのNaCl、6mMのMgCl、6mMのdTT、約U/μｌのクレノウ
及び100μＭのdNTP中における処理によりブラント末端
にされうる。このクレノウフラグメントは、接着末端の
５′側の反対側を「埋め合わせ」するが、しかし酵素の
３′−→５′エキソクヌクレアーゼ活性は、鋳型領域の
非存在下において一本鎖の３′側の突出しを分解せしめ
る。必要ならば、選択的な修復は、その接着末端の性質
により示される制限内において１種のみの、又は選ばれ
たdNTPを供給することにより行われうる。クレノウによ
る処理後、この混合物をフェノール／クロロホルムによ
り抽出せしめ、そしてエタノール沈澱させる。S1ヌクレ
アーゼ又はBal−31による適当な条件下での処理は、任
意の一本鎖部分の加水分解をもたらす。
ーゼにより、当業界において知られる一般的な条件のも
とで行われ、その特異性はこれら商業的に入手できる制
限酵素の製造者により明確化されている。New Englang
Biolabs,Product Catalog（New Englang Biolabs,Bever
ly,MA）を参照のこと。一般に、約１μｇのDNAは、約20
μｌの緩衝溶液における１ユニットの酵素により分解さ
れる。制限酵素の過剰はDNA基質の完全な分解を確実に
するために用いられる；しかしながら、部分的分解であ
って、DNAにおける付与された制限酵素のいくつかであ
って全てでない部分が分解されることを行うことが望ま
しいことがある。このような部分分解は制限酵素の濃度
を変えること、又は制限分解の実施時間を変えることに
より達成される。約１時間から２時間で、約37℃でのイ
ンキュベーションが有用であるが、その変更も可能であ
る。それぞれのインキュベーション後、タンパク質はフ
ェノール／クロロホルムによる抽出により取り除かれ、
そしてその後エーテル抽出せしめることがあり、そして
この核酸はエタノール沈澱による水性画分から回収され
る。必要ならば、分解フラグメントのサイズ選別を標準
技術を利用するポリアクリルアミドゲル又はアガロース
ゲル電気泳動により行うことがある。サイズ選別の一般
的な説明は、Methods in Enzymology（1980）65:499−5
60;Lawn et al.,（1981）Nuc.Acids Res.9:6113−6114
及びGoeddel,et al.,（1980）Nuc.Acids Res.8:405に記
載されている。制限分解フラグメントはE.コリDNAポリ
メラーゼＩ（クレノウ）の大きなフラグメントによる、
４個のデオキシリボヌクレオキド３リン酸（dNTP）の存
在仕立において、20から25℃での約15から25分間でのイ
ンキュベーション時間を利用して50mMのトリスpH7.6、5
0mMのNaCl、6mMのMgCl、6mMのdTT、約U/μｌのクレノウ
及び100μＭのdNTP中における処理によりブラント末端
にされうる。このクレノウフラグメントは、接着末端の
５′側の反対側を「埋め合わせ」するが、しかし酵素の
３′−→５′エキソクヌクレアーゼ活性は、鋳型領域の
非存在下において一本鎖の３′側の突出しを分解せしめ
る。必要ならば、選択的な修復は、その接着末端の性質
により示される制限内において１種のみの、又は選ばれ
たdNTPを供給することにより行われうる。クレノウによ
る処理後、この混合物をフェノール／クロロホルムによ
り抽出せしめ、そしてエタノール沈澱させる。S1ヌクレ
アーゼ又はBal−31による適当な条件下での処理は、任
意の一本鎖部分の加水分解をもたらす。
合成オリゴヌクレオチドがMetteucciら（1981）J.Am.Ch
em.Soc.103:3185−3191のトリエステル方法、又は自動
化合成方法により調製されうる。アニール化の前の又は
標識化のための一本鎖のリン酸化は、過剰の、例えば約
10ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを１ナノモルの
基質に対して、50mMのトリス、pH7.6、10mMのMgCl2、5m
Mのジチオスレイトール及び１−2mMのATPの存在下にお
いて用いることにより行われる。もしリン酸化がプロー
ブの標識のためであったら、ATPは高い比活性のガンマ
ー32Pを含むであろう。
em.Soc.103:3185−3191のトリエステル方法、又は自動
化合成方法により調製されうる。アニール化の前の又は
標識化のための一本鎖のリン酸化は、過剰の、例えば約
10ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを１ナノモルの
基質に対して、50mMのトリス、pH7.6、10mMのMgCl2、5m
Mのジチオスレイトール及び１−2mMのATPの存在下にお
いて用いることにより行われる。もしリン酸化がプロー
ブの標識のためであったら、ATPは高い比活性のガンマ
ー32Pを含むであろう。
リゲーションは15−30μｌの容量において、以下の標準
的な条件及び温度のもとで行われる：［20mMのトリス−
HCl、pH7.5、10mMのMgCl、10mMのDTT、33μg/mlのBSA、
10mM−50mMのNaCl、及び40μＭのATP、0.01−0.02（Wei
ss）ユニットのT4DNAリカーゼにより０℃で（「接着末
端」のリゲーションのため）、又は1mMのATP、0.3−0.6
（Weiss）ユニットのT4DNAリガーゼにより14℃で（「ブ
ラント末端」のリゲーションのため）。］分子間の「接
着末端」のリゲーションは通常33−00μg/mlの総DNA濃
度（５−100nMの最終総濃度）で行われる。分子間のブ
ラント末端リゲーション（通常10−30倍の挿入物の過剰
モル数を利用する）は１μＭの最終総濃度で行われる。
的な条件及び温度のもとで行われる：［20mMのトリス−
HCl、pH7.5、10mMのMgCl、10mMのDTT、33μg/mlのBSA、
10mM−50mMのNaCl、及び40μＭのATP、0.01−0.02（Wei
ss）ユニットのT4DNAリカーゼにより０℃で（「接着末
端」のリゲーションのため）、又は1mMのATP、0.3−0.6
（Weiss）ユニットのT4DNAリガーゼにより14℃で（「ブ
ラント末端」のリゲーションのため）。］分子間の「接
着末端」のリゲーションは通常33−00μg/mlの総DNA濃
度（５−100nMの最終総濃度）で行われる。分子間のブ
ラント末端リゲーション（通常10−30倍の挿入物の過剰
モル数を利用する）は１μＭの最終総濃度で行われる。
「ベクターフラグメント」を利用するベクター作製にお
いて、このベクターフラグメントは５′リン酸を除去
し、そしてベクターの再リゲーションを防ぐため、一般
に細菌アルカリホスファターゼ（BAP）により処理す
る。BAP分解はpH8にて、約150mMのトリス中で、Na+及び
Mg+2の存在下において、１μｇのベクター当り約１ユニ
ットのBAPを用い、60℃で約１時間行われる。核酸フラ
グメントを除去するため、この調製物をフェノール／ク
ロロホルムにより抽出せしめ、そしてエタノール沈澱さ
せた。他方、再リゲーションは、不要のフラグメントの
更なる制限酵素分解により二重に分解せしめたベクター
において防ぐことができる。
いて、このベクターフラグメントは５′リン酸を除去
し、そしてベクターの再リゲーションを防ぐため、一般
に細菌アルカリホスファターゼ（BAP）により処理す
る。BAP分解はpH8にて、約150mMのトリス中で、Na+及び
Mg+2の存在下において、１μｇのベクター当り約１ユニ
ットのBAPを用い、60℃で約１時間行われる。核酸フラ
グメントを除去するため、この調製物をフェノール／ク
ロロホルムにより抽出せしめ、そしてエタノール沈澱さ
せた。他方、再リゲーションは、不要のフラグメントの
更なる制限酵素分解により二重に分解せしめたベクター
において防ぐことができる。
DNA配列の修飾
配列の修飾を必要とする、cDNA又はゲノミックDNA由来
のベクターの一部のため、位置特異性プライマーに向け
られた突然変異誘発を利用した。この技術は当業界にお
いて現在標準的であり、そして突然変異すべき一本鎖フ
ァージDNAと相補するが、ただし目的の突然変異を表わ
すために一定の不対合のプライマー合成オリゴヌクレオ
チドを用いて行う。簡単には、この合成オリゴヌクレオ
チドは、ファージDNAと相補の鎖の合成を導くためのプ
ライマーとして用いられ、そして得られる二本鎖DNAを
ファージ支持宿主細菌に形質転換せしめる。形質転換細
菌の培養物をアガーの上において平板培養し、ファージ
の潜入した単一の細胞由来のプラークを形成せしめる。
のベクターの一部のため、位置特異性プライマーに向け
られた突然変異誘発を利用した。この技術は当業界にお
いて現在標準的であり、そして突然変異すべき一本鎖フ
ァージDNAと相補するが、ただし目的の突然変異を表わ
すために一定の不対合のプライマー合成オリゴヌクレオ
チドを用いて行う。簡単には、この合成オリゴヌクレオ
チドは、ファージDNAと相補の鎖の合成を導くためのプ
ライマーとして用いられ、そして得られる二本鎖DNAを
ファージ支持宿主細菌に形質転換せしめる。形質転換細
菌の培養物をアガーの上において平板培養し、ファージ
の潜入した単一の細胞由来のプラークを形成せしめる。
理論的には、新しいプラークの50％は、一本鎖として突
然変異の型を有すファージを含むであろう;50％は本来
の配列を有するであろう。このプラークのニトロセルロ
ースフィルターに移し、そしてこの「移されたもの」を
キナーゼ処理合成プライマーと、正確なハイブリダイゼ
ーションを可能にするが、本来の鎖との不対合がハイブ
リダイゼーションを妨げるのに十分となる温度でハイブ
リダイゼーションをせしめる。プローブとハイブリダイ
ズしたプラークを次に選び、培養し、そしてそのDNAを
回収した。位置特異的突然変異処理の詳細は、記載例に
おいて以下、説明する。
然変異の型を有すファージを含むであろう;50％は本来
の配列を有するであろう。このプラークのニトロセルロ
ースフィルターに移し、そしてこの「移されたもの」を
キナーゼ処理合成プライマーと、正確なハイブリダイゼ
ーションを可能にするが、本来の鎖との不対合がハイブ
リダイゼーションを妨げるのに十分となる温度でハイブ
リダイゼーションをせしめる。プローブとハイブリダイ
ズしたプラークを次に選び、培養し、そしてそのDNAを
回収した。位置特異的突然変異処理の詳細は、記載例に
おいて以下、説明する。
作製物の評価
以下に記載する構造において、プラスミドの作製のため
の正しいリゲーションは最初の形質転換E.コリ株MM29
4、又はリゲーション混合物を有するその他の適当な宿
主により確認する。有用な形質転換体はアンピシリン、
テトラサイクリンもしくはその他の抗生物質耐性体によ
り選ばれるか、又はプラスミドの作製の方法に依存し
て、当業界に知られるその他のマーカーを利用して選ば
れる。この形質転換体由来のプラスミドは次にClewell
ら（1969）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 62:1159の方法、任
意的にその後のクロラムフェニコール（Cm）増幅（Clew
ell,（1972）J.Bacteriol.110:667）に従って調製され
る。この単離DNAを制限処理及び／又はSangerらの（197
7）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463、更に詳しくはMes
singらの（1981）Nuc.Acids Res.9:309に記載のジデオ
キシ方法、もしくはMaxamらの（1980）Methods in Enzy
mology 65:499の方法によりシーケンス化されることに
より分析する。
の正しいリゲーションは最初の形質転換E.コリ株MM29
4、又はリゲーション混合物を有するその他の適当な宿
主により確認する。有用な形質転換体はアンピシリン、
テトラサイクリンもしくはその他の抗生物質耐性体によ
り選ばれるか、又はプラスミドの作製の方法に依存し
て、当業界に知られるその他のマーカーを利用して選ば
れる。この形質転換体由来のプラスミドは次にClewell
ら（1969）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 62:1159の方法、任
意的にその後のクロラムフェニコール（Cm）増幅（Clew
ell,（1972）J.Bacteriol.110:667）に従って調製され
る。この単離DNAを制限処理及び／又はSangerらの（197
7）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463、更に詳しくはMes
singらの（1981）Nuc.Acids Res.9:309に記載のジデオ
キシ方法、もしくはMaxamらの（1980）Methods in Enzy
mology 65:499の方法によりシーケンス化されることに
より分析する。
本明細書に記載の発明をより理解せしめるため、以降の
例を記載するが、これは例示を目的としており、本発明
をいかなる手段において限定するためのものではない。
例を記載するが、これは例示を目的としており、本発明
をいかなる手段において限定するためのものではない。
例１
セルロース陰性アセトバクター株の調製
以下の例において、多数の培地を用いた。何らかの記載
がない限り、培地は以下の通りに作られている： R20−２倍地は次の組成を有する： 成分 最終濃度 バクト−ペプトン ５ g/l 酵母抽出物 ５ g/l Na2HPO4 ５ g/l クエン酸 1.15g/l 炭素源 特定された通り（特定され ていない場合、２％のグル コース） 最終pH 5.±0.2 最少倍地R70（アセトバクター最少培地、又は「AMM」と
も称する）は次の組成を有する： 成分 最終濃度 （NH4）2SO4 25 KH2PO4 7.3 MgSO4 1.0 FeSO4 0.013 CaCl2 0.10 Na2M0O4 0.001 ZnSO4 0.006 MnSO4 0.006 CuSO4 0.0002 グルコース pH−5.0 何らかの記載がない限り２ ％又は４％（W/V） Ｒ−70倍地及びその改質品を使用する全ての研究のため
に、次のビタミン混合物を100倍希釈でこの最少倍地に
加えた： 成分 ビタミン混合物mg/L イノシトール 200 ニアシン 40 ピリドキシン HCl 40 チアミン HCl 40 Ca パントテナーテ 40 リボフラビン 20 パラ−アミノベンゾン酸 20 葉酸 0.2 ビチオン 0.2 R70−２培地はR70の改質型である。R70−２は次の組成
を有する： 成分 最終濃度 （mM） （NH4）2SO4 25 KH2PO4 7.3 Na クエン酸 4.0 MgSO4 1.0 FeCl3 0.01 CaCl2 0.10 Na2MoO4 0.001 ZnSO4 0.005 MnSO4 0.005 CuSO4 0.001 CoCl2 0.001 NiCl2 0.001 成分 最終濃度 （mM） ビタミン混合物 10ml/リッター グルコース 特定した通り （通常２又は４％、W/V） 最終pH＝5.09±0.2 突然変異アセトバクター株の生産 R70 100ml＋２％のグルコース＋２％のトウモロコシの
浸したリカー（corn steep liquor）E804 E（CSL,Corn
Products,NJ）培地を含む３つの組織培養フラスコをア
セトバクター株1306−21（ACTT No.53524）（各フラス
コに対して１本の凍結2mlバイアル）により感染せしめ
た。このフラスコを静置して、23時間、30℃でインキュ
ベートせしめた。
がない限り、培地は以下の通りに作られている： R20−２倍地は次の組成を有する： 成分 最終濃度 バクト−ペプトン ５ g/l 酵母抽出物 ５ g/l Na2HPO4 ５ g/l クエン酸 1.15g/l 炭素源 特定された通り（特定され ていない場合、２％のグル コース） 最終pH 5.±0.2 最少倍地R70（アセトバクター最少培地、又は「AMM」と
も称する）は次の組成を有する： 成分 最終濃度 （NH4）2SO4 25 KH2PO4 7.3 MgSO4 1.0 FeSO4 0.013 CaCl2 0.10 Na2M0O4 0.001 ZnSO4 0.006 MnSO4 0.006 CuSO4 0.0002 グルコース pH−5.0 何らかの記載がない限り２ ％又は４％（W/V） Ｒ−70倍地及びその改質品を使用する全ての研究のため
に、次のビタミン混合物を100倍希釈でこの最少倍地に
加えた： 成分 ビタミン混合物mg/L イノシトール 200 ニアシン 40 ピリドキシン HCl 40 チアミン HCl 40 Ca パントテナーテ 40 リボフラビン 20 パラ−アミノベンゾン酸 20 葉酸 0.2 ビチオン 0.2 R70−２培地はR70の改質型である。R70−２は次の組成
を有する： 成分 最終濃度 （mM） （NH4）2SO4 25 KH2PO4 7.3 Na クエン酸 4.0 MgSO4 1.0 FeCl3 0.01 CaCl2 0.10 Na2MoO4 0.001 ZnSO4 0.005 MnSO4 0.005 CuSO4 0.001 CoCl2 0.001 NiCl2 0.001 成分 最終濃度 （mM） ビタミン混合物 10ml/リッター グルコース 特定した通り （通常２又は４％、W/V） 最終pH＝5.09±0.2 突然変異アセトバクター株の生産 R70 100ml＋２％のグルコース＋２％のトウモロコシの
浸したリカー（corn steep liquor）E804 E（CSL,Corn
Products,NJ）培地を含む３つの組織培養フラスコをア
セトバクター株1306−21（ACTT No.53524）（各フラス
コに対して１本の凍結2mlバイアル）により感染せしめ
た。このフラスコを静置して、23時間、30℃でインキュ
ベートせしめた。
培養物においてアセトバクター細胞により形成された薄
膜をピンセットで取り出し、約15秒ほどかき混ぜ、そし
て４層の除菌チーズクロスで濾過せしめた。細胞を、４
℃で7500rpmの10分間の遠心により、0.9％のNaClで２回
洗浄せしめた。この細胞を0.9％のNaCl20mlに再懸濁せ
しめ、そしてもう一度あらゆる残骸を除去するために４
層のチーズクロスで濾過した。
膜をピンセットで取り出し、約15秒ほどかき混ぜ、そし
て４層の除菌チーズクロスで濾過せしめた。細胞を、４
℃で7500rpmの10分間の遠心により、0.9％のNaClで２回
洗浄せしめた。この細胞を0.9％のNaCl20mlに再懸濁せ
しめ、そしてもう一度あらゆる残骸を除去するために４
層のチーズクロスで濾過した。
95％から99.9％の細胞殺傷を及ぼす突然変異誘発性条件
を選んだ。この培養物を30℃でインキュベートせしめ
た。突然変異原はエチルメタンスルホネート（EMS,Sigm
a,St Louis,MO）であった。このEMS濃度を１％から２％
（V/V）の範囲にし、そしてインキュベーション時間は6
0分から210分の範囲にした。同様の条件をアセトバクタ
ー株1306−３及び1306−11に用いた（それぞれのATCC N
o.53264及び53263）。
を選んだ。この培養物を30℃でインキュベートせしめ
た。突然変異原はエチルメタンスルホネート（EMS,Sigm
a,St Louis,MO）であった。このEMS濃度を１％から２％
（V/V）の範囲にし、そしてインキュベーション時間は6
0分から210分の範囲にした。同様の条件をアセトバクタ
ー株1306−３及び1306−11に用いた（それぞれのATCC N
o.53264及び53263）。
Cel-アセトバクター株を単離するために２つの方法を用
い、それは１）表現を伴わない突然変異誘発、及び２）
表現を伴う突然変異誘発である。
い、それは１）表現を伴わない突然変異誘発、及び２）
表現を伴う突然変異誘発である。
表現を伴わないEMS突然変異誘発からの突然変異アセト
バクター株 アセトバクター株1306−21をEMSにより処理に、その後
パーセント生存率を検定するためにR20−２倍地上に直
接平板培養せしめた。1306−21のEMS突然変異性由来の
プレートは、以下の通りに潜在性Cel-コロニーについて
試験した。この突然変異誘発培養物の平板培養し、そし
て７日後に予想されるCel-コロニーを採取した。Cel-突
然変異はプレート上で、平らな光沢のあるコロニーとし
て同定することができる（野性型コロニーは荒い、乾い
た外観を有する）。攪伴せしめた培養Cel+株はペレット
を形成するが、Cel-1培養物は単一細胞の懸濁液を生成
する。Cel-コロニーの頻度は0.05％から２％の範囲にあ
ると検定された。アセトバクター株1306−３及び1306−
11からCel-株を単離するための類似の技術が利用され、
そして類似の突然変異頻度が観察された。
バクター株 アセトバクター株1306−21をEMSにより処理に、その後
パーセント生存率を検定するためにR20−２倍地上に直
接平板培養せしめた。1306−21のEMS突然変異性由来の
プレートは、以下の通りに潜在性Cel-コロニーについて
試験した。この突然変異誘発培養物の平板培養し、そし
て７日後に予想されるCel-コロニーを採取した。Cel-突
然変異はプレート上で、平らな光沢のあるコロニーとし
て同定することができる（野性型コロニーは荒い、乾い
た外観を有する）。攪伴せしめた培養Cel+株はペレット
を形成するが、Cel-1培養物は単一細胞の懸濁液を生成
する。Cel-コロニーの頻度は0.05％から２％の範囲にあ
ると検定された。アセトバクター株1306−３及び1306−
11からCel-株を単離するための類似の技術が利用され、
そして類似の突然変異頻度が観察された。
表現を伴うEMS突然変異誘発による突然変異アセトバク
ター株 EMS処理アセトバクター細胞（株1306−21）のサンプル
（約0.05ml）をチューブの中（2ml）、R20−２培養液）
に感染せしめ、そして突然変異を表現せしめることを可
能とするために静置培養により増殖せしめた。培養サン
プルを連続希釈し、そしてR20−２プレート上で平板培
養せしめた。インキュベーション後、前記のプロトコー
ルを利用して潜在性Cel-タイプに対するコロニーをスク
リーンし、そして同程度の突然変異頻度が得られた。Ce
l-株をアセトバクター株1306−３及び1306−11から単離
するために類似の技術を用いた。
ター株 EMS処理アセトバクター細胞（株1306−21）のサンプル
（約0.05ml）をチューブの中（2ml）、R20−２培養液）
に感染せしめ、そして突然変異を表現せしめることを可
能とするために静置培養により増殖せしめた。培養サン
プルを連続希釈し、そしてR20−２プレート上で平板培
養せしめた。インキュベーション後、前記のプロトコー
ルを利用して潜在性Cel-タイプに対するコロニーをスク
リーンし、そして同程度の突然変異頻度が得られた。Ce
l-株をアセトバクター株1306−３及び1306−11から単離
するために類似の技術を用いた。
例II
セルロース陰性アセトバクター株の特徴付け
セルロースシンターゼ活性の測定
Cel-アセトバクター突然変異株のインビトロセルロース
シンターゼ活性測定のために用いるセルロースシンター
ゼ測定は、Aloni,et al.,（1982）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 79:6448−6452に記載の改良方法であって、ウリジ
ン５′−ジホスホー14C）−グルコース（UDPG）由来の
アルカリ不溶性ポリマー（セルロース）の生産を測定す
る方法である。この測定はアセトバクターCel-突然変異
のスクリーニングのために適正化した。インキュベーシ
ョン後（10分、30℃）、各反応混合物における未反応混
合物を、NaOHとの加熱（95℃で１時間）及び濾過により
セルロースから分離せしめた。フィルター上に残った放
射性標識（14C）セルロースを次いでシンチレーション
計測により定量した。
シンターゼ活性測定のために用いるセルロースシンター
ゼ測定は、Aloni,et al.,（1982）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 79:6448−6452に記載の改良方法であって、ウリジ
ン５′−ジホスホー14C）−グルコース（UDPG）由来の
アルカリ不溶性ポリマー（セルロース）の生産を測定す
る方法である。この測定はアセトバクターCel-突然変異
のスクリーニングのために適正化した。インキュベーシ
ョン後（10分、30℃）、各反応混合物における未反応混
合物を、NaOHとの加熱（95℃で１時間）及び濾過により
セルロースから分離せしめた。フィルター上に残った放
射性標識（14C）セルロースを次いでシンチレーション
計測により定量した。
この測定において用いた総タンパク質の量は、セルロー
スシンターゼの精製状態に依存する。少なくとも１つ
の、この測定の直線領域（全UDPG消費量の20％未満）を
得るために、２から３の異なるサンプル希釈を測定し
た。
スシンターゼの精製状態に依存する。少なくとも１つ
の、この測定の直線領域（全UDPG消費量の20％未満）を
得るために、２から３の異なるサンプル希釈を測定し
た。
最終濃度として0.2mMの（1C）UDPG（7.5cpm/pモル）、5
0mMのトリス、pH7.5、10mMのMgCl2、1mMのEDTA、2mMのC
aCl2、及びサンプルを含む0.2mlの測定混合物を測定し
た。サイクリックジグアノシン１リン酸（ｃ−di−GM
P）を、いくつかの測定チューブに５μＭとなる迄加え
た（ｃ−di−GMPはセルロースシンターゼを活性化せし
める）。コントロールは、サンプルの加えられていない
チューブ及びインキュベーション前に0.5MのNaOH4mlの
添加により変性せしめたサンプルを含むチューブを含
む。
0mMのトリス、pH7.5、10mMのMgCl2、1mMのEDTA、2mMのC
aCl2、及びサンプルを含む0.2mlの測定混合物を測定し
た。サイクリックジグアノシン１リン酸（ｃ−di−GM
P）を、いくつかの測定チューブに５μＭとなる迄加え
た（ｃ−di−GMPはセルロースシンターゼを活性化せし
める）。コントロールは、サンプルの加えられていない
チューブ及びインキュベーション前に0.5MのNaOH4mlの
添加により変性せしめたサンプルを含むチューブを含
む。
一定時間の反応は、酵素を添加し、この混合物を混ぜ、
そしてこのチューブを30℃の湯浴に入れることで開始す
る。以降のチューブは一定の時間間隔で開始された。10
分後、各反応を、チューブを湯浴から取り出し、0.5Mの
NaOH4mlを加え、そして攪伴することにより停止せしめ
た。全ての反応を停止させたら、約20mgのセルロースを
（14C）セルロースのためのキャリアーとして働かさせ
るために各チューブに加えた。次いでこのチューブを湯
浴の中にて95℃で１時間、細胞を分解せしめるために加
熱した。
そしてこのチューブを30℃の湯浴に入れることで開始す
る。以降のチューブは一定の時間間隔で開始された。10
分後、各反応を、チューブを湯浴から取り出し、0.5Mの
NaOH4mlを加え、そして攪伴することにより停止せしめ
た。全ての反応を停止させたら、約20mgのセルロースを
（14C）セルロースのためのキャリアーとして働かさせ
るために各チューブに加えた。次いでこのチューブを湯
浴の中にて95℃で１時間、細胞を分解せしめるために加
熱した。
真空マニホールドを用い、各測定チューブの内容物をワ
ットマン（Whatman）GF/Aフィルターで濾過せしめ、こ
の反応混合物をフィルターに通過せしめることによりセ
ルロース生成物を単離せしめ（あらゆる未反応14CUDPG
を除去した）；この測定チューブを脱イオン水で３回す
すぎ、このすすぎ水を流し；フィルターを脱イオン水20
mlで２回洗浄し；次いで0.5MのHCl 20ml、そして脱イオ
ン交換水20ml、更にメタノール20mlで洗浄した。
ットマン（Whatman）GF/Aフィルターで濾過せしめ、こ
の反応混合物をフィルターに通過せしめることによりセ
ルロース生成物を単離せしめ（あらゆる未反応14CUDPG
を除去した）；この測定チューブを脱イオン水で３回す
すぎ、このすすぎ水を流し；フィルターを脱イオン水20
mlで２回洗浄し；次いで0.5MのHCl 20ml、そして脱イオ
ン交換水20ml、更にメタノール20mlで洗浄した。
セルロース生成物はシンチレーション計測により定量し
た。各フィルターを、10mlのシンチレーション流体（NE
N Atomligth,Boston,MA）を有するシンチレーションバ
イアルに移し入れ、そしてセルロース生成の定量分析
は、（14C）UDPGの塩基性不溶物質への混入によるシン
チレーション計測により測定される。（14C）UDGPの比
活性を得るため、2mMの（14C）UDGP保存液のアリコート
を測定した。
た。各フィルターを、10mlのシンチレーション流体（NE
N Atomligth,Boston,MA）を有するシンチレーションバ
イアルに移し入れ、そしてセルロース生成の定量分析
は、（14C）UDPGの塩基性不溶物質への混入によるシン
チレーション計測により測定される。（14C）UDGPの比
活性を得るため、2mMの（14C）UDGP保存液のアリコート
を測定した。
この測定のcpmの測定全域は保存液アリコートから決定
でき、そして各測定チューブら消費された総UDPGの割合
は、以下の通りに計算される： １分当りに消費されるUDPGのｎモルは以下の通りに計算
される： ｎモルUDPG/分＝（消費された全UDPGの割合）×（40,00
0pモル）×（1/10分） 活性は1mlのサンプル当り、１分間当りのｎモルに基づ
いて示すか、又は1mgタンパク質当り、１分間当りのｎ
モルに基づいて示した。
でき、そして各測定チューブら消費された総UDPGの割合
は、以下の通りに計算される： １分当りに消費されるUDPGのｎモルは以下の通りに計算
される： ｎモルUDPG/分＝（消費された全UDPGの割合）×（40,00
0pモル）×（1/10分） 活性は1mlのサンプル当り、１分間当りのｎモルに基づ
いて示すか、又は1mgタンパク質当り、１分間当りのｎ
モルに基づいて示した。
ジグアニレートサイクラーゼ活性のための測定
ジグアニレートサイクラーゼ測定は、２又はそれより多
くの特定の活性を欠損、例えばセルロースシンターゼ活
性及びジグアニレートサイクラーゼ活性における欠損す
るアセトバクター宿主を同定するために用いた。この酵
素ジグアニレートサイクラーゼはグアノシン３リン酸
（GTP）由来の、セルロースシンターゼ活性化物質であ
るｃ−di−GMPの生産を触媒する。
くの特定の活性を欠損、例えばセルロースシンターゼ活
性及びジグアニレートサイクラーゼ活性における欠損す
るアセトバクター宿主を同定するために用いた。この酵
素ジグアニレートサイクラーゼはグアノシン３リン酸
（GTP）由来の、セルロースシンターゼ活性化物質であ
るｃ−di−GMPの生産を触媒する。
細胞を増殖せしめ、洗浄せしめ、そして以下に記載のス
クリーニング測定のために超音波処理せしめた。ジグア
ニレートサイクラーゼ活性は、Ross,et al.,（1987）Na
ture 325:279において報告されているものと類似のアッ
セイを用いて測定した。超音波処理細胞（1mg/アッセイ
チュブ）を10分間、30℃で、0.2mMの［アルファー32P］
GTP、50mMのトリスHCl、pH7.5、10mMのMgCl2,1mMのEDT
A、5mlのCaCl2、2mMのホスホクレアチン、及び24ユニッ
ト/mlのクレアチンホスホキナーゼを含む反応混合物0.1
mlにおいてインキュベートした。この反応を100％（W/
V）とトリクロロ酢酸により停止させた。沈殿物を除去
するために遠心した後、各反応混合物10mlを薄層クロマ
トグラフィー（TLC）プレート（Polygram Cel 300 PEI,
Macherey−Nagel,Duren,W.Germany,U.S.販売元Sybron/B
rinkman,Westbury,NY）上にスポットした。このTLCプレ
ートを1.5MのKH2PO4、pH3.65中に、約２時間展開せし
め、オートラジオグラフせしめ、そしてGTD及びサイク
リックージーGMPに相当するTLCプレート上の領域を切り
出し、シンチレーション計測器において計数せしめた。
クリーニング測定のために超音波処理せしめた。ジグア
ニレートサイクラーゼ活性は、Ross,et al.,（1987）Na
ture 325:279において報告されているものと類似のアッ
セイを用いて測定した。超音波処理細胞（1mg/アッセイ
チュブ）を10分間、30℃で、0.2mMの［アルファー32P］
GTP、50mMのトリスHCl、pH7.5、10mMのMgCl2,1mMのEDT
A、5mlのCaCl2、2mMのホスホクレアチン、及び24ユニッ
ト/mlのクレアチンホスホキナーゼを含む反応混合物0.1
mlにおいてインキュベートした。この反応を100％（W/
V）とトリクロロ酢酸により停止させた。沈殿物を除去
するために遠心した後、各反応混合物10mlを薄層クロマ
トグラフィー（TLC）プレート（Polygram Cel 300 PEI,
Macherey−Nagel,Duren,W.Germany,U.S.販売元Sybron/B
rinkman,Westbury,NY）上にスポットした。このTLCプレ
ートを1.5MのKH2PO4、pH3.65中に、約２時間展開せし
め、オートラジオグラフせしめ、そしてGTD及びサイク
リックージーGMPに相当するTLCプレート上の領域を切り
出し、シンチレーション計測器において計数せしめた。
スクリーニングアッセイ
セルロースシンターゼ活性の復帰を観察するため、セル
ロースシンターゼ陰性であり、且つジグアニレートサイ
クラーゼ陽性である株を単離する必要がある。以下のス
クリーニングアッセイは前記のセルロースシンターゼ活
性測定を改良したものであり、そして２つの異なる酵素
を包含する突然変異を、GTP又はｃ−di−GMPの有無にお
いてセルロースシンターゼ活性を比較せしめることによ
り検定するために用いられうる。このアッセイは懸濁し
た、超音波処理細胞によるセルロースの生成により測定
される。
ロースシンターゼ陰性であり、且つジグアニレートサイ
クラーゼ陽性である株を単離する必要がある。以下のス
クリーニングアッセイは前記のセルロースシンターゼ活
性測定を改良したものであり、そして２つの異なる酵素
を包含する突然変異を、GTP又はｃ−di−GMPの有無にお
いてセルロースシンターゼ活性を比較せしめることによ
り検定するために用いられうる。このアッセイは懸濁し
た、超音波処理細胞によるセルロースの生成により測定
される。
突然変異アセトバクター株は、超音波処理細胞を複数の
条件下で測定することにより分類する。３つのクラスの
アセトバクター突然変異体が同定された。クラスＩ（セ
ルロースシンターゼ陰性）株はいづれのアッセイ条件の
もとでもセルロースを生成しなかった。クラスII（ジグ
アニレートサイクラーゼ陰性）株はｃ−di−GMPの存在
下においてセルロースを生成したが、GTPの存在下にお
いては生成しなかった。クラスIIIの突然変異はGTP又は
ｃ−di−GMPのいづれかによる活性化後、セルロースを
生成した。クラスII及びIIIにおける突然変異体はセル
ロースシンターゼを含み、そしてインビトロで活性を示
したが、しかしインビボではわずか、又は全っくセルロ
ースを生成しなかった。クラスIII突然変異体における
この欠損は、生化学的に定義できなかった。
条件下で測定することにより分類する。３つのクラスの
アセトバクター突然変異体が同定された。クラスＩ（セ
ルロースシンターゼ陰性）株はいづれのアッセイ条件の
もとでもセルロースを生成しなかった。クラスII（ジグ
アニレートサイクラーゼ陰性）株はｃ−di−GMPの存在
下においてセルロースを生成したが、GTPの存在下にお
いては生成しなかった。クラスIIIの突然変異はGTP又は
ｃ−di−GMPのいづれかによる活性化後、セルロースを
生成した。クラスII及びIIIにおける突然変異体はセル
ロースシンターゼを含み、そしてインビトロで活性を示
したが、しかしインビボではわずか、又は全っくセルロ
ースを生成しなかった。クラスIII突然変異体における
この欠損は、生化学的に定義できなかった。
スクリーニングアッセイは以下の条件:1）ヌクレオチド
無添加;2）0.4mMのGTP添加；及び３）５μＭのｃ−di−
GMP添加、のもとで行った。
無添加;2）0.4mMのGTP添加；及び３）５μＭのｃ−di−
GMP添加、のもとで行った。
酵素の由来及び用いた緩衝液について除外して、このア
ッセイ方法及びコントロールはセルロースシンターゼ活
性測定についての前記と同じである。
ッセイ方法及びコントロールはセルロースシンターゼ活
性測定についての前記と同じである。
６つの突然変異アセトバクター株を単一のスクリーニン
グにおいて測定した。全てにつき、セルロースシンター
ゼ活性及びジグアニレートサイクラーゼ活性の両者を有
するアセトバクター株を、アッセイ間の一貫性を監視す
るために含ませた。
グにおいて測定した。全てにつき、セルロースシンター
ゼ活性及びジグアニレートサイクラーゼ活性の両者を有
するアセトバクター株を、アッセイ間の一貫性を監視す
るために含ませた。
選別せしめたアセトバクター株を約24時間、30℃で増殖
せしめた。生育培地はR70−２、１％のアンブレックス1
003（Ambrex1003;TYE,Universal Foods,Milwaukee,W
l）、４％のフルクトース、0.01％のV/Vダウコーニング
アンチフォームＢ（Dow Corning Antifoam B）及び50mM
の3,3−ジメチルグルタル酸（DMG）、pH5.0を含む;125m
lのバッフルシェークフラスコにおいて、25mlの培地を
凍結シードバイアルからの細胞により感染せしめた。細
胞を集める前に、R70−２＋0.5％のTYE及びグルコース
アガープレートを、夾雑について検定するために画線培
養した。このプレートを30℃で約３日インキュベートし
た。
せしめた。生育培地はR70−２、１％のアンブレックス1
003（Ambrex1003;TYE,Universal Foods,Milwaukee,W
l）、４％のフルクトース、0.01％のV/Vダウコーニング
アンチフォームＢ（Dow Corning Antifoam B）及び50mM
の3,3−ジメチルグルタル酸（DMG）、pH5.0を含む;125m
lのバッフルシェークフラスコにおいて、25mlの培地を
凍結シードバイアルからの細胞により感染せしめた。細
胞を集める前に、R70−２＋0.5％のTYE及びグルコース
アガープレートを、夾雑について検定するために画線培
養した。このプレートを30℃で約３日インキュベートし
た。
細胞を集めるに先立ち、集塊を防ぐために0.6MのEDTA5m
lをこの培地に加えた。この細胞を遠心し（5000rpm、10
分間、JA21ローター）、そして上清を捨てた。このペレ
ットを50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.0 20mlに懸濁
せしめ、そして集塊を低めるために5MのNaCl5mlを加え
た。
lをこの培地に加えた。この細胞を遠心し（5000rpm、10
分間、JA21ローター）、そして上清を捨てた。このペレ
ットを50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.0 20mlに懸濁
せしめ、そして集塊を低めるために5MのNaCl5mlを加え
た。
細胞密度は、クレット（Klett）メーター（10クレット
単位（「KU」）＝約40mgの細胞/ml）により測定した。
この細胞を再度遠心し（5Kppm、10分、JA21ローター）
としてこの上清液を捨てた。このペレットを50mMのＮ−
（２−ヒドロキシエチル）ヒペラジン、Ｎ′−３−プロ
パンスルホン酸（EPPS,Sigma）緩衝液、pH7.5中で20mg
の細胞/ml迄懸濁した。
単位（「KU」）＝約40mgの細胞/ml）により測定した。
この細胞を再度遠心し（5Kppm、10分、JA21ローター）
としてこの上清液を捨てた。このペレットを50mMのＮ−
（２−ヒドロキシエチル）ヒペラジン、Ｎ′−３−プロ
パンスルホン酸（EPPS,Sigma）緩衝液、pH7.5中で20mg
の細胞/ml迄懸濁した。
この細胞を超音波処理するため、0.5mlの各細胞懸濁物
を1.5mlのエッペンドルフ遠沈管に移し入れた。各チュ
ーブをカップソニケーター（Branson Sonic Power Co.,
Model 350,Plainview,NY）内で、１分間、80％の衝撃周
波数、設定値７で超音波処理した。アッセイは前述の通
り、各アッセイチューブについて50μｌの超音波処理細
胞懸濁物、50mMのトリスの代りに50mMのEPPS（pH9.0）
を含み、1mMのEDTAを使用せず、そして10mMのMgCl2の代
りに20mMのMgCl2を加えたものを用いて行った。各アッ
セイ条件は二重測定で行い、そしてこの二重測定結果を
平均した。
を1.5mlのエッペンドルフ遠沈管に移し入れた。各チュ
ーブをカップソニケーター（Branson Sonic Power Co.,
Model 350,Plainview,NY）内で、１分間、80％の衝撃周
波数、設定値７で超音波処理した。アッセイは前述の通
り、各アッセイチューブについて50μｌの超音波処理細
胞懸濁物、50mMのトリスの代りに50mMのEPPS（pH9.0）
を含み、1mMのEDTAを使用せず、そして10mMのMgCl2の代
りに20mMのMgCl2を加えたものを用いて行った。各アッ
セイ条件は二重測定で行い、そしてこの二重測定結果を
平均した。
複数のCel-株を生化学的に特徴付けた。株1306−24（13
06−３由来）は正常なるジグアニレートサイクラーゼ活
性を有するが、セルロースシンターゼ活性を欠損するこ
とが見い出せた。株1306−42（1306−21由来）及び90−
１（1306−２由来）はジグアニレートサイクラーゼ及び
セルロースシンターゼ活性の両者を欠損する。これらの
株を次の研究のために採取した。
06−３由来）は正常なるジグアニレートサイクラーゼ活
性を有するが、セルロースシンターゼ活性を欠損するこ
とが見い出せた。株1306−42（1306−21由来）及び90−
１（1306−２由来）はジグアニレートサイクラーゼ及び
セルロースシンターゼ活性の両者を欠損する。これらの
株を次の研究のために採取した。
例III
コスミドベクターの作製及びコンジュゲーション方法
新規のコスミドベクターpKT230 cos5を、セルロースシ
ンターゼ遺伝子のクローニングにつての図２における概
略の通りに作製した。このベクターはストレプトマイシ
ン耐性遺伝子（Sm）、ファージラムダのcosフラグメン
ト及び異種DNAの挿入のためのクローニング部位を含
む。
ンターゼ遺伝子のクローニングにつての図２における概
略の通りに作製した。このベクターはストレプトマイシ
ン耐性遺伝子（Sm）、ファージラムダのcosフラグメン
ト及び異種DNAの挿入のためのクローニング部位を含
む。
ラムダcos部位を含む1.85KbのDNAフラグメントを、プラ
スミドpVK100（Knaut and Nester,（1982）Plasmid 8:4
5−55）から、制限酵素BglIIによる分解から切り出し、
そしてプラスミドpUC19におけるBamHI部位においてクロ
ーン化せしめた（New England Biolabs Catalog）。こ
の新規のプラスミドpUC19cos2を制限酵素Hind III及びX
maIで分解せしめ、そして1.85Kbのcos含有フラグメント
を含むHind III−XmaIフラグメントを、XmaI−及びHind
III分解プラスミドpKT230中でクローン化せしめ、これ
によりカナマイシン耐性遺伝子を不活性化せしめた。こ
の得られるベクター、コスミドpKT230 cos5はE.コリか
らアセトバクターへの自己感染ができない。それ故、ヘ
ルペープラスミドpRK2013が、pKT230 cos5の供与細胞か
らアセトバクター株1306−24の受容細胞への転移移送に
必要である。pKT230 cos5により形質転換せしめたE.コ
リ株MM294を、100μg/mlのSmを含む、R2培地（20.0gの
トリプトン、10.0gの酵母抽出物、10.0gのNaCl、1.0リ
ットルの蒸留水、ph6.9及び2g/lのグルコース（R2−
４）、更に任意に15g/lのバクトアガー）中で37℃で150
KUのクレット値迄増殖せしめた。動員プラスミドpRK201
3を含むE.コリ株HB101を、50μg/mlのKmを含む、R2−４
培地にて37℃で150KUのクレット値迄増殖せしめた。こ
のアセトバクター受容細胞1306−24をＲ−20−２培地中
で30℃で200KUのクレット値迄増殖せしめた。各供与細
胞1mlを動員し、そして2mlの受容細胞を混合し、そして
0.2ミクロンのゲルマン（Gelman）ディスポーザブルフ
ィルター（Gelman,Ann Arbor,Ml）で濾過せしめ、抗生
物質を伴う10mlのR2培地で、２回洗浄せしめた。このフ
ィルターをR2−４培地を含むアガープレート上にて平板
培養した。このプレートを30℃で３時間インキュベート
し、交配を行った。この３つの株間の交配後、このコン
ジュゲーション混合物を0.9％の塩化ナトリウム2ml中に
再懸濁せしめた。この溶液0.1mlを、50μg/mlのSm及び2
0μg/mlのCmを含むR20−２培地のアガープレート上で平
板培養せしめた。このプレートを30℃で５日間インキュ
ベートした。アセトバクター株はもとから20μg/mlのCm
に耐性であるが、E.コリ株はそれに対して感受性であ
る。それ故、供与プラスミドを受け入れたアセトバクタ
ーコロニーのみがこれらの選択プレート上で生育した。
その後、制限分析は、コスミドpKT230 cos5がアセトバ
クター株1306−24におけるいかなる転位も行なわれなか
ったことを示した。
スミドpVK100（Knaut and Nester,（1982）Plasmid 8:4
5−55）から、制限酵素BglIIによる分解から切り出し、
そしてプラスミドpUC19におけるBamHI部位においてクロ
ーン化せしめた（New England Biolabs Catalog）。こ
の新規のプラスミドpUC19cos2を制限酵素Hind III及びX
maIで分解せしめ、そして1.85Kbのcos含有フラグメント
を含むHind III−XmaIフラグメントを、XmaI−及びHind
III分解プラスミドpKT230中でクローン化せしめ、これ
によりカナマイシン耐性遺伝子を不活性化せしめた。こ
の得られるベクター、コスミドpKT230 cos5はE.コリか
らアセトバクターへの自己感染ができない。それ故、ヘ
ルペープラスミドpRK2013が、pKT230 cos5の供与細胞か
らアセトバクター株1306−24の受容細胞への転移移送に
必要である。pKT230 cos5により形質転換せしめたE.コ
リ株MM294を、100μg/mlのSmを含む、R2培地（20.0gの
トリプトン、10.0gの酵母抽出物、10.0gのNaCl、1.0リ
ットルの蒸留水、ph6.9及び2g/lのグルコース（R2−
４）、更に任意に15g/lのバクトアガー）中で37℃で150
KUのクレット値迄増殖せしめた。動員プラスミドpRK201
3を含むE.コリ株HB101を、50μg/mlのKmを含む、R2−４
培地にて37℃で150KUのクレット値迄増殖せしめた。こ
のアセトバクター受容細胞1306−24をＲ−20−２培地中
で30℃で200KUのクレット値迄増殖せしめた。各供与細
胞1mlを動員し、そして2mlの受容細胞を混合し、そして
0.2ミクロンのゲルマン（Gelman）ディスポーザブルフ
ィルター（Gelman,Ann Arbor,Ml）で濾過せしめ、抗生
物質を伴う10mlのR2培地で、２回洗浄せしめた。このフ
ィルターをR2−４培地を含むアガープレート上にて平板
培養した。このプレートを30℃で３時間インキュベート
し、交配を行った。この３つの株間の交配後、このコン
ジュゲーション混合物を0.9％の塩化ナトリウム2ml中に
再懸濁せしめた。この溶液0.1mlを、50μg/mlのSm及び2
0μg/mlのCmを含むR20−２培地のアガープレート上で平
板培養せしめた。このプレートを30℃で５日間インキュ
ベートした。アセトバクター株はもとから20μg/mlのCm
に耐性であるが、E.コリ株はそれに対して感受性であ
る。それ故、供与プラスミドを受け入れたアセトバクタ
ーコロニーのみがこれらの選択プレート上で生育した。
その後、制限分析は、コスミドpKT230 cos5がアセトバ
クター株1306−24におけるいかなる転位も行なわれなか
ったことを示した。
例IV
アセトバクターDNAライブラリーの作製
ラムダファージは長さにおいて38から52KbのDNAを、も
しcos部位がその両端に存在するならばパッケージする
であろう。ベクターpKT230 cos5は比較的小さいため（1
3.5Kb）、大量のアセトバクターDNA（28から37Kb）をラ
ムダファージ粒子の中に挿入し、パッケージできる。ア
セトバクターのゲノムサイズがE.コリのそれと等しいと
考えるなら、700から1000クローンのみが完全な遺伝子
バンクを得るために必要であると考えられる。DNAバン
クはアセトバクター株1306−３から、以下の通りに作製
される。
しcos部位がその両端に存在するならばパッケージする
であろう。ベクターpKT230 cos5は比較的小さいため（1
3.5Kb）、大量のアセトバクターDNA（28から37Kb）をラ
ムダファージ粒子の中に挿入し、パッケージできる。ア
セトバクターのゲノムサイズがE.コリのそれと等しいと
考えるなら、700から1000クローンのみが完全な遺伝子
バンクを得るために必要であると考えられる。DNAバン
クはアセトバクター株1306−３から、以下の通りに作製
される。
約26mgの核酸がR20−２アガープレート上のアセトバク
ター1306−３菌叢から単離された。この核酸をRNaseA及
びRNaseT1により処理し、このサンプルにおけるRNAを分
解せしめた。総量560μｇのDNAが回収された。このDNA
を制限酵素Sau3Aの４つの異なる酵素濃度で部分分解せ
しめた。このDNAを10−40％のスクローズグラジエント
に基づいて、サイズにより分画せしめた。27−38Kbの間
の最も多量のDNA分子を含む画分を選んだ（約２μｇのD
NA）。
ター1306−３菌叢から単離された。この核酸をRNaseA及
びRNaseT1により処理し、このサンプルにおけるRNAを分
解せしめた。総量560μｇのDNAが回収された。このDNA
を制限酵素Sau3Aの４つの異なる酵素濃度で部分分解せ
しめた。このDNAを10−40％のスクローズグラジエント
に基づいて、サイズにより分画せしめた。27−38Kbの間
の最も多量のDNA分子を含む画分を選んだ（約２μｇのD
NA）。
約１μｇのこのDNAを、BamHI分解、且つ脱リン酸せしめ
たpKT230 cos5の中にリゲートせしめ、そしてこのリゲ
ーション分解物をラムダファージ粒子の中にパッケージ
せしめた。次いでのファージ粒子をE.コリ株K802recA-
を感染せしめるために用いた。６つのランダムE.コリ単
離物から単離したコスミドDNAを挿入DNAフラグメントの
サイズの測定に用いた。この６つのクローンは平均サイ
ズ28Kbを有する、８から40Kbに範囲するDNA挿入物を有
していた。約2000のクローンを採取し、それぞれをマイ
クロタイター皿にて増殖せしめ、そしてその後のスクリ
ーニングのために保存せしめた。このバンクをpKT230 c
os5:1306−3A2と表示する。
たpKT230 cos5の中にリゲートせしめ、そしてこのリゲ
ーション分解物をラムダファージ粒子の中にパッケージ
せしめた。次いでのファージ粒子をE.コリ株K802recA-
を感染せしめるために用いた。６つのランダムE.コリ単
離物から単離したコスミドDNAを挿入DNAフラグメントの
サイズの測定に用いた。この６つのクローンは平均サイ
ズ28Kbを有する、８から40Kbに範囲するDNA挿入物を有
していた。約2000のクローンを採取し、それぞれをマイ
クロタイター皿にて増殖せしめ、そしてその後のスクリ
ーニングのために保存せしめた。このバンクをpKT230 c
os5:1306−3A2と表示する。
例Ｖ
セルロース陰性アセトバクター株におけるセルロースシ
ンターゼ活性を復帰せしめるクローン化DNAの同定及び
単離 セルロースシンターゼ活性の復帰についての遺伝子的相
補アッセイを、Cel-アセトバクター突然変異体における
セルロースシンターゼ活性を復帰できるコスミドDNAの
単離のために用いた。
ンターゼ活性を復帰せしめるクローン化DNAの同定及び
単離 セルロースシンターゼ活性の復帰についての遺伝子的相
補アッセイを、Cel-アセトバクター突然変異体における
セルロースシンターゼ活性を復帰できるコスミドDNAの
単離のために用いた。
コンジュゲーション中のアセトバクター遺伝子のバンク
のスクリーニング 遺伝子バンクpKT230 cos5:1306−3A2からのコスミド
（例IVに記載通りに得られたもの）を、以下に詳細の多
スポットコンジュゲーション方法における動員プラスミ
ドpKT 2013を用いるスクリーニングのために受容突然
変異アセトバクター株1306−24の中に移し入れた。
のスクリーニング 遺伝子バンクpKT230 cos5:1306−3A2からのコスミド
（例IVに記載通りに得られたもの）を、以下に詳細の多
スポットコンジュゲーション方法における動員プラスミ
ドpKT 2013を用いるスクリーニングのために受容突然
変異アセトバクター株1306−24の中に移し入れた。
アセトバクター株1306−24をR20−２培地中で、30℃で
振騰させながら約28時間、100−150KUのクレット値とな
るまで増殖せしめた。E.コリHB101/pRT2013をR2−４培
地及び50μg/mlのカナマイシン（Km）中で、37℃で振騰
させながら、100−150KUのクレット値となるまで増殖せ
しめた。E.コリK802recA-（pKT230cos5:1306−3A2）培
養物を、火炎処理したフロッグ（flamed frog）を有す
凍結マイクロタイタートレーから、100μｌのR24−４培
地及び50μ/mlのSmを含むマイクロタイター皿の中に感
染せしめ、そして振騰せずに約18時間、37℃でインキュ
ベートせしめた。このE.コリHB101/pRK2013培養物を遠
心し、Kmを除去せしめるために当容量の0.9％の生理食
塩水で洗浄し、再度遠心し、そして生理食塩水でもとの
容量の1/10における再懸濁により濃縮した、10μｌ容量
のこの濃縮E.コリHB101/pRK2013を、E.コリK802recA-pK
T230 cos5:1306−３−A2の18時間培養物100μｌを含む
各マイクロタイターウエルに添加した。10μｌ容量の、
この混合したHB101/pRK2013及びK802recA-pKT230 cos5:
1306−３−A2培養物を、８チャンネルピペットを用いて
乾燥した150mmのR2−４プレート上に、マイクロタイタ
ーウエルのパターンと一致する方向においてスポット
し、従って各トランスコンジュガントがE.コリコスミド
バンクにおけるそのものとの位置にトレースできるよう
にした。このスポットが乾燥したなら、更に10μｌの各
混合培養物をもとのスポット上に載せ、そして乾燥せし
めた。これを繰り返し、50μｌの各混合培養物が載るよ
うにした。このアセトバクター1306−24培養物を遠心
し、そしてもとの容量の1/10の0.9％の生理食塩水に再
懸濁せしめた。この濃縮培養物10μｌを、８チャンネル
ピペットにより、R2−４プレート上のHB101/pRK2013及
びE.コリK802recA-pKT230 cos5:1306−3A2スポットのそ
れぞれに載せた。このスポットを乾燥せしめ、次いでこ
のコンジュゲーション混合物をR2−４プレート上で30℃
で３時間インキュベートせしめた。
振騰させながら約28時間、100−150KUのクレット値とな
るまで増殖せしめた。E.コリHB101/pRT2013をR2−４培
地及び50μg/mlのカナマイシン（Km）中で、37℃で振騰
させながら、100−150KUのクレット値となるまで増殖せ
しめた。E.コリK802recA-（pKT230cos5:1306−3A2）培
養物を、火炎処理したフロッグ（flamed frog）を有す
凍結マイクロタイタートレーから、100μｌのR24−４培
地及び50μ/mlのSmを含むマイクロタイター皿の中に感
染せしめ、そして振騰せずに約18時間、37℃でインキュ
ベートせしめた。このE.コリHB101/pRK2013培養物を遠
心し、Kmを除去せしめるために当容量の0.9％の生理食
塩水で洗浄し、再度遠心し、そして生理食塩水でもとの
容量の1/10における再懸濁により濃縮した、10μｌ容量
のこの濃縮E.コリHB101/pRK2013を、E.コリK802recA-pK
T230 cos5:1306−３−A2の18時間培養物100μｌを含む
各マイクロタイターウエルに添加した。10μｌ容量の、
この混合したHB101/pRK2013及びK802recA-pKT230 cos5:
1306−３−A2培養物を、８チャンネルピペットを用いて
乾燥した150mmのR2−４プレート上に、マイクロタイタ
ーウエルのパターンと一致する方向においてスポット
し、従って各トランスコンジュガントがE.コリコスミド
バンクにおけるそのものとの位置にトレースできるよう
にした。このスポットが乾燥したなら、更に10μｌの各
混合培養物をもとのスポット上に載せ、そして乾燥せし
めた。これを繰り返し、50μｌの各混合培養物が載るよ
うにした。このアセトバクター1306−24培養物を遠心
し、そしてもとの容量の1/10の0.9％の生理食塩水に再
懸濁せしめた。この濃縮培養物10μｌを、８チャンネル
ピペットにより、R2−４プレート上のHB101/pRK2013及
びE.コリK802recA-pKT230 cos5:1306−3A2スポットのそ
れぞれに載せた。このスポットを乾燥せしめ、次いでこ
のコンジュゲーション混合物をR2−４プレート上で30℃
で３時間インキュベートせしめた。
どのトランスコンジュガントがセルロースを生成するか
を検定するため、各交配混合物を除菌つまようじにより
交配プレートから取り出し、そして13×100mmチューブ
中の0.5％のTYE、３％のグルコース、25mMのDMG、20μg
/mlのCm及び50μg/mlのSmを含むR70−22mlの中に直接感
染せしめた（「試験管選択スクリーニング」）。抗生物
質CmはE.コリ供与体及び補助親株の生育を阻害する。抗
生物質Smはコスミドを受け入れていないアセトバクター
株1306−24の生育を阻害する。これらのチューブを30℃
でインキュベートし、そして７〜14日目に薄膜の形成に
ついて検査した。この方法はトランスコンジュガントが
生成したセルロースの識別を可能にした。
を検定するため、各交配混合物を除菌つまようじにより
交配プレートから取り出し、そして13×100mmチューブ
中の0.5％のTYE、３％のグルコース、25mMのDMG、20μg
/mlのCm及び50μg/mlのSmを含むR70−22mlの中に直接感
染せしめた（「試験管選択スクリーニング」）。抗生物
質CmはE.コリ供与体及び補助親株の生育を阻害する。抗
生物質Smはコスミドを受け入れていないアセトバクター
株1306−24の生育を阻害する。これらのチューブを30℃
でインキュベートし、そして７〜14日目に薄膜の形成に
ついて検査した。この方法はトランスコンジュガントが
生成したセルロースの識別を可能にした。
コスミド転移のために前述した多スポットコンジュゲー
ション方法及びセルロース生成のための試験管選択スク
リーンを利用しながら、バンクpKT230 cos5:1306−3A2
由来の487個のコスミドをアセトバクターセルロースシ
ンターゼ突然変異1306−24との交配において用いた。こ
れらのコンジュゲーション中、386個が有用なコスミド
転移を示した。この交配混合物のうちの３つは直立試験
管スクリーン開始後、30℃で14日間のインキュベーショ
ンにより薄膜を形成した。これらの３つのコスミド供与
培養物をT19G9,T20A1及びT20B6と命名した。
ション方法及びセルロース生成のための試験管選択スク
リーンを利用しながら、バンクpKT230 cos5:1306−3A2
由来の487個のコスミドをアセトバクターセルロースシ
ンターゼ突然変異1306−24との交配において用いた。こ
れらのコンジュゲーション中、386個が有用なコスミド
転移を示した。この交配混合物のうちの３つは直立試験
管スクリーン開始後、30℃で14日間のインキュベーショ
ンにより薄膜を形成した。これらの３つのコスミド供与
培養物をT19G9,T20A1及びT20B6と命名した。
これらのコンジュゲーション混合物を直接平板培養した
際、Cel+表現型を示すトランスコンジュガントコロニー
は現れなかった。コンジュゲーション混合物を直立試験
管に感染せしめることでセルロースの生成が検出された
場合のみが観察された。後の研究において、Cel+活性の
復帰は組換に奇因し、真の相補によってではないことが
観察された。このことは、単に平板培養に頼るよりも、
試験管選別を利用するスクリーンについての必要性を意
味しうる。
際、Cel+表現型を示すトランスコンジュガントコロニー
は現れなかった。コンジュゲーション混合物を直立試験
管に感染せしめることでセルロースの生成が検出された
場合のみが観察された。後の研究において、Cel+活性の
復帰は組換に奇因し、真の相補によってではないことが
観察された。このことは、単に平板培養に頼るよりも、
試験管選別を利用するスクリーンについての必要性を意
味しうる。
フィルター交配におけるセルロースシンターゼ活性の復
帰の確認 コスミドT19G9,T20A1及びT20B6であって、その1306−24
トランスコンジュガントが前述の試験管別スクリーンに
おいて薄膜を生成したものを、例IIIにおける方法に従
う、アセトバクター1306−24（受容体）、E.コリHB101p
KT2013（ヘルパープラスミド株）、並びにE.コリpKT203
cos5:1306−3A2 T19G,−T20A1及び−T2B6（供与株）
による、フィルターコンジュゲーション方法により行わ
れる転移において更に試験した。
帰の確認 コスミドT19G9,T20A1及びT20B6であって、その1306−24
トランスコンジュガントが前述の試験管別スクリーンに
おいて薄膜を生成したものを、例IIIにおける方法に従
う、アセトバクター1306−24（受容体）、E.コリHB101p
KT2013（ヘルパープラスミド株）、並びにE.コリpKT203
cos5:1306−3A2 T19G,−T20A1及び−T2B6（供与株）
による、フィルターコンジュゲーション方法により行わ
れる転移において更に試験した。
100μｌの交配混合物を試験管選別スクリーンのために
感染せしめた。これらのコンジュゲーションについての
コンジュゲーション頻度を、交配混合物の連続希釈を、
20μg/mlのCm及び40μg/mlのSmを含むR20−２プレート
上におけるコンジュゲーション後、直接平板培養するこ
とにより検定した。陰性コントロールとしてベクターpK
T203 cos5をこれらのコンジュゲーションと平行して130
6−24に移し入れ、平板培養し、そして試験管に感染せ
しめた。これら1306−24 pKT203 cos5トランスコンジュ
ガントは直立試験管スクリーンにおいて薄膜を形成せ
ず、そして直立試験管におけるCel-成育及び薄膜形成間
の区間のためのコントロールとして働く。先に同定した
３つのコスミドのうち、コスミドpKT230 cos5 1306−3A
2 T19G9のみが陽性の結果、即ち、直立試験管スクリー
ンにおけるCel-からCel+の転換株1306−24を示した。コ
スミドT19G9のコンジュゲーションの頻度は受容細胞当
り7.0×10-8であった。
感染せしめた。これらのコンジュゲーションについての
コンジュゲーション頻度を、交配混合物の連続希釈を、
20μg/mlのCm及び40μg/mlのSmを含むR20−２プレート
上におけるコンジュゲーション後、直接平板培養するこ
とにより検定した。陰性コントロールとしてベクターpK
T203 cos5をこれらのコンジュゲーションと平行して130
6−24に移し入れ、平板培養し、そして試験管に感染せ
しめた。これら1306−24 pKT203 cos5トランスコンジュ
ガントは直立試験管スクリーンにおいて薄膜を形成せ
ず、そして直立試験管におけるCel-成育及び薄膜形成間
の区間のためのコントロールとして働く。先に同定した
３つのコスミドのうち、コスミドpKT230 cos5 1306−3A
2 T19G9のみが陽性の結果、即ち、直立試験管スクリー
ンにおけるCel-からCel+の転換株1306−24を示した。コ
スミドT19G9のコンジュゲーションの頻度は受容細胞当
り7.0×10-8であった。
例VI
不完全及び全長セルロースシンターゼ遺伝子Ｂを有する
コスミドの作製 pKT230 cos5T19G9を有するE.コリとアセトバクター1306
−24とのコンジュゲーションをフィルター上で行った。
100μｌのコンジュゲーション混合物を前述の通り、試
験管選別スクリーンのために感染せしめた。７日後、試
験管において薄膜が形成され、そしてこれを0.9％のNaC
l25mlにて、ブレンダーによりかき混ぜた。得られた懸
濁物を、単一コロニーのために20μg/mlのCm及び40μg/
mlのSmを含むR20−２プレート上で画線培養した。Cel+
コロニーを採取し、そして1306−24 T19G9＃106と表示
した。1306−24 T19G9＃106から単離したコスミドは、
長さにおいて16.6Kbであった。T19G9＃106を有するE.コ
リ株K802recA-を受容体として利用した場合、アセトバ
クタートランスコンジュガントは試験管選別スクリーン
における試験管の100％においてCel+表現型を示した。
それ故、16.6Kbのコスミドは1306−24のCel-突然変異に
おけるセルロースシンターゼ活性を復帰できる。制限分
板は、T19G9＃106はT19G9の欠落生成物であることを示
した。インタクト遺伝子をクローン化後のヌクレオチド
配列分析は、コスミドT19G9＃106が不完全セルロースシ
ンターゼＢ遺伝子を有し、ここでその欠落部位はその遺
伝子コード化領域における固有BamHI部位から142bp 3′
に位置することを確証せしめた。
コスミドの作製 pKT230 cos5T19G9を有するE.コリとアセトバクター1306
−24とのコンジュゲーションをフィルター上で行った。
100μｌのコンジュゲーション混合物を前述の通り、試
験管選別スクリーンのために感染せしめた。７日後、試
験管において薄膜が形成され、そしてこれを0.9％のNaC
l25mlにて、ブレンダーによりかき混ぜた。得られた懸
濁物を、単一コロニーのために20μg/mlのCm及び40μg/
mlのSmを含むR20−２プレート上で画線培養した。Cel+
コロニーを採取し、そして1306−24 T19G9＃106と表示
した。1306−24 T19G9＃106から単離したコスミドは、
長さにおいて16.6Kbであった。T19G9＃106を有するE.コ
リ株K802recA-を受容体として利用した場合、アセトバ
クタートランスコンジュガントは試験管選別スクリーン
における試験管の100％においてCel+表現型を示した。
それ故、16.6Kbのコスミドは1306−24のCel-突然変異に
おけるセルロースシンターゼ活性を復帰できる。制限分
板は、T19G9＃106はT19G9の欠落生成物であることを示
した。インタクト遺伝子をクローン化後のヌクレオチド
配列分析は、コスミドT19G9＃106が不完全セルロースシ
ンターゼＢ遺伝子を有し、ここでその欠落部位はその遺
伝子コード化領域における固有BamHI部位から142bp 3′
に位置することを確証せしめた。
サザンハイブリダイゼーションにおいて、コスミドT19G
9由来の1.8KbのBamHI−SmaIフラグメントはオリゴプロ
ーブMK172（この配列は図１におけるヌクレオチド4564
から4582に広がる）と強くハイブリダイズした。セルロ
ースシンターゼの分子量が120Kbより大きくないなら、
1.8KbのBamHI−SmaIフラグメントはこの遺伝子の３′末
端を含まないであろう。この説を確認するため、全長セ
ルロースシンターゼ遺伝子を有するプラスミドを以下の
通り、三種のリゲーションにおいて作製した。
9由来の1.8KbのBamHI−SmaIフラグメントはオリゴプロ
ーブMK172（この配列は図１におけるヌクレオチド4564
から4582に広がる）と強くハイブリダイズした。セルロ
ースシンターゼの分子量が120Kbより大きくないなら、
1.8KbのBamHI−SmaIフラグメントはこの遺伝子の３′末
端を含まないであろう。この説を確認するため、全長セ
ルロースシンターゼ遺伝子を有するプラスミドを以下の
通り、三種のリゲーションにおいて作製した。
コスミドベクターpKT230 cos5を第１にBamHIで分解し、
そしてその末端を４種の全てのデオキシリボヌクレオチ
ド３リン酸の存在下においてクレノウ（Klenow）酵素に
より修復せしめた。このDNAを更にHind IIIにより分解
せしめた。セルロースシンターゼ遺伝子の３′末端を含
むT19G9由来の3.5KbのBamHI−SmaIフラグメント及びセ
ルロースシンターゼ遺伝子の５′末端を有するT19G9＃1
06由来のHind III−BamHIフラグメントを、TRT18−１を
作製するためにHind III−BamHI修復ベクターpKT230 co
s5の中にリゲートせしめた。このTRT18−１についての
作製は図３に示す。
そしてその末端を４種の全てのデオキシリボヌクレオチ
ド３リン酸の存在下においてクレノウ（Klenow）酵素に
より修復せしめた。このDNAを更にHind IIIにより分解
せしめた。セルロースシンターゼ遺伝子の３′末端を含
むT19G9由来の3.5KbのBamHI−SmaIフラグメント及びセ
ルロースシンターゼ遺伝子の５′末端を有するT19G9＃1
06由来のHind III−BamHIフラグメントを、TRT18−１を
作製するためにHind III−BamHI修復ベクターpKT230 co
s5の中にリゲートせしめた。このTRT18−１についての
作製は図３に示す。
例VII
セルロース陽性トランコンジュガントにおけるインビト
ロでのセルロースシンターゼ活性 アセトバクターゲノミックDNAの3Kb領域（コスミドT19G
9＃106）はアセトバクター株1306−24にCel+表現型を復
帰できる（例VI）。本例はトランスコンジュガントアセ
トバクター株1306−24におけるセルロースシンターゼ活
性の復帰を詳細する。利用したアッセイは例IIにおける
スクリーニングアッセイとして記載したものである。
ロでのセルロースシンターゼ活性 アセトバクターゲノミックDNAの3Kb領域（コスミドT19G
9＃106）はアセトバクター株1306−24にCel+表現型を復
帰できる（例VI）。本例はトランスコンジュガントアセ
トバクター株1306−24におけるセルロースシンターゼ活
性の復帰を詳細する。利用したアッセイは例IIにおける
スクリーニングアッセイとして記載したものである。
アセトバクター株1306−３（Cel+）より成るコントロー
ル及び株1306−24（Cel-）のそれぞれはベクターpKT230
cos5を有する。Cel+株1306−24 T19G9＃106（「トラン
スコンジュガント」）はベクターpKT230 cos5における
アセトバクターゲノミックDNAの3Kbのフラグメントを有
する。この細胞を50mg/lのSm及び20mg/lのCmを加えた例
IIにおける記載に従って生育せしめた、細胞を集め、セ
ルロースから分離し、洗浄し、濃縮し、そして前述の通
りの超音波処理した。インビトロでのセルロースシンタ
ーゼ活性を測定し、そしてピアース（Pierce）（Chemic
al Company,Rockford,1L）より開発されたBCA（ビシン
コニン酸）タンパク質測定を超音波処理細胞調製物のタ
ンパク質濃度の測定のために用いた。株は2mg細胞/mlの
濃度で測定された。また、株1306−24 pKT230 cos5及び
1306−24 T19G9＃106を有効濃度効果の検定のため、5mg
細胞/mlで測定した。
ル及び株1306−24（Cel-）のそれぞれはベクターpKT230
cos5を有する。Cel+株1306−24 T19G9＃106（「トラン
スコンジュガント」）はベクターpKT230 cos5における
アセトバクターゲノミックDNAの3Kbのフラグメントを有
する。この細胞を50mg/lのSm及び20mg/lのCmを加えた例
IIにおける記載に従って生育せしめた、細胞を集め、セ
ルロースから分離し、洗浄し、濃縮し、そして前述の通
りの超音波処理した。インビトロでのセルロースシンタ
ーゼ活性を測定し、そしてピアース（Pierce）（Chemic
al Company,Rockford,1L）より開発されたBCA（ビシン
コニン酸）タンパク質測定を超音波処理細胞調製物のタ
ンパク質濃度の測定のために用いた。株は2mg細胞/mlの
濃度で測定された。また、株1306−24 pKT230 cos5及び
1306−24 T19G9＃106を有効濃度効果の検定のため、5mg
細胞/mlで測定した。
表１に示す通り、株1306−24 pKT230 cos5及びトランス
コンジュガント1306−24のセルロースシンターゼ活性
は、この測定での細胞濃度に影響されなかった。1306−
3pKT230 cos5の活性は株1306−21の活性（図示せず）と
類似していた。それ故、ベクターpKT230 cos5はセルロ
ースシンターゼ活性を及ぼさないものと思われた。株13
06−24はｃ−di−GMPによる活性化に基づく低レベルの
セルロースシンターゼ活性を示した。これはほとんどの
クラスＩ（セルロースシンターゼ陰性）アセトバクター
突然変異体についての事実であった。セルロースシンタ
ーゼ活性における突然変異はインビトロで幾分漏出ぎみ
であるが、細胞はインビボでは非常に少量のセルロース
を生成した（フラスコ振騰において）。この3Kbの挿入
物は株1306−24のセルロースシンターゼ活性を、測定チ
ューブにおける5mg細胞/mlにて大まかに10倍（0.4から
4.1nモル／分mg）上昇させた。このことはセルロース陽
性表現型の出現と関連する。トランスコンジュガント株
1306−24は、セルロース陽性株1306−３と同等のｃ−di
−GMPを刺激活性を有していた。
コンジュガント1306−24のセルロースシンターゼ活性
は、この測定での細胞濃度に影響されなかった。1306−
3pKT230 cos5の活性は株1306−21の活性（図示せず）と
類似していた。それ故、ベクターpKT230 cos5はセルロ
ースシンターゼ活性を及ぼさないものと思われた。株13
06−24はｃ−di−GMPによる活性化に基づく低レベルの
セルロースシンターゼ活性を示した。これはほとんどの
クラスＩ（セルロースシンターゼ陰性）アセトバクター
突然変異体についての事実であった。セルロースシンタ
ーゼ活性における突然変異はインビトロで幾分漏出ぎみ
であるが、細胞はインビボでは非常に少量のセルロース
を生成した（フラスコ振騰において）。この3Kbの挿入
物は株1306−24のセルロースシンターゼ活性を、測定チ
ューブにおける5mg細胞/mlにて大まかに10倍（0.4から
4.1nモル／分mg）上昇させた。このことはセルロース陽
性表現型の出現と関連する。トランスコンジュガント株
1306−24は、セルロース陽性株1306−３と同等のｃ−di
−GMPを刺激活性を有していた。
適当なコントロールを利用した別な実験におけるTRT18
−１について結果は、このプラスミドがCel-表現型から
Cel+への転換を可能にし、そして第２にインビトロアッ
セイにおいて、この酵素活性は、表１に示す通り、3Kb
のT19G9＃106アセトバクターDNA挿入物を有するpKT230
cos5ベクターについて観察できた活性と対照的であっ
た。
−１について結果は、このプラスミドがCel-表現型から
Cel+への転換を可能にし、そして第２にインビトロアッ
セイにおいて、この酵素活性は、表１に示す通り、3Kb
のT19G9＃106アセトバクターDNA挿入物を有するpKT230
cos5ベクターについて観察できた活性と対照的であっ
た。
例VIII
セルロースシンターゼＢ遺伝子のヌクレオチド配列
本例において、コスミドT19G9＃106上にあるセルロース
シンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の決定のため、本
発明のクローン化セルロースシンターゼＢ遺伝子の制限
地図をサグクローニング方法を説明するために用いた。
シンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の決定のため、本
発明のクローン化セルロースシンターゼＢ遺伝子の制限
地図をサグクローニング方法を説明するために用いた。
コスミドT19G9＃106におけるセルロースシンターゼ遺伝
子を有するクローン化挿入DNAを制限酵素を用いて物理
的に地図化した。この地図情報を次に、Methods in Enz
ymol,101:20−78（1983）においてMessingの記載する方
法に従うシーケシング分析のため、アセトバクターDNA
挿入物をM13RF DNAにサブクローンせしめるために用い
た。制限フラグメントのヌクレオチド配列は、Innis他
の（1988）Proc,Natl,Acad.Sci.USA 85:9436−9440に記
載の、TagDNAポリメラーゼ（Cetus Corp.Emeryville,C
A）を用いた鎖停止方法により決定した。
子を有するクローン化挿入DNAを制限酵素を用いて物理
的に地図化した。この地図情報を次に、Methods in Enz
ymol,101:20−78（1983）においてMessingの記載する方
法に従うシーケシング分析のため、アセトバクターDNA
挿入物をM13RF DNAにサブクローンせしめるために用い
た。制限フラグメントのヌクレオチド配列は、Innis他
の（1988）Proc,Natl,Acad.Sci.USA 85:9436−9440に記
載の、TagDNAポリメラーゼ（Cetus Corp.Emeryville,C
A）を用いた鎖停止方法により決定した。
例IX
突然変異アセトバクター株1306−24におけるセルロース
シンターゼ遺伝子崩壊及びセルロースシンターゼ活性の
復帰 セルロースシンターゼがプラスミドTRT18−１から表現
されているかを調べるため、三つの異なるフレームシフ
ト突然変異をセルロースシンターゼ遺伝子コード化領域
に導入せしめた。この突然変異遺伝子をプラスミドTRT1
8−１に導入せしめ、次いでそれぞれアセトバクター株1
306−24に移し入れた。
シンターゼ遺伝子崩壊及びセルロースシンターゼ活性の
復帰 セルロースシンターゼがプラスミドTRT18−１から表現
されているかを調べるため、三つの異なるフレームシフ
ト突然変異をセルロースシンターゼ遺伝子コード化領域
に導入せしめた。この突然変異遺伝子をプラスミドTRT1
8−１に導入せしめ、次いでそれぞれアセトバクター株1
306−24に移し入れた。
三種の突然変異体をセルロースシンターゼのコード化領
域の中に、以下の通りに導入せしめた:Bgl IIリンカー
配列をヌクレオチド位置3113でEcoRV部位及びヌクレオ
チド位置3954でのStuI部位に導入せしめた。このEcoRV
挿入はフレームシフト突然変異と同様に停止コドンTGA
を作り出す。4564の位置のStuI部位に導入したBgl IIリ
ンカーはフレームシフト突然変異を作り出す。第三の突
然変異をヌクレオチド位置1899のBamHI部位に導入し、
そしてこれはクレノウによるBamHI部位の埋め合わせに
より作られる。
域の中に、以下の通りに導入せしめた:Bgl IIリンカー
配列をヌクレオチド位置3113でEcoRV部位及びヌクレオ
チド位置3954でのStuI部位に導入せしめた。このEcoRV
挿入はフレームシフト突然変異と同様に停止コドンTGA
を作り出す。4564の位置のStuI部位に導入したBgl IIリ
ンカーはフレームシフト突然変異を作り出す。第三の突
然変異をヌクレオチド位置1899のBamHI部位に導入し、
そしてこれはクレノウによるBamHI部位の埋め合わせに
より作られる。
これらのプラスミドのDNAは制限分解により分析され、D
NAシーケシングにより評価される。各突然変異遺伝子を
クラスＩ突然変異株1306−24とコンジュゲートせしめ
た。プレートからの単一コロニーを直立試験管に移し、
そしてこれらのコンジュゲーションの結果を表２に示
す。薄膜を形成する能力は、コンジュゲーション混合
物、又は選別プレートからのコロニーにより直接感染さ
れたチューブにおいて表記した。全ての突然変異遺伝子
は1306−24において存在するCel-突然変異の転換を可能
とし、このことは突然変異の転換はプラスミドと染色体
の間の組換を介して起こることを推論させる。
NAシーケシングにより評価される。各突然変異遺伝子を
クラスＩ突然変異株1306−24とコンジュゲートせしめ
た。プレートからの単一コロニーを直立試験管に移し、
そしてこれらのコンジュゲーションの結果を表２に示
す。薄膜を形成する能力は、コンジュゲーション混合
物、又は選別プレートからのコロニーにより直接感染さ
れたチューブにおいて表記した。全ての突然変異遺伝子
は1306−24において存在するCel-突然変異の転換を可能
とし、このことは突然変異の転換はプラスミドと染色体
の間の組換を介して起こることを推論させる。
この結果より、染色体及びプラスミドシンターゼ遺伝子
が遺伝子の機能的なコピーを形成するために組織したこ
とが考えられる。おそらく、転写及び翻訳シグナルが染
色体コピーにより提供されたのであろう。定性的に述べ
ると、全てのチューブにおいて形成された薄膜のサイズ
は同程度であり、全てのトランスコンジュガントにおけ
る表現型のレベルが同等であると考えられる。
が遺伝子の機能的なコピーを形成するために組織したこ
とが考えられる。おそらく、転写及び翻訳シグナルが染
色体コピーにより提供されたのであろう。定性的に述べ
ると、全てのチューブにおいて形成された薄膜のサイズ
は同程度であり、全てのトランスコンジュガントにおけ
る表現型のレベルが同等であると考えられる。
例Ｘ
アセトバクター株由来の3.5Kbの内因性プラスミドのク
ローン化 酢培養物（CMCC824）から単離されるセルロース生産株
であるCetus Corporationの専売の株、アセトバクターC
MCC824は、3.5Kbのプラスミドを含む。このプラスミド
を単離するため、R20−２プレートから単一コロニーを5
0mlのR20−２に感染せしめ、そして振騰せずに30℃で48
時間インキュベートせしめた。この薄膜を50mMのトリ
ス、10mMのEDTA、pH8.0、100mlにて２回洗浄し、ベック
マン（Beckman）ブレンダーにおいてホモジナイズし、
そしてチーズクロスで濾過せしめた。この細胞をペレッ
ト化し、そしてプラスミドDNAをGuerry,et al.,（197
3）J.Becteriol.116:1064による改良のSDS溶解方法の後
に得られた。
ローン化 酢培養物（CMCC824）から単離されるセルロース生産株
であるCetus Corporationの専売の株、アセトバクターC
MCC824は、3.5Kbのプラスミドを含む。このプラスミド
を単離するため、R20−２プレートから単一コロニーを5
0mlのR20−２に感染せしめ、そして振騰せずに30℃で48
時間インキュベートせしめた。この薄膜を50mMのトリ
ス、10mMのEDTA、pH8.0、100mlにて２回洗浄し、ベック
マン（Beckman）ブレンダーにおいてホモジナイズし、
そしてチーズクロスで濾過せしめた。この細胞をペレッ
ト化し、そしてプラスミドDNAをGuerry,et al.,（197
3）J.Becteriol.116:1064による改良のSDS溶解方法の後
に得られた。
この細胞ペレットに25％スクロース、0.05Mのトリス−H
Cl、pH8、1.5mlを加え、そしてこの細胞をパスツールピ
ペットを用いてゆっくりと再懸濁せしめ、その後12mlの
ポリプロピレンチューブに移し入れた。0.15mlのリゾチ
ーム（250mMとトリス−HCl、pH8において10mg/ml）を加
えた後、0.25MのNa2−EDTA、pH8を0.6ml加え、そしてこ
のチューブを逆さまにし、氷の上に20分間置いた。
Cl、pH8、1.5mlを加え、そしてこの細胞をパスツールピ
ペットを用いてゆっくりと再懸濁せしめ、その後12mlの
ポリプロピレンチューブに移し入れた。0.15mlのリゾチ
ーム（250mMとトリス−HCl、pH8において10mg/ml）を加
えた後、0.25MのNa2−EDTA、pH8を0.6ml加え、そしてこ
のチューブを逆さまにし、氷の上に20分間置いた。
次に、10％のSDS0.6mlを、室温でゆっくりとひっくり返
し、透明感が観察できたらチューブに加えた。5MのNaCl
を約0.9ml加え、そしてこのチューブを白色の沈殿物が
観察できる迄ひっくり返し続けた。このチューブを４℃
中で、氷の上に２−20時間置き、その後その沈殿物を2
0,000×ｇで45分間、０−４℃で沈降下せしめた。
し、透明感が観察できたらチューブに加えた。5MのNaCl
を約0.9ml加え、そしてこのチューブを白色の沈殿物が
観察できる迄ひっくり返し続けた。このチューブを４℃
中で、氷の上に２−20時間置き、その後その沈殿物を2
0,000×ｇで45分間、０−４℃で沈降下せしめた。
この上清液を除去し、そして等容量の蒸留水を加えた。
等容量の、２度蒸留した、トリス平衡化フェノール（pH
8.0）を加え、そしてこのチューブを20℃で、5000×ｇ
での15分間の遠心の前に、３−４分間にゆっくりとひっ
くり返し続けた。水相をパスツールピペットを用いて慎
重に取り出し、この容量の２〜３倍の容量のポリプロピ
レンチューブに移し入れた。次に、3MのNaOAc1/10容量
及び無水EtOH2−３倍容量を加え、よく攪拌し、このチ
ューブを−20℃で一夜放置した。上清を遠心（20,000×
０、30分間、０℃）で集め、そしてペレットを５−10ml
の冷70％EtOHで洗浄し、その後ペレットを回収するため
に20,000×ｇで10分間再遠心せしめた。このペレットを
50−100μｌのTE（100mMのトリス、1mMのEDTA）に溶解
した。プラスミドDNAをエチジウムブロマイド−CsCl密
度遠心により精製した。
等容量の、２度蒸留した、トリス平衡化フェノール（pH
8.0）を加え、そしてこのチューブを20℃で、5000×ｇ
での15分間の遠心の前に、３−４分間にゆっくりとひっ
くり返し続けた。水相をパスツールピペットを用いて慎
重に取り出し、この容量の２〜３倍の容量のポリプロピ
レンチューブに移し入れた。次に、3MのNaOAc1/10容量
及び無水EtOH2−３倍容量を加え、よく攪拌し、このチ
ューブを−20℃で一夜放置した。上清を遠心（20,000×
０、30分間、０℃）で集め、そしてペレットを５−10ml
の冷70％EtOHで洗浄し、その後ペレットを回収するため
に20,000×ｇで10分間再遠心せしめた。このペレットを
50−100μｌのTE（100mMのトリス、1mMのEDTA）に溶解
した。プラスミドDNAをエチジウムブロマイド−CsCl密
度遠心により精製した。
このプラスミドを物理的に地図化するため、CsCl調製DN
Aを以下の制限酵素:Hind III,EcoRI,PstI,BamHI,SacI,P
vr IIにより分解せしめた。試験した酵素の中で、SacI
のみこのプラスミドを直鎖化できた。
Aを以下の制限酵素:Hind III,EcoRI,PstI,BamHI,SacI,P
vr IIにより分解せしめた。試験した酵素の中で、SacI
のみこのプラスミドを直鎖化できた。
SacI分解プラスミドをE.コリにおけるクローニングのた
めにSacI分解プラスミドpUC18（New England Biolabs）
にリゲートせしめた。このシャトルベクターをpUC18−8
24と表示する。pUC18−824の物理的地図化のため、この
プラスミドを種々制限エンドヌクレアーゼにより分解せ
しめた。pUC18−824の制限地図を図４に示す。
めにSacI分解プラスミドpUC18（New England Biolabs）
にリゲートせしめた。このシャトルベクターをpUC18−8
24と表示する。pUC18−824の物理的地図化のため、この
プラスミドを種々制限エンドヌクレアーゼにより分解せ
しめた。pUC18−824の制限地図を図４に示す。
例X I
エレクトロトランスフォーメーション
シャトルベクターpUC18−824をアセトバクター株に移す
ことができることを示すため、pUC18−824プラスミドDN
Aを、Clewell,et al.,（1972）J.Bacteriol.110:667に
従て、pUC18−824を有すE.コリ宿主株DG98から調製し
た。アセトバクター株1306−21及び1306−24をDower,et
al.,（1988）（前述）に記載に従って洗浄せしめた。
細菌培養物の形質転換のためにデザインされたエレクト
ロポレーション装置を、アセトバクターエレクトロポレ
ーションのために用いた。本例において用いられた装置
は哺乳類設計エレクトロポレーション装置の改良品であ
るが、商業的な装置、例えばバイオラッドジーンパルサ
ー装置（Bio−Rad Gene−Pulser Apparatus）（120V,50
/60Hz）を、同等の形質転換率を得るために代用でき
る。エレクトロポレーションのパラメータはプラスミド
pKT230 cos5T19G9＃106を以下に従って最適化する：株1
306−21及び1306−24のために9.0キロボルト（KV）及び
9.5KVの電場がそれぞれ必要である。25マイクロファラ
デー/750オーム（＝18.75m秒）のパルス持続時間（RC
値）が最適であることが分った。30℃で更に５日間のイ
ンキュベーションに基づき、１マイクログラムのDNA当
り104個より多い形質転換体が、100マイクログラム/ml
のアンピシリンを含むR20−２プレート上で得られた。
ことができることを示すため、pUC18−824プラスミドDN
Aを、Clewell,et al.,（1972）J.Bacteriol.110:667に
従て、pUC18−824を有すE.コリ宿主株DG98から調製し
た。アセトバクター株1306−21及び1306−24をDower,et
al.,（1988）（前述）に記載に従って洗浄せしめた。
細菌培養物の形質転換のためにデザインされたエレクト
ロポレーション装置を、アセトバクターエレクトロポレ
ーションのために用いた。本例において用いられた装置
は哺乳類設計エレクトロポレーション装置の改良品であ
るが、商業的な装置、例えばバイオラッドジーンパルサ
ー装置（Bio−Rad Gene−Pulser Apparatus）（120V,50
/60Hz）を、同等の形質転換率を得るために代用でき
る。エレクトロポレーションのパラメータはプラスミド
pKT230 cos5T19G9＃106を以下に従って最適化する：株1
306−21及び1306−24のために9.0キロボルト（KV）及び
9.5KVの電場がそれぞれ必要である。25マイクロファラ
デー/750オーム（＝18.75m秒）のパルス持続時間（RC
値）が最適であることが分った。30℃で更に５日間のイ
ンキュベーションに基づき、１マイクログラムのDNA当
り104個より多い形質転換体が、100マイクログラム/ml
のアンピシリンを含むR20−２プレート上で得られた。
pUC18−824プラスミドDNAが４つのアセトバクター候補
から単離され、そしてE.コリ及びアセトバクターに形質
転換せしめた。シャトルベクターは、アセトバクター中
での増殖後安定であり、なぜなら、制限分析は（４つの
総クローン）全てのポリリンカー部位の存在及び見わけ
られる欠損の非存在性を示したからである。
から単離され、そしてE.コリ及びアセトバクターに形質
転換せしめた。シャトルベクターは、アセトバクター中
での増殖後安定であり、なぜなら、制限分析は（４つの
総クローン）全てのポリリンカー部位の存在及び見わけ
られる欠損の非存在性を示したからである。
例X II
セルロースシンターゼＢ遺伝子を含むpUC18−824の作製
セルロースシンターゼＢ遺伝子はプラスミドTRT18−１
から単離でき、その作製は例VIに教示され、又は他方、
この遺伝子のヌクレオチド配列が本明細書にて提供され
ているため、この全長遺伝子は化学的手段により直接合
成するか、もしくはプライマーを用い、作製された遺伝
子バンクから得ることができる。例えば、プライマーオ
リゴヌクレオチドMK170（TGCCCTGGCCAGATGTCAGCA）が作
製した遺伝子バンクから1760個の固有培養物をつり出す
ために用いられ、そして６つのクローンを更なる特徴付
けのために単離せしめた。これら３つのクローンから単
離した３つのコスミドを、T5A1,T1C2及びT5D2と命名す
る。
から単離でき、その作製は例VIに教示され、又は他方、
この遺伝子のヌクレオチド配列が本明細書にて提供され
ているため、この全長遺伝子は化学的手段により直接合
成するか、もしくはプライマーを用い、作製された遺伝
子バンクから得ることができる。例えば、プライマーオ
リゴヌクレオチドMK170（TGCCCTGGCCAGATGTCAGCA）が作
製した遺伝子バンクから1760個の固有培養物をつり出す
ために用いられ、そして６つのクローンを更なる特徴付
けのために単離せしめた。これら３つのクローンから単
離した３つのコスミドを、T5A1,T1C2及びT5D2と命名す
る。
前記の単離コスミドの制限及びサザン分析は、それら全
てが8Kbより大きいセルロースシンターゼＢ遺伝子のDNA
配列５′及びセルロースシンターゼＢタンパク質生成物
についての全体をコード化する配列を有することを示し
た。プローブとしてのプライマーMK170によるコスミドD
NAのサザン分析により、T5A1由来の7.2KbのBamHIフラグ
メントはセルロースシンターゼＢ遺伝子のほとんどの配
列、及びこの遺伝子の５′のすぐ隣りに更なる配列を有
することが示された。それ故、7.2KbのBamHIフラグメン
トをヌクレオチド配列分析のため、プラスミドpUC18及
びpBR322にサブクローン化せしめた。7.2KbのBamHIフラ
グメントの制限地図を図５において示す。この図に示す
約8.3KbのSmaIフラグメントはインタクトの全長セルロ
ースシンターゼＢ遺伝子を含む。この遺伝子は、以下の
クローニングベクターpUC18−824による作製において用
いるため、プラスミドT5A1から単離せしめた。更にサザ
ン分析が示すには、染色体におけるセルロースシンター
ゼＢ遺伝子座の構造はコスミドT5A1のそれと同一である
ことである；それ故、このコスミドにおけるアセトバク
ター配列は更に再配列されていない。
てが8Kbより大きいセルロースシンターゼＢ遺伝子のDNA
配列５′及びセルロースシンターゼＢタンパク質生成物
についての全体をコード化する配列を有することを示し
た。プローブとしてのプライマーMK170によるコスミドD
NAのサザン分析により、T5A1由来の7.2KbのBamHIフラグ
メントはセルロースシンターゼＢ遺伝子のほとんどの配
列、及びこの遺伝子の５′のすぐ隣りに更なる配列を有
することが示された。それ故、7.2KbのBamHIフラグメン
トをヌクレオチド配列分析のため、プラスミドpUC18及
びpBR322にサブクローン化せしめた。7.2KbのBamHIフラ
グメントの制限地図を図５において示す。この図に示す
約8.3KbのSmaIフラグメントはインタクトの全長セルロ
ースシンターゼＢ遺伝子を含む。この遺伝子は、以下の
クローニングベクターpUC18−824による作製において用
いるため、プラスミドT5A1から単離せしめた。更にサザ
ン分析が示すには、染色体におけるセルロースシンター
ゼＢ遺伝子座の構造はコスミドT5A1のそれと同一である
ことである；それ故、このコスミドにおけるアセトバク
ター配列は更に再配列されていない。
セルロースシンターゼＢ遺伝子及び約3Kbの上流配列
（図５における制限地図参照のこと）を有する、8.3Kb
のSmaIフラグメントをpUC18−824のSmaI部位の中にてク
ローン化せしめた。反対方向の8.3KbのSmaI制限フラグ
メントを有する得られたプラスミドを、それぞれpUC18
−824FS−１とpUC18−824FS−６と命名した。FS−６の
制限地図を図６に示した。このようなプラスミドを1306
−24（セルロースシンターゼ欠損株）、1306−42及びC9
0−１（両方ともジグアニレートサイクラーゼ及びセル
ロースシンターゼ活性を欠損する）に形質転換せしめる
際、この形質転換はプレート上にCel+コロニー表現型を
示した。それ故、初期の実験において観察できた「組換
現象」とは反対に、8.3KbのアセトバクターDNA挿入物に
よりコード化されたタンパク質は突然変異体が有するセ
ルロースシンターゼ突然変異を直接相補できるものと結
論づけられる。
（図５における制限地図参照のこと）を有する、8.3Kb
のSmaIフラグメントをpUC18−824のSmaI部位の中にてク
ローン化せしめた。反対方向の8.3KbのSmaI制限フラグ
メントを有する得られたプラスミドを、それぞれpUC18
−824FS−１とpUC18−824FS−６と命名した。FS−６の
制限地図を図６に示した。このようなプラスミドを1306
−24（セルロースシンターゼ欠損株）、1306−42及びC9
0−１（両方ともジグアニレートサイクラーゼ及びセル
ロースシンターゼ活性を欠損する）に形質転換せしめる
際、この形質転換はプレート上にCel+コロニー表現型を
示した。それ故、初期の実験において観察できた「組換
現象」とは反対に、8.3KbのアセトバクターDNA挿入物に
よりコード化されたタンパク質は突然変異体が有するセ
ルロースシンターゼ突然変異を直接相補できるものと結
論づけられる。
インビトロアッセイはプラスミドpUC18−824FS−１及び
pUC18−824FS−６のセルロースシンターゼ陰性突然変異
株1306−24へのセルロースシンターゼ活性の復帰の能力
を確証せしめた。形質転換体及びコントロール株のイン
ビトロセルロースシンターゼアッセイは例VIIにおける
記載に従って行った。表３に示す通り、この形質転換
体、1306−24 pUC18−825 FS−１及び1306−24 pUC18−
824FS−６は、もとのCel+親株、1306−３のセルロース
シンターゼ比活性よりも高い比活性を示した（それぞれ
1.3倍及び1.8倍）。
pUC18−824FS−６のセルロースシンターゼ陰性突然変異
株1306−24へのセルロースシンターゼ活性の復帰の能力
を確証せしめた。形質転換体及びコントロール株のイン
ビトロセルロースシンターゼアッセイは例VIIにおける
記載に従って行った。表３に示す通り、この形質転換
体、1306−24 pUC18−825 FS−１及び1306−24 pUC18−
824FS−６は、もとのCel+親株、1306−３のセルロース
シンターゼ比活性よりも高い比活性を示した（それぞれ
1.3倍及び1.8倍）。
例X III
アセトバクターにおける表現ベクターの作製
プラスミドpUC19（New England Biolabs）を制限酵素Sa
cIにより分解せしめた。この直鎖プラスミドをSacI−制
限されたアセトバクタープラスミド824とリゼートせし
めた。得られたプラスミドをpUC19−824と命名した。8.
3KbのSmaIフラグメント由来のセルロースシンターゼ遺
伝子をHind III−SmaIフラグメント（即ち、4.9Kb）と
して、pUC19プラスミドのリンカー領域におけるHind II
I−SmaI部位にクローン化し（図８を参照のこと）、従
ってその転写方向はlacプロモーターと同一である。lac
プロモーターは構成プロモーターのため、lac遺伝子生
成物の不存在におけるセルロースシンターゼの表現はア
セトバクターにおいて調節不能となるであろう。このプ
ラスミドをpAL1と表示する。
cIにより分解せしめた。この直鎖プラスミドをSacI−制
限されたアセトバクタープラスミド824とリゼートせし
めた。得られたプラスミドをpUC19−824と命名した。8.
3KbのSmaIフラグメント由来のセルロースシンターゼ遺
伝子をHind III−SmaIフラグメント（即ち、4.9Kb）と
して、pUC19プラスミドのリンカー領域におけるHind II
I−SmaI部位にクローン化し（図８を参照のこと）、従
ってその転写方向はlacプロモーターと同一である。lac
プロモーターは構成プロモーターのため、lac遺伝子生
成物の不存在におけるセルロースシンターゼの表現はア
セトバクターにおいて調節不能となるであろう。このプ
ラスミドをpAL1と表示する。
pAL1をアセトバクター株1306−24の形質転換のために用
い、そしてそれはプレート上にてCel+表現型としてもた
らされるセルロースシンターゼ欠落表現型を相補するこ
とを表した。
い、そしてそれはプレート上にてCel+表現型としてもた
らされるセルロースシンターゼ欠落表現型を相補するこ
とを表した。
例X IV
セルロースシンターゼオペロンの同定
A.オペロンにおける第１の遺伝子の同定
アセトバクター染色体からの図５に示す7.2KbのBamHI制
限フラグメントは、セルロースシンターゼＢ遺伝子の上
流に更なる4.6Kbのヌクレオチド配列を有するものとし
て同定された。この領域が、セルロースの生合成におい
て含まれる遺伝子を含むかを調べるため、セルロースシ
ンターゼＢ遺伝子の上流のヌクレオチド配列を以下の通
りに検定した。
限フラグメントは、セルロースシンターゼＢ遺伝子の上
流に更なる4.6Kbのヌクレオチド配列を有するものとし
て同定された。この領域が、セルロースの生合成におい
て含まれる遺伝子を含むかを調べるため、セルロースシ
ンターゼＢ遺伝子の上流のヌクレオチド配列を以下の通
りに検定した。
7.2KbのBamHIフラグメントをpBR322のBamHI部位中でク
ローン化せしめた。pBR322の組換プラスミド由来の7.2K
bのBamHIフラグメントの、2.3KbのSac IIフラグメン
ト、0.9KbのBgl IIフラグメント及び3.2KbのBamHI−Bal
IIフラグメントを、ブルースクリプト（Bluescriptf）
（Stratagene）KSベクターのSac II又はBamHI部位のそ
れぞれにサブクローン化せしめた。これら３つのサブク
ローン及びpBR322組換プラスミドであってBamHIフラグ
メント全体を有するものを次にCsCl密度勾配により精製
し、そしてヌクレオチド配列分析のためのジデオキシチ
ェーンターミネーション方法における鋳型として用い
た。このジデオキシチェーンターミネーション方法は、
前述の通り、ただし伸長反応においてクレノウフラグメ
ントの代りにシークエナーゼ（Sequenase）を用いた。
ローン化せしめた。pBR322の組換プラスミド由来の7.2K
bのBamHIフラグメントの、2.3KbのSac IIフラグメン
ト、0.9KbのBgl IIフラグメント及び3.2KbのBamHI−Bal
IIフラグメントを、ブルースクリプト（Bluescriptf）
（Stratagene）KSベクターのSac II又はBamHI部位のそ
れぞれにサブクローン化せしめた。これら３つのサブク
ローン及びpBR322組換プラスミドであってBamHIフラグ
メント全体を有するものを次にCsCl密度勾配により精製
し、そしてヌクレオチド配列分析のためのジデオキシチ
ェーンターミネーション方法における鋳型として用い
た。このジデオキシチェーンターミネーション方法は、
前述の通り、ただし伸長反応においてクレノウフラグメ
ントの代りにシークエナーゼ（Sequenase）を用いた。
セルロースシンターゼオペロンのヌクレオチド配列は、
図１に示す。ヌクレオチド2594のATGコドンがセルロー
スシンターゼＢ遺伝子の開始コドンと考えると、セルロ
ースシンターゼＢ遺伝子のコード化領域ヌクレオチド配
列はヌクレオチド2594から4999迄広がる。成熟タンパク
質はヌクレオチド2666のアラニンコドンから開始するた
め（例X IV）参照のこと）、このセルロースシンターゼ
は24のアミノ酸の誘導配列を有するものと理解される。
この誘導ペプチドの推定アミノ酸配列は、種々の細菌由
来の分泌物及び膜タンパク質が有する誘導タンパク質と
機能的に類似する。それ故、セルロースシンターゼＢ遺
伝子によりコード化されるセルロースシンターゼタンパ
ク質は膜タンパク質でありうる。
図１に示す。ヌクレオチド2594のATGコドンがセルロー
スシンターゼＢ遺伝子の開始コドンと考えると、セルロ
ースシンターゼＢ遺伝子のコード化領域ヌクレオチド配
列はヌクレオチド2594から4999迄広がる。成熟タンパク
質はヌクレオチド2666のアラニンコドンから開始するた
め（例X IV）参照のこと）、このセルロースシンターゼ
は24のアミノ酸の誘導配列を有するものと理解される。
この誘導ペプチドの推定アミノ酸配列は、種々の細菌由
来の分泌物及び膜タンパク質が有する誘導タンパク質と
機能的に類似する。それ故、セルロースシンターゼＢ遺
伝子によりコード化されるセルロースシンターゼタンパ
ク質は膜タンパク質でありうる。
B.転写開始部位の局在化
1.RNAの単離：アセトバクター1306−21を、20μg/mlのC
m及び0.1％（V/V）のセルラーゼ（Genencor）を含むR70
−２培地において、30℃で振騰させながら対数増殖の後
期迄（O.D.600nm＝0.7）増殖せしめた。次にこれらの細
菌を6,000rpmで10分間、４℃での遠心により集め、そし
て1mMのEDTA及び１％のSDSを含むNaOAC、pH6.0の緩衝液
2.5mに再懸濁せしめた。等容量のフェノール／クロロホ
ルム溶液をこの細胞懸濁物に加え、そしてこの混合物を
15秒間超音波処理せしめた。10分間の60℃でのインキュ
ベーション後、この混合物を遠心せしめ、そして次に水
性相をフェノール／クロロホルムにより更に２回抽出せ
しめた。抽出後、このRNAをイソプロパノール及びNaOAc
により−70℃で一夜沈殿せしめた。このRNAを遠心によ
り集め、100％のエタノールで洗浄し、そして乾燥せし
め、DEPC処理蒸留水120μｌに再懸濁せしめた。このRNA
溶液におけるDNAを分解せしめるため、DNaseI（Sigma）
を10μg/mlとなる迄加え、そしてこの混合物を室温で20
分間インキュベートせしめた。この分解処理混合物を等
容量のフェノール／クロロホルムにより２回抽出せしめ
た。次に水性相のNaOAc濃度を0.3Mに調整し、そしてRNA
を等容量のイソプロパノールにより沈殿せしめた。この
精製RNAを80％のエタノールにより洗浄し、乾燥し、そ
してDEPC処理蒸留水40μｌに再懸濁せしめた。
m及び0.1％（V/V）のセルラーゼ（Genencor）を含むR70
−２培地において、30℃で振騰させながら対数増殖の後
期迄（O.D.600nm＝0.7）増殖せしめた。次にこれらの細
菌を6,000rpmで10分間、４℃での遠心により集め、そし
て1mMのEDTA及び１％のSDSを含むNaOAC、pH6.0の緩衝液
2.5mに再懸濁せしめた。等容量のフェノール／クロロホ
ルム溶液をこの細胞懸濁物に加え、そしてこの混合物を
15秒間超音波処理せしめた。10分間の60℃でのインキュ
ベーション後、この混合物を遠心せしめ、そして次に水
性相をフェノール／クロロホルムにより更に２回抽出せ
しめた。抽出後、このRNAをイソプロパノール及びNaOAc
により−70℃で一夜沈殿せしめた。このRNAを遠心によ
り集め、100％のエタノールで洗浄し、そして乾燥せし
め、DEPC処理蒸留水120μｌに再懸濁せしめた。このRNA
溶液におけるDNAを分解せしめるため、DNaseI（Sigma）
を10μg/mlとなる迄加え、そしてこの混合物を室温で20
分間インキュベートせしめた。この分解処理混合物を等
容量のフェノール／クロロホルムにより２回抽出せしめ
た。次に水性相のNaOAc濃度を0.3Mに調整し、そしてRNA
を等容量のイソプロパノールにより沈殿せしめた。この
精製RNAを80％のエタノールにより洗浄し、乾燥し、そ
してDEPC処理蒸留水40μｌに再懸濁せしめた。
2.プライマー伸長：オリゴデオキシリボヌクレオチドGE
13（５′−TGCGGCGATAAGTGCACA−３′）をガンマー32P
ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼにより標識せし
めた。一体化されなかったヌクレオチドをエタノール沈
殿により除去せしめた。この標識オリゴデオキシリボヌ
クレオチドを0.3MのNaOAc溶液100μｌに再懸濁せしめ
た。このプライマーの比活性は約４×106cpm/pモルであ
った。標識プライマー（0.02及び0.2pモル）は、プライ
マー伸長分析のために用いた。
13（５′−TGCGGCGATAAGTGCACA−３′）をガンマー32P
ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼにより標識せし
めた。一体化されなかったヌクレオチドをエタノール沈
殿により除去せしめた。この標識オリゴデオキシリボヌ
クレオチドを0.3MのNaOAc溶液100μｌに再懸濁せしめ
た。このプライマーの比活性は約４×106cpm/pモルであ
った。標識プライマー（0.02及び0.2pモル）は、プライ
マー伸長分析のために用いた。
この標識プライマーを50μgRNAと混合した。この混合核
酸をエタノールで沈殿せしめ、その後50mMのHEPES,pH7.
5,1mMのEDTA及び300mMのNaClを含む、ハイブリダイゼー
ション緩衝液30μｌに再懸濁せしめた。
酸をエタノールで沈殿せしめ、その後50mMのHEPES,pH7.
5,1mMのEDTA及び300mMのNaClを含む、ハイブリダイゼー
ション緩衝液30μｌに再懸濁せしめた。
ハイブリダイゼーション反応は30℃で10分間行った。ハ
イブリダイゼーション後、この混合物をAMV逆転写酵素
により処理した。この反応を42℃で90分間行い、次いで
0.5MのEDTA1μｌ及びRNase1μｌ（1mg/ml）を加えるこ
とにより停止せしめた。37℃での30分間のインキュベー
ション後、この混合物をフェノール／クロロホルムによ
り抽出せしめた。cDNAを沈殿せしめ、乾燥し、そして1m
MのEDTAを含む10mMのトリス−HCl,pH8.0 ３μｌに再懸
濁せしめた。ホルムアミド４μｌをこのcDNA懸濁物に加
え、そしてこの混合物を３分間煮沸せしめ、DNAシーケ
シングゲル上に載せた。
イブリダイゼーション後、この混合物をAMV逆転写酵素
により処理した。この反応を42℃で90分間行い、次いで
0.5MのEDTA1μｌ及びRNase1μｌ（1mg/ml）を加えるこ
とにより停止せしめた。37℃での30分間のインキュベー
ション後、この混合物をフェノール／クロロホルムによ
り抽出せしめた。cDNAを沈殿せしめ、乾燥し、そして1m
MのEDTAを含む10mMのトリス−HCl,pH8.0 ３μｌに再懸
濁せしめた。ホルムアミド４μｌをこのcDNA懸濁物に加
え、そしてこの混合物を３分間煮沸せしめ、DNAシーケ
シングゲル上に載せた。
このプライマー伸長分析は、転写開始部位が、セルロー
スシンターゼオペロンにおける第１の遺伝子の５′領域
に位置することを示した。このオペロン転写開始部位
を、図１におけるヌクレオチド235の上に位置する下向
矢印で示した。
スシンターゼオペロンにおける第１の遺伝子の５′領域
に位置することを示した。このオペロン転写開始部位
を、図１におけるヌクレオチド235の上に位置する下向
矢印で示した。
C.遺伝子Ｃ及びＤのクローニング
pABCDの構造を図８に概略した。このプラスミドの構造
において、PFS−６の1.8KbのBamHIフラグメントはTRT11
−４由来の5.5KbのBamHIフラグメントに置き代ってい
る。PF−６の1.8KbのBamHIフラグメントはセルロースシ
ンターゼＢ遺伝子の３′側の426のbp及びＣ遺伝子約1.4
Kbを有していた。この置換5.5KbのフラグメントはＣ遺
伝子全体及び更なる３′配列を含んでいた。TRT11−４
に載っているこの5.5Kbフラグメントは本来T19G9から単
離されるものであり、そしてTRT11−４を作製するため
に5.5KbのBamHIフラグメントとしてpUC18のBamHI部位に
クローン化せしめた。
において、PFS−６の1.8KbのBamHIフラグメントはTRT11
−４由来の5.5KbのBamHIフラグメントに置き代ってい
る。PF−６の1.8KbのBamHIフラグメントはセルロースシ
ンターゼＢ遺伝子の３′側の426のbp及びＣ遺伝子約1.4
Kbを有していた。この置換5.5KbのフラグメントはＣ遺
伝子全体及び更なる３′配列を含んでいた。TRT11−４
に載っているこの5.5Kbフラグメントは本来T19G9から単
離されるものであり、そしてTRT11−４を作製するため
に5.5KbのBamHIフラグメントとしてpUC18のBamHI部位に
クローン化せしめた。
15マイクログラムのTRT11−4DNAを、制限エンドヌクレ
アーゼBamHIにより、37℃で１時間完全に分解せしめ
た。この分解DNAを0.8％のGTGアガロースゲル上に流し
た。この5.5KbのBamHIフラグメントをゲルから切り出
し、電気溶離せしめてエタノールにより沈殿させ、そし
て少量のH2Oに再懸濁せしめた。
アーゼBamHIにより、37℃で１時間完全に分解せしめ
た。この分解DNAを0.8％のGTGアガロースゲル上に流し
た。この5.5KbのBamHIフラグメントをゲルから切り出
し、電気溶離せしめてエタノールにより沈殿させ、そし
て少量のH2Oに再懸濁せしめた。
11マイクログラムのpFS−６を、BamHIにより、37℃で１
時間完全に分解せしめ、セルロースシンターゼオペロン
の５′領域を含む1.8KbのDNAを12.6Kbのベクターフラグ
メントから遊離せしめた。この分解物を0.8％のアガロ
ースゲル上に流し、そしてpUC18:824ベクター配列、セ
ルロースシンターゼプロモーター、Ａ遺伝子、及びＢ遺
伝子の５′領域を含む12.6Kbのフラグメントをゲルから
切り出し、そして電気溶離せしめた。この精製DNAをウ
シアルカリホスファターゼにより処理し、その後TRT11
−４から単離した5.5KbのBamHIフラグメントとリゲート
せしめた。
時間完全に分解せしめ、セルロースシンターゼオペロン
の５′領域を含む1.8KbのDNAを12.6Kbのベクターフラグ
メントから遊離せしめた。この分解物を0.8％のアガロ
ースゲル上に流し、そしてpUC18:824ベクター配列、セ
ルロースシンターゼプロモーター、Ａ遺伝子、及びＢ遺
伝子の５′領域を含む12.6Kbのフラグメントをゲルから
切り出し、そして電気溶離せしめた。この精製DNAをウ
シアルカリホスファターゼにより処理し、その後TRT11
−４から単離した5.5KbのBamHIフラグメントとリゲート
せしめた。
リゲーションは、5.5Kbの挿入物12.6KbのベクターDNAに
対するモル比を10:1で、標準条件のもとで行った。この
リゲーション混合物をE.コリ DG101コンピテント細胞
を形質転換させるために用いた。この形質転換混合物
を、50μg/mlのアンピシリンを有するR2−４プレート上
に平板培養し、そして37℃で一夜インキュベートせしめ
た。36個のアンピシリン耐性形質転換体がこれらのプレ
ートから採取され、そしてそれらを50μg/mlのアンピシ
リンを含むR2培地にて、37℃で振騰させながら約６時間
培養せしめた。アルカリ溶解ミニスクリーンDNAをこれ
らの36の形質転換体から単離せしめた。このDNAをエン
ドヌクレアーゼBamHI及びSmaIによる制限分解により分
析した。この単離物のうちの６個はこの5.5Kbのフラグ
メントの挿入を示したが、その６個のうちの２個のみが
Ｂ遺伝子オープンリーディングフレームを復帰せしめる
正しい配向におけるこの5.5Kbフラグメントを示した。
これらの単離物をpABCD＃１及び＃32と称し、図８にお
いてプラスミド地図に関連する制限パターンを示した。
対するモル比を10:1で、標準条件のもとで行った。この
リゲーション混合物をE.コリ DG101コンピテント細胞
を形質転換させるために用いた。この形質転換混合物
を、50μg/mlのアンピシリンを有するR2−４プレート上
に平板培養し、そして37℃で一夜インキュベートせしめ
た。36個のアンピシリン耐性形質転換体がこれらのプレ
ートから採取され、そしてそれらを50μg/mlのアンピシ
リンを含むR2培地にて、37℃で振騰させながら約６時間
培養せしめた。アルカリ溶解ミニスクリーンDNAをこれ
らの36の形質転換体から単離せしめた。このDNAをエン
ドヌクレアーゼBamHI及びSmaIによる制限分解により分
析した。この単離物のうちの６個はこの5.5Kbのフラグ
メントの挿入を示したが、その６個のうちの２個のみが
Ｂ遺伝子オープンリーディングフレームを復帰せしめる
正しい配向におけるこの5.5Kbフラグメントを示した。
これらの単離物をpABCD＃１及び＃32と称し、図８にお
いてプラスミド地図に関連する制限パターンを示した。
プラスミドを含む培養物を精製プラスミドDNAを調製及
び単離するために用いた。10μｇのpABCD＃1DNAを、標
準のエレクトロポレーション条件のもとで、1306−３細
胞40μｌを形質転換させるために用いた。1mlのR20−２
培地をこの形質転換混合物に加え、そしてこの細胞を10
0μg/mlのアンピシリンを含むR20−２プレー上に平板培
養した。30℃での７日間のインキュベーション後、547
個のアンピシリン耐性コロニーがプレート上に見られ
た。376個のコロニー（約69％）は非常に先のとがったC
el+コロニー表現型を示し、171個のコロニー（約31％）
は平らな、ややいぼ状ではあるがCel+表現型であるもの
を示した。各タイプのコロニー４個を、アンピシリンを
100μg/mlで有するR20−２上に、30℃で４日間画線培養
せしめた。４日後、８プレート全ての上のコロニータイ
プは区別できなかった。わずかにとがったコロニーの画
線培養物からの１つのコロニーを、0.5％のTYE,3％のグ
ルコース,25mMのDMG,0.1％のセルロース及び50μg/mlの
アンピシリンを有するR70−２ 25mlに移し、30℃で24
時間、振騰しながらインキュベートした。24時間後、グ
リセロールをこの培養物に全容量の15％になる迄加え、
そして1.5mlのアリコートを−70℃の保存のために凍結
した。この保存品を1306−3pABCDと称する。
び単離するために用いた。10μｇのpABCD＃1DNAを、標
準のエレクトロポレーション条件のもとで、1306−３細
胞40μｌを形質転換させるために用いた。1mlのR20−２
培地をこの形質転換混合物に加え、そしてこの細胞を10
0μg/mlのアンピシリンを含むR20−２プレー上に平板培
養した。30℃での７日間のインキュベーション後、547
個のアンピシリン耐性コロニーがプレート上に見られ
た。376個のコロニー（約69％）は非常に先のとがったC
el+コロニー表現型を示し、171個のコロニー（約31％）
は平らな、ややいぼ状ではあるがCel+表現型であるもの
を示した。各タイプのコロニー４個を、アンピシリンを
100μg/mlで有するR20−２上に、30℃で４日間画線培養
せしめた。４日後、８プレート全ての上のコロニータイ
プは区別できなかった。わずかにとがったコロニーの画
線培養物からの１つのコロニーを、0.5％のTYE,3％のグ
ルコース,25mMのDMG,0.1％のセルロース及び50μg/mlの
アンピシリンを有するR70−２ 25mlに移し、30℃で24
時間、振騰しながらインキュベートした。24時間後、グ
リセロールをこの培養物に全容量の15％になる迄加え、
そして1.5mlのアリコートを−70℃の保存のために凍結
した。この保存品を1306−3pABCDと称する。
D.セルロースシンターゼオペロンの配列及び構造
セルロースシンターゼオペロンのシーケンス化のため
に、チェーンターミネーション方法を用いた。オペロン
を有する二本鎖DNAをDNA鋳型として用いた。pABCD由来
の領域のヌクレオチド配列を図に示す。セルロースシン
ターゼオペロンは長さにおいて9217bpであり、４つの遺
伝子より構成される。遺伝子A,B,C及びＤは、それぞれ
の長さが2,262bp,2,406bp,3,957bp及び468bpである。遺
伝子生成物により決定される分子量及びその推定機能は
以下の通りである。
に、チェーンターミネーション方法を用いた。オペロン
を有する二本鎖DNAをDNA鋳型として用いた。pABCD由来
の領域のヌクレオチド配列を図に示す。セルロースシン
ターゼオペロンは長さにおいて9217bpであり、４つの遺
伝子より構成される。遺伝子A,B,C及びＤは、それぞれ
の長さが2,262bp,2,406bp,3,957bp及び468bpである。遺
伝子生成物により決定される分子量及びその推定機能は
以下の通りである。
Ｄ遺伝子の３′未満のDNA配列のコンピュータ分析は、
安定なステム及びループ構造を形成する能力を有する領
域を示した。図１における下線領域に示す通り、この領
域はＤ遺伝子のターミネーションコドンの26bp3′側に
位置し、そしてオペロンの転写終結領域に相当する。
安定なステム及びループ構造を形成する能力を有する領
域を示した。図１における下線領域に示す通り、この領
域はＤ遺伝子のターミネーションコドンの26bp3′側に
位置し、そしてオペロンの転写終結領域に相当する。
例XV
組換株における細胞増殖、セルロース生産及びセルロー
スシンターゼ活性 A.1306−21pUC18−824pABCDによる研究 この研究において、1306−21 pABCDにおけるセルロース
シンターゼ活性の過剰表現を振騰フラスコ実験において
試験した。1306−21pABCDの構造は1306−3pABCDの構造
と類似していた（例XIVを参照のこと）。この実験の全
ての段階のための培養培地は、10μＭのFeCl3,1％TYE,2
5mMのDMG及び４％のグルコース（1306−21）又は４％の
フルクトース（1306−３）を有するR70−２であった。
シード培地は0.1％のセルラーゼを含んだ。培養物を含
むプラスミドを増殖するため、アンピシリンを50μg/ml
迄培地に加えた。培地を125mlのバッフルフラスコの中
に、フラスコ当り25mlづつ分配した。株1306−21、1306
−21 pUC18−824（宿主細胞にシャトルベクターを加え
たもの）、1306−21 pUC18−824 pABCD（正常−−親株
と同様の表現型）、及び1306−21 pUC18−824 pABCD
（尖頂状−−プレート上でその増殖は増大し、そして親
株よりもより尖っている）をそれぞれ試験した。各培養
物を、滅菌生理食塩水を用いて0.72g/Lに調整した（濁
度1.8OD680）。試験フラスコを0.21mlのシード培養物で
感染せしめた（感染、２％（V/V））。各株につき６つ
のフラスコを感染せしめ、そして30℃,125rpm,2インチ
振騰範囲でインキュベートした。フラスコを1,2及び５
日後に回収した。細胞質量及びセルロース測定のため、 二重測定フラスコを各時点で回収した。更に５日目のフ
ラスコからの培養物を、プレート上における抗生物質耐
性の観察（パッチテスト）によりプラスミド保持力につ
いて検査した。各株につき、30のコロニーを試験した。
スシンターゼ活性 A.1306−21pUC18−824pABCDによる研究 この研究において、1306−21 pABCDにおけるセルロース
シンターゼ活性の過剰表現を振騰フラスコ実験において
試験した。1306−21pABCDの構造は1306−3pABCDの構造
と類似していた（例XIVを参照のこと）。この実験の全
ての段階のための培養培地は、10μＭのFeCl3,1％TYE,2
5mMのDMG及び４％のグルコース（1306−21）又は４％の
フルクトース（1306−３）を有するR70−２であった。
シード培地は0.1％のセルラーゼを含んだ。培養物を含
むプラスミドを増殖するため、アンピシリンを50μg/ml
迄培地に加えた。培地を125mlのバッフルフラスコの中
に、フラスコ当り25mlづつ分配した。株1306−21、1306
−21 pUC18−824（宿主細胞にシャトルベクターを加え
たもの）、1306−21 pUC18−824 pABCD（正常−−親株
と同様の表現型）、及び1306−21 pUC18−824 pABCD
（尖頂状−−プレート上でその増殖は増大し、そして親
株よりもより尖っている）をそれぞれ試験した。各培養
物を、滅菌生理食塩水を用いて0.72g/Lに調整した（濁
度1.8OD680）。試験フラスコを0.21mlのシード培養物で
感染せしめた（感染、２％（V/V））。各株につき６つ
のフラスコを感染せしめ、そして30℃,125rpm,2インチ
振騰範囲でインキュベートした。フラスコを1,2及び５
日後に回収した。細胞質量及びセルロース測定のため、 二重測定フラスコを各時点で回収した。更に５日目のフ
ラスコからの培養物を、プレート上における抗生物質耐
性の観察（パッチテスト）によりプラスミド保持力につ
いて検査した。各株につき、30のコロニーを試験した。
セルロース生成及び細胞濃度を測定するため、各サンプ
ルのフラスコ内容物を100mlのビーカーに移し入れた。
次いでこの懸濁物、大テクマー（Tekmar）プローブによ
り、その最大出力の50％で１分間解離せしめた。その
後、この懸濁物を5,000rpmで10分間遠心せしめた。上清
液を捨て、そしてこのペレットを15mlの生理食塩水溶液
に再懸濁せしめ、そして時折攪拌しながら15分間インキ
ュベートした。このサンプルを再度遠心し、そして上記
の洗浄工程を繰り返した。
ルのフラスコ内容物を100mlのビーカーに移し入れた。
次いでこの懸濁物、大テクマー（Tekmar）プローブによ
り、その最大出力の50％で１分間解離せしめた。その
後、この懸濁物を5,000rpmで10分間遠心せしめた。上清
液を捨て、そしてこのペレットを15mlの生理食塩水溶液
に再懸濁せしめ、そして時折攪拌しながら15分間インキ
ュベートした。このサンプルを再度遠心し、そして上記
の洗浄工程を繰り返した。
第２の洗浄工程からのペレットを0.1NのNaOH15mlに再懸
濁せしめ、そしてゆっくりとした攪拌を伴って60分間、
60℃でインキュベートした。この懸濁物を遠心し、この
NaOH上清液を細胞濃度の分析のために用い、そしてこの
ペレットをセルロース濃度分析のために用いた。
濁せしめ、そしてゆっくりとした攪拌を伴って60分間、
60℃でインキュベートした。この懸濁物を遠心し、この
NaOH上清液を細胞濃度の分析のために用い、そしてこの
ペレットをセルロース濃度分析のために用いた。
ペレットは15mlの脱イオン水に再懸濁せしめ、そして時
折攪拌しながら室温で15分間放置した。次いでこのサン
プルを遠心し、そして上記の洗浄工程を総計３回繰り返
した。最終の遠心工程の後、このセルロース沈殿物をバ
キュームオーブン内で60℃、一夜乾燥させ、その後秤量
した。
折攪拌しながら室温で15分間放置した。次いでこのサン
プルを遠心し、そして上記の洗浄工程を総計３回繰り返
した。最終の遠心工程の後、このセルロース沈殿物をバ
キュームオーブン内で60℃、一夜乾燥させ、その後秤量
した。
上清は、HClにより中和し（0.5mlのサンプルに約0.05ml
のHCl）、そしてタンパク質濃度をローリー（Lowry）方
法により測定した。
のHCl）、そしてタンパク質濃度をローリー（Lowry）方
法により測定した。
細胞濃度＝タンパク質濃度×1.54
細胞増殖及びセルロース生産は表４に要約した。
セルロースの細胞に対する比はセルロース比生産効率に
ついての表示である。増殖の最初の２日間におけるpABC
D1306−21株においてのセルロースの細胞に対する比
は、コントロール1306−21株のそれよりも明らかに高か
った。このpABCD（尖頂株）はpABCD（正常）株よりもよ
り多くのセルロースを生成するようであった。両組換株
は、コントロール株よりもより多くのセルロースをその
増殖末期に生成した。
ついての表示である。増殖の最初の２日間におけるpABC
D1306−21株においてのセルロースの細胞に対する比
は、コントロール1306−21株のそれよりも明らかに高か
った。このpABCD（尖頂株）はpABCD（正常）株よりもよ
り多くのセルロースを生成するようであった。両組換株
は、コントロール株よりもより多くのセルロースをその
増殖末期に生成した。
アンピシリンマーカーを有する株において、５日間の培
養物のプラスミド安定度は100％を示した。このマーカ
ーの復帰率は、プラスミドにおけるセルロースシンター
ゼ遺伝子に起こりうる再配列の程度を示すものではな
い。５日目の株は、１及び２日目と同じ速度でセルロー
スを生成していない可能性がある。この説を支持する確
証は５日目のものの平板培養からのコロニー表現型にお
いて見られる。pABCDの尖頂株は異常なコロニーをこれ
らのプレート上に示さなかった。
養物のプラスミド安定度は100％を示した。このマーカ
ーの復帰率は、プラスミドにおけるセルロースシンター
ゼ遺伝子に起こりうる再配列の程度を示すものではな
い。５日目の株は、１及び２日目と同じ速度でセルロー
スを生成していない可能性がある。この説を支持する確
証は５日目のものの平板培養からのコロニー表現型にお
いて見られる。pABCDの尖頂株は異常なコロニーをこれ
らのプレート上に示さなかった。
1306−3pUC18−824ABCDによるセルロース生産は、1306
−３及び1306−3pUC19−824コントロール株よりも高か
った。このことは、セルロースシンターゼのインビトロ
活性における増大に関連する（下記参照）。この２つの
株の細胞増殖は類似していた。結果的に1306−3pUC18−
824pABCDによるセルロースの細胞に対する比は1306−３
単独のそれよりも明らかに高かった。
−３及び1306−3pUC19−824コントロール株よりも高か
った。このことは、セルロースシンターゼのインビトロ
活性における増大に関連する（下記参照）。この２つの
株の細胞増殖は類似していた。結果的に1306−3pUC18−
824pABCDによるセルロースの細胞に対する比は1306−３
単独のそれよりも明らかに高かった。
この組換株1306−21 pABCDは、細胞増殖及びセルロース
生産についてチェマップ（Chemap）発酵器においても試
験した。フラスコにおける観察と比べ、この株の状態は
親株のものと類似していた。組換株の不安定性は高めら
れたセルロース生産性がないことに起因すると考えられ
ている。染色体セルロースシンターゼオペロン遺伝子の
過剰表現は、組換株の不安定性を低下させるであろう。
生産についてチェマップ（Chemap）発酵器においても試
験した。フラスコにおける観察と比べ、この株の状態は
親株のものと類似していた。組換株の不安定性は高めら
れたセルロース生産性がないことに起因すると考えられ
ている。染色体セルロースシンターゼオペロン遺伝子の
過剰表現は、組換株の不安定性を低下させるであろう。
B.pUC18−824 FS6（AB）の研究
pUC18−824 FS6（セルロースシンターゼプロモーター
並びに遺伝子Ａ及びＢを有す）を有する1306−３（Ce
l+）の15個の単離体をセルロースシンターゼ活性の過剰
表現ついてのスクリーンのために用いた。この細胞を集
め、洗浄し、懸濁し、そして破壊し、そして標準のイン
ビトロセルロースシンターゼアッセイを例IIにおける記
載の通りに実施した。
並びに遺伝子Ａ及びＢを有す）を有する1306−３（Ce
l+）の15個の単離体をセルロースシンターゼ活性の過剰
表現ついてのスクリーンのために用いた。この細胞を集
め、洗浄し、懸濁し、そして破壊し、そして標準のイン
ビトロセルロースシンターゼアッセイを例IIにおける記
載の通りに実施した。
15個の単離体全ては、インビトロセルロースシンターゼ
活性を、コントロール株（1306−3pUC18:824）のそれよ
りも明らかに過剰に表わした。その活性は、コントロー
ル株よりも1.5〜2.4倍高い範囲にあった。15株のうちの
２株（＃302及＃303）のスクリーンは指数期及び定常期
にて試験した。条件は例XVにおける記載と類似するが、
ただしグルコースをフルクトースに代えた。表５におい
て示す通り、２日目にコントロール株1306−３及び1306
−3pUC18−824の活性は、時間経過にわたる活性の低下
を伴い、１日目の30％及び40％を保持した。２日目の単
離体＃302及び＃303は１日目の活性の45％及び50％迄低
下し、これも時間の経過にわたる活性の低下を伴った。
しかしながら、この後者の株は両方とも1306−３の１日
目の活性よりも約２倍高く、そして２日目では約３倍の
活性を示した。
活性を、コントロール株（1306−3pUC18:824）のそれよ
りも明らかに過剰に表わした。その活性は、コントロー
ル株よりも1.5〜2.4倍高い範囲にあった。15株のうちの
２株（＃302及＃303）のスクリーンは指数期及び定常期
にて試験した。条件は例XVにおける記載と類似するが、
ただしグルコースをフルクトースに代えた。表５におい
て示す通り、２日目にコントロール株1306−３及び1306
−3pUC18−824の活性は、時間経過にわたる活性の低下
を伴い、１日目の30％及び40％を保持した。２日目の単
離体＃302及び＃303は１日目の活性の45％及び50％迄低
下し、これも時間の経過にわたる活性の低下を伴った。
しかしながら、この後者の株は両方とも1306−３の１日
目の活性よりも約２倍高く、そして２日目では約３倍の
活性を示した。
これらの組換株におけるセルロース生成は親株について
見られたものと類似していた。
見られたものと類似していた。
セルロースシンターゼ活性は、崩壊されたセルロースシ
ンターゼＢ遺伝子を有する株においても抑制されている
ことが観察された。この遺伝子は、セルロースシンター
ゼＢ遺伝子の内在するBamHI部位での、ストレプトマイ
シン耐性遺伝子をコード化する1.1KbのBamHIフラグメン
トの挿入を介して崩壊される。ストレプトマイシン耐性
遺伝子の挿入は、セルロースシンターゼＢ遺伝子をその
５′末端付近で妨害せしめる。
ンターゼＢ遺伝子を有する株においても抑制されている
ことが観察された。この遺伝子は、セルロースシンター
ゼＢ遺伝子の内在するBamHI部位での、ストレプトマイ
シン耐性遺伝子をコード化する1.1KbのBamHIフラグメン
トの挿入を介して崩壊される。ストレプトマイシン耐性
遺伝子の挿入は、セルロースシンターゼＢ遺伝子をその
５′末端付近で妨害せしめる。
例X VI
染色体プロモーターの交換
アセトバクターは非常に効率的な組換系であるが、自律
DNAの大きなセグメントを有する任意のプラスミドによ
る不安定性の問題を引き起こしうるものを有することが
示された。この潜在的な問題を解決するため、このオペ
ロンは異種のコントロール要素を利用することにより、
染色体セルロースシンターゼオペロンの転写を行うため
に染色体レベルで過剰表現されうる。異種プロモーター
を含むプラスミドpTac25−1,pLac21−７の作成及びそれ
らの作製のために用いる中間ベクターを以下に記載し、
そして図９において図解した。
DNAの大きなセグメントを有する任意のプラスミドによ
る不安定性の問題を引き起こしうるものを有することが
示された。この潜在的な問題を解決するため、このオペ
ロンは異種のコントロール要素を利用することにより、
染色体セルロースシンターゼオペロンの転写を行うため
に染色体レベルで過剰表現されうる。異種プロモーター
を含むプラスミドpTac25−1,pLac21−７の作成及びそれ
らの作製のために用いる中間ベクターを以下に記載し、
そして図９において図解した。
A.MP11:Pcs:LF01の作製
15マイクロプログラムのpFS−1DNAをHind IIIにより分
解し、セルロースシンターゼオペロンプロモーターを有
する2.5Kbのフラグメントが遊離した。この分解物を0.8
％のGTG アガロースゲル上に流し、プロモーターを有
するこの2.5Kbフラグメントをゲルから切り出し、電気
溶離し、そして予めHind IIIにより分解せしめた二本鎖
M13MPファージDNAとリゲートせしめた。このリゲーショ
ン混合物をE.コリ株DG98を形質転換せしめるために用い
た。この形質転換細胞をE.コリJM103の菌叢を有するR17
−３プレート上にまき、そして37℃で一夜インキュベー
トした。11個の得られたファージプラークを採取し、R2
−６培地（5.0gのトリプトン、5.0gの酵母抽出物、5.0g
のNaCl及び1.0Lの蒸留水、pH6.9）により1:100に希釈し
た対数増殖期JM103 3mlに感染せしめた。この培養物を3
7℃で６時間インキュベートし、そしてエッペンドルフ
チューブにおいて沈殿下せしめた。遊離のファージを含
むこの上清液を４℃で保存し、その間にミニスクリーン
DNAをこの細胞ペレットからアルカリ溶解方法により調
製した。このミニスクリーンDNAを酵素Hind III及びBgL
IIによる制限分解により分析した。１つのクローンを
選び出し、これをM.p11:Pcsと称した。このクローンか
ら上清液をJM103に感染せしめるために用いた。JM103 M
p11:Pcsの培養物15mlを６時間増殖せしめ、沈殿下せし
め、そして一本鎖ファージDNAをこの上清液から単離せ
しめた。
解し、セルロースシンターゼオペロンプロモーターを有
する2.5Kbのフラグメントが遊離した。この分解物を0.8
％のGTG アガロースゲル上に流し、プロモーターを有
するこの2.5Kbフラグメントをゲルから切り出し、電気
溶離し、そして予めHind IIIにより分解せしめた二本鎖
M13MPファージDNAとリゲートせしめた。このリゲーショ
ン混合物をE.コリ株DG98を形質転換せしめるために用い
た。この形質転換細胞をE.コリJM103の菌叢を有するR17
−３プレート上にまき、そして37℃で一夜インキュベー
トした。11個の得られたファージプラークを採取し、R2
−６培地（5.0gのトリプトン、5.0gの酵母抽出物、5.0g
のNaCl及び1.0Lの蒸留水、pH6.9）により1:100に希釈し
た対数増殖期JM103 3mlに感染せしめた。この培養物を3
7℃で６時間インキュベートし、そしてエッペンドルフ
チューブにおいて沈殿下せしめた。遊離のファージを含
むこの上清液を４℃で保存し、その間にミニスクリーン
DNAをこの細胞ペレットからアルカリ溶解方法により調
製した。このミニスクリーンDNAを酵素Hind III及びBgL
IIによる制限分解により分析した。１つのクローンを
選び出し、これをM.p11:Pcsと称した。このクローンか
ら上清液をJM103に感染せしめるために用いた。JM103 M
p11:Pcsの培養物15mlを６時間増殖せしめ、沈殿下せし
め、そして一本鎖ファージDNAをこの上清液から単離せ
しめた。
このファージDNA Mp11:Pcsを、セルロースシンターゼ
オペロンプロモーター配列の両側から12bpにある酵素Ss
tI,SmaI,及びBamHIのための制限部位配列を含むオリゴ
ヌクレオチドLF01（５′−GAATATATAAGGGAGCTCCCGGGATC
CACCTGTTTTACC−３′）により突然変異せしめた。１ピ
コモルの一本鎖ファージDNA Mp11:Pcsを10pモルのLF01
と共に68℃で５分間インキュベートし、その後プロモー
ター配列と共に30分間37℃でアニール化せしめた。この
アニール化分子を次に、完全な二本鎖DNAを形成せしめ
るためのdNTDを0.5mM迄、及びDNAポリメラーゼ１のクレ
ノウフラグメントを0.25ユニット／μｌ迄加えることに
より伸長せしめた。この伸長は４℃で30分間、その後の
37℃での１時間によって処理した；次にそれらを68℃で
10分間加熱し、そしてこの混合物JM103コンピーテント
細胞の形質転換のために用いた。
オペロンプロモーター配列の両側から12bpにある酵素Ss
tI,SmaI,及びBamHIのための制限部位配列を含むオリゴ
ヌクレオチドLF01（５′−GAATATATAAGGGAGCTCCCGGGATC
CACCTGTTTTACC−３′）により突然変異せしめた。１ピ
コモルの一本鎖ファージDNA Mp11:Pcsを10pモルのLF01
と共に68℃で５分間インキュベートし、その後プロモー
ター配列と共に30分間37℃でアニール化せしめた。この
アニール化分子を次に、完全な二本鎖DNAを形成せしめ
るためのdNTDを0.5mM迄、及びDNAポリメラーゼ１のクレ
ノウフラグメントを0.25ユニット／μｌ迄加えることに
より伸長せしめた。この伸長は４℃で30分間、その後の
37℃での１時間によって処理した；次にそれらを68℃で
10分間加熱し、そしてこの混合物JM103コンピーテント
細胞の形質転換のために用いた。
この形質転換混合物をJM103菌叢細胞と共に、3mlのR17
（10.0gのＮ−Ｚアミン、タイプＡ、5.0gのNaCl、DMF2.
0ml巾のＸ−gal 0.04g）、10mMのMgCl2、0.7％の特級
アガロースを有するR2−４プレート上で平板培養せしめ
た。ファージプラークをこれらのプレートからニトロセ
ルロースフィター上に移し、そしてこのプレート４℃で
保存した。このフィルターを80℃で２時間焼き、そして
32P標識オリゴヌクレオチドプローブLF02とハイブリダ
イズせしめた。LF02は、突然変異のために用いられるオ
リゴヌクレオチドLF01の配列の部分集合を含み、その３
つの制限部位配列はセルロースシンターゼプロモーター
配列の両側のわずか2bpにある。LF02の配列は５′−GGG
AGCTCCCGGGATCCAC−３′である。ハイブリダイゼーショ
ンは58℃で行った。このフィルターを58℃で、５倍量の
SSC、２倍量のSSC及び0.1％のSDSを含む２倍量のSSCで
逐次５分間洗浄せしめた。コダック（Kodak）Ｘ−OMAT
AR フィルムをフィルター上に60時間さらした。60時
間後、現像フィルム上に、プレート上に未だ存在する転
移せしめたプラークに相当する暗いスポットが現れた。
フィルム上のこの暗いスポットに相当する16個のプラー
クを単離し、そしてRF DNAを酵素Hind III,BamHI,及び
SstIによる制限分解により分析した。Mp11:Pcs:LF01は
図９に示す地図に相当する。Mp11:Pcs:LF01における導
入制御部位は異種プロモーターの置換のためにある。側
方の領域は、プラスミドとアセトバクター染色体間の遺
伝子交換における相同性組換のための部位として働く。
（10.0gのＮ−Ｚアミン、タイプＡ、5.0gのNaCl、DMF2.
0ml巾のＸ−gal 0.04g）、10mMのMgCl2、0.7％の特級
アガロースを有するR2−４プレート上で平板培養せしめ
た。ファージプラークをこれらのプレートからニトロセ
ルロースフィター上に移し、そしてこのプレート４℃で
保存した。このフィルターを80℃で２時間焼き、そして
32P標識オリゴヌクレオチドプローブLF02とハイブリダ
イズせしめた。LF02は、突然変異のために用いられるオ
リゴヌクレオチドLF01の配列の部分集合を含み、その３
つの制限部位配列はセルロースシンターゼプロモーター
配列の両側のわずか2bpにある。LF02の配列は５′−GGG
AGCTCCCGGGATCCAC−３′である。ハイブリダイゼーショ
ンは58℃で行った。このフィルターを58℃で、５倍量の
SSC、２倍量のSSC及び0.1％のSDSを含む２倍量のSSCで
逐次５分間洗浄せしめた。コダック（Kodak）Ｘ−OMAT
AR フィルムをフィルター上に60時間さらした。60時
間後、現像フィルム上に、プレート上に未だ存在する転
移せしめたプラークに相当する暗いスポットが現れた。
フィルム上のこの暗いスポットに相当する16個のプラー
クを単離し、そしてRF DNAを酵素Hind III,BamHI,及び
SstIによる制限分解により分析した。Mp11:Pcs:LF01は
図９に示す地図に相当する。Mp11:Pcs:LF01における導
入制御部位は異種プロモーターの置換のためにある。側
方の領域は、プラスミドとアセトバクター染色体間の遺
伝子交換における相同性組換のための部位として働く。
培養物Mp11:Pcs:LF01からのファージ上清物はプラーク
から精製されたものであり、再度適切な制御パターンに
ついて検査せしめ、次いで感染及び二本鎖塩化セシウム
勾配精製DNAのために用いた。
から精製されたものであり、再度適切な制御パターンに
ついて検査せしめ、次いで感染及び二本鎖塩化セシウム
勾配精製DNAのために用いた。
B.pACYの184:Pcsの作製
20マイクログラムのMp11:Pcs:LF01DNAを200ユニットのH
ind−IIIにより分解し、そしてセルロースシンターゼプ
ロモーター領域を含む2.5Kbのフラグメントをゲル精製
し、透析袋の中で0.1倍量のTEAにて100ボルト、２時間
電気溶離せしめた。このDNA及び緩衝液をこの袋から取
り出し、フェノール／クロロホルムにより抽出せしめ、
エタノール中の酢酸ナトリウムで沈殿せしめ、トリス−
EDTA緩衝液にて再懸濁せしめた。このフラグメントをHi
nd III分解pACY184（New England Biolabs）と、10:1の
挿入物のベクターに対する比で、2mMのATP濃度にて16℃
で一夜、リゲートせしめた。このリゲーション混合物を
MM294コンピーテント細胞に形質転換せしめ、そして20
μg/mlのCmを含むR2−４プレート上で平板培養せしめ
た。このプレートを37℃で一夜インキュベートし、そし
て15,000個以上のCmRコロニーが出現した。Pscフラグメ
ントの挿入による、pACY184のテトラサイクリン耐性遺
伝子の不活性化についての試験のため、これらのコロニ
ーのうちの66個を50μg/mlのアンピシリンを有するR2−
４プレート及び15μg/mlのテトラサイクリンR2−４プレ
ート上に貼付し、そして37℃で一夜インキュベートし
た。66のCmRAmpRコロニーの内の６個はパッチテストに
基づきテトラサイクリンに対する耐性を示した。ミニプ
レプDNAをこの６つのコロニーから単離し、Hind IIIに
より分解し、そして0.8％のアガロースゲル上で分析し
た。３つのプスミドは１つの2.5KbのHind III挿入物を
示し、その他の３つは３又はそれより多くの挿入物を示
した。このプラスミドをpACYC184と称する:Pscは単一の
2.5KbのHind III挿入物を示した。塩化セシウム臭化エ
チウム勾配精製DNAをこのプラスミドを含む培養物から
単離した。
ind−IIIにより分解し、そしてセルロースシンターゼプ
ロモーター領域を含む2.5Kbのフラグメントをゲル精製
し、透析袋の中で0.1倍量のTEAにて100ボルト、２時間
電気溶離せしめた。このDNA及び緩衝液をこの袋から取
り出し、フェノール／クロロホルムにより抽出せしめ、
エタノール中の酢酸ナトリウムで沈殿せしめ、トリス−
EDTA緩衝液にて再懸濁せしめた。このフラグメントをHi
nd III分解pACY184（New England Biolabs）と、10:1の
挿入物のベクターに対する比で、2mMのATP濃度にて16℃
で一夜、リゲートせしめた。このリゲーション混合物を
MM294コンピーテント細胞に形質転換せしめ、そして20
μg/mlのCmを含むR2−４プレート上で平板培養せしめ
た。このプレートを37℃で一夜インキュベートし、そし
て15,000個以上のCmRコロニーが出現した。Pscフラグメ
ントの挿入による、pACY184のテトラサイクリン耐性遺
伝子の不活性化についての試験のため、これらのコロニ
ーのうちの66個を50μg/mlのアンピシリンを有するR2−
４プレート及び15μg/mlのテトラサイクリンR2−４プレ
ート上に貼付し、そして37℃で一夜インキュベートし
た。66のCmRAmpRコロニーの内の６個はパッチテストに
基づきテトラサイクリンに対する耐性を示した。ミニプ
レプDNAをこの６つのコロニーから単離し、Hind IIIに
より分解し、そして0.8％のアガロースゲル上で分析し
た。３つのプスミドは１つの2.5KbのHind III挿入物を
示し、その他の３つは３又はそれより多くの挿入物を示
した。このプラスミドをpACYC184と称する:Pscは単一の
2.5KbのHind III挿入物を示した。塩化セシウム臭化エ
チウム勾配精製DNAをこのプラスミドを含む培養物から
単離した。
pACYC184:Pca DNA 40μｇを、４ユニットのBamHIによ
り部分分解し、そしてゲル精製した。２つのBamHI部位
の１つが切断された直鎖状のプラスミド分子を含む約6.
7Kbのフラグメントを単離し、その後SstIにより完全に
分解せしめた。このフラグメントをゲル精製し、そして
6.7KbのBamHI−SstIフラグメントをゲルから切り出し、
0.1容量のTEA中で電気溶離せしめ、フィノール／クロロ
ホルムにより抽出せしめ、エタノールにおける酢酸ナト
リウムにより沈殿せしめ、そしてトリス−EDTA緩衝液に
て再懸濁せしめた。
り部分分解し、そしてゲル精製した。２つのBamHI部位
の１つが切断された直鎖状のプラスミド分子を含む約6.
7Kbのフラグメントを単離し、その後SstIにより完全に
分解せしめた。このフラグメントをゲル精製し、そして
6.7KbのBamHI−SstIフラグメントをゲルから切り出し、
0.1容量のTEA中で電気溶離せしめ、フィノール／クロロ
ホルムにより抽出せしめ、エタノールにおける酢酸ナト
リウムにより沈殿せしめ、そしてトリス−EDTA緩衝液に
て再懸濁せしめた。
C.固有SstI部位のpBR322への導入
10マイクログラムのpBR322DNAを制御エンドヌクレアー
ゼAlwNIにより完全に分解せしめ、そしてその末端はプ
ラント状にした。ニューイングランドバイオラブ（New
England Biolabs）からのSstI（SacI）リンカーオリゴ
ヌクレオチドを、標準条件下でブランド末端pBR322切断
フラグメントのためにT4リガーゼによりリゲートせしめ
た。このリゲーション混合物を５ユニットのSstIにより
直接分解せしめ、ゲル精製、その後標準条件下でそれ自
身をT4DNAリガーゼによりリゼートせしめた。このリゲ
ーション混合物を、アンピシリン耐性についての選択性
を有するMM294コンピーテント細胞を形質転換せしめる
ために用いた。１つの培養物、MM294 pALF20は、SstIに
より直鎖状となり、且つ長さにおいて約4.4KbのDNAを提
供した。このプラスミドを次にlac及びtacプロモーター
を適用させるために用いた。
ゼAlwNIにより完全に分解せしめ、そしてその末端はプ
ラント状にした。ニューイングランドバイオラブ（New
England Biolabs）からのSstI（SacI）リンカーオリゴ
ヌクレオチドを、標準条件下でブランド末端pBR322切断
フラグメントのためにT4リガーゼによりリゲートせしめ
た。このリゲーション混合物を５ユニットのSstIにより
直接分解せしめ、ゲル精製、その後標準条件下でそれ自
身をT4DNAリガーゼによりリゼートせしめた。このリゲ
ーション混合物を、アンピシリン耐性についての選択性
を有するMM294コンピーテント細胞を形質転換せしめる
ために用いた。１つの培養物、MM294 pALF20は、SstIに
より直鎖状となり、且つ長さにおいて約4.4KbのDNAを提
供した。このプラスミドを次にlac及びtacプロモーター
を適用させるために用いた。
D.オリゴヌクレオチドのアニール化
tac及びlacUV5プロモーターを形成するためのオリゴヌ
クレオチドを合成した。各オリゴヌクレオチドは、一端
にEcoRI半分部位の一本鎖及び他端にHind III半分部位
の一本鎖を有する一本鎖のプローモーターについての配
列を含む。この合成ヌクレオチドをH2Oに、100pモル／
μｌの濃度迄懸濁せしめた。200pモルの各オリゴヌクレ
オチドを９ユニットのポリヌクレオチドキナーゼによ
り、1mMのATPを含む反応液20μｌ中で、37℃で30分間処
理した。キナーゼ処理せしめたら、このオリゴヌクレオ
チドの組を一緒に混合せしめ、次いで任意的に二次構造
を対合しないように68℃で15分間加熱せしめた。次いで
このオリゴヌクレオチドを37℃の冷却により共にアニー
ル化し、そして30分間インキュベートした。30分間、こ
のオリゴヌクレオチドを以下の通りに単離せしめたpALF
20EcoRI/Hind IIIフラグメントとのリゲーション反応に
含ませた。
クレオチドを合成した。各オリゴヌクレオチドは、一端
にEcoRI半分部位の一本鎖及び他端にHind III半分部位
の一本鎖を有する一本鎖のプローモーターについての配
列を含む。この合成ヌクレオチドをH2Oに、100pモル／
μｌの濃度迄懸濁せしめた。200pモルの各オリゴヌクレ
オチドを９ユニットのポリヌクレオチドキナーゼによ
り、1mMのATPを含む反応液20μｌ中で、37℃で30分間処
理した。キナーゼ処理せしめたら、このオリゴヌクレオ
チドの組を一緒に混合せしめ、次いで任意的に二次構造
を対合しないように68℃で15分間加熱せしめた。次いで
このオリゴヌクレオチドを37℃の冷却により共にアニー
ル化し、そして30分間インキュベートした。30分間、こ
のオリゴヌクレオチドを以下の通りに単離せしめたpALF
20EcoRI/Hind IIIフラグメントとのリゲーション反応に
含ませた。
E.ベクターの調製
20μｇのプラスミドpALF20を100ユニットのEcoRI及び10
0ユニットのHind IIIにより、37℃で1.5時間分解せしめ
た。この反応物を0.8％のGTGアガロースゲル上に流し、
そして直鎖DNAに相当する約4.4Kbのフラグメントをゲル
から切り出した。このフラグメントを0.1容量TEA緩衝液
の中で、透析袋において100ボルトで1.5時間電気溶解せ
しめた。このDNA及び緩衝液を袋から取り出し、フェノ
ール及びクロロホルムにより抽出せしめ、次いでエタノ
ールにおける酢酸ナトリウムにより沈殿せしめた。この
DNAをスピードバク（speed vac）内で乾燥し、そしてH2
Oに再懸濁せしめた。
0ユニットのHind IIIにより、37℃で1.5時間分解せしめ
た。この反応物を0.8％のGTGアガロースゲル上に流し、
そして直鎖DNAに相当する約4.4Kbのフラグメントをゲル
から切り出した。このフラグメントを0.1容量TEA緩衝液
の中で、透析袋において100ボルトで1.5時間電気溶解せ
しめた。このDNA及び緩衝液を袋から取り出し、フェノ
ール及びクロロホルムにより抽出せしめ、次いでエタノ
ールにおける酢酸ナトリウムにより沈殿せしめた。この
DNAをスピードバク（speed vac）内で乾燥し、そしてH2
Oに再懸濁せしめた。
F.リゲーション
アニール化オリゴヌクレオチドの各組を、Hind III/Eco
RI分解pALF20DNAと、3:1の挿入物のベクターに対する比
により、16℃で3.5時間、0.1mMのATPを含む反応におい
てリゲートせしめた。コントロールとして、ベクターEc
oRI/Hind III分解pALF20を同条件下でそれ自身にリゲー
トせしめた。各リゲーション混合物のアリコートを、リ
ガーゼを加える前、且つ3.5時間のリゲーション後に取
り出した。これらのアリコートを0.8％のアガロースゲ
ル上に流し、そして16℃で3.5時間後の分子量において
明らかなる増大が見られ、十分なるリゲーションが示さ
れた。
RI分解pALF20DNAと、3:1の挿入物のベクターに対する比
により、16℃で3.5時間、0.1mMのATPを含む反応におい
てリゲートせしめた。コントロールとして、ベクターEc
oRI/Hind III分解pALF20を同条件下でそれ自身にリゲー
トせしめた。各リゲーション混合物のアリコートを、リ
ガーゼを加える前、且つ3.5時間のリゲーション後に取
り出した。これらのアリコートを0.8％のアガロースゲ
ル上に流し、そして16℃で3.5時間後の分子量において
明らかなる増大が見られ、十分なるリゲーションが示さ
れた。
G.形質転換
各リゲーション混合物を、DG101コンピーテント細胞に
形質転換せしめ、そして15μg/mlのテトラサイクリンを
含むR2−４プレート上で平板培養せしめた。リゲートさ
れたベクターによる形質転換は６つのテトラサイクリン
耐性コロニーを提供した。pALF20:lacUV5は30のテトラ
サイクリン耐性コロニーを提供し、pALF20:tacは99個提
供した。塩化セシウム臭化エチジウム勾配精製DNAをpLa
c19,pLac20及びpLac21と命名したpALF20:lacUV5形質転
換体由来の３つのクローン、並びにpTac24及びTac25と
命名した。pALF20:tac形質転換体由来の２つのクローン
から調製した。これらのプラスミドを、アニール化オリ
ゴヌクレオチド挿入物の存在の検定のためにシーケンス
化せしめた。
形質転換せしめ、そして15μg/mlのテトラサイクリンを
含むR2−４プレート上で平板培養せしめた。リゲートさ
れたベクターによる形質転換は６つのテトラサイクリン
耐性コロニーを提供した。pALF20:lacUV5は30のテトラ
サイクリン耐性コロニーを提供し、pALF20:tacは99個提
供した。塩化セシウム臭化エチジウム勾配精製DNAをpLa
c19,pLac20及びpLac21と命名したpALF20:lacUV5形質転
換体由来の３つのクローン、並びにpTac24及びTac25と
命名した。pALF20:tac形質転換体由来の２つのクローン
から調製した。これらのプラスミドを、アニール化オリ
ゴヌクレオチド挿入物の存在の検定のためにシーケンス
化せしめた。
pLac21:誤まりなしでlacUV5配列を含んだ。
pTac25:プロモーターの−47の位置でのＧとＡの１塩基
の誤まりを有するtacプロモーター配列を含んだ。
の誤まりを有するtacプロモーター配列を含んだ。
組立の続きのためにプラスミドpTac25及びpLac21を選ん
だ。各プラスミド10μｇをSstI及びその後BamHIにより
完全に分解せしめた。異種プロモーター（tac又はlac）
に結合するアンピシリン耐性遺伝子の含む約1.5Kbのフ
ラグメントをゲルから切り出し、0.1容量のTEA中で電気
溶離せしめ、フェノール／クロロホルムにより抽出せし
め、エタノール中における酢酸ナトリウムにより沈澱せ
しめ、そしてトリス−EDTA緩衝液に再懸濁せしめた。
だ。各プラスミド10μｇをSstI及びその後BamHIにより
完全に分解せしめた。異種プロモーター（tac又はlac）
に結合するアンピシリン耐性遺伝子の含む約1.5Kbのフ
ラグメントをゲルから切り出し、0.1容量のTEA中で電気
溶離せしめ、フェノール／クロロホルムにより抽出せし
め、エタノール中における酢酸ナトリウムにより沈澱せ
しめ、そしてトリス−EDTA緩衝液に再懸濁せしめた。
H.リゲーション
約6.7BamHI部分的SstIpACY−C184:PCSベクターフラグメ
ント（セクションＢにおいて単離）をpLac21及びpTac25
由来のBamHI/SstIアンピシリン耐性異種プロモーターフ
ラグメントと、7:1の挿入物：ベクターの比、そして16
℃で24時間にて0.2mMのATP濃度による、２つの別々のリ
ゲーション反応においてリゲートせしめた。これらの２
つのリゲーション混合物をDG101コピーテント細胞を形
質転換せしめるために用いた。この形質転換は、pACYC1
84:Pcs:Lac21については786個のアンピシリン耐性形質
転換体を、そしてpACYC184:Pcs:Tac25から803のアンピ
シリン耐性形質転換体を作り出した。各形質転換体から
の９個のコロニーからの培養物を50μg/mlのアンピシリ
ンを有するR2において増殖せしめた。アルカリ溶解ミニ
プレプDNAをこれらの培養物から単離し、そして酵素Bam
HI,Hind III、及びSstIによる制限分解により分析し
た。図９におけるpLac21−７及びpTac25−１と表示する
プラスミドについての制限地図に相当するDNAが同定さ
れた。これらのプラスミドを保存1306−21エレクトロコ
ンピーテント細胞の形質転換のために用いた。得られる
株を、これらの株の染色体形態の評価のためにサザンブ
ロット分析にかけ、その後セルロースシンターゼ活性及
びセルロース生成の増大レベルのための発酵実験に用い
た。
ント（セクションＢにおいて単離）をpLac21及びpTac25
由来のBamHI/SstIアンピシリン耐性異種プロモーターフ
ラグメントと、7:1の挿入物：ベクターの比、そして16
℃で24時間にて0.2mMのATP濃度による、２つの別々のリ
ゲーション反応においてリゲートせしめた。これらの２
つのリゲーション混合物をDG101コピーテント細胞を形
質転換せしめるために用いた。この形質転換は、pACYC1
84:Pcs:Lac21については786個のアンピシリン耐性形質
転換体を、そしてpACYC184:Pcs:Tac25から803のアンピ
シリン耐性形質転換体を作り出した。各形質転換体から
の９個のコロニーからの培養物を50μg/mlのアンピシリ
ンを有するR2において増殖せしめた。アルカリ溶解ミニ
プレプDNAをこれらの培養物から単離し、そして酵素Bam
HI,Hind III、及びSstIによる制限分解により分析し
た。図９におけるpLac21−７及びpTac25−１と表示する
プラスミドについての制限地図に相当するDNAが同定さ
れた。これらのプラスミドを保存1306−21エレクトロコ
ンピーテント細胞の形質転換のために用いた。得られる
株を、これらの株の染色体形態の評価のためにサザンブ
ロット分析にかけ、その後セルロースシンターゼ活性及
びセルロース生成の増大レベルのための発酵実験に用い
た。
これらの２株を、非形質転換株1306−21と共に、標準プ
ロトコールを利用して試験した。これらの株を、細胞増
殖、セルロース生成及びインビトロセルロース活性につ
いて、二重測定において、1,2及び５日にわたり試験し
た。125mlのバッフルフラスコにシード培地を含む２％
のセルロースを接種せしめた。10μＭのFeCl3,25mMのDM
G,1％のTYE及び３％のグルコースを有するR70−２を含
む標準フラスコ培地を用いた。
ロトコールを利用して試験した。これらの株を、細胞増
殖、セルロース生成及びインビトロセルロース活性につ
いて、二重測定において、1,2及び５日にわたり試験し
た。125mlのバッフルフラスコにシード培地を含む２％
のセルロースを接種せしめた。10μＭのFeCl3,25mMのDM
G,1％のTYE及び３％のグルコースを有するR70−２を含
む標準フラスコ培地を用いた。
酵素アッセイのための培養物を集め、この細胞をチーズ
クロスで濾過し、そしてこの細胞を前記プロトコールを
利用して洗浄せしめた。このペレットを、そのサンプル
を集めるに従って凍結せしめた。この細胞を超音波処理
せしめ、その後セルロースシンターゼ活性、セルロース
の生成及び細胞増殖についてアッセイした。
クロスで濾過し、そしてこの細胞を前記プロトコールを
利用して洗浄せしめた。このペレットを、そのサンプル
を集めるに従って凍結せしめた。この細胞を超音波処理
せしめ、その後セルロースシンターゼ活性、セルロース
の生成及び細胞増殖についてアッセイした。
本実験の結果は、セルロースシンターゼオペロンのアセ
トバクター染色体プロモーターがE.コリプロモーターと
交換されることができ、そしてインビトロセルロースシ
ンターゼ活性及びセルロース生成が得られ続けられうる
ことを示す。tacプロモーター構造のインビトロセルロ
ース比活性は野性型細胞と発酵にわたり、日数の経路し
た培養物の活性、並びに２及び５日経過培養物の活性に
おける低下の両者において類似し、そしてlacプロモー
ター構造の活性は野性株のそれよりも低かった。その活
性は初日と２日目の間でも低下した。
トバクター染色体プロモーターがE.コリプロモーターと
交換されることができ、そしてインビトロセルロースシ
ンターゼ活性及びセルロース生成が得られ続けられうる
ことを示す。tacプロモーター構造のインビトロセルロ
ース比活性は野性型細胞と発酵にわたり、日数の経路し
た培養物の活性、並びに２及び５日経過培養物の活性に
おける低下の両者において類似し、そしてlacプロモー
ター構造の活性は野性株のそれよりも低かった。その活
性は初日と２日目の間でも低下した。
tacプロモーター構造の細胞増殖及びセルロース生産は
コントロールのそれらと実験上同一であった。このlac
プロモーター構造はセルロース生産においてはコントロ
ールに比べ明らかに低く、しかし細胞増殖においては低
くなかった。このデーターにより、lacプロモーター株
におけるセルロース生産はセルロースシンターゼの生体
内活性により制限されるものと考えられる。
コントロールのそれらと実験上同一であった。このlac
プロモーター構造はセルロース生産においてはコントロ
ールに比べ明らかに低く、しかし細胞増殖においては低
くなかった。このデーターにより、lacプロモーター株
におけるセルロース生産はセルロースシンターゼの生体
内活性により制限されるものと考えられる。
それ故、本明細書に示す通り、種々の強さのプロモータ
ーは異なる酵素活性及びセルロースの、細胞に対する比
の発生を提するであろう。
ーは異なる酵素活性及びセルロースの、細胞に対する比
の発生を提するであろう。
例X VII
セルロースシンターゼＤ遺伝子の実験
本実験の目的は、セルロースシンターゼオペロンＤ遺伝
子の機能の研究のための1306−21誘導株の作製である。
本明細書で作成するこの株は、野性型タンパク質のＣ末
端の16.5％を欠落する、遺伝子Ｄ由来のポリペプチドを
生成できる。完全遺伝子Ｄの除去される二次構造物も作
製した。これらの株を、セルロース生成に関連するそれ
らの表現型について試験した。
子の機能の研究のための1306−21誘導株の作製である。
本明細書で作成するこの株は、野性型タンパク質のＣ末
端の16.5％を欠落する、遺伝子Ｄ由来のポリペプチドを
生成できる。完全遺伝子Ｄの除去される二次構造物も作
製した。これらの株を、セルロース生成に関連するそれ
らの表現型について試験した。
A.遺伝子Ｃ及びＢを含む3.7KbのフラグメントのpACYC18
4へのクローン化 20μｇのpACYC184DNAを、全容量300μｌの200ユニット
のEcoRV及び200ユニットのBamHIにより、37℃で２時間
分解せしめた。このDNAを14ユニットの仔牛小腸アルカ
リホスファターゼにより、37℃で30分間処理し、次いで
１％のGTGアガロースゲルに流した。約4KbのEcoRI/BamH
Iフラグメントをこのゲルから切り出し、0.1要領の少量
のTEA中にて100ボルトで１時間電気溶解せしめ、フェノ
ール及びクロロホルムで抽出せしめ、エタノール中で酢
酸ナトリウムにより沈殿せしめそして10μｌのトリスED
TA緩衝液に再懸濁せしめた。
4へのクローン化 20μｇのpACYC184DNAを、全容量300μｌの200ユニット
のEcoRV及び200ユニットのBamHIにより、37℃で２時間
分解せしめた。このDNAを14ユニットの仔牛小腸アルカ
リホスファターゼにより、37℃で30分間処理し、次いで
１％のGTGアガロースゲルに流した。約4KbのEcoRI/BamH
Iフラグメントをこのゲルから切り出し、0.1要領の少量
のTEA中にて100ボルトで１時間電気溶解せしめ、フェノ
ール及びクロロホルムで抽出せしめ、エタノール中で酢
酸ナトリウムにより沈殿せしめそして10μｌのトリスED
TA緩衝液に再懸濁せしめた。
50μｇのpBR322:5.5T19G9DNAをSmaIにより完全に分解せ
しめ、完全に直鎖となったかを検査し、その後BamHIに
より分解せしめた。（TRT11−４由来の5.5KbのBamHIフ
ラグメント（例X IV.C）をpBR322のBamHI部位にクロー
ン化せしめ、pBR322:5.5 T19G9を作成した。）この分解
DNAを0.1％のGTGアガロースゲル上に流し、遺伝子Ｃの
３′部分及び遺伝子Ｄを含む約3.7Kbのフラグメント
（図１のヌクレオチド6341−10164）をこのゲルから切
り出し、そして0.1容量の少量のTEA中にて、100ボルト
で１時間電気溶離せしめた。このDNAを次にフェノール
／クロロホルム抽出せしめ、エタノール中にて酢酸ナト
リウムにより沈殿せしめ、そして10μｌのトリス−EDTA
に再懸濁せしめた。約２μｇ当量のpACYC184BamHI/EcoR
Iフラグメントを約25μｇ当量の3.7KbのBamHI/SmaIフラ
グメントと、約3:1の挿入物：ベクターの比で、20μｌ
容量における２ユニットのT4DNAリガーゼにより、16℃
で3.5時間、100μＭのATP濃度にてリゲートせしめた。
このATP濃度をその後1mM迄上昇させ、そしてこのリゲー
ション混合物を16℃で１夜インキュベートせしめた。
しめ、完全に直鎖となったかを検査し、その後BamHIに
より分解せしめた。（TRT11−４由来の5.5KbのBamHIフ
ラグメント（例X IV.C）をpBR322のBamHI部位にクロー
ン化せしめ、pBR322:5.5 T19G9を作成した。）この分解
DNAを0.1％のGTGアガロースゲル上に流し、遺伝子Ｃの
３′部分及び遺伝子Ｄを含む約3.7Kbのフラグメント
（図１のヌクレオチド6341−10164）をこのゲルから切
り出し、そして0.1容量の少量のTEA中にて、100ボルト
で１時間電気溶離せしめた。このDNAを次にフェノール
／クロロホルム抽出せしめ、エタノール中にて酢酸ナト
リウムにより沈殿せしめ、そして10μｌのトリス−EDTA
に再懸濁せしめた。約２μｇ当量のpACYC184BamHI/EcoR
Iフラグメントを約25μｇ当量の3.7KbのBamHI/SmaIフラ
グメントと、約3:1の挿入物：ベクターの比で、20μｌ
容量における２ユニットのT4DNAリガーゼにより、16℃
で3.5時間、100μＭのATP濃度にてリゲートせしめた。
このATP濃度をその後1mM迄上昇させ、そしてこのリゲー
ション混合物を16℃で１夜インキュベートせしめた。
このリゲーション混合物を、標準の条件下でMM294コン
ピーテント細胞を形質転換させるために用いた。この形
質転換は、20μg/mlのCmを含むR2−４プレート上で選別
され、そして37℃で一夜インキュベートせしめた。CmR
形溶解ミニスクリーンDNAの調製のために採取した。ク
ローンpACYC184:3.7は、遺伝子の３′末端及び遺伝子Ｄ
全てを含む3.7KbのSmaI−BamHI挿入物を有し、オペロン
の終点にステムとループ終結構造を含むことが示され
た。pACYC184:3.7についての塩化セシウム臭化エチジウ
ム勾配精製DNAが単離された。
ピーテント細胞を形質転換させるために用いた。この形
質転換は、20μg/mlのCmを含むR2−４プレート上で選別
され、そして37℃で一夜インキュベートせしめた。CmR
形溶解ミニスクリーンDNAの調製のために採取した。ク
ローンpACYC184:3.7は、遺伝子の３′末端及び遺伝子Ｄ
全てを含む3.7KbのSmaI−BamHI挿入物を有し、オペロン
の終点にステムとループ終結構造を含むことが示され
た。pACYC184:3.7についての塩化セシウム臭化エチジウ
ム勾配精製DNAが単離された。
B.遺伝子Ｄ配列の妨害
20μｇのpACYC184:3.7DNAをEcoRVにより完全に分解せし
め、フェノール／クロロホルムにより抽出せしめ、沈殿
せしめ、その後20μｌのトリス−EDTAに再懸濁せしめ
た。５μｇのpBR322DNAをEcoRI及びAlwNIにより完全に
分解せしめた。このDNAを沈殿せしめ、その接着末端を
クレノウによる、４種のdNTP全ての存在下において埋め
た。
め、フェノール／クロロホルムにより抽出せしめ、沈殿
せしめ、その後20μｌのトリス−EDTAに再懸濁せしめ
た。５μｇのpBR322DNAをEcoRI及びAlwNIにより完全に
分解せしめた。このDNAを沈殿せしめ、その接着末端を
クレノウによる、４種のdNTP全ての存在下において埋め
た。
この埋められたDNAを１％のGTGアガロースゲル上に流
し、1.5KbのAmpRフラグメントをこのゲルから切り出
し、0.1容量のTEAにて電気溶離せしめ、フェノール／ク
ロロホルム抽出し、沈殿させ、そして５μｌのトリス−
EDTA緩衝液に再懸濁せしめた。
し、1.5KbのAmpRフラグメントをこのゲルから切り出
し、0.1容量のTEAにて電気溶離せしめ、フェノール／ク
ロロホルム抽出し、沈殿させ、そして５μｌのトリス−
EDTA緩衝液に再懸濁せしめた。
５μｇ当量のpBR322AmpRフラグメントDNAを１μｇ当量
のpACYC184:3.7EcoRI分解DNAと、約9:1の挿入物：ベク
ターの比で、標準リゲーションの条件下でリゲートせし
めた。このリゲーション混合物を標準条件下でMM294コ
ンピーテント細胞を形質転換せしめるために用いた。こ
の形質転換体をR2−4 Amp50プレートにて平板培養し、3
7℃で１夜インキュベートせしめた。AmpRコロニーが得
られ、そして培養せしめた。細胞を各培養物から集め、
そしてアルカリ溶解ミニプレプDNAを培養物から単離せ
しめた。pDI−２と命名するこの培養物のうち１つを130
6−21の形質転換のために選んだ。pDI−２は遺伝子Ｄを
妨害するpACYC184:3.7のEcoRV部位において挿入され
た、pBR322由来のAmp耐性フラグメントを含む。塩化セ
シウム臭化エチジウム勾配pDI−2DNAを調製した。この
分解物を2mlのH2Oにより、セントリコン30（Centricon
30）（Amicon）において5,000rpmによる遠心により洗浄
せしめた。次にこのDNAをスピードバク内で乾燥し、そ
して４μｌのH2Oに再懸濁せしめた。40μｌのエレクト
ロコンピーテント1306−21細胞をこの分解DNAに加え、
そしてこれらの細胞を標準条件下でエレクトロポレート
した。1mlのR20−２をこのエレクトロポレート処理細胞
に加え、そしてこの混合物を直ちにR20−2Amp 100Cm20
上で平板培養した。
のpACYC184:3.7EcoRI分解DNAと、約9:1の挿入物：ベク
ターの比で、標準リゲーションの条件下でリゲートせし
めた。このリゲーション混合物を標準条件下でMM294コ
ンピーテント細胞を形質転換せしめるために用いた。こ
の形質転換体をR2−4 Amp50プレートにて平板培養し、3
7℃で１夜インキュベートせしめた。AmpRコロニーが得
られ、そして培養せしめた。細胞を各培養物から集め、
そしてアルカリ溶解ミニプレプDNAを培養物から単離せ
しめた。pDI−２と命名するこの培養物のうち１つを130
6−21の形質転換のために選んだ。pDI−２は遺伝子Ｄを
妨害するpACYC184:3.7のEcoRV部位において挿入され
た、pBR322由来のAmp耐性フラグメントを含む。塩化セ
シウム臭化エチジウム勾配pDI−2DNAを調製した。この
分解物を2mlのH2Oにより、セントリコン30（Centricon
30）（Amicon）において5,000rpmによる遠心により洗浄
せしめた。次にこのDNAをスピードバク内で乾燥し、そ
して４μｌのH2Oに再懸濁せしめた。40μｌのエレクト
ロコンピーテント1306−21細胞をこの分解DNAに加え、
そしてこれらの細胞を標準条件下でエレクトロポレート
した。1mlのR20−２をこのエレクトロポレート処理細胞
に加え、そしてこの混合物を直ちにR20−2Amp 100Cm20
上で平板培養した。
30℃で４日のインキュベーション後、約100,000個のAmp
Rコロニーがプレート上に現れた。これらの形質転換体
は弱いセルロース生産体として現れた。類似の結果が、
セルロースシンターゼＤ遺伝子全体の欠落する形質転換
体について観察された。これらの発見は、セルロースシ
ンターゼＤ遺伝子がセルロース合成において機能するこ
とを示す。
Rコロニーがプレート上に現れた。これらの形質転換体
は弱いセルロース生産体として現れた。類似の結果が、
セルロースシンターゼＤ遺伝子全体の欠落する形質転換
体について観察された。これらの発見は、セルロースシ
ンターゼＤ遺伝子がセルロース合成において機能するこ
とを示す。
例X VIII
セルロースシンターゼの精製
株1306−27を1000mlのバッフルフラスコにおける400ml
の４％フルクトース、１％の酵母抽出物、0.5％のバク
トペプトン、0.3％のNaH2PO4培地、pH5.0において24時
間増殖せしめた。生育培地を緩衝液（50mMのK2HPO4、pH
6.0）による２回の洗浄により除去した。約14gの乾燥細
胞が得られた。
の４％フルクトース、１％の酵母抽出物、0.5％のバク
トペプトン、0.3％のNaH2PO4培地、pH5.0において24時
間増殖せしめた。生育培地を緩衝液（50mMのK2HPO4、pH
6.0）による２回の洗浄により除去した。約14gの乾燥細
胞が得られた。
細胞膜
細胞を、ポリエチレングリコール（PEG）及びTME緩衝液
（20％のPEG（W/V）の存在下においてフレンチプレス中
で破壊せしめた。この破壊細胞を遠心し（12,000×ｇ、
10分間）そしてこのペレットを同じ容量のTME緩衝液に
再懸濁せしめた。この懸濁物をホモジナイズし（ポッタ
ーエレベジェムホモジナイザー（Potter Elevehjem hom
ogenizer）、そしてこの懸濁物を遠心せしめた（12,000
×ｇ、10分間）。得られたペレットはセルロースシンタ
ーゼ活性を含んでいた。このサンプル（Ｐ−PEG）をTME
緩衝液に、50mg細胞/mlに相当する濃度迄懸濁せしめ、
そして液体窒素にて凍結し、−80℃で保存した。
（20％のPEG（W/V）の存在下においてフレンチプレス中
で破壊せしめた。この破壊細胞を遠心し（12,000×ｇ、
10分間）そしてこのペレットを同じ容量のTME緩衝液に
再懸濁せしめた。この懸濁物をホモジナイズし（ポッタ
ーエレベジェムホモジナイザー（Potter Elevehjem hom
ogenizer）、そしてこの懸濁物を遠心せしめた（12,000
×ｇ、10分間）。得られたペレットはセルロースシンタ
ーゼ活性を含んでいた。このサンプル（Ｐ−PEG）をTME
緩衝液に、50mg細胞/mlに相当する濃度迄懸濁せしめ、
そして液体窒素にて凍結し、−80℃で保存した。
トリプシン処理
Ｐ−PEGを遠心し（12,000×ｇ、10分間）そしてそのペ
レットを0.1Mのトリス、pH8.3、20％のスクロース中
に、乾燥重量10gの細胞/ml迄懸濁せしめた。１容量％の
8mg/mlのトリプシン（Sigma）を加え、そしてこの調製
物をゆっくり攪拌しながら１時間、４℃にてインキュベ
ートせしめた。１容量％のトリプシンインヒビターを加
え、そしてこの調製物を氷上に15分間インキュベートせ
しめた。遠心（100,000g、30分間）後、ペレット（TT−
Ｐ−PEG）を−80℃で保存した。
レットを0.1Mのトリス、pH8.3、20％のスクロース中
に、乾燥重量10gの細胞/ml迄懸濁せしめた。１容量％の
8mg/mlのトリプシン（Sigma）を加え、そしてこの調製
物をゆっくり攪拌しながら１時間、４℃にてインキュベ
ートせしめた。１容量％のトリプシンインヒビターを加
え、そしてこの調製物を氷上に15分間インキュベートせ
しめた。遠心（100,000g、30分間）後、ペレット（TT−
Ｐ−PEG）を−80℃で保存した。
溶解
TME緩衝液中の10％ジギトニン（digitonin;Serva,Westb
ury,NY）を湯浴にて５−10分間加熱することにより調製
し、そしてこの調製物を４℃に冷却した。このTT−Ｐ−
PEGペレットを２％のジギトニンを含むTME緩衝液に、も
との1/10の容量迄懸濁せしめた。この懸濁物をMSEモデ
ル140超音波器を用いて４℃で２分間超音波処理した。
超音波処理は、断続冷却を伴って30秒の超音波パルスに
おいて、30mlに分配して行った。この懸濁物を振騰し、
そしてゆっくりと90分間攪拌し、その後200,000gで60分
間遠心せしめた。この上清液はもとのセルロースシンタ
ーゼ活性の約50％を含んだ。前記の通り凍結及び保存し
た際、活性は数カ月保持された。
ury,NY）を湯浴にて５−10分間加熱することにより調製
し、そしてこの調製物を４℃に冷却した。このTT−Ｐ−
PEGペレットを２％のジギトニンを含むTME緩衝液に、も
との1/10の容量迄懸濁せしめた。この懸濁物をMSEモデ
ル140超音波器を用いて４℃で２分間超音波処理した。
超音波処理は、断続冷却を伴って30秒の超音波パルスに
おいて、30mlに分配して行った。この懸濁物を振騰し、
そしてゆっくりと90分間攪拌し、その後200,000gで60分
間遠心せしめた。この上清液はもとのセルロースシンタ
ーゼ活性の約50％を含んだ。前記の通り凍結及び保存し
た際、活性は数カ月保持された。
酵素の濃縮
この溶解酵素をアミコンコーン（Amicon cones）（フィ
ルター100K）を用いて５−７倍濃縮し、10−16酵素ユニ
ット/ml（ユニット＝１ナノモル／分）の活性にした。
この濃縮酵素を４℃で一夜保持するか、又は前述と同様
に保存した。
ルター100K）を用いて５−７倍濃縮し、10−16酵素ユニ
ット/ml（ユニット＝１ナノモル／分）の活性にした。
この濃縮酵素を４℃で一夜保持するか、又は前述と同様
に保存した。
酵素−生成物の回収
コントロン（Contron）TST−28（スウィンギングバケッ
ト）ローターの６つの40mlの遠沈管それぞれの底に、グ
リセロール含有クッション（12−13％のグリセロール、
1nMのUDPG及び15μモルのｃ−di−GMP）を含むTME緩衝
液（pH8.5））26mlに加え、そして10mlの反応混合物（5
0mlの溶解酵素、6.25ミリモルとトリス−HCl緩衝液、pH
9.6、340μモルのCaCl2、１ミリモルのMgCl2、0.6μモ
ルのｃ−di−GMP及び60μモルのUDGP（最終容量60ml）
をゆっくりその上に載せた。この管を15分間、30℃でイ
ンキュベートし、次いで氷上に2.5時間置き、そして最
後にTST−28コントロンローター中で30分間、20,000rpm
で遠心した。（この遠心機は３−４分間において350rpm
減速するように設定してある。）この上清液を慎重にデ
カントした。このペレットを15mlのTMEに手動ホモジナ
イザーにより混合し、そして懸濁させた。この最終ペレ
ットを5mlのTMEに懸濁せしめた。この得られる酵素は凍
結及び前記の通りに保存した場合、数週間安定である。
得られた酵素の活性の回収率は約45％であった。
ト）ローターの６つの40mlの遠沈管それぞれの底に、グ
リセロール含有クッション（12−13％のグリセロール、
1nMのUDPG及び15μモルのｃ−di−GMP）を含むTME緩衝
液（pH8.5））26mlに加え、そして10mlの反応混合物（5
0mlの溶解酵素、6.25ミリモルとトリス−HCl緩衝液、pH
9.6、340μモルのCaCl2、１ミリモルのMgCl2、0.6μモ
ルのｃ−di−GMP及び60μモルのUDGP（最終容量60ml）
をゆっくりその上に載せた。この管を15分間、30℃でイ
ンキュベートし、次いで氷上に2.5時間置き、そして最
後にTST−28コントロンローター中で30分間、20,000rpm
で遠心した。（この遠心機は３−４分間において350rpm
減速するように設定してある。）この上清液を慎重にデ
カントした。このペレットを15mlのTMEに手動ホモジナ
イザーにより混合し、そして懸濁させた。この最終ペレ
ットを5mlのTMEに懸濁せしめた。この得られる酵素は凍
結及び前記の通りに保存した場合、数週間安定である。
得られた酵素の活性の回収率は約45％であった。
SDS−PAGEに基づくタンパク質の分離
もとのセルロースシンターゼ活性の12−15％を含む得ら
れた酵素をラエムリ（Laemmli）サンプル緩衝液（DTTを
含む）に溶解し、そして10％アクリルアミドスラブゲル
におけるSDS−PAGEかけた。ペプチドバンドはタマジー
ブルー染色により識別化し、そして切り出した。４つの
主なバンド、バンドA90−95Kd、バンドB65−68Kd、バン
ドC58−60Kd及びバンドD54−56Kdが観察できた。このゲ
ルスライスを保存のため、10％の酢酸を含むプラスチッ
ク袋に閉入した。
れた酵素をラエムリ（Laemmli）サンプル緩衝液（DTTを
含む）に溶解し、そして10％アクリルアミドスラブゲル
におけるSDS−PAGEかけた。ペプチドバンドはタマジー
ブルー染色により識別化し、そして切り出した。４つの
主なバンド、バンドA90−95Kd、バンドB65−68Kd、バン
ドC58−60Kd及びバンドD54−56Kdが観察できた。このゲ
ルスライスを保存のため、10％の酢酸を含むプラスチッ
ク袋に閉入した。
SDS−PAGEゲルスライスからのタンパク質の回収
タンパク質をHunkapiller他（Methods in Enzymology,1
983,91:227−247）からの改良方法を利用し、SDS−PAGE
ゲルスライスからの電気溶離によって分離せしめた。こ
の方法は低めの最終SDS農度をもたらすように改良し
た。この改良は： １）浸透緩衝液（0.05MのNH4HCO3における２％のSDS）
に対する溶出緩衝液（0.05MのNH4HCO3における0.1％のS
DS）の置換；及び２）装置における溶出緩衝液（0.05M
のNH4HCO3における0.1％のSDS）を透析緩衝液（0.01Mの
NH4HCO3における0.02のSDS）により交換する際、慎重に
サンプルの阻害を回避しながらサンプルセル内のほとん
どの緩衝液も交換される。
983,91:227−247）からの改良方法を利用し、SDS−PAGE
ゲルスライスからの電気溶離によって分離せしめた。こ
の方法は低めの最終SDS農度をもたらすように改良し
た。この改良は： １）浸透緩衝液（0.05MのNH4HCO3における２％のSDS）
に対する溶出緩衝液（0.05MのNH4HCO3における0.1％のS
DS）の置換；及び２）装置における溶出緩衝液（0.05M
のNH4HCO3における0.1％のSDS）を透析緩衝液（0.01Mの
NH4HCO3における0.02のSDS）により交換する際、慎重に
サンプルの阻害を回避しながらサンプルセル内のほとん
どの緩衝液も交換される。
例X IX
セルロースシンターゼ調製物から単離されるポリペプチ
ドタンパク質のＮ末端アミノ酸配列 アセトバクター株1306−27から精製される90−95Kdタン
パク質の最初の18個のアミノ酸及び65−68Kdタンパク質
の最初の16個のアミノ酸を、アプライドバイオシステム
（Applied Biosystem）モデル470Aプロテインシーケン
サーにおける自動化エドマン分解により、この製造者に
より供給される試薬及びプロトコールを利用してシーケ
ンス化せしめた。この90−95Kdタンパク質の18個のアミ
ノ酸は、前述の通りに得られるセルロースシンターゼの
DNA配列から予想されるアミノ酸配列と一致した。この
一致は、図１において示されるアラニン残基から始ま
る。精製後に得られるアミノ末端は本質的なインビボＮ
末端でないことがあるが、しかしこのアラニンの後に続
くリジンでのタンパク質分解を反映しうる。クローン化
遺伝子の予想配列は83Kdのタンパク質についてコード化
する。Ｎ−末端の近くに初期アミノ酸に対するいくつか
の更なるピークが存在し、おそらく夾雑物に由来するで
あろう。
ドタンパク質のＮ末端アミノ酸配列 アセトバクター株1306−27から精製される90−95Kdタン
パク質の最初の18個のアミノ酸及び65−68Kdタンパク質
の最初の16個のアミノ酸を、アプライドバイオシステム
（Applied Biosystem）モデル470Aプロテインシーケン
サーにおける自動化エドマン分解により、この製造者に
より供給される試薬及びプロトコールを利用してシーケ
ンス化せしめた。この90−95Kdタンパク質の18個のアミ
ノ酸は、前述の通りに得られるセルロースシンターゼの
DNA配列から予想されるアミノ酸配列と一致した。この
一致は、図１において示されるアラニン残基から始ま
る。精製後に得られるアミノ末端は本質的なインビボＮ
末端でないことがあるが、しかしこのアラニンの後に続
くリジンでのタンパク質分解を反映しうる。クローン化
遺伝子の予想配列は83Kdのタンパク質についてコード化
する。Ｎ−末端の近くに初期アミノ酸に対するいくつか
の更なるピークが存在し、おそらく夾雑物に由来するで
あろう。
65−68Kdタンパク質に対して得られる配列の質は90−95
Kdタンパク質に対して得られるものほど優れていなかっ
たが、しかし65−68KdN−末端配列と図１において予想
される配列からのアミノ酸（カッコで示す）の間はよく
一致しうる。それ故、65−68Kdタンパク質は90−95Kdタ
ンパク質のタンパク質分析フラグメントであると考えら
れる。
Kdタンパク質に対して得られるものほど優れていなかっ
たが、しかし65−68KdN−末端配列と図１において予想
される配列からのアミノ酸（カッコで示す）の間はよく
一致しうる。それ故、65−68Kdタンパク質は90−95Kdタ
ンパク質のタンパク質分析フラグメントであると考えら
れる。
以下の培養物はアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン、（ATCC）Rockville,MD,USAにて、特許手続の目的の
ための微生物の寄託の国際認定に基づくブタペスト条約
の下で、そしてそれに基づく条件（ブタペスト条約）の
もとで寄託されており、それ故、これらはブタペスト条
約に従って保管され、入手できる。このような株の入手
は全ての政府のもとでのその特許法による権利に基づく
違背における発明の実施として制限されていない。
ン、（ATCC）Rockville,MD,USAにて、特許手続の目的の
ための微生物の寄託の国際認定に基づくブタペスト条約
の下で、そしてそれに基づく条件（ブタペスト条約）の
もとで寄託されており、それ故、これらはブタペスト条
約に従って保管され、入手できる。このような株の入手
は全ての政府のもとでのその特許法による権利に基づく
違背における発明の実施として制限されていない。
この寄託培養物は以下のATCC寄託番号が付与されてい
る。この培養物は本出願の出願人であり、以下のCMCC寄
託番号を受けたシータスコーポレーション（Emeryvill
e,CA,USA）のマスターカルチャーコレクション（CMCC）
に保存されている。
る。この培養物は本出願の出願人であり、以下のCMCC寄
託番号を受けたシータスコーポレーション（Emeryvill
e,CA,USA）のマスターカルチャーコレクション（CMCC）
に保存されている。
本発明はいくつかの特定態様により実例化されている
が、これらは本発明の範囲を限定するものでない。
が、これらは本発明の範囲を限定するものでない。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
//(Ｃ１２Ｎ 15/09
Ｃ１２Ｒ 1:02）
(Ｃ１２Ｎ 15/09
Ｃ１２Ｒ 1:02
1:19）
Ｃ１２Ｒ 1:02）
(Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:02
1:19）
(72)発明者 フェアー，アンナ リサ
アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611,
オークランド，＃103，グレン アベニュ
67
(72)発明者 ジェルファンド，デビッド エイチ.
アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611,
オークランド，シェルトン ドライブ
6208
(72)発明者 ミード，ジェイムス エイチ.
アメリカ合衆国，カリフォルニア 94564,
ピノール，フランシス ドライブ 2540
(72)発明者 タル，ロニー
アメリカ合衆国，カリフォルニア 94805,
リッチモンド，ヘイゼル アベニュ 5900
(72)発明者 ウォン，ヒン
アメリカ合衆国，カリフォルニア 94585,
サン ラモン，ロモンド サークル 634
(72)発明者 ベンジマン，モシェ
イスラエル国，エルサレム，チェルニコフ
スキ ストリート 32
Claims (17)
- 【請求項１】細菌セルロースシンターゼオペロン遺伝子
をコード化するポリヌクレオチドであって、４本の連な
る遺伝子を含んで成り、 ここで前記遺伝子のうち第一遺伝子は実質的に次のアミ
ノ酸配列より成るペプチドをコード化し、 前記遺伝子のうちの第二の遺伝子は実質的に次のアミノ
酸配列より成るペプチドをコード化し、 前記遺伝子のうちの第三の遺伝子は実質的に次のアミノ
酸配列より成るペプチドをコード化し、 そして前記遺伝子のうちの第四の遺伝子は実質的に次の
アミノ酸配列より成るペプチドをコード化する、 ことを特徴とするポリヌクレオチド。 - 【請求項２】アセトバクターのゲノム由来の請求項１記
載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】前記の遺伝子と隣り合い、且つ上流に位置
するプロモーターをコード化するDNA配列を更に含んで
成る、請求項１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】請求項１に記載のポリヌクレオチドにより
形質転換されている組換宿主細胞。 - 【請求項５】次のアミノ酸配列を有するセルロースシン
ターゼＡについてのヌクレオチド配列に実質的に対応す
るポリヌクレオチド： - 【請求項６】次のアミノ酸配列を有するセルロースシン
ターゼＢについてのヌクレオチド配列に実質的に対応す
るポリヌクレオチド： - 【請求項７】次のアミノ酸配列を有するセルロースシン
ターゼＣについてのヌクレオチド配列に実質的に対応す
るポリヌクレオチド： - 【請求項８】次のアミノ酸配列を有するセルロースシン
ターゼＤについてのヌクレオチド配列に実質的に対応す
るポリヌクレオチド： - 【請求項９】表現のため、コントロール配列と作動連結
している請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項１０】表現のため、コントロール配列と作動連
結している請求項６記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項１１】細菌セルロースシンターゼを生成するた
めの方法であって、請求項４に記載の形質転換された細
胞を細菌セルロースシンターゼの表現のために適切な条
件のもとで培養し、そして該培養物から表現される細菌
セルロースシンターゼを回収することを含んで成る方
法。 - 【請求項１２】およそ85キロダルトンの分子量を有し、
且つ以下に示すセルロースシンターゼＢについてのアミ
ノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパ
ク質： - 【請求項１３】およそ84キロダルトンの分子量を有し、
且つ以下に示すセルロースシンターゼＡについてのアミ
ノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパ
ク質： - 【請求項１４】およそ141キロダルトンの分子量を有す
るタンパク質であって、セルロースシンターゼオペロン
の他の３種類のタンパク質と適切な割合において組合さ
れたときにインビボにおいて５′−ジホスホグルコース
からβ（１−４）グルカンポリマーを合成、且つ分泌せ
しめることのでき、且つ以下のセルロースシンターゼＣ
についてのアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列
を有するタンパク質： - 【請求項１５】およそ17キロダルトンの分子量を有する
タンパク質であって、セルロースシンターゼオペロンの
他の３種類のタンパク質と適切な割合において組合され
たときにインビボにおいて５′−ジホスホグルコースか
らβ（１−４）グルカンポリマーを合成、且つ分泌せし
めることのでき、且つ以下のセルロースシンターゼＤに
ついてのアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を
有するタンパク質： - 【請求項１６】組換微生物におけるセルロース生成を高
めるための方法であって、以下の段階； ａ）適当な微生物を、請求項１又は６記載のポリヌクレ
オチドを含んで成るベクターにより形質転換せしめ、 ｂ）該形質転換微生物をセルロースの生成のために適す
る条件のもとで培養せしめること、 を含んで成る方法。 - 【請求項１７】ａ）プラスミドp824の機能的なアセトバ
クター複製起点含有フラグメント； ｂ）形質転換、細胞分裂及び培養し易い感受性宿主細胞
の中に形質転換せしめた際に少なくとも一種の抗生物質
に対する耐性を供する１又は複数のDNAセグメント；並
びに ｃ）請求項１記載のポリヌクレオチド又は請求項６記載
のポリヌクレオチド； を含んで成る組換DNAベクター。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33719489A | 1989-04-12 | 1989-04-12 | |
| US337,194 | 1989-04-12 | ||
| US49623690A | 1990-03-23 | 1990-03-23 | |
| US496,236 | 1990-03-23 | ||
| PCT/US1990/001811 WO1990012098A2 (en) | 1989-04-12 | 1990-04-04 | Methods and nucleic acid sequences for the expression of the cellulose synthase operon |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04503456A JPH04503456A (ja) | 1992-06-25 |
| JPH0773500B2 true JPH0773500B2 (ja) | 1995-08-09 |
| JPH0773500B1 JPH0773500B1 (ja) | 1995-08-09 |
Family
ID=26990589
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2-506168A Expired - Lifetime JPH0773500B2 (ja) | 1989-04-12 | 1990-04-04 | セルロースシンターゼオペロンの表現のための方法及び核酸配列 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0471687B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0773500B2 (ja) |
| AT (1) | ATE161049T1 (ja) |
| AU (1) | AU5437390A (ja) |
| CA (1) | CA2014264C (ja) |
| DE (1) | DE69031803T2 (ja) |
| DK (1) | DK0471687T3 (ja) |
| ES (1) | ES2111536T3 (ja) |
| IL (1) | IL94053A (ja) |
| NZ (1) | NZ233312A (ja) |
| WO (1) | WO1990012098A2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5268274A (en) * | 1989-04-12 | 1993-12-07 | Cetus Corporation | Methods and nucleic acid sequences for the expression of the cellulose synthase operon |
| WO1991013988A1 (en) * | 1990-03-15 | 1991-09-19 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | RECOMBINANT β-1,4 GLUCAN SYNTHASE PROTEINS |
| US5114849A (en) * | 1990-10-26 | 1992-05-19 | Weyerhaeuser Company | Protectants for microbial fermentation |
| JPH07501450A (ja) * | 1991-11-29 | 1995-02-16 | モンサント カンパニー | 環状ジグアニレート代謝酵素 |
| US5382656A (en) * | 1992-10-06 | 1995-01-17 | Weyerhaeuser Company | Cellulose synthase associated proteins |
| AUPO069996A0 (en) * | 1996-06-27 | 1996-07-18 | Australian National University, The | Manipulation of plant cellulose |
| WO1998039455A1 (fr) * | 1997-03-04 | 1998-09-11 | Bio-Polymer Research Co., Ltd. | NOUVEAU GENE, GROUPE DE GENES ET NOUVELLE β-GLUCOSIDASE |
| US6462257B1 (en) | 1999-06-01 | 2002-10-08 | Institute Of Paper Science And Technology, Inc. | Vicilin-like seed storage protein gene promoter and methods of using the same |
| WO2001000819A1 (en) * | 1999-06-25 | 2001-01-04 | Chauhan, Sarita | Targeted gene replacements in enteric bacteria using linear dna |
| CN101708341B (zh) * | 2009-12-11 | 2012-07-18 | 东华大学 | 载银细菌纤维素水凝胶抗菌敷料制备方法及其制品 |
| JPWO2014104310A1 (ja) * | 2012-12-28 | 2017-01-19 | 国立大学法人京都大学 | セルロース製造用発現ベクター、形質転換体およびセルロースの製造方法 |
| CN105463625B (zh) * | 2014-08-29 | 2021-01-19 | 清华大学 | 一种由细菌细胞制得的细菌纤维材料及其应用 |
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1990
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- 1990-04-04 JP JP2-506168A patent/JPH0773500B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-04 DK DK90906539T patent/DK0471687T3/da active
- 1990-04-04 AT AT90906539T patent/ATE161049T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-04-04 AU AU54373/90A patent/AU5437390A/en not_active Abandoned
- 1990-04-04 DE DE69031803T patent/DE69031803T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1990-04-04 ES ES90906539T patent/ES2111536T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-09 IL IL9405390A patent/IL94053A/en active IP Right Grant
- 1990-04-10 CA CA002014264A patent/CA2014264C/en not_active Expired - Fee Related
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